MX2014005683A

MX2014005683A - Metodos para tratar, diagnosticar y vigilar enfermedad de alzheimer.

Info

Publication number: MX2014005683A
Application number: MX2014005683A
Authority: MX
Inventors: Timothy W Behrens; Robert R Graham; Tushar Bhangale
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2015-01-22
Also published as: WO2013071119A3; KR20140089384A; AR088827A1; BR112014011127A2; HK1214631A1; JP2018166507A; CA2854779A1; JP6338530B2; JP2014533949A; RU2014123511A; CN105063186A; WO2013071119A2; CN103930568A; CN106011243A; EP2776582A2; US20140371094A1

Abstract

La invención proporciona métodos de diagnóstico y pronostico de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto que comprenden detectar la presencia o ausencia de una o mas variaciones genéticas en una muestra del sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar EA. Se proporcionan también métodos para predecir la respuesta de un sujeto a agentes terapéuticos para el tratamiento de la EA.

Description

METODOS PARA TRATAR, DIAGNOSTICAR Y VIGILAR LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER CAMPO DE LA INVENCION Se proporcionan métodos de identificación, diagnóstico, y pronóstico de la enfermedad de Alzheimer (EA) que incluyen determinados subfenotipos de EA, asi como métodos para tratar la EA, que incluyen determinadas subpoblaciones de pacientes. Se proporcionan también métodos para identificar agentes terapéuticos eficaces contra la EA, y predecir la respuesta de los agentes terapéuticos de la EA.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa del sistema nervioso central asociada con la pérdida progresiva de la función cognitiva y de la memoria, y en última instancia demencia. La EA es la causa más significativa y común de demencia en los países desarrollados, que representa el 60% o más de todos los casos de demencia. Se observan dos características patológicas en los pacientes de EA durante la autopsia: placas extracelulares y ovillos intracelulares en el hipocampo, corteza cerebral, y otras áreas del cerebro esenciales para la función cognitiva. las placas se forman en su mayoría a partir de la deposición del amiloide ß (?ß) , un péptido derivado de la proteína precursora del amiloide (PPA) .

REF.: 248437 La frecuencia de la EA aumenta con cada década de la vida adulta, alcanzando a un 20-40% de la población a la edad de 85. Debido a que cada vez más personas vivirán hasta los 80 y 90, se espera que el número de pacientes se triplique en los próximos 20 años. Más de 5 millones de personas padecen EA en los Estados Unidos, donde 800.000 muertes por año se asocian con la EA. En 2011, el coste de los cuidados de los pacientes con EA se ha estimado en un total de 183.000 millones de dólares. La EA representa también una barrera emocional para los miembros de la familia y los cuidadores: hay aproximadamente 14,9 millones de personas al cuidado de los pacientes con EA en los Estados Unidos. Los pacientes de EA viven un promedio de 7 a 10 años tras el diagnóstico y pasan un promedio de 5 años con cuidados en casa o en una residencia de ancianos .

La enfermedad de Alzheimer de inicio precoz (EAIP) es una forma rara de enfermedad de Alzheimer en la que los individuos son diagnosticados con la enfermedad antes de los 65 años. Menos del 10% de todos los pacientes con enfermedad de Alzheimer tienen EAIP. Aproximadamente la mitad de los casos de EAIP son familiares, en los que la herencia de la enfermedad sigue un modelo autosómico dominante. Los casos de EA en los que no se encuentra un modelo de herencia obvio son denominados "esporádicos". Hasta la fecha se han identificado mutaciones en tres genes que incluyen la proteina precursora del am loide (PPA) en el cromosoma 21, la presenilina 1 (PSENl) en el cromosoma 14 y la presenilina 2 (PSEN2) en el cromosoma 1 con EAIP familiar. La mayoría de las mutaciones patógenas en los genes de la PPA y la presenilina se asocian con el procesamiento anómalo de la PPA que conduce a un aumento en la producción de ?ß42, el principal componente en las placas amiloides.

La enfermedad de Alzheimer de inicio tardío (EAIT) es la forma más común de enfermedad de Alzheimer, que representa aproximadamente un 90% de los casos y que se produce normalmente después de los 65 años. La EAIT afecta prácticamente a la mitad de todos los individuos con edades superiores a 85 años, y es normalmente esporádica. Basándose en estudios en gemelos, se ha estimado que la heredabilidad de la enfermedad es un 79%, sin diferencia (tras control por edad) entre hombres y mujeres en la prevalencia de la heredabilidad (Gatz, y col., Arch. Gen. Psychiatry, 63:168-74 (2006)). Las mutaciones de gen único identificadas hasta la fecha asociadas con la enfermedad de Alzheimer de inicio precoz no parece que estén implicadas en la enfermedad de Alzheimer de inicio tardío .

Aunque no se han encontrado genes específicos que produzcan la forma de inicio tardío de la EA, un factor de riesgo genético que aumenta el riesgo de una persona de desarrollar la enfermedad está relacionado con el gen de la apolipoproteína E (APOE) que se encuentra en el cromosoma 19.

Los estudios genéticos precoces de la EA han demostrado la asociación y la relación con la misma región del cromosoma 19 que contiene el gen APOE (Schellenberg, y col., J. Neurogenet., 4:97-108 (1987); Pericak-Vance, y col., Am. J. Hum. Gen., 48:1034-1050 (1991)). El gen APOE tiene tres alelos comunes, designados e2, e3, y e4. En comparación con los alelos e3 comunes, el alelo e4 aumenta el riesgo de EA, mientras que el alelo e2 disminuye el riesgo de EA. (Corder, y col., (1993) Science, 281:921-923; Corder y col. (1994) Nat. Genet. 7: 180-184). Aunque el riesgo durante la vida (LTR) de la EA a los 85 años para la población general es del 11-14%, el LTR aumenta hasta 23-35% para los portadores de APOE 3/4, y hasta el 51-68% para los portadores de APOE 4/4 (Genin y col. (2011) Molecular Psychiatry 16: 903-907). El riesgo de EA para los portadores de APOE 2/4 es el mismo que para los sujetos que tienen el genotipo neutro APOE 3/3, mientras que los portadores de APOE 2/3 tienen un riesgo menor. Aunque el 40-65% de los pacientes de EA tienen al menos una copia del alelo ????-e4, ??0?-e4 no es un determinante necesario de la enfermedad ya que al menos una tercera parte de pacientes con EA son ????-e4 negativos y algunos homocigotos de ????-e4 no desarrollan nunca la enfermedad. De esta manera, este alelo por si mismo no es suficiente para el diagnóstico de la EA (Ertekin-Taner (2007) Neurol. Clin. 25: 811) .

Actualmente, el método principal de diagnóstico de la EA implica disponer de antecedentes médicos detallados de los pacientes, la realización de pruebas de memoria y psicológicas, y descartar otras explicaciones para la pérdida de memoria que incluyen dolencias temporales (por ejemplo, depresión o deficiencia de vitamina B12) o permanente (por ejemplo, ictus) . Con esta hipótesis, la EA no se puede diagnosticar de forma concluyente hasta después de la muerte, cuando la autopsia revela las placas amiloides y ovillos neurofibrilares característicos de la enfermedad en el cerebro de un paciente. Además, los procedimientos de diagnóstico clínico solo son de ayuda después de que los pacientes hayan comenzado a presentar pérdida anómala significativa de la memoria o cambios de personalidad. De este modo, es posible que un paciente haya tenido EA durante años. Una prueba diagnóstica que, por ejemplo, permita a los médicos identificar la EA precozmente en el proceso de la enfermedad, o identificar individuos que tienen riesgo de desarrollar la enfermedad, proporcionará la opción de intervenir en una etapa precoz en el proceso de la enfermedad. La intervención precoz en los procesos de la enfermedad da como resultado generalmente mejores resultados en el tratamiento retrasando el inicio o la progresión de la enfermedad en comparación con una intervención posterior. Existe por tanto necesidad de otros métodos de diagnóstico y de ayuda al diagnóstico de la EA.

SUMARIO DE LA INVENCION La invención proporciona métodos de diagnóstico y pronóstico de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto que comprenden detectar la presencia o ausencia de una o más variaciones genéticas en una muestra del sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA tal como se describe en el presente documento.

En una modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar variantes genéticas que tienen un efecto perjudicial o beneficioso sobre el desarrollo de la EA en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4, comprendiendo el método identificar una variante genética que está presente en una frecuencia aumentada o disminuida en sujetos con menos de 65 años de edad, que tienen EA, y que tienen al menos un alelo ????-e4, en comparación con los sujetos del control con más de 75 años de edad, sin EA, y que tienen al menos un alelo APOE-e4, donde la frecuencia aumentada en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control indica que la variación genética está asociada con un efecto perjudicial en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4, y una frecuencia disminuida en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control indica que la variación genética está asociada con un efecto beneficioso en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4. En algunas modalidades, la variación genética se identifica usando un análisis de asociación del genoma completo.

La invención proporciona además un método para seleccionar variantes genéticas que tienen un efecto perjudicial o beneficioso sobre el desarrollo de la EA en sujetos que tienen al menos un alelo ??0?-e4, comprendiendo el método (a) determinar el genotipo en uno o más locus genéticos de una pluralidad de sujetos de menos de 65 años de edad, que tienen EA, y que tienen al menos un alelo ??0?-e4; (b) determinar el genotipo en uno o más locus genéticos de una pluralidad de sujetos del control con más de 75 años de edad, sin EA, y que tienen al menos un alelo ????-e4; y (c) identificar una variante genética que está presente en una frecuencia aumentada o disminuida en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control, donde la frecuencia aumentada en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control indica que la variación genética está asociada con un efecto perjudicial en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4, y una frecuencia disminuida en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control indica que la variación genética está asociada con un efecto beneficioso en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4.

En algunas modalidades de estos métodos de selección, el efecto perjudicial es un riesgo mayor de desarrollar la EA. En algunas modalidades, el efecto perjudicial es disminuir la edad del inicio de la EA. En algunas modalidades, el efecto beneficioso es un riesgo menor de desarrollar la EA. En algunas modalidades, el efecto beneficioso es aumentar la edad del inicio de la EA.

En una modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de una variación genética indicativa de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo que puede detectar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos; y (b) determinar la presencia o ausencia de la variación genética, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

En varias modalidades, la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP, por sus siglas en inglés), un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción. En algunas modalidades, la variación genética es un SNP. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo en rs2228145.

En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo ??' en rsl21918427. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3). En una modalidad adicional, la variación genética es un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N°:3).

En otras modalidades, la al menos una variación genética es una sustitución, inserción, o deleción de aminoácidos. En "algunas modalidades, la variación genética es una sustitución de aminoácido. En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l) . En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

En algunas modalidades del método, el reactivo se selecciona entre un oligonucleótido, una sonda de ADN, una sonda de ARN, y una ribozima. En otras modalidades, el reactivo es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que comprende la variación genética. En algunas modalidades, el reactivo está marcado.

En algunas modalidades del método, la muestra se selecciona entre una de líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, esputo, saliva, raspado de la mucosa, biopsia de tejido, secreción lacrimal, semen, o sudor.

En una modalidad, el método comprende además tratar el sujeto para la EA basándose en el resultado de la etapa (b) . En una modalidad, el método comprende además detectar en la muestra la presencia de al menos un alelo ????-e4. En una modalidad, la presencia del al menos una variación genética junto con la presencia de al menos un alelo ??0?-e4 es indicativa de un riesgo aumentado de edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que tiene al menos un alelo ????-e4 y que carece de la presencia del al menos una variación genética.

La invención proporciona además un método para detectar una variación genética indicativa de enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende: determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos, en una muestra biológica de un sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

En varias modalidades, la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP) , un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción. En algunas modalidades, la variación genética es un SNP. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo *C en rs2228145. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo ??" en rsl21918427. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3). En una modalidad adicional, la variación genética es un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N° : 3) .

En otras modalidades, la al menos una variación genética es una sustitución, inserción, o deleción de aminoácidos. En algunas modalidades, la variación genética es una sustitución de aminoácido. En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l) . En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

En varias modalidades del método, la detección de la presencia de una o más variaciones genéticas se lleva a cabo mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo que consiste en la secuenciación directa, hibridación de la sonda especifica de alelo, extensión del cebador especifica de alelo, amplificación especifica de alelo, incorporación de nucleótidos especifica de alelo, digestión con nucleasa 5', ensayo de baliza molecular, ensayo de ligadura de oligonucleótidos , análisis de tamaño, y polimorfismo de conformación monocatenario . En algunas modalidades, los ácidos nucleicos procedentes de la muestra se amplifican antes de determinar la presencia de la una o más variaciones genéticas.

En otras modalidades del método, la detección de la presencia de la una o más variaciones genéticas en una proteina se lleva a cabo mediante un proceso seleccionado entre electroforesis , cromatografía, espectroscopia de masas, digestión proteolítica, secuenciación de proteínas, ensayo de inmunoafinidad, o una de sus combinaciones. En algunas modalidades, las proteínas procedentes de la muestra se purifican usando anticuerpos o péptidos que se unen a las proteínas antes de determinar la presencia de una o más variaciones genéticas.

En una modalidad, el método comprende además tratar el sujeto para la EA basándose en el resultado de la etapa (b) . En una modalidad, el método comprende además detectar en la muestra la presencia de al menos un alelo ??0?-e4. En una modalidad, la presencia del al menos una variación genética junto con la presencia de al menos un alelo ??0?-e4 es indicativa de un riesgo aumentado de edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que tiene al menos un alelo ??0?-e4 y que carece de la presencia del al menos un marcador genético.

La invención proporciona además un método para diagnosticar o pronosticar la EA en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo que puede detectar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos; y (b) determinar la presencia o ausencia de la variación genética, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

En varias modalidades, la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP) , un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción. En algunas modalidades, la variación genética es un SNP. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l) . En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo 'C en rs2228145. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2) . En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo ??" en rsl21918427. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3). En una modalidad adicional, la variación genética es un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N° : 3) .

En otras modalidades, la al menos una variación genética es una sustitución, inserción, o deleción de aminoácidos. En algunas modalidades, la variación genética es una sustitución de aminoácido. En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

En algunas modalidades, el método comprende además someter al sujeto a una o más pruebas diagnósticas adicionales para la EA seleccionadas entre el grupo que consiste en la selección de uno o más marcadores genéticos adicionales, realizar una exploración del estado mental, o someter al sujeto a procedimientos de diagnóstico por imagen.

En algunas modalidades, el método comprende además analizar la muestra para detectar la presencia de al menos un marcador genético adicional que es un modificador de APOE, donde el al menos un marcador genético adicional está en un gen seleccionado entre el gen que codifica IL6R, el gen que codifica NTF4 , el gen que codifica UNC5C, y un gen relacionado en la Tabla 3. En varias modalidades, el al menos un marcador genético adicional es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N° : 2 ) , un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835W en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N° : 3 ) , o un SNP que se relaciona en la Tabla 3.

La invención proporciona además un método de diagnóstico o pronóstico de la EA en un sujeto, que comprende: determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos, en una muestra biológica de un sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

En varias modalidades, la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP) , un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción. En algunas modalidades, la variación genética es un SNP. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l) . En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo AC en rs2228145. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2) . En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo ? ' en rsl21918427. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3). En una modalidad adicional, la variación genética es un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N° : 3) .

En otras modalidades, la al menos una variación genética es una sustitución, inserción, o deleción de aminoácidos. En algunas modalidades, la variación genética es una sustitución de aminoácido. En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3) .

En algunas modalidades, el método comprende además analizar la muestra para detectar la presencia de al menos un marcador genético adicional que es un modificador de APOE, donde el al menos un marcador genético adicional está en un gen seleccionado entre el gen que codifica IL6R, el gen que codifica NTF4, el gen que codifica UNC5C, y un gen relacionado en la Tabla 3. En varias modalidades, el al menos un marcador genético adicional es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835W en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), o un SNP que se relaciona en la Tabla 3.

La invención proporciona además un método para identificar un sujeto que tiene un riesgo mayor de una edad precoz del inicio de la EA, que comprende: (a) determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos, en una muestra biológica de un sujeto; y (b) determinar la presencia o ausencia de al menos un alelo APOE-E-4, donde la presencia de la variación genética y de al menos un alelo ????-e4 indica que el sujeto tiene un riesgo mayor de una edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que carece de la presencia de variación genética y de al menos un alelo ??0?-e4.

En varias modalidades, la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP), un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción. En algunas modalidades, la variación genética es un SNP. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l) . En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo 'C en rs2228145. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2) . En una modalidad adicional, la variación genética es un alelo ??" en rsl21918427. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3). En una modalidad adicional, la variación genética es un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N° : 3) .

En otras modalidades, la al menos una variación genética es una sustitución de aminoácido, inserción, o una deleción En algunas modalidades, la variación genética es una sustitución de aminoácido. En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

La invención proporciona además un método para ayudar en el pronóstico de un subfenotipo de la EA en un sujeto, comprendiendo el método detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), donde el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por niveles aumentados de la ILR6 soluble en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control.

La invención proporciona además un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico contra la EA que se dirige a IL6R, que comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), donde la presencia del SNP es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a IL6R. En una modalidad, el agente terapéutico es un anticuerpo dirigido contra IL6R.

La invención proporciona además un método para ayudar en el pronóstico de un subfenotipo de la EA en un sujeto, comprendiendo el método detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), donde el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por la activación disminuida de TrkB en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control.

La invención proporciona además un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico contra la EA que se dirige a TrkB, que comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID NT: 2), donde la presencia del SNP es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a TrkB. En una modalidad, el agente terapéutico es un agonista de TrkB.

La invención proporciona además un método para ayudar en el pronóstico de un subfenotipo de la EA en un sujeto, comprendiendo el método detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), donde el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por un aumento en la actividad apoptótica de UNC5C en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control.

La invención proporciona además un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico contra la EA que se dirige a UNC5C, que comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), donde la presencia del SNP es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a UNC5C. En una modalidad, el agente terapéutico se dirige al dominio de muerte de UNC5C.

La invención proporciona además un método para diagnosticar o pronosticar la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo capaz de detectar la presencia o ausencia de uno o más SNP seleccionados entre el grupo que consiste en un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 , y un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), y (b) analizar la muestra para detectar la presencia de los uno o más SNP, donde la presencia del uno o más SNP en la muestra indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA. En una modalidad, el método comprende además detectar uno o más SNP seleccionados entre los SNP relacionados en la Tabla 3.

La invención proporciona además un kit para llevar a cabo el método, que comprende al menos un reactivo de detección de oligonucleótidos , donde el reactivo de detección de oligonucleótidos distingue entre cada uno de al menos dos alelos diferentes en el uno o más SNP. En varias modalidades, la detección se lleva a cabo mediante un proceso seleccionado entre el grupo que consiste en la secuenciación directa, hibridación de la sonda especifica de alelo, extensión del cebador especifica de alelo, amplificación especifica de alelo, secuenciación, digestión con nucleasa 5', ensayo de baliza molecular, ensayo de ligadura de oligonucleótidos, análisis de tamaño, y polimorfismo de conformación monocatenario .

En una modalidad, los reactivos de detección de oligonucleótidos se inmovilizan en un sustrato. En una modalidad adicional, los reactivos de detección de oligonucleótidos se disponen en una matriz.

La invención proporciona además un método para diagnosticar o pronosticar la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo capaz de detectar la presencia o ausencia de una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4, y la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3) , y (b) analizar la muestra para detectar la presencia de la una o más sustituciones de aminoácidos, donde la presencia de la una o más sustituciones de aminoácidos en la muestra indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

La invención proporciona además un kit para llevar a cabo el método, que comprende al menos un reactivo de detección de anticuerpos, donde el reactivo de detección de anticuerpos distingue entre cada uno de al menos dos aminoácidos diferentes en la una o más sustituciones de aminoácidos. La invención proporciona además un kit para llevar a cabo el método, que comprende al menos un reactivo de detección de péptidos, donde el reactivo de detección de péptidos distingue entre cada uno de al menos dos aminoácidos diferentes en la una o más sustituciones de aminoácidos.

La invención proporciona además una diana terapéutica para el tratamiento de la EA, donde la diana terapéutica es una o una combinación de las proteínas codificadas por los genes seleccionados entre IL6R, NTF4 y UNC5C.

La invención proporciona además un conjunto de sondas moleculares para el diagnóstico o el pronóstico de la EA que comprende al menos dos sondas capaces de detectar directa o indirectamente al menos dos marcadores seleccionados entre el grupo que comprende: un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4, y un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), donde las sondas moleculares no se asocian con una micromatriz de más de 1000 elementos. En una modalidad, el conjunto de sondas moleculares comprende además una o más sondas capaces de detectar directa o indirectamente al menos dos marcadores seleccionados entre los SNP relacionados en la Tabla 3.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Fig. 1 ilustra la estrategia utilizada en la selección del modificador de APOE .

La Fig. 2 es una gráfica Manhattan que muestra las localizaciones a través de una porción de un cromosoma humano 1 donde hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las variantes genéticas en las muestras del caso de la EA comparadas con los supercontroles . Cuanto menor sea el valor p, más fuerte es la asociación.

La Fig. 3 muestra la frecuencia del alelo T de rs4129267, un alelo relacionado con el alelo C de rs2228145, en los casos de la enfermedad de Alzheimer no seleccionados (N = 932 individuos) y en controles (N = 832 individuos) procedentes del estudio NIA/LOAD. La frecuencia del alelo menor se estratifica por la edad del inicio en los casos de la EA y la edad en los controles.

La Fig. 4 muestra un análisis de datos procedentes del proyecto TGEN (Webster y col. (2009) Am. J. Hum. Genet . 84: 445-458). Los niveles de expresión de IL6R unido a membrana y soluble en los cerebros de los sujetos con EA (EA) se compararon con los controles (CN) , utilizando tanto una sonda que detecta solo la forma unida a membrana de IL6R (NM_000565) , como una sonda que captura la forma unida a membrana y sIL6R (NM_181359) .

La Fig. 5 muestra los resultados de los análisis de unión no paramétrica en el árbol genealógico L01.

La Fig. 6 proporciona una alineación de la secuencia de aminoácidos de los miembros de la familia UNC5, que muestra la conservación del resto aminoácido T853.

La Fig. 7 es una gráfica Manhattan que muestra las localizaciones a través de una porción de un cromosoma humano 1 donde hubo una asociación estadísticamente significativa entre las variantes genéticas y los niveles de IL6R soluble en liquido cefalorraquídeo. Cuanto menor sea el valor p, más fuerte es la asociación.

La Fig. 8 muestra el porcentaje relativo unido a membrana de IL6R en células 293T transfectadas con construcciones D358 o A358 de IL6R, y tratadas con miristato acetato de forbol 100 nM (PMA) durante 0, 30, 60 o 120 minutos. Las células se recogieron después del tratamiento, se tiñeron con un anticuerpo dirigido contra IL6R-PE, y se analizó mediante FACS el IL6R unido a membrana.

La Fig. 9 muestra el porcentaje de IL6R unido a membrana en linfocitos T CD4+ de donantes emparejados por edad, sexo y etnia que eran homocigóticos tanto para D358 como A358, antes y después del tratamiento con 100 nM de PMA durante 60 min. Las células se recogieron pronto después del tratamiento, se tiñeron con un anticuerpo dirigido contra IL6R-PE, y se analizó mediante FACS el IL6R unido a membrana.

La Fig. 10 muestra el IL6R soluble para los linfocitos T CD4+ de donantes emparejados por edad, sexo y etnia que eran homocigóticos tanto para D358 como A358. Los linfocitos T CD4+ se sembraron en placas con anticuerpos dirigidos contra CD3/CD28, se cosecharon después de 24, 48 y 72 horas para la extracción del ARN total, y se recogió el sobrenadante para determinar los niveles de SIL6R mediante ELISA. La gráfica muestra las veces de aumento en el IL6R soluble para A358, con respecto a D358, en cada punto temporal.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION DEFINICIONES El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", tal como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos , nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se puede incorporar a un polímero mediante la ADN o la ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tal como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede transmitir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir mediante componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente tras la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente marcado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caperuzas", la sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc. ) , aquellas que contienen restos pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del (de los) polinucleótido ( s ) . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares puede sustituirse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores convencionales, o activados para preparar enlaces adicionales para nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar a soportes sólidos. Los OH en los extremos 5' y 3' se pueden fosforilar o sustituir por aminas o restos de grupos terminales orgánicos de entre 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos se pueden también derivatizar a grupos protectores convencionales. Los poli9nucleótidos pueden contener también formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2 ' -O-metil-21 -O-alilo, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos , azúcares . alfa . -anoméricos , azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas , análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster se pueden sustituir por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, modalidades donde el fosfato está sustituido por P(0)S ("tioato"), P(S)S ( "ditioato" ) , "(O)NR 2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ( "formacetal" ) , donde cada R o R" es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (--0— ) , arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces de un polinucleótido tienen que ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluyendo ARN y ADN .

"Oligonucleótido" , tal como se usa en el presente documento, se refiere a polinucleótidos monocatenarios cortos que tienen aproximadamente al menos de siete nucleótidos de longitud y menos de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser sintéticos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a oligonucleótidos .

El término "cebador" se refiere a un polinucleótido monocatenario que se puede hibridar con un ácido nucleico y permitir la polimerización de un ácido nucleico complementario, generalmente proporcionando un grupo 3 '--OH libre.

Tal como se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que codifica a través de su molde o ARN mensajero una secuencia de aminoácidos característica de un péptido, polipéptido, o proteína específicos. El término "gen" se refiere también a una secuencia de ADN que codifica un producto de ARN. El término gen, tal como se usa en el presente documento con referencia al ADN genómico incluye interponer regiones sin codificación así como regiones reguladoras y puede incluir extremos 5' y 3 ' .

El término "variación genética" o variación de nucleótido" se refiere a un cambio en una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una inserción, deleción, inversión, o sustitución de uno o más nucleótidos, tal como un polimorfismo único (SNP) ) con respecto a una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia que se encuentra comúnmente y/o natural, y/o la secuencia de un alelo principal) . El término abarca también el correspondiente cambio en el complemento de la secuencia de nucleótidos, salvo que se indique de otra forma. En una modalidad, una variación genética es un polimorfismo somático. En una modalidad, una variación genética es un polimorfismo de la línea germinal.

Un "polimorfismo de nucleótido único" o "SNP", se refiere a una posición de base única en el ADN para cuyos alelos diferentes, o nucleótidos alternativos, existe una población. La posición del SNP suele estar usualmente precedida y seguida por secuencias muy conservadas del alelo (por ejemplo, secuencias que varían en menos de 1/100 o 1/1000 miembros de las poblaciones). Un individuo puede ser homocigótico o heterocigótico para un alelo en cada posición del SNP.

El término "variación de aminoácido" se refiere a un cambio en una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una inserción, sustitución, o deleción de uno o más aminoácidos, tal como una deleción interna o un truncamiento en el extremo N o C) con respecto a la secuencia de referencia.

El término "variación" se refiere tanto a una variación de nucleótidos como a una variación de aminoácidos.

El término "una variación genética en la posición del nucleótido que corresponde a un SNP", "una variación de nucleótido en la posición del nucleótido que corresponde a un SNP" y sus variantes gramaticales se refiere a una variación de nucleótido en una secuencia de polinucleótidos en la posición relativa del ADN correspondiente ocupada por el SNP en el genoma. El término abarca también la correspondiente variación en el complemento de la secuencia de nucleótidos, salvo que se indique de otra forma.

Tal como se usa en el presente documento, el término "alelo" se refiere a una de una pareja o serie, de formas de un gen o región no génica que se produce en un locus dado en un cromosoma. En una célula diploide normal existen dos alelos de un gen cualquiera (uno de cada progenitor) , que ocupan la misma posición relativa (locus) en los cromosomas homólogos. En una población pueden existir más de dos alelos de un gen. Los SNP tienen también alelos, es decir, los dos (o más) nucleótidos que caracterizan el SNP.

Tal como se usa en el presente documento, el término "desequilibrio de unión" o "LD" se refiere a la situación en la que los alelos de dos o más loci no se encuentran juntos en los individuos muestreados de una población a las frecuencias previstas por el producto de sus frecuencias alélicas individuales. Los marcadores que están en LD no siguen la segunda ley de Mendel de segregación aleatoria independiente. La LD puede estar ocasionada por cualquiera de diversos artefactos demográficos o de población asi como por la presencia de unión genética entre marcadores. Sin embargo, cuando estos artefactos se controlan y eliminan como fuentes de LD, entonces el LD resulta directamente del hecho de que los loci implicados se localizan próximos entre si en el mismo cromosoma de tal manera que las combinaciones especificas de alelos para diferentes marcadores (haplotipos) se heredan juntas. Se puede considerar que los marcadores que están a un LD elevado están localizados próximos entre si y se puede considerar un marcador de haplotipo que está a un LD elevado con un rasgo genético está localizado próximo al gen que afecta este rasgo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "locus" se refiere a una posición especifica en un cromosoma o secuencia de ADN . Dependiendo del contexto, un locus podría ser un gen, un marcador, una banda cromosómica o una secuencia específica de uno o más nucleótidos.

El término "matriz" o "micromatriz" se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz que se pueden hibridar, preferentemente sondas de polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos ) , sobre un sustrato. El sustrato puede ser un sustrato sólido, tal como un porta de vidrio, o un sustrato semisólido, tal como una membrana de nitrocelulosa .

El término "amplificación" se refiere al proceso de producir una o más copias de una secuencia de ácido nucleico de referencia o su complemento. La amplificación puede ser lineal o exponencial (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ) . Una "copia" no significa necesariamente una complementariedad o identidad perfecta de la secuencia con respecto a la secuencia del molde. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótidos tales como desoxiinosina, alteraciones intencionadas de la secuencia (tales como alteraciones de la secuencia introducidas a través de un cebador que comprende una secuencia que se puede hibridar, pero que no es completamente complementaria, del molde) , y/o errores de secuencia que se producen durante la amplificación .

El término "oligonucleótido especifico de alelo" se refiere a un oligonucleótido que se híbrida con una región de un ácido nucleico diana que comprende una variación de nucleótido (a menudo una sustitución) . "Hibridación especifica de alelo" significa que, cuando un oligonucleótido específico de alelo se híbrida con su ácido nucleico diana, la base de un nucleótido del oligonucleótido específico del alelo se empareja con la variación del nucleótido. Se dice que un oligonucleótido específico de alelo capaz de hibridación específica de alelo con respecto a una variación de nucleótido concreta es "específico de" esta variación.

El término "cebador específico de alelo" se refiere a un oligonucleótido específico de alelo que es un cebador.

El término "ensayo de extensión del cebador" se refiere a un ensayo en el cual se añaden nucleotidos a un ácido nucleico, dando como resultado un ácido nucleico más largo, o "producto de extensión", que se detecta directa o indirectamente. Los nucleotidos se pueden añadir para extender el extremo 5' o 3' del ácido nucleico.

El término "ensayo de incorporación de nucleótido específico de alelo" se refiere a un ensayo de extensión del cebador en el que un cebador se (a) híbrida con un ácido nucleico diana en una región que está en 3' o 5' de una variación de nucleótido y (b) se extiende mediante una polimerasa, incorporando por tanto al producto de extensión un nucleótido que es complementario de la variación de nucleótido.

El término "ensayo de extensión del cebador especifico de alelo" se refiere a un ensayo de extensión del cebador en el que un cebador especifico de alelo se híbrida con un ácido nucleico diana y se extiende.

El término "ensayo de hibridación de oligonucleótido específico de alelo" se refiere a un ensayo en el que (a) un oligonucleótido específico de alelo se híbrida con un ácido nucleico diana y (b) la hibridación se detecta directa o indirectamente .

El término "ensayo de la nucleasa 5'" se refiere a un ensayo en el que la hibridación de un oligonucleótido específico de alelo con un ácido nucleico diana permite la escisión nucleolítica de la sonda hibridada, dando como resultado una señal detectable.

El término "ensayo que emplea balizas moleculares" se refiere a un ensayo en el que la hibridación de un oligonucleótido específico de alelo con un ácido nucleico diana da como resultado un nivel de señal detectable que es mayor que el nivel de señal detectable emitido por el oligonucleótido libre .

El término "ensayo de ligadura del oligonucleótido" se refiere a un ensayo en el cual un oligonucleótido específico de alelo y un segundo oligonucleótido se hibridan adyacentes entre sí con un ácido nucleico diana y se ligan juntos (tanto directa como indirectamente a través de los nucleótidos intercalados) , y el producto de ligadura se detecta directa o indirectamente .

El término "secuencia diana", o "ácido nucleico diana" o "secuencia de ácido nucleico diana" se refiere en general a una secuencia del polinucleótido de interés en la que se sospecha o se sabe que existe una variación de nucleótido, incluyendo las copias del ácido nucleico diana generadas mediante amplificación.

El término "detección" incluye cualquier medio de detección, incluyendo la detección directa e indirecta.

El término "IL6R" se usa para referirse al receptor de la interleuquina-ß, que se conoce también como IL-6R1, IL-6RA, IL-6R alfa, subunidad alfa del receptor de la interleuquina-6, y CD126. El término abarca el IL6R de "longitud completa" sin procesar así como cualquier forma de IL6R que sea resultado del procesamiento en la célula. El término abarca también las variantes de IL6R que se producen de forma natural, por ejemplo, variantes por corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de un IL6R humano ilustrativo se muestra en la SEC ID N°: 1 MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPGVEPEDNATVHW VLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLS CFRKSPLSNVVCE GPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQ FSCQLAV PEGDSSFYIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQD PHS NSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQ GEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVSTPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSS SVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVLRFKKTWKLRALKEGKTSMHPPYSLGQLVPERPRP TPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR (SEC ID N° : 1) (N° de acceso de Genbank NP_000566) .

El término "NTF4" se usa para referirse a neutrotrofina 4, que se conoce también como neutrotrofina 5, factor neurotrófico 4, factor neurotrófico 5, NT4, NT5, NT-4, NT-5, NTF5, GLC10 y NT-4/5. El término abarca NTF4 de "longitud completa" sin procesar asi como cualquier forma de NTF4 que sea resultado del procesamiento en la célula. El término abarca también las variantes de NTF4 que se producen de forma natural, por ejemplo, variantes por corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una NTF4 humana ilustrativa se muestra en la SEC ID N°: 2 MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLF LLEAGAFRESAGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEV LGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRAL TADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA (SEC ID N°:2) (N° de acceso al Genbank. NP_006170) .

El término "UNC5C" se usa para referirse al receptor de netrina UNC5C, que se conoce también como homólogo 3 de UNC-5, homólogo C de UNC-5, y UNC5H3. El término abarca el UNC5C de "longitud completa" sin procesar asi como cualquier forma de UNC5C que sea resultado del procesamiento en la célula. El término abarca también las variantes de UNC5C que se producen de forma natural, por ejemplo, variantes por corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de un UNC5C humano ilustrativo se muestra en la SEC ID N° : 3 MRKGLRATAARCGLGLGYLLQMLVLPALALLSASGTGSAAQDDDFFHELPETFPSDPPEP LPHFLIEPEEAYIVKNKPVNLYCKASPATQIYFKCNSEWVHQKDHIVDERVDETSGLIVR EVSIEISRQQVEELFGPEDY CQCVA SSAGTTKSRKAYVRIAYLRKTFEQEPLGKEVSL EQEVLLQCRPPEGIPVAEVEWLKNEDIIDPVEDRNFYITIDHNLIIKQARLSDTANYTCV AKNIVAKRKSTTATVIVYVNGG STWTEWSVCNSRCGRGYQKRTRTCTNPAPLNGGAFCE GQSVQKIACTTLCPVDGRWTP SKWSTCGTECTHWRRRECTAPAPKNGGKDCDGLVLQSK NCTDGLCMQTAPDSDDVALYVGIVIAVIVCLAISVVVALFVYRKNHRDFESDIIDSSALN GGFQPVNIKAARQDLLAVPPDLTSAAAMYRGPVYALHDVSDKIPMTNSPILDPLPNLKIK VYNTSGAVTPQDDLSEFTSKLSPQMTQSLLENEALSLKNQSLARQTDPSCTAFGSFNSLG GHLIVPNSGVSLLIPAGAIPQGRVYEMYVTVHRKETMRPPMDDSQTLLTPVVSCGPPGAL LTRPVVLTMHHCADPNTEDWKILLKNQAAQGQ EDVVVVGEENFTTPCYIQLDAEACHIL TENLSTYALVGHSTTKAAAKRLKLAIFGPLCCSSLEYSIRVYCLDDTQDALKEILHLERQ MGGQLLEEPKALHFKGSTHNLRLSIHDIAHSLWKSKLLAKYQEI PFYHVWSGSQRNLHCT FTLERFSLNTVELVCKLCVRQVEGEGQIFQLNCTVSEEPTGIDLPLLDPANTITTVTGPS AFSI PLPIRQKLCSSLDAPQTRGHDWRMLAHKLNLDRYLNYFATKSSPTGVILDLWEAQN FPDGNLSMLAAVLEEMGRHETVVSLAAEGQY (SEC ID N°:3) (N° de acceso al Genbank NP_003719) .

Tal como se usa en el presente documento, el término "enfermedad de Alzheimer" (EA) se refiere a la EA de inicio precoz y a la EA de inicio tardío, asi como a las formas familiares y esporádicas de la EA.

Tal como se usa en el presente documento, un sujeto "en riesgo" de desarrollar la enfermedad de Alzheimer puede tener o no enfermedad detectables o síntomas de la enfermedad, y puede expresar o no enfermedad detectable o los síntomas de la enfermedad expresados antes de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento. "En riesgo" denota que un sujeto tiene uno o más factores de riesgo, que son parámetros medibles que se correlacionan con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. Un sujeto que tiene uno o más de estos factores de riesgo tiene una probabilidad mayor de desarrollar la enfermedad de Alzheimer que un sujeto sin uno o más de este (estos) factor (es) de riesgo.

El término "diagnóstico" se usa en el presente documento para referirse a la identificación o clasificación de un estado molecular o patológico, enfermedad o dolencia, por ejemplo, EA. "Diagnóstico" puede referirse también a la clasificación de un subtipo concreto de EA, por ejemplo, por las características moleculares (por ejemplo, una subpoblación de pacientes caracterizada por variación (es ) genética (s) en un gen o región de ácido nucleico concreta) .

El término "diagnóstico auxiliar " se usa en el presente documento para referirse a los métodos que ayudan a realizar una determinación clínica con respecto a la presencia, o naturaleza, de un tipo concreto de síntoma o dolencia de la EA. Por ejemplo, un método de diagnóstico auxiliar de la EA puede comprender medir la presencia o ausencia de uno o más marcadores genéticos indicativos de la EA o un riesgo mayor de tener EA en una muestra biológica procedente de un individuo.

El término "pronóstico" se usa en el presente documento para referirse a la predicción de la probabilidad de desarrollar síntomas incluyendo, por ejemplo, pérdida de memoria y demencia, de la EA. El término predicción se utiliza en el presente documento para referirse a la probabilidad de que un paciente responderá de forma favorable o desfavorable a un fármaco o conjunto de fármacos. En una modalidad, la predicción se refiere a la extensión de las respuestas. En una modalidad, la predicción se refiere si y/o la probabilidad de que un paciente sobreviva o mejore tras tratamiento, por ejemplo, tratamiento con un agente terapéutico concreto, y durante un determinado periodo de tiempo sin recurrencia de la enfermedad. Los métodos predictivos de la invención se pueden usar clínicamente para tomar las decisiones del tratamiento escogiendo las modalidades de tratamiento más adecuadas para cualquier paciente concreto. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas para predecir si es probable que un paciente responda favorablemente a una pauta terapéutica, tal como una pauta terapéutica dada, incluyendo por ejemplo, la administración de un agente o combinación terapéutica dada, intervención quirúrgica, tratamiento con esteroides, etc., o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente después de una pauta terapéutica.

Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o las células que - se están tratando, y se puede llevar a cabo antes o durante el curso de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la incidencia o recurrencia de una enfermedad o una dolencia o síntoma de la misma, aliviar una dolencia o síntoma de la enfermedad, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminuir la velocidad de evolución de la enfermedad, mejora o alivio de la patología, y conseguir la remisión o una mejora en el pronóstico. En algunas modalidades, los métodos y composiciones de la invención son útiles en los intentos de retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.

Un "agente terapéutico contra la EA", un "agente terapéutico eficaz para tratar la EA", y sus variaciones gramaticales, tal como se usa en el presente documento, se refieren a un agente que, cuando se proporciona en una cantidad eficaz, se sabe, se demuestra de forma clínica, o los médicos esperan que proporcione un beneficio terapéutico a un sujeto que tiene EA. En una modalidad, la frase incluye cualquier agente que está comercializado por un fabricante, o se usa de otra forma por médicos colegiados, como un agente clínicamente aceptado que, cuando se proporciona en una cantidad eficaz, se esperaría que produjera un efecto terapéutico en un sujeto que tiene EA. En diversas modalidades no limitantes, un agente terapéutico contra la EA comprende un inhibidor de la colinesterasa, memantina, una medicación antiespasmódica, un antidepresivo, un ansiolítico, o un compuesto que se dirige a una proteína precursora del amiloide, amiloide beta, placas de amiloide, o cualquiera de las enzimas que escinden la proteína precursora del amiloide que incluye, pero no se limita a alfa-secretasa, beta-secretasa, y gamma-secretasa El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación en forma tal que permite que la actividad biológica de un principio activo incluido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se administre la formulación.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente incluido en una formulación farmacéutica, diferente al principio activo, que no sea tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un amortiguador, excipiente, estabilizante, o conservante .

Un "efecto terapéutico" se refiere a la producción de un estado que es mejor que el estado promedio o normal en un individuo que no padece un trastorno (es decir, un efecto supranormal tal como una mejora en la cognición, memoria, ánimo u otras características en un sujeto atribuibles al menos en parte al funcionamiento del SNC, en comparación con el estado normal o promedio en un sujeto sin padecimiento o asintomático) .

Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patológico, edad, sexo, y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para estimular una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del agente terapéutico tiene mayor peso que los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz que, en las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, logra el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Normalmente, pero no de forma necesaria, puesto que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Un "individuo", "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En determinadas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen pero no se limitan a, primates (incluyendo primates humanos y no humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En determinadas modalidades, un mamífero es un ser humano .

Una "subpoblación de pacientes" y sus variaciones gramaticales, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un subconjunto de pacientes que se caracteriza por tener una o más características medibles y/o identificables distintivas que distinguen al subconjunto de pacientes de otros en una categoría de enfermedad más amplia a la cual esta pertenece. Las características incluyen subcategorías de enfermedades, sexo, estilo de vida, antecedentes sanitarios, órganos/tejidos implicados, antecedentes de tratamiento, etc. En una modalidad, una subpoblación de pacientes se caracteriza por firmas genéticas, que incluyen variaciones genéticas en posiciones de nucleótidos y/o regiones de nucleótidos concretas (tales como los SNP) .

Un "sujeto control" se refiere a un sujeto sano al que no se ha diagnosticado que padece EA y que no padece de ningún signo o síntoma asociado con la EA.

El término "muestra", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que se obtiene o deriva de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/u otro tipo de entidad molecular que se va a caracterizar y/o identificar, basándose por ejemplo en características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra de enfermedad" y sus variaciones se refiere a cualquier muestra obtenida de un sujeto de interés que se esperaría o que se sabe que contiene la entidad celular y/o molecular que se va a caracterizar.

Por "muestra de tejido o de células" se entiende una colección de células similares obtenidas a partir de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra de tejido o células puede ser un tejido sólido que procede de una muestra de un órgano o tejido reciente, congelado y/o preservado, o de una biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente sanguíneo; fluidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, fluido amniótico, fluido peritoneal, o fluido intersticial; células de cualquier tiempo en gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido puede ser también de células primarias o cultivadas o de líneas celulares. De manera opcional, la muestra de tejido o de célula se obtiene de un tejido/órgano con enfermedad. La muestra de tejido puede contener compuestos que no se mezclan naturalmente con el tejido en la naturaleza tal como conservantes, anticoagulantes, amortiguadores, fijadores, nutrientes, antibióticos, o similares. Una "muestra de referencia", "célula de referencia", "tejido de referencia", "muestra del control", "célula del control", o "tejido del control", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra, célula o tejido obtenido de una fuente que se sabe, o que se cree, que no se encuentra afectada con la enfermedad o dolencia para la cual se utiliza un método o composición de la invención para identificarla. En una modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra del control, célula del control, o tejido del control se obtiene de una parte sana del cuerpo del mismo sujeto o paciente en quien se está identificando una enfermedad o dolencia utilizando una composición o método de la invención. En una modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra del control, célula del control, o tejido del control se obtiene de una parte sana de un individuo que no es el sujeto o paciente en quien se está identificando una enfermedad o dolencia utilizando una composición o método de la invención.

Para los fines del presente documento, se entiende que una "sección" de una muestra de tejido es una parte o pieza única de una muestra de tejido, por ejemplo, un corte fino de tejido o un corte de células de una muestra de tejido. Se entiende que se pueden tomar múltiples secciones de muestras de tejido y someterse a análisis de acuerdo con la presente invención, siempre que se entienda que la presente invención comprende un método en el que se analiza la misma sección de una muestra de tejido a niveles morfológicos y moleculares, o se analiza con respecto tanto proteínas como a ácidos nucleicos .

Por "correlacionar" o "que correlaciona" se entiende comparar, de cualquier forma, el comportamiento y/o los resultados de un primer análisis o protocolo con el comportamiento y/o los resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo un segundo protocolo y se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si debería llevarse a cabo un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la realización del análisis o protocolo de expresión génica, se pueden usar los resultados del análisis o protocolo de expresión génica para determinar si debería llevarse a cabo una pauta terapéutica específica.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan de manera indistinta en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales , anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos siempre que presenten la actividad biológica deseada) y pueden incluir también determinados fragmentos de anticuerpos (tal como se describe en mayor detalle en el presente documento) . Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado por afinidad. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antigeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab ' , F(ab' )2, y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios ; y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Una "molécula pequeña" o molécula orgánica pequeña" se define en el presente documento como una molécula orgánica que tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons .

La palabra "marca" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable. La marca puede ser detectable por si misma (por ejemplo, marcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que da como resultado un producto detectable. Los radionucleidos que pueden servir como marcas detectables incluyen, por ejemplo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, y Pd-109.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modalidades que se dirigen a este valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, tratamiento combinado, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de los productos terapéuticos. COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE LA INVENCIÓN Variaciones genéticas En un aspecto, la invención proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de variaciones genéticas asociadas con la enfermedad de Alzheimer (EA) en una muestra de un sujeto, asi como métodos de diagnóstico y pronóstico de la EA detectando la presencia o ausencia de una o más de estas variaciones genéticas en una muestra de un sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA. Se identificaron variaciones genéticas asociadas con el riesgo de EA utilizando estrategias que incluyen estudios de asociación de genoma completo, selecciones de modificadores, y selección basada en familias.

Las variaciones genéticas para su uso en los métodos de la invención incluyen variaciones genéticas en el receptor de la interleuquina-6 (IL6R), factor 4 neurotrófico (NTF4) y UNC5C, o los genes que codifican estas proteínas, así como cualquiera de los genes relacionados en la Tabla 3 o las proteínas que codifican. En algunas modalidades, la variación genética está en el ADN genómico que codifica un gen (o su región reguladora) donde el gen se selecciona entre los genes que codifican el receptor de la interleuquina-6 (IL6R) , factor 4 neurotrófico (NTF4) y UNC5C, y cualquiera de los genes relacionados en la Tabla 3. En varias modalidades, la variación genética es un SNP, un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción en uno o más genes seleccionados entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, y cualquiera de los genes relacionados en la Tabla 3. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). En una modalidad, la variación genética es un alelo C en rs2228145. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad, la variación genética es un alelo ??' en rsl21918427. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835 en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3). En modalidades, la variación genética es un SNP en un gen seleccionado entre los que se relacionan en la Tabla 3. En las modalidades, la variación genética es un SNP seleccionado entre rsl2733578, rs4658945, rsl478161, rsl024591, rs7799010, rsl0969475, y rsl2961250. En varias modalidades, la al menos una variación genética es una sustitución de aminoácido, inserción, o deleción en IL6R, NTF4 o UNC5C. En algunas modalidades, la variación genética es una sustitución de aminoácido. En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l) . En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad, la variación genética es la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

Detección de variaciones genéticas El ácido nucleico, tal como se usa en cualquiera de los métodos de detección descritos en el presente documento, puede ser ADN genómico; ARN transcrito a partir del ADN genómico; o ADNc generado a partir de ARN. El ácido nucleico se puede derivar de un vertebrado, por ejemplo, un mamífero. Se dice que un ácido nucleico se "deriva de" una fuente concreta si se obtiene directamente a partir de esta fuente o si es una copia de un ácido nucleico que se encuentra en esta fuente. Ácido nucleico incluye copias del ácido nucleico, por ejemplo, copias que resultan de la amplificación. La amplificación puede ser deseable en determinados casos, por ejemplo, a fin de obtener una cantidad deseada de material para detectar variaciones. Los amplicones pueden someterse a continuación a un método de detección de la variación, tal como los descritos a continuación, para determinar si una variación está presente en el amplicón.

Se pueden detectar variaciones genéticas mediante determinados métodos conocidos de los expertos en la materia. Los métodos incluyen, pero no se limitan a, secuenciación del ADN; ensayos de extensión del cebador, incluyendo ensayos de incorporación de nucleótidos específicos de alelo y ensayos de extensión del cebador específicos de alelo (por ejemplo, PCR específica de alelo, reacción en cadena de ligadura (LCR) específica de alelo, y hueco-LCR) ensayos de hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo (por ejemplo, ensayos de ligadura de oligonucleótidos); ensayos de protección de la escisión en los que la protección de los agentes de escisión se usa para detectar bases incorrectamente emparejadas en dupletes de ácido nucleico; análisis de la unión a la proteína MutS; análisis electroforético que compara la movilidad de las moléculas de ácido nucleico variantes y naturales; electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE, como en, por ejemplo, Myers y col. (1985) Nature 313:495); análisis de escisión de la ARNasa en pares de bases emparejadas incorrectamente; análisis de la escisión química o enzimática del ADN heteroduplete ; espectrometría de masas (por ejemplo, MALDI-TOF) ; análisis de bit genético (GBA) ; ensayos de la nucleasa 5' (por ejemplo, TaqMan™) ; y ensayos que emplean balizas moleculares. Algunos de estos métodos se describen en detalle a continuación.

Se puede llevar a cabo la detección de variaciones en ácidos nucleicos diana mediante clonación y secuenciación molecular de los ácidos nucleicos diana utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Alternativamente, se pueden usar técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de ácido nucleico diana directamente a partir de una preparación de ADN genómico procedente del tejido tumoral. La secuencia de ácido nucleico de las secuencias amplificadas puede determinarse a continuación, e identificarse las variaciones a partir de la anterior. Son bien conocidas en la materia las técnicas de amplificación, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa se describe en Saiki y col., Science 239:487, 1988; patentes de los Estados Unidos Nros . 4.683.203 y 4.683.195.

La reacción en cadena de la ligasa, que es conocida en la técnica, también se puede usar para amplificar las secuencias de ácido nucleico diana. Véase, por ejemplo, Wu y col., Genomics 4:560-569 (1989). Además, también se puede usar una técnica conocida como PCR especifica de alelo para detectar variaciones (por ejemplo, sustituciones). Véase, por ejemplo, Ruano y Kidd (1989) Nucleic Acids Research 17:8392; McClay y col. (2002) Analytical Biochem. 301:200-206. En determinadas modalidades de esta técnica, se usa un cebador especifico de alelo donde el nucleótido 3' terminal del cebador es complementario de (es decir, capaz de emparejar sus bases específicamente) una variación concreta en el ácido nucleico diana. Si la variación concreta no está presente, no se observa producto de la amplificación. También se puede usar el sistema de amplificación resistente a la Mutación (ARMS, por sus siglas en inglés) para detectar variaciones (por ejemplo, sustituciones). Se describe el ARMS, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente europea N° 0332435, y en Newton y col., Nucleic Acids Research, 17:7, 1989.

Otros métodos útiles para detectar variaciones (por ejemplo, sustituciones) incluyen, pero no se limitan a, (1) ensayos de incorporación de nucleótidos específicos de alelo, tales como ensayos de extensión de base única (véase por ejemplo, Chen y col., (2000) Genome Res. 10:549-557; Fan y col. (2000) Genome Res. 10:853-860; Pastinen y col. (1997) Genome Res. 7:606-614; y Ye y col. (2001) Hum. Mut . 17:305-316; (2) ensayos de extensión del cebador específicos de alelo (véase, por ejemplo, Ye y col. (2001) Hum. Mut. 17:305-316; y Shen y col. Genetic Engineering News, vol . 23, 15 de marzo 2003), que incluyen PCR específica de alelo; (3) ensayos de la nucleasa 5' (véase, por ejemplo, De La Vega y col. (2002) BioTechniques 32:S48-S54 (que describe el ensayo TaqMan . RTM . ) ; Ranade y col. (2001) Genome Res. 11:1262-1268; y Shi (2001) Clin. Chem. 47:164-172; (4) ensayos que emplean balizas moleculares (véase, por ejemplo, Tyagi y col. (1998) Nature Biotech. 16:49-53, y Mhlanga y col. (2001) Methods 25:463-71); y (5) ensayos de ligadura de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Grossman y col. (1994) Nuc. Acids Res. 22:4527-4534; publicación de solicitud de patente N° US 2003/0119004 Al; publicación internacional PCT N° WO 01/92579 A2 ; y la patente de los Estados Unidos N° 6.027.889) .

También se pueden detectar variaciones mediante los métodos de detección del empare amiento incorrecto. Los emparejamientos incorrectos son dupletes de ácido nucleico hibridado que no son complementarios al 100%. La carencia de complementariedad total puede deberse a deleciones, inserciones, inversiones, o sustituciones. Un ejemplo de un método de detección del emparejamiento incorrecto es el ensayo de detección de la reparación del emparejamiento incorrecto (MRD) descrito, por ejemplo, en Faham y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102:14717-14722 (2005) y Faham y col., Hum. Mol. Genet. 10:1657-1664 (2001). Otro ejemplo de una técnica de escisión del emparejamiento incorrecto es el método de protección de la ARNasa, que se describe en detalle en Winter y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU, 82:7575, 1985, y Myers y col., Science 230:1242, 1985. Por ejemplo, un método de la invención puede implicar el uso de una ribosonda marcada que es complementaria del ácido nucleico diana natural humano. La ribosonda y el ácido nucleico diana derivados de la muestra de tejido se funden (hibridan) juntos y se digieren posteriormente con la enzima ARNasa A que es capaz de detectar algunos emparejamientos incorrectos en una estructura de un ARN duplete. Si se detecta un emparejamiento incorrecto por la ARNasa A, esta escinde el sitio del emparejamiento incorrecto. De esta manera, cuando la preparación de ARN hibridado se separa en una matriz de gel electroforético, si se ha detectado un emparejamiento incorrecto que se ha escindido mediante la ARNasa A, se observará un producto de ARN que es más pequeño que el ARN duplete de longitud completa de la ribosonda y el ARNm o el ADN. La ribosonda tiene que ser la longitud completa del ácido nucleico diana, pero puede ser una porción del ácido nucleico diana, con la condición que abarque la posición sospechosa de tener una variación.

De manera similar, se pueden usar sondas de ADN para detectar emparejamientos incorrectos, por ejemplo, mediante escisión enzimática o química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU, 85:4397, 1988; y Shenk y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU, 72:989, 1975. Alternativamente, se pueden detectar emparejamientos incorrectos mediante cambios en la movilidad electroforética de dupletes emparejados incorrectamente con respecto a dupletes emparejados correctamente. Véase, por ejemplo, Cariello, Human Genetics, 42:726, 1988, tanto con ribosondas como con sondas de ADN, el ácido nucleico diana sospechoso de comprender una variación puede amplificarse antes de la hibridación. También se pueden detectar cambios en el ácido nucleico diana utilizando la hibridación Southern, especialmente si los cambios son redisposiciones groseras, tales como deleciones e inserciones .

Se pueden usar sondas de polimorfismos de longitud del fragmento de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) para los ácidos nucleicos diana o los genes que rodean el marcador para detectar variaciones, por ejemplo, inserciones o deleciones. También se pueden detectar inserciones y deleciones mediante clonación, secuenciación y amplificación de un ácido nucleico diana. Se puede usar también el análisis del polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP, por sus siglas en inglés) para detectar variantes de cambios de bases de un alelo. Véase, por ejemplo, Orita y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2766-2770, 1989, and Genomics, 5:874-879. 1989. SSCP identifica diferencias de bases mediante la alteración en la migración electroforética de productos de la PCR monocatenarios . Se pueden generar productos de la PCR monocatenarios calentando o desnaturalizando de otra manera productos de la PCR bicatenarios . Los ácidos nucleicos monocatenarios pueden replegarse o formar estructuras secundarias que son parcialmente dependientes de la secuencia de las bases. Las diferentes movilidades electroforéticas de los productos de amplificación monocatenarios están relacionadas con las diferencias en la secuencia de bases en las posiciones SNP. La electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) diferencia los alelos SNP según las diferentes estabilidades dependientes de secuencia y fusionando las propiedades inherentes en el ADN polimórfico y las diferencias correspondientes en los modelos de migración electroforética en un gel desnaturalizador en gradiente.

También se pueden detectar variaciones genéticas con el uso de micromatrices . Una micromatriz es una tecnología multiplete que utiliza normalmente una serie dispuesta de miles de sondas de ácidos nucleicos para hibridarse con, por ejemplo, una muestra de ADNc o ARNc en condiciones muy rigurosas. La hibridación sonda-diana se detecta y cuantifica normalmente mediante la detección de dianas marcadas con fluoróforo, plata, o marcadas mediante quimioluminiscencia para determinar la abundancia relativa de secuencias de ácidos nucleicos en la diana. En micromatrices típicas, las sondas se unen a una superficie sólida mediante un enlace covalente con una matriz química (mediante epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida u otros) . La superficie sólida es, por ejemplo, vidrio, un chip de silicio, o perlas microscópicas. Están comercialmente disponibles varias micromatrices, incluyendo las fabricadas, por ejemplo, por Affymetrix, Inc. e Illumina, Inc.

Otro método para la genotipación de SNP se basa en la espectrometría de masas. La espectrometría de masas se aprovecha de la masa única de cada uno de los cuatro nucleótidos del ADN. Los SNP se pueden genotipar sin ambigüedad mediante espectrometría de masas midiendo las diferencias en la masa de ácidos nucleicos que tienen alelos SNP alternativos. La tecnología de espectrometría de masas ALDI-TOF (desorción ionización láser asistida por la matriz con detección de masas por tiempo de vuelo) es útil para determinaciones extremadamente precisas de masas moleculares, tales como los SNP. Se han desarrollado numerosas soluciones para los análisis de SNP basándose en la espectrometría de masas. Los métodos ilustrativos basados en la espectrometría de masas de genotipación de SNP incluyen ensayos de extensión del cebador, que se pueden utilizar también junto con otras soluciones, tales como formatos y micromatrices basados en gel tradicionales .

También se pueden usar ribozimas específicas de secuencia (patente de los Estados Unidos N° 5.498.531) para puntuar los SNP basándose en la aparición o la pérdida de un sitio de escisión de ribozima. Las secuencias emparejadas perfectamente se pueden distinguir de las secuencias emparejadas incorrectamente mediante ensayos de digestión con nucleasa de escisión o por diferencias en la temperatura de fusión. Si el SNP afecta un sitio de escisión de la enzima de restricción, el SNP se puede identificar mediante alteraciones en los modelos de digestión con la enzima de restricción, y los correspondientes cambios en las longitudes de los fragmentos de ácidos nucleicos determinados mediante electroforesis en gel .

En otras modalidades de la invención, se usan técnicas de detección basadas en proteínas para detectar proteínas variantes codificadas por los genes que tienen variaciones genéticas tal como se describe en el presente documento. La determinación de la presencia de la forma variante de la proteína se puede llevar a cabo usando cualquier técnica adecuada conocida en la materia, por ejemplo, electroforesis (por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida con o sin desnaturalización, electroforesis bidimensional en gel, electroforesis capilar, e isoelectrofocalización) , cromatografía (por ejemplo, cromatografía de dimensionamiento, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) , y HPLC de intercambio catiónico) , y espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas MALDI-TOF, espectrometría de masas por ionización con electropulverización (ESI, por sus siglas en inglés) , y espectrometría de masas en tándem) . Véase, por ejemplo, Ahrer y Jungabauer (2006) J. Chromatog. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 841: 110-122; y ada (2002) J. Chromatog. B. 781: 291-301). Se pueden seleccionar técnicas adecuadas basándose en parte en la naturaleza de la variación que se va a detectar. Por ejemplo, las variaciones resultantes de las sustituciones de aminoácidos donde los aminoácidos sustituidos tienen una carga diferente a la del aminoácido original se pueden detectar mediante focalización isoeléctrica. Focalización isoeléctrica del polipéptido a través de un gel que tiene un gradiente de pH a las proteinas separadas por voltajes elevados por su pl. El gel del gradiente de pH se puede comparar simultáneamente con un gel de análisis que contiene la proteina natural. En los casos donde la variación da como resultado la generación de un nuevo sitio de escisión proteolitica, o la desaparición de uno existente, la muestra se puede someter a digestión proteolitica seguida por el cartografiado peptidico utilizando una técnica electroforética, cromatográfica o, de espectrometría de masas. También se puede detectar la presencia de una variación utilizando técnicas de secuenciación de proteínas tales como la degradación de Edman o determinadas formas de espectroscopia de masas.

Se pueden usar también métodos conocidos en la técnica que utilizan combinaciones de estas técnicas. Por ejemplo, en la técnica de espectrometría de masas en tándem con HPLC y microscopio, se llevó a cabo la digestión proteolitica de una proteína, y la mezcla peptídica resultante se separó mediante separación cromatográfica en fase inversa. A continuación se llevó a cabo la espectrometría de masas en tándem y se recogieron y analizaron los datos de la anterior. (Gatlin y col. (2000) Anal. Chem., 72:757-763). En otro ejemplo, la electroforesis en gel no desnaturalizante se combinó con la espectroscopia de masas MALDI (Mathew y col. (2011) Anal. Biochem. 416: 135-137) .

En algunas modalidades, la proteina se puede aislar de la muestra utilizando un reactivo, tal como un anticuerpo o péptido que se une específicamente a la proteina, y a continuación analizarse adicionalmente para determinar la presencia o ausencia de la variación genética utilizando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente.

Alternativamente, se puede detectar la presencia de la proteína variante en una muestra mediante ensayos de inmunoafinidad basándose en los anticuerpos específicos de las proteínas que tienen variaciones genéticas de acuerdo con la presente invención, esto es, anticuerpos que se unen específicamente a la proteína que tiene la variación, pero no a una forma de la proteína que carece de la variación. Los anticuerpos se pueden producir mediante cualquier técnica adecuada conocida en la materia. Los anticuerpos se pueden usar para inmunoprecipitar proteínas específicas a partir de muestras de disolución o para inmunotransferir proteínas separadas mediante, por ejemplo, geles de poliacrilamida .

También se pueden usar métodos inmunocitoquímicos para detectar variantes específicas de proteína en tejidos o células. También se pueden usar otras técnicas conocidas basadas en anticuerpos que incluyen, por ejemplo, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) , ensayos inmunoradiométrícos (IRMA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA), incluyendo ensayos de tipo sándwich que utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales . Véanse, por ejemplo patentes de los Estados Unidos Nros. 4.376.110 y 4.486.530.

Identificación de marcadores genéticos adicionales Los marcadores genéticos descritos son útiles para identificar marcadores genéticos adicionales asociados con el desarrollo de la EA. Por ejemplo, se pueden usar los SNP descritos en el presente documento para identificar SNP adicionales que están en desequilibrio de unión. Asi, cualquier SNP en desequilibrio de unión con un primer SNP asociado con la EA se asociará con la EA. Una vez que se ha demostrado la asociación entre un SNP dado y la EA, puede ser de mayor interés el descubrimiento de SNP adicionales asociados con la EA para aumentar la densidad de SNP en esta región particular.

Son bien conocidos en la materia los métodos para identificar SNP adicionales y llevar a cabo el análisis de desequilibrio de unión. Por ejemplo, la identificación de SNP adicionales en desequilibrio de unión con los SNP descritos en el presente documento puede implicar las etapas de: (a) amplificar un fragmento de la región genómica que comprende o rodea un primer SNP de una pluralidad de individuos; (b) identificar los SNP secundarios en la región genómica que hospeda o rodea el primer SNP; (c) llevar a cabo un análisis de desequilibrio de unión entre el primer SNP y los SNP secundarios; y (d) seleccionar los SNP secundarios que están en desequilibrio de unión con el primer marcador.

Métodos de diagnóstico adicionales para su uso en combinación La detección de los marcadores genéticos descritos se puede usar junto con una o más soluciones diagnósticas adicionales para identificar sujetos que tienen EA o que tienen un riesgo mayor de desarrollar EA. Por ejemplo, los sujetos se pueden seleccionar para los marcadores genéticos adicionales además de los marcadores genéticos descritos en el presente documento. Se puede analizar el liquido cefalorraquídeo de sujetos para determinar si tienen niveles aumentados de amíloide beta o proteína tau que son característicos de la EA. Se pueden someter también los sujetos a una exploración del estado mental, tal como el Miniexamen del Estado Mental (MMSE, por sus siglas en inglés) para evaluar la memoria, concentración, y otras capacidades cognitivas. Los sujetos también se pueden someter a procedimientos de diagnóstico por imagen, tales como una exploración por TC, una IRM, una exploración SPECT o una exploración PET para identificar cambios en la estructura o el tamaño del cerebro indicativos de la enfermedad de Alzheimer.

Diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la enfermedad de Alzheimer La invención proporciona métodos para el diagnóstico o el pronóstico de la EA en un sujeto mediante la detección de la presencia, en una muestra del sujeto, de una o más variaciones genéticas asociadas con la EA tal como se describe en el presente documento. En las modalidades de la invención, la una o más variaciones genéticas están en un gen seleccionado a partir de los genes que codifican el receptor de la interleuquina-6 (IL6R), factor 4 neurotrófico (NTF4) y UNC5C, y cualquiera de los genes relacionados en la Tabla 3. En algunas modalidades, la variación genética está en el ADN genómico que codifica un gen (o su región reguladora) donde el gen se selecciona entre los genes que codifican el receptor de la interleuquina-6 (IL6R), factor 4 neurotrófico (NTF4) y UNC5C, y cualquiera de los genes relacionados en la Tabla 3. En varias modalidades, la variación genética es un SNP, un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción en uno o más genes seleccionados entre los genes que codifican el receptor de la interleuquina-6 (IL6R), factor 4 neurotrófico (NTF4) y UNC5C, y cualquiera de los genes relacionados en la Tabla 3. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). En una modalidad, la variación genética es un alelo 'C en rs2228145. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2). En una modalidad, la variación genética es un alelo ??' en rsl21918427. En una modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835 en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3). En modalidades, la variación genética es un SNP en un gen seleccionado entre los que se relacionan en la Tabla 3. En las modalidades, la variación genética es un SNP seleccionado entre rsl2733578, rs4658945, rsl478161, rsl024591, rs7799010, rsl0969475, y rsl2961250. Una cualquiera o más de estas variaciones genéticas se pueden usar en cualquiera de los métodos de detección, diagnóstico y pronóstico descritos a continuación.

En una modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de una variación genética indicativa de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo que puede detectar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C; y (b) determinar la presencia o ausencia de la variación genética, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

El reactivo para su uso en el método puede ser un oligonucleótido, una sonda de ADN, una sonda de ARN, y una ribozima. En algunas modalidades, el reactivo está marcado. Las marcas pueden incluir, por ejemplo, marcas de radioisótopos, marcas fluorescentes, marcas bioluminiscentes o marcas enzimáticas. Los radionucleidos que pueden servir como marcas detectables incluyen, por ejemplo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, y Pd-109.

Se proporciona también un método para detectar una variación genética indicativa de enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende: determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C en una muestra biológica de un sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA. En varias modalidades del método, la detección de la presencia de una o más variaciones genéticas se lleva a cabo mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo que consiste en la secuenciación directa, hibridación de la sonda especifica de alelo, extensión del cebador especifica de alelo, amplificación especifica de alelo, incorporación de nucleótidos especifica de alelo, digestión con nucleasa 5', ensayo de baliza molecular, ensayo de ligadura de oligonucleótidos , análisis de tamaño, y polimorfismo de conformación monocatenario . En algunas modalidades, los ácidos nucleicos procedentes de la muestra se amplifican antes de determinar la presencia de la una o más variaciones genéticas.

La invención proporciona además un método para diagnosticar o pronosticar la EA en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo que puede detectar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C; y (b) determinar la presencia o ausencia de la variación genética, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

La invención proporciona además un método de diagnóstico o pronóstico de la EA en un sujeto, que comprende: determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C en una muestra biológica de un sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

La invención proporciona además un método para diagnosticar o pronosticar la EA en un sujeto, que comprende: (a) obtener una muestra que contiene ácido nucleico a partir del sujeto, y (b) analizar la muestra para detectar la presencia de al menos una variación genética en un gen seleccionado a partir de los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

En algunas modalidades, el método de diagnóstico o pronóstico comprende además someter al sujeto a uno o más ensayos diagnósticos adicionales para determinar la EA, por ejemplo, seleccionar uno o más marcadores genéticos adicionales, realizar una exploración del estado mental, o someter al sujeto a procedimientos de diagnóstico por imagen. En algunas modalidades, El método comprende además analizar la muestra para detectar la presencia de al menos un marcador genético adicional que es un modificador de APOE, donde el al menos un marcador genético adicional está en un gen seleccionado entre el gen que codifica IL6R, el gen que codifica NTF4, el gen que codifica UNC5C, y un gen relacionado en la Tabla 3.

Se contempla además que cualquiera de los anteriores métodos puede comprender además tratar al sujeto de su EA basándose en los resultados del método. En algunas modalidades, los anteriores métodos comprenden además detectar en la muestra la presencia de al menos un alelo ??0?-e4. En una modalidad, la presencia del al menos una variación genética junto con la presencia de al menos un alelo ??0?-e4 es indicativa de un riesgo aumentado de edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que tiene al menos un alelo ????-e4 y que carece de la presencia del al menos un marcador genético.

Se proporciona también un método para identificar un sujeto que tiene un riesgo mayor de edad precoz de diagnóstico de la EA, que comprende: (a) determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C en una muestra biológica de un sujeto; y (b) determinar la presencia o ausencia de al menos un alelo ??0?-e4, donde la presencia de la variación genética y de al menos un alelo ??0?-e4 indica que el sujeto tiene un riesgo mayor de una edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que carece de la presencia de variación genética y de al menos un alelo ??0?-e4.

También se proporciona un método para ayudar en el pronóstico de un subfenotipo de la EA en un sujeto, comprendiendo el método detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de una variante genética en un gen que codifica IL6R, NTF4 o UNC5C. En una modalidad, la variante genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N° : 1 ) , y el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por niveles aumentados de la IL6R soluble en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control. En otra modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206 en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), y el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por la activación disminuida de TrkB en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control. En otra modalidad, la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), y el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por un aumento en la actividad apoptótica de UNC5C en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control.

La invención proporciona además un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico contra la EA que se dirige a IL6R, que comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), donde la presencia del SNP es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a IL6R. En una modalidad, el agente terapéutico es un antagonista o un agente de unión a IL6R, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra IL6R.

La invención proporciona además un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico contra la EA que se dirige a TrkB, que comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), donde la presencia del SNP es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a TrkB. En una modalidad, el agente terapéutico es un agonista de TrkB, por ejemplo, un anticuerpo agonista de TrkB.

Se puede obtener una muestra biológica para su uso en cualquiera de los métodos descritos anteriormente utilizando determinados métodos conocidos por los expertos en la materia. Se pueden obtener muestras biológicas de animales vertebrados, y en particular, de mamíferos. En determinadas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como líquido cefalorraquídeo, células neurales, o tejido cerebral. Se pueden detectar variaciones en los ácidos nucleicos diana (o en los polipéptidos codificados) a partir de una muestra de tejido o de otras muestras corporales tales como líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, orina, esputo, saliva, raspado de la mucosa, secreción lacrimal, o sudor. Seleccionado las muestras corporales, se puede conseguir un diagnóstico precoz sencillo para enfermedades tales como la EA. Además, se puede vigilar la evolución del tratamiento más fácilmente realizando ensayos sobre las muestras corporales para determinar variaciones en los ácidos nucleicos diana (o en los polipéptidos codificados). En algunas modalidades, la muestra biológica se obtiene de un individuo sospechoso de tener EA.

Con posterioridad a la determinación de que un sujeto, o muestra biológica obtenida del sujeto, comprende una variación genética descrita en el presente documento, se contempla que una cantidad eficaz de un agente terapéutico contra la EA adecuado se pueda administrar al sujeto para tratar la EA en el sujeto.

Se proporcionan también métodos para ayudar en el diagnóstico de la EA en un mamífero detectando la presencia de una o más variaciones en el ácido nucleico que comprende una variación genética en uno cualquiera o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3, de acuerdo con el método descrito anteriormente.

En otra modalidad, se proporciona un método para predecir si un sujeto con EA responderá a un agente terapéutico determinando si el sujeto comprende una variación en uno o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3, de acuerdo con el método descrito anteriormente.

Se proporcionan también métodos para evaluar la predisposición de un sujeto a desarrollar EA detectando la presencia o ausencia en el sujeto de una variación en uno o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3.

Se proporcionan también métodos para subclasificar la EA en un mamífero, comprendiendo el método detectar la presencia de una variación genética en uno cualquiera o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3.

Se proporcionan también métodos para identificar un agente terapéutico eficaz para tratar la EA en una subpoblación de pacientes, comprendiendo el método correlacionar la eficacia del agente con la presencia de una variación genética en una posición de nucleótido que corresponde a un SNP en uno cualquiera o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3.

Los métodos adicionales proporcionan información útil para determinar las etapas de intervención clínica adecuadas, según sea adecuado. Por lo tanto, en una modalidad de un método de la invención, el método comprende además una etapa de intervención clínica basada en los resultados de la evaluación de la presencia o ausencia de una variación en un gen asociado con la EA tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una intervención adecuada puede implicar etapas profilácticas y de tratamiento, o ajuste (s) de cualquiera de las etapas profilácticas o de tratamiento vigentes basándose en la información genética obtenida por un método de la invención .

Como será evidente para un experto en la materia, en cualquier método descrito en el presente documento, aunque la detección de la presencia de una variación indicara positivamente una característica de una enfermedad (por ejemplo, la presencia o el subtipo de una enfermedad), la no detección de una variación seria también informativa ya que proporcionaría la caracterización inversa de la enfermedad.

Otros métodos adicionales incluyen métodos para tratar la EA en un mamífero, que comprenden las etapas de obtener una muestra biológica del mamífero, examinar la muestra biológica para determinar la presencia o ausencia de una variación, tal como se describe en el presente documento, y tras determinar la presencia o la ausencia de la variación en la muestra de tejido o de célula, administrar una cantidad eficaz de un agente terapéutico adecuado a el mamífero. De manera opcional, los métodos comprenden administrar una cantidad eficaz de un agente terapéutico dirigido contra la EA al mamífero.

También se proporcionan métodos para tratar la EA en un sujeto en quien se sabe que está presente una variación genética en una posición de nucleótido que corresponde a un SNP en uno cualquiera o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3, comprendiendo el método administrar al sujeto un agente terapéutico eficaz para tratar la dolencia.

También se proporcionan métodos para tratar un sujeto que tiene EA, comprendiendo el método administrar al sujeto un agente terapéutico que se sabe que es eficaz para tratar la dolencia en un sujeto que tiene una variación genética en una posición de nucleótido que corresponde a un SNP en uno cualquiera o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3.

También se proporcionan métodos para tratar un sujeto que tiene EA, comprendiendo el método administrar al sujeto un agente terapéutico que se ha mostrado anteriormente que es eficaz para tratar la dolencia en al menos un estudio clínico donde el agente se ha administrado a al menos cinco sujetos humanos que tiene cada uno de ellos una variación genética en una posición de nucleótido que corresponde a un SNP en uno cualquiera o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3. En una modalidad, los al menos cinco sujetos tuvieron dos o más SNP diferentes en total para el grupo de al menos cinco sujetos. En una modalidad, los al menos cinco sujetos tuvieron el mismo SNP para el grupo completo de al menos cinco sujetos.

También se proporcionan métodos para tratar un sujeto con EA que pertenece a una subpoblación específica de EA que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente terapéutico que está homologado como agente terapéutico para la subpoblación, donde la subpoblación se caracteriza al menos en parte por su asociación con una variación genética en una posición de nucleótido que corresponde a un SNP en uno cualquiera o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3.

En una modalidad, la subpoblación es de antecesores europeos. En una modalidad, la invención proporciona un método que comprende fabricar un agente terapéutico contra la EA, y envasar el agente junto con instrucciones para administrar el agente a un sujeto que tiene o se cree que tiene EA y que tiene una variación genética en una posición que corresponde a un SNP en uno cualquiera o más de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3.

También se proporcionan métodos para seleccionar a un paciente que padece EA para su tratamiento con un agente terapéutico contra la EA que comprenden detectar la presencia de una variación genética en una posición de nucleótido que corresponde a un SNP en uno cualquiera de los genes que codifican IL6R, NTF4, o UNC5C tal como se describe en el presente documento, o un gen relacionado en la Tabla 3.

Se puede incorporar un agente terapéutico para el tratamiento de la EA a las composiciones, que en algunas modalidades son adecuadas para el uso farmacéutico. Las composiciones comprenden normalmente el péptido o polipéptido, y un portador aceptable, por ejemplo, uno que sea farmacéuticamente aceptable. Un portador "farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica (Gennaro, Remington: The science and practice of pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa . (2000)). Los ejemplos de los portadores o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, disolución salina, soluciones de Finger, disolución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%, Se pueden utilizar también liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos, excepto cuando un medio o agente convencional es incompatible con un compuesto activo, se contempla el uso de estas composiciones. Se pueden incorporar también compuestos activos suplementarios en las composiciones .

Se puede administrar un agente terapéutico de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional para el tratamiento de la EA) mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar, intratecal e intranasal y, si se desea para un tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen, por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es a corto plazo o crónica. Se contemplan en el presente documento diferentes pautas de administración incluyendo pero sin limitación administraciones únicas o múltiples en diferentes puntos temporales, administración en bolo e infusión en pulsos.

Determinadas modalidades de la invención proporcionan que el agente terapéutico contra la EA atraviese la barrera hematoencefálica . Existen varias soluciones conocidas en la técnica para trasportar moléculas a través de la barrera hematoencefálica, incluyendo, pero sin limitación, métodos físicos, métodos basados en lípidos, y métodos basados en receptores y canales.

Los métodos físicos para trasportar el agente terapéutico contra la EA a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, rodear completamente la barrera hematoencefálica, o creando aperturas en la barrera hematoencefálica . Los métodos de rodeo incluyen, pero no se limitan a, inyección directa en el cerebro {véase por ejemplo, Papanastassiou y col., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) e implantar un dispositivo de administración en el cerebro {véase, por ejemplo., Gilí y col., Na ture Med. 9: 589-595 (2003)). y Gliadel Wafers™, Guildford Pharraaceutical) . Los métodos para crear aperturas en la barrera incluyen, pero no se limitan a, ultrasonidos (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense con número 2002/0038086), presión osmótica (por ejemplo, mediante la administración de manitol hipertónico Neuwelt, E. A. , Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vol. 1 y 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), permeabilización mediante por ejemplo, bradiquidina o permeabilizante A-7 (véase, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206, y 5.686.416), y la transfeccion de neuronas que se ubican a ambos lados de la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican el anticuerpo o uno de sus fragmentos (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense con número 2003/0083299) .

Los métodos basados en lípidos para trasportar el agente terapéutico contra la EA a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, encapsular el agente terapéutico contra la EA en liposomas acoplados con fragmentos de unión a anticuerpo que se unen a receptores del endotelio vascular de la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 20020025313), y el revestimiento del agente terapéutico contra la EA en partículas de lipoproteína de baja densidad (véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 20040204354) o la apolipoproteina E {véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud estadounidense con número 20040131692) .

Los métodos basados en receptores para trasportar el agente terapéutico contra la EA a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, la conjugación del agente terapéutico contra la EA con ligandos que reconocen los receptores expresados en la barrera hematoencefálica, dando como resultado su transporte a través de la barrera hematoencefálica tras la transcitosis mediada por receptor (Gabathuler (2010) Neurobiology of Disease 37; 48-57) . Estos ligandos incluyen, pero no se limitan a ligandos para los receptores endoteliales capilares del cerebro tales como un anticuerpo monoclonal para el receptor de la transferrina o para el receptor de la insulina, histonas, biotina, folato, niacina, ácido pantoténico, o glicopéptidos .

Las dosificaciones y calendarios eficaces para administrar los agentes terapéuticos contra la EA se pueden determinar empíricamente, y llevar a cabo las determinaciones está comprendido en los conocimientos del experto en la materia. Se pueden emplear dosis únicas o múltiples. Cuando se emplea la administración in vivo de un agente terapéutico contra la EA, las cantidades de dosificación normales pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal de mamífero o más por día, preferentemente aproximadamente de 1 ug/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. Se proporcionan en la bibliografía directrices para las dosificaciones y métodos concretos; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos números 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212.

Se contempla que se pueden emplear más tratamientos adicionales en los métodos. Los uno o más tratamientos adicionales pueden incluir, pero no se limitan a, la administración de un agente terapéutico contra la EA adicional, tal como un inhibidor de la colinesterasa, memantina, una medicación antiespasmódica, un antidepresivo, un ansiolítico, o un compuesto que se dirige a una proteína precursora del amiloide, amiloide beta, placas de amiloide, o cualquiera de las enzimas que escinden la proteína precursora del amiloide que incluye, pero no se limita a alfa-secretasa, beta-secretasa, y gamma-secretasa, y similares.

Kits Para uso en las aplicaciones descritas o sugeridas en el presente documento, se proporcionan también kits o artículos de fabricación. Los kits pueden comprender un medio portador que está compartimentado para alojar en estrecho confinamiento uno o más medios contenedores tales como viales, tubos, y similares, cada uno de los medios contenedores comprende uno de los elementos separados que se va a usar en el método. Por ejemplo, uno de los medios contenedores puede comprender una sonda que está o puede estar marcada de manera detectable. La sonda puede ser un polinucleótido específico de un polinucleótido que comprende una variante genética asociada con la EA tal como se describe en el presente documento. Cuando el kit utiliza la hibridación del ácido nucleico para amplificar la secuencia del ácido nucleico diana y/o un envase que comprende un medio indicador, el kit puede incluir también envases que contienen nucleótido (s) para amplificar la secuencia del ácido nucleico diana y/o un envase que comprende un medio indicador, tal como una proteína de unión a avidina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula indicadora, tal como una marca enzimática, fuorescente, o de radioisótopos .

En otras modalidades, el kit puede comprender un agente marcado capaz de detectar un polipéptido que comprende una variante genética asociada con la EA tal como se describe en el presente documento. El agente puede ser un anticuerpo que se une al polipéptido. El agente puede ser un péptido que se une al polipéptido. El kit puede comprender, por ejemplo, un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido que comprende una variante genética tal como se describe en el presente documento; y, de manera opcional, un segundo anticuerpo diferente que se une a cualquiera del polipéptido o el primer anticuerpo y se conjuga con una marca detectable.

Los kits comprenderán normalmente el envase descrito anteriormente y uno o más envases diferentes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones para el uso. En el envase se puede incluir una marca para indicar que la composición se usa para un tratamiento especifico o para una aplicación no terapéutica, y puede indicar también instrucciones para su uso tanto in vivo como in vitro, tales como las descritas anteriormente. Otros componente opcionales del kit incluyen uno o más amortiguadore (por ejemplo, amortiguador de bloqueo, amortiguador de lavado, amortiguador de sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que se altera químicamente por una marca enzimática, disolución de recuperación de epítopos, muestras del control (controles positivos y/o negativos), porta (s) control etc.

Métodos de comercialización La invención del presente documento abarca también un método para comercializar los métodos de diagnóstico o pronóstico de la EA descritos que comprenden publicitar, instruir, y/o especificar a una audiencia objetivo, el uso de los métodos descritos.

El marketing es generalmente la comunicación pagada a través de un medio no personal donde el patrocinador está identificado y el mensaje está controlado. El marketing, para los fines del presente documento, incluye publicidad, relaciones públicas, colocación del producto, mecenazgo, suscripción, y similares. Este término incluye también noticias públicas informativas patrocinadas que aparecen en cualquier medio de comunicación impreso.

El marketing del método diagnóstico del presente documento se puede llevar a cabo por cualquier medio. Los ejemplos de medios de marketing usados para suministrar estos mensajes incluyen televisión, radio, películas, revistas, periódicos, internet, vallas publicitarias, incluyendo anuncios comerciales, que son mensajes que aparecen en los medios de comunicación.

El tipo de marketing utilizado dependerá de muchos factores, por ejemplo, de la naturaleza de la audiencia objetivo que se va a alcanzar, por ejemplo, hospitales, compañías de seguros, especialistas, médicos, enfermeras, y pacientes, así como consideraciones de costes y las leyes jurisdiccionales relevantes y las normas que gobiernan el marketing de los medicamentos y los diagnósticos. Se puede individualizar o personalizar el marketing según las caracterizaciones del usuario definidas por la interacción del servicio y/u otros datos tales como la localización demográfica y geográfica del usuario.

Se indican a continuación ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden llevar a la práctica otras muchas modalidades, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: SELECCIÓN DEL MODIFICADOR DE APOE Se diseñó un estudio para identificar variantes que modifican el efecto de APOE sobre el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA) . En la Fig. 1 se ilustra el diseño del estudio. Se aisló el ADN de sujetos de 65 años de edad y que tenían EA, por lo tanto supuestamente enriquecido en alelos de riesgo (los "casos"), que se comparó con el ADN aislado de sujetos de 75 u 80 años de edad sin EA y con cognición normal según pruebas neurológicas , por lo tanto supuestamente enriquecido en alelos protectores (los "supercontroles"). Todos los sujetos eran bien homocigóticos (E4/E4) o bien heterocigóticos (E3/E4) para el alelo APOE E4, residentes en Estados Unidos de descendientes europeos, y se obtuvieron del National Cell Repository of Alzheimer' s Disease (NCRAD) . Tal como se muestra en la Tabla 1, los casos de la Cohorte 1 incluyeron un total de 31 casos de homocigóticos E4/E4 y 50 casos de E3/E4 con enfermedad de Alzheimer con una edad de inicio de demencia <65 y >55 años de edad. Para aproximadamente un tercio de los casos se confirmó un diagnóstico de EA mediante la autopsia. Los supercontroles de la Cohorte 1 incluyeron 19 casos de heterocigóticos E3/E4 de 80 años de edad y 50 casos de homocigóticos E4/E4 de más de 75 años de edad. Todos los controles tuvieron una escala en la clasificación de demencia clínica (CDR) igual a 0, no indicando evidencia de deterioro cognitivo en la última visita. Se confirmó el alelo APOE de las muestras mediante la secuenciación del genoma completo (para los heterocigóticos ) o mediante la secuenciación del exorna (para los homocigóticos ) .

Tabla 1 *Se han usado en este estudio muestras procedentes del National Cell Repository for Alzheimer's Disease (NCRAD) , que recibe financiación del gobierno con una beca del acuerdo de cooperación (U24 AG21886) otorgada por el National Institute on Aging (NIA) . Los inventores dan las gracias a los contribuyentes, incluyendo los centros para la Enfermedad de Alzheimer que recogieron las muestras utilizadas en este estudio, así como los pacientes y sus familias, cuya ayuda y participación ha hecho posibles este trabajo.

Modificadores comunes del riesgo de APOE Se llevó a cabo un análisis de asociación de genoma completo en la Cohorte 1 para identificar variantes comunes que modifican el riesgo de APOE. Los sujetos de la Cohorte 1 se genotiparon usando la matriz de SNP IIlumina 1 M. Se llevó a cabo el control de calidad para los datos de genotipación tal como se describe en Gateva y col. (2009) Nat . Genet. 2009 Nov; 41 (11) : 1228-1233. Se usó la Cohorte 1 (Tabla 1) para la fase de descubrimiento. Las variantes comunes en la región IL6R/SHE/TDR10 en el cromosoma 1 humano mostraron asociación significativa en 81 casos E4 + frente a 68 controles E4+ de la cohorte 1 (Fig. 2) .

Se obtuvo un conjunto de datos de replicación de la base de datos de genotipos y Fenotipos (dbGAP) disponible en el sitio web de la National Center for Biotechnology Information (NCBI) para el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento -Estudio familiar sobre el inicio tardío de la enfermedad de Alzheimer: Genome-Wide Association Study for Susceptibility Loci [Estudio de Asociación de genoma completo para los loci de Susceptibilidad] (ID del estudio dbGAP: phs000168.vl.pl). El estudio NIA/LOAD consistió en 932 casos de EA y 836 controles de antecesores europeos-americanos genotipados para la matriz de SNP Illumina 610K. Se seleccionaron doscientos casos de heterocigóticos y homocigóticos E4 con una edad de diagnóstico <65 y 144 controles heterocigóticos y homocigóticos E4 con una edad en la última visita >= 75 años.

Tal como se muestra en la Tabla 2, se confirmó que un SNP (rs2228154) en el gen que codificaba IL6R esta significativamente asociado con la EA en ambas cohortes de descubrimiento y replicación. La variante de SNP rs2228145 que tenía un C en el sitio polimórfico (el "alelo C") , se encuentra preferentemente en los casos de EA en comparación con los controles. Este alelo comprende la sustitución del aminoácido D358A en IL6R.

Tabla 2 Descubrimiento : 81 casos de sujetos < 65 años de edad ALZ E4+ comparados con 68 sujetos del control > 80 años de edad E4+ alelo C: 47% en los casos, 31% en los controles Replicación: 200 casos de sujetos < 65 años de edad ALZ E4+ comparados con 144 sujetos del control > 75 años de edad E4+ alelo C: 46% en los casos, 33% en los controles El metavalor P era 4,7 x 10-5.

La distribución del alelo variante A358 de IL6R se examinó adicionalmente en 932 casos de EA no seleccionados y en 836 controles procedentes del estudio NIA/LOAD. La evaluación clínica y la genotipación de los polimorfismos de APOE en los sujetos NIA/LOAD se ha descrito en Lee y col., (2008) Arch Neurol. 65: 1518-1526. La Figura 3 muestra la frecuencia del alelo T de rs4129267, un alelo relacionado con el alelo C de rs2228145, en los casos de EA sin seleccionar y en los controles del estudio NIA/LOAD, que se estratificaron por edad del inicio en los casos de la EA y por edad en los controles. El alelo variante A358 estuvo presente con más frecuencia en los casos de inicio más precoz en comparación con los controles, pero con menos frecuencia en los casos de inicio más tardío en comparación con los controles, los que es consistente con una variante de modificación de la enfermedad.

El receptor de la interleuquina-6 ( IL6R) es el receptor de la citoquina interleuquina 6 (IL-6), una potente citoquina pleiotrópica que regula el crecimiento y la diferenciación celular y tiene un papel importante papel en la respuesta inmune. IL6R A358 es un alelo variante común asociado con niveles de IL6R séricos aumentados (Galicia y col. (2004) Genes & Im unity 5:513; Marinou y col. (2010) Ann. Rheum. Dis . 69: 1191) . El alelo variante A358 se ha asociado con niveles de CRP en circulación disminuidos y un riesgo disminuido de arteriopatía coronarias (Elliott y col. (2009) JAMA 302: 37-48), así como un riesgo aumentado de asma (Ferreira y col. (2011) Lancet 378: 1006-1014).

Para examinar si la expresión del ARNm de IL6R está elevada en la EA y/o se ve afectada por el genotipo en posición 358, se analizaron los datos procedentes del proyecto TGEN (Webster y col. (2009) Am. J. Hum. Genet . 84: 445-458) para comparar los niveles de expresión de IL6R tanto unido a membrana como soluble en los cerebros de los sujetos con EA en comparación con los controles. Mediante el uso de una sonda que detecta solo la forma unida a membrana de IL6R (NM_000565 ) , no se observó enriquecimiento en la ?? o por genotipo en la posición 358. Sin embargo, mediante el uso de una sonda que captura el ARNm tanto unido a membrana unida como de sIL6R (NM_181359) , se observó un enriquecimiento significativo en los casos de EA en comparación con los controles en la región temporal del cerebro y en el genotipo en la posición 358 (Fig. 4).

Además, de la región de IL6R, las regiones relacionadas en la Tabla 3 mostraron asociación significativa en la Cohorte 1 y en el conjunto de datos NIA/LOAD, lo que sugiere que estos loci pueden ser modificadores comunes adicionales del riesgo de APOE.

Tabla 3 Regiones asociadas con el riesgo de APOE en la Cohorte 1 y el estudio NIA/LOAD Variantes raras en la selección del modificador de APOE Neurotrofina 4 (NTF4 ) Además de las variantes comunes descritas anteriormente, la selección del modificador de APOE dio como resultado la identificación de las variantes raras asociadas con la EA. Estas variantes raras, que tienen menos de un 2% de frecuencia del alelo en la población global, incluyeron la variante R206W de NTF4. La variante R206W de NTF4 se encontró en 2 de 78 (2,6%) de casos de EA y en 0 de 67 (0,0%) de los supercontroles . Además, la variante R206 no se observó en 1300 europeos-americanos secuenciados por el exorna (P = 1,87 x 10~9) que no tenían EA en el momento de la recogida de muestras, usando los datos obtenidos del servidor de la variante del exorna del Proyecto NHLBI de Secuenciación del Exorna (ESP) .

La variante R206W de NTF4 es el resultado de una sustitución de C a T en el sitio del SNP rsl21918427 en el cromosoma 19. La neurotrofina 4 es un miembro de una familia de factores neurotróficos, las neurotrofinas (NT) , que controlan la supervivencia y la diferenciación de las neuronas de mamíferos. Las neurotrofinas son responsables del mantenimiento, proliferación y diferenciación de subconjuntos de neuronas que soportan receptores específicos de la tirosina quinasa, los Trk. la activación de Trk por los NT promueve la supervivencia neuronal mediante la denegación de la muerte celular programada (Robinson y col. (1999) Protein Sci. 8: 2589-2597). NTF4 promueve la supervivencia de las neuronas periféricas y simpáticas, y activa Trk y TrkB (Berkemeier y col. (1991) Neuron 7: 857-866).

Se había notificado anteriormente que la variante R206W de NTF4 está representada en exceso en sujetos con glaucoma en comparación con los controles. ( (Passuto y col. (2009) Am. J. Hum. Genet. 85: 447-456); Liu y col. (2010) Am. J. Hum. Genet . 86: 498-499). El resto alterado está muy conservado entre ortólogos en chimpancé, perros, ratones y ratas, y está localizado en el sitio de unión de TrkB. La proteína variante tiene una capacidad reducida para activar TrkB, y demuestra una función alterada en la extensión de neuritas. Se predijo por tanto que la proteína variante tenía un efecto sobre la supervivencia neuronal. (Passuto y col., más arriba).

Esta asociación recientemente identificada de esta función alterada de la variante de R206W de NTF4 con los portadores de AP0E4 en la EA de inicio precoz sugiere que la activación de la ruta NTF4 puede ser protectora contra el desarrollo de la EA y que los agonistas del receptor TrkB pueden ser agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de la EA.

EJEMPLO 2: SELECCIÓN BASADA EN FAMILIA El árbol genealógico LOl se obtuvo mediante la colaboración con Alison Goate (Universidad de Washington) . El árbol genealógico LOl mostró un modelo que sugería una herencia dominante de la EA. El probando fue uno de cinco hermanos, dos de los cuales tenían también EA, mientras que el estado de EA de otro hermano estaba por determinar. La madre del probando tuvo EA, y el padre no. Un hermanastro del probando, el hijo del padre del probando con otra esposa, no tenía EA. De los hijos del probando y los hermanos, cuatro tenían EA. La edad del inicio de la EA en los miembros de la familia variaba desde 58 a 87. Se llevó a cabo el análisis de la unión no paramétrica usando los datos del genotipo utilizando la Matriz de Unión Illumina obtenida a partir de 16 miembros del árbol genealógico LOl. Se analizó la unión de NPL utilizando el software MERLIN usando un conjunto de datos QCed. En la Fig. 5 se muestran los resultados del análisis de unión no paramétrica en el árbol genealógico LOl, y se observaron 3 regiones con una puntuación en el límite de determinación analítica de NPL > 1,5. Para identificar los potenciales alelos causantes comprendidos en los 3 intervalos de unión, se llevó a cabo la secuenciacion del exorna para el probando (tecnología de lectura única de Illumina) , y se restringió el análisis a los picos de unión de NPL que tienen una puntuación LOD mayor de 1,5. Las 4.153 variantes resultantes se clasificaron por novedad (definida como la presencia en dbSNP o los datos del proyecto genoma 1000), la función heterocigotica y presunta. Se determinó el genotipo de otro caso de EA, una sobrina del probando, usando la secuenciacion del genoma completo (CGI) , y se determinó la presencia o ausencia de las cinco variantes principales. Se identificó una única variante en este proceso, que se localizó en el cromosoma 4. Se determinó la presencia o ausencia de esta variante en los 19 miembros del árbol genealógico LOl, incluyendo el probando, la madre del probando, tres hermanos, y el hijo del probando y todos los hermanos. De los once portadores, ocho tenían EA, mientras que el estado de enfermedad de otro era desconocido. Los dos portadores restantes no tenían EA, pero tenían menos de 75 años de edad. Ninguno de los ocho miembros de la familia que carecían de la variante tenían EA.

Se encontró que la variante era una sustitución G por A en el cromosoma 4, dando como resultado la sustitución del aminoácido T835M en el gen que codificaba UNC5C. UNC5C es un miembro de la familia UNC5 de los receptores de netrina, y es un receptor de la netrina 1. UNC5C se expresa intensamente en las neuronas del hipocampo. UNC5A, B y C median el efecto quimiorrepulsivo de la netrina 1 en los axones específicos. Estos receptores son también receptores de dependencia que inducen la apoptosis cuando no están unidos a su ligando netrina 1. La actividad proapoptótica de estos receptores depende de la escisión de los receptores por la caspasa y la presencia de un dominio de muerte conservado en el extremo C del dominio intracelular .

Se usó el programa SIFT (Ng y Henikoff (2003) Nucleic Acids Res. 31: 3812-3814) para predecir si se esperaba que esta sustitución de aminoácido afectara a la función de la proteína. Una puntuación SIFT de menos de 0,05 es indicativa de una sustitución perjudicial. La puntuación SIFT de la variante T835M fue 0,01, indicando que esta variante tenía una elevada probabilidad de ser perjudicial. Una alineación con otros miembros de la familia UNC5 (Fig. 6) muestra que esta variante está presente en un motivo conservado. Basándose en la estructura de las proteínas UNC5, esta variante está en una región bisagra entre el dominio de muerte y el dominio ZU5, una región que interactúa con los reguladores corriente abajo de la apoptosis (Williams y col. (2003) J. Virol. Chem. 278: 17483-17490) . Dada la función de UNC5C como receptor de la netrina y su elevada expresión en las neuronas del hipocampo, la variante T835M puede afectar la señalización de UNC5C de tal manera que el dominio de muerte de UNC5C se encuentra preferentemente en un estado activado abierto, dando como resultado una señalización proapoptót ica aumentada y la muerte de células neuronales. Esta asociación identificada recientemente de la variante T835M de UNC5C con EA sugiere que bloquear la señalización apoptótica anómala de esta variante de UNC5C puede ser una solución terapéutica potencial para el tratamiento de la EA .

Los datos procedentes de la selección del modificador de APOE descritos en el Ejemplo 1 se evaluaron para la presencia de la variante T385M de UNC5C. La variante T835M de UNC5C se observó en 2/78 casos de EA y 1/67 controles. La genotipación de >6.000 controles adicionales estableció una frecuencia en la población de alelos de T825M en poblaciones europeas-americanas que era de 0,00071 (9/6315 individuos heterocigóticos para T835M) (Tabla 4), y una frecuencia de casos de EA de 0,013 ( P= l , 5x10"7 ) . Estos datos sugieren que T835M es una variante rara que aumenta el riesgo de EA .

Tabla 4 EJEMPLO 3: ASOCIACIÓN DE A358 CON NIVELES AUMENTADOS DE IL6R SOLUBLE Se llevaron a cabo ensayos para determinar la asociación entre los niveles de IL6R soluble (sIL6R) en liquido cefalorraquídeo (CSF) y los genotipos en los SNP en la región génica de IL6R en los datos de 291 muestras procedentes de la Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative [Iniciativa de Neuroimágenes de la Enfermedad de Alzheimer] (ADNI; einer, M.W y col., (2010) Alzheimer's & Dementia 6: 202-211). Se genotiparon los sujetos utilizando la matriz de SNP de genoma completo Human610Quad de Illumina, y se midió sIL6R utilizando un panel de inmunoensayo basado en la tecnología de inmunoensayo Luminex desarrollada por Rules Based Medicine (MyriadRBM) . En cada SNP se llevó a cabo una regresión lineal de log(sIL6R) en el genotipo de SNP codificado de una manera aditiva (0, 1, o 2 alelos mutantes), y se ensayó la hipótesis nula de que el tamaño del efecto del genotipo era cero. Las variantes del gen IL6R mostraron una asociación significativa con niveles aumentados de sIL6R en CSF (Fig. 7) , con el SNP rs4129267, un polimorfismo relacionado con rs2228145, que muestra la asociación más fuerte.

Tal como se ha descrito anteriormente, la variante de SNP rs2228145 da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en IL6R. Tal como se ha indicado en la Tabla 5, el genotipo de IL6R en la posición 358 se ha correlacionado con los niveles de IL6R soluble en CSF, asociándose la presencia del alelo variante A358 con niveles mayores de CSF SIL6R.

Tabla 5 Se examinó el efecto de la presencia de la variante A358 en IL6R sobre el esclarecimiento de IL6R in vitro e in vivo. Para los experimentos in vitro, Se transíectaron células 293T con construcciones de D358 o A358 de IL6R. 48 horas después de la transfección, se cambiaron los medios y se trataron las células con acetato miristato de forbol 100 nM (PMA) durante 0, 30, 60 y 120 minutos. Las células se recogieron tras el tratamiento y se tiñeron con un anticuerpo dirigido contra IL6R-PE (BD Pharmingen, (N° de Cat . 551850). Se analizó el IL6R unido a membrana mediante FACS. La Fig. 8 muestra la intensidad promedio de la fluorescencia en porcentaje (MFI) con respecto al punto temporal de 0 minutos en sucesivos puntos temporales tras el tratamiento con PMA. Estos datos demuestran que la variante de A358 conduce a un mayor esclarecimiento de IL6R en las células 293T debido a que la cantidad de IL6R unido a células detectada disminuyó notablemente en las muestras que contenían la variante A358 a diferencia de la detectada en las muestras que contienen D358 natural.

También se llevaron a cabo experimentos para determinar si la presencia del alelo variante de A358 en IL6R conduce también a un mayor esclarecimiento de IL6R en los linfocitos T primarios. Se genotiparon voluntarios humanos sanos para el SNP de IL6R rs2228145 mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el ensayo de genotipación de SNP TaqMan, ID del ensayo C_16170664_10 de Applied Biosystems. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) mediante gradiente de ficol a partir de una pareja de donantes homocigóticos (uno con cada genotipo AA y CC) que se emparejaron por edad, género y etnia. Se purificaron linfocitos T CD4+ a partir de PBMC mediante selección negativa usando el kit de enriquecimiento en linfocitos T CD4+ TEasySep (N° de catálogo 19052) de STE CELL Technologies tal como recomendaba el fabricante. A continuación, los linfocitos T CD4+ se cultivaron durante 72 horas en RPMI 1640 + FBS al 10% + 2-mercaptoetanol y se trataron con PMA 100 nM durante 60 min. Las células se recogieron pronto tras el tratamiento y se tiñeron con el anticuerpos dirigido contra IL6R-PE (BD Pharmingen, (N° de Cat. 551850). Se analizó el IL6R unido a membrana mediante FACS . La Fig. 9 muestra que la fracción unida a membrana de IL6R fue menor para los linfocitos T CD4+ que transportaban IL6R con la mutación A358 en oposición al IL6R de D358 natural tras la activación de PMA, indicando un esclarecimiento mayor en células A358.

En otro experimento se activaron los linfocitos T CD4+ mediante un anticuerpo dirigido contra hCD3 unido a placa (BD Pharmingen, N° de Cat. 555329, 10 mg/ml) y anticuerpo dirigido contra hCD28 (N° de Cat. BD 555725, 5 mg/ml) o un control isotópico (BD Pharmingen, N° de Cat 554721- 15 mg/ml) . A continuación las células se recogieron después de 24, 48 y 72 horas para la extracción del ARN total y se recogió el sobrenadante para determinar los niveles de sIL6R mediante ELISA utilizando el Kit ELISA alpha Quantikine de IL-6 R humano (R&D Systems, (N° de Cat . DR600). La Fig. 10 muestra las veces de aumento en el IL6R soluble para A358, con respecto a D358, en cada punto temporal. Aunque la cantidad de IL6R soluble siguió siendo aproximadamente constante en el tiempo para D358, aumentó cuatro veces para A358 durante el curso del experimento .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para detectar la presencia o ausencia de una variación genética indicativa de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo que puede detectar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos; y (b) determinar la presencia o ausencia de la variación genética, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP) , un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la variación genética es un SNP.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l).

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la variación genética es un alelo XC en rs2228145.

6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2).

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la variación genética es un alelo *?" en rsl21918427.

8. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la variación genética es un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N°:3).

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo se selecciona entre el grupo que consiste en un oligonucleótido, una sonda de ADN, una sonda de ARN, y una ribozima.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el reactivo está marcado.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la al menos una variación genética es una sustitución, inserción o deleción en una proteina seleccionada a partir de IL6R NTF4 y UNC5C .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la al menos una variación genética es una sustitución de aminoácido seleccionada de D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N° : 2 ) , y T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el reactivo es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que comprende la variación genética .

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra se selecciona entre una de líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, esputo, saliva, raspado de la mucosa, biopsia de tejido, secreción lacrimal, semen, o sudor.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además tratar el sujeto para la EA basándose en el resultado de la etapa (b) .

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además detectar en la muestra la presencia de al menos un alelo ????-e4.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la presencia del al menos una variación genética junto con la presencia de al menos un alelo ????-e4 es indicativa de un riesgo aumentado de edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que tiene al menos un alelo ????-e4 y que carece de la presencia del al menos un marcador genético.

19. Un método para detectar una variación genética indicativa de enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, caracterizado porque comprende: determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos, en una muestra biológica de un sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP) , un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la variación genética es un SNP.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l).

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la variación genética es un alelo 'C en rs2228145.

24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2).

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la variación genética es un alelo ??' en rsl21918427.

26. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la variación genética es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la variación genética es un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N°:3).

28. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la presencia de una o más variaciones genéticas se lleva a cabo mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo que consiste en la secuenciación directa, hibridación de la sonda especifica de alelo, extensión del cebador especifica de alelo, amplificación especifica de alelo, incorporación de nucleótidos especifica de alelo, digestión con nucleasa 5', ensayo de baliza molecular, ensayo de ligadura de oligonucleótidos , análisis de tamaño, y polimorfismo de conformación monocatenario .

29. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque los ácidos nucleicos procedentes de la muestra se amplifican antes de determinar la presencia de la una o más variaciones genéticas.

30. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la al menos una variación genética es una sustitución, inserción o deleción en una proteina seleccionada a partir de IL6R NTF4 y UNC5C .

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la al menos una variación genética es una sustitución de aminoácido seleccionada de D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), y T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

32. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la presencia de la una o más variaciones genéticas se lleva a cabo mediante un proceso seleccionado entre electroforesis, cromatografía, espectroscopia de masas, digestión proteolítica, secuenciación de proteínas, ensayo de inmunoafinidad, o una de sus combinaciones.

33. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque las proteínas procedentes de la muestra se purifican usando anticuerpos o péptidos que se unen a las proteínas antes de determinar la presencia de una o más variaciones genéticas.

34. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la muestra se selecciona entre una de líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, esputo, saliva, raspado de la mucosa, biopsia de tejido, secreción lacrimal, semen, o sudor.

35. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende además tratar el sujeto para la EA basándose en la presencia de la una o más variaciones genéticas .

36. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende además detectar en la muestra la presencia de al menos un alelo ????-e4.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la presencia del al menos una variación genética junto con la presencia de al menos un alelo ????-e4 es indicativa de un riesgo aumentado de edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que tiene al menos un alelo ??0?-e4 y que carece de la presencia del al menos un marcador genético.

38. Un método para diagnosticar o pronosticar la EA en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo que puede detectar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos; y (b) determinar la presencia o ausencia de la variación genética, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP), un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la variación genética es un SNP.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la variación genética se selecciona del grupo que consiste en un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), y un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N° : 3) .

42. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la variación genética se selecciona entre un alelo 'C en rs2228145, un alelo 'T' en rsl21918427, y un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N°:3).

43. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el reactivo se selecciona entre el grupo que consiste en un oligonucleótido, una sonda de ADN, una sonda de ARN, y una ribozima.

44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el reactivo está marcado.

45. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la al menos una variación genética es una sustitución, inserción o deleción en una proteina seleccionada a partir de IL6R NTF4 y UNC5C.

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la al menos una variación genética es una sustitución de aminoácido seleccionada de D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), R206 en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N° : 2 ) , y T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el reactivo es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que comprende la variación genética .

48. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la muestra se selecciona entre una de líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, esputo, saliva, raspado de la mucosa, biopsia de tejido, secreción lacrimal, semen, o sudor.

49. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende además tratar el sujeto para la EA basándose en el resultado de la etapa (b) .

50. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende además detectar en la muestra la presencia de al menos un alelo ????-e4.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la presencia del al menos una variación genética junto con la presencia de al menos un alelo ????-e4 es indicativa de un riesgo aumentado de edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que tiene al menos un alelo ????-e4 y que carece de la presencia del al menos un marcador genético.

52. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende además someter al sujeto a una o más pruebas diagnósticas adicionales para la EA seleccionadas entre el grupo que consiste en la selección de uno o más marcadores genéticos adicionales, realizar una exploración del estado mental, o someter al sujeto a procedimientos de diagnóstico por imagen.

53. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende además analizar la muestra para detectar la presencia de al menos un marcador genético adicional que es un modificador de APOE, donde el al menos un marcador genético adicional está en un gen seleccionado entre el gen que codifica IL6R, el gen que codifica NTF4, el gen que codifica UNC5C, y un gen relacionado en la Tabla 3.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el al menos un marcador genético adicional es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835W en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N° : 3 ) , o un SNP que se relaciona en la Tabla 3.

55. Un método para diagnosticar o pronosticar la EA en un sujeto, caracterizado porque comprende: determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos, en una muestra biológica de un sujeto, donde la presencia de la variación genética indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la al menos una variación genética es un polimorfismo de nucleótido único (SNP) , un alelo, un haplotipo, una inserción, o una deleción.

57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la variación genética es un SNP.

58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la variación genética se selecciona entre un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), y un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

59. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la variación genética se selecciona entre un alelo 'C en rs2228145, un alelo ??' en rsl21918427, y un SNP que sustituye G por A en el codón que codifica el aminoácido en la posición 835 de UNC5C (SEC ID N°:3).

60. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la presencia de una o más variaciones genéticas se lleva a cabo mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo que consiste en la secuenciación directa, hibridación de la sonda especifica de alelo, extensión del cebador especifica de alelo, amplificación especifica de alelo, incorporación de nucleótidos especifica de alelo, digestión con nucleasa 5', ensayo de baliza molecular, ensayo de ligadura de oligonucleótidos, análisis de tamaño, y polimorfismo de conformación monocatenario .

61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque los ácidos nucleicos procedentes de la muestra se amplifican antes de determinar la presencia de la una o más variaciones genéticas.

62. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la al menos una variación genética es una sustitución, inserción o deleción en una proteína seleccionada a partir de IL6R NTF4 y UNC5C.

63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la al menos una variación genética es una sustitución de aminoácido seleccionada de D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), R206 en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), y T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3).

64. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la presencia de la una o más variaciones genéticas se lleva a cabo mediante un proceso seleccionado entre electroforesis, cromatografía, espectroscopia de masas, digestión proteolítica, secuenciación de proteínas, ensayo de inmunoafinidad, o una de sus combinaciones.

65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque las proteínas procedentes de la muestra se purifican usando anticuerpos o péptidos que se unen a las proteínas antes de determinar la presencia de una o más variaciones genéticas.

66. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la muestra se selecciona entre una de liquido cefalorraquídeo, sangre, esputo de suero, saliva, raspado de la mucosa, biopsia de tejido, secreción lacrimal, semen, o sudor.

67. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende además tratar el sujeto para la EA basándose en la presencia de la una o más variaciones genéticas .

68. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende además detectar en la muestra la presencia de al menos un alelo ????-e4.

69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la presencia del al menos una variación genética junto con la presencia de al menos un alelo ????-e4 es indicativa de un riesgo aumentado de edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que tiene al menos un alelo ????-e4 y que carece de la presencia del al menos un marcador genético.

70. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende además someter al sujeto a una o más pruebas diagnósticas adicionales para la EA seleccionadas entre el grupo que consiste en la selección de uno o más marcadores genéticos adicionales, realizar una exploración del estado mental, o someter al sujeto a procedimientos de diagnóstico por imagen.

71. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende además analizar la muestra para detectar la presencia de al menos un marcador genético adicional que es un modificador de APOE, donde el al menos un marcador genético adicional está en un gen seleccionado entre el gen que codifica IL6R, el gen que codifica NTF4, el gen que codifica UNC5C, y un gen relacionado en la Tabla 3.

72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el al menos un marcador genético adicional es un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l). un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835W en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N° : 3 ) , o un SNP que se relaciona en la Tabla 3.

73. Un método para identificar un sujeto que tiene un riesgo mayor de edad precoz de diagnóstico de la EA, caracterizado porque comprende: determinar la presencia o ausencia de una variación genética en un gen seleccionado entre los genes que codifican IL6R, NTF4 y UNC5C, o uno de sus productos génicos, en una muestra biológica de un sujeto, determinar la presencia o ausencia de al menos un alelo ??0?-e4, donde la presencia de la variación genética y de al menos un alelo ??0?-e4 indica que el sujeto tiene un riesgo mayor de una edad precoz de diagnóstico de la EA en comparación con un sujeto que carece de la presencia de variación genética y de al menos un alelo ??0?-e4.

74. Un método para añadir un pronóstico de un subfenotipo de la EA en un sujeto, caracterizado porque comprende detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), donde el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por niveles aumentados de la IL6R soluble en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control.

75. Un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico contra la EA que se dirige a IL6R, caracterizado porque comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), donde la presencia del SNP es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a IL6R.

76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el agente terapéutico es un anticuerpo dirigido contra IL6R.

77. Un método para añadir un pronóstico de un subfenotipo de la EA en un sujeto, caracterizado porque comprende detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), donde el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por la activación disminuida de TrkB en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control .

78. Un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico contra la EA que se dirige a TrkB, caracterizado porque comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4 (SEC ID N°:2), donde la presencia del SNP es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a TrkB.

79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el agente terapéutico es un agonista de TrkB.

80. Un método para añadir un pronóstico de un subfenotipo de la EA en un sujeto, caracterizado porque comprende detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), donde el subfenotipo de la EA se caracteriza al menos en parte por un aumento en la actividad apoptótica de UNC5C en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos del control.

81. Un método para predecir la respuesta de un sujeto a un agente terapéutico contra la EA que se dirige a UNC5C, caracterizado porque comprende detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835 en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), donde la presencia del SNP es indicativa de una respuesta a un agente terapéutico que se dirige a UNC5C.

82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el agente terapéutico se dirige al dominio de muerte de UNC5C.

83. Un método para diagnosticar o pronosticar la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo capaz de detectar la presencia o ausencia de uno o más SNP seleccionados entre el grupo que consiste en un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206 en la secuencia de aminoácidos de NTF4, y un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), y (b) analizar la muestra para detectar la presencia de el uno o más SNP, donde la presencia del uno o más SNP en la muestra indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

84. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque comprende además detectar uno o más SNP seleccionados entre los SNP relacionados en la Tabla 3.

85. Un kit para llevar a cabo el método de la reivindicación 83, caracterizado porque comprende al menos un reactivo de detección de oligonucleótidos , donde el reactivo de detección de oligonucleótidos distingue entre cada uno de al menos dos alelos diferentes en el uno o más SNP.

86. El kit de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque la detección se lleva a cabo mediante un proceso seleccionado entre el grupo que consiste en la secuenciación directa, hibridación de la sonda especifica de alelo, extensión del cebador especifica de alelo, amplificación especifica de alelo, secuenciación, digestión con nucleasa 5', ensayo de baliza molecular, ensayo de ligadura de oligonucleótidos, análisis de tamaño, y polimorfismo de conformación monocatenario .

87. El kit de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque los reactivos de detección de oligonucleótidos se inmovilizan en un sustrato.

88. El kit de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque los reactivos de detección de oligonucleótidos se disponen en una matriz.

89. Un método para diagnosticar o pronosticar la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un reactivo capaz de detectar la presencia o ausencia de una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4, y la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), y (b) analizar la muestra para detectar la presencia de la una o más sustituciones de aminoácidos, donde la presencia de la una o más sustituciones de aminoácidos en la muestra indica que el sujeto padece, o tiene riesgo de desarrollar, EA.

90. Un kit para llevar a cabo el método de la reivindicación 89, caracterizado porque comprende al menos un reactivo de detección de anticuerpos, donde el reactivo de detección de anticuerpos distingue entre cada uno de al menos dos aminoácidos diferentes en la una o más sustituciones de aminoácidos .

91. Una diana terapéutica para el tratamiento de la EA, caracterizada porque es una o una combinación de las proteínas codificadas por los genes seleccionados entre IL6R, NTF4 y UNC5C.

92. Un conjunto de sondas moleculares para el diagnóstico o el pronóstico de la EA, caracterizado porque comprende al menos dos sondas capaces de detectar directa o indirectamente al menos dos marcadores seleccionados entre el grupo que comprende: un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido D358A en la secuencia de aminoácidos de IL6R (SEC ID N°:l), un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido R206W en la secuencia de aminoácidos de NTF4, y un SNP que da como resultado la sustitución del aminoácido T835M en la secuencia de aminoácidos de UNC5C (SEC ID N°:3), donde las sondas moleculares no se asocian con una micromatriz de más de 1000 elementos.

93. El conjunto de sondas moleculares de la reivindicación 92, caracterizado porque comprende además una o más sondas capaces de detectar directa o indirectamente al menos dos marcadores seleccionados entre los SNP relacionados en la Tabla 3.

94. Un método para seleccionar variantes genéticas que tienen un efecto perjudicial o beneficioso sobre el desarrollo de la EA en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4, caracterizado porque comprende identificar una variante genética que está presente en una frecuencia aumentada o disminuida en sujetos con menos de 65 años de edad, que tienen EA, y que tienen al menos un alelo ????-e4, en comparación con los sujetos del control con más de 75 años de edad, sin EA, y que tienen al menos un alelo ??0?-e4, donde la frecuencia aumentada en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control indica que la variación genética está asociada con un efecto perjudicial en sujetos que tienen al menos un alelo ??0?-e4, y una frecuencia disminuida en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control indica que la variación genética está asociada con un efecto beneficioso en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4.

95. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la variación genética se identifica utilizando un análisis de asociación de genoma completo.

96. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el efecto perjudicial es un mayor riesgo de desarrollo de la EA o una edad menor de inicio de la EA.

97. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el efecto beneficioso es un menor riesgo de desarrollo de la EA o una edad superior de inicio de la EA.

98. Un método para seleccionar variantes genéticas que tienen un efecto perjudicial o beneficioso sobre el desarrollo de la EA en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4, caracterizado porque comprende (a) determinar el genotipo en uno o más locus genéticos de una pluralidad de sujetos con menos de 65 años de edad, que tienen EA, y que tienen al menos un alelo ????-e4; (b) determinar el genotipo en uno o más locus genéticos de una pluralidad de sujetos del control con más de 75 años de edad, sin EA, y que tienen al menos un alelo ??0?-e4; y (c) identificar una variante genética que está presente en una frecuencia aumentada o disminuida en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control, donde la frecuencia aumentada en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control indica que la variación genética está asociada con un efecto perjudicial en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4, y una frecuencia disminuida en sujetos que tienen EA en comparación con los sujetos del control indica que la variación genética está asociada con un efecto beneficioso en sujetos que tienen al menos un alelo ????-e4.