MX2014004980A

MX2014004980A - Inmunoaglutinantes biespecificos dirigidos contra tnf e il-17.

Info

Publication number: MX2014004980A
Application number: MX2014004980A
Authority: MX
Inventors: Chung-Ming Hsieh; Jennifer Perez; Suju Zhong; Lucia Eaton; Anca Clabbers; John Memmott; Yuliya Kutskova; Margaret Hugunin; Lorenzo Benatuil; Alyssa Brito
Original assignee: Abbvie Inc
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2014-09-11
Also published as: AR088514A1; HK1200321A1; PH12014500903A1; BR112014009810A2; CR20140224A; EP2771361A1; ECSP14001260A; US9655964B2; AU2012328917B2; KR20140084254A; CL2014001055A1; PE20142245A1; WO2013063110A1; IL232207A0; US20140161804A1; GT201400077A; RS20140202A1; US20140079705A1; SG11201401796SA; UY34410A

Abstract

Se proveen proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas diseñadas, métodos de elaboración, y específicamente sus usos en la prevención, diagnosis, y/o tratamiento de enfermedad.

Description

INMUNOAGLUTIN ANTES BIESPECI FICOS DIRIGIDOS CONTRA TNF E IL-17 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad a Solicitud provisional de Estados Unidos serie No. 61/550,619, representada el 24 de octubre de 2011, que se incorpora aquí para referencia en su totalidad.

Campo de la invención Proteínas de unión multi-específicas y multivalentes que unen TNF e IL-17, métodos de fabricación y específicamente para su uso en el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, cáncer y otras enfermedades se proporcionan.

Antecedentes de la invención Proteínas diseñadas, tal como proteínas de unión multi-específicas capaces de unir dos o más antígenos son conocidas la técnica. Dichas proteínas de unión multi-específicas pueden generarse utilizando, fusión celular, conjugación química o técnicas de DNA recombinante.

Proteína de unión bi-especifica se han producido utilizando la tecnología de quadroma (véase Milstein y Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40) basada en la fusión somática de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales de murino (mAbs) con las especificidades deseadas del anticuerpo bi-específico. Debido a l apareamiento aleatorio de dos diferentes cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina (Ig) dentro de la l ínea celular hibrido-hibridoma resultante (o quadroma), hasta diez diferentes especies Ig se generan, de los cuales sólo u no es un anticuerpo bi-específico funcional . La presencia de subproductos mis-apareados y los rendimientos de producción significativa mente reducidos , significa que se requieren procedimientos de purificación sofisticada .

Protei na de unión bi-específica también puede ser producida por conjugación química de dos diferentes mAbs (véase Staerz et al. ( 1985) Nature 314(6012) : 628-31 ) . Este método no produce preparación homogénea. Otros métodos han utilizado conjugación química de dos diferentes mAbs o fragmentos de anticuerpos pequeños (véase Brennan et al . (1 985) Science 229(4708) : 81 -3).

Otro método utilizado para producir proteína de unión bi-específica es el acoplamiento de dos anticuerpos parentales con un entrelazador hetero-bifunciona l, pero los anticuerpos bi-específicos resultantes sufren de heterogeneidad molecular significativa porque la reacción del entrelazador con los anticuerpos parentales no es dirigida de sitio . Para obtener preparaciones más homogéneas de anticuerpos bi-específicos dos diferentes fragmentos Fab se han entrelazado qu ímicamente en sus residuos de cisteína de articulación en una manera dirigida de sitio (véase Glenn ie et a l . ( 1 987) J . I mmunol . 1 39(7) : 2367-75) . Pero estos resultados del método en fragmentos Fab'2, no completan una molécula de IgG .

Se ha desarrollado una amplia variedad de otros formatos de anticuerpos bi-específico recombinantes (véase Kriangkum et al. (2001) Biomol. Engin. 18(2): 31-40). Moléculas Fv de cadena sencilla tándem y anticuerpos y varios derivados de los mismos, son los más ampliamente utilizados. Rutinariamente, construcción de estas moléculas se inicia desde dos fragmentos de Fv de cadena sencilla (scFv) que reconocen diferentes antígenos (véase Economides et al. (2003) Nat. Med. 9(1): 47-52). Moléculas de scFv tándem (taFv) representan un formato sencillo simplemente conectando a dos moléculas de scFv con un enlazador de péptido adicional. Los dos fragmentos scFv presentes en estas moléculas de scFv tándem forman enlazadores de péptido adicionales. Varios enlazadores pueden utilizarse para conectar los dos fragmentos scFv y enlazadores con una longitud de hasta 63 residuos (véase Nakanishi et al., (2001) Ann. Rev. Immunol. 19:423-74). Aunque los fragmentos scFv parentales normalmente pueden expresarse en forma soluble en las bacterias, es, sin embargo, a menudo observado que las moléculas de scFv tándem forman agregados insolubles en bacterias. Por lo tanto, protocolos de replegamiento o el uso de sistemas de expresión de mamíferos se aplican rutinariamente para producir moléculas de scFv tándem solubles. Expresión in vivo por conejos transgénicos y ganado de un scFv tándem contra CD28 y un proteoglicano asociado con melanoma es reportado por Gracie et al., (1999) J. Clin. Invest. 104(10): 1393-401. En esta construcción, las dos moléculas de scFv están conectadas por un enlazador de CH1 y concentraciones de suero de hasta 100 mg/L de anticuerpo bi-específico se obtienen. Se utilizaron diversas estrategias que incluyen las variaciones de la orden de dominio o que usan enlazadores medios con variación de longitud o flexibilidad para permitir la expresión soluble en bacterias. Algunos estudios han reportado la expresión de moléculas de scFv tándem solubles en bacterias (véase Leung et al., (2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502; Ito et al., (2003) J. Immunol. 170(9): 4802-9; arni et al (2002) ] Neuroimmunol. 125(1-2): 134-40) utilizando un enlazador Ala3 muy corto o enlazadores ricos en glicina/serina largos. En otro estudio, despliegue de fago de un repertorio de scFv tándem que contiene enlazadores medios al azar con una longitud de 3 o 6 residuos se emplea para enriquecer para aquellas moléculas que se producen en forma soluble y activa en las bacterias. Este método resulta en el aislamiento de una molécula de scFv tándem con un enlazador de residuo de 6 aminoácidos (véase Arndt y rauss (2003) Methods Mol. Biol. 207:305-21). No está claro si esta secuencia de enlazador representa una solución general a la expresión soluble de moléculas scFv tándem. Sin embargo, este estudio demuestra que el despliegue de fago de moléculas scFv tándem en combinación con mutagénesis dirigida es una poderosa herramienta para enriquecer estas moléculas, que pueden ser expresadas en bacterias en forma activa.

Anticuerpos bi-específicos (Db) utilizan el formato de diacuerpo para la expresión. Diacuerpos se producen a partir de fragmentos scFv al reducir la longitud del enlazador que conecta el dominio VH y VL a aproximadamente 5 residuos (véase Peipp y Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4): 507-11). Esta reducción de tamaño de enlazador facilita la dimerización de dos cadenas polipeptídicas por el cruce de apareamiento de los dominios VH y VL. Diacuerpos bi-específicos son producidos por expresión de dos cadenas polipeptídicas con cualquiera de las dos estructuras VHA-VLB y VHB-VLA (configuración VH-VL), o VLA-VHB y VLB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. Una gran variedad de diferentes anticuerpos bi-específicos se ha producido en el pasado y la mayoría de ellos se puede expresar en forma soluble en bacterias. Sin embargo, un estudio comparativo demuestra que la orientación de los dominios variables puede influir la expresión y formación de sitios de unión activa (véase Mack et al (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92(15): 7021-5). Sin embargo, la expresión soluble en bacterias representa una importante ventaja sobre moléculas de scFv tándem. Sin embargo, ya que dos cadenas polipeptídicas diferentes se expresan dentro de homodímeros inactivos de célula sencilla pueden ser producidos junto con heterodímeros activos. Esto requiere la implementación de etapas de purificación adicionales con el fin de obtener preparaciones homogéneas de diacuerpos bi-específicos. Un método para forzar la generación de diacuerpos bi-especificos de la producción de diacuerpos con botón en orificio (véase Holliger et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-8.18). Este método es demostrado por un diacuerpo bi-específico dirigido contra HER2 y CD3. Un botón grande se introduce en el dominio VH intercambiando Val37 con Phe y Leu45 con Trp y un orificio complementario se produce en el dominio VL por mutación de Phe98 a Met y Tyr87 a Ala, en los dominios variables anti-HER2 o anti-CD3.

Utilizando este método la producción de diacuerpos bi-específicos puede aumentarse de 72% por el diacuerpo parenteral a más del 90% por el diacuerpo de botón en orificio. Lo importante, rendimientos de producción solamente disminuyen ligeramente como resultado de estas mutaciones. Sin embargo, se observa una reducción en la actividad de unión de antígeno para varios constructos analizados. Así, este método bastante elaborado requiere el análisis de varios constructos con el fin de identificar aquellas mutaciones que producen molécula heterodimérica con actividad de unión inalterada. Además, dicho método requiere modificación mutacional de la secuencia de inmunoglobulína en la región constante, creando así la forma no nativa y no natural de la secuencia de anticuerpo, que puede resultar en inmunogenicidad incrementada, mala estabilidad in vivo, así como farmacocinéticos indeseables.

Diacuerpos de cadena sencilla (scDb) representan una estrategia alternativa para mejorar la formación de moléculas tipo diacuerpo bi-específico (véase Holliger y Winter (1997) Cáncer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu et al (1996) Immunotechnology 2(1): 21-36). Diacuerpos de cadena sencilla bi-específicos se producen conectando las dos cadenas polipeptídicas que forma diacuerpo con un enlazador medio adicional con una longitud de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos. En consecuencia, todas las moléculas con un peso molecular correspondiente a diacuerpos de cadena sencilla monoméricos (50-60 kDa) son bi-específicos. Varios estudios han demostrado que diacuerpos de cadena sencilla bi-específicos se expresan en las bacterias en forma soluble y activa con la mayoría de moléculas purificadas presentes como monómeros (véase Holliger y Winter (1997) Cáncer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu et al., (1996) Immunotechnol 2(1):21-36; Pluckthun y Pack (1997) Immunotechnol. 3(2): 83-105; Ridgway et al., (1996) Protein Engin. 9(7):617-2 ). Por lo tanto, diacuerpos de cadena sencilla combinan las ventajas del scFv tándem (todos los monómeros son bi-específicos) y diacuerpos (expresión soluble en bacterias).

Más recientemente han sido fusionados diacuerpos a Fe para generar más moléculas tipo Ig, llamadas di-diacuerpos (véase Lu et al (2004) J. Biol. Chem. 279(4): 285a-65). Además, constructo de anticuerpo multivalente que comprende dos Fab se repite en la cadena pesada de un IgG y capaz de unir cuatro moléculas de antígeno se ha descrito (véase publicación PCT No. WO 0177342 y Miller et al., (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61).

TNF (también conocido como factor de necrosis tumoral, factor de necrosis tumoral alfa, factor-a de necrosis tumoral, TNF-a y caquectina) es una citoquina involucrada en la regulación de las respuestas inmunes. Juega un papel fundamental en la patología asociada con una variedad de enfermedades que involucran elementos inmunes e inflamatorios, tal como enfermedades autoinmunes, especialmente aquellas asociadas con inflamación. Por lo tanto, las proteínas de unión aquí pueden utilizarse para tratar estos trastornos. También sé involucran en los trastornos respiratorios; condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de diversos órganos; tumores o cánceres; y varios tipos de infecciones virales, bacterianas y parasitarias. lnterleuquina-17 (IL-17) es una citoquina secretada por las células T activadas, que actúa como un potente mediador en respuestas inmunes al inducir moléculas de señalización inmunes en varios tejidos para reclutar monocitos y neutrófilos al sitio de la inflamación. Actúa sinérgicamente con TNF para llevar a cabo sus funciones. IL-17 se ha relacionado con muchas enfermedades relacionadas inmunes/autoinmune, incluyendo artritis reumatoide, asma, lupus, rechazo de aloinjertos e inmunidad antitumoral.

Existe una necesidad en la técnica de proteínas de unión multivalentes mejoradas capaces de unirse a TNF. Patente de E.U.A. No. 7,612,181 proporciona una novedosa familia de proteínas de unión capaces de unir dos o más antígenos con alta afinidad, que se llaman proteínas de unión de dominio variable dual (proteína de unión a DVD). Se proporcionan proteínas de unión nuevas que unen TNF.

Breve descripción de la invención Se proporcionan proteínas de unión multivalentes capaces de enlace TNF e IL-17. Se proporciona una novedosa familia de proteínas de unión capaces de enlace TNF e IL-17 con alta afinidad.

En una modalidad, proteínas de unión que unen TNF que comprenden una cadena polipeptídica, en donde la cadena polipeptídica comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, C es un dominio constante, X1 representa un aminoácido o polipéptido, X2 representa una región Fe y n es O o 1, se proporcionan. En una modalidad el VD1 y VD2 en la proteína de unión son dominios variables de cadena pesada. En otra modalidad, el dominio variable de cadena pesada es un dominio variable de cadena pesada de murino, un dominio variable de cadena pesada humano, un dominio variable de cadena pesada injertado con CDR, o un dominio variable de cadena pesada humanizado. En aún otra, modalidad VD1 y VD2 son capaces de unir el mismo antígeno. En otra modalidad VD1 y VD2 son capaces de unir diferentes antígenos. En aún otra modalidad, C es un dominio constante de cadena pesada. En una modalidad, X1 es un enlazador con la salvedad de que X1 no sea CH1. En una modalidad, X1 es un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO. 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPS VFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPA ELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); o GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27); y ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28). En una modalidad, X2 es una región Fe. En otra modalidad, X2 es una región variante Fe.

En una modalidad la proteína de unión descrita aquí comprende una cadena polipeptídica que une TNF, en donde la cadena polipeptídica compone VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un enlazador con la salvedad de que no es CH1, y X2 es una región Fe.

En una modalidad, VD1 y VD2 en la proteína de unión son dominios variables de cadena ligera. En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera es un dominio variable de cadena ligera de murino, un dominio variable de cadena ligera humano, un dominio variable de cadena ligera injertado con CDR, o un dominio variable de cadena ligera humanizado. En una modalidad VD1 y VD2 son capaces de unir el mismo antígeno. En otra modalidad VD1 y VD2 son capaces de enlazar diferentes antígenos. En una modalidad, C es un dominio constante de cadena ligera. En una modalidad, X1 es un enlazador con la salvedad de que X1 no es CL. En una modalidad, X1 comprende la secuencia de aminoácidos AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); o GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27); y ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28). En una modalidad, la proteína de unión no comprende X2.

En una modalidad, tanto las cadenas pesadas variables como cadenas ligeras variables comprenden el mismo enlazador. En otra modalidad, las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables comprenden diferentes enlazadores. En otra modalidad, las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables comprenden a un enlazador corto (aproximadamente 6 aminoácidos). En otra modalidad, las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables comprenden un enlazador largo (más de 6 aminoácidos). En otra modalidad, la cadena pesada variable comprende a un enlazador corto y la cadena ligera variable comprende a un enlazador largo. En otra modalidad, la cadena pesada variable comprende a un enlazador largo y la cadena ligera variable comprende a un enlazador corto.

En una modalidad la proteína de unión descrita aquí comprende una cadena polipeptídica que unen TNF, en donde la cadena polipeptíd ica comprende VD 1 -(X1 )n-VD2-C(X2)n , en donde VD 1 es un primer dom inio de cadena ligera variable, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición de que no sea CL, y X2 no comprende una región Fe.

En otra modalidad, una proteína de unión que une TNF que comprende dos cadenas polipeptídicas, en donde la primera cadena polipéptidica comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD 1 es un primer dominio variable de cadena pesada , VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada , C es un dominio constante de cadena pesada , X1 es un primer enlazador, y X2 es una región Fe; y la segunda cadena polipeptídica comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , donde VD 1 es un primer dominio variable de cadena ligera , VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera , X 1 es un segundo enlazador, y X2 no comprende una región Fe se proporciona. En algunas modalidades, el primero y segundo X1 son los m ismos. En otras modalidades, el primero y segundo X1 son diferentes. En algunas modalidades el primer X1 no es un dominio CH 1 . En algu nas modalidades el segundo X1 no es un dominio CL.

En una modalidad particular, la proteína de unión de dominio de variable Dual (DVD) comprende cuatro cadenas polipeptídicas, en donde cada una de las dos primeras cadenas polipeptídicas comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada , C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un primer enlazador, y X2 es una región Fe; y cada una de las dos segundas cadenas polipeptídicas comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un segundo enlazador, y X2 no comprende una región Fe. Dicha proteína de unión de DVD tiene cuatro sitios de unión de antígeno. En algunas modalidades, el primero y segundo X1 son los mismos. En otras modalidades, el primero y segundo X1 son diferentes. En algunas modalidades el primer X1 no es un dominio CH1. En algunas modalidades el segundo X1 no es un dominio CL. En otra modalidad las proteínas de unión descritas aquí son capaces de unir TNF. En consecuencia, en algunas modalidades, las proteínas de unión comprenden por lo menos dos secuencias de dominio variable (por ejemplo, VD1 y VD2) capaces de unir TNF, en cualquier orientación. En algunas modalidades, VD1 y VD2 se eligen de forma independiente. Por lo tanto, en algunas modalidades, VD1 y VD2 comprenden la misma SEQ ID NO y, en otras modalidades, VD1 y VD2 comprenden SEQ ID NOS diferentes.

En una modalidad, la proteína de unión comprende dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2, y dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2, en donde (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807, 809 o cualquiera de 36-41, 48-72, u 88-97, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o alguno de 42-47, 73-87, o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807, 809, o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 comprenden independientemente tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o alguno de 42-47, 73-87 o 98-107, y la proteína de unión es capaz de unir TNF; o (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807, 809, o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o alguno de 42-47, 73-87 o 98-107, el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDrs de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, 812; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807, 809, o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDrs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o alguno de 42-47, 73-87 o 98-107, y el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, u 812.

En otra modalidad, la proteína de unión comprende una cadena pesada y una secuencia de cadena ligera como se muestra en el cuadro 1.

En otra modalidad , una proteína de unión que une TNF que com prende una cadena polipeptídica , en donde la cadena polipeptídica comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en donde; VD 1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno; VD2 es un segundo dom inio variable de pesada cadena obtenido de un segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que puede ser igual o diferente del primer anticuerpo de origen ; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1 )n es un enlazador con la salvedad de que no es CH 1 , en donde (X1 )n está presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde el (X2)n está presente o ausente se proporciona. En una modalidad , la región Fe está ausente de la proteína de unión.

En otra modalidad, una proteína de unión que une TN F que comprende una cadena polipeptídica, en donde la cadena polipeptídica comprende VD 1 -(X 1 )n-VD2-C-(X2)n , en donde, VD 1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que puede ser igual o diferente del primer anticuerpo de origen ; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1 )n es un enlazador con la salvedad de que no es CL, en donde (X1 )n está presente o ausente; y (X2)n no com prende una región Fe, en donde (X2)n está presente o ausente se proporciona. En una modalidad (X2)n está ausente de la proteína de unión .

En otra modalidad , la proteí na de unión que une TN F comprende primera y segunda cadenas polipeptídicas, en donde la primera cadena polipeptídica compone un primer VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD 1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido un primer a nticuerpo de origen o porción de unión de antígeno; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo de origen o su porción de unión del antígeno, que puede ser igual o diferente del primer anticuerpo de origen; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1 )n es un primer enlazador, en donde (X 1 )n está presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde el (X2)n está presente o ausente; y en donde la segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido de un primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que puede ser igual o diferente del primer anticuerpo de origen ; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1 )n es un segundo enlazador, en donde el (X1 )n está presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en donde el (X2)n está presente o ausente. En otra modalidad, la proteína de unión comprende dos primeras cadenas polipeptídicas y dos segundas cadenas polipeptídicas. En aún otra modalidad , (X2)n está ausente del segundo polipéptido. En algunas modalidades, el primero y segundo X1 son los mismos. En otras modalidades, el primero y segundo X1 son diferentes. En algunas modalidades el primer X1 no es un dominio CH 1 . En algunas modal idades el segundo X1 no es un dominio CL. En aún otra modalidad, la región Fe, si está presente en el primer polipéptido, es una región Fe de secuencia nativa o una región Fe de secuencia de variante. En aún otra modalidad, la región Fe es una región Fe de un lgG 1 , una región Fe de un lgG2, una región Fe de un lgG3, una región Fe de un lgG4, una región Fe de un IgA, una región Fe de un IgM , una región Fe de un IgE o una región Fe de un IgD .

En otra modalidad , la proteína de unión que une TNF comprende cuatro cadenas polipeptídicas, en donde, la primera y tercera cadenas polipeptídicas comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde, VD1 es un pri mer dominio variable de cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido de un segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que puede ser igual o diferente del primer a nticuerpo de origen; C es un dominio constante de cadena pesada ; (X1 )n es un primer enlazador, en donde el (X1 )n está presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde el (X2)n está presente o ausente; y en donde la seg u nda y cuarta cadenas polipeptídicas com prenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X 2)n , en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido un primer anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno; VD2 es un segundo dom inio variable de cadena ligera obtenido de un segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que puede ser igual o d iferente del primer a nticuerpo de origen; C es un dominio constante de cadena l igera; (X1 )n es un segundo enlazador, en donde (X1 )n está presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en donde el (X2)n está presente o ausente. En algunas modalidades, el primero y segundo X 1 son los mismos. En otras moda lidades, el primero y segundo X1 son diferentes. En algunas modalidades el primero X1 no es un dominio CH 1 . En algunas modalidades el segundo X1 no es un dominio CL.

Se proporciona un método para hacer una proteína de unión que une TNF. En una modalidad, el método para producir una proteína de unión que une I L-1 3 e IL-17 comprende los pasos de a) obtener un primer anticuerpo de origen, o su porción de unión de antígeno, que une I L-1 3; b) obtener un segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que une I L-1 7; c) construir una primera y tercera cadenas polipeptídicas que com prenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde, VD 1 es un primer dom inio variable de cadena pesada del primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada del segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que puede ser igual o diferente del primer anticuerpo de origen ; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1 )n es un primer enlazador, en donde (X1 )n está presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde (X2)n está presente o ausente; d) construir la segunda y cuarta cadenas polipeptídicas que comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en donde, VD 1 es un primer dominio variable de cadena ligera del primer anticuerpo de origen su porción de u nión de antígeno; VD2 es un segundo dom inio variable de cadena ligera del segundo anticuerpo de origen o su unión de antígeno, C es un dominio constante de cadena ligera ; (X1 )n es un segundo enlazador, en donde (X1)n está presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en donde (X2)n está presente o ausente; e) expresar la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas polipeptídicas; tal que una proteína de unión que se une al primero y segundo antígenos se genera. En algunas modalidades, el primero y segundo X1 son los mismos. En otras modalidades, el primero y segundo X1 son diferentes. En algunas modalidades el primer X1 no es un dominio CH1. En algunas modalidades el segundo X1 no es un dominio CL.

En aún otra modalidad, un método para generar una proteína de unión que une TNF con propiedades deseadas que comprende los pasos de a) obtener un primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que une TNF y que posee al menos una propiedad deseada exhibida por la proteína de unión; b) obtener un segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que une un segundo antígeno y posee al menos una propiedad deseada exhibida por la proteína de unión; c) construir una primera y tercera cadenas polipeptídicas que comprenden DVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde; VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido del primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido del segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, que puede ser igual o diferente del primer anticuerpo de origen; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un primer enlazador, en donde (X1)n está presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en donde el (X2)n está presente o ausente; d) construir la segunda y cuarta cadenas polipeptídicas que comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde; VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido del primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido del segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, C es un dominio constante de cadena ligera; (X1 )n es un segundo enlazador, en donde (X1 )n está presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en donde el (X2)n está presente o ausente; e) expresar la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas polipeptídicas; tal que una inmunoglobulina de dominio variable dual capaz de unir el primero y segundo antígenos con propiedades deseadas se proporciona. En algunas modalidades, el primero y segundo X1 son los m ismos. En otras modalidades, el primero y segundo X1 son diferentes. En algunas modalidades el primero X1 no es un dominio CH 1 . En algunas modal idades el segundo X 1 no es un dominio CL.

En una modalidad, el VD 1 de la primera y segunda cadenas polipeptídicas descritas aquí se obtienen del mismo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno. En otra modalidad , el VD1 de la primera y segunda cadenas polipeptídicas descritas aquí se obtienen de diferentes anticuerpos de origen o sus porciones de unión de antígeno. En otra modalidad , el VD2 de la primera y segunda cadenas polipeptíd icas descritas aqu í se obtienen del mismo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno. En otra modalidad , el VD2 de la primera y segunda cadenas polipeptídicas descritas aquí se obtienen de diferentes anticuerpos de origen o sus porciones de unión de antígeno.

En una modalidad el primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, y el segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno son el mismo anticuerpo. En otra modalidad el primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, y el segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, son diferentes anticuerpos.

En una modalidad el primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, une un primer antígeno y el segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, une un segundo antígeno. En una modalidad particular, el primero y segundo antígenos son el mismo antígeno. En otra modalidad, los anticuerpos de origen unen diferentes epítopes en el mismo antígeno. En otra modalidad el primero y segundo antígenos son antígenos diferentes. En otra modalidad, el primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, une el primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la que el segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, une el segundo antígeno. En aún otra modalidad, el primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, une el primer antígeno con una diferente afinidad con la que el segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, une el segundo antígeno.

En otra modalidad el primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, y el segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, son un anticuerpo humano, anticuerpo injertado con CDR o anticuerpo humanizado. En una modalidad, las porciones de unión de antígeno son un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región de articulación, un fragmento Fd , que consiste de los dominios VH y CH 1 , un fragmento Fv que consistente de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb, una región de determinación de complementariedad aislada (CDR), un anticuerpo de cadena sencilla o diacuerpos.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión a IL-1 7 que comprende al menos una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende (a) tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cualquiera de las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-1 1 5, 121 -317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 61 3, 618, 623, 628, 633, 638, 641 , 651 , 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751 , 761 , 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 81 1 ; o (b) cualquiera de las SEQ I D NO: 30, 32, 34, 108-1 15, 121 -317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641 , 651 , 663, 673, 683, 693, 703, 71 3, 723, 733, 743, 751 , 761 , 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 81 1 .

En una modalidad, la invención proporciona una proteína de unión a I L-1 7 que comprende al menos una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende (a) tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cualquiera de las SEQ I D NO: 31 , 33, 35, 1 16-120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812; o (b) cualquiera de las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116-120, 318- 526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812.

En una modalidad, la invención proporciona una proteína de unión a IL-17 que comprende al menos una región variable de cadena pesada (región VH) y al menos una región variable de cadena ligera (región VL) donde la región VH comprende: (a) tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cualquiera de las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 811; o (b) cualquiera de las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-115, 121- 317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 811; y la región VL comprende: (c) tres CDR de cualquiera de las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116-120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812; o (d) cualquiera de las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116-120, 318- 526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812.

En una modalidad, la proteína de unión comprende dos regiones VH y dos regiones VL.

En una modalidad, la proteína de unión comprende al menos una región VH y al menos una región VL que comprende un conjunto de secuencias de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30 y 31; 32 y 33; 34 y 35; 108 y 118; 108 y 119; 109 y 116; 110 y 117; 111 y 120; 112 y 117; 113 y 120; 114 y 117; 115 y 117; 527 y 537; 527 y 538; 528 y 535; 529 y 536; 530 y 539; 531 y 536; 532 y 539; 533 y 536; y 534 y 536.

En una modalidad, donde la proteína de unión: (a) modula una función biológica de IL-17; (b) neutraliza IL-17; (c) disminuye la capacidad de IL-17 de unirse a su receptor; (d) disminuye la capacidad de IL-17 pro-humana, IL-17 humana madura, o IL-17 humana truncada de unirse a su receptor; y/o (e) reduce uno o más de la producción de citocina dependiente de 11-17, destrucción celular dependiente de IL-17, inflamación dependiente de IL-17, erosión de los huesos dependiente de IL-17 y el daño a los cartílagos dependiente de IL-17.

En una modalidad, donde la proteína de unión tiene una constante de velocidad de asociación (Kasoc) de al menos alrededor de 102M 1s 1; al menos alrededor de 103M ~ s~1; al menos alrededor de 104M" 1s'1; al menos alrededor de 105M"1s 1; o al menos alrededor de 106M'1s 1, según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.

En una modalidad, la proteína tiene una constante de velocidad de disociación (Kdisoc) de como máximo alrededor de 10 3s 1 ; como máximo alrededor de 10"4s ; como máximo alrededor de 10~5s-1 ; o como máximo alrededor de 10 6s 1 , según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales.

En una modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) de como máximo alrededor de 10 7 ; como máximo alrededor de 10"8 M ; como máximo alrededor de 10"9 M; como máximo alrededor de 10"10 M ; como máximo alrededor de 1 0 " 1 1 M; como máximo alrededor de 1 0 12 M; o como máximo de 10"13 M.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión capaz de unirse a I L-17 humana, la proteína de unión comprende: (a) una región constante de cadena pesada; (b) una región constante de cadena ligera; (c) una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-1 15, 1 21 -317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641 , 651 , 663, 673, 683, 693, 703, 71 3, 723, 733, 743, 751 , 761 , 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 81 1 ; y (d) una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 31 , 33, 35, 1 16-120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812.

En otra modalidad la proteína de unión posee al menos una propiedad deseada exhibida por el primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno, o el segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno. Alternativamente, el primer anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno y el segundo anticuerpo de origen o su porción de unión de antígeno poseen al menos una propiedad deseada exhibida por la inmunoglobulina de dominio Variable Dual. En una modalidad, la propiedad deseada es uno o más parámetros de anticuerpo. En otra modalidad, los parámetros de anticuerpos son especificidad de antígeno, afinidad a antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento del epítope, estabilidad, solubilidad, eficacia de producción, inmunogenicidad, farmacocinéticas, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido o unión de antígeno ortólogo. En una modalidad la proteína de unión es multivalente. En otra modalidad, la proteína de unión es multi-específica. Las proteínas de unión multivalentes o multi-específicas descritas aquí tienen propiedades deseables especialmente desde un punto de vista terapéutico. Por ejemplo, la proteína de unión multivalente y/o multiespecífica puede (1 ) ser interiorizada (y/o catabolizada) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno a la que los anticuerpos se unen; (2) ser un anticuerpo agonista; y/o (3) inducir la muerte celular y/o apoptosis de la célula que expresa un antígeno que el anticuerpo multivalente es capaz de unir a. El "anticuerpo de origen" que proporciona al menos una especificidad de unión de antígeno de las proteínas de unión multivalentes y/o multi-específicas puede ser uno que es internalizado (o catabolizado) por una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo; y/o puede ser un agonista, anticuerpo que induce apóptosis y/o que induce la muerte celular, y la proteína de unión multivalente y/o multiespecífica como se describe en este documento puede desplegar mejora(s) en una o más de estas propiedades. Además, el anticuerpo de origen puede carecer de uno o más de estas propiedades, pero puede ser dotado con ellas cuando se construya como una proteína de unión multivalente descrita en este documento.

En otra modalidad la proteína de unión tiene una constante de velocidad de asociación (KaSoc) para uno o más objetivos de: por lo menos aproximadamente 102M"1s"1; al menos aproximadamente 103M"1s"1; al menos aproximadamente 104M"1s"1; al menos aproximadamente 105M 1s"1; o al menos aproximadamente 106M~1s 1, como se mide por resonancia de plasmón superficial. En una modalidad, la proteína de unión tiene una constante de velocidad de asociación (Kasoc) para uno o más objetivos entre aproximadamente 102M"1s_1 y aproximadamente 103M'1s'1; entre aproximadamente 103M'1s y aproximadamente 104 "1s'1; entre aproximadamente 104M 1s"1 y aproximadamente 105M 1s 1; o entre aproximadamente 105M*1s"1 y aproximadamente 106M" s"\ como se mide por resonancia de plasmón superficial.

En otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de velocidad de disociación (Kd¡Soc) para uno o más objetivos de: como máximo aproximadamente 10"3s"1; a mas de aproximadamente 10"4s1; a más de aproximadamente 105s"1; o a más de aproximadamente 10'6s"1, como se mide por resonancia de plasmón superficial. En una modalidad, la proteína de unión tiene constante de velocidad de disociación (Kdisoc) para uno o más objetivos de aproximadamente 103s~1 a aproximadamente 104s 1; de aproximadamente 104s1 a aproximadamente 10"5s 1; o de aproximadamente 10"5S a aproximadamente 10~6s"1, como se mide por resonancia de plasmón superficial.

En otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para uno o más objetivos de: más de aproximadamente 107M; a más de aproximadamente 10~8M; a más de aproximadamente 10'9M; a más de aproximadamente 10"10M; a más de aproximadamente 1011 ; a más de aproximadamente 10" 2M; o a más de 1013M. En Modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para sus objetivos de aproximadamente 107M a aproximadamente 108M; de aproximadamente 10"8M a aproximadamente 109M; de aproximadamente 109M a aproximadamente 10"10M; de aproximadamente 10~10M a aproximadamente 1011M; de aproximadamente 1011M a aproximadamente 1012M; o de aproximadamente 1012 a aproximadamente 10'13M.

En otra modalidad, la proteína de unión descrita aquí es un conjugado que comprende adicionalmente un agente. En otra modalidad, el agente es una molécula de inmuno-adhesión, un agente de formación de imágenes, un agente terapéutico, o un agente citotóxico. En una modalidad, el agente de formación imágenes es un radioetiquetado, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bioluminiscente, una etiqueta magnética o una biotina. En otra modalidad, el radioetiquetado es: 3H, 1 C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, o 153Sm. En aún otra modalidad, el agente terapéutico o citotóxico es un anti-metabolito, un agente de alquilación, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente anti-angiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, toxina o un agente apoptótico.

En otra modalidad, la proteína de unión descrita aquí es una proteína de unión cristalizada y existe como un cristal. En una modalidad, el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico libre de portador. En aún otra modalidad, la proteína de unión cristalizada tiene una mayor vida media in vivo que la contraparte soluble de la proteína de unión. En todavía otra modalidad, la proteína de unión cristalizada mantiene actividad biológica.

En otra modalidad, la proteína de unión descrita aquí es glicosilada. Por ejemplo, la glicosilación es un patrón de glicosilación humana.

También se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica alguna de las proteínas de unión descritas aquí. Una modalidad adicional proporciona un vector que comprende el ácido nucleico aislado descrito aquí en donde el vector es pcDNA; pTT (Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(2); pTT3 (pTT con sitio de clonación múltiple adicional; pEFBOS (Mizushima y Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO; pEF6 TOPO; pBOS-hCyl, pHybE o pBJ. En una modalidad, el vector es un vector descrito en Publicación de Patente de E.U.A. No.20090239259.

En otro aspecto una célula hospedera se transforma con el vector descrito aquí. En una modalidad, la célula hospedera es una célula procariota. En otra modalidad, la célula hospedera es E. coli. En una modalidad relacionada con la célula hospedera es una célula eucariota. En otra modalidad, la célula eucariota es una célula protista, una célula animal, una célula vegetal, o una célula fúngica. En aún otra modalidad, la célula hospedera es una célula de mamífero incluyendo pero sin limitarse a, CHO, COS; NSO, SP2, POR.C6 o una célula fúngica, tal como Saccharomyces cerevisiae o una célula de insecto, tal como Sf9.

En una modalidad, dos o más, por ejemplo, con diferentes especificidades, se producen en una célula hospedera recombinante sencilla. Por ejemplo, la expresión de una mezcla de anticuerpos ha sido llamada Oligoclonics™, (Merus B.V. , Países Bajos) Patente de E.U.A. NOS . 7,262,028; 7,429,486.

Un método de producción de una proteína de unión descrita aquí que comprende el cultivo de cualquiera de las células hospederas también descritas aquí en un medio de cultivo en condiciones suficientes para producir la proteína de unión se proporciona. En una modalidad, 50%-75% de la proteína de unión producida por este método es una proteína de unión tetravalente específica dual. En una modalidad particular, 75-90% de la proteína de unión producida por este método es una proteína de unión tetravalente específica dual. En una modalidad particular, 90%-95% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica dual.

Una modalidad proporciona una composición para la liberación de una proteína de unión en donde la composición comprende una formulación que a su vez comprende una proteína de unión cristalizada, como se describe aquí y un ingrediente y al menos un portador polimérico. Por ejemplo, es el portador polimérico es: poli(ácido acrílico) , poli(cianoacrilatos) , poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(depsipéptido) , poli(ésteres) , poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli(b-hidroxibutirato) , poli(caprolactona) , poli(dioxanona) ; poli(etilenglicol), pol i (hidroxipropil)metacri lamida, poli[(organo)fosfazeno], poli(ortoésteres) , poli(alcohol vin ílico), poli(vinilpirrolidona) , copolímeros de alquil vinil éter anh ídrido maléico, polioles plurónicos, albúmina , alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina , gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, o mezclas y sus copolímeros. Por ejemplo, el ingrediente puede ser albúmina , sacarosa , trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclodextrina , metoxipolietilenglicol o polietilenglicol. Otra modalidad proporciona un método para el tratamiento de un mamífero que comprende el paso de la administración al mam ífero de una cantidad efectiva de la composición descrita aqu í.

Se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión, como se describe aquí y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional la composición farmacéutica comprende al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico, un agente de formación de imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de angiogénesis (incluyendo pero no limitado a un anticuerpo anti-VEGF o un VEGF-trap) , un inhibidor de quinasa (incluyendo pero no limitado a un KDR y un inhibidor de TI E-2) , un bloqueador de molécula de co-estimulación (incluyendo pero no limitado a anti-B7.1 , anti-B7.2 , CTLA4-lg , anti-CD20) , un bloqueador de molécula de adhesión (incluyendo pero no limitado a un anticuerpo anti-ALF-1 , un anticuerpo de selectiva anti-E/L, un inhibidor de molécula pequeña) , un anticuerpo anti-citoquinas o su fragmento funcional (incluyendo pero no limitado a un anticuerpo del receptor anti-I L-18, anti-TNF y anti-I L-6/citoquinas), metotrexato, ciclosporina, rapamicina , FK506, una etiqueta detectable o reportero, un antagonista TN F, un antirreumático , un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esferoide (NSAI D) , u n analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico loca l , un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano , un antipsoriático, un corticosteroide , un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal , un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estim ulante, una medicación para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citoquina o un antagonista de citoquina.

Un método para el tratam iento de un sujeto humano que sufre de un trastorno en el que el objetivo, u objetivos, capaces de ser enlazados por la protei na de un ión descrita aquí es perjudicial, que comprende la administración al sujeto humano de una proteína de unión descrita aquí tal que la actividad del objetivo, u objetivos en el sujeto humano se inhibe y uno o más síntomas se alivian o el tratamiento se consigue se proporciona. En una modalidad, enfermedades que pueden ser tratadas o diagnosticadas con las composiciones y métodos incluyen, pero no se limitan a, elementos inmunes e inflamatorios, tal como enfermedades autoinmunes, particularmente aquellas asociadas con inflamación, que incluyen la enfermedad de Crohn, psoriasis (que incluyen psoriasis de placa), artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis psorática, osteoartritis o artritis idiopática juvenil), esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, artropatía espondilitis, lupus eritematoso sistémico, uveitis esclerosis múltiple, sepsis y enfermedades neurodegenerativas, regeneración neuronal, lesiones de la médula espinal y cánceres primarios y metastásicos. En otra modalidad, el trastorno es un trastorno respiratorio; asma; asma alérgica y no alérgica; asma debido a una infección; asma debido a una infección con el virus sincitial respiratorio (RSV); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); una afección que involucra inflamación de las vías respiratorias; eosinofilia; la fibrosis y la producción de exceso de moco; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópica; urticaria; eczema; rinitis alérgica; enterogastritis alérgica; una condición autoinmune y/o inflamatoria de la piel; una condición autoinmune y/o inflamatoria de los órganos gastrointestinales; enfermedades inflamatorias intestinales (IBD); colitis ulcerativa; enfermedad de Chrohn; una condición inflamatoria y/o autoinmune del hígado; cirrosis hepática; fibrosis hepática; fibrosis hepática causada por el virus de hepatitis B y/o C; esclerodermia; tumores o cánceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma de Hodgkin; una infección viral; una infección bacteriana; una infección parasitaria; infección por HTLV-1; supresión de la expresión de respuestas inmunes tipo I de protección, y la supresión de la expresión de una respuesta inmune tipo 1 protectora durante la vacunación.

En una modalidad, los anticuerpos o sus porciones de unión de antígeno, se utilizan para tratar el cáncer o en la prevención o la inhibición de metástasis de los tumores descritos aquí ya sea cuando se usan solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos.

En otro aspecto un método para tratar un paciente que padece de un trastorno que comprende el paso de la administración de una de las proteínas de unión descritas aquí antes, simultáneamente o después de la administración de un segundo agente, como se describe en este documento se proporciona. En una modalidad particular el segundo agente es budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas del receptor IL-1, mAbs anti-l L-1 ß, mAbs del receptor anti-l L-6 o IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL- 23, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, NSAIDs, ibuprofeno, corticosteroides, prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adensosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibidores de quinasa MAP, inhibidores enzimáticos de conversión de IL-?ß, inhibidores de enzima de conversión de TNFa, inhibidores de señalización de células T, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citoquinas solubles, receptor de TNF p55 soluble, receptor de TNF p75 soluble, sll_-1RI, slL-1RII, slL-6R, citoquinas antiinflamatorias, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, o TGFp. En una modalidad particular las composiciones farmacéuticas descritas aquí son administradas al paciente por administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabroquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intercereberal, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intra-rectal, intra-renal, intra-retiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica. Al menos un anticuerpo anti-idiotipo para al menos una proteína de unión también se proporciona. El anticuerpo anti-idiotipo incluye cualquier proteína o péptido que contiene la molécula que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina tal como, pero no limitado a, al menos una región de determinación complementariamente (CDR) de una cadena pesada o ligera o su porción de unión de ligando, una región variable de cadena ligera o cadena pesada, una región constante de cadena ligera o cadena pesada, una región de marco, o cualquier porción de la misma, que puede ser incorporada en una proteína de unión provista aquí.

Se proporciona un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de TNF (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El método comprende ensayar la muestra de prueba para el antígeno (o un fragmento del mismo) por un inmunoensayo. El inmunoensayo (i) emplea al menos una proteína de unión y al menos una etiqueta detectable y (ii) comprende comparar una señal generada por la etiqueta detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de antígeno (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba a una señal generada como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del antígeno (o un fragmento del mismo) en un control o un calibrador. El calibrador es opcionalmente parte de una serie de calibradores en que cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores en la serie por la concentración del antígeno (o un fragmento del mismo). Una de al menos una proteína de unión comprende la proteína de unión, tal como la proteína de unión a DVD, descrita aquí. El método puede comprender (i) poner en contacto con la muestra de prueba con al menos un agente de captura, que se une a un epítope en el antígeno (o un fragmento del mismo) para formar un agente de captura/antígeno (o un fragmento del mismo), (i¡) poner en contacto con el agente de captura/antígeno (o un fragmento del mismo) complejo con al menos un agente de detección, que comprende una etiqueta detectable y se une a un epítope en el antígeno (o un fragmento del mismo) que no esté enlazado por el agente de captura, para formar un agente de captura/antígeno (o un fragmento del mismo)/complejo de agente de detección y (iii) determinar la presencia, cantidad o concentración del antígeno (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba basada en la señal generada por la etiqueta detectable en el agente de captura/antígeno (o un fragmento del mismo)/complejo de agente de detección formado en (ii), en donde al menos una agente de captura y/o al menos un agente de detección es al menos una proteína de unión.

Alternativamente, el método puede comprender (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos un agente de captura, que se une a un epítope en el antígeno (o un fragmento del mismo) para formar un complejo de agente de captura/antígeno (o un fragmento del mismo), y simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, poner en contacto la muestra de prueba con antígeno etiquetado detectablemente (o un fragmento del mismo), que puede competir con cualquier antígeno (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba para unir a la menos un agente de captura, en donde cualquier antígeno (o un fragmento del mismo) presente en la muestra de prueba y el antígeno etiquetado detectablemente compiten entre sí para formar un complejo de agente de captura/antígeno (o un fragmento del mismo) y un complejo de agente de captura/antígeno etiquetado detectablemente (o un fragmento del mismo), respectivamente, y (¡i) determinar la presencia, cantidad o concentración del antígeno (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba basada en la señal generada por la etiqueta detectable en el complejo de agente de captura/antígeno etiquetado detectablemente (o un fragmento del mismo) formado en (ii), en donde al menos un agente de captura es al menos una proteína de unión y en donde la señal generada por la etiqueta detectable en el complejo de agente de captura/antígeno etiquetado detectablemente (o un fragmento del mismo) es inversamente proporcional a la cantidad o concentración de antígeno (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba.

En algunas modalidades, los métodos descritos aquí comprenden analizar la muestra de prueba para el antígeno (o un fragmento del mismo) por un inmunoensayo. El inmunoensayo (i) emplea al menos una proteína de unión y al menos una etiqueta detectable y (ii) comprende comparar una señal generada por la etiqueta detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del antígeno (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba a una señal generada como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del antígeno (o un fragmento del mismo) en un control o un calibrador. El calibrador es opcionalmente parte de una serie de calibradores en que cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores de la serie por la concentración del antígeno (o un fragmento del mismo). Una de al menos una proteína de unión comprende la proteína de unión , tal como la proteína de unión a DVD, descrita aquí .

Si la muestra de prueba es de un paciente, los métodos descritos aquí pueden comprender además diagnosticar, pronosticar, o evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente. Si los métodos además comprenden evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente, los métodos opcionalmente comprenden además modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según sea necesario para mejorar la eficacia . Los métodos descritos en este documento pueden ser adaptados para su uso en un sistema automatizado o sistema semi-automatizado.

También se proporciona un kit para análisis de una muestra de prueba para u n antígeno (o un fragmento del mismo) . El kit comprende al menos un componente para análisis de la muestra de prueba para un antígeno (o un fragmento del mismo) e instrucciones para el análisis de la muestra de prueba para un antígeno (o u n fragmento del mismo) , en donde al menos un componente incluye al menos una composición que comprende una proteína de unión descrita aquí .

Breve descripción de los d ibujos Figura 1 A es una representación esquemática de constructos de dom inio variable dual (DVD) y muestra la estrategia para la generación de u na proteína de un ión a DVD de dos anticuerpos de origen.

Figura 1 B es una representación esquemática de constructos DVD 1 -lg , DVD2-lg y dos clones de anticuerpo mono-específicos quiméricos.

Descripción detallada de la invención Se proporcionan proteínas de unión multivalentes y/o multiespecíficas capaces de unir dos o más antígenos. Proteínas de unión de dominio variable (proteínas de un ión a DVD) y sus composiciones farmacéuticas, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y las células hospederas para producir dichas proteínas de unión a DVD. También se proporcionan métodos para usar las proteínas de unión a DVD para detectar antígenos específicos, tanto in vitro como in vivo.

A menos q ue se defina lo contrario aquí , términos científicos y técnicos utilizados aquí tienen los significados que son comúnmente entendidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. En caso de cualquier ambigüedad latente, definiciones establecidas aquí toman precedente sobre cualquier defin ición de diccionario o extrínseca . A menos que el contexto requiera lo contrario, térm inos singulares incluirán pluralidades y términos plurales que incluyen el singular. El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. El uso del término "que incluye", así como de otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante . Términos como "elemento" o "componente" incluyen ambos elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se indique específicamente lo contrario.

Generalmente, nomenclaturas utilizadas en relación con el cultivo celular y de tejidos, biología molecular, inmunología , microbiología , genéticas y proteínas y química de ácido nucleico e hibridación descritos aquí son aquellos bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Los métodos y técn icas establecidas aquí por lo general se realizan de acuerdo con métodos convencionales bien sabidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y m ás específicas que son citadas y discutidas a lo largo de la presente especificación a menos que se indique lo contrario. Reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, normalmente realizadas en la técnica o como se describe en este documento. Las nomenclaturas utilizadas en conexión con , y los procedimientos de laboratorio y técnicas de quím ica analítica, qu ímica orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descrita aquí son aquellos bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica . Técnicas estándares se utilizan para la síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica , formulación y suministro y tratamiento de pacientes.

Para que la descripción pueda ser más fácilmente entendida, los términos seleccionados se definen a continuación .

El término "anticuerpo" se refiere ampliamente a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) conformada por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, muíante, variante o su derivación , que retiene las características de unión de epítope esencial de una molécula Ig. Dicho formatos de anticuerpo mutante, variante o derivados son conocidos en la técnica, y modalidades no limitantes de los mismos se discuten en este documento.

En un anticuerpo de longitud com pleta, cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH 1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera . La región constante de cadena ligera se compone de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas en las regiones de hipervariabilidad , denominadas reg iones de determinación de com plementariedad (CDR) , intercaladas con reg iones que están más conservadas, denom inadas regiones de marco (FR) . Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, arregladas de amino amino-termino a carboxi-termino en el siguiente orden : FR1 , CDR 1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG , IgE , IgM , IgD, IgA y IgY) , clase (por ejemplo, IgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4, lgA1 y lgA2) o subclase.

El término "Región Fe" se utiliza para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunog lobul ina, que puede ser generada por digestión de pa pa ína de u n anticuerpo intacto. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa o una la región Fe variante. La región Fe de una inm unog lobuiina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3 y opeionalmente comprende un domi nio CH4. Sustituciones de residuos de aminoácidos en la porción Fe para alterar la función efectora de anticuerpos son conocidas en la técnica (Patente US No. 5,648,260 y 5,624, 821 ). La porción Fe del anticuerpo media varias funciones efectoras importantes, por ejemplo, inducción de citoquinas, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y vida media/tasa de aclaramiento de complejos de anticuerpo y antígeno-anticuerpo. En algunos casos estas funciones efectoras son deseables para un anticuerpo terapéutico, pero en otros casos podrían ser innecesarias o incluso perjudiciales, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Algunos isotipos IgG humanos, particularmente IgG 1 e lgG3, median ADCC y CDC a través del enlace a FcyRs y C 1 q de complemento, respectivamente. Los receptores Fe neonatales (FcRn) son los componentes críticos que determinan la vida media de circulación de anticuerpos. En todavía otra modalidad, al menos un residuo de am inoácido se sustituirá en la región constante del anticuerpo, por ejemplo la región Fe del anticuerpo, tal que las funciones efectoras del anticuerpo se alteran. La dimerización de dos cadenas pesadas idénticas de una inmunoglobuiina es mediada por la dimerización de dominios CH3 y está estabilizado por enlaces de disulfuro dentro de la región de articulación (Huber et al . , (1 976) Nature 264:41 5-20; Thies et al ( 1 999) J . mol Biol . 293:67-79). Mutación de residuos de cisteína dentro de las regiones de articulación para evitar los enlaces de disulfuro de cadena pesada-cadena pesada desestabilizarán la dimeración de dominios CH3. Se han identificado residuos responsables de la dimerización de CH3 (Dall'Acqua (1998) Biochem. 37:9266-73.). Por lo tanto, es posible generar una mitad-lg monovalente. Curiosamente, estas moléculas Ig medias monovalentes se han encontrado en la naturaleza para subclases de IgG e IgA (Seligman (1978) Ann. Immunol. 129:855-70; Biewenga et al., (1983) Clin. Exp. Immunol. 51:395-400). La estequiometría de FcRn: región Fe de Ig se ha determinado que es 2:1 (West et al., (2000) Biochem. 39:9698-708), y media Fe es suficiente para mediar el enlace FcRn (Kim et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24:542-548.). Mutaciones para interrumpir la dimerización de dominio CH3 no tienen mayor efecto adverso sobre su unión de FcRn como los residuos importantes para dimerización CH3 se encuentran en la interfaz interna de la estructura de hoja de CH3 b, mientras que la región responsable de unión de FcRn se encuentra en la interfaz exterior de dominios CH2-CH3. Sin embargo, la molécula Ig media puede tener ciertas ventajas en penetración de tejido debido a su tamaño más pequeño que el de un anticuerpo regular. En una modalidad al menos un residuo de aminoácido se sustituirá en la región constante de las proteínas de unión provista aquí, por ejemplo la región Fe, tal que se interrumpe la dimerización de las cadenas pesadas, resultando en moléculas de proteína de unión a DVD. La actividad anti-inflamatoria de IgG es dependiente de la sialilación de glican N-enlazado del fragmento Fe de IgG. Los requerimientos de glican precisos para actividad anti- inflamatoria han sido determinados , tal que puede crearse un fragmento Fe de lgG1 apropiado, con lo cual se genera un lgG 1 sialilada, completamente recombinante con potencia incrementada grandemente (Anthony et al . , (2008) Science 320: 373-376) .

El término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o varios fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de un ir específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que se puede realizar la función de un ión de antígeno de un anticuerpo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Dichas modalidades de anticuerpo también pueden ser formatos bi-específicos, específicos duales o multi-específicos; unión específicamente a dos o más antígenos diferentes. Ejemplos de enlace fragmentos de unión incluidos dentro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo incluye (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios de VL, VH , CL y CH 1 ; (ii) un fragmento F(ab' )2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH 1 ; (iv) un fragmento Fv consistente de los dominios VL y VH de un solo brazo de un a nticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al ( 1 989) Nature 341 :544-546, Publicación PCT No. WO 90/05144), que comprende un único dominio variable; y (vi) una región de determ inación de complementariedad (CDR) . Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH , son codificados por genes independientes, pueden unirse , utilizando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite hacer como una cadena de proteína única en la que el par de regiones VL y VH formen moléculas monovalentes (conocidas como cadena sencilla Fv (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla pretenden ser incluidos dentro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena sencillas, tal como diacuerpos. Diacuerpos son anticuerpos bi-específicos bivalentes en qué dominios VH y VL se expresan en una cadena polipeptídica sencilla, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, con lo cual obliga a los dominios aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión del antígeno (véase por ejemplo, Holliger et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al (1994) Structure 2:1121-1123). Dichas porciones de unión de anticuerpo son conocidas en la técnica (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. Nueva York. 790 pp (ISBN 3-540-41354-5). Además anticuerpos de cadena sencilla también incluyen "anticuerpos lineales", que comprenden un par de segmentos de Fv tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión del antígeno (Zapata et al (1995) Proteín Eng. 8(10): 1057-1062; y Patente de Estados Unidos No. 5,641,870).

El término "proteína de unión multivalente" se utiliza a través de esta especificación para denotar una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión de antígeno. En una modalidad, la proteína de unión multivalente está diseñada para tener tres o más sitios de unión de antígeno y no es generalmente un anticuerpo de origen natural. El término "proteína de unión multiespecífica" se refiere a una proteína de unión capaz de unir dos o más objetivos relacionadas o no relacionados. Proteínas de unión de domin io variable dua l (DVD) proporcionadas aquí comprenden dos o más sitios de unión de antígeno y son proteínas de unión tetravalentes o multivalentes. Proteínas de unión a DVD pueden ser monoespecíficas, es decir, capaces de unir un antígeno o multiespecífico, es decir, capaces de unir dos o más antígenos. Proteínas de unión a DVD que comprenden dos polipéptidos DVD de cadena pesada y dos polipéptidos DVD de cadena ligera se conocen como DVD. Cada m itad de u na proteína de unión a DVD comprende un polipéptido DVD de cadena pesada y u n polipéptido DVD de cadena ligera y dos sitios de unión de antígeno. Cada sitio de unión comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de 6 CDRs involucrados en la unión de antígeno por sitio de unión de antígeno.

El término "anticuerpo bi-específíco" se refiere a anticuerpos de longitud completa generados por la tecnología de quadroma (véase Milstein y Cuello ( 1983) Nature 305(5934) : 537-40) , por conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase Staerz et al. ( 1985) Nature 314(601 2): 628-31 ) , o por métodos de botón el orificio o simi lares que introduce mutaciones en la región Fe (véase Holliger et al (1 993) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90( 14): 6444-6448) , resultando en múltiples especies de inmunoglobu l ina diferentes de los cuales sólo uno es el anticuerpo biespecífico funcional. Por función molecular, un anticuerpo biespecífico une a un antígeno (o epitope) en uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) y une a un antígeno diferente (o epitope) en su segundo brazo (un par diferente de HC/LC). Por esta definición , un anticuerpo bi-específico tiene dos brazos de unión de antígeno distintos (en especificidad y secuencias de CDR) y es monovalente para cada antígeno al cual se une.

El término "anticuerpo específico dual" se refiere a anticuerpos de longitud completa que se pueden unir a dos antígenos diferentes (o epítopes) en cada uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) (véase la publicación PCT No. WO 02/02773). En consecuencia, una proteína de unión específica dual tiene dos brazos de unión de antígeno idénticos, con especificidad idéntica y secuencias de CDR idénticas y es bivalente para cada antígeno al que se une.

Un "sitio de unión de antígeno funcional" de una proteína de unión es uno q ue es capaz de unir un antígeno objetivo. La afinidad de unión de antígeno del sitio de unión de antígeno no es necesariamente tan fuerte como el anticuerpo de origen del cual el sitio de unión de antígeno se deriva, pero la capacidad de unir el antígeno puede medirse utilizando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para la evaluación de unión de anticuerpo a un antígeno. Además, la afinidad de unión de antígeno de cada uno de los sitios de unión de antígeno de un anticuerpo multivalente aquí no necesita ser cuantitativamente el mismo.

El término "enlazador" se utiliza para denotar polipéptidos que comprenden dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces de péptido y se utiliza para unir una o más porciones de unión de antígeno. Dichos polipéptidos de enlazador son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Holliger et al (1 993) Proc. Nati. Acad . Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al ( 1 994) Structure 2: 1 121 -1 123) .

Un "dominio constante de inmunoglobulina" se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. Secuencias de aminoácido de dominio constante de cadena ligera y cadena pesada IgG humana son conocidas en la técnica .

El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales q ue comprenden la población son idénticos excepto para mutaciones de origen natural posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra u n antígeno único. Además , a diferencia de las prepa raciones de anticuerpos policlonales que usualmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada mAb se dirige contra un solo determinante en el antígeno. El mod ificador "monoclonal" no es debe construir como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular.

El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de l ínea germina l humana. Los anticuerpos humanos provistos aquí pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmu nog lobulina de l ínea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en el CDR y en CDR3 particular. Sin embargo, el término "anticuerpo humano" no incluye anticuerpos en los cuales secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especies de mamíferos, tal como un ratón, han sido injertada sobre secuencias marco humano.

El término "anticuerpo humano recombinante", como se usa aquí, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que están preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una genoteca de anticuerpo humano combinatorial recombinante (Hoogenboom H.R. (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., y Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de ¡nmunoglobulina humana (véase, Taylor, L. D., et al. Nucí (1992). Acid res. 20:6287-6295; Kellermann S-A. y Green L.L. (2002) Current Opinión in biotechnology 13:593-597; Little et al (2000) Immunology Today 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica dividir secuencias de genes de ¡nmunoglobulina humana con otras secuencias de DNA. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, dichos anticuerpos recombinantes humanos son sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando un animal transgénico para secuencias Ig humanas se usa, mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, m ientras se derivan y relacionan con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, naturalmente no pueden existir dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpo humano in vivo.

Un anticuerpo "madurado de afinidad" es un anticuerpo con una o más alteraciones en uno o varios de sus CDRs que resulta en una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno, en comparación con un anticuerpo de origen que no posee estas alteraciones. Anticuerpos madurados de afinidad ejemplares tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Anticuerpos madurados de afinidad son producidos por procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. (1 992) BioTechnology 1 0:779-783 describe la maduración de afin idad por transposiciones de dominio VH y VL. Mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de marco es descrito por: por ejemplo, Barbas et al . ( 1 994) Proc. Nat. Acad . Sci , USA 91 : 3809-381 3 y mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva, contacto o posiciones de hipermutación con una actividad que incrementa residuos de aminoácidos como se describe en Patente de E. U.A. No. 6,914, 1 28.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena ligera y pesada de una especie y secuencias de región constante de otras especies, tal como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera de murino enlazadas a regiones constantes humanas.

El término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena ligera y pesad a de una especie, pero en el cual las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL son reemplazadas con secuencias CDR de otras especies, tal como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena ligera y pesada en la que una o más de CDRs de murino (por ejemplo CDR3) se han reemplazado con secuencias CDR humanas.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena ligera y pesada de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en la cual al menos una porción de la secuencia VH y/o VL ha sido alterada por ser más "tipo-humano", es decir, más similar a las secuencias variables de lí nea germinal humana . Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en cuyas las secuencias CDR humanas se introducen en secuencias VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias CDR no humanas correspondientes. También "anticuerpo human izado" es un anticuerpo o u na variante, derivado, análogo o su fragmento que une inmu noespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región de marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de am inoácidos de un anticuerpo humano y un CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. El término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR q ue tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 80%, al menos 85% , al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende substancialmente todos de al menos uno, y usualmente dos, dominios variables (Fab, Fab' , F(ab' )2 , FabC, Fv) en que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una ¡nmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o substancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de ¡nmunog lobulina humana . En una modalidad, un anticuerpo humanizado comprende también al menos una porción de una región Fe de ¡nm unoglobulina, normalmente de una ¡ nmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera así como al menos el domin io variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede inclu ir las regiones CH 1 , articu lación, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena ligera human izada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado sólo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o cadena pesada humanizada.

Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "etiquetado de Kabat" se usan indistintamente en este documento. Estos términos, que son reconocidos en la técnica , se refieren a un sistema de numeración de residuos de am inoácidos que son más variables (es decir hipervariables) diferentes de otros residuos de aminoácidos en las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo, o su porción de unión de antígeno (Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad., Sci. 190:382-391 y, Kabat, E.A., et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable varía de posiciones 31 a 35 de aminoácido para CDR1, posiciones 50 a 65 de aminoácido para CDR2, y posiciones 95-102 de aminoácido para CDR3. Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable varía de posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2 y posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.

El término "CDR" se refiere a la región de determinación de complementariedad dentro de secuencias variables de anticuerpo. Existen tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que son designadas CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "conjunto de CDR" se refiere a un grupo de tres CDRs que ocurre en una región variable sencilla capaz de unir el antígeno. Se han definido los límites exactos de estos CDRs diferentes de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no sólo proporciona un residuo inequívoco que numera el sistema aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, pero también proporciona límites de residuos precisos que definen las tres CDRs. Estas CDRs pueden ser referidas como para CDRs de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk ( 1 987) J . Mol . Biol . 1 96: 901 -917 ; Chothia et al . (1 989) Nature 342: 877-883) encuentra que ciertas sub-porciones dentro de CDRs de Kabat adoptan conformaciones de cadena pri nci pal de péptido casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad en el nivel de secuencia de aminoácidos. Estas sub-porciones se designan como L 1 , L2 y L3 o H 1 , H2 y H3 donde la "L" y la " H" designan las regiones de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden referirse como CDRs Chothia, que tiene lím ites que se traslapan con CDRs de Kabat. Otros l ímites que definen CDRs se superponen con las CDRs de Kabat han sido descritos por Padlan ( 1 995) FASEB J . 9: 1 33-139 y MacCallum ( 1 996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45). Todavía otras definiciones de límite de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas aquí, pero no obstante se superponen con los CDRs de Kabat, aunque puede ser acortado o alargado en vista de la predicción o resultados experimentales que residuos particulares o grupos de residuos o incl uso CDR completa no impacta significativamente la unión de antígeno. Los métodos utilizados en este documento pueden uti lizar C DRs que definen de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas modalidades utilizan Kabat o Chothia definen CDRs.

El término "marco" o "secuencia de marco" se refiere a las secuencias restantes de una región variable menos las CDRs. Porque la definición exa cta de una secuencia de CDR puede determinarse por diferentes sistemas , el significado de una secuencia de marco es sujeto a interpretaciones diferentes correspondientemente. Las seis CDRs (CDR-L 1 , -L2 y -L3 de cadena ligera y CDR-H 1 - H2 y - H3 de cadena pesada) también dividen las regiones de marco en la cadena ligera y cadena pesada en cuatro subregiones (FR1 , FR2, FR3 y FR4) de cada cadena, en donde CDR1 se sitúa entre FR 1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR 1 , FR2, FR3 o FR4, una región de marco, mencionada por otros, representa FR combinados dentro de la región variable de una cadena sencilla de inmunoglobulina de origen natural. FR representa una de las cuatro sub-regiones y FRs representa dos o más de las cuatro sub-regiones que constituyen una región de marco.

El término "gene de anticuerpo de línea germinal" o "fragmento genético" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por célu las no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que conduce al reordenamiento genético y m utación para la expresión de una inmunoglobulina particular. (Véase, por ejemplo, Shapiro et al . , (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3) : 183-200; Marchalonis et al (2001 ) Adv. Exp. Med . Biol . 484: 1 3-30). Una de las ventajas proporcionadas de diversas modalidades deriva del reconocimiento que genes de anticuerpos de l ínea germinal son más probables que los genes de anticuerpo maduro para conservar las características de estructuras de secuencia de aminoácidos esenciales de los individuos en las especies, por lo tanto menos propensas a ser reconocidas a partir de una fuente extranjera cuando se usa terapéuticamente en esta especie.

El término "neutralización" se refiere a contrarrestar la actividad biológica de un antígeno cuando una proteína de u nión se une específicamente al antígeno. En una modalidad, la neutralización de proteína de u nión se une a la citoquina y reduce su actividad biológica por al menos aproximadamente 20% , 40% , 60% , 80%, 85% o más.

El término "actividad" incluye actividades tal como la especificidad de unión y la afinidad de una proteína de unión a DVD para dos o más antígenos.

El térm ino "epítope" incluye cualquier determinante de polipéptido capaz de unión específica a una inmunoglobulina o receptor de célula T. En ciertas modalidades, determinantes de epítope incluyen agrupaciones de superficies químicamente activas de moléculas tal como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de la carga específica. Un epítope es una región de un antígeno que está un ida por un anticuerpo. U n epítope así consta de los residuos de aminoácidos de una región de un antígeno (o su fragmento) conocido para unir con el sitio complementario en la pareja de unión específica. Un fragmento antigénico puede contener más de un epítope. En ciertas modalidades, un anticuerpo u ne específicamente a un antígeno cuando reconoce su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Anticuerpos "un idos con el m ismo epítope" si los anticuerpos compiten cruzados (uno evita la un ión o efecto de modulación del otro) . Además las definiciones estructurales de epítopos (superpuestos, sim ilares, idénticos) son informativas, pero definiciones funcionales son a menudo más relevantes que las que incluyen parámetros estructurales (enlace) y funcionales (modulación , competición) .

El término "resonancia de plasmón superficial", como se usa aquí, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones bioespécificas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo utilizando el sistema BIAcore® (BIAcore I nternational AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden y Piscataway, NJ) . Para descricpiones adicionales, véase Jónsson et al. ( 1993) Ann . Biol. Clin . 51 : 19-26; Jónsson .

El térm ino "KaSoc" se refiere a la constante de velocidad de asociación de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) al antígeno para formar, por ejemplo, complejo como anticuerpo/antígeno es conocido en la técnica. La "Ka Soc" también es conocida por los términos "constante de velocidad de asociación", o "ka", como se utiliza intercam biablemente aquí . Este valor ind ica la velocidad de unión de un anticuerpo a su antígeno objetivo o la velocidad de formación de complejo entre un anticuerpo y antígeno también se muestra por la sig uiente ecuación: Anticuerpo ("Ab") + antígeno ("Ag")?Ab-Ag.

El término " OÍSOC" se refiere a la constante de velocidad de disociación , o "constante de velocidad de disociación", de una proteína de unión (por ejem plo, un anticuerpo) de, por ejemplo, complejo de anticuerpo/antígeno como es conocido en la técnica. La "Kdisoc" también es conocida por los términos "constante de velocidad de disociación" o " kd" como se utiliza indistintamente aquí. Este valor indica la velocidad de disociación de un anticuerpo de su antigeno objetivo o separación del complejo Ab-Ag en el tiempo en anticuerpo libre y antígeno como se muestra en la siguiente ecuación: AB + Ag-»Ab-Ag Los términos "KD" y la "constante de disociación de equilibrio" y se refiere al valor obtenido en una medición de valoración en el equilibrio, o al dividir la constante de velocidad de disociación (kdisoc) por la constante de velocidad de asociación ( ka Soc) - La constante de velocidad de asociación, la constante de velocidad de disociación y la constante de disociación de equilibrio, se utilizan para representar la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. Métodos para la determinación de constantes de velocidad de asociación y disociación son conocidos en la técnica. Utilizando técnicas basadas en fluorescencia ofrece alta sensibilidad y la capacidad de examinar muestras en reguladores de pH fisiológicos en el equilibrio. Otros métodos experimentales e instrumentos tal como un ensayo de BIAcore® (análisis de interacción biomolecular), pueden ser utilizados (por ejemplo, instrumento disponible de BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Adicionalmente, un ensayo inExA® (ensayo de exclusión cinética), disponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho), también puede ser utilizado.

El término "enlazado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "enlazada operablemente" a una secuencia de codificación es ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra en condiciones compatibles con las secuencias se control . Secuencias "operablemente enlazadas" incluyen secuencias de control de expresión que son contiguas con el gene de interés y secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gene de interés. El término "secuencia de control de expresión" como se utiliza aquí se refiere a secuencias de polinucleótido que son útiles para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación que están ligadas. Secuencias de control de expresión incluyen la iniciación de transcripción apropiada, terminación , secuencias de promotor y potenciador; señales de procesam iento de RIMA eficientes tal como señales de poliadenilación y división; secuencias q ue estabilizan m RNA citoplasmático; secuencias que incrementan la eficiencia de traducción (es decir, la secuencia de consenso Kozak) ; secuencias que incrementan la estabilidad de proteína ; y cuando se desee, secuencias que incrementan la secreción de la proteí na. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedero; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión ribosomal, y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, por lo general , dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. El térm ino "secuencias de control" pretende incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias de líder y secuencias de pareja de fusión .

El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera") , está destinado para hacer referencia a una celda en la que se ha introducido DNA exógeno. En una modalidad , la célula hospedera comprende dos más anticuerpos de codificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, múltiples) , tal como las células hospederas descritas en Patente de E . U .A. No. 7,262, 028, por ejemplo. Debe entenderse que dichos términos están destinados para referirse no sólo a la célula objetivo particular, sino también a la progen ie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en las sucesivas generaciones debido a la mutación o influencias ambientales, dicha progenie de hecho, no podrá ser idéntica a la célula de origen, pero están todavía incluidas en el alcance del término "célula hospedera" como se usa aquí . En una modalidad , células huésped incluyen células procariotas y eucariotas seleccionadas desde cualquiera de los reinos de la vida . En otra modalidad, células eucariotas incluyen células protistas, fúngicas, de plantas y animales. En otra modalidad , células huésped incluyen pero no están limitadas a la línea de célula procariota E . coli ; líneas celulares de mam ífero CHO, H EK 293, COS , NSO, SP2 y PER. C6; la línea celular de insectos Sf9; y el célula fúng ica Saccharomyces cerevisiae.

Pueden uti lizarse técnicas estándares para DNA recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo de tejido y transformación (por ejem plo, electroporación , lipofección). Reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden ser realizadas de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como comúnmente se realiza en la técnica o como se describe aquí. Las técnicas anteriores y los procedimientos pueden realizarse generalmente de acuerdo con los métodos convencionales bien sabidos en la técn ica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que son citadas y discutidas a lo largo de la presente especificación. Véase por ejemplo, Sambrook et al . MO LECULAR CLON I NG : A LABORATORY MAN UAL (2d ed . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N .Y. ( 1 989)), que se incorpora aquí para referencia para cualquier propósito.

"Valor predeterminado" y "nivel predeterm inado " se refieren generalmente un valor de corte de ensayo que se utiliza para evaluar los resultados de diagnóstico/pronóstico/eficacia terapéutica mediante la comparación de los resultados del ensayo contra el corte/nivel predeterm inado, donde el corte/nivel predeterminado ya ha enlazado o asociado con distintos parámetros clínicos (por ejemplo, la gravedad de la enfermedad , progresión/no progresión/mejora, etc. ) . Aunque la presente descripción puede proporcionar niveles predeterminados ejemplares, es bien conocido que los valores límite pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, anticuerpos empleados, etc. ) . Está más bien dentro de la habil idad ordinaria de una persona en la técnica adaptar la descripción aquí para otros inmunoensayos para obtener valores de corte específicos de inmunoensayo para aquellos otros inmunoensayos basados en esta descripción. Considerando que el valor preciso del corte/nivel predeterminado puede variar entre ensayos, correlaciones como se describe aquí (si existe) pueden ser generalmente aplicables.

"Reactivo de pre-tratamiento", por ejemplo, lisis, reactivo de precipitación y/o solubilización, como se utiliza en un ensayo de diagnóstico como se describe aquí es uno que lisa cualquiera de las células y/o solubiliza cualquier analito que esté presente en una muestra de prueba. Pre-tratamiento no es necesario para todas las muestras, como se describe aquí. Entre otras cosas, solubilización del analito (por ejemplo, polipéptido de interés) puede implicar la liberación del analito de cualquiera de las proteínas de unión endógenas presentes en la muestra. Un reactivo de pre-tratamiento puede ser homogéneo (no requieren un paso de separación) o heterogéneo (que requieren un paso de separación). Con el uso de un reactivo de pre-tratamiento heterogéneo existe eliminación de cualquiera de las proteínas de unión del analito precipitado de la muestra de prueba antes de proceder al siguiente paso del ensayo.

"Reactivos de control de calidad" en el contexto de inmunoensayos y kits descritos aquí, incluyen, pero no se limitan a, calibradores, controles y paneles de sensibilidad. Normalmente se utiliza una "calibrador" o "estándar" (por ejemplo, uno o más, tal como una pluralidad) con el fin de establecer las curvas de calibración (estándar) para la interpolación de la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. Alternativamente, puede utilizarse un calibrador sencillo, q ue está cerca de un determinado corte positivo/negativo. Calibradores múltiples (es decir, más de un calibrador o una cantidad variable de ca libradores pueden usarse en conjunción con el fin de comprender un "panel de sensibilidad".

Los términos "específico" y "especificidad" en el contexto de una interacción entre los m iembros de un par de unión específica (por ejemplo, un antígeno (o fragmento del mismo) y un anticuerpo (o su fragmento antigénicamente reactivo)) se refieren a la reactividad selectiva de la interacción. La frase "específicamente une a" y frases análogas se refieren a la capacidad de los anticuerpos (o sus fragmentos antigénicamente reactivos) para unir específicamente al analito (o un fragmento del mismo) y no unir específicamente a otras entidades.

El térm ino "pareja de unión específica" es un miembro de un par de unión específica . Un par de unión especifica comprende dos moléculas d iferentes, que se unen específicamente entre sí a través de medios químicos o físicos. Por lo tanto, además de los pares de unión específica del antígeno y anticuerpo específico de inmunoensayos comunes , otros pares de unión específica pueden incluir biotina y avidi na (o estreptavidina), carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarios, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, inhibidores de enzima y enzimas, y lo similar. Además, los pares de unión específica pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específica originales, por ejemplo, un análogo a nalito . Los m iembros de unión específica i nmuno-reactiva incluyen antígenos, fragmentos de antígeno y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, así como complejos, fragmentos y variantes (que incluyen fragmentos de variantes) del mismo, ya sea aislado o producido de manera recombinante.

El término "variante" significa un polipéptido que difiere de un polipéptido determinado en la secuencia de aminoácidos por la adición (por ejemplo, inserción), eliminación o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que retiene la actividad biológica del polipéptido determinado (por ejemplo, una variante IL-17 puede competir con el anticuerpo anti-IL-17 para la unión a IL-17). Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente de características similares (por ejemplo, hidrofilia y grado y distribución de regiones cargadas) es reconocida en la técnica como normalmente implica un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, al considerar el gran índice hidropático de aminoácidos, como se entiende en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Es conocido en la técnica que aminoácidos de similares índices hidropáticos pueden sustituirse y conservan la función de las proteínas. En uno aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ± 2. La hidrofilicidad de aminoácidos también puede utilizarse para revelar las sustituciones que resultarían en las proteínas que retienen la función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la hidrof ilicidad promedio local mayor de este péptido, una medida útil que se ha reportado para correlacionar bien con la antigenicidad e inmunogenicidad (véase, por ejemplo, Patente de E. U .A. No. 4, 554, 101 ) . Sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad sim ilares puede resultar en péptidos que retienen actividad biológica, por ejemplo inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. En un aspecto, se realizan sustituciones con am inoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ± 2 de cada uno. El índice de hidrofobicidad y el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de este aminoácido. Consistente con esta observación, sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica se entienden que dependen de la relativa similitud de los aminoácidos y particularmente las cadenas laterales de aquellos aminoácidos, como se revela por la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga , tamaño y otras propiedades. "Variante" también puede utilizarse para describir un polipéptido o su fragmento que ha sido procesado diferencialmente, tal como por proteólisis, fosforilación, y otras modificaciones post-traduccionales, aún conserva su actividad biológica o la reactividad de antígeno, por ejemplo, la capacidad de unir a IL-18. Uso de "variante" aqu í pretende incluir fragmentos de una variante a menos que se contradiga por el contexto. 1 ) Generación de proteína de unión de DVD Se proporcionan proteínas de unión de dominio variable dual capaces de unir a TNF y métodos para hacer las mismas. La proteína de unión puede generarse utilizando diversas técnicas. Vectores de expresión, célula hospedera y métodos de generación de la proteína de unión se proporcionan .

A) Construcción de moléculas de proteína de unión de DVD La molécula de proteína de unión de dominio variable dual (DVD) está diseñada para que dos dominios variables diferentes de cadena ligera (VL) de los dos anticuerpos monoclonales de origen diferentes están unidos en tándem directamente o a través de un enlazador corto por técnicas de DNA recombinante, seguido por el dominio constante de cadena ligera . Asimismo, la cadena pesada consta de dos dominios variables de cadena pesada (VH) enlazados en tándem , seguido por la región CH 1 y Fe de dominio constante (Figura 1 A).

Los dominios variables pueden obtenerse utilizando técnicas de DNA recombinante de un anticuerpo de origen generado por cualquiera de los métodos descritos en este documento. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada o cadena ligera de murino. En otra modalidad, el dominio variable es una CDR injertada o un dominio de cadena pesada o ligera variable humanizado. En una modalidad , el dominio variable es un dominio variable de cadena pesada o ligera humano.

En una modalidad el primeros y segundo dominios variables están enlazados directamente entre si usando técnicas de DNA recombinante. En otra modalidad los dom inios variables están enlazados a través de una secuencia enlazadora. En una modal idad , dos dominios variables están enlazados. Tres o más dominios variables también pueden unirse directamente o a través de una secuencia enlazadora. Los dominios variables pueden unir el mismo antígeno o pueden unir diferentes antígenos. En algunas modalidades, las moléculas de proteína de unión de DVD pueden incluir un dominio variable de inmunoglobulina y un dominio variable no de inmunoglobulina tal como dominio de unión de ligando de un receptor, dominio activo de una enzima. Las moléculas de proteína de unión de DVD también pueden comprender 2 o más dominios no Ig.

La secuencia enlazadora puede ser un aminoácido sencillo o una secuencia de polipéptido. En una modalidad, las secuencias enlazadoras son: AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27); y ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28). La elección de secuencias enlazadoras se basa en el análisis de estructura de cristal de varias moléculas Fab. Existe un enlace flexible natural entre el dominio variable y el dominio constante de CH1/CL en Fab o estructura molecular de anticuerpo. Este enlace natural comprende aproximadamente 10-12 residuos de aminoácidos, contribuidos por 4-6 residuos de C-término de dominio V y 4-6 residuos de N-término de dominio CL/CH1. Proteína de unión de DVD Igs se genera usando 5-6 residuos de aminoácidos N-terminales, o residuos de aminoácidos de 11-12, de CL o CH1 como enlazador en cadena ligera y cadena pesada de proteína de unión a DVD, respectivamente. Los residuos N-terminales de dominios CL o CH1, particularmente los primeros 5-6 residuos de aminoácidos, adoptan una conformación de lazo sin fuertes estructuras secundarias, por lo tanto, pueden actuar como enlazadores flexibles entre los dos dominios variables. Los residuos N-terminales de dominios CL o CH1 son una extensión natural de los dominios variables, ya que son parte de las secuencias Ig, por lo tanto minimizan en gran medida cualquier inmunogenicidad potencialmente derivada de los enlazadores y uniones.

Otras secuencias enlazadoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud de dominio CL/CH1 pero no todos los residuos del dominio CL/CH1; por ejemplo los primeros 5-12 residuos de aminoácidos de los dominios CL/CH1; los enlazadores de cadena ligera pueden ser de CK o CX; y los enlazadores de cadena pesada pueden derivarse de CH1 de cualquiera de los isotipos, incluyendo Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Cal , Ca2, C5, Ce y ?µ. Secuencias enlazadoras también pueden derivarse de otras proteínas tal como proteínas tipo Ig , (por ejemplo, TCR, FcR, KI R) ; secuencias basadas en G/S (por ejemplo, repeticiones G4S; SEQ I D NO: 29) ; secuencias derivadas de la región de articulación; y otras secuencias naturales de otras proteínas.

En una modalidad un dominio constante está enlazado a los dos dominios variables enlazados utilizando técnicas de DNA recombinante. En una modalidad, secuencia que comprende dominios variables de cadena pesada enlazados está enlazada a un dominio constante de cadena pesada y secuencia q ue comprende dominios variables de cadena ligera enlazados está enlazada a un dom inio constante de cadena ligera. En una modalidad , los dominios constantes son dominio constante de cadena pesada humano y dominio constante de cadena ligera humano, respectivamente. En una modalidad, la cadena pesada de DVD está enlazada adicionalmente a una región Fe. La región Fe puede ser región Fe de secuencia nativa , o una región Fe variante . En otra modalidad , la región Fe es una región Fe humana. En otra modalidad la región Fe incluye la región Fe de lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, Ig M, IgE o IgD.

En otra modalidad dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de cadena ligera se combinan para formar una molécula de proteína de unión de DVD. El cuadro 1 enumera las secuencias de aminoácidos de regiones VH y VL de anticuerpos ejemplares para objetivos útiles para tratar la enfermedad , por ejemplo, para tratar el cáncer. En una modalidad , se proporciona una DVD que comprende al menos dos de las regiones VH y/o VL enumeradas en el cuadro 1 , en cualquier orientación. En algunas modalidades, VD1 y VD2 se eligen de forma independiente. Por lo tanto, en algunas modalidades, VD 1 y VD2 comprenden la misma SEQ I D NO y, en otras modalidades, VD 1 y VD2 comprenden diferentes S EQ I D NOS. Las secuencias de dominio VH y VL proporcionadas anteriormente comprenden la región de determinación complementaria (CDR) y secuencias de marco que son conocidas en la técnica o fácilmente discernibles utilizando métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, una o más de estas CDR y/o secuencias de marco se sustituyen, sin pérdida de la función , por otras CDR y/o secuencias de marco de proteínas de unión que son conocidas en la técnica para unir al mismo antígeno.

CUADRO 1 Lista de secuencias de aminoácido de regiones VH y VL de anticuerpos para generación de proteínas de unión a DVD Se muestran tres variantes diferentes anti-I L-1 7 en el Cuadro 1 A (sec. 1 , sec. 2 y sec. 3) CUADRO 1A Ciertas regiones VH y VL que unen Los Cuadros 1 B y 1 C proporcionan las secuencias de VH y VL de anticuerpos monoclonales anti-TNF humano completamente humanos, aislados mediante tecnologías de expresión in vitro a partir de bibliotecas de anticuerpos humanos, por su capacidad de unirse a proteínas de TNF humano recombinante.

CUADRO 1 B Secuencias de VH anti-TNF-a humano completamente humanas individuales CUADRO 1 C Secuencias de VL anti-TNF-a humano completamente humanas individuales Los cuadros a 1D y 1E continuación proporcionan una lista de anticuerpos MAK-195 anti-TNF humanizados que se convirtieron en proteínas IgG para caracterización, ambas secuencias VH y VL.

CUADRO 1 D Secuencias VH de anticuerpos MAK-195 anti-TNF humanizados clones convertidos de IgG CUADRO 1E Secuencias VL de anticuerpos AK-195 anti-TNF humanizados clones convertidos de IgG Los cuadros a continuación proporcionan una lista de anticuerpos MAK-1 99 humanizados que son convertidos en proteínas IgG para caracterización, ambas secuencias VH y VL.

CUADRO 1 F Secuencias VH de anticuerpos MAK-199 anti-TNF humanizados clones convertidos de IgG CUADRO 1G Secuencias VL de anticuerpos MAK-199 anti-TNF humanizados clones convertidos de IgG Los siguientes cuadros proporcionan secuencias de anti-IL- de clones convertidos.

CUADRO 1 H Secuencias VH de anticuerpos anti-IL-17 individuales de clones convertidos para generar proteínas de unión de DVD CUADRO 11 Secuencias VL de anticuerpos anti-I L-17 de clones convertidos para generar proteínas de unión de DVD Descripción detallada de moléculas de proteína de unión de DVD específicas capaces de enlazar objetivos específicos, y métodos para hacer las mismas, se proporcionan en la sección de ejemplos posteriores .

B) producción de proteínas de unión de DVD Las proteínas de unión establecidas aqu í pueden ser producidas por cualquiera de una serie de técnicas conocidas en la técnica . Por ejem plo, la expresión de las células huésped , donde el o los vectores de expresión de cod ificación de las cadenas l igeras de DVD y pesadas de DVD se transfectaron en una célula huésped por técnicas estándares. Las diversas formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente util izadas para la introducción de DNA exógeno en una célula hospedera procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación , precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y sim ilares. Aunque es posible expresar las proteí nas de unión de DVD proporcionadas aquí en cualquiera de las células huésped procariotas o eucariotas, proteínas DVD están expresadas en las célu las eucariotas, por ejemplo, las células h uésped de mamífero, ya que esas células eucariotas (y en particular células de mam ífero) es más probables a diferencia de las células procariotas que monten y secreten una proteína DVD correctamente plegada e inmunológicamente activa.

Las cél ulas huésped de mam ífero ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes proporcionados aquí incluyen ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin ( 1 980) Proc. Nati . Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizado con u n marcador seleccionable DH FR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp ( 1 982) Mol . Biol. 1 59:601 -621 ), células de mieloma NS0, células COS , SP2 y cél ulas PER.C6. Cuando vectores de expresión recombinante de codificación de proteínas de DVD se introducen en las células huésped de mamífero, las proteínas DVD son producidas por el cultivo de las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión de las proteínas DVD en las células h uésped o secreción de las proteí nas DVD en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Proteínas DVD se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas estándares.

En un sistema ejemplar de expresión recombinante de proteínas DVD provistas aquí , un vector de expresión recombinante de codificación de la cadena pesada de DVD y la cadena ligera de DVD se introduce en las células de dhfr-CHO por transfección mediada con fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recom binante, los genes de cadena ligera y pesada de DVD están cada uno operativamente enlazado con potenciador CMV/elementos reguladores promotores AdMLP para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también l leva un gene DH FR, que permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector mediante selección/amplificación de metotrexato. Se cultivan las células huésped transformantes seleccionadas para perm itir la expresión de las cadenas ligera y pesada de DVD y la proteína DVD intacta es recuperada desde el medio de cultivo. Técnicas estándares de biología molecular se utilizan para preparar el vector de expresión recom binante, transfectar las células huésped , seleccionar transformantes, cultivar las células huésped y recuperar la proteína DVD del medio de cultivo. También se proporciona un método de síntesis de una proteína DVD provista aquí por el cultivo de una célu la h uésped proporcionada aqu í en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetice una proteína DVD. El método puede comprender además aislar la proteí na DVD del medio de cultivo.

Una característica importante de proteína de unión de DVD es que puede ser producida y purificada de manera similar como un anticuerpo convencional . La producción de proteína de unión de DVD resulta en un prod ucto im portante homogéneo, sencillo con actividad específica dua l deseada, sin ninguna modificación de secuencia de la región constante o modificaciones qu ímicas de ningún tipo. Otros métodos anteriormente descritos para generar proteínas de unión de longitud completa "bi-específica", "m ulti-específica" y "multivalente multi-específíca" no conducen a un solo producto primario pero en cambio conducen a la producción intracelular o secretada de una mezcla de proteínas de unión de longitud com pleta inactivas ensambladas, mono-específicas, multi-específicas, multiva lentes , y proteínas de unión de longitud com pleta multivalentes con combinación de sitios de enlace diferentes. Como un ejemplo, basado en el diseño descrito por iller y Presta (Publicación PCT No. WO2001 /077342), hay 1 6 combinaciones posibles de las cadenas ligeras y pesadas. En consecuencia sólo el 6.25% de proteína es muy probable que esté en la forma activa deseada y no como un solo producto primario o único producto primario en comparación con las otras 15 combinaciones posibles. Separación de las formas completamente activas, deseadas de la proteína de formas inactivas y parcialmente activas de la proteína mediante técn icas de cromatografía estándar, normalmente utilizadas en la fabricación de gran escala , todavía está por demostrarse.

Sorprendentemente el diseño de las "proteí nas de unión de longitud completa m ultivalentes dual específica" provisto aquí conduce a una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable doble que monta principalmente a las "proteínas de unión de longitud completa multivalente dual específica".

Al menos 50%, al menos 75% y al menos 90% de las moléculas de inmunoglobulina de dominio variable duales montadas y expresadas son la proteína deseada tetravalente dual específica. Esta modalidad particularmente mejora la utilidad comercial. Por lo tanto, se proporciona un método para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una sola célula que conduce a un solo producto primario de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente dual específica".

Métodos de expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una sola célula que conduce a un "producto primario" de una " proteína de unión de longitud completa tetravalente dual específica", donde el "producto primario" es más del 50%, tal como más del 75% y más del 90%, de toda la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual se proporcionan.

I I) Proteínas de unión de DVD derivadas Una modalidad proporciona una proteína de unión etiquetada en donde la proteína de unión es derivada o enlazada a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión etiquetada se puede derivar por medio de enlace funcionalmente a una proteína de unión proporcionada aquí (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra) a una o más entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo bi-específico o un di-acuerpo) , un agente detectable , un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación de la proteína de unión con otra molécula (como una región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina). Enfoques a proteínas de derivación son ejemplificados en la técnica y en la habilidad de la persona de experiencia en la técnica.

I I I) Usos de proteínas de unión de DVD Dada su capacidad para enlazar a dos o más antígenos las proteínas de unión proporcionadas aquí pueden util izarse para detectar los antígenos (por ejemplo, en una m uestra biológica, como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, tales como ensayos inmunosorbentes enlazado a enzima (ELISA) , un radio-inmunoensayo (RIA) o inm unohistoquímica de tejido. La proteína de un ión de DVD está etiquetada directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Sustancias detectables convenientes incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materia les lum iniscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas convenientes incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina , ß-ga lactosidasa o acetilcolinesterasa ; ejem plos de complejos del grupo prostético conveniente incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radiactivo apto incluyen, 14C, 35S, 90Y, "Te, 1 1 1 ln, 125l , 131 l, 77Lu, 66Ho, or 153Sm.

En una modalidad, las proteínas de unión proporcionadas son capaces de neutralizar la actividad de los antígenos tanto in vitro como in vivo. En consecuencia, estas proteínas de unión de DVD pueden utilizarse para inhibir la actividad de antígeno, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene los antígenos, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que tienen los antígenos con los cuales una proteína de unión proporcionada aquí reacciona de manera cruzada. En otra modalidad, se proporciona un método para reducir la actividad de antígeno en un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno en donde la actividad de antígeno es perjudicial. Una proteína de unión proporcionada aquí puede ser administrada a un sujeto humano con fines terapéuticos.

El término "un trastorno en el que la actividad de antígeno es perjudicial" pretende incluir las enfermedades y otros trastornos en los que la presencia del antígeno en un sujeto que padece el trastorno ha demostrado ser o se sospecha que es responsable de la fisiopatología del trastorno o un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. En consecuencia, un trastorno en donde la actividad de antígeno es perjudicial es un trastorno en donde la reducción de la actividad de antígeno se espera que alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Tales trastornos pueden probarse, por ejemplo, por un aumento en la concentración del antígeno en un fluido biológico de un sujeto que padece del trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentración de antígeno en suero, plasma, líquido sinovial, etc. del sujeto). Ejemplos no limitantes de los trastornos que pueden tratarse con las proteínas de unión proporcionadas aquí incluyen aquellos trastornos que se discuten a continuación y en la sección relativa a las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de unión .

Las proteínas de unión de DVD son útiles como agentes terapéuticos para bloquear simultáneamente dos objetivos diferentes para mejorar la eficacia/seguridad y/o aumentar la cobertura del paciente. Dichos objetivos pueden incluir objetivos solubles (TNF) y objetivos de receptor de superficie celular (VEGFR y EGFR) . También puede utilizarse para inducir citotoxicidad re-direccíonada entre células tumorales y células T (Her2 y CD3) para la terapia del cáncer, o entre células auto-reactivas y células efectoras para la enfermedad autoinmune o trasplante o entre cualquier célula objetivo y célula efectora para elimi nar las células causantes de enfermedades en cualquier enfermedad dada .

Además, puede utilizarse la proteína de unión de DVD para disparar el agrupamiento del receptor y activación cuando está diseñado para dirigir dos epítopes diferentes en el mismo receptor. Esto puede tener beneficios en la fabricación de terapias anti-GPCR agonísticas y antagon ísticas . En este caso, la proteína de unión de DVD puede utilizarse para dirig ir dos epítopes d iferentes (incluidos los epítopes en las regiones de bucle y el dominio extracelular) en u na célula para el agrupam iento/señalización (dos moléculas de superficie celular) o señalización (en una molécula) . Asimismo, una molécula de proteína de unión de DVD puede diseñarse para disparar la ligación de CTLA-4 y una señal negativa al dirigir dos diferentes epítopes (o 2 copias del mismo epítope) del dominio extracelular de CTLA-4 , llevando a la sub-regulación de la respuesta inmune. CTLA-4 es un objetivo cl ínicamente validado para el tratamiento terapéutico de una serie de trastornos inmunológ icos. Interacciones de CTLA-4/B7 regulan negativamente la activación de células T atenuando la progresión del ciclo celular, producción de I L-2 y la proliferación de células T tras la activación , y acoplam iento de CTLA-4 (CD 1 52) puede sub-regu lar la activación de células T y promover la inducción de tolerancia inmunológica. Sin embargo, la estrategia de atenuar la activación de células T por acoplamiento de anticuerpo agonístico de CTLA-4 no ha tenido éxito ya que la activación de CTLA-4 requiere ligación . La interacción molecular de CTLA-4/B7 es en arreglos " cremallera sesgada", como lo demuestra el anál isis estructural de cristal (Stamper 2001 Nature 410:608) . Sin embargo, ninguno de los reactivos de enlace de CTLA-4 disponibles en la actual idad tienen propiedades de ligación , incluyendo mAbs anti-CTLA-4. Ha habido varios intentos para abordar esta cuestión . En un caso, un anticuerpo de cadena simple en lazado a miembros celulares se generó y significativamente inhibió el rechazo alogén ico en ratones (Hwang 2002 J l 1 69 : 633). En un caso separado, a nticuerpo de cadena sencilla enlazado a la superficie APC artificial a CTLA-4 fue generado y demostrado para atenuar las respuestas de células T (Griffin 2000 J l 164:4433). En ambos casos, la ligación de CTLA-4 se logró por anticuerpos de unión a miembros estrechamente localizados en sistemas artificiales. Mientras que estos experimentos proporcionan prueba de concepto para la sub-regulación inmune accionando la señalización negativa CTLA-4, los reactivos utilizados en estos informes no son adecuados para uso terapéutico. Con este fin, la ligación de CTLA-4 puede lograrse mediante el uso de una molécula de proteína de unión de DVD, que dirigen dos epítopes diferentes (o 2 copias del mismo epítope) del dominio extracelular de CTLA-4. La razón es que la distancia que abarca dos sitios de unión de una IgG , aproximadamente 150-1 70A, es demasiado grande para la ligación activa de CTLA-4 (30-50 A entre 2 homodímeros de CTLA-4) . Sin embargo, la distancia entre los sitios de unión de dos en la proteína de unión de DVD- (un brazo) es mucho más corta, también en el rango de 30-50 A, permitiendo la correcta ligación de CTLA-4.

Asimismo, proteína de unión de DVD puede dirigir dos miem bros diferentes de un complejo de receptor de superficie celular (por ejemplo, I L- 12R alfa y beta) . Además, proteína de unión de DVD puede dirigir CR1 y una proteína soluble/patógeno para accionar la evacuación rápida de la proteína soluble objetivo/patógeno.

Además, proteí nas de proteína de DVD proporcionadas aqu í pueden ser empleadas para la entrega específica de tej idos (dirigir un marcador de tejido y un mediador de enfermedad para PK local mejorada así una mayor eficacia y/o menor toxicidad), incluyendo la entrega intracelular (direccionando un receptor de intemalización y una molécula intracelular), entregando al interior del cerebro (dirigiendo el receptor de transferrina y un mediador de enfermedad de CNS para cruzar la barrera sangre-cerebro) . La proteína de unión de DVD puede servir también como proteína portadora para entregar un antígeno a un lugar específico a través del enlace a un epítope no neutralizante de ese antígeno y también para aumentar la vida media del antígeno. Además, la proteína de unión de DVD puede diseñarse para enlazarse físicamente a dispositivos médicos implantados en pacientes o dirigir estos dispositivos médicos (véase Burke et al (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3) : 437-446; Hildebrand et al . (2006) Surface and Coatíngs Technol . 200(22-23) : 6318-6324; Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27( 1 1 ) : 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen . Med. 377-397) . Brevemente, el direccionamiento de tipos apropiados de células al sitio de implante médico puede promover la curación y restauración de la función normal del tejido. Alternativamente, la inhibición de mediadores (incluyendo pero no limitado a las citoqu inas), liberada a la implantación del dispositivo por un DVD acoplado a o dirigido a un dispositivo también se proporciona. Por ejemplo, Stents se han usado por años en cardiología intervencionista para despejar las arterias bloqueadas y mejorar el flujo de sangre al m úsculo cardíaco. Sin embargo, los stents de metales desnudos tradicionales se han conocido por causar restenosis (reestrechamiento de la arteria en u n área tratada) en algunos pacientes y puede llevar a coágulos de sangre. Recientemente, se ha descrito un stent recubierto con anticuerpos anti-CD34 que reduce la restenosis y evita que coágulos de sangre ocurran al capturar las células endoteliales progenitoras (CEP) circulando por toda la sangre. Las células endoteliales son células que recubren los vasos sanguíneos, permitiendo que la sangre fluya uniformemente. Las EPC se adhieren a la superficie dura del stent formando una capa lisa que no sólo promueve la cura sino que previene la restenosis y coágulos de sangre, las complicaciones previamente asociadas con el uso de stents (Aoji et al (2005) J . Am. Coll Cardiol. 45(1 0): 1 574-9) . Además de mejorar los resultados en pacientes que requieren stents, también hay repercusiones en pacientes que requieran cirugía de derivación cardiovascular. Por ejemplo, un conducto vascular protésico (arteria artificial) recubierto con anticuerpos anti-EPC que elim inarían la necesidad de util izar las arterias de las piernas de los pacientes o los brazos para injertos de cirugía de derivación. Esto reduciría tiempos de cirugía y anestesia, que a su vez reducirá las muertes por cirugía coronaria . Proteina de unión de DVD están diseñados de tal manera que se une a un marcador de superficie cel ular (como CD34) así como una proteína (o un epítope de cua lquier tipo, incl uyendo pero no limitado a las proteínas, lípidos y polisacáridos) que se ha recubierto en el dispositivo implantado para facilitar la contratación de células. Estos enfoques pueden también aplicarse a otros implantes médicos en general. Alternativamente, proteínas de unión de DVD pueden estar revestidas en dispositivos médicos y sobre la implantación y liberación de todos los DVD del dispositivo (o cualquier otra necesidad que requiera proteínas de unión de DVD frescas adicionales, incluyendo el envejecimiento y la desnaturalización de la proteína de unión de DVD ya cargada) el dispositivo podría ser recargado por la administración sistémica de proteína de unión de DVD fresca para el paciente, donde la proteína de unión de DVD está diseñada para unirse a un objetivo de interés (una citoquina, un marcador de superficie celular (como CD34) etc.) con un conjunto de sitios de unión y a un objetivo cubierto en el dispositivo (incluyendo una proteína, un epítope de cualquier tipo, incluyendo pero no limitado a lípidos, polisacáridos y polímeros) con el otro. Esta tecnología tiene la ventaja de ampliar la utilidad de los implantes recubiertos.

C) Uso de proteínas de unión de DVD en diversas enfermedades Las moléculas de proteína de unión de DVD proporcionadas aquí también son útiles como moléculas terapéuticas para tratar diversas enfermedades. Estas moléculas de DVD pueden unirse a uno o más objetivos involucrados en una enfermedad específica. A continuación se describen ejemplos de tales objetivos en diversas enfermedades. 1 ) Respuesta humana autoinmune e inflamatoria TNF juega un papel fundamental en la patología asociada con una variedad de enfermedades que implican elementos inmunes e inflamatorios, como enfermedades autommunes, especialmente aquellas asociados con la inflamación , incluyendo la enfermedad de Crohn , psoriasis (incluida la psoriasis en placa) , artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis psorática , osteoartritis o artritis idiopática juvenil) , esclerosis mú ltiple y espondilitis anquilosante. Por lo tanto, las proteínas de unión en este documento pueden uti lizarse para el tratamiento de estos trastornos. También están involucradas en condiciones inflamatorias y/o autoinmunes de diversos órganos. I L-1 7 se ha relacionado con muchas enfermedades relacionadas inmunes/autoinmunes incluyendo artritis reumatoide, asma, lupus, rechazo de aloinjertos e inmunidad antitumoral. 2) Asma Asma alérgica se caracteriza por la presencia de eosinofilia, metaplasia de células caliciformes, alteraciones de células epiteliales, hiper-reactividad de las vías respiratorias (AH R) y expresión de citoq uinas Th2 y Th 1 , así como los niveles de Ig E de suero elevado. Ahora es ampliamente aceptado que la inflamación de las vías respiratorias es el factor clave subyacente a la patogénesis del asma , que implica una com pleja interacción de células inflamatorias tales como las células T, células B, eosinófilos, mastocitos y macrófagos y de sus mediadores secretados incluyendo citoquinas y quimioquinas. Los corticosteroides son el tratamiento anti-inflamatorio más im portante para el asma en la actualidad, sin embargo, su mecanismo de acción es inespecífico y existen preocupaciones de seguridad , especialmente en la población de pacientes menores. El desarrollo de tratamientos más específicos y dirigidos por lo tanto, está garantizado.

TN F-a puede amplificar la respuesta i nflamatoria en el asma y puede estar relacionado con la severidad de la enfermedad (McDonnell et al. (2001 ) Progress Respir. Res. 31 :247-250. ).

Modelos animales como el modelo de ratón con asma inducida por OVA, donde la inflamación y AH R pueden evaluarse, son conocidos en la técnica y pueden utilizarse para determinar la capacidad de varias moléculas de proteina de unión de DVD para tratar el asma. 3) Artritis reumatoide La artritis reumatoide (RA), una enfermedad sistémica, se caracteriza por una reacción inflamatoria crónica en la sinovial de las articulaciones y se asocia con la degeneración del cartílago y la erosión del hueso juxta-articular. Muchas citoquinas pro-inflamatorias incluyendo TNF, quimioquinas y factores de crecimiento se expresan en las articulaciones enfermas. La admin istración sistémica de anticuerpo anti-TNF o proteína de fusión de sTNFR para modelos de ratón de RA demostró ser protectora anti-inflamatorio y de las articulaciones. I nvestigaciones clínicas en la que la actividad de TN F en pacientes con RA fue bloqueada con por infliximab administrada por vía intravenosa (Harriman G , Harper LK, Schaible TF. 1 999 Summary of clinical triáis ¡n rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFalpha treatment. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1 : 161 -4) , un mAb anti-TNF quimérico, ha proporcionado pruebas que TNF regula la IL-6, IL-8, MCP-1, y producción de VEGF, reclutamiento de células inmunes e inflamatorias en las articulaciones, angiogénesis y reducción de los niveles sanguíneos de metaloproteinasas- y -3 de matriz. Una mejor comprensión de la vía inflamatoria en la artritis reumatoide ha llevado a la identificación de otros objetivos terapéuticos implicados en la artritis reumatoide. Tratamientos prometedores como antagonistas de interleucina-6 (anticuerpo de receptor de IL-6 MRA, desarrollado por Chugai, Roche (Nishimoto, Norihiro et al. (2004) Arthritis Rheum. 50(6):1761-1769), CTLA4lg (abatacept, Genovese et al. (2005) N. Engl. J. Med. 353:1 14-23.), y terapia celular anti-B (rituximab, Okamoto y Kamatani (2004) N. Engl. J. Med 351:1909) ya se ha probado en ensayos controlados aleatorios durante el año pasado. Otras citoquinas han sido identificadas y han demostrado ser de beneficio en modelos animales, incluyendo la interleucina-15 (anticuerpo terapéutico HuMax-IL_15, AMG 714 ver Baslund et al (2005) Arthritis Rheum. 52(9): 2686-2692), interleucina-17 e interleucina-18, y se están realizando ensayos clínicos de estos agentes actualmente. Terapia de anticuerpo específico dual, combinando anti-TNF y otro mediador, tiene un gran potencial en la mejora de la eficacia clínica y/o cobertura del paciente. Por ejemplo, bloqueo de TNF y VEGF puede potencialmente erradicar la inflamación y angiogénesis, los cuales están involucrados en la fisiopatología de RA. El bloqueo de otros pares de objetivos involucrados en RA, incluyendo, pero sin limitarse a, TNF e IL- 8; TNF e IL-12; TNF e IL-23; TNF e IL-1beta; TNF y MIF; TNF e IL-17; y TNF e IL-15 con proteína específica de unión de DVD tam bién se contemplan. Además de las evaluaciones de seguridad de rutina de estos pares objetivo, pruebas específicas para el grado de i nm unosupresión pueden ser garantizadas y útiles en la selección de los mejores pares objetivo (véase Luster et al (1 994) Toxicology 92( 1 -3) :229-43). Si una molécula de proteína de unión de DVD será útil para el tratamiento de la artritis reumatoide puede evaluarse utilizando modelos preclínicos de RA de animales como el modelo de ratón de artritis inducida por colágeno. Otros modelos útiles también se conocen bien en la técnica (véase Brand (2005) Comp. Med. 55(2) : 1 14-22). Basado en la reactividad cruzada de los anticuerpos parenta les para estudios de validación de otólogos humanos y de ratón (por ejemplo, reactividad para TNF humano y de ratón , I L-1 5 humano y de ratón , etc. ) en el modelo de ratón CIA pueden realizarse con moléculas de la proteína de unión de DVD derivadas de "anticuerpo suplente coincidente" ; brevemente , una proteína de unión de DVD basada en dos (o más) anticuerpos específicos objetivo del ratón puede ajustarse a la medida de lo posible a las características de los anticuerpos humanos o humanizados parentales utilizados para la construcción de proteína humana de unión de DVD (afinidad similar, potencia de neutral ización sim ilares, vida media similar etc. ). 4) Lupus eritematoso sistém ico (S LE) El sel lo de inmunopatogénico del lupus eritematoso sistém ico es la activación policlonal de células B, lo que conduce a la hiperglobulinemia , la producción de auto-anticuerpos y la formación de complejos i nm une. La anormalidad fundamental parece ser el fracaso de las células T para suprimir los clones de célula B prohibida debido a la generalizada no regulación de células T. Además, la interacción de células B y T es facilitada por varias citoquinas como I L-1 0 así como moléculas co-estimuladoras tal como CD40 y CD40L, B7 y CD28 y CTLA-4, que inician la segunda señal. Estas interacciones junto con aclarado fagocítico afectado de complejos inmunes y material apoptótico, perpetúan la respuesta inmune con lesión tlsu lar resultante. SLE es considerado un Th-2 impulsado por enfermedad con elevaciones documentadas en suero I L-4, IL-6, I L-1 0. Proteínas de unión de DVD capaces de unir uno o más objetivos tales como, por ejemplo IL-4, I L-6, I L-1 0, I FN-a o TN F-a también se contemplan . La combinación de objetivos discutidos aquí mejorará la eficacia terapéutica para SLE que puede probarse en un número de modelos preclínicos de lupus (véase Peng (2004) Methods Mol . Med 1 02: 227-72) . Basado en la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales para estudios de validación de otólogos humanos y de ratón (por ejemplo, reactividad para CD20 humano y de ratón , interferón alfa humano y de ratón etc. ) en un modelo de lupus de ratón se pueden conducir con molécu las de proteína de unión de DVD "anticuerpo suplente coincidente"; brevemente, una proteína de u nión de DVD basada en dos (o más) anticuerpos específicos de ratón objetivo pueden ajustarse a la medida de lo posible a las características de los anticuerpos humanos o humanizados parentales utilizados para construcción de proteína humana de unión de DVD (afin idad sim ilar, potencia de neutral ización sim ilar, vida med ia similar etc. ) . 5) Esclerosis múltiple (MS) Esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad de tipo autoinmune humana compleja con una etiolog ía desconocida predominantemente. Destrucción inmunológ ica de la proteína básica de mielina (MBP) en todo el sistema nervioso es la principal patología de la esclerosis m últiple. MS es una enfermedad de patologías complejas, que implica la infiltración por células T CD4+ y CD8+ y de respuesta en el sistema nervioso central . La expresión en el CNS de citoquinas, especies de nitrógeno reactivo y moléculas co-estim uladoras se han descrito en MS. De consideración importante son los mecanismos inmunológicos que contribuyen al desarrollo de la autoinmunidad. En particular, la expresión del antígeno , interacciones de citoquinas y de leucocitos y células T reguladoras, que ayudan a equilibrar/modular otras célu las T como las células Th 1 y Th2, son áreas importantes para la identificación del objetivo terapéutico.

TWEAK es un miembro de la familia de TN F, se expresa constitutivamente en el sistema nervioso central (CNS) , con efectos pro-inflamatorios, proliferativos o apoptóticos dependiendo de los tipos cel ulares. Su receptor, Fn 14, se expresa en CNS por células endoteliales, astrocitos reactivos y neuronas. TWEAK y expresión de mRNA Fn 14 aumentan en la médula espinal durante la encefalomielitis autoinmu ne experimental (EAE) . Tratamiento de anticuerpo anti-TWEAK en la glicoproteína de mielina oligodendrocito (MOG) inducida por EAE en ratones C57BL/6 resultó en una reducción de la severidad de la enfermedad e infiltración de leucocitos cuando los ratones fueron tratados después de la fase de iniciación.

En una modalidad , moléculas de DVD Ig capaces de unir uno o más, por ejemplo dos, objetivos tales como, por ejemplo, I L-1 2 , TWEAK, IL-23, CXCL1 3, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TN F, CD45RB, CD200, I FNgamma , GM-CSF, FGF, C5, CD52 o CCR2 son proporcionados. Una modalidad incluye un anti-I L- 2 específico dual/TWEAK DVD Ig como un agente terapéutico beneficioso para el tratamiento de MS.

Varios modelos animales para evaluar la utilidad de las moléculas de DVD para tratar MS son conocidos en la técnica basados en la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales para estudios de validación de otólogos de especies humanas y de ratón (por ejemplo, la reactividad para I L-12 humana y de ratón, TWEAK humano y ratón etc. ) en el modelo de ratón EAE pueden llevarse a cabo con moléculas de proteína de unión de DVD derivada de "anticuerpo suplente coincidente"; brevemente, una proteína de unión de DVD basada en dos (o más) anticuerpos específicos de objetivo de ratón puede ajustarse a la medida de lo posible a las características de los anticuerpos humanos o humanizados parentales utilizados para construcción de proteína humana de unión de DVD (afinidad similar, potencia de neutralización similar, vida medía similar etc.) . El mismo concepto se aplica a los modelos animales en otras especies no roedores, donde una proteína de unión de DVD derivada de "anticuerpo suplente coincidente" se puede seleccionar para la farmacología anticipada y posiblemente estudios de seguridad . Además de las evaluaciones de seguridad de rutina de estas pruebas específicas de pares para el grado de inm unosupresión pueden ser garantizadas y útiles en la selección de los mejores pares de destino (véase luster et al (1 994) Toxicol. 92( 1 -3)).

S sin embargo no es sólo una enfermedad imunológica, pero tiene un componente neurodegenerativo muy importante. La progresión de la enfermedad en MS es debido a la pérdida acumulada y el daño de axones y los puntajes de la enfermedad final de los pacientes están determinados por estos procesos neurodegenerativos (Compston y Coles (2008) Lancet 372: 1 502-1 51 7; Trapp y Nave (2008) Annu. Rev Neurosci. 31 :247-269). Varios mecanismos pueden contar para el daño axonal en MS. La liberación excesiva del neurotransmisor glutamato con neurotoxicidad asociada mediada con calcio, liberación de óxido nítrico y daño posterior de axon, pérdida de soporte neurotrófico, acumulación masiva de moléculas inhibidoras de crecimiento del axón o repulsivas tipo RGM A, NOGO A, Semaforinas, Efrinas, pueden contribuir a neurodegeneración dirigida por axón y pérdida de la regeneración de axón exitosa. Direccionamiento en actividades neutralizantes de molécula de prote ína de unión de DVD sencilla dirigida contra componentes tipo RG M A, NOGO A, Semaforinas, Efrinas con actividades neutra lizantes dirig idas contra citoquinas pro-inflamatorias tipo I L- 1 2, TWEA , I L-23, CXCL1 3, CD40, CD40L, I L-1 8, VEGF , VLA-4, TNF , CD45RB , CD200, I FNgamma , GM-CSF , FGF , C5, CD52 y CCR2 pueden permitir el enfoque simultáneo en inflamación y neuro- regeneración , un objetivo aún no alcanzado por cualq uiera de los actuales principios terapéuticos de MS . La estimulación de la neuro-regeneración puede compensar las deficiencias funcionales causadas por la neurodegeneración axonal masiva observada en MS, posibilitando la recu peración de las funciones cerebrales perdidas posibles. 6) Sepsis La fisiopatología de la sepsis es in iciada por los componentes de la membrana externa de organismos gram-negativo (lipopolisacárido [LPS], l ípido A, endotoxina) y organismos gram-positivos (ácido lipoteicoico, peptidoglicano) . Estos componentes de la membrana externa son capaces de unirse al receptor CD14 en la superficie de monocitos. En virtud de los receptores tipo toll recientemente descritos, entonces se transmite una señal a la célula, llevando a la eventual producción de las citoquinas pro-inflamatorias factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) y la interleucina-1 (I L-1 ). Respuestas inflamatorias e inm unes abrumadoras son características esenciales del shock séptico y desempeñan un papel central en la patogenia de daño tisular, i nsuficiencia de múltiples órganos, y la muerte inducida por sepsis. Citoquinas, especialmente el factor de necrosis tumoral (TNF) e interleucina (I L-1 ) , han demostrado ser mediadores del shock séptico. Estas citoquinas tienen un efecto tóxico directo sobre los tejidos; también activan la fosfolipasa A2. Estos y otros efectos conducen a un aumento de las concentraciones del factor de activación de plaquetas, promoción de la actividad de óxido nítrico sintasa, promoción de la infiltración de tejido por neutrófilos y promoción de la actividad de neutrófilo.

El tratam iento de sepsis y shock séptico sigue siendo un enigma clín ico y recientes ensayos prospectivos con modificadores de respuesta biológica (es decir, anti-TN F, anti-M I F) d irigidos a la respuesta inflamatoria han mostrado sólo un modesto beneficio clínico. Recientemente, el interés se ha desplazado hacia terapias dirigidas a revertir los períodos acompañantes de inmunosupresión . En animales de experimentación, no sólo el tratamiento con inhibidores de apoptosis puede prevenir la apoptosis de células linfoides; también puede mejorar el resultado. Aunque ensayos clínicos con agentes anti-apoptóticos permanecen distantes debido en gran parte a las dificultades técnicas asociadas a su administración y direccionamiento de tejidos, inhibición de apoptosis de linfocitos representa un atractivo objetivo terapéutico para el paciente séptico. Asimismo, un agente específico dual de direccionam iento del mediador inflamatorio y mediador de apoptosis, puede tener beneficio agregado. U na modalidad pertenece a proteínas de unión de DVD capaces de enlazar uno o más objetivos involucrados en la sepsis, en una modalidad dos objetivos, tales como, por ejemplo TNF e I L-1 7. La eficacia de dicha proteína de unión de DVD para sepsis puede evaluarse en modelos animales preclínicos conocidos en la técnica (ver Buras et al . (2005) Nat. Rev. Drug Discover. 4( 1 0) : 854-65 y Calandra et al . , (2000) Nat. Med. 6(2) : 164-70). 7) Trastornos neurológicos (a) Enfermedades neurodegenerativas Enfermedades neurodegenerativas son crónicas en cuyo caso son usualmente dependientes de la edad o agudas (por ejemplo, apoplejía, lesión cerebral traumática, lesión medu lar, etc. ) . Estas enfermedades neurodegenerativas crónicas representan una compleja interacción entre múltiples tipos de células y mediadores. Estrategias de tratamiento para estas enfermedades son limitadas y en su mayoría constituyen ambos procesos inflamatorios de bloqueo con agentes antiinflamatorios no específicos (por ejemplo, corticosteroides, inhibidores de COX) o agentes para prevenir la pérdida de neuronas y/o funciones sinápticas. Estos tratam ientos no detienen la progresión de la enfermedad . Estudios recientes sugieren que más terapias dirigidas como anticuerpos a péptido A-b soluble (incluyendo las formas oligoméricas A-b) no sólo pueden ayudar a detener la progresión de la enfermedad pero puede ayudar a mantener la memoria y otras funciones cognitivas. Estas observaciones prel iminares indican que terapias específicas de direccionam iento de más de un mediador de la enfermedad (por ejemplo, A-b y una citoquina pro-inflamatoria como TNF) pueden proporcionar incluso una mejor eficacia terapéutica para enfermedades neurodegenerativas crónicas a lo observado con direccionam iento de un mecanismo sencillo de la enfermedad (por ejemplo, soluble A-b solamente) .

Las moléculas de proteína de unión de DVD proporcionadas aquí pueden en lazar uno o más objetivos i nvolucrados en enfermedades crónicas neurodegenerativas como el Alzheimer. Estos objetivos incluyen, pero no se limitan a, cualquier mediador, soluble o superficie de la célula , implicado en la patogénesis de AD por ejemplo, AGE (S 1 00 A, anfoterina), citoquinas pro-inflamatorias (po ejemplo, I L-1 ), quimioquinas (por ejemplo, MCP 1 ) , moléculas que inhiben la regeneración de los nervios (por ejemplo, Nogo, RGM A), moléculas que favorecen el crecimiento de la neurita (neurotrofinas) y moléculas que pueden mediar el transporte en la barrera sangre-cerebro (por ejemplo, receptor de transferrina, receptor de insulina o RAGE) . La eficacia de las moléculas de proteína de unión de DVD se puede validar en estudios pre-clínicos de modelos animales como los ratones transgénicos que sobre-expresan la proteína precursora amiloide o RAGE y desarrollan síntomas similares a la enfermedad de Alzheimer. Además, las moléculas de proteína de unión de DVD pueden ser construidas y probadas para la eficacia en los modelos animales y la mejor proteína de unión de DVD terapéutica puede seleccionarse para la prueba en pacientes humanos. Las moléculas de proteína de unión de DVD también pueden ser empleadas para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson. Alfa-sinucleína participa en la patología de Parkinson . Las moléculas de proteína de unión de DVD capaces de dirigir alfa-sinucleína y med iadores inflamatorios tales como TNF , I L-1 , MCP-1 puede resultar una terapia eficaz para la enfermedad de Parkinson y también son modalidades.

Alternativamente una proteína de unión de DVD capaz de dirigir alfa-sinucleína y RGM A no sólo podría frenar el progreso patológico en la sustancia negra de los pacientes de enfermedad de Parkinson pero también puede resultar en el crecimiento regenerador de neuritas dañadas porque RGM A ha demostrado recientemente que es fuertemente sobre-regulada en esta área en los pacientes PD (Bossers et al (2009) Brain Pathol . 1 9:91 - 1 07). (b) Regeneración neuronal y lesiones de la médula espinal A pesar del incremento en el conocimiento de los mecanismos patológicos , la lesión de la médula espinal (SCI ) sigue siendo una enfermedad devastadora y representa una ind icación médica caracterizada por una alta necesidad médica. No existe ningún tratamiento satisfactorio y la inyección de bolo de altas dosis de metilprednisolona (M P) es la única terapia utilizada dentro de una ventana de tiempo estrecha de lesiones después de 8 horas. Este tratamiento , sin embargo, es únicamente para prevenir la lesión secundaria sin causar cualquier recuperación funcional significativa. Es fuertemente criticado por la falta de eficacia inequívoca y efectos adversos graves, como la inmunosupresión con posteriores infecciones y alteraciones musculares histopatológ icos severos. No se han aprobado fármacos, biológicos o pequeñas moléculas, estim ulando el potencial regenerador endógeno, pero princi pios de tratamiento prometedores y fármacos candidatos han demostrado eficacia en modelos animales de SCI en recientes años y primero datos cl ínicos prometedores se han presentado recientemente. En gran medida la falta de recuperación funcional en SCI humana es causada por factores que inhiben el crecim iento de la neurita , en sitios de lesión , en el tejido de la cicatriz, en mielina así como en las células asociadas con lesiones. Estos factores son las proteínas asociadas con mielina NogoA, OMgp y MAG, RGM A, la CSPG asociada con la cicatriz (proteoglicanos de condroitina sulfato) y factores inhibitorios en astrocitos reactivos (algunas semaforinas y efrinas). Sin embargo, en el sitio de la lesión no sólo se encuentran moléculas inhibidoras del crecimiento sino también factores estimulantes del crecimiento de neurita como neurotrofinas, laminina, L1 y otros. Este conjunto de moléculas neurita inhibitoria de crecimiento y promotoras de crecimiento pueden explicar el bloqueo de factores individuales, como NogoA o RGM A, resultó en recuperación funcional significativa en modelos de roedores SCI , debido a una reducción de las influencias inhibidoras podría inclinar la balanza de la inhibición del crecimiento a la promoción del crecimiento. Sin embargo, las recuperaciones que se observaron con el bloqueo de una molécula inhibidora de sobre-crecimiento de neurita no fueron completas. Para lograr recuperaciones más rápidas y más pronunciadas bloqueando dos moléculas inhibidoras de sobre-crecimiento de neurita por ejemplo, Nogo y RGM A, o bloqueo de una molécula inhibidora de sobre-crecimiento de neurita y mejorar las funciones de una molécula de mejora de sobre-crecimiento de neurita, por ejemplo Nogo y neurotrofinas o bloqueo de una molécula inhibitoria sobre-crecimiento de neurita, por ejemplo Nogo y una molécula pro-inflamatoria por ejemplo, TNF, puede ser deseable (ver McGee et al. , (2003) Trends Neurosci. 26: 193).

En un aspecto, proteínas de unión de DVD capaces de unir pares objetivo tal como NgR y RGM A; NogoA y RGM A; MAG y RGM A; OMGp y RG M A; RGM A y RGM B; RGM A y Semaforina 3A; RGM A y Semaforina 4; CS PGs y RGM A; agrecano, midquina, rteurocan, versican, fosfacan , Te38 y TN F-a ; anticuerpos específicos de AIJ globulómeros combinados con anticuerpos que promueven el brote de dendrita y axón se proporcionan . Daños de patología y axón dendrita , o distrofia neurítica son un signo m uy temprano de AD y es conocido que NOGO A restri nge el crecimiento de dendrita y que las otras moléculas asociadas a miel ina y mencionados antes por ejemplo, RGM A, MAG , recrecimiento axonal deteriorado OMGp. Uno puede combinar este tipo de ab con cualquiera de SCI-candidato (proteínas de mielina) Ab. Otros objetivos de proteína de enlace de DVD pueden incluir cualquier combinación de NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG u Omgp. Además, los objetivos también pueden incluir cualquier mediador, soluble o superficie de la célula , implicada en la inhibición de neurita, por ejemplo, Nogo , Ompg , MAG , RGM A, semaforinas, efrinas, a-b solu ble, citoq uinas pro-inflamatorias (por ejemplo, I L-1 ), moléculas quim iocinas (por ejemplo, M I P 1 a) que inhiben la regeneración de los nervios. La eficacia de anti-nogo/anti-RGM A o moléculas de la proteína de unión de DVD similares pueden validarse en modelos animales preclínicos de lesiones de la médula espinal. Además, estas moléculas de proteína de unión de DVD pueden ser construidas y probadas para la eficacia en los modelos animales y la mejor proteína de unión de DVD terapéutica puede seleccionarse para la prueba en pacientes humanos. Además, las moléculas de proteína de unión de DVD se pueden construir para dirigir dos sitios de unión de ligando distintos en un solo receptor, por ejem plo, el receptor Nogo que une tres ligandos Nogo, OMGp y MAG y RAGE que une A-b y S 1 00 A. Además, inhibidores de crecimiento de neurita, por ejemplo, nogo y receptor nogo, también desempeñan un papel en la prevención de la regeneración de los nervios en enfermedades inmunológicas como la esclerosis múltiple. I nhibición de la interacción del receptor nogo-nogo ha demostrado que mejora la recuperación en modelos animales de esclerosis múltiple. Por lo tanto, moléculas de proteína de unión de DVD que pueden bloquear la función de un mediador inmune por ejemplo, una citoquina como I L- 1 2 y una molécula inhibidora de crecimiento de neurita , por ejemplo, nogo o RGM pueden ofrecer una eficacia más rápida y mayor que el bloqueo de una molécula inhi bidora inmune y de crecimiento de neurita sola .

En general , los anticuerpos no cruzan la barrera sangre-cerebro (BBB) de manera eficaz y pertinente . Sin embargo, en ciertas enfermedades neurológicas, por ejem plo, accidente cerebrovascular, lesión traumática del cerebro, esclerosis m últiple, etc. , la BBB puede verse comprometida y permite mayor penetración de las proteínas de unión de DVD y anticuerpos en el cerebro. En otras condiciones neurológicas, cuando no se prod uce salida de BBB, uno puede emplear el direccionamiento de los sistemas de transporte endógeno, incluyendo transportadores mediados por portador como portadores de glucosa y aminoácidos y estructuras/receptores de cél ulas que median la trancitosis mediada por los receptores en el endotel io vascular de la BBB, perm itiendo así el transporte trans-BBB de la proteína de un ión de DVD. Estructuras en la BBB permitiendo este tipo de transporte incluyen pero no se limitan al receptor de insulina, receptor de transferrina, LRP y RAGE. Además, las estrategias permiten el uso de proteínas de unión de DVD también como lanzaderas para transportar medicamentos potenciales en el sistema nervioso central incluyendo los fármacos de bajo peso molecular, nanopartículas y ácidos nucleicos (Coloma et al. , (2000) Pharm Res. 1 7 (3): 266-74; Boado et al (2007). Bioconjug. Chem 18(2):447-55). 8) Trastornos oncológicos Terapia de anticuerpo monoclonal ha emergido como una importante modalidad terapéutica para el cáncer (von Mehren et al (2003) Annu. Rev. Med 54:343-69). Anticuerpos pueden ejercer efectos antítumorales por inducir apoptosis, citotoxicidad redireccionada, interferencia con las interacciones ligando-receptor, o previniendo la expresión de proteínas que son críticas para el fenotipo neoplásico. Además, los anticuerpos pueden dirigir los componentes del microambiente tumoral, perturbación de las estructuras vitales como la formación de la vasculatura tumoral asociada. Los anticuerpos también pueden dirigir los receptores cuyos ligandos son factores de crecimiento, como el receptor del factor de crecimiento epidérmico. El anticuerpo inhibe así los ligandos naturales que estimulan el crecimiento celular de enlace a las células tumorales dirigidas. Alternativamente, los anticuerpos pueden inducir una red anti-idiotipo, citotoxicidad mediada por el complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). El uso de anticuerpos específicos duales que dirige dos mediadores independientes tumorales probablemente dará beneficio adicional en comparación con una terapia mono-específica.

IV) Composiciones farmacéuticas Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de unión proporcionadas aquí son para uso en, pero sin limitación a, diagnóstico, detección o vigilancia de un trastorno, en la prevención, tratamiento, manejo o mejoramiento de un trastorno o uno o más de sus síntomas, y/o en la investigación. En una modalidad específica, una composición consta de uno o más proteínas de unión proporcionadas aquí. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una o más proteínas de unión proporcionadas aquí y uno o varios agentes profilácticos o terapéuticos diferentes a las proteínas de unión proporcionadas aquí para tratar un trastorno. En una modalidad, los agentes profilácticos o terapéuticos conocidos por ser útiles para o que se han o se están utilizando actualmente en la prevención, tratamiento, manejo o mejoramiento de un trastorno o uno o más de sus síntomas. Según estas modalidades, la composición puede abarcar además un portador, diluyente o excipiente.

Las proteínas de unión proporcionadas aquí pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas convenientes para la administración a un sujeto. Normalmente, la composición farmacéutica comprende una proteína de unión proporcionada aquí y un portador farmacéuticamente aceptable. El térm ino "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes anti-bacterianos y anti-micóticos, isotónicos y agentes dilatorios de absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los m ismos. En algunas modalidades, agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol , sorbitol o cloruro de sodio, se incluyen en la composición. Portadores farmacéuticamente aceptables pueden com prender además pequeñas cantidades de sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o reguladores de pH , que refuerzan la vida de anaquel o eficacia del anticuerpo o porción de unión del anticuerpo.

Varios sistemas de entrega son conocidos y pueden usarse para administrar u no o más anticuerpos proporcionados aquí o la com binación de uno o más anticuerpos proporcionados en este documento y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para la prevención , manejo, tratam iento, o mejoramiento de un trastorno o uno o más de sus síntomas, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpos, endocitosis mediada por el receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu (1 987) J . Biol . Chem . 262 :4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Métodos de administración de un agente profiláctico o terapéutico proporcionado aquí incluyen , pero no se limitan a la administración parenteral (por ejemplo, intradérm ica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), admin istración epidurala, administración intratumoral y administración mucosal (por ejemplo, rutas intranasales y orales) . Además, la administración pulmonar puede ser empleada , por ejem plo, por el uso de un inhalador o nebulizador y formulación con un agente aerosolizante. Véase , por ejemplo, Patente de E. U.A. No. 6, 01 9, 968. En una modalidad , una proteína de unión proporcionada aqu í , la terapia combinada, o una composición proporcionada aquí es administrada mediante la tecnología de entrega de fármacos pul monar Alkermes® (Alkermes, I nc. , Cambridge, Massachusetts) . En una modalidad específica , agentes profilácticos o terapéuticos proporcionados aquí son administrados por vía intramuscular, por vía intravenosa , intratumoralmente, por vía oral, intranasal, pulmonar, o por vía subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse por cualquier ruta conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o m ucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal , etc.) y pueden ser administrados junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser local o sistém ica .

En una modalidad, la unión específica de nanotubos de carbono acoplados a anticuerpo (CNTs) a las células tumorales in vitro, seguido de su ablación altamente específica con luz casi infrarroja (N I R) puede utilizarse para dirigir las células tumorales. Por ejemplo, los lípidos polares bioti nilados pueden utilizarse para preparar dispersiones CNT estables, biocompatibles, no citotóxicos y que están unidas a una o dos proteínas de unión de DVD derivadas de avidina neutralita diferentes d irigidas contra uno o más antígenos tumorales (por ejemplo, CD22) (Chakravarty et al . , (2008) Proc. Nati . Acad. Sci. USA 1 05: 8697-8702.

En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos estipulados aquí localmente en el área que necesitan tratamiento; esto puede lograrse mediante, por ejemplo y no por la forma de limitación, infusión local, por inyección o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso o no poroso, incluyendo las membranas y matrices, tales como las membranas sialásticas, polí meros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®) o matrices de colágeno. En una modalidad , una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos proporciona aquí antagonistas es administrada localmente en el área afectada a un sujeto para prevenir, tratar, manejar y/o mejorar un trastorno o un síntoma del mismo. En otra modalidad, una cantidad efectiva de u no o más anticuerpos provistos aquí es admin istrada localmente en el área afectada en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (por ejemplo, uno o más profilácticos o agentes terapéuticos) que no sea una proteína proporcionada aquí a un sujeto para evitar, tratar, manejar y/o mejorar un trastorno o uno o más de sus síntomas.

En otra modal idad, el agente profiláctico o terapéutico puede ser entregado en un sistema de liberación sostenida o de liberación controlada. En una modalidad, puede utilizarse una bomba para lograr liberación controlada o sostenido (véase Langer, supra; Sefton (1 987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al. ( 1980) Sugery 88: 507 ; Saudek et al ( 1989) N . Engl. J. ed. 321 : 574). En otra modalidad, materiales poliméricos pueden utilizarse para lograr liberación controlada o sostenido de las terapias. En una modalidad, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable en almacenamiento, estéril y biodegradable. En otra modalidad aún, un sistema de liberación controlada o sostenida puede colocarse en la proximidad del objetivo profiláctico o terapéutico, por lo que requiere sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson , en Medical Applications of Controlled Reléase, supra , vol. 2, pp. 1 1 5-1 38 (1 984)).

Sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer ( 1 990) Science 249: 1 527-1 533) . Cualquier técnica conocida por uno con habilidad en la técnica puede utilizarse para producir formulaciones de liberación sostenida que comprende uno o más agentes terapéuticos proporcionados aqu í .

En una modalidad específica, cuando la composición es un ácido nucleico de codificación de un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico puede ser administrado in vivo para promover la expresión de su agente profiláctico o agente terapéutico codificado, mediante su construcción como parte de un vector de expresión adecuada de ácido nucleico y se administración de manera tal que resulta intracelular, por ejemplo, por medio de un vector retroviral (ver la Patente de E. U .A. No. 4, 980,286) , o por inyección directa, o por uso de bombardeo de micropartículas (por ejem plo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o capa con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección , o por su administración en el enlace a un péptido tipo homeobox que es conocido para entrar en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al. (1991 ) Proc. Nati . Acad. Sci. USA 88: 1864-1868). Alternativamente, un ácido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporado dentro del DNA de célula huésped para la expresión por recombinación homologa .

Una composición farmacéutica provista aquí está formulada para ser compatible con su ruta prevista de adm inistración. Cuando es útil , la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local como lignocamina para aliviar el dolor en el sitio de la inyección .

El método puede abarcar la administración de una composición formulada para la administración parenteral por medio de inyección (por ejemplo, mediante la inyección de bolo o infusión continua). Form ulaciones para la inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampolletas o en envases multi-dosis) con un conservador añadido. Las composiciones pueden tomar esas formas como suspensiones, soluciones o em ulsiones en vehículos aceitosos o acuosos y pueden contener a agentes formulatorios como suspensión , estabilización y/o agentes de dispersión . Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en la forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua libre de pirógenos estériles) antes de su uso.

Los métodos provistos en el presente documento pueden comprender además la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de accionamiento largo pueden ser administradas por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles (por ejemplo, como una sal poco soluble).

Los métodos proporcionados aquí incluyen la administración de composiciones formuladas como formas neutras o sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellas derivadas de clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, ácidos tartáricos, etc. y aquellas formadas con cationes tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

En general, los ingredientes de las composiciones son suministrados por separado o mezclados juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolleta o saco indicando la cantidad de agente activo. Cuando el modo de administración es la infusión, la composición puede ser dispensada con una botella de infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril o solución salina. Cuando el modo de administración es por inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina puede ser proporcionada para que se puedan mezclar los ingredientes antes de la administración.

En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas proporcionados aquí viene en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolleta o saco indicando la cantidad del agente. En una modalidad, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas proporcionados aquí se suministran como un polvo seco esterilizado liofilizado esterilizado o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado y puede ser reconstituido (por ejemplo, con agua o solución salina) a la concentración adecuada para la administración a un sujeto. En una modalidad, uno o varios de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas proporcionadas aquí se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente cerrado en una dosis unitaria de por lo menos 5 mg , por lo menos 10 mg, por lo menos 1 5 mg, por lo menos 25 mg, por lo menos 35 mg, por lo menos 45 mg, al menos 50 mg, por lo menos 75 mg, o al menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos liofilizado o composiciones farmacéuticas proporcionadas aquí pueden conservarse entre 2°C y 8°C en su envase original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas proporcionadas aquí pueden ser administrados dentro de 1 semana, por ejemplo, dentro de 5 días, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 1 2 horas, dentro de 6 horas, en 5 horas, dentro de 3 horas o dentro de 1 hora después de ser reconstituida. En una modalidad alternativa , uno o varios de los agentes profilácticos o terapéuticos o com posiciones farmacéuticas proporcionadas aquí se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente cerrado indicando la cantidad y la concentración del agente. En una modalidad, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un recipiente herméticamente cerrado al menos 0.25 mg/ml , por lo menos 0.5 mg/ml, por lo menos 1 mg/ml, por lo menos 2.5 mg/ml, por lo menos 5 mg/ml, por lo menos 8 mg/ml , por lo menos 1 0 mg/ml , por lo menos 1 5 mg/kg , por lo menos 25 mg/ml , por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml o al menos 1 00 mg/ml . La forma l íquida puede conservarse entre 2°C y 8°C en su envase original.

Las proteínas de unión proporcionadas aquí pueden incorporarse en una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral . En una modal idad , se preparará el anticuerpo o porciones de anticuerpos como u na solución inyectable que contiene 0.1 -250 mg/ml de proteína de unión. La solución inyectable puede estar com puesta de una forma de dosificación líquida o liofilizada en un vial de cristal de roca o ám bar, ampolleta o jeringa precargada. El regulador de pH puede ser L-histidina ( 1 -50 m M) , óptimamente 5-10 mM , a pH 5.0 a 7.0 (óptimamente pH 6.0). Otros reguladores de pH adecuados incluyen pero no están lim itados a, succi nato de sodio , citrato de sodio, fosfato de sod io o fosfato de potasio. Cloruro de sodio puede utilizarse para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 1 50 mM para una forma de dosificación líquida). Crioprotectores pueden incluirse para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 0-10% sacarosa (óptimamente 0.5-1 .0%). Otros crioprotectores convenientes incluyen trehalosa y lactosa. Agentes de volumen pueden incluir una forma de dosificación liofilizada, principalmente 1 -10% manitol (óptimamente 2-4%) . Se pueden utilizar estabilizadores en las formas de dosificación l íquida y liofilizada, principalmente 1 -50 mM L-metionina (óptimamente 5-1 0 mM). Otros agentes de volumen adecuados incluyen glicina, arginina, pueden ser incluidos como 0-0.05% polisorbato-80 (óptimamente 0.005-0.01 %).

Agentes surfactantes adicionales incluyen pero no se limitan a polisorbato 20 y agentes surfactantes BRIJ . La composición farmacéutica que comprende las proteínas de unión proporcionadas en este documento preparadas como una solución inyectable para la administración parenteral, puede comprender aún más un agente útil como un adyuvante, como aquellos utilizados para aumentar la absorción o dispersión de una proteína terapéutica (por ejemplo, anticuerpos). Un adyuvante particularmente útil es hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante) . Además de la hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad humana tras la administración parenteral , especialmente la administración por vía subcutánea. También permite mayores volúmenes del sitio de inyección (es decir, más de 1 mi) con menos dolor y malestar y la mínima incidencia de reacciones del sitio de inyección (véase Las composiciones contenidas pueden estar en una variedad de formas . Estos incluyen , por ejemplo, formas de dosificación liquida, semisólida y sólida, como soluciones l íquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles) , dispersiones o suspensiones, tabletas , pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma escogida depende del modo previsto de la adm inistración y aplicación terapéutica . Composiciones típicas están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, como composiciones similares a aquellas utilizadas para la inm unización pasiva de los seres humanos con otros anticuerpos. El modo elegido de administración es parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa , subcutánea , intraperitoneal, intramuscular) . En una modalidad, el anticuerpo se administra por infusión intravenosa o inyección . En otra modalidad, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.

Composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenam iento. La composición puede ser formulada como una solución , m icroemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada conveniente a concentración alta de fármacos. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas por incorporar el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de unión del anticuerpo) en la cantidad necesaria en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en el presente, como sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de compuestos activos en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados en este documento. En el caso de polvo liofilizado, estéril para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y secado por aspersión que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución estéril filtrada previamente del mismo. La fluidez correcta de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de una capa como la lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersión y por el uso de agentes surfactantes. Absorción prolongada de composiciones inyectables puede ser llevada al incluir, en la composición, un agente que retarda la absorción, por ejemplo, de sales de monoestearato y gelatina.

Las proteínas de unión proporcionadas aquí pueden ser administradas por una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, en una modalidad, la ruta/modo de administración es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como será apreciada por el artesano especializado, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede prepararse con un portador que protegerá el compuesto contra rápida liberación, como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulado. Polímeros biodegradables, biocompatibles pueden utilizarse ta l como acetato de vinilo de etileno, polian h ídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de ta les formulaciones son patentados o generalmente conocidos por los expertos en la técnica . Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed . , Marcel Dekker, Inc. , New York, 1 978.

Compuestos activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones. En ciertas modalidades, una proteína de unión proporcionada aquí es co-formulada con y/o co-administrada con uno o más agentes terapéuticos adicionales a los que son útiles para tratar trastornos con una proteína de unión proporcionada aquí. Por ejemplo, una proteína de unión proporcionada aquí puede ser co-formulada y/o co-administrada con uno o más anticuerpos adicionales que unen otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que unen otras citoquinas o que unen las moléculas de superficie celular) . Además, pueden utilizarse uno o más anticuerpos proporcionados aqu í en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos que preceden. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis inferiores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diferentes monoterapias.

En ciertas modalidades, una proteí na de unión está enlazada a un vehículo de extensión de vida media conocido en la técnica . Dichos veh ículos incluyen, pero no se limitan a , el dominio de Fe, glicol de polietileno y dextrano. Se describen dichos vehículos, por ejemplo, en la Solicitud de E. U .A. No. de serie 09/428, 082 y Publicación PCT No. WO 99/25044.

En una modalidad específica, secuencias de ácido nucleico de codificación de una proteína de unión proporcionada aquí u otro agente profiláctico o terapéutico proporcionado aquí son administrados para tratar, prevenir, gestionar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas de los mismos a modo de terapia génica . Terapia génica se refiere a la terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta modalidad, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o agente profiláctico o terapéutico proporcionado aquí que media un efecto profiláctico o terapéutico.

Cualq uiera de los métodos para la terapia génica disponibles en la técnica puede ser utilizado en los métodos proporcionados en el presente. Para comentarios generales de los métodos de la terapia génica , ver Goldspiel et al. , 1 993. Se describen métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de DNA recombinante, que puede utilizarse en Ausubel et al . (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY ( 1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual , Stockton Press, NY ( 1 990) . La descripción detallada de los diversos métodos de la terapia génica se describe en la publicación de patente No. US20050042664.

Un método para el tratamiento de un sujeto humano que sufre de un trastorno en el que el objetivo u objetivos, capaz de unirse por la proteína de unión proporcionada aquí es perjudicial, que comprende la administración al sujeto humano de una proteína de unión proporcionada aquí tal que la actividad del objetivo u objetivos en el sujeto humano se inhibe y uno o más de los síntomas es aliviado o tratamiento conseguido se proporciona. En una modalidad, enfermedades que pueden ser tratadas o diagnosticadas con las composiciones y métodos incluyen , pero no se limitan a, elementos inmunes e inflamatorios, como las enfermedades autoinmunes, particularmente aquellas asociadas con inflamación , incluyendo la enfermedad de Crohn , psoriasis (incluida la psoriasis en placa), artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis psorátíca, osteoartritis o artritis idiopática juvenil) , esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, sepsis y enfermedades neurodegenerativas, regeneración neuronal , lesiones de la médula espinal y cánceres primarios y metastásicos. En otra modalidad, la enfermedad es un trastorno respiratorio; asma; asma alérgica y no alérgica; asma debido a una infección; asma debido a una infección con el virus respiratorio sincitial (RSV); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); una condición que involucra la inflamación de las vías respiratorias; eosinofilia; fibrosis y la producción de exceso de moco; fibrosis quística; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópica; urticaria; eczema; rinitis alérgica; enterogastritis alérgica; una condición autoinmune y/o inflamatoria de la piel ; una condición autoinmune y/o inflamatoria de los órganos gastrointestinales; enfermedades inflamatorias intestinales (I BD) ; colitis ulcerativa; una condición inflamatoria y/o autoinmune del hígado; cirrosis hepática; fibrosis hepática; fibrosis hepática causada por el virus de hepatitis B y/o C; esclerodermia; tumores o cánceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma de Hodgkin ; una infección viral; una infección bacteriana ; una infección parasitaria ; infección por HTLV-1 ; supresión de la expresión de la respuesta inmune de protección tipo 1 y la supresión de la expresión de una respuesta inmune protectora tipo 1 durante la vacunación.

Una proteína de unión proporcionada en este documento también puede administrarse con uno o varios otros agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de diversas enfermedades.

Una proteína de unión proporcionada en este documento puede utilizarse sola o en combinación para tratar estas enfermedades. Debe entenderse q ue las proteínas de enlace pueden utilizarse solas o en combinación con un agente adicional , por ejemplo, un agente terapéutico, el agente adicional que ser seleccionado por los expertos en la técnica para su propósito. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica siendo útil para el tratamiento de la enfermedad o condición que es tratada por el anticuerpo proporcionado aqu í . El agente adicional también puede ser un agente que im parte un atributo beneficioso a la composición terapéutica por ejemplo, un agente que afecta la viscosidad de la composición .

Además debe entenderse que las combinaciones proporcionadas en este documento son aquellas combinaciones útiles para los fines previstos. Los agentes expuestos a continuación son para fines ilustrativos y no se pretende ser limitados. En algunas modalidades, las combinaciones comprenden los anticuerpos proporcionados y al menos un agente adicional seleccionado de la lista a continuación. La combinación también puede incluir a más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede realizar su función.

Las composiciones farmacéuticas proporcionada en este documento pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de una proteína de unión proporcionada en este documento. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad en efectiva, en las dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de unión puede ser determinada por una persona experta en la técnica y puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad de la proteína de unión para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una en que cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o porción de unión del anticuerpo, se ponderan por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad efectiva, en las dosis y durante períodos de tiempo necesaria, para lograr el resultado deseado profiláctico. Normalmente, ya que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad terapéuticamente profilácticamente eficaz será menor que la cantidad efectiva terapéuticamente.

Regímenes de dosis pueden ajustarse para proporcionar la óptima respuesta deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejem plo, puede administrarse un bolo único, pueden adm in istrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse proporcionalmente o aumentada según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para la facilidad de administración y uniformidad de la dosis. El término "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a ser tratados; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutica requerida. La especificación para las formas de dosis unitarias proporcionadas aquí es dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular para lograrse y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de un compuesto activo para el tratam iento de la sensibilidad en los individuos.

Una gama ejemplar, no limitante para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de una proteína de unión proporcionada aquí es 0.1 -20 mg/kg, por ejemplo, 1 -1 0 mg/kg . Se debe señalar que los valores de dosis pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección a aliviarse. Se debe entender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosis específica pueden ajustarse con el tiempo seg ún la necesidad individual y el j uicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de dosis establecidos son ejemplares solamente y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reclamada .

V) Diagnósticos La descripción en este documento también proporciona aplicaciones de diagnóstico. Esto es dilucidado a ún más posteriormente.

A. Método de ensayo La presente descripción también proporciona un método para determinar la presencia , cantidad o concentración de un analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba utilizando al menos una proteína de unión de DVD como se describe en este documento. Cualq uier ensayo adecuado como es conocido en la técnica se puede utilizar en el método. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a , inmunoensayo, como inmunoensayo sándwich (por ejemplo, inmunoensayos sándwich de proteínas monoclonales, policlonales y/o unión de DVD o cualquier variación de los mismos (por ejemplo, proteína monoclonal/de unión de DVD, proteína de unión de DVD/policlonal, etc. ), incluyendo la detección de rad ioisótopos (radioinmunoensayo (RIA)) y la detección de la enzima (inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) (por ejemplo, ensayos ELISA de Quantikine, R & D Systems, Minneapolis, M N))) , inmunoensayo de inhibición competitiva (por ejem plo, hacia adelante e inversa) , inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA) , técnica de inmunoensayo de enzima multiplicada (EM IT) , transferencia de energía de resonancia de biolum iniscencia (BRET) y ensayo quimioluminiscente homólogo, etc.. En un inmunoensayo basado en S ELDI , un reactivo de captura que específicamente se une a un analito (o un fragmento del mismo) de interés está unido a la superficie de una sonda de espectrometría de masas, tal como un arreglo de chip proteína pre-activado. El analito (o un fragmento del mismo) es capturado entonces específicamente sobre el biochip y el analito capturado (o un fragmento del m ismo) es detectado por espectrometría de masas. Alternativamente, el analito (o un fragmento del m ismo) puede ser eluído del reactivo de captura y detectado por MALDI tradicional (desorción/ionización láser asistida por matriz) o por SELDI . Un inmunoensayo de micropartículas quim ioluminiscente, en particular uno que emplea el analizador automatizado ARCH ITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L), es un ejemplo de un inmunoensayo preferido.

Métodos bien conocidos en la técnica para la recolección, manipulación y procesamiento de orina , sangre, suero y plasma y otros líquidos corporales, se utilizan en la práctica de la presente descripción, por ejem plo, cuando una proteína de unión de DVD tal como se describe en este documento se emplea como un reactivo de inmunodiagnóstico y/o en un kit de inmunoensayo de analito. La muestra de prueba puede comprender más radicales además del anal ito de interés, tal como anticuerpos, antígenos, haptenos, hormonas, fármacos, enzimas, receptores, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y/o polin ucleótidos. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre obtenida de un sujeto. Puede ser necesario o deseado que una muestra de prueba, especialmente la sangre entera , se trate antes del inmunoensayo como se describe en este documento, por ejemplo, con un reactivo de pre-tratamiento. I ncluso en casos donde el tratamiento previo no es necesario (por ejemplo, la mayoría de las muestras de orina) , el pre-tratamiento opcionalmente puede hacerse (por ejemplo, como parte de un régimen en una plataforma comercial) .

El reactivo de pre-tratamiento puede ser cualquier reactivo apropiado para su uso con el inmunoensayo y kits proporcionados aquí . El pre-tratam iento opcionalmente comprende: (a) uno o más solventes (por ejemplo, metanol y glicol de etileno) y, opcionalmente, sal, (b) uno o más solventes y sal y opcionalmente, detergente, (c) detergente, o (d) detergente y sal . Los reactivos de pre-tratamiento son conocidos en la técnica, y tal trata miento previo puede emplearse, por ejemplo, para ensayos en Abbott TDx, AxSYM® y analizadores ARCH ITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L) , como se describe en la literatura (véase , por ejemplo, Clin Yatscoff et al (1 990) . 36 : 1 969 Chem-1 973 y Wallemacq et al . ( 1999) . Clin . Chem . 45:432-435) , y/o como comercialmente disponible. Además, puede hacerse un pre-tratamiento como se describe en la Patente de E . U .A. No. 5, 1 35,875 y 6, 660 , 843; publicación de patentes europea No. EU0471 293, solicitud de patente de E. U .A. No. 20080020401 . El reactivo de pre-tratamiento puede ser un agente heterogéneo o un agente homogéneo.

Con el uso de un reactivo de pre-tratamiento heterogéneo, el reactivo de pre-tratamiento precipita la proteína de unión de analito (por ejemplo, proteína que se puede enlazar a un analito o un fragmento del m ismo) presentes en la muestra. Ese paso de pre-tratamiento consta de retirar cualquier proteína de unión de analito al separar de la proteína de unión de analito precipitado el sobrenadante de la mezcla formada por la adición del agente de pre-tratamiento a la muestra. En un ensayo, el sobrenadante de la mezcla ausente cualquier proteína de unión se utiliza en el ensayo, procedente directamente al paso de captura de anticuerpos.

Con el uso de un reactivo de pre-tratamiento homogéneo no hay ningún paso de separación. Toda la mezcla de la m uestra de prueba y reactivo de pre-tratamiento se contactó con una pareja de unión específico etiquetado de analito (o un fragmento del mismo), tal como un anticuerpo anti-analito etiquetado (o un fragmento antigénicamente reactivo del m ismo) . El reactivo de pre-tratamiento empleado para tal ensayo normalmente se diluye en la mezcla de la m uestra de prueba pre-tratada, antes o durante la captura por la primera pareja de unión específica. A pesar de dicha dilución , una cierta cantidad de reactivo de pre-tratamiento está todavía presente (o sigue estando) en la mezcla de la m uestra de prueba durante la captura. En una modalidad , la pareja de unión específica etiquetada puede ser una proteína de unión de DVD (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante del mismo).

En un formato heterogéneo, después que la m uestra se obtiene de u n sujeto, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba q ue está siendo evaluada para un analito (o un fragmento del mismo) y una primera pareja de unión específica , en donde la primera pareja de un ión específica y cualquier analito contenido en la muestra de prueba forman un primer complejo pareja-analito de unión específico. Preferentemente, la primera pareja de unión específica es un anticuerpo anti-analito o un fragmento del mismo. La primera pareja de unión específica puede ser una proteína de unión de DVD (o un fragmento, una varia nte o un fragmento de una variante del mismo) como se describe en este documento. El orden en el que la muestra de prueba y la primera pareja de unión específica se agregan para formar la mezcla no es crítico. Preferentemente, la primera pareja de unión específica es inmovilizada sobre una fase sólida. La fase sólida utilizada en el inmunoensayo (para la primera pareja de unión específica y, opcionalmente , la segunda pareja de unión específica) puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica , tales como, pero no limitado a , una partícula magnética, una perla, un tubo de ensayo, una placa de m icrotitulación, una probeta , una membrana , una molécula de andamio, una película, un papel de filtro, un disco y un chip.

Después que la mezcla que contiene el primer complejo de analito-pareja de unión específica, cualquier analito no unido se quitará del com plejo usando cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, el anal ito no unido puede eliminarse mediante el lavado.

Preferiblemente, sin embargo, la primera pareja de unión específica está presente en exceso de cualquier analito presente en la m uestra de prueba , tal que todos los analitos que están presentes en la muestra de prueba está unida por la primera pareja de unión específica.

Después que cualquier analito no unido se remueve, una segunda pareja de unión específica se agrega a la mezcla para formar a un primer complejo de pareja de unión específica segundo analito pareja de unión específico. La segunda pareja de unión específico es preferentemente un anticuerpo anti-analito que se une a un epítope en analito que difiere del epítope en el analito unido por la primera pareja de unión específica . Además, también preferiblemente, la segunda pareja de unión específica se etiqueta con o contiene una etiqueta detectable como se describió anteriormente. La segunda pareja de unión específica puede ser una proteína de unión de DVD (o un fragmento, una variante o u n fragmento de una variante del mismo) como se describe en este documento.

Puede utilizarse cualquier etiqueta detectable conveniente como es conocido en la técnica. Por ejemplo, la etiqueta detectable puede ser u na etiqueta radiactiva (tal como 3H , 1 25l , 35S, C, 32P, y 33P), una etiqueta enzi mática (como peroxidasa de rábano picante, peroxidasa alcal ina , gl ucosa 6-fosfato-deshidrogenasa y similares) , una etiqueta quimiolum iniscente (como ésteres de acridinio, tioésteres o sulfonamidas; lum inol, isoluminol , ésteres de fenantridinio y similares) , una etiqueta fluorescente (como la fluoresceína (por ejem plo, 5-fluoresceína , 6-carboxifluoresceína , 3'6-carboxifluoresceína , 5(6)- carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos cuánticos (por ejemplo, seleniuro de zinc sulfuro-tapado de cadmio), una etiqueta termométrica o una etiqueta de reacción en cadena de inmuno-polimerasa. Una introducción a las etiquetas, procedimientos de etiquetado y detección de etiquetas se encuentra en Polak y Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2a ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), que es un manual combinado y catálogo editado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Una etiqueta fluorescente puede utilizarse en FPIA (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,593,896). Un compuesto de acridinio puede utilizarse como una etiqueta detectable en un ensayo quimioluminiscente homogéneo o heterogéneo (véase, por ejemplo, Adamczyk et al. (2006) Bioorg. Med Chem Lett. 16:1324-1328).

Un compuesto de acridinio preferido es una acridinio-9-carboxamida. Métodos para la preparación de acridinio 9-carboxamides son descritos en por ejemplo, Mattingly (1991) J. Biolumin. Chemilumin. 6:107-114. Otro compuesto acridinio preferido es un éster de acridinio-9-carboxilato de arilo. Un ejemplo de un éster de acridinio-9-carboxilato de arilo es 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio fluorosulfonato (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Métodos para la preparación de ésteres de arilo de 9-carboxilato de acridinio se describen en, por ejemplo, McCapra et al. (1965) Photochem. Photobiol. 4:1111-21. Más detalles sobre el éster de acridinio-9-carboxilato de arilo y su uso se establecen en la publicación de patente No. 20080248493.

Ensayos quimioluminiscentes (por ejemplo, usando acridinio como se describió anteriormente u otros agentes quimioluminiscentes) pueden realizarse según los métodos descritos en Adamczyk et al. (2006). Anal . Chim . Acta 579(1 ) : 61 -67. Si bien puede utilizarse cualquier formato de ensayo adecuado, un quimioluminómetro de microplacas (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S. A. , LLC, Oak Ridge, TN) permite el ensayo de múltiples m uestras de pequeños volúmenes rápidamente.

No es importante el orden en el que la muestra de prueba y la o las parejas de unión específica se agrega n para formar la mezcla para el ensayo quimioluminiscente. Si la primera pareja de unión específica es etiquetado de manera detectable con un agente quim ioluminiscente como un compuesto acridinio, se forman complejos pareja-analito de unión específica primero etiquetado de manera detectable. Alternativamente, si se utiliza una segunda pareja de unión específica y la seg unda pareja de unión específica se etiquetada de manera perceptible con un agente quim iolum iniscente como un compuesto acridinio, se forman complejos de pareja de unión específico segundo - ana lito - pareja de unión específica primera etiquetado de manera detectable. Cualquier pareja de unión específica no unida, etiquetada o sin etiquetar, puede extraerse de la mezcla usando cualquier técnica conocida en la técnica, tal como el lavado.

Peróxido de h idrógeno puede ser generado in situ en la mezcla o proporcionado o suministrado a la mezcla (por ejemplo, la fuente del peróxido de hidrógeno siendo uno o más reguladores de pH u otras soluciones que se saben que contienen peróxido de hidrógeno) antes, simultáneamente con, o después de la adición de un compuesto de acridio descrito antes. Peróxido de hidrógeno puede ser generado in situ en un número de maneras como sería evidente por un experto en la técnica.

Tras la adición simultánea o posterior de al menos una solución básica a la muestra, una señal detectable, es decir, se genera una señal quimioluminiscente, indicativa de la presencia del analito. La solución básica contiene al menos una base y tiene un pH mayor o igual a 10, preferentemente, mayor o igual a 12. Ejemplos de soluciones básicas incluyen , pero no se limitan a, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de amonio, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio y bicarbonato de ca lcio. La cantidad de solución básica añadida a la muestra depende de la concentración de la solución básica. Basado en la concentración de la solución básica utilizada , un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de solución básica para añadir a la muestra .

La señal quimioluminiscente que se genera puede detectarse mediante técnicas de rutina conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Basado en la intensidad de la señal generada , se puede cuantificar la cantidad de analito en la muestra . Específicamente, la cantidad de analito en la muestra es proporcional a la intensidad de la señal generada. La cantidad de analito presente puede ser cuantificada mediante la comparación de la cantidad de luz generada a una curva estándar de analito o por comparación con un estándar de referencia. La curva estándar puede generarse mediante diluciones en serie o soluciones de concentraciones conocidas del analito mediante espectroscopia de masas, métodos gravimétricos y otras técnicas conocidas en la técnica. Mientras lo anterior se describe con énfasis en el uso de un compuesto acridinio como el agente quimioluminiscente, uno de experiencia en la técnica puede adaptar fácilmente esta descripción para el uso de otros agentes quimioluminiscentes.

Inmunoensayos de analito generalmente pueden llevarse a cabo utilizando cualquier formato conocido en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, un formato de sándwich. Específicamente, en un formato de inmunoensayo, por lo menos dos anticuerpos se emplean para separar y cuantificar el analito, como un analito humano, o un fragmento del mismo en una muestra. Más específicamente, los al menos dos anticuerpos se unen a diferentes epítopes en un analito (o un fragmento del mismo) formando un complejo inmune, que se conoce como un "sándwich". En general, en los inmunoensayos uno o más anticuerpos pueden utilizarse para capturar el analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba (estos anticuerpos son frecuentemente denominados un anticuerpo de "captura" o anticuerpos de "captura") y uno o más anticuerpos pueden utilizarse para unir una etiqueta detectable (es decir, cuantificable) al sándwich (estos anticuerpos son frecuentemente denom inados como el "anticuerpo de detección" los "anticuerpos de detección", el "conjugado", o los "conjugados"). Así, en el contexto de un formato de inmunoensayo sándwich, u na proteína de unión o una proteína de un ión de DVD (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante del mismo) como se describe en este documento puede utilizarse como un anticuerpo de captura, un anticuerpo de detección o ambos. Por ejemplo, una proteína de unión o proteína de unión de DVD que tiene un dominio que se puede unir a un primer epítope en un analito (o un fragmento del mismo) puede utilizarse como un agente de captura y/o otra proteína de unión o proteína de unión de DVD que tiene un dominio que puede un ir un segundo epítope en un analito (o un fragmento del mismo) puede utilizarse como un agente de detección. En este sentido, una proteína de unión o una proteína de unión de DVD con un primer dominio que puede unir un primer epítope en un analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que puede unir un segundo epítope en un analito (o un fragmento del mismo) puede utilizarse como un agente de captura y/o un agente de detección . Alternativamente, una proteína de unión o proteína de unión de DVD con un primer dominio que se m puede unir un epítope en un primer analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que puede unir un epítope en un segundo analito (o un fragmento del mismo) puede ser utilizado como un agente de captura y/o un agente de detección para detectar y cuantificar de manera opcional , dos o más analitos. En caso de que un analito puede estar presente en u na m uestra de más de una forma, tal como una forma monomérica y una forma dimérica/muNmérica, lo que puede ser homomérica o heteromérica, una proteína de unión o proteína de unión de DVD que tiene un dominio que puede unir un epítope que sólo se expone en la forma monomérica y otra proteína de unión o proteína de unión de DVD que tiene un dominio que puede unir un epítope en una parte diferente de una forma dimérica/multimérica pueden utilizarse como agentes de captura y/o agentes de detección, lo que permite de esta manera la detección y cuantificacion opcional , de diferentes formas de un analito determinado. Además, empleando proteínas de unión o proteínas de unión de DVD con afinidades diferenciales dentro de una proteína de unión sencilla o proteína de unión de DVD y/o entre proteínas de unión o proteínas de unión de DVD puede proporcionar una ventaja de avidez. En el contexto de inmunoensayos descritos en este documento, por lo general pueden ser útiles o deseados para incorporar uno o más enlazadores dentro de la estructura de una proteína de unión o una proteína de unión de DVD. Cuando está presente, óptimamente el enlazador puede ser de suficiente longitud y flexibilidad estructural para permitir la unión de un epítope por los dom inios internos así como la unión de otro epítope por los dominios externos. En este sentido, cuando una proteína de unión o una proteína de unión de DVD pueden unir dos analitos diferentes y un analito es más grande que el otro, preferiblemente el analito mayor está unido por los dominios externos.

Hablando en términos generales, una muestra que se analiza para (por ejemplo, sospecha que contiene) analito (o un fragmento del mismo) puede contactarse con al menos un agente de captura (o agente) y al menos un agente de detección (que puede ser un segundo agente de detección o un tercer agente de detección o incluso un agente sucesivamente numerado, por ejemplo, donde el agente de captura y/o detección comprende varios agentes) ya sea simultáneamente o secuencialmente y en cualqu ier orden. Por ejemplo, la muestra de prueba puede contactarse primero con al menos un agente de captura y luego (secuencialmente) con al menos un agente de detección. Alternativamente, la muestra puede contactarse primero con al menos un gente de detección y luego (secuencialmente) con al menos un agente de captura . En otra alternativa todavía, la muestra de prueba puede contactarse al mismo tiempo con un agente de captura y un agente de detección .

En el formato de ensayo sándwich , una muestra que se sospecha que contiene el analito (o un fragmento del mismo) es llevado primero en contacto con al menos un primer agente de captura bajo condiciones que permiten la formación de un primer complejo de agente/analito. Si se util iza más de un agente de captura, un primer complejo agente de captura/analito compuesto por dos o más agentes de captura está formado. En un ensayo de sándwich, los agentes, es decir, preferentemente , el al menos uno agente de captura son utilizados en cantidades excesivas de molares de la máxima cantidad de analito (o un fragmento del m ismo) se espera en la muestra de prueba . Por ejemplo, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 1 mg de agente por mi de regulador de pH (por ejemplo, regulador de pH de revestimiento de micropartícu las) puede utilizarse.

I nm unoensayos de inhibición competitiva , que a menudo se utilizan para medir los analitos pequeños porque se requiere un enlace por sólo un anticuerpo (es decir, una proteína de unión y/o una proteína de unión de DVD en el contexto de la presente descripción), comprenden los formatos clásicos y secuencia les. En un inmunoensayo de inhibición com petitiva secuencial un agente de captura para un analito de interés es recubierto en un pozo de una placa de microtitulación u otro soporte sólido. Cuando se añade la muestra que contiene el analito de interés al pozo, el analito de interés se une al agente de captura. Después del lavado, una cantidad conocida de analito marcado (por ejemplo, biotina o peroxidasa de rábano picante (HRP)) capaz de un ir el anticuerpo de captura se añade al pozo. Un sustrato para una etiqueta enzimática se utiliza para generar una señal. Un ejemplo de un sustrato adecuado para H RP es 3, 3', 5, 5'-tetrametilbencidina (TMB) . Después del lavado, la señal generada por el analito etiquetado se mide y es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra. En un inmunoensayo de inhibición competitiva clásico típicamente un anticuerpo (es decir, proteína de unión y/o una proteína de unión de DVD en el contexto de la presente descripción) a un analito de interés está cubierto en un soporte sólido (por ejemplo, un pozo de una placa de microtitulación) . Sin em bargo, a diferencia del inmunoensayo de inhibición competitiva secuencial, la muestra y el analito etiquetado se agregan al pozo al mismo tiempo. Cualquier analito en la muestra compite con el analito etiquetado para unirse al agente de captura. Después del lavado, la señal generada por el analito etiquetado se m ide y es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra . Por supuesto, hay muchas variaciones de estos formatos, por ejemplo, cuando se une con el soporte sólido tiene lugar, si el formato es un paso, dos pasos, dos pasos retardados y similares, y éstos serían reconocidos por uno con experiencia en la técnica.

Opcionalmente, antes de poner en contacto con la muestra de prueba con al menos un agente de captura (por ejemplo, el primer agente de captura), el al menos un agente de captura puede unirse a un soporte sólido, lo que facilita la separación del primer complejo agente/analito (o un fragmento del mismo) de la m uestra de prueba. El sustrato al que está unido el agente de captura puede ser cualquier soporte sólido adecuado o fase sólida que facilita la separación del complejo agente de captura-analito de la muestra .

Los ejemplos incluyen un pozo de una placa, como una placa de microtitulación , un tubo de ensayo, un gel poroso (por ejemplo, gel de sí lice, agarosa, dextrano o gelatina), una película polimérica (por ejemplo, poliacrilamida) , perlas (por ejemplo, perlas de poliestireno o perla magnética) , una tira de un filtro/membrana (por ejemplo, nitrocel ulosa o nylon) , micropartículas (por ejemplo, partículas de látex, micropartículas magnetizables (por ejemplo, micropartículas de óxido férrico o núcleos de óxido de cromo y capas homo- o hetero-poliméricos y radios de aproximadamente 1 - 1 0 mieras) . El sustrato puede constar de un material poroso adecuado con una afinidad superficial conveniente para unir antígenos y suficiente porosidad para permitir el acceso por anticuerpos de detección. U n material microporoso es generalmente preferido, aunque se puede utilizar un material gelatinoso en un estado hidratado. Dichos sustratos porosos son preferentemente en la forma de hojas con un grosor de aproximadamente 0.01 a 0.5 m m, preferentemente aproximadamente 0.1 mm . Mientras que el tamaño del poro puede variar un poco, preferiblemente el tamaño del poro es de aproximadamente 0.025 a aproximadamente 1 5 mieras, más preferiblemente más de aproximadamente 0.15 a aproximadamente 1 5 mieras. La superficie de estos sustratos puede ser pasivamente revestida o activada por procesos químicos que causan enlace covalente de un anticuerpo al sustrato. La unión irreversible, generalmente por adsorción a través de fuerzas hidrofóbicas, del antígeno o el anticuerpo a los resultados de sustrato; alternativamente, un agente químico de acoplamiento u otros medios pueden utilizarse para un ir covalentemente el anticuerpo al sustrato, siempre que tal enlace no interfiera con la capacidad del anticuerpo para unirse al analito. Como alternativa, el anticuerpo (es decir, proteínas de unión y/o proteínas de unión de DVD en el contexto de la presente descripción) se puede unir con micropartículas, que han sido previamente cubiertas con estreptavidina (por ejemplo, Perlas Magnéticas DYNAL®, I nvitrogen, Carlsbad, CA) o biotina (por ejemplo, usando micropartículas recubiertas de estreptavidina Power-BindTM-SA-MP (Seradyn, I ndianápolis, I N)) o anticuerpos monoclonales a nti-especie-específico (es decir, proteínas de unión y/o proteínas de unión de DVD en el contexto de la presente descripción) . Si es necesario o deseado, el sustrato (por ejemplo, para la etiqueta) se puede derivar para permitir la reactividad con diferentes grupos funcionales en el anticuerpo (es decir, proteínas de unión y/o proteínas de unión de DVD en el contexto de la presente descripción). Tal derivación requiere el uso de ciertos agentes de acoplamiento, ejemplos de las cuales incluyen, pero no se limitan a, anhídrido maleico, N-hidroxisuccinimida y 1 -etil-3-(3-dimeti!aminopropil) carbodiimida. Si se desea, uno o más agentes de captura, como anticuerpos (o sus fragmentos) (es decir, proteínas de unión y/o proteínas de unión de DVD en el contexto de la presente descripción, cada una de las cuales es específica para el o los analitos puede acoplarse a las fases sólidas en distintas ubicaciones físicas o tratables (por ejemplo, como en una configuración de biochip (véase, por ejemplo, la patente de E. U.A. No. 6,225,047; publicación PCT No. WO 99/51773; patente de E. U.A. No. 6,329,209; publicación PCT No. WO 00/56934 y patente de E. U.A. No. 5,242,828). Si el agente de captura está unido a una sonda de espectrometría de masas como el soporte sólido, la cantidad de analito unido a la sonda puede detectarse mediante espectrometría de masas de ionización de desorción de láser. Alternativamente, una sola columna puede ser empacada con diferentes perlas, que son derivadas con los uno o más agentes de captura , con lo que la captura del analito en un solo lugar (véase, tecnologías derivadas de anticuerpos, basadas en la perla, por ejemplo , la tecnología xMAP de Luminex (Austin, TX)) .

Después que la muestra de prueba se ensayo para el analito (o un fragmento del mismo) se pone en contacto con al menos un agente de captura (por ejemplo, el primer agente de captura) , la mezcla se incuba para permitir la formación de un primer complejo agente de captura (o agente de captura m últ¡ple)-analito (o un fragmento del mismo) . La incubación puede realizarse en un pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 10.0, a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45°C y durante un período de por lo menos alrededor de un 1 minuto a aproximadamente dieciocho ( 1 8) horas, preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 minutos, preferiblemente más de aproximadamente 4 a aproximadamente 1 8 minutos. El inmunoensayo descrito aquí puede realizarse en un solo paso (lo que significa la muestra de prueba , por lo menos un agente de captura y al menos un agente de detección se añaden todos secuencialmente o simultáneamente a un vaso de reacción) o en más de un paso, dos pasos, tres pasos, etc.

Después de la formación del complejo (primera o múltiple) agente de captura/analito (o un fragmento del m ismo) , el complejo luego se contacta con al menos un agente de detección bajo condiciones que permiten la formación de un (primero o múltiple) agente de captura/analito (o un fragmento del mismo)/ segundo complejo de agente de detección) . Mientras se da título para mayor claridad como el "segundo" agente (por ejemplo, seg undo agente de detección) , de hecho, cuando el agente múltiple se utiliza para la captura y/o detección, el al menos un agente de detección puede ser el segundo, tercero, cuarto, etc. agentes usados en el inmunoensayo. Si el complejo agente de captura/analito (o un fragmento del m ismo) es contactado con más de un agente de detección , entonces un com plejo de agente de detección (primero o m últiple) agente de captura/a nalito (o un fragmento del mismo)/(múltiple) se forma. Como con el agente de captura (por ejem plo, el primer agente de captura), cuando al menos un agente de detección (por ejemplo, segundo y cualquiera posterior) se pone en contacto con el complejo agente de captura/analito (o un fragmento del mismo) , un período de incubación en condiciones similares a las descritas anteriormente se requ iere para la formación del complejo (primero o múltiple) agente de detección/analito (o un fragmento del mismo)/(segundo o múltiple) agente de detección . Preferiblemente, por lo menos un agente de detección contiene una etiqueta detectable. La etiqueta detectable se puede enlazar con el agente de detección al menos uno (por ejemplo, el segundo agente de detección) antes, simultáneamente con o después de la formación del complejo de agente de detección del (primero o múltiple) agente de captura/analito (o un fragmento del m¡smo)/(segundo o múltiple). Puede utilizarse cualquier etiqueta detectable en la técnica (véase la discusión anterior, incluyendo las referencias Polak y Van Noorden ( 1 997) y Haugland ( 1 996)).

La etiqueta detectable puede un irse a los anticuerpos ya sea directamente o a través de un agente de acoplamiento. Un ejemplo de un agente de acoplamiento que se puede utilizar es EDAC (1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodüm ida clorhidrato) , que está disponible comercialmente de Sigma-Aldrich , St. Louis, MO. Otros agentes de acoplamiento que se pueden utilizar son conocidos en la técnica. Métodos para la unión de una etiqueta detectable a un anticuerpo son conocidos en la técnica . Además, m uchas etiquetas detectables pueden ser compradas o sintetizadas ya conteniendo grupos term inales que facilitan el acoplam iento de la etiqueta detectable al agente, como un éster de CPSP acridinio (es decir, 9-[N-tosil-N-(3-carboxipropil)]- 1 0-(3-sulfopropil)acridinio carboxam ida) o SPSP-acridinio éster (es decir, N 1 0-(3-sulfopropil)-N-(3-sulfopropil)-acridinio-9-carboxamida).

El complejo de agente de detección (primero o múltiple) agente de captura/a nalito/(segundo o múltiple) puede ser, pero no debe separarse del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación de la etiqueta. Por ejemplo, si el agente de captura al menos uno (por ejemplo, el primer agente de captura, como una proteína de unión y/o una proteína de unión de DVD de acuerdo con la presente descripción) está unido a un soporte sólido, como un pozo o una perla, separación puede lograrse eliminando el fluido (de la muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Alternativamente, si el al menos un primer agente de captura está unido a un soporte sólido, se puede al mismo tiempo contactar con la muestra que contiene el analito y el al menos un segundo agente de detección para formar un primer complejo de agente (múlti ple) agente/analito/segundo (múltiple), seguido de la eliminación del fluido (muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Si el al menos un primer agente de captura no está unido a un soporte sólido, entonces complejo de agente de detección (primero o m últiple) agente de captura/analito/(segundo o múltiple) no debe removerse de la muestra de prueba para la cuantificación de la cantidad de la etiqueta.

Después de la formación del complejo agente de captura7ana l ito/agente de detección (por ejemplo, el complejo primer agente de captura/analito/segundo agente de detección), la cantidad de etiqueta en el complejo se cuantifica mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, si se utiliza una etiqueta enzimática, el complejo etiquetado reacciona con un sustrato para la etiqueta que da una reacción cuantificable como el desarrollo de color. Si la etiqueta es una etiqueta radiactiva, se cuantifica la etiqueta utilizando los medios apropiados, tales como un contador de centelleo. Si la etiqueta es una etiqueta fluorescente, la etiqueta se cuantifica al estimular la etiqueta con una luz de un color (que se conoce como la "longitud de onda de excitación") y la detección de otro color (que se conoce como la "longitud de onda de la emisión") que se emite por la etiqueta en respuesta a la estimulación. Si la etiqueta es una etiqueta quimioluminiscente, la etiqueta se cuantifica mediante la detección de la luz emitida ya sea visualmente o mediante luminómetros, película de rayos x, películas fotográficas de alta velocidad, una cámara CCD, etc. Una vez que se ha cuantificado la cantidad de etiqueta en el complejo, la concentración de analito o un fragmento del mismo en la muestra de prueba se determinan por los medios adecuados, como por el uso de una curva estándar que se ha generado mediante diluciones en serie de analito o un fragmento del mismo de concentración conocida. Diferente al uso de diluciones en serie de analito o un fragmento del mismo, la curva estándar puede generarse gravimétricamente, por espectroscopia de masa y por otras técnicas conocidas en la técnica.

En un ensayo de microparticulas quimioluminiscentes empleando el analizador ARCHITECT®, el pH de diluyente de conjugado puede ser aproximadamente 6.0 +/- 0.2, el regulador de pH de la capa de micropartículas puede mantenerse en aproximadamente la temperatura ambiente (es decir, de aproximadamente 17 a aproximadamente 27 6C), el pH del regulador de pH de la capa de micropartículas puede ser aproximadamente 6.5 +/- 0.2 y el pH del diluyente de micropartículas puede ser aproximadamente 7.8 +/- 0.2. Sólidos son preferentemente menos de aproximadamente 0.2%, como menos de aproximadamente 0.15%, menos de aproximadamente 0.14%, menos de aproximadamente 0.13%, menos de aproximadamente 0.12%, o menos de aproximadamente 0.11%, tal como aproximadamente 0.10%.

FPIAs se basan en principios de inmunoensayo de unión competitiva. Un compuesto fluorescentemente etiquetado, cuando se excita por una luz polarizada linealmente, emitirá fluorescencia que tiene un grado de polarización inversamente proporcional a su velocidad de rotación. Cuando un complejo de anticuerpo-trazador fluorescentemente etiquetado es excitado por una luz polarizada linealmente, la luz emitida sigue siendo altamente polarizada porque el fluoróforo está restringido de la rotación entre la luz temporal es absorbida y la luz temporal es emitida. Cuando un compuesto trazador "libre" (es decir, un compuesto que no está ligado a un anticuerpo) es excitado por la luz linealmente polarizada, su rotación es mucho más rápida que el correspondiente conjugado trazador-anticuerpo (o proteína de unión de trazador y/o proteína de unión de trazador de acuerdo con la presente descripción) producido en un inmunoensayo de unión competitiva. FPIAs son ventajosos sobre RIAs, ya que no hay sustancias radiactivas que requieran de un manejo especial y eliminación. Además, FPIAs son ensayos homogéneos que se pueden realizar fácilmente y rápidamente.

En vista de lo anterior, se proporciona un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de analito (o un fragmento del m ismo) en una muestra de prueba. El método comprende el ensayo de la muestra de prueba para un analito (o un fragmento del mismo) con un ensayo (i) empleando (i') al menos uno de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que se puede unir a un analito, una variante de un anticuerpo que se puede unir a un anal ito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que se puede enlazar a un analito, una proteína de unión como se describe aquí y una proteína de unión de DVD (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante del mismo) que puede unirse a un analito, y (?') al menos una etiqueta detectable y (ii) que comprende comparar una señal generada por la etiqueta detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba a una señal generada como una indicación directa o indirecta de la presencia , cantidad o concentración de analito (o un fragmento del mismo) en un control o un calibrador. Opcionalmente , el calibrador es parte de una serie de calibradores, en donde cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores por la concentración del analito.

El método puede incluir (i) el contacto de la muestra de prueba con al menos un primera pareja de unión específica para el analito (o un fragmento del mismo) que comprende un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede unirse a un analito, una variante de un anticuerpo que se puede unir a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que se puede unir a un analito, una proteína de unión como se describe aquí, o una proteína de unión de DVD (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante del mismo) que se puede unir a un analito para formar un complejo primera pareja de unión específica/analito (o fragmento del m ismo), (ii) contactar el complejo primera pareja de unión específica/analito (o fragmento del mismo) con al menos una segunda pareja de unión específica para analito (o fragmento del mismo) q ue comprende un anticuerpo anti-analito etiquetado de manera detecta ble, un fragmento etiquetado de manera detectable de un anticuerpo anti-analito que se puede unir al analito, u na variante etiquetada de manera detectable de un anticuerpo anti-analito que se puede unir a l analito, un fragmento etiquetado de manera detectable de una variante de un anticuerpo anti-analito que se puede unir al anal ito, una proteí na de unión etiquetada de manera detectable como se describe aquí que se puede un ir a un analito, o una proteína de unión de DVD etiquetada de manera detectable (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo) con el fin de formar un complejo primera pareja específica de unión/analito (o fragmento del m ismo)/segunda pareja de unión específica , y (iii) determinar la presencia, cantidad o concentración de anal ito en la m uestra de prueba mediante la detección o medición de la señal generada por la etiqueta detectable en el complejo primera pareja de unión específica/analito (o fragmento del mismo)/segunda pareja de unión específica formado en (ii). Un método en el que al menos una primera pareja de unión específica de anaiito (o un fragmento del mismo) y/o al menos una segunda pareja de unión específica para el anaiito (o un fragmento del mismo) es una proteína de unión como se describe aquí o una proteína de unión de DVD (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante del mismo) como se describe aquí puede ser preferido.

Como alternativa , el método puede constar poner en contacto la muestra de prueba con al menos una primera pareja de unión específica para anaiito (o un fragmento del mismo) que comprende un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que se puede unir a un anaiito, una variante de un anticuerpo que se puede unir a un anaiito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que se puede unir a un anaiito, una proteína de unión como se describe aquí y una proteína de unión de DVD (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo) y simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden , poner en contacto la m uestra de prueba con al menos una segunda pareja de unión específica , que puede competir con el anaiito (o un fragmento del mismo) para la unión a la primera pareja de unión específica al menos una y que comprende un anaiito etiquetado de manera detectable, un fragmento etiquetado de manera detectable de anaiito que se puede unir con la primera pareja de unión específica , una variante etiquetada de manera detectable del anaiito que se puede unir con la primera pareja de unión específica, o un fragmento etiquetado de manera detectable de una variante del analito que se puede unir con la primera pareja de unión específica. Cualquier analito (o un fragmento del mismo) presente en la muestra de prueba y al menos una segunda pareja de unión específica compiten entre sí para formar un complejo de primera pareja de unión específica/analito (o fragmento del mismo) y un complejo de primera pareja de unión específica/segunda pareja de unión específica, respectivamente. El método comprende adicionalmente la determinación de la presencia, cantidad o concentración de analito en la muestra de prueba por la detección o medición de la señal generada por la etiqueta detectable en el complejo de primera pareja de unión específica/segunda pareja de unión específica formado en (¡i), en donde la señal generada por la etiqueta detectable en el complejo de primera pareja de unión específica/segunda pareja de unión específica es inversamente proporcional a la cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba.

Los métodos anteriores pueden comprender además diagnosticar, pronosticar o evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico de un paciente del cual se obtiene la muestra de prueba. Si el método además comprende evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente del cual se obtiene la muestra de prueba, el método opcionalmente comprende además modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según sea necesario para mejorar la eficacia. El método puede ser adaptado para su uso en un sistema automatizado o sistema semi-automatizado.

Con respecto a los métodos de ensayo (y por consiguiente del kit) , es posible emplear anticuerpos anti-analito comercialmente disponible o métodos para la producción de anti-analito como se describe en la literatura. Suministros comerciales de varios anticuerpos incluyen, pero no se limitan a , Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), GenWay Biotech , I nc. (San Diego, CA), y R&D Systems (RDS; Minneapolis, MN).

Por lo general, un nivel predeterm inado puede ser empleado como punto de referencia contra el cual evaluar los resultados obtenidos en el análisis de una muestra de prueba para analito o su fragmento, por ejemplo, para detectar la enfermedad o riesgo de enfermedad. Generalmente, al hacer tal comparación , el nivel predeterminado se obtiene mediante la ejecución de un ensayo particular de un número suficiente de veces y bajo condiciones apropiadas tal que un enlace o asociación de presencia de analito, cantidad o concentración con una etapa particular o punto final de una enfermedad, trastorno o condición o con indicios clínicos particulares se puede hacer. Normalmente, el nivel predeterminado es obtenido con ensayos de sujetos de referencia (o poblaciones de sujetos) . El analito medido puede incluir sus fragmentos, sus productos de degradación , y/o sus productos de división enzimática .

En particular, con respecto a un nivel predeterminado como se emplea para monitorear la progresión de enfermedad y/o tratamiento, la cantidad o concentración de analito o su fragmento puede ser "no cambiado" "favorable" (o "favorablemente alterado") , o "desfavorable" (o "desfavorablemente alterado"). "Elevada" o "incrementada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es superior a un nivel o intervalo normal o típico (por ejemplo, el nivel predeterminado), o es superior a otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra de línea de base o temprana). El término "disminuida" o "reducida" se refiere a una cantidad o concentración en una muestra de prueba que es inferior a un nivel o intervalo normal o típico (por ejemplo, nivel predeterminado), o es inferior a otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra de línea de base o temprana). El término "alterada" se refiere a una cantidad o concentración en una muestra que está alterada (aumentada o disminuida) de un nivel o intervalo normal o típico (por ejemplo, el nivel predeterminado) u otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra de línea de base o temprana).

El nivel o intervalo típico o normal para analito se define de acuerdo con la práctica estándar. Debido a que los niveles de analito en algunos casos serán muy bajos, un nivel alterado así llamado o alteración puede considerarse que se han producido cuando existe cualquier cambio neto en comparación con el nivel o intervalo típico o normal, o nivel o intervalo de referencia, que no puede explicarse por error experimental o variación de muestra. Así, el nivel medido en una muestra particular será comparado con el nivel o intervalo de niveles determinados en muestras similares de un sujeto normal así llamado. En este contexto, un "sujeto normal" es un individuo con enfermedad no detectable, por ejemplo, y un paciente "normal" (a veces denominado "control") o población es/son uno(s) que no exhiben enfermedad detectable, respectivamente, por ejemplo. Además, dado que el analito rutinariamente no se encuentra a un alto nivel en la mayoría de la población humana, un "sujeto normal" puede ser considerado un individuo sin cantidad o concentración elevada o incrementada sustancial detectable de analito, y un paciente "normal" (a veces denominado "control") o población es/son uno(s) que no exhiben cantidad o concentración elevada o incrementada detectable sustancial de analito. Un "sujeto aparentemente normal" es uno en que el analito aún no ha sido o está siendo evaluado actualmente. El nivel de un analito es "elevado" cuando el analito es normalmente indetectable (por ejemplo, el nivel normal es cero, o dentro de un intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 percentiles de poblaciones normales), pero se detecta en una muestra de prueba , así como cuando el analito está presente en la muestra de prueba en un nivel superior al normal. Así, ínter alia, la descripción proporciona un método de clasificación para un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad , trastorno o condición particular. El método de ensayo también puede involucrar el ensayo de otros marcadores y lo similar.

En consecuencia , los métodos descritos en este documento también pueden utilizarse para determinar si o no un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad , trastorno o condición determinada. Específicamente, dicho método puede comprender los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad en una muestra de prueba de un sujeto de analito (o un fragmento del mismo) (por ejemplo, utilizando los métodos descritos aquí , o métodos conocidos en la técnica); y (b) comparar la concentración o cantidad de analito (o un fragmento del mismo) determ inado en el paso (a) con un nivel predeterminado, en donde, si la concentración o cantidad de analito determinado en el paso (a) es favorable con respecto a un nivel predeterm inado, después el sujeto está determinado a no tener o estar en riesgo de una enfermedad , trastorno o condición determinada. Sin embargo, si la concentración o cantidad de analito determinado en el paso (a) es desfavorable con respecto al nivel predeterm inado, después el sujeto está determinado a tener o estar en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición determ inada.

Adicionalmente, aquí se proporciona el método para monitorear la progresión de la enfermedad en un sujeto. Óptimamente el método que comprende los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad en una muestra de prueba de un sujeto de analito; (b) determinar la concentración o cantidad en una muestra de prueba tardía del sujeto de a nalito ; y (c) comparar la concentración o cantidad de analito como se determina en el paso (b) con la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a), en donde si la concentración o cantidad determinada en el paso (b) no es cambiada o es desfavorable en comparación con la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a) , entonces la enfermedad en el sujeto se determina que ha continuado, progresado o empeorado. En comparación, si la concentración o cantidad de analito como se determina en el paso (b) es favorable en com paración con la concentración o cantidad de analito como se determina en el paso (a), entonces la enfermedad en el sujeto se determina que ha sido interrumpida, retrocedida o mejorada .

Opcionalmente, el método además com prende comparar la concentración o cantidad de analito como se determina en el paso (b), por ejemplo, con un nivel predeterm inado. Además, opcionalmente el método comprende tratar el sujeto con una o más composiciones farmacéuticas por un período de tiempo si la comparación muestra que la concentración o cantidad de analito como se determina en el paso (b), por ejemplo, es desfavorablemente alterada con respecto al nivel predeterminado.

Aún adicionalmente, los métodos pueden utilizarse para monitorear el tratamiento en un sujeto que recibe tratamiento con una o más com posiciones farmacéuticas. Específicamente, dichos métodos implican proporcionar una primera muestra de prueba de un sujeto antes de que el sujeto haya sido administrado con una o más composiciones farmacéuticas. Después, se determina la concentración o cantidad en una primera muestra de prueba de un sujeto de analito (por ejemplo, utilizando los métodos descritos aqu í o como es conocido en la técnica). Después se determina la concentración o cantidad de analito, opcionalmente la concentración o cantidad de analito es entonces comparada con u n nivel predeterminado. Si la concentración o cantidad de analito como se determina en la primera muestra de prueba es inferior al nivel predeterminado, entonces el sujeto no se trata con una o más composiciones farmacéuticas. Sin embargo , si la concentración o cantidad de analito como se determina en la primera muestra de prueba es mayor que el nivel predeterminado, entonces el sujeto es tratado con una o más composiciones farmacéuticas por un período de tiempo. El período de tiempo que el sujeto es tratado con una o más composiciones farmacéuticas puede determinarse por una persona con experiencia en la técnica (por ejemplo, el período de tiempo puede ser de aproximadamente siete (7) días a aproximadamente dos años, preferiblemente de aproximadamente catorce ( 14) días a aproximadamente un (1 ) año).

Durante el curso del tratamiento con una o más composiciones farmacéuticas, segunda y posteriores muestras de prueba entonces se obtienen del sujeto. El número de muestras de prueba y el tiempo en el cual las m uestras de prueba se obtienen del sujeto no es crítico. Por ejemplo , una segunda muestra de prueba se puede obtener de siete (7) días después de que el sujeto es primero administrado por una o más composiciones farmacéuticas, una tercera muestra de puede obtenerse dos (2) semanas después de que el sujeto es primero administrado con una o más composiciones farmacéuticas, una cuarta muestra de prueba puede obtenerse tres (3) semanas después de que el sujeto es primero administrado con una o más composiciones farmacéuticas, una quinta muestra de prueba puede obtenerse cuatro (4) semanas después de que el sujeto es primero administrado con una o más composiciones farmacéuticas, etc.

Después de que cada segunda o posterior muestra de prueba se obtiene del sujeto, la concentración o cantidad de anaiito se determina en la segunda o posterior muestra de prueba está determinada (por ejem plo, utilizando los métodos descritos aqu í o como son conocidos en la técnica) . La concentración o cantidad de anaiito como se determi na en cada u na de la segunda y posterior muestras de prueba entonces se compara con la concentración o cantidad de anaiito como se determina en la primera m uestra de prueba (por ejemplo, la muestra de prueba que opcionalmente originalme nte se compara con el nivel predeterminado) . Si la concentración o cantidad de anaiito determinada en el paso (c) es favorable en comparación con la concentración o cantidad de anaiito determ inada en el paso (a), entonces la enfermedad en el sujeto es determinada por haber sido descontinuada , retrocedida o mejorada, y el sujeto puede continuar siendo administrada a uno o composiciones farmacéuticas del paso (b) . Sin embargo, si la concentración o cantidad determ inada en el paso (c) no se cam bia o es desfavorable en comparación con la concentración o cantidad de an ai ito determinada en el paso (a) , entonces la enfermedad en el sujeto es determinada por haber sido continuada, avanzada o empeorada y el sujeto se puede tratar con una mayor concentración de una o más composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en el paso (b) o el sujeto puede tratarse con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de una o mas composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en el paso (b) . Específicamente, el sujeto puede tratarse con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de una o más composiciones farmacéuticas que el sujeto ha recibido previamente para disminuir o bajar el nivel de analito del sujeto.

En general, para los ensayos en que pruebas repetidas pueden hacerse (por ejemplo, monitoreo de progresión de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento), se obtiene una segunda o posterior muestra de prueba en un periodo de tiempo después de que la primera muestra de prueba se ha obtenido del sujeto. Específicamente, puede obtenerse una segunda muestra de prueba del sujeto minutos, horas, días, semanas o años después de que la primera muestra de prueba se ha obtenido del sujeto. Por ejemplo, la segunda muestra de prueba puede obtenerse del sujeto en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 1 5 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 1 0 horas, aproximadamente 1 1 horas, aproximadamente 1 2 horas, aproximadamente 1 3 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 1 5 horas, aproximadamente 1 6 horas, aproximadamente 1 7 horas, aproximadamente 1 8 horas, aproximadamente 1 9 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 d ías, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 d ías, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 1 1 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas , aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 sema nas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 sema nas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2.5 años, aproximadamente 3.0 años, aproximadamente 3.5 años, aproximadamente 4.0, aproximadamente 4.5 años, aproximadamente 5.0, aproximadamente 5.5 años, aproximadamente 6.0 años, aproximadamente 6.5 años, aproximadamente 7.0 años, aproximadamente 7.5 años, aproximadamente 8.0 años, aproximadamente 8.5 años, aproximadamente 9.0, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 1 0.0 años después de la primera muestra de prueba del sujeto se obtiene.

/ Cuando se utiliza para monitorear la progresión de la enfermedad, el ensayo anterior puede utilizarse para monitorear la progresión de la enfermedad en sujetos que sufren de condiciones agudas. Condiciones agudas, también conocidas como condiciones de cuidados críticos, se refieren a enfermedades agudas, mortales u otras condiciones médicas críticas que involucran, por ejemplo, el sistema cardiovascular o el sistema excretor. Normalmente, las condiciones de cuidados críticos se refieren aquellas condiciones que requieren la intervención médica aguda en un establecimiento basado en el hospital (incluyendo, pero no lim itado a, la sala de emergencias, unidad de cuidados intensivos, centro de trauma u otro establecimiento de atención emergente) o administración por un paramédico u otro personal médico basado en el campo. Para condiciones de cuidados críticos, monitoreo de repetición generalmente se realiza dentro de un marco de tiempo más corto, principalmente, minutos, horas o días (por ejemplo, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 1 0 minutos, aproximadamente 1 5 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 1 1 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 1 5 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 1 7 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 1 9 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproxi madamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días) , y el ensayo inicial asimismo generalmente se realiza en un plazo más corto, por ejemplo, sobre los minutos, horas o días del comienzo de la enfermedad o condición .

Los ensayos también pueden utilizarse para monitorear la progresión de la enfermedad en sujetos que sufren de condiciones no agudas o crónicas. Cuidado no crítico o, las condiciones no agudas, se refiere a cond iciones distintas de enfermedad aguda , q ue amenazan la vida u otras condiciones médicas críticas que implican , por ejemplo, el sistema cardiovascular y/o el sistema excretor. Normalmente, las condiciones no agudas incluyen aquellas de d uración a largo plazo o crónica. Para condiciones no agudas, monitoreo de repetición generalmente se realiza con un plazo de tiempo más largo, por ejemplo, horas, días, semanas, meses o años (por ejemplo, aproximadamente 1 hora , aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 1 1 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 3 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 1 5 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 1 7 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 1 9 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 d ías, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas , aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 1 0 semanas, aproximadamente 1 1 semanas, aproximadamente 1 2 semanas, aproximadamente 1 3 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 1 5 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 1 7 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 1 9 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 sema nas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2.5 años, aproximadamente 3.0 años, aproximadamente 3.5 años, aproximadamente 4.0, aproximadamente 4.5 años, aproximadamente 5.0, aproximadamente 5.5 años, aproximadamente 6.0 años, aproximadamente 6.5 años, aproximadamente 7.0 años, aproximadamente 7.5 años, aproximadamente 8.0 años, aproximadamente 8.5 años, aproximadamente 9.0, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 10.0 años) , y el ensayo inicial asimismo generalmente se realiza dentro de un período de tiempo más largo, por ejemplo, aproximadamente horas, días, meses o años del comienzo de la enfermedad o condición.

Además, los ensayos anteriores pueden realizarse utilizando una primera muestra de prueba obtenida de un sujeto donde la primera muestra es obtenida de una fuente, tal como orina , suero o plasma. Opcionalmente, los ensayos anteriores entonces se pueden repetir usando u na segunda muestra de prueba obtenida del sujeto donde se obtiene la segunda muestra de prueba de otra fuente. Por ejemplo, si se obtiene la primera muestra de prueba de orina, puede obtenerse la segunda muestra de prueba de suero o plasma . Pueden compararse los resultados obtenidos de los ensayos usando la primera muestra de prueba y la segunda muestra de prueba . La comparación puede utilizarse para evaluar el estado de una enfermedad o condición en el sujeto.

Además, la presente descripción tam bién se refiere a métodos para determinar si un sujeto predispuesto a o sufre de una enfermedad , trastorno o condición determinada se beneficiará de tratamiento. En particular, la descripción se refiere a métodos y productos de diagnóstico de compañero de analito. Por tanto, el método de "monitoreo del tratamiento de la enfermedad en u n sujeto" como se describe aquí óptimamente también puede incluir adicionalmente seleccionar o identificar candidatos para la terapia.

Así, en modalidades particulares, la descripción también proporciona un método para determinar si un sujeto tiene, o corre el riesgo de una determinada enfermedad, trastorno o condición es un candidato para la terapia. En general, el sujeto es uno que ha experimentado algún síntoma de una determinada enfermedad, trastorno o condición o que actualmente ha sido diagnosticado como que tiene, o está en riesgo de, una determinada enfermedad, trastorno y/o condición y que demuestra una concentración o cantidad desfavorable de analito o un fragmento del mismo, tal como se describe en este documento.

El método comprende opcionalmente un ensayo tal como se describe aquí, donde el analito es evaluado antes y después del tratamiento de un sujeto con una o más composiciones farmacéuticas (por ejemplo, particularmente con un farmacéutico relacionado con un mecanismo de acción que involucra el analito), con terapia inmunosupresora, o por la terapia de immunoabsorción, o donde el analito se evalúa siguiendo dicho tratamiento y la concentración o la cantidad de analito se compara con un nivel predeterminado. Una concentración desfavorable de la cantidad de analito observada después del tratamiento confirma que el sujeto no se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuo, mientras que una concentración o cantidad favorable de analito observada después del tratamiento confirma que el sujeto se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuo. Esta confirmación ayuda en la gestión de los estudios clínicos y provisión de cuidado del paciente mejorado.

Esto es sin decir que, mientras ciertas modalidades aquí son ventajosas cuando se emplean para evaluar una determinada enfermedad, trastorno o condición como se describe aquí, los kits y ensayos pueden ser em pleados para evaluar el analito en otras enfermedades, trastornos y condiciones. El método de ensayo también puede implicar el análisis de otros marcadores y lo similar.

El método de ensayo también puede utilizarse para identificar un compuesto que mejora una determinada enfermedad , trastorno o condición . Por ejemplo, una célula que expresa el analito puede contactarse con un compuesto candidato. El nivel de expresión de analito en la célula que entra en contacto con el compuesto puede compararse al de una célula de control que usa el método de ensayo descrito aquí.

VI) Kit Un kit para el análisis de una muestra de prueba para la presencia, cantidad o concentración de un analito (o un fragmento del mismo) en una m uestra de prueba tam bién se proporciona. El kit comprende al menos un componente de análisis de la muestra de prueba para el analito (o un fragmento del mismo) e instrucciones para ensayo de la muestra de prueba para el analito (o un fragmento del mismo). Al menos un componente para análisis de la muestra de prueba para el analito (o un fragmento del mismo) puede incluir una composición que comprende una proteína de unión como se describe aquí y/o una proteína de unión de DVD anti-analito (o un fragmento, una variante o un fragmento de su variante), que es opcionalmente inmovilizado sobre una fase sólida.

El kit puede comprender al menos un componente de análisis de la muestra de prueba para un analito por inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes e instrucciones para ensayo de la muestra de prueba para un analito por inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes. Por ejemplo, el kit puede comprender de al menos una pareja de unión específica para un analito, tal como un anticuerpo monoclonal/policlonal , anti-analito (o un fragmento del mismo que puede enlazar con el analito, una variante del mismo que puede enlazar con el analito o un fragmento de una variante que puede enlazar con el analito), una proteína de unión como se describe aqu í , o una proteína de unión de DVD anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo) , cualquiera de los cuales puede etiquetarse detectablemente. Alternativamente o adicionalmente, el kit puede comprender de analito etiquetado detectablemente (o un fragmento del mismo que puede enlazar a un anticuerpo monoclonal/policlonal , anti-analito, una proteína de unión como se describe aqu í , o una proteína de unión de DVD anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante del mismo)), que puede competir con cualquier analito en una muestra de prueba para la unión a un anticuerpo monoclona l/policlonal , anti-ana lito (o un fragmento del mismo que puede enlazar con el analito, una variante del mismo que puede enlazar con el analito, o un fragmento de una variante que puede enlazar con el analito), una proteína de unión como se describe aquí, o una proteína de unión de DVD anti-analito (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante del mismo), cualquiera de los cuales puede ser inmovilizado en un soporte sólido. El kit puede comprender un calibrador o control, por ejemplo, analito aislado o purificado. El kit puede comprender al menos un contenedor (por ejemplo, tubo, placas de microtitulación o tiras, que pueden ser ya recubiertas con una primera pareja de unión específica, por ejemplo) para conducir el ensayo, y/o un regulador de pH, tal como un regulador de pH de ensayo o un regulador de pH de lavado, uno de los cuales se puede proporcionar como una solución concentrada, una solución de sustrato para la etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta enzimática), o una solución de paro. Preferentemente, el kit comprende todos los componentes, es decir, reactivos, estándares, reguladores de pH, diluyentes, etc. , que se utilizan para realizar el ensayo. Las instrucciones pueden ser en forma de papel o en formato legible por computadora, tal como un disco, CD, DVD o lo similar.

Más específicamente, se proporciona un kit para análisis de una muestra de prueba para un antígeno (o un fragmento del mismo). El kit comprende al menos un componente de análisis de la muestra de prueba para un antígeno (o un fragmento del mismo) e instrucciones para el análisis de la muestra de prueba para un antígeno (o un fragmento del mismo), en donde al menos un componente incluye al menos una composición que comprende una proteína de unión, tal como una proteína de unión a DVD, descrita aquí.

Cualquiera de los anticuerpos, tal como un anticuerpo anti-analito, cualquier proteína de unión como se describe aqu í , cualquiera de las proteínas de unión de DVD anti-analito, o trazadores pueden incorporar una etiqueta detectable como se describe aquí , tal como un fluoróforo, un radical radiactivo, una enzima , una etiqueta de biotina/avidina, un cromóforo, una etiqueta quim ioluminiscente o lo similar, o el kit puede incluir reactivos para realizar etiquetado detectable. Los anticuerpos, cali bradores y/o controles pueden ser proporcionados en contenedores separados o pre-dispensados en un formato de ensayo apropiado, por ejemplo, en placas de microtitulación .

Opcionalmente, el kit incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibradores y controles positivos) . Preparación de los reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en hojas de inserto para una variedad de productos de inmunodiagnóstico. Miembros del panel de sensibilidad opcionalmente se utilizan para establecer las características de rendim iento de ensayo, y además opcionalmente son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del kit de inmunoensayo, y la normalización de ensayos.

El kit opcionalmente también puede incluir otros reactivos necesarios para conducir un ensayo de diagnóstico o facilitar las evaluaciones de control de calidad , tal como reg uladores de pH , sales, enzimas, cofactores de enzima, sustratos de enzima, los reactivos de detección y similares. Otros com ponentes, tal como reg uladores de pH y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, reactivos de pre-tratam iento) , también se pueden incluir en el kit. El kit adicionalmente puede incluir uno o más de otros controles. Uno o más de los componentes del kit pueden ser liofilizados, en cuyo caso el kit puede comprender además los reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes liofilizados.

Los diversos com ponentes del kit opcionalmente se proporcionan en contenedores adecuados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtitulación. El kit además puede incluir contenedores para mantener o almacenar una muestra (por ejemplo, un contenedor o un cartucho para una muestra de orina). En su caso, el kit opcionalmente también puede contener los recipientes de reacción, recipientes de mezclado y otros componentes que facilitan la preparación de reactivos o la muestra de prueba. El kit también puede incluir uno o más instrumentos para ayudar a la obtención de una muestra de prueba , tal como una jeringa, pipeta , fórceps, cuchara de medición , o lo similar.

Si la etiqueta detectable es al menos un compuesto de acridina, el kit puede comprender al menos una acridina-9-carboxamida, al menos un éster arílico de acridina-9-carboxilato o cualquier combinación de los mismos. Si la etiqueta detectable es al menos un compuesto de acridina, el kit también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tal como un regulador de pH , una sol ución y/o al menos una solución básica. Si se desea , el kit puede contener una fase sólida , tal como una partícula magnética , perla, tubo de ensayo, placa de microtitulación , probeta, membrana, molécula de andamios, película, papel de filtro, disco o chip.

A. Adaptación del kit y método El kit (o sus com ponentes), así como el método para determinar la presencia , cantidad o concentración de un analito en una muestra de prueba, tal como un inmunoensayo como se describe aquí, puede ser adaptado para su uso en una variedad de sistemas automatizados y semi-automatizados (incluyendo aquellos en donde la fase sólida comprende una micropartícula) , como se describe, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos Nos. 5, 089,424 y 5,006,309 y vendida comercialmente, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, I L) como ARCHITECT®.

Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semi-automatizado en comparación con un sistema no automatizado (por ejemplo, ELISA) incl uyen el sustrato al cual la primera pareja de unión específica (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal/policlonal anti-analito, (o su fragmento, una variante del mismo o un fragmento de una variante del mismo) , una proteína de unión como se describe aquí , o una proteína de unión de DVD anti-analito (o su fragmento, su variante, o su fragmento de una variante) se une; ya sea a manera , de formación sándwich y reactividad de anal ito puede ser impactado) y la longitud y el tiempo de la captura, detección y/o cualquiera de los pasos de lavado opcionales. Mientras que un formato no automatizados, tal como un ELI SA, puede requerir un tiempo de incubación relativamente largo con reactivo de captura y m uestra (por ejemplo, aproximadamente 2 horas) , un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCHITECT®, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 18 minutos para ARCHITECT ®). Asimismo, considerando que un formato no automatizado, tal como un ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección, tal como el reactivo conjugado, por un período de incubación relativamente largo (por ejemplo, unas 2 horas), un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCHITECT®) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 4 minutos para el ARCHITECT®).

Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen, pero no se limitan a, AxSYM®, IMx® (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos 5,294,404, PRISM®, EIA (perla) y Quantum™ II, así como otras plataformas. Además, los ensayos, kits y componentes del kit pueden ser empleados en otros formatos, por ejemplo, en sistemas de ensayos electroquímicos u otros de punto de atención portátiles. La presente descripción es, por ejemplo, aplicable a sistema de inmunoensayo electroquímico comercial Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories) que realiza inmunoensayos de sandwich. Se describen inmunosensores y sus métodos de fabricación y operación de dispositivos de prueba de un solo uso, por ejemplo en, Patente de E.U.A. Nos. 5,063,081, 7,419,821; y 7,682,833; Publicación de E.U.A. Nos.20040018577 y 20060160164.

Es más evidente decir que los métodos y kits como se describe en este documento necesariamente incluyen otros reactivos y métodos para la realización del inmunoensayo. Por ejemplo, se incluyen varios reguladores de pH tal como son conocidos en la técnica y/o que pueden ser fácilmente preparados u optimizados para emplearse, por ejemplo, para el lavado, como un diluyente conjugado, diluyente de micropartículas, y/o como un diluyente calibrador. U n diluyente conjugado ejemplar es ARCHITECT® diluyente conjugado empleado en ciertos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L) y que contiene ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) , una sal , un bloqueador de proteína, un agente antimicrobiano, y un detergente. Un diluyente de calibrador ejemplar es diluyente calibrador humano ARCHITECT® empleado en ciertos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L), que comprende un regulador de pH que contiene el MES , otra sal, un bloqueador de proteína y un agente antimicrobiano. Adicionalmente, como se describe en Solicitud de patente de E. U.A. Nos. 61 /142,048 presentada el 31 de diciembre de 2008, generación de señal mejorada puede obtenerse, por ejemplo, en un formato de cartucho de l-Stat, utilizando una secuencia de ácido nucleico enlazada al anticuerpo de señal como un amplificador de señal.

Será aparente para aquellos de experiencia en la técnica que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de los métodos descritos aquí son obvios y pueden realizarse usando equivalentes adecuados sin apartarse del alcance de las modalidades descritas aquí . Ahora se describen ciertas encarnaciones en detalle, las mismas serán más claramente entendidas para referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen para fines de ilustración solamente y no están destinadas a ser limitantes .

Ejemplos Ejemplo 1 Proteínas de unión parental de TN F-a mejoradas Ejemplo 1 .1 Identificación de proteínas de unión com pletamente humanas a TNF por sistemas de despliegue in vitro 1 .1 . 1 Selecciones de anticuerpo Anticuerpos monoclonales de TNF anti-humanos completamente humanos fueron aislados por tecnologías de visualización in vitro de genotecas de anticuerpo humano por su capacidad de enlazar proteínas de TN F humanas recombinantes. Las secuencias de am inoácidos de las cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) se determ ina a partir de la secuenciación del DNA y enumeradas en el cuadro 1 B en la sección A) I) A) anteriormente. 1 .1 .2: Maduración de afinidad de la proteína de unión de TNF humana completamente humana AE 1 1 -5 La proteína de unión h umana AE 1 1 -5 a TNF humano fue madurado de afinidad por la tecnolog ía de despliegue in vitro. Una genoteca de cadena ligera fue construida para contener la mutagénesis limitada en los siguientes residuos: 28, 31 , 32, 51 , 55, 91 , 92, 93, 95a y 96 (numeración de Kabat). Esta genoteca contiene también retro- mutaciones de línea germinal de marco contenidas D 1 E, M4L, H 1 1 Q, R49K, H76N y Q 103K, así como residuos alternados en posición 50(R/K) y 94(S/L) para permitir el lineamiento germinal de marco durante selecciones de genoteca . Dos genotecas de cadena pesada se hicieron para contener la mutagénesis limitada en CDRH1 y CDRH2 en residuos 30, 31 , 33, 50, 52 y 55 a 58 (numeración de Kabat) o en CDRH3 en residuos 95 a 1 00b. La genoteca que contiene diversidades CDRH 1 y CDRH2 también tiene retro-mutaciones de línea germinal de marco A1 8V y L64Q y alternar el residuo en 54(L/F) y 78(V/A) . La genoteca de CDRH3 tiene un residuo alternado ad icional en 100c(A/F).

Todas las tres genotecas fueron seleccionadas por separado para que poder enlazar a TNF de mono cynomolgus o humano en presencia de la disminución de concentraciones de antígenos de TN F de mono cynomolgus o humano biotin ilado. Todas las secuencias de CDR mutadas recuperadas de selecciones de genoteca se recombinan en genotecas adicionales y las genotecas recombinadas fueron sometidas a condiciones de selección más estrictas antes de que se identifiquen anticuerpos individuales.

El sig uiente cuadro (cuadro 2) proporciona una lista de secuencias de aminoácidos de VH y VL de la proteína de unión AE 1 1 -5 completamente humana que fueron sometidos al protocolo de selección de la maduración de afin idad . Residuos de aminoácidos de CDRs individuales de cada secuencia VH y VL se indican en negrita.

CUADRO 2 Residuos de aminoácidos observados en anticuerpos AE 1 1 -5 madura< de afinidad AE1.1-5 Región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 805) AE11- 12345678901234567890123456789012345678901234567890123345678901 5VH EVQLVQSGAEVKKPGSSAKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTANYAQ V N TTT WT FRSPI TY SV M TDAST GI P L I NGS AN G V P V F N I H R V A L K R F M L 234567890123456789012abc345678901234567í Í90abcl234567í ? 90123 KgLGRVTITADESTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYYDPTRADrWGQGTLVTVSS Q A SVFFNTSWF WIWEFASM TFP TRKP ARH IGRA Q ADI Y V P N G AE11-5 Región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 806) AE11- 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901 5VL DIVMTQSPDFHSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIRHASQSISGVPSR E L Q R RR KYV L T TT P V N GN T T I NC G S C KG S M G CI E N K HK D K Y VM F PL R LY P V 2345678901234567890123456789012345a67890123456a FSGSGSGTDFTLTIHSLEAEDAATYYCHQSSSSPPPTFGQGTQVEIK RRRL LS NGI AR GIC SL TCG RT CNN TA ITT QQ MK HH V M Ejemplo 1.2 Maduración de afinidad de una proteína de unión TN F humana humanizada hMAK-1 95 El anticuerpo TNF antihumano de ratón MAK-195 se humaniza y madura de afinidad para generar un panel de variantes MAK195 humanizado que tienen reactividad cruzada cino-TNF y afinidad mejorada y cinéticas de unión contra cino-TNF y humano.

Para mejorar la afinidad de hMAK1 95 a TNF, se identifican residuos CDR hipermutados de otras secuencias de anticuerpo humano en la base de datos IgBLAST que también comparte identidad alta a líneas germinales VH3-53 e IGKV1 -39. Los residuos CDR hMAK1 95 correspondientes después se someten a mutagénesis limitada por PCR con iniciadores que tienen degeneración baja en estas posiciones para crear tres genotecas de anticuerpos en el formato scFv. La primera genoteca contiene mutaciones en residuos 31 , 32 , 33, 35, 50, 52, 53, 54, 56 y 58 en el CDR1 VH y 2 (numeración de Kabat); la segunda genoteca en residuos 95 a 1 00, 1 00a, 1 01 y 1 02 en CDR3 VH ; y la tercera genoteca en residuos 28, 30, 31 , 32, 50, 53, 92 , 93, 94 y 95 en la tres CDRs VL. Para aumentar adicionalmente la identidad de hMAK1 95 para las secuencias de marco de la línea germinal humana, una degeneración binaria en posiciones de VH 60 (D/A) , 61 (S/D) , 62 (T/S) , 63 (L/V) y 65 (S/G) se introducen en la primera genoteca. También, una degeneración binaria en las posiciones de VL 24 (K/R), 33 (V/L) , 54 (R/L) , 55 (H/Q) , 56 (T/S), 91 (H/S) y 96 (F/Y) se introducen en la tercera genoteca .

Estos h MAK1 95 seleccionados contra una baja concentración de TNF biotinilado para mejor en la tasa encendida , tasa apagada o ambas se llevan a cabo y secuencias de proteínas de anticuerpo de hMAK1 95 modulada de afinidad se recuperan para la conversión nuevamente a IgG para caracterización adicional. Las tres genotecas son seleccionadas por separado para la capacidad de unir TNF de mono cynomolgus o humano en presencia de la disminución de concentraciones de antígenos de TNF de mono cynomolgus o humano biotinilados. Todas las secuencias de CDR mutadas recuperadas de selecciones de genoteca se recombinan en genotecas adicionales y las genotecas recombinadas se someten a condiciones de selección más estrictas antes de que anticuerpos individuales se identifican.

El siguiente cuadro (cuadro 3) proporciona una lista de secuencias de aminoácidos de VH y VL de MAK-1 95 humanizado que se someten al Protocolo de selección de la maduración de afinidad . Residuos de aminoácidos de CDRs individuales de cada secuencia VH y VL se indican en negrita.

CUADRO 3 Residuos de aminoácidos observados en hMAK-195 madurado de afinidad Los cuadros 1 D y E anteriormente en la sección I) A) proporcionan una lista de anticuerpos MAK-195 humanizados que se convierten en proteínas IgG para caracterización.

Pares de cadenas ligeras y pesadas se preparan como sigue en el cuadro 4: CUADRO 4 Pares de cadenas pesada y ligera de clones madurados de afinidad hMAK195 Ejemplo 1.3 Maduración de afinidad de una proteína de unión TNF humana humanizada hMAK-199 El anticuerpo TNF antihumano de ratón MAK-199 es humanizado y madurado de afinidad para generar un panel de variantes de MAK195 humanizado que tiene afinidad y cinéticas de unión mejoradas contra ciño TNF y humanos. Varias genotecas se hacen de acuerdo con las siguientes especificaciones: Tres genotecas HC se hacen después de la retro-mutación V2I primero se introduce y confirma que no impacta la afinidad scFv a TNF.

Genoteca H1 + H2 (DDK): - Mutagénesis limitada a 7 residuos (T30, N31, N35, T52a, T54, E56, T58) - Alternar la línea germinal: M34I y F63LH1 Genoteca H1 + H2 (QKQ): - Mutagénesis limitada a 7 residuos (T30, N31, N35, T52a, T54, E56, T58) - Alternar la línea germinal: M34I y F63L - Retro-mutaciones de línea germinal: D61Q, D62K, K64Q, F67V, F69M, L71T Genoteca H3: - Mutagénesis limitada en 12 residuos 95-100, 100a-100f - Alternar la línea germinal: F91Y Genoteca LC: - Mutagénesis limitado a 11 residuos 28, 30-32, 50, 53, 91- 94, 96 - Alternar la línea germinal: T51A, Y71F, F87Y y T43A/V44P (estos dos co-evolucionan) Genotecas recombinadas: Genotecas VH se recombinarán con y sin la genoteca VL después de diversidad de genoteca se reduce después de al menos 3 rondas de selección.

Todas las cuatro genotecas se seleccionan por separado para que poder enlazar TNF de mono cynomolgus o humano en presencia de la disminución de concentraciones de antígenos TNF de mono cynomolgus o humano biotinilado. Todas las secuencias de CDR mutadas recuperadas de selecciones de genoteca se recombinan en genotecas adicionales y las genotecas recombinadas son sometidas a condiciones de selección más estrictas antes que los anticuerpos individuales se identifican.

El siguiente cuadro (cuadro 5) proporciona una lista de secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo hMAK-199 que se someten al protocolo de selección de maduración de afinidad. Residuos de aminoácidos de CDRs individuales de cada secuencia VH y VL se indican en negrita.

CUADRO 5 Residuos de aminoácidos observados en proteínas de unión hMAK-199 maduradas de afinidad MRK199 Región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 809) MAK199VH 1234567890123456789012345678901234567890123456789012a345678901 .2a EIQLVQSGAEVKKPGflSVKVSCKASGYTFTN-OdNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYAD V ND II N K S Q AH T S V H ST Q Q N RS s R M DO G L K KK A S A P V N R Q I Q M D D G A E 234567890123456789012abc345678901234567890abcdefql234567890123 DFKCRFTFTLDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFLT VW DYAMDYWGQGTTVTVSS GLT V M T Y RLFNPMDASEHT K Q NYMKVEAEM SR IRSSAEMN CC VSRARSD H CWL IMG D QP QII I VF GPQ F ND D P V GM N L CA L A H Makl99 Región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 810) Makl99Vk 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901 .la DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLN YQQKPGKTVKLLIYYTSRLQSGVPSR YQV AP FA L ESF V N K AKT G TT WH GD NR F C 234567890123456789012345678901234567890123456a FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPPTFGQGTKLEIK F Y isw T MQ s IP A AM RR F G V Y A Secuencias individuales de VH y VL hMAK-199 de clones convertidos se preparan y se muestran anteriormente en cuadros 1 F y G en la sección I) A) .

CUADRO 6 Clones scFv madurados de afinidad h MAK1 99 convertidos a IgG de longitud completa Ejemplo 1.4 Determinación de afinidad usando tecnología BIACORE CUADRO 7 Reactivo para análisis biacore Métodos BIACORE: El ensayo BIACORE (Biacore, I nc. Piscataway, NJ) determ ina la afinidad de proteínas de un ión con mediciones cinéticas de constantes de velocidad de asociación y velocidad de disoción. Unión de proteínas de unión a un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno objetivo recom binante purificado) está determ inada por las mediciones basadas en la resonancia de plasmón de superficie con Biacore® 1000 o instrumento 3000 (Biacore® AB, Uppsala , Suecia) usando ejecutar H BS-EP ( 10 mM H EPES [pH 7.4], 1 50 m M NaCI, 3 m M EDTA y 0.005% agente surfactante P20) a 25°C . Todos los químicos son obtenidos de Biacore® AB (U ppsala, Suecia) o de otra manera desde una fuente diferente como se describe en el texto. Por ejemplo, aproximadamente 5000 RU de IgG anti-ratón de cabra , (Fcy), anticuerpo policlonal específico de fragmento (Pierce Biotechnology I nc, Rockford , I llinois, Estados Unidos) diluido en acetato de sodio 1 0 mM (pH 4.5) se inmoviliza directamente a través de un chip biosensor de grado de investigación CM5 util izando una kit de acoplamiento de amina estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los proced imientos en 25 µg/ml . Rad icales que no reacciona n en la superficie del biosensor está n bloqueados con etanolamina. Superficie de dextrano de carboximetil mod ificado en celda de flujo 2 y 4 se utiliza como una superficie de reacción. Dextrano carboximetil sin modificar sin IgG anti-ratón de cabra en celda de flujo 1 y 3 se utiliza como la superficie de referencia . Para análisis cinético, ecuaciones de tasa derivadas del modelo de unión de Langmuir 1 : 1 se asocian simultánea mente a las fases de asociación y disociación de las ocho inyecciones (usando análisis de ajuste global) con el uso de software de Biaevaluation 4.0. 1 . Anticuerpos purificados se diluyen en solución salina regulada de pH con H EPES para captura a través de superficies de reacción específica de IgG anti-ratón de cabra . Anticuerpos a ser capturados como un ligando (25 µg/m l) se inyectan en matrices de reacción a un caudal de 5 µ?/minuto. Las constantes de velocidad de asociación y disociación , ka Soc (M"1 s_ 1 ) y kdisoc (s-1), se determinan utilizando un caudal continuo de 25 µ?/minuto. Constantes de velocidad se derivan haciendo mediciones de unión cinética en concentraciones de antígeno diferentes que van desde 10-200 nM. La constante de disociación de equilibrio (M) de la reacción entre los anticuerpos y los antígenos objetivo entonces se calcula de las constantes de velocidad cinética mediante la siguiente fórmula: KD= kdisoc kasoci . U nión se registra como una función del tiempo y constantes de velocidad cinética se calculan. En este ensayo, en tasas tan rápidas como 1 06M 1 s' 1 y velocidades de disociación tan lentas como 10 6s se pueden medir.

Las proteínas de unión en el presente documento se espera que tengan propiedades benéficas en este sentido, incluyendo la alta afinidad, lenta velocidad de dosiciación , y alta capacidad de neutralización .

Ejemplo 1 .5 Neutralización de TNF-a h umano Las células L929 se cultivan a una densidad de semi-confluente y se cosechan utilizando tripsina al 0.25% (Gibco #25300) .

Las células se lavan con PBS, contadas y re-suspendidas en 1 E6 células/m L en los medios de ensayo que contienen 4 µ9/?t>?_ de actinomicina D. Las células se siembran en una placa de 96 pozos (Costar #3599) en un volumen de 100 µ? y 5E4 células/pozo. Las proteínas de un ión e IgG de control son diluidas a una concentración 4X en medios de ensayo y se realizan diluciones 1 :4 seriales. HuTNF-a se diluye a 400 pg/m L en los medios de ensayo. Muestra de proteína de unión (200 µ?) se añade a huTNF-ct (200 µ?) en un esquema de dilución 1 :2 y permite incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente.

La solución de TN F-a humano/proteína se añade a las células plateadas en 1 00 µ? para una concentración final de 100 pg/mL de huTNF-a y 1 50 nM-0.0001 nM de proteína de unión. Las placas se incuban durante 20 horas a 37°C, 5% de C02. Para cuantificar la viabilidad, 1 00 µ? se extraen de los pozos y se agregan 1 0 µ? de reactivo WST-1 (Roche cat # 1 1644807001 ) . Las placas se incuban en condiciones de ensayo durante 3.5 horas . Las placas se leen en OD 420 600 nm en un lector de placas ELI SA Spectromax 1 90.

Las proteínas de unión aquí se espera que tengan propiedades beneficiosas en este sentido, incluyendo alta afinidad, velocidad de disociación lenta y alta capacidad de neutralización.

Ejemplo 2 Maduración de afinidad de anticuerpo I L-1 7 anti-humano humanizado h 10F7 El anticuerpo I L-17 anti-humano humanizado fue previamente descrito. Este anticuerpo fue posteriormente madurado de afinidad para mejorar su afinidad total al ser humano, mono de cynomolgus y ratón IL-17. Varias genotecas se hacen de acuerdo con las siguientes especificaciones: Genoteca H1 + H2: - Mutagénesis limitada en 7 residuos en 30, 31, 33, 35, 53, 56, 57 y 58.

- Alternar entre la línea germinal humana y secuencias de h10F7 en posiciones 27, 48, 51, 52, 54, 67 y 69.

Genoteca H3: - Mutagénesis limitada en 95 - 100 y 102.

- Alternar entre la línea germinal humana y secuencias de h10F7 en 93.

Genoteca de LC 1 : - Mutagénesis limitada en 30, 31, 32, 34, 50, 53, 89, 91, 92, 93 y 96.

- Alternar entre la línea germinal humana y secuencia de h10F7 en las posiciones 4, 24, 27, 29, 33, 36, 43, 47, 52 y 55.

Genoteca LC 2: construida con un residuo adicional en posición G28 en CDR1 para aumentar la identidad a los anticuerpos humanos.

- Mutagénesis limitada a 28, 30, 31, 32, 34, 50, 53, 89, 91, 92, 93 y 96.

- Alternar entre la línea germinal humana y secuencia de h10F7 en posiciones 24, 27, 29, 33, 37, 44, 48, 52 y 55.

- Mutación de línea germinal de marco en FR 1 (posición 4) a probarse primero como scFv. "M" será usado en lugar de "L" Si la unión no se ve afectada.

Genoteca rHC: recombinar salidas de genotecas H 1 + H2 y H3.

Genoteca rHCLC: recom binar salidas de H 1 + H2, H3 y genotecas LC1 o LC2. (Usar LC2 en lugar LC 1 si unión de salida de LC2 parece ser al menos tan bueno como WT, de lo contrario se recombinan la salida de LC 1 ) .

Todas las cuatro genotecas fueron seleccionadas por separado para la capacidad de unir I L-1 7 de ratón y nomo cynomolgus, humano en la presencia de la disminución de las concentraciones de antígenos biotinilados. Todas las secuencias de CDR mutadas recuperadas de selecciones de genotecas se recombinan en genotecas adicionales y las genotecas recom binadas fueron sometidas a condiciones de selección más estrictas antes de que se identifiquen anticuerpos individuales.

El cuadro 8 proporciona una lista de secuencias de aminoácidos VH de anticuerpo h 1 0F7 que fueron sometidos al protocolo de selección de maduración de afinidad. Residuos de aminoácidos de CDRs individuales de cada secuencia VH se indican en negrita .

CUADRO 8 Lista de secuencias de aminoácidos de variantes VH h10F7 maduradas de afinidad El cuadro 9 proporciona una lista de secuencias de aminoácidos de las regiones VL de anticuerpos I L-1 7 humanos completamente madurados de afinidad derivados de h 10F7. Residuos de aminoácidos de CDRs ind ividuales de cada secuencia VH se indican en negrita.

CUADRO 9 Lista de secuencias de aminoácidos de variantes VL h1 0F7 maduradas de afinidad CUADRO 1 0 Residuos de am inoácidos observados en anticuerpo anti-I L-1 7 madurado de afinidad h 10F7 hl0£7 Región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 811) hlOfWH.l 1234567890123456789012345678901234567890123456789012a345678901 EVQLVQSGAEVKKPGSSV VSCKASGYTFTDYEIHWVRQAPGQGLEWIGVNDPESGGTFYMQ DE M I D SL S IY A M E N P 234567890123456789012abc345678901234567890abcdl234567890123 KFDGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRYYRYESFYGMDYWGQGTTVTVSS V I DKWDGLE I I SM W YN C W Y SD E F V L L E N S S N M Q F F A H R A F M K H hl0f7 Región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 812) H10f7Vk 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901 .la DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASS-SISYIYWFQQKPGKSPKR IYATFEIASGVPSR M R QGIRRCLD Y A L R SD K SVSNSVN E A DLVGD F D Y Q NTN S S G A FPP Q G Q I GLI G T W V LDF Q L T PCA P H E K M M 234567890123456789012345678901234567890123456a FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCHQRSSYPWTFGQGTKLEIK R VGN E Q WTI L LMR N M F Y KRT S FKY V PAL A GDM S W Q I H T G D Los siguientes se convierten en IgG para caracterización adicional.

CUADRO 11 Secuencias VH anti-IL17 individuales de clones convertidos CUADRO 12 Secuencia VL anti-IL-17 de clones individuales CUADRO 13 Clones scFv madurados de afinidad h10F7 convertidos a IgG de longitud completa Caracterización funcional de proteínas DVD-lg TNF/IL-17 Protocolo de ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) IL-17 El siguiente protocolo se utiliza para caracterizar la unión de anticuerpos IL-17 para IL-17 humano por ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA). Se recubrió una placa de ELISA con 50 µ? por pocilio de IgG-Fc anti ratón de cabra a 2pg/ml, durante la noche a 4°C. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de Mab diluido a 1 g/ml en PBS/BSA al 0.1 % se agregó a los pocilios adecuados y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de biotina-I L-17 humana diluida en serie se agregó a los pocilios adecuados y se incubó durante 1 hora a RT. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de estreptavidina-HRP diluida 1 : 10,000 en PBS/BSA al 0.1 % se agregó a los pocilios adecuados y se incubaron durante 1 hora a RT. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de TMB se agregaron a los pocilios adecuados y la reacción se dejó continuar durante 1 minuto. La reacción se detuvo con 50 µ? / pocilio de H2S04 2N y se leyó la absorbancia a 450 nm.

CUADRO 14 Determinación de afinidad de unión de anticuerpos IL-17 a IL-17 humano por ELISA Medida de afinidad de Anti DVD-lg TNF/IL-17 por resonancia de plasmón de superficie La unión de anticuerpos a proteínas IL-17 recombinantes purificadas se determina por las mediciones basadas en la resonancia de plasmón de superficie con un instrumento de Biacore® T200 (GE Healthcare) utilizando HBS-EP de ejecución ( 1 0 mM HEPES [pH 7.4], 1 50 m M de NaCI , 3 mM EDTA y 0.005% de agente surfactante P20) que contiene 0.1 mg/ml de BSA a 25°C. Todos los químicos obtenidos de Biacore® AB (GE Healthcare) o de otra manera de una fuente como se describe en el texto. Aproximadamente 5000 RU de anticuerpo policlonal específico de fragmento IgG anti-humano de cabra (Fcg) (Pierce Biotecnology Inc, Rockford, I L) diluido en acetato de sodio 1 0 mM (pH 4.5) se inmoviliza directamente a través de un chip biosensor de grado de investigación CM5 usando un kit de acoplam iento de am ina estándar de acuerdo con instrucciones del fabricante y los procedimientos a 25 pg/ml. Radicales que no reaccionan en la superficie del biosensor son bloqueados con etanolamina. Superficie de dextrano carboximetilo modificado en celda de flujo 2, 3 y 4 son usados como una superficie de reacción . Dextrano carboximetilo modificado con IgG de cabra en la celda de flujo 1 es utilizado como la superficie de referencia . Para análisis cinético, ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de unión de Langmuir 1 : 1 se ajustaron simultáneamente a las fases de asociación y disociación de las seis inyecciones (usando análisis de ajuste global con flotador local para Rmax) con el uso de software v.1 .0 de evaluación Biacore T200. Anticuerpos purificados se diluyen en solución salina regulada de pH con H EPES para captura a través de superficies de reacción específica IgG anti-humana de cabra. Anticuerpos que son capturados como ligando ( 1 -5 g/ml) se inyectan en matrices de reacción a una velocidad de flujo de 50 µ?/minuto. Se monitorea la fase de asociación por 5 minutos, mientras la fase de disociación se monitorea por 10-60 minutos para acomodar las velocidades de disociación más lentas. Las constantes de velocidad de asociación y disociación, ka (unidad M"1s 1) y kd (unidad s"1) se determinan bajo una velocidad de flujo continua de 50 ul/minuto. Constantes de velocidad se derivan por hacer mediciones de unión cinética en seis concentraciones de antígeno diferentes que varían de 0.78 nM a 100 nM, dependiendo de las especies de IL-17 analizadas. La Asociación ka, velocidad de disociación Kd y constante de disociación de equilibrio se calculan con el uso del mismo software v.1.0 de evaluación Biacore T200.

CUADRO 15 Ensayo para secreción de IL-6 inducida por IL-17A e IL-17A/F en fibroblastos de prepucio humana primaria HS27 La línea celular HS27 humana (ATCC acceso # CRL-1634) secreta IL-6 en respuesta a IL-17. Se inhibe la secreción de IL-6 inducida por IL-17 mediante la neutralización de anticuerpos anti-IL-17 (véase, por ejemplo, J. Immunol., 155:5483-5486 (1995); Cytokine, 9:794-800 (1997)).

Las células HS27 se mantienen en medio de ensayo: medio de glucosa alta de DMEM (Gibco #11965) con 10% de suero bovino fetal (Gibco #26140), 4 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, penicilina G (100 U/500 mi) y estreptomicina (100 Mg/500 mi). Las células son cultivadas en matraces T150 hasta que aproximadamente 80-90% confluente el día del ensayo. IL-17A humano (R & D Systems, #317-IL/CF), o mono cynomolgous (cyno) IL-17A (generado en Abbott) se reconstituyen en PBS estéril sin Ca2+ y Mg2+ almacenados congelados, recién descongeladas para uso diluidas a 240 pM (4X) o 4nM (4X) para IL-17A/F en el medio de ensayo. Se realizan diluciones seriadas de anticuerpos en una placa separada (concentraciones 4X), mezcladas con un volumen igual de 240 pM (4X) de hulL-17 o cynolL-17A o 4 nM (4X) hulL-17A/F y se incuban a 37°C durante 1 hora. Células HS27 (normalmente aproximadamente 20.000 en 50 µ? de medio de ensayo) se agregan a cada pozo de una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Costar #3599), seguido por la adición de 50 µ? de anticuerpo pre-incubado más mezcla de IL-17. La concentración final de humano y cynolL-17A es 60 pM. La concentración final de IL-17A/F humano es 1 nM. Las células se incuban durante aproximadamente 24 horas a 37°C. Luego se recogieron los sobrenadantes de medios. Se mide el nivel de neutralización de IL-17 por determinación de las cantidades de IL-6 en el sobrenadante utilizando un kit comercial de Meso Scale Discovery (cat # L411AKB-1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtienen valores de IC50 utilizando logaritmo de anticuerpo frente a ajuste de pendiente variable de cantidad de IL-6.

Ensayo para secreción de IL-6 inducida por TNF-a e IL-17 de línea celular de fibroblastos embriónicos de murino (NIH3T3) La línea celular N1H3T3 de murino (ATCC acceso # CRL-1658) secreta IL-6 en respuesta a murina IL-17A de rata o conejo y TNFa de murino (R&D Systems, Cat# 410-MT). Se inhibe la secreción de IL-6 inducida por IL-17 mediante la neutralización de anticuerpos anti-IL-17.

Las células N1H3T3 se mantienen en medio de ensayo: DMEM (Invitrogen Cat#11965-092) con 10% de suero bovino fetal (Gibco #26140-079), 1% de aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, penicilina G (100 U/500 mi) y estreptomicina (100 pg/500 mi). Las células son cultivadas en matraces T150 hasta que aproximadamente 80-90% confluente el día del ensayo. IL-17A de rata IL17A (Prospec bio, Cat# CYT-542) se reconstituyen en PBS estéril sin Ca2+ y Mg2+, con 0.1% de BSA, forman alícuotas y se almacenan congeladas en 100 µg/ml. IL17A de conejo (Abbott, A-1239293.0) se forma en alícuotas y almacenan congeladas a 260 pg/mL. TNF-a de murino se reconstituye en 0.1% de BSA/PBS sin Ca2+ y Mg2+ en una concentración de 10 pg/mL, se forman alícuotas y almacenan congeladas. Anticuerpos de I L-1 7 recién descongeladas se diluyen a 200 9/??? (4X) en el medio de ensayo. Se realizan diluciones seriadas de anticuerpos en una placa separada (concentraciones 4X), se mezclan con igual volumen de 40 ng/ml (4X) de I L-1 7A de murino o rata o 100 ng/mL de I L-1 7A de conejo, y se incuban a 37°C durante 1 hora.

Células N I H3T3 (normalmente aproximadamente 400.000 células en 50 µ? de medio de ensayo) se agregan a cada pozo de una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Costar #3599) , seguido de la adición de 50 µ? de anticuerpo pre-incubado más mezcla de I L-1 7. M U TN F-a 5.5 ng/m l (1 0x) se añade en 1 1 µ? de medios a cada pozo. La concentración final de I L-1 7A es 10 ng/ml para murina y rata y 25 ng/mL para conejo. La concentración final de mu TN Fa es 0.55 ng/mL. Las células se incuban durante aproximadamente 24 horas a 37°C. Luego se colectaron los sobrenadantes de medios. Se mide el nivel de neutralización de I L-1 7 por determinación de las cantidades de I L-6 en el sobrenadante utilizando un kit comercial de Meso Scale Discovery (cat # K1 12AKA-4) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtienen valores de IC50 utilizando logaritmo de anticuerpo frente a ajuste de pendiente variable de cantidad de I L-6.

CUADRO 16 Ejemplo 3 Generación de moléculas DVD-lg anti-TNF/IL-17 novedoso y completamente novedoso 1 .1 Construcción de constructos de DNA DVD-lg TNF/I L-17 Dominios variables de anticuerpo anti-TNF se combinan con múltiples dominios variables del anticuerpo IL-1 7 al superponer la amplificación de PCR con la intervención de secuencias de DNA de enlazador. Los productos PCR amplificados son sub-clonados en vectores de expresión adecuados para expresión transitoria en células HEK293 y regiones de marco de lectura abierto son confirmadas por secuenciación antes de la expresión de DVD-lg.

Expresión y producción de proteínas de unión de DVD-lg TNF/IL17 Después de la confirmación de DNA mediante la secuenciación, todas los constructos de DNA DVD-lg se ampliaron en E. coli y DNA se purifica mediante Qiagen Hispeed Maxi Prep (CAT #12662, Q IAGEN) . DNA de DVD-lg se transfecta en las células 293E de fase log (0.5 x 1 0s/ml , viabilidad >95%) mediante la mezcla de PEI y DNA@ relación 2: 1 con 0.2 µg/ml de DNA de cadena pesada y 0.3 de g/m l de DNA de cadena ligera. Complejo DNA: PEI se forma a temperatura ambiente en campana TC durante quince minutos antes de la adición a las células 293E. Veinticuatro después, 0.5% TN 1 se añade a las células 293E. Al quinto día, sobrenadante fue colectado para la medición de titulación de lgG 1 humana . Sobrenadante de célula es cosechada en d ía siete y filtrado mediante filtro PES 0.2 µ? . Sobrenadante es purificado utilizando cromatografía de afinidad de sefarosa de proteína A de acuerdo con las instrucciones del fabricante. DVD-lgs purificadas se eluyen de la columna por 0. 1 M de glicina (pH 2.99) y se dializa en regulador de pH de histidina 15 mM (pH 6.0) inmediatamente. Las proteínas de unión se cuantifican por A280 y se analizan por espectrometría de masas y SEC.

Secuencias de constructos de DVD-lg TNF/I L-17 Se determina la secuencia de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera de proteínas DVD-lg capaces de unir TN F humano y hl L-1 7. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas variables, cadenas ligeras variables y regiones constantes de las proteínas de u nión de DVD-lg TNF/I L-1 7 se m uestran en el cuadro sig uiente (cuadro 1 7) . IgG 1 humana tipo silvestre e IgG 1 mutante con mutaciones leu a ala en posiciones de región de articulación inferior 234, 235 (sistema de numeración EU) han sido probadas y se muestra comparativamente activa en unión a TNF e IL-17.

CUADRO 17 Secuencias de regiones variable y constante de proteínas de unión DVD-lg TNF/IL-17 Región de proteina Identificador de 12345678901234567890 secuencia CH CG1 234,235 SEQ ID NO. :554 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT MUT Z NONA AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CKASQLVSSAVAWYQQKPGKAP KLLIYWASTLHTGVPSRFSGSG VARIABLE LIGERA DVD SEQ ID NO. : 555 SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC hMAK195-24-GS10- QQHYRTPFTFGQGTKLEIKRGG Mll DVD SGGGGSGDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASSGIISYIDWFQ QKPGKAPKRLIYATFDLASGVP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPE DFATYYCRQVGSYPETFGQGTK LEIKR hMAK195-24VL SEQ ID NO :556 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CKASQLVSSAVAWYQQKPGKAP KLLIYWASTLHTGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYRTPFTFGQGTKLEIKR ENLAZADOR SEQ ID NO :557 GGSGGGGSG H10F7-M11VL SEQ ID NO :558 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASSGIISYIDWFQQKPGKAP KRLIYATFDLASGVPSRFSGSG SGTDYTLTISSLQPEDFATYYC RQVGSYPETFGQGTKLEIKR CL SEQ ID NO :559 TVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC Región de proteína Identificador de 12345678901234567890 secuencia H10F7-A6 Vh SEQ ID NO. :583 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGYTFTDYEIHWVRQAPGQG LEWIGVNDPDSGGTLYNQKFDG RVTLTADESTSTAYMELSSLRS EDTAVYYCTRYDKWYSFEGMDI WGQGTTVTVSS CH CG1 234,235 SEQ ID NO. :584 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT MUT Z NONA AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQLVSSAVAWYQQKPGKAP KLLIYWASARHTGVPSRFSGSG VARIABLE LIGERA DVD SEQ ID NO . : 585 SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC hMAK195-21-GS10-A6 QQHYKTPFTFGQGTKLEIKRGG DVD SGGGGSGDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCSASQGIRSYIDWFQ QKPGKSPKRLIYATFDLASGVP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPE DFATYYCRQVGNYPGTFGQGTK LEIKR hMAK195-21VL SEQ ID NO :586 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQLVSSAVAWYQQKPGKAP KLLIYWASARHTGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYKTPFTFGQGTKLEIKR ENLAZADOR SEQ ID NO. :587 GGSGGGGSG H10F7-A6 VL SEQ ID NO :588 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CSASQGIRSYIDWFQQKPGKSP KRLIYATFDLASGVPSRFSGSG SGTDYTLTISSLQPEDFATYYC RQVGNYPGTFGQGTKLEIKR CL SEQ ID NO. :589 TVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC Región de proteína Identificador de 12345678901234567890 secuencia H10F7- 10Vh SEQ ID NO. : 641 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGYTFDDYEIHWVRQAPGQG LEWIGVNDPESGGTFYNQKFDG RATLTADKSTSTAYMELSSLRS EDTAVYYCTRYDKWDSFYGMDY WGQGTTVTVSS ENLAZADOR SEQ ID NO. :642 GGGGSGGGGS HMAK195-21 Vh SEQ ID NO. :643 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFSNYGVTWVRQAPGKG LEWVSMIWADGSTHYASSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAREWQHGPVAYWGQG TLVTVSS CH CG1, 234,235 SEQ ID NO. : 644 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT UT Z NONA AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CSASSGSISYIDWFQQKPGKAP KRLIYATFELASGVPSRFSGSG VARIABLE LIGERA DVD SEQ ID NO. 645 SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC hlOF7-M10-GS10- HQLGSYPDTFGQGTKLEIKRGG hMAKl 95-21 DVD SGGGGSGDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQLVSSAVAWYQ QKPGKAPKLLIYWASARHTGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQHYKTPFTFGQGTK LEIKR H10F7-M10VL SEQ ID NO :646 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CSASSGSISYIDWFQQKPGKAP KRLIYATFELASGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC HQLGSYPDTFGQGTKLEIKR ENLAZADOR SEQ ID O :647 GGSGGGGSG HMAK195-21VL SEQ ID NO :648 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQLVSSAVAWYQQKPGKAP KLLIYWASARHTGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYKTPFTFGQGTKLEIKR Región de proteína Identificador de 12345678901234567890 secuencia CH CG1234,235 SEQ ID NO. : 664 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT MUT Z NONA AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQDISQYLNWYQQKPGKAP KLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSG VARIABLE LIGERA DVD SEQ ID NO. : 665 SGTDFTLTISSLQPEDFATYFC HMAK199-1-GS10- QQGNTWPPTFGQGTKLEIKRGG H10F7-M11DVD SGGGGSGDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASSGIISYIDWFQ QKPGKAPKRLIYATFDLASGVP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPE DFATYYCRQVGSYPETFGQGTK LEIKR HMAK199-1 VL SEQ ID NO. :666 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQDISQYLNWYQQKPGKAP KLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYFC QQGNTWPPTFGQGTKLEIKR ENLAZADOR SEQ ID NO. :667 GGSGGGGSG H10F7- 11VL SEQ ID NO. :668 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASSGIISYIDWFQQKPGKAP KRLIYATFDLASGVPSRFSGSG SGTDYTLTISSLQPEDFATYYC RQVGSYPETFGQGTKLEIKR CL SEQ ID NO. : 669 TVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC Combinaciones de cadenas ligeras y pesadas de DVD-IgLa El siguiente cuadro (cuadro 18) muestra las secuencias de cadenas ligeras y pesadas utilizadas para la expresión de diferentes proteínas de unión DVD-lg TNF/I L-17.

CUADRO 18. Combinaciones de cadenas ligeras y pesadas de DVD-IgLa Caracterización funcional de las proteínas DVD-lg TNF/IL-17 Protocolo de ensayo inmunosorbente enlazado con enzima IL-17 El siguiente protocolo se utiliza para caracterizar la unión de proteínas DVD-lg TNF/IL-17 a TNF humano e IL-17 por ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA). Se recubrió una placa de ELISA con 50 µ? por pocilio de IgG-Fc anti ratón de cabra, a 2pg/ml, durante la noche a 4°C. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de Mab diluido a 1pg/ml en PBS/BSA al 0.1% se agregó a los pocilios adecuados y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de biotina-TNF o IL-17 humanos, diluida en serie se agregó a los pocilios adecuados y se incubó durante 1 hora a RT. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de estreptavidina-HRP diluida 1:10.000 en PBS/BSA al 0.1% se agregó a los pocilios adecuados y se incubaron durante 1 hora a RT. La placa se lavó 3 veces con PBS/Tween. 50 µ? de TMB se agregaron a los pocilios adecuados y la reacción se dejó continuar durante 1 minuto. La reacción se detuvo con 50 µ? / pocilio de H2SO4 2N y se leyó la absorbancia a 450 nm. Los resultados se muestran en el cuadro 19.

CUADRO 1 9 Unión de proteínas DVD-lg TNF/IL-17 a TNF humano e IL-17 por ELISA Medida de afinidad de DVD-lg anti-TNF/IL-17 por resonancia de plasmón de superficie La unión de anticuerpos a proteínas TNFa e IL-17 recombinante purificado se determina por mediciones basadas en resonancia de plasmón de superficie con un instrumento de Biacore® T200 (GE Healthcare) usando ejecutar HBS-EP (1 0 mM HEPES [pH 7.4], 1 50 mM de NaCI , 3 mM EDTA, y 0.005% surfactante P20) que contiene 0.1 mg/ml de BSA a 25°C. Todos los qu ímicos se obtienen de Biacore® AB (GE Healthcare) o de otra manera desde un origen distinto, como se describe en el texto. Aproximadamente 5000 RU de anticuerpo policlonal específico de fragmento IgG anti-humano de cabra (Fcy) (Pierce Biotechnology Inc, Rockford , I L) diluido en acetato de sodio 1 0 mM (pH 4.5) se inmoviliza directamente a través de un chip biosensor de grado de investigación CM5 usando un kit de acoplamiento de amina estándar de acuerdo con instrucciones del fabricante y los procedimientos a 25 ug/ml . Radicales que no reaccionan en la superficie del biosensor se bloquean con etanolamina . Superficie de dextrano carboximetilo modificado en celda de flujo 2, 3 y 4 se usan como una superficie de reacción . Dextrano carboximetil modificado con IgG de cabra en celda de flujo 1 se utiliza como la superficie de referencia . Para análisis cinético , ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de unión de Langmu ir 1 : 1 se aj ustaron simultáneamente a las fases de asociación y disociación de las seis i nyecciones (con análisis de ajuste global flotador local para Rmax) con el uso de software v. 1 .0 de evaluación Biacore T200. Anticuerpos purificados se diluyeron en solución salina regulada de pH con HEPES para captura a través de superficies de reacción específica IgG anti-humano de cabra . Anticuerpos que se capturan como l iga ndo (1 -5 pg/m l) se inyectan en matrices de reacción a una velocidad de flujo de 50 µ ?/mi nuto. Se monitorea la fase de asociación por 5 minutos, mientras que la fase de d isociación se monitorea por 1 0-60 minutos para acomodar las velocidades de disociación más lentas. Las constantes de velocidad de asociación y disociación , ka (unidad M" 1 s 1 ) y kd (unidad s~1) se determinan bajo una velocidad de flujo continuo de 50 µ?/minuto. Constantes de velocidad son derivadas por hacer mediciones de unión cinética en seis diferentes concentraciones de antígeno que varían de 0.78 nM a 100 nM , dependiendo de las especies de I L-17 o TN Fa probado. La asociación ka, velocidad de disociación Kd y constante de disociación de equilibrio kd se calculan con el uso del mismo software v. 1 .0 de evaluación de Biacore T200.

CUADRO 20. Afinidad de proteínas DVD-lg TNF-IL-17 a IL-7 mediante Biacore CUADRO 21. Afinidad de proteínas DVD-lg TNF-IL-17 a TNF mediante Biacore Potencia de neutralización de TNF de moléculas DVD-lg TNF/IL-17 Bioensayo L929 para medición de potencia de neutralización TNF TNF humano Lot. No. 1277249 (1.85 mg/mL) se prepara en Abbott Bioresearch Center (Worcester, Massachusetts, US) y recibido de Biologics Pharmacy. Actinomicina D (catálogo # A1410) se adquiere de Sigma Aldrich y re-suspende de una concentración de muestra de 10 mg/mL de DMSO.

Medios de ensayo: 10% de FBS (Hyclone #SH30070.03), Reactivos Gibco: RPMI 1640 (#21870), 2 mM L-glutamina (#25030), 50 unidades/mL de penicilina/50 pg/mL de estreptomicina (#15140), 0.1 mM aminoácidos no esenciales MEM (#11140) y 5.5 X 105 M 2-mercaptoetanol (#21985-023).

Las células L929 se hacen crecer a una densidad de semi-confluente y se cosechan usando 0.05% de tripsina (Gibco #25300). Las células se lavan con PBS, se cuentan y re-suspenden en 1E6 células/mL en medios de ensayo que contienen 4 pg/mL de actinomicina D. Las células se siembran en una placa de 96 pozos (Costar #3599) en un volumen de 50 pL y 5E4 células/pozo. Pozos reciben 50 pL de medios de ensayo, que llevan el volumen a 100 pL.

Se prepara una muestra de prueba como sigue. El DVD-lg™ e IgG control se diluyen a una concentración 4x en medios de ensayo y diluciones 1:3 seriales. TNF se diluye hasta 400 pg/mL huTNF en los medios de ensayo. Muestra de DVD-lg (200 pL) se añade a TNF (200 pL) en un sistema de dilución 1:2 y se les permite incubar durante 0.5 horas a temperatura ambiente.

Para medir la potencia de neutralización de huTNF de DVD-lg en este ensayo, la solución DVD-lg/TNF se añade a las células plateadas en 100 pL para una concentración final de DVD-lg en 375 nM - 0.019 nM DVD-lg. La concentración final de TNF es 100 pg/mL. Las placas se incubaron durante 20 horas a 37°C, 5% de CO2. Para cuantificar la viabilidad, 100 pL se remueven de los pozos y se añade 10 pL de reactivo WST-1 (Roche cat# 11644807001). Las placas se incuban en condiciones de ensayo durante 3.5 horas, se centrifuga a 500 x g y 75 µ? del sobrenadante transferido a una placa de ELISA (Costar cat # 3369). Las placas se leen en OD 420-600 nm en un lector de placas ELISA Spectromax 190. La potencia de neutralización de proteínas de unión DVD-lg TNF/IL-17 seleccionadas se muestra en el cuadro 22.

CUADRO 22. Potencia in vitro para TNF humano Ensayo para secreción IL-6 inducida con IL-17 humana y cyno en fibroblastos de prepucio humano primario HS27 La línea celular HS27 (ATCC acceso # CRL-1634) segrega IL-6 en respuesta a IL-17. Se inhibe la secreción de IL-6 inducida por IL-17 mediante la neutralización de anticuerpos anti-IL-17 (véase, por ejemplo, J. Immunol., 155:5483-5486 (1995); Cytokine, 9:794-800 (1997)).

Las células HS27 se mantuvieron en medio de ensayo: medio de glucosa alta DMEM (Gibco #11965) con 10% de suero bovino fetal (Gibco #26140), 4 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sodio, penicilina G (100 U/500 mi) y estreptomicina (100 g/500 mi). Las células se cultivan en matraces T150 hasta que son 80-90% confluente el día del ensayo. IL-17A humano (R & D Systems, #317-IL/CF), o mono cynomolgous (cyno) IL-17A (generado en Abbott) es reconstituido en PBS estéril sin Ca2+ y Mg2+ congelado almacenado, recién descongelado para uso y diluido a 240 pM (4X) o 4nM (4X) para IL-17A/F en el medio de ensayo. Se hacen diluciones seriadas de anticuerpos en una placa separada (concentraciones 4X), mezclado con volumen igual de 240 pM (4 X) de hulL-17 o cynolL-17A o 4 nM (4 X) hulL-17A/F y se incuba a 37°C durante 1 hr. Células HS27 (normalmente aproximadamente 20.000 células en 50 µ? de medio de ensayo) se agregan a cada pozo de una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Costar #3599), seguido por la adición de 50 µ? de anticuerpo pre-incubado más IL-17. La concentración final de humanos y cynolL-17A es 60 pM. La concentración final de IL-17A/F humano es 1 nM. Las células se incuban durante aproximadamente 24 horas en 37°C. Luego se colectan los sobrenadantes de medios. Se mide el nivel de neutralización de IL-17 por determinación de las cantidades IL-6 usando un kit comercial de Meso Scale Discovery (cat # L411AKB-1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtienen valores de IC50 utilizando logaritmo de anticuerpo frente a ajuste de pendiente variable de cantidad de IL-6.

Ensayo para secreción de IL-6 inducida por IL-17 de línea celular de fibroblasto embrióníco de murino (NIH3T3) La línea de células NIH3T3 murina (ATCC acceso # CRL-1658) segrega IL-6 en respuesta IL-17A de ratón rata o conejo cuando se agrega en la presencia de niveles bajos de TNFa de murino (R & D Systems, Cat #410-MT). La secreción de IL-6 inducida por IL-17 es inhibida por la neutralización de DVD-lg anti-IL-17.

Las células NIH3T3 se mantienen en medio de ensayo: DMEM (Invitrogen Cat #11965-092) con 10% de suero bovino fetal (Gibco #26140-079), 1% de aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sodio, penicilina G (100 U/500 mi) y estreptomicina (100 µg/500 mi). Las células se cultivan en matraces T150 hasta que son 80-90% confluente el día del ensayo. IL17A de rata se reconstituye (Prospec bio, Cat # CYT-542) en PBS estéril, sin Ca2+ y Mg2+, con 0.1% de BSA, forma alícuotas y se almacena congelado 100 g/ml. IL17A de conejo (Abbott, A-1239293.0) se forman alícuotas y se almacenan congelados a 260 pg/mL. TNF-c de murino se reconstituye en .1% de BSA/PBS sin Ca2+ y Mg2+ en una concentración de 10 Mg/mL, se forman alícuotas y se almacenan congelados. Anticuerpos de IL-17 recién descongelados se diluyen a 200 ug/ml (4X) en el medio de ensayo. Se realizan diluciones seriadas de anticuerpos en una placa separada (concentraciones 4X), mezclado con igual volumen de 40 ng/ml (4X) de IL-17A de rata o ratón o 100 ng/mL de IL-17A de conejo y se incuba a 37°C durante 1 hora.

Células NIH3T3 (normalmente aproximadamente 400.000 células en 50 µ? de medio de ensayo) se agregan a cada pozo de una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pozos (Costar #3599), seguido de la adición de 50 µ? de DVD-lg pre-incubada más IL-17. TNF-a Mu en 5.5 ng/ml (10 x) se añade en 11 µ I de medios a cada pozo. La concentración final de IL-17A es 10 ng/ml para murino y rata y 25 ng/mL para conejo. La concentración final de TNFa mu es 0.55ng/mL. Las células se incuban durante aproximadamente 24 horas a 37°C. Luego se colectaron los sobrenadantes de medios. Se mide el nivel de neutralización de IL-17 por determinación de cantidades de IL-6 en el sobrenadante utilizando un kit comercial de Meso Scala Discovery (cat # K112AKA-4) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtienen los valores IC50 utilizando logaritmo de anticuerpos frente a ajuste de pendiente variable de cantidad de IL-6.

CUADRO 23. Secreción de I L-6 a partir de células de fibroblastos en respuesta a IL-17A Eficacia terapéutica de anticuerpos 11-17 Potencia de neutralización de anticuerpos I L-1 7 en modelo KC inducido por I L-1 7 agudo Se evalúan varias proteínas DVD-lg TNF/IL-17 en el modelo KC inducido por rhlL17. Ratones BALB/cJ hembras se pre-dosifican con anticuerpos intra-peritonealmente (i.p.) y 18 horas más tarde se inyectan i.p. con 3 g de rhlL17 en un volumen de 500µ?_. Después de 1 hora, los ratones son sacrificados y se evaluaron los niveles de KC por MesoScala. Se determinan los valores ED50 para % de inhibición de KC. Como se muestra en el cuadro 24, las tres proteínas DVD-lg neutralizan completamente IL-17 y TNF in vivo.

CUADRO 24 ED50 en modelos de desafío de citoquina de ratón Potencia de neutralización de DVD-lg TNF/IL-17 en modelo de ratón letalmente inducido con rhTNF/D-galactosamina También se evalúan los brazos de TNF de las moléculas DVD-lg TNF/IL17 en el modelo de letalidad inducido por rhTNF/D-galactosamina. Ratones C57BL6/N hembra son pre-dosificados con proteína de unión (i.p.) y 18 horas más tarde se desafían (i.p.) con 0.1 [ig de rh TNF y 20 mg de D-galactosamina en 500 µ? de 0.9% de cloruro de sodio y se monitorea para sobrevivir más de 48 horas. Se calculan los valores ED50 por porcentaje de supervivencia. Como se muestra en el cuadro 25, tres distintos constructos de DVD-lg anti-IL-17/TNF se analizan en estos modelos y todos los tres constructos neutralizaron completamente bioactividad inducida por TN F humano e I L-17 humano.

CUADRO 25 ED50 en modelos de desafío de citoq ui na de ratón Protocolo bioanalítico PK para estudios PK DVD-Ig TNF/I L 1 7 en rata Ratas macho Sprague-Dawley se les coloca cánula en la vena yugular que pesan aproximadamente 280 g se administran con una dosis única de DVD-Ig o anticuerpos parentales a 4 mg/kg a través de la cánula de la vena yugular. Se recolectan m uestras de sangre (50-1 00 ul) de la vena de cola durante un período de 28 días en tubos separadores de suero, se dejan coagular a temperatura ambiente durante al menos una hora , y se centrifugan durante 1 0 min a 4C. Las muestras de suero se congelan a -80°C hasta su análisis.

Muestras de suero se descongelan a temperatura ambiente, se centrifugan d urante 1 0 min a 4°C y concentraciones de DVD-Ig determinadas por u n unión de ligando usando sistema Meso Scale Discovery (MS D) . Brevemente, placas de estrepatavid ina se recubren con antígeno humano biotinilado e incuban durante la noche. Las placas se bloquean y el DVD-Ig que contiene las m uestras de suero se diluyen con reg ulador de pH de ensayo (concentración final de suero 1 %), se incuban las placas durante una hora y se detectado utilizando a IgG anti-humana de cabra etiquetada con sulfo-etiqueta . Las concentraciones se calculan con la ayuda de una curva estándar utilizando cuatro ajustes logísticos de parámetro.

Parámetros farmacocinéticos para cada animal se calculan con el software WinNonlin versión 5.2. 1 por análisis no compartimental usando ajuste trapezoidal lineal.

CUADRO 26 Propiedades de PK de moléculas DVD-lg TN F/I L-1 7 Determinación de la estabilidad de suero DVD-lg in vitro Protocolo del ensayo de estabilidad de suero in vitro Anticuerpos y DVD-lgs son recibidos en concentraciones de 5 mg/m L, etiquetados con Alexa Fluor 488 y purificados usando columnas de centrifugado. La tinta Alexa Fluor 488 tiene un radical de éster tetrafluorrofenilo (TFP) que reacciona eficientemente con aminas primarias de proteínas para formar conjugados de tinta-proteína estables. Las proteínas etiquetadas tienen absorción y emisión de fluorescencia máxima de aproximadamente 494 nm y 51 9 nm respectivamente. Suero de rata que contiene azida de sodio 1 mM se utiliza para diluir las proteínas etiquetadas a 0.5 mg/mL e incubar a 37°C por hasta 7 días. Cada m uestra se diluye también en PBS como control negativo. Las muestras son analizadas por cromatografía de exclusión de tamaño en los días 0, 1 , 4 y 7 utilizando columna de Superóse 6. La formación de agregados de proteínas y fragmentos se utiliza para monitorear la estabilidad en el suero de las moléculas. Pendientes se calculan al graficar el porcentaje del área de los agregados de alto peso molecular versus tiempo.

CUADRO 27. Formación de agregados de proteína DVD-lg como medida de la estabilidad Ejemplo 4 Generación de proteínas de unión de DVD adicional Las moléculas de proteína de un ión a DVD capaces de unirse dos antígenos se construyen utilizando dos anticuerpos monoclonales de origen, uno contra el antígeno A humano, y el otro contra antígeno B humano, se seleccionan como se describe aquí .

Generación de una proteína de unión a DVD que tiene dos longitudes de enlazador Se utiliza una región constante que contiene µ 1 Fe con mutaciones en 234 y 235 para eliminar funciones efectoras ADCC/CDC. Se generan cuatro constructos de proteína de unión a DVD anti-A/B diferentes: 2 con en lazador corto y 2 con enlazador largo, cada uno en dos orientaciones de dominio diferentes: VA-VB-C y VB-VA-C . Las secuencias de enlazador, derivadas de la secuencia N-term inal de dominio humano Cl/Ck o CH 1 , son los siguientes : Para constructos de DVDAB: cadena l igera (si anti-A tiene ?) : enlazador corto: QPKAAP (SEQ ID NO: 15); enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) cadena ligera (si anti-A tiene ?): enlazador corto: TVAAP (SEQ ID NO: 13); enlazador largo: TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) cadena pesada (?1): enlazador corto: ASTKGP (SEQ ID NO: 21); enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) Para constructos de DVDBA: cadena ligera (si anti-B tiene ?): enlazador corto: QPKAAP (SEQ ID NO: 15); enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) cadena ligera (si anti-B tiene k): enlazador corto: TVAAP (SEQ ID NO: 13); enlazador largo: TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) cadena pesada (?1): enlazador corto: ASTKGP (SEQ ID NO: 21); enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) Constructos de cadena ligera y pesada se subclonan en el vector de expresión pBOS y se expresan en células COS, seguido de purificación por cromatografía de proteína A. Los materiales purificados son sometidos a análisis de SDS-PAGE y SEC.

El cuadro 28 describe los constructos de cadena pesada y cadena ligera usadas para expresar cada proteína de unión a DVD anti-A/B CUADRO 28 Constructos de proteína de unión de DVD anti-A/B Incorporación por referencia La presente descripción se incorpora como referencia en sus técnicas de totalidad bien conocidas en el campo de la biología molecular y suministro de fármaco. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, las técnicas que se describen en las siguientes publicaciones: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1 993); Ausubel, F.M . et al. eds., Short Protocols In Molecular Biology (4a Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471 -32938- X); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed. , pp. 20 1 -16, Oxford University Press, New York, New York, (1999); Goodson, in Medical Applications of Controlled Reléase, vol. 2, pp. 115-138 (1984); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Kabat et al., Sequences of Proteins of Jmmunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991); Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Lu and Weiner eds., CLONING AND EXPRESSION VECTORS FOR GENE FUNCTION ANALYSIS (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1 -881299-21 -X); MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Oíd, R.W. & S.B. Primrose, PRINCIPLES OF GENE MANIPULATION: AN INTRODUCTION TO GENETIC ENGINEERING (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4); Sambrook, J. et al. eds., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1 -3. (ISBN 0-87969-309-6) ; SUSTAI N ED AN D CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVE RY SYSTEMS, J . R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, I nc. , New York, 1 978; Winnacker, E . L. FROM G EN ES TO CLONES: I NTRODUCTION TO GEN E TECHNOLOGY ( 1 987) VCH Publishers, NY (translated by Horst I belgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).

Los contenidos de todas las referencias citadas (incluyendo las referencias bibliográficas, patentes, solicitudes de patente y sitios Web) que pueden ser citadas a lo largo de esta aplicación son con lo cual incorporadas expresamente para referencia en su totalidad para cualquier fin, como son las referencias citadas en el mismo. La descripción se empleará , a menos que se indique lo contrario, las técnicas convencionales de inmunología, biología molecular y biología celular, que son bien conocidos en la técnica.

Equivalentes La descripción puede incorporarse en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o sus características esenciales. Las modalidades anteriores son por lo tanto consideradas ilustrativas en lugar de limitar la descripción en todos los aspectos. Alcance de la descripción así está indicado por las reivindicaciones anexadas en lugar de la descripción anterior, y todos los cambios que vienen dentro del significado e intervalo de la equivalencia de las reivindicaciones y por tanto, pretenden ser inclu idos aquí .

Claims

REIVINDICACIONES 1 - Una proteína de unión que comprende una cadena polipeptídica, en donde la cadena polipeptídica comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, donde; VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que no sea CH1; X2 es una región Fe; (X1 )n, donde n es 0 o 1 ; (X2)n, donde n es 0 o 1; y en donde (a) VD1 o VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y la proteína es capaz de unir TNF; (c) VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; o (d) VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811. 2. La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (a) VD1 o VD2 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) VD1 y VD2 independientemente comprenden SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (c) VD1 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, y VD2 comprende SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; o (d) VD2 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, y VD1 comprende SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811. 3 - Una proteína de unión que comprende una cadena polipeptídica, en donde la cadena polipeptídica comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, donde; VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que no sea CL; X2 no constituyen una región Fe; (X1)n, donde n es 0 o 1; (X2)n, donde n es 0 o 1; y en donde (a) VD1 o VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107, y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107, y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (c) VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107, y VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812; (d) VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812. 4.- La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque (a) VD1 o VD2 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) VD1 y VD2 independientemente comprenden SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (c) VD1 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y VD2 comprende SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812; o (d) VD2 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y VD1 comprende SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812. 5 - La proteína de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizado porque (X1)n es 0 y/o (X2)n es 0. 6.- Una proteína de unión que comprende primera y segunda cadenas polipeptídicas, en donde la primera cadena polipeptídica comprende un primer VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un primer enlazador; X2 es una región Fe; (X1)n, donde n es 0 o 1 ; (X2)n, donde n es 0 o 1; y en donde la segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un segundo enlazador; X2 no constituye una región Fe; (X1)n, donde n es 0 o 1 (X2)n, donde n es 0 o 1; y en donde el primer y segundo enlazador X1 son lo mismo o diferente; en donde el primer enlazador X1 no es CH1 y/o el segundo enlazador X1 no es CL y en donde (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera de VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812. 7.- La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 independientemente comprenden SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteina de unión es capaz de unir TNF; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812. 8. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1, 3 o 6, caracterizada porque X1 y/o X2 es cualquiera de SEQ ID NOS 1-29. 9. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la proteína de unión consta de dos primeras cadenas polipeptídicas y dos seg undas cadenas polipeptídicas. 1 0. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 , 3 o 6 , caracterizada porque la región Fe es una región Fe de secuencia variante. 1 1 . - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 , 3 o 6, caracterizada porque la región Fe es una región Fe de un lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE o IgD. 1 2 - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque VD1 de la primera cadena polipeptídica y VD1 de la segunda cadena polipeptídica se obtienen de un mismo anticuerpo de origen primero y segundo, respectivamente, o la porción de unión de antígeno. 1 3. - La proteína de unión de conform idad con la reivindicación 6, caracterizada porque VD 1 de la primera cadena polipeptídica y VD 1 de la seg unda cadena polipeptídica son de un anticuerpo de origen diferentes primero y segundo, respectivamente, o porción de unión de antígeno del mismo. 14. - La proteína de unión de conformidad con la reivind icación 6, caracterizada porque VD2 de la primera cadena polipeptídica y VD2 de la segunda cadena polipeptídica son de un mismo anticuerpo de origen primero y segundo, respectivamente, o porción de unión de antígeno del mismo. 1 5. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 6 , caracterizada porque VD2 de la primera cadena polipeptídica y VD2 de la segunda cadena polipeptídica son de un anticuerpo de origen diferente primero y segundo, respectivamente, o porción de unión de antígeno del mismo. 16. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 3 o 1 5, caracterizada porque el primero y segundo anticuerpos de origen unen diferentes epítopes en el antígeno. 17. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-16, caracterizada porque el primer anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno del mismo, une el primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con el que el segundo anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno del mismo, une el segundo antígeno. 18. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-16, caracterizada porque el primer anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno del mismo, une el primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la que el segundo anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno del mismo, une el segundo antígeno. 19. - Una proteína de unión capaz de unir dos antígenos, la proteína de unión que comprende cuatro cadenas polipeptídicas, en donde dos cadenas polipeptídicas comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un primer enlazador; X2 es una región Fe; y en donde dos cadenas polipeptídicas comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un segundo enlazador; X2 no comprende una región Fe; (X1)n, donde n es 0 o 1; y (X2)n, donde n es 0 o 1 ; donde el primero y segundo enlazador X1 son los mismos o diferentes; en donde el primer enlazador X1 no es CH1 y/o el segundo enlazador X1 no es CL; en donde (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, el dominio variable de la cadena ligera VD1 o VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 independientemente comprenden tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 81 ; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera de VD1 comprende tres CDRs de SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812. 20 - Una proteína de unión capaz de unir dos antígenos, la proteína de unión que comprende cuatro cadenas polipeptídicas, en donde dos cadenas polipeptídicas comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un primer enlazador; X2 es una región Fe; (X1 )n, donde n es 0 o 1 ; (X2)n, donde n es 0 o 1; y en donde dos cadenas polipeptídicas comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un segundo enlazador; X2 no comprende una región Fe; (X1)n, donde n es 0 o 1; (X2)n, donde n es 0 o 1 ; y en donde el primero y segundo enlazador X1 son los mismos o diferentes; en donde el primer enlazador X1 no es CH1 y/o el segundo enlazador X1 no es CL en donde (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, el dominio variable de cadena ligera VD1 o VD2 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 independientemente comprenden SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812; o (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera de VD1 comprende SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812. 21.- La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1, 3, 6, 19 o 20, caracterizada porque la proteína de unión tiene una constante de velocidad de asociación (KaSoc) a los objetivos uno o más de al menos aproximadamente 102M~1s~1; por lo menos aproximadamente 103M 1s 1; por lo menos aproximadamente 104M 1s 1; por lo menos aproximadamente 105M"1s"1; o por lo menos aproximadamente 106M 1s"1; como es medido por resonancia de plasmón superficial. 22 - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1, 3, 6, 19 o 20, caracterizada porque proteína de unión tiene una constante de velocidad de disociación (Ko¡soc) a los objetivos uno o más de a lo más aproximadamente 10~3s"1; a lo más aproximadamente 10" s 1 ; a lo más aproximadamente 1 0"5s 1 ; o a lo más aproximadamente 1 0 6s 1 , como es medido por resonancia de plasmón superficial . 23. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 , 3, 6, 19 o 20, caracterizada porque la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) a los objetivos uno o más de a lo más aproximadamente 10 7 M ; a lo más aproximadamente 1 0"8 M ; a lo más aproximadamente 1 0 9 ; a lo más aproximadamente 10" 10 M; a lo más aproximadamente 1 0 1 1 M ; a lo más aproximadamente 1 0"12 M; o a lo más 1 0-13 M. 24. Un conjugado de proteína de unión compuesto por una proteína de unión de la reivindicación 1 , 3, 6 , 19 o 20, el conjugado de proteína de unión además comprende un agente, en donde el agente es una molécula de inmuno-adhesión, un agente de imágenes, un agente terapéutico o un agente citotóxico. 25. - El conjugado de proteína de unión de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el agente de imágenes es una radio-etiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bio-luminiscente, una etiqueta magnética o biotina . 26. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 , 3, 6, 1 9 o 20, caracterizado porque la proteína de unión es una proteína de unión cristalizada. 27. Un ácido nucleico aislado de codificación de una secuencia de aminoácidos de proteína de unión de la reivindicación 1 , 3, 6, 1 9 o 20. 28. - Un vector compuesto por un ácido nucleico aislado de la reivind icación 27. 29. - El vector de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el vector es pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS , pBV, pJV, pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO, pHybE, pBOS-hCyl o pBJ . 30. - Una célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 28. 31 . - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la célula huésped es una célula procariota. 32. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la célu la huésped es una célula eucariota. 33. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 32 , caracterizada porque la célula eucariota es una célula protista, célula animal, célula vegetal, célula de levadura, células de mamífero, célula aviar, célula de insecto o célula fúngica . 34. - Un método de producción de una proteína de unión, que comprende el cultivo de una célula huésped descrita en cualquiera de las reivindicaciones 30-33 en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión. 35. - Una proteína producida del método de la reivindicación 34. 36. U na com posición farmacéutica que comprende la proteína de unión de la reivindicación 1 , 3, 6, 1 9, 20, o 35 y un portador farmacéuticamente aceptable. 37. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque comprende al menos un agente terapéutico adicional . 38. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el agente terapéutico adicional es un agente de imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de angiogénesis, un inhibidor de quinasa , un bloqueador de molécula de co-estimulación, un bloqueador de la molécula de adhesión , un anticuerpo anti-citoquina o un su fragmento funcional, metotrexato, ciclosporina, rapam icina , F 506, una etiqueta detectable o reportero, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroide (NSAI D), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriatico, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización , una inmunoglobulina, u n inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un medicamento de reemplazo hormonal , un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, u na medicación para el asma, un agonista beta , un esteroide inha lado, una epinefrina o análogo, una citoquina o un antagonista de citoquina. 39. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 1 , 3, 6, 1 9, 20 o 35 para el uso en el tratamiento de un sujeto para una enfermedad o un trastorno al adm inistrar al sujeto la proteína de unión de tal forma que se logre el tratamiento. 40. - La proteína de unión de conform idad con la reivindicación 39, caracterizada porque el trastorno son trastornos autoinmunes e inflamatorios, asma , artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, artropatía espondilitis, psoriasis, trastornos gastrointestinales, enfermedad inflamatoria intestinal , colitis ulcerosa, enfermedad de Chrohn, uveitis y lupus eritematoso sistémico. 41 . - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la administradora al sujeto es parenteral, subcutánea , intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial , intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intercerebral , intracerebroventricular, intracolica, i ntracervical , intragástrica, intrahepática , intramiocárdica , intraosteal , intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal , intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina , intravesical, bolo, vaginal , rectal , bucal, sublingual, intranasal o transdérmica . 42. - Un método para generar una proteína de unión capaz de unir dos antígenos, el método que comprende los pasos de: a) obtener un primer anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno del mismo, capaz de unir un primer antígeno; b) obtener un segundo anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno del mismo, capaz de unir un segundo antígeno; c) construir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 6, 1 9 o 20; d) expresar la o las cadenas polipeptídicas; tal que se genera una proteína de un ión capaz de unir el primer y el segundo antígeno. 43.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque (a) el dominio variable de cadena pesada VD1 o VD2 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, el dominio variable de la cadena ligera VD1 o VD2 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (b) los dominios variables de cadena pesada VD1 y VD2 independientemente comprenden SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97, los dominios variables de cadena ligera VD1 y VD2 independientemente comprenden SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y la proteína de unión es capaz de unir TNF; (c) el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766 u 812; (d) el dominio variable de cadena pesada VD2 comprende SEQ ID NO: 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 606, 611, 616, 621, 626, 631, 636, 643, 653, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 753, 763, 771, 776, 781, 786, 791, 796, 801, 805, 807 u 809 o cualquiera de 36-41, 48-72 u 88-97 y el dominio variable de cadena pesada VD1 comprende SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803 u 811; el dominio variable de cadena ligera VD2 comprende SEQ ID NO: 546, 556, 566, 576, 586, 596, 648, 658, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 758, 768 o cualquiera de 42-47, 73-87 o 98-107 y el dominio variable de cadena ligera VD1 comprende SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116, 117, 118, 119, 120, 31-526, 535-539, 548, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 71 8, 728, 738, 748, 756, 766 u 81 2. 44.- El método de conformidad con la reivindicación 42 , caracterizado porque la región Fe es una región Fe de secuencia variante. 45.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la región Fe es una reg ión Fe desde una lgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE o IgD. 46. - El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el primer anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno del mismo, si está presente, une el primer antígeno con una afinidad diferente y/o la potencia que la afinidad y/o potencia con la que el segundo anticuerpo de origen o porción de unión de antígeno del mismo, si está presente, une el segundo antígeno. 47. - Un método para determinar la presencia de al menos un antígeno o fragmento del mismo en una muestra de prueba por un inmunoensayo, en donde el inmunoensayo comprende el contacto con la muestra de prueba con al menos una proteína de unión y por lo menos una etiqueta detectable, en donde la proteína de unión al menos una comprende la proteína de unión de la reivindicación 1 , 3 , 9 , 19 , 20 o 35. 48. - El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la muestra de prueba con la proteína de unión al menos una , en donde la proteína de unión se une a un epítope en el antígeno o fragmento del mismo con el fin de formar un primer complejo; (ü) poner en contacto el complejo con la etiqueta detectable al menos una , en donde la etiqueta detectable se une a la proteína de unión o un epítope en el antígeno o fragmento del mismo que no está unido por la proteína de unión para formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia del antígeno o fragmento del m ismo en la muestra de prueba basada en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, donde la presencia del antígeno o fragmento del mismo está directamente relacionada con la señal generada por la etiqueta detectable. 49.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la muestra de prueba con la proteína de unión al menos una, en donde la proteína de unión se une a un epítope en el antígeno o fragmento del m ismo con el fin de formar un primer complejo; (ii) poner en contacto el complejo con la etiqueta detectable al menos una , en donde la etiqueta detectable compite con el antígeno o fragmento del m ismo para un irse a la proteína de unión con el fin de formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia del antígeno o fragmento del m ismo en la muestra de prueba basada en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, donde la presencia del antígeno o fragmento del mismo indirectamente está correlacionado con la señal generada por la etiqueta detectable. 50.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48-50, caracterizado porque la muestra de prueba es de un paciente y el método además comprende el diagnóstico, pronóstico o valoración de la eficiencia del tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente, y en donde si el método además com prende evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente, el método opcionalmente comprende además modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según sea necesario para mejorar la eficacia. 51 . - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48-51 , caracterizado porque el método está adaptado para su uso en un sistema automatizado o semiautomatizado. 52. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48-52, caracterizado porque el método determina la presencia de más de un antígeno en la muestra . 53. - Un método para determi nar la cantidad o concentración de un antígeno o su fragmento en una muestra de prueba por un inmunoensayo, en donde el inmunoensayo (a) emplea al menos una proteína de unión y por lo menos una etiqueta detectable y (b) comprende comparar una señal generada por la etiqueta detectable con un control o calibrador que comprende el antígeno o su fragmento, en donde el calibrador opcionalmente es parte de una serie de calibradores en donde cada ca librador difiere de los otros calibradores en las series por la concentración del antígeno o su fragmento, en donde al menos una proteína de unión comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 1 , 3, 9, 1 9, 20 o 35. 54. - El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende adicionalmente . (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de unión, en donde la proteína de unión se une a u n epítope en el antígeno o su fragmento con el fin de formar un primer complejo; (ii) poner en contacto con el complejo con al menos una etiqueta detectable, en donde la etiqueta detectable se une a un epítope en el antígeno o su fragmento que no está unido por la proteína de unión para formar un segundo complejo; y (iii) determinar la cantidad o concentración del a ntígeno o su fragmento en la muestra de prueba basado en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, en donde la cantidad o concentración del antígeno o su fragmento es directamente proporcional a la señal generada por la etiqueta detectable. 55. - El método de conform idad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende ad icionalmente: (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de unión, en donde la proteína de unión se une a un epítope en el antígeno o su fragmento con el fin de formar un primer com plejo; (ii) poner en contacto el com plejo con al menos u na etiqueta detectable , en donde la etiqueta detectable compite con el antígeno o su fragmento para unirse a la proteína de unión para formar un segundo complejo; y (iii) determinar la cantidad o concentración del antígeno o su fragmento en la muestra de prueba basado en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo com plejo, en donde presencia del antígeno o su fragmento es indirectamente proporcional a la señal generada por la etiqueta detectable. 56. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-56, caracterizado porque la muestra de prueba es de un paciente y el método además comprende el diagnóstico, pronóstico o evaluación de la eficacia del tratam iento terapéutico/profiláctico del paciente, y en donde si el método además comprende evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente, el método opcionalmente comprende además modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según sea necesario para mejorar la eficacia . 57. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, caracterizado porque el método se adapta para uso en un sistema automatizado o sistema sem i-automatizado. 58. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-58, caracterizado porque el método determina la cantidad o concentración de más de un antígeno en la muestra . 59. - U n kit para ensayar una muestra de prueba para la presencia , cantidad o concentración de un antígeno o su fragmento, el kit comprende (a) instrucciones para ensayar la muestra de prueba para el antígeno o su fragmento y (b) al menos una proteína de unión que comprende la proteína de unión de la reivindicación 1, 3, 9, 19, 20 o 35. 60. - Una proteína de unión a IL-17 que comprende al menos una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende: (a) tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cualquiera de las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 811; o (b) cualquiera de las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 811. 61. - Una proteína de unión a IL-17 que comprende al menos una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende: (a) tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cualquiera de las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116-120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812; o (b) cualquiera de las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116-120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812. 62 - Una proteína de unión a IL-17 que comprende al menos una región variable de cadena pesada (región VH) y al menos una región variable de cadena ligera (región VL) donde la región VH comprende: (a) tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cualquiera de las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 811; o (b) cualquiera de las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 811; y la región VL comprende: (c) tres CDR de cualquiera de las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116-120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812; o (d) cualquiera de las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116-120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812. 63.- La proteína de unión de la reivindicación 62, donde la proteína de unión comprende dos regiones VH y dos regiones VL. 64.- La proteína de unión de la reivindicación 62, donde la proteina de unión comprende al menos una región VH y al menos una región VL que comprende un conjunto de secuencias de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30 y 31; 32 y 33; 34 y 35; 108 y 118; 108 y 119; 109 y 116; 110 y 117; 111 y 120; 112 y 117; 113 y 120; 114 y 117; 115 y 117; 527 y 537; 527 y 538; 528 y 535; 529 y 536; 530 y 539; 531 y 536; 532 y 539; 533 y 536; y 534 y 536. 65.- La proteína de unión de la reivindicación 63, donde la proteína de unión: (a) modula una función biológica de IL-17; (b) neutraliza IL-17; (c) disminuye la capacidad de IL-17 de unirse a su receptor; (d) disminuye la capacidad de IL-17 pro-humana, IL-17 humana madura, o IL-17 humana truncada de unirse a su receptor; y/o (e) reduce uno o más de la producción de citocina dependiente de 11-17, destrucción celular dependiente de IL-17, inflamación dependiente de IL-17, erosión de los huesos dependiente de IL-17 y el daño a los cartílagos dependiente de IL-17. 66. - La proteína de unión de la reivindicación 63, donde la proteína de unión tiene una constante de velocidad de asociación (Kasoc) de al menos alrededor de 102 '1s"1; al menos alrededor de 103M 1s 1; al menos alrededor de 10 M 1s 1; al menos alrededor de 105M" 1s~1; o al menos alrededor de 106M s , según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales. 67. - La proteína de unión de la reivindicación 63, donde la proteína tiene una constante de velocidad de disociación (Kdisoc) de como máximo alrededor de 103s ; como máximo alrededor de 104s'1; como máximo alrededor de 105s-1; o como máximo alrededor de 10"6s \ según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales. 68. - La proteína de unión de la reivindicación 63, donde la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) de como máximo alrededor de 10"7 M; como máximo alrededor de 10"8 M; como máximo alrededor de 109 M; como máximo alrededor de 10'10 M; como máximo alrededor de 1011 M; como máximo alrededor de 1012 M; o como máximo de 10"13 M. 69. - Una proteína de unión capaz de unirse a IL-17 humana, la proteína de unión comprende: (a) una región constante de cadena pesada; (b) una región constante de cadena ligera; (c) una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30, 32, 34, 108-115, 121-317, 527-534, 543, 553, 563, 573, 583, 593, 603, 608, 613, 618, 623, 628, 633, 638, 641, 651, 663, 673, 683, 693, 703, 713, 723, 733, 743, 751, 761, 773, 778, 783, 788, 793, 798, 803, y 811; y (d) una región variable de cadena ligera (región VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 116-120, 318-526, 535-539, 548, 558, 568, 578, 588, 598, 646, 656, 668, 678, 688, 698, 708, 718, 728, 738, 748, 756, 766, y 812. 70. - La proteína de unión de la reivindicación 62, donde la proteína de unión comprende una molécula de inmunoglobulina, un Fv, un Fv enlazado a disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un scFv, una proteína de unión quimérica, una proteína de unión de dominio simple, una proteína de unión injertada en una CDR, un diacuerpo, una proteína de unión humanizada, una proteína de unión multiespecífica, un Fab, una proteína de unión específica dual, un fragmento Fab', una proteína de unióna biespecífica, un fragmento F(ab')2, una DVD-lg™, un gragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos a un puente disulfuro en la región bisagra, un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH 1 , un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb, una regiones determinantes de la complementariedad (CDR) aislada, o una proteína de unión de cadena simple. 71 . - La proteína de unión de la reivindicación 63, donde la proteína de unión está conjugada con un agente de imaginología seleccionado del grupo que consiste en una radioetiqueta, una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta bioluminiscente, una etiqueta magnética y biotina. 72. - La proteína de unión de la reivindicación 63, donde la proteína de unión comprende adicionalmente un agente terapéutico o citotóxico seleccionado del grupo que consiste en un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente antiangiogénico, un agente antimicótico, una antraciclina, toxina y un agente apoptótico. 73. - Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de unión que comprende la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 62. 74. - Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 73. 75. - Una célula hospedadora que comprende un vector de la reivindicación 74. 76. - Un método para producir una proteína que se une a IL-17, el método comprende las etapas de cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 75 en un medio de cultivo, bajo condiciones suficientes para producir una proteína de unión que se una a I L-17. 77. - Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de la reivindicación 62, y un portador farmacéuticamente aceptable. 78. - Un método para tratar a un mamífero que comprende administrarle al mamífero una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 77. 79. - Un método para reducir la actividad de I L-17 humana, el método comprende poner en contacto IL-17 humana con la proteína de unión de la reivindicación 62, de manera que la actividad de I L-17 se reduzca. 80. - El método para reducir la actividad de IL-17 en un sujeto humano que padece de un trastorno en el cual la actividad de IL-17 es perjudicial, el método comprende administrarle al sujeto humano la proteína de unión de la reivindicación 62, de manera que la actividad de IL-1 7 humano en el sujeto humano se reduzca y/o se logre el tratamiento. 81 . - Un método para tratar a un paciente que padece de un trastorno en el cual IL-17 es perjudicial, que comprende administrarle al paciente la proteína de unión de la reivindicación 62 ya sea antes, a la vez, o después de la administración al paciente de un segundo agente, donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas del receptor de IL-1, mAbs anti-l L-1? , receptores de mAbs anti-IL-6 o IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o antagonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, F 506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, AINE, ibuprofeno, corticosteroides, prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, inhibidores de cinasa MAP, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibidores de la enzima que convierte I L- 1 ß , inhibidores de la enzima que convierte TNFa, inhibidores de la señalización de linfocitos T, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima que convierte angiotensina, receptores de citocinas solubles, receptor de p55 TNF soluble, receptor de p75 TNF soluble, sIL-IRI, slL-1RII, slL-6R, citocinas antiinflammatorias, IL-4, IL- 1 0, IL-1 1 , I L-13, y TGFp. 82. - El método de la reivindicación 80 u 81 , donde el trastorno es un trastorno autoinmunitario y/o inflamatorio. 83. - El método de la reivindicación 82, donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste en trastornos autoinmunitarios y antiinflamatorios, asma , artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, artropatía espondilitis , psoriasis, trastornos gastrointestinales, enfermedad inflamatoria intestinal , colitis ulcerosa, enfermedad de Chrohn, uveitis, y lupus eritematoso sistémico. 84.- El método de la reivindicación 82, donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias , inflamación , enfermedad de Crohn, psoriasis (incluyendo psoriasis en placa), artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis psoriásica, osteoartritis, o artritis idiopática juvenil), esclerosis múltiple, espondilitis anq uilosante, artropatía espondilitis, lupus eritematoso sistémico, uveitis, esclerosis múltiple, sepsis, enfermedades neurodegenerativas, regeneración neuronal, lesiones a la médula espinal , cánceres primarios y metastásicos, un trastorno respiratorio; asma; asma alérgico o no alérgico; asma debido a una infección ; asma debido a una infección con el virus sincitial respiratorio (RSV) ; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); una afección que involucra la inflamación de las vías respiratorias; eosinofilia; fibrosis y producción excesiva de mucosa; fibrosis qu ística ; fibrosis pulmonar; un trastorno atópico; dermatitis atópica; urticaria; eczema; rinitis alérgica ; enterogastritis alérgica; una afección infla matoria y/o autoinmun itaria de la piel; una afección inflamatoria y/o autoinmunitaria de los órganos gastrointestinales; enfermedad inflamatoria intestinal (I BD) ; colitis ulcerosa ; una afección inflamatoria y/o autoinmunitaria del hígado; cirrosis hepática; fibrosis hepática ; fibrosis hepática causada por el virus de la hepatitis B y/o C virus; escleroderma ; tumores o cánceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma de Hodgkin; una infección viral; una infección bacteriana; una infección parasitaria; una infección por HTLV- 1 ; supresión de la expresión de las respuestas inmunitarias protectoras tipo 1 , y supresión de la expresión de una respuesta inmunitaria protectora tipo 1 durante la vacunación. 85. - Un método para determinar la presencia de IL-1 7 o un fragmento de esta en una muestra de prueba mediante inmunoensayo, donde el inmunoensayo comprende poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de unión o un fragmento de esta, de acuerdo con la reivindicación 62 , y al menos una etiqueta detectable. 86. - El método de la reivindicación 85, donde el método comprende adicionalmente: (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de unión o un fragmento de esta, donde la proteína de unión se une a un epítopo de I L-1 7 o un fragmento de este, de manera de formar un primer complejo; (ii) poner en contacto el complejo con al menos una etiqueta detectable, donde la etiqueta detectable se une a un epítopo en el primer complejo, o en I L-1 7 o fragmento de este, q ue no está unido a la proteína de unión o fragmento de esta, para formar un segundo complejo; y (¡ü) detectar la presencia de IL- 17 o fragmento de esta en la muestra de prueba, basándose en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, donde la presencia de 11-1 7 o un fragmento de esta se relaciona directamente con la señal generada por la etiqueta detectable. 87. - El método de la reivindicación 85, donde el método comprende adicionalmente: (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de unión o un fragmento de esta, donde la proteína de unión o fragmento de esta se une a un epítopo de I L-1 7 o un fragmento de este, de manera de formar un primer complejo; (ii) poner en contacto el complejo con al menos una etiqueta detectable, donde la etiqueta detectable compite con I L- 17 o fragmento de este, para unirse a la proteína de unión o fragmento de esta, de manera de formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia de I L-1 7 o fragmento de esta en la muestra de prueba, basándose en la señal generada por la etiqueta detectable en el segundo complejo, donde la presencia de 11-1 7 o un fragmento de esta se relaciona indirectamente con la señal generada por la etiqueta detectable. 88. - El método de la reivindicación 85, donde el método comprende adicional y opcionalmente realizar un diag nóstico, pronóstico, o evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente . RES U MEN Se proveen proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas diseñadas, métodos de elaboración, y específicamente sus usos en la prevención , diagnóstico, y/o tratamiento de enfermedad.