MX2014009091A - Inmunogenos para vacunacion contra vih. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos inmunógenos basados en péptidos solapantes (OLP) y péptidos derivados de los mismos útiles para la prevención y tratamiento de SIDA y sus enfermedades oportunistas relacionadas. La invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados, vectores y células huésped que expresan estos inmunógenos así como vacunas que incluyen dichos inmunógenos.

Description

INMÜNOGENOS PARA VACUNACIÓN CONTRA VIH Campo de la Invención La presente invención se refiere a nuevos inmunógenos basados en péptidos solapantes (OLP, por sus siglas en inglés) y péptidos derivados de los mismos. También se refiere a ácidos nucleicos aislados que expresan estos inmunógenos asi como a vectores y células que comprenden tales ácidos nucleicos. Los compuestos de la presente invención son útiles como vacunas, particularmente para la prevención y tratamiento de SIDA y enfermedades oportunistas .

Antecedentes de la Invención La infección por VIH induce respuestas de células T restringidas por HLA de clase I, fuerte y ampliamente dirigida, para las que se han implicado epitopos específicos y alelos de HLA restrictivos en el control relativo in vivo. Véase, Brander C, et al., Current Opinión Immunol. 2006; 18:1-8. Mientras que el grueso de la respuesta de LTC antivírica parece estar restringida por HLA-B, la contribución relativa de regiones víricas diana y moléculas de HLA restrictivas en la eficacia de estas respuestas permanece oscura. Véase, Kiepiela P, et al., Nature 2004; 432:769-775 y Ngumbela K, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 2008; 24:72-82.

Además, el papel que la diversidad de secuencia de VIH desempeña en la relevancia i n vivo de la inmunidad de células T específica de virus no está claro, ya que las restricciones funcionales de las variantes de escape, el uso de codones en posiciones de proteínas individuales, plasticidad y avidez funcional del receptor de células T (TCR) y la potencial reactividad cruzada pueden contribuir a la eficacia global de una respuesta de células T específica. Véase, Brockman M, et al., J. Virol. 2007; 81: 12608-12618 y Yerly D, et al., J. Virol. 2008; 82:3147-3153. De importancia, las respuestas de células T a Gag de VIH se han asociado más consistentemente con cargas víricas reducidas en cohortes infectadas tanto por el ciado B como por el ciado C de VIH. Véase, Zuñiga R, et al., J. Virol. 2006; 80:3122-3125 y Kiepiela P, et al., Nat . Med. 2007; 13:46-53.

Sin embargo, ninguno de estos análisis evaluó el papel de respuestas a regiones más cortas de proteína (s) objetivo que pueden inducir respuestas particularmente eficaces. Además, no está claro si el beneficio relativo de Gag es debido a cualquier otra característica específica de esta proteína, tal como los niveles de expresión, composición de aminoácidos e inmunogenicidad inherentemente mayor. Por tanto, es factible que se pudieran identificar subunidades proteicas fuera de Gag y dentro de estas, regiones ricas en epítopos, cortas, específicas que: i) inducen respuestas predominantemente vistas en controladores de VIH y ii) que serían detectables en individuos de diversos tipos de HLA, no limitadas a individuos que expresan alelos previamente asociados con control vírico eficaz.

Mientras que algunos de los estudios anteriores han controlado de hecho una potencial sobrerrepresentación de epítopos derivados de Gag presentados en alelos de clase I "buenos", permanecen las preocupaciones de que vacunas contra VIH basadas puramente en Gag podrían beneficiar principalmente a aquellas personas con un genotipo de HLA ventajoso y no tendrían ventaja de dianas potencialmente beneficiosas fuera de Gag. Véase, Kiepiela, 2007, anteriormente y Honeyborne I, et al., J. Virol. 2007; 81:3667-3672. Además, los estudios de escape de LTC e idoneidad vírica se han limitado en gran parte a epítopos derivados de Gag presentados en el contexto de alelos de HLA relativamente protectores tales como HLA-B57 y -B27. Véase, Schneidewind A, et al., J. Virol. 2007; 81:12382-12393 y Leslie A, et al., Nat . Med. 2004; 10:282-289. La información disponible puede, por tanto, no proporcionar información relevante para secuencias inmunógenas diseñadas para proteger a la mayoría genéticamente diversa de la población huésped humana.

Además, muchos estudios se han enfocado en las dianas inmunodominantes solo, a pesar de algunos estudios recientes en infección por VIH y VIS que demuestran una contribución crucial de respuestas subdominantes en el control vírico in vivo, entre ellas dianas situadas fuera de Gag. Véase, Frahm N, et al., Nat. Immunol. 2006; 7:173-178 y Friedrich T, efc al., J. Virol. 2007; 81:3465-3476. En conjunto, la visión actual sobre qué puede constituir un respuesta inmunitaria celular protectora a VIH está por tanto bastante probablemente sesgada hacia un enfoque en las respuestas inmunodominantes y en respuestas restringidas por alelos de HLA de clase I frecuentes y alelos de HLA asociados con desenlace de la enfermedad superior. Por tanto, el desarrollo de vacunas contra VIH está limitado en parte por la falta de inmunógenos capaces de inducir una respuesta inmunitaria amplia. La presente invención aborda el diseño de tales inmunógenos.

Sumario de la Invención En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias SEQ ID NO 1-16 o variantes de dichas SEQ ID NO: 1-16, en donde cada una de dichas variantes tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos, siempre que dicha secuencia de aminoácidos no comprenda ningún tramo de secuencia derivado del genoma de VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferentes de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO 1-16 o las variantes de las mismas.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas en donde dicha variante tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos, siempre que: i) dicha secuencia de aminoácidos inmunógena no comprenda ningún tramo de secuencia derivado del genoma de VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferentes de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO 1-16 o una variante o un fragmento de las mismas, y ii) cuando el inmunógeno comprende solo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16, entonces esta secuencia no se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 5, 6 y 16.

En aspectos adicionales, la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican los inmunógenos del primer aspecto y segundo aspecto, y a casetes de expresión, vectores, virus y células que comprenden dichos ácidos nucleicos .

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende un polipéptido inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y uno o más adyuvantes .

En otro aspecto, la presente invención se refiere al polipéptido inmunógeno, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus o la célula del tercer aspecto, o la composición vacuna para su uso en medicina .

En otro aspecto, la presente invención se refiere al polipéptido inmunógeno, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus o la célula del tercer aspecto, o la composición vacuna para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección por VIH o una enfermedad asociada con una infección por VIH.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende el inmunógeno del primer aspecto y/o segundo aspecto, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus o la célula del tercer aspecto, o la composición del cuarto aspecto.

Depósito de Microorganismo El plásmido 298H GMCSF-HIVACAT DNA se depositó el 13 de enero, 2012, con el número de acceso DSM 25555 en la DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Inhoffenstrañe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una representación esquemática del gen incluido en el plásmido de expresión. Los puntos identifican los codones de inicio y terminación.

Las Figuras 2a y 2b se refieren a las respuestas inmunitarias celulares analizadas en mezclas de esplenocitos por análisis de citometria de flujo. Se muestran la frecuencia de respuestas de interferón gamma especificas de Gag, Pol y Nef-Tat-Vif total entre los grupos en (Figura 2a) y la distribución de respuestas CD4 y CD8 en (Figura 2b) .

La Figura 3 se refiere a las respuestas a Gag, Pol, NTV y la secuencia de inmunógeno de células T HIVACAT medidas por ensayo ELISpot de interferón gamma en esplenocitos murinos . Los ratones individuales se inmunizaron con los plásmidos que codifican para Gag, Pol completas y el polipéptido Nef-Tat-Vif. Se muestra la contribución de las respuestas que se dirigen a las regiones incluidas en el inmunógeno de célula T HIVACAT respecto a la respuesta especifica de Gag-Pol-NTV de interferón gamma total.

Las Figuras 4a y 4b se refieren a la comparación de la amplitud en (Figura 4a) y magnitud en (Figura 4b) de las respuestas de interferón gamma que se dirigen al inmunógeno de células T HIVACAT en ratones inmunizados. Los sujetos se trataron con los plásmidos que codifican las proteínas completas o la secuencia de células T mínima.

Las Figuras 5a y 5b se refieren al equilibrio de respuestas de interferón gamma contra Gag, Pol, Vif o Nef para ratones inmunizados con 20 g de plásmidos que codifican Gag, Pol enteras más polipéptido Nef-Tat-Vif e inmunógeno de células T HIVACAT. El dominio de las respuestas específicas de Gag se muestra en el panel (Figura 5a) para ratones inmunizados con proteínas completas mientras que se ve un repertorio más equilibrado en el panel (Figura 5b) para ratones inmunizados con el inmunógeno de células T HIVACAT.

Las Figuras 6a a 6c se refieren a anticuerpos de unión a p24, p37 y p55 detectados por inmunotransferencia usando extractos celulares de células HEK 293 transíectadas con 1 mg de los vectores de expresión de gag y gag-pol (muestra p55 gag y las subunidades de gag p24, p37 y p55 procesadas) separadas en SDS-PAGE al 12% y ensayando las membranas con Figura 6a) suero humano de un paciente infectado por VIH, Figura 6b) mezcla de sueros de ratones inmunizados con altas dosis del inmunogeno y Figura 6c) mezcla de sueros de ratones inmunizados con bajas dosis del inmunogeno (todos a una dilución 1:100).

Las Figuras 7a y 7b se refieren: Figura 7a) Títulos finales de anticuerpo de unión específico de Gag-p24 de ratones tratados. La determinación se realizó mediante ELISA de muestras individuales de mezclas de suero diluidos 4 veces en serie. Figura 7b) ELISA de gag p55 desarrollado internamente usando la proteína recombinante VIH-1IIIB pr55 Gag (No. de catálogo 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, EE UU) . La determinación se realizó en sueros de ratones individuales a una dilución 1:100.

Las Figuras 8a a 8d se refieren: Figura 8a) Representación esquemática de inmunizaciones de ratones. Se usaron grupos de seis ratones C57BL/6 para comparar la inmunogenicidad de diferentes combinaciones heterólogas (sensibilización de 2xADN frente a sensibilización de 3xADN seguido por refuerzo de lxMVA) usando bien 100 µg de pDNA-HIVACAT o 10A6 ufp de VA-HIVACAT mediante inyección intramuscular. Figura 8b) Comparación de la amplitud y magnitud de las respuestas de IFNy dirigidas al inmunogeno de células T HIVACAT en ratones inmunizados individuales. Figura 8c) Distribución de las respuestas específicas a Gag, Pol, Vif y Nef en ratones inmunizados individuales.

Figura 8d) Se muestra la distribución entre 8 subunidades de proteina incluidas en el inmunógeno de células T HIVACAT (Gag pl7, Gag p24, Gag p2p7plp6, Pol-proteasa , Pol-RT, Pol-integrasa, Vif y Nef) en diferentes grupos de inmunización Descripción Detallada de la Invención La invención divulga varios compuestos inmunógenos eficaces para inducir una respuesta inmunitaria alta contra VIH en una amplia gama de sujetos. En particular, se han obtenido respuestas de células T CD4+ y CD8+ especificas de VIH para epitopos clave codificados por VIH con estos compuestos . 1. Definiciones de términos y expresiones generales El término "adyuvante", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente inmunológico que modifica el efecto de un inmunógeno, mientras que tiene pocos, si alguno, efectos directos cuando se administra por si mismo. Con frecuencia se incluye en vacunas para aumentar la respuesta inmunitaria del receptor al antigeno suministrado, al tiempo que mantiene el material exógeno inyectado a un mínimo. Los adyuvantes se añaden a las vacunas para estimular la respuesta del sistema inmunitario al antígeno diana, pero no confieren inmunidad por sí mismos. Ejemplos no limitantes de adyuvantes útiles incluyen sales minerales, polinucleótidos , poliargininas , ISCOM, saponinas, monofosforil lípido A, imiquimod, inhibidores de CCR5, toxinas, polifosfacenos, citoquinas, proteínas inmunorreguladoras , proteínas de fusión inmunoestimuladoras, moléculas coestimuladoras y combinaciones de los mismos. Las sales minerales incluyen, pero no están limitadas a, A1K(S04)2, AlNa(S04)2, A1NH4(S04), sílice, alumbre, A1(0H)3, Ca3(P0 )2, caolín o carbono. Los polinucleótidos inmunoestimuladores útiles incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos de CpG con o sin complejos inmunoestimuladores (ISCOM), oligonucleótidos de CpG con o sin poliarginina, ácidos poli IC o poli AU . Las toxinas incluyen toxina del cólera. Las saponinas incluyen, pero no están limitadas a, QS21, QS17 o QS7. Un ejemplo de una proteina de fusión inmunoestimuladora útil es la proteína de fusión de IL-2 con el fragmento Fe de inmunoglobulina . Las moléculas inmunorreguladoras útiles incluyen, pero no están limitadas a, CD40L y ligando CDla. Las citoquinas útiles como adyuvantes incluyen, pero no están limitadas a, IL-1, IL-2, IL-4, GMCSF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-OÍ, IFN-ß e interferón gamma. Además, ejemplos de muramil dipéptidos, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominado nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- ( 112 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina (CGP 19835A, también denominado MTP- PE), RIBI (MPL+TDM+CWS ) en una emulsión al 2 por ciento de escualeno/TWEEN® 80, lipopolisacáridos y sus varios derivados, incluyendo lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund, Adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU) , cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella , Titermax, Quil A, ALUN, derivados de lípido A, derivados de la toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, derivados de MPL, matrices de péptidos sintéticos o GMDP, Montanide ISA-51 y QS-21, oligonucleótido CpG, poli I:C y GMCSF. Véase, Osol A., Ed., Remington ' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co . , Easton, PA, EE UU, 1980, pp. 1324-1341), Hunter R, US 5.554.372 y Jager E, Knuth A, WO1997028816. También se pueden usar combinaciones de adyuvantes.

El término "SIDA", como se usa en el presente documento, se refiere a la fase sintomática de la infección por VIH, e incluye tanto el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (comúnmente conocido como SIDA) como "ARC", o complejo relacionado con SIDA. Véase, Adler , et al., Brit. Med. J. 1987; 294: 1145-1147. Las manifestaciones inmunológicas y clínicas del SIDA se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, infecciones oportunistas y cánceres resultantes de la inmunodeficiencia .

El término "enlazador aminoácido", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos diferente de la que aparece en una posición particular en la proteína natural y en general se diseña para ser flexible o para interponer una estructura, tal como una hélice entre dos grupos proteicos. Un enlazador también se denomina un espaciador. El enlazador es típicamente no antigénico y puede tener esencialmente cualquier longitud (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos) . El enlazador también puede ser una localización o secuencia donde la maquinaria de procesamiento de antígenos celular pueda iniciar la degradación del polipéptido inmunógeno sin destruir epítopos de células T potentes) .

El término "sitio de mutación de resistencia antirretroviral" , como se usa en el presente documento, se refiere a un sitio que, cuando se muta, confiere resistencia a un agente antirretroviral. Tales sitios se pueden identificar buscando en bases de datos conocidas tal como la base de datos de resistencia a fármacos de VIH de la Universidad de Stanford, donde, por ejemplo, se pueden recuperar secuencias y tratamientos de virus con mutaciones especificas o datos de susceptibilidad a fármacos para aislados con mutaciones seleccionadas. Véase, Dong J, US 20040106136 y Shafer R, Assay for Antiretroviral Resistance, HIV InSite Knowledge Base Chapter (http : / /hivinsite . ucsf . edu/ InSite?page=kb-02- 02-03 , Enero 2012) . Los sitios de resistencia antirretroviral ya conocidos en VIH son publicados regularmente por la Organización Mundial de la Salud o la Sociedad Antivirica Internacional-USA (por ejemplo, Johnson V, et al., ISA-USA Topics Antiviral Med. 2011; 19(4) : 153-164.

La expresión "respuesta inmunitaria celular", como se usa en el presente documento, describe una respuesta inmunitaria contra antigeno (s) exógeno(s) que está mediada por células T y sus productos de secreción.

El término "secuencia centro del árbol" o "COT", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de la que la distancia evolucionaría media a cada punta de un diagrama filogenético de secuencias variantes relacionadas se ha minimizado. Véase, Nickle D, et al., Science 2003; 299, 1515-1517.

El término "codón optimizado", como se usa en el presente documento, se refiere al cambio de codones en moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso de codones típico del organismo huésped sin cambiar el polipéptido codificado por el ADN, para mejorar la expresión. Se han descrito previamente una plétora de métodos y herramientas informáticas para la optimización de codones . Véase, Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69 ( 12 ): 7250-7253, Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(1) :18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39 (50) : 15399-15409, y Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2) : 252-2.

El término "comprender" o "comprende", como se usa en el presente documento, divulga también "consistir en" según la práctica de patente generalmente aceptada.

La expresión "enfermedad asociada con una infección por VIH", como se usa en el presente documento, incluye un estado en el que el sujeto ha desarrollado SIDA, pero también incluye un estado en el que el sujeto infectado con VIH no ha mostrado ningún signo o síntoma de la enfermedad. Por tanto, la vacuna de la invención cuando se administra a un sujeto que no tiene signos clínicos de la infección puede tener actividad preventiva, ya que pueden prevenir el inicio de la enfermedad. Las composiciones inmunogénicas son capaces de prevenir o retrasar la infección y destrucción de células T CD4+ sanas en tal sujeto. También se refiere a la prevención y retraso del inicio de los síntomas de la enfermedad de inmunodeficiencia adquirida tales como recuento de células T CD4+ extremadamente bajo e infecciones repetidas por patógenos oportunistas tales como Mycobacteria spp., Pneumocystis carinii, y Pneumocystis cryptococcus . Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a, un aumento en el recuento de células T CD4+ indiferenciadas absoluto (intervalo 10-3520), un aumento en el porcentaje de células T CD4+ sobre las células inmunitarias circulantes totales (intervalo 1-50 por ciento) y/o aumento en el recuento de células T CD4+ como porcentaje del recuento de células T CD4+ normales en un sujeto sin infectar (intervalo 1-161 por ciento) .

Los términos "variante" o "fragmento", como se usan en el presente documento, se refieren a un polipéptido derivado de cualquiera de las SEQ ID NO 1-16 por deleción de uno o más aminoácidos terminales en el extremo N o en el extremo C de una SEQ ID NO individual. Las variantes o fragmentos preferiblemente tienen una longitud de al menos 8 aminoácidos o de hasta el 10%, hasta el 20%, hasta el 30%, hasta el 40%, hasta el 50%, hasta el 60%, hasta el 70%, hasta el 80%, hasta el 90% o hasta el 99% de su respectiva SEQ ID NO.

El término "genoma de VIH" como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ARN de aproximadamente 8749 nucleótidos de longitud encerrado por la cápside de VIH y que codifica los genes gag, pol, env, tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, vpx, y opcionalmente tev. La secuencia genómica de VIH subyace a una alta variabilidad, por esta razón, el genoma de VIH a que se hace referencia en la presente invención no está limitado a ninguna secuencia especifica. Las secuencias preferidas son las de los tipos y subtipos de VIH enumerados en el presente documento .

El término "virus de la inmunodeficiencia humana" o "VIH", como se usa en el presente documento, se refiere a virus de la inmunodeficiencia humana en general e incluye VIH de tipo 1 ("VIH-1"), VIH de tipo 2 ("VIH-2") u otros virus VIH, incluyendo, por ejemplo, el VIH-1, VIH-2, VIH emergente y otros subtipos de VIH y variantes de VIH, tales como variantes ampliamente dispersadas o geográficamente aisladas y virus de la inmunodeficiencia simia ("VIS") . Por ejemplo, se puede determinar una secuencia génica vírica ancestral para los genes env y gag de VIH-1, tal como los subtipos de VIH-1, A, B, C, D, E, F, G, H, J y K y recombinantes intersubtipo tales como AG, AGI y para grupos M, N, 0, o para virus VIH-2 o subtipos de VIH-2 A o B. VIH-1, VIH-2 y VIS incluyen, pero no están limitados a, partículas víricas extracelulares y las formas de los virus asociadas con sus células infectadas respectivas.

La "respuesta inmunitaria humoral", como se usa en el presente documento, describe una respuesta inmunitaria contra antígeno(s) exógeno(s) gue está mediada por anticuerpos producidos por células B.

El término "composición inmunogénica" , como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que induce una respuesta inmunitaria en un sujeto que produce anticuerpos o respuestas inmunitarias celulares contra un inmunógeno específico.

El término "polipéptido inmunógeno" o "inmunógeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria adaptativa (es decir, una respuesta inmunitaria humoral o celular) si se inyecta por sí misma o con un adyuvante .

El término "kit", como se usa en el presente documento, se refiere a una combinación de artículos que facilita un proceso, método o aplicación. Estos kits proporcionan los materiales necesarios para llevar a cabo la aplicación descrita en la presente invención.

El término "operativamente unido", como se usa en el presente documento, significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a secuencia (s) reguladora ( s ) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped) . Véase, Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43.

El término "etiqueta peptidica" o "etiqueta", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido o secuencia de aminoácidos, que se puede usar en el aislamiento o purificación de dicho inmunógeno. Por tanto, dicha etiqueta es capaz de unirse a uno o más ligandos, por ejemplo, uno o más ligandos de una matriz de afinidad tal como un soporte de cromatografía o bola con alta afinidad. Ejemplo ilustrativos, no limitantes de etiquetas útiles para el aislamiento o purificación de una proteína incluyen la etiqueta Arg, la etiqueta FLAG, la etiqueta His o la etiqueta Strep; un epítopo capaz de ser reconocido por un anticuerpo, tal como una etiqueta c-myc (reconocida por un anticuerpo anti-c-myc) , etiqueta SBP, etiqueta S, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión S-transferasa, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA o etiqueta Avi; una secuencia de aminoácidos, tal como AHGHRP (SEQ ID NO: 96), PIHDHDHPHLVIHS (SEQ ID NO: 97), o GMTCXXC (SEQ ID NO: 98); o ß-galactosidasa . Véase, Terpe K, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003; 60:523-525.

Los términos "soporte farmacéuticamente aceptable", "diluyente farmacéuticamente aceptable", "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable", usados de forma intercambiable en el presente documento, se refieren a un relleno, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo convencional sólido, semisólido o líquido no tóxico. Un soporte farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, el soporte para una formulación que contiene polipéptidos normalmente no incluirla agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe son per udiciales para los polipéptidos. Los soportes adecuados incluyen, pero no están limitados a, agua, dextrosa, glicerol, solución s a l i n a , etanol y combinaciones de los mismos. El soporte puede contener agentes adicionales tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH o adyuvantes que aumenten la eficacia de la formulación .

Los términos "prevenir" y "prevención", como se usan en el presente documento, se refieren a inhibir el principio o disminuir la aparición de una enfermedad en un animal. La prevención puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de células patológicas en un sujeto) . La prevención también puede ser parcial, de modo que por ejemplo la aparición de células patológicas en un sujeto sea menor de la que se hubiera producido sin la presente invención. Prevención también se refiere a susceptibilidad reducida a un estado clínico.

El término "péptido señal de secreción" se refiere a una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, preferiblemente de 15 a 60 aminoácidos de longitud) muy hidrofóbica de proteínas que deben cruzar a través de membranas para llegar a su localización celular de funcionamiento. Uniéndose a partículas de reconocimiento señal, estas secuencias dirigen complejos proteína naciente-ribosomas a una membrana donde la proteína se inserta durante la traducción. Los péptidos señal dirigen la captación traduccional de la proteina por varias membranas (por ejemplo, retículo endoplásmico, mitocondria, cloroplasto, peroxisoma) . Las secuencias señal líder en proteínas no membranosas se elimina finalmente por peptidasas específicas. Algunos péptidos señal usados incluyen quimioquina MCP-3, para fomentar la secreción y atracción de células presentadoras de antígeno; un péptido derivado de catenina (CATE) para degradación proteosómica aumentada; y la proteína lisosomal asociada, LAMP1 para dirigirse al compartimento de MHC II. Véase, Rosati M, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2009; 106:15831-15836.

La expresión "administración secuencial", como se usa en el presente documento, significa que la administración no es simultánea, sino que se realiza una primera administración, seguida por una o más administraciones sucesivas .

La expresión "sustancialmente conserva las capacidades inmunológicas del polipéptido inmunógeno", como se usa en el presente documento, significa que la variante muestra al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o al el 100% de la capacidad del polipéptido inmunógeno para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa (es decir, una respuesta inmunitaria humoral o celular) , si se inyecta por sí mismo o con adyuvantes.

El término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de una composición inmunogénica de la invención o de un medicamento que la contiene para controlar la evolución de la enfermedad antes o después de que hayan aparecido signos clínicos . Se entiende que control de la evolución de la enfermedad significa los resultados clínicos beneficiosos o deseados que incluyen, pero no están limitados a, reducción de los síntomas, reducción de la duración de la enfermedad, estabilización de estados patológicos (específicamente para evitar deterioro adicional) , retraso de la evolución de la enfermedad, mejora del estado patológico y remisión (tanto parcial como total) . El control de la evolución de la enfermedad también implica una extensión de la supervivencia, comparada con la supervivencia esperada si no se aplicara el tratamiento.

El término "vacuna", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia o composición que establece o mejora inmunidad hacia una enfermedad particular induciendo una respuesta inmunitaria adaptativa que incluye una memoria inmunológica . Una vacuna típicamente contiene un agente que se parece a un microorganismo causante de la enfermedad o a una parte del mismo (por ejemplo, un polipéptido) . Las vacunas pueden ser profilácticas o terapéuticas.

El término "variante", como se usa en el presente documento, se refiere a todas esas secuencias de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO 1-16 por medio de modificaciones o mutaciones, incluyendo sustituciones, preferiblemente sustituciones conservadoras, inserciones o deleciones no terminales, que afectan a uno o más aminoácidos y que sustancialmente conserva las capacidades inmunogénicas del polipéptido inmunógeno.

El término "vector", como se usa en el presente documento, a una molécula de ácido nucleico lineal o circular, que comprende un segmento según el ácido nucleico de interés operativamente unido a segmentos adicionales que aseguran su replicación autónoma en una célula huésped de interés o según el cásete de expresión de interés. 2. Polipeptidos inmunógenos de la invención En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias SEQ ID NO 1-16 o variantes de dichas SEQ ID NO: 1-16, en donde cada una de dichas variantes tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos, siempre que dicha secuencia de aminoácidos no comprenda ningún tramo de secuencia derivado del genoma de VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferentes de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO 1-16 o de las variantes de las mismas.

En una forma de realización particular, el polipéptido inmunógeno del primer aspecto tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 49.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas o un fragmento de las mismas, en donde dicho fragmento tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos, siempre que: i) dicha secuencia de aminoácidos no comprenda ningún tramo de secuencia derivado del genoma de VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferente de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO 1-16 o una variante o una fragmento de las mismas, y ii) cuando el inmunógeno comprende solo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 1- 16, entonces esta secuencia no se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 5, 6 y 16.

Preferiblemente, la variante según el primer y segundo aspectos es equivalente a su secuencia relacionada y deriva de una cepa de VIH diferente o es una secuencia de VIH artificial. Equivalente a este respecto significa diferente en uno o más residuos de aminoácidos, pero correspondiente a la misma secuencia (por ejemplo, determinada por la posición en el genoma o similitud de secuencia) . En otras palabras, en una forma de realización preferida, la variante es una "variante natural", que se refiere a secuencias de ácido nucleico derivadas de un genoma de VIH de un virus circulante actualmente o en el pasado y que se puede identificar de bases de datos existentes (por ejemplo, bases de datos de secuencias GenBank y Los Alamos) . Las secuencias de virus circulantes también se pueden determinar por metodologías de biología molecular. Véase, Brown T, "Gene Cloning" (Chapman & Hall, London, GB, 1995) ; Watson R, et al., "Recombinant DNA" , 2a Ed. (Scientific American Books, Nueva York, NY, EE UU, 1992) ; Sambrook J, et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE UU, 1989) . Preferiblemente, una variante de cualquiera de SEQ ID NO 1-16 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% a su correspondiente (es decir, SEQ ID NO 1-16) . Los ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0. Véase, Altschul S, et al., Nuc . Acids Res. 1977; 25:3389-3402 y Altschul S, et al., J. Mol. Biol . 1990; 215: 403-410. Los programas BLAST y BLAST 2.0 se pueden usar para determinar el porcentaje de identidad de secuencia pata los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para realizar análisis por BLAST está públicamente disponible a través de Centro Nacional para Información Biotecnológica . Véase, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi, Enero 2012.

Las variantes también pueden contener uno o más residuos de aminoácidos modificados (por ejemplo, residuos que se modifican mediante la unión de grupos sustituyentes ) o uno o más aminoácidos no naturales tales como beta aminoácidos .

Los métodos para determinar el grado de la respuesta celular se conocen en la técnica. Se puede usar cualquier método adecuado para evaluar la estimulación de células T en respuesta a un Ag. Los procedimientos descritos a continuación proporcionan unos pocos ejemplos de métodos adecuados : 1) Inmunospot unido a enzima (ELISpot) : se transfieren células no adherentes de pocilios precultivo a una placa, que se ha recubierto con los anticuerpo de captura anti-citoquina deseados (Ac; por ejemplo, anti-IFN, -IL-10, -IL-2, -IL-4) . El revelado se lleva a cabo con Ac secundarios biotinilados y métodos de detección colorimétrica o fluorimétrica estándar tales como estreptavidina-fosfatasa alcalina y NBT-BCIP y las manchas se cuentan. Las lecturas del ELISpot se expresan como células formadoras de manchas (CF )/106 células iniciales. 2) Ensayo de citoquina en sobrenadante: se miden las citoquinas liberadas en el sobrenadante del cultivo por técnicas diferentes, tal como enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) , matriz de bolas citométrica BD, ensayo Bio-Plex de Biorad y otros.

) Tetrámeros de HLA de clase I: con este procedimiento, se detectan células T reactivas a Ag que reconocen epitopos peptidicos específicos, usando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, dexámeros de MHC de clase I, Inmudex, Copenhague, DK) o generados internamente (por ejemplo, Novak E, et al., J. Clin. Invest . 1999; 104 :R63-R67) .

) Tetrámeros de HLA de clase II: con este procedimiento, se detectan células T reactivas a Ag que reconocen epitopos peptidicos específicos, usando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, Ultimers™ de MHC de clase II, Prolmmune Ltd, Oxford, GB) o generados internamente (por ejemplo, Novak, 1991, anteriormente) .

) Aumento de marcadores de activación (por ejemplo, CD69, CD25, CD137) : con este procedimiento, se detectan respuestas de células T específicas de Ag por su expresión diferencial de marcadores de diferenciación expuestos en la membrana después de reconocimiento del Ag.

) Ensayos de captura de citoquinas: este sistema es una alternativa válida al ELISpot para visualizar células específicas de Ag según sus respuestas a citoquinas (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, DE) . Además, permite la separación y clonación directa de células T de interés.

) Ensayo de CD154: este procedimiento está limitado a la detección de células T CD4+ específicas de Ag . Véase, Chattopadhyay P, et al., Nat. Med. 2005; 11:1113-11117 y Frentsch , et al., Nat . ed. 2005; 11 : 1118-112 . 8) Ensayo de CD107: este procedimiento permite la visualización de células T CD8+ especificas de Ag con potencial citotóxico. Véase, Betts , et al., J. Immunol. Methods 2003; 281:65-78. 9) Ensayo de dilución de CFSE: este procedimiento detecta células T (CD4+ y CD8+) especificas de Ag según su proliferación después de reconocimiento de Ag. Véase, Mannering S, et al., J. Immunol. Methods 2003; 283:173-183.

Los métodos para determinar el nivel de la respuesta humoral de una variante se conocen en la técnica. Se puede usar cualquier método adecuado para evaluar la estimulación de células T en respuesta a un Ag. Los ejemplos de métodos adecuados incluyen, pero no están limitados a, detectar o cuantificar la cantidad relativa de un anticuerpo, que reconoce específicamente un agente antigénico o inmunogénico en el suero de un sujeto que se ha tratado con un polipéptido inmunógeno o variante relativo a la cantidad del anticuerpo en un sujeto sin tratar. Se pueden determinar los títulos de los anticuerpos usando ensayos estándar tales como enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), ensayo de inmunodifusión radial única (SRID) o inmunoensayo enzimático (ETA) .

En una forma de realización preferida, la variante de cualquiera de SEQ ID NO 1-16 es un fragmento de dicha (s) secuencia ( s ) .

En formas de realización específicas, se determinan secuencias víricas ancestrales para los genes env de los subtipos B o C de VIH-1, o para los genes gag de los subtipos B o C. En otras formas de realización, se determina la secuencia del virus ancestral para otros genes 0 polipéptidos de VIH, tales como pol o los genes o polipéptidos auxiliares. En aún otra forma de realización, se determina la secuencia vírica por consenso o técnicas de centro del árbol.

En una forma de realización preferida, el VIH es un VIH del grupo M. El grupo M es el grupo de VIH-1 circulante predominante. Se ha dividido en subtipos, indicados con letras, y sub-subtipos, indicados con cifras. Los subtipos Al, A2, A3, A4, B, C, D, E, Fl, F2 , G, H, J y K se reconocen actualmente. Los subtipos de VIH, también llamados ciados, son cepas filogenéticamente unidas de VIH- 1 que están aproximadamente a la misma distancia genética entre sí; en algunos casos, los subtipos también están unidos geográfica o epidemiológicamente. La variación genética en un subtipo puede ser del 15 al 20 por ciento o más, mientras que la variación entre subtipos o miembros divergentes del mismo subtipo habitualmente es del 25 al 35 por ciento. Los avances en la secuenciación del genoma completo de VIH han producido la identificación de formas circulantes recombinantes y únicas (CFR y UFR, respectivamente) . Estas son el resultado de recombinación entre subtipos en una persona dualmente infectada, de la que las formas recombinantes pasan después a otras personas. La progenie recombinante se clasifica como formas recombinantes circulantes si se identifican en tres o más personas sin conexión epidemiológica directa; de otra forma se describen como formas recombinantes únicas.

En una forma de realización, dicho inmunógeno tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas, en donde dicha condición ii) es: cuando el inmunógeno comprende solo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16, entonces esta secuencia no se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16.

En una forma de realización preferida, dicho inmunógeno comprende al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas, en donde dicha condición ii) es: cuando el inmunógeno comprende solo dos, tres o cuatro secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16, entonces no todas de estas secuencias se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 5, 6 y 16. En otra forma de realización, dicho inmunógeno tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas, en donde dicha condición ii) es: cuando el inmunógeno comprende solo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16, entonces no todas de estas secuencias se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16.

En una forma de realización preferida, el inmunógeno según el primer aspecto comprende las secuencias según SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas, en el orden 1-16.

En una forma de realización, la invención se refiere al inmunógeno del primer aspecto, en donde al menos dos secuencias se unen por un enlazador aminoacidico .

En otra forma de realización, la invención se refiere al inmunógeno del segundo aspecto, en donde, si dicho inmunógeno comprende al menos dos secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas, dichas secuencias están unidas por un enlazador aminoácido .

En una forma de realización preferida de los inmunógenos tanto del primer como del segundo aspecto, el enlazador tiene la secuencia de aminoácidos A, AA o AAA. En otra forma de realización, cuando el residuo C-terminal de la secuencia localizada N-terminalmente con respecto al enlazador o el residuo N-terminal de la secuencia localizada C-terminalmente es un residuo de alanina, el enlazador se pude acortar de modo que se forme una secuencia AAA en la región de unión entre secuencias contiguas. Por tanto, en una forma de realización preferida, si el residuo C-terminal de la secuencia localizada N-terminalmente con respecto al enlazador es una alanina o si el residuo N-terminal de la secuencia localizada C-terminalmente con respecto al enlazador es una alanina, el enlazador tiene la secuencia AA. En otra forma de realización, si el residuo C-terminal de la secuencia localizada N-terminalmente con respecto al enlazador y el residuo N-terminal de la secuencia localizada C-terminalmente con respecto al enlazador son ambos alanina, entonces el enlazador tiene la secuencia A.

En otra forma de realización, dichos inmunógenos comprenden además un péptido señal de secreción en el extremo N, en donde dicho péptido señal preferiblemente aumenta la secreción del inmunogeno de las células que expresan dicho inmunogeno. Un péptido señal de secreción preferido deriva de GMCSF (factor estimulantes de colonias de granulocitos macrófagos), preferiblemente seguido por una valina para aumentar la estabilidad. La secuencia del péptido señal de GMCSF es preferiblemente MWLQSLLLLGTVACSIS (SEQ ID NO: 46) o MWLQSLLLLGTVACSISV (SEQ ID NO: 47) .

En otra forma de realización, dichos inmunógenos comprenden además opcionalmente una etiqueta peptidica. La etiqueta peptidica puede estar localizada en el extremo N entre el péptido señal y el polipéptido inmunógeno o, preferiblemente, puede estar localizada en el extremo C antes del codón de terminación.

Preferiblemente, dicha etiqueta es un péptido FLAG. El sistema FLAG utiliza un péptido corto, hidrofilico de 8 aminoácidos, que se fusiona a la proteina recombinante de interés. El péptido FLAG incluye el sitio de unión para varios anticuerpos monoclonales ANTI-FLAG muy específicos (MI, M2, M5; Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, EE UU) , que se pueden usar para evaluar la expresión de la proteína de interés en material de células transfectadas . Debido al pequeño tamaño de la etiqueta peptidica FLAG, no cubre otros epítopos, dominios, o altera la función, secreción o transporte de la proteína de fusión en general. Preferiblemente, dicho péptido FLAG tiene la secuencia DYKDDDDKL (SEQ ID NO: 48) .

En una forma de realización preferida, dicha etiqueta es solo para análisis de expresión y purificación del inmunógeno y se elimina antes de usarlo para provocar una respuesta inmunitaria.

En otra forma de realización, la invención se refiere a dichos inmunógenos, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende al menos un sitio de mutación de resistencia antirretroviral .

La mutación se puede producir en cualquier sitio del genoma vírico. Preferiblemente, la mutación se produce en la región que codifica los genes de la integrasa, la proteasa o la transcriptasa inversa.

Los mutantes en la integrasa que confieren resistencia a inhibidores de integrasa incluyen, sin limitación, T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 y R263 en SEQ ID NO: 1 y una combinación de las mismas. En una forma de realización preferida, la mutación se selecciona del grupo que consiste en las mutaciones E92Q, G140S, G140A y Y143R en la proteína integrasa y sus combinaciones.

Los mutantes en la proteasa asociada con resistencia al inhibidor de proteasa (IP) incluyen mutaciones en la proteasa principal, proteasa accesoria y en el sitio de corte de proteasas . Véase, Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2) :67-84. Diecisiete posiciones en gran parte no polimórficas son de la mayor significancia clínica, incluyendo L231, L241, D30N, V321, L33F, M461/L, 147/V/A, G48V/M, 150L/V, F53L, 154V/T/A/L/M, G73S/T, L76V, V82A/T/F/S, 184V/A/C, N88D/S, L90M. Las mutaciones en la proteasa accesoria incluyen las mutaciones polimórficas L101/V, 113V, K20R/M/I, M36I, D60E, I62V, L63P, A71V/T, V77I y 193L y las mutaciones no polimórficas L10F/R, VIH, E34Q, E35G, K43T, K45I, 55R, Q58E, A71I/L, T74P/A/S, V751, N83D, P79A/S, 185V, L89V, T91S, Q92K y C95F.

En otra forma de realización, el sitio de mutación de resistencia antirretroviral está localizado en la transcriptasa inversa, que produce una resistencia a inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosídicos (NRTI) o inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosídicos (NNRTI) . Las mutaciones de resistencia a NRTI incluyen M184V, mutaciones de análogos de timidina (TAM) , mutaciones seleccionadas por pautas que carecen de análogos de timidina (No-TAM) , y mutaciones de resistencia multinucleosidica (mutaciones multi-NRTI) y muchas mutaciones accesorias no polimórficas recientemente descritas. En conjunto, M184V, mutaciones asociadas a no análogos de timidina tales como K65R y L74V, y la mutación de resistencia multinucleosidica Q151M actúan disminuyendo la incorporación de NRTI . Las mutaciones de análogos de timidina, las inserciones en T69 asociadas con resistencia multinucleosidica y muchas de las mutaciones accesorias facilitan el desbloqueo del cebador. Véase, Shafer, 2008, anteriormente. 184V es la mutación de resistencia NRTI que se produce más comúnmente. Las mutaciones de aminoácidos resistentes a fármacos más comunes son M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F y K219QE. Las mutaciones más comunes en pacientes que desarrollan insuficiencia virológica mientras reciben un esqueleto NRTI que contiene no análogos de timidina (No-TAM) incluyen M184V sola o M184V en combinación con K65R o L74V. Otras mutaciones no-TAM incluyen K65N, K70E/G, L741, V75T/M, Y115F. Las inserciones de aminoácidos en el codón 69 en general se producen en presencia de múltiples TAM, y en este marco se asocian con resistencia intermedia a 3TC y FTC y resistencia de alto nivel a cada uno de los NRTI restantes. Q151M es una mutación de 2 pb (CAG ? ATG) que habitualmente está acompañada de dos o más de las siguientes mutaciones: A62V, V751, F77L y F116Y. El complejo Q151M causa resistencia de alto nivel a ZDV, d4T, ddl y ABC, y resistencia intermedia a TDF, 3TC y FTC. Véase, Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2) : 67-8 .

Las mutaciones de resistencia a NNTRI incluyen, sin limitación, las mutaciones de resistencia a NNTRI primarias (K103N/S, V106A/M, Y181C/I/V, Y188L/C/H y G190A/S/E), las mutaciones secundarias de resistencia a NNRTI (L1001, K101P, P225H, F227L, 230L y K238T) y mutaciones raras (V179F, F227C y L2341) .

Las mutaciones no polimórficas menores -A98G, K101E, V1081 y V179D/E son mutaciones de resistencia a NNRTI comunes que reducen la susceptibilidad a nevirapina y efavirenz aproximadamente de 2 veces a 5 veces.

Las mutaciones de resistencia a inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosidicos mezcla, tales como K101Q, 1135T/M, V1791 y L2831, reducen la susceptibilidad a nevirapina y efavirenz en aproximadamente dos veces y pueden actuar sinérgicamente con mutaciones de resistencia a NNRTI primarias. Otras mutaciones como L74V, H221Y, K223E/Q, L228H/R y N3481 se seleccionan principalmente por NRTI, aunque también producen reducciones sutiles en susceptibilidad a NNRTI.

Preferiblemente, dicho sitio de mutación de resistencia antirretroviral está localizado en cualquiera de SEQ ID NO 9-11. Más preferiblemente, dicho sitio de mutación de resistencia antirretroviral es el residuo de aminoácido 8 de SEQ ID NO: 9. en donde el aminoácido Leu se sustituye por el aminoácido Met.

En otra forma de realización, la variante o fragmento tiene una longitud de 8 a 40 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 11 a 27 aminoácidos. Preferiblemente, dicha variante o fragmento no comprende un enlazador peptidico que una a cualquiera de SEQ ID NO 1-16. Además, se prefiere que el aminoácido C-terminal de dicha variante o fragmento no sea G, P, E, D, Q, N, T, S ni C, ya que estos residuos no forman un anclaje C-terminal para epitopos de células T restringidos por HLA de clase I en general .

En una forma de realización más preferida, dicha variante o fragmento se selecciona del grupo que consiste en los péptidos según SEQ ID NO 17-45.

Además, se prevé que dicha variante o fragmento se combine con o fusione a una proteina de choque térmico. La presente invención también se refiere a una proteina de fusión que comprende dicha variante o fragmento y una proteina de choque térmico. Las proteínas de choque térmico preferidas son HsplO, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 o HsplOO.

En otra forma de realización, la variante o fragmento es una variante o fragmento según el primer y segundo aspectos. Preferiblemente, dicha variante o fragmento no comprende un enlazador aminoacídico que una cualquiera de SEQ ID NO 1-16. Además, se prefiere se prefiere que el aminoácido C-terminal de dicha variante o fragmento no sea G, P, E, D, Q, N, T, S ni C, ya que estos residuos no forman un anclaje C-terminal para epítopos de células T restringidos por HLA de clase I en general.

En una forma de realización más preferida, dicha variante o fragmento se selecciona del grupo que consiste en los péptidos según SEQ ID NO 17-45.

Además, se prevé que dicha variante o fragmento se combine con o fusione a una proteína de choque térmico. La presente invención también se refiere a una proteína de fusión que comprende dicha variante o fragmento y una proteína de choque térmico. Las proteínas de choque térmico preferidas son HsplO, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 o HsplOO. 3. Ácidos nucleicos, vectores , virus y células de la invención En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el inmunógeno del primer aspecto, y a un cásete de expresión, un vector, un virus y una célula que comprenden dicho ácido nucleico.

Preferiblemente, dicho ácido nucleico es un polinucleótido, refiriéndose a polímeros monocatenarios o bicatenarios de monómeros nucleotídicos (ácidos nucleicos), incluyendo, pero no limitado a, 2 ' -desoxirribonucleótidos (ADN) y ribonucleótidos (ARN) unidos por enlaces fosfodiéster internucleótido . Los polinucleótidos de la invención codifican el inmunógeno de la invención sin comprender sustancialmente regiones adicionales del genoma de VIH.

En una forma de realización, dicho ácido nucleico tiene codones optimizados. En una forma de realización preferida, el ácido nucleico tiene codones optimizados para expresión en seres humanos. Se pueden preparar ácidos nucleicos con codones optimizados para su uso según la presente invención cambiando los codones del ácido nucleico que codifica el inmunógeno por codones "humanizados" (es decir, los codones don los aparecen frecuentemente en genes muy expresados en seres humanos) . Véase, André S, et al., J. Virol. 1998; 72:1497-1503. En una forma de realización preferida, dicho ácido nucleico con codones optimizados tiene la secuencia según SEQ ID NO: 50.

El ácido nucleico del tercer aspecto puede requerir cortar con enzimas de restricción para ligarlo a un vector. Este procedimiento podría suponer la eliminación de varios nucleótidos terminales (por ejemplo, 1, 2 o 3) . Como tal, en una forma de realización, la invención se refiere a dicho ácido nucleico, en donde se ha cortado en cada extremo con una enzima de restricción.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un cásete de expresión que comprende el ácido nucleico del tercer aspecto, una secuencia promotora y una 3'-UTR y opcionalmente un marcador de selección.

Preferiblemente, la secuencia promotora es un promotor de citomegalovirus (CMV) humano o una secuencia promotora temprana-tardia p7.5. Preferiblemente, la 3'-UTR es un poli-A de la hormona de crecimiento bovina (BGH) . El marcador de selección opcional es un gen de resistencia a antibiótico (por ejemplo, kanamicina, ampicilina, tetraciclina, espectinomicina) , preferiblemente.

En aún otra forma de realización, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende el ácido nucleico o el cásete de expresión del tercer aspecto .

En otra forma de realización, el vector es un vector de expresión. Por tanto, los vectores adecuados según la presente invención incluyen vectores procariotas, tales como plásmidos pUC18, pUC19 y pBluescript y derivados de los mismos, como los plásmidos mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl y RP ; fagos y vectores lanzadera, tales como los vectores pSA3 y pAT28; vectores de expresión en levaduras, tales como vectores de tipo plásmido de 2-micrones; plásmidos de integración; vectores YEP; plásmidos centroméricos y análogos; vectores de expresión en células de insecto, tal como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL; vectores de expresión en plantas, tales como los vectores de las series pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, p DC, pMY, pORE y análogos; y vectores de expresión en células eucariotas superiores basados en vectores víricos (por ejemplo, MVA, adenovirus, virus asociados a adenovirus, retrovirus y lentivirus) así como vectores no víricos, tales como los vectores pSilencer 4.1-CMV (Ambion®, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, EE UU), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHC V/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HC V2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl .

En una forma de realización particular, el vector de expresión es un vector de expresión en mamíferos que comprende un promotor y un sitio de poliadenilación de mamíferos. Preferiblemente, el promotor es el promotor del citomegalovirus (CMV) humano. Preferiblemente, el sitio de poliadenilación es el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) . El vector de expresión en mamíferos se puede modificar para optimizar la replicación del vector en bacterias. El vector de expresión en mamíferos puede comprender además un gen de selección, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico. En una forma de realización particular, el vector de expresión en mamíferos comprende un gen de resistencia a kanamicina.

En otra forma de realización particular, el vector de expresión es un vector vírico, preferiblemente el vector del virus vaccinia Ankara modificado ( VA) .

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un virus que contiene el ácido nucleico del tercer aspecto. Los virus adecuados son seguros, tienen baja toxicidad y son genéticamente estables. Los ejemplos no limitantes son retrovirus, particularmente poxvirus tales como MVA, lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados (AAV) .

En una forma de realización preferida particular adicional, la presente invención se refiere a un virus vaccinia Ankara modificado (MVA) recombinante que comprende un polinucleótido o construcción génica que codifica los polipéptidos inmunógenos de la invención. Virus vaccinia Ankara modificado (MVA) es un virus relacionado con el virus vaccinia, un miembro del género ortopoxvirus en la familia poxviridae. MVA se ha generado por 516 pases en serie en fibroblastos embrionarios de pollo de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA) . Véase, Mayr A, et al., Infection 1975; 3:6-14 y Sutter G, et al., US 6.440.422 y CH 568.392. Los virus MVA están públicamente disponibles (por ejemplo, número de acceso de ATCC VR-1508) . MVA se distingue por su atenuación (por ejemplo, virulencia disminuida y capacidad limitada para reproducir viriones infecciosos en ciertas células de mamífero) , mientras que mantiene buena inmunogenicidad y capacidad total de replicarse y producir viriones infecciosos en células aviares. Las cepas de MVA adecuadas incluyen cepas con seguridad aumentada debido a i) capacidad de replicación reproductiva in vitro en fibroblastos embrionarios de pollo (CFE) , pero sin capacidad de replicación reproductora en una línea celular humana, como en la línea celular de queratinocitos humanos HaCaT, la línea de células de riñon embrionario humano 293, la línea celular de osteosarcoma humano 143B y la línea celular de adenocarcinoma cervical humano HeLa; ii) ausencia de replicación en un modelo de ratón que es incapaz de producir células B y T maduras y como tal está gravemente inmunocomprometido y es muy susceptible a virus replicantes; y iii) inducción de al menos el mismo nivel de respuesta inmunitaria específica en pautas de cebado con virus vaccinia/recuerdo con virus vaccinia cuando se compara con pautas de cebado con ADN/recuerdo con virus vaccinia. Una cepa de MVA atenuada adecuada es la cepa denominada VA-BN. Véase, Chaplin P, et al., WO2002042480, número de acceso de ECACC V00083008.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una célula que comprende el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión o el virus del tercer aspecto. Las células que se van a usar pueden ser de cualquier tipo celular, incluyendo tanto células eucariotas como células procariotas. Preferiblemente, las células incluyen células procariotas, células de levadura o células de mamífero. Los ejemplos preferidos de células de mamífero son células COS, célula HeLa, células HEK 293T o células aisladas de un paciente (por ejemplo, un paciente con VIH) . 4. Composiciones de la invención En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende una variante o fragmento según el primer y segundo aspectos y una proteína de choque térmico. Las composiciones inmunogénicas se pueden preparar, por ejemplo, como inyectables tal como soluciones, suspensiones y emulsiones líquidas. Las proteínas de choque térmico preferidas son HsplO, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 o HsplOO.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inmunógeno, ácido nucleico, cásete de expresión, vector o célula según la invención o una composición según el cuarto aspecto y soporte farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, dichas composiciones farmacéuticas y la composición del cuarto aspecto se pueden usar como una vacuna, como explica posteriormente . 5. Vacuna de la invención En otro aspecto, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende el inmunógeno del primer y segundo aspectos, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus o la célula del tercer aspecto o la composición del cuarto aspecto.

En una forma de realización preferida, dicha vacuna es capaz de generar respuestas celulares y humorales. Más preferiblemente, la vacuna genera una respuesta de células T citotóxicas. Se puede usar un ensayo de células T citotóxicas o linfocitos T citotóxicos (LCT) para seguir la respuesta inmunitaria celular que sigue a la inmunización subgenómica con una secuencia vírica contra cepas de VIH homologas y heterólogas. Véase, Burke S, et al., J. Inf. Dis. 1994; 170:1110-1119 y Tigges M, et al., J. Immunol, 1996; 156:3901-3910. Los ensayos convencionales utilizados para detectar respuestas de células T incluyen, por ejemplo, ensayos de proliferación, ensayos de secreción de linfoquinas, ensayos de citotoxicidad directa y ensayos de dilución limitante. Por ejemplo, se puede evaluar la capacidad de células presentadoras de antígeno que se han incubado con un péptido, para inducir respuestas de LTC en poblaciones de células respondedoras. Las células presentadoras de antígeno pueden ser células tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células dendríticas (CD) . De forma alternativa, se pueden usar líneas celulares de mamífero no humanas mutantes que son deficientes en su capacidad para cargar moléculas de MHC de clase I con péptidos procesados internamente y que se han transfectado con el gen de MHC de clase I humano apropiado, para probar la capacidad de un péptido de interés para inducir in vitro respuestas de LTC primarias. Las PBMC se pueden usar como la fuente de células respondedoras de precursores de LTC. Las células presentadoras de antigeno apropiadas se incuban con el péptido después de lo cual las células presentadoras de antigeno cargadas con proteina se incuban con la población de células respondedoras en condiciones de cultivo optimizadas. La activación de LTC positivos se puede determinar evaluando en el cultivo la presencia de LTC que aniquilan células diana radiomarcadas, tanto dianas pulsadas con péptidos específicos como células dianas que expresan formas procesadas endógenamente del antígeno del que deriva la secuencia del péptido. Por ejemplo, las células diana se pueden radiomarcar con 51Cr y se puede calcular la actividad citotóxica a partir de la radioactividad liberada de las células diana. Otro método adecuado permite la cuantificación directa de células T específicas de antígeno tiñendo con complejos tetraméricos de HLA marcados con fluoresceína . Véase, Altman J, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993; 90:10330-10334 y Altman J, et al., Science 1996; 274:94-96. Otros desarrollos técnicos relativamente recientes incluyen tinción para linfoquinas intracelulares y ensayos de liberación de interferón o ensayos ELISpot.

En una forma de realización, la vacuna del cuarto aspecto comprende además uno o más adyuvantes o proteínas de choque térmico.

Los adyuvantes se han definido anteriormente. Las proteínas de choque térmico preferidas son HsplO, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 o HsplOO. 6. Métodos terapéuticos En una forma de realización preferida, el polipéptido inmunógeno según la invención, el ácido nucleico de la invención, el cásete de expresión de la invención, el vector de expresión de la invención, el virus de la invención, la célula de la invención o la vacuna según la invención se pueden usar en la prevención o tratamiento de una infección por VIH o una enfermedad asociada a una infección por VIH.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al polipéptido inmunógeno según la invención, el ácido nucleico de la invención, el cásete de expresión de la invención, el vector de expresión de la invención, el virus de la invención, la célula de la invención o la vacuna según la invención para su uso en la prevención o tratamiento de un infección por VIH o una enfermedad asociada a una infección por VIH.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del polipéptido inmunógeno según la invención, el ácido nucleico de la invención, el cásete de expresión de la invención, el vector de expresión de la invención, el virus de la invención, la célula de la invención o la vacuna según la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una infección por VIH o una enfermedad asociada con una infección por VIH.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la prevención o tratamiento de una infección por VIH o una enfermedad asociada con una infección por VIH en un sujeto en necesidad de ello que comprende la administración a dicho sujeto del polipéptido inmunógeno según la invención, el ácido nucleico de la invención, el cásete de expresión de la invención, el vector de expresión de la invención, el virus de la invención, la célula de la invención o la vacuna según la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un infección por VIH o una enfermedad asociada a una infección por VIH.

En una forma de realización particular, el péptido inmunógeno, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus, la célula o la vacuna para su uso según la invención, comprende la administración secuencial de: i) un primer péptido inmunógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, cásete de expresión de la reivindicación 15, vector de expresión de la reivindicación 16, virus de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, célula de la reivindicación 19 o vacuna de la reivindicación 20, y ii) un segundo péptido inmunógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, cásete de expresión de la reivindicación 15, vector de expresión de la reivindicación 16, virus de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, célula de la reivindicación 19 o vacuna de la reivindicación 20.

En una forma de realización particular, el primer péptido inmunógeno, ácido nucleico, cásete de expresión, vector de expresión, virus, células o vacuna son diferentes del segundo péptido inmunógeno, ácido nucleico, cásete de expresión, vector de expresión, virus, células o vacuna. Preferiblemente, se administra primero un vector de expresión según la invención seguido por la administración de un virus vaccinia Ankara modificado según la invención.

En una forma de realización particular, el primer vector de expresión según la invención se administra al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces.

El efecto profiláctico o terapéutico beneficioso de la vacuna respecto a la infección por VIH o síntomas de SIDA incluye, por ejemplo, prevenir o retrasar la infección inicial de un individuo expuesto a VIH; reducir la carga vírica en un individuo infectado con VIH; prolongar la fase asintomática de la infección por VIH; mantener cargas víricas bajas en pacientes infectados con VIH cuyos niveles de virus han disminuido mediante terapia antirretroviral (ART) ; aumentar los niveles de células T CD4 o mitigar la disminución en células T CD4, tanto específicas como no específicas de VIH-1, en pacientes sin tratamiento farmacológico y en pacientes tratados con ART, aumentar la amplitud, magnitud, avidez y funcionalidad de LTC específicos de VIH, aumentar la salud global o calidad de vida en un individuo con SIDA; y prolongar la esperanza de vida de un individuo con SIDA. Un médico puede comparar el efecto de la inmunización con el estado del paciente antes del tratamiento, o con el estado esperado de un paciente sin tratar, para determinar si el tratamiento es eficaz en inhibir el SIDA.

Preferiblemente, dicha enfermedad es SIDA, ARC o una enfermedad oportunista de VIH. Ejemplos no limitantes de enfermedades oportunistas de VIH son linfoma de Burkitt, candidiasis en los bronquios, tráquea, pulmones o esófago, cáncer cervical, coccidioidomicosis (diseminada o fuera de los pulmones), criptococosis (fuera de los pulmones), criptosporidiosis (en los intestinos que duran más de 1 mes), infección por citomegalovirus (fuera del hígado, bazo o ganglios linfáticos), retinitis por citomegalovirus (con pérdida de visión) , encefalopatía por VIH, lesiones por herpes simple que duran más de un mes, herpes simple en los bronquios, pulmones o esófago, histoplasmosis (diseminada o fuera de los pulmones), linfoma inmunoblástico, carcinoma { cáncer ) cervical invasivo, isosporiasis en los intestinos que dura más de un mes, sarcoma de Kaposi, linfoma (primario en el cerebro), complejo Myco¿>acterium avium (diseminado o fuera de los pulmones), Mycobacterium kansasii (diseminado o fuera de los pulmones), Mycobacterium tuberculosis (diseminado o fuera de los pulmones), neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía (recurrente en un periodo de 12 meses), leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML), septicemia por salmonella (recurrente), toxoplasmosis (en el cerebro), síndrome consuntivo y otras enfermedades resultantes de una infección facilitada por un sistema inmunitario comprometido en un paciente infectado por VIH.

La vacuna de la invención puede ser útil para la terapia de infección por VIH-1. Mientras que todos los animales que puedan estar afectados con VIH-1 o sus equivalentes se pueden tratar de esta manera (por ejemplo, chimpancés, macacos, babuinos o seres humanos) , las composiciones inmunogénicas de la invención se dirigen particularmente a sus usos terapéuticos en seres humanos. Con frecuencia, se puede requerir más de una administración para producir el efecto terapéutico deseado; el protocolo exacto (dosis y frecuencia) se puede establecer por procedimientos clínicos estándar.

La presente invención se refiere además a prevenir o reducir síntomas asociados con infección por VIH. Estos incluyen síntomas asociados con la fase sintomática secundaria de la infección por VIH, incluyendo, por ejemplo, culebrilla, erupción cutánea e infección de la uñas, llagas en la boca, infección recurrente en nariz y garganta y pérdida de peso. Además, síntomas adicionales asociados con la fase sintomática principal de la infección por VIH incluyen, por ejemplo, candidiasis oral y vaginal, diarrea persistente, pérdida de peso, tos persistente y tuberculosis reactivada o infecciones de herpes recurrentes, tal como calenturas (herpes simple) . Otros síntomas del SIDA completo que se pueden tratar según la presente invención incluyen, por ejemplo, diarrea, nausea y vómitos, candidiasis y llagas bucales, infecciones vaginales persistentes, recurrentes y cáncer cervical, linfoadenopatía generalizada persistente (PGL) , infecciones graves de la piel, verrugas y tiña, infecciones respiratorias, neumonía, especialmente neumonía por Pneumocystis carinii (PCP), herpes zoster (o culebrilla), problemas del sistema nervioso, tales como dolores, entumecimiento u hormigueo en manos y pies, anormalidades neurológicas , sarcoma de Kaposi, linforna, tuberculosis u otras infecciones oportunistas similares.

Los efectos beneficiosos de la invención incluyen, por ejemplo, prevenir o retrasar la infección inicial de un individuo expuesto a VIH; reducir la carga vírica en un individuo infectado con VIH; prolongar la fase asintomática de la infección por VIH; mantener cargas víricas bajas en pacientes infectados con VIH cuyos niveles de virus han disminuido mediante terapia antirretroviral (ART) ; aumentar los niveles de células T CD4 o mitigar la disminución en células T CD4 , tanto específicas como no específicas de VIH-1, en pacientes sin tratamiento farmacológico y en pacientes tratados con ART, aumentar la amplitud, magnitud, avidez y funcionalidad de los LTC específicos de VIH, aumentar la salud global o calidad de vida en un individuo con SIDA; y prolongar la esperanza de vida de un individuo con SIDA. Un médico puede comparar el efecto de la inmunización con el estado del paciente antes del tratamiento, o con el estado esperado de un paciente sin tratar, para determinar si el tratamiento es eficaz en inhibir el SIDA.

Las composiciones inmunogénicas se pueden diseñar para introducir los ácidos nucleicos o vectores de expresión en un sitio de acción deseado y liberarlo a una velocidad apropiada y controlable. Los métodos para preparar formulaciones de liberación controlada se conocen en la técnica. Por ejemplo, se pueden producir preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para acomplejar o absorber el inmunógeno o composición inmunogénica . Se puede preparar una formulación de liberación controlada usando macromoléculas apropiadas (por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos , polivinilo, pirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina, que se sabe que proporcionan las característica de liberación controlada o perfil de liberación. Otro método posible para controlar la duración de la acción por una preparación de liberación controlada es incorporar los ingredientes activos en partículas de un material polimérico (por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de estos ácidos, o copolímeros de etileno y acetato de vinilo) . De forma alternativa, en lugar de incorporar estos ingredientes activos en partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas , nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Véase en Voller A, et al., Eds . , "New Trends and Developments in Vaccines (University Park Press, Baltimore, MD, EE UU, 1978) y Gennaro A, Ed., "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Ed . (Mack Publishing Co . , Easton, PA, EE UU, 1990) .

Las dosis adecuadas de los ácidos nucleicos y vectores de expresión de la invención (colectivamente, los inmunógenos) en la composición inmunogénica de la invención las pueden determinar fácilmente los expertos en la materia. Por ejemplo, la dosis de los inmunógenos puede variar dependiendo de la via de administración y el tamaño del sujeto. Los expertos en la materia pueden determinar las dosis adecuadas, por ejemplo, midiendo la respuesta inmunitaria de un sujeto, tal como un animal de laboratorio, usando técnicas inmunológicas convencionales, y ajustando la dosis según sea apropiado. Tales técnicas para medir la respuesta inmunitaria del sujeto incluyen, pero no están limitadas a, ensayos de liberación de cromo, ensayos de unión de tetrámeros, ensayos ELISPOT de IFN, ensayos ELISPOT de IL-2, ensayos de citoguinas intracelulares y otros ensayos de detección inmunológica . Véase, Harlow E, Lañe D, "Antibodies : A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE UU, 1988) .

Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar usando cualquier método de administración adecuado incluyendo, pero no limitado a, administración intramuscular, intravenosa, intradérmica, transcutánea, intranasal, mucosa (por ejemplo, intrarrectal, intravaginal, oral) y tópica. Tales métodos se conocen bien en la técnica. Ejemplos más específicos de métodos de administración con inyección intramuscular, inyección intradérmica e inyección subcutánea. Sin embargo, la administración no necesita limitarse a métodos de inyección. Además, la administración de ADN a tejido animal se ha alcanzado por inyección directa de liposomas catiónicos de ADN desnudo en tejido muscular animal o inyección intradérmica de ADN usando tecnología de "cañones de genes" o electroporación . Véase, Watanabe M, et al., Mol. Reprod. Dev. 1994; 38:268-274, Charnock-Jones D, et al., WO1996020013, Robinson H, et al., Vaccine 1993: 11:957-960, Hoffman S, et al., Vaccine 1994; 12(16) :1529-1533; Xiang Z, et al., Virology 1994; 199:132-140, Webster R, et al., Vaccine 1994; 12:1495-1498, Davis H, et al., Vaccine 1994; 12: 1503-1509, Davis H, et al., Hum. Mol. Gen. 1993; 2:1847-1851, y Johnston S, et al., Meth. Cell Biol. 1994; 43:353-365. La administración también se puede alcanzar a través de una superficie de mucosa tales como la mucosa anal, vaginal u oral. 7. Kit de la invención En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende el inmunógeno del primer aspecto, el péptido o variante del mismo del segundo aspecto, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus o la célula del cuarto aspecto, o la vacuna del cuarto aspecto. Estos kits proporcionan los materiales necesarios para llevar a cabo la aplicación descrita en el presente documento. El kit también podría estar en forma de un parche.

Además, el kit puede comprender un envoltorio, que permite mantener los reactivos dentro de determinados límites. Los materiales adecuados para preparar tales envoltorios incluyen vidrio, plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, policarbonato) , botellas, viales, papel o bolsitas. El kit de la invención puede contener además instrucciones para usar los componentes contenidos en el mismo, en particular los que constituyen el parche hemostático de la invención. Dichas instrucciones se pueden encontrar en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico que puede almacenar instrucciones de modo que las pueda leer posteriormente un sujeto, tal como un medio de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas) , o medios ópticos (por ejemplo, CD-ROM, DVD) . Los medios pueden contener de forma adicional o alternativa sitios web de internet que proporcionan dichas instrucciones.

PROCEDIMIENTOS GENERALES 1. Diseño de inmunógenos de células T Se siguió el siguiente planteamiento para el diseño de los OLP de VIH de la invención.

El cribado experimental (ELISpot de interferón gamma) de 232 individuos sin tratar infectados por VIH usando un conjunto de péptidos consenso del ciado B reveló regiones del proteoma vírico que estaban predominantemente atacados por sujetos con control de VIH superior. Véase, Frahm N, et al., J. Virol. 2004; 78:2187-2200; Mothe B, et al., J. Transí. Med. 2011; 9(1):208. El conjunto de péptidos de prueba global consistió en 410 péptidos solapantes 18-meros que abarcaban el proteoma vírico entero. De estos, se identificaron 26 OLP donde el grupo de respondedores a OLP tenía una carga vírica significativamente (p<0,05 sin corregir para comparación múltiple) reducida comparado con el grupo de no respondedores a OLP (es decir, individuos que no reaccionaron a estos OLP en el ensayo ELISpot de interferón gamma) . Estos OLP beneficiosos tenían una relación protectora (PR>1) y se localizaban en la proteína Gag de VI (n=10), en Pol (n=12) de VIH, y en las proteínas Vif (n=3) y Nef (n=l) del virus. De los 26 OLP, 15 eran parcialmente solapantes . Véase la tabla 1.

Tabla 1 * Los valores de PR en negrita indican PR>1, es decir, respuestas a OLP vistas con más frecuencia en individuos con cargas víricas reducidas.

Para construir una secuencia de inmunógeno continua, los 26 OLP se alinearon y ensamblaron a un total de 16 segmentos, gue variaban desde 11-78 aminoácidos de longitud. Las posiciones iniciales y finales precisas de estos segmentos se basaron en el análisis de residuos anteriores y posteriores de los 26 OLP identificados y se basó en un número de consideraciones que se aplicaron a los diferentes sitios flanqueantes. Estas consideraciones incluían : 1) Datos de inmunogenicidad de los OLP 2) Datos de reactividad de regiones conservadas 3) Extensión o corte de segmentos para inclusión/exclusión de epítopos buenos o malos conocidos 4) Cobertura de epitopo CD4 5) Cobertura de HLA 6) Variabilidad de secuencia (consenso 2010 y epitopos definidos de HBX2) 7) Análisis multivariante de OLP 8) Creación de nuevos epitopos/autoepitopos 9) Mantenimiento de la secuencia natural aunque no incluyera OLP beneficioso 10) Introducción de cambios para evitar reconocimiento de epitopos y 11) Evitar residuos prohibidos (G, P, E, D, Q, N, T, S o C) Este protocolo produjo el diseño de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 como inmunógenos potenciales. 2. Vectores Las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 se unieron con aminoácidos alanina única, dual o triple entre los segmentos para asegurar el procesamiento óptimo y para evitar la digestión prematura del epitopo.

A continuación, los segmentos unidos se usaron como secuencias inmunogeno de células T de VIH para la inclusión en ADN en vectores MVA. Para la administración de los inmunógenos usando péptidos solubles solo o en combinación con proteínas de choque térmico, se diseñaron péptidos solapantes más cortos (longitud mediana 23 residuos) que abarcan los 16 segmentos, sin incluir los enlazadores triples AAA. Estos OLP se generaron de una manera que ayudó a evitar residuos prohibidos en el extremo C-terminal ( importante para la presentación óptima del epitopo en moléculas de HLA de clase I. Véase, SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 45, Enero 2012). Estos péptidos solapantes varían en longitud desde 11-27 aminoácidos. 3. Inmunogeno de células T El inmunogeno de células T se ha diseñado como un polipéptido y ensamblado de 16 segmentos del genoma de VIH-1 de tamaño variable (entre 11 y 78 aa) unificado por enlazadores de triple alanina. La descripción de las regiones incluía: Longitud total: 529 (incluyendo enlazadores A , AA o AAA) 4. Inclusión de una secuencia líder Los péptidos señal generalmente son secuencias de aminoácidos muy hidrofóbicas (de 15 a 60 aminoácidos de longitud) de proteínas que deben cruzar a través de membranas para llegar a su localización celular de funcionamiento. Uniéndose a partículas de reconocimiento señal, estas secuencias dirigen complejos proteína naciente-ribosoma a una membrana donde la proteína se inserta durante la traducción. Los péptidos señal dirigen la captación traduccional de la proteina por varias membranas (por ejemplo, retículo endoplásmico, mitocondria, cloroplasto, peroxisoma) . Las secuencias señal líder en proteínas no membranosas se elimina finalmente por peptidasas específicas.

Algunos péptidos señal usados incluyen quimioquina CP-3, para fomentar la secreción y atracción de células presentadoras de antígeno; un péptido derivado de catenina (CATE) para degradación proteosómica aumentada; y la proteína lisosomal asociada, LAMP1 para dirigirse al compartimento de MHC II. Véase, Rosati M, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2009; 106:15831-15836.

En el presente diseño, se introdujo el péptido señal de GMCSF (factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos) en el extremo amino del inmunógeno para aumentar la secreción del inmunógeno de células que lo expresan, seguido por una valina para aumentar la estabilidad. La secuencia de péptido señal de GMCSF es: MWLQSLLLLGTVACSIS (SEQ ID NO: 46) 5. Inclusión de una etiqueta para experimentos de expresión in vi tro Para el fin de evaluar la expresión en células transíectadas , la secuencia inmunógeno incluía primero un péptido FLAG en la región C-terminal, antes del codón de terminación, era: DYKDDDDKL (SEQ ID NO: 48) El sistema FLAG utiliza un péptido corto, hidrofilico de 8 aminoácidos, que se fusiona a la proteina recombinante de interés. El péptido FLAG incluye el sitio de unión para varios anticuerpos monoclonales ANTI-FLAG muy específicos (MI, M2, M5; Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, EE UU) , que se pueden usar para evaluar la expresión de la proteína de interés en material de células transf ectadas .

Debido al pequeño tamaño de la etiqueta peptídica FLAG, no cubre otros epítopos, dominios o altera la función, secreción o transporte de la proteína de fusión en general. Esta secuencia se eliminó después para el ensayo de inmunogenicidad en ratones. La etiqueta FLAG se elimina del inmunógeno final (298H) antes de la inmunización. 6. Descripción del inmunógeno de célula T El inmunógeno de células T tiene la siguiente secuencia ( SEQ ID NO: 49) : M W L Q S L L L L G T V A C S I S V (E K I R L R P G G K K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V N P G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L K S L Y N T V A T L Y C V H Q K I E VJsi A A A (K A F S P E V I P M F S A L)S2 A A A (G H Q A A M Q M L K E)s3 A A A (I A P G Q M R E P R G S D I A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G L N K I V R M Y S P T S I)s4 A A A (Y V D R F Y K T L R A E Q A)s5 A (A C Q G V G G P G H K A R V L)s6 A A A (C T E R Q A N F L G K I W P S H K G R P G N F L Q S R)S7 A A (K M I G G I G G F I K V R Q Y D Q I L I E I C G H K A I G T V L V G P T P V N I I G R N L L T Q I G C T L N F)S8 A A A (L V E I C T E M E K E G K I S K I)sg A A A (L R W G F T T P D K K H Q K E P P F L W M G Y E L H P D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L V G K L)Sio A A A (I L K E P V H G V Y Y D P S K D L I A E I Q K Q G Q G Q W T Y Q I Y)sn A A A (T K E L Q K Q I T K I Q N F R V Y Y R D S R D P L W K G P A K L L W)si2 A A A (K I I R D Y G K Q M A G D D C V A)Si3 A A (V K H H M Y I S K K A K G W F Y R H H Y E S T H P R)si4 A A A (V T K L T E D R W N K P Q K T K G H R)si5 A A (A W L E A Q E E E E V G F)Si6 D Y K D D D D K L en donde, el péptido señal de GMCSF se muestra subrayado, la valina que sigue inmediatamente a la secuencia está destacada, los enlazadores de A única, dual o triple (AAA) se muestran en negrita, el epítopo FLAG (eliminado en la construcción final para estudios in vivo) se muestra en cursiva y los diferentes segmentos se muestran en paréntesis como sigue: 7. Optimización de codones de la secuencia de nucleótidos La secuencia de inmunógeno de células T se tradujo a ARN/secuencia de nucleótido optimizada de codones para aumentar la expresión y secreción (Mr. Gene GmbH, Regensburg, DE) . La optimización de codones se basó en introducir múltiples cambios de nucleótidos para destruir las secuencias de procesamiento de ARN, inhibidora e inestabilidad previamente identificadas en el ARNm sin afectar a la proteina codificada. Véase, Schwartz S, et al., J. Virol. 1992; 66(12): 7176-7182. Este proceso también puede incluir la eliminación de sitios de ayuste predichos (puntuación>0, 4 ) de las secuencias codificantes por cambios de codones apropiados, para minimizar la posibilidad de ayuste.

Como resultado de los cambios de nucleótidos indicados anteriormente, el contenido en GC final del inmunógeno de células T fue del 63%. La secuencia de nucleótidos con codones optimizados completa del inmunógeno es (SEQ ID NO: 50) : ATGTGGCTCC AGAGCCTGCT ACTCCTGGGG ACGGTGGCCT GCAGCATCTC GGTCGAGAAG 61 ATCCGGCTGC GGCCAGGCGG AAAGAAGAAG TACAAGCTGA AGCACATCGT CTGGGCCTCG 121 AGGGAGCTGG AGCGGTTCGC GGTGAACCCG GGACTTCTGG AGACGTCGGA GGGGTGCAGG 181 CAGATCCTCG GCCAGCTGCA GCCCTCTCTG CAAACGGGGT CTGAGGAGCT GAAGAGCCTG 241 TACAACACGG TGGCGACCCT CTACTGCGTC CACCAGAAGA TCGAGGTGGC AGCGGCCAAG 301 GCGTTCTCGC CGGAGGTCAT CCCCATGTTC TCGGCGCTGG CAGCTGCCGG ACACCAGGCC 361 GCGATGCAGA TGCTGAAGGA GGCCGCTGCG ATCGCACCGG GCCAGATGAG GGAGCCACGC 421 GGTTCCGACA TCGCGGGAAC CACCTCGACG CTCCAGGAGC AGATCGGATG GATGACGAAC 481 AACCCGCCAA TCCCGGTCGG GGAGATCTAC AAGCGGTGGA TCATCCTCGG GCTGAACAAG 541 ATCGTCCGGA TGTACAGCCC GACGTCGATC GCTGCGGCAT ACGTTGACCG GTTCTACAAG 601 ACCCTGAGGG CCGAGCAGGC AGCGGCCTGC CAGGGGGTCG GTGGACCAGG GCACAAGGCC 661 CGAGTGCTCG CGGCCGCATG CACGGAGCGG CAGGCGAACT TCCTGGGGAA GATCTGGCCG 721 TCGCACAAGG GCCGACCGGG AAACTTCCTC CAGTCTCGCG CAGCGGCTAA GATGATCGGA 781 GGCATCGGAG GCTTCATCAA AGTCCGTCAG TACGACCAGA TCCTCATCGA GATCTGCGGG 841 CACAAGGCGA TCGGAACCGT GCTCGTCGGC CCAACGCCCG TGAACATCAT CGGCCGCAAC 901 CTGTTAACGC AGATCGGCTG CACCCTCAAC TTCGCCGCAC TAGTGGAGAT CTGCACGGAG 961 ATGGAGAAGG AGGGCAAGAT ATCGAAGATC GCGGCAGCTC TGAGGTGGGG CTTCACCACG 1021 CCGGACAAGA AGCACCAGAA GGAGCCGCCA TTCCTGTGGA TGGGATACGA GCTGCACCCG 1081 GACAAGTGGA CCGTGCAGCC CATCGTCCTG CCGGAGAAGG ACTCGTGGAC GGTGAACGAC 1141 ATCCAGAAGC TCGTGGGGAA GCTGGCGGCA GCCATCCTCA AGGAGCCCGT CCACGGGGTG 1201 TACTACGACC CCTCTAAGGA CCTGATCGCG GAGATCCAGA AGCAGGGGCA GGGTCAGTGG 1261 ACCTACCAGA TCTACGCAGC AGCAACCAAG GAGCTGCAGA AGCAGATCAC GAAGATCCAG 1321 AACTTCCGCG TATACTACCG CGACTCGCGG GACCCCCTGT GGAAGGGCCC TGCGAAGCTT 1381 CTCTGGGCAG CCGCGAAGAT CATCCGGGAC TACGGCAAGC AGATGGCGGG CGACGACTGC 1441 GTGGCCGCAG CGGTGAAGCA CCATATGTAC ATCTCGAAGA AGGCGAAGGG CTGGTTCTAC 1501 AGACACCACT ACGAGTCCAC CCACCCCAGG GCAGCTGCGG TGACGAAGCT GACGGAGGAC 1561 CGGTGGAACA AGCCCCAGAA GACGAAGGGT CACCGGGCGG CTGCATGGCT GGAGGCTCAG 1621 GAGGAGGAGG AGGTGGGCTT CGATTACAAG GACGATGACG ACAAGCTGtg ataa en donde la secuencia que codifica el péptido señal de GMCSF está subrayada, el codón de valina inmediatamente después de la secuencia que codifica la secuencia señal se muestra destacada, la secuencia que codifica el polipéptido inmunógeno se muestra en letras normales, la secuencia que codifica la etiqueta Flag se muestra en cursiva y los codones de terminación tga y taa se muestran en minúscula. 8. Estrategia de clonación El inmunógeno de células T con codones optimizados se clonó en el plásmido de expresión en mamíferos BV5, que consiste en un esqueleto de plásmido básico de CMV modificado optimizado para el crecimiento en bacterias que tiene el promotor del citomegalovirus (CMV) humano, el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y el gen de resistencia a kanamicina -sin el sitio Xho . Los pasos de clonación fueron como sigue: 1) En un primer paso, se introdujo un cambio de aminoácido de Leu a Met en el inmunógeno de células T sintetizado -uno que incluye el epítopo FLAG en la posición 41 de RT (segmento 9) para cubrir uno de los sitios de mutación de resistencia antirretroviral principales. El gen del inmunógeno de células T (vector inicial) se clonó en un plásmido que tiene resistencia a espectomicina . Se insertó un segmento generado por PCR que cubría el cambio M41 en RT en el inmunógeno de células T como Spel/HindIII . Se usaron células DH108B competentes para la transformación y se cultivaron en medio LB-espectomicina . El plásmido resultante se nombró HIVACAT RT M41. La inserción de la mutación puntual se confirmó por secuenciación por PCR usando cebadores sentido y antisentido que cubren la secuencia del segmento 9.

En un segundo paso, el gen HIVACAT RT M41 se insertó en el plásmido BV5 que carece del sitio X o en el gen de resistencia a kanamicina como SalI/EcoRI, por ligación del vector y del fragmento de HIVACAT RT M41 digerido purificado en gel. Se usaron células DH108B competentes para la transformación y se cultivaron en medio LB-Kan. El nombre del plásmido resultante fue 297H (GMCSF-HIVACAT-FLAG) . La inserción del gen se confirmó por digestión de restricción y secuenciación por PCR usando cebadores sentido (desde el promotor de C V) y antisentido (desde la región poliA de BGH) . En un tercer paso, el epítopo para la etiqueta FLAG se eliminó del plásmido 297H por digestión con BstEII-EcoRI y la inserción se hibridó con los cebados 298H Plus y 298H inus : 298HPlus GTCACCGGGCGGCTGCATGGCTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGAGGTGGGCTTCt gataaG (SEQ ID NO: 51) 298H Minus aattCttatcaGAAGCCCACCTCCTCCTCCTCCTGAGCCTCCAGCCATGCAGCC GCCCG (SEQ ID NO: 52) El plásmido resultante se nombró 298H GMCSF-HIVACAT, número de acceso DSM 25555) . Véase la figura 1. La eliminación de la etiqueta FLAG se confirmó por secuenciación por PCR usando cebadores antisentido (desde la región poliA de BGH) .

Ejemplo 1 Estudios de expresión in vitro Se realizaron varias trans fecciones transitorias para evaluar la expresión, localización y estabilidad del inmunógeno de células T HIVACAT .

Brevemente, se sembraron lxlO6 células 293 humanas en DMEM completo más suero bovino fetal (SBF) al 10% en placas de cultivo de 60 mm y se dejaron adherir durante la noche. Las células HEK 293 se trans fectaron por coprecipitación de ADN con fosfato de Ca con un total de 7 pg de ADN (100 ng o 250 ng de ADN del plásmido 297H GMCSF-HIVACAT-FLAG, 50 ng de plásmido que expresa GFP pFRED143 completado hasta 7 g con ADN de Bluescript) . 6 horas después de la transfección el medio se cambió con 3 mi de DMEM suplementado con STF al 2%. Después de 24 y 48 horas las células y los sobrenadantes se recogieron en RIPA 0,5X.

Se analizó la expresión de proteínas por inmunotransferencia . Se cargaron 1/250 del total de extractos y sobrenadantes celulares. Las proteínas se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio al 10% (Nu-Page Bis-Tris, NuPAGE, Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, EE UU) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa .

El plásmido 297H se detectó tras probar las membranas con anticuerpo monoclonal anti-FLAG conjugado con peroxidasa de rábano (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, O, EE UU) a una dilución 1:3.000.

Las bandas se visualizaron usando ECL. Se hicieron imágenes de las membranas en un ChemiDoc XRS+.

Se usaron controles positivos e incluían ADN de plásmido gue codifica p55 Gag del ciado B, que también tenia la etiqueta FLAG.

Se probaron extractos celulares de transfecciones transitorias usando el plásmido 298H (que codifica el inmunógeno de células T HIVACAT sin la etiqueta FLAG) con suero humano de un sujeto infectado con VIH-1 a una dilución 1:3.000 seguido por un anti-IgG humano conjugado a peroxidasa de rábano, dilución 1:10.000.

Los plásmidos 297H y 298H expresaron establemente (misma cantidad estimada a las 24 horas y 48 horas) la construcción de inmunógeno de células T HIVACAT, que se visualizó en el compartimento de extracto celular. No hubo evidencia de secreción de la construcción.

Ejemplo 2 Respuesta celular en ratones Se produjo una solución madre de 1 mi (2 mg/ml) de ADN de 298H G CSF-HIVACAT sin endotoxina para estudios in vivo en ratones .

Se evaluó la inmunogenicidad del inmunógeno de células T HIVACAT en ratones C57BL/6 hembra de 6-8 semanas de edad (Charles River Labs, Inc., Frederick, MD, EE UU) .

Se administraron 20 g y 5 µg de ADN por vía intramuscular mediante electroporación usando el sistema Inovio (Inovio Pharmaceuticals , Inc., Blue Bell, PA, EE UU) en los cuádriceps izquierdo y derecho (20 µ?/50 µ? por dosis, 25 µ? por sitio) en la semana 0 y 4. Los ratones se sacrificaron 2 semanas después de la última inmunización. Se recogieron esplenocitos y suero de los ratones para estudios de inmunogenicidad . Los ADN controles usados fueron : 1) 114H p55gag ciado B: expresa la proteina gag entera; 2) 132H NTV: expresa una proteina quimérica de nef, tat y vif 3) 133H pol: expresa la proteina pol entera; y 4) BV4 C V-Kan-Básico : control de referencia, esqueleto de plásmido de ADN similar sin transgén expresado.

Se usaron 35 ratones en el experimento, agrupando 5 ratones por grupo. La distribución de la inmunización por grupo fue como sigue: Las respuestas inmunitarias celulares se caracterizaron en un primer paso usando tinción de citoquina intracelular (ICS) en mezclas de esplenocitos (células de 5 ratones que pertenecían al grupo) y usando un conjunto de péptidos solapantes que cubren las proteínas gag, pol, nef, tat y vif enteras.

Brevemente, las mezclas de esplenocitos de ratón aislados de cada grupo de ratones se incubaron a una densidad de 2<106 células/ml, en un cocultivo de 1 mi durante la noche, en presencia de conjuntos de péptidos (15-meros, solapantes en 11 aa que cubren gag de ciado B, pol B consenso y secuencias de nef, tat y vif de NL43, 1 pg/ml de cada péptido, total de aproximadamente 12 horas, 1 hora sin parada de Golgi para prevenir la secreción de citoquinas) . La inmunotinción de superficie se realizó con CD3-aloficocianina-Cy7, CD4-PerCP, CD8-Azul Pacifico (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, EE UU) . La tinción de citoquinas intracelulares se realizó usando anticuerpo de interferón gamma-FITC (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, EE UU) después de permeabilizar .

Desde los primeros análisis de inmunogenicidad, tanto 20 g como 5 g de ADN en ratones C57BL/6 generaron respuestas detectables de interferón gamma a gag entera, pol y conjuntos de péptidos nef-tat-vif. Véase la figura 2a. Se muestra la distribución de respuestas CD4+ y CD8+. Véase la figura 2b.

A nivel de ratones individual, las respuestas se desentrañaron usando esplenocitos congelados estimulados con 8 conjuntos de péptidos para cubrir las subunidades de proteína incluidas en el inmunógeno en un ensayo ELISpot de interferón gamma.

El ensayo ELISpot se realizó usando el kit de ELISpot de interferón gamma de ratón (ALP) (Mabtech AB, Estocolmo, SE) según las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. Para todos los ensayos, se añadieron esplenocitos de ratón a un número de células aportado de 4?105 células/pocilio en 140 µ? de medio RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% en placas de polivinilideno de 96 pocilios (Millipore Corp., Bedford, MA, EE UU) solo o con conjuntos de péptidos específicos de VIH-1 (concentración final para cada péptido, 14 g/ml) durante 16 horas a 37°C en CO2 al 5%. Ocho conjuntos de péptidos, que cada uno contenía entre 2 y 12 péptidos de 18 aminoácidos basados en la secuencia consenso B 2001 se agruparon en diferentes subunidades proteicas (gag-pl7, gag-p24, gag-p2p7plp6 , pol-RT, pol-proteasa, pol-integrasa, vif y nef) que abarcaban los segmentos incluidos en el inmunógeno de células T HIVACAT. Véase, http://hiv-web . lanl . gov/content/hiv-db/CONSENSUS/M_GROUP/Consensus .html, enero 2012. Los conjuntos de péptidos de VIH usados en ratones inmunizados con ADN que expresan las proteínas gag, pol, nef, tat y vif enteras, consistían en péptidos 18-meros con un solapamiento de 11 residuos que abarcan las proteínas gag (6 conjuntos, 11 péptidos/cada uno), pol (8 conjuntos, 16 o 17 péptidos/cada uno), nef (2 conjuntos, 13 ol4 péptidos/cada uno), tat (1 conjunto, 12 péptidos) y vif (2 conjuntos, 12 péptidos/cada uno) completas.

Se usó concavalina A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, EE UU) , a 5 mg/ml, como control positivo. Las placas se revelaron con un paso fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitroazul de tetrazolio (BCIP/NBT; Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, EE UU) . Las manchas en las placas se contaron usando un sistema lector de ELISPOT automatizado (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, EE UU) usando software ImmunoSpot y la magnitud de las respuestas se expresó como células formadoras de manchas (CFM) por millón de esplenocitos aportados. El umbral para respuestas positivas se definió como al menos 5 manchas por pocilio y respuestas que superaban el "número medio de manchas en pocilios de controles negativos más 3 desviaciones estándar de los pocilios de controles negativos" y "tres veces la media de los pocilios de controles negativos", el que fuera más alto. 1) El dominio de respuestas de interferón gamma desarrolladas en ratones inmunizados con plásmidos que codifican las proteínas gag, pol, nef, tat y vif enteras era hacia regiones fuera de los segmentos cubiertos del inmunógeno de células T HIVACAT (la relación mediana de respuestas que se dirigen a regiones del inmunógeno HIVACAT/gag+pol+nef+tat+vif total fue 0,26 (intervalo 0,17-0,42)) y no se diferenciaba entre grupos inmunizados con dosis alta (20 g) o dosis baja (5 g) de ADN . Véase la figura 3. 2) La amplitud mediana de las respuestas a subunidades proteicas incluidas en la secuencia del inmunógeno de células T HIVACAT fue 4 (intervalo 2-5) en ratones inmunizados con 20 µg de HIVACAT frente a 2 respuestas (intervalo 1-3) en ratones inmunizados con 20 µg de plásmidos que codifican proteínas enteras (ns) sin diferencias significativas en la magnitud de las respuestas. Seis de las ocho subunidades proteicas eran al menos una vez objetivo en los ratones inmunizados con el inmunógeno de células T HIVACAT. Véase las figuras 4a y 4b. 4) El dominio de las respuestas en ratones inmunizados con plásmidos que codifican las proteínas enteras de gag, pol, nef, tat y vif fue del 89% dirigido principalmente hacia gag, mientras que en ratones inmunizados con el inmunógeno de células T HIVACAT a dosis altas fue más equilibrado hacia todos los componentes proteicos (gag, pol, vif y nef) contenidos en el inmunógeno. Véase las figuras 5a y 5b.

Ej empl o 3 Respuesta humoral en ratones Las respuestas humorales se analizaron primero en mezclas de suero de ratones. Se detectaron anticuerpos de unión a p24, p37 y p55 por inmunotransferencia usando extractos celulares de células HEK 293 transfectadas con 1 mg de los vectores de expresión de gag, separados en SDS-PAGE al 12% y probando las membranas con mezclas de suero de ratones (a una dilución 1:100) . Los títulos de anticuerpo contra gag p24 se midieron por ELISA. Se evaluaron diluciones en serie de 4 veces de las muestras de mezclas de suero y se determinó la absorbancia a 450 nm (Advanced BioScience Lab, Inc., ensington, MD, EE UU) . Los títulos de unión se describieron como la dilución mayor con puntuación positiva que tenia un valor mayor que la media más 3 desviaciones estándar obtenida con sueros control de los ratones inmunizados con ADN de referencia. a) Desde los primeros análisis de inmunogenicidad humoral, el inmunógeno de células T HIVACAT indujo respuestas de anticuerpos de unión a gag p55, p37 y p24 detectables por inmunotransferencia en los grupos de ratones inmunizados con 20 µg. Véase las figuras 6a a 6c. b) Los anticuerpos de unión a p24 se cuantificaron por ELISA. Los titulo finales del anticuerpo de unión especifico para p24-gag de los ratones que recibieron los plásmidos descritos se determinaron por ELISA de muestras de mezclas de suero individuales diluidas en serie 4 veces. En el grupo de dosis alta de ratones inmunizados con el inmunógeno de células T HIVACAT a un titulo de 1:4.000 que fueron menores que los títulos detectados en ratones inmunizados con la construcción de gag completa. Los anticuerpos de unión a p24 no fueron medibles en el grupo de dosis baja. Véase la figura 7a. A nivel de ratones individuales, se realizó un ELISA para gag p55 desarrollado internamente usando la proteína recombinantes VIH-1IIIB pr55 gag (No. de catálogo 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, EE UU) con sueros de ratón a una dilución 1:1000. Se detectaron niveles bajos de anticuerpo en 2 de 3 ratones inmunizados con dosis altas del inmunógeno. Véase la figura 7b.

Ejemplo 4 Inmunogenicidad in vivo por sensibilización/refuerzo heterólogo en ratones ATERIALES Y MÉTODOS Preparación de las vacunas pDNA-HIVACAT y MVA-HIVACAT Se clonó el inmunógeno de células T con codones optimizados en el plásmido de expresión en mamífero BV5, que consiste en un esqueleto plasmídico básico de CMV modificado optimizado para crecimiento en bacterias que tiene el promotor de citomegalovirus (CMV) humano, el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y el gen de resistencia a kanamicina que carece del sitio Xho . El ADN de plásmido para las inmunizaciones de ratones se preparó usando Endo-Free Megaprep (Qiagen) y se almacenó a -80°C hasta su uso.

Se hizo un MVA recombinante que expresa el gen HIVACAT como se describe previamente {Letourneau, 2007 #235; Nkolola, 2004 #321}. Brevemente, se infectaron fibroblastos de pollo embrionarios (CEF) crecidas en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con SBF al 10%, penicilina/estreptomicina y glutamina (DMEM 10) con MVA parental a MOI 1 y se transíectaron usando Superfectin (Qiagen) con 3 pg de pDNA-HIVACAT que tiene el gen de la ß-galactosidasa como marcador. Dos días después, el virus total se recogió y usó para reinfectar células CEF. MVA se sometió a cinco rondas de purificación en placa, después de lo cual se hizo crecer una cepa de virus maestro, se purificó en un colchón de sacarosa al 36%, se tituló y se almacenó a -80°C hasta su uso.

Inmunogenicidad in vivo en ratones C57BL/6 Para los experimentos de inmunogenicidad in vivo de sensibilización/refuerzo heterólogo en ratones, se usaron grupo de cinco hembras C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (Harían Laboratories Ltd., Barcelona, España) . Los ratones se sensibilizaron por vía intramuscular con 100 µg de pDNA- HIVACAT (2 o 3 vacunaciones) seguido por un refuerzo de 10?6 ufp de MVA-HIVACAT (grupos: 2xADN, 3xADN, 2xADN + 1MVA y 3xADN + 1 MVA, respectivamente) . Todas las vacunaciones estaban separadas por tres semanas.

Todos los ratones se sacrificaron dos semanas después de la última vacunación en cada experimento. Se recogieron esplenocitos y suero de ratón para los estudios de inmunogenicidad . Los bazos se retiraron y se comprimieron individualmente a través de un filtro de células (Falcon) usando un émbolo de goma de jeringuilla de 5 mi. Después de la lisis de los glóbulos rojos, los esplenocitos se lavaron y resuspendieron en RP I 1640 suplementado con SFT al 10%, penicilina/estreptomicina (RIO) y se congelaron hasta su uso .

Todos los procedimientos y cuidados animales fueron aprobados por un comité de ética local.

Péptldos solapantes y distribución de grupos de péptldos Para evaluar la inmunogenicidad de las pautas heterólogas fueron pDNA o MVA que expresaban solo el inmunógeno de células T HIVACAT y para descartar inmunogenicidad de los potenciales epitopos de la unión se sintetizó de nuevo un conjunto de péptidos solapantes de 147 péptidos de 15 aminoácidos de longitud (solapantes en 11 residuos) que abarcan el inmunógeno de células T HIVACAT entero (incluyendo la secuencia líder y las regiones enlazadoras) usando química de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) . Los péptidos se distribuyeron en 18 grupos diferentes, según las subunidades proteicas y segmentos del inmunógeno (1 grupo para la secuencia del péptido señal, n=4 péptidos; 7 grupos para Gag, n=8-ll péptidos /cada uno; 7 grupos para Pol, n=5-ll péptidos /cada uno; 2 grupos para Vif, n=6-8 péptidos/cada uno y 1 grupo para Nef, n=2 péptidos) . Los resultados se presentan agrupados por respuestas de IF Y específicas para las ocho subunidades proteicas (Gag pl7, Gag p24, Gag p2p7plp6, Pol-proteasa, Pol-RT, Pol-integrasa, Vif y Nef ) .

Ensayo ELISPOT de IFNy marino Se realizó el ensayo ELISPOT usando el kit ELISpot de IFNY de ratón (ALP) (Mabtech AB, Estocolmo, SE) según las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. Para todos los ensayos, primero se descongelaron los esplenocitos de ratón congelados y se dejaron reposar durante 5 horas a 37°C en RIO antes de su uso. Las células se añadieron a un número de células de entrada de 4xl05 células/pocilio en 140 µ? de RIO en placas de polivinilideno de 96 pocilios ( illipore Corp., Bedford, MA, EE UU) solas o con grupos de péptidos específicos de VIH-1 (concentración final de 14 µg/ml para cada péptido) durante 16 horas a 37°C en CO2 al 5%. Se usó concavalina A ( Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, EE UU) a 5 mg/ml, como un control positivo. Las placas se revelaron con fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitoazul de tetrazolio (BCIP/NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, EE UU) en un paso. Las manchas en las placas se contaron usando un sistema lector de ELISPOT automatizado (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, EE UU) usando software ImmunoSpot y la magnitud de las respuestas se expresó como células formadoras de manchas (CFM) por millón de esplenocitos de entrada. Se definió el umbral para las respuestas positivas como al menos 5 manchas por pocilio y respuestas que superaban el "número medio de manchas en los pocilios de control negativo más 3 desviaciones estándar de los pocilios de control negativo" y "tres veces la media de los pocilios de control negativo", el que fuera más alto.

RESULTADOS En estos experimentos como no se inmunizaron ratones usando plásmidos que codifican proteínas enteras, un segundo conjunto de péptidos solapantes que coinciden con la secuencia exacta del inmunógeno se sintetizó y usó para las comparaciones de inmunogenicidad. Tres inmunizaciones intramusculares (i.m.) con 100 ]iq de pDNA-HIVACAT pudieron inducir frecuencias de respuestas de IFNy en todos los ratones que eran comparables a las frecuencias de respuestas de IFNy inducidas por inmunizaciones con el sistema de electroporación Inovio. Sin embargo, se encontró que dos vacunaciones i.m. con pDNA eran inmunógenas solo en tres animales (60%) comparado con el 100% de los animales que inducían una respuesta después de tres inmunizaciones i.m. con pDNA. De forma interesante, la vacuna de MVA-HIVACAT pudo aumentar las respuestas tanto en amplitud como en magnitud (figura 8B) en dos grupos analizados, pero solo aumentó significativamente la magnitud de las respuestas cuando los ratones se habían sensibilizado previamente con tres dosis de pDNA-HIVACAT (figura 8B y 8C) . Como se ve en los experimentos de EP previos, se observó una respuesta equilibrada y amplia a la mayoría de todas las subunidades proteicas incluidas en el inmunógeno en todos los animales, sin un patrón claro de dominancia entre ellos. No se detectaron respuestas específicas a nef o gag-pl5 en los ratones estudiados (figura 8D) .

**** Mientras que la invención se describe en algún detalle para fines de claridad y entendimiento, el experto en la materia apreciará de una lectura de esta divulgación que se pueden hacer varios cambios en forma y detalle sin separarse del verdadero ámbito de la invención y reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones mencionadas anteriormente en el presente documento se incorporan al mismo en su totalidad por referencia.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias SEQ ID NO 1-16 o variantes de dichas SEQ ID NO: 1-16, en donde cada una de dichas variantes tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos, siempre que dicha secuencia de aminoácidos no comprenda ningún tramo de secuencia derivado del genoma de VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferentes de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO 1-16 o las variantes de las mismas. El polipéptido inmunógeno según la reivindicación 1 en donde al menos dos secuencias están unidas por un enlazador aminoacidico, en donde dicho enlazador aminoacidico produce la formación de una región de secuencia AAA en la región de unión entre secuencias contiguas . El polipéptido inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 49. Un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16 o una variante de las mismas en donde dicha variante tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos, siempre que : i) dicha secuencia de aminoácidos no comprenda ningún tramo de secuencia derivado del genoma de VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferentes de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO 1-16 o la variante de las mismas, y ii) cuando el inmunógeno comprende solo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16, entonces esta secuencia no se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 5, 6 y 16. El inmunógeno según la reivindicación 4 en donde, si dicho inmunógeno comprende al menos dos secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas, dichas secuencias están unidas por un enlazador de aminoácidos, en donde dicho enlazador produce la formación de una región de secuencia AAA en la región de unión entre secuencias contiguas . El inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende al menos un sitio de mutación de resistencia antirretroviral y, preferiblemente, en donde dicho sitio de mutación de resistencia antirretroviral está localizado en cualquiera de SEQ ID NO 9-11. El inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además un péptido señal en el extremo N. El inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha variante tiene una longitud de 8 a 40 aminoácidos, más preferiblemente, una longitud de 11 a 27 aminoácidos. El inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el aminoácido C-terminal de dicha variante no es G, P, E, D, Q, N, T, S ni C. El inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha variante se selecciona del grupo que consiste en los péptidos según SEQ ID NO 17-45. El inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha variante se fusiona a una proteina de choque térmico. Un ácido nucleico que codifica el inmunógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11. Un ácido nucleico según la reivindicación 12 que tiene codones optimizados para expresión en células humanas. El ácido nucleico de la reivindicación 13, en donde dicho ácido nucleico tiene la secuencia según SEQ ID NO 50. Un cásete de expresión que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, una secuencia promotora, una 3'-UTR y, opcionalmente, un marcador de selección. I -81- 16. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12-14 o el cásete de expresión de la reivindicación 15. virus que comprende el ácido nucleico de cualquiera las reivindicaciones 12-14. El virus según la reivindicación 17, en donde dicho virus es un virus vaccinia Ankara modificado Una célula que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, el cásete de expresión de la reivindicación 15, el vector de expresión de la reivindicación 16 o el virus de cualquiera de las reivindicaciones 17-18. Una vacuna que comprende un polipéptido inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y uno o más adyuvantes . El péptido inmunógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, el ácido nucleico de las reivindicaciones 12-14, el cásete de expresión de la reivindicación 15, el vector de expresión de la reivindicación 16, el virus de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, la célula de la reivindicación 19 o la vacuna según la reivindicación 20 para su uso en medicina. 22. El péptido inmunógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, el ácido nucleico de las reivindicaciones 12-14, el cásete de expresión de la reivindicación 15, el vector de expresión de la reivindicación 16, el virus de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, la célula de la reivindicación 19 o la vacuna según la reivindicación 20 para su uso en la prevención o tratamiento de una infección por VIH o una enfermedad asociada con una infección por VIH. El péptido inmunógeno, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus, la célula o la vacuna para uso según la reivindicación 22, dicho uso comprende la administración secuencial de: i) un primer péptido inmunógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, ácido nucleico de las reivindicaciones 12-14, cásete de expresión de la reivindicación 15, vector de expresión de la reivindicación 16, virus de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, célula de la reivindicación 19 o vacuna según la reivindicación 20 y ii) un segundo péptido inmunógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, ácido nucleico de las reivindicaciones 12-14, cásete de expresión de la reivindicación 15, vector de expresión de la reivindicación 16, virus de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, célula de la reivindicación 19 o vacuna según la reivindicación 20. El péptido inmunógeno, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus, la célula o la vacuna para uso según la reivindicación 23, en donde el primer péptido inmunógeno, ácido nucleico, casete de expresión, vector de expresión, virus, célula o vacuna son diferentes del segundo péptido inmunógeno, ácido nucleico, cásete de expresión, vector de expresión, virus, célula o vacuna. El péptido inmunógeno, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus, la célula o la vacuna para uso según la reivindicación 24, en donde se administra un vector de expresión según la reivindicación 16 seguido por la administración de un virus vaccinia Ankara modificado según la reivindicación 18. El péptido inmunógeno, el ácido nucleico, el cásete de expresión, el vector de expresión, el virus, la célula o la vacuna para uso según la reivindicación 25, en donde el vector de expresión según la reivindicación 16 se administra al menos dos veces. Un kit que comprende el inmunógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, el ácido nucleico de las reivindicaciones 12-14, el cásete de expresión de la reivindicación 15, el vector de expresión de la reivindicación 16, el virus de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, la célula de la reivindicación 19 o la vacuna según la reivindicación 20. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos inmunógenos basados en péptidos solapantes (OLP) y péptidos derivados de los mismos útiles para la prevención y tratamiento de SIDA y sus enfermedades oportunistas relacionadas. La invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados, vectores y células huésped que expresan estos inmunógenos asi como vacunas que incluyen dichos inmunógenos.