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MX2014010156A - Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de las mismas. - Google Patents

Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de las mismas.

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MX2014010156A
MX2014010156A MX2014010156A MX2014010156A MX2014010156A MX 2014010156 A MX2014010156 A MX 2014010156A MX 2014010156 A MX2014010156 A MX 2014010156A MX 2014010156 A MX2014010156 A MX 2014010156A MX 2014010156 A MX2014010156 A MX 2014010156A
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MX
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amino acid
conjugate
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MX2014010156A
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Analiesa Sybil Anderson
Kathrin Ute Jansen
Justin Keith Moran
Mark E Ruppen
Susan Kay Hoiseth
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Pfizer
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Publication date
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Abstract

En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 71. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un sacárido capsular conjugado de un serogrupo meningocócico.

Description

COMPOSICIONES DE NEISSERIA MENINGITIDIS Y MÉTODOS DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones de Neisseria meningitidis y métodos de las mismas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Neisseria meningitids es una bacteria encapsulada Gram-negativa que puede provocar sepsis, meningitis y muerte. N. meningitidis se puede clasificar en aproximadamente 13 serogrupos (que incluyen serogrupos A, B, C, E29, H, I, K, L, W-135, X , Y y Z) con base en cápsulas de polisacáridos química y antigénicamente distintivas. Cinco de los serogrupos (A, B, C, Y, y W135) son responsables de la mayor parta de la enfermedad.
Las meningitis meningocócica es una enfermedad devastadora que puede matar a niños y adultos jóvenes en cuestión de horas independientemente de la disponibilidad de antibióticos. Existe una necesidad de composiciones inmunogénicas mejoradas contra serogrupos meningocócicos A, B, C, Y, y W135 y/o X.
Para satisfacer estas y otras necesidades, la presente invención se refiere a composiciones de Neisseria meningitidis y métodos de las mismas.
En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 71 , donde los primeros veinte residuos de aminoácidos de la secuencia no contiene una cisteína.
En una realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido en las posiciones 1 a 184 de la SEQ ID NO: 71.
En una realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido en las posiciones 158 a 185 de la SEQ ID NO: 71. En otra realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido en las posiciones 159 a 186 de la SEQ ID NO: 71.
En una realización, el polipéptido aislado incluye al menos 6 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido en las posiciones 185 a 254 de la SEQ ID NO: 71.
En una realización, el polipéptido aislado es no piruvilado.
En una realización, el polipéptido aislado es no lipidado.
En una realización, el polipéptido aislado es inmunogénico.
En una realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 71.
En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 76, donde los primeros veinte residuos de aminoácidos de la secuencia no contienen una cisteína.
En una realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 76.
En una realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 76, donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. En otra realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 76, donde la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. En una realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 77.
En una realización, el polipéptido aislado es no piruvilado. En una realización, el polipéptido aislado es no lipidado. En una realización, el polipéptido aislado es inmunogénico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones mencionadas con anterioridad. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente.
En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71.
En una realización, la secuencia de ácido nucleico aislado incluye la SEQ ID NO: 72. En un aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En una realización, la composición inmunogénica incluye al menos dos conjugados seleccionados de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En una realización, la composición inmunogénica incluye al menos tres conjugados seleccionados de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En una realización, la composición inmunogénica incluye un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A; un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C; un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En una realización, el polipéptido es una polipéptido de subfamilia A.
En una realización, el polipéptido es una polipéptido de subfamilia B.
En una realización, el polipéptido es un A05 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido es un A12 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido es un A22 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido es un B01 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido es un B09 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido es un B44 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido es un B22 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido es un B24 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido es un A62 no piruvilado y no lipidado.
En una realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 71 , y la SEQ ID NO: 75. En una realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 77.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmune contra Neisseria meningitidis en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición ¡nmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener un anticuerpo bactericida contra Neisseria meningitidis serogrupo C en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B.
En una realización, el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. En otra realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 76. Aún en otra realización, la cisteína en la posición 1 del polipéptido está suprimida. En una realización adicional, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 77.
En una realización, la composición inmunogénica además incluye al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener un anticuerpo bactericida contra Neisseria meningitidis serogrupo Y en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B.
En una realización, el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. En otra realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 76. Aún en otra realización, la cisteína en la posición 1 del polipéptido está suprimida. En una realización adicional, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 77.
En una realización, la composición inmunogénica además incluye al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para obtener un anticuerpo bactericida contra Neisseria meningitidis en un mamífero, que incluye la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Secuencias de Ácido Nucleico de la Variante P2086.
Figura 2: Secuencias de Aminoácido de la Variante P2086. El tallo de Gly/Ser en la cola N terminal de cada variante está subrayado.
Figura 3: Estructura de la Proteína ORF2086 Figura 4: Eliminación de Resultados Cys N-terminal en Pérdida de Expresión en E. col.
Figura 5: Efecto de la Longitud del Tallo de Gly/Ser sobre la Expresión de Variante ORF2086 No Lipidada. La secuencia asociada con la variante de proteína marcada B01 está establecida en la SEQ ID NO: 35. La secuencia asociada con la variante de proteína marcada B44 está establecida en la SEQ ID NO: 36. La secuencia asociada con la variante de proteína marcada A05 está establecida en la SEQ ID NO: 37. La secuencia asociada con la variante de proteína marcada A22 está establecida en la SEQ ID NO: 38. La secuencia asociada con la variante de proteína marcada B22 está establecida en la SEQ ID NO: 39. La secuencia asociada con la variante de proteína marcada A19 está establecida en la SEQ ID NO: 40.
Figura 6: Niveles Altos de Expresión B09 no lipidada independientemente de un tallo de Gly/Ser corto. Las dos líneas izquierdas demostraron la expresión de la variante B09 suprimida de Cys N-terminal antes y después de la inducción. La tercera y cuarta líneas demuestran la expresión de la variante B09 positiva de Cys N-terminal antes y después de la inducción. La línea más a la derecha es un estándar de peso molecular. La secuencia de aminoácido mostrada debajo de la imagen está establecida en la SEQ ID NO: 41. La secuencia de nucleótido representativa de la variante A22 suprimida de Cys N-terminal, denominada como "A22_001 " en la figura, está establecida en la SEQ ID NO: 42, que está mostrada bajo la SEQ ID NO: 41 en la figura. La secuencia de nucleótido representativa de la variante B22 suprimida de Cys N-terminal, denominada como "B22_001 " en la figura, está establecida en la SEQ ID NO: 52. La secuencia de nucleótido representativa de la variante B09 suprimida de Cys N-terminal, denominada como "B09_004" en la figura, está establecida en la SEQ ID NO: 53.
Figura 7: La Optimización de Codones Aumenta la Expresión de Variantes B22 y A22 no lipidadas. El cuadro de la izquierda demuestra la expresión de la variante B22 suprimida de Cys N-terminal antes (lineas 1 y 3) y después (líneas 2 y 4) de la inducción por IPTG. El cuadro de la derecha la expresión de la variante A22 suprimida de Cys N-terminal antes (línea 7) y después (línea 8) inducción por IPTG. Las líneas 5 y 6 son estándares de peso molecular.
Figura 8: Secuencias Ácido de Nucleico y Aminoácido de la Variante P2086 Figura 9A-9B: Alineación de Secuencia de variantes fHBP de la subfamilia A y B seleccionadas de tipo salvaje discutidas en los Ejemplos 15 a 19. Se debe destacar que la N-terminal de A62 es 100% idéntica a B09 y su C-terminal es 100% idéntica a A22. Las secuencias mostradas son A05 (SEQ ID NO: 13); A12 (SEQ ID NO: 14); A22 (SEQ ID NO: 15); A62 (SEQ ID NO: 70); B09 (SEQ ID NO: 18); B24 (SEQ ID NO: 20); y los Consensoss (SEQ ID NO: 78).
IDENTIFICADORES DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen A04, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 2 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen A05, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 3 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen A12, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 4 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen A12-2, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 5 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen A22, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 6 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, vanante 2086 gen B02, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 7 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B03, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 8 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B09, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 9 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B22, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 10 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B24, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 1 1 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B44, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.
La SEQ ID NO: 12 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A04, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 .
La SEQ ID NO: 13 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A05, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 14 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A12, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 15 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A22, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 16 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B02, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 .
La SEQ ID NO: 17 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B03, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 .
La SEQ ID NO: 18 establece la secuencia de aminoácido para el N, meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B09, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 .
La SEQ ID NO: 19 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B22, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 .
La SEQ ID NO: 20 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B24, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 .
La SEQ ID NO: 21 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B44, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 .
La SEQ ID NO: 22 establece una secuencia de ADN para un cebador directo, mostrada en el Ejemplo 2.
La SEQ ID NO: 23 establece una secuencia de ADN para un cebador inverso, mostrada en el Ejemplo 2.
La SEQ ID NO: 24 establece una secuencia de ADN para un cebador directo, mostrada en el Ejemplo 2, Tabla 1.
La SEQ ID NO: 25 establece una secuencia de ADN para un cebador inverso, mostrada en el Ejemplo 2, Tabla 1 .
La SEQ ID NO: 26 establece una secuencia de ADN para un cebador directo, mostrada en el Ejemplo 2, Tabla 1.
La SEQ ID NO: 27 establece una secuencia de ADN para un cebador inverso, mostrada en el Ejemplo 2, Tabla 1.
La SEQ ID NO: 28 establece una secuencia de ADN para un tallo de Gly/Ser, mostrada en el Ejemplo 4.
La SEQ ID NO: 29 establece la secuencia de aminoácido para un tallo de Gly/Ser, mostrada en el Ejemplo 4, que está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 28.
La SEQ ID NO: 30 establece una secuencia de ADN para un tallo de Gly/Ser, mostrada en el Ejemplo 4.
La SEQ ID NO: 31 establece la secuencia de aminoácido para un tallo de Gly/Ser, mostrada en el Ejemplo 4, que está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 30.
La SEQ ID NO: 32 establece una secuencia de ADN para un tallo de Gly/Ser, mostrada en el Ejemplo 4.
La SEQ ID NO: 33 establece la secuencia de aminoácido para un tallo de Gly/Ser, que está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 32 y la SEQ ID NO: 34.
La SEQ ID NO: 34 establece una secuencia de ADN para un tallo de Gly/Ser, mostrada en el Ejemplo 4.
La SEQ ID NO: 35 establece la secuencia de aminoácido para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B01 , mostrada en la Figura 5.
La SEQ ID NO: 36 establece la secuencia de aminoácido para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B44, mostrada en la Figura 5.
La SEQ ID NO: 37 establece la secuencia de aminoácido para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A05, mostrada en la Figura 5.
La SEQ ID NO: 38 establece la secuencia de aminoácido para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A22, mostrada en la Figura 5.
La SEQ ID NO: 39 establece la secuencia de aminoácido para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B22, mostrada en la Figura 5.
La SEQ ID NO: 40 establece la secuencia de aminoácido para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A19, mostrada en la Figura 5.
La SEQ ID NO: 41 establece la secuencia de aminoácido para la terminal N de a N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086, mostrada en la Figura 6.
La SEQ ID NO: 42 establece una secuencia de ADN para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A22, mostrada en la Figura 6.
La SEQ ID NO: 43 establece una secuencia de ADN optimizada de codones para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B44, donde el codón que codifica una cisteína N-terminal está suprimido, en comparación con la SEQ ID NO: 1 1. El plásmido pDK087 incluye la SEQ ID NO: 43.
La SEQ ID NO: 44 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis, serogrupo B, no lipidado variante 2086 B44. La SEQ ID NO: 44 es idéntica a la SEQ ID NO: 21 donde la cisteína N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 21 está suprimida. La SEQ ID NO: 44 está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43.
La SEQ ID NO: 45 establece una secuencia de ADN optimizada de codones para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B09, donde el codón que codifica una cisteína N-terminal está suprimido, y donde la secuencia incluye codones qué codifican una región Gly/Ser adicional, en comparación con la SEQ ID NO: 8. El plásmido pEB063 incluye la SEQ ID NO: 45.
La SEQ ID NO: 46 establece una secuencia de ADN optimizada de codones para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B09, donde el codón que codifica una cisteína N-terminal está suprimido, en comparación con la SEQ ID NO: 8. El plásmido pEB064 incluye la SEQ ID NO: 46.
La SEQ ID NO: 47 establece una secuencia de ADN optimizada de codones para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B09, donde el codón que codifica una cisteína N-terminal está suprimido, en comparación con la SEQ ID NO: 8. El plásmido pEB 065 incluye la SEQ ID NO: 47.
La SEQ ID NO: 48 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B09, donde el codón que codifica una cisteína N-terminal está suprimido, en comparación con la SEQ ID NO: 8. El plásmido pLA134 incluye la SEQ ID NO: 48.
La SEQ ID NO: 49 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis no lipidado, serogrupo B, variante 2086 B09. La SEQ ID NO: 49 es idéntica a la SEQ ID NO: 18 donde la cisteina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 18 está suprimida. SEQ ID 49 está codificada por, por ejemplo, una secuencia de ADN seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, y la SEQ ID NO: 48.
La SEQ ID NO: 50 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B09, donde el codón que codifica una cisteína N-terminal está suprimido y donde la secuencia incluye codones que codifican una región Gly/Ser adicional, en comparación con la SEQ ID NO: 18. La SEQ ID NO: 50 está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 45.
La SEQ ID NO: 51 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen B44, donde el codón que codifica una cisteína N-terminal está suprimido, en comparación con la SEQ ID NO: 11. El plásmido pLN056 incluye la SEQ ID NO: 51.
La SEQ ID NO: 52 establece una secuencia de ADN para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B22, mostrada en la Figura 6.
La SEQ ID NO: 53 establece una secuencia de ADN para la terminal N de N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B09, mostrada en la Figura 6.
La SEQ ID NO: 54 establece una secuencia de ADN para un N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086, gen A05, donde el codón que codifica una cisteína N-terminal está suprimido, en comparación con la SEQ ID NO: 2.
La SEQ ID NO: 55 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis no lipidado, serogrupo B, variante 2086 A05. La SEQ ID NO: 55 es idéntica a la SEQ ID NO: 13 donde la cisteína N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 13 está suprimida. La SEQ ID NO: 55 está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54.
La SEQ ID NO: 56 establece la secuencia de aminoácido de una secuencia repetida de serina-glicina, mostrada en el Ejemplo 7.
La SEQ ID NO: 57 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis no lipidado, serogrupo B, variante 2086 B01. La SEQ ID NO: 57 es idéntica a la SEQ ID NO: 58 donde la cisteína N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 58 está suprimida.
La SEQ ID NO: 58 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B01 , que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 59 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B15, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 60 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B16, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 61 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B22, en la que el codón para la Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 19 está reemplazado por un codón para una Glicina.
La SEQ ID NO: 62 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B22, en la que la Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 19 está reemplazado por una Glicina.
La SEQ ID NO: 63 establece una secuencia de ADN para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A22, en la que el codón para la Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 15 está reemplazado por un codón para una Glicina.
La SEQ ID NO: 64 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A22, en la que la Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 15 está reemplazado por una Glicina.
La SEQ ID NO: 65 establece una secuencia de ADN optimizada de codones (pEB042) que codifica un polipéptido no lipidado y no piruvilado A05.
La SEQ ID NO: 66 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis no lipidado, serogrupo B, variante 2086 A12. La SEQ ID NO: 66 es idéntica a la SEQ ID NO: 14 donde la cisteína N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 14 está suprimida. La SEQ ID NO: 66 está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 67.
La SEQ ID NO: 67 establece una secuencia de ADN optimizada de codones para un polipéptido no lipidado y no piruvilado A12.
La SEQ ID NO: 68 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis no lipidado, serogrupo B, variante 2086 A22. La SEQ ID NO: 68 es idéntica a la SEQ ID NO: 15 donde la cisteína N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 15 está suprimida. La SEQ ID NO: 68 está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 69.
La SEQ ID NO: 69 establece una secuencia de ADN optimizada de codones para un polipéptido no lipidado y no piruvilado A22.
La SEQ ID NO: 70 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis serogrupo B, variante 2086 A62, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1 .
La SEQ ID NO: 71 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis no lipidado, serogrupo B, variante 2086 A62. La SEQ ID NO: 71 es idéntica a la SEQ ID NO: 70 donde la cisteina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 70 está suprimida.
La SEQ ID NO: 72 establece una secuencia de ADN optimizada de codones para la SEQ ID NO: 71.
La SEQ ID NO: 73 establece una secuencia de ADN optimizada de codones (pDK086) para un N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 gen A05, donde el codón que codifica una cisteina N-terminal está suprimido, en comparación con la SEQ ID NO: 2.
La SEQ ID NO: 74 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A29, que incluye una Cys N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 75 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis no lipidado, serogrupo B, variante 2086 B22. La SEQ ID NO: 75 es idéntica a la SEQ ID NO: 19 donde la cisteina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 19 está suprimida.
La SEQ ID NO: 76 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 A05.
La SEQ ID NO: 77 establece la secuencia de aminoácido para un N. meningitidis no lipidado, serogrupo B, variante 2086 A05. La SEQ ID NO: 77 es idéntica a la SEQ ID NO: 19 donde la cisteina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 76 no está presente.
La SEQ ID NO: 78 establece la secuencia de aminoácido para una secuencia de consenso mostrada en la FIG. 9A-9B.
La SEQ ID NO: 79 es idéntica a la SEQ ID NO: 78 excepto que la Cys en la posición 1 de la SEQ ID NO: 78 no está presente.
La SEQ ID NO: 80 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B24. La SEQ ID NO: 80 es idéntica a la SEQ ID NO: 20 donde la cisteína N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 20 está suprimida.
La SEQ ID NO: 81 establece la secuencia de aminoácido para el N. meningitidis, serogrupo B, variante 2086 B24. La SEQ ID NO: 81 es idéntica a la SEQ ID NO: 20 en donde los residuos en la posición 1 a 3 de la SEQ ID NO: 20 se suprimen.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el que se conoce comúnmente por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica a los cuales pertenece esta invención. Si bien se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos que se describen en la presente en la práctica o pruebas de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos, y no pretenden ser limitantes. Todas las publicaciones, patentes y otros documentos mencionados en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. Definiciones El término "antígeno" por lo general se refiere a una molécula biológica, normalmente una proteína, péptido, polisacárido, lípido o conjugado que contiene al menos un epítopo al cual se puede unir en forma selectiva un anticuerpo cognado; o en algunas instancias a una sustancia inmunogénica que puede estimular la producción de anticuerpos o respuestas de células T, o ambas, en un animal, que incluye composiciones que se inyectan o absorbe en un animal. La respuesta inmune se puede generar para toda la molécula, o para una o más varias porciones de la molécula (por ej., un epítopo o hapteno). El término se puede utilizar para referirse a una molécula individual o a una población homogénea o heterogénea de moléculas antigénicas. Un antígeno está reconocido por anticuerpos, receptores de células T u otros elementos de inmunidad específica humoral y/o celular. El término "antígeno" incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. Los epítopos de un antígeno dado se pueden identificar por el uso de cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos, muy conocidas en la técnica. Véase, por ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J. Por ejemplo, los epítopos lineales se pueden determinar por medio de por ej., la síntesis simultánea de un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteina, y por medio de la reacción de los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos aún están adjuntos a los soportes. Tales técnicas son conocidas en la técnica y se describen, por ej., en la Patente de los Estados Unidos N.° 4.708.871 ; Geysen et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :3998 a 4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709 a 715, todos se incorporan como referencia en sus totalidades en la presente. En forma similar, los epítopos conformacionales se pueden identificar por medio de la determinación de la conformación espacial de aminoácidos tales como, por ej., por medio de cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ej., Epitope Mapping Protocols, supra. Además, para los propósitos de la presente invención, un "antígeno" también se pueden utilizar para referirse a una proteína que incluye modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (por lo general son conservativas por naturaleza, pero pueden ser no conservativas), con la secuencia nativa, con la condición de que la proteína mantenga la capacidad de obtener una respuesta inmunológica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como en el caso de mutagénesis dirigida al sitio, o a través de procedimientos sintético particulares, o a través de un enfoque de manipulación genética, o pueden ser accidentales, tales como a través de mutaciones de huéspedes, que producen los antígenos. Además, el antígeno se puede derivar, obtener, o aislar de un microbio, por ej. una bacteria, o puede ser un organismo completo. En forma similar, un olígonucleótido o polinucleótido, que expresa un antígeno, tal como en las aplicaciones de inmunización por ácido nucleico, también se incluye en la definición. Los antígenos sintéticos también están incluidos, por ejemplo, poliepítopos, epítopos de flanqueo, y otros antígenos recombinantes o derivados en forma sintética (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 a 2781 ; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242 a 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. y Cell Biol. 75:402 a 408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Suiza, 28 de Jun. al 3 de Jul., 1998).
El término sustituciones de aminoácidos "conservativas" se puede llevar a cabo con base en la similitud en cuanto a la polaridad, carga, solubilidad hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza antipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, triptofano, y metionina; los aminoácidos polares/neutrales incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos cargados en forma positiva (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y los aminoácidos cargados en forma negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas realizaciones, los cambios de aminoácido conservativos alteran la secuencia primaria de los polipéptidos ORF2086, pero no alteran la función de la molécula. Cuando se generan estos mutantes, se puede considerar el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos en la atribución de la función biológica interactiva en un polipéptido por lo general se comprende en la técnica (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157( ): 105 a 32). Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un similar índice hidropático o puntaje y aún dar lugar a un polipéptido con actividad biológica similar. Cada aminoácido se ha asignado a un índice hidropático con base en sus características de hidrofobicidad y carga. Estos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1 ,9); alanina (+1 ,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1 ,3); prolina (-1 ,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se cree que el carácter hidropático relativo del residuo de aminoácido determina la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante, que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos, y similares. Se conoce en la técnica que un aminoácido se puede sustituir por otro aminoácido que tiene un índice hidropático similar y aún obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +1-2, se prefieren en particular aquellos dentro de +/-1 , y se prefiere aún más en particular aquellos dentro de +/-0.5.
Las sustituciones o inserciones de aminoácidos conservativos también se pueden llevar a cabo con base en la hidrofilicidad. De acuerdo con lo descripto en la Patente de los Estados Unidos N.° 4.554.101 , que se incorpora como referencia en la presente, la mayor hidrofilicidad promedio local de un polipéptido, de acuerdo con lo gobernado por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica del polipéptido. La Patente de los Estados Unidos N.° 4.554.101 recita que los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1 ); glutamato (+3,0±1 ); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5±1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1 ,0); metionina (-1 ,3); valina (-1 ,5); leucina (-1 ,8); isoleucina (-1 ,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Se comprende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aún obtener un polipéptido biológicamente equivalente, y en particular, un polipéptido inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2; en particular se prefieren aquellos dentro de ±1 ; y aún más en particular se prefieren aquellos dentro de ±0,5. Las sustituciones representativas que toman en consideración varias de las características anteriores son muy conocidas para aquellos con experiencia en la técnica e incluyen, sin limitación: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
El término " cantidad inmunogénica efectiva" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a una cantidad de un polipéptido o composición que comprende un polipéptido que es efectiva para obtener una respuesta inmune en un huésped vertebrado. Por ejemplo, una cantidad inmunogénica efectiva de una proteína rl_P2086 de esta invención es una cantidad que es efectiva para obtener una respuesta inmune en un huésped vertebrado. La " dosificación o cantidad inmunogénico efectiva" particular dependerá de la edad, el peso y la condición médica del huésped, así como también del método de administración. Las dosis adecuadas se determinan con facilidad por aquellos con experiencia en la técnica.
El término "tallo de Gly/Ser" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a la serie de residuos Gly y Ser inmediatamente corriente abajo del residuo de la Cys N-terminal de una proteína codificada por ORF2086. Puede haber entre 5 y 12 residuos de Gly y Ser en el tallo de Gly/Ser. Por consiguiente, el tallo de Gly/Ser consiste en los aminoácidos 2 a entre 7 y 13 de la proteína codificada por ORF2086. Con preferencia, el tallo de Gly/Ser consiste en los aminoácidos 2 y hasta entre 7 y 13 de la proteína codificada por ORF2086. Los tallos de Gly/Ser de las variantes P2086 de la presente invención están representados por las secuencias subrayadas en la Figura 2 (SEQ ID NOs: 12 a 21). De acuerdo con lo mostrado en la presente, la longitud del tallo de Gly/Ser puede afectar la estabilidad o nivel de expresión de una variante P2086 no lipidada. En una realización representativa, los efectos de afectar la longitud del tallo de Gly/Ser se comparan con aquellos de la variante de tipo salvaje correspondiente.
El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de un antígeno o una vacuna para obtener una respuesta inmune, ya sea humoral o mediada por células, o ambas.
Una "cantidad inmunogénica", o una " cantidad inmunológicamente efectiva" o "dosis", cada uno de los se utilizan en forma intercambiable en la presente, por lo general se refiere a la cantidad de antígeno o composición inmunogénica suficiente para obtener una respuesta inmune, ya sea una respuesta celular (célula T) o humoral (célula B o anticuerpo), o ambas, de acuerdo con lo medido por medio de ensayos estándares conocidos para aquellos con experiencia en la técnica.
El término "composición inmunogénica" se refiere a cualquier composición farmacéutica que contiene un antígeno, por ej. un microorganismo, o un componente de los mismos, dicha composición se puede utilizar para obtener una respuesta inmune en un sujeto. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden utilizar para tratar a un ser humano susceptible a una infección por N. meningidis, por medio de la administración de las composiciones inmunogénicas a través de una vía sistémica transdérmica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección a través de las vías intramusculares (i.m.), intraperitoneales (i.p.), intradérmica (i.d.) o subcutáneas; la aplicación por medio de un parche u otro dispositivo de administración transdérmica; o a través de administración mucosal en los tractos oral/alimentarios, respiratorios o genitourinarios. En una realización, la composición inmunogénica se puede utilizar en la elaboración de una vacuna o en la obtención de un anticuerpo policlonal o monoclonal que se podría utilizar para proteger o tratar un sujeto en forma pasiva.
Las cantidades óptimas de componentes para una composición inmunogénica particular se pueden determinar por medio de estudios estándares que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Luego de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas en forma adecuada.
El término "aislado" significa que el material se retira se un ambiente original (por ej. , el ambiente natural si aparece en forma natural o de su organismo huésped si es una entidad recombinante, o si se toma de un ambiente para un ambiente diferente). Por ejemplo, una proteína o péptido "aislado" está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de cual está derivada la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando está químicamente sintetizada, o de lo contrario está presente en una mezcla como parte de una reacción química. En la presente invención, las proteínas pueden estar aisladas de la célula bacteriana o de restos celulares, de manera tal que se proporcionan en una forma útil en la elaboración de una composición inmunogénica. El término "aislado" o "aislación" puede incluir purificar, o la purificación, que incluye por ejemplo, los métodos de purificación de las proteínas, de acuerdo con lo descripto en la presente. La frase "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un polipéptido o proteína en la que el polipéptido o proteína está separada de los componentes celulares de las células de las cuales está aislado o producido en forma recombinante. Por lo tanto, una proteína o péptido que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones del polisacárido, proteína o péptido en cápsula que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5%, o 1 %, (en peso seco) de proteína o polisacárido u otro material celular contaminante. Cuando el polipéptido/proteína está producido en forma recombinante, también con preferencia está sustancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10%, o 5% del volumen de la preparación de la proteína. Cuando un polipéptido o proteína está producida por medio de síntesis química, con preferencia está sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos, es decir, está separado de precursores químicos u otros químicos que están implicados en la síntesis de la proteína o polisacárido. Por consiguiente, tales preparaciones del polipéptido o proteína tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos al polipéptido/proteína o fragmento de polisacárido de interés.
El término "cola de la N terminal" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a la porción N-terminal de una proteína codificada por ORF2086, que adjunta la proteína a la membrana celular. Una cola de la N terminal se muestra en la parte inferior de la estructura en vista lateral en la Figura 3. Una cola de la N terminal en forma típica comprende los 16 aminoácidos N-terminales de la proteína codificada por ORF2086. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal son los aminoácidos 1 a 16 de cualquiera de las SEQ ID NOs: 12 a 21. El término "ORF2086" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere al Marco de Lectura Abierto 2086 de las bacterias de la especie Neisseria. La ORF2086 de Neissería, las proteínas codificadas del mismo, los fragmentos de esas proteínas, y las composiciones inmunogénicas que comprenden esas proteínas son conocidas en la técnica y se describen, por ej., en WO2003/063766, y en Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° US 20060257413 y US 20090202593, cada uno de cuales se incorpora como referencia en su totalidad en la presente.
El término "P2086" por lo general se refiere a la proteína codificada por ORF2086. La "P" antes de "2086" es una abreviatura de "proteína." Las proteínas P2086 de la invención pueden ser lipidadas o no lipidadas. "LP2086" y "P2086" en forma típica se refieren a formas lipidadas y no lipidadas de una proteína 2086, respectivamente. La proteína P2086 de la invención puede ser recombinante. "rLP2086" y "rP2086" en forma típica se refieren a las formas lipidadas y no lipidadas de una proteína 2086 recombinante, respectivamente. "2086" también se conoce como la proteína de unión al factor H (fHBP) debido a su capacidad para unirse al factor H.
El término "diluyente, excipiente, y/o portador aceptables para uso farmacéutico" de acuerdo con lo utilizado en la presente pretende incluir cualquier y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, compatibles con la administración a seres humanos u otros huéspedes vertebrados. En forma típica, un diluyente, excipiente, y/o portador aceptables para uso farmacéutico es un diluyente, excipiente, y/o portador aprobados por una agencia regulatoria de un gobierno Federal, estatal, u otra agencia regulatoria, o enumerada en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, que incluye seres humanos así como también mamíferos no humanos. El término "diluyente, excipiente, y/o portador" se refieren a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra la composición farmacéutica. Tales diluyentes, excipientes, y/o portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen las de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético. Se pueden emplear agua, soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como diluyentes, excipientes, y/o portadores líquidos, en particular para soluciones inyectables. Los diluyentes y/o excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de humectantes, agentes de carga, emulsificantes, o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden adquirir la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, formulaciones de liberación sostenida y similares. Los ejemplos de diluyentes, excipientes, y/o portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. La formulación se debe adecuar al modo de administración. El diluyente, excipiente, y/o portador apropiados serán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica y dependerá en gran parte de la vía de administración.
Una respuesta inmune "protectora" se refiere a la capacidad de una composición inmunogénica para obtener una respuesta inmune, ya sea humoral o mediada por células, que sirve para proteger al sujeto de una infección. La protección proporcionada no necesita ser absoluta, es decir, la infección no necesita prevenirse o erradicarse en forma total, si existe una mejora estadísticamente significativa en comparación con una población de sujetos de control, por ej. animales infectados no administrados con la vacuna o composición inmunogénica. La protección se puede limitar a la mitigación de la severidad o rapidez del inicio de los síntomas de la infección. Por lo general, una " respuesta inmune protectora" incluiría la inducción de un aumento en los niveles de anticuerpos específicos para un antígeno particular en al menos 50% de los sujetos, que incluye algún nivel de respuestas de anticuerpos funcionales mensurables para cada antígeno. En situaciones particular, una "respuesta inmune protectora " podría incluir la inducción de un aumento en dos veces en los niveles de anticuerpos o un aumento en cuatro veces en los niveles de anticuerpos específicos para un antígeno particular en al menos 50% de los sujetos, que incluye algún nivel de respuestas de anticuerpos funcionales mensurables para cada antígeno. En ciertas realizaciones, los anticuerpos opsonizantes se correlacionan con una respuesta inmune protectora. Por lo tanto, la respuesta inmune protectora se puede ensayar por medio de la medición de la disminución porcentual en el recuento bacteriano en un ensayo de la actividad bactericida en suero (SBA) o un ensayo de opsonofagocitosis, por ejemplo aquellos que se describen a continuación. Tales ensayos también son conocidos en la técnica. Para vacunas meningocócicas, por ejemplo, el ensayo de SBA es un sustituto establecido para la protección En algunas realizaciones, existe una disminución en el recuento bacteriano de al menos 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más, en comparación con el recuento bacteriano en ausencia de la composición inmunogénica.
Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no están limitados a una longitud mínima del producto. Por lo tanto, los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares, están incluidos dentro de la definición. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas están abarcadas por la definición. Los términos también incluyen modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (por lo general son conservativas por naturaleza, pero pueden ser no conservativas), a una secuencia nativa, con preferencia de manera tal que la proteína mantiene la capacidad para obtener una respuesta inmunológica dentro de un animal al cual se administra la proteína. También se incluyen modificaciones posteriores a la expresión, por ej. glicosilación, acetilación, lipidación, fosforilación y similares.
Las variantes activas y fragmentos de los polinucleótidos y polipéptidos revelados también se describen en la presente. Las "variantes" se refieren a secuencias sustancialmente similares. De acuerdo con lo utilizado en la presente, un "polipéptido variante" se refiere a un polipéptido derivado de la proteína nativa por medio de una modificación de uno o más aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa. La modificación puede incluir la supresión (denominada truncamiento) de uno o más aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; supresión y/o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Los polipéptidos variantes continúan hasta poseer la actividad biológica deseada del polipéptido nativo, esto es, son inmunogénicos. Una variante de una secuencia de polipéptido o polunucleótido revelada en la presente (es decir, las SEQ ID NOs: 1 a 25 o 39) en forma típica tendrán al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la secuencia de referencia.
El término "fragmento" se refiere a una porción de un aminoácido o secuencia de nucleótidos que comprende un número especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos contiguos. En realizaciones particulares, un fragmento de un polipéptido revelado en la presente puede retener la actividad biológica del polipéptido de longitud completa y de ese modo ser inmunogénicos. Los fragmentos de un polunucleótido pueden codificar fragmentos de proteina que retienen la actividad biológica de la proteína y de ese modo son inmunogénicos. En forma alternativa, los fragmentos de un polunucleótido que son útiles como cebadores PCR por lo general no retienen actividad biológica. Por lo tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos revelada en la presente puede oscilar entre al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400, o 1500 nucleótidos contiguos o hasta el polunucleótido de longitud completa. Los fragmentos de una secuencia de polipéptido revelada en la presente pueden comprender al menos 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 425, 450, 475, o 500 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en el polipéptido de longitud completa.
El término "recombinante" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a cualquier proteína, polipéptido, o célula que expresa un gen de interés que está producido por medio de métodos de manipulación genética. El término "recombinante" de acuerdo con lo utilizado con respecto a una proteína o polipéptido, significa un polipéptido producido por medio de la expresión de un polinucleótido recombinante. Las proteínas de la presente invención pueden estar aisladas de una fuente natural o producidas por medio de métodos de manipulación genética. "Recombinante", de acuerdo con lo utilizado en la presente, además describe una molécula de ácido nucleico, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociada con toda o una porción del polinucleótido con el que está asociada en la naturaleza. El término "recombinante" de acuerdo con lo utilizado con respecto a una célula huésped significa una célula huésped que incluye un polinucleótido recombinante.
El término "sujeto" se refiere a un mamífero, ave, pez, reptil, o cualquier otro animal.
El término "sujeto" también incluye seres humanos. El término "sujeto" también incluye animales domésticos. Los ejemplos no limitantes de animales domésticos incluyen: perros, gatos, cerdos, conejos, ratas, ratones, jerbos, hámsteres, cobayos, hurones, aves, serpientes, lagartos, peces, tortugas y ranas. El término "sujeto" también incluye animales de ganado. Los ejemplos no limitantes de animales de ganado incluyen: alpacas, bisontes, camellos, bovinos, ciervos, cerdos, caballos, llamas, muías, burros, ovejas, cabras, conejos, renos, yaks, gallinas, gansos, y pavos.
El término "mamíferos" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a cualquier mamífero, tal como, por ejemplo, seres humanos, ratones, conejos, primates no humanos. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.
Los términos "vacuna" o "composición de vacuna", que se utilizan en forma intercambiable, se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una composición inmunogénica que induce una respuesta inmune en un sujeto.
Descripción General La presente invención también identifica dificultades previamente no identificadas que expresan las variantes P2086 no lipidadas y proporciona métodos para superar estas dificultades y composiciones novedosas de las mismas. Si bien los constructos de plásmidos que codifican variantes P2086 no lipidadas proporcionaban una expresión fuerte de las variantes no lipidadas, estas variantes estaban piruviladas en la Cys N-terminal. La piruvilación previene o reduce la probabilidad de consistencia o uniformidad de elaboración de los polipéptidos. Los inventores además hallaron que la supresión de la Cys N-terminal de las secuencias de variantes P2086 no lipidadas evitaba la piruvilación de las variantes P2086 no lipidadas. Los intentos por superar la piruvilación por medio de la supresión del codón para la Cys N-terminal ya sea derogaban la expresión o daban lugar a la expresión de variantes insolubles. En forma alternativa, la eliminación de la Cys N-terminal de las variantes P2086 no lipidadas disminuyó la expresión en algunas vanantes. Sin embargo, en forma sorprendente, los inventores descubrieron que al menos las variantes A05, A12, A22, A62, B01 , B09, B22, y B44 no piruviladas y no lipidadas se pueden expresar independientemente de la supresión del residuo de Cys N-terminal. Por lo general, estos polipéptidos se podrían expresar sin modificaciones adicionales distintas a la supresión de Cys, en comparación con la secuencia no lipidada de tipo salvaje correspondiente. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 2 y 4. Además, los inventores descubrieron que las variantes no piruviladas y no lipidadas eran sorprendentemente inmunogénicas y obtenían inesperadamente anticuerpos bactericidas.
Por consiguiente, la presente invención proporciona dos métodos para superar o reducir la probabilidad de estas dificultades en la expresión de variantes no lipidadas. Sin embargo, están contemplados métodos adicionales por la presente invención. El primer método fuer variar la longitud del tallo de Gly/Ser en la cola de la N-terminal, inmediatamente corriente abajo de la Cys N-terminal. El segundo método fue la optimización de codones dentro de la cola de la N terminal. Sin embargo, la optimización de codones adicionales está contemplada por la presente invención. Estos métodos proporcionan una expresión potenciada de las variantes P2086 solubles no lipidadas. Por ejemplo, en una realización, la expresión potenciada de variantes P2086 solubles no lipidadas se compara con la expresión de las variantes no lipidadas de tipo salvaje correspondientes.
Polipéptidos aislados En forma sorprendente, los inventores descubrieron polipéptidos ORF2086 aislados no piruvilados, no lipidados. Los inventores además descubrieron que los polipéptidos son inesperadamente inmunogénicos y son capaces de obtener una respuesta inmune bactericida.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, el término "no piruvilado" se refiere a un polipéptido que no tiene contenido de piruvato. Los polipéptidos ORF2086 no lipidados que tienen un contenido de piruvato en forma típica exhibieron un cambio de masa de +70, en comparación con el polipéptido de tipo salvaje correspondiente. En una realización, el polipéptido inventivo no exhibe un cambio de masa de +70 en comparación con el polipéptido no lipidado de tipo salvaje correspondiente cuando se mide por medio de espectrometría de masas. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 10.
En otra realización, el polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado incluye una supresión de un residuo de cisteína N-terminal comparado con el polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo salvaje correspondiente. El término "cisteína N-terminal" se refiere a una cisteína (Cys) en la N-terminal o cola de la N terminal de un polipéptido. En forma más específica, la "cisteína N-terminal" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a la cisteína N-terminal en la cual las lipoproteínas LP2086 están lipidadas con una cola de lípido tripalmitoil, de acuerdo con lo conocido en la técnica. Por ejemplo, cuando se refiere a cualquiera de las SEQ ID NOs: 12 a 21 como una secuencia de referencia, la cisteína N-terminal está ubicada en la posición 1. Como otro ejemplo, cuando se refiere a la SEQ ID NO: 70 como una secuencia de referencia, la cisteína N-terminal está ubicada en la posición 1.
El término "polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo salvaje" o "polipéptido 2086 no lipidado de tipo salvaje" o "polipéptido no lipidado de tipo salvaje" de acuerdo con lo utilizado en la presente se refiere a un polipéptido ORF2086 que tiene una secuencia de aminoácido que es idéntica a la secuencia de aminoácido del polipéptido ORF2086 lipidado maduro correspondiente que se halla en la naturaleza. La única diferencia entre las moléculas no lipidadas y las lipidadas es que el polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo salvaje no está lipidado con una cola de lípido tripalmitoil en la cisteína N-terminal.
De acuerdo con lo conocido en la técnica, la forma 2086 no lipidado se produce por medio de una proteína que carece de la secuencia líder original o por medio de una secuencia líder que está reemplazada por una porción de secuencia que no especifica un sitio de acilación de ácidos grasos en una célula huésped. Véase, por ejemplo, WO2003/063766, que se incorpora como referencia en su totalidad en la presente.
Los ejemplos de un ORF2086 no lipidado incluyen no únicamente un polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo salvaje recién descripto sino también polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs: 12 a 21 donde la Cys N-terminal está suprimida y polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs: 12 a 21 donde la Cys N-terminal está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Otro ejemplo de un polipéptido ORF2086 no lipidado incluye un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 70 donde la Cys N-terminal está suprimida y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 70 donde la Cys N-terminal está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Los ejemplos adicionales de un polipéptido ORF2086 no lipidado incluyen las secuencias de aminoácido seleccionadas de la SEQ ID NO: 44 (B44), la SEQ ID NO: 49 (B09), la SEQ ID NO: 55 (A05), la SEQ ID NO: 57 (B01 ), la SEQ ID NO: 58 (B01 ), la SEQ ID NO: 62 (B22), la SEQ ID NO: 64 (A22), y la SEQ ID NO: 75 (B22). Los ejemplos aún adicionales de un polipéptido ORF2086 no lipidado incluyen las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID NO: 66 (A12), la SEQ ID NO: 68 (A22), y la SEQ ID NO: 71 (A62). Más ejemplos incluyen la SEQ ID NO: 80 (B24) y la SEQ ID NO: 81 (B24). Los ejemplos adicionales de un polipéptido ORF2086 no lipidado incluyen las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77. En una realización, el polipéptido no lipidado incluye la secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a una secuencia que codifica el polipéptido no lipidado correspondiente. Por ejemplo, en una realización representativa, el polipéptido A62 no lipidado incluye la secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 71.
Los ejemplos de un polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo salvaje incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs: 12 a 21 , mostrada en la Figura 2, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, y la SEQ ID NO: 60. Otro ejemplo de un polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo salvaje incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 70. Estos polipéptidos ORF2086 no lipidados de tipo salvaje representativos incluyen una Cys N-terminal.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, por ejemplo, un polipéptido B44 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 21 , la SEQ ID NO: 21 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, y la SEQ ID NO: 44. Un polipéptido B44 "no lipidado de tipo salvaje" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 21 . Un polipéptido B44 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 21 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, y la SEQ ID NO: 44.
Como otro ejemplo, de acuerdo con lo utilizado en la presente, un polipéptido B09 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 18 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, la SEQ ID NO: 49, y la SEQ ID NO: 50. Un polipéptido B09 "no lipidado de tipo salvaje" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 18. Un polipéptido B09 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 18 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, la SEQ ID NO: 49, y la SEQ ID NO: 50.
Aún como un ejemplo adicional, de acuerdo con lo utilizado en la presente, un polipéptido A05 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, y la SEQ ID NO: 55. Otro ejemplo de un polipéptido A05 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Un ejemplo adicional de un polipéptido A05 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 76. Aún otro ejemplo de un polipéptido A05 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 77. Un polipéptido A05 "no lipidado de tipo salvaje" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 13. Un polipéptido A05 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida y la SEQ ID NO: 55. Los ejemplos adicionales de un A05 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys; la SEQ ID NO: 76 donde la Cys en la posición 1 está suprimida; la SEQ ID NO: 76 donde la Cys en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys; y la SEQ ID NO: 77.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, un polipéptido A62 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 70 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, y la SEQ ID NO: 71. Otro ejemplo de un polipéptido A62 no lipidado incluye un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 70 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Un polipéptido A62 "no lipidado de tipo salvaje" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 70. Un polipéptido A62 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 70 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, y la SEQ ID NO: 71. Otro ejemplo de un polipéptido A62 no piruvilado y no lipidado incluye un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 70 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Con preferencia, un polipéptido A62 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, un polipéptido A12 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 14 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, y la SEQ ID NO: 66. Un polipéptido A12 "no lipidado de tipo salvaje" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 14. Un polipéptido A12 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 14 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, y la SEQ ID NO: 66.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, un polipéptido A22 "no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 15 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, la SEQ ID NO: 64, y la SEQ ID NO: 68. Un polipéptido A22 "no lipidado de tipo salvaje" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 15. Un polipéptido A22 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 15 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, la SEQ ID NO: 64, y la SEQ ID NO: 68. Con preferencia, un polipéptido A22 "no piruvilado y no lipidado" incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 68.
El término "supresión" de la Cys N-terminal de acuerdo con lo utilizado en la presente incluye una mutación que suprime la Cys N-terminal, en comparación con una secuencia de polipéptido no lipidado de tipo salvaje. Por ejemplo, una "supresión" de la Cys N-terminal se refiere a una eliminación del aminoácido Cys de una secuencia de referencia, por ej., de la secuencia de tipo salvaje correspondiente, lo que da lugar a una disminución de un residuo de aminoácido en comparación con la secuencia de referencia. A menos que se describa lo contrario, los términos "Cys N-terminal," "Cys N-terminal en la posición 1 ," "Cys en la posición 1 " son intercambiables.
En otra realización, la Cys N-terminal está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Por ejemplo, en una realización representativa, la Cys N-terminal en la posición 1 de las SEQ ID NOs: 12 a 21 incluye una sustitución C?G en la posición 1. Véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 62 en comparación con la SEQ ID NO: 19 (B22 de tipo salvaje), y la SEQ ID NO: 64 en comparación con la SEQ ID NO: 15 (A22 de tipo salvaje). Los aminoácidos representativos para reemplazar la Cys N-terminal incluyen cualquier aminoácido no Cys, con preferencia un aminoácido polar no cargado tal como, por ejemplo, glicina. En una realización preferida, la sustitución está hecha con un residuo no conservador de Cys.
Los inventores en forma sorprendente descubrieron que la expresión de polipéptidos ORF2086 no lipidado que tienen una supresión de un residuo de Cys N-terminal no dio lugar a piruvilación detectable alguna cuando se midió por medio de espectrometría de masas, en comparación con el polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo salvaje correspondiente. Los ejemplos de polipéptidos ORF2086 no piruvilado y no lipidado incluyen aquellos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12 (A04), la SEQ ID NO:13 (A05), la SEQ ID NO:14 (A12), la SEQ ID NO:15 (A22), la SEQ ID NO-.16 (B02) , la SEQ ID NO: 17 (B03), la SEQ ID NO: 18 (B09), la SEQ ID NO: 19 (B22), la SEQ ID NO: 20 (B24), la SEQ ID NO: 21 (B44), y la SEQ ID NO: 70 (A62), donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. Otro ejemplo de un polipéptido ORF2086 no piruvilado y no lipidado incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 58 (B01 ), donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. Los ejemplos adicionales de polipéptidos ORF2086 aislados fio piruvilados y no lipidados incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 71 , y la SEQ ID NO: 75. Un ejemplo adicional de un polipéptido ORF2086 no piruvilado y no lipidado incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 57 (B01 ). Otro ejemplo un polipéptido ORF2086 aislado, no piruvilado y no lipidado incluye un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 77 (A05); un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 76 (A05) donde la Cys en la posición 1 está suprimida; y un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 76 (A05) donde la Cys en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Los ejemplos adicionales de polipéptidos ORF2086 no piruvilados y no lipidados incluyen aquellos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12 (A04), la SEQ ID NO: 13 (A05), la SEQ ID NO: 14 (A12), la SEQ ID NO: 15 (A22), la SEQ ID NO: 58 (B01 ), la SEQ ID NO: 16 (B02), la SEQ ID NO: 17 (B03), la SEQ ID NO: 18 (B09), la SEQ ID NO: 19 (B22), la SEQ ID NO: 20 (B24), la SEQ ID NO: 21 (B44), y la SEQ ID NO: 70 (A62) donde la cisteina en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Con preferencia, el polipéptido 2086 no piruvilado y no lipidado incluye al menos aproximadamente 250, 255, o 260 aminoácidos consecutivos, y a lo sumo aproximadamente 270, 269, 268, 267, 266, 265, 264, 263, 260, 259, 258, 257, 256, o 255 aminoácidos consecutivos. Se puede combinar cualquier valor mínimo con cualquier valor máximo para definir un intervalo. Con mayor preferencia, el polipéptido tiene al menos 254 o 262 aminoácidos consecutivos. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene a lo sumo262 aminoácidos consecutivos. En otras realizaciones, el polipéptido tiene a lo sumo254 aminoácidos consecutivos. En una realización, el polipéptido no piruvilado y no lipidado incluye la secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%. 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a una secuencia que codifica el polipéptido no piruvilado y no lipidado correspondiente. Por ejemplo, en una realización representativa, el polipéptido A62 no piruvilado y no lipidado incluye la secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 71.
En una realización, el polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado está codificado por una secuencia de nucleótido que está vinculada en forma operativa a un sistema de expresión, donde el sistema de expresión es capaz de expresarse en una célula bacteriana. En una realización representativa, la secuencia de nucleótido está vinculada a una secuencia regulatoria que controla la expresión de la secuencia de nucleótido.
Los sistemas de expresión, las secuencias regulatorias, y células bacterianas adecuadas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier vector de expresión de plásmidos, por ej., PET™ (Novogen, Madison Wis.) o PMAL™ (New England Biolabs, Beverly, Mass.) con la condición de que el polipéptido sea capaz de expresarse en una célula bacteriana. Con preferencia, se utiliza el vector PET™ para la clonación y expresión de proteínas recombinantes en E. coli. En el sistema PET™, el gen clonada se puede expresar bajo el control de un promotor de fago T7. Las células bacterianas representativas incluyen Pseudomonas fluorescens, y con preferencia, E. coli.
En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido ORF2086 no lipidado y no piruvilado que se puede obtener por medio del proceso. El polipéptido con preferencia es aislado. La invención además se refiere a composiciones que incluyen un polipéptido ORF2086 no lipidado y no piruvilado que se puede obtener por medio de un proceso. La composición con preferencia es una composición inmunogénica. El proceso incluye la expresión de una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO:14, la SEQ ID NO:15, la SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 21 , la SEQ ID NO: 58, y la SEQ ID NO: 70, donde la cisterna en la posición 1 está suprimida. En otra realización, el proceso incluye la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 76, donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. En una realización adicional, el proceso incluye la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO:16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 21 , la SEQ ID NO: 58, y la SEQ ID NO: 70, donde la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. La secuencia de nucleótido está vinculada en forma operativa a un sistema de expresión que es capaz de expresarse en una célula bacteriana.
En una realización, el proceso incluye la expresión de una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 71 , la SEQ ID NO: 57, y la SEQ ID NO: 75. En otra realización, el proceso incluye la expresión de una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido en la SEQ ID NO: 77. En otra realización, la secuencia de nucleótido está seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 51 , la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 69, y la SEQ ID NO: 72. Con preferencia, la célula bacteriana es E. coli.
B09, B44, A05: En un aspecto, la invención se refiere a una composición que incluye un primer polipéptido aislado, que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 49 (B09), y un segundo polipéptido aislado, que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 44 (B44). En una realización preferida, los polipéptidos son inmunogénicos. En otra realización preferida, la composición además incluye un polipéptido de la subfamilia ORF2086 del N. meningitidis serogrupo B. Con preferencia, el polipéptido de la subfamilia ORF2086 es un polipéptido de la subfamilia A ORF2086 no piruvilado y no lipidado. En una realización representativa, el polipéptido de la subfamilia ORF2086 es A05, los ejemplos de los cuales incluyen, por ejemplo, la SEQ ID NO: 13, donde la cisteína N-terminal en la posición 1 está suprimida, y la SEQ ID NO: 55. En otra realización representativa, la composición incluye un polipéptido A05 no piruvilado y no lipidado que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 76 donde la Cys en la posición 1 está suprimida; la SEQ ID NO: 76 donde la Cys en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys; y la SEQ ID NO: 77.
Dominios de Polipéptidos En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir un polipéptido aislado. El método incluye la expresión en una célula bacteriana de un polipéptido, que incluye una secuencia que tiene más de 90% de identidad con la SEQ ID NO:21 , dicha secuencia incluye al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 13 a 18 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 21 a 34 de la SEQ ID NO: 21 , y aminoácidos 70 a 80 de la SEQ ID NO: 21 , o una combinación de los mismos, donde el polipéptido carece de una cisteína N-terminal. El método además incluye la purificación del polipéptido. El polipéptido producido en el mismo incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado y no piruvilado. Con preferencia, el polipéptido es inmunogénico. En una realización preferida, la célula bacteriana es E. coli.
Los ejemplos de polipéptidos que incluyen al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 13 a 18 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 21 a 34 de la SEQ ID NO: 21 , y aminoácidos 70 a 80 de la SEQ ID NO: 21 , o una combinación de los mismos, que incluyen la SEQ ID NO: 12 (A04), la SEQ ID NO: 13 (A05), la SEQ ID NO: 14 (A12), la SEQ ID NO: 15 (A22), la SEQ ID NO: 16 (B02), la SEQ ID NO: 17 (B03), la SEQ ID NO: 18 (B09), la SEQ ID NO: 19 (B22), la SEQ ID NO: 20 (B24), y la SEQ ID NO: 21 (B44). Con preferencia, la cisteína en la posición 1 de estos polipéptidos está suprimida. En otra realización, la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. Los polipéptidos representativos adicionales incluyen la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 62, y la SEQ ID NO: 64. Otro polipéptido representativo incluye la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 71. Un polipéptido representativo adicional incluye la SEQ ID NO: 76. Aún otro polipéptido representativo incluye la SEQ ID NO: 77. Los ejemplos adicionales incluyen SEQ ID NO: 80 (B24) y SEQ ID NO: 81 (B24).
En una realización representativa, la secuencia de polipéptido aislada además incluye al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 96 a 1 16 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos158 a 170 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 172 a 185 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 187 a 199 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 213 a 224 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 226 a 237 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 239 a 248 de la SEQ ID NO: 21 , o una combinación de los mismos. Los ejemplos de polipéptidos que incluyen al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 13 a 18 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 21 a 34 de la SEQ ID NO: 21 , y aminoácidos 70 a 80 de la SEQ ID NO: 21 , o una combinación de los mismos, y que además incluye al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 96 a 1 16 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 158 a 170 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 172 a 185 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 187 a 199 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 213 a 224 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 226 a 237 de la SEQ ID NO: 21 , los aminoácidos 239 a 248 de la SEQ ID NO: 21 , o una combinación de los mismos, que incluyen la SEQ ID NO: 16 (B02), la SEQ ID NO: 17 (B03), la SEQ ID NO: 18 (B09), la SEQ ID NO: 19 (B22), la SEQ ID NO: 20 (B24), y la SEQ ID NO: 21 (B44). Con preferencia, la cisteína en la posición 1 de estos polipéptidos está suprimida. Los polipéptidos representativos adicionales incluyen un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50, y la SEQ ID NO: 55, y la SEQ ID NO: 62.
En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado producido por medio de un proceso descripto en la presente. En una realización, el polipéptido aislado es un polipéptido no piruvilado y no lipidado. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica producida por medio de un proceso descripto en la presente.
Secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos B09: En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 18 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 49. Las secuencias de nucleótidos representativas que codifican la SEQ ID NO: 49 incluyen las secuencias seleccionadas de la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, y la SEQ ID NO: 48. Con preferencia, la secuencia de nucleótido es la SEQ ID NO: 46. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 46. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 47. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 48.
En un aspecto, la invención se refiere a un plásmido que incluye una secuencia de nucleótido seleccionada de la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 48, y la SEQ ID NO: 45, donde el plásmido es capaz de expresarse en una célula bacteriana. Los sistemas de expresión adecuados, secuencias regulatorias, y células bacterianas son conocidas en la técnica, de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Con preferencia, la célula bacteriana es E. coli.
En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 50. En una realización representativa, la SEQ ID NO: 50 está codificada por la SEQ ID NO: 45.
B44: Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 21 donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 44. Las secuencias de nucleótidos representativas que codifican la SEQ ID NO: 44 incluyen las secuencias seleccionadas de la SEQ ID NO; 43 y la SEQ ID NO: 51. Con preferencia, la secuencia de nucleótido es la SEQ ID NO: 43. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 43.
A05: En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 13 (A05) donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 55. Las secuencias de nucleótidos representativas que codifican la SEQ ID NO: 55 incluyen las secuencias seleccionadas de la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 65, y la SEQ ID NO: 73. Con preferencia, la secuencia de nucleótido es la SEQ ID NO: 65. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 54. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 65. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 73.
A12: En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 14 (A12) donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 66. Las secuencias de nucleótidos representativas que codifican la SEQ ID NO: 66 incluyen la SEQ ID NO: 67. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 67.
A22: Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 15 (A22) donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 68. Las secuencias de nucleótidos representativas que codifican la SEQ ID NO: 68 incluyen la SEQ ID NO: 69. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 69.
A62: En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 71 , donde los primeros 20 residuos de aminoácidos de la secuencia no contiene una cisteína. Con preferencia, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en las posiciones 1 a 184 de la SEQ ID NO: 71. El polipéptido con preferencia es no lipidado y no piruvilado. En otra realización, el polipéptido es inmunogénico.
En otra realización, el polipéptido aislado incluye un fragmento de A62. Los fragmentos representativos de A62 incluyen cualquier número de residuos contiguos de la SEQ ID NO: 70 o la SEQ ID NO: 71. En una realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido en las posiciones 158 a 185 de la SEQ ID NO: 71. En otra realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácido en las posiciones 159 a 186 de la SEQ ID NO: 71. En una realización, el polipéptido incluye al menos 6 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido en las posiciones 185 a 254 de la SEQ ID NO: 71.
En otro aspecto, la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 71 , donde los primeros 20 residuos de aminoácidos de la secuencia no contiene una cisteína. Con preferencia, el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71. En una realización, la secuencia de ácido nucleico aislado incluye la SEQ ID NO: 72.
Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 70 (A62) donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 71. Las secuencias de nucleótidos representativas que codifican la SEQ ID NO: 71 incluyen la SEQ ID NO: 72. En un aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada que incluye la SEQ ID NO: 72.
Composiciones inmunogénicas En una realización preferida, las composiciones descriptas en la presente que incluyen un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado son inmunogénicas. Las composiciones inmunogénicas que incluyen una proteína codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria meningitidis ORF2086 son conocidas en la técnica. Las composiciones inmunogénicas representativas incluyen aquellas que se describen en WO2003/063766, y la publicación solicitud de patente de los Estados Unidos números US 20060257413 y US 20090202593, que se incorporan como referencia en su totalidad en la presente. Tales composiciones inmunogénicas de acuerdo con lo descripto en el mismo incluyen una proteína que exhibe una actividad bactericida identificada como la proteína ORF2086, las porciones inmunogénicas de la misma, y/o equivalentes biológicos de las mismas. La proteína ORF2086 se refiere a una proteína codificada por el marco de lectura abierto 2086 de la especie Neisseria.
La proteína puede ser una proteína recombinante o una proteína aislada de la especie Neisseria nativa. Por ejemplo, las proteínas ORF2086 Neisseria pueden estar aisladas de cepas bacterianas, tales como las de la especie Neisseria, que incluye cepas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z, y 29E), Neisseria gonorrhoeae, y Neisseria lactamica, así como también porciones inmunogénicas y/o equivalentes biológicos de dichas proteínas.
Las proteínas ORF2086 incluyen proteínas 2086 de la Subfamilia A y proteínas de la Subfamilia B, porciones inmunogénicas de las mismas, y/o equivalentes biológicos de las mismas. Las proteínas 2086 de la subfamilia A y proteínas 2086 de la subfamilia B son conocidas en la técnica, véase, por ejemplo Fletcher et al., 2004 citado con anterioridad y Murphy et al., J Infecí Dis. 2009 Aug 1 ;200(3):379 a 89. Véase también WO2003/063766, que revela las SEQ ID NOs: 260 a 278 en el mismo como secuencias de aminoácido representantes asociadas con las proteínas 2086 de la Subfamilia A. En adición, en WO2003/063766 se revelan las SEQ ID NOS: 279 a 299 en el mismo como secuencias de aminoácido representantes asociadas con las proteínas 2086 de la Subfamilia B. WO2003/063766 se incorpora como referencia en su totalidad en la presente. Las proteínas ORF2086 o equivalentes de las mismas, etc. pueden ser lipidadas o no lipidadas. Con preferencia, la proteína ORF2086 Neisseria es no lipidada. En forma alternativa, las composiciones inmunogénicas pueden ser combinaciones de proteínas ORF2086 lipidadas y no lipidadas.
En una realización, la composición ¡nmunogénica incluye una proteína aislada que tiene al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácido con una proteína codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086. En otra realización, la composición ¡nmunogénica incluye una proteína aislada que tiene al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia de aminoácido idéntica a una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086.
En una realización, la composición ¡nmunogénica incluye una proteína aislada que tiene al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácido con una proteína de la Subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086. Con preferencia, la composición ¡nmunogénica incluye una proteína aislada de la Subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086. En algunas realizaciones, el polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A es una variante A05, una A04, una A 2, una A62, o una A22. En algunas realizaciones, el polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A es una variante A05, una A12, o una A22.
Combinación de polipéptidos de la subfamilia A: En una realización, la composición incluye cualquier combinación de polipéptidos ORF2086 de la Subfamilia A. Las combinaciones representativas de polipéptidos ORF2086 de la Subfamilia A incluyen, por ejemplo, A05 y A12; A05 y A22; A05 y A62; A12 y A62; A12 y A22; A22 y A62; A05, A12, y A22; A05, A12, y A62; A12, A22, y A62; y A05, A22, y A62. Con preferencia, el polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A es no lipidado y no piruvilado.
En otra realización, la composición ¡nmunogénica incluye una proteína aislada que tiene al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácido con una proteína de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótido de Neissería ORF2086. Con preferencia, la composición inmunogénica incluye una proteina aislada de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086. En algunas realizaciones, la proteína ORF2086 de la subfamilia B es una variante B44, una B02, una B03, una B22, una B24 o una B09. En algunas realizaciones, la proteína ORF2086 de la subfamilia B es una variante B44, una B22, o una B09.
Combinación de polipéptidos de la subfamilia B: En una realización, la composición incluye cualquier combinación de polipéptidos ORF2086 de la subfamilia B. Las combinaciones representativas de polipéptidos ORF2086 de la subfamilia B incluyen, por ejemplo, B09 y B22; B22 y B44; B44 y B09; B01 y B09; B01 y B22; B01 y B44; y B09, B22, y B44; B09 y B24; B22 y B24; B24 y B44; B01 y B24; B02 y B24; B02 y B01 ; B02 y B09; B02 y B44; B01 , B09, y B24; B01 , B24, y B44.
En una realización preferida, la composición inmunogénica incluye un polipéptido aislado no piruvilado y no lipidado que tiene al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácido con una proteína de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína ORF2086 de la subfamilia B es una secuencia seleccionada de una variante B44 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 21 ; una B02 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 16; una B03 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 17; una B22 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 19; una B24 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 20; una B01 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 58; o una B09 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 18, donde la Cys N-terminal está suprimida, o una combinación de los mismos.
Con mayor preferencia, la composición inmunogénica incluye un polipéptido B09 no piruvilado y no lipidado, un polipéptido B44 no piruvilado y no lipidado, o combinaciones de los mismos. En una realización, la composición incluye una variante B09 no piruviiada y no Iipidada que tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 18, donde la Cys N-terminal está suprimida, una B44 no piruviiada y no Iipidada que tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 21 , donde la Cys N-terminal está suprimida, o una combinación de los mismos. En otra realización, la composición inmunogénica incluye una B09 no piruviiada y no Iipidada que tiene la SEQ ID NO: 49, una B44 no piruviiada y no Iipidada que tiene la SEQ ID NO: 44, o una combinación de los mismos.
En un aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis serogrupo B, donde el polipéptido es un B44 no piruvilado y no lipidado. El B44 puede incluir la secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 21 , donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 44. En una realización, la composición además incluye un segundo polipéptido ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis serogrupo B, donde el segundo polipéptido es un B09 no piruvilado y no lipidado. El B09 puede incluir la secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 18, donde la Cys N-terminal está suprimida, o la SEQ ID NO: 49. En una realización, la composición inmunogénica es una vacuna.
En otra realización, la composición incluye no más de 3 poíipéptidos ORF2086 de la subfamilia B. En una realización adicional, la composición incluye no más de 2 poíipéptidos ORF2086 de la subfamilia B.
En una realización adicional, la composición incluye a lo sumo 1 , 2, o 3 especies de una variante ORF2086 de la subfamilia B. En una realización adicional, la composición incluye a lo sumo 1 , 2, o 3 especies de una variante ORF2086 de la subfamilia A.
Composiciones que incluyen un polipéptido de la Subfamilia B y un polipéptido de la Subfamilia A: En una realización, la composición además incluye uno o más polipéptidos ORF2086 de la subfamilia A. En una realización preferida, la composición incluye un polipéptido A05 de la subfamilia A. Con mayor preferencia, el polipéptido A05 de la Subfamilia A es no lipidado y no piruvilado. En otra realización preferida, la composición incluye un polipéptido A62 de la subfamilia A. Con mayor preferencia, el polipéptido A62 de la Subfamilia A es no lipidado y no piruvilado.
Aún en otra realización, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada que tiene al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácido con una proteína de la Subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086, y una proteína aislada que tiene al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácido con una proteína de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086.
Con preferencia, la composición inmunogénica incluye una proteína aislada de la Subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086 y una proteína aislada de la subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086. Con mayor preferencia, la composición inmunogénica incluye un polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A aislado no piruvilado y no lipidado y un polipéptido ORF2086 de la Subfamilia B aislado no piruvilado y no lipidado.
Combinaciones: Se contempla cualquier combinación de polipéptidos ORF2086. En una realización, la composición incluye al menos un polipéptido de la Subfamilia A en ausencia de polipéptidos de la Subfamilia B. Por ejemplo, la composición incluye únicamente polipéptidos de la Subfamilia A. En otra realización, la composición incluye al menos un polipéptido de la Subfamilia B en ausencia de polipéptidos de la Subfamilia A. Por ejemplo, la composición incluye únicamente polipéptidos de la Subfamilia A.
La composición inmunogénica puede incluir cualquier polipéptido de la Subfamilia A o combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A es una variante A05, una A04, una A12, o una A22. En otra realización, el polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A incluye A62. En una realización preferida, el polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A es una variante A05 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 13; una A04 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 12; una A12 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 14; o una A22 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 15, donde la Cys N-terminal está suprimida, o cualquier combinación de los mismos. Aún otra composición inmunogénica representativa incluye una combinación de polipéptidos A05 y A62 aislados, no piruvilados y no lipidados ORF2086 de la Subfamilia A. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede incluir un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 55 y un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 71. Una composición inmunogénica representativa adicional incluye una combinación de polipéptidos A05 y A12 aislados, no piruvilados y no lipidados ORF2086 de la Subfamilia A. Otra composición inmunogénica representativa incluye una combinación de polipéptidos A 2 y A62 aislados, no piruvilados y no lipidados ORF2086 de la Subfamilia A.
La composición inmunogénica puede incluir cualquier polipéptido de la Subfamilia B o combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la proteína ORF2086 de la subfamilia B es una variante B44, una B02, una B03, una B22, una B24 o una B09. En una realización preferida, la proteína ORF2086 de la subfamilia B es una variante B44 que tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 21 ; una B02 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 16; una B03 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 17; una B22 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 19; una B24 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 20; o una B09 que tiene una secuencia de aminoácido de acuerdo con lo mostrado en la SEQ ID NO: 18, donde la Cys N-terminal está suprimida, o una combinación de los mismos. Aún otra composición inmunogénica representativa incluye una combinación de polipéptidos B09 y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados ORF2086 de la Subfamilia B. Una composición inmunogénica representativa adicional incluye una combinación de polipéptidos B09 y B22 aislados, no piruvilados y no lipidados ORF2086 de la Subfamilia B. Otra composición inmunogénica representativa incluye una combinación de polipéptidos B22 y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados ORF2086 de la Subfamilia B. Una composición inmunogénica representativa adicional incluye una combinación de polipéptidos B09, B22 y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados ORF2086 de la Subfamilia B.
En una realización, la composición incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado en ausencia de un polipéptido ORF2086 lipidado. En otra realización, la composición incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado y al menos un polipéptido ORF2086 lipidado.
En una realización, la composición incluye un polipéptido ORF2086 no piruvilado y no lipidado en ausencia de un polipéptido ORF2086 lipidado. En otra realización, la composición incluye un polipéptido ORF2086 lipidado y un polipéptido ORF2086 no piruvilado y no lipidado. Por ejemplo, la composición puede incluir un polipéptido A05 lipidado que tiene la SEQ ID NO: 76 y un A05 no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 77. Otra composición representativa incluye un polipéptido A05 lipidado que tiene la SEQ ID NO: 76 y un A62 no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 71 . Una composición representativa adicional incluye un polipéptido B01 lipidado que tiene la SEQ ID NO: 58 y un A62 no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 71.
Combinaciones representativas: Una composición inmunogénica representativa incluye una combinación de un polipéptidos aislado no lipidado A05, B09, B22, y B44 ORF2086. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede incluir un polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A A05 no piruvilado y no lipidado (SEQ ID NO: 55) y polipéptidos ORF2086 de la Subfamilia B aislados no piruvilados y no lipidados B09 (SEQ ID NO: 49), B22 (SEQ ID NO: 75), y B44 (SEQ ID NO: 44).
Otra composición inmunogénica representativa incluye una combinación de polipéptidos ORF2086 de la Subfamilia A aislados no piruvilados y no lipidados A05 y A12 y polipéptidos ORF2086 de la Subfamilia B aislados no piruvilados y no lipidados B22 y B44. Una composición inmunogénica representativa adicional incluye polipéptidos A05, A12, B09, y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados. Aún otro ejemplo incluye polipéptidos A12, A62, B09, y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados. Aún un ejemplo adicional incluye polipéptidos A05, A12, A62, B09, y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados. Otra composición inmunogénica representativa incluye polipéptidos A62 y B09 aislados, no piruvilados y no lipidados. Otra composición inmunogénica representativa incluye polipéptidos A62 y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados. Otra composición inmunogénica representativa incluye polipéptidos A62, B09, y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados. Otra composición inmunogénica representativa incluye polipéptidos A05, A62 y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados. Otra composición inmunogénica representativa incluye polipéptidos A05, A62, B09, y B44 aislados, no piruvilados y no lipidados.
En una realización, la composición inmunogénica incluye una proporción 1 : 1 de una proteína de la subfamilia A a una proteína de la subfamilia B. En otra realización, la composición inmunogénica incluye cualquiera de las siguientes proporciones de un polipéptido de la Subfamilia A a un polipéptido de la Subfamilia B: 1 : 1 ; 1 :2; 1 :3; 1 :4; 1 :5; 1 :6; 1 :7; 1 :8; 1 :9; o 1 : 10. En otra realización, la composición inmunogénica incluye cualquiera de las siguientes proporciones de un polipéptido de la Subfamilia B a un polipéptido de la Subfamilia A: 1 : 1 ; 1 :2; 1 :3; 1 :4; 1 :5; 1 :6; 1 :7; 1 :8; 1 :9; o 1 : 10.
Respuestas inmunes bactericidas En un aspecto, los polipéptidos aislados y composiciones que se describen en la presente obtienen una respuesta inmune bactericida en un mamífero contra una infección de cualquier serogrupo de N. meningitidis, tal como un serogrupo seleccionado del serogrupo A, B, C, E29, H, I, K, L, W-135, X, Y y Z. En una realización preferida, los polipéptidos aislados y composiciones que se describen en la presente obtienen una respuesta inmune bactericida en un mamífero contra una infección de los serogrupos A, B, C, W-135, Y y/o X.
En otro aspecto, los polipéptidos aislados y composiciones descriptas en la presente obtienen una respuesta inmune bactericida en un mamífero contra un polipéptido ORF2086 de N. meningitidis serogrupo B. Las composiciones tienen la capacidad de inducir anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un mamífero, y en realizaciones preferidas pueden inducir anticuerpos que son bactericidas contra cepas con las respectivas subfamilias. A continuación se presenta información adicional sobre respuestas bactericidas. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 6, 1 1 , 12, y 13.
En una realización, las composiciones obtienen una respuesta inmune bactericida contra una subfamilia heteróloga de N. meningitidis serogrupo B. Por ejemplo, una composición que incluye un polipéptido de la Subfamilia A no lipidado puede obtener una respuesta inmune bactericida contra una variante de la subfamilia A de N. meningitidis serogrupo B y/o contra una variante de la subfamilia B N. meningitidis serogrupo B. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 18 y 9.
En un aspecto adicional, los polipéptidos aislados y composiciones descriptas en la presente obtienen una respuesta inmune bactericida contra al menos una de las cepas del serogrupo A, serogrupo B, serogrupo C, serogrupo W135, y/o serogrupo Y de N. meningitidis. En una realización preferida, las composiciones obtienen una respuesta inmune bactericida al menos contra el serogrupo B, serogrupo C, y serogrupo Y de N. meningitidis. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 21.
Los anticuerpos bactericidas son un indicador de protección en seres humanos y los estudios preclínicos sirven como un sustituto, y cualquier candidato de composición inmunogénica nueva descripto en la presente debe obtener estos anticuerpos funcionales.
B09: En un aspecto, el polipéptido B09 aislado no lipidado, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtiene anticuerpos bactericidas (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B de N. meningitidis, subfamilia B. En una realización representativa, el polipéptido B09 aislado no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 18 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 49, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del N. meningitides serogrupo B, de la subfamilia A o con preferencia de la subfamilia B. Con preferencia, el polipéptido B09 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra la variante A05 (SEQ ID NO: 13); la variante B44 (SEQ ID NO: 21 ); la variante B16 (SEQ ID NO: 60); la variante B24 (SEQ ID NO: 20); la variante B09 (SEQ ID NO: 18), o una combinación de los mismos. En una realización representativa, el polipéptido B09 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra la variante B44 (SEQ ID NO: 21 ); la variante B16 (SEQ ID NO: 60); la variante B24 (SEQ ID NO: 20); la variante B09 (SEQ ID NO: 18), o una combinación de los mismos. Véanse, por ejemplo, el Ejemplo 1 1 , el Ejemplo 12, y el Ejemplo 13.
B44: En un aspecto, el polipéptido B44 aislado no lipidado, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtiene anticuerpos bactericidas (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B de N. meningitidis, subfamilia B. En otra realización representativa, el polipéptido B44 aislado no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 21 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 44, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B N. meningitidis, de la subfamilia B. Con preferencia, el polipéptido B44 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra la variante B44 (SEQ ID NO: 21 ); la variante B16 (SEQ ID NO: 60); la variante B24 (SEQ ID NO: 20); la variante B09 (SEQ ID NO: 18), o una combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 1. En forma adicional, el polipéptido B44 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo también pueden obtener anticuerpos bactericidas que se unen a la variante B02 (SEQ ID NO: 16). Véanse, por ejemplo, el Ejemplo 12 y el Ejemplo 13. Además, el polipéptido B44 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo también pueden obtener anticuerpos bactericidas que se unen a la variante B03 (SEQ ID NO: 17) y la variante B15 (SEQ ID NO: 59). Véase, por ejemplo, el Ejemplo 6.
B22: En un aspecto, el polipéptido B22 aislado no lipidado, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtiene anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B de N. meningitidis, subfamilia B. En una realización representativa adicional, el polipéptido B22 aislado no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 19 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B N. meningitidis, de la subfamilia B. Con preferencia, el polipéptido B22 no piruvilado y no lipidado obtiene anticuerpos bactericidas contra la variante B44 (SEQ ID NO: 21 ); la variante B 6 (SEQ ID NO: 60); la variante B24 (SEQ ID NO: 20); la variante B09 (SEQ ID NO: 18), o una combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 13.
A05: En un aspecto, el polipéptido A05 aislado no lipidado, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtiene anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B de N. meningitidis, subfamilia A. En una realización, el polipéptido A05 aislado no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 55, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B N. meningitidis, de la subfamilia A. En una realización, el polipéptido A05 aislado incluye la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 76, donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. En otra realización, el polipéptido A05 aislado incluye la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 76, donde la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. En una realización, el polipéptido A05 aislado incluye la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 77. Con preferencia, el polipéptido A05 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra la variante A05 (SEQ ID NO: 13), la variante A22 (SEQ ID NO: 15), la variante A12 (SEQ ID NO: 14), o una combinación de los mismos. Véanse, por ejemplo, el Ejemplo 6 y 13.
A62: En un aspecto, el polipéptido A62 aislado no lipidado, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtiene anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B de N. meningitidis, subfamilia A. En una realización, el polipéptido A62 aislado incluye la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 70, donde la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. En otra realización, el polipéptido A62 aislado no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 70 donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 71 , y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B N. meningitidis, de la subfamilia A y/o la subfamilia B. Por ejemplo, el polipéptido A62 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra la variante A05 (SEQ ID NO: 13), la variante A12 (SEQ ID NO: 14), la variante A22 (SEQ ID NO: 15), y la vanante A62 (SEQ ID NO: 70). Como otro ejemplo, el polipéptido A62 no piruvilado y no lipidado A62 y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra la variante A29, la variante B09, y la variante B24. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 18 y 19. En otra realización, el A62 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtiene anticuerpos bactericidas contra la variante B16.
A12: En una realización, el polipéptido A12 aislado no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 14 donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 66, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra un polipéptido ORF2086 del serogrupo B N. meningitidis, de la subfamilia A y/o la subfamilia B. Con preferencia, el polipéptido A12 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra la variante A05 (SEQ ID NO: 13), la variante A22 (SEQ ID NO: 15), la variante A12 (SEQ ID NO: 14), la variante A62 (SEQ ID NO: 70), la vanante A29, la variante B09. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 18 y 19.
En una realización, el polipéptido A22 aislado no piruvilado y no lipidado que tiene la SEQ ID NO: 15 donde la Cys N-terminal está suprimida o la SEQ ID NO: 68, y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra (por ej., que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 del serogrupo B N. meningitidis, de la subfamilia A y/o la subfamilia B. Con preferencia, el polipéptido A22 no piruvilado y no lipidado y las composiciones inmunogénicas del mismo, obtienen anticuerpos bactericidas contra la variante A05 (SEQ ID NO: 13), la variante A22 (SEQ ID NO: 15), la variante A62 (SEQ ID NO: 70), la variante A29. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 18 y 19.
Método para obtener anticuerpos bactericidas En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo A de N. meningitidis en un mamífero. En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo C de N. meningitidis en un mamífero. En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo W135 de N. meningitidis en un mamífero. En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo X de N. meningitidis en un mamífero. En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo Y de N. meningitidis en un mamífero. En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para los serogrupos A, B, C, W-135, X y/o Y de N. meningitidis en un mamífero. En un aspecto, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo B de N. meningitidis en un mamífero. En una realización representativa, el método incluye obtener anticuerpos bactericidas específicos para un ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis serogrupo B, un ORF2086 de la subfamilia A N. meningitidis serogrupo B, o una combinación de los mismos.
El método incluye la administración al mamífero de una cantidad efectiva de un polipéptido 2086 aislado no piruvilado y no lipidado o una composición inmunogénica de los mismos, de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 18, 19, y 22.
En una realización preferida, el método incluye obtener anticuerpos bactericidas específicos para un ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis serogrupo B. El polipéptido aislado o composición inmunogénica incluye un polipéptido B44 no piruvilado y no lipidado. En otra realización preferida, la composición además incluye un polipéptido B09 no piruvilado y no lipidado. En una realización representativa, el polipéptido aislado o composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 44, o una combinación de los mismos. En otra realización representativa, el polipéptido aislado o composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 18, donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, la SEQ ID NO: 21 , donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, o una combinación de los mismos. Aún en otra realización representativa, el polipéptido aislado o composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 19, donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida. En una realización, la composición inmunogénica para obtener anticuerpos bactericidas específicos para un ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis serogrupo B incluye al menos uno de un polipéptido A05, A12, y A62 no piruvilados y no lipidados. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 19.
En una realización preferida, el método incluye obtener anticuerpos bactericidas específicos para un ORF2086 de la subfamilia A N. meningitidis serogrupo B. El polipéptido aislado o composición inmunogénica incluye un polipéptido A05 no piruvilado y no lipidado. En una realización preferida, el polipéptido aislado o composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 13, donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, En otra realización preferida, la composición además incluye un polipéptido B44 no piruvilado y no lipidado. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 6 y 13. En una realización representativa, el polipéptido aislado o composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 44, o una combinación de los mismos. En una realización preferida, el polipéptido aislado o composición inmunogenica incluye la SEQ ID NO: 13, donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, la SEQ ID NO: 21 , donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, o una combinación de los mismos. En otra realización representativa, el polipéptido aislado o la composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 77 (A05), la SEQ ID NO: 44 (B44), o una combinación de los mismos. En una realización, la composición inmunogénica para obtener anticuerpos bactericidas específicos para un ORF2086 de la subfamilia A N. meningitidis serogrupo B incluye al menos uno de un polipéptido A05, A 2, y A62 no piruvilados y no lipidados. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 18 y 19.
Cuando una composición inmunogénica representativa que incluye al menos dos polipéptidos ORF2086 no piruvilados y no lipidados de acuerdo con lo descripto con anterioridad se administró a mamíferos, los inventores en forma sorprendente descubrieron que se puede obtener una respuesta inmune bactericida sinérgica contra el serogrupo B de Neissería meningitidis, en comparación con una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 no piruvilado y no lipidado respectivo. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 19. Por consiguiente, en una realización, la composición inmunogénica incluye al menos un primer polipéptido ORF2086 no piruvilado y no lipidado que actúa en forma sinérgica con al menos un segundo polipéptido ORF2086 piruvilado y no lipidado para obtener una respuesta inmune contra el serogrupo B de Neissería meningitidis.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo C de N. meningitidis en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad efectiva de un polipéptido 2086 aislado no piruvilado y no lipidado de N. meningitidis serogrupo B o una composición inmunogénica de los mismos, de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 22. En una realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. Enuna realización, el polipeptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. En otra realización, la composición inmunogénica además incluye al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y. Una composición inmunogénica representativa incluye al menos un polipéptido A62 aislado no piruvilado y no lipidado y a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo Y de N. meningitidis en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad efectiva de un polipéptido 2086 aislado no piruvilado y no lipidado de N. meningitidis serogrupo B o una composición inmunogénica de los mismos, de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 22. En una realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. En una realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. En otra realización, la composición inmunogénica adicional incluye al menos un conjugado seleccionada de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para obtener anticuerpos bactericidas específicos para el serogrupo X de N. meningitidis en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad efectiva de un polipéptido 2086 no piruvilado y no lipidado de N. meningitidis serogrupo B o una composición inmunogénica de los mismos, de acuerdo con lo descripto con anterioridad. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 22. En una realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. En una realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO. 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys. En otra realización, la composición inmunogénica además incluye al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
Cuando una composición inmunogénica representativa que incluye cuatro polipéptidos ORF2086 no piruvilados y no lipidados y un conjugado de un sacárido capsular de cada uno de los Neisseria meningitidis serogrupos A, C, W135, e Y de acuerdo con lo descripto con anterioridad se administró a mamíferos, los inventores en forma sorprendente descubrieron que se puede obtener una respuesta inmune bactericida sinérgica al menos contra los serogrupos B, C, e Y de Neisseria meningitidis, en comparación con una composición inmunogénica que incluye los polipéptidos ORF2086 donde los conjugados de un sacárido capsular están ausentes, y en comparación con una composición inmunogénica que incluye un conjugado de un sacárido capsular de cada uno de los Neisseria meningitidis serogrupos A, C, W135, e Y donde un polipéptido ORF2086 está ausente. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 22. Por consiguiente, en una realización, la composición inmunogénica incluye al menos un polipéptido ORF2086 no piruvilado y no lipidado que actúa en forma sinérgica con al menos un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, C, W135, e Y para obtener una respuesta inmune contra Neisseria meningitidis. La respuesta inmune obtenida puede ser contra al menos uno de serogrupos B, C, e Y de Neisseria meningitidis. La composición inmunogénica puede incluir una proteína codificada por una secuencia de nucleótido de Neisseria ORF2086, polinucleotidos, o equivalentes de los mismos como el único inmunógeno activo en la composición inmunogénica. En forma alternativa, la composición inmunogénica puede incluir en forma adicional inmunógenos activos, que incluye otros polipéptidos inmunogénicos de Neisseria sp., o proteínas activas en forma ¡nmunológica de uno o más otros patógenos microbianos (por ej. un virus, prión, bacteria, u hongo, sin limitación) o polisacárido capsular. Las composiciones pueden comprender uno o más proteínas, fragmentos o compuestos farmacéuticos deseados de acuerdo con lo deseado para una indicación elegida.
Cualquier composición inmunogénica multi-antígeno o multivalente está contemplada por la presente invención. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede incluir combinaciones de dos o más proteínas ORF2086, una combinación de proteína ORF2086 con uno o más proteínas Por A, una combinación de proteína ORF2086 con polisacáridos de meningococcus serogrupo A, C, Y y W135 y/o conjugados de polisacáridos, una combinación de proteína ORF2086 con combinaciones cíe meningococcus y pneumococcus, o una combinación de cualquiera de las anteriores en una forma adecuada para una administración deseada, por ej., para administración mucosal. Aquellos con experiencia en la técnica serán capaces con facilidad de formular tales composiciones inmunológicas multi-antígeno o multivalentes.
En un aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y.
En una realización, la composición inmunogénica incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neissería meningitidis serogrupo B, y al menos dos de los conjugados. En otra realización, la composición incluye al menos tres de los conjugados. Por ejemplo, las composiciones puede incluir sacáridos de: los serogrupos A y C; los serogrupos A y W135; los serogrupos A e Y; los serogrupos C y W135; los serogrupos W135 e Y; los serogrupos A, C, y W135; los serogrupos A, C, e Y; los serogrupos A, W135, e Y; o los serogrupos C y W135, e Y. Se prefieren las composiciones que incluyen al menos un sacárido del serogrupo C (por ej., C e Y).
Aún en otra realización, la composición inmunogénica incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neissería meningitidis serogrupo B, y cuatro conjugados, por ej., un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo A; un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo C; un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo W135; y un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo Y.
En una realización preferida, el conjugado es un conjugado del sacárido capsular y una proteína portadora. Las proteínas portadoras adecuadas son conocidas en la técnica. Con preferencia, la proteína portadora es a toxina bacteriana, tales como una toxina de difteria o tétanos, o toxoides o mutantes de los mismos. Con la mayor de las preferencias, la proteína portadora es CRMi97. Por ejemplo, en una realización, la composición incluye al menos un conjugado seleccionado de (a) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis y (¡i) CRIv ; (b) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis y (ii) CRM 97; (c) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo W135 de N. meningitidis y (¡i) CRM197; y (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis y (ii) CRM 97.
Los sacáridos capsulares de los serogrupos A, C, W135, e Y están caracterizados y son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el sacárido capsular del serogrupo A de meningococo es un homopolímero de N-acetil-D- manosamina-1 -fosfato vinculada a (a 1?6), con O-acetilación parcial en las posiciones C3 y C4. La acetilación en la posición C-3 puede ser de 70 a 95%. Las condiciones utilizadas para purificar el sacárido pueden dar lugar a una des-O-acetilación (por ej. bajo condiciones básicas), pero es útil retener OAc en esta posición C-3. En algunas realizaciones, al menos 50% (por ej. al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) de los residuos de manosamina en sacáridos del serogrupo A están O-acetilados en la posición C-3. Los grupos acetilo se pueden reemplazar con grupos de bloqueo para prevenir hidrólisis, y tales sacáridos modificados aún son sacáridos del serogrupo A dentro del significado de la invención.
El sacárido capsular del serogrupo C es un homopolímero de ácido siálico vinculado a (a 2?9) (ácido N-acetilneuramínico). La mayor parte de las cepas del serogrupo C tienen grupos O-acetilo en C-7 y/o C-8 de los residuos de ácido siálico, pero algunos aislados clínicos carecen de estos grupos O-acetilo.
El sacárido del serogrupo W135 es un polímero de unidades de disacárido de ácido siálico-galactosa. Al igual que el sacárido del serogrupo C, tiene una O-acetilación variable, pero en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico. La estructura se escribe como: ?4)-D-NeupNAc(7/90Ac)- -(2?6)-D-Gal- -(1?.
El sacárido del serogrupo Y es similar al sacárido del serogrupo W135, excepto que la unidad de repetición de disacárido incluye glucosa en lugar de galactosa. La estructura del serogrupo Y se escribe como:?4)-D-NeupNAc(7/90Ac)-a-(2?6)-D-Glc-a-(1?. Al igual que el serogrupo W135, tiene una O-acetilación variable en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico.
Los sacáridos utilizados de acuerdo con la invención pueden estar O-acetilados de acuerdo con lo descripto con anterioridad, por ej., con el mismo patrón de O-acetilación de acuerdo con observado en sacáridos capsulares nativos, o pueden estar des-O-acetilados en forma parcial o total en una o más posiciones de los anillos del sacárido, o pueden estar híper-O-acetilados con relación a los sacáridos capsulares nativos.
En una realización, la composición inmunogénica incluye un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y, donde el polipéptido ORF2086 no lipidado y no piruvilado incluye al menos uno de los siguientes: B44, B09, A05, B22, A12, A22, A62, B22, B16, B15 y B03. En una realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 71 , y la SEQ ID NO: 75. En otra realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, y la SEQ ID NO: 20, donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. En otra realización, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, y la SEQ ID NO: 20, donde la cisteína en la posición 1 está sustituida con un aminoácido que no es un residuo de Cys.
La presente invención también contempla regímenes de inmunización múltiple donde se puede combinar cualquier composición útil contra un patógeno en las mismas o con las mismas composiciones de la presente invención. Por ejemplo, sin limitación, se puede administrar la composición inmunogénica de la presente invención a un paciente y otra composición inmunológica para inmunizarlo contra el virus del papiloma humano (HPV), tales como la vacuna contra el HPV GARDASIL®, como parte de un régimen de inmunización múltiple. Aquellos con experiencia en la técnica serán capaces con facilidad de seleccionar composiciones inmunogénicas para su uso en conjunto con las composiciones inmunogénicas de la presente invención para los propósitos de desarrollo e implementación de regímenes de inmunización múltiple.
Los polipéptidos ORF2086, fragmentos y equivalentes se pueden utilizar como parte de una composición inmunogénica conjugada; donde una o más proteínas o polipéptidos están conjugadas con un portador con el fin de generar una composición que tiene propiedades inmunogénicas contra varios serotipos, o serotipos de N. meningitidis, en forma específica serogrupos meningococos, en forma específica del serogrupo B, y/o contra varias enfermedades. En forma alternativa, uno de los polipéptidos ORF2086 se pueden utilizar como una proteína portadora para otros polipéptidos inmunogénicos. La formulación de tales composiciones inmunogénicas es muy conocida para aquellos con experiencia en este campo.
Las composiciones inmunogénicas de la invención con preferencia incluyen un excipiente, diluyente, y/o portador aceptables para uso farmacéutico. Los excipientes, portadores y/o diluyentes aceptables para uso farmacéutico adecuados incluyen cualquier y todos los solventes convencionales, medios de dispersión, rellenantes, portadores sólidos, soluciones acuosas, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares. Los excipientes, diluyentes, y/o portadores aceptables para uso farmacéutico adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como también combinaciones de los mismos.
Los excipientes, diluyentes, y/o portadores aceptables para uso farmacéutico pueden incluir en forma adicional cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o efectividad del anticuerpo. La preparación y el uso de excipientes, diluyentes, y/o portadores aceptables para uso farmacéutico son muy conocidos en la técnica. Excepto con la condición de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el componente activo, está contemplado el uso de los mismos en las composiciones inmunogénicas de la presente invención.
Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar por vía parenteral, por ej., por medio de inyección, ya sea por vía subcutánea o intramuscular, así como también por vía oral o intranasal. Los métodos para inmunización por vía intramuscular se describen en Wolff et al. Biotecniques; 1 1 (4):474 a 85, (1991 ). y en Sedegah et al. PNAS Vol. 91 , pp. 9866 a 9870, (1994). Otros modos de administración emplean formulaciones orales, formulaciones pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdérmicas, por ejemplo, sin limitación. Las formulaciones orales, por ejemplo, incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares, sin limitación. Con preferencia, la composición inmunogénica se administra por vía intramuscular.
Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden comprender además uno o más adicional "inmunomoduladores", que son agentes que perturban o alteran el sistema inmune, de manera tal que ya sea la regulación por aumento o regulación por disminución de humoral y/o inmunidad mediada por células se observa. En una realización particular, se prefiere la regulación por aumento de los brazos humorales y/o mediados por células del sistema inmune. Los ejemplos de ciertos inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, un adyuvante o citoquina, o ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descripta en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.254.339 entre otras.
Los ejemplos no limitantes de adyuvantes que se pueden utilizar en la vacuna de la presente invención incluyen el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), alum, geles minerales tales como gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, por ej. , adyuvantes de Freund completos e incompletos, copolímero en bloque (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, monofosforil lípido A, y adyuvante de lípido-amina avridina. Los ejemplos no limitantes de emulsiones de aceite en agua útiles en la vacuna de la invención incluyen formulaciones de SEAM62 y SEAM 1/2 modificadas. La SEAM62 modificada es una emulsión de aceite en agua que contiene 5% (v/v) de escualeno (Sigma), 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85 (Tensioactivos ICI), 0,7% (v/v) de detergente polisorbato ® 80 (ICI Tensioactivos), 2,5% (v/v) de etanol, 200 pg/ml de Quil A, 100 pg/ml de colesterol, y 0,5% (v/v) de lecitina. La SEAM 1/2 modificada es una emulsión de aceite en agua que comprende 5% (v/v) de escualeno, 1 % (v/v) de detergente SPAN® 85, 0,7% (v/v) de detergente polisorbato 80, 2,5% (v/v) de etanol, 100 pg/ml de Quil A, y 50 pg/ml colesterol.
Otros "inmunomoduladores" que pueden estar incluidos en la vacuna incluyen, por ej. , uno o más interleuquinas, interferones, u otras citoquinas o quimiocinas conocidas. En una realización, el adyuvante puede ser un derivado de ciclodextrina o un polímero polianiónico, tal como aquellos que se describen en las Patentes de los Estados Unidos N.° 6.165.995 y 6.610.310, respectivamente. Se ha de comprender que el inmunomodulador y/o adyuvante a utilizarse dependerá del sujeto al cual se administrará la vacuna o composición inmunogénica, la vía de inyección y el número de inyecciones a administrar.
En algunas realizaciones, el adyuvante es saponina. En algunas realizaciones, la concentración de saponina está entre 1 Mg/ml y 250 Mg/ml; entre 5 pg/ml y 150 pg/ml; o entre 10 µg/ml y 100 pg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de saponina es de aproximadamente 1 µg ml; aproximadamente 5 Mg/ml; aproximadamente 10 µg/ml; aproximadamente 20 Mg/ml; aproximadamente 30 Mg/ml; aproximadamente 40 Mg/ml; aproximadamente 50 pg/ml; aproximadamente 60 pg/ml; aproximadamente 70 pg/ml; aproximadamente 80 Mg/ml; aproximadamente 90 g/ml; aproximadamente 100 pg/ml; aproximadamente 1 10 pg/ml; aproximadamente 120 pg/ml; aproximadamente 130 pg/ml; aproximadamente 140 pg/ml; aproximadamente 150 pg/ml; aproximadamente 160 pg/ml; aproximadamente 170 pg/ml; aproximadamente 180 gg/ml; aproximadamente 190 µg/ml; aproximadamente 200 µg ml; aproximadamente 210 pg/ml; aproximadamente 220 pg/ml; aproximadamente 230 pg/ml; aproximadamente 240 pg/ml; o aproximadamente 250 pg/ml.
En ciertas realizaciones preferidas, las proteínas de esta invención se utilizan en una composición ínmunogénica para administración oral que incluye un adyuvante mucosal y se utilizan para el tratamiento o prevención de infección por N. meningitidis en una huésped humano. El adyuvante mucosal puede ser una toxina de cólera; sin embargo, con preferencia, los adyuvantes mucosales distintos a una toxina de cólera que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen derivados non tóxicos de una holotoxina de cólera, donde la subunidad A es una toxina de cólera mutagenizada, químicamente modificada, o proteínas relacionadas que se producen por medio de la modificación de la secuencia de aminoácido de la toxina cólera. Para una toxina de cólera específica que puede ser útil en particular en la preparación de composiciones inmunogénicas de esta invención, véase la holotoxina de cólera muíante E29H, de acuerdo con lo revelado en la Solicitud Internacional Publicada WO 00/18434, que se incorpora como referencia en su totalidad en la presente. Estos se pueden agregar a, o conjugar con, los polipéptidos de esta invención. Se pueden aplicar las mismas técnicas a otras moléculas con adyuvante mucosal o propiedades de administración tales como toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT).
Se pueden utilizar otros compuestos con adyuvante mucosal o actividad de administración tales como bilis; policationes tales como DEAE-dextrano y poliornitina; detergentes tales como dodecil bencen sulfato de sodio; materiales conjugados por lípidos; antibióticos tales como estreptomicina; vitamina A; y otros compuestos que alteran la integridad estructural o funcional de las superficies mucosales. Otros compuestos mucosalmente activos incluyen derivados de estructuras microbianas tales como MDP; acridina y cimetidina. STIMULON™ QS-21 , MPL, e iL-12, de acuerdo con lo descripto con anterioridad, también se pueden utilizar.
Las composiciones inmunogénicas de esta invención se puede administrar en la forma de ISCOMS (complejos estimuladores inmunes), ISCOMS que contienen CTB, liposomas o encapsulados en compuestos tales como acrilatos o poli(DL-lactida-co-glicosida) para formar microesferas de un tamaño adecuado para la adsorción. Las proteínas de esta invención también se pueden incorporar en emulsiones aceitosas.
Una cantidad (es decir, dosis) de composición inmunogénica que se administra al paciente se puede determinar de acuerdo con técnicas estándar conocidas para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, tomando en consideración tales factores como el antígeno particular, el adyuvante (si está presente), la edad, el sexo, el peso, la especie, la condición del paciente particular, y la vía de administración.
Por ejemplo, una dosificación para un paciente humano adolescente puede incluir al menos 0, 1 pg, 1 µ?, 10 µ?, o 50 µg de una proteína ORF2086 de Neisseria, y a lo sumo 80 µg, 100 Q, 150 µg, o 200 \jg de una proteína ORF2086 de Neisseria. Se puede combinar cualquier valor mínimo y cualquier máximo valor para definir un intervalo adecuado.
Adyuvantes Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con lo descripto en la presente también comprenden, en ciertas realizaciones, uno o más adyuvantes. Un adyuvante es una sustancia que potencia la respuesta inmune cuando se administra junto con un inmunógeno o antígeno. Se ha demostrado que un número de citoquinas o linfocinas tienen actividad moduladora inmune, y por lo tanto son útiles como adyuvantes, que incluyen, pero sin limitación, las interleucinas 1 -a, 1-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por ej. , la Patente de los Estados Unidos N.° 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes); los interferones-a, ß y ?; factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (véase, por ej., la Patente de los Estados Unidos N.° 5.078.996 y ATCC Número de Accesión 39900); factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF); factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); y los factores de necrosis tumoral a y ß.
Incluso otros adyuvantes que son útiles con las composiciones inmunogénicas de acuerdo con lo descripto en la presente incluyen quimiocinas, que incluyen sin limitación, MCP-1 , ???-1a, ???-1 ß, y RANTES; moléculas de adhesión, tales como una selectina, por ej., L-selectina, P-selectina y E-selectina; moléculas similares a mucinas, por ej. , CD34, GlicAM- y MadCAM-1 ; un miembro de la familia integrina tal como LFA- , VLA-1 , Mac-1 y p150,95; un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas tales como PECAM, ICAM, por ej. , ICAM-1 , ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3; moléculas coestimuladoras tales como B7 a 1 , B7 a 2.CD40 y CD40L; factores de crecimiento que incluye factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, PDGF, BL-1 , y factor de crecimiento endotelial vascular; moléculas receptoras que incluye Fas, receptor TNF, Flt, Apo-1 , p55, WSL-1 , DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, y DR6; y Caspase (ICE).
Otros adyuvantes representativos incluyen, pero sin limitación hidróxido de aluminio; fosfato de aluminio; STIMULON™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.); MPL™ (3-O-deacilado monofosforil lípido A; Corixa, Hamilton, Mont), 529 (un compuesto de fosfato de amino alquil glucosamina, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.); N-acetil-muramil-L-teronil-D-isoglutamina (thr-MDP); N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 1 1637, denominada como nor- DP); N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1 '-2 '-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifos-foriloxi-etilamina) (CGP 19835A, denominada como MTP-PE); y toxina de cólera. En ciertas realizaciones preferidas, el adyuvante es QS-2 .
Los adyuvantes representativos adicionales incluyen derivados no tóxicos de toxina de cólera, que incluye su subunidad A, y/o conjugados o fusiones genéticamente manipulada de polipéptido de N. meningitidis con toxina de cólera o su subunidad B ("CTB"), procoleragenoide, polisacáridos fúngicos, que incluye esquizofilano, dipéptido de muramilo, derivados de dipéptido de muramilo ("MDP"), ésteres de forbol, la toxina lábil al calor de E. coli, polímeros en bloque o saponinas.
El fosfato de aluminio se ha utilizado como el adyuvante en un ensayo clínico de fase 1 a una concentración de 0, 125 mg/dosis, mucho menor que el límite de 0,85 mg/dosis especificado por el US Code of Federal Regulations [610, 15(a)]. Los adyuvantes que contienen aluminio se utilizan ampliamente en seres humanos para potenciar la respuesta inmune de antigenos cuando se administran por vía intramuscular o subcutánea. En algunas realizaciones, la concentración de aluminio en la composición inmunogénica está entre 0, 125 pg/ml y 0,5 pg/ml; entre 0,20 pg/ml y 0,40 g/ml; o entre 0,20 ¡g/m\ y 0,30 µg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de aluminio en la composición inmunogénica es de aproximadamente 0, 125 µg/ml; aproximadamente 0, 15 µg/ml; aproximadamente 0, 175 µg/ml; aproximadamente 0,20 pg/ml; aproximadamente 0,225 µg ml; aproximadamente 0,25 µg/ml; aproximadamente 0,275 µg/ml; aproximadamente 0,30 pg/ml; aproximadamente 0,325 µg/ml; aproximadamente 0,35 pg/ml; aproximadamente 0,375 pg/ml; aproximadamente 0,40 µg/ml; aproximadamente 0,425 pg/ml; aproximadamente 0,45 pg/ml; aproximadamente 0,475 µg/ml; o aproximadamente 0,50 pg/ml.
En una realización preferida, la concentración de aluminio en la composición inmunogénica está entre 0,125 mg/ml y 0,5 mg/ml; entre 0,20 mg/ml y 0,40 mg/ml; o entre 0,20 mg/ml y 0,30 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de aluminio en la composición inmunogénica es de aproximadamente 0,125 mg/ml; aproximadamente 0, 15 mg/ml; aproximadamente 0,175 mg/ml; aproximadamente 0,20 mg/ml; aproximadamente 0,225 mg/ml; aproximadamente 0,25 mg/ml; aproximadamente 0,275 mg/ml; aproximadamente 0,30 mg/ml; aproximadamente 0,325 mg/ml; aproximadamente 0,35 mg/ml; aproximadamente 0,375 mg/ml; aproximadamente 0,40 mg/ml; aproximadamente 0,425 mg/ml; aproximadamente 0,45 mg/ml; aproximadamente 0,475 mg/ml; o aproximadamente 0,50 mg/ml.
Los adyuvantes adecuados que se utilizan para potenciar una respuesta inmune además incluyen, sin limitación, MPL™ (3-O-deacilated monofosforil lípido A, Corixa, Hamilton, T), que se describe en la Patente de los Estados Unidos N.° 4.912.094. Los adyuvantes también adecuados para su uso como adyuvantes son análogos de lípido A sintéticos o compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles de Corixa (Hamilton, MT), y que se describen en la Patente de los Estados Unidos N.° 6.1 13.918. Une AGP tal es 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Deoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoiox¡-tetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranosida, que también se conoce como 529 (anteriormente se conocía como RC529). Este adyuvante 529 está formulado como un forma acuosa (AF) o como una emulsión estable (SE).
Incluso otros adyuvantes incluyen péptidos de muramilo, tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2 a (1 '-2' dipalmitoil-sn-glicero-3 a hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE); emulsiones de aceite en agua, tales como MF59 (Patente de los Estados Unidos N.° 6.299.884) (que contiene 5% de Escualeno, 0,5% de polisorbato 80, y 0,5% de SPAN 85 (que en forma opcional contiene varias cantidades de MTP-PE) formulado en partículas de submicrones que utilizan un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 1 10Y (Microfluidics, Newton, MA)), y SAF (que contiene 10% de Escualeno, 0,4% de polisorbato 80, 5% de polímero PLURONIC bloqueado L121 , y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión de submicrones o vortexado para generar una emulsión de mayor tamaño de partículas mayor); adyuvante de Freund incompleto (IFA); sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; AMPHIGEN; Avridina; L121/escualeno; D-lactida-polilactida/glicosida; polioles PLURONIC; Bordetella muerta; saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), que se describe en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), que se describe en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.254.339, y complejos inmunoestimuladores (ISCOMATRIX); Mycobacte um tuberculosis; lipopolisacáridos bacterianos; polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (por ej. , la Patente de los Estados Unidos N.° 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), que se describe en las Patentes Europeas N.° 1.296.713 y 1.326.634; una toxina pertussis (PT) o un muíante de la misma, una toxina de cólera o muíante de la misma (por ej. , las Palenles de ios Eslados Unidos N.° 7.285.281 , 7.332.174, 7.361 .355 y 7.384.640); o una toxina lábil al calor de E. coü (LT) o muíante de la misma, en particular LT-K63, LT-R72 (por ej., las Patentes de los Estados Unidos N.° 6.149.919, 7.115.730 y 7.291.588).
Métodos para Producir Antígenos P2086 No lipidados En un aspecto, la invención se refiere a un método para producir un polipéptido ORF2086 no piruvilado y no lipidado. El método incluye la expresión de una secuencia de nucleólido que codifica un polipéplido ORF2086 donde la cisfeína N-terminal está suprimida en comparación con la secuencia de tipo salvaje correspondiente, y donde la secuencia de nucleótido está vinculada en forma operativa a un sistema de expresión que es capaz de expresarse en una célula bacteriana. Los polipéptidos representativos producidos por el método incluyen cualquier polipéptido descripto en la presente. Por ejemplo, con preferencia, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 12; la SEQ ID NO: 13; la SEQ ID NO: 14; la SEQ ID NO: 15; la SEQ ID NO: 16; la SEQ ID NO: 17; la SEQ ID NO: 18; la SEQ ID NO: 19; la SEQ ID NO: 20; la SEQ ID NO: 21 ; la SEQ ID NO: 58; la SEQ ID NO: 70, donde la cisteina en la posición 1 está suprimida, en comparación con la secuencia de tipo salvaje correspondiente. En otra realización preferida, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 76, donde la cisteina en la posición 1 está suprimida. Los polipéptidos representativos adicionales incluyen un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 71 , y la SEQ ID NO: 75. Un polipéptido representativo adicional incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido en la SEQ ID NO: 77. Otros ejemplos incluyen la SEQ ID NO: 80 (B24) y la SEQ ID NO: 81 (B24). El método además incluye la purificación del polipéptido.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para producir antígenos P2086 solubles no lipidado que comprende los pasos de clonar la secuencia de ácido nucleico de la variante ORF2086 en un vector de expresión de E. coli sin una secuencia de control de lipidación, transformar las bacterias de E. coli con el vector de expresión de ORF2086, inducir la expresión y aislar la proteina P2086 expresada. En algunas realizaciones, la expresión se induce con IPTG.
En algunas realizaciones, el codón para la Cys N-terminal de la variante ORF2086 está suprimida. Los ejemplos de tales codones incluyen TGC. En algunas realizaciones, el codón para la Cys N-terminal de la variante ORF2086 está mutada por medio de mutagénesis de punto para generar un codón Ala, Gly, o Val. En algunas realizaciones, se agregan los codones Ser y Gly a la cola de la N terminal de la variante ORF2086 para extender el tallo de Gly/Ser inmediatamente corriente abajo de la Cys N-terminal. En algunas realizaciones, el número total de residuos de Gly y Ser dentro del tallo de Gly/Ser es de al menos 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12. En algunas realizaciones, el codón para la Cys N-terminal está suprimido. En algunas realizaciones, los residuos de la N-terminal 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12 son ya sea Gly o Ser.
En algunas realizaciones, los codones de la cola de la N terminal de la variante ORF2086 no lipidada están optimizados por medio de mutagénesis de punto. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal de la variante ORF2086 no lipidada está optimizada para igualar la cola de la N terminal de la variante B09. En algunas realizaciones, los codones de la cola de la N terminal de la variante ORF2086 están optimizados por medio de mutagénesis de punto de manera tal que el codón que codifica el quinto aminoácido de la variante ORF2086 es 100% idéntico a los nucleótidos 13 a 15 de la SEQ ID NO: 8 y el codón que codifica el décimo tercero aminoácido de la variante ORF2086 es 100% idéntico a los nucleótidos 37 a 39 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal de la variante ORF2086 no lipidada está optimizada de manera tal que los 5' 45 ácidos nucleicos son 100% idénticos a los ácidos nucleicos 1 a 45 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal de la variante ORF2086 no lipidada está optimizada de manera tal que los 5' 42 ácidos nucleicos son 100% idénticos a los ácidos nucleicos 4 a 45 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal de la variante ORF2086 no lipidada está optimizada de manera tal que los 5' 39 ácidos nucleicos son 00% idénticos a los ácidos nucleicos 4 a 42 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal de la variante P2086 no lipidada comprende al menos una sustitución de aminoácido en comparación con los aminoácidos 1 a 15 de la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal de la variante P2086 no lipidada comprende dos sustituciones de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1 a 15 de la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal de la variante P2086 no lipidada comprende al menos una sustitución de aminoácido en comparación con los aminoácidos 2 a 15 de la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal de la variante P2086 no lipidada comprende dos sustituciones de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 2 a 15 de la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas.
En algunas realizaciones, los codones de la variante no lipidada se han optimizado para una expresión aumentada. La optimización de codones es conocida en la técnica. Véase, por ej., Sastalla et al, Applied and Environmental Microbiology, vol. 75(7): 2099 a 21 0 (2009) y Coleman et al, Science, vol. 320: 1784 (2008). En algunas realizaciones, la optimización de codones incluye igualar la utilización de codones de una secuencia de aminoácido con la frecuencia de codones del organismo huésped elegido mientras que incluye y/o excluye secuencias de ADN específicas. En algunas realizaciones, la optimización de codones además incluye minimizar la estructura de ARNm secundaria correspondiente para reducir los impedimentos traduccionales. En algunas realizaciones, la cola de la N terminal se ha optimizado por codones para comprender cualquiera de las SEQ ID NO: 28, 30, 32, y 34. En algunas realizaciones, el tallo de Gly/Ser se ha optimizado por codones para comprender cualquiera de las SEQ ID NO: 28, 30, 32, y 34.
Con el fin de que esta invención se pueda comprender mejor, se establecen los siguientes ejemplos. Los ejemplos son únicamente para el propósito de ilustración y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención.
Formulaciones de Composición Inmunogénica En ciertas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la invención además comprenden al menos uno de un adyuvante, un tampón, un crioprotector, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un inhibidor de oxidación de radicales libres, un diluyente o un portador.
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender además uno o más conservantes en adición a una pluralidad de antígenos de proteína meningocócica y conjugados de polisacárido capsular-proteína. La FDA requiere que los productos biológicos en viales de dosis múltiples (multidosis) contienen un conservante, con únicamente unas pocas excepciones. Los productos de vacunas que contienen conservantes incluyen vacunas que contiene cloruro de bencetonio (ántrax), 2-fenoxietanol (DTaP, HepA, Lyme, Polio (parenteral)), fenol (Pneumo, Tifoidea (parenteral), Vaccinia) y timerosal (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Rabias). Los conservantes aprobados para su uso en fármacos inyectables incluyen, por ej., clorobutanol, m-cresol, metilparabeno, propilparabeno, 2-fenoxietanol, cloruro de bencetonio, cloruro de benzalconio, ácido benzoico, alcohol bencílico, fenol, timerosal y nitrato fenilmercúrico.
Las formulaciones de la invención pueden comprender además uno o más de un tampón, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un crioprotector tal como una azúcar, y un antioxidante tal como un barredor de radicales libres o agente quelante, o cualquier combinación múltiple de los mismos. La elección de cualquier componente, por ej., un quelador, puede determinar si se desea o no otro componente (por ej., un barredor). La composición final formulada para administración de ser estéril y/o libre de pirógenos. Aquellos con experiencia pueden determinar en forma empírica qué combinaciones de estos y otros componentes serán óptimas para su inclusión en las composiciones inmunogénicas de la invención que contienen conservantes dependiendo de una variedad de factores tales como el almacenamiento particular y las condiciones de administración requeridas.
En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tampones aceptables para uso fisiológico seleccionados de, pero sin limitación, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina y succinato. En ciertas realizaciones, la formulación se tampona hasta dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0, con preferencia de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,4.
En ciertas realizaciones, puede ser deseable ajustar el pH de la composición o formulación inmunogénica de la invención. El pH de una formulación de la invención se puede ajustar por el uso de técnicas estándares en la técnica. El pH de la formulación se puede ajustar para estar entre 3,0 y 8,0. En ciertas realizaciones, el pH de la formulación puede ser, o se puede ajustar para estar, entre 3,0 y 6,0, 4,0 y 6,0, o 5,0 y 8,0. En otras realizaciones, el pH de la formulación puede ser, o se puede ajustar para ser, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,8, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5, o aproximadamente 8,0. En ciertas realizaciones, el pH puede ser, o se puede ajustar para estar, en un intervalo de 4,5 a 7,5, o de 4,5 a 6,5, de 5,0 a 5,4, de 5,4 a 5,5, de 5,5 a 5,6, de 5,6 a 5,7, de 5,7 a 5,8, de 5,8 a 5,9, de 5,9 a 6,0, de 6,0 a 6, 1 , de 6, 1 a 6,2, de 6,2 a 6,3, de 6,3 a 6,5, de 6,5 a 7,0, de 7,0 a 7,5 o de 7,5 a 8,0. En una realización específica, el pH de la formulación es aproximadamente 5,8.
En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con administración parenteral comprende uno o más cationes divalentes, que incluye pero sin limitación MgCI2, CaCI2 y MnCI2, a una concentración que oscila entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 10 mM, se prefiere hasta aproximadamente 5 mM.
En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende una o más sales, que incluyen pero sin limitación cloruro de sodio, cloruro de potasio cloruro, sulfato de sodio, y sulfato de potasio, que están presentes en una potencia iónica que es aceptable para uso fisiológico para el sujeto tras la administración parenteral y se incluye en la concentración final para producir una fuerza iónica seleccionada u osmolaridad en la formulación final. La fuerza iónica final u osmolalidad de la formulación se determinará por medio de múltiples componentes (por ej., iones de compuesto(s) de tamponamiento y otras sales no de tamponamiento. Una sal preferida, NaCI, está presente en un intervalo de hasta aproximadamente 250 mM, con concentraciones de sal seleccionadas para complementar otros componentes (por ej., azúcares) de manera tal que la osmolaridad total final de la formulación es compatible con la administración parenteral (por ej., inyección intramuscular o subcutánea) y promoverán estabilidad a largo término de los componentes inmunogénicos de la formulación de la composición inmunogénica sobre varios intervalos de temperatura. Las formulaciones libres de sal tolerarán intervalos aumentados de los uno o más crioprotectores seleccionados para mantener los niveles de osmolaridad final deseados.
En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más crioprotectores seleccionados de, pero sin limitación, disacáridos (por ej., lactosa, maltosa, sacarosa o trehalosa) y polihidroxi hidrocarburos (por ej., dulcitol, glicerol, manitol y sorbitol).
En ciertas realizaciones, la osmolaridad de la formulación está en un intervalo de aproximadamente 200 mOs/L a aproximadamente 800 mOs/L, con un intervalo preferido de aproximadamente 250 mOs/L a aproximadamente 500 mOs/L, o de aproximadamente 300 mOs/L a aproximadamente 400 mOs/L. Una formulación libre de sal puede contener, por ejemplo, de aproximadamente 5% a aproximadamente 25% de sacarosa, y con preferencia de aproximadamente 7% a aproximadamente 15%, o aproximadamente 10% a aproximadamente 12% de sacarosa. En forma alternativa, una formulación libre de sal puede contener, por ejemplo, de aproximadamente 3% a aproximadamente 12% de sorbitol, y con preferencia de aproximadamente 4% a 7%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente 6% de sorbitol. Si se agrega una sal tal como cloruro de sodio, entonces el intervalo de sacarosa o sorbitol efectivo disminuye en forma relativa. Estas y otras consideraciones de osmolalidad y osmolaridad son muy conocidas dentro del alcance de la técnica.
En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más inhibidores de oxidación de radicales libres y/o agentes quelantes. Se conoce una variedad de barredores de radicales libres y queladores en la técnica y se aplican a las formulaciones y métodos de uso descriptos en la presente. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, etanol, EDTA, una combinación de EDTA/etanol, trietanolamina, manitol, histidina, glicerol, citrato de sodio, hexafosfato de inositol, tripolifosfato, ácido ascórbico/ascorbato, ácido succínico/succinato, ácido málico/maleato, desferal, EDDHA y DTPA, y varias combinaciones de dos o más de los anteriores. En ciertas realizaciones, se puede agregar al menos un barredor de radicales libres no reductor a una concentración que potencia en forma efectiva la estabilidad a largo término de la formulación. También se pueden agregar uno o más inhibidores de oxidación de radicales libres/queladores en varias combinaciones, tales como un barredor y un catión divalente. La elección del quelador determinará si se necesita o no la adición de un barredor.
En ciertas realizaciones, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tensioactivos no iónicos, que incluyen pero sin limitación ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitano, Polisorbato-80 (TWEEN 80), Polisorbato-60 (TWEEN 60), Polisorbato-40 (TWEEN 40) y Polisorbato-20 (TWEEN 20), polioxietilen alquil éteres, que incluyen pero sin limitación BRIJ 58, BRIJ 35, así como también otros tales como TRITON X-100; TRITON X-1 14, NP40, SPAN 85 y las series PLURONIC de tensioactivos no iónicos (por ej., PLURONIC 121 ), siendo los componentes preferidos Polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 2% (se prefiere hasta aproximadamente 0,25%) o Polisorbato-40 a una concentración de aproximadamente 0,001 % a 1 % (se prefiere hasta aproximadamente 0,5%).
En ciertas realizaciones, una formulación de la invención comprende uno o más agentes estabilizantes adicionales adecuados para administración parenteral, por ej., un agente reductor que comprende al menos un grupo tiol (-SH) (por ej., cisteína, cisteína N-acetil, glutationa reducida, tioglicolato de sodio, tiosulfato, monotioglicerol, o mezclas de los mismos). En forma alternativa o en forma opcional, las formulaciones de composición inmunogénica de la invención que contienen conservantes se pueden estabilizar en forma adicional por medio de la eliminación del oxígeno de los contenedores de almacenamiento, la protección de la formulación de la luz (por ej., por el uso de contenedores de vidrio ámbar).
Las formulaciones de composición inmunogénica de la invención que contienen conservantes pueden comprender uno o más diluyentes, portadores o excipientes aceptables para uso farmacéutico, que incluyen cualquier excipiente que no induzca por sí mismo una respuesta inmune. Los excipientes adecuados incluyen pero sin limitación macromoléculas tales como proteínas, sacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, sacarosa (Paoletti et al, 2001 , Vaccine, 19:21 18), trehalosa, lactosa y agregados de lípidos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Tales diluyentes, excipientes, y/o portadores con muy conocidos para aquellos con experiencia. Los excipientes aceptables para uso farmacéutico se discuten, por ej., en Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ma edición, ISBN:0683306472.
Las composiciones de la invención pueden estar en una forma liofilizada o acuosa, es decir, soluciones o suspensiones. Las formulaciones líquidas se pueden administrar en forma ventajosa directamente de su forma envasada y de ese modo son ideales para inyección sin la necesidad de reconstitución en un medio acuoso que de lo contrario se requiere para las composiciones de la invención liofilizadas.
La administración directa de las composiciones inmunogénicas de la presente invención a un sujeto se pueden lograr por medio de administración parenteral (por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, o el espacio intersticial de un tejido); o por medio de administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosal. En una realización preferida, la administración parenteral es por medio de inyección intramuscular, por ej., en el muslo o la parte superior del brazo del sujeto. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ej., una aguja hipodérmica), pero en forma alternativa se puede utilizar una inyección libre de agujas. Una dosis intramuscular típica es de 0,5ml. Las composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas, por ej., para inyección ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. En ciertas realizaciones, la composición se puede preparar como un polvo o pulverizador para administración pulmonar, por ej., en un inhalador. En otras realizaciones, la composición se puede preparar como un supositorio o pesario, o para administración nasal, aural u ocular, por ej., como un pulverizador, gotas, gel o polvo.
Las cantidades óptimas de componentes para una composición inmunogénica particular se pueden determinar por medio de estudios estándares que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Luego de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas en forma adecuada.
Envasado y Formas de Dosificación Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden envasar en formas de dosis unitarias o multidosis (por ej. 2 dosis, 4 dosis, o más). Para las formas de multidosis, en forma típica se prefieren viales pero no necesariamente sobre jeringas prellenadas. Los formatos multidosis adecuados incluyen pero sin limitación: 2 a 10 dosis por contenedor a 0,1 a 2 mi por dosis. En ciertas realizaciones, la dosis es una dosis de 0,5 mi. Véase, por ej. , la Solicitud de patente Internacional WO2007/127668, que se incorpora como referencia en la presente.
Las composiciones se pueden presentar en viales u otros contenedores de almacenamiento adecuados, o se pueden presentar en dispositivos de administración prellenados, por ej., jeringas de componente único o múltiple, que pueden estar suministradas con o sin agujas. Una jeringa en forma típica contiene, pero no necesariamente requiere contener, una única dosis de la composición inmunogénica de la invención que contiene conservante, si bien también se conciben jeringas multidosis y prellenadas. Asimismo, un vial puede incluir una dosis única pero en forma alternativa incluye dosis múltiples.
Los volúmenes de dosificación efectiva se pueden establecer en forma rutinaria, pero una dosis típica de la composición para inyección tiene un volumen de 0,5 mi. En ciertas realizaciones, la dosis está formulada para la administración a un sujeto humano. En ciertas realizaciones, la dosis está formulada para la administración a un sujeto humano adulto, adolescente, niño o infante (es decir, no más de un año de edad) y en realizaciones preferidas se pueden administrar por medio de inyección.
Las composiciones inmunogénicas de la invención líquidas también son adecuadas para reconstituir otras composiciones inmunogénicas que se presentan en forma liofilizada. Cuando una composición inmunogénica ha de utilizarse para tal reconstitución extemporánea, la invención proporciona un kit con dos o más viales, dos o más jeringas prellenadas, o uno o más de cada uno, los contenidos de la jeringa se utilizan para reconstituir los contenidos del vial antes de la inyección, o vice versa.
En forma alternativa, las composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden liofilizar y reconstituir, por ej., por el uso de uno de una multitud de métodos para liofilización muy conocidos en la técnica para formar partículas secas, de forma regular (por ej., esféricas), tales como micropélets o microesferas, que tienen características de partículas tales como tamaños de diámetros medios que se pueden seleccionar y controlar por medio de la variación de los métodos exactos que se utilizan para prepararlos. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender además un adyuvante que en forma opcional se puede preparar con o contener en partículas separadas secas, de forma regular (por ej., esféricas) tales como micropélets o microesferas. En tales realizaciones, la presente invención además proporciona un kit de una composición inmunogénica que comprende un primer componente que incluye una composición inmunogénica estabilizada y seca, en forma opcional comprende uno o más conservantes de la invención, y un segundo componente que comprende una solución estéril, acuosa para la reconstitución de los primeros componentes. En ciertas realizaciones, la solución acuosa comprende uno o más conservantes, y en forma opcional puede comprender al menos un adyuvante (véase, por ej., WO2009/109550 (que se incorpora en la presente como referencia).
Aún en otra realización, un contenedor del formato multidosis se selecciona de uno o más del grupo que consiste en, pero sin limitación, cristalería de laboratorio general, matraces, vasos de precipitados, cilindros graduados, fermentadores, biorreactores, tuberías, tubos, bolsas, frascos, viales, cierres de viales (por ej., un tapón de goma, una rosca en el tapón), ampollas, jeringas, jeringas de cámara doble o múltiple, tapones de jeringas, pistones de jeringas, cierres de goma, cierres de plástico, cierres de vidrio, cartuchos y plumas desechables y similares. El contenedor de la presente invención no está limitado por el material de elaboración, e incluye materiales tales como vidrio, metales (por ej. , acero, acero inoxidable, aluminio, etc.) y polímeros (por ej., termoplásticos, elastómeros, termoplásticos-elastómeros). En una realización particular, el contenedor del formato es un vial de vidrio de 5 mi de Tipo Schott 1 con un tapón de butilo. Aquellos con experiencia apreciarán que el formato establecido con anterioridad de ningún modo es una lista exhaustiva, sino que simplemente sirve como una guía para aquellos con experiencia con respecto a la variedad de formatos disponibles para la presente invención. Los formatos adicionales contemplados para su uso en la presente invención se pueden hallar en catálogos publicados de vendedores y elaboradores de equipamiento de laboratorio tales como United States Plástic Corp. (Lima, OH), VWR.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Procedimientos experimentales Ensayo bactericida en suero Se inmunizaron Macacos Cynomolgus (n = 5/grupo) por vía intramuscular con proteínas rLP2086 o rP2086 (A + B) adsorbidas a AIP04. Los macacos Cynomolgus son un ejemplo de primates no humanos. Los animales se vacunaron en las semanas 0, 4 y 24, y se determinaron titulaciones de anticuerpo funcional de IgG específicas de ORF2086 en las semanas 0, 4, 6 y 26. Se determinaron titulaciones de IgG específicas de ORF2086 en suero contra rLP2086A y B.
Se examinaron titulaciones de anticuerpo funcional por medio de un ensayo bactericida en suero (SBA) contra cepas de Neisseria meningitidis que expresaban ya sea LP2086 con secuencias homologas o heterólogas a aquellas contenidas en la vacuna.
Se determinaron los anticuerpos bactericidas en suero en macacos o conejos inmunizados con la vacuna ORF2086 por el uso de un SBA con complemento humano. Los sueros inmunes de conejos o sueros inmunes de macacos se inactivaron por calor para eliminar la actividad complementaria intrínseca y posteriormente se diluyeron en forma serial 1 :2 en PBS de Dulbecco con Ca2+ y Mg2+ (D-PBS) en una placa de microtitulación de 96 pocilios para probar la actividad bactericida en suero contra cepas de N. meningitidis. Las bacterias utilizadas en el ensayo se cultivaron en medios GC suplementados con suplemento de Kellogg (GCK) y se monitorearon por medio de densidad óptica a 650 nm. Las bacterias se cosecharon para su uso en el ensayo a un OD6so final de 0,50-0,55, se diluyeron en D-PBS y se agregaron 1000 a 3000 CFU a la mezcla de ensayo con 20% de complemento humano.
El suero humano sin actividad bactericida detectable se utilizó como la fuente de complemento exógeno. Las fuentes de complemento se probaron por su adecuabilidad contra cada cepa de prueba individual. Únicamente se utilizó una fuente de complemento si el número de bacterias que sobrevivían en los controles sin sueros inmunes agregados era >75%. Se requirieron diez fuentes de complemento únicas para llevar a cabo los SBA descriptos en este estudio.
Después de una incubación de 30 minutos a 37°C con 5% de C02, se agregó D-PBS a la mezcla de reacción y se transfirieron alícuotas en placas de microfiltros llenadas con 50% de medios GCK. Las placas de microfiltros se filtraron, se incubaron hasta el día siguiente a 37°C con 5% de C02 y se tiñeron microcolonias y se cuantificaron. Las titulaciones bactericidas en suero se definieron como la dilución en suero recíproca interpolada que dio un 50% de reducción en las CFU en comparación con las CFU en los pocilios de control sin sueros inmunes. La titulación SBA se define como la recíproca de la dilución interpolada del suero de prueba que provoca un 50% de reducción en los recuentos bacterianos después de una incubación de 30 minutos a 37°C. Se estableció la susceptibilidad a la eliminación con sueros inmunes ORF2086 si había un aumento de 4 veces o más en la titulación SBA para sueros inmunes ORF2086 en comparación con los sueros preinmunes correspondientes. Los sueros que fueron negativos contra la cepa de ensayo en la dilución de inicio se asignaron una titulación de la mitad del límite de detección para el ensayo (es decir, 4).
Ejemplo 2: Clonación y Expresión de Variantes ORF2086 no Lipidadas La secuencia de aminoácido P2086 maduro correspondiente a los residuos 27 a 286 de N. meningitidis cepa M98250771 (A05) se derivaron en forma original de la amplificación de PCR de ADN genómico. El cebador directo, con una secuencia de TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG (SEQ ID NO: 22), se templó con la 5' secuencia y contenían un sitio Ndel para la clonación. El cebador inverso, con una secuencia de CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC (SEQ ID NO: 23), se templó con el 3' extremo del gen y contenía un codón de terminación TAG seguido del sitio de restricción BamHI. El fragmento amplificado 799 bp primero se clonó en un vector intermedio PCR2.1 (Invitrogen, Carlesbac, CA). Este plásmido se escindió con Ndel y BamHI, y se ligó al vector de expresión pET9a (Novagen, Madison, Wl) que se había escindido con Ndel y BamHI. El vector pLA100 resultante (que incluye la SEQ ID NO: 54), expresó el P2086 maduro de la Subfamilia A05 de la cepa M98250771 sin la cisteína N-terminal (véase la SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 55) que estaría presente en la proteína lipidada. Se utilizó la cepa huésped de £ coli BLR(DE3) [F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm A(srl-recA)306:.Tn10 (TetR) (DE3)] (Novagen) para obtener la expresión de fHBP.
Se utilizaron los mismos pasos de clonación para preparar las variantes suprimidas B02, B03, B09, B22, B24, B44, A04, A12, y A22 Cys N-terminales. Las variantes que contienen Cys N-terminales también se prepararon por este mismo método por el uso de cebadores directos que también incluyó el codón Cys (por ej. El primer codón de las SEQ ID NOs: 1 a 1 1 ). Con base en las secuencias proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia serán capaces de diseñar cebadores directos e inversos para cada una de estas variantes. Por ejemplo, se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar la variante B44 no lipidada seguido de la clonación en pET9a por el uso de Ndel y Blpl.
Tabla 1 Resultados Los constructos de plásmido no lipidado estaban fuertemente expresados, pero las variantes de proteína no lipidadas estaban piruviladas en el residuo de la Cys N-terminal. Véanse los Ejemplos 8 y 9, que describen, por ejemplo, un método para expresar los constructos. Para superar esta piruvilación, el codón de la Cys N-terminal se suprimió. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 10. Sin embargo, la supresión de la Cys N-terminal, derogó la expresión de las variantes A22 y B22. Véase por ej., la Figura 4. Sin embargo, las variantes A05, B01 , y B44, aún estaban expresadas independientemente de la supresión del residuo de la Cys N-terminal. Véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 13 (A05), donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, la SEQ ID NO: 35 (B01 N-terminal), y la SEQ ID NO: 21 (B44), donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida. Véase por ej. , la Figura 5. En adición, la expresión de la variante B09 no lipidada no se vio afectada por la supresión del residuo de la Cys N-terminal. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 4.
Ejemplo 3: Efecto del Tallo de Gly/Ser en Expresión de Variante no lipidada Para determinar por qué las variantes A05, B01 , y B44 se expresaban en la ausencia de la Cys N-terminal y las vanantes A22 y B22 no, las secuencias de estas variantes se alinearon. Las variantes A05, B01 , y B44 todas poseen una serie extendida de 10 o 11 residuos de Gly y Ser inmediatamente luego de la Cys N-terminal (es decir, el tallo de Gly/Ser). Sin embargo, las variantes A22 y B22, únicamente tenían un tallo de Gly/Ser que consistía en 6 residuos de Gly y Ser. Por consiguiente, el tallo de Gly/Ser de las variantes A22 y B22 se expandió por medio de la inserción de residuos Gly y Ser adicionales.
Se prepararon variantes de tallo de Gly/Ser largos por medio de los métodos que se describen en el Ejemplo 2 por el uso de cebadores directos que codifican un tallo de Gly/Ser ya sea 10 o 1 1 residuos de Gly y Ser.
Las variantes A22 y B22 con una Cys N-terminal suprimida, de tallo de Gly/Ser largo (10 a 1 residuos de Gly/Ser) mostró una expresión aumentada sobre las variantes A22 y B22 en una Cys N-terminal suprimida, de tallo de Gly/Ser corto (6 residuos de Gly/Ser). Sin embargo, estos niveles de expresión aún eran reducidos en comparación con los niveles de expresión de las variantes A05, B0 , y B44.
Ejemplo 4: Optimización de codones La expresión de la variante B09 no lipidada no se vio afectada por la supresión del residuo de la Cys N-terminal (véase la SEQ ID NO: 18, donde la cisteína en la posición 1 está suprimida, o la SEQ ID NO: 49). Véase, por ej. , la Figura 6. La evaluación de secuencia de la variante B09 demostró que la variante B09 tiene un tallo de Gly/Ser que consiste en 6 residuos de Gly y Ser, similar al tallo de Gly/Ser de las variantes A22 y B22. De hecho, las colas de la N terminal de las variantes B09 y A22 son idénticas en cuanto al nivel de aminoácido. Sin embargo, las colas de la N terminal de las variantes B09 y A22 (SEQ ID NO: 53 y 42, respectivamente), varían en cuanto al nivel de ácido nucleico por 2 ácidos nucleicos: los ácidos nucleicos 15 y 39 de la SEQ ID NO: 8. Véase por ej., la Figura 6. Los primeros 14 aminoácidos de la cola de la N terminal de la variante B22 son idénticos a las vanantes B09 y A22, y la cola de la N terminal de la variante B22 únicamente difiere en el 15vo aminoácido. Los ácidos nucleicos 1 a 42 de la vanante B22 son idénticos a los ácidos nucleicos 1 a 42 de la variante A22. Los ácidos nucleicos 1 a 42 de la variante B22 (véase la SEQ ID NO: 52) son idénticos a los ácidos nucleicos 1 a 42 de la variante B09 (véase la SEQ ID NO: 53) pero por diferencias en los ácidos nucleicos 15 y 39, cuando están alineados en forma óptima. Por consiguiente, la variante B22 difiere de la variante B09 en los aminoácidos 15 y 39 de la SEQ ID NO: 8. Esta última oración contiene un error tipográfico y debería declarar que la variante B22 difiere de la variante B09 en los ácidos nucleicos 15 y 39 de la SEQ ID NO: 8.
Para determinar si las diferencias del ácido nucleico afectaron el nivel de expresión de la variante B09 en comparación con las variantes A22 y B22, las variantes A22 y B22 se mutaron por medio de mutación por punto para incorporar los ácidos nucleicos 15 y 39 en los codones correspondientes para Gly5 y Gly13. La incorporación de estas mutaciones de ácido nucleico silenciosa aumentó en forma significativa la expresión de las variantes A22 y B22 con la Cys N-terminal suprimida a niveles similares a la variante B09 con la Cys N-terminal suprimida. Véase por ej., la Figura 7. Por consiguiente, la optimización de codones para igualar la variante B09 puede aumentar la expresión de variantes P2086 no lipidadas con la Cys N-terminal suprimida.
Un análisis adicional de las secuencias de variantes no lipidadas sugirieron optimizaciones por codones adicionales en el tallo de Gly/Ser para mejorar la expresión. Por consiguiente, se construyeron variantes no lipidadas adicionales por medio del método del Ejemplo 2 por el uso de cebadores directos que comprenden tales secuencias optimizadas por codones. Los cebadores directos que se utilizaron para generar tallos de Gly/Ser optimizados incluyen cualquiera de las siguientes secuencias: ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGAAGCGGGGGCGGTGGA (SEQ ID NO: 28) S S G G G G S G G G G (SEQ ID NO: 29) ATGAGCTCTGGAAGCGGAAGCGGGGGCGGTGGA (SEQ ID NO: 30) M S S G S G S G G G G (SEQ ID NO: 31 ) ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGA (SEQ ID NO: 32) M S S G G G G (SEQ ID NO: 33) ATGAGCAGCGGGGGCGGTGGA (SEQ ID NO: 34) M S S G G G G (SEQ ID NO: 33) Ejemplo 5: Optimización de la Formulación de Composición inmunogénica Las vacunas formuladas con ISCOMATRIX generan una respuesta inmune rápida que da lugar a una reducción en el número de dosificaciones requeridas para alcanzar una tasa de respuesta mayor que 4 veces de acuerdo con lo medido en un ensayo bactericida en suero. Se inmunizaron grupos de cinco macacos rhesus con diferentes formulaciones de una vacuna rP2086 no lipidada bivalente. La vacuna incluyó una variante A05 no piruvilada y no lipidada (SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 55 codificada por la SEQ ID NO: 54) y una variante B44 no piruvilada y no lipidada (SEQ ID NO: 21 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 44 codificada por la SEQ ID NO: 51 ). Las unidades de adyuvante están de acuerdo con lo presentado a continuación: AIP04 es 250 mcg, ISCOMATRIX está entre 10 y 100 mcg. Las unidades de adyuvante para AIP04 mostrada en las Tablas 2 a 5 se muestran como unidades de miligramos, y por lo tanto se muestran como 0,25 (miligramos) en oposición a 250 mcg.
El cronograma de inmunización fue en las semanas 0, 4 y 24 con extracciones de sangre en las semanas 0, 4, 6 y 26. No hubo aumentos en las titulaciones de SBA luego de las dosis una para cualquiera de los grupos. Después de la dosis dos, se observó un aumento en las titulaciones de SBA y el número de respondedores de acuerdo con lo definido por un aumento de 4 veces en la titulación de SBA por encima del valor de referencia para las formulaciones que contenían el adyuvante ISCOMATRIX. Las Tablas 2 y 3 proporcionan los GMT SBA observados para una cepa de la Subfamilia A y B de fHBP respectivamente. Los GMT SBA para las formulaciones de ISCOMATRIX fueron de 3 a 19 y de 4 a 24 veces mayores que las observadas para la formulación AIP04 para las cepas de la subfamilia A y B respectivamente. También se observaron titulaciones potenciadas después de la dosis tres para las formulaciones de ISCOMATRIX de 13 a 95 y de 2 a 10 para una cepa de la Subfamilia A y B de fHBP respectivamente en comparación con la formulación de AIP04. El análisis de estas tasas de respuesta, de acuerdo con lo definido por un aumento de cuatro veces o mayor en la titulación de SBA sobre el valor de referencia reveló una tendencia similar (Tablas 4 y 5).
Cinco monos por grupo; Cronograma de inmunización: 0, 4, 24 semanas; cronograma de extracciones de sangre 0, 4, 6 y 26 semanas. Cepa de prueba de SBA nB M98 250771 . "-" < 8; "+" 8 a 32; "++" 33 a 128; 129 a 512; "++++" >512 Ejemplo 6: Inmunoprotección conferida por Variantes Lipidadas y no Lipidadas Una variante P2086 no lipidada expresada en forma recombinante (B44) induce una amplia protección de acuerdo con lo medido por medio de SBA contra cepas que representan diversas variantes fHBP (de aproximadamente 85% a aproximadamente <92% ID) secuencias LP2086. Estas tasas de respuesta se obtuvieron para una vacuna no lipidada formulada con AIPO4. Véase la Tabla 6, que muestra tasas de respuesta SBA a una cepa fHBP MnB de la subfamilia B generada por medio de una vacuna bivalente fHBP. La vacuna no lipidada (representada por un "-" debajo de la columna "lipidación") incluyó 1 mcg por proteína de una variante A05 no piruvilada y no lipidada (SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida) y una variante B44 no piruvilada y no lipidada (SEQ ID NO: 21 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida) .
En forma alternativa, una variante P2086 no lipidada expresada en forma recombinante (B44) induce mayores respuestas inmunes de acuerdo con lo medido por medio de la titulación de SBA que una variante lipidada (B01 ) contra cepas que portan secuencias LP2086 similares (>92% ID) y diversas (<92% ID). Se observaron mayores tasas de respuesta (de acuerdo con lo definido por un aumento de cuatro veces o mayor en las titulaciones de SBA sobre el valor de referencia) para la vacuna que contenía el B44 rP2086 no lipidado en comparación con la vacuna lipidada rLP2086 B01 (Tabla 6).
De acuerdo con la Tabla 6, el B44 no lipidado es un componente preferido de la subfamilia B de fHBP en una composición para proporcionar una amplia cobertura contra (por ej., obtener anticuerpos bactericidas contra) cepas de variante LP2086 múltiples.
En forma sorprendente, los inventores notaron que las cepas de la variante B09 LP2086 es improbable en particular que tengan tasas de respuesta de SBA positivas con respecto a polipéptidos ORF2086 (no B09) heterológos. En particular, los inventores hallaron que B09 LP2086 es una excepción en términos de una cepa de ensayo contra la que la composición inmunogénica A05/B44 que se describe en la Tabla 6 obtuvo anticuerpos bactericidas. Por lo tanto, en una realización preferida una composición inmunogénica de la invención incluye un polipéptido B09, en particular en el contexto de una composición que incluye más de un polipéptido ORF2086 de la subfamilia B. En una realización preferida una composición inmunogénica que incluye un B44 no lipidado también puede incluir un polipéptido B09 no lipidado.
Tabla 6: Tasas de respuesta de SBA a una cepa fHBP MnB de la subfamilia B generada por vacunas fHBP bivalentes Suero inmune de macacos rhesus.
Variante % ID a Subfamilia % de LP2086 de Igualada para Adyuvante Vacuna lipidación respondedores Cepa de Componente de PD3 Sem. 26 ensayo Vacuna no lipidada B02 A05/B01 + 80 99,6 A05/B44 100 AIP04 B03 A05/B01 + 50 - 86,7 0,25mg A05/B44 80 B09 A05/B01 + 0 86,3 A05/B44 - 0 B15 A05/B01 + 25 86,7 A05/B44 - 80 B16 A05/B01 + 0 - 87,1 A05/B44 50 B16 A05/B01 + 0 87,1 A05/B44 - 60 B24 A05/B01 + 0 85,9 A05/B44 - 60 B44 A05/B01 + 100 - 100 A05/B44 100 ISCOMATRIX® A05 A05/B44 - 100 100 (10 mcg) ISCOMATRIX® A05 A05/B44 - 100 100 (100 mcg) ISCOMATRIX® A22 A05/B44 - 88,9 80 (10 mcg) ISCOMATRIX® A22 A05/B44 - 88,9 100 (100 mcg) Cinco monos por grupo; Cronograma de inmunización: 0, 4, 24 semanas; cronograma de extracciones de sangre 0, 4, 6, y 26 semanas.
Ejemplo 7: Optimización de codones de las Variantes B44 y B09 Si bien los niveles de expresión alcanzados en los ejemplos anteriores fueron adecuados para muchas aplicaciones, se deseaba una optimización adicional, y se prepararon y probaron constructos de expresión de E. coli que contenían optimización de codones adicionales sobre la longitud completa de la proteína. Se halló que una secuencia tal mejorada para la expresión de una proteína no Cys B44 era la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 43. De acuerdo con lo mostrado en el Ejemplo 9, el constructo de expresión que contenía la SEQ ID NO: 43 mostró una expresión potenciada en comparación con la de la secuencia de tipo salvaje no optimizada.
La expresión de la proteína B09 suprimida de la Cys N-terminal se mejoró por medio de la aplicación de cambios de codones del constructo B44 (SEQ ID NO: 43) a B09 (SEQ ID NO: 48) optimizado con anterioridad. Para generar secuencias B09 optimizadas, la secuencia de ADN optimizada B44 (SEQ ID NO: 43) primero se alineó con la secuencia de ADN del alelo B09 (SEQ ID NO: 48). La secuencia de codificación no lipidado del alelo B09 (SEQ ID NO: 48) se optimizó para reflejar los cambios de codón observados en el alelo B44 optimizado (SEQ ID NO: 43) donde los aminoácidos entre B44 (SEQ ID NO: 44) y B09 (SEQ ID NO: 49) eran idénticos. Las secuencias de codones en el alelo B09 correspondiente a los aminoácidos idénticos entre el alelo B09 y el alelo B44 se cambiaron para reflejar el codón utilizado en la secuencia B44 optimizada (SEQ ID NO: 43). Las secuencias de codones para los aminoácidos que difieren entre B09 (SEQ ID NO: 49) y B44 (SEQ ID NO: 44) no se cambiaron en la secuencia de ADN B09.
En forma adicional, la secuencia de aminoácido B44 no lipidada (SEQ ID NO: 44) contiene dos secuencias repetidas de serina-glicina secuenciales (S-G-G-G-G)(SEQ ID NO: 56)(véanse también los aminoácidos 2 a 6 de la SEQ ID NO: 44) en su N-terminal, mientras que el alelo B09 contiene únicamente una repetición de serina-glicina en la N-terminal (véanse los aminoácidos 2 a 6 y los aminoácidos 7 a 1 1 de la SEQ ID NO: 49). Las dos repeticiones de serina-glicina en la N-terminal de B44 (los aminoácidos 2 a 6 y los aminoácidos 7 a 1 1 de la SEQ ID NO: 44) también tienen usos de codones diferentes (véanse los nucleótidos 4 a 18 y los nucleótidos 19 a 33 de la SEQ ID NO: 43), y diferentes combinaciones de la repetición B44 de serina-glicina optimizada (por ej., ya sea los nucleótidos 4 a 18 de la SEQ ID NO: 43, o los nucleótidos 19 a 33 de la SEQ ID NO: 43, o una combinación de los mismos) se aplicaron a la secuencia de ADN B09 (SEQ ID NO: 48, por ej., aplicados a los nucleótidos 4 a 18 de la SEQ ID NO: 48) con el fin de examinar el efecto de la expresión de proteínas recombinantes.
Se construyeron tres versiones diferentes de B09 optimizadas: la SEQ ID NO: 45 contiene tanto repeticiones de serina-glicina (GS1 y GS2) (los ácidos nucleicos 4 a 33 de la SEQ ID NO: 43) del B44 optimizado, la SEQ ID NO: 46 contiene GS1 (los ácidos nucleicos 4 a 18 de la SEQ ID NO: 43), y la SEQ ID NO: 47 contiene GS2 (los ácidos nucleicos 19 a 33 de la SEQ ID NO: 43). El ADN para todas las secuencias optimizadas por codones anteriores se sintetizaron químicamente por el uso de química estándar en la técnica. El ADN resultante se clonó en vectores de expresión de plásmidos apropiados y se probaron por la expresión en células huéspedes de E. coli de acuerdo con lo descripto en los Ejemplos 8 y 9.
Ejemplo 8: Método para Expresar ORF2086, variante B09 Se transformaron células de la cepa K-12 de E. coli (derivados de W31 10 (CGSC4474) de tipo salvaje que tiene supresiones en recA, fhuA y araA) con el plásmido pEB063, que incluye la SEQ ID NO: 45, pEB064, que incluye la SEQ ID NO: 46, plásmido pEB065, que incluye la SEQ ID NO: 47, o plásmido pLA134, que incluye la SEQ ID NO: 48. Las modificaciones preferidas para la cepa K-12 son útiles para los propósitos de fermentación pero no se requieren para la expresión de las proteínas.
Las células se inocularon en un medio definido con sales de glucosa. Después de 8 horas de incubación a 37°C se aplicó una alimentación de glucosa lineal y la incubación prosiguió durante 3 horas adicionales. Se agregó Isopropil ß-D-l -tiogalactopiranosida (IPTG) al cultivo hasta una concentración final de 0,1 mM seguido por 12 horas de incubación a 37°C. Las células se recolectaron por medio de centrifugación a 16.000xg durante 10 minutos y se lisaron por medio de la adición de Easy-Lyse™ Cell Lysing Kit" de Lienco Technologies (St. Louis, MO) y de un tampón de carga. Los lisatos depurados se analizaron por la expresión de B09 por medio de tinción de Coomassie de geles SDS-PAGE y/o análisis de Western blot con cuantificacion por medio de un densitómetro de barrido. Los resultados de la densitometría de barrido se encuentran a continuación en la Tabla 7: Ejemplo 9: Método para Expresar ORF2086, variante B44 Se transformaron células de la cepa B de E. coli (BLR(DE3), Novagen) con el plásmido pLN056, que incluye la SEQ ID NO: 51 . Las células de la cepa K-12 de E. coli (derivado de W31 10 de tipo salvaje) se transformaron con el plásmido pDK087, que incluye la SEQ ID NO: 43. Las células se inocularon en un medio definido con sales de glucosa. Después de 8 horas de incubación a 37°C se aplicó una alimentación de glucosa lineal y prosiguió la incubación durante 3 horas adicionales. Se agregó Isopropil ß-D-l-tiogalactopiranosida (IPTG) al cultivo hasta una concentración final de 0,1 mM seguido por 12 horas de incubación a 37°C. Las células se recolectaron por medio de centrifugación a 16.000xg durante 10 minutos y se lisaron por medio de la adición de Easy-Lyse™ Cell Lysing Kit" de Lienco Technologies (St. Louis, MO) y de un tampón de carga. Los sobrenadantes se analizaron por la expresión de B09 por medio de tinción de COOMASSIE de geles SDS-PAGE y/o análisis de Western blot, con cuantificacion por medio de un densitómetro de barrido. Los resultados de la densitometría de barrido se encuentran a continuación en la Tabla 8: Ejemplo 10: Piruvilación El presente ejemplo demuestra que el residuo de la Cys N-terminal de proteínas ORF2086 no lipidadas se puede volver piruvilado cuando se expresa en, por ejemplo, E. coli.
Se monitoreó la acumulación de proteínas heterólogas durante la producción de las variantes A05 (SEQ ID NO: 13) y B44 (SEQ ID NO: 21 ) por el uso de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). Esta separación se interconectó con un espectrómetro de masas con detector de tiempo de vuelo cuadrupolo (QTOF-MS) para proporcionar un medio para monitorear la formación de variantes relacionadas con el producto.
Después de expresarse en las células huéspedes B y/o K-12 de E. coli, los productos derivados de estas fermentaciones se sometieron a un procedimiento de purificación durante el cual se observó una modificación del producto. La deconvolución de los espectros de masa caracterizaron las variantes como que exhibían cambios de masa de +70 Da, en comparación con los productos nativos de 27640 y 27572 Da para A05 y B44, respectivamente.
La literatura publicada indicó que un cambio de masa de +70 Da se había observado previamente en las proteínas y se ha atribuido a la piruvilación del residuo amino-terminal.
La presencia y ubicación del grupo piruvato se confirmó por el uso de los datos de fragmentación de espectros de masas (MS/MS). Los datos indicaron que la modificación fue en un residuo de cisteína amino-terminal, es decir, un aminoácido en la posición 1 , de acuerdo con A05 y B44. Para A05, el porcentaje de polipéptidos piruvilados fue de aproximadamente 30%, en comparación con el número total de polipéptidos A05 (SEQ ID NO: 13). Para B44 el porcentaje de polipéptidos piruvilados fue de aproximadamente 25%, en comparación con el número total de polipéptidos B44 (SEQ ID NO: 21 ).
Cuando se purificaron las variantes A05 (SEQ ID NO: 13 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 55) y B44 (SEQ ID NO: 21 donde la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o la SEQ ID NO: 44), que no contienen una cisteína amino-terminal, no hubo una piruvilación detectable (+70 Da).
Ejemplo 11 : Inmunogenicidad de B09 y B44, en forma individual y en combinación Se inmunizaron 5 a 10 grupos de monos macacos rhesus con la variante B09 (SEQ ID NO: 49 codificada por la SEQ ID NO: 48) o la variante B44 (SEQ ID NO: 44 codificada por la SEQ ID NO: 43), o la A05, B09 y B44 (SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 49 codificada por la SEQ ID NO: 48, y SEQ ID NO: 44 codificada por la SEQ ID NO: 43, respectivamente) formulada con 250 mcg de AIP04 por dosis. Los monos se vacunaron por la vía intramuscular en las semanas 0, 4 y 8 con 10 mcg cada uno de fHBP no lipidada sola o en combinación de acuerdo con lo enumerado en las Tablas 9 y 10. Ambas semanas 0 y 12 se analizaron las muestras de suero en SBA contra cepas MnB con ya sea las variantes fHBP de la subfamilia A o la subfamilia B. Los respondedores se registraron como los animales con un aumento x 4 en la titulación. La variante B44 probada fue el constructo optimizado (SEQ ID NO: 43) y las amplias tasas de respuesta que se observaron en estudios previos (tabla anterior) se mantuvieron para el constructo optimizado (Tabla 9) la vacuna B44 sola o en combinación con B09. La vacuna B09 sola (Tabla 10) también podría generar respuestas inmunes con reacción ampliamente cruzada (Tabla 10).
Tabla 9: Tasas de respuesta obtenidas para vacunas fHBP no lipidadas en macacos rhesus Se inmunizaron macacos rhesus (n= 0) por vía i.m. en las semanas 0, 4 y 8 con 10 mcg cada uno de fHBP no lipidada sola o en combinación de acuerdo con lo enumerado en la columna de Vacuna en la formulación con 250 mcg de AIP04. Ambas semanas 0 y 10 se analizaron las muestras de suero en SBA contra las cepas MnB de acuerdo con lo enumerado en la tabla. Los respondedores se registraron como los animales con un aumento x 4 en la titulación.
La Tabla 9 indica, por ejemplo, que una composición que incluye una combinación de B44, B09, y A05 no piruvilados y no lipidados mostró una mayor cobertura cruzada contra las variantes de prueba en comparación con la cobertura cruzada de una composición que incluye B44 solo. En vista de los resultados mostrados en la presente solicitud, que incluye en particular la Tabla 6 y la Tabla 9 juntas, las composiciones que incluyen B44, B09 y A05 solos o en combinación son realizaciones preferidas de la presente invención. En particular, se revelan las composiciones que incluyen tanto B44 como B09. Tal composición con preferencia además incluye una polipéptido de subfamilia A, tal como en particular A05.
Tabla 10: Tasas de respuesta obtenidas para vacuna fHBP B09 no lipidada en macacos rhesus Se inmunizaron macacos rhesus (n= 5) por vía i.m. en las semanas 0, 4 y 8 con 10 mcg cada uno de fHBP no lipidada sola o en combinación de acuerdo con lo enumerado en la columna de Vacuna en la formulación con 250 mcg de AIP0 . Ambas semanas 0 y 10 se analizaron las muestras de suero en SBA contra las cepas MnB de acuerdo con lo enumerado en la tabla. Los respondedores se registraron como los animales con un aumento x 4 en la titulación.
Ejemplo 12: Inmunoprotección conferida por constructo de Variante Lipidada y no Lipidada Veinte conejos blancos hembra de Nueva Zelanda, 2,5 a 3,5 kg, obtenidos de Charles River Canadá, se pre-visualizaron por medio de ELISA celular completo y se seleccionaron 10 animales para este estudio con base en sus bajas titulaciones anteriores contra las cepas de prueba que representan variantes B02 (SEQ ID NO: 16) y B44 (SEQ ID NO: 21 ) de fHBP (Tabla 1 ). Se inmunizó un grupo de tres animales con 100 [ig de cada proteína formulada con 50 pg de ISCOMATRIX por 0,5 mi de dosis en las semanas 0, 4 y 9 (Tabla 12). El Grupo 1 se vacunó con B44 no lipidado (SEQ ID NO: 44). Se incluyó un grupo de control que se vacunó con B01 lipidado formulado con AIP04 (250 mcg). Se les extrajo sangre a los conejos en las semanas 0, 4, 9 y 10. Se prepararon sueros individuales de la semana 10 y se analizaron por medio de un ensayo bactericida en suero contra múltiples cepas meningocócicas del serogrupo B de fHBP de la subfamilia B.
Tabla 11 : Conejos Utilizados en el Estudio Especie: Conejo Cepa: Blanco de Nueva Zelanda Fuente:3 Charles River Laboratory N.° de Animales Por Grupo: 3 N.° Total de Animales: 9 Edad y Sexo: Hembra Peso: 2 3 B01 100 50 3 3 B01 + 100 - 100 Cronograma de inmunización en las Semanas 0, 4, 9; Cronograma de Extracciones en las Semanas 0, 4, 9,10 Ensayo bactericida en suero (SBA): Se llevó a cabo un ensayo bactericida en suero (SBA) basado en microcolonias contra múltiples cepas meningocócicas del serogrupo B (Tabla 13) en muestras de suero individuales. Los sueros humanos de donantes se calificaron como la fuente de complemento para la cepa probada en el ensayo. Se interpolaron las titulaciones bactericidas dependientes de anticuerpos mediadas por complementos y se expresaron como la recíproca de la dilución del suero de prueba que eliminó el 50% de las células meningocócicas en el ensayo. El limite de detección del ensayo fue una titulación de SBA de 4. A una titulación de SBA de <4 se le asignó número de 2. Se calculó un aumento= 4 veces de las titulaciones de SBA en los sueros de la semana 10 en comparación con las titulaciones antes de la extracción y se comparó.
La actividad de anticuerpos bactericidas en suero de acuerdo con lo medido en el SBA es el sustituto inmunológico de protección contra la enfermedad meningocócica. Se determinó la capacidad de inmunización con rfHBP no lipidado para obtener anticuerpos bactericidas en conejos por medio de SBA. El SBA mide el nivel de anticuerpos en una muestra de suero por medio de la imitación de la lisis bacteriana mediada por complementos que sucede en forma natural. Se analizaron las muestras de suero de conejo recolectada de la semana 10 por medio de SBA contra cepas con un fHBP B44 o un fHBP B02. De acuerdo con lo mostrado en la Tabla 13, una semana después de la tercera inmunización (semana 10), todas las muestras de suero exhibieron una actividad bactericida contra ambas cepas de prueba (Tabla 13). El B44 no lipidado (SEQ ID NO: 44) fuer más inmunogénico que el B01 no lipidado en Conejos de Nueva Zelanda contra estas cepas. El B44 no lipidado (SEQ ID NO: 44) formulado con el adyuvante iscomatrix dio titulaciones comparables con el B01 lipidado formulado con fosfato de aluminio contra estas cepas. Los sueros de conejo antes de la extracción por lo general no mostraron actividad bactericida preexistente contra las cepas probadas.
Tabla 13: Actividad bactericida en suero contra Cepas de fHBP de la Subfamilia B en Conejos Blancos de Nueva Zelanda Vacunados con fHBP No lipidado Recombinante Titulación SBA GMT contra variante de prueba Variante de la Subfamilia B B44 (SEQ ID NO: 21) B02 (SEQ ID NO: 16) (formulación) B44 no lipidada (SEQ ID NO: 6675 7140 44)(ISCOMATRIX) B01 no lipidada (ISCOMATRIX) 625 1052 B01 lipidada (AIPQ4) 10099 10558 Ejemplo 13: Inmunogenicidad de seis proteínas de unión al factor H no lipidadas en conejos blancos de Nueva Zelanda.
Se inmunizaron grupos de 5 conejos con variantes fHBP no lipidadas de acuerdo con lo descripto en la Tabla 14. Las vacunas se administraron en las semanas 0, 4 y 9. Las muestras de suero de conejo recolectadas de las semanas 0 y 10 se analizaron por medio de SBA contra las cepas con secuencias homologas y heterólogas de fHBP. La Tabla 14 muestra los porcentajes de respondedores luego de la tercera inmunización. Una semana después de la tercera inmunización (semana 10), todas las muestras de suero exhibieron una actividad bactericida contra las cepas homologas así como también otras cepas de prueba de la misma subfamilia fHBP. Los sueros de conejos antes de la extracción por lo general no mostraron actividad bactericida preexistente contra las cepas probadas.
Tabla 14: Tres Por ciento posterior a la Dosis de Respondedores en Conejos Blancos de Nueva Zelanda Vacunados con fHBP Recombinantes No lipidados Proteínas MnB fHBP Utilizadas Variantes de prueba en la Tabla 14: Ejemplo 14: > A05 no lipidado (SEQ ID NO: 55) SSGSGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAE TFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAWALQI EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTID FAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGD RAQ E I AGSATVKI RE KVH E I G I AG KQ >pEB042 (SEQ ID NO: 65) ATGAGCTCTGGAAGCGGAAGCGGGGGCGGTGGAGTTGCAGCAGACATTGGAACA GGATTAGCAGATGCACTGACGGCACCGTTGGATCATAAAGACAAAGGCTTGAAAT CGCTTACCTTAGAAGATTCTATTTCACAAAATGGCACCCTTACCTTGTCCGCGCAA GGCGCTGAAAAAACTTTTAAAGTCGGTGACAAAGATAATAGCTTAAATACAGGTAA ACTCAAAAATGATAAAATCTCGCGTTTTGATTTCGTGCAAAAAATCGAAGTAGATG GCCAAACCATTACATTAGCAAGCGGTGAATTCCAAATATATAAACAAGACCATTCA GCAGTCGTTGCATTGCAAATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCT GATAAACCAACGTTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGTGAACATACAGCCTTC AACCAATTACCAAGCGGCAAAGCGGAGTATCACGGTAAAGCATTTAGCTCAGATG ATGCAGGCGGTAAATTAACTTATACAATTGACTTTGCAGCAAAACAAGGACATGGC AAAATTG AAC ATTTAAAAAC AC CCG AAC AG AAC GTAG AG CTCG C ATC C G C AG AACT CAAAGCAGATGAAAAATCACACGCAGTCATTTTGGGTGACACGCGCTACGGCAGC GAAGAAAAAGGTACTTACCACTTAGCTCTTTTTGGCGACCGAGCTCAAGAAATCG CAGGTAGCGCAACCGTAAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATTGGGATCGCGG G C AAAC AATAA > A12 no lipidado (SEQ ID NO: 66) SSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGA EKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIE KINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSID FTKKQGYGRIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGD RAQE I AGSATVKI REKVHEI G IAG KQ >pEB043(SEQ ID NO: 67) ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGAAGCGGGGGCGGTGGAGTTGCAGCAGACATTGG AGCAGGATTAGCAGATGCACTGACGGCACCGTTGGATCATAAAGACAAAAGTTTG CAGTCGCTTACCTTAGATCAGTCTGTCAGGAAAAATGAGAAACTTAAGTTGGCGG CGCAAGGCGCTGAAAAAACTTATGGAAACGGTGACAGCTTAAATACAGGTAAACT CAAAAATGATAAAGTCTCGCGTTTTGATTTCATTCGTCAAATCGAAGTAGATGGCC AAACC ATTAC ATTAG CAAG CGGTG AATTC C AAATATATAAAC AAAAC C ATTC AG C A GTCGTTGCATTGCAAATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGAT AAACCAACGTTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGTGAACATACAGCCTTCAAC CAATTACCAGACGGCAAAGCGGAGTATCACGGTAAAGCATTTAGCTCAGATGATC CGAACGGTAGGTTACACTATTCCATTGACTTTACCAAAAAACAAGGATACGGCAGA ATTGAACATTTAAAAACGCCCGAACAGAACGTAGAGCTCGCATCCGCAGAACTCA AAGCAGATGAAAAATCACACGCAGTCATTTTGGGTGACACGCGCTACGGCGGCG AAGAAAAAGGTACTTACCACTTAGCCCTTTTTGGCGACCGCGCTCAAGAAATCGC AGGTAGCGCAACCGTAAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATTGGGATCGCGGG CAAACAATAA >A22 no lipidado (SEQ ID NO: 68) SSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYG NGDSLNTGKLKND VSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPD KIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQG HGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIA GSATVKIREKVHEIGIAGKQ >pEB058 (SEQ ID NO: 69) ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGAGTTGCAGCAGACATTGGAGCAGGATTAGCAGAT GCACTGACGGCACCGTTGGATCATAAAGACAAAAGTTTGCAGTCGCTTACCTTAG ATCAGTCTGTCAGGAAAAATGAGAAACTTAAGTTGGCGGCGCAAGGCGCTGAAAA AACTTATGGAAACGGTGACAGCTTAAATACAGGTAAACTCAAAAATGATAAAGTCT CGCGTTTTGATTTCATTCGTCAAATCGAAGTAGATGGCCAACTTATTACATTAGAAA GCGGTGAATTCCAAATATATAAACAAGACCATTCAGCAGTCGTTGCATTGCAAATT GAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGTTCCTTCCT TGTCAGCGGTTTGGGCGGTGAACATACAGCCTTCAACCAATTACCAAGCGGCAAA GCGGAGTATCACGGTAAAGCATTTAGCTCAGATGATGCAGGCGGTAAATTAACTT ATAC AATTG ACTTTG CAG C AAAAC AAG G AC ATG G C AAAATTG AAC ATTTAAAAAC A CCCGAACAGAACGTAGAGCTCGCATCCGCAGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCAC ACGCAGTCATTTTGGGTGACACGCGCTACGGCGGCGAAGAAAAAGGTACTTACCA CTTAGCTCTTTTTGGCGACCGAGCTCAAGAAATCGCAGGTAGCGCAACCGTAAAG ATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATTGGGATCGCGGGCAAACAATAA > A62 (SEQ ID NO: 70). GenBank: ACI46789,1 CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTY GNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQ DSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDF AAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDR AQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ >A62 no lipidado (SEQ ID NO: 71) SSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYG NGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQD SEDSG MVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAA KQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRA QEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ >pLA164 (SEQ ID NO: 72) ATGAGCAGCGGAGGGGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGTGCGGGGCTTGCCGA TGCACTAACCGCACCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGCAGTCTTTAACGCTG GATCAGTCCGTCAGGAAAAACGAGAAACTGAAGCTGGCGGCACAAGGTGCGGAA AAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTTAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGG TCAGCCGCTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGAAGCTCATTACCTT GGAGAGCGGAGAGTTCCAAGTGTACAAACAAAGCCATTCCGCCTTAACCGCCCTT CAGACCGAGCAAGTACAAGACTCGGAGGATTCCGGGAAGATGGTTGCGAAACGC CAGTTCAGAATCGGCGACATAGCGGGCGAACATACATCTTTTGACAAGCTTCCCA AAGGCGGCAGTGCGACATATCGCGGGACGGCGTTCGGTTCAGACGATGCTGGCG GAAAACTGACCTATACTATAGATTTCGCCGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGA ACACTTGAAAACACCCGAGCAAAATGTCGAGCTTGCCTCCGCCGAACTCAAAGCA GATGAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCGGCGAAGAA AAAGGCACTTACCACCTCGCCCTTTTCGGCGACCGCGCCCAAGAAATCGCCGGC TCGGCAACCGTGAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGCCGGCAAA CAGTAA > pDK086 (SEQ ID NO: 73) ATGTCCAGCGGTTCAGGCAGCGGCGGTGGAGGCGTGGCAGCAGATATCGGAAC AG GTTTAG C AG ATG CTCTG AC AG C ACCCTTAG ATC AC AAAG AC AAAG G ACTTAAAT CACTGACATTGGAAGATTCTATCTCGCAAAATGGTACTCTCACTCTTTCAGCCCAA GGCGCAGAAAAAACATTTAAAGTAGGCGATAAAGATAACTCCTTAAATACAGGTAA ATTAAAAAATGACAAAATCTCACGGTTTGATTTCGTTCAGAAAATTGAAGTAGATGG ACAAACGATTACATTAGCAAGCGGCGAATTCCAAATTTATAAACAAGACCATTCAG CAGTAGTAGCATTACAAATCGAAAAAATTAACAACCCGGACAAAATTGATTCTCTTA TTAACCAACGCTCTTTTCTCGTATCAGGACTTGGTGGTGAACATACAGCGTTTAAT CAACTGCCGTCAGGAAAAGCAGAATATCATGGTAAAGCATTTTCATCAGACGACG CAGGTGGCAAACTGACCTATACTATTGACTTTGCAGCAAAACAGGGACATGGAAA AATTGAACATTTAAAAACACCCGAACAGAACGTAGAACTGGCCTCAGCAGAATTGA AAG CTG ATG AAAAATCC C ATG C AGT AATTTT AG GCG ATAC AC GTT ACGGTAG C G AA G AAAAAG GTAC ATATC ACTTAG CTCTTTTTG G C GATCGTG CTC AAG AAATTG CTG G TTCCGCAACAGTTAAAATCCGTGAAAAAGTACATGAAATCGGCATTGCAGGTAAAC AATAA >A29 (SEQ ID NO: 74) CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQG AEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWA LQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGDKAEYHGKAFSSDDPNGRLH YTIDFTNKQGYGRIEHLKTPELNVDLASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLAL FGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ >B22 no lipidado (SEQ ID NO: 75) SSGGGGVAADIGAVLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYG NGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQD SEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDASGKLTYTIDFAA KQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLG!FGGQAQ EVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ > A05 no lipidado (SEQ ID NO: 76) (pPW102) CGSSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGD KDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSL INQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKT PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEI GIAGKQ > A05 no lipidado (SEQ ID NO: 77) GSSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDK DNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLI NQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTP EQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGI AGKQ >Consenso (SEQ ID NO: 78) CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGD SLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQSHSALVALQTEQINNSDKSGSLIN QRSFRISGIAGEHTAFNQLPKGGKATYRGTAFSSDDAGG LTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPE QNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGI AGKQ >Consenso (SEQ ID NO: 79) SSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDS LNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQSHSALVALQTEQINNSDKSGSLINQ RSFRISGIAGEHTAFNQLPKGGKATYRGTAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQ NVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIA GKQ Ejemplo 15: Generación de variantes no lipidadas de rP2086de la subfamilia A-Clonación de genes de fHBP no lipidados La secuencia de codificación de la proteína no lipidada A05 fHBP (SEQ ID NO: 55) se alineó a una secuencia B44 optimizada por expresión (SEQ ID NO: 43). Cuando los aminoácidos entre las dos eran idénticos, se utilizó el codón de la B44 (SEQ ID NO: 43) para sustituirse en el gen A05. La secuencia optimizada se sintetizó de nuevo en Celtek Genes, con el agregado de sitios de restricción endonucleasa Ndel y BamHI en las N- y C-terminales, respectivamente. El gen resultante (SEQ ID NO: 65) se subclonó en pET30a en esos sitios.
Se expresó la fHBP A12 no lipidada recombinante (SEQ ID NO: 66) a partir de pEB043 (SEQ ID NO: 67). El alelo A12 se optimizó por expresión por medio de Blue Heron Technologies. Este gen se optimizó por medio del mismo proceso que para A05 (pEB042). En adición, los codones amino-terminales B44 SGGGGSGGGG (residuos de aminoácidos 2 a 1 1 de la SEQ ID NO: 44) optimizados por Blue Heron reemplazaron los codones A12 SSGGGG nativos (residuos de aminoácidos 1 a 6 de la SEQ ID NO: 66). La secuencia optimizada se sintetizó de nuevo en Celtek Genes, con el agregado de sitios de restricción endonucleasa Ndel y BamHI en las N- y C-terminales, respectivamente. El gen resultante (SEQ ID NO: 67) se subclonó en pET30a en esos sitios.
Se expresó la fHBP A22 no lipidada recombinante (SEQ ID NO: 68) a partir de pEB058 (SEQ ID NO: 69). Este gen se optimizó por medio del mismo proceso que para pEB042. En adición, los codones amino-terminales B44 SGGGG (residuos de aminoácidos 2 a 6 de la SEQ ID NO: 44) optimizados por Blue Heron reemplazaron los codones A22 SSGGGG nativos (residuos de aminoácidos 1 a 6 de la SEQ ID NO: 68). La secuencia optimizada se sintetizó de nuevo en Celtek Genes, con el agregado de sitios de restricción endonucleasa Ndel y BamHI en las N- y C-terminales, respectivamente. El gen resultante (SEQ ID NO: 69) se subclonó en pET30a en esos sitios.
Se expresó la fHBP A62 recombinante (SEQ ID NO: 71 ) a partir de pLA164 (SEQ ID NO: 72). El alelo A62_002 de la cepa 0167/03 se amplificó por PCR con cebadores que contenían sitios de restricción endonucleasa Ndel y BamHI en las N- y C-terminales, respectivamente. El gen resultante (SEQ ID NO: 72) se subclonó en pET30a en esos sitios.
Ejemplo 16: Expresión, Fermentación, y Purificación de proteínas rP2086 de la Subfamilia A de cepas de expresión de E. coli Se utilizó BLR(DE3) E. coli B recA- transformado con pLA164 (SEQ ID NO: 72) para la expresión de A62 (SEQ ID NO: 71 ). El plásmido pEB042 (SEQ ID NO: 65) se transformó en el huésped de E. coli BD643 (W31 10:DE3 ArecA AfhuA AaraA) para dar la cepa BD660 para la expresión de A05 (SEQ ID NO: 55). La expresión de A22 (SEQ ID NO: 68) fue a partir de la cepa BD592 que consiste en el plásmido pEB058 (SEQ ID NO: 69) que reside en el huésped BD559 (que también es W31 10:DE3 ArecA AfhuA AaraA). Por último, el plásmido pEB043 (SEQ ID NO: 67) se transformó en el huésped BD483 (W31 10:DE3 ArecA) para dar la cepa BD540 para la expresión de A12 (SEQ ID NO: 66).
Fermentación Se fermentaron cepas de expresión en un medio mínimo basado en glucosa. Se inoculó un cultivo de inicio del día anterior en diez litros de fermentadores operados a 37°C, 1 vvm de aeración con control en cascada dO a 20%. Cuando se retiró la glucosa en lotes del medio (a ~OD600=15), se inició una alimentación de glucosa lineal limitante a 3,8 g/L/hr. La alimentación prosiguió hasta la inducción con 0,1 mM de IPTG y a través de un período de expresión de proteínas posterior. Para la expresión de A05 (SEQ ID NO: 55), la cepa BD660 se indujo a OD60o=25 y la fermentación prosiguió durante 7 horas después de la inducción (HPI). La expresión de A22 (SEQ ID NO: 68) y A12 (SEQ ID NO: 66) de las cepas BD592 y BD540, respectivamente, se alcanzó por medio de la inducción a OD600=40 y por medio de la fermentación durante 24 HPI. Al final de la fermentación, las pastas celulares se recolectaron por medio de centrifugación.
A62 (SEQ ID NO: 71 ) Las proteínas rP2086 se producen como proteínas solubles en el citoplasma de las cepas de E. coli. El extracto citoplásmico soluble en forma típica se obtiene por medio del descongelamiento de células congeladas que expresan una variante particular de la subfamilia A de rP2086 en un tampón hipotónico (10mM de Hepes-NaOH pH 7,4 que contiene inhibidores de proteasa) y que altera las células en un Microfluidizador bajo ~20.000 psi. Se agregan ARNse y ADNse para digerir los ácidos nucleicos y el extracto citoplásmico se recolecta como el sobrenadante luego de la centrifugación a baja velocidad cualquier célula intacta y luego alta velocidad (>100,000xg) para eliminar membranas, paredes celulares y otros componentes subcelulares más grandes. El extracto citoplásmico está clarificado además por medio de ajustes secuenciales a 25% luego 50% saturado+9 sulfato de amonio y por medio de la eliminación de material precipitado después de cada ajuste por medio de centrifugación a baja velocidad. Los componentes celulares iónicos de bajo peso molecular luego se eliminan por medio de la adsorción de la rP2086 en 50% de sulfato de amonio saturado en un tampón de 10mM de Hepes-NaOH pH 7,4, mM de Na2EDTA en una columna de interacción hidrofóbica (fenil sefarosa adquirida de GE Healthcare), luego por medio de la elución de la rP2086 por medio de la disminución lineal de la concentración de sulfato de amonio hasta 0% con un tampón de 10mM de Hepes-NaOH pH 7,4, 1 mM de Na2EDTA. La mayor parte de las proteínas cargadas en forma negativa luego se eliminan por medio del ajuste del rP2086 que contiene fracciones hasta un tampón de 10mM de Tris-HCI, pH 8,6, 1 mM de Na2EDTA, por medio del paso de las fracciones reunidas sobre una columna de intercambio de aniones (TMAE adquirido de EMD) equilibrada con el mismo tampón. La rP2086 luego se purifica en forma adicional por medio de cromatografía en hidroxiapatita cerámica (obtenida de BioRad) por medio del intercambio del tampón que contiene la rP2086 para 10mM de Hepes-NaOH, pH 7,4 que contiene 1 mM de fosfato de sodio que adsorbe la proteína en la hidroxiapatita cerámica luego por medio de la elución con un gradiente lineal de fosfato de sodio hasta 250mM a un pH de 7,4. Las operaciones de unidad enumeradas con anterioridad a menudo son suficientes para dar los miembros rP2086 de la subfamilia A purificados. Sin embargo, dado que el nivel de expresión puede variar de a 10 veces, cuando la rP2086 está expresada en el extremo inferior del intervalo o cuando se requiere rP2086 ultra puro (en concentraciones altas para determinaciones estructurales de NMR), se agregan las siguientes operaciones de unidad adicionales: cromatoenfoque seguido por cromatografía de hidroxiapatita cerámica. El tampón que contiene proteína rP2086 del paso de hidroxiapatita anterior se intercambia con 25mM de Tris-acetato, pH 8,3 y la proteina se adsorbe en una columna PBE94 de cromatoenfoque (obtenida de GE Healthcare) equilibrada con el mismo tampón y luego se eluye con un tampón de politampón 94-acetato, pH 6. Las proteínas rP2086 se eluirán en sus ~pl y se reúnen las fracciones que contienen la proteína. El tampón déla rP2086 que contiene fracciones luego se intercambia con 10mM de Hepes-NaOH pH 7,4 que contiene 1 mM de fosfato de sodio y se adsorbe y se eluyeron al igual que con anterioridad. Los miembros rP2086 de la subfamilia A preparados por medio de este proceso en forma típica son >95% homogéneos por medio de análisis SDS-PAGE y más a menudo >99% homogéneos.
A05, A12 y A22 (SEQ ID NOs: 55, 66, y 68, respectivamente) Al final de la fermentación, la suspensión celular se recubre por medio de centrifugación continua y se resuspende hasta ~1/4 del volumen de la fermentación original en 20 mM de Tris, 5 mM de EDTA, pH 6,0. La lisis de la suspensión celular se alcanza por medio de homogenización a alta presión (2 pasadas, 4000 a 9000 psi). Se agrega DADMAC al homogenado hasta una concentración final de 0,5%. La solución se agita a 15 a 25 °C durante 60 minutos, tiempo durante el cual se forma un precipitado pesado. La solución se clarifica por medio de centrifugación continua. Las proteínas (A05, A12 y A22) se purifican por el uso de dos pasos cromatográficos seguidos por un intercambio de tampones final. El pH del concentrado se ajusta hasta 5,5 y se carga en una columna GigaCap-S (CEX). La proteína se une a la resina y posteriormente se eluye por el uso de un gradiente de cloruro de sodio. A lo reunido de la columna de CEX se agrega citrato de sodio hasta una concentración final de 1 ,5 M, y la solución se carga en una columna Phenil-650M (HIC). La proteína se une a la resina y posteriormente se eluye por el uso de un paso de gradiente de citrato de sodio. La reunión de HIC que contiene la proteína purificada se intercambia con el tampón de principio activo final por medio de diafiltración. Se utiliza un cassette de ultrafiltración de acetato de celulosa regenerado de 5 kD. La concentración de proteína se dirige a 1 ,5 a 2,0 mg/ml. El retenido diafiltrado se filtra a través de un filtro de 0,2 micrones antes de rellenarse en las botellas de almacenamiento. El principio activo se almacena a -70°C.
Ejemplo 17: Ensayo bactericida en suero Se examinaron las titulaciones de anticuerpo funcional por medio de un ensayo bactericida en suero (SBA) contra cepas de Neisseria meningitidis serogrupo B de tipo salvaje o manipuladas que expresan fHBP ya sea con secuencias homologas o heterólogas a aquellas contenidas en la vacuna. Se determinaron anticuerpos bactericidas en suero en conejos inmunizados con vacunas de rP2086 por el uso de SBA con un complemento humano. Los sueros inmunes de conejo se inactivaron por calor para eliminar la actividad de complemento intrínseca y posteriormente se diluyeron en forma serial dos veces en PBS de Dulbecco con una placa de microtitulación de 96 pocilios Ca2+ y g2+ (D-PBS) para probar la actividad bactericida en suero contra cepas de N. meningitidis. Para estudios de combinación con cepas manipuladas, los sueros de interés se mezclaron en una proporción 1 : 1 antes de la dilución serial descripta con anterioridad, entonces la concentración efectiva de cada componente era la mitad cuando cada una se probaba en forma individual. Las bacterias utilizadas en el ensayo se cultivaron en medios GC suplementados con suplemento de Kellogg (GCK) y se monitorearon por medio de densidad óptica a 650 nm. Las bacterias se cultivaron para su uso en el ensayo en un OD650 final de 0,50 a 0,55, se diluyeron en D-PBS y se agregaron 000 a 3000 CFU a la mezcla de ensayo. Se utilizó suero humano sin actividad bactericida detectable como la fuente de complemento exógena. Las fuentes de complemento se probaron por su adecuabilidad contra cada cepa de prueba individual. Para las cepas isogénicas, se identificó un único suero humano y se calificó para los SBA contra todas las cepas isogénicas. Se utilizó una fuente de complemento únicamente si el número de bacterias que sobrevivían en los controles sin sueros inmunes agregados era >75%. Después de una incubación de 30 minutos a 37°C con 5% de C02 y una agitación de 700 rpm en un agitador, se agregó D-PBS a la mezcla de reacción y se transfirieron alícuotas a placas de microfiltros prellenadas con 50% de medios GCK para las cepas de tipo salvaje y 100% de medio GCK para las cepas manipuladas. Las placas de microfiltros se filtraron, se incubaron hasta el día siguiente a 37°C con 5% de C02 y se tiñeron y cuantificaron las microcolonias. Las titulaciones de bactericidas en suero se definieron como la dilución en suero reciproca interpolada que dio un 50% de reducción en las CFU en comparación con las CFU en pocilios de control sin sueros inmunes. Se estableció la susceptibilidad a la eliminación por medio de sueros inmunes anti-rP2086 si había un aumento de 4 veces o más en la titulación de SBA para sueros inmunes anti-rP2086 en comparación con los sueros preinmunes correspondientes. Los sueros que eran negativos contra la cepa de ensayo en la dilución de inicio se asignaron una titulación de la mitad del límite de detección para el ensayo.
Ejemplo 18: Inmunogenicidad de variantes no lipidadas de proteínas rP2086 de la subfamilia A Se utilizaron conejos hembra blancos de Nueva Zelanda (de 2,5 a 3,5 kg) obtenidos de Charles River (Canadá) en dos estudios. Para el primer estudio, se inmunizaron grupos de 3 conejos con ya sea 30 mcg o 3 mcg cada uno de ya sea una formulación fHBP de A05 lipidada o de A05 no lipidada. Para el segundo estudio, se inmunizaron cinco conejos por grupo por vía intramuscular en la pata trasera derecha con variantes rP2086A a 20 pg/ml adyuvada con 500 pg/ml de AIP04 (0,5ml/dosis/dos sitios). Los animales se vacunaron en las semanas 0, 4 y 9, se les extrajo sangre en las semanas 0 y 6 y se desangraron en la semana 10. Las titulaciones de anticuerpo bactericida específico LP2086 se determinaron en las semanas 0, 6 y 10.
El objetivo de estos estudios fue imitar las las respuestas reducidas que se observan para poblaciones inmunológicamente na'if tales como infantes. Primero se comparó una dosificación baja y una alta (30 vs 3 mcg por antígeno por dosis) de vacunas que contenían ya sea A05 lipidado (SEQ ID NO: 13) o A05 no lipidado (SEQ ID NO: 55) (Tablas 15 A y 15B). Las dosificaciones bajas se utilizaron de manera tal que se pudieran discernir las diferencias en la tasa de respuesta entre cada vacuna. Se llevó a cabo un análisis SBA por el uso de dos conjuntos de cepas. El primer conjunto consistió en cepas de tipo salvaje que habían provocado una enfermedad invasiva. El segundo era un conjunto de cepas genéticamente manipuladas que tenían el mismo antecedente de cepas y difería únicamente por la secuencia del fHBP que se expresaba de acuerdo con lo presentado a continuación: la cepa PMB3556 de N. menigitidis, que expresa una variante B24 de fHBP, se manipuló de manera tal que su gen fhbp endógeno se reemplazó con genes que codifican otras variantes fHBP. Los constructos se diseñaron de manera tal que únicamente la región que codifica el ORF se "intercambió" y el antecedente genético que lo rodeaba se dejó intacto. Por lo tanto, el análisis de SBA por el uso de este conjunto de cepas permitió la evaluación de reactividad contra diferentes proteínas fHBP de la subfamilia A expresadas en el mismo nivel y en el mismo antecedente genético por el uso de una fuente de complemento humano. Todas las cepas tenían niveles de expresión de fHBP que estaba por encima del umbral identificado por Jiang et al (2010). De acuerdo con lo mostrado en las Tablas 15A y 15B, tanto los niveles de dosis altas y bajas de la vacuna que contiene A05 lipidado obtuvo una amplia protección a lo largo de las variantes de la subfamilia A genéticamente diversas, mientras que se observaron respuestas reducidas en ambas dosis para la vacuna que contiene la variante no lipidada A05. Por lo tanto, esta comparación de lado a lado reveló que, si bien la variante no lipidada A05 es protectora en forma cruzada a lo largo de la cepas expresoras de la subfamilia A, no es tan inmunogénica como la variante lipidada que es más probable que forme una configuración nativa (Tablas 15A y 15B).
Para el estudio posterior, el nivel de dosis se elevó a 10 mcg por variante no lipidada de la subfamilia A para evaluar casa uno por su potencial para proporcionar una amplia cobertura contra las cepas de la subfamilia A. El análisis de SBA revela que en estos sueros de nivel de dosis elevados de conejos inmunizados con variantes fHBP A05 (SEQ ID NO: 55), A62 (SEQ ID NO: 71 ), A12 (SEQ ID NO: 66) y A22 (SEQ ID NO: 68) no lipidadas todos indujeron titulaciones de cepas de tipo salvaje que expresan tanto variantes homologas como heterólogas de la subfamilia A, lo que indica que todos eran protectores en forma cruzada en esta dosis baja dentro de la subfamilia A. Por lo tanto, se ha observado que la vacuna N2C1 (A05) podría generar anticuerpos que podrían eliminar las cepas de las variantes N1 C2 (A22) y N2C2 (A12) y asimismo las vacunas de estos otros grupos podrían eliminar las cepas con variantes opuestas. Bajo estas condiciones, se observó que las variantes A05 y A62 indujeron las tasas de respuesta de SBA más altas a lo largo de las cepas (Tabla 16). Por consiguiente, esto muestra un efecto protector a lo largo de estas variantes.
Tablas 15A y 15B. Las Titulaciones de SBA Medias Geométricas contra cepas de N. meningitidis grupo B de sueros tomadas antes y después (PD3 = 10 semanas) de la inmunización de los conejos (n = 3) con vacunas ya sea de 30 o 3 mcg que contienen A05 lipidado o no lipidado. Las filas superiores (marcadas como "cepas de tipo salvaje") de las Tablas 15A y 15B sintetizan la actividad contra aislados clínicos. Las filas inferiores (marcadas como "cepas isogénicas") de las Tablas 15A y 15B sintetizan la actividad contra un conjunto de cepas isogénicas que se manipularon de la cepa de N. meningitidis parental (PMB3556) de manera tal que la ORF completa de su fHBP endógeno se reemplazó ya sea con variantes A05 (SEQ ID NO: 13), A22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) o A12 (SEQ ID NO: 14).
Tabla 16. El porcentaje de respondedores que demuestra un aumento de al menos 4 veces en los niveles de GMT SBA sobre los antecedentes de los sueros de 10 semanas tomados de conejos inmunizados con 10 mcg de variantes fHBP no lipidadas de la subfamilia A contra cepas que expresan las variantes fHBP A05, A62, A12 o A22.
También se observó una protección cruzada para todas las variantes por el uso del conjunto de cepas isogénicas que se describe con anterioridad en la dosis aumentada de 10 mcg, con sueros de conejos inmunizados con la variante A62 (SEQ ID NO: 71 ) lo que demuestra la mayor reactividad cruzada, seguido por anti-sueros A05 (Tabla 17). En adición, los sueros de conejos inmunizados con la variante A62 (SEQ ID NO: 71 ) mostraron reactividad tanto a la cepa PMB3556 parental y la cepa B09 intercambiada (Tabla 18), lo que indica que la actividad de reactividad cruzada se extiende a las proteínas de la subfamilia B. A62 parece estar compuesta tanto por dominios de la subfamilia A (A22) como la subfamilia B (B09) (Figuras 9A y 9B).
Porcentaje de Respondedores (aumento >4 veces) Tabla 17. Se manipularon cepas isogénicas "intercambiadas" de la cepa N. meningitidis padre (PMB3556) de manera tal que la ORF completa de su fHBP endógeno (una variante B24) se reemplazó ya sea con las variantes A05 (SEQ ID NO: 13), A22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) o A12 (SEQ ID NO: 14). KA30 1 es una cepa de control negativo (es decir, el PMB3556 padre cuyo gen fhbp se ha suprimido). Las Titulaciones de SBA Geométricas Medias (n = 5) de sueros (tomadas antes o 10 semanas después de la inmunización de conejos con tres dosis de 10 mcg de variantes fHBP no lipidadas de la subfamilia A) contra estas cepas se muestra en las filas superiores. El porcentaje de respondedores que demuestra un aumento de al menos 4 veces en respuesta por sobre los antecedentes se muestra en las filas inferiores.
Tabla 18. Titulaciones de SBA Geométricas Medias de sueros (tomadas antes o 10 semanas después de la inmunización de conejos (n = 5) con 10 mcg de proteínas de la subfamilia A no lipidadas (A62 (SEQ ID NO: 71 ); A05 (SEQ ID NO: 55); A12 (SEQ ID NO: 66); A22 (SEQ ID NO: 68)) contra dos cepas isogénicas de la subfamilia B.
Ejemplo 19: Evaluación del efecto de la combinación de sueros elevados contra proteínas no lipidadas de la subfamilia A en SBA Se evaluaron combinaciones de suero para probar el efecto en la amplitud de la cobertura. Se probaron suero pareados antes vs después de la vacunación para confirmar que no existía una eliminación no específica inducida como un resultado de la combinación del suero. Se calculó el aumento de GM veces para los sueros individuales y para las combinaciones de suero a lo largo de las 4 cepas isogénicas que representaban diversidad dentro de la subfamilia A. Los aumentos de las veces se detectaron para algunas de las combinaciones probadas, lo que proporciona la evidencia de que la amplitud de la cobertura se puede aumentar por medio de la inclusión de más variantes de la subfamilia A (Tabla 19). Las combinaciones óptimas parecen ser A05 (SEQ ID NO: 55) con A62 (SEQ ID NO: 71 ) o A62 (SEQ ID NO: 71 ) con A12 (SEQ ID NO: 66) (Tabla 20).
Tabla 19. Las Titulaciones de SBA de sueros délos respondedores más altos de cada grupo de vacuna se probaron nuevamente contra el conjunto de cepas isogénicas de acuerdo con lo mostrado en la Tabla 17. Los sueros se probaron en mezclas uno a uno para determinar la extensión de actividad sinergistica.
Tabla 20. El aumento de veces para los sueros probados en combinación en comparación con cada uno probado por sí solo (calculado de la Tabla 19).
Los resultados presentados con anterioridad en los Ejemplos 18 y 19 muestran que las proteínas no lipidado de la subfamilia A son inmunogénicos y pueden proporcionar protección contra la infección de cepas de N. meningitidis que portan variantes ya sean homologas o heterólogas. Los datos presentados en la presente ilustran que las variantes no lipidadas de la subfamilia A seleccionados retienen su inmunogenicidad y proporcionan una protección cruzada contra cepas heterólogas, si bien estas respuestas son menores que las variantes lipidadas. También se ha demostrado que el antígeno rP2086A62 (SEQ ID NO: 71 ), que tiene una similitud de secuencia con la subfamilia B (véase, por ejemplo, las Figuras 9A y 9B), puede proteger a lo largo de las subfamilias dado que la vacuna A62 (SEQ ID NO: 71 ) puede eliminar las cepas que expresan las variantes B09 o B24 de la subfamilia B).
Los datos presentados con anterioridad muestran que no únicamente son las variantes no lipidadas de la subfamilia A capaces del tipo de sinergia observada con las combinaciones de fHBP lipidado, sino también que pueden proporcionar una cobertura contra variantes de la subfamilia B.
Ejemplo 20: Evaluación de inmunogenicidad de la combinación de proteínas de unión al factor H y vacuna conjugada meníngocócica tetravalente en conejos blancos de Nueva Zelanda El estudio se llevó a cabo en conejos blancos de Nueva Zelanda en el intervalo de 2,5 a 3,5 kg obtenidos de Charles River, Canadá (Tabla 21 ). Antes de ingresar al estudio, 55 conejos se pre-visualizaron por anticuerpos existentes por el uso de ELISA de célula completa contra las cepas A05 y B02. Después de la visualización, los conejos con titulaciones de anticuerpo relativamente bajas (titulaciones de IgG específicas <350) se vacunaron por vía intramuscular en las patas traseras, 0,5 mi por sitio (1 ,0ml por dosis, véase la Tabla 22) en las semanas 0, 4, y 9. Había tres conejos por grupo. Se les extrajo sangre a los conejos en las semanas 0, 4, 6, 9, y se desangraron en la semana 10. Se prepararon las muestras de suero y las muestras de suero de la semana 0 y 10 se analizaron por medio de SBA. Se prepararon la vacuna conjugada meníngocócica (MENVEO®, vacuna conjugada meníngocócica CRM197 oligosacáridos de difteria (Grupos A, C, Y y W-135), Novartis), las variantes bivalentes rLP2086 y tetravalentes no lipidadas y sus combinaciones de acuerdo con las Tablas 23 a 26.
Tabla 21 :Conejos Utilizados en Este Estudio Especie: Conejo Cepa: Blanco de Nueva Zelanda Fuente:3 Charles River Laboratory N.° de Animales Por Grupo: 3 N.° Total de Animales : 30 Edad y Sexo: Machos Peso: 2,5 a 3,5 kg Tabla 21 :Conejos Utilizados en Este Estudio os conejos se mantuvieron de acuerdo con los establecido en las directrices del Institutional Animal Care and Use Committee.
El diseño del estudio se muestra en la Tabla 22.
Síntesis de Formulaciones Contenedor/Cierre para MnB Tetravalente: Viales: vidrio de tipo 1 de 2 mi, West Pharmaceuticals Tapones: Tapones de viales de 13 mm para liofilización, butilo gris, recubierto con Flurotec (WPS V2-F451 W 4432/50 Gray B2-TR Westar® RU Verisure Ready-Pack), West Pharmaceuticals Contenedor/Cierre para 60 mM de Solución Salina: Viales: vidrio de tipo 1 de 2 mi, Schott (Vendor Part #: 8M002PD-CS) Tapones: 13 mm Daikyo D777-1 , S2-F451 , B2-40 Westar RS West, (Parte del Vendedor *: 19560180) Contenedor/Cierre para Soluciones de AIP04: Viales: Viales Vacíos Estériles, Tamaño 30 ml-20 mm, Tapones incluidos, Allergy Laboratories, N.° de Lote SEV070708A TABLA 25. ANALISIS DE DATOS La proteína tetravalente no lipidada (B22, B09, A05 y B44) se monitoreó por su estabilidad durante 6 horas a 2 a 8 °C tras la combinación con MENVEO®.
Ejemplo 21 : Ensayo bactericida en suero (SBA) Se llevó a cabo un ensayo bactericida en suero (SBA) basado en microcolonias contra múltiples cepas meningocócicas del serogrupo B, C e Y (Tabla 27) en muestras de suero individuales. Los sueros humanos de donantes se calificaron como la fuente de complemento para la cepa probada en el ensayo. Se interpolaron las titulaciones bactericidas dependientes de anticuerpos mediadas por complementos y se expresaron como la recíproca de la dilución del suero de prueba que eliminó el 50% de las células meningocócicas en el ensayo. El límite de detección del ensayo fue una titulación de SBA de 4. A una titulación de SBA de <4 se le asignó número de 2. Se calculó un aumento= 4 veces de las titulaciones de SBA en los sueros de la semana 10 en comparación con las titulaciones antes de la extracción y se comparó.
Tabla 27: Cepas de SBA Ejemplo 22: Inmunogenicidad de la combinación de proteínas de unión al factor H lipidadas o no lipidadas y la vacuna conjugada en conejos blancos de Nueva Zelanda El anticuerpo bactericida en suero es el sustituto inmunológico de protección contra la enfermedad meningocócica. Tanto la inmunización con vacunas conjugadas tetravalentes de rfHBP lipidadas, no lipidadas, solas o en combinación que obtuvieron anticuerpos bactericidas en conejos se determinaron por medio de SBA. El SBA mide el nivel de anticuerpos en una muestra de suero por medio de la imitación de la lisis bacteriana mediada por complementos que aparece en forma natural. En los seres humanos, se considera que una titulación de SBA de 1 :4 es protectora; también se considera que un aumento de cuatro veces en la titulación, antes vs después de la inmunización es un respuesta inmune inmunológicamente relevante. Las muestras de suero de conejos recolectadas de las semanas 0 y 10 se analizaron por medio de SBA contra cepas de varios serogrupos meningocócicos. De acuerdo con lo mostrado en la Tabla 28 (dosis más alta) y 29 (dosis más baja), una semana después de la tercera inmunización (semana 10), las vacunas conjugadas tetravalentes únicamente obtuvieron respuestas de SBA contra las cepas MnC y MnY probadas. Todas las otras muestras de suero exhibieron una actividad bactericida contra las cepas homologas así como también otras cepas de prueba de la misma subfamilia fHBP al igual que en las formulaciones de vacuna. Se destaca que la inmunización con A05/B01 lipidada (SEQ ID NOs: 13 y 58, respectivamente) sola en dosis de 30 mcg cada una obtuvo los anticuerpos bactericidas más altos contra las cepas homologas asi como también contra otras cepas probadas de ambas subfamilias fHBP (Tabla 28). En forma similar, la inmunización con A05/B09/B22/B44 no lipidadas (SEQ ID NOs: 55, 49, 75, y 44, respectivamente) solas también obtuvo anticuerpos bactericidas contra las cepas de varios serogrupos meningocócicos, si bien las titulaciones de SBA fueron 3 a 15 veces menores que la vacuna bivalente lipidada (Tabla 30). Se alcanzó una tasa de respuesta de 100% (aumento > 4 veces en una titulación de SBA) contra todas las cepas de varios serogrupos para fHBP lipidada, alta dosis de fHBP no lipidado y todas las combinaciones.
Tabla 28: Aumento de veces en las titulaciones de SBA contra cepas de meningococo serogrupo B, C e Y por el uso de sueros de conejos inmunizados con una combinación de dosis más alta de fHBP y vacuna conjugada Los sueros de conejos antes de la extracción no mostraron actividad bactericida preexistente contra las cepas probadas. Los conejos NZW (n=3) se vacunaron en las semanas 0, 4 y 8 con 0,5 mi de vacuna, por vía i.m.; datos de la Sem. 10.
Tabla 29: Aumento de veces en las titulaciones de SBA contra cepas de meningococo serogrupo B, C e Y por el uso de sueros de conejos inmunizados con una combinación de dosis menor de fHBP y vacuna conjugada Los sueros de conejos antes de la extracción no mostraron actividad bactericida preexistente contra las cepas probadas. Los conejos NZW (n=3) se vacunaron en las semanas 0, 4 y 8 con 0,5 mi de vacuna, por vía i.m.; datos de la Sem. 10 Tabla 30: Tasas de respuesta de SBA contra cepas de meningococo serogrupo B, C e Y por el uso de sueros de conejos inmunizados con una combinación de fHBP y vacuna conjugada Respondedores PD3 (>4 aumento de veces) Los conejos NZQ (n=3) se vacunaron en las semanas 0, 4 y 8 con 0,5 mi de vacuna, por vía i.m.; datos de la Sem. 10 El fHBP lipidado obtuvo titulaciones de SBA más altas que el fHBP no lipidado.
El fHBP lipidado a 30 mcg cada uno por dosis obtuvo titulaciones de SBA 3 a 15 veces más altas que todas las cepas B, C e Y meningocócicas probadas. El fHBP no lipidado a 30 mcg cada uno por dosis obtuvo titulaciones de SBA 4 a 23 veces más altas que todas las cepas meningocócicas B, C e Y probadas (Tablas 28 y 29).
La titulación de dosis se alcanzó con los fHBP, la vacuna conjugada o las combinaciones Con una dosis más alta de vacuna conjugado, los fHBP o sus combinaciones aumentaron las respuestas de SBA que con una dosis más baja (Tablas 28 a 30). La única dosis humana de la vacuna conjugada obtuvo titulaciones de SBA 2 a 8 veces más altas contra las cepas meningocócicas C e Y que un décimo de la dosis de la vacuna conjugada. El fHBP lipidado a 30 mcg cada uno por dosis obtuvo titulaciones de SBA 2 a 4 veces más altas contra todas las cepas probadas que el de 3 mcg cada uno por dosis. El fHBP no lipidado a 30 mcg cada uno por dosis obtuvo titulaciones de SBA 4 a 15 veces más altas contra todas las cepas de los serogrupos meningocócicos B, C e Y que el de 3 mcg cada uno por dosis.
Respuestas de SBA sinérgicas por medio de la combinación de fHBP y vacunas conjugadas Existe una tendencia de que las respuestas de SBA son más altas contra las cepas de los serogrupos meningocócicos C e Y cuando se utilizó la combinación de vacuna conjugada y fHBP que por el uso de cualquier componente solo, en especial con la adición de una dosis más baja de fHBP lipidado o no lipidado (Tabla 29). En el presente estudio, se evaluó la actividad funcional contra las cepas de varios serogrupos meningocócicos por el uso de sueros de conejos blancos de Nueva Zelanda inmunizados con fHBP recombinante lipidado o no lipidado en formulación con AIP0 y la vacuna conjugada sola o en combinación. Los conejos que recibieron la vacuna conjugado obtuvieron respuestas SBA únicamente contra las cepas del serogrupo meningocócíco C e Y, pero no las cepas del serogrupo B. El fHBP lipidado o no lipidado en formulación con AIP04 obtuvo anticuerpos en suero que fueron bactericidas contra las cepas de todos los serogrupos meningocócicos.
Los conejos blancos de Nueva Zelanda que recibieron tres dosis del fHBP lipidado o no lipidado en formulación con AIP04 obtuvo anticuerpos en suero que fueron bactericidas contra las cepas de los serogrupos meningocócicos B, C e Y probados. Se alcanzó una tasa de respuesta de 100% (aumento > 4 veces en una titulación de SBA) contra todas las cepas probadas excepto el grupo no lipidado de dosis más baja.
El fHBP lipidado obtuvo mayores titulaciones de anticuerpo bactericida que las formas no lipidadas. Se observó una respuesta de dosis clara con el fHBP lipidado o no lipidado y la vacuna conjugada sola o en combinaciones.
Existe una tendencia de respuestas de SBA sinérgicas contra las cepas del serogrupo meningocócíco C e Y entre la vacuna conjugada y fHBP en especial con la adición de proteínas de dosis más bajas.
Ejemplo 23: Evaluación de la inmunogenicidad de combinaciones de proteínas de unión al factor H no lipidadas en Conejos Blancos de Nueva Zelanda Se llevaron a cabo estudios en conejos blancos de Nueva Zelanda en el intervalo de 2,5 a 3,5 kg obtenidos de Charles River, Canadá (Tabla 31 ). Los conejos se vacunaron por vía intramuscular en las patas traseras, 0,5 mi por sitio (1 ,0ml por dosis, véase la Tabla 32) en las semanas 0, 4 y 9. Los Números de ID de Secuencia para cada uno de los antígenos probados se enumeran en la Tabla 33. Había 10 conejos por grupo. Se les extrajo sangre a los conejos en las semanas 0, 6 y se desangraron en la semana 10. Se prepararon las muestras de suero y las muestras de suero de la semana 0 y 10 se analizaron por medio de SBA contra un panel de aislados de N. meningitidis.
Tabla 31 : Conejos Utilizados en estos Estudios 3 a Los conejos se mantuvieron de acuerdo con los establecido en las directrices del Institutional Animal Care and Use Committee.
Tabla 32: Diseño del Estudio3 Los conejos se vacunaron por vía intramuscular (semanas 0, 4 y 9) y se les extrajo sangre (semanas 0, 6 y 10) para preparar muestras de suero para los análisis de SBA Tabla 33: Variantes de Proteína fHBP N. meningitidis Serogrupo B Utilizadas I-LP2086-B01 SEQ ID NO: 58 La Tabla 34 sintetiza la respuesta inmune en conejos para mezclas de proteínas fHBP no lipidadas en comparación con la respuesta inmune para el par rl_P2086-A05 y rLP2086-B01 de antígenos lipidados. Los sueros de conejos antes de la extracción por lo general no mostraron actividad bactericida preexistente contra las cepas probadas. La respuesta inmune está presentada como el porcentaje de animales en cada grupo de tratamiento que responde a las combinaciones respectivas de antígenos fHBP luego de la tercera inmunización con un aumento en la titulación de SBA 4 veces. El ensayo de SBA se llevó a cabo por el uso de cepas de N. meningitidis blanco que ya sea expresan variantes fHBP idénticas a el inmunógeno de vacuna (A05, A12), o cepas que expresan variantes fHBP heterólogas (A22, B16, B24). La identidad de secuencia de aminoácido comparativa de la variante fHBP A22 diverge hasta 15% de las variantes de la subfamilia A probadas. En forma similar, la identidad de secuencia de aminoácido comparativa de las variantes fHBP B16 y B24 diverge hasta 12% de las variantes de la subfamilia B incluidas como antígenos.
Tabla 34: Porcentaje de Conejos Blancos de Nueva Zelanda Vacunados con fHBP No lipidados Recombinantes que Responden con un Aumento >4 Veces en las titulaciones de SBA Después de la Dosis Tres 3 10 animales por grupo de tratamiento; todos los tratamientos formulados con adyuvante AIP04 (250mcg/dosis) En aquellos grupos de conejos inmunizados con 0mcg de cada variante rP2086 de prueba, las muestras de suero de animales tratados con la combinación de A05 + A62 + B09 + B44 tuvieron la tasa de respuesta bactericida más alta. La respuesta de SBA fue reducida en cierto modo en los animales tratados únicamente con 5mcg cada uno de la misma mezcla de cuatro variantes fHBP no lipidadas. Otros grupos cuatrivalentes de los antígenos fHBP dosificados con 5mcg le fue tan bien como la combinación de A05 + A62 + B09 + B44 no lipidado. De las combinaciones cuatrivalentes probadas, las muestras de suero del grupo de tratamiento que incluyó 5mcg cada uno de variantes fHBP no lipidadas A12 + A62 + B09 + B44 tuvieron las mejores tasas de respuesta de SBA para las cepas de ensayo seleccionadas. La tasa de respuesta para la combinación no lipidada pentavalente de A05 + A12 + A62 + B09 + B44 es en cierto modo mejor que la respuesta a cualquiera de las combinaciones cuatrivalentes probadas.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 71 , donde los primeros veinte residuos de aminoácidos de la secuencia no comprenden una cisteína. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácido en la posición 1 a 184 de la SEQ ID NO: 71. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el polipéptido comprende al menos 6 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido en la posición 185 a 254 de la SEQ ID NO: 71. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el polipéptido es no piruvilado. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el polipéptido es no lipidado. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el polipéptido es inmunogénico. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , donde la secuencia de aminoácido consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 71. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además un polipéptido A12. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además un polipéptido A05. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además un polipéptido B09. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además un polipéptido B44. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además un polipéptido A 2, B09, y B44. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además un polipéptido A05, A12, B09, y B44. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde cada polipéptido es no lipidado. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde cada polipéptido es no piruvilado. Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71. La secuencia de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 17, donde la secuencia de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 72. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado del Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde la composición comprende al menos dos conjugados seleccionados de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A b) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo C c) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo Y. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde la composición comprende al menos tres conjugados seleccionados de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo A b) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo C c) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo Y. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde la composición comprende un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo A; un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo C; un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo W135; y un conjugado de un sacárido capsular de Neissería meningitidis serogrupo Y. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un polipéptido de la subfamilia A. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un polipéptido de la subfamilia B. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un A05 no piruvilado y no lipidado. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un A12 no piruvilado y no lipidado. 27. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un A22 no piruvilado y no lipidado. 28. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un B01 no piruvilado y no lipidado. 29. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un B03 no piruvilado y no lipidado. 30. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un B09 no piruvilado y no lipidado. 31. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un B15 no piruvilado y no lipidado. 32. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un B16 no piruvilado y no lipidado. 33. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un B22 no piruvilado y no lipidado. 34. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un B24 no piruvilado y no lipidado. 35. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un B44 no piruvilado y no lipidado. 36. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido es un A62 no piruvilado y no lipidado. 37. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 71 , la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81 , y SEQ ID NO: 75. Un método para inducir una respuesta inmune contra Neisseria meningitidis en un mamífero, que comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición ¡nmunogénica que comprende un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado del Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y. Un método para obtener un anticuerpo bactericida contra Neisseria meningitidis serogrupo C en un mamífero, que comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que comprende un polipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado del Neisseria meningitidis serogrupo B. El método de acuerdo con la reivindicación 39, donde el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. El método de acuerdo con la reivindicación 39, donde la composición inmunogénica además comprende al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y. Un método para obtener un anticuerpo bactericida contra Neisseria meningitidis serogrupo Y en un mamífero, que comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que comprende un poiipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado de Neisseria meningitidis serogrupo B. El método de acuerdo con la reivindicación 42, donde el poiipéptido consiste en la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21 , donde la cisteína en la posición 1 está suprimida. El método de acuerdo con la reivindicación 42, donde la composición inmunogénica además comprende al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y. Un método para obtener un anticuerpo bactericida contra Neisseria meningitidis en un mamífero, que comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que comprende un poiipéptido ORF2086 aislado no lipidado y no piruvilado del Neisseria meningitidis serogrupo B, y al menos un conjugado seleccionado de: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo A, b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C, c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo W135, y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo Y. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 71. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 46, donde la secuencia comprende la SEQ ID NO: 71. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 46, donde el polipéptido es no lipidado. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 46, donde el polipéptido es no piruvilado. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 46, donde el polipéptido es no lipidado y no piruvilado. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 46, donde el polipéptido es inmunogénico. El polipéptido aislado que comprende el aminoácido señalado en la SEQ ID NO: 76. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 52, donde el polipéptido es no lipidado. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 52, donde el polipéptido es no piruvilado. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 52, donde el polipéptido es no lipidado y no piruvilado. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 52, donde el polipéptido es inmunogénico. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 56. Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 76 Un método para inducir una respuesta inmune contra Neisseria meningitidis en un mamífero, que comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 76. Un método para obtener un anticuerpo bactericida contra Neisseria meningitidis serogrupo C en un mamífero, que comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 76.
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