MX2014009748A

MX2014009748A - Composicion farmaceutica para el tratamiento y/o prevencion del cancer.

Info

Publication number: MX2014009748A
Application number: MX2014009748A
Authority: MX
Inventors: Fumiyoshi Okano; Shinichi Kobayashi; Takanori Saito
Original assignee: Toray Industries
Priority date: 2012-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2014-11-14
Also published as: US20150004171A1; AU2013223143A1; CA2864864C; CN104169303B; EP2818482A1; RU2632645C2; US9273130B2; AU2013223143B2; KR20140130668A; DK2818482T3; MX360208B; PL2818482T3; CA2864864A1; HUE044611T2; RU2014138040A; EP2818482B1; IN2014KN01713A; KR102009238B1; WO2013125636A1; JP6187255B2

Abstract

Esta invención proporciona un anticuerpo que se dirige a una proteína antigénica del cáncer, específicamente expresada sobre la superficie de células cancerosas y el uso del mismo en un agente terapéutico y/o preventivo para cánceres. Específicamente, esta invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido de CAPRIN-1 parcial, que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No.: 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos, y una composición farmacéutica para el tratamiento de cánceres, que comprende el anticuerpo o el fragmento del mismo como un ingrediente activo.

Description

COMPOSICION FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCION DEL CANCER Campo de la Invención La presente invención se refiere al novedoso uso de un anticuerpo contra CAPRIN-1 o un fragmento del mismo, en un fármaco tal como un agente terapéutico y/o preventivo para el cáncer .

Antecedentes de la Invención El cáncer es la causa principal de muerte. Este trastorno es actualmente tratado por terapia quirúrgica en combinación con radioterapia y/o quimioterapia. A pesar del desarrollo de las nuevas técnicas quirúrgicas o el descubrimiento de nuevos agentes anticancerosos, el tratamiento existente contra el cáncer tiene una respuesta mejorada de manera insuficiente, excepto para algunos tipos de cáncer. Con los avances recientes de la biología molecular o la inmunología del cáncer, los anticuerpos que reaccionan específicamente con el cáncer, los antígenos del cáncer que son reconocidos por las células T citotóxicas, los genes que codifican para tales antígenos cancerosos, y similares, han sido identificados, dando origen a expectativas sobre la terapia específica contra el cáncer que se dirige a los antígenos cancerosos (Literatura 1 No de Patente) .

Para reducir la reacción adversa de la terapia Ref. 250278 contra el cáncer, se desea que los péptidos, polipéptidos , polipéptidos , o las proteínas reconocidas como antígenos del cáncer deban existir raramente en las células normales, y existen específicamente en células cancerosas. En 1991, Boon et al . (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Bélgica) aisló un antígeno de melanoma humano, MAGE1 reconocido por las células T positivas a CD8 , mediante un método de clonación de expresión de cADN utilizando líneas autólogas de células cancerosas y células T reactivas contra el cáncer (Literatura 2 No de Patente) . Posteriormente, ha sido reportado un método SEREX (identificación serológica de antígenos mediante expresión de identificación recombinante) , el cual adopta un procedimiento de clonación de expresión de genes para identificar los antígenos tumorales reconocidos por los anticuerpos producidos en respuesta al cáncer autólogo in vivo en un paciente con cáncer (Literatura 3 No de Patente y Literatura 1 de Patente) . De acuerdo a este método, algunos antígenos contra el cáncer que son raramente expresados en la células normales y son específicamente expresados en el cáncer han sido aislados (Literaturas 4 a la 9 No de Patentes) . Además, la terapia celular utilizando inmunocitos que reaccionan específicamente con los antígenos del cáncer o la inmunoterapia específica para el cáncer utilizando vacunas o similares, que comprenden antígenos cancerosos, está bajo pruebas clínicas que se dirigen a algunos de los antígenos cancerosos aislados.

En años recientes, diversos fármacos tipo anticuerpo para el tratamiento del cáncer, que se dirigen a proteínas antigénicas de células cancerosas, han emergido en el mundo. Estos fármacos han recibido atención debido a que tienen cierta eficacia como agentes terapéuticos específicos del cáncer. Una gran mayoría de las proteínas antigénicas que son objetivo de los fármacos no obstante, son también expresadas en células normales. Como resultado de la administración de los anticuerpos, las células cancerosas, así como las células normales que expresan los antígenos son dañadas, dando como resultado desventajosamente una reacción adversa. De este modo, si los antígenos del cáncer expresados específicamente sobre la superficie de las células cancerosas pueden ser identificados y los anticuerpos que se dirigen a los antígenos pueden ser utilizados como fármacos, puede esperarse que estos fármacos de anticuerpo logren el tratamiento con reacción menos adversa.

La proteína 1 asociada al citoplasma y a la proliferación (CAPRIN-1, por sus siglas en inglés) ha sido conocida como una proteína intracelular que es expresada después de la activación o la división celular de las células normales en reposo, y forma gránulos de agresión al citoplasma con los ARNs intracelulares , para participar en la regulación del transporte y la traducción de los mAR s . Se ha encontrado que esta proteína es específicamente expresada sobre la superficie de las células cancerosas y está bajo estudio como un objetivo de los fármacos de anticuerpo para el tratamiento del cáncer (Literatura 2 de Patente) .

Literatura de los antecedentes de la invención.

Literatura de Patente Literatura de Patente 1 : Patente de los Estados Unidos No. 5698396 Literatura de Patente 2: O2010/016526 Literatura No de Patente Literatura No de Patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cáncer and Chemotherapy", 1997, Vol . 24, p. 55-519 (Japanese Journal of Cáncer and Chemoterapy Publishers Inc., Japón) Literatura No de Patente 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991) Literatura No de Patente 3: Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995) Literatura No de Patente 4: Int. J. Cáncer, 72: 965-971 (1997) Literatura No de Patente 5: Cáncer Res., 58: 1034-1041 (1998) Literatura No de Patente 6: Int. J. Cáncer, 29: 652-658 (1998) Literatura No de Patente 7: Int. J. Oncol . , 14: 703-708 (1999) Literatura No de Patente 8: Cáncer Res., 56: 4766-4772 (1996) Literatura No de Patente 9: Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997 Breve Descripción de la Invención PROBLEMA A SER RESUELTO POR LA INVENCION Un objetivo de la presente invención es producir un anticuerpo que se dirija a CAPRIN-1 específicamente expresada sobre la superficie de las células cancerosas, y es superior en actividad antitumoral a los anticuerpos convencionales, y proporcionar el uso del mismo como un agente terapéutico y/o preventivo para el cáncer.

MEDIOS PARA RESOLVER EL PROBLEMA Las características de la presente invención son como sigue: La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido de CAPRIN-1 parcial que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No. : 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos, y una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer, que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo como un ingrediente activo.

En la modalidad anterior, el cáncer es el cáncer de mama, cáncer de riñon, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer del cérvix uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma, o melanoma.

En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

En otra modalidad más, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena simple, o un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) .

La presente descripción abarca los contenidos descritos en la descripción y/o las figuras de la Solicitud de Patente Japonesa No. 2012-035484 cuya prioridad reivindica la presente solicitud.

EFECTO DE LA INVENCIÓN El anticuerpo contra CAPRIN-1 de acuerdo a la presente invención daña las células cancerosas. De este modo, el anticuerpo contra CAPRIN-1 es útil en el tratamiento o prevención del cáncer.

Descripción Detallada de la Invención El anticuerpo de acuerdo a la presente invención es un anticuerpo que reconoce y se enlaza a un polipéptido parcial predeterminado de CAPRIN-1 y tiene actividad antitumoral. Más específicamente, el anticuerpo de acuerdo a la presente invención es un anticuerpo que reconoce (es decir, tiene reactividad inmunitaria con) un polipéptido parcial de una proteína CAPRIN-1 (polipéptido CAPRIN-1 parcial) que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No.: 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferentemente 85% o más, más preferentemente 90% o más, adicionalmente de manera preferida 95% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 5. En la presente invención, se revela que este anticuerpo exhibe actividad antitumoral. La presente invención se refiere a todos los anticuerpos que se enlazan a los fragmentos de las proteínas CAPRIN-l como se describe anteriormente, y exhiben actividad antitumoral.

El anticuerpo contra CAPRIN-1 de acuerdo a la presente invención puede ser cualquier tipo de anticuerpo, con la condición de que éste pueda ejercer actividad antitumoral, e incluye, por ejemplo, anticuerpos recombinantes (por ejemplo, anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos de cadena simple (scFv) ) , anticuerpos humanos, y fragmentos de anticuerpos de éstos (por ejemplo, Fab, F(ab')2, y Fv) . Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser preparados mediante métodos en general conocidos por aquellos expertos en la técnica. De manera deseable, el anticuerpo de acuerdo a la presente invención tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 o un polipéptido parcial de la misma, o se enlaza a (preferentemente, se enlaza específicamente a) la proteína CAPRIN-1 a través de la reacción antígeno-anticuerpo. Como se utiliza en la presente, el término "que se enlaza específicamente a la proteína CAPRIN-1" significa que el anticuerpo se enlaza específicamente a la proteína CAPRIN-1 sin enlazarse sustancialmente a otras proteínas. El anticuerpo de acuerdo a la presente invención es preferentemente un anticuerpo monoclonal y no obstante, puede ser un anticuerpo policlonal, siempre y cuando los anticuerpos homogéneos puedan se establemente producidos. En el caso de que un sujeto sea humano son deseables anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados para evitar o suprimir el rechazo .

El anticuerpo contra un polipéptido CAPRIN-1 de acuerdo a la presente invención puede ser evaluado para su actividad antitumoral, como se describe posteriormente, mediante el examen in vivo de la inhibición del crecimiento tumoral en un animal que posee cáncer, o al examinar in vitro si el anticuerpo exhibe o no actividad citotóxica mediada por los inmunocitos o por el complemento contra las células tumorales que expresan el polipéptido.

El sujeto en necesidad de tratamiento y/o la prevención del cáncer de acuerdo a la presente invención es un mamífero tal como un humano, un animal de mascota, ganado, o un animal deportivo, preferentemente un humano.

De aquí en adelante, la presente invención será descrita con más detalle.

Preparación del antígeno para la preparación del anticuerpo Las proteínas o fragmentos de las mismas, utilizados como antígenos sensibilizadores para obtener el anticuerpo contra CAPRIN-1 de acuerdo a la presente invención, no están limitados por las especies animales que sirven como sus orígenes, incluyendo humanos, perros, gatos, reses, caballos, ratones, ratas y pollos. Las proteínas o los fragmentos de los mismos, no obstante, son preferentemente seleccionados en vista de la compatibilidad de las células progenitoras para el uso en la fusión celular. En general, son preferidas las proteínas derivadas de mamíferos. Particularmente, son preferidas las proteínas derivadas de humanos. Por ejemplo, cuando CAPRIN-1 es CAPRIN-1 humana, las proteínas CAPRIN-1 humanas, los péptidos parciales de las mismas, o las células que expresan CAPRIN-1 humana, pueden ser utilizadas.

Las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de CAPRIN-1 humana y homólogos de la misma pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante la realización de un acceso a GenBank (NCBI, Estados Unidos) y utilizando un algoritmo tal como BLAST o FASTA (Karlin y Altschul, Proc . Nati. Acad. Sci . Estados Unidos, 90: 5873-5877, 1993; y Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

En la presente invención, con referencia a la secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. : 1 ó 3) o la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. : 2 ó 4) de CAPRIN-1 humana, la CAPRIN-1 objetivo es un ácido nucleico o una proteína que consiste de una secuencia que tiene 70% a 100%, preferentemente 80% a 100%, más preferentemente 90% a 100%, todavía más preferentemente 95% a 100%, por ejemplo, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, ó 99.5% a 100% de identidad secuencial a la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos de la ORF o la porción Madura de la referencia (Nota: cuando se comparan una con la otra, las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID No. : 2 y la SEQ ID No. : 4 difieren de los residuos de aminoácidos en la posición 690 y después de la posición 690) . Como se utiliza en la presente, el término "% de identidad secuencial" significa un porcentaje (%) del número de aminoácidos idénticos (o nucleótidos) al número total (incluyendo el número de espacios vacíos) de los aminoácidos (o nucleótidos) cuando dos secuencias son alineadas tal que el grado máximo de similitud o identidad puede ser alcanzado con o sin los espacios vacíos introducidos.

Un fragmento que comprende un epítopo (o un determinante antigénico) , que es la unidad mínima reconocida por el anticuerpo, y tiene una longitud que va desde la longitud de aminoácidos del epítopo hasta menos de la longitud completa de la proteína CAPRIN-1, puede ser utilizada como un fragmento de proteína CAPRIN-1. El epítopo se refiere a un fragmento de polipéptido que tiene la antigenicidad o la inmunogenicidad en mamíferos, preferentemente humanos. Su unidad mínima consiste de aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, por ejemplo, 8 a 11 aminoácidos. El fragmento de proteína CAPRIN-1 para el uso en la preparación del anticuerpo de acuerdo a la presente invención es preferentemente un fragmento que es reconocido por el anticuerpo de la presente invención y comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No. : 5 (que corresponde a una secuencia desde las posiciones 141 a 156 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 2 ó 4) o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferentemente 85% o más, más preferentemente 90% o más, todavía más preferentemente 95% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 5, o comprende al menos un epítopo que consiste de aproximadamente 7 a 12 aminoácidos consecutivos, por ejemplo, 8 a 11 aminoácidos consecutivos en cualquiera de estas secuencias de aminoácidos .

Las proteínas CAPRIN-1 humanas anteriores y los fragmentos polipeptídicos que comprenden los péptidos parciales de las mismas pueden ser sintetizados de acuerdo a los métodos de síntesis química, por ejemplo, los métodos Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) y tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course) 1, the Japanese Biochemical Society ed. , Protein Chemistry IV, Chemical Modification y Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Doj in Co., Ltd. (Japón), 1981). También, estos polipéptidos pueden ser sintetizados mediante métodos rutinarios utilizando diversos sintetizadores peptídicos comercialmente disponibles.

Alternativamente, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos pueden ser preparados utilizando técnicas de ingeniería genética conocidas en la materia (Sambrook et al., Molecular Cloning, la 2a edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, la 3a edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John iley & Sons; etc.) e incorporados dentro de los vectores de expresión, los cuales son luego introducidos dentro de las células hospederas, de modo que las células hospederas producen los polipéptidos. De esta manera, las proteínas CAPRIN-1 humanas de interés o los fragmentos polipéptidos de las mismas, pueden ser obtenidos.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos pueden ser fácilmente preparados mediante técnicas de ingeniería genética conocidas en la técnica, o los métodos rutinarios que utilizan sintetizadores de ácidos nucleicos, comercialmente disponibles. Por ejemplo, un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de un gen CAPRIN-1 humano puede ser preparado mediante PCR utilizando una biblioteca de ADN cromosómico o de cADN humanos, como una plantilla y un par de cebadores diseñados para ser capaces de amplificar la secuencia de nucleótidos. Las condiciones de reacción para esta PCR pueden ser apropiadamente determinadas. Los ejemplos de las condiciones pueden incluir, pero no están limitados a, 30 ciclos, cada uno involucrando los pasos de reacción de 94°C por 30 segundos (desnaturalización) , 55°C por 30 segundos a 1 minuto (recocido) , y 72°C por 2 minutos (alargamiento) utilizando la ADN-polimerasa termoestable (por ejemplo, la polimerasa Taq o la polimerasa Pfu) y un amortiguador de PCR que contiene Mg2+- seguido por la reacción a 72°C por 7 minutos. El procedimiento de PCR, las condiciones, etc., son descritos en, por ejemplo, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, la 3ra edición, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995) , John Wiley & Sons (particularmente, Capítulo 15) .

También, las sondas o cebadores apropiados pueden ser preparados con base en la información respecto a las secuencias de nucleótidos de los genes CAPRIN-1 y las secuencias de aminoácidos de las proteínas CAPRIN-1, y pueden ser usados en la selección de, por ejemplo, una biblioteca de cADN humana, para aislar el ADN deseado. Preferentemente, tal biblioteca de cADN es producida a partir de células, órganos o tejidos que expresan las proteínas CAPRIN-1. Los ejemplos de tales células o tejidos incluyen células o tejidos derivados de los testículos o de los cánceres o tumores tales como leucemia, cáncer de mama, linfoma, tumor cerebral, cáncer pulmonar, cáncer pancreático, y cáncer colorrectal . Estas técnicas, incluyendo la preparación de las sondas o cebadores, la construcción de una biblioteca de cADN, la selección de la biblioteca de cADN, y la clonación del gen de interés, son conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden ser realizados de acuerdo a los métodos descritos en, por ejemplo, Sambrook et al.. Molecular Cloning, la 2da edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989) , y Ausubel et al. (ibid.) . Los ADNs que codifican para las proteínas CAPRIN-1 humanas y los péptidos parciales de las mismas pueden ser obtenidos a partir del ADN obtenido de este modo .

Las células hospederas que van a recibir los vectores de expresión pueden ser cualquier célula capaz de expresar los polipéptidos anteriores. Los ejemplos de células procarióticas incluyen, pero no están limitados a, E. coli. Los ejemplos de células eucarióticas incluyen, pero no están limitados a: células de mamífero tales como las células de riñon de mono COSI y las células de ovario de hámster Chino CHO; una línea celular de riñon embrionario humano HEK293; una línea celular de piel embrionaria de ratón NIH3T3 ; células de levadura tales como la levadura en gemación y células de levadura en fisión; células del gusano de seda; y células de huevo de Xenopus.

En el caso de utilizar células procarióticas como las células hospederas, los vectores de expresión utilizados tienen un origen que permite la replicación en las células procarióticas, un promotor, un sitio de enlace al ribosoma, un sitio de clonación múltiple, un terminador, un gen de resistencia a fármaco, un gen complementario auxotrófico, etc. Los ejemplos de los vectores de expresión para E. coli pueden incluir la serie pUC, pBluescript II, los sistemas de expresión pET, y los sistemas de expresión pGEX. Los ADNs que codifican para los polipéptidos anteriores, pueden ser incorporados dentro de tales vectores de expresión, con los cuales son luego transformadas las células hospederas procarióticas, seguido por el cultivo de los transformantes obtenidos, de modo que los polipéptidos codificados por los ADNs son expresados en las células hospederas procarióticas. A este respecto, los polipéptidos pueden ser expresados como proteínas de fusión con otras proteínas.

En el caso de utilizar células eucarióticas como las células hospederas, los vectores de expresión para las células eucarióticas que tienen un promotor, una región de empalme, un sitio de adición poli (A) , etc., son utilizados como los vectores de expresión. Los ejemplos de tales vectores de expresión pueden incluir los vectores pKAl, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 , y pYES2. De la misma manera que se describe anteriormente, los ADNs que codifican para los polipéptidos anteriores pueden ser incorporados dentro de tales vectores de expresión, con los cuales las células hospederas eucarióticas son luego transformadas, seguido por el cultivo de los transformantes obtenidos, de modo que los polipéptidos codificados por los ADNs son expresados en las células hospederas eucarióticas. En el caso de utilizar vectores de expresión tales como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl, o pEGFP-Cl, los polipéptidos pueden ser expresados como diversas proteínas de fusión marcadas con el marcador His (por ejemplo, (His)6 a (His)i0) , el marcador FLAG, el marcador myc, el marcador HA, GFP, o similares.

Los vectores de expresión pueden ser introducidos dentro de las células hospederas utilizando métodos bien conocidos tales como electroporacion, un método de fosfato de calcio, un método de liposomas, un método de DEAE-dext ano, microinyección, infección viral, lipofección, y enlace con péptidos penetradores de las células.

El polipéptido de interés puede ser aislado y purificado a partir de las células hospederas mediante una combinación de técnicas de separación conocidas en la técnica. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a, el tratamiento con un desnaturalizante (por ejemplo, urea) o tensioactivo, ultrasonicación, digestión enzimática, desplazamiento salino, fraccionamiento o precipitación con solvente, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, y cromatografía de fase inversa.

Los antígenos preparados de este modo pueden ser utilizados como agentes de sensibilización como se describe posteriormente para la producción del anticuerpo de acuerdo a la presente invención.

Estructura del anticuerpo Los anticuerpos ( inmunoglobulinas) son usualmente glucoproteínas heteromultiméricas cada una comprendiendo al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las inmunoglobulinas, excepto por la IgM, son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 kDa cada una compuesta de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) . Típicamente, cada cadena ligera está conectada a una cadena pesada vía un enlace disulfuro covalente simple, mientras que el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas varía entre diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada una de las cadenas pesadas y ligeras tiene también un enlace disulfuro intracatenario . Cada cadena pesada tiene un dominio variable (región VH) en un extremo, seguido por una serie de regiones constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable (región VL) en un extremo y tiene una región constante simple en el otro extreme. La región constante de cadena ligera está alineada con la primera región constante de cadena pesada, mientras que el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de cadena pesada. Las regiones particulares llamadas regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) en los dominios variables de anticuerpo muestran variabilidad específica e imparten especificidad de enlace al anticuerpo. Las porciones relativamente conservadas en las regiones variables son llamadas regiones estructurales (FRs) . Los dominios variables de cadena pesada y ligera completos cada uno comprenden cuatro FRs conectadas vía tres CDRs. Estas tres CDRs son llamadas CDRH1 , CDRH2 , y CDRH3 en este orden desde el extremo N de la cadena pesada. De igual modo, las CDRs son llamadas CDRL1 , CDRL2 , y CDRL3 en la cadena ligera. La CDRH3 es la más importante debido a la especificidad de enlace del anticuerpo para su antígeno. Además, las CDRs en cada cadena son mantenidas cerca una de la otra por las regiones FR, y contribuyen a la formación de un sitio de enlace al antígeno en el anticuerpo, junto con las CDRs en la otra cadena. Las regiones constantes no contribuyen directamente al enlace anticuerpo-antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, por ejemplo, el involucramiento en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , fagocitosis mediada por el enlace a un receptor de Fcy, proporción vida media/depuración medida por un receptor de Fe neonatal (FcRn) , y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediada por un componente Clq en la cascada del complemento.

Preparación del anticuerpo El anticuerpo anti-CAPRIN-1 de acuerdo a la presente invención significa un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 de longitud completa o un fragmento de la misma. Particularmente, el anticuerpo anti -CAPRIN-1 de la presente invención es un anticuerpo que se enlaza inmunológicamente a un polipéptido parcial de una proteína CAPRIN-1 (polipéptido CAPRIN-1 parcial) que es un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos que contiene el epítopo, representado por la SEQ ID No. : 5 o un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferentemente 85% o más, más preferentemente 90% o más, todavía más preferentemente 95% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos. Preferentemente, el anticuerpo de la presente invención reconoce un epítopo que consiste de aproximadamente 7 a 12 aminoácidos consecutivos, por ejemplo, 8 a 11 aminoácidos consecutivos, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No.: 5 o la secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferentemente 85% o más, más preferentemente 90% o más, todavía más preferentemente 95% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 5. Este anticuerpo anti-CAP IN-1 de la presente invención es capaz de enlazarse específicamente a la proteína CAPRIN-1 de longitud completa. El anticuerpo de la presente invención puede ser obtenido mediante la selección de un anticuerpo que se enlaza inmunológicamente al polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No. : 5 o el polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferentemente 85% o más, más preferentemente 90% o más, todavía más preferentemente 95% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No . : 5, de acuerdo a un método rutinario de entre los anticuerpos obtenidos de las proteínas CAPRIN-1 o fragmentos de las mismas, como antígenos.

Como se usa en la presente, la "reactividad inmunológica" significa la propiedad del anticuerpo que se enlaza a un antígeno CAPRIN-1 (proteína CAPRIN-1 de longitud completa o el polipéptido parcial de la misma) in vivo. Por medio de tal enlace a CAPRIN-1, el anticuerpo de la presente invención ejerce la función de daño (por ejemplo, muerte, supresión, o regresión) de las células tumorales. El anticuerpo de la presente invención puede dañar un tumor, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de riñon, cáncer pancreático, cáncer colorrectal (por ejemplo, cáncer de colon) , cáncer pulmonar, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer del cérvix uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma, o melanoma, a través del enlace a la proteína CAPRIN-1.

El anticuerpo de la presente invención puede ser cualquier tipo de anticuerpo. Los ejemplos del tipo del anticuerpo de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecífieos , anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena simple, y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')2, y Fv) . También, el anticuerpo es cualquier clase de molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, o IgY, o cualquier subclase, por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4, IgAl, o IgA2.

El anticuerpo puede ser además modificado por una modificación tal como acetilación, formilación, amidación, fosforilación, PEGilación, o similares, además de la glucosilación .

De aquí en adelante, serán descritos los ejemplos de preparación de los diversos anticuerpos.

Cuando el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, una línea celular de cáncer de mama SK-BR-3 que expresa CAPRIN-1, es administrada a cada ratón para la inmunización. El bazo es extraído de este ratón. Después de la separación de las células del bazo, las células son fusionadas con las células de mieloma de ratón. Los clones productores de anticuerpos que tienen un efecto inhibidor del crecimiento de las células cancerosas, son seleccionados de entre las células de fusión obtenidas (hibridomas) . Alternativamente, pueden ser seleccionados los clones productores de anticuerpos que se enlazan a un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No. : 5 o un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 5. Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales que tienen un efecto inhibidor del crecimiento de las células cancerosas o los hibridomas productores de los anticuerpos monoclonales contra el polipéptido de la SEQ ID No.: 5 o similares, son aislados y cultivados. El anticuerpo de la presente invención puede ser preparado mediante purificación a partir del sobrenadante de cultivo de acuerdo a un método de purificación por afinidad, general.

Los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal pueden ser preparados, por ejemplo, como sigue: primeramente, los animales son inmunizados con los antígenos de sensibilización de acuerdo a un método conocido en la técnica. Este método de inmunización involucra en general inyectar intraperitoneal o subcutáneamente los antígenos de sensibilización a los mamíferos. Específicamente, los antígenos de sensibilización son diluidos o suspendidos en PBS (solución salina amortiguada con fosfato) , solución salina fisiológica, o similares en una cantidad apropiada, y luego mezclados si se desea, por una cantidad apropiada de un adyuvante convencional, por ejemplo, un adyuvante completo de Freund. Después de la emulsificación, la emulsión resultante es administrada a cada mamífero varias veces cada 4 a 21 días. Alternativamente, puede ser utilizado un portador apropiado para la inmunización con los antígenos de sensibilización .

Después de la confirmación de una elevación de nivel del anticuerpo deseado en el suero de mamífero inmunizado de este modo, los inmunocitos son recolectados del mamífero y sometidos a fusión celular. Los ejemplos preferidos de los inmunocitos particularmente incluyen células del bazo.

Las células de mieloma de mamífero se utilizan como células progenitoras socias para ser fusionadas con los inmunocitos. Diversas líneas celulares conocidas en la técnica, por ejemplo, P3U1 (P3-X63Ag8Ul) , P3 (P3x63Ag8.653 ) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology y Immunology (1978) 81, 1-7) , NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), y R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133), son preferentemente utilizadas como las células de mieloma.

La fusión celular entre los inmunocitos y las células de mieloma puede ser realizada básicamente de acuerdo a un método conocido en la técnica, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C. Methods Enzymol . (1981) 73, 3-46) .

Más específicamente, la fusión celular es llevada a cabo, por ejemplo, en presencia de un promotor de fusión celular en un medio nutritivo convencional. Por ejemplo el polietilenglicol (PEG) o el virus Sendai (virus de la hemaglutinación del Japón (HVJ, por sus siglas en inglés) , se utiliza como el promotor de la fusión. Si se desea, un auxiliar tal como sulfóxido de dimetilo puede ser adicionalmente agregado para el uso con el fin de aumentar la eficiencia de la fusión.

La proporción entre los inmunocitos y las células de mieloma utilizadas puede ser arbitrariamente establecida. Por ejemplo, la cantidad de los inmunocitos es preferentemente ajustada a 1 a 10 veces la cantidad de las células de mieloma. Los ejemplos del medio que puede ser utilizado en la fusión celular incluyen los medios RPMI1640 y ME adecuados para el crecimiento de las líneas celulares de mieloma, así como los medios convencionales para el uso en este tipo de cultivo celular. Además, un suplemento de suero tal como suero fetal de ternera (FCS) puede ser utilizado en combinación con estos medios.

Para la fusión celular, los inmunocitos y las células de mieloma son perfectamente mezclados en sus cantidades predeterminadas del medio. Una solución de PEG (peso molecular promedio: por ejemplo, aproximadamente 1000 a 6000) precalentada aproximadamente a 37°C es usualmente agregada a la mezcla a una concentración de 30 a 60% (p/v) y mezclada con ésta para formar los hibridomas de interés. Subsecuentemente, los procedimientos de agregar secuencialmente un medio apropiado y retirar el sobrenadante mediante centrifugación, son preferentemente repetidos para remover los agentes de fusión celular o similares, desfavorables para el crecimiento de los hibridomas .

Los hibridomas obtenidos de este modo son cultivados en un medio selectivo convencional, por ejemplo, un medio HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina) para la selección. Este cultivo en el medio HAT es continuado por un periodo (usualmente, varios días a varias semanas) suficiente para la muerte de las células (células no fusionadas) diferentes de los hibridomas de interés. Subsecuentemente, los hibridomas que producen el anticuerpo de interés son seleccionados y clonados como clones simples por un método de dilución limitante convencional.

Además de una obtención de los hibridomas mediante inmunización de animales no humanos con antígenos, los hibridomas que producen anticuerpos humanos que tienen la actividad deseada (por ejemplo, actividad inhibitoria del crecimiento celular) pueden ser obtenidos mediante la sensibilización de los linfocitos humanos, por ejemplo, los linfocitos humanos infectados con el virus EB, con proteínas, células que expresan proteínas, o lisados de las mismas in vitro, y fusionando los linfocitos sensibilizados con las células de mieloma derivadas de humano, capaces de dividirse permanentemente, por ejemplo, U266 (Registro No. TIB196) .

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales preparados de este modo, pueden ser subcultivados en un medio convencional, y pueden ser también almacenados por un periodo prolongado en nitrógeno líquido.

Específicamente, los antígenos deseados o las células que expresan los antígenos deseados, son utilizados como antígenos de sensibilización en la inmunización de acuerdo a un método de inmunización convencional. Los inmunocitos obtenidos son fusionados con las células progenitoras conocidas en la técnica, de acuerdo a un método de fusión celular convencional. Las células productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) pueden ser seleccionadas por un método de selección convencional para preparar el anticuerpo de interés.

Otro ejemplo más del anticuerpo que puede ser utilizado en la presente invención es un anticuerpo policlonal. El anticuerpo policlonal puede ser obtenido, por ejemplo, como sigue: El suero es obtenido de animales pequeños tales como ratones, ratones productores de anticuerpo humano, o Conejos inmunizados con proteínas CAPRIN-1 naturales o proteínas CAPRIN-1 recombinantes expresadas como proteínas de fusión con GST o similar en microorganismos tales como E. coli, o péptidos parciales de las mismas. Alternativamente, el suero puede ser obtenido a partir de mamíferos inmunizados con los fragmentos de CAPRIN-1 que sirven como antígenos de sensibilización, es decir, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No. : 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferentemente 85% o más, más preferentemente 90% o más, todavía más preferentemente 95% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ IOD No.: 5 (preferentemente, un polipéptido que consiste de cualquiera de estas secuencias de aminoácidos) , o un polipéptido que comprende un epítopo (preferentemente, que consiste del epítopo) que consiste de aproximadamente 7 a 12 aminoácidos consecutivos, por ejemplo, 8 a 11 aminoácidos consecutivos, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No.: 5 o la secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferentemente 85% o más, más preferentemente 90% o más, todavía más preferentemente 95% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 5. El suero obtenido de este modo puede ser purificado utilizando, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, columnas de proteína A o proteína G, cromatografía de intercambio iónico de DEAE o columnas de afinidad acopladas con las proteínas CAPRIN-l o péptidos sintéticos para preparar los anticuerpos policlonales anti-CAPRIN-1. El anticuerpo policlonal de la presente invención incluye anticuerpos obtenidos de animales productores de anticuerpos humanos (por ejemplo, ratones) inmunizados con la proteína CAPRIN-1.

En este contexto, por ejemplo, los ratones KM (Kirin Pharma Co . , Ltd. /Medarex) y ratones Xeno (Amgen Inc . ) son conocidos como los ratones productores de anticuerpos humanos (por ejemplo, Publicaciones Internacionales Nos. WO02/43478 y WO02/092812) . Los anticuerpos policlonales humanos completos pueden ser obtenidos a partir de sangre de tales ratones inmunizados con la proteína CAPRIN-1 o fragmentos de las mismas. Alternativamente, las células del bazo pueden ser aisladas de los ratones inmunizados de este modo y fusionadas con células de mieloma. De esta manera, pueden ser obtenidos los anticuerpos monoclonales humanos.

Los antígenos pueden ser preparados de acuerdo a, por ejemplo, un método que utiliza células animales (Publicación de Patente Japonesa (Kohyo) No. 2007-530068 A(2007)) o un método que utiliza baculovirus (por ejemplo, Publicación Internacional No. W098/46777) . Los antígenos que tienen baja inmunogenicidad pueden ser enlazados a macromoléculas inmunogénicas tales como la albúmina para la inmunización. Los antígenos pueden ser administrados junto con los adyuvantes para la inmunización.

Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede ser obtenido como un anticuerpo genéticamente recombinante que es producido utilizando una técnica de recombinación génica que involucra: la clonación de un gen del anticuerpo a partir de hibridomas; la incorporación del gen del anticuerpo dentro de vectores apropiados; y la introducción de los vectores dentro de los hospederos (ver por ejemplo, Cari, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990) . Específicamente, la región variable del anticuerpo (región V) de los cADNs es sintetizada a partir de los mARNs de los hibridomas utilizando la transcriptasa inversa. Después de la obtención de los ADNs que codifican para las regiones V del anticuerpo, de interés, los ADNs son ligados con los ADNs que codifican par las regiones constantes de anticuerpo, deseadas (regiones C) . Los productos de ligadura resultantes son incorporados dentro de los vectores de expresión. Alternativamente, los ADNs que codifican para la región V del anticuerpo pueden ser incorporados dentro de los vectores de expresión que contienen los ADNs de la región C del anticuerpo. Estos ADNs son incorporados dentro de los vectores de expresión para ser expresados bajo el control de las regiones de control de expresión, por ejemplo, un aumentador y un promotor. En seguida, las células hospederas pueden ser transformadas con los vectores de expresión resultantes y se les deja expresar los anticuerpos.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invención es preferentemente un anticuerpo monoclonal . Alternativamente, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo manipulado por ingeniería genética (anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, etc.), o similar.

El anticuerpo monoclonal incluye anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales de animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón, rata, conejo y pollo), anticuerpos monoclonales quiméricos, y similares. El anticuerpo monoclonal puede ser preparado mediante el cultivo de los hibridomas obtenidos por la fusión entre las células del bazo provenientes de mamíferos no humanos (por ejemplo, ratones, ratones productores de anticuerpo o humanos, pollos o conejos) inmunizados con las proteínas CAPRIN-1 o fragmentos de las mismas y células de mieloma. El anticuerpo quimérico es un anticuerpo preparado a partir de una combinación de secuencias derivadas de diferentes animales y es, por ejemplo, un anticuerpo compuesto de las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo de ratón, y las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico puede ser preparado utilizando un método conocido en la técnica que involucra, por ejemplo: la ligadura de los ADNs que codifican para las regiones V del anticuerpo de ratón con los ADNs que codifican para las regiones C del anticuerpo humano; la incorporación de los productos de ligadura resultantes dentro de los vectores de expresión; y la introducción de los vectores dentro de los hospederos de modo que son producidos los anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales que tienen reactividad inmunitaria con el polipéptido CAPRIN-1 parcial que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No.: 5 y tienen un efecto antitumoral, son preparados mediante un método descrito posteriormente en los Ejemplos.

El anticuerpo humanizado, también denominado anticuerpo humano reconformado, es un anticuerpo manipulado por ingeniería genética. El anticuerpo humanizado es construido mediante el injerto de las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo de un animal inmunizado, en las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) correspondientes de un anticuerpo humano. Un procedimiento de recombinación génica general para el mismo es también conocido .

Específicamente, las secuencias de ADN diseñadas para ligar, por ejemplo, las CDRs de anticuerpos de ratón, de conejo o de pollo, y las regiones estructurales de anticuerpo humano (FRs, por sus siglas en inglés) son sintetizadas mediante PCR a partir de diversos oligonucleótidos preparados que tienen porciones terminales que se traslapan una con la otra. Los ADNs obtenidos son ligados con los ADNs que codifican para las regiones constantes del anticuerpo humano. Subsecuentemente, los productos de ligadura resultantes son incorporados dentro de los vectores de expresión, los cuales son luego introducidos dentro de los hospederos para la producción del anticuerpo, para obtener el anticuerpo de interés (ver Solicitud de Patente Europea Publicación No. EP239400 y Publicación Internacional No. O96/02576) . Las FRs del anticuerpo humano conectadas vía las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) son seleccionadas de tal manera que las (CDRs) forman un sitio favorable de enlace al antígeno. Si es necesario, los aminoácidos en las regiones estructurales de las regiones variables del anticuerpo pueden ser sustituidos tal que las regiones de determinación de la complementariedad del anticuerpo humano reconformado, resultante, forman un sitio de enlace al antígeno, apropiado (Sato K. et al.. Cáncer Research 1993, 53: 851-856). Además, estas FRs pueden ser reemplazadas con regiones estructurales derivadas de anticuerpos humanos de diferentes clases o subclases de los mismos (ver Publicación Internacional No. W099/51743) .

Los aminoácidos en las regiones variables (por ejemplo, las FRs) o las regiones constantes del anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado preparado de este modo, pueden ser sustituidos, por ejemplo, por otros aminoácidos.

La sustitución de aminoácidos es la sustitución de, por ejemplo, menos de 15, menos de 10, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, ó 2 o menos aminoácidos, preferentemente 1 a 5 aminoácidos, más preferentemente 1 ó 2 aminoácidos. El anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo no sustituido. La sustitución es deseablemente, una sustitución conservadora de aminoácido, la cual es la sustitución entre aminoácidos similares en propiedades tales como carga, cadenas laterales, polaridad, y aromaticidad. Los aminoácidos pueden ser clasificados en términos de propiedades similares en, por ejemplo: aminoácidos básicos (arginina, lisina, e histidina) ; aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico) ; aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína, y tirosina) ; aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, y metionina) ; aminoácidos ramificados (leucina, valina, e isoleucina) ; y aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano, e histidina) .

Los ejemplos de anticuerpos modificados pueden incluir anticuerpos enlazados con diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG) . En el anticuerpo modificado de la presente invención, la sustancia que va a ser enlazada no está limitada. Con el fin de obtener tal anticuerpo modificado, el anticuerpo obtenido puede ser típicamente modificado. Un método para el mismo ha sido ya establecido en la técnica.

Como se utiliza en la presente, el término " funcionalmente equivalente" significa que un anticuerpo en cuestión tiene actividad biológica o bioquímica similar a aquella del anticuerpo de la presente invención, específicamente, el anticuerpo en cuestión tiene la función de dañar el tumor y no provoca esencialmente rechazo cuando se aplica a humanos, por ejemplo. Los ejemplos de tal actividad pueden incluir actividad inhibitoria del crecimiento celular y actividad de enlace.

Un método de preparación de un polipéptido funcionalmente equivalente a cierto polipéptido, que involucra la introducción de una mutación dentro de un polipéptido, es bien conocido para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, aquellos expertos en la materia pueden introducir apropiadamente una mutación dentro del anticuerpo de la presente invención utilizando mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ. , y Smith, M. (1983) ethods Enzymol . 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. y Fritz, HJ. , (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel , TA., (1985) Proc . Nati. Acad. Sci. Estados Unidos. 82, 488-492; y Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) o similares, con lo cual se prepara un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención.

El anticuerpo que reconoce un epítopo de una proteína CAPRIN-1 o un polipéptido fragmento de CAPRIN-1 que comprende el epítopo, puede ser obtenido mediante un método en general conocido para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser obtenido mediante un método que involucra la determinación del epítopo de la proteína CAPRIN-1 reconocida por el anticuerpo anti -CAPRIN-1 obtenido, que tiene un efecto inhibitorio del crecimiento de las células cancerosas, mediante un método convencional (por ejemplo, mapeo de epítopos o un método de identificación de epítopos descrito posteriormente) y la preparación de un anticuerpo utilizando un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos contenida en el epítopo como un inmunógeno, o un método que involucra la determinación de un epítopo para un anticuerpo preparado mediante un método convencional y seleccionando un anticuerpo que reconoce el mismo epítopo que aquel para el anticuerpo anti-CAPRIN-1. Como se usa en la presente, el "epítopo" se refiere a un fragmento polipeptídico que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos, preferentemente en humanos. Su unidad mínima consiste de aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, preferentemente 8 a 11 aminoácidos.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con CAPRIN-1, un anticuerpo que reconoce específicamente a CAPRIN-1, o un anticuerpo que se enlaza específicamente a CAPRIN-1 y muestra actividad citotóxica contra el cáncer o un efecto inhibitorio del crecimiento tumoral . El anticuerpo es preferentemente un anticuerpo que tiene una estructura que provoca poco o ningún rechazo en animales recipientes. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos humano-ratón) , anticuerpos de cadena simple, y anticuerpos biespecíficos cuando los animales recipientes son humanos. Estos anticuerpos tienen regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera derivadas de un anticuerpo humano o tienen regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera con regiones de determinación de la complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) derivadas de un anticuerpo de animal no humano y regiones estructurales (FR1, FR2, FR3 , y FR4) derivadas de un anticuerpo humano. Alternativamente, estos anticuerpos son anticuerpos recombinantes que tiene regiones variables de cadena pesada y cadena ligera derivadas de un anticuerpo de animal no humano y regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera derivadas de un anticuerpo humano. El anticuerpo de la presente invención es preferentemente los primeros dos anticuerpos .

Tales anticuerpos recombinantes pueden ser preparados como sigue: los ADNs que codifican para los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de humano, ratón, rata, conejo, y pollo) contra CAPRIN-1 humana, son clonados a partir de las células productoras de anticuerpo tales como los hibridomas y utilizados como plantillas en RT-PCR o similares, para preparar los ADNs que codifican para las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos. Las secuencias respectivas de las regiones variables de cadena ligera y pesada, las secuencias respectivas de CDR1, CDR2 , y CDR3 en cada región, o las secuencias respectivas de FR1, FR2 , FR3 , y FR4 en cada región, pueden ser determinadas con base en, por ejemplo, el sistema de numeración de Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Tal ADN que codifica para cada región variable o un ADN que codifica para cada CDR es preparado utilizando una técnica de recombinación génica (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o un sintetizador de ADN. En este contexto, los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos pueden ser preparados mediante la inmunización de animales productores del anticuerpo humano (por ejemplo, ratones) con CAPRIN-1 humana y luego fusionando las células del bazo extirpadas de los animales inmunizados, con células de mieloma. A parte de esto, los ADNs que codifican para las regiones variables y constantes de las cadenas ligeras o pesadas derivadas del anticuerpo humano, son preparados, si es necesario, utilizando una técnica de recombinación génica o un sintetizador de ADN.

Para el anticuerpo humanizado, los ADNs en los cuales la secuencia de codificación de CDR en los ADNs que codifican para las regiones variables de cadena ligera o pesada derivadas del anticuerpo humano, son sustituidas por las secuencias de codificación de CDR correspondientes de un anticuerpo derivado de animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, o pollo) pueden ser preparados y ligados con los ADNs que codifican para las regiones constantes de cadena ligera y pesada derivada del anticuerpo humano, para preparar el ADN humano que codifica para el anticuerpo humanizado.

Para el anticuerpo quimérico, los ADNs que codifican para las regiones variables de cadena ligera o pesada de un anticuerpo derivado de animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, o pollo) pueden ser ligados con los ADNs que codifican para las regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas del anticuerpo humano, para preparar un ADN que codifica para el anticuerpo quimérico.

El anticuerpo de cadena simple se refiere a un anticuerpo que comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera linealmente enlazadas una a la otra vía un ligador. Un ADN que codifica para el anticuerpo de cadena simple puede ser preparado mediante la ligadura de un ADN que codifica para la región variable de cadena pesada, un ADN que codifica para el ligador, y a un ADN que codifica para la región variable de cadena ligera. En este contexto, las regiones variables de cadena ligera y pesada son ambas derivadas de un anticuerpo humano o derivadas de un anticuerpo humano que tiene CDRs solas, sustituidas con CDRs de un anticuerpo derivado de animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, o pollo) . El ligador consistes de 12 a 19 aminoácidos. Los ejemplos de los mismos incluyen (G4S)3 que consiste de 15 aminoácidos (G.B. Kim et al., Protein Engineering Design y Selection 2007, 20 (9) : 425-432) .

El anticuerpo biespecífico (por ejemplo, diacuerpo) se refiere a un anticuerpo capaz de enlazarse específicamente a dos diferentes epítopos. Un ADN que codifica para el anticuerpo biespecífico puede ser preparado mediante la ligadura, por ejemplo, de un ADN que codifica para una región variable de cadena pesada A, un ADN que codifica para una región variable de cadena ligera B, un ADN que codifica para una región variable de cadena pesada B, y un ADN que codifica para una región variable de cadena ligera A, en este orden (con la condición de que el ADN que codifica para una región variable de cadena ligera B y el ADN que codifica para una región de cadena pesada B sean ligados vía un ADN que codifica para un ligador como se describió anteriormente) . En este contexto, las regiones variables de cadena ligera y pesada son todas derivadas de un anticuerpo humano o derivadas de un anticuerpo humano que tiene las CDRs solas sustituidas por CDRs de un anticuerpo derivado de animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, o pollo) .

Los ADNs recombinantes preparados de este modo pueden ser incorporados dentro de uno o más vectores apropiados, los cuales son luego introducidos dentro de las células hospederas (por ejemplo, células de mamífero, células de levadura, y células de insecto) de modo que los ADNs son (co) expresados para producir anticuerpos recombinantes (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES . , 1997 WILEY, P. Shepherd y C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; y J.W. Goding., Monclonal Antibodies: principies y practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Los ejemplos del anticuerpo de la presente invención, preparado mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente incluyen el siguiente anticuerpo (a) obtenido en los Ejemplos posteriores: (a) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las regiones de determinación de la complementariedad de las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10 y una región variable de cadena pesada que comprende las regiones de determinación de la complementariedad de las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14 (por ejemplo, un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de la SEQ ID No.: 11 y una región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 15) .

En este contexto, las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10 corresponden a CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena pesada de un anticuerpo derivado de ratón, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14 corresponden a CDR1 , CDR2 , y CDR3 de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo derivado de ratón, respectivamente .

Los ejemplos del anticuerpo humanizado, el anticuerpo quimérico, el anticuerpo de cadena simple, o el anticuerpo biespecífico de la presente invención incluyen los siguientes anticuerpos (i) al (iii) : (i) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 que consisten de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10, respectivamente, y las regiones estructurales derivadas del anticuerpo humano, y una región constante de cadena pesada derivada del anticuerpo humano, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende CDR1, CDR2, y CDR3 que consisten de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14, respectivamente, y las regiones estructurales derivadas del anticuerpo humano; (ii) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye una región variable de cadena pesada que comprende CDR1, CDR2, y CDR3 , que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10, respectivamente, y las regiones estructurales derivadas del anticuerpo humano, y una región constante de cadena pesada derivada del anticuerpo humano, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que incluye CDR1, CDR2 , y CDR3 que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14 , respectivamente, y las regiones estructurales derivadas del anticuerpo humano, y una región constante de cadena ligera derivada del anticuerpo humano; y (iii) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 11 y una región constante de cadena pesada derivada del anticuerpo humano, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 15 y una región constante de cadena ligera derivada del anticuerpo humano.

Las secuencias de las regiones constantes y variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo humano, están disponibles de, por ejemplo, NCBI (USA; GenBank, UniGene, etc.). Por ejemplo, se puede hacer referencia a las siguientes secuencias: Registro No. J00228 para una región constante de cadena pesada de IgGl humana; Registro No. JO0230 para una región constante de cadena pesada de IgG2 humana; Registro No. X03604 para una región constante de cadena pesada de IgG3 humana; Registro No. K01316 para una región constante de cadena pesada de IgG4 humana; Registros Nos. V00557, X64135, X64133, etc., para una región constante ? de cadena ligera humana; y Registros Nos. X64132, X64134, etc., para una región constante ? de cadena ligera humana.

Preferentemente, estos anticuerpos tienen actividad citotóxica y pueden con esto ejercer un efecto antitumoral .

Las secuencias particulares anteriores de las regiones variables de cadena ligera y pesada y las CDRs en cada anticuerpo son proporcionadas meramente para fines ilustrativos. Es obvio que el anticuerpo de la presente invención no está limitado por las secuencias particulares. Los hibridomas capaces de producir anticuerpos humanos anti-CAPRIN-1 humana o los anticuerpos de animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos de ratón) diferentes de aquellos descritos anteriormente son preparados, y los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas son recuperados y evaluados por ser (o no ser) los anticuerpos de interés con actividad de enlace inmunológico contra CAPRIN-1 humana y actividad citotóxica como índices. Los hibridomas productores del anticuerpo monoclonal de interés son con esto identificados. Posteriormente, los ADNs que codifican para las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos de interés son producidos a partir de los hibridomas y secuenciados , como se describió anteriormente. Los ADNs son utilizados para la preparación de los diferentes anticuerpos .

Los anticuerpos anteriores pueden cada uno tener la sustitución, supresión, o adición de uno o varios aminoácidos, particularmente en una secuencia de región estructural y/o una secuencia de región constante, siempre y cuando el anticuerpo tenga tal especificidad que pueda reconocer específicamente a CAPRIN-1. Como se usa en la presente, el término "varios" significa preferentemente 2 a 5, más preferentemente 2 ó 3.

La constante de afinidad Ka ( Kencendido/kapagado ) del anticuerpo de la presente invención para la proteína CAPRIN-1 o el fragmento de la misma es preferentemente de al menos 107 M"1, al menos 108 M"1, al menos 5 x 108 NT1, al menos 109 M"1, al menos 5 x 109 M"1, al menos 1010 M"1, al menos 5 x 1010 M"1, al menos 1011 M"1, al menos 5 x 1011 M"1 , al menos 1012 M"1, o al menos 1013 M"1, .

El anticuerpo de la presente invención puede ser conjugado con un agente antitumoral . La conjugación del anticuerpo con el agente antitumoral puede ser realizada vía un espaciador que tiene un grupo reactivo con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, o similares (por ejemplo, un grupo succinimidilo, un grupo formilo, un grupo 2-piridilditio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo, o un grupo hidroxilo) .

Los ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos públicamente en las literaturas, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, bisulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina , bulatacina, bulatacinona, canfotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancrastistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, clofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina , clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimez, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina , trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, acitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (por ejemplo, calusteron, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, y testolactona) , aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, motoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, ácido tenuazónico, traizicuona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol , mitolactol, pipobromano, gacitocina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina , cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecan, inhibidores de topoisomerasa, difluorometilorinitina (DMFO) , ácido retinoico, capecitabina, y las sales y derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede ser administrado en combinación con un agente antitumoral para producir un efecto terapéutico mayor. Este procedimiento es adaptable a un paciente con un cáncer que expresa CAPRIN-1 ya sea antes o después de la operación quirúrgica. Este procedimiento puede ser aplicado, particularmente después de la cirugía, al cáncer que expresa CAPRIN-1, el cual ha sido tratado convencionalmente con un agente antitumoral solo, para producir mayor prevención de la recurrencia del cáncer o prolongación de tiempo de supervivencia.

Los ejemplos del agente antitumoral utilizados en la administración combinada con el anticuerpo de la presente invención incluyen los siguientes agentes antitumorales públicamente conocidos en la literatura, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosf mida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, canfotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancrastistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, clofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina , fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina , carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina , puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina , estreptozocina , tubercidina, ubenimez, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, acitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, motoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida , procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermamio, ácido tenuazónico, traizicuona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol , mitolactol, pipobromano, gacitocina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecan, inhibidores de topoisomerasa, difluometilorinitina (DMFO) , ácido retinoico, capecitabina, y las sales farmacéuticamente aceptables (conocidas en la técnica) , y los derivados (conocidos en la técnica) los mismos. De estos agentes antitumorales , son particularmente utilizados la ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, o vinorelbina.

Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede ser enlazado a un radioisótopo públicamente conocido en las literaturas, etc., tales como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 211Bi, 32P, 175Lu, o 176Lu, 89Sr, 64Cu, o llxIn (Hideo Saji, YAKUGAKU ZASSHI 128 (3) 323-332, 8 (2008), Jpn) . Un radioisótopo efectivo para el tratamiento o diagnóstico del tumor es deseable. Tal radioisótopo es también incluido del agente antitumoral de acuerdo a la presente invención.

Identificación del epítopo Como se muestra en los Ejemplos siguientes, el anticuerpo de la presente invención se enlaza a un epítopo en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID No. : 5. Un ejemplo de un método para confirmar un epítopo para el anticuerpo de la presente invención, incluye un método que involucra la inmovilización de un epítopo en el polipéptido representada por la SEQ ID No.: 5 sobre una placa, y la evaluación del anticuerpo para su reactividad con este epítopo. Específicamente, un epítopo en el polipéptido de la SEQ ID No.: 5 es inmovilizado a través de la reacción sobre una placa acoplada con grupos funcionales extractores de electrones vía un espaciador tal como el oligoetilenglicol . El anticuerpo de la presente invención se puede hacer reaccionar con la placa y es evaluado para su reactividad con el epítopo a través de la reacción con un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, marcado con peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) que se enlaza al anticuerpo de la presente invención, es decir, puede ser confirmado el epítopo al cual se enlaza el anticuerpo de la presente invención. El epítopo en el polipéptido de la SEQ ID No. : 5 utilizado en la inmovilización sobre una placa es una secuencia misma que comprende al menos el epítopo en la secuencia de la SEQ ID No.: 5 o una porción modificada del mismo (por ejemplo, los residuos N-terminal o C-terminal modificados con diversos aminoácidos arbitrarios o una proteína tal como KLH o un (poli) péptido modificado con una proteína MAP) . El anticuerpo de la presente invención necesita únicamente enlazarse a cualquiera de éstos (poli) péptidos .

Por otra parte, incluso el anticuerpo de la presente invención puede ser no reactivo con el polipéptido de la SEQ ID No. : 5, es decir, el epítopo puede no ser confirmado, en el método anterior. En este caso, el anticuerpo se hace reaccionar con un antígeno bajo condiciones en solución que facilitan el enlace entre el antígeno y el anticuerpo. Después de la obtención de un complejo antígeno-anticuerpo mediante un método de inmunoprecipitación, un polipéptido parcial enlazado con el anticuerpo puede ser separado y examinado para su secuencia de aminoácidos, para confirmar el epítopo para el anticuerpo de la presente invención. En este contexto, el antígeno es, por ejemplo, el polipéptido de la SEQ ID No. : 5 mismo o una porción modificada del mismo. Alternativamente, incluso una proteína CAPRIN-1 puede ser utilizada siempre y cuando el epítopo reactivo con el anticuerpo de la presente invención pueda ser confirmado por el método anterior.

Efecto antitumoral El efecto antitumoral del anticuerpo anti-CAPRIN-1 utilizado en la presente invención sobre las células cancerosas que expresan CAPRIN-1 parece ser originado por el siguiente mecanismo: la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, mediada por células efectoras (ADCC, por sus siglas en inglés) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra las células que expresan CAPRIN-1. Sin embargo, este mecanismo no está destinado a limitar el alcance de la presente invención.

Se sabe que el efecto antitumoral basado en el mecanismo correlaciona con el número de moléculas objetivo expresadas sobre la superficie de las células cancerosas a las cuales se enlaza el anticuerpo (Niwa R. , Clinical Cáncer Research 2005 Mar 15; 11 (6) : 2327-2336) . El número de moléculas objetivo expresadas sobre la superficie de las células cancerosas puede ser examinado utilizando un kit de ensayo existente, capaz de medir el número de moléculas de la superficie celular. Específicamente, el número de moléculas objetivo a las cuales se enlaza el anticuerpo puede ser determinado mediante: la reacción de los anticuerpos primarios tales como los anticuerpos contra las moléculas objetivo con las células cancerosas; la reacción con éstas de los anticuerpos fluorescentemente marcados, contra los anticuerpos primarios conjuntamente con esferas para una curva de calibración con el número conocido de moléculas; y la medición de la intensidad de fluorescencia media de las muestras para obtener una curva de calibración.

De este modo, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 utilizado en la presente invención puede ser evaluado para su actividad, como es mostrado específicamente en los Ejemplos siguientes, mediante la evaluación de la actividad de ADCC o CDC contra las células cancerosas que expresan CAPRIN-1 in vitro, o mediante el examen del número de moléculas de CAPRIN-1 expresadas sobre la superficie de las células cancerosas utilizando el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de acuerdo a la presente invención como un anticuerpo primario.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 utilizado en la presente invención se enlaza a una proteína CAPRIN-1 sobre las células cancerosas y exhibe un efecto antitumoral a través de la actividad. De este modo, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invención es útil en el tratamiento o prevención del cáncer. De este modo, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer, que comprende el anticuerpo anti-CAPRIN-1 como un ingrediente activo. El anticuerpo anti-CAPRIN-1 utilizado para el propósito de administración a los cuerpos humanos (terapia con anticuerpo) es preferentemente un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.

Un anticuerpo anti -CAPRIN- 1 con más alta afinidad de enlace para una proteína CAPRIN-1 sobre la superficie de la célula cancerosa ejerce más fuerte actividad antitumoral. De este modo, el anticuerpo de la presente invención tiene alta afinidad de enlace por la proteína CAPRIN-1 y puede por lo tanto esperarse que tenga un efecto antitumoral más fuerte. En consecuencia, el anticuerpo de la presente invención es aplicable a una composición farmacéutica destinada para el tratamiento y/o prevención del cáncer. Tal alta afinidad de enlace del anticuerpo de la presente invención es preferentemente al menos 107 M"1, al menos 10a M" \ al menos 5 x 108 M~\ al menos 109 M"1, al menos 5 X 109 M"1, al menos 1010 M"1, al menos 5 X 1010 NT1 , al menos 1011 M"1, al menos 5 x 1011 M"1, al menos 1012 M"1, o al menos 1013 M"1, en términos de una constante de asociación (constante de afinidad) Ka (kencendido/kapagado) , como se describe anteriormente .

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 que se enlaza a un mayor número de moléculas de CAPRIN-1 sobre la superficie de las células cancerosas, produce actividad antitumoral más fuerte. De manera deseable, el número de moléculas de CAPRIN-1 en el ensayo utilizando el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invención es 104 o más, preferentemente 105 o más, por célula cancerosa a la cual se enlaza el anticuerpo, en la expectativa del efecto antitumoral. Los tumores (células cancerosas) que tienen un número grande de moléculas de CAPRIN-1 sobre la superficie celular es particularmente preferido como un cáncer para recibir el anticuerpo de la presente invención.

Enlace a las células que expresan antígeno La habilidad del anticuerpo para enlazarse a CAPRIN-1 puede ser determinada mediante el uso del ensayo de enlace que utiliza, por ejemplo, ELISA, transferencia de Western, inmunofluorescencia, y análisis de citometría de flujo, como se describe en los Ejemplos.

Tinción inmunohistoquímica El anticuerpo que reconoce CAPRIN-1 puede ser probado para su reactividad con CAPRIN-1 mediante un método inmunohistoquímico bien conocido por aquellos expertos en la técnica, utilizando la sección congelada fijada con paraformaldehído o con acetona o la sección tisular incrustada en parafina, fijada con paraformaldehído de un tejido obtenido de un paciente durante la operación quirúrgica o de un animal que lleva un tejido de xenoinjerto inoculado con una línea celular que expresan CAPRIN-1 ya sea espontáneamente o después de la transfeccion.

Para la tinción inmunohistoquímica , el anticuerpo reactivo con CAPRIN-1 puede ser teñido mediante varios métodos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser visualizado a través de la reacción con un anticuerpo de cabra anti-ratón, conjugado a peroxidasa de rábano, anticuerpo de cabra anti-conejo o anticuerpo de cabra anti-pollo.

Composición farmacéutica, y método para tratar y/o prevenir el cáncer Un objetivo de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer de la presente invención no está particularmente limitado, siempre y cuando el objetivo sea un cáncer (células) que expresa un gen de CAPRIN-1.

Los términos "tumor" y "cáncer" como se utilizan en la presente significan el neoplasma maligno y se utilizan intercambiablemente uno con el otro.

El cáncer objetivo en la presente invención es un cáncer que expresa un gen que codifica para una proteína CAPRIN-1 y es preferentemente cáncer de mama, cáncer de riñon, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer del cérvix uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma , mastocitoma, o melanoma.

Los ejemplos específicos de estos cánceres incluyen, pero no están limitados a, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama tipo complejo, tumor mixto maligno de glándula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma pulmonar, cáncer de células escamosas, cáncer microcítico, cáncer macrocítico, glioma el cual es un tumor del tejido neuroepitelial , ependimoma, tumor neuronal , tumor neuroectodérmico embrionario, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentario, linfoma tipo microcítico a mesocítico, cáncer del ciego, cáncer del colon ascendente, cáncer del colon descendente, cáncer del colon transversal, cáncer de colon sigmoide, cáncer rectal, cáncer de ovario epitelial, tumor de células germinales, tumor de células estromales, carcinoma de los conductos pancreáticos, carcinoma invasor de los conductos pancreáticos, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasma papilar-mucinoso intraductal, neoplasma quístico mucinoso, pancreatoblastoma, cistadenocarcinoma seroso, tumor pseudopapilar sólido, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (síndrome de ermer) , tumor de células no funcionales de los islotes, somatostatinoma, y VIPoma.

Los sujetos recipientes (pacientes) son preferentemente mamíferos, por ejemplo, mamíferos que incluyen primates, animales de compañía, ganado y animales deportivos, y particularmente y de manera preferida humanos, perros y gatos .

En el caso de utilizar el anticuerpo de la presente invención como una composición farmacéutica, la composición farmacéutica puede ser formulada por un método bien conocido por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede ser utilizada en la forma de una inyección parenteral de una solución o suspensión aséptica con agua o con cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede ser formulada con el anticuerpo mezclado en una forma de dosis unitaria requerida para la práctica farmacéutica en general aceptada, en combinación con portadores o medios farmacéuticamente aceptables, específicamente agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, un emulsificante, un agente suspensor, un tensioactivo, un estabilizador, un agente saborizante, un excipiente, un vehículo, un conservante, un aglutinante, etc., como sea apropiado. La cantidad del ingrediente activo en tal preparación es determinada tal que puede ser alcanzada una dosis apropiada dentro del intervalo indicado.

Una composición aséptica para la inyección puede ser formulada de acuerdo a la práctica farmacéutica convencional utilizando un vehículo tal como agua destilada inyectable.

Los ejemplos de soluciones acuosas para la inyección incluyen solución salina fisiológica, soluciones isotónicas que contienen glucosa u otros adyuvantes, por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, y cloruro de sodio. Estas soluciones pueden ser utilizadas en combinación con un solubilizador apropiado, por ejemplo, un alcohol (particularmente, etanol) o un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol ) , o un tensioactivo no iónico, por ejemplo, polisorbato 80 (MR) o HCO-60.

Los ejemplos de las soluciones aceitosas incluyen aquellas que utilizan aceite de ajonjolí o aceite de soja. Las soluciones pueden ser utilizadas en combinación con un solubilizador tal como benzoato de bencilo o alcohol bencílico. Las soluciones pueden ser además mezcladas con un amortiguador (por ejemplo, una solución amortiguadora de fosfato o una solución amortiguadora de acetato de sodio) , un agente suavizante (por ejemplo, clorhidrato de procaína) , un estabilizador (por ejemplo alcohol bencílico o fenol), y un antioxidante. Las soluciones para inyección preparadas de este modo son en general cargadas dentro de ampolletas 1 apropiadas .

La composición farmacéutica de la presente invención es administrada oralmente o parenteralmente, preferentemente parenteralmente. Los ejemplos específicos de sus formas de dosis incluyen inyecciones, agentes de administración intranasal, agentes de administración transpulmonar y agentes de administración percutánea. Los ejemplos de las inyecciones incluyen inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal , e inyección subcutánea, a través de las cuales la composición farmacéutica puede ser administrada sistémicamente o localmente .

También, el método de administración puede ser apropiadamente seleccionado dependiendo de la edad, el peso, el género, los síntomas etc., de un paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo o un polinucleótido que codifica para el anticuerpo puede ser seleccionada dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0.0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dosis. Alternativamente, la dosis puede ser seleccionada dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0.001 a 100000 kg/de peso corporal de un paciente, aunque la dosis no está necesariamente limitada a estos valores numéricos. Aunque la dosis y el método de administración varían dependiendo del peso, la edad, el género, los síntomas, de un paciente, aquellos expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente la dosis y el método .

La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención o el fragmento del mismo puede ser administrada a un sujeto para tratar y/o para prevenir el cáncer, preferentemente cáncer de mama, cáncer renal, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar, cáncer cerebral, cáncer gástrico, cáncer del cérvix uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma, o melanoma.

La presente invención abarca además un método para tratar y/o prevenir el cáncer, que comprende administrar la composición farmacéutica de la presente invención en combinación con el agente antitumoral como se ejemplificó anteriormente, o una composición farmacéutica que comprende el agente antitumoral a un sujeto. El anticuerpo de la presente invención o el fragmento del mismo pueden ser administrados simultáneamente con o separadamente del agente antitumoral al sujeto. En el caso de administrar separadamente estas composiciones farmacéuticas, cualquiera puede ser administrada primero o después. Sus intervalos de dosificación, las dosis, las vías de administración y el número de dosis pueden ser apropiadamente seleccionados por un médico quien es un especialista en terapia del cáncer.

Otras formas de dosis de fármacos distintos que van a ser administrados simultáneamente también incluyen, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas formuladas cada una al mezclar el anticuerpo de la presente invención o el fragmento del mismo o el agente antitumoral en un portador (o medio) farmacológicamente aceptable. Las descripciones anteriores respecto a la prescripción, formulación, vías de administración, rutas, dosis, cáncer, etc., respecto a las composiciones farmacéuticas y las formas de dosis que contienen el anticuerpo de la presente invención son también aplicables a cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriormente descritas y formas de dosis que contienen el agente antitumoral .

De este modo, la presente invención también proporciona un fármaco en combinación para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, que comprende la composición farmacéutica de la presente invención y una composición farmacéutica que incluye el agente antitumoral como se ejemplificó anteriormente, y un método para tratar y/o prevenir el cáncer, que comprende administrar el fármaco en combinación. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer, que comprende el anticuerpo de la presente invención o el fragmento del mismo y el agente antitumoral, junto con un portador farmacológicamente aceptable .

Polipéptido y ADN La presente invención proporciona además un ADN que codifica para el anticuerpo de la presente invención o el fragmento (fragmento de enlace al anticuerpo) del mismo. Tal ADN puede ser un ADN que codifica para las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo o puede ser un ADN que codifica para las regiones variables de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo. Tal ADN puede ser un ADN que codifica para cada una o una combinación de las regiones de determinación de la complementariedad del anticuerpo. Tal ADN incluye, por ejemplo, un ADN que codifica para la región variable de cadena pesada, que comprende las secuencias nucleotídicas que codifican para las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10 y un ADN que codifica para la región variable de cadena pesada, que comprende las secuencias nucleotídicas que codifica para las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14, en el caso de el anticuerpo (a).

Las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) codificadas por el ADN que tiene estas secuencias, sirven como regiones que determinan la especificidad del anticuerpo. Las secuencias que codifican las otras regiones (es decir, las regiones constantes y las regiones estructurales) del anticuerpo pueden por lo tanto ser secuencias derivadas de otros anticuerpos. En este contexto, "otros anticuerpos" también pueden incluir anticuerpos derivados de organismos no humanos y son preferentemente aquellos derivados de humanos desde el punto de vista de reducción de reacciones adversas. Específicamente, en el ADN anteriormente descrito, las regiones que codifican para cada región estructural y cada región constante en las cadenas pesadas y ligeras comprenden preferentemente secuencias nucleotídicas que codifican las secuencias de aminoácidos correspondientes derivadas del anticuerpo humano.

Los ejemplos adicionales del ADN que codifica para el anticuerpo de la presente invención incluyen un ADN que codifica para la región variable de cadena pesada, que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 11, y un ADN que codifica para la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 15, en el caso de el anticuerpo (a) . En este contexto, la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 11 es, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. : 16. La secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 15 es, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. : 17. Cuando tal ADN comprende una región que codifica para cada región constante en las cadenas pesadas y ligeras, esta región comprende preferentemente una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos derivada del anticuerpo humano correspondiente (una secuencia de aminoácidos de cada región constante en las cadenas pesadas y ligeras) .

Estos ADNs de anticuerpo pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante los métodos descritos anteriormente o el siguiente método: primeramente, los ARNs totales son preparados a partir de hibridomas que producen el anticuerpo de la presente invención utilizando un kit de extracción de ARN, comercialmente disponibles, y los cADNs son sintetizados utilizando transcriptasa inversa y cebadores aleatorios o similares. Subsecuentemente, los cADNs que codifican para el anticuerpo son amplificados mediante PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos para las secuencias conservadas de cada región variable en los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo de ratón, conocidos. Las secuencias que codifican para las regiones constantes pueden ser obtenidas mediante la amplificación por PCR de las secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos del ADN puede ser incorporada dentro de un plásmido o un fago para el secuenciamiento, por ejemplo, y determinada de acuerdo a un método rutinario.

La presente invención proporciona además los siguientes polipéptidos y ADNs relacionados al anticuerpo (a) : (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 11, y un ADN que codifica para el polipéptido (por ejemplo, un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. : 16) ; (ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 15, y un ADN que codifica para el polipéptido (por ejemplo, un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. : 17) ; (iii) un polipéptido de CDR de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10, y un ADN que codifica para el polipéptido; y (iv) un polipéptido de CDR de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14, y un ADN que codifica para el polipéptido.

Estos polipéptidos y ADNs pueden ser preparados utilizando técnicas de recombinación de genes como se describió anteriormente.

Los aspectos de la presente invención, descritos anteriormente, son resumidos en seguida. (1) Un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido de CAPRIN-1 parcial que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No . : 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos. (2) El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo a (1) , en donde el anticuerpo o fragmento del mismo tiene actividad citotóxica contra una célula cancerosa que expresa una proteína CAPRIN-1. (3) El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo a (1) ó (2) , en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. (4) El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo a cualquiera de (1) a (3) , en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena simple, o un anticuerpo multiespecífico . (5) El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo a cualquiera de (1) a (4) , en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende las regiones de determinación de la complementariedad de las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10 (CDR1, CDR2 , y CDR3, respectivamente) y una región variable de cadena ligera que comprende las regiones de determinación de la complementariedad de las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14 (CDR1, CDR2, y CDR3 , respectivamente) y tiene reactividad inmunológica con la proteína CAPRIN-1. (6) El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo a cualquiera de (1) a (5) , en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está conjugado con un agente antitumoral. (7) Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo a cualquiera de (1) a (6) como un ingrediente activo. (8) La composición farmacéutica de acuerdo a (7) , en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñon, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer del cérvix uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma, o melanoma . (9) Un fármaco en combinación para el tratamiento y/o prevención del cáncer, que comprende una composición farmacéutica de acuerdo a (7) u (8) y una composición farmacéutica que comprende un agente antitumoral. (10) Un ADN que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo a cualquiera de (1) a (5) . (11) Un método para tratar y/o prevenir el cáncer, que comprende administrar un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo a cualquiera de (1) a (6), una composición farmacéutica de acuerdo a (7) ó (8) , o un fármaco en combinación de acuerdo a (9) a un sujeto.

EJEMPLOS De aquí en adelante, la presente invención será descrita específicamente con referencia a los Ejemplos. No obstante, el alcance de la presente invención no está destinado a ser limitado por estos ejemplos específicos.

Ejemplo 1. Análisis de la expresión de CAPRIN-1 en cada tej ido La expresión del gen de CAPRIN-1 en tejidos normales caninos y humanos y diversas líneas celulares, fue examinada mediante RT-PCR de acuerdo al Ejemplo 1(4) de WO2010/016526. Como resultado, su fuerte expresión fue observada en los testículos entre los tejidos caninos celulares, mientras que la expresión fue observada en el cáncer de mama canino y en los tejidos de adenocarcinoma . Como resultado de confirmar también la expresión en tejidos humanos, la expresión fue confirmada únicamente en los testículos entre los tejidos normales, como el gen de CAPRIN-1 canino. En contraste, la expresión fue detectada en muchos tipos de líneas de células cancerosas, incluyendo 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, DA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, y MRK-nu-1) y 4 líneas celulares de cáncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, y BxPc-3) , entre otras células cancerosas. Estos resultados demostraron que CAPRIN-1 es expresada en las líneas celulares de cáncer de mama y las líneas celulares de cáncer pancreático, aunque su expresión no es observada en tejidos normales diferentes de los testículos.

Ejemplo 2. Preparación del anticuerpo monoclonal de ratón contra CAPRIN-1 (1) Preparación del anticuerpo monoclonal de ratón 100 9 de la proteína CAPRIN-1 humana que tenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 2, como se preparó en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 fue mezclada con una cantidad igual del adyuvante MPL + TDM (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.) . Esta mezcla fue utilizada como una solución de antígeno por ratón. La solución de antígeno fue intraperitonealmente administrada a cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad (fabricado por Japan SLC, Inc.). Posteriormente, fueron realizados 7 refuerzos cada semana para completar la inmunización. Tres días después de la última inyección, el bazo de cada ratón fue extirpado y aplastado entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS(-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y la remoción del sobrenadante mediante centrifugación a 1500 rpm por 10 minutos fueron repetidos tres veces para obtener las células del bazo. Las células del bazo obtenidas fueron mezcladas con células de mieloma de ratones SP2/0 (adquiridas de la ATCC) a una proporción de 10:1. 200 µ? de un medio RPMI1640 que contenía 10% de FBS fueron calentados a 37°C y mezclados con 800 µ? de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH) , y la solución de PEG preparada de este modo fue agregada a la mezcla celular, la cual fue luego dejada reposar por 5 minutos para la fusión celular. Después del retiro del sobrenadante mediante centrifugación a 1700 rpm por 5 minutos, las células fueron suspendidas en 150 mi de un medio RP I1640 que contenía 15% de FBS suplementado con 2% equivalente de una solución de HAT (fabricada por Life Technologies, Inc./Gibco) (medio selectivo de HAT). Esta suspensión fue incluida en quince placas de 96 pozos (fabricadas por Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) a una concentración de 100 µ?/????. Las células del bazo y las células de mieloma fueron fusionadas mediante cultivo a 37°C por 7 días bajo condiciones de 5% de C02 para obtener los hibridomas .

Los hibridomas preparados fueron seleccionados para afinidad de enlace a los anticuerpos producidos por los hibridomas contra las proteínas CAPRIN-1 como un indicador. Una solución a 1 g/ml de la proteína CAPRIN-1 preparada mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 fue agregada a una placa de 96 pozos a una concentración de 100 µ?/???? y se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada pozo fue lavado tres veces con PBS-T.

Posteriormente, fue agregada a ésta una solución de albúmina sérica bovina (BSA, por sus siglas en inglés) al 0.5% (fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) a una concentración de 400 µ?/???? y se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución en cada pozo fue desechada, y cada pozo fue lavado tres veces con 400 µ? de PBS-T. Posteriormente, el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente fue agregado a éste a una concentración de 100 µ?/???? y se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada pozo fue lavado tres veces con PBS-T. Posteriormente, el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con HRP (H + L) (fabricados por Invitrogen Corp.) diluido a 5000 veces con PBS, fue agregado a éstos a una concentración de 100 µ?/???? y se dejaron reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada pozo fue lavado tres veces con PBS-T. Posteriormente, fue agregada a éstos una solución de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a una concentración de 100 µ?/???? y se dejaron reposar por 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, la reacción fue terminada por la adición de ácido sulfúrico 1 N a una concentración de 100 µ?/????. La absorbancia fue medida a 450 nm y 595 nm utilizando un espectrómetro de absorción. Como resultado, fueron seleccionados varios hibridomas que produjeron anticuerpos que tenían alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados fueron agregados a una placa de 96 pozos a una densidad de 0.5 células/pozo y cultivados en la placa. Una semana después, los hibridomas que formaron colonias simples en los pozos fueron observados. Las células en estos pozos fueron posteriormente cultivadas, y los hibridomas clonados fueron seleccionados para la afinidad de enlace de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra las proteínas CAPRIN-ls como un indicador. Una solución de 1 µg/ml de las proteínas CAPRIN-1 preparadas en un procedimiento descrito en el Ejemplo 3 del documento W02010/016526 fue agregada a una placa de 96 pozos a una concentración de 100 µ?/???? y se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada pozo fue lavado tres veces con PBS-T. Luego, se agregó una solución de BSA al 0.5% a éste a una concentración de 400 µ?/???? y se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución en cada pozo fue desechada, y cada pozo fue lavado tres veces con 400 µ? de PBS-T. Posteriormente, el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente fue agregado a éstos a una concentración de 100 µ?/???? y se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada pozo fue lavado tres veces con PBS-T. Luego, se agregó a éstos el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con HRP (H + L) (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos a 5000 veces con PBS, a una concentración de 100 µ?/???? y se dejaron reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada pozo fue lavado tres veces con PBS-T. Posteriormente, la solución sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) fue agregada a éstos a una concentración de 100 µ?/???? y se dejó reposar por 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, la reacción fue terminada por la adición de ácido sulfúrico 1 N a una concentración de 100 µ?/????. La absorbancia fue medida a 450 nm y 595 nm utilizando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron 61 líneas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con las proteínas CAPRIN-1.

En seguida, estos anticuerpos monoclonales fueron seleccionados para los anticuerpos reactivos con la superficie de las células de cáncer de mama que expresan CAPRIN-1. Específicamente, 10s células de una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231V fueron centrifugadas en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mi. 100 µ? del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente fueron agregados a éste, y se dejó reposar por 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, se agregaron a éste los anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón marcados con FITC (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos a 500 veces con PBS que contenía 0.1% de FBS, y se dejó reposar por 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson y Company) . Por otra parte, la misma operación anterior fue realizada utilizando el suero de cada ratón Balb/c de seis semanas, no tratado, diluido a 500 veces con un medio para el cultivo de hibridoma, en vez de los anticuerpos, para preparar un control. Como resultado, un anticuerpo monoclonal (anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1) que tenían la más fuerte intensidad de fluorescencia que aquella del control, es decir, reactivo con la superficie de las células de cáncer de mama, se seleccionó. (2) Identificación del epítopo de CAPRIN-1 reconocido por el anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN-1 #1 Los anticuerpos monoclonales contra CAPRIN-1, reactivos a la superficie de las células cancerosas (anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1) obtenido en el párrafo (1) fueron utilizados para identificar una región de epítopo de CAPRIN-1 reconocida por éstos. 93 péptidos candidatos cada uno consistiendo de 12 a 16 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína CAPRIN-1 humana fueron sintetizados, y cada uno disuelto a una concentración de 1 mg/ml en DMSO.

Cada péptido fue disuelto a una concentración de 30 µg/ml en una solución amortiguadora de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) . La solución fue agregada a 100 µ?/???? a una placa de 96 pozos (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, producto No.: 436006) y se dejó reposar toda la noche a 4°C. La solución en cada pozo fue desechada, y se agregaron a éstos etanolamina 10 mM/solución amortiguadora de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) a una concentración de 200 µ?/???? y se dejaron reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Posteriormente, la solución en cada pozo fue desechada, y cada pozo fue lavado dos veces con PBS que contenía 0.5% de Tween 20 (PBST) para preparar una placa inmovilizada con péptido .

El sobrenadante de cultivo celular que contenía el anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1 fue agregado a una concentración de 50 µ?/???? a cada placa obtenida de este modo. Después de agitar a temperatura ambiente por 1 hora, la solución en cada pozo fue desechada, y cada pozo fue lavado tres veces con PBST. En seguida, una solución de anticuerpo secundaria que contenía los anticuerpos anti-IgG de ratón marcados con HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos de 3000 a 4000 veces con PBST fue agregada a éstos a una concentración de 50 µ?/????. Posteriormente, la solución en cada pozo fue desechada, y cada pozo fue lavado seis veces con PBST.

Una solución de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) fue agregada a éstos a 100 µ?/???? y se dejó reposar por 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, la reacción fue terminada por la adición de ácido sulfúrico 1 N a una concentración de 100 µ?/????. La absorbancia fue medida a 450 nm y a 595 nm utilizando un espectrómetro de absorción.

Como resultado el polipéptido de la SEQ ID NO: 5 fue identificado como una secuencia parcial de CAPRIN-1 reconocida por el anticuerpo anti-CAPRIN-l #1 obtenido en el Ejemplo 2(1). (3) Clonación de los genes de la región variable de los anticuerpo anti-CAPRIN- 1 #1 Los anticuerpos monoclonales obtenidos en el Ejemplo 2(1) fueron analizados para sus secuencias de genes que codifican para la región variable y las secuencias de aminoácidos de los mismos, de acuerdo al método descritos en el Ejemplo 5 del documento O2010/016526. Como resultado, el anticuerpo monoclonal #1 comprendió una región variable de cadena pesada que consistió de la secuencia de aminoácidos representado por la SEQ ID No. : 11 y una región variable de cadena ligera que consistió de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No.: 15. Una secuencia de genes que codifican para la región variable de cadena pesada del anticuerpo #1 es mostrada en la SEQ ID No. : 16, la secuencia de aminoácidos de la misma es mostrada en la SEQ ID No. : 11, una secuencia de genes que codifica para la región variable de cadena ligera de la misma es mostrada en la SEQ ID No. : 17 y la secuencia de aminoácidos de la misma es mostrada en la SEQ ID No. : 15.

Se mostró también que: el anticuerpo monoclonal #1 obtenido en el Ejemplo 2(1) comprende la región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No. : 11 y la región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.: 15, en donde CDR1, CDR2 , y CDR3 en la región variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10, respectivamente, y CDR1, CDR2 , y CDR3 en la región variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14, respectivamente.

Ejemplo 3. Preparación del anticuerpo policlonal contra el polipéptido CAPRIN-1 parcial, presente sobre la superficie de las células cancerosas Con el fin de obtener anticuerpos policlonales contra los polipéptidos de CAPRIN-1 parciales presentes sobre la superficie de las células cancerosas, un polipéptido (péptido derivado de CAPRIN-1 mostrado en la SEQ ID No. : 5) que comprende la región de epítopo para el anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1 obtenido en el Ejemplo 2, un polipéptido que consiste en una región de los residuos de aminoácidos números 50 al 98 en la secuencia de aminoácido de CAPRIN-1 humana de la SEQ ID No. : 2, y un polipéptido que tenía una región de residuos de aminoácidos números 233 al 305 de la SEQ ID No. : 2, fueron sintetizados. 1 mg de cada uno de estos péptidos fue mezclado como un antígeno con un volumen igual de una solución de adyuvante incompleto de Freund (IFA) . Esta mezcla fue subsecuentemente administrada a cada conejo cuatro veces cada dos semanas. Posteriormente, se recolectó la sangre para obtener el antisuero que contenía cada anticuerpo policlonal. Este antisuero fue adicionalmente purificado utilizando un portador de proteína G (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) y reemplazado con PBS para obtener los anticuerpos policlonales contra los polipéptidos de CAPRIN-1 parciales presentes sobre la superficie de las células cancerosas. Además, el suero de un conejo que no recibió antígeno fue purificado utilizando un portador de proteína G, de la misma manera que se describe anteriormente y utilizado como anticuerpos control.

Ejemplo 4. Análisis de la expresión de la proteína CAPRIN-1 sobre la superficie membranal de las células cancerosas En seguida, 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, DA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, y MRK-nu-1) confirmaron tener un alto nivel de expresión del gen de CAPRIN-1, y fueron examinadas para su expresión de las proteínas CAPRIN-1 sobre la superficie celular. 5 x 105 células de cada línea celular de cáncer de mama humano confirmadas de este modo como poseedoras de expresión génica, fueron centrifugadas en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mi. 2 µg (5 µ?) de cada uno de los anticuerpos policlonales contra los péptidos derivados de CAPRIN-1 (SEQ ID No. : 5) preparados como se describe anteriormente en el Ejemplo 3 y 95 µ? de PBS que contenía 0.1% de suero fetal bovino fueron agregados a éste y mezclados, y se dejó reposar por 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, la solución resultante fue mezclada por la adición de 1 µ? de los anticuerpos de cabra anti-IgG de conejo, marcados con Alexa 488 (fabricados por Invitrogen Corp.) y 98 µ? de PBS contenía 0.1% de suero fetal bovino (FBS) y se dejaron reposar por 30 horas sobre hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson y Company) . Por otra parte, se realizó la misma operación que se describe anteriormente utilizando los anticuerpos control preparados como se describe anteriormente en el Ejemplo 3, en vez de los anticuerpos policlonales contra los péptidos derivados de CAPRIN-1 para preparar un control. Como resultado, las células cancerosas son suplementadas con los anticuerpos anti -CAPRIN- 1 mostraron todos intensidad de fluorescencia al menos 35% más fuerte que aquella del control. Esto demostró que las proteínas CAPRIN-1 son expresadas sobre la superficie de la membrana celular de las líneas celulares de cáncer humano. La proporción de aumento en la intensidad de fluorescencia, anteriormente descrita, fue indicada por la proporción del incremento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) en cada línea celular, y calculada de acuerdo a la siguiente expresión: Proporción de incremento en la intensidad de fluorescencia media (Proporción de mejoramiento en la intensidad de fluorescencia) (%) = ( (MFI de las células que reaccionaron con los anticuerpos anti-CAPRIN-1) - (MFI Control) )/ (MFI Control) x 100.

También, fue medida la intensidad de fluorescencia en dos líneas celulares de cáncer de riñon (Caki-1 y Caki-2), una línea celular de cáncer de vejiga (T24) , una línea celular de cáncer de ovario (SKOV3), 2 líneas celulares de cáncer de pulmón (QG56 y A549) , una línea celular de cáncer de próstata (PC3) , una línea celular de cáncer de cérvix uterino (SW756), una línea celular de fibrosarcoma (HT1080) , 2 líneas celulares de tumor cerebral (T98G y U87MG) , una línea celular de cáncer gástrico (MNK28) , 3 líneas celulares de cáncer colorrectal (Lovo, DLD-1, y HCT-116) , y 4 líneas celulares de cáncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, y BxPC-3) utilizando el mismo procedimiento que se describe anteriormente. Como resultado, todas las células cancerosas tuvieron intensidad de fluorescencia al menos 35% más fuerte que aquella del control.

Como con los resultados anteriormente obtenidos, la expresión de la proteína CAPRIN-1 sobre la superficie membranal de las células cancerosas fue también confirmada utilizando el anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1 obtenido en el Ejemplo 2.

Ejemplo 5. Preparación del anticuerpo monoclonal quimérico humano-ratón El fragmento de amplificación génica que comprendió el gen variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1 obtenido en el Ejemplo 2, fue tratado en ambos extremos con enzimas de restricción, luego purificado, e insertado de acuerdo a un método rutinario dentro de un vector de pcADN4/myc-His (fabricado por Invitrogen Corp.) que tiene ya los insertos génicos de una secuencia guía derivada del anticuerpo de ratón, y una región constante de cadena H de IgGi humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 6. También, el fragmento de amplificación génica que comprende el gen de la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1 fue tratado en ambos extremos con las enzimas de restricción, luego purificado, e insertado de acuerdo a un método rutinario dentro de un vector pcADN3.1/myc-His (fabricado por Invitrogen Corp.) que tiene ya los insertos génicos de una secuencia guía derivada de anticuerpo de ratón, y una región constante de cadena L de IgGi humana, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. : 7.

En seguida, el vector recombinante que tenía el inserto génico de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1 y el vector recombinante que tenía el inserto génico de la región variable de cadena ligera, fueron introducidos dentro de las células CH0-K1 (obtenidas de Riken Cell Bank) . Específicamente, 2 x 105 células CH0-K1 fueron cultivadas en 1 mi de medio F12 de Ham (fabricado por Invitrogen Corp.) que contenía 10% de FBS por pozo de una placa de cultivo de 12 pozos, y se lavó con PBS(-) . Luego, 1 mi del medio F12 de Ham fresco que contenía 10% de FBS por pozo, fue agregado a éstos. 250 ng de cada uno de los vectores lisados en 30 µ? de OptiMEM (fabricado por Invitrogen Corp.) se mezclaron con 30 µ? del reactivo de transfección Polyfect (fabricado por Qiagen N.V.), y esta mezcla fue agregada a cada pozo. Las células CH0-K1 contransfectadas con vectores recombinantes fueron cultivadas en un medio F12 de Ham que contenía 10% de FBS suplementado con 200 g/ml de Zeocina (fabricada por Invitrogen Corp.) y 200 µg/ml de Geneticina (fabricada por Roche Diagnostics K.K.) y luego inoculados a una placa de 96 pozos a una densidad de 0.5 células/pozo para preparar las líneas celulares que producen establemente cualquiera de los anticuerpos monoclonales quiméricos #1 de humano-ratón que tienen las regiones variables del anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1, obtenido en el Ejemplo 2.

Cada línea celular preparada fue cultivada por 5 días en un matraz de 150 cm2 a una densidad de 5 x 105 células/ml utilizando 30 mi de un medio OptiCHO libre de suero (fabricado por Invitrogen Corp.) para obtener los sobrenadantes de cultivo que contienen el anticuerpo monoclonal quimérico humano-ratón #1.

También, las líneas celulares que producen establemente anticuerpos comparativos quiméricos de humano-ratón 1 al 26, fueron preparadas como muestras comparativas de la misma manera que se describe anteriormente, respectivamente, utilizando los siguientes anticuerpos comparativos: anticuerpos monoclonales anti -CAPRIN-1 derivados de ratón, descritos en el documento O2010/016526 [un anticuerpo comparativo 1 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No.: 26 (descrito en la presente; lo mismo sucede para la descripción siguiente) y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 27; un anticuerpo comparativo 2 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 28 y una región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 29; un anticuerpo comparativo 3 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 30 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 31; un anticuerpo comparativo 4 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 32 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 33; un anticuerpo comparativo 5 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 34 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 35; un anticuerpo comparativo 6 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 36 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 37; un anticuerpo comparativo 7 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 38 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 39; un anticuerpo comparativo 8 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 40 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 41; un anticuerpo comparativo 9 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 42 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 43; un anticuerpo comparativo 10 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 44 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 45; y un anticuerpo comparativo 11 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No.: 46 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 47] , anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 descritos en el documento WO2011/096517 [un anticuerpo comparativo 12 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No.: 43 (descrito en la presente; lo mismo sucede para la descripción siguiente) y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 47; y un anticuerpo comparativo 13 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 43 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.:], los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 descritos en el documento WO2011/096528 [un anticuerpo comparativo 14 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 43 (descrito en la presente; lo mismo sucede para la descripción siguiente) y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 47; un anticuerpo comparativo 15 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 51 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 55; un anticuerpo comparativo 16 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 59 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 63; un anticuerpo comparativo 17 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 76 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 80; un anticuerpo comparativo 18 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 84 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 88; y un anticuerpo comparativo 19 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 92 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No . : 96] , un anti-CAPRIN-1 anticuerpo monoclonal descrito en el documento WO2011/096519 [un anticuerpo comparativo 20 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No.: 42 (descrito en la presente; lo mismo sucede para la descripción siguiente) y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 46] , los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 descritos en el documento WO2011/096533 [un anticuerpo comparativo 21 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No.: 43; lo mismo sucede para la descripción siguiente) y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 51; un anticuerpo comparativo 22 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 47 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No.: 51; y un anticuerpo comparativo 23 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 63 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 67] , y los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 descritos en el documento O2011/096534 [un anticuerpo comparativo 24 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No.: 43 (descrito en la presente; lo mismo sucede para la descripción siguiente) y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 47; un anticuerpo comparativo 25 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 43 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 51; y un anticuerpo comparativo 26 que tiene la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No. : 63 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No. : 67] . Cada línea celular fue preparada por 5 días en un matraz de 150 cm2 a una densidad de 5 x 105 células/ml utilizando 30 mi de medio OptiCHO libre de suero (fabricado por Invitrogen Corp.) para obtener los sobrenadantes de cultivo que contienen cualquiera de los anticuerpos monoclonales comparativos quiméricos humano-ratón 1 al 26.

Ejemplo 6. Expresión de CAPRIN-1 sobre la superficie de diversas células cancerosas utilizando anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 En seguida, las 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7 , T47D, SK-BR-3, MDA-MB- 157 , BT-20, MDA-MB- 23 IV, y MRK-nu-1), las 2 líneas celulares de cáncer de riñon (Caki-1 y Caki-2) , la línea celular de cáncer de vejiga (T24), la línea celular de cáncer de ovario (SKOV3), las 2 líneas celulares de cáncer pulmonar (QG56 y A549) , la línea celular de cáncer de próstata (PC3), la línea celular de cáncer de cérvix uterino (S 756) , la línea celular de fibrosarcoma (HT1080) , las 2 líneas celulares de tumor cerebral (T98G y U87MG) , la línea celular de cáncer gástrico (MNK28), las 3 líneas celulares de cáncer colorrectal (Lovo, DLD-1, y HCT-116), y las 4 líneas celulares de cáncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, y BxPC-3) confirmaron tener expresión del gen CAPRIN-1 y fueron examinadas para su expresión de las proteínas CAPRIN-1 sobre la superficie celular utilizando los sobrenadantes de cultivo que contenían el anticuerpo anti -CAPRIN- 1 #1 obtenido en el Ejemplo 2. 106 células de cada línea celular fueron centrifugadas en cada tubo para microcentrí fuga de 1.5 mi. Cada sobrenadante de cultivo (100 µ? ) que contenía el anticuerpo fue agregado al tubo y se dejó reposar por 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, el anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con FITC (H + L) (fabricados por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluido con PBS que contenía 0.1% de FBS fue agregado a éste y se dejaron reposar a 4°C por 30 minutos. Después del lavado con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) . El control negativo utilizado fueron las células que reaccionaron únicamente con los anticuerpos secundarios. Como resultado, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 #1 mostró reactividad con intensidad de fluorescencia al menos 30% más fuerte que aquella del control negativo. Esto demostró que las proteínas CAPRIN-1 son expresadas sobre la superficie de membrana celular de la línea celular de cáncer humano. La proporción de aumento anteriormente mencionada en la intensidad de fluorescencia, fue indicada por la proporción de incremento en la intensidad de fluorescencia media (MFI ) en cada línea celular y calculada de acuerdo a la siguiente expresión: Proporción de incremento en la intensidad de fluorescencia media (Proporción de mejoramiento en la intensidad de fluorescencia) (%) = (MFI de las células que reaccionaron con los anticuerpos anti-CAPRIN-1) - (MFI Control) / (MFI Control) x 100.

Ejemplo 7. Actividad antitumoral contra células cancerosas del anticuerpo contra el péptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID No . : 5) Con el fin de evaluar cada anticuerpo contra el péptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID No. : 5) para la fuerza de su citotoxicidad contra las células cancerosas que expresan CAPRIN-1, fue determinada la actividad de ADCC. Los anticuerpos policlonales contra el péptido (SEQ ID No.: 5), preparado en el Ejemplo 3, fueron utilizados en esta evaluación. Una evaluación similar fue conducida utilizando los anticuerpos policlonales contra otros péptidos derivados de CAPRIN-1 humana (anticuerpos policlonales contra los residuos de aminoácidos números 50 al 98 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. :2 de CAPRIN-1 humana y los anticuerpos policlonales contra los residuos de aminoácidos números 233 al 305, que fueron preparados en el Ejemplo 3) como los anticuerpos que van a ser comparados, y los anticuerpos control derivados de suero de conejo preparados en el Ejemplo 3 como un control negativo. 106 células cada una de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231V, la línea celular de cáncer colorrectal humano DLD-1, la línea celular de cáncer pancreático humano Capan-2, y la línea celular de cáncer pulmonar humano QG56 que confirmaron tener la expresión de CAPRIN-1, fueron recolectadas dentro de un tubo de centrifuga de 50 mi, al cual se agregaron luego 100 µ?? de cromo 51, seguido por incubación a 37°C por 2 horas. Posteriormente, las células fueron lavadas tres veces con un medio RPMI1640 que contenía 10% de suero fetal de ternera y se agregaron una densidad de 2 x 103 células/pozo a cada placa de 96 pozos con fondo en forma de V. Los anticuerpos policlonales contra el péptido derivado de CAPRIN-1 humano (SEQ ID No.: 5) y dos tipos de anticuerpos policlonales contra otros péptidos derivados de CAPRIN-1 humana (anticuerpos policlonales contra los residuos de aminoácidos números 50 al 98 en la SEQ ID No. : 2 de CAPRIN-1 humana y los anticuerpos policlonales contra los residuos de aminoácidos números 233 al 305) como se describió anteriormente, fueron separadamente agregados a éstos a una concentración de 1 µg/pozo. Los linfocitos separados de la sangre periférica de humano de acuerdo a un método rutinario fueron luego agregados a éstos a una densidad de 4 x 105 células/pozo y cultivados a 37°C por 4 horas bajo condiciones de 5% de C02. Después del cultivo, se midió la cantidad de cromo (Cr) 51 liberado de las células cancerosas dañadas, en el sobrenadante de cultivo para calcular la actividad de ADCC contra las células cancerosas de los anticuerpos policlonales contra cada péptido derivado de CAPRIN-1 humana. Como resultado, todos los anticuerpos policlonales obtenidos mediante la inmunización con los 3 péptidos parciales de CAPRIN-1 humana que tienen una secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos números 50 al 98 o los residuos de aminoácidos números 233 al 305 de la SEQ ID No. : 2 de la CAPRIN-1 humana tuvieron actividad menor de 8% contra la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231V, la línea celular de cáncer colorrectal humano DLD-1, la línea celular cáncer pancreático humano Capan-2, y la línea celular de cáncer pulmonar humano QG56. En contraste, los grupos suplementados con los anticuerpos policlonales contra el péptido derivado de CAPRIN- 1 humano (SEQ ID No. : 5) confirmó que tiene 27% o más actividad citotóxica contra todas las líneas de células cancerosas. Los anticuerpos control negativo tuvieron actividad menor de 5% contra todas las células cancerosas. Estos resultados demostraron que el anticuerpo contra CAPRIN-1 mostrado en la SEQ ID No.: 5 ejerce fuerte actividad citotóxica contra las células cancerosas que expresan CAPRIN-1.

Estos resultados respecto a la actividad citotóxica fueron obtenidos mediante: el mezclado del anticuerpo contra CAPRIN-1 utilizado en la presente invención, linfocitos, y 2 x 103 células de cada línea de células cancerosas con el cromo 51 incorporado, como se describe anteriormente: el cultivo de las células por 4 horas; después del cultivo, la medición de la cantidad de cromo 51 liberado hacia el medio; y el cálculo de la actividad citotóxica contra cada línea de células cancerosas de acuerdo a la siguiente expresión* : *Expresión: Actividad citotóxica (%) = Cantidad de cromo 51 liberado de las células objetivo suplementadas con el anticuerpo contra CAPRIN-1 y linfocitos/Cantidad de cromo 51 liberado de las células objetivo suplementadas con ácido clorhídrico 1 N X 100.

El anticuerpo monoclonal quimérico humano-ratón obtenido en el Ejemplo 5 fue evaluado para su actividad citotóxica contra las células cancerosas humanas. El sobrenadante de cultivo de cada línea celular que produce cualquiera de los anticuerpos fue purificado utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). Después del reemplazo con PBS(-), la solución fue filtrada a través de un filtro de 0.22-µ?t? (fabricado por Millipore Corp.) . El anticuerpo resultante fue utilizado para el ensayo de actividad. 106 células de cada una de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231V, la línea celular de cáncer colorrectal humano DLD-1, la línea celular de cáncer pancreático humano Capan-2, y la línea celular de cáncer pulmonar humano QG56 fueron recolectadas dentro de un tubo para centrífuga de 50 mi, al cual se agregaron luego 100 µ€? de cromo 51, seguido por la incubación a 37°C por 2 horas. Posteriormente, las células fueron lavadas tres veces con un medio RPMI1640 que contenía 10% de FBS y se agregaron a una densidad de 2 x 103 células/pozo a cada placa de 96 pozos con fondo en V para preparar las células objetivo. Los anticuerpos purificados (anticuerpo quimérico humano-ratón anti-CAPRIN-1 #1) y los anticuerpos monoclonales comparativos quiméricos humano-ratón 1 al 26 obtenidos en Ejemplo 5, fueron cada uno agregados a éstos, a una concentración de 0.75 µ9/ ???. Una población celular que contenía las células NK humanas fue separada utilizando un método rutinario a partir de los linfocitos de sangre periférica humana preparados de acuerdo a un método rutinario. La población celular que contenía las células NK humanas, que fue utilizada en esta evaluación, fue preparada como sigue: las células mononucleares de sangre periférica humana separadas utilizando una solución de separación por gravedad específica Histopaque para la separación de las células mononucleares de sangre periférica (Sigma-Aldrich Corp.) se hicieron reaccionar con los anticuerpos marcados con el colorante fluorescente FITC (anticuerpo anti-CD3 humano, anticuerpo anti-CD20 humano, anticuerpo anti-CD19 humano, anticuerpo anti-CDllc humano, o anticuerpo anti-HLA-DR (Becton, y Dickinson and Company) ) , y una población celular que contenía las células NK no teñidas, con los anticuerpos, fue separada utilizando un clasificador celular (FACS Vantage SE (Becton, y Dickinson and Company) ) o el kit de separación de células NK humanas (fabricado por Miltenyi Biotec ?.?.) . La población de células separadas que contenían las células , fue agregada a la placa a una densidad de 2 X 105 células/pozo y cultivada a 37°C por 4 horas bajo condiciones de 5% de CO2. Después del cultivo, se midió la cantidad de cromo 51 liberada de las células tumorales dañadas, en el sobrenadante de cultivo para calcular la actividad citotóxica de cada anticuerpo anti -CAPRIN-1 contra las células cancerosas. El control negativo utilizado fue las células suplementadas con los anticuerpos control isotipo. Como resultado, los anticuerpos control isotipo utilizados tuvieron actividad citotóxica de menos de 5% contra toda las líneas de células cancerosas, y los anticuerpos monoclonales comparativos quiméricos humano-ratón 1 al 26 utilizados, tuvieron actividad citotóxica menor de 5% contra DA-MB-231V, menor de 8% contra DLD-1, menor de 10% contra Capan-2, y menor de 10% contra QG56. En contraste, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-ratón #1 tuvo actividad citotóxica de 12% o mayor contra MDA-MB-231V, 22% o mayor contra DLD-1, 28% o mayor contra Capan-2, y 21% o mayor contra QG56. De igual modo, los anticuerpos control isotipos utilizados en los anticuerpos comparativos 1 al 26 utilizados, tuvieron actividad citotóxica menor de 4% contra todas las otras células cancerosas, líneas celulares de cáncer de mama T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MCF7, y MRK-nu-1, una línea celular de glioma T98G, una línea celular de cáncer pulmonar A549, una línea celular de cáncer de riñon Caki-1, una línea celular de cáncer de cérvix uterino SW756, una línea celular de cáncer de vejiga T24, una línea celular de cáncer gástrico MKN28, una línea celular de cáncer colorrectal SW480, una línea celular de leucemia AML5 , y una línea celular de linfoma Ramos. En contraste, el anticuerpo monoclonal quimérico humano-ratón fue confirmado como poseedor del 10% o más de actividad citotóxica contra estas líneas celulares. Estos resultados mostraron que los anticuerpos contra el péptido derivado de CAPRIN-1 mostrado en la SEQ ID No.: 5 dañan las células cancerosas que expresan CAPRIN-1 a través de su acción de ADCC, y demostraron que el anticuerpo monoclonal quiméricos humano-ratón #1 muestra actividad citotóxica más fuerte contra las células cancerosas humanas que aquella de los anticuerpos comparativos 1 al 26.

Estos resultados respecto a la actividad citotóxica fueron obtenidos mediante: el mezclado del anticuerpo contra CAPRIN-1 utilizado en la presente invención, linfocitos (población celular que contiene células NK) , y 2 x 103 células de cada línea de células cancerosas con el cromo 51 incorporado, como se describe anteriormente: el cultivo de las células por 4 horas; después del cultivo, la medición de la cantidad de cromo 51 liberado hacia el medio; y el cálculo de la actividad citotóxica contra cada línea de células cancerosas de acuerdo a la siguiente expresión* : *Expresión: Actividad citotóxica (%) = Cantidad de cromo 51 liberado de las células objetivo suplementadas con el anticuerpo contra CAPRIN-1 y linfocitos (población celular que contiene células NK) /Cantidad de cromo 51 liberado de células objetivo suplementadas con ácido clorhídrico 1 N x 100.

Ejemplo 8. Número de moléculas de CAPRIN-1 sobre la superficie de diversas células cancerosas reconocidas por el anticuerpo anti-CAPRIN- 1 #1 Una línea celular de cáncer de mama humano (MDA-MB- 23IV) , una línea celular de cáncer de riñon (Caki-1) , una línea celular de cáncer de vejiga (T24), una línea celular de cáncer de ovario (SKOV3), las líneas celulares de cáncer pulmonar (QG56 y A549) , una línea celular de cáncer pancreático (Capan-2) , una línea celular de cáncer de próstata (PC3) , una línea celular de cáncer de cérvix uterino (SW756) , una línea celular de fibrosarcoma (HT1080) , una línea celular de tumor cerebral (T98G) , una línea celular de cáncer gástrico (MKN28) , las líneas celulares de cáncer colorrectal (Lovo y DLD-1) , una línea celular de leucemia (AML5) , y una línea celular linfoma (Ramos) fueron examinadas utilizando un kit de ensayo "QIFIKIT" para el número de moléculas (fabricado por Dako Japan Inc.) para el número de moléculas de CAPRIN-1 sobre su superficie celular, reconocidas por el anticuerpo anti -CAPRIN-1 #1. De manera similar, el número de moléculas CAPRIN-1 sobre la superficie de estas diversas células cancerosas fue también examinado utilizando los anticuerpos monoclonales comparativos anti-CAPRIN-1 1 al 26 preparados en el Ejemplo 5.

De acuerdo al protocolo anexo al kit, cada anticuerpo (anticuerpos anti-CAPRIN-1 #1 y anticuerpos comparativos 1 al 26) fue diluido en 5 g/ml (en términos de concentración final) con PBS, y esta dilución fue agregada a cada línea celular y se hizo reaccionar por 30 minutos. Después del lavado con PBS, los anticuerpos anti-IgG de ratón, marcados fluorescentemente, acoplados al kit fueron agregados como anticuerpos secundarios, junto con las esferas de calibración anexas al kit, a cada línea celular y se dejaron reposar por 45 minutos sobre hielo. Cada línea celular y las esferas de calibración fueron lavadas con PBS. Posteriormente, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) para obtener un valor de intensidad de fluorescencia media (valor medio) . También, se obtuvo un valor (medio) de la intensidad de fluorescencia media mediante el mismo ensayo que se describe anteriormente para los anticuerpos comparativos. El control negativo utilizado fue las células que reaccionaron con los anticuerpos control isotipo, y se obtuvo también una media. Cada valor (medio) de intensidad de fluorescencia media fue utilizado para calcular el número de moléculas de acuerdo al protocolo anexo al kit. Como resultado, el número de moléculas de CAPRIN-1 sobre la superficie de las diversas células cancerosas reconocidas por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 y los anticuerpos comparativos 12 al 26 fue de 105 o más por célula para todas las líneas celulares de cáncer humano, examinadas. Por otra parte, el número de moléculas reconocidas por los anticuerpos comparativos 1 al 11 fue menor de 105 por célula.

Aplicabilidad Industrial El anticuerpo de la presente invención es útil para el tratamiento y/o prevención del cáncer.

Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas aquí son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, caracterizado porque tiene reactividad inmunológica con un polipéptido de CAPRIN-1 parcial que consiste de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID No. : 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos.

2. El anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene actividad citotóxica contra una célula cancerosa que expresa una proteína CAPRIN-1.

3. El anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal .

4. El anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena simple, o un anticuerpo multiespecífico .

5. El anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende las regiones de determinación de la complementariedad de las SEQ ID Nos: 8, 9, y 10 (CDR1, CDR2 , y CDR3 , respectivamente) y una región variable de cadena ligera que comprende las regiones de determinación de la complementariedad de las SEQ ID Nos: 12, 13, y 14 (CDR1, CDR2 , y CDR3 , respectivamente) y tiene reactividad inmunológica con la proteína CAPRIN-1.

6. El anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque está conjugado con un agente antitumoral .

7. Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, caracterizada porque comprende un anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como un ingrediente activo.

8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñon, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer del cérvix uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma, o melanoma.

9. Un fármaco de combinación para el tratamiento y/o prevención del cáncer, caracterizado porque comprende una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7 u 8 y una composición farmacéutica que comprende un agente antitumoral .

10. Un ADN, caracterizado porque codifica un anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Un método para tratar y/o prevenir el cáncer, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo o el fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7 ó 8, o un fármaco en combinación de conformidad con la reivindicación 9, a un sujeto.