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MX2014009052A - Variantes de lipasa y polinucleotidos que las codifican. - Google Patents

Variantes de lipasa y polinucleotidos que las codifican.

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MX2014009052A
MX2014009052A MX2014009052A MX2014009052A MX2014009052A MX 2014009052 A MX2014009052 A MX 2014009052A MX 2014009052 A MX2014009052 A MX 2014009052A MX 2014009052 A MX2014009052 A MX 2014009052A MX 2014009052 A MX2014009052 A MX 2014009052A
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MX
Mexico
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variant
lipase
seq
mature polypeptide
polynucleotide
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MX2014009052A
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MX353911B (es
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Carsten Hoerslev Hansen
Luise Erlandsen
Allan Svendsen
Jesper Vind
Carsten Peter Sönksen
Original Assignee
Novozymes As
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Publication date
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Publication of MX353911B publication Critical patent/MX353911B/es

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Abstract

La presente invención se refiere a variantes de lipasa y a métodos para obtenerlas. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes, a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos; y a métodos para utilizar las variantes.

Description

VARIANTES DE LIPASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE LAS CODIFICAN CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a variantes de lipasa, a polinucleótidos que codifican las variantes, a métodos para producir las variantes y a métodos para utilizar las variantes. La presente invención proporciona variantes de lipasa con unas propiedades mejoradas en comparación con su progenitor. En particular, las variantes son más estables en presencia de catalizadores orgánicos tales como derivados de tipo sulfato zwitteriónicos de 3 , 4 -dihidroisoquinolina .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Cuando se desean generar composiciones de limpieza eficaces, las lipasas se encuentran entre los diferentes componentes empleados en la formulación de tales composiciones. Sin embargo, la actividad de las lipasas se puede ver afectada por la presencia de los demás componentes incluidos. En particular, se ha demostrado que la introducción de algunos catalizadores de la decoloración desactiva ciertas enzimas. Este problema de compatibilidad constituye un reto que no se puede superar siempre de forma satisfactoria solamente mediante la formulación.
El documento WO07/001262 se refiere a composiciones de limpieza que comprenden catalizadores orgánicos con una mayor compatibilidad enzimática, y a procesos para preparar y Ref . :249713 utilizar tales composiciones, donde los catalizadores son derivados de tipo sulfato zwitteriónicos de 3,4-dihidroisoquinolina. Se ha demostrado que los catalizadores tienen una mayor compatibilidad con las amilasas pero no con las lipasas.
Por consiguiente, se necesitan lipasas que tengan una mayor compatibilidad con los catalizadores orgánicos, tales como los derivados de tipo sulfato zwitteriónicos de 3,4-dihidroisoquinolina, y métodos para sintetizarlas.
SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un método para obtener una variante de lipasa que comprende introducir en una lipasa progenitora una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37, N39 o G91 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa y, en comparación con la lipasa progenitora, tiene un rendimiento mejorado en presencia de un catalizador orgánico seleccionado del grupo constituido por catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: c) mezclas de estas, mezclas de estos, donde cada Rl es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 3 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 1 a 24 carbonos; y recuperar la variante.
La presente invención también se refiere a una variante de lipasa que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,N39AÍC,D/E,F,G,I,K,L,M,P, Q,R,T,V,W,Y y G91D,H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa.
La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican las variantes; a constructos de ácido nucleico, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos; y a métodos para producir las variantes.
Definiciones Lipasa: El término "lipasa" o las expresiones "enzima lipolítica" o "esterasa de lípidos" se refieren a una enzima de la clase EC 3.1.1, tal como se define según la nomenclatura de enzimas. Puede tener actividad lipasa (triacilglicerol-lipasa, EC 3.1.1.3), actividad cutinasa (EC 3.1.1.74) , actividad esterol-esterasa (EC 3.1.1.13) y/o actividad hidrolasa de ésteres tipo cera (EC 3.1.1.50) . A efectos de la presente invención, la actividad lipasa se determina de acuerdo con el procedimiento que se describe en los Ejemplos. En un aspecto, las variantes de la presente invención tienen al menos un 20%, por ejemplo, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 100% de la actividad lipasa del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
Variante alélica: La expresión "variante alélica" se refiere a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica aparece de manera natural debido a una mutación y puede generar polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
ADNc: El término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm maduro, que ya ha experimentado corte y empalme, obtenida de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de las secuencias intrónicas que puedan estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, que incluyen el corte y empalme, antes de aparecer como un ARNm maduro que ya ha experimentado corte y empalme.
Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los límites de la secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, el cual comienza con un codón de iniciación, tal como ATG, GTG o TTG, y finaliza con un codón de terminación tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de estos.
Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, procedente del mismo gen) o exógena (es decir, procedente de un gen diferente) respecto al polinucleótido que codifica la variante o pueden ser nativas o exógenas entre sí. Las secuencias de control de este tipo incluyen, sin carácter limitante, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia de tipo péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.
Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso que interviene en la producción de una variante, incluidas, sin carácter limitante, la transcripción, modificación posterior a la transcripción, traducción, modificación posterior a la traducción y secreción.
Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN circular o lineal que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está ligada operablemente a secuencias de control que permiten su expresión.
Fragmento: El término "fragmento" se refiere a un polipéptido que tiene uno o más (p. ej . , varios) aminoácidos ausentes en el extremo amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad lipasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% y al menos un 95% del número de aminoácidos del polipéptido maduro.
Condiciones de rigurosidad alta: La expresión "condiciones de rigurosidad alta" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 50% de formamida, siguiendo procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 65 °C.
Célula hospedera: La expresión "célula hospedera" se refiere a cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción o similares con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación.
Propiedad mejorada: La expresión "propiedad mejorada" se refiere a una característica asociada con una variante que se mejora en comparación con el progenitor. Tales propiedades mejoradas incluyen un rendimiento mejorado en presencia de un catalizador orgánico. En algunas modalidades, la invención se refiere a un catalizador orgánico seleccionado del grupo constituido por catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: Fórmula 1; Fórmula 2 ; o c) mezclas de estas, mezclas de estos, donde cada Rl es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 3 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 1 a 24 carbonos, en particular en donde R es 2-butiloctilo, y preferente la estabilidad mejorada es en presencia de la Fórmula 2 en donde R es 2-butiloctilo.
Aislado: El término "aislado" se refiere a una sustancia en una forma o entorno que no se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no sea de origen natural, (2) cualquier sustancia que incluye, sin carácter limitante, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor que se haya separado, al menos en parte, de uno o más o de todos los constituyentes de origen natural con los cuales está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por intervención humana respecto a la sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada incrementando la cantidad de la sustancia respecto a otros componentes con los cuales está asociada de manera natural (p. ej . , copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; el uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado de manera natural con el gen que codifica la sustancia) . Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.
Condiciones de rigurosidad baja: La expresión "condiciones de rigurosidad baja" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 25% de formamida, siguiendo procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 50 °C.
Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" se refiere a un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualesquiera modificaciones posteriores a la traducción, tales como el procesamiento del N-terminal, truncación del C-terminal, glucosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1-269 de la SEQ ID NO: 2.
Secuencia que codifica el polipéptido maduro: La expresión "secuencia que codifica el polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que posee actividad lipasa. En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 67-873 de la SEQ ID NO : 1.
Condiciones de rigurosidad media: La expresión "condiciones de rigurosidad media" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 35% de formamida, siguiendo procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 55 °C.
Condiciones de rigurosidad media-alta: La expresión "condiciones de rigurosidad media-alta" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridicación e hibridación a 42 "C en 5x SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 35% de formamida, siguiendo procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 60 °C.
Mutante: El término "imitante" se refiere a un polinucleótido que codifica una variante.
Constructo de ácido nucleico: La expresión "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenaria, la cual se aisla a partir de un gen de origen natural o se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de un modo sintético o que no existiría en la naturaleza de otro modo, que comprende una o más secuencias de control.
Ligado operablemente: La expresión "ligado operablemente" se refiere a una configuración en la cual una secuencia de control se coloca en una posición adecuada respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de modo que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.
Progenitor o lipasa progeni ora: El término "progenitor" o la expresión "lipasa progenitora" se refiere a una lipasa en la cual se le realiza una sustitución para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. El progenitor puede ser un polipéptido que se encuentre en la naturaleza (de origen natural) o una variante o un fragmento de este.
Identidad secuencial: El grado de correlación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad secuencial". A efectos de la presente invención, la identidad secuencial entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferentemente la versión 5.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión del hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62) . El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula tal como se indica a continuación: (Residuos idénticos x 100 )/ (Longitud de la alineación -Número total de huecos en la alineación) Para los efectos de la presente invención, la identidad secuencial entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, mencionado anteriormente) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, mencionado anteriormente), preferentemente la versión 5.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión del hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4) . El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula tal como se indica a continuación: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100 )/ (Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación) Subsecuencia: El término " subsecuencia" se refiere a un polinucleótido que tiene uno o más (p. ej . , varios) nucleótidos ausentes en el extremo 5' y/o 3' de la secuencia codificante de un polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica el fragmento que tiene actividad lipasa. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% y al menos un 95% del número de nucleótidos de la secuencia codificante del polipéptido maduro.
Variante: El término "variante" se refiere a un polipéptido que tiene actividad lipasa que comprende una sustitución en una o más (p. ej . , varias) posiciones. Una sustitución se refiere al reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente. Las variantes de la presente invención tienen al menos un 20%, por ejemplo, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% o al menos un 100% de la actividad lipasa del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.
Condiciones de rigurosidad muy alta: La expresión "condiciones de rigurosidad muy alta" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 50% de formamida, siguiendo procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 70 °C.
Condiciones de rigurosidad muy baja: La expresión "condiciones de rigurosidad muy baja" se refiere, para sondas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, a una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y un 25% de formamida, siguiendo procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12-24 horas. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS a 45 °C.
Lipasa de origen natural: La expresión lipasa "de origen natural" se refiere a una lipasa expresada por un microorganismo de origen natural tal como una bacteria, levadura u hongo filamentoso que se encuentra en la naturaleza.
Convenciones para designar las variantes Para los efectos de la presente invención, el polipéptido maduro que se describe en la SEQ ID NO: 2 se utiliza para determinar el residuo aminoacídico correspondiente en otra lipasa. La secuencia de aminoácidos de otra lipasa se alinea con el polipéptido maduro que se describe en la SEQ ID NO: 2 y, basándose en la alineación, el número de la posición aminoacídica correspondiente a cualquier residuo aminoacídico del polipéptido maduro descrito en la SEQ ID NO: 2 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J". Mol. Biol. 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferentemente la versión 5.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión del hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62) .
La identificación del residuo aminoacídico correspondiente en otra lipasa puede determinarse mediante una alineación de múltiples secuencias polipeptídicas utilizando varios programas informáticos incluido, sin carácter limitante, MUSCLE (comparación de múltiples secuencias mediante una expectativa-log; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) y EMBOS EMMA. que emplea ClustalW (1.83 o versiones posteriores; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), utilizando sus parámetros predeterminados respectivos.
Cuando la otra enzima difiere del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 de modo tal que una comparación tradicional basada en las secuencias no consiga detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol . 295: 613-615), se pueden utilizar otros algoritmos de comparación de secuencias por pares. Se puede obtener una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que emplean representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para realizar búsquedas en bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso iterativo de búsqueda en bases de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede obtener una sensibilidad incluso mayor si la familia o superfamilia para el polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras proteicas. Los programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de varias fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructurales y potenciales de solvatación) como entrada para una red neural que predice el plegamiento estructural para una secuencia problema. De forma similar, el método de Gough et al., 2000, J". Mol. Biol . 313: 903-919 se puede utilizar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilias presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones se pueden utilizar a su vez para generar modelos de homología para el polipéptido y tales modelos se pueden evaluar para determinar su exactitud utilizando varias herramientas desarrolladas con este fin.
Para proteínas de estructura conocida, se dispone de varias herramientas y recursos para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias SCOP de proteínas han sido alineadas estructuralmente, y estas alineaciones son accesibles y se pueden descargar. Se pueden alinear dos o más estructuras proteicas utilizando varios algoritmos tales como la matriz de alineación a distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y se puede utilizar adicionalmente la implementación de estos algoritmos para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés con el fin de descubrir posibles homólogos estructurales (p. ej . , Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
A la hora de describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura que se describe a continuación se adapta para facilitar su referencia. Se emplean las abreviaturas de los aminoácidos de tres letras o de una única letra aceptadas por la IUPAC.
Sustituciones . Para la sustitución de aminoácidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 con alanina se denomina "Thr226Ala" o "T226A" . Las mutaciones múltiples se separan mediante el símbolo de la suma ("+"), p. ej . , "Gly205Arg + Ser411Phe" o "G205R + S411F" que representa sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) y serina (S) con fenilalanina (F) , respectivamente.
Sustituciones múltiples. Las variantes que comprenden sustituciones múltiples se separan mediante el símbolo de la suma ("+"), p. ej . , "Argl70Tyr+Glyl95Glu" o "R170Y+G195E" que representa una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 con tirosina y ácido glutámico, respectivamente .
Sustituciones diferentes. Cuando se pueden introducir alteraciones diferentes en una posición, las diferentes alteraciones se separan por medio de una coma, p. ej . , "Argl70Tyr, Glu" o "R170Y,E" que representa una sustitución de arginina en la posición 170 con tirosina o ácido glutámico. Así pues, "Tyrl67Gly, Ala +Argl70Gly, Ala" designa las siguientes variantes: "Tyrl67Gly +Argl70Gly" , "Tyrl67Gly +Argl70Ala", "Tyrl67Ala +Argl70Gly" y "Tyrl67Ala +Argl70Ala" .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Variantes La presente invención se refiere a variantes de lipasa aisladas que comprenden una sustitución en una o más (p. ej . , varias) posiciones correspondientes a las posiciones T37A,D,E,F,G,H,I(L,N/P,Q,R,S,V,W,Yf 39A,C,D,E,F,G,I,K,L>M P, Q,R,T,V, ,Y y G91D,H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa.
En una modalidad, la variante presenta una identidad secuencial de al menos un 60%, p. ej . , al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos de un 100%, respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipasa progenitora.
En otra modalidad, la variante presenta al menos un 60%, p. ej . , al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos de un 100% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En un aspecto, el número de sustituciones en las variantes de la presente invención es 1-20, p. ej . , 1-10 y 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 sustituciones.
En otro aspecto, una variante comprende una sustitución en una o más (p. e j . , varias) posiciones correspondientes a las posiciones T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M, P,Q,R,T,V,W,Y y G91D,H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, una variante comprende una alteración en dos posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones T37A,D,E,F,G,H, I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y, N39A, C, D,E, F,G, I, K, L,M, P,Q,R,T, V,W, Y, y G91D,H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, una variante comprende una alteración en tres posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones T37A, D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y, y G91D,H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por una sustitución en una posición correspondiente a la posición T37 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 que se sustituye con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente con Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr o Val. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución T37A, T37D, T37E, T37F, T37G, T37H, T37I, T37L, T37N, T37P, T37Q, T37R, T37S, T37V, T37W o T37Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por una sustitución en una posición correspondiente a la posición N39 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 que se sustituye con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie. Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente con Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr o Val. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución N39A, N39C, N39D, N39E, N39F, N39G, N39I, N39K, N39L, N39M, N39P, N39Q, N39R, N39T, N39V, N39W, N39Y del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por una sustitución en una posición correspondiente a la posición G91 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 que se sustituye con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente con Asp, Gln, His, lie o Pro. En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por la sustitución G91D, G91H, G91I, G91P, G91Q o incluso G91A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto preferido, la variante comprende o está constituida por una sustitución en una posición correspondiente a G91 que es G91A.
En otra modalidad, se combina cualquiera de estas sustituciones en la posición 37, 39 y/o 91 con una o más de T231R y N233R, preferentemente con ambas.
En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones T37 y N39, tales como aquellas descritas anteriormente.
En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones T37 y G91, tales como aquellas descritas anteriormente.
En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones N39 y G91, tales como aquellas descritas anteriormente.
En otro aspecto, la variante comprende o está constituida por sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones T37, N39 y G91, tales como aquellas descritas anteriormente.
Las variantes pueden comprender además una o más sustituciones adicionales en una o más (p. ej . , varias) posiciones diferentes.
Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; supresiones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el C-terminalarboxilo, tales como un residuo de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como una región de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Algunos ejemplos de sustituciones conservadoras son las sustituciones dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos de bajo peso molecular (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) .
De forma alternativa, los cambios de los aminoácidos son de una naturaleza tal que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos se alteran. Por ejemplo, los cambios de los aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.
Por ejemplo, las variantes pueden comprender una sustitución en una posición correspondiente a las posiciones D96, T143, A150, E210, G225, T231, N233 y P250 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, la sustitución se selecciona entre D96G, T143A, A150G, E210Q, G225R, T231R, N233R y P250R.
En algunas modalidades, la invención se refiere a variantes seleccionadas entre: G91Q +T143A +E210Q +T231R +N233R +P250R G91Q +A150G +E210Q +T231R +N233R +P250R T37R +N39R +G91A +D96G +T231R +N233R G91Q +E210Q +T231R +N233R +P250R G91I +E210Q +T231R +N233R +P250R G91A +D96G +T231R +N233R G91A +D96G +G225R +T231R +N233R G91N +E210Q +T231R +N233R +P250R G91L +E210Q +T231R +N233R G91A +D96G +A150G +T231R +N233R Los aminoácidos esenciales de un polipéptido se pueden identificar de acuerdo con procedimientos de uso común en la técnica tales como la mutagénesis dirigida o la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la técnica más reciente, se introducen mutaciones de una única alanina en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutadas resultantes se ensayan para determinar su actividad lipasa y para identificar los residuos aminoacídicos que son cruciales para la actividad de la molécula. Remítase también a Hilton et al., 1996, J. Biol . Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante el análisis físico de la estructura, tal como se determina mediante técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o mareaje de fotoafinidad, junto con la mutación de posibles aminoácidos del sitio de contacto. Remítase, por ejemplo, a de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett . 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede deducir a partir de una alineación con un polipéptido relacionado .
Las variantes pueden estar constituidas por al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% y al menos un 95% del número de aminoácidos del polipéptido maduro.
En una modalidad, la variante tiene un rendimiento mejorado en presencia de un componente decolorante o una mezcla de más de uno. Los componentes decolorantes adecuados incluyen catalizadores de la decoloración, fotodecolorantes, activadores de la decoloración, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados y mezclas de estos. En general, el componente decolorante puede estar presente en una cantidad comprendida entre aproximadamente un 0.00001 y un 90% en peso, preferentemente entre un 0.0001% y aproximadamente un 50% o incluso entre aproximadamente un 0.001% y aproximadamente 25% del componente decolorante en peso de una composición de limpieza. Los ejemplos de componentes decolorantes adecuados incluyen : (1) Perácidos preformados: Los perácidos preformados adecuados incluyen, sin carácter limitante, compuestos seleccionados entre el grupo constituido por peroxiácidos preformados o sales de estos, normalmente un ácido peroxicarboxílico o una sal de este, o un ácido peroxisulfónico o una sal de este.
El peroxiácido preformado o la sal de este es preferentemente un ácido peroxicarboxílico o una sal de este que normalmente tiene una estructura química que se corresponde con la siguiente fórmula química: donde: R14 se selecciona entre alquilo, aralquilo, cicloalquilo, arilo o grupos heterocíclicos ; el grupo R14 puede estar sustituido o no sustituido y ser lineal o ramificado; e Y es cualquier contraión adecuado que consiga neutralizar la carga eléctrica, preferentemente Y se selecciona entre hidrógeno, sodio o potasio. Preferentemente, R14 es un alquilo C6-9 sustituido o no sustituido, lineal o ramificado. Preferentemente, el peroxiácido o la sal de este se selecciona entre el ácido peroxihexanoico, ácido peroxiheptanoico, ácido peroxioctanoico, ácido peroxinonanoico, ácido peroxidecanoico, cualquiera de sus sales o cualquier combinación de estos . Los peroxiácidos particularmente preferidos son los ácidos ftalimidoperoxialcanoicos , en particular el ácido e-ftalimidoperoxihexanoico (PAP) . Preferentemente, el peroxiácido o la sal de este tiene un punto de fusión comprendido en el intervalo de 30 °C a 60 °C.
El peroxiácido preformado o la sal de este también puede ser un ácido peroxisulfónico o una sal de este que normalmente tiene una estructura química que se corresponde con la siguiente fórmula química: donde: R15 se selecciona entre alquilo, aralquilo, cicloalquilo, arilo o grupos heterocíclicos ; el grupo R15 puede estar sustituido o no sustituido y ser lineal o ramificado; y Z es cualquier contraion adecuado que consiga neutralizar la carga eléctrica, preferentemente Z se selecciona entre hidrógeno, sodio o potasio. Preferentemente, R15 es un alquilo C6-9 sustituido o no sustituido, lineal o ramificado. Preferentemente, tales componentes decolorantes pueden estar presentes en una composición en una cantidad comprendida entre un 0.01 y un 50%, aún más preferentemente entre un 0.1% y un 20%. (2) Las fuentes de peróxido de hidrógeno incluyen, por ejemplo, sales perhidratadas inorgánicas, incluidas las sales de metales alcalinos tales como las sales sódicas de perborato (normalmente mono- o tetrahidratadas) , percarbonato, persulfato, perfosfato, persilicato y mezclas de estas. En un aspecto de la invención, las sales perhidratadas inorgánicas son como las seleccionadas entre el grupo constituido por las sales sódicas de perborato, percarbonato y mezclas de estos. Cuando se emplean las sales perhidratadas inorgánicas, normalmente están presentes en cantidades comprendidas entre un 0.05 y un 40% en peso o entre un 1 y un 30% en peso del total de la composición, y normalmente se incorporan en tales composiciones como un sólido cristalino que puede estar revestido. Los revestimientos adecuados incluyen sales inorgánicas tales como sales silicato, carbonato o borato de metales alcalinos o mezclas de estas, o materiales orgánicos tales como polímeros dispersables o solubles en agua, ceras, aceites o jabones grasos.
Preferentemente, tales componentes decolorantes pueden estar presentes en una composición en una cantidad comprendida entre un 0.01 y un 50%, aún más preferentemente entre un 0.1% y un 20%. (3) Los activadores de la decoloración adecuados son aquellos que contienen R- (C=0) -L donde R es un grupo alquilo, opcionalmente ramificado, que contiene de 6 a 14 átomos de carbono o de 8 a 12 átomos de carbono, cuando el activador de la decoloración es hidrófobo, y menos de 6 átomos de carbono o incluso menos de 4 átomos de carbono, cuando el activador de la decoloración es hidrófilo; y L es un grupo saliente. Algunos ejemplos de los grupos salientes adecuados son el ácido benzoico y sus derivados - especialmente el bencenosulfonato . Los activados de la decoloración adecuados incluyen el dodecanoiloxibencenosulfonato, decanoiloxibencenosulfonato, ácido decanoiloxibenzoico o sales de este, 3 , 5 , 5-trimetilhexanoiloxibencenosulfonato, tetraacetiletilendiamina (TAED) y nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS) . En el documento W098/17767 también se describen activadores de la decoloración adecuados. Aunque se puede emplear cualquier activador de la decoloración adecuado, en un aspecto de la invención, la composición de limpieza en cuestión puede comprender NOBS, TAED o mezclas de estos. Cuando está presente, el perácido y/o el activador de la decoloración generalmente está presente en el producto de consumo en una cantidad comprendida entre un 0.1 y aproximadamente un 60% en peso, entre aproximadamente un 0.5 y aproximadamente un 40% en peso e incluso entre aproximadamente un 0.6 y aproximadamente un 10% en peso en función de la tela y el producto de limpieza doméstica. Se pueden utilizar uno o más perácidos hidrófobos o precursores de estos combinados con uno o más perácidos hidrófilos o precursores de estos. Preferentemente, tales componentes decolorantes pueden estar presentes en una composición en una cantidad comprendida entre un 0.01 y un 50%, aún más preferentemente entre un 0.1% y un 20%.
Las cantidades de la fuente de peróxido de hidrógeno y del perácido o activador de la decoloración se pueden seleccionar de modo que la proporción molar de oxígeno disponible (de la fuente de peróxido) respecto al perácido sea de 1:1 a 35:1 o incluso de 2:1 a 10:1. (4) Peróxidos de diacilo - las especies decolorantes de tipo peróxido de diacilo incluyen aquellas seleccionadas entre los peróxidos de diacilo de fórmula general: Rx-C(0) -00- (O)C-R2 en donde R1 representa un alquilo C6-Ci8, preferentemente un grupo alquilo C6-C12 que contiene una cadena lineal de al menos 5 átomos de carbono y que contiene opcionalmente uno o más sustituyentes (p. ej . , -N+(CH3)3, -COOH o -CN) y/o uno o más restos interruptores (p. ej . , -CONH- o -CH=CH-) interpuestos entre átomos de carbono adyacentes del radical alquilo, y R2 representa un grupo alifático compatible con un resto peróxido, de modo que R1 y R2 contengan entre los dos un total de 8-30 átomos de carbono. En un aspecto preferido, R1 y R2 son cadenas de alquilo C6-Ci2 no sustituidas lineales. Aún más preferentemente, R1 y R2 son idénticos. Se prefieren particularmente los peróxidos de diacilo en los que tanto R1 como R2 son grupos alquilo C6-C12- Preferentemente, al menos uno de los grupos R (R1 o R2) , aún más preferentemente solo uno de ellos, no contiene ramificaciones ni anillos laterales en la posición alfa, o preferentemente ni en las posiciones alfa ni beta, o aún más preferentemente en ninguna de las posiciones alfa ni beta ni gamma. En otra modalidad preferida, el DAP puede ser asimétrico, de modo que preferentemente la hidrólisis del grupo acilo R1 sea rápida para generar el perácido, pero la hidrólisis del grupo acilo R2 sea lenta.
La especie decolorante de tipo peróxido de tetraacilo se selecciona preferentemente entre los peróxidos de tetraacilo de fórmula general : R3 -C(O) -OO-C(O) - (CH2)n-C(0) -OO-C(O) - R3 en donde R3 representa un grupo alquilo Ci-C9, preferentemente un grupo C3-C7, y n representa un número entero comprendido entre 2 y 12, preferentemente entre 4 y 10 inclusive .
Preferentemente, la especie decolorante de tipo peróxido de diacilo y/o tetraacilo está presente en una cantidad suficiente para proporcionar al menos 0.5 ppm, más preferentemente al menos 10 ppm e incluso más preferentemente al menos 50 ppm en peso de las aguas de lavado. En una modalidad preferida, la especie decolorante está presente en una cantidad suficiente para proporcionar entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 300 ppm, más preferentemente entre aproximadamente 30 y aproximadamente 150 ppm en peso de las aguas de lavado.
Preferentemente, el componente decolorante comprende un catalizador de la decoloración (5 y 6) . (5) Se prefieren los catalizadores de la decoración orgánicos (no metálicos) que incluyen los catalizadores de la decoloración capaces de aceptar un átomo de oxígeno de un peroxiácido y/o una de sus sales, y de transferir el átomo de oxígeno a un sustrato oxidable. Los catalizadores de la decoloración adecuados incluyen, sin carácter limitante: cationes y poliiones imínicos; zwitteriones imínicos; aminas modificadas; óxidos de aminas modificadas; iV-sulfoniliminas ; N-fosfoniliminas ; N-aciliminas ; dióxidos de tiadiazol; perfluoroiminas ; cetonas de azúcares cíclicos y mezclas de estos .
Los cationes y poliiones imínicos adecuados incluyen, sin carácter limitante, tetrafluoroborato de N-metil-3,4-dihidroisoquinolinio, preparado como se describe en Tetrahedron (1992), 49(2), 423-38 (remítase, por ejemplo, al compuesto 4 de la pág. 433) ; p-toluenosulfonato de N-metil-3 , 4-dihidroisoquinolinio, preparado como se describe en el documento US5360569 (remítase, por ejemplo, a la Columna 11 del Ejemplo 1); y p- toluenosulfonato de .W-octil-3 , 4-dihidroisoquinolinio, preparado como se describe en el documento US5360568 (remítase, por ejemplo, a la Columna 10 del Ej emplo 3 ) .
Los zwitteriones iminícos adecuados incluyen, sin carácter limitante, N- (3-sulfopropil) -3 , 4-dihidroisoquinolinio, sal interna, preparada como se describe en el documento US5576282 (remítase, p. ej . , a la Columna 31 del Ejemplo II); N- [2- (sulfooxi)dodecil] -3,4-dihidroisoquinolinio, sal interna, preparada como se describe en el documento US5817614 (remítase, por ejemplo, a la Columna 32 del Ejemplo V) ; 2- [3- [ (2-etilhexil)oxi] -2- (sulfooxi)propil] -3,4-dihidroisoquinolinio, sal interna, preparada como se describe en el documento WO05/047264 (remítase, por ejemplo, al Ejemplo 8 de la página 18) , y 2- [3- [ (2-butiloctil) oxi] -2-(sulfooxi) propil] -3 , 4-dihidroisoquinolinio, sal interna.
Los catalizadores que transfieren oxígeno de tipo amina modificada adecuados incluyen, sin carácter limitante, 1 , 2 , 3 , 4 - tetrahidro-2 -metil - 1 - isoquinolinol , que se puede preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en Tetrahedron Letters (1987), 28(48) , 6061-6064. Los catalizadores que transfieren oxígeno de tipo óxido de amina modificada adecuados incluyen, sin carácter limitante, 1-hidroxi-N-oxi-Itf- [2 - (sulfooxi ) decil] -1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina sódica.
Los catalizadores que transfieren oxígeno de tipo N-sulfonilimina adecuados incluyen, sin carácter limitante, 1,1-dióxido de 3 -metil-1 , 2 -benzisotiazol , preparado de acuerdo con el procedimiento descrito en Journal of Organic Chemistry (1990), 55(4) , 1254-61.
Los catalizadores que transfieren oxígeno de tipo N-fosfonilimina adecuados incluyen, sin carácter limitante, la amida [R- (E) ] -N- [ (2-cloro-5-nitrofenil)metileno] -P-fenol-P- (2,4,6-trimetilfenil) fosfínica, que se puede preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1994), (22) , 2569-70.
Los catalizadores que transfieren oxígeno de tipo N-acilamina adecuados incluyen, sin carácter limitante, [N{E) ] -N- ( fenilmet ilen) acetamida, que se puede preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en Polish Journal of Chemistry (2003) , 77(5) , 577-590.
Los catalizadores que transfieren oxígeno de tipo dióxido de tiadiazol adecuados incluyen, sin carácter limitante, 1,1-dióxido de 3-metil-4-fenil-l, 2 , 5-tiadiazol, que se puede preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento US5753599 (Columna 9 del Ejemplo 2) .
Los catalizadores que transfieren oxígeno de tipo perfluoroimina adecuados incluyen, sin carácter limitante, fluoruro de (Z)-2,2,3,3,4,4 , 4-heptafluoro-N- (nonaflúorobuti1 ) butanimidoílo , que se puede preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en Tetrahedron Letters (1994), 35(34), 6329-30.
Los catalizadores que transfieren oxígeno de tipo cetona de azúcar cíclico adecuados incluyen, sin carácter limitante, 1,2:4, 5 -di -O- isopropilideno-D-eritro-2 , 3-hexodiuro-2 , 6-piranosa como se prepara en el documento US6649085 (Columna 12 del Ejemplo 1) .
Preferentemente, el catalizador de la decoloración comprende un grupo funcional iminio y/o carbonilo, y normalmente es capaz de formar un grupo funcional oxaziridinio y/o dioxirano al aceptar un átomo de oxígeno, especialmente al aceptar un átomo de oxígeno de un peroxiácido y/o una sal de este. Preferentemente, el catalizador de la decoloración comprende un grupo funcional oxaziridinio y/o es capaz de formar un grupo funcional oxaziridinio al aceptar un átomo de oxígeno, especialmente al aceptar un átomo de oxígeno de un peroxiácido y/o una sal de este. Preferentemente, el catalizador de la decoloración comprende un grupo funcional iminio cíclico, preferentemente donde el resto cíclico tiene un tamaño del anillo de entre cinco y ocho átomos (incluido el átomo de nitrógeno) , preferentemente seis átomos. Preferentemente, el catalizador de la decoloración comprende un grupo funcional ariliminio, preferentemente un grupo funcional ariliminio bicíclico, preferentemente un grupo funcional 3 , 4 -dihidroisoquinolinio . Normalmente, el grupo funcional imínico es un grupo funcional imínico cuaternario y normalmente es capaz de formar un grupo funcional oxaziridinio cuaternario al aceptar un átomo de oxígeno, especialmente al aceptar un átomo de oxígeno de un peroxiácido y/o una sal de este. En otro aspecto, la composición detergente comprende un componente decolorante que tiene un logP0/w que no es superior a 0, no es superior a -0.5, no es superior a -1.0, no es superior a -1.5, no es superior a -2.0, no es superior a -2.5, no es superior a -3.0 o que incluso no es superior a -3.5. El método para determinar logP0/w se describe más detalladamente más adelante .
Normalmente, el ingrediente decolorante es capaz de generar una especie decolorante con un Xso comprendido entre 0.01 y aproximadamente 0.30, entre 0.05 y aproximadamente 0.25 o incluso entre aproximadamente 0.10 y 0.20. El método para determinar XSo se describe más detalladamente más adelante. Por ejemplo, los ingredientes decolorantes que tienen una estructura de isoquinolinio son capaces de generar una especie decolorante con una estructura de oxaziridinio. En este ejemplo, el Xso es el de la especie colorante oxaziridínica .
Preferentemente, el catalizador de la decoloración tiene una estructura química que se corresponde con la siguiente fórmula química donde : n y m son independientemente de 0 a , preferentemente n y m son ambos 0; cada R1 se selecciona independientemente entre un radical sustituido o no sustituido seleccionado entre el grupo constituido por Q hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, arilo condensado, anillo heterocíclico, anillo heterocíclico condensado, nitro, halo, ciano, sulfonato, alcoxi, ceto, radicales carboxílicos y carboalcoxi ; y dos sustituyentes R1 adyacentes cualesquiera se pueden combinar para formar un arilo condensado, anillo 5 carboxílico condensado o heterocíclico condensado; cada R2 se selecciona independientemente entre un radical sustituido o no sustituido seleccionado independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxi, alquilo, cicloalquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alquílenos, anillo heterocíclico, 0 alcoxis, grupos arilcarbonilo, grupos carboxialquilo y grupos amida; cualquier R2 se puede unir con cualquier otro R2 para formar parte de un anillo común; cualquier otro R2 germinal se puede combinar para formar un carbonilo; y dos R2 cualesquiera se pueden combinar para formar un resto insaturado condensado sustituido o no sustituido; R3 es un alquilo C!-C2o sustituido o no sustituido; R4 es hidrógeno o el resto Qt-A, donde: Q es un alquileno ramificado o no ramificado, t = O o l y A es un grupo aniónico seleccionado entre el grupo constituido por 0S03", S03~, C02", 0C02~, OP032", OP03H" y 0P02"; R5 es hidrógeno o el resto -CR11R12-Y-Gb-Yc-[ (CR9R10) y-0] k- 8, donde: cada Y se selecciona independientemente del grupo constituido por 0, S, N-H o N-R8; y cada R8 se selecciona independientemente del grupo constituido por alquilo, arilo y heteroarilo, estando los restos sustituidos o no sustituidos, y conteniendo los restos ya sean sustituidos o no sustituidos menos de 21 carbonos; cada G se selecciona independientemente entre el grupo constituido por CO, S02, SO, PO y P02; R9 y R10 se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo C1-C4; R11 y R12 se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por H y alquilo, o cuando se consideran a la vez se pueden juntar para formar un carbonilo; b = 0 o 1; c puede ser = 0 o 1, pero c debe ser = 0 si b = 0; y es un número entero comprendido entre 1 y 6 ; k es un número entero comprendido entre 0 y 20; R6 es H, o un resto alquilo, arilo o heteroarilo; estando los restos sustituidos o no sustituidos; y X, si está presente, es un contraión que compensa la carga adecuado, preferentemente X está presente cuando R4 es hidrógeno, un X adecuado, incluidos pero sin carácter limitante: cloruro, bromuro, sulfato, metosulfato, sulfonato, p-toluenosulfonato, tetrafluoruro de boro y fosfato .
En una modalidad de la presente invención, el catalizador de la decoloración tiene una estructura que se corresponde con la siguiente fórmula general : donde R13 es un grupo alquilo ramificado que contiene 3 a 24 átomos de carbono (incluidos los átomos de carbono ramificados) o un grupo alquilo lineal que contiene de 1 a 24 átomos de carbono; preferentemente R13 es un grupo alquilo ramificado que contiene de 8 a 18 átomos de carbono o un grupo alquilo lineal que contiene de 8 a 18 átomos de carbono; preferentemente R13 se selecciona entre el grupo constituido por 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo; preferentemente R13 se selecciona entre el grupo constituido por 2-butiloctilo, 2 -pentilnonilo, 2-hexildecilo, isotridecilo e isopentadecilo.
Preferentemente, el componente decolorante comprende una fuente de perácido además del catalizador de la decoloración, en particular un catalizador de la decoloración orgánico. La fuente de perácido se puede seleccionar entre (a) un perácido preformado; (b) una sal percarbonato, perborato o persulfato (fuente de peróxido de hidrógeno) preferentemente combinada con un activador de la decoloración; y (c) una enzima perhidrolasa y un éster para formar perácido in situ en presencia de agua en un paso de tratamiento de una superficie dura o textiles.
Cuando está presente, el perácido y/o el activador de la decoloración generalmente está presente en una composición en una cantidad comprendida entre aproximadamente un 0.1 y aproximadamente un 60% en peso, entre aproximadamente un 0.5 y aproximadamente un 40% en peso o incluso entre aproximadamente un 0.6 y aproximadamente un 10% en peso en función de la composición. Se pueden utilizar uno o más perácidos hidrófobos o precursores de estos combinados con uno o más perácidos hidrófilos o precursores de estos.
Las cantidades de la fuente de peróxido de hidrógeno y del perácido o activador de la decoloración se pueden seleccionar de modo que la proporción molar de oxígeno disponible (de la fuente de peróxido) respecto al perácido sea de 1:1 a 35:1 o incluso de 2:1 a 10:1. (6) Catalizadores de la decoloración que contienen metales - el componente decolorante puede ser proporcionado por un complejo metálico catalítico. Un tipo de catalizador de la decoloración que contiene un metal es un sistema catalítico que comprende un catión de un metal de transición con actividad catalítica de la decoloración definida, tal como cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, wolframio, molibdeno o manganeso, un catión metálico auxiliar con poca actividad catalítica de la decoloración o sin ella, tal como cationes de zinc o aluminio, y un secuestrante con constantes de estabilidad definida para los cationes metálicos auxiliares y catalíticos, en particular el ácido etilendiaminotetraacético, ácido etilendiaminotetra(metilenofosfónico) y sales hidrosolubles de estos. Tales catalizadores se describen en el documento US4430243. Los catalizadores preferidos se describen en los documentos O09/839406, US6218351 y WO00/012667. Se prefieren en particular los catalizadores de metales de transición o ligandos de estos que son ligandos donantes de N polidentados retropuenteados .
Si se desea, las composiciones de la presente pueden ser catalizadas por medio de un compuesto manganésico. Tales compuestos y niveles de uso son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los catalizadores basados en manganeso descritos en el documento US5576282.
Los catalizadores de la decoloración de cobalto útiles en la presente son conocidos se describen, por ejemplo, en el documento US5597936; US5595967. Tales catalizadores de cobalto se preparan fácilmente mediante métodos conocidos, como los que se describen en los documentos US5597936 y US5595967.
Las composiciones de la presente también pueden incluir convenientemente un complejo de un metal de transición con ligandos tales como bispidonas (US7501389) y/o ligandos rígidos macropolicíclicos - abreviados como "MRL" , por sus siglas en inglés. En la práctica y sin carácter limitante, las composiciones y los procesos de la presente se pueden ajustar para proporcionar del orden de al menos una parte por cien millones de la especie MRL activa en el medio de lavado acuoso, y normalmente proporcionarán entre aproximadamente 0.005 ppm y aproximadamente 25 ppm, entre aproximadamente 0.05 ppm y aproximadamente 10 ppm o incluso entre aproximadamente 0.1 ppm y aproximadamente 5 ppm del MRL en las aguas de lavado.
Los metales de transición adecuados en el catalizador de la decoloración de un metal de transición de la presente incluyen, por ejemplo, manganeso, hierro y cromo. Los MRL adecuados incluyen 5 , 12 -dietil - 1 , 5 , 8 , 12 -tetraazabiciclo [6.6.2] hexadecano. Los MRL de metales de transición adecuados se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos como los que se describen, por ejemplo, en los documentos US6225464 y WOOO/32601. (7) Fotodecolorantes - los fotodecolorantes adecuados incluyen, por ejemplo, tintes de ftalocianina de zinc sulfonada, ftalocianinas de aluminio sulfonadas, xanteno y mezclas de estos. Los componentes decolorantes preferidos para utilizar en las presentes composiciones de la invención comprenden una fuente de peróxido de hidrógeno, un activador de la decoloración y/o un peroxiácido orgánico, generados opcionalmente in situ mediante la reacción de una fuente de peróxido de hidrógeno y un activador de la decoloración, combinados con un catalizador de la decoloración. Los componentes decolorantes preferidos comprenden catalizadores de la decoloración, preferentemente catalizadores de la decoloración orgánicos, como los descritos anteriormente.
Los componentes decolorantes particularmente preferidos son los catalizadores de la decoloración, en particular los catalizadores de la decoloración orgánicos.
Las composiciones pueden ser composiciones de tratamiento y/o limpieza sólidas o líquidas, o una composición con una forma de dosificación unitaria mono- o multicompartimental .
En una modalidad, la variante tiene un rendimiento mejorado en presencia de un catalizador orgánico seleccionado del grupo constituido por catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: Fórmula 1 ; Fórmula 2 ; c) mezclas de estas, donde cada Rl es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 3 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 1 a 24 carbonos.
En algunas modalidades, Rl es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 8 a 18 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 8 a 18 carbonos. En algunas modalidades, Rl se selecciona independientemente entre el grupo constituido por 2 -propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2 -hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo . Preferentemente, Rl se selecciona entre el grupo constituido por 2 -butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, isotridecilo e isopentadecilo. Las variantes preferidas tienen un rendimiento mejorado en presencia de una catalizador de fórmula b) en donde R es 2-butiloctilo.
El catalizador orgánico se utiliza normalmente en una cantidad que proporciona 0.001-0.02 g de material activo por litro de aguas de lavado, o en una cantidad que proporciona de 0.01 a 4.5, de 0.5 a 4.0, de 1.0 a 3.5, de 1.5 a 3.0 o de 2.0 a 2.5 ppm de material activo por litro de aguas de lavado.
En algunas modalidades, una fuente de peroxiácidos orgánicos está presente como un agente decolorante. La fuente de peroxiácidos orgánicos puede ser un perácido preformado o un peróxido de diacilo, o puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno y un activador de la decoloración. Los agentes decolorantes adecuados incluyen peróxidos de diacilo, activadores de la decoloración, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados y mezclas de estos.
En general, cuando se utiliza un agente decolorante, las composiciones de la presente invención pueden comprender entre aproximadamente un 0.1% y aproximadamente un 50% o incluso entre un 0.1% y aproximadamente un 25% de agente decolorante en peso de la composición de limpieza en cuestión. El agente decolorante es normalmente una fuente de peroxiácidos orgánicos o una fuente de peroxígeno activado. Cuando está presente, el perácido y/o el activador de la decoloración generalmente está presente en la composición en una cantidad comprendida entre aproximadamente un 0.1 y aproximadamente un 60% en peso, entre aproximadamente un 0.5 y aproximadamente un 40% en peso o incluso entre aproximadamente un 0.6 y aproximadamente un 10% en peso en función de la composición. Se pueden utilizar uno o más perácidos hidrófobos o precursores de estos combinados con uno o más perácidos hidrófilos o precursores de estos. Las cantidades de la fuente de peróxido de hidrógeno y del perácido o activador de la decoloración se pueden seleccionar de modo que la proporción molar de oxígeno disponible (de la fuente de peróxido) respecto al perácido sea de 1:1 a 35:1 o incluso de 2:1 a 10:1.
Para evaluar la estabilidad frente a la degradación oxidativa de la variante de lipasa, se determina el valor del rendimiento relativo (RRlavado) , es decir, el rendimiento de lavado (R) de la variante de lipasa que se desea estudiar, y se divide entre el rendimiento de lavado de la lipasa de la SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, RRlavado = R(variante de lipasa de la invención) /R (lipasa de la SEQ ID NO: 2). Las variantes de lipasa con una estabilidad mejorada frente a la degradación oxidativa tendrán un valor de RRlavado de al menos 1.01, preferentemente al menos 1.1 o incluso al menos 1.5.
Lipasas progenitoras La lipasa progenitora puede ser (a) un polipéptido que presenta al menos un 60% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad baja con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, o (ii) la secuencia complementaria completa de (i) ; o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que presenta al menos un 60% de identidad secuencial respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1.
En un aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 de al menos un 60%, p. ej . , al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual tiene actividad lipasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de 20 aminoácidos, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 O 20, del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.
En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por los aminoácidos 1-269 de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, el progenitor es un fragmento del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 que contiene al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% y al menos un 95% del número de aminoácidos del polipéptido maduro.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, el progenitor está codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, o (ii) el complemento completo de (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York) .
El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o una subsecuencia de este, así como el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de este, se puede utilizar con el fin de diseñar sondas de ácidos nucleicos para identificar y clonar el ADN que codifica un progenitor procedente de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con métodos de uso común en la técnica. En particular, este tipo de sondas se pueden utilizar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos estándar de transferencia de Southern, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en este. Este tipo de sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben tener una longitud de al menos 15, p. ej . , al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleótidos. Preferentemente, la sonda de ácido nucleico tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos, p. ej . , al menos 200 nucleótidos , al menos 300 nucleótidos , al menos 400 nucleótidos , al menos 500 nucleótidos , al menos 600 nucleótidos , al menos 700 nucleótidos , al menos 800 nucleótidos o al menos 900 nucleótidos. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas suelen marcarse para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina) . La presente invención abarca este tipo de sondas.
Se puede cribar una colección de ADN genómico o ADNc preparada a partir de otras cepas de este tipo para detectar ADN que se hibride con las sondas descritas anteriormente y que codifique un progenitor. El ADN genómico o de otro tipo procedente de otras cepas de este tipo se puede separar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, o mediante otras técnicas de separación. El ADN de las colecciones o el ADN separado se puede transferir a nitrocelulosa u otro material portador adecuado e inmovilizarlo sobre este. Con el fin de identificar un clon o ADN que se hibride con la SEQ ID NO: l o una subsecuencia de esta, el material portador se utiliza en una transferencia de Southern.
A efectos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido se híbrida con una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a (i) la SEQ ID NO: 1; (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1; (iii) la secuencia complementaria completa de esta; o (iv) una subsecuencia de esta; en condiciones de rigurosidad de muy baja a muy alta. Las moléculas con las cuales se híbrida la sonda de ácido nucleico en estas condiciones se pueden detectar utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica.
En un aspecto, la sonda de ácido nucleico está constituida por la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico está constituida por los nucleótidos 67-873 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico está constituida por un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2; el polipéptido maduro de este; o un fragmento de este. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 1.
En otra modalidad, el progenitor está codificado por un polinucleótido que presenta una identidad secuencial respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 de al menos un 60%, p. ej . , al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.
El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el cual una región de un polipéptido se fusiona con el N-terminal o el C-terminal de una región de otro polipéptido.
El progenitor puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible en el cual se fusiona otro polipéptido con el N-terminal o el C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son de uso común en la técnica, tales como ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en fase y que la expresión del polipéptido de fusión esté controlada por el mismo promotor o promotores y el mismo terminador. Los polipéptidos de fusión también se pueden construir utilizando la tecnología de inteínas en la cual los polipéptidos de fusión se crean después de la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Al secretar la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, sin carácter limitante, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J". Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol . 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl . Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
El progenitor se puede obtener a partir de microorganismos de cualquier género. Para los efectos de la presente invención, la expresión "obtenido a partir de", tal como se utiliza en la presente en relación con una fuente determinada, significará que el progenitor codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la cual se ha insertado el polinucleótido procedente de la fuente. En un aspecto, el progenitor se secreta extracelularmente .
El progenitor puede ser una lipasa bacteriana. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido de una bacteria grampositiva tal como una lipasa de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillue, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Thermobifida fusca alias Thermomonospora fusca, o un polipéptido de una bacteria gramnegativa tal como una lipasa de Campylobacter, E. coli, Flavobacteriu , Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella o Ureaplasma.
En un aspecto, el progenitor es una lipasa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulaos, Bacillus firmas, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus mgaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis .
En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Streptococcus equisindiis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis o Streptococcus equi subesp. Zooepideicus.
En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Streptomyces acíirorriqgenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus o Streptomyces lividans.
El progenitor puede ser una lipasa fúngica. Por ejemplo, el progenitor puede ser una lipasa de levaduras tal como una lipasa de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia; o una lipasa de un hongo filamentoso tal como una lipasa de Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gihberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria.
En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.
En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Acremonium cellulolyticus , Aspergillus aculeatus , Aspergillus awa ori , Aspergillus foetidus , Aspergillus fumigatus , Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans-, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola , Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellen.se , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporu , Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum, Humicola grísea, Humicola insolens , Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa, Penicillium funiculosu , Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces , Thielavia albopilosa , Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana , Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride .
En otro aspecto, el progenitor es una lipasa de Humicola lanuginosa, p. ej . , la lipasa de la SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de esta.
Se sobreentenderá que para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, p. ej . , anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el cual se los conoce. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.
Las cepas de estas especies son de dominio público y se puede acceder a ellas fácilmente en una serie de colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraaljbureau Voor Schi melcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .
El progenitor se puede identificar y obtener a partir de otras fuentes, que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej . , el suelo, compost, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente a partir de materiales naturales (p. ej . , el suelo, compost, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales son de uso común en la técnica. A continuación, se puede obtener un polinucleótido que codifica un progenitor cribando de manera similar una colección de ADN genómico o de ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mixto. Una vez que se ha detectado el polinucleótido que codifica un progenitor con la o las sondas, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que son de uso común para los expertos en la técnica (remítase, p. ej . , a Sambrook et al., 1989, mencionado anteriormente).
Preparación de las variantes La presente invención también se refiere a un método para obtener una variante de lipasa que comprende introducir en una lipasa progenitora una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37, N39 o G91 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2, donde la variante tiene actividad lipasa y, en comparación con la lipasa progenitora, tiene un rendimiento mejorado en presencia de un catalizador orgánico seleccionado del grupo constituido por catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: Fórmula 1; (b) rmu a ; o mezclas de estos, donde cada Rl es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 3 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 1 a 24 carbonos; y recuperar la variante.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método en el que Rl es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 8 a 18 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 8 a 18 carbonos.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método en el que Rl se selecciona independientemente entre el grupo constituido por 2 -propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo . Preferentemente, Rl se selecciona entre el grupo constituido por 2-butiloctilo, 2 -pentilnonilo, 2-hexildecilo, isotridecilo e isopentadecilo.
El catalizador orgánico se utiliza normalmente en una cantidad que proporciona 0.001-0.02 g de material activo por litro de aguas de lavado, o en una cantidad que proporciona de 0.01 a 4.5, de 0.5 a 4.0, de 1.0 a 3.5, de 1.5 a 3.0 o de 2.0 a 2.5 ppm de material activo por litro de aguas de lavado.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método en el que una fuente de peroxiácidos orgánicos está presente como un agente decolorante. La fuente de peroxiácidos orgánicos puede ser un perácido preformado o un peróxido de diacilo, o puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno y un activador de la decoloración.
Los agentes decolorantes adecuados incluyen peróxidos de diacilo, activadores de la decoloración, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados y mezclas de estos.
En general, cuando se utiliza un agente decolorante, las composiciones de la presente invención pueden comprender entre aproximadamente un 0.1% y aproximadamente un 50% o incluso entre un 0.1% y aproximadamente un 25% de agente decolorante en peso de la composición de limpieza en cuestión. El agente decolorante es normalmente una fuente de peroxiácidos orgánicos o una fuente de peroxígeno activado.
Cuando está presente, el perácido y/o el activador de la decoloración generalmente está presente en la composición en una cantidad comprendida entre aproximadamente un 0.1 y aproximadamente un 60% en peso, entre aproximadamente un 0.5 y aproximadamente un 40% en peso o incluso entre aproximadamente un 0.6 y aproximadamente un 10% en peso en función de la composición. Se pueden utilizar uno o más perácidos hidrófobos o precursores de estos combinados con uno o más perácidos hidrófilos o precursores de estos.
Las cantidades de la fuente de peróxido de hidrógeno y del perácido o activador de la decoloración se pueden seleccionar de modo que la proporción molar de oxígeno disponible (de la fuente de peróxido) respecto al perácido sea de 1:1 a 35:1 o incluso de 2:1 a 10:1.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método en el que la lipasa progenitora comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; está constituida por la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de esta que tiene actividad lipasa.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método en el que la variante es: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en al menos condiciones de rigurosidad baja con: (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o (ii) una hebra complementaria completa de (i); o (c)un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60% de identidad respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método en el que la sustitución se selecciona entre T37A,D, E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y, N39A,C,D,E, F,G, I,K,L,M, P,Q,R,T,V,W,Y y G91D,H,I,P,Q.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método en el que la variante comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones D96, T143, A150, E210, G225, T231, N233 y P250 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2.
En algunas modalidades, la invención se refiere a un método en el que la sustitución se selecciona entre D96G, T143A, A150G, E210Q, G225R, T231R, N233R y P250R.
Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica tal como la mutagénesis dirigida, la construcción de genes sintéticos, la construcción de genes semisintéticos , la mutagénesis aleatoria, el reordenamiento, etc.
La mutagénesis dirigida es una técnica en la cual se introducen una o más (p. ej . , varias) mutaciones en uno o más sitios definidos de un polinucleótido que codifica el progenitor.
La mutagénesis dirigida se puede llevar a cabo in vitro mediante PCR la cual implica el uso de cebadores oligonucleotídicos que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida también se puede llevar a cabo in vitro mediante mutagénesis por inserción de un cásete, la cual implica la escisión mediante una enzima de restricción en un sitio en el plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el progenitor y la ligadura posterior de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Normalmente, la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, lo que permite que los extremos adhesivos del plásmido y la inserción se liguen entre sí. Remítase, p. ej . , a Scherer y Davis, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.
La mutagénesis dirigida también se puede llevar a cabo in vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Remítase, p. ej . , a la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol . 19: 773-776; Kren et al., 1998, Wat. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet . Newslett. 43: 15-16.
En la presente invención, se puede utilizar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida. Existen muchos kits comerciales disponibles que se pueden utilizar para preparar las variantes.
La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para que codifique un polipéptido de interés. La síntesis de genes se puede llevar a cabo utilizando una serie de técnicas tales como la tecnología basada en microchips multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en las cuales los oligonucleótidos se sintetizan y acoplan en chips microfluídicos fotoprogramables .
Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de un único aminoácido o de múltiples aminoácidos se pueden realizar y evaluar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o reordenamiento, seguidos de un procedimiento de cribado relevante, como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413 o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la PCR propensa a error, expresión en fago (p. ej . , Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente de EE. UU. N.° 5.223.409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al. , 1988, DNA 7: 127) .
Los métodos de mutagénesis/reordenamiento se pueden combinar con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutados clonados expresados por las células huésped (Ness et al., 1999, iVature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutado que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar a partir de las células huésped y secuenciar rápidamente utilizando métodos estándar de la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipéptido.
La construcción de genes semisintéticos se consigue combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos, y/o mutagénesis dirigida, y/o mutagénesis aleatoria y/o reordenamiento. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos polinucleotídicos que se sintetizan de forma combinada con técnicas de PCR. De este modo, las regiones definidas de los genes se pueden sintetizar de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores mutagénicos específicos para un sitio, mientras que otras regiones más se pueden someter a amplificación por PCR propensa a error o por PCR no propensa a error. A continuación, las subsecuencias de polinucleótidos se pueden reorganizar.
Polinucleótidos La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una variante de la presente invención.
Constructos de ácido nucleico La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedera adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control .
Los polinucleótidos se pueden manipular de diferentes maneras para hacer posible la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante son de uso común en la técnica .
La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedera para la expresión del polinucléotido . El promotor contiene secuencias de control de la transcripción que regulan la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera, incluidos los promotores híbridos, truncados y mutados, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos intracelulares o extracelulares , tanto homólogos como heterólogos respecto a la célula hospedera.
Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera bacteriana son los promotores obtenidos del gen alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , gen alfa-amilasa de Bacillus licheniformis {amyL) , gen penicilinasa de Bacillus licheniformis {penP) , gen amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , gen levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB) , genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operón lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301- 315) , gen agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y gen beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Se describen promotores adicionales en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Sclentific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, mencionado anteriormente. En el documento O 99/43835 se describen ejemplos de promotores en tándem.
Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedera de un hongo filamentoso son los promotores obtenidos a partir de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA) , TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , lipasa de Rhizomucor miehei, aspártico-proteinasa de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor de NA2-tpi (un promotor modificado procedente de un gen de la alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el cual el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido procedente de un gen de la triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus; los ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados procedentes de un gen de la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger en el cual el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido procedente de un gen de la triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae) ; y promotores híbridos, truncados y imitados de estos .
En un hospedero de tipo levadura, los promotores útiles se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol-deshidrogenasa/gliceraldehído-3 -fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP) , triosa-fosfato-isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI) , metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3 - fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células huésped de tipo levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, el cual es reconocido por una célula hospedera para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está ligada operablemente al extremo 3' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedera.
Los terminadores preferidos para las células huésped bacterianas se obtienen a partir de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprfí) , alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB) .
Los terminadores preferidos para las células huésped de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para las células huésped de tipo levadura se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) y gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células huésped de tipo levadura se describen en Romanos et al., 1992, mencionado anteriormente.
La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm en dirección 31 de un promotor y en dirección 5' de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.
Algunos ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas se obtienen a partir de un gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471) .
La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que sea importante para la traducción por parte de la célula hospedera. La secuencia líder está ligada operablemente al extremo 5' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede utilizar cualquier líder que sea funcional en la célula hospedera.
Los líderes preferidos para las células huésped de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa- fosfato-isomerasa de Aspergillus nidulans .
Los líderes adecuados para las células huésped de tipo levadura se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3 - fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol-deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) .
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia ligada operablemente al extremo 3' de la secuencia que codifica la variante y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedera como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede utilizar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedera.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células huésped de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.
Las secuencias de poliadenilación útiles para las células huésped de tipo levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol . 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región que codifique un péptido señal, la cual codifica un péptido señal ligado al N-terminal de una variante y dirige la variante hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia que codifica el polinucleótido puede contener de manera intrínseca una secuencia que codifica un péptido señal ligada de manera natural en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica la variante. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia que codifique un péptido señal que sea exógena respecto a la secuencia codificante. La secuencia que codifica el péptido señal exógena puede ser necesaria cuando la secuencia codificante no contenga de manera natural ninguna secuencia que codifique un péptido señal. Como alternativa, una secuencia que codifica un péptido señal exógena puede simplemente reemplazar la secuencia que codifica el péptido señal natural con el fin de mejorar la secreción de la variante. Sin embargo, se puede utilizar cualquier secuencia que codifique un péptido señal que dirija la variante expresada hacia la vía secretora de una célula hospedera.
Las secuencias que codifican péptidos señal eficaces para células huésped bacterianas son las secuencias que codifican péptidos señal obtenidas a partir de los genes de la amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal se describen en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Las secuencias que codifican péptidos señal eficaces para células huésped de tipo hongo filamentoso son las secuencias que codifican péptidos señal obtenidas a partir de los genes de la amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y aspártico-proteinasa de Rhizomucor miehei.
Los péptidos señal útiles para las células huésped de tipo levadura se obtienen a partir de los genes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y de la invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Otras secuencias que codifican péptidos señal útiles se describen en Romanos et al., 1992, mencionado anteriormente.
La secuencia de control también puede ser una secuencia que codifique un propéptido, la cual codifica un propéptido situado en el N-terminal de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Generalmente, un propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo mediante la escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia que codifica un propéptido puede obtenerse a partir de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE) , proteasa neutral de Bacillus subtilis (nprT) , lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae .
Cuando tanto la secuencia del propéptido como la del péptido señal estén presentes, la secuencia del propéptido se colocará a continuación del N-terminal de la variante y la secuencia del péptido señal se colocará a continuación del N-terminal de la secuencia del propéptido.
También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante en función del crecimiento de la célula hospedera. Algunos ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que provocan la expresión del gen que se ha de activar o desactivar como respuesta a un estímulo físico o químico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores de lac, tac y fcrp. En levaduras, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, se pueden utilizar el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la TAKA-alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa, que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de las metalotioneínas, que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante estaría ligado operablemente con la secuencia reguladora.
Vectores de expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los diferentes nucleótidos y secuencias de control se pueden unir entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en este tipo de sitios. Como alternativa, el polinucleótido se puede expresar insertando el polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprenda el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se sitúa en el vector de modo que la secuencia codificante esté ligada operablemente a las secuencias de control adecuadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej . , un plásmido o un virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y que pueda propiciar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual se vaya a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, p. ej . , un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación . Como alternativa, el vector puede ser aquel que, cuando se introduzca en la célula hospedera, se integre en el genoma y se replique junto con el o los cromosomas en los cuales se haya integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido, o se pueden utilizar dos o más vectores o plásmidos que contengan de forma conjunta el ADN total que se ha de introducir en el genoma de la célula hospedera, o se puede utilizar un transposón.
El vector contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección sencilla de las células transformadas, transíectadas , transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a virus o biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares.
Algunos ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol , kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclinas . Algunos marcadores adecuados para células huésped de tipo levadura incluyen, sin carácter limitante, ADE2, HIS3, LEU2 , LYS2 , MET3 , TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables que se pueden utilizar en una célula hospedera de tipo hongo filamentoso incluyen, sin carácter limitante, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina-carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricina-acetiltransferasa) , hph (higromicina-fosfotransferasa) , niaD (nitrato-reductasa) , pyrG (orotidina-5 ' -fosfato-descarboxilasa) , sC (sulfato-adeniltransferasa) y fcrpC (antranilato-sintasa) , así como también sus equivalentes. Para el uso en una célula de Aspergillus, se prefieren los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae, y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus .
El vector contiene preferentemente uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedera o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula hospedera, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. Como alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en una o más ubicaciones concretas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación concreta, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como entre 100 y 10 000 pares de bases, entre 400 y 10 000 pares de bases y entre 800 y 10 000 pares de bases, que posean un grado de identidad secuencial elevado respecto a la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de una recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia diana en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos codificantes o no codificantes. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedera mediante recombinación no homologa.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedera en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que regule la replicación autónoma que esté en funcionamiento en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" se refiere a un polinucleótido que permite la replicación in vivo de un plásmido o vector.
Algunos ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicación en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060 y pAMSl, que permiten la replicación en Bacillus .
Algunos ejemplos de orígenes de replicación que se pueden utilizar en células hospederas de tipo levadura son los orígenes de replicación de 2 mieras, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.
Algunos ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de tipo hongo filamentoso son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se pueden conseguir de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 00/24883.
Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedera para incrementar la producción de una variante. Se puede conseguir aumentar el número de copias del polinucleótido al integrar al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera o al incluir un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido, donde las células que contengan copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por lo tanto, copias adicionales del polinucleótido, se puedan seleccionar mediante el cultivo de las células en presencia del agente de selección apropiado.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente con el fin de construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son muy conocidos por los expertos en la técnica (remítase, p. ej . , a Sambrook et al., 1989, mencionado anteriormente).
Células hospederas La presente invención también se refiere a células hospederas recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Se introduce un constructo o vector que comprende un polinucleótido en una célula hospedera de modo que el constructo o vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante, tal como se ha descrito anteriormente. La expresión "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula hospedera dependerá en gran medida del gen que codifica la variante y su fuente.
La célula hospedera puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, p. ej . , una célula procariota o eucariota.
La célula hospedera procariota puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa . Las bacterias grampositivas incluyen, sin carácter limitante, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanojbacil us, Stap ylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, sin carácter limitante, Campylojbac er, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
La célula hospedera bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus incluidas, sin carácter limitante, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lerzfcus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis .
La célula hospedera bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus incluidas, sin carácter limitante, las células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus egui subesp. Zooepidemicus .
La célula hospedera bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces, incluidas, sin carácter limitante, las células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces aver itilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans .
La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar mediante la transformación de protoplastos (remítase, p. ej . , a Chang y Cohén, 1979, Mol. Gen. Genet . 168: 111-115), transformación de células competentes (remítase, p. ej . , a Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol . 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporación (remítase, p. ej . , a Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (remítase, p. ej . , a Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede efectuarse por transformación de protoplastos (remítase, p. ej . , a Hanahan, 1983, J". Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (remítase, p. ej . , a Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces se puede efectuar mediante la transformación de protoplastos, electroporación (remítase, p. ej . , a Gong et al., 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49: 399-405), conjugación (remítase, p. ej . , a Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) o transducción (remítase, p. ej., a Burke et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar mediante electroporación (remítase, p. ej . , a Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o conjugación (remítase, p. ej . , a Pinedo y Smets, 2005, Appl . Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus se puede efectuar mediante competencia natural (remítase, p. ej . , a Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (remítase, p. ej . , a Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporación (remítase, p. ej . , a Buckley et al., 1999, Appl . Environ. Microbiol . 65: 3800-3804) o conjugación (remítase, p. ej . , a Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedera.
La célula hospedera también puede ser una célula eucariota tal como una célula vegetal, fúngica, de mamífero o insecto .
La célula hospedera puede ser una célula fúngica. El término "hongos", tal como se utiliza en la presente, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como los definidos en Hawksworth et al., en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8.a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).
La célula hospedera fúngica puede ser una célula de tipo levadura. El término "levadura", tal como se utiliza en la presente, incluye levaduras que se reproducen por ascosporas (Endomycetales) , levaduras que se reproducen por basidiosporas y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos {Blastomycetes) . Debido a que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los efectos de esta invención, las levaduras se definirán según se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore y Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series N. ° 9, 1980).
La célula hospedera de tipo levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, KluyverOmyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.
La célula hospedera fúngica puede ser una célula de tipo hongo filamentoso. La expresión "hongos filamentosos" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (tal como los definen en Hawksworth et al., 1995, mencionado previamente) . Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por tener una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo tiene lugar mediante la elongación de la hifa y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo de levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, tiene lugar mediante la gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.
La célula hospedera de tipo hongo filamentoso puede ser una célula de Acre onium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, icor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paeciloyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaroyces, Theroascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.
Por ejemplo, la célula hospedera de tipo hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus awamori , Aspergillus foetidus, Aspergillus fu igatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nídulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium ¿nqps, Chrysosporium Jeratinqphilum, Chrysosporium luc/cnowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutu , Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioid.es, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Hu icola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenu , Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoder a harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride .
Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Se describen procedimientos adecuados para la transformación de células hospederas de Aspergillus y Trichoderma en el documento EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Se describen métodos adecuados para transformar especies de Fusarium en Maladier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y O 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, págs. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol . 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de producción La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula hospedera de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperar la variante.
Las células hospederas se cultivan en un medio de nutrientes adecuado para la producción de la variante utilizando métodos de uso común en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante el cultivo en un matraz agitado o la fermentación a pequeña escala o gran escala (incluidas las fermentaciones continua, discontinua, por lote alimentado o de estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales, llevada a cabo en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la variante se exprese y/o se aisle. El cultivo se lleva a cabo en un medio de nutrientes adecuado, que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, mediante la utilización de procedimientos de uso común en la técnica. Los medios adecuados se pueden adquirir de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con las composiciones publicadas (p. ej . , en los catálogos de la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo) . Si la variante se secreta al medio de nutrientes, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar a partir de los lisados celulares.
La variante se puede detectar utilizando métodos de uso común en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección incluyen, sin carácter limitante, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.
La variante se puede recuperar utilizando métodos de uso común en la técnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio de nutrientes mediante procedimientos convencionales que incluyen, sin carácter limitante, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación.
La variante se puede purificar mediante varios procedimientos de uso común en la técnica que incluyen, sin carácter limitante, cromatografía (p. ej . , de intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforáticos (p. ej . , isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (p. ej . , precipitación con sulfato amónico) , SDS-PAGE o extracción (remítase, p. ej . , a Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.
En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que en su lugar se utiliza una célula hospedera de la presente invención que expresa la variante como fuente de la variante .
Composiciones La presente invención también se refiere a composiciones particuladas como las que se describen en el documento EP11170520 que comprenden una variante de lipasa, que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T3 A, D,E,F,G,H,I,L, N,P,Q,R,S,V,W,Y,N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y y G91D, H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa.
En algunas modalidades, la presente invención se refiere a una composición particulada que comprende: (a) partículas que comprenden una fuente de peroxiácidos orgánicos; y (b) partículas que comprenden un catalizador de la decoloración; y (c) partículas que comprenden (i) un núcleo que comprende una enzima rodeado de (ii) un revestimiento de liberación retardada, donde la enzima es una variante de lipasa, que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,N39A,C,D,E,F,G,I,K, L,M,P,Q,R,T,V, ,Y y G91D,H, I, P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa.
En algunas modalidades, la presente invención se refiere a una composición particulada que comprende: (a) partículas que comprenden una fuente de peroxiácidos orgánicos; y (b) partículas que comprenden un catalizador de la decoloración; y (c) partículas que comprenden (i) un núcleo que comprende una enzima que es una enzima lipolítica de primer lavado rodeado de (ii) un revestimiento de liberación retardada, donde la enzima es una variante de lipasa, que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37A,D,E, F,G, H, I , L,N, P, Q, R, S, V, W, Y,N39A, C,D, E, F, G, I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y y G91D,H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa.
Usos La presente invención también se refiere al uso de una variante de lipasa que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37A,D,E,F, G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,N39A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y y G91D,H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa, para preparar partículas de lipasa como las que se describen en el documento EP11170520.
En algunas modalidades, la presente invención se refiere a un método para preparar partículas de lipasa, que comprende: (a) evaluar la sensibilidad al catalizador de la decoloración de al menos una enzima mediante la determinación del rendimiento de lavado para una combinación de la enzima con un catalizador de la decoloración y una fuente de peroxiácidos orgánicos, y comparar el rendimiento con el rendimiento sin el catalizador de la decoloración, con el fin de identificar una enzima sensible al catalizador de la decoloración; (b) proporcionar un núcleo que comprende la enzima sensible, y rodear el núcleo con un revestimiento de liberación retardada, donde la enzima es una variante de lipasa, que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37A, D, E, F, G, H, I , L, , P, Q,R,S,V,W,Y,N39A,C,D,E#F#G,I,K,L,M,P,Q,R,T#V,W,Y, y G91D,H, I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
La lipasa de la invención puede estar encapsulada. En un aspecto, una capsula comprende un núcleo y una cubierta que tiene una superficie interna y externa, donde la cubierta encapsula al núcleo. En un aspecto de la cápsula, el núcleo puede comprender un material seleccionado entre el grupo constituido por perfumes; abrillantadores; tintes; repelentes de insectos; siliconas; ceras; sabor izantes ; vitaminas; agentes suavizantes de tejidos; agentes para el cuidado de la piel, en un aspecto parafinas; enzimas; agentes antibacterianos; decolorantes; productos refrescantes; y mezclas de estos; y la cubierta puede comprender un material seleccionado entre el grupo constituido por polietilenos; poliamidas; alcoholes poliviní lieos, que contienen opcionalmente otros comonómeros ; poliestirenos; poliisoprenos; policarbonatos; poliésteres; poliacri latos; aminoplastos, en un aspecto el aminoplasto puede comprender poliureas, poliuretano y/o poliurea-uretano, en un aspecto la poliurea puede comprender polioximetilenurea y/o melamina-formaldehído; poliolefinas; polisacáridos , en un aspecto el polisacárido puede comprender alginato y/o quitosano; gelatina; shellac; resinas epoxi; polímeros vinílieos; compuestos inorgánicos insolubles en agua; silicona; y mezclas de estos.
En algunas modalidades, la lipasa se utilizó en una composición en cantidades comprendidas entre un 0.00001% y un 2%, más preferentemente entre un 0.0001% y un 0.02%, aún más preferentemente entre un 0.001% y un 0.01% en peso. Normalmente, la composición de limpieza y/o tratamiento está presente en agua en una cantidad comprendida entre un 0.001 y un 5%, de modo tal que los niveles de la variante de lipasa preferidos en el paso de tratamiento acuoso son de entre 0.000001 y 1000 ppm.
Plantas La presente invención también se refiere a plantas, p. ej . , una planta transgénica, parte de una planta o célula vegetal, que comprenden un polinucleótido de la presente invención para que de este modo expresen y produzcan la variante en cantidades recuperables. La variante se puede recuperar a partir de la planta o parte de la planta. Como alternativa, la planta o parte de la planta que contiene la variante se puede utilizar tal cual para mejorar la calidad de un alimento para los seres humanos o animales, p. ej . , mejorando su valor nutricional, palatabilidad y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicotiledónea) o monocotiledónea (una monocotiledónea) . Algunos ejemplos de plantas monocotiledóneas son las gramíneas, tales como la espiguilla (pasto azul, Poa) , pasto forrajero tal como Festuca, Lolium, pasto de zonas templadas, tal como Agrostis, y cereales, p. ej . , trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.
Algunos ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, las legumbres, tales como altramuces, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y soja, y las plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como la coliflor, la colza, y el organismo modelo Arabidopsis thaliana estrechamente relacionado.
Algunos ejemplos de las partes de una planta son el tallo, callo, hojas, raíces, frutos, semillas y tubérculos, así como también los tejidos individuales que comprenden estas partes, p. ej . , epidermis, mesofilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemos. Los compartimentos celulares vegetales específicos, tales como los cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasma, también se consideran partes de una planta. Además, cualquier célula vegetal, independientemente del origen del tejido, se considera una parte de una planta. Asimismo, las partes de una planta tales como las células y los tejidos específicos aislados para facilitar la utilización de la invención también se consideran partes de una planta, p. ej . , los embriones, endospermos, y las capas de aleurona y seminales.
También se incluyen dentro del alcance de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de una planta y células vegetales.
La planta transgénica o célula vegetal que expresa una variante se puede construir de acuerdo con métodos de uso común en la técnica. Resumiendo, la planta o célula vegetal se construye incorporando uno o más constructos de expresión que codifican una variante en el genoma huésped vegetal o el genoma cloroplástico y propagando la planta o célula vegetal modificada resultante en forma de una planta transgénica o célula vegetal.
El constructo de expresión es convenientemente un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica una variante ligado operablemente a secuencias reguladoras adecuadas requeridas para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de la planta seleccionada. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células vegetales en las cuales se ha integrado el constructo de expresión y secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la plantas en cuestión (el último caso depende del método de introducción de ADN que se vaya a utilizar) .
La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y de terminación y opcionalmente secuencias señal o de tránsito, se determina, por ejemplo, en función de cuándo, dónde y cómo se desee que se exprese la variante. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica una variante puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica para el desarrollo, una fase o un tejido, y el producto génico no se puede dirigir a un tejido o parte de una planta específico tal como las semillas o las hojas. Se describen secuencias reguladoras, por ejemplo, en Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
Para la expresión constitutiva, puede utilizarse el promotor 35S-CaMV, la ubiquitina 1 del maíz o la actina 1 del arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol . 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos para un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos de sumideros de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de papa y frutos (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet . 24: 275-303), o de tejidos de sumideros metabólicos tales como meristemos (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878) , un promotor específico para las semillas tal como el promotor de la glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), un promotor de Vicia fába de la legúmina B4 y el gen de la proteína seminal desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo graso seminal (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor de la proteína de almacenamiento napA de Brassica napus o cualquier otro promotor específico para las semillas conocidos en la técnica, p. ej . , como los descritos en el documento WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico para las hojas tal como el promotor rbcs del arroz o el tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000) , el promotor del gen de la adenina-metiltransferasa del virus de la clórela (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya efc al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674) o un promotor inducible por lesión tal como el promotor pin2 de la papa (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede inducirse mediante tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducirse con sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, p. ej . , etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico, y metales pesados.
También se puede emplear un elemento potenciador del promotor para conseguir una mayor expresión de una variante en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador del promotor puede ser un intrón que esté situado entre el promotor y el polinucleótido que codifica una variante. Por ejemplo, Xu et al., 1993, mencionado anteriormente, describen el uso del primer intrón del gen de la actina 1 del arroz para incrementar la expresión.
El gen del marcador seleccionable y cualesquiera otras partes del constructo de expresión se pueden elegir entre los que se encuentran disponibles en la técnica.
El constructo de ácido nucleico se incorpora en el genoma vegetal de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la técnica y que incluyen la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/'Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, iVature 338: 274).
La transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es un método para generar dicotiledóneas transgénicas (para consultar una reseña, remítase a Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) y para transformar monocotiledóneas, aunque pueden utilizarse otros métodos de transformación para estas plantas. Un método para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas de oro o de wolframio microscópicas recubiertas con el ADN transformante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol . 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos tal como se describe en Omirulleh et al. , 1993, Plant Mol .
Biol. 21: 415-428. Los métodos de transformación adicionales incluyen aquellos descritos en las patentes de EE . UU. N.os 6.395.966 y 7.151.204 (ambas de ellas se incorporan a la presente en su totalidad por referencia) .
Tras la transformación, se seleccionan los transformantes que han incorporado el constructo de expresión y se regeneran en forma de plantas completas de acuerdo con métodos de uso común en la técnica. Habitualmente el procedimiento de transformación está diseñado para la eliminación selectiva de genes seleccionados, ya sea durante la regeneración o en las siguientes generaciones, mediante, por ejemplo, la cotransformación con dos constructos de ADN-T independientes o la escisión específica para el sitio del gen seleccionado por acción de una recombinación específica.
Además de la transformación directa de un genotipo vegetal particular con un constructo de la presente invención, las plantas transgénicas se pueden crear cruzando una planta que contenga el constructo con una segunda planta que carezca del constructo. Por ejemplo, un constructo que codifica una variante se puede introducir en una variedad de planta particular por cruzamiento, sin necesidad de tener que transformar directamente una planta de esa variedad en ningún momento. Por lo tanto, la presente invención no abarca únicamente una planta regenerada directamente a partir de células que han sido transformadas de acuerdo con la presente invención, sino también la progenie de tales plantas. El término "progenie", tal como se utiliza en la presente, se puede referir a la descendencia de cualquier generación de una planta progeni tora preparada de acuerdo con la presente invención. La progenie puede incluir un constructo de ADN preparado de acuerdo con la presente invención. El cruzamiento da como resultado la introducción de un transgén en una línea vegetal por polinización cruzada de una línea inicial con una línea vegetal donante. Algunos ejemplos no limitantes de estos pasos se describen en la Patente de EE. UU. N.° 7,151,204.
Se pueden generar plantas mediante un proceso de conversión por retrocruzamiento. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas a las que se les denomina híbrido, línea, endógamo o genotipo convertido por retrocruzamiento.
Se pueden utilizar marcadores genéticos para facilitar la introgresión de uno o más transgenes de la invención de un contexto genético a otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas frente al cultivo selectivo convencional, ya que se puede utilizar para evitar errores debidos a las variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos referentes al grado relativo del germoplasma élite en la progenie individual de un cruzamiento particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado, que por lo demás tiene un contexto genético no deseable desde un punto de vista agronómico, se cruza con un progenitor élite, se pueden emplear marcadores genéticos para seleccionar la progenie que no solamente posea el rasgo de interés, sino que también posea una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De este modo, se minimiza el número de generaciones requeridas para introgresar uno o más rasgos en un contexto genético particular.
La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante de la presente invención, que comprenden: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica la variante en condiciones propicias para la producción de la variante; y (b) recuperar la variante.
La presente invención se describe además mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Ensayo de estrés mecánico automático para el lavado de ropa Con el fin de evaluar el rendimiento de lavado en el lavado de la ropa, se llevaron a cabo experimentos utilizando el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA, por sus siglas en inglés) . Con el AMSA, se puede examinar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes de lipasa de volumen pequeño. La placa AMSA tiene una serie de ranuras para las soluciones de ensayo y una tapa que aprieta con firmeza el artículo textil manchado contra todos los orificios de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de ensayo, el artículo textil y la tapa se agitan enérgicamente para que la solución de ensayo entre en contacto con el artículo textil y para aplicar un estrés mecánico de modo regular, periódico y oscilante. Para consultar una descripción más detallada, remítase al documento WO02/42740, especialmente al párrafo "Modalidades del método especiales" en las páginas 23-24.
Los experimentos de lavado de ropa se llevan a cabo en las condiciones experimentales que se especifican a continuación: Los materiales de prueba y el detergente modelo fueron que se indican a continuación *E1 catalizador de la decoloración tiene una estructura química que se corresponde con la fórmula química: R es 2-butiloctilo. La dureza del agua se ajustó a 18 °dH mediante la adición de CaCl2/ MgCl2 y NaHC03 (Ca2+:Mg2+ = 4:1:7.5) al sistema de prueba. Después de lavar, los artículos textiles se aclararon con agua corriente y se secaron durante 5 minutos a 85 °C en una cámara calefactora.
El rendimiento de lavado se midió como el brillo del color del articulo textil lavado. El brillo también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada por la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está manchada, la intensidad de la luz reflejada es menor que la de la muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada se puede utilizar para medir el rendimiento de 1avado .
Las mediciones del color se realizan con un escáner de superficie plana profesional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Brondby, Dinamarca), el cual se utiliza para capturar una imagen del artículo textil lavado.
Con el fin de extraer un valor para la intensidad de la luz de las imágenes escaneadas, los valores en píxeles de 24 bits de la imagen se convierten en valores para rojo, verde y azul ( BG, por sus siglas en inglés) . El valor de la intensidad (Int) se calcula sumando los valores RBG como vectores y tomando a continuación la longitud del vector resultante : Int=^r2 +g2 +b2 El rendimiento de lavado (P) de la variante de lipasa se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: P = AInt = Int (v) - Int(r), donde Int (v) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie del artículo textil lavado con la variante de lipasa e Int(r) es el valor de la intensidad de la luz de la superficie del artículo textil lavado sin la variante de lipasa.
Cálculo del puntaje para el rendimiento relativo (RRlavado) : Se otorga un puntaje para el rendimiento relativo como resultado del lavado a escala completa de acuerdo con la definición : Los puntajes para el rendimiento relativo (RRlavado) proporcionan el rendimiento (R) de la variante de lipasa de la invención frente a la lipasa convencional: RR = R(variante de lipasa de la invención) /R (lipasa convencional). Una formulación de lipasa se considera que exhibe un rendimiento de lavado mejorado, si se comporta mejor que la lipasa convencional .
Ejemplo 2: Variantes G91 con un rendimiento mejorado en presencia de catalizadores de la decoloración Ejemplo 3: Variantes T37 con un rendimiento mejorado en presencia de catalizadores de la decoloración Ejemplo 4: Variantes N39 con un rendimiento mejorado en presencia de catalizadores de la decoloración Ejemplo 5: Variantes con dos o más mutaciones y con un rendimiento mejorado en presencia de catalizadores de la decoloración La invención descrita y reivindicada en la presente no debe estar limitada en cuanto a su alcance por los aspectos específicos que se describen en la presente, ya que se pretende que estos aspectos sean ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se pretende que cualesquiera aspectos equivalentes queden incluidos en el alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica teniendo en cuenta la descripción anterior. También se pretende que tales modificaciones queden incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. En caso de contradicción, prevalecerá la presente descripción, incluidas las definiciones .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para obtener una variante de lipasa caracterizado porque comprende introducir en una lipasa progenitora una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37, N39 o G91 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa y, en comparación con la lipasa progenitora, tiene un rendimiento mejorado en presencia de un catalizador orgánico seleccionado del grupo constituido por catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: a) Fórmula 1 ; b) Fórmula 2 ; o c) mezclas de estas, donde cada l es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 3 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 1 a 24 carbonos; y recuperar la variante.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Rl se selecciona independientemente entre el grupo constituido por 2-propilheptilo, 2- butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, p-dodecilo, n-tetradecilo, rz-hexadecilo, n-octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo .
3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lipasa progenitora comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; está constituida por la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de esta que tiene actividad lipasa.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la variante es: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 ; b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en al menos condiciones de rigurosidad baja con: (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1; o (ii) una hebra complementaria completa de (i), o c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 60% respecto de la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustitución se selecciona entre T37A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,V, ?,?,??T?,?,?,?,?,?,?,?^,?,?,?,?,?,?, ?,? y G91D,H, I, P,Q.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la variante comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones D96, T143, A150, E210, G225, T231, N233 y P250 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
7. El método de conformidad con la reivindicación anterior, caracterizado porque la sustitución se selecciona entre D96G, T143A, A150G, E210Q, G225R, T231R, N233R y P250R.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la variante es: a) G91A +D96G +T231R +N233R; b) G91Q +T143A +E210Q +T231R +N233R +P250R; c) G91Q +A150G +E210Q +T231R +N233R +P250R; d) T37R +N39R +G91A +D96G +T231R +N233R; e) G91A +D96G +G225R +T231R +N233R; f) G91Q +E210Q +T231R +N233R +P250R; g) G91N +E210Q +T231R +N233R +P250R; h) G91I +E210Q +T231R +N233R +P250R; i) G91L +E210Q +T231R +N233R; o j) G91A +D96G +A150G +T231R +N233R.
9. Una variante de lipasa caracterizada porque comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones T37A, D,E,F,G,H, I,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y, 39A, C, D, E, F,G, I, K,L,M, P, Q,R,T, V, W, Y y G91D,H,I,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, donde la variante tiene actividad lipasa.
10. La variante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque es una variante de una lipasa progenitora seleccionada del grupo constituido por: (a) un polipéptido que presenta una identidad secuencial de al menos un 60% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad baja con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: l o (ii) el complemento de longitud completa de (i) ; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que presenta una identidad de al menos un 60% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: l; Y d) un fragmento del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, que tiene actividad lipasa.
11. La variante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque tiene una identidad secuencial de al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos de un 100%, respecto de la secuencia de aminoácidos de la lipasa progenitora.
12. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, caracterizada porque el número de sustituciones es 1-20, p. ej . , 1-10 y 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 O 20 sustituciones .
13. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, caracterizada porque comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones D96, T143, A150, E210, G225, T231, N233 y P250.
14. La variante de conformidad con la reivindicación anterior, caracterizada porque la sustitución se selecciona entre D96G, T143A, A150G, E210Q, G225R, T231R, N233R y P250R.
15. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es: a) G91Q +T143A +E210Q +T231R +N233R +P250R; b) G91Q +A150G +E210Q +T231R +N233R +P250R; C) T37R +N39R +G91A +D96G +T231R +N233R; d) G91Q +E210Q +T231R +N233R +P250R; o e) G91I +E210Q +T231R +N233R +P250R.
16. Una variante caracterizada porque es: a) G91A +D96G +T231R +N233R; b) G91A +D96G +G225R +T231R +N233R; c) G91N +E210Q +T231R +N233R +P250R; d) G91L +E210Q +T231R +N233R; o e) G91A +D96G +A150G +T231R +N233R.
17. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-16, caracterizada porque en comparación con la lipasa progenitora tiene un rendimiento mejorado en presencia de un catalizador orgánico seleccionado del grupo constituido por catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: Fórmula 1 ; Fórmula 2 ; o c) mezclas de estas, donde cada Rl es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 3 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 1 a 24 carbonos; y recuperar la variante.
18. La variante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque Rl se selecciona independientemente entre el grupo constituido por 2 -propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo.
19. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-18.
20. Un constructo de ácido nucleico caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 19.
21. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 19.
22. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 19.
23. Un método para producir la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-18, caracterizado porque comprende: a) cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 22 en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y b) recuperar la variante.
24. Una planta transgénica, parte de una planta o célula vegetal caracterizada porque es transformada con el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 19.
25. Un método para producir la variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-18, caracterizado porque comprende: a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica la variante en condiciones propicias para la producción de la variante; y b) recuperar la variante.
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