[go: up one dir, main page]

MX2014004319A - Valoracion del riesgo de pml (leucoencefalopatia multifocal progresiva) y metodos basados en la misma. - Google Patents

Valoracion del riesgo de pml (leucoencefalopatia multifocal progresiva) y metodos basados en la misma.

Info

Publication number
MX2014004319A
MX2014004319A MX2014004319A MX2014004319A MX2014004319A MX 2014004319 A MX2014004319 A MX 2014004319A MX 2014004319 A MX2014004319 A MX 2014004319A MX 2014004319 A MX2014004319 A MX 2014004319A MX 2014004319 A MX2014004319 A MX 2014004319A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
cells
subject
psgl
cd62l
sample
Prior art date
Application number
MX2014004319A
Other languages
English (en)
Inventor
Nicholas Schwab
Heinz Wiendl
Tilman Schneider-Hohendorf
Original Assignee
Univ Muenster Wilhelms
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Muenster Wilhelms filed Critical Univ Muenster Wilhelms
Publication of MX2014004319A publication Critical patent/MX2014004319A/es

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G01N2333/70553—Integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/7056—Selectin superfamily, e.g. LAM-1, GlyCAM, ELAM-1, PADGEM
    • G01N2333/70564—Selectins, e.g. CD62
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

La invención proporciona un método para valorar el riesgo de ocurrencia de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) en un sujeto así como un método para estratificar a un sujeto que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4 para la suspensión del tratamiento, y un método para estratificar a un sujeto que se somete a Terapia Antirretroviral Altamente Activa (HAART) para la modificación de HAART. Estos métodos comprenden detectar el nivel de células T que expresan el ligando-1 de glicoproteína de P-selectina (PSGL-1) en una muestra del sujeto.

Description

VALORACIÓN DEL RIESGO DE PML (LEUCOENCEFALOPATÍA MULTIFOCAL PROGRESIVA) Y MÉTODOS BASADOS EN LA MISMA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de una solicitud para "Risk Stratification of Patients Receiving VLA-4 Blocking Agents" ("Estratificación del Riesgo de Pacientes que Reciben Agentes Bloqueadores VLA-4") presentada el 17 de Octubre de 2011 en la Oficina de Patente Europea, y asignada debidamente con el número de serie EP 11185 439. La presente solicitud reivindica además el beneficio y la prioridad de una solicitud para "Methods of Risk Assessment of PML" ("Métodos para Valoración de Riesgo de PML") presentada el 07 de Marzo de 2012 en la Oficina de Patente Europea, y asignada debidamente con el número de serie EP 12 158 369. Los contenidos de dichas solicitudes presentadas el 17 de Octubre de 2011 y 07 de Marzo de 2012 se incorporan en la presente mediante la referencia para todo propósito en su totalidad, incluyendo todas las tablas, figuras, y reivindicaciones - así como incluyendo la incorporación de cualquier elemento o parte de la descripción, reivindicaciones o dibujos no contenidos en la presente y referidos en la Regla 20.5(a) del PCT, conforme a la Regla 4.18 del PCT.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la valoración del riesgo de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML), es decir, la valoración del riesgo de ocurrencia de PML, en un sujeto. La invención también se refiere a métodos basados en tal valoración de riesgo. La invención proporciona un método para estratificar a un sujeto que se somete a Terapia Antirretroviral Altamente Activa (HAART) para la modificación de HAART, así como a un método para estratificar a un sujeto que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a-integrina y/o un agente bloqueador de VLA-4 para la suspensión de este tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4. Se proporcionan además un método para tratar una infección retroviral para evitar la ocurrencia de PML y un método para administrar un agente bloqueador de a4-integrina o un agente bloqueador de VLA-4 en un sujeto a fin de evitar la ocurrencia de PML. La invención proporciona además un método para tratar a un sujeto con una enfermedad autoinmune. La invención también proporciona un método para tratar a un sujeto con una infección retroviral tal como V1H.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La siguiente exposición de los antecedentes de la invención se proporciona solamente para ayudar al lector en el entendimiento de la invención y no se admite para describir o constituir la téenica anterior para la presente invención.
La leucoencefalopatía multifocal (PML) es una enfermedad neurodegenerativa que puede ocurrir típicamente en el curso de V1H/SIDA avanzado. La PML también es un efecto adverso potencial de una cierta terapia de esclerosis múltiple y enfermedad de Crohn.
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad del sistema inmune humano reconocido primero en E.U. en 1981. Se identificaron casos sobre la base de varias infecciones oportunistas, y después se encontró que la enfermedad se causó por el V1H. En 2011, la Organización Mundial de la Salud estimó que existían aproximadamente 34.2 millones de personas en el mundo viviendo con VIH/SIDA.
El desarrollo de nuevos agentes antirretrovirales que incluyen inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa e inhibidores de proteasa ha cambiado el VIH/SIDA de una infección fatal aguda/subaguda a una enfermedad crónica. El desarrollo de terapias antirretrovirales también ha tenido un impacto significativo sobre las manifestaciones neurológicas de VIH. La sobrevivencia prolongada de pacientes con VIH/SIDA en Terapia Antirretroviral Altamente Activa (HAART) ha cambiado la prevalencia de enfermedades neurológicas relacionadas con VIH a grupos de edad más avanzada y se crea una población que se encuentra en riesgo de desarrollar enfermedades neurodegenerativas en la edad avanzada.
La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad del sistema nervioso central (CNS) crónica, inflamatoria, caracterizada patológicamente por desmielinización. La MS también se ha clasificado como una enfermedad autoinmune. La actividad de la enfermedad MS puede monitorearse por exploraciones craneales, incluyendo formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) del cerebro, la acumulación de discapacidad, así como la tasa y severidad de recaídas. Existen cinco distintas etapas y/o tipos de la enfermedad de MS, es decir, (1) esclerosis múltiple benigna; (2) esclerosis múltiple remitente-recurrente; (3) esclerosis múltiple progresiva secundaria; (4) esclerosis múltiple recurrente progresiva; y (5) esclerosis múltiple progresiva primaria.
La enfermedad de Crohn es un tipo de enfermedad inflamatoria del intestino. Típicamente se manifiesta en el tracto gastrointestinal y puede categorizarse por la región específica del tracto afectada. Se considera ser una enfermedad autoinmune, en la cual el sistema inmune del cuerpo ataca el tracto gastrointestinal, causando la inflamación del tracto gastrointestinal. Las manifestaciones de la enfermedad usualmente se aíslan en el tracto digestivo, pero se encuentran bien descritas otras manifestaciones tales como inflamación de las estructuras de la piel, los ojos, y las articulaciones. La enfermedad se conoce por tener remisiones y exacerbaciones espontáneas. Desafortunadamente, no se conoce la causa de la enfermedad de Crohn, y no existe cura conocida para la enfermedad de Crohn.
La enfermedad de Crohn tiene un patrón de respuesta inmune que incluye una producción incrementada de interleucina-12, factor de necrosis tumoral (TNF) e interferón-g. El factor de necrosis tumoral (TNF) se ha identificado como una citocina importante en la patogénesis de la enfermedad de Crohn, con concentraciones elevadas que juegan un papel en la inflamación patológica. La producción incrementada de TNF por macrófagos en pacientes con enfermedad de Crohn da como resultado concentraciones elevadas de TNF en las heces, sangre, y mucosa. En años recientes, los modificadores de respuesta biológica que inhiben la actividad de TNF se han vuelto terapias potenciales para tratar la enfermedad de Crohn.
La inmunoglobulina monoclonal humanizada Natalizumab, dirigida contra la a4-subunidad de integrinas a4b? (VLA-4, Antígeno-4 Muy Tardío) y a4b7 (LPAM-1, Molécula 1 de Adhesión de Placas de Pcyer de Linfocito) expresadas sobre la superficie de linfocitos activados, se ha utilizado en el tratamiento tanto de MS como de la enfermedad de Crohn. Natalizumab es tanto clínicamente efectivo como bien tolerado en general. Sin embargo, se ha encontrado que el tratamiento con Natalizumab por más de 18 meses se asocia con un riesgo aumentado para desarrollar PML. PML casi se ha encontrado exclusivamente en individuos inmunocomprometidos, especialmente en sujetos con inmunidad celular reducida. También se ha reportado en enfermedades reumáticas. PML se ha encontrado por ejemplo en individuos con malignidades hematológicas y enfermedades linfoproliferativas, individuos con linfoma de Hodgkin, individuos con lupus eritematoso sistémico o sujetos que reciben medicación inmunosupresora tales como pacientes con trasplante. Además de la terapia con Natalizumab, PML se ha encontrado que se asocia con terapia que utiliza los anticuerpos monoclonales Rituximab, utilizados en el tratamiento de linfornas, leucemias, rechazo de trasplante y ciertos trastornos autoinmunes, y Efalizumab, anteriormente utilizado en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, en particular psoriasis. En vista del riesgo de PML, Efalizumab se ha retirado actualmente del mercado de E.U. Natalizumab, aprobado primero en 2004 por la Administración de Alimentos y Fármacos de E.U. (FDA) para el tratamiento de esclerosis múltiple, se retiró del mercado después de que se relacionó con tres casos de PML. Después de una revisión de la información de seguridad y de que no se identificaron casos adicionales de PML en pacientes previamente tratados, el anticuerpo se volvió a introducir en los E.U. y se aprobó en la Unión Europea en Julio de 2006.
Natalizumab se ha limitado ahora como una monoterapia para pacientes adultos con esclerosis múltiple remitente-recurrente (RRMS) con alta actividad de la enfermedad. Natalizumab también se aprobó aún como una monoterapia para adultos con la enfermedad de Crohn activa de moderada a severa.
PML se causa por infección lítica de oligodendrocitos por el virus de John Cunningham (JCV), un poliomavirus humano sin envoltura, de doble filamento. Hasta ahora ha habido más de 150 casos de PML inducido por JCV asociados con el tratamiento de pacientes de MS con Natalizumab con una tasa de mortalidad hasta ahora de 20%. Aún se desconoce grandemente cómo el tratamiento con bloqueo de integrinas a4bi/n?A-4 y/o a4b7/?RAM-1 interfiere con el control o inmunovigilancia de JCV (Tan, C.S, and Koralnik, I.J., Lancet Neurol. (2010) 9, 4, 425-437). Sin embargo, la mayoría de los casos de PML, se representa por individuos infectados con V1H (supra). Aunque la disponibilidad de las terapias antirretrovirales potentes ha conducido a una disminución en la incidencia de PML, la mortalidad y morbidez de PML asociada con V1H/SIDA permanecen altas (Hernández, B., et al . , Expert Opin. Pharmacother.
[2009] 10, 3, 403-416). JCV es difícil de estudiar ya que se desarrolla solamente en unos cuantos tipos celulares in vitro (células gliales fetales de humano o glioma de adulto o líneas celulares de neuroblastoma) y no existen modelos animales.
El pronóstico de PML es deficiente, ya que no está disponible una terapia específica. Aunque solamente el 20% de los pacientes con PML tratados con Natalizumab hasta ahora han muerto, se ha reportado que la mortalidad total de PML es mayor del 50%. En la ausencia de cualquier terapia, sería particularmente útil ser capaz de predecir el riesgo de si un individuo, en particular un individuo que padece de infección de V1H, probablemente está por desarrollar PML. Por lo tanto, existe una necesidad de medios para determinar en una etapa temprana, es decir, antes del inicio de la enfermedad, si un individuo V1H positivo es probable que sufra de PML.
Los estudios recientes sugieren que los pacientes bajo tratamiento con el agente bloqueador de a4-integrina, Natalizumab, por más de 12 meses están en riesgo elevado de PML, con el riesgo incrementando después de aproximadamente 18 meses de tratamiento, y pueden alcanzar niveles de riesgo de hasta 1:120. No se sabe si el riesgo de desarrollar PML continua aumentado, permanece igual, o disminuye después de que un paciente ha estado en Natalizumab por más de tres años. Ya que existe una clara asociación de riesgo entre Natalizumab y el desarrollo de PML después de tratamiento a largo plazo con el agente bloqueador de a4-integrina, Natalizumab, existe una necesidad urgente de identificar aquellos pacientes que son más propensos a PML. Sin embargo, solamente pocos candidatos como indicadores en este aspecto han desarrollado: (1) duración de tratamiento, (2) pre-tratamiento con fármacos inmunosupresores, y (3) presencia de anticuerpos JCV en suero.
La solicitud de patente europea EP 2 226 392 Al describe un metodo inmunológico para detectar una infección activa extra renal por JCV en un paciente que es un candidato para tratamiento inmunosupresor. El método de EP 2226 392 Al incluye buscar la presencia de linfocitos T activados contra JCV.
Solicitud de patente de E.U.2010/0196318 describe probar el anticuerpo anti-JCV de suero antes de iniciar la terapia con Natalizumab en pacientes. Sin embargo, la detección de anticuerpo JCV en un individuo no predice el riesgo de PML y por lo tanto no puede aconsejar a un médico de si continuar o no el tratamiento. La solicitud de patente de E.U. 2009/0216107 describe un método para seleccionar pacientes que se someten a tratamiento con Natalizumab al probar el fluido cerebroespinal del paciente para detectar la presencia de citomegalovirus, JCV, Toxoplasma gondii, virus de Epstein-Barr, Cryptococcus neoformans y tuberculosis por PCR, así como examinar el estado retinal para detectar la presencia de citomegalovirus ocular. Si se detecta una indicación de la presencia del virus, debería interrumpirse el tratamiento con Natalizumab. Sin embargo, tales métodos son solamente medidas precautorias, las cuales tampoco indican un riesgo de desarrollar PML. Aún permanece una necesidad de desarrollar un metodo para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar PML quien recibe un agente bloqueador de a4-integrina en una base individual. Sería ventajoso si la determinación podría ayudar al practicante a identificar pacientes quienes son propensos a PML o detener el tratamiento en tiempo antes de que se deteriore la competencia inmune del sujeto.
Por lo tanto es un objeto de la presente invención proporcionar un método que es adecuado para determinar el riesgo de desarrollo de PML en un sujeto. Sería ventajoso si tal método puede utilizarse para monitorear la competencia inmune de pacientes que reciben o esperan recibir Natalizumab, de esta manera para evitar el posible desarrollo de PML o aún otra complicación en una etapa posterior. Es un objeto adicional de la invención proporcionar un método para valorar la probabilidad de ocurrencia de PML en un sujeto que padece V1H. Es aún un objeto adicional de la invención proporcionar un método terapéutico o utilizarlo para un sujeto bajo HAART o bajo tratamiento con un agente bloqueador de o¡4-integrina que evita la ocurrencia de PML. Estos objetos se resuelven por los métodos de las reivindicaciones independientes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente descripción puede tomarse para relacionarse generalmente con la determinación de una competencia inmune del sujeto. En un aspecto, la invención se refiere a la identificación de uno o más sujetos que/quienes están en riesgo inferior o más alto de desarrollar PML. Más específicamente, la presente invención proporciona ínter alia un método para valorar la probabilidad de que un sujeto desarrollará una condición asociada con virus JC y un método de estratificación para riesgo de una enfermedad inducida por JCV. Típicamente tal un método es un método de estratificación de riesgo de PML. Un sujeto respectivo puede estar en una condición inmunosupresora. Un sujeto respectivo también puede haber recibido un trasplante de médula ósea, un trasplante de órgano, o un trasplante de célula madre. En un aspecto, esta descripción proporciona un método de valoración del riesgo de un individuo tal como un paciente que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o tratamiento con un agente bloqueador de VLA-4 para ocurrencia de una enfermedad inducida por JCV o al menos algunos aspectos de tal enfermedad. En un aspecto adicional la invención proporciona un método para detectar o diagnosticar el riesgo de ocurrencia de PML así como un método para diagnóstico y/o pronóstico de PML. En otro aspecto esta descripción proporciona un método para determinar si un individuo tal como un paciente infectado con un retrovirus tal como V1H está o no está en riesgo incrementado de padecer una enfermedad inducida por JCV. En todavía un aspecto adicional se proporciona un método para llevar a cabo citometría de flujo en células T de un individuo para valorar la probabilidad de que el individuo desarrollará o no una enfermedad inducida por JCV. La presente descripción proporciona biomarcadores, el nivel de los cuales puede ayudar al practicante a determinar un régimen terapéutico apropiado para un sujeto, típicamente un paciente. La presente invención también proporciona un método para tratar a un sujeto infectado con V1H así como un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno autoinmune. En algunas modalidades el trastorno autoinmune es una enfermedad inflamatoria patológica, tal como MS, la enfermedad de Crohn, sarcoidosis, Síndrome de Sjógren, síndrome de Churg-Strauss o colitis ulcerativa. En algunas modalidades el trastorno autoinmune es enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Addison, tiroiditis de Hashimoto, lupus eritematoso sistémico o una miopatía inflamatoria idiopática tal como dermatomiositis, polimiositis y miositis corporal por inclusión esporádica.
Los métodos y usos proporcionados por la presente invención se basan en emplear L-selectina (CD62L), ligando-1 de glicoproteína de P-selectina (PSGL-1) y/o antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1) como un biomarcador para identificar una predisposición de un sujeto de desarrollar PML. En el contexto de la presente invención los niveles de CD62L, niveles de PSGL-1 y/o niveles de LFA-1 pueden determinarse utilizando cualquier téenica deseada. En algunas modalidades pueden emplearse medios que indican indirectamente niveles de CD62L, niveles de PSGL-1 y/o niveles de LFA-1, por ejemplo al valorar indicadores de cuales niveles de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 pueden inferirse. Un método de acuerdo a la invención puede incluir asignar una probabilidad de uno o más cambios futuros en una competencia inmune del sujeto, en particular con respecto a un riesgo del sujeto de tener una condición asociada con virus JC. Un método de acuerdo a la invención puede incluir organizar, monitorear, categorizar y/o determinar una competencia inmune del sujeto, asi como organizar, monitorear, categorizar y/o determinar regímenes de diagnóstico y tratamiento adicionales en un sujeto en riesgo de padecer una enfermedad inducida por JCV.
De acuerdo a un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para valorar el riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto. El método generalmente incluye proporcionar una muestra del sujeto. Además el método comprende detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 en la muestra del sujeto. En algunas modalidades el método comprende además detectar el nivel de células T que expresan CD62L en la muestra del sujeto. En algunas modalidades el método comprende además detectar el nivel de células T que expresan LFA-1 en la muestra del sujeto. En una modalidad el método comprende detectar el nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y de células T que expresan PSGL-1 en la muestra del sujeto.
De acuerdo a algunas modalidades del método de acuerdo al primer aspecto la muestra es una muestra de fluido corporal del sujeto seleccionada de una muestra sanguínea, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al primer aspecto, las células T son células T CD3+. De acuerdo a modalidades particulares del método de acuerdo al primer aspecto, el sujeto padece de una infección retroviral. El sujeto, por ejemplo, puede infectarse con V1H. En una tal modalidad el método comprende detectar el nivel de células T que expresan CD62L en una muestra del sujeto. De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al primer aspecto, la expresión se monitorea a ciertos, e.g. intervalos de tiempo, predeterminados.
De acuerdo a una modalidad adicional del método de acuerdo al primer aspecto, el sujeto se ha diagnosticado como estando con necesidad de tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina. En tal una modalidad puede analizarse el nivel de células T que expresan CD62L, células T que expresan PSGL-1 y/o células T que expresan LFA-1 en la muestra del sujeto.
De acuerdo a todavía una modalidad adicional del método de acuerdo al primer aspecto, el sujeto se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina tal como un agente bloqueador de VLA-4 y/o un agente bloqueador de LPAM-1. El agente bloqueador de a4-integrina es en algunas modalidades una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. De acuerdo a una modalidad del método de acuerdo al primer aspecto, un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, puede indicar un riesgo elevado de ocurrencia de PML. En tales modalidades un método de acuerdo al primer aspecto puede incluir determinar que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de ocurrencia de PML. De acuerdo a esta modalidad del método de acuerdo al primer aspecto, un nivel incrementado de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, o un nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 que es aproximadamente el valor umbral, puede indicar riesgo no elevado de ocurrencia de PML. En este caso de acuerdo con lo anterior puede determinarse que el sujeto no está en riesgo elevado de ocurrencia de PML.
En algunas modalidades del método de acuerdo al primer aspecto se determina además si el sujeto es seropositivo para JCV, es decir, si las inmunoglobulinas contra JCV están presentes en el organismo del sujeto. Si el sujeto no es seropositivo para JCV se determina que el sujeto no está en riesgo elevado de ocurrencia de PML. Si el sujeto es seropositivo para JCV, es decir, el sujeto tiene inmunoglobulinas contra JCV, y se detecta un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, se determina que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de desarrollar una condición asociada con infección de JCV. En modalidades donde se detecta el nivel de células T que expresan CD62L y/o de células T que expresan LFA-1 en la muestra, y el sujeto es seropositivo para JCV, si se detecta un nivel disminuido de una de células T que expresan CD62L, células T que expresan LFA-1, y células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, se determina que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de desarrollar una condición asociada con infección de JCV.
En algunas modalidades del método de acuerdo al primer aspecto el detectar el nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 incluye contactar la muestra con un ligando. El ligando es específico para al menos uno de CD62L, LFA-1 y PSGL-1, respectivamente. En tales modalidades del método de acuerdo al primer aspecto el detectar el nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 incluye además detectar la cantidad del ligando que se une a proSP-B.
En algunas modalidades el método de acuerdo al primer aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo en células T del sujeto. En algunas modalidades el método de acuerdo al primer aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS).
De acuerdo a algunas modalidades del método de acuerdo al primer aspecto, el método incluye comparar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 en la muestra con un valor umbral.
En algunas modalidades del método de acuerdo al primer aspecto un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica un riesgo elevado de ocurrencia de PML. Un nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral indica riesgo no elevado de ocurrencia de PML cuando se compara con sujetos saludables. En algunas modalidades un método de acuerdo al primer aspecto de acuerdo con lo anterior incluye diagnosticar la probabilidad de ocurrencia o no ocurrencia de PML, y el nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 se correlaciona(n) con la probabilidad de ocurrencia o no ocurrencia de PML.
En algunas modalidades del método de acuerdo al primer aspecto se determina un riesgo incrementado de ocurrencia de PML si se detecta un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral. En algunas modalidades del método de acuerdo al primer aspecto se determina que no existe riesgo incrementado de ocurrencia de PML si se detecta un nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral.
En una modalidad se determina más de un nivel del nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y de células T que expresan PSGL-1. Cada uno de los niveles/cantidades medidos puede compararse con un valor umbral. Una probabilidad incrementada de la ocurrencia de PML se asigna al sujeto cuando la concentración medida está por debajo del umbral (relativa a la probabilidad asignada cuando la concentración medida está arriba o en el umbral). Cuando la concentración medida está arriba o en el umbral, puede asignarse una probabilidad incrementada de la no ocurrencia de PML al sujeto (relativa a la probabilidad asignada cuando la concentración medida está por debajo del umbral).
En algunas modalidades el método de acuerdo al primer aspecto se incluye en un método para tratar a un sujeto con una enfermedad autoinmune, incluyendo una enfermedad desmielinizante. Como se explica arriba, se considera que PML se causa por JCV, de manera que la enfermedad desmielinizante correspondiente tratada es diferente de PML. Ejemplos de una enfermedad autoinmune respectiva incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple, incluyendo MS remitente-recurrente y MS progresiva secundaria, la enfermedad de Crohn, artritis reumatoide y psoriasis. El método para tratar a un sujeto con una enfermedad autoinmune comprende administrar un agente bloqueador de a4-integrina, determinar la expresión de PSGL-1 en células T del sujeto, y continuar o discontinuar la administración del agente bloqueador de a4-integrina en base al nivel determinado de expresión de PSGL-1. El determinar la expresión de PSGL-1 en células T del sujeto típicamente se lleva a cabo en células T que se incluyen en una muestra del sujeto tratado o a tratarse. La administración del agente bloqueador de a4-integrina puede detenerse si se identifica un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1 con relación a un valor umbral. La administración del agente bloqueador de oc4-integrina puede continuarse si se determina un nivel de células T que expresan PSGL-1 que es aproximadamente el mismo que un valor umbral, o arriba de un valor umbral. En algunas modalidades tal un método comprende además determinar la expresión de CD62L y/o LFA-1 en células T del sujeto. En tal una modalidad la administración del agente bloqueador de a4-integrina puede detenerse o continuarse en base al nivel medido de expresión de PSGL-1 así como CD62L y/o LFA-1 en células T del sujeto. La administración del agente bloqueador de a4-integrina puede discontinuarse si se determina un nivel disminuido de al menos una de las células T que expresan PSGL-1, células T que expresan CD62L y células T que expresan LFA-1, con relación a un valor umbral. La administración del agente bloqueador de a4-integrina puede continuarse si se determina un nivel de PSGL-1, células T que expresan CD62L y/o LFA-1 que es aproximadamente el mismo que un valor umbral, o arriba de un valor umbral.
En algunas modalidades el método de acuerdo al primer aspecto se incluye en un método para tratar pacientes con una infección retroviral, incluyendo una infección de V1H. El método para tratar a un sujeto con una infección retroviral comprende administrar un compuesto antirretroviral o una combinación de compuestos antirretrovirales, determinar la expresión de PSGL-1 en células T del sujeto, y continuar o discontinuar la administración del(los) compuesto(s) antirretroviral(es) en base al nivel determinado de expresión de PSGL-1. El determinar la expresión de PSGL-1 en células T del sujeto típicamente se lleva a cabo en células T que se incluyen en una muestra del sujeto tratado o a tratarse. La administración del(los) compuesto(s) antirretroviral(es) puede detenerse si se identifica un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1 con relación a un valor umbral. La administración del(los) compuesto(s) antirretroviral(es) puede continuarse si se determina un nivel de células T que expresan PSGL-1 que es aproximadamente el mismo que un valor umbral, o arriba de un valor umbral. En algunas modalidades tal un método comprende además determinar la expresión de CD62L y/o LFA-1 en células T del sujeto. En tal una modalidad la administración del(los) compuesto(s) antirretroviral(es) puede detenerse o continuarse en base al nivel medido de expresión de PSGL-1 así como CD62L y/o LFA-1 en células T del sujeto. La administración de compuesto(s) antirretroviral(es) puede discontinuarse si se determina un nivel disminuido de al menos una de las células T que expresan PSGL-1, células T que expresan CD62L y células T que expresan LFA-1, con relación a un valor umbral. La administración del(los) compuesto (s) antirretroviral(es) puede continuarse si se determina un nivel de PSGL-1, células T que expresan CD62L y/o LFA-1 que es aproximadamente el mismo que un valor umbral, o arriba de un valor umbral.
De acuerdo a modalidades adicionales del método de acuerdo al primer aspecto el método comprende determinar la migración de células inmunes CD45+CD49d+, tales como células T CD45+CD49d+. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis transendotelial. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis, por ejemplo emplear una membrana permeable vacía.
En un segundo aspecto relacionado la invención proporciona un método para seleccionar uno o más individuos para riesgo u ocurrencia futura de una condición asociada con infección de JCV. En algunas modalidades uno o más individuos se infecta(n) con un retrovirus tal como V1H. El método generalmente incluye proporcionar una muestra de cada uno de uno o más sujetos. El método comprende detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 en la muestra de cada uno de uno o más sujetos. En algunas modalidades el método comprende además detectar el nivel de células T que expresan CD62L en la muestra de cada uno de uno o más sujetos. En algunas modalidades el método comprende además detectar el nivel de células T que expresan LFA-1 en la muestra de cada uno de uno o más sujetos. En una modalidad el método comprende detectar el nivel de células T que expresan CD62L, detectar el nivel de células T que expresan LFA-1 y detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 en la muestra de cada uno de uno o más sujetos.
De acuerdo a una modalidad del método de acuerdo al segundo aspecto, el método incluye comparar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 en la muestra con un valor umbral.
En algunas modalidades del método de acuerdo al segundo aspecto un nivel alterado, tal como uno disminuido o uno incrementado de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1, con relación a un valor umbral, puede indicar un riesgo incrementado de ocurrencia futura de una condición asociada con infección de JCV. En tales modalidades un método de acuerdo al segundo aspecto puede incluir determinar que el sujeto se encuentra en un riesgo incrementado de ocurrencia futura de una condición asociada con infección de JCV.
En una modalidad del método de acuerdo al segundo aspecto un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica que el sujeto se encuentra en un riesgo incrementado de ocurrencia futura de una condición asociada con infección de JCV. Un nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral indica que el sujeto no está en riesgo incrementado de ocurrencia futura de una condición asociada con infección de JCV cuando se compara con sujetos saludables.
En algunas modalidades del método de acuerdo al segundo aspecto se determina que un sujeto está en un riesgo incrementado de ocurrencia futura de una condición asociada con infección de JCV si se detecta un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral. En algunas modalidades del método de acuerdo al segundo aspecto se determina que un sujeto está en riesgo incrementado de una condición asociada con infección de JCV si se detecta un nivel disminuido de al menos una de las células T que expresan PSGL-1 y células T que expresan CD62L, con relación a un valor umbral.
En algunas modalidades del método de acuerdo al segundo aspecto se determina además si el sujeto es seropositivo para JCV, es decir, si el sujeto lleva inmunoglobulinas contra JCV. Si el sujeto no es seropositivo para JCV se determina que el sujeto no está en riesgo elevado de desarrollar una condición asociada con infección de JCV. Si el sujeto es seropositivo para JCV, es decir, el sujeto tiene inmunoglobulinas contra JCV, y se detecta un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, se determina que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de desarrollar una condición asociada con infección de JCV.
En algunas modalidades del método de acuerdo al segundo aspecto, las células T son células T CD3+. En algunas modalidades el método de acuerdo al segundo aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a algunas modalidades del método de acuerdo al segundo aspecto el método comprende determinar la migración de células inmunes CD45+CD49d+, tales como células T CD45+CD49d+. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis transendotelial. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis, por ejemplo emplear una membrana permeable vacía.
En un tercer aspecto se proporciona un método para monitorear el riesgo de ocurrencia de una condición relacionada con JCV en un sujeto. El método incluye monitorear el nivel de células T que expresan PSGL-1 del sujeto. En algunas modalidades tal método comprende además monitorear el nivel de células T que expresan CD62L y/o LFA-1 del sujeto. Generalmente estas células T se incluyen, incluyendo se proporcionan, en una muestra del sujeto. En algunas modalidades del método de acuerdo al tercer aspecto, las células T son células T CD3+. El monitoreo de la expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en células T generalmente se lleva a cabo utilizando una muestra del sujeto. El monitoreo puede llevarse a cabo a intervalos de tiempo predeterminados. En algunas modalidades el monitoreo comienza antes de un tratamiento. Un tratamiento respectivo puede ser un tratamiento para mejorar la competencia inmune del sujeto, tal como HAART (supra). En algunas modalidades un tratamiento respectivo puede ser un tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina tal como un tratamiento con un agente bloqueador de VLA-4 y/o un tratamiento con un agente bloqueador de LPAM-1.
En algunas modalidades el método de acuerdo al tercer aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a modalidades adicionales del método de acuerdo al tercer aspecto, el método comprende determinar la migración de células inmunes CD45+CD49d+, tales como células T CD45+CD49d+. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis transendotelial. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis, por ejemplo emplear una membrana permeable vacía.
En un cuarto aspecto relacionado se proporciona un método para monitorear el riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto. El método incluye monitorear el nivel de expresión de PSGL-1 en células T. En algunas modalidades el método del cuarto aspecto incluye además monitorear el nivel de expresión de CD62L y/o LFA-1 en células T. Generalmente estas células T se incluyen, incluyendo se proporcionan, en una muestra del sujeto.
En una modalidad del método de acuerdo al cuarto aspecto un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 en un punto de tiempo, con relación a un valor umbral, indica que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de padecer JCV, incluyendo una condición asociada con infección de JCV. En algunas modalidades un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 en dos puntos consecutivos de tiempo (cuando se realizó una medición), con relación a un valor umbral, indica que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de padecer JCV. Un nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral indica que el sujeto no está en riesgo elevado de padecer una condición asociada con infección de JCV cuando se compara con sujetos saludables.
En algunas modalidades del método de acuerdo al cuarto aspecto, las células T son células T CD3+. En algunas modalidades el método de acuerdo al cuarto aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
En algunas modalidades el método de acuerdo al cuarto aspecto comprende determinar la migración de células inmunes CD45+CD49d+, tales como células T CD45+CD49d+. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis transendotelial. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis, por ejemplo emplear una membrana permeable vacía.
En un quinto aspecto se describe un método para seleccionar pacientes que se sabe o se sospecha que son propensos a ocurrencia de PML, es decir, susceptibles a PML. El método generalmente comprende detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra del sujeto. En algunas modalidades el método comprende además detectar el nivel de células T que expresan CD62L y/o LFA-1 en una muestra del sujeto. El método también incluye comparar el resultado, el nivel de células T que expresan PSGL-1, así como - donde sea aplicable - células T que expresan CD62L y/o LFA-1, con un valor umbral.
De acuerdo a un sexto aspecto en este sentido, la invención proporciona un método para monitorear el riesgo de ocurrencia de una complicación relacionada con JCV de infección de SIDA/V1H. El método incluye monitorear el nivel de células T que expresan CD62L y/o células T que expresan PSGL-l en una muestra de un sujeto que tiene infección de SIDA/V1H. Generalmente estas células T se incluyen, incluyendo se proporcionan, en una o más muestras del sujeto. En algunas modalidades las células T son células T CD3+.
De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al sexto aspecto, la expresión se monitorea a ciertos, e.g. intervalos de tiempo, predeterminados. Pueden proporcionarse las muestras del sujeto que se han obtenido en los puntos de tiempo correspondientes.
De acuerdo a una modalidad del método de acuerdo al sexto aspecto, el método incluye comparar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-l en la muestra con un valor umbral.
En algunas modalidades el método de acuerdo al sexto aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
En algunas modalidades del método de acuerdo al sexto aspecto un nivel alterado, tal como uno disminuido o uno incrementado de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1, con relación a un valor umbral, puede indicar un riesgo incrementado de ocurrencia de una condición asociada con infección de JCV. De acuerdo a una modalidad particular, el método de acuerdo al sexto aspecto incluye comparar el nivel de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1 en la muestra con un valor umbral.
En una modalidad del método de acuerdo al sexto aspecto un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica que el sujeto se encuentra en o ha adquirido un riesgo incrementado de padecer una condición asociada con infección de JCV. Un nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral indica que el sujeto no está en riesgo incrementado de padecer una condición asociada con infección de JCV cuando se compara con sujetos saludables.
En algunas modalidades el método de acuerdo al sexto aspecto comprende determinar la migración de células inmunes CD45+CD49d+, tales como células T CD45+CD49d+. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis transendotelial. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis, por ejemplo emplear una membrana permeable vacía.
De acuerdo a un séptimo aspecto, la invención proporciona un método para predecir el riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto. El método también puede tomarse por ser un método para predecir si un paciente está en riesgo de desarrollar PML. El método comprende detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra del sujeto. El método generalmente incluye proporcionar una muestra del sujeto. El método comprende además detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 en la muestra. En algunas modalidades las células T son células T CD3+.
En algunas modalidades el método de acuerdo al séptimo aspecto incluye comparar la expresión de PSGL-1 en células T con un valor de referencia o un valor umbral. Un valor umbral puede basarse en uno o más valores de referencia.
En algunas modalidades el método de acuerdo al séptimo aspecto incluye además detectar el nivel de células T que expresan CD62L en una muestra del sujeto. En algunas modalidades el método de acuerdo al séptimo aspecto incluye comparar la expresión de CD62L en células T con un valor de referencia o un valor umbral. Un valor umbral puede basarse en uno o más valores de referencia. De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al séptimo aspecto, la expresión de CD62L y PSGL-1 se monitorea a ciertos, e.g. intervalos de tiempo, predeterminados.
En algunas modalidades del método de acuerdo al séptimo aspecto un nivel disminuido de al menos una de las células T que expresan CD62L y células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, puede indicar un riesgo elevado de ocurrencia de PML en el sujeto. En tales modalidades un método de acuerdo al séptimo aspecto puede incluir determinar que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de ocurrencia de PML. De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al séptimo aspecto, el nivel de células T que expresan CD62L y de células T que expresan PSGL-1 en la muestra se compara con un valor umbral.
En una modalidad del método de acuerdo al séptimo aspecto un nivel disminuido de al menos una de las células T que expresan CD62L y de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica un riesgo elevado de ocurrencia de PML en el sujeto. Un nivel de al menos una de las células T que expresan CD62L y de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral indica riesgo no elevado de ocurrencia de PML en el sujeto cuando se compara con sujetos saludables.
De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al séptimo aspecto el método comprende además detectar el nivel de células T que expresan LFA-1 en la muestra. De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al séptimo aspecto el sujeto se infecta con un retrovirus. El sujeto puede ser por ejemplo V1H positivo. De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al séptimo aspecto el sujeto se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina tal como un agente bloqueador de VLA-4 y/o un agente bloqueador de LPAM-l. El agente bloqueador de a4-integrina es en algunas modalidades una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina.
En algunas modalidades el método de acuerdo al séptimo aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
En algunas modalidades el método de acuerdo al séptimo aspecto comprende determinar la migración de células inmunes CD45+CD49d+, tales como células T CD45+CD49d+. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis transendotelial. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis, por ejemplo emplear una membrana permeable vacía.
De acuerdo a un octavo aspecto, la invención proporciona un método para monitorear el riesgo de ocurrencia de una complicación relacionada con JCV bajo tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina. El bloqueador de oc4-integrina es en algunas modalidades una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. El método incluye monitorear el nivel de células T en una muestra de un sujeto que tiene infección de SIDA/V1H, que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1. Generalmente estas células T se incluyen, incluyendo se proporcionan, en una o más muestras del sujeto. Las muestras del sujeto pudieron haberse obtenido en ciertos puntos de tiempo.
En algunas modalidades del método de acuerdo al octavo aspecto, las células T son células T CD3+. En algunas modalidades el método de acuerdo al octavo aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T (cf. véase también arriba). En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
En algunas modalidades el método de acuerdo al octavo aspecto incluye comparar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 en la muestra con un valor umbral. En una modalidad del método de acuerdo al octavo aspecto un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, en un punto de tiempo indica que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de ocurrencia de una complicación relacionada con JCV. En algunas modalidades un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 en dos puntos consecutivos de tiempo (donde se realizó una medición), con relación a un valor umbral, indica que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de ocurrencia de una complicación relacionada con JCV. Un nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral indica que el sujeto no está en riesgo elevado de ocurrencia de una complicación relacionada con JCV cuando se compara con sujetos saludables.
De acuerdo a una modalidad particular, el método de acuerdo al octavo aspecto incluye monitorear la migración de células inmunes CD45+CD49d+, tales como células T CD45+CD49d+. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis transendotelial. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis empleando una membrana permeable vacía.
De acuerdo a un noveno aspecto, la invención proporciona un método para estratificar a un sujeto que/quien se está sometiendo a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina para suspensión de tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina. El un agente bloqueador de a4-integrina es en algunas modalidades una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. El método generalmente incluye proporcionar una muestra del sujeto. El método comprende además detectar el nivel de células T en la muestra del sujeto, con las células T que expresan PSGL-1. En algunas modalidades las células T, el nivel de las cuales se detecta, están expresando CD62L y/o LFA-1. En algunas modalidades del método de acuerdo al noveno aspecto, las células T son células T CD3+.
En algunas modalidades del método de acuerdo al noveno aspecto la muestra es una muestra de fluido corporal del sujeto seleccionada de una muestra sanguínea, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
En algunas modalidades el método de acuerdo al noveno aspecto es un método para seleccionar sujetos bajo tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina en cuanto a si son más propensos a PML.
En algunas modalidades el método de acuerdo al noveno aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el metodo incluye llevar a cabo FACS. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a una modalidad particular, el método de acuerdo al noveno aspecto incluye comparar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 en la muestra con un valor umbral.
En algunas modalidades del método de acuerdo al noveno aspecto un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1, con relación a un valor umbral, puede indicar un riesgo incrementado de ocurrencia de PML. En tales modalidades un método de acuerdo al noveno aspecto puede incluir estratificar el sujeto para suspensión de tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina.
En una modalidad del método de acuerdo al noveno aspecto un nivel disminuido de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica un riesgo incrementado de ocurrencia de PML. Un nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral indica riesgo no incrementado de ocurrencia de PML cuando se compara con sujetos saludables.
De acuerdo a un décimo aspecto, la invención proporciona un método para estratificar a un sujeto que se somete a HAART para suspensión de HAART. El método generalmente incluye proporcionar una muestra del sujeto. El método comprende además detectar el nivel de células T que expresan CD62L y/o de células T que expresan PSGL-1 en la muestra del sujeto.
En algunas modalidades del método de acuerdo al décimo aspecto la muestra es una muestra de fluido corporal del sujeto seleccionada de una muestra sanguínea, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
En algunas modalidades del método de acuerdo al décimo aspecto un nivel alterado, tal como uno disminuido o uno incrementado de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1, con relación a un valor umbral, puede indicar un riesgo elevado de ocurrencia de PML. En tales modalidades un método de acuerdo al décimo aspecto puede incluir estratificar el sujeto para suspensión de HAART. De acuerdo a una modalidad particular, el método de acuerdo al décimo aspecto incluye comparar el nivel de células T que expresan CD62L y/o de células T que expresan PSGL-1 en la muestra con un valor umbral.
En una modalidad del método de acuerdo al décimo aspecto un nivel disminuido de células T que expresan CD62L o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica un riesgo elevado de ocurrencia de PML en el sujeto. Un nivel de al menos una de las células T que expresan CD62L y de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral indica riesgo no elevado de ocurrencia de PML en el sujeto cuando se compara con sujetos saludables. Si se detecta un nivel disminuido de células T que expresan CD62L o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, un sujeto que se somete a HAART puede estratificarse para suspensión de HAART. Si se detecta un nivel de células T que expresan CD62L o de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente a un valor umbral o arriba de un valor umbral el sujeto puede no estratificarse para suspensión de HAART.
En algunas modalidades del método de acuerdo al décimo aspecto las células T son células T CD3+. En algunas modalidades el método de acuerdo al décimo aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
En algunas modalidades el método de acuerdo al décimo aspecto es un método para seleccionar sujetos bajo HAART en cuanto a si son más propensos a desarrollar PML.
De acuerdo a algunas modalidades, el método de acuerdo al décimo aspecto comprende determinar la migración de células inmunes CD45+CD49d+, tales como células T CD45+CD49d+. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis transendotelial. En algunas modalidades la migración se mide utilizando un ensayo de quimiotaxis, por ejemplo emplear una membrana permeable vacía.
De acuerdo a un onceavo aspecto, la invención proporciona un método para determinar la proporción, tal como el porcentaje, de células T de un sujeto que tienen PSGL-1 sobre la superficie celular. Típicamente el método se lleva a cabo en una muestra del sujeto. El método comprende determinar la proporción de células T que tienen PSGL-1 sobre la superficie celular al número total de células T, por ejemplo células T en una muestra del sujeto. El método incluye contactar las células T con un ligando específico para PSGL-1. El método comprende además permitir la formación de un compuesto entre PSGL-1 en las células T y el ligando.
En algunas modalidades del método de acuerdo al onceavo aspecto las células T son células T CD3+. En algunas modalidades el método de acuerdo al onceavo aspecto incluye comparar la proporción de células T que expresan PSGL-1 a un valor umbral. En una modalidad del método de acuerdo al onceavo aspecto, si se detecta una proporción disminuida de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, se determina que el sujeto se encuentra (a) con necesidad de una terapia para prevenir la ocurrencia de una condición asociada con infección de JCV o (b) con necesidad de un cambio de terapia de V1H o terapia con un agente bloqueador de a4-integrina para evitar la ocurrencia de una condición asociada con infección de JCV. El un agente bloqueador de a4-integrina es en algunas modalidades una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. Como es aplicable, el sujeto se expone entonces a una terapia para prevenir la ocurrencia de una condición asociada con infección de JCV. Si bajo tal terapia, se cambia una terapia de V1H o una terapia con un agente bloqueador de a4-integrina. Si se detecta una porción incrementada de células T que expresan PSGL-1, relativa a un valor umbral, o una proporción de aproximadamente el valor umbral, se determina que el sujeto (a) no está con necesidad de una terapia para prevenir la ocurrencia de una condición asociada con infección de JCV o (b) no está con necesidad de un cambio de terapia de VIH o terapia con un agente bloqueador de a4-integrina.
En algunas modalidades del método de acuerdo al onceavo aspecto se determina además si el sujeto es seropositivo para JCV. Si el sujeto no es seropositivo para JCV se continúa cualquier terapia de V1H o una terapia con un agente bloqueador de a4-integrina. No se inicia una terapia para prevenir la ocurrencia de una condición asociada con infección de JCV. Si el sujeto es seropositivo para JCV y se detecta una proporción disminuida de células T que expresan PSGL-l, con relación a un valor umbral, e.g. en una muestra del sujeto, se cambia una terapia de V1H o una terapia con un agente bloqueador de a4-integrina, si es aplicable. Si el sujeto es seropositivo para JCV y se detecta una proporción disminuida de células T que expresan PSGL-l, con relación a un valor umbral, el sujeto también puede exponerse a una terapia para prevenir la ocurrencia de una condición asociada con infección de JCV.
Típicamente las células T del sujeto se incluyen en una muestra del sujeto. En algunas modalidades del método de acuerdo al onceavo aspecto la muestra es una muestra de fluido corporal del sujeto seleccionada de una muestra sanguínea, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
De acuerdo a un doceavo aspecto, la invención proporciona un método para determinar la proporción, tal como el porcentaje, de células T de un sujeto que tienen CD62L, LFA-1 y/o PSGL-l sobre la superficie celular. El sujeto tiene infección de SIDA/V1H. Típicamente el método se lleva a cabo en una muestra del sujeto. El método comprende determinar la proporción de células T que tienen CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 sobre la superficie celular al número total de células T, por ejemplo células T en la muestra. El método incluye contactar las células T con un ligando específico para al menos uno de CD62L, LFA-1 y PSGL-1, respectivamente. El método comprende además permitir la formación de un compuesto entre CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 en las células T y el ligando.
En algunas modalidades el método de acuerdo al doceavo aspecto incluye comparar la proporción de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 con un valor umbral. En una modalidad del método de acuerdo al doceavo aspecto, si se detecta una proporción disminuida de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-1 y/o de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, se determina que el sujeto se encuentra con necesidad de un cambio de terapia de V1H para evitar la ocurrencia de una condición asociada con infección de JCV. Cualquier terapia de VIH se cambia de acuerdo con lo anterior. Si se detecta una porción incrementada de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1, con relación a un valor umbral, o una proporción de aproximadamente el valor umbral, se determina que el sujeto no está con necesidad de un cambio de terapia de VIH.
En algunas modalidades del método de acuerdo al doceavo aspecto se determina además si el sujeto es seropositivo para JCV. Si el sujeto no es seropositivo para JCV se continúa cualquier terapia de V1H. Si el sujeto es seropositivo para JCV y una proporción disminuida de células T que expresan CD62L, LFA-l y/o PSGL-l, con relación a un valor umbral, se detecta, e.g. en una muestra del sujeto, se cambia una terapia de V1H.
En algunas modalidades del método de acuerdo al doceavo aspecto las células T son células T CD3+. Típicamente las células T del sujeto se incluyen en una muestra del sujeto. En algunas modalidades del método de acuerdo al doceavo aspecto la muestra es una muestra de fluido corporal del sujeto seleccionada de una muestra sanguínea, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
De acuerdo a un treceavo aspecto, la invención se refiere a un método para llevar a cabo citometría de flujo en células T de un sujeto. El método generalmente es un método de diagnóstico. El método incluye contactar las células T con un ligando específico para PSGL-l. El método comprende además permitir la formación de un compuesto entre PSGL-l en las células T y el ligando. En modalidades típicas el método del treceavo aspecto incluye permitir que las células T pasen a través de un dispositivo microfluídico que es capaz de interrogar a las células T con respecto a la presencia de PSGL-l. En algunas modalidades el dispositivo microfluídico tiene un sensor que es capaz de detectar el ligando. El método comprende además determinar el número de células T que expresan PSGL-l con relación al número total de células T en la muestra. El método comprende además comparar el número de células T que expresan PSGL-l, relativas al número total de células T, con un valor umbral.
En algunas modalidades del método de acuerdo al treceavo aspecto las células T son células T CD3+. Típicamente las células T del sujeto se incluyen en una muestra del sujeto. En algunas modalidades del método de acuerdo al treceavo aspecto la muestra es una muestra de fluido corporal del sujeto seleccionada de una muestra sanguínea, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
De acuerdo a un catorceavo aspecto, la invención se refiere a un método para llevar a cabo citometría de flujo en células T de un sujeto que tiene infección de SIDA/V1H. El método generalmente es un método de diagnóstico. El método incluye contactar las células T con uno o más ligandos específicos para al menos uno de CD62L, LFA-1 y PSGL-l. El método comprende además permitir la formación de un compuesto entre CD62L, LFA-1 y/o PSGL-l en las células T y el ligando correspondiente. En modalidades típicas el método del catorceavo aspecto incluye permitir que las células T pasen a través de un dispositivo microfluídico que es capaz de interrogar a las células T con respecto a la presencia de CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1. En algunas modalidades el dispositivo microfluídico tiene un sensor que es capaz de detectar el ligando. El método comprende además determinar el número de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 con relación al número total de células T en la muestra. El método comprende además comparar el número de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1, con relación al número total de células T, con un valor umbral.
En algunas modalidades del método de acuerdo al catorceavo aspecto las células T son células T CD3+.
Típicamente las células T del sujeto se incluyen en una muestra del sujeto. En algunas modalidades del método de acuerdo al catorceavo aspecto la muestra es una muestra de fluido corporal del sujeto seleccionada de una muestra sanguínea, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
De acuerdo a un quinceavo aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de un ligando, que es específico para CD62L, para valorar el riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto. El sujeto en algunas modalidades puede padecer una infección retroviral. En algunas modalidades el sujeto se infecta con V1H.
En modalidades típicas el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina, con la molécula de unión o la inmunoglobulina siendo específica para CD62L.
De acuerdo a una modalidad particular del uso de acuerdo al quinceavo aspecto el sujeto puede someterse a tratamiento con uno o más agentes bloqueadores a4-integrina. En algunas modalidades el uso de acuerdo al quinceavo aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T CD62L+. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a un dieciseisavo aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de un ligando, que es específico para CD62L, para estratificar a un sujeto que se somete a HAART para la modificación de HAART.
En modalidades típicas el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específica para CD62L. En algunas modalidades el uso de acuerdo al dieciseisavo aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T CD62L+. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a un diecisieteavo aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de un ligando, que es especifico para PSGL-1, para valorar el riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto. El sujeto se infecta con un retrovirus tal como V1H.
En modalidades típicas el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específica para PSGL-1.
De acuerdo a un dieciochoavo aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de un ligando, que es específico para PSGL-1, para estratificar a un sujeto que se somete a HAART para la modificación de HAART.
En modalidades típicas el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específica para PSGL-1. En algunas modalidades el uso de acuerdo al dieciochoavo aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T PSGL-1+. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a un decimonoveno aspecto la invención se refiere al uso in vitro de un ligando, que es específico para LFA-1, para valorar el riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto. El sujeto se infecta con un retrovirus tal como V1H.
En modalidades típicas el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específica para LFA-1. En algunas modalidades el uso de acuerdo al decimonoveno aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T LFA-1+. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a un veinteavo aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de un ligando, que es específico para al menos uno de CD11A, CD18 y LFA-1, para valorar el riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto. El sujeto padece de una infección retroviral. En algunas modalidades el sujeto se infecta con V1H.
En modalidades típicas el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específica para al menos uno de CD11A, CD18 y LFA-1. En algunas modalidades el método de acuerdo al veinteavo aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T positivas para al menos uno de CD11A, CD18 y LFA-1. La clasificación de células T puede basarse en contactar las células en una muestra del sujeto con un ligando, que es específico para CD11A, CD18 y/o LFA-1, respectivamente. El ligando en algunas modalidades puede inmovilizarse en un sustrato. En algunas modalidades el ligando está en solución. En algunas modalidades el ligando se acopla a una marca detectable. En una modalidad el método incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a un vigésimo primer aspecto la invención se refiere al uso de un kit de ensayo de unión PSGL-1 para determinar el riesgo de un sujeto que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina para desarrollar PML.
De acuerdo a una modalidad particular del uso de acuerdo al vigésimo primer aspecto, el kit de ensayo de unión PSGL-1 emplea un ligando PSGL-1.
De acuerdo a un vigésimo-segundo aspecto la invención se refiere al uso de un kit de ensayo de unión de CD62L y/o PSGL-1 para determinar el riesgo de un sujeto infectado con un retrovirus, por ejemplo un sujeto V1H positivo, para desarrollar PML.
De acuerdo a una modalidad particular del uso de acuerdo al vigésimo-segundo aspecto, el kit de ensayo de unión CD62L emplea un ligando CD62L. De acuerdo a una modalidad particular del uso de acuerdo al vigésimo-segundo aspecto, el Ensayo de unión PSGL-1 emplea un ligando PSGL-1.
De acuerdo a un vigésimo-tercer aspecto, la invención se refiere a la medición de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste de CD62L, LFA-1 y PSGL-1 para el pronóstico de PML en un sujeto. El vigésimo-tercer aspecto también puede tomarse para relacionarse con el uso de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste de CD62L, LFA-1 y PSGL-1 para el pronóstico de PML en un sujeto. En algunas modalidades el uso/medición es para la evaluación del riesgo de ocurrencia de PML en el sujeto.
Típicamente la medición del uno o más biomarcadores se lleva a cabo en una muestra del sujeto. En algunas modalidades la medición del uno o más biomarcadores está determinando si el uno o más biomarcadores están presentes en la superficie de células T. En algunas modalidades del método de acuerdo al vigésimo-tercer aspecto las células T son células T CD3+. Típicamente estas células T se incluyen en una muestra del sujeto. En algunas modalidades de la medición o uso de acuerdo al vigésimo-tercer aspecto la muestra es una muestra de fluido corporal del sujeto seleccionada de una muestra sanguínea, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
En algunas modalidades la medición o uso de acuerdo al vigésimo-tercer aspecto incluye llevar a cabo citometría de flujo para clasificar células T. En una modalidad la medición/use incluye llevar a cabo FACS.
De acuerdo a un vigésimo-cuarto aspecto, la invención proporciona un método para estratificar a un sujeto infectado con un retrovirus tal como V1H para discontinuar la administración de uno o más compuestos anti-retrovirales. El sujeto se encuentra de acuerdo con lo anterior bajo tratamiento con estos compuestos anti-retrovirales. El método generalmente incluye proporcionar una muestra del sujeto. El método comprende además detectar el nivel de células T que expresan CD62L, células T que expresan LFA-1 y/o células T que expresan PSGL-1 en una muestra del sujeto. En algunas modalidades del método de acuerdo al vigésimo-cuarto aspecto un nivel alterado, tal como un disminuido de al menos una de las células T que expresan CD62L, células T que expresan LFA-1 y células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, puede indicar la necesidad de discontinuar la administración de los compuestos anti-retrovirales. En tales modalidades un método de acuerdo al vigésimo-cuarto aspecto puede incluir determinar que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de ocurrencia de PML. De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al vigésimo-cuarto aspecto, el nivel de células T que expresan CD62L y de células T que expresan PSGL-1 en la muestra se compara con un valor umbral.
De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al vigésimo-cuarto aspecto, la expresión de CD62L, LFA-1 y PSGL-1 se monitorea a ciertos, e.g. intervalos de tiempo, predeterminados. En algunas modalidades del método de acuerdo al vigésimo-cuarto aspecto las células T son células T CD3+. En algunas modalidades el método de acuerdo al aspecto incluye llevar a cabo citometria de flujo para clasificar células T. En una modalidad la medición/uso incluye llevar a cabo FACS.
En algunas modalidades el método de acuerdo al vigésimo-cuarto aspecto es un método para seleccionar sujetos infectados con un retrovirus y bajo tratamiento con uno o más compuestos anti-retrovirales para una alteración de terapia antirretroviral.
De acuerdo a un vigésimo-quinto aspecto, la invención proporciona un método para tratar una infección retroviral en un sujeto para evitar la ocurrencia adicional de PML. El método comprende administrar una combinación de compuestos anti-retrovirales al sujeto, generalmente una cantidad efectiva de los compuestos anti-retrovirales, durante un periodo de tiempo, seguido por discontinuar la administración por un periodo de tiempo. El discontinuar la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales se efectúa si se determina un nivel reducido de células T que expresan PSGL-1. De acuerdo con lo anterior el método generalmente incluye medir la cantidad/la proporción de células T que expresan PSGL-1. En algunas modalidades el discontinuar la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales incluye iniciar la administración de una combinación alternativa de compuestos anti-retrovirales. En algunas modalidades el método comprende administrar una combinación de compuestos anti-retrovirales al sujeto durante un periodo de tiempo, seguido por intercambiar la combinación de compuesto anti-retrovirales administrada para una combinación diferente de compuestos anti-retrovirales.
En algunas modalidades del método de acuerdo al vigésimo-quinto aspecto se determina además si el sujeto es seropositivo para JCV. Si el sujeto no es seropositivo para JCV se continúa la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales. Si el sujeto es seropositivo para JCV y se detecta un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, en una muestra del sujeto, se interrumpe la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales por un periodo de tiempo.
En un vigésimo-sexto aspecto relacionado la invención proporciona una combinación de compuestos anti-retrovirales para utilizarse en el tratamiento de infección retroviral para evitar la ocurrencia adicional de PML. El uso comprende administración de la combinación a un sujeto durante un periodo de tiempo, seguido por una interrupción de la administración por un periodo de tiempo.
De acuerdo a un vigésimo-séptimo aspecto, la invención proporciona un método para tratar una infección retroviral en un sujeto. El método comprende administrar una combinación de compuestos anti-retrovirales al sujeto, generalmente una cantidad efectiva de los compuestos anti-retrovirales. El método comprende además medir el nivel de expresión de uno o más de CD62L, LFA-1 y PSGL-1 en células T, tales como células T CD3+, del sujeto, típicamente en una muestra del sujeto. En algunas modalidades el método comprende determinar repetidamente la expresión del nivel de CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 en una muestra del sujeto. En algunas modalidades el método incluye monitorear células T que expresan CD62L, células T que expresan LFA-1 y/o células T que expresan PSGL-1 en una muestra del sujeto. En base a la cantidad de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 que se ha determinado, se detiene o continúa la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales. El detener la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales puede incluir iniciar la administración de una combinación alternativa de compuestos anti-retrovirales. En algunas modalidades la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales se reemplaza por administración de una combinación diferente de compuestos anti-retrovirales. El método de acuerdo al vigésimo-séptimo aspecto puede incluir discontinuar la administración de los compuestos anti-retrovirales por un periodo de tiempo si se determina un nivel disminuido de células T que expresan CD62L y/o células T que expresan PSGL-1 con relación a un valor umbral. El método de acuerdo al vigésimo-séptimo aspecto puede incluir continuar la administración de los compuestos anti-retrovirales si se determina un nivel de células T que expresan CD62L y/o células T que expresan PSGL-1 que es un nivel estando a aproximadamente un valor umbral o un nivel arriba de un valor umbral.
En algunas modalidades del método de acuerdo al vigésimo-séptimo aspecto la cantidad de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 se determina después de que se ha discontinuado la administración de los compuestos anti-retrovirales. En algunas modalidades la cantidad de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 se monitorea después de que se ha discontinuado la administración de los compuestos anti-retrovirales. Si se determina que se ha recuperado el número de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1, es decir, incrementado con relación a uno o más valores previos después de interrumpir la administración del(los) compuesto(s) anti-retroviral (es), el(los) compuesto(s) anti-retroviral (es) pueden administrarse al sujeto. En algunas modalidades la administración del(los) compuesto(s) anti-retroviral(es) se inicia de nuevo si se determina un nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 que está aproximadamente al nivel de un valor umbral o arriba de un valor umbral.
De acuerdo a una modalidad particular, el método de acuerdo al vigésimo-séptimo aspecto incluye además comparar el nivel de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1 en la muestra con un valor umbral. De acuerdo a otra modalidad particular, el método de acuerdo al vigésimo-séptimo aspecto incluye además determinar la migración de células inmunes, tales como células CD45+CD49+ y células T. En algunas modalidades el método puede incluir tanto (i) detectar el nivel de expresión del uno o más biomarcadores en células T como (ii) determinar la migración de células inmunes.
De acuerdo a una modalidad particular adicional, el método de acuerdo al vigésimo-séptimo aspecto incluye además discontinuar la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales si se ha determinado un nivel alterado, tal como uno disminuido o uno incrementado de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1. En una modalidad discontinuar la administración de la combinación incluye una terapia de substitución. Discontinuar la administración de la combinación puede incluir administrar una combinación adicional de compuestos anti-retrovirales. Esta combinación adicional es diferente de la combinación de compuesto anti-retrovirales usada inicialmente. De esta manera en una modalidad el metodo comprende administrar una primera combinación de compuestos anti-retrovirales al sujeto, generalmente una cantidad efectiva de los compuestos anti-retrovirales de la primera combinación. El método comprende además monitorear la expresión del nivel de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1 en una muestra del sujeto. El método puede incluir además discontinuar la administración de la primera combinación de compuestos anti-retrovirales y comenzar a administrar una segunda combinación de compuestos anti-retrovirales si se ha determinado un nivel alterado de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1. La segunda combinación de compuestos anti-retrovirales es diferente de la primera combinación de compuestos anti-retrovirales.
En algunas modalidades del método de acuerdo al vigésimo-séptimo aspecto se determina además si el sujeto es seropositivo para JCV. Si el sujeto no es seropositivo para la administración de los compuestos anti-retrovirales se continúa la administración de los compuestos anti-retrovirales. Si el sujeto es seropositivo para JCV y se detecta un nivel disminuido de células T que expresan CD62L y/o células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, la administración de los compuestos anti-retrovirales se interrumpe por un periodo de tiempo.
De acuerdo a una modalidad particular del método de acuerdo al vigésimo-séptimo aspecto la infección retroviral es una infección de V1H.
De acuerdo a un vigésimo-octavo aspecto la invención proporciona un método para tratar a un sujeto que/quien está en un estado de inmunodeficiencia para evitar la ocurrencia adicional de PML. En algunas modalidades el método del vigésimo-octavo aspecto es un método para tratar a un sujeto que/quien padece de una enfermedad autoinmune, incluyendo una enfermedad desmielinizante. El sujeto puede padecer, por ejemplo, MS, e.g. MS remitente-recurrente y MS progresiva secundaria, la enfermedad de Crohn y/o artritis reumatoide. El método comprende administrar uno o más agentes bloqueadores a4-integrina al sujeto, generalmente una cantidad efectiva del(los) agente(s) bloqueador(es) a4-integrina, durante un periodo de tiempo. El agente bloqueador de a4-integrina es en algunas modalidades una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. El método comprende además medir el nivel de expresión de células T, tales como células T CD3+ y/o células T CD4+, que expresan PSGL-1 del sujeto, típicamente en una muestra del sujeto. En algunas modalidades el método comprende determinar repetidamente la expresión del nivel de PSGL-1 en células T en una muestra del sujeto. En algunas modalidades el método incluye monitorear células T que expresan PSGL-1 en una muestra del sujeto. En base al nivel de células T que expresan PSGL-1 que se ha determinado, se detiene o continúa la administración del(los) agente(s) bloqueador(es) oc4-integrina. De acuerdo con lo anterior el método puede incluir discontinuar la administración del(los) agente(s) bloqueador(es) a4-integrina por un periodo de tiempo. Discontinuar la administración del uno o más agentes bloqueadores a4-integrina puede efectuarse después de que se determina un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1 con relación a un valor umbral. El método de acuerdo al vigésimo-octavo aspecto puede incluir discontinuar la administración del(los) agente(s) bloqueador(es) a4-integrina por un periodo de tiempo si se determina un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1 con relación a un valor umbral. El método de acuerdo al vigésimo-octavo aspecto puede incluir continuar la administración del(los) agente(s) bloqueador(es) a4-integrina si se determina un nivel de células T que expresan PSGL-1 que es un nivel, que está a aproximadamente un valor umbral o un nivel que está arriba de un valor umbral.
El método puede incluir además monitorear la expresión de Niveles de PSGL-1 en células T, incluyendo células T CD3+ y/o células T CD4+, en una muestra del sujeto, después de que se ha discontinuado la administración del(los) agente(s) bloqueador(es) a4-integrina. Si se determina que se ha recuperado el número de células T que expresan PSGL-1, es decir, incrementado con relación a uno o más valores previos después de interrumpir la administración del(los) agente(s) bloqueador(es) a4-integrina, puede administrarse el agente bloqueador de a4-integrina(s) al sujeto. En algunas modalidades la administración del(los) agente(s) bloqueador(es) a4-integrina se inicia de nuevo si se determina un nivel de células T que expresan PSGL-1 que está aproximadamente al nivel de un valor umbral o arriba de un valor umbral.
En algunas modalidades el sujeto padece de una enfermedad autoinmune tal como una enfermedad desmielinizante. El sujeto puede padecer, por ejemplo, MS, e.g. MS remitente-recurrente y MS progresiva secundaria, la enfermedad de Crohn, artritis reumatoide y/o psoriasis.
En algunas modalidades del método de acuerdo al vigésimo-octavo aspecto se determina además si el sujeto es seropositivo para JCV. Si el sujeto no es seropositivo para JCV, se continúa la administración del agente bloqueador de a4-integrina. Si el sujeto es seropositivo para JCV y se detecta un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, en una muestra del sujeto, se interrumpe la administración del agente bloqueador de a4-integrina por un periodo de tiempo.
En algunas modalidades del método de acuerdo al vigésimo-octavo aspecto es un método para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto. En algunas modalidades el sujeto padece de una infección retroviral tal como V1H.
De acuerdo a un vigésimo-noveno aspecto la invención proporciona una combinación de una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD62L, una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD3+, y una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para V1H.
De acuerdo a una modalidad particular, la combinación de acuerdo al vigésimo-noveno aspecto se proporciona en la forma de un kit. El kit incluye un primer recipiente que incluye la inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD62L. El kit incluye además un segundo recipiente que incluye la inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD3+. El kit también incluye un tercer recipiente que incluye la inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para VIH.
De acuerdo a un trigésimo aspecto la invención proporciona una combinación de una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para PSGL-1, una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD62L, y una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD3+.
De acuerdo a una modalidad particular, la combinación de acuerdo al trigésimo aspecto se proporciona en la forma de un kit. El kit incluye un primer recipiente que incluye la inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para PSGL-1. El kit incluye además un segundo recipiente que incluye la inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD62L. El kit también incluye un tercer recipiente que incluye la inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD3+.
De acuerdo a un trigésimo-primer aspecto se proporciona un método para tratar a un sujeto. El método comprende administrar uno o más agentes bloqueadores a4-integrina y/o agentes bloqueadores VLA-4 al sujeto. En algunas modalidades el agente bloqueador de a4-integrina es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. El método puede incluir además detectar el nivel de expresión de PSGL-1 en células T, tales como células T CD3+, del sujeto. En algunas modalidades el método comprende además detectar el nivel de células T que expresan CD62L en la muestra del sujeto. En algunas modalidades el método comprende además detectar el nivel de células T que expresan LFA-l en la muestra del sujeto. En una modalidad el método comprende detectar el nivel de células T que expresan CD62L, de células T que expresan LFA-l y de células T que expresan PSGL-1 en la muestra del sujeto. En algunas modalidades se monitorea la expresión de PSGL-1 y, donde sea aplicable, de CD62L y/o LFA-1 en células T. Generalmente estas células T se incluyen, incluyendo se proporcionan, en una muestra del sujeto. El método también puede incluir determinar la migración de células inmunes, tales como células CD45+CD49+ y células T. En algunas modalidades, un biomarcador respectivo es uno o más de CD62L, PSGL-1 y LFA-l. En algunas modalidades el método puede incluir tanto (i) detectar el nivel de expresión del uno o más biomarcadores en células T como (ii) determinar la migración de células inmunes. En algunas modalidades el sujeto puede padecer de un trastorno autoinmune. En algunas modalidades el trastorno autoinmune puede ser un trastorno desmielinizante.
El sujeto en algunas modalidades padece de una enfermedad inflamatoria patológica dentro del CNS. El sujeto en algunas modalidades puede diagnosticarse por tener una enfermedad autoinmune, tal como esclerosis múltiple, e.g. esclerosis múltiple remitente-recurrente y esclerosis múltiple progresiva secundaria o la enfermedad de Crohn. En algunas modalidades el agente bloqueador de VLA-4 es específico de CD49d, es decir, específica para la cadena de integrina a4. Ejemplos de un agente bloqueador de VLA-4 adecuado incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales Natalizumab, HP2/1, HP1/3, HP1/2, incluyendo HP1/2, HP1/7, HP2/4, B-5G10, TS2/16, L25, P4C2, AJM300 humanizado y los anticuerpos anti-VLA4 recombinantes descritos en las Patentes de E.U. US 6,602,503 y US 7,829,092, un antagonista VLA-4 de bajo peso molecular tal como SB-683699, un CS-1 peptidomimético como se describe en e.g. Patentes de E.U. US 5,821,231, US 5,869,448, US 5,869,448, US 5,936,065, US 6,265,572, US 6,288,267, US 6,365,619, US 6,423,728, US 6,426,348, US 6,458,844, US 6,479,666, US 6,482,849, US 6,596,752, US 6,667,331, US 6,668,527, US 6,685,617, US 6,903,128 o US 7,015,216, un derivado de fenilalanina como se describe en e.g. Patentes de E.U. US 6,197,794, US 6,229,011, US 6,329,372, US 6,388,084, US 6,348,463, US 6,362,204, US 6,380,387, US 6,445,550, US 6,806,365, US 6,835,738, US 6,855,706, US 6,872,719, US 6,878,718, US 6,911,451, US 6,916,933, US 7,105,520, US 7,153,963, US 7,160,874, US 7,193,108, US 7,250,516 o US 7,291,645, alfa-feto proteína, un compuesto beta-aminoácido como se describe en e.g. solicitudes de patente de E.U. US 2004/0229859 o US 2006/0211630, un compuesto semi-péptido como se describe en e.g. Patente de E.U. 6,376,538, el tripéptido Leu-Asp-Val y una molécula pegilada como se describe en solicitud de patente de E.U. US 2007/066533 o Patente de E.U. US 6,235,711.
El determinar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 en cualquiera de los aspectos y modalidades anteriores puede incluir detectar el número, proporción, e.g. porcentaje y/o el número absoluto de células T en la muestra del sujeto que tienen CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 sobre la superficie celular. El determinar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 también puede incluir detectar la cantidad o nivel de CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 presente en células T de la muestra del sujeto. El determinar el nivel de células T que expresan CD62L también puede incluir detectar, en células T de la muestra del sujeto, la cantidad o nivel de formación de ácido nucleico del gen SELL que codifica CD62L. El determinar el nivel de células T que expresan LFA-1 también puede incluir detectar la cantidad o nivel de formación de ácido nucleico del gen ITGAL que codifica CD11A y/o el gen ITGB2 que codifica CD18. El determinar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 también puede incluir detectar, en células T de la muestra del sujeto, la cantidad o nivel de formación de ácido nucleico del gen SELPLG que codifica PSGL-1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1A representa el porcentaje (%) de células T CD3+ CD4+ que expresan en superficie CD62L, como se determina por mediciones citométricas de flujo utilizando células mononucleares derivadas de sangre periférica (PBMC). Las células se aíslan de sangre EDTA por centrifugación gradiente de densidad, congelan, descongelan para análisis, y colorean con inmunoglobulinas marcadas con fluorescencia contra CD3, CD4 y CD62L. Las células se representan como se muestra en la Figura 1C. Las cajas en la Fig.1A representan 50% de cada grupo (25vo-75vo percentil) mientras 80% de todos los individuos residen dentro de los límites de cada caja y sus bigotes (10mo-90mo percentil). La línea dentro de las cajas indica el promedio, el más (+) representa la media del grupo respectivo. Cada punto representa un paciente individual. La caja blanca representa 21 sujetos de control sin ningún trastorno agudo o crónico (controles saludables). La caja punteada representa sujetos diagnosticados con MS, quienes están en una condición estable y no reciben ningún tratamiento inmunomodulador anterior (MS simple). La caja gris claro representa pacientes diagnosticados con MS, quienes recibieron tratamientos base diferentes a Natalizumab como se señala en la Fig.14. Estos retiros de sangre tienen lugar justo antes de la intensificación a terapia con Natalizumab (MS base). La caja gris oscuro indica pacientes diagnosticados con MS, quienes después de recibir los tratamientos base como se señala en la Fig. 14 recibieron Natalizumab continuamente por 18 meses o más (18-66 meses de tratamiento con Natalizumab, Natalizumab para MS). Los seis pacientes pre-PML con MS (Natalizumab) numerados coinciden con los criterios del grupo gris oscuro, pero desarrollaron PML después en puntos de tiempo diferentes por toda la terapia a largo plazo con Natalizumab como se señala en la Fig. 14. La línea punteada indica el umbral para riesgo incrementado de PML bajo terapia a largo plazo con Natalizumab (promedio del grupo gris oscuro menos dos veces su desviación estándar).
Figura IB representa el porcentaje (%) de células T CD3+ CD4+ que expresan en superficie CD62L, ver la explicación para la Fig.1A para detalles. Ambos grupos MS (Natalizumab) aguda- y post-PML coinciden con el grupo gris oscuro pero se tomaron muestras después del inicio de PML, ya sea mientras que padece PML aguda (MS (Natalizumab) PML aguda) o después que PML bajo (MS (Natalizumab) post-PML, e.g. el inicio del síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (IRIS). Dos pacientes con otras PMLs asociadas con anticuerpo monoclonal, uno que padece de psoriasis severa tratado con Efalizumab y uno que padece linfoma de célula B tratado con Rituximab (otra PML aguda asociada con anticuerpo monoclonal), y siete pacientes con PML de V1H/SIDA (PML aguda asociada con V1H) sirvieron como controles de PML adicionales. Las líneas rayadas indican muestras secuenciales, si están disponibles pacientes idénticos en diferentes puntos de tiempo durante el desarrollo de la enfermedad.
Figura 1C muestra mediciones ilustrativas de citometría de flujo al colocar en linfocitos vivos, células T CD3+ así como CD4+ y células T CD8+.
Figura ID representa datos de mediciones citométricas de flujo de células mononucleares derivadas de sangre periférica (PBMC). Las células se aíslan de sangre EDTA (sangre EDTA: 1.2 a 2 mg/ml) por centrifugación de gradiente de densidad y se congelan posteriormente. Para análisis, las células se descongelan y colorean con anticuerpos marcados con fluorescencia contra CD3, CD4 y CD62L. 200,000 células se utilizan por coloración. Después de la medición de citometría de flujo, las células se colocan primero en linfocitos vivos, después células CD3+, después células CD4+ y finalmente en células CD62L+ (cf. véase también Fig. 1C). La gráfica representa linfocitos vivos CD3+ CD4+ que son positivos para expresión de CD62L (1-selectina). Los grupos son como sigue: HD = controles saludables sin ninguna patología o tratamiento; NAT = pacientes que padecen esclerosis múltiple recurrente/remitente a largo plazo tratada con Natalizumab (18+ meses de tratamiento); V1H = pacientes que padecen de infección de VIG tratados con medicación HAART; PML V1H = pacientes que padecen infección de VIH tratados con medicación HAART que desarrollaron terapia junto a PML.
Figura 2 muestra porcentajes de monocitos CD14+, celulas T CD4+ y CD8+, células B CD19+, y células NK CD56+ (de PBMC) en la sangre periférica de pacientes que reciben terapia a largo plazo con Natalizumab (³18 meses). Los puntos blancos representan donadores saludables (n=16-39), puntos negros representan pacientes con MS no tratados (n=12), y puntos grises representan pacientes tratados con Natalizumab ³18 meses continuamente (n=34). El significado de diferencias entre los grupos se indica por los asteriscos (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
Figura 3A y 3B representa análisis de datos de mediciones citométricas de flujo de células ononucleares derivadas de sangre periférica (PBMC). Sangre EDTA se obtiene de pacientes y sujetos saludables de control como se indica arriba, PBMC se aislaron por aislamiento de gradiente de densidad y crio-conservaron en 50% RPMI, 40% FCS y 10% DMSO. Las muestras se descongelaron posteriormente y se colorearon en salina regulada por fosfato (200mM EDTA, 0.5% BSA) para marcadores de superficie (CD3, CD4, CD8, CD62L y CD162 (PSGL-1)). 1: Controles saludables, n=73; 2: pacientes con RRMS sin tratar, n=12; 3: pacientes con RRMS antes de la terapia con Natalizumab, n=30; 4: pacientes con RRMS después de terapia a largo plazo con Natalizumab, que se define como una terapia de más de 18 meses, n=78; 5: pacientes V1H+ (CDC estadio B1-C2), n=5; 6: pacientes V1H+ (CDC estadio C3), n=9. Círculos blancos: pacientes con RRMS bajo terapia a largo plazo con Natalizumab antes del inicio de PML; Círculos negros: pacientes VIH+ después del inicio de PML.
Figura 3A: Se muestra el porcentaje de células positivas CD62L de células T CD3+CD4+ o células T CD3+CD8+. Se utilizó un control de isotipo para definir un umbral entre células positivas y negativas CD62L.
Figura 3B: se muestra la expresión de PSGL-1 en células T CD3+CD4+ o células T CD3+CD8+; MFI = Intensidad de Fluorescencia Promedio.
Figura 4 muestra la composición de célula inmune en la sangre periférica (puntos) y CSF (triángulos) de pacientes bajo terapia con Natalizumab (n=18; tratamiento ³18 meses). Se dan los porcentajes de monocitos, células T CD4+ y CD8+ y células B (de leucocitos totales).
Figura 5 muestra la migración in vitro de PBMC aislada sobre células endoteliales icrovasculares de humano primarias (HBMEC). Se dan los valores absolutos de células T migradas por ml de muestra representada por puntos individuales de donadores saludables (círculos abiertos, n=10), pacientes con MS no tratados (negro, n=16) o pacientes con Natalizumab (gris, n=29). La migración se valora después de 6h.
Figura 6 muestra la migración in vitro de PBMC aislada sobre células epiteliales derivadas de plexos coroideos de humano primarias (HCPEpiC). Se dan los valores absolutos de células T migradas por ml de muestra representada por puntos individuales de donadores saludables (círculos abiertos, n=6), pacientes con MS no tratados (negro, n=6) o pacientes con Natalizumab (gris, n=15). La migración se ha valorado después de 6h.
Figura 7 representa diagramas de punto de muestras de los seis pacientes pre-PML con MS Natalizumab y un paciente MS ejemplificativo antes del inicio de la terapia con Natalizumab. La numeración de pacientes pre-PML está en línea con la numeración utilizada en la Fig.14. PBMC se colocaron primero en "linfocitos vivos", después CD3+ (células T), después CD4+ y finalmente se trazaron en CD62L vs. CD45RA para ilustrar la pérdida de CD62L (especialmente el impacto en las células T CD4+ CD45RA+ (simple)).
Figura 8 muestra cuantificación relativa de CDlla en comparación con hS18 en PBMC descongelada de pacientes con MS antes (mes 0) y en el curso de tiempo de terapia (meses 1, 3, 6, 12, 15-20, 21-25, 26-30, 31-40, 41-50; n=27 pacientes) como se valora por PCR en tiempo real. Los valores CT delta inferiores indican una expresión más alta del objetivo.
Figura 9 muestra cuantificación relativa de Runx-3 en comparación con hS18 en PBMC descongelada de pacientes con MS antes (mes 0) y en el curso de tiempo de terapia (meses 1, 3, 6, 12, 15-20, 21-25, 26-30, 31-40, 41-50; n=28 pacientes) como se valora por PCR en tiempo real. Los valores CT delta inferiores indican una expresión más alta del objetivo.
Figura 10 muestra cuantificación relativa de CD62L en comparación con hS18 en PBMC descongelada de pacientes con MS antes (mes 0) y en el curso de tiempo de terapia (meses 1, 3, 6, 12, o más; n=28 pacientes) como se valora por PCR en tiempo real. Los valores CT delta inferiores indican una expresión más alta del objetivo.
Figura 11 muestra los porcentajes de células T que expresan LFA-1 antes de tratamiento con Natalizumab (mes 0) y en el curso de tiempo de terapia (meses 1, 3, 6, 12, 15-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55; n=39 pacientes). Símbolos negros indican el promedio calculado de pacientes en puntos de tiempo dados, se da el error estándar del promedio. Los círculos blancos y grises representan dos pacientes quienes desarrollaron después PML.
Figura 12 muestra los porcentajes de células T que expresan CD62L antes de tratamiento con Natalizumab (mes 0) y en el curso de tiempo de terapia (meses 1, 3, 6, 12, 15-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55; n=39 pacientes). Símbolos negros indican el promedio calculado de pacientes en puntos de tiempo dados, se da el error estándar del promedio. Los círculos blancos y grises representan dos pacientes quienes desarrollaron después PML.
Figura 13 muestra la migración de células T CD3+ (en por ciento, relacionada con pacientes con MS no tratados fijada a 100%) antes de tratamiento con Natalizumab (mes 0) y en el curso de tiempo de terapia (meses 1, 3, 6, 12, 15-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55; n=50 pacientes). Símbolos negros indican el promedio calculado de pacientes en puntos de tiempo dados, se dan promedios de error estándar. Los círculos blancos y grises representan dos pacientes quienes desarrollaron después PML.
Figura 14 enlista todos los pacientes incluidos en el estudio. Se dan grupo/paciente, número de pacientes, año de nacimiento, sexo, primer manifestación de MS, EDSS, pretratamientos, seropositividad de anticuerpo JCV, ciclos de Natalizumab,%CD62L de células T CD4+ (promedio, desviación estándar, y 10-90 percentil) de los siguientes grupos: Controles saludables, MS (simple), MS (tratamientos base), MS (Natalizumab), MS (Natalizumab) pre-PML, MS (Natalizumab) PML aguda, MS (Natalizumab) post-PML, otras PML aguda asociada con V1H y PML aguda asociada con anticuerpo monoclonal, correspondientes a los grupos en la Fig.1A y Fig. IB.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona, entre otros, métodos para determinar un pronóstico del riesgo de ocurrencia de PML. Utilizando tal un método de acuerdo a la invención un sujeto puede identificarse como estando en un riesgo más alto de desarrollar PML cuando se compara con sujetos de otra manera aparentemente similares, e.g. sujetos de estado de salud/enfermedad comparable o exposición del factor de riesgo. En algunas modalidades un método respectivo de acuerdo a la invención de esta manera puede tomarse para definir un método para valorar el nivel de riesgo de un sujeto con respecto a ocurrencia de PML. En base a tal una valoración del riesgo de ocurrencia de PML, se toma una decisión en algunas modalidades en cuanto a si una terapia, por ejemplo para administrar un agente bloqueador de a4-integrina y/o un agente bloqueador de VLA-4, o HAART debe continuarse o descontinuarse. Los métodos de la invención también permiten estratificar pacientes para riesgo de PML.
Definid ones Al menos que se establezca de otra manera, los siguientes términos utilizados en este documento, incluyendo la descripción y reivindicaciones, tienen las definiciones dadas abajo.
La palabra "aproximadamente" como se utiliza en la presente se refiere a un valor estando dentro de un rango de error aceptable para el valor particular como se determina por un experto en la materia, que dependerá en parte de cómo el valor se mide o determina, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, por la práctica en la materia. El término "aproximadamente" también se utiliza para indicar que la cantidad o valor en cuestión puede ser el valor designado o algún otro valor que es aproximadamente el mismo. La frase se propone para expresar que valores similares promueve los resultados o efectos equivalentes de acuerdo a la invención. En este contexto "aproximadamente" puede referirse a un rango arriba y/o abajo de hasta 10%. La palabra "aproximadamente" se refiere en algunas modalidades a un rango arriba de y debajo de un cierto valor que es hasta 5%, tal como hasta 2%, hasta 1%, o hasta 0.5% arriba o abajo de ese valor. En una modalidad "aproximadamente" se refiere a un rango hasta 0.1% arriba y debajo de un valor dado.
El término "administrar", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier modo de transferir, suministrar, introducir, o transportar materia tal como un compuesto, e.g. un compuesto farmacéutico, u otro agente tal como un antígeno, a un sujeto. Los modos de administración incluyen administración oral, contacto tópico, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intranasal, o subcutánea (cf. véase también abajo). Administración "en combinación con" materia adicional tal como uno o más agentes terapéuticos incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "anticuerpo" generalmente se refiere a una inmunoglobulina, un fragmento de la misma o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina (cf. véase también abajo).
La palabra "ensayo" como se utiliza en este documento se refiere a un método, generalmente conocido en la materia, para analizar una característica, e.g. una actividad catalítica, la presencia, la formación o la cantidad de materia que ocurre en un espécimen biológico. Tal materia puede ocurrir en un organismo vivo o que representa un organismo vivo, tal como una proteína, un ácido nucleico, un lípido, una célula, un virus, un sacárido, un polisacárido, una vitamina o un ión, por nombrar unos pocos ejemplos. La palabra "ensayo" enfatiza que se sigue un cierto procedimiento o series de procedimientos, que pueden tomarse para representar el ensayo respectivo. Un ensayo puede incluir reactivos cuantificados y protocolos establecidos para valorar la presencia, ausencia, cantidad o actividad de una entidad biológica.
El término "ensayo de unión" generalmente se refiere a un método para determinar la interacción de materia. Por lo tanto, algunas modalidades de un ensayo de unión pueden utilizarse para determinar cualitativa o cuantitativamente la habilidad de la materia, e.g. una sustancia, para unirse a otra materia, e.g. una proteína, un ácido nucleico o cualquier otra sustancia. Algunas modalidades de un ensayo de unión pueden utilizarse para analizar la presencia y/o la cantidad de materia sobre la base de unión de la materia a un reactivo tal como un ligando que se utiliza en el metodo/ensayo. Como dos ejemplos ilustrativos, un ensayo de unión PSGL-1 o un ensayo de unión CD62L puede incluir el uso de un ligando tal como un anticuerpo (cf. véase abajo) que se une específicamente a PSGL-1 y CD62L, respectivamente. Donde un ensayo de unión se basa en el uso de una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina como un ligando tal un método/procedimiento también puede llamarse un "inmunoensayo". En este sentido, se entiende que las señales obtenidas de un inmunoensayo son un resultado directo de los compuestos formados entre una o más inmunoglobulinas o moléculas de unión proteínicas con funciones similares a inmunoglobulina y el biomarcador correspondiente (es decir, el analito) que contiene los epítopos(s) necesario(s) a los cuales se une(n) el(los) ligando(s). Aunque tal un ensayo puede detectar el biomarcador de longitud completa y el resultado del ensayo puede expresarse como una concentración de un biomarcador de interés, la señal del ensayo actualmente es un resultado de todas de tales moléculas "inmunoreactivas" presentes en la muestra. La expresión de un biomarcador también puede determinarse por promedios además de un inmunoensayo, incluyendo mediciones de proteína tales como inmunotransferencias, inmunotransferencia Western, métodos cromatográficos, espectrometría de masa, y mediciones de ácido nucleico tal como cuantificación de ARNm. Para este propósito las células T pueden aislarse y U sarse opcionalmente, cf. véase también abajo.
Una variedad de métodos para analizar la unión de materia a otra materia se conocen en la materia. Las téenicas debajo de tales métodos, por ejemplo, pueden subdividirse en base al uso de una marca detectable (cf. véase también abajo). Por ejemplo, algunas técnicas requieren un ligando marcado para detección de señal, mientras otras generan una señal en base a la interacción del analito y el ligando - incluyendo por ejemplo medir un cambio de masa. Algunas técnicas no utilizan ligandos marcados, sino que en su lugar utilizan un analito marcado. Algunas técnicas utilizan dos ligandos para crear un así llamado "ensayo sándwich", mientras otras utilizan solamente un ligando (tales como ensayos competitivos). En ensayos sándwich, ambos ligandos se unen específicamente al mismo analito. En algunas modalidades, los dos ligandos se unen a porciones diferentes, tales como epítopos diferentes, del analito. Algunas téenicas requieren una etapa de separación para diferenciar entre un ligando marcado que ha unido un analito y un ligando marcado que no ha unido un analito. Algunas técnicas no requieren una etapa de separación, tales como ensayos de aglutinación y ensayos en donde la marca en el ligando marcado se modifica, activa, o desactiva por la unión del analito. Algunas técnicas requieren un soporte en el cual un ligando se inmoviliza. Un soporte respectivo, por ejemplo puede utilizarse, en el contexto de una técnica donde se emplean dos ligandos - un primer ligando inmovilizado en el soporte, mientras un segundo ligando es un ligando marcado - para unir la marca al soporte. A modo de enjuagar el soporte, cualquier ligando marcado libre, no unido puede entonces moverse antes de medir la cantidad de marca. El término "ensayo de quimotaxis" como se utiliza en la presente se refiere a un método establecido en la materia que puede utilizarse para medir la migración de ciertas células en un ambiente dado.
El término "ligando" como se utiliza en la presente se refiere a materia, tal como una molécula, en particular una molécula polimérico, que puede unir una molécula de ácido nucleico tal como una molécula de ADN o ARN, incluyendo una molécula de ARNm, asi como un péptido, una proteína, un sacárido, un polisacárido o un lípido a través de una interacción que es suficiente para permitir que el agente forme un compuesto con la molecula de ácido nucleico, péptido, proteína o sacárido, un polisacárido o un lípido, generalmente a través de un enlace no covalente. En algunas modalidades el ligando es una molécula PNA. En algunas modalidades el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina como se define abajo. En algunas modalidades el ligando es un aptámero. En algunas modalidades un ligando es específico para un objetivo particular. En algunas modalidades un ligando incluye una pluralidad de sitios de unión, cada sitio de unión siendo específica para un objetivo particular. Como un ejemplo ilustrativo, un ligando puede ser un agente proteínico con funciones similares a inmunoglobulina con dos sitios de unión. Por ejemplo, puede ser un diacuerpo biespecífico, tal como un diacuerpo de cadena única biespecífica.
El término "biomarcador" como se utiliza en la presente se refiere a una proteína o un gen que codifica la proteína, que se expresa a un nivel inferior en, o se encuentra a un nivel inferior en, células T de individuos que están en riesgo en comparación con no en riesgo de ocurrencia de PML.
El término "detectar" o "detectando", así como el término "determinar" o "determinando" cuando se usan en el contexto de un biomarcador, se refiere a cualquier método que puede usarse para detectar la presencia de un ácido nucleico (ADN y ARN) o una proteina/polipéptido. Cuando se utiliza en la presente en combinación con las palabras "nivel", "cantidad" o "valor", las palabras "detectar", "detectando", "determinar" o "determinando" se entiende generalmente que se refieren a un nivel cuantitativo en lugar de cualitativo. De acuerdo con lo anterior, un método de acuerdo a la invención incluye una cuantificación de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 - es decir, la cantidad o número de células T que expresan CD62L, que expresan PSGL-1 y/o que expresan LFA-1, e.g. células T positivas CD3, se analiza. En este sentido las palabras "valor," "cantidad" y "nivel" se utilizan de manera intercambiable en la presente. Los términos "valor," "cantidad" y "nivel" también se refieren a la tasa de síntesis de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en células T CD3+, como se explica más abajo. La naturaleza exacta del "nivel", "cantidad" o "valor" depende del diseño específico y componentes del método analítico particular empleado para detectar CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 u otro biomarcador.
El término "marca detectable" se utiliza en la presente para referirse a cualquier sustancia, la detección o medición de la cual, ya sea directa o indirectamente, por medios físicos o químicos, es indicativa de la presencia de una bioentidad objetivo seleccionada en una muestra.
Ejemplos representativos de marcas detectables útiles incluyen, pero no se limitan a, moleculas o iones directa o indirectamente detectables en base a absorbencia de luz, fluorescencia, reflectividad, difusión de luz, fosforescencia, o propiedades de luminiscencia, moléculas o iones detectables por su propiedades radioactivas o moléculas o iones detectables por sus propiedades paramagnéticas o resonancia magnética nuclear. Una marca detectable en algunas modalidades puede ser una molécula que puede detectarse indirectamente en base a absorbencia de luz o fluorescencia, por ejemplo, varias enzimas que causan que los sustratos apropiados se conviertan, e.g., de moléculas que no absorben luz en moléculas que absorben luz, o de moléculas no fluorescentes a fluorescentes.
Una expresión "diferencial", "diferenciando" o "alterada", como se utiliza por tota la presente solicitud, se observa cuando una diferencia en el nivel de expresión de un biomarcador de la invención puede analizarse al medir el nivel de expresión de los productos de los biomarcadores de la invención, tal como la diferencia en nivel de AR expresado, la diferencia de la cantidad en células o la diferencia de células que llevan el biomarcador en su superficie celular. Una expresión diferencial, se observa por ejemplo, cuando la expresión de una proteína, e.g. en la superficie de una célula, es inferior o más alta que aquella observada de uno o más sujetos de control de manera que un experto en la materia la consideraría de un significado estadístico. Como se explica abajo, en algunas modalidades la expresión/cantidad de una proteína se considera diferencial o alterada cuando la expresión/cantidad de gen se incrementa o disminuye por aproximadamente 10% en comparación con el nivel de control. La expresión/cantidad de una proteína en algunas modalidades se considera diferencial cuando se incrementa o disminuye por aproximadamente 25% cuando se compara con el nivel de control. En algunas modalidades la expresión/cantidad de una proteína se considera alterada cuando la expresión/cantidad de gen se incrementa o disminuye por aproximadamente 50%. En algunas modalidades la expresión/cantidad de una proteína se considera diferencial cuando se incrementa o disminuye por aproximadamente 75%, incluyendo aproximadamente 100%, o más alto, en comparación con el nivel de control. En algunas modalidades un nivel de expresión o una cantidad se considera "diferencial", "incrementada" o "disminuida" cuando la expresión/cantidad de gen se incrementa o disminuye por al menos aproximadamente 0.1 vez, en comparación con un nivel de control. En algunas modalidades un nivel de expresión o una cantidad se considera diferencial cuando se incrementa o disminuye por al menos aproximadamente 0.2 veces. En algunas modalidades la expresión/cantidad de una proteína se considera diferencial cuando se incrementa o disminuye por aproximadamente un factor de 1, incluyendo al menos aproximadamente 2. En algunas modalidades un nivel de expresión o una cantidad se considera "diferencial" cuando la expresión/cantidad de gen se incrementa o disminuye por al menos aproximadamente 5 veces, en comparación con un nivel de control.
Generalmente un biomarcador de la presente invención se expresa a un nivel inferior cuando un sujeto está en un riesgo incrementado de ocurrencia de PML. El término expresión "diferencial", "que se diferencia" o "alterada" también se puede referir a un incremento o disminución en el nivel de expresión medible de un biomarcador dado en una población de células en comparación con el nivel de expresión medible de un biomarcador en una segunda población de células. En una modalidad, la expresión diferencial puede compararse utilizando la proporción del nivel de expresión de un biomarcador o marcadores dados en comparación con el nivel de expresión del biomarcador o biomarcadores dados de un control como se explica abajo. Una expresión diferencial significa que la proporción respectiva no es igual a 1.0. Por ejemplo, un ARN se expresa diferencialmente si la proporción del nivel de expresión en una primer muestra en comparación con una segunda muestra es mayor a o menor a 1.0. Por ejemplo, una proporción mayor a 1 o a 1.2 es una expresión que se diferencia de la referencia. Como un ejemplo adicional, donde la proporción de expresión entre una primer y una segunda muestra es aproximadamente 1.5 o más la expresión es alterada o diferente. En algunas modalidades una expresión con una proporción de aproximadamente 1.7 o mayor se considera como alterada o diferente. En algunas modalidades se toma una proporción de niveles de expresión de aproximadamente 2, 3, 3, 5, 10, 15, 20 o más por ser alterada o diferencial/diferente. Como un ejemplo adicional, donde la proporción de expresión entre muestras es menor a l o aproximadamente 0.8 o menos la expresión es alterada o diferente. En algunas modalidades los niveles de expresión se consideran como diferentes/alterados cuando la proporción es 0.6 o menos. En algunas modalidades se toma una proporción de niveles de expresión de aproximadamente 0.6, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.001 o menos por ser diferente. En algunas modalidades la expresión diferencial se mide utilizando p-valor. Por ejemplo, cuando se utiliza un p-valor, un biomarcador se identifica como expresándose diferencialmente como entre una primera y segunda población cuando el p-valor es menor a aproximadamente 0.1, incluyendo menor a aproximadamente 0.05. En algunas modalidades los niveles de expresión se consideran como diferentes/alterados cuando el p-valor es menor a aproximadamente 0.01. En algunas modalidades los niveles de expresión que tienen a p-valor menor a aproximadamente 0.005 se consideran como diferentes/alterados. En algunas modalidades los niveles de expresión se consideran como diferentes/alterados cuando el p-valor es menor a aproximadamente 0.001.
Una "cantidad efectiva" o una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un compuesto, tal como un compuesto anti-retroviral o un agente bloqueador de VLA-4, es una cantidad - ya sea como una dosis única o como parte de una serie de dosis - suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de la condición patológica relevante, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la presencia de la condición. Tal una condición puede asociarse con inmunosupresión, e.g. una enfermedad autoinmune, o con una infección retroviral.
Un "epítopo" es antigénico y de esta manera un epítopo también puede tomarse para definir una "estructura antigénica" o "determinante antigénico". De esta manera, un dominio de unión de una inmunoglobulina o de una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina es un "sitio de interacción de antígeno". El término "sitio de interacción de antígeno" define, de acuerdo con la presente invención, un motivo de un polipéptido, que es capaz de interactuar específicamente con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos, e.g. L-selectina, PSGL-1 y/o LFA-1 en diferentes especies. Esta unión/interacción también se entiende por definir un "reconocimiento específico". Un epítopo usualmente consiste de agrupamientos de superficie espacialmente accesibles de porciones de una o más entidades químicas tales como cadenas de polipéptido o mono- o polisacáridos. Los agrupamientos de superficie, por ejemplo, pueden ser agrupamientos de aminoácidos o cadenas laterales de azúcar. Un epítopo usualmente tiene tres características estructurales dimensionales, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero pero no al último se pierde en la presencia de solventes desnaturalizantes (cf. véase también abajo).
El término "epítopo" también se refiere a un sitio en un antígeno tal como CD3, CD4 o CD8, con el cual una inmunoglobulina, un receptor de célula T o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina forma un compuesto. En algunas modalidades, un epítopo es un sitio en una molécula contra la cual se producirá una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina y/o a la cual se unirá un anticuerpo. Por ejemplo, un epítopo puede reconocerse por una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. El epítopo puede ser un "epítopo lineal", que es un epítopo donde una secuencia primaria de aminoácidos contiene el epítopo reconocido. Un epítopo lineal típicamente incluye al menos 3, y más usualmente, al menos 5 aminoácidos en una secuencia única. Un epítopo lineal por ejemplo puede incluir aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única. El epítopo también puede ser un "epítopo confor acional", que en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo donde la secuencia primaria de los aminoácidos que incluye el epítopo no es el único componente de definición del epítopo reconocido (e.g., un epítopo en donde la secuencia primaria de aminoácidos no se reconoce necesariamente por el anticuerpo que define el epítopo). Típicamente un epítopo conformacional incluye un número más grande de aminoácidos que un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina reconoce una estructura 3-dimensional del antígeno, tal como n péptido o proteína, o un fragmento de un péptido o proteína. Como un ejemplo ilustrativo, cuando una molécula de proteína se dobla para formar una estructura tridimensional, ciertos aminoácidos y/o toda o porciones de la estructura de polipéptido que forma el epítopo conformacional se yuxtapone, permitiendo que un anticuerpo reconozca el epítopo. Métodos para determinar la conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos x, espectroscopia de resonancia magnética nuclear 2-dimensional, marcado giratorio dirigido al sitio y espectroscopia de resonancia paramagnética de electrón.
Por el uso del término "enriquecido" en referencia a un polipéptido, un ácido nucleico o una célula se entiende que la secuencia específica de aminoácidos/nucleótidos o célula, incluyendo población celular, constituye una fracción significativamente más alta (2 - 5 veces) de las secuencias de aminoácidos totales o secuencia de ácidos nucleicos presentes en la muestra de interés en la fuente natural de la cual se obtiene la muestra. El polipéptido, un ácido nucleico o una célula también puede constituir una fracción significativamente más alta que en un organismo enfermo o normal o que en células normales o enfermas o en las células de las cuales se toma la secuencia. Esto podría causarse por reducción preferencial en la cantidad de otras secuencias de aminoácidos/nucleótidos o células presentes, o por un incremento preferencial en la cantidad de la secuencia específica de aminoácidos/nucleótidos o célula de interés, o por una combinación de los dos. Sin embargo, debería observarse que enriquecido no implica que no están presentes otras secuencias de aminoácidos, secuencias de nucleótidos o células. El término solamente define que la cantidad relativa de la secuencia de interés se ha incrementado significativamente. El término significante se utiliza aquí para indicar que el nivel de incremento es útil para la persona que alcanza tal un incremento, y generalmente significa un incremento con relación a otra secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de aproximadamente al menos 2-vez, por ejemplo al menos aproximadamente 5- a 10-veces o incluso más. El término se entiende como cubrir solamente aquellas situaciones en las cuales ha intervenido el hombre para incrementar la proporción de la secuencia de aminoácidos deseada, secuencia de nucleótidos o célula.
El término "esencialmente consiste de" se entiende para permitir la presencia de componentes adicionales en una muestra o una composición que no afecta las propiedades de la muestra o una composición. Como un ejemplo ilustrativo, una composición farmacéutica puede incluir excipientes si consiste esencialmente de un ingrediente activo.
Los términos "expresando" y "expresión" en referencia a un biomarcador se proponen para entenderse en el significado ordinario como se utiliza en la materia. Un biomarcador se expresa por una célula a través de la transcripción de un ácido nucleico en ARNm, seguido por traducción en un polipéptido, que se dobla y posiblemente además se procesa. Los biomarcadores tratados en esta descripción además se transportan a la superficie de la célula respectiva. Por lo tanto, la declaración de que una célula está expresando tal un bio arcador indica que el biomarcador se encuentra en la superficie de la célula e implica que el biomarcador se encuentra sintetizado por la maquinaria de expresión de la célula respectiva. De acuerdo con lo anterior, el término "nivel de expresión" en el contexto de una población celular tales como células T se refiere al número o porcentaje de células que tienen el biomarcador de interés en su superficie celular. La determinación de expresión puede basarse en el nivel de expresión normalizado de los biomarcadores. Los niveles de expresión se normalizan al corregir el nivel de expresión absoluto de un biomarcador al comparar su expresión con la expresión de un gen que no es un biomarcador en el contexto de la invención. El nivel de expresión también puede proporcionarse como un nivel de expresión relativo.
Con respecto al proceso biológico respectivo por sí mismo, los términos "expresión", "expresión genética" o "expresando" se refieren a la totalidad de trayectorias reguladoras que convierten la información codificada en la secuencia de ácidos nucleicos de un gen primero en ARN mensajero (ARNm) y después en una proteína. De acuerdo con lo anterior, la expresión de un gen incluye su transcripción en un ARNhn primario, el procesamiento de este ARNhn en un ARN maduro y la traducción de la secuencia de ARNm en la secuencia de aminoácidos correspondiente de la proteína. En este contexto, también se observa que el término "producto genético" se refiere no solamente a una proteína, incluyendo e.g. una proteína final (incluyendo una variante de unión de la misma) codificada por ese gen y una proteína precursora respectiva donde sea aplicable, sino que también al ARNm respectivo, que puede considerarse como el "primer producto genético" durante el curso de expresión genética.
Por "fragmento" en referencia a un polipéptido tal como una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea se entiende cualquier secuencia de aminoácidos presente en un polipéptido correspondiente, siempre que sea más corto que la secuencia de longitud completa y tan largo que sea capaz de realizar la función de interés de la proteína - en el caso de una inmunoglobulina específicamente uniéndose al objetivo deseado, antígeno (CD62L, LFA-1 o PSGL-1, por ejemplo). El término "fragmento de inmunoglobulina" se refiere a una porción de una inmunoglobulina, con frecuencia la región hipervariable y porciones de las cadenas pesadas y ligeras alrededor que despliega afinidad de unión específica para una molécula particular. Una región hipervariable es una porción de una inmunoglobulina que se une físicamente al polipéptido objetivo.
Los términos "inmunizar", "inmunización", o "inmunizando" se refieren a exponer el sistema inmune de un animal a un antígeno o a un epítopo del mismo como se ilustra en más detalle abajo. El antígeno puede introducirse en el animal utilizando una vía administración deseada, tal como inyección, inhalación o ingestión. En una segunda exposición al mismo antígeno, la respuesta inmune adaptativa, en particular respuestas de célula T y célula B, se mejora.
El término "aislado" indica que la célula o células, o el(los) péptido(s) o molécula(s) de ácido nucleico se ha(n) removido de su ambiente fisiológico normal, e.g. una fuente natural, o que se sintetiza un péptido o ácido nucleico. El uso del término "aislado" indica que una secuencia que ocurre de manera natural se ha removido de su ambiente celular normal (es decir, cromosomal). De esta manera, la secuencia puede estar en una solución libre de célula o colocarse en un ambiente celular diferente. Una célula aislada o células aisladas pueden, por ejemplo, incluirse en un medio diferente tal como una solución acuosa que se proporciona originalmente, o colocarse en un ambiente fisiológico diferente. Típicamente las células, péptidos o molécula(s) de ácido nucleico aisladas constituyen una fracción más alta de las células totales, péptidos o molécula(s) de ácido nucleico presentes en su ambiente, e.g. solución/suspensión según sea aplicable, que en el ambiente del cual se toman. Por "aislado" en referencia a un polipéptido o molécula de ácido nucleico se entiende un polímero de aminoácidos (2 o más aminoácidos) o nucleótidos acoplados entre sí, incluyendo un polipéptido o molécula de ácido nucleico que se aísla de una fuente natural o que se sintetiza. El término "aislado" no implica que la secuencia es la única cadena de aminoácidos o cadena de nucleótidos presente, sino que está esencialmente libre, e.g. aproximadamente 90 - 95% pura o más, de e.g. material no aminoácido y/o material no ácido nucleico, respectivamente, asociado naturalmente a ella.
El aislamiento de una población de células deseada puede incluir en algunas modalidades téenicas de enriquecimiento celular generales tales como centrifugación, filtración o cromatografía celular. Generalmente, el aislamiento o enriquecimiento de una población de células deseada puede llevarse a cabo de acuerdo a cualquier técnica deseada conocida en la materia. En algunas modalidades el aislamiento de una población de células deseada puede incluir el uso de un kit de aislamiento comercialmente disponible. Las células T, por ejemplo, pueden obtenerse de sangre periférica, de sangre, fluido cerebroespinal, o fracciones enriquecidas de las mismas. Las células T, por ejemplo, pueden obtenerse de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) tales como PBMCs de humano. En algunas modalidades PBMC, por ejemplo, puede enriquecerse utilizando una téenica estándar en base a una densidad celular y/o tamaño celular. Como un ejemplo ilustrativo, PBMC puede enriquecerse o aislarse a través de una centrifugación de gradiente de densidad, por ejemplo utilizando sucrosa, dextran, Ficoll® o Percoll®. Las células T pueden entonces enriquecerse o purificarse de las PBMCs obtenidas, por ejemplo utilizando un kit de aislamiento de célula T comercialmente disponible tal como el kit Dynabeads® Untouched™ Human CD4 T Cells disponible de Invitrogen o el Kit StemSep® Human CD4+ T Cell Enrichment de STEMCELL Technologies Inc.
El término "molécula de ácido nucleico" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier ácido nucleico en cualquier configuración posible, tal como de un solo filamento, de doble filamento o una combinación de los mismos. Ejemplos de ácidos nucleicos incluyen por ejemplo moléculas de ADN, moléculas de ARN, análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótido o utilizando química de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico (LNA) bloqueadas, moléculas de ácidos nucleicos de proteína (PNA), moléculas de ácido nucleico de alquilfosfotriéster y alquilfosfonato y tecto-moléculas de ARN (e.g. Liu, B., et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076-4077). LNA tiene una estructura de ARN modificada con un puente de metileno entre C4' y 02', proporcionando la molécula respectiva con una estabilidad dúplex más alta y resistencia a nucleasa. Las moléculas de ácido nucleico de alquilfosfotriéster y alquilfosfonato pueden observarse como una molécula de ADN o ARN, en la cual los grupos fosfatos de la estructura de ácido nucleico se neutralizan al intercambiar los grupos P-OH de los grupos fosfato en la estructura de ácido nucleico por un alquilo y por un grupo alcoxi, respectivamente. ADN o ARN puede ser de origen sintético o genómico y puede ser de un solo filamento o doble filamento. Tal ácido nucleico puede ser e.g. ARNm, ARNc, ARN sintético, ADN genómico, ADN sintético de ADNc, un copolímero de ADN y ARN, oligonucleótidos, etc. Un ácido nucleico respectivo puede contener además análogos de nucleótido no naturales y/o enlazarse a una etiqueta de afinidad o una marca.
Se conocen muchos análogos de nucleótido y pueden utilizarse en ácidos nucleicos utilizados en los métodos de la invención. Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene una modificación en, por ejemplo, las porciones base, azúcar, o fosfato. Como un ejemplo ilustrativo, se conoce una sustitución de residuos 2'-OH de ARNsi con residuos 2'F, 2'0-Me o 2? para mejorar la estabilidad in vivo del ARN respectivo. Las modificaciones en la porción base pueden ser una modificación natural o una sintética de A, C, G, y T/U, una base de pirimidina o purina diferente, tal como uracil-5-ilo, hipoxantin-9-ilo, y 2-aminoadenin-9- ilo, así como una base de nucleótido no pirimidina o no purina. Otros análogos de nucleótido sirven como bases universales. Ejemplos de bases universales incluyen 3-nitropirrolo y 5-nitroindol. Las bases universales son capaces de formar un par base con cualquier otra base. Las modificaciones base con frecuencia pueden combinarse, por ejemplo, una modificación de azúcar, tal como ejemplo 2'-O-metoxietilo, e.g. para lograr propiedades únicas tal como estabilidad dúplex incrementada.
El término "ocurrencia de PML" como se utiliza en esta descripción incluye una condición que tiene una o más características indicativas de la presencia de PML. Como se explica arriba, la característica típica de PML es la desmielinización en cerebro. La característica de PML generalmente utilizada en la materia para propósitos de diagnóstico es la presencia de ADN de JCV en fluido cerebroespinal o un espécimen de biopsia cerebral (cf. véase también abajo). Las características adicionales pueden valorarse, e.g. pueden realizarse pruebas de campo visual, examen oftalmológico y/o formación de imágenes de resonancia magnética craneal.
Como se utiliza en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos activos, materiales, composiciones, portadores, y/o formas de dosificación que son adecuados, dentro del alcance de juicio razonable médico, adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otros problemas o complicaciones, que se conmensuran con una proporción razonable de beneficio/riesgo.
"Plasma" como se utiliza en esta descripción se refiere a fluido acelular encontrado en la sangre. "Plasma" puede obtenerse de sangre al remover material celular completo de sangre por métodos conocidos en la materia tal como centrifugación o filtración.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácido y no se limitan a cierta longitud mínima del producto. Donde ambos términos se utilizan concurrentemente, este nombramiento de dos veces explica el uso de ambos términos lado a lado en la materia.
El término "predecir el riesgo" como se utiliza en la descripción se refiere a valorar la probabilidad de que un sujeto padecerá de PML en el futuro. Como se entenderá por aquellos expertos en la materia, tal una valoración usualmente no se propone que sea correcta para 100% de los sujetos a investigarse. El término, sin embargo, requiere que pueda hacerse una predicción para una porción estadística significativa de sujetos en una manera apropiada y correcta. Si una porción es estadísticamente significativa puede determinarse por aquellos expertos en la materia utilizando varias herramientas de evaluación estadísticas bien conocidas, e.g., determinación de intervalos de confidencia, determinación de p-valor, prueba t de Student, y prueba Mann-Whitncy. Los intervalos de confidencia adecuados generalmente son al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%. Los p-valores adecuados generalmente son 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, o 0.0001. En una modalidad de los métodos descritos, la probabilidad contemplada por la presente descripción permite que la predicción de un riesgo incrementado, normal, o disminuido será correcta para al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% de los sujetos de un grupo dado o población. Las predicciones de riesgo en un método descrito se refiere a predecir si existen o no un riesgo incrementado para PML en comparación con el riesgo promedio para desarrollar PML en una población de sujetos en lugar de dar una probabilidad precisa para el riesgo.
En este sentido el término "pronóstico", común y bien entendido en la práctica médica y clínica, se refiere a un pronóstico, una predicción, una declaración avanzada, o predecir la probabilidad de ocurrencia de un estado de enfermedad o condición en un sujeto no teniendo (aún) la condición o estado de enfermedad respectiva. En el contexto de la presente invención pronóstico se refiere al pronóstico o predicción de la probabilidad en cuanto a si un sujeto padecerá o no PML.
El término "prevenir" en el contexto médico/fisiológico, es decir, en el contexto de un estado fisiológico, se refiere a disminuir la probabilidad de que un organismo contraiga o desarrolle una condición anormal.
El término "purificado" se entiende que es una indicación relativa en comparación con el ambiente original de la célula, representando así una indicación de que la célula es relativamente más pura que en el ambiente natural. Por lo tanto incluye, pero no solamente se refiere a, un valor absoluto en el sentido de pureza absoluta de otras células (tal como una población celular homogénea). En comparación con el nivel natural, el nivel después de purificar la célula generalmente será al menos 2-5 veces mayor (e.g., en términos de células/ml). La purificación de al menos un orden de magnitud, tal como aproximadamente dos o tres órdenes, incluyendo por ejemplo aproximadamente cuatro o cinco órdenes de magnitud se contempla expresamente. Puede desearse obtener la célula al menos esencialmente libre de contaminación, en particular libre de otras células, a un nivel funcionalmente significativo, por ejemplo aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o 99% puro. Con respecto a un ácido nucleico, péptido o una proteína, lo anterior aplica mutatis mutandis . En este caso la purificación del ácido nucleico, péptido o proteína por ejemplo generalmente será al menos 2-5 veces mayor (e.g., en términos de mg/ml).
Cuando se utiliza en el contexto de expresión de un biomarcador, e.g. PSGL-1 o CD62L, en células y la cantidad o nivel de un biomarcador que puede detectarse, "recuperación" se define como un incremento en la cantidad/nivel después de una disminución. Una recuperación de expresión puede ser un regreso del nivel del biomarcador a un nivel que se ha observado previamente para un sujeto dado, o a un nivel más alto. Generalmente una recuperación es un regreso del porcentaje de células que expresa el biomarcador de regreso al rango de un nivel de referencia o más alto. Una recuperación se determina al comparar una cantidad determinada o nivel a un valor umbral, el cual puede basarse en un nivel de referencia (cf. véase abajo).
Diagnóstico, determinación, valoración o predicción del "riesgo de ocurrencia" de PML se entiende que se refieren a un análisis de un grado relativo de un riesgo cuando se compara con un individuo saludable. El término "riesgo de ocurrencia" se refiere a la probabilidad o posibilidad de que PML ocurrirá en un sujeto. Sin limitarse por teoría, se considera que PML es una reactivación de infección latente (cf. véase arriba) con JCV. Mientras una susceptibilidad general para ocurrencia de PML se relaciona con la presencia de JCV en un organismo del sujeto, la mera presencia de JCV en un organismo no indica si existen o habrá una infección de oligodendrocitos con JCV, lo que conduce a desmielinización (supra). Por lo tanto, generalmente puede ser solamente un riesgo elevado de ocurrencia de PML si JCV está presente en un organismo, sin embargo, el nivel de riesgo actual necesita determinarse sobre la base del nivel de PSGL-1, CD62L y/o LFA-1. En el contexto de diagnóstico y valoración del riesgo, la determinación/predicción del riesgo de ocurrencia de PML es una valoración relativa si un sujeto particular está en un riesgo más alto o no en un riesgo más alto de padecer PML en un punto de tiempo en el futuro, cuando se compara con un sujeto saludable o con un sujeto promedio que está en una condición fisiológica de otra manera comparable.
La palabra "reco binante" se utiliza en este documento para describir una molécula de ácido nucleico que, en virtud de su origen, manipulación, o ambas no se asocia con toda o una porción de la molécula de ácido nucleico con la cual se asocia en naturaleza. Generalmente una molécula recombinante de ácido nucleico incluye una secuencia que no ocurre de manera natural en la célula u organismo de tipo silvestre respectivo. Típicamente una molécula recombinante de ácido nucleico se obtiene por ingeniería genética, usualmente construida fuera de una célula. Generalmente una molécula recombinante de ácido nucleico es sustancialmente idéntica y/o sustancial complementaria a al menos una porción de la molécula de ácido nucleico correspondiente que ocurre en naturaleza. Una molécula recombinante de ácido nucleico puede ser de cualquier origen, tal como de origen genómico, ADNc, mamífero, bacterial, viral, semisintético o sintético. El término "recombinante" como se utiliza con respecto a una proteína/polipéptido significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante.
El término "reducir el riesgo", como se utiliza en este documento, significa disminuir la probabilidad o posibilidad de un estado de enfermedad o condición, e.g., PML, de ocurrir en un sujeto, especialmente cuando el sujeto se encuentra predispuesto a tal o en riesgo de contraer un estado de enfermedad o condición, e.g., PML.
Los términos "seleccionar sujetos", "seleccionar individuos" o "seleccionar pacientes" en el contexto de valoración del riesgo se refiere a un método o proceso para determinar si un sujeto/paciente o una pluralidad de sujetos/pacientes probablemente está por padecer o no una enfermedad o trastorno tal como PML, o tiene o no tiene un riesgo incrementado de desarrollar una enfermedad o trastorno. "Seleccionar compuestos" y "seleccionar ensayo" significa un proceso o método utilizado para caracterizar o seleccionar compuestos a base de su actividad de una colección de compuestos.
"Suero" como se utiliza en esta descripción, se refiere a componentes de sangre que no definen una célula, tal como un leucocito, y que no definen un factor coagulante. Suero incluye la fracción de plasma obtenida después de que se deja coagular plasma o sangre y la fracción coagulada se remueve.
El término "específico" como se utiliza en este documento se entiende que indica que un ligando se dirige contra, une a, o reacciona con un biomarcador descrito en la presente solicitud, tal como PSGL-1, LFA-1, CD4, CD8, CD62L y CD3. De esta manera, dirigiéndose a, uniéndose a o reaccionando con incluye que el ligando específicamente se une CD62L, LFA-1, PSGL-1, CD4 , CD8 o CD3, según sea aplicable. El término "específicamente" en este contexto significa que el ligando reacciona con CD62L, LFA-1, PSGL-1, CD4, CD8 o CD3, según sea aplicable, o/y una porción del mismo, pero al menos esencialmente no con otra proteína. El término "otra proteína" incluye cualquier proteína, incluyendo proteínas cercanamente relacionadas con o siendo homologas a e.g. CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3 contra las cuales se dirige el ligando. El término "no se une esencialmente" significa que el ligando no tiene afinidad particular con otra proteína, es decir, muestra una reactividad cruzada menor a aproximadamente 30%, cuando se compara con la afinidad a CD62L, LFA-1, PSGL-1 o CD3 . En algunas modalidades el ligando muestra una reactividad cruzada menor a aproximadamente 20%, tal como menor a aproximadamente 10%. En algunas modalidades el ligando muestra una reactividad cruzada menor a aproximadamente 9, 8, o 7%, cuando se compara con la afinidad a CD62L, LFA-1, PSGL-1 o CD3. En algunas modalidades el ligando muestra una reactividad cruzada menor a aproximadamente 6%, tal como menor a aproximadamente 5%, cuando se compara con la afinidad a CD62L, LFA-1, PSGL-1 o CD3. Si el ligando específicamente reacciona como se define en la presente arriba puede probarse fácilmente, Ínter alia, al comparar la reacción de un ligando respectivo con CD62L, con LFA-1, PSGL-1 o con CD3, según sea aplicable, y la reacción del ligando con (una) otra(s) proteína(s). El término "específicamente reconociendo", que puede utilizarse de manera intercambiable con los términos "dirigido a" o "reaccionando con" significa en el contexto de la presente descripción que una molécula particular, generalmente una inmunoglobulina, un fragmento de inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina es capaz de interactuar específicamente con y/o unirse a al menos dos, incluyendo al menos tres, tal como al menos cuatro o incluso más aminoácidos de un epítopo como se define en la presente. Generalmente la inmunoglobulina o molécula de unión proteinácea puede formar así un compuesto con el epítopo respectivo de e.g. CD62L, LFA-1, PSGL-1 o CD3. Tal unión puede ejemplificarse por la especificidad de un "principio de seguro-y-llave". "Unión específica" también puede determinarse, por ejemplo, de acuerdo con una prueba inmunotransferencia Western, ELISA, RIA, ECL, IRMA, FACS, IHC y una exploración de péptido.
Los términos "estratificar" y "estratificación" como se utiliza en la presente indican en un aspecto que los individuos se asignan a grupos con características similares tal como a un nivel de riesgo similar de desarrollar PML. Como un ejemplo ilustrativo, los individuos pueden estratificarse en categorías de riesgo. Los términos "estratificar" y "estratificación" como se utilizan en la presente indican en otro aspecto que un individuo se asigna a un cierto grupo de acuerdo a las características que coinciden con el grupo respectivo tal como un nivel de riesgo correspondiente de desarrollar PML. Los grupos pueden ser, por ejemplo, para probar, prescribir, suspender, o abandonar cualquiera o más de un fármaco, cirugía, dieta, ejercicio, o intervención. De acuerdo con lo anterior, en algunas modalidades de un método o uso de acuerdo a la invención un sujeto puede estratificarse en un subgrupo de una prueba clínica de una terapia. Como se explica a continuación, en el contexto de la presente invención CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 pueden utilizarse para estratificación de riesgo de PML.
Los términos "estratificar" y "estratificación" de acuerdo a la invención generalmente incluyen identificar sujetos que requieren una alteración de su terapia actual o futura. El término incluye valoración, e.g. determinación, de que terapia necesita un sujeto que probablemente padece PML. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención la estratificación puede basarse en la probabilidad (o riesgo) de desarrollar PML. Un método o uso de acuerdo a la invención también puede servir en estratificar la probabilidad del riesgo de PML o el riesgo de cualquier condición relacionada con PML para un sujeto. Un método para estratificar a un sujeto para terapia de PML de acuerdo a la invención comprende detectar la cantidad de determinación del nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 como se describe arriba, y/o valoración de la capacidad migratoria de células inmunes CD45+CD49d+ del sujeto. Como se explica arriba, en algunas modalidades en una base general un ligando CD62L, uno PSGL-1 y/o uno LFA-1 puede utilizarse ventajosamente para seleccionar a los pacientes en riesgo que están en un riesgo más alto o tienen una predisposición más alta a desarrollar PML.
El término "sujeto" como se utiliza en la presente, también dirigido como un individuo, se refiere a un humano o animal no humano, generalmente un mamífero. Un sujeto puede ser una especie mamífera tal como un conejo, un ratón, una rata, un conejillo de Indias, un hámster, un perro, un gato, un puerco, una vaca, una cabra, una oveja, un caballo, un mono, un chimpancé o un humano. De esta manera, los métodos, usos y composiciones descritas en este documento son aplicables tanto a enfermedad de humano y veterinaria. Como se explica en más detalle abajo, la muestra se ha obtenido del sujeto. De esta manera se entiende que las conclusiones sacadas de los niveles de expresión en la muestra y decisiones en base a las mismas conciernen al sujeto de quien se han tomado. Además, aunque un sujeto típicamente es un organismo vivo, la invención descrita en este documento también puede utilizarse en el análisis post-mortem. Donde el sujeto es un ser humano vivo que está recibiendo cuidado médico para una enfermedad o condición, también se dirige como un "paciente".
El término "susceptibilidad" como se utiliza en este documento se refiere a la tendencia de un sujeto al desarrollo de un cierto estado o una cierta condición tal como una condición patológica, incluyendo una enfermedad o trastorno, en particular PML, o a ser menos capaz de resistir un estado particular que el individuo promedio. La susceptibilidad a PML es en particular dependiente de la presencia de JCV en un organismo.
Los términos "tratamiento" y "tratar" como se utiliza en la presente, se refieren a una medición profiláctica o preventiva que tienen un efecto terapéutico y prevenir, disminuir (menguar), o al menos aliviar o abolir parcialmente una condición anormal, incluyendo patológica, en el organismo de un sujeto. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en quienes está por prevenir el trastorno (profilaxis). Generalmente un tratamiento reduce, estabiliza, o inhibe la progresión de un síntoma que se asocia con la presencia y/o progresión de una enfermedad o condición patológica. El término "administrar" se refiere a un método para incorporar un compuesto en células o tejidos de un sujeto. El término "efecto terapéutico" se refiere a la inhibición o activación de factores causando o contribuyendo a la condición anormal. Un efecto terapéutico alivia a algún grado uno o más de los síntomas de una condición anormal o enfermedad. El término "condición anormal" se refiere a una función en las células o tejidos de un organismo que se desvía de sus funciones normales en ese organismo. Una condición anormal puede relacionarse Ínter alia con proliferación celular, diferenciación celular, o sobrevivencia celular.
Como se utiliza en la presente, el término "viable" se refiere a una célula que mantiene homeostasis por el uso de uno o más mecanismos consumidores de energía. De esta manera una célula "viable" por ejemplo incluye una célula en la cual ocurre metabolismo oxidativo productivo para producir la energía necesaria; una célula en la cual solamente glicolisis se utiliza para producir energía, así como una célula que mantiene integridad celular, tal como la habilidad para excluir, o remover activamente, ciertas moléculas del interior de la célula, por mecanismos consumidores de energía. En algunas modalidades, una célula viable es capaz de someterse a mitosis, crecimiento celular, diferenciación, y/o proliferación. La expresión "célula viable" puede tomarse por ser sinónimo con una "célula viva", que incluye una célula que es quiescente (y de esta manera no va a través del ciclo celular), pero sin embargo se alivia debido a que ocurre el consumo y producción de energía en tal una célula para mantener homeostasis.
El término "agente bloqueador de VLA-4" se refiere a una molécula que se une al antígeno VLA-4 en la superficie de un leucocito con suficiente especificidad para inhibir la interacción VLA-4/VCAM-1. En algunas modalidades el agente bloqueador se une a integrina VLA-4 con un KD menor a 10-6 M. Un agente bloqueador de VLA-4 puede ser un anticuerpo de unión VLA-4 tal como una inmunoglobulina anti-VLA-4 o un fragmento de una inmunoglobulina anti-VLA-4 (cf. véase abajo para detalles). Un agente bloqueador de VLA-4 generalmente inhibe la migración de leucocitos de la sangre al sistema nervioso central al interrumpir la adhesión entre la célula T y células endoteliales. Se cree que esto da como resultado la reducción de citocinas proinflamatorias, y de esta manera la reducción de la ocurrencia de enfermedad inflamatoria patológica dentro del CNS. Ejemplos de un agente bloqueador de VLA-4 incluyen, pero no se limitan a, Natalizumab (Biogen, Pat. de E.U. No. 5,840,299), inmunoglobulinas monoclonales HP2/1, HPl/3 (Elices et al, Cell (1990) 60, 577-584), HP1/2 (Sanchez-Madrid et al, Eur. J. Immunol (1986) 16, 1343-1349), HPl/2 humanizada (Pat. de E.U. No.6,602,503), HPl/7, HP2/4, B-5G10, TS2/16 (Pulido et al, J Biol. Chem. (1991) 266, 16, 10241-5), inmunoglobulina monoclonal L25 (Becton Dickinson GmBH, Alemania), P4C2 (Abcam, Cambridge, UK), y AJM300 (Ajinomoto, Japón), y anti-VLA4 inmunoglobulinas recombinantes como se describe en Pat. de E.U. No.6,602,503 y Pat. de E.U. No. 7,829,092. En una modalidad, el agente bloqueador de VLA-4 es específico para CD49d (a4-integrina). Como un ejemplo adicional, un agente bloqueador de VLA-4 también puede ser un antagonista VLA-4 que difiere de un anticuerpo tal como una inmunoglobulina. Ejemplo ilustrativo de tal un antagonista son los compuestos de bajo peso molecular SB-683699 (GlaxoSmithKline, Middlesex, UK), que es un antagonista a4 dual, un CS-1 peptidomimético (Pats. de E.U. Nos. 5,821,231, 5,869,448, 5,869,448; 5,936,065; 6,265,572; 6,288,267; 6,365,619; 6,423,728; 6,426,348; 6,458,844; 6,479,666; 6,482,849; 6,596,752; 6,667,331; 6,668,527; 6,685,617; 6,903,128; y 7,015,216), un derivado de fenilalanina (Pats. de E.U. Nos. 6,197,794; 6,229,011; 6,329,372; 6,388,084; 6,348,463; 6,362,204; 6,380,387; 6,445,550; 6,806,365; 6,835,738; 6,855,706; 6,872,719; 6,878,718; 6,911,451; 6,916,933; 7,105,520; 7,153,963; 7,160,874; 7,193,108; 7,250,516; y 7,291,645) proteína alfa-feto (Pub. de Pat. de E.U. No. 2010/0150915), un compuesto beta-aminoácido (Pub. de Pat. de E.U. Nos. 2004/0229859 y 2006/0211630), un compuesto semi-péptido (Pat. de E.U. No. 6,376,538), tripéptido Leu-Asp-Val (Pat. de E.U. No. 6,552,216), o una molécula pegilada como se describe en la solicitud de patente de E.U.2007/066533 y Pat. de E.U. No. 6,235,711.
Un "agente bloqueador de cc4-integrina" se refiere a una molécula que se une a la a4-subunidad de integrinas con una especificidad y una afinidad y/o tasa kapagada que es suficiente para inhibir la interacción con un ligando fisiológico tal como MAdCAM-l, VCAM-1 o CS-1 de la integrina respectiva. En algunas modalidades el agente bloqueador se une a una integrina que tiene una a4-subunidad con una afinidad constante de al menos aproximadamente 10-5 M. En algunas modalidades la constante de afinidad tiene un valor de al menos aproximadamente 10e M. La afinidad de unión en algunas modalidades puede ser de un KD de aproximadamente 0.1 nM o abajo. En algunas modalidades KD puede estar por debajo de 10 picomolar (pM). Un agente bloqueador de a4-integrina en algunas modalidades puede unirse a integrina VLA-4. En algunas modalidades el agente bloqueador de a4-integrina se une a integrina LPAM-1. En algunas modalidades el agente bloqueador de a4-integrina se une tanto a integrina VLA-4 como LPAM-1. Un agente bloqueador de a4-integrina puede ser un anticuerpo de unión a4-integrina tal como una inmunoglobulina anti-a4-integrina o un fragmento de una inmunoglobulina anti-a4-integrina (cf. véase abajo para detalles). Ejemplos de un agente bloqueador de a4-integrina incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas monoclonales Natalizumab (Biogen, Pat. de E.U. No.5,840,299), Vedolizumab (Millennium Phar aceuticals, Cambridge, E.U.), HPl/2, HP2/1, HP1/3 (Elices et al, Cell (1990) 60, 577-584), HPl/2 (Sánchez-Madrid et al, Eur. J. Immunol (1986) 16, 1343-1349), HPl/2 humanizada (Pat. de E.U. No.6,602,503), HP1/7, HP2/4, B-5G10, Max68P (Becton Dickinson GmBH, Alemania), L25 (Becton Dickinson GmBH, Alemania), P4C2 (Abcam, Cambridge, UK), Rl-2 (BD Biosciences) y AJM300 (Ajinomoto, Japón).
Los términos "comprendiendo", "incluyendo," "conteniendo", "teniendo" etc. deben leerse de manera expansiva y ser abiertos y sin limitación. Las formas singulares tales como "un", "una" o "el(la)" incluyen referencias plurales al menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. De esta manera, por ejemplo, referencia a un "vector" incluye un vector único así como una pluralidad de vectores, ya sea el mismo - e.g. el mismo operón - o diferente. Del mismo modo la referencia a "célula" incluye una célula única así como una pluralidad de células. Al menos que se indique de otra manera, el término "al menos" precediendo una serie de elementos debe entenderse como refiriéndose a cada elemento en las series. Los términos "al menos uno" y "al menos uno de" incluyen por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, o cinco o más elementos. Se entiende además que ligeras variaciones arriba y debajo de un rango establecido pueden utilizarse para lograr substancialmente los mismos resultados como un valor dentro del rango. También, al menos que se indique de otra manera, la descripción de los rangos se propone como un rango continuo incluyendo cada valor entre los valores, mínimo y máximo.
El alcance y significado de cualquier uso de un término serán aparentes del contexto específico en el cual se utiliza el término. Ciertas definiciones adicionales para términos seleccionados utilizados por todo este documento se dan en el contexto apropiado de la descripción detallada, según sea aplicable. Al menos que se defina de otra manera, otros términos científicos y téenicos utilizados en la descripción, figuras y reivindicaciones tienen su significado ordinario como se entienden comúnmente por un experto en la materia.
Valoración del riesgo de PML y la Muestra Utilizada La presente invención se basa al menos en parte en el descubrimiento sorprendente que los niveles de CD62L y niveles de PSGL-1 en células T pueden utilizarse como un indicador para la evaluación de riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto, por ejemplo un sujeto que tiene un organismo que está en una condición asociada con inmunosupresión. Sobre la base de niveles de CD62L y/o niveles de PSGL-1, opcionalmente junto con pruebas o indicadores adicionales explicados en esta especificación, puede valorarse si un sujeto es más probable que padezca PML, por ejemplo cuando se compara con un sujeto saludable o cuando se compara con el promedio estadístico de sujetos que están en un estado de salud comparable. Los niveles de PSGL-1 y CD62L en células T pueden ayudar a un médico en la determinación de un régimen terapéutico apropiado. En algunas modalidades el sujeto es un sujeto infectado con V1H y/o un sujeto que se somete a HAART. Un nivel de CD62L en células T puede utilizarse para identificar una probabilidad de que un sujeto V1H positivo tal como un sujeto que padece SIDA desarrollará PML, así como para predicción si un sujeto que se somete a HAART desarrollará PML. El determinar niveles de CD62L y/o de PSGL-1 en células T mejora la valoración de complicaciones por VIH potenciales y facilitar el hacer una decisión con respecto al curso adicional de terapia de VIH y/o HAART.
En parte la presente invención también se basa en el descubrimiento de que la unión de VLA-4 tiene influencia en la expresión de las moléculas de superficie celular CD62L, PSGL-1 y LFA-1 y funciones de célula inmune básicas tal como capacidad migratoria. Sin limitarse por ninguna teoría particular, los presentes inventores han descubierto que algunas moléculas de superficie celular, incluyendo CD62L, PSGL-1 y LFA-1, se expresan diferencialmente en células T en sujetos quienes/que desarrollan o han desarrollado PML. Además, los presentes inventores han encontrado que CD62L ya se expresa diferencialmente en células T en sujetos quienes/que aproximadamente están por desarrollar PML. El uso de tales moléculas como biomarcadores, opcionalmente junto con biomarcadores o pruebas adicionales, proporciona una indicación en cuanto a que sujetos es más probable que padezcan PML. Los biomarcadores proporcionados en la presente invención pueden ayudar a los médicos para determinar un régimen terapéutico apropiado. Sin limitarse por ninguna teoría particular, los descubrimientos de los inventores pueden ayudar a entender una observación previa por Wipfler et al. (Múltiple Sclerosis (2011) 17, 1, 16-23), quien reportó una disminución en la expresión de CD49d no bloqueada (a4-integrina) en células mononucleares en la sangre de pacientes bajo tratamiento con la inmunoglobulina que inhibe a4b1 y a4b7 integrina Natalizumab.
De acuerdo con lo anterior, los biomarcadores proporcionados en la presente invención pueden utilizarse ventajosamente para diagnosticar la competencia inmune de un sujeto, tal como un sujeto quien/que está en un estado de inmunodeficiencia, por ejemplo una terapia para prevenir el rechazo de injerto o una terapia con un agente bloqueador de a4-integrina. Un sujeto respectivo puede inmunocomprometerse debido a una infección tal como una infección con V1H. Un sujeto respectivo puede inmunocomprometerse debido a recibir una terapia inmunosupresora, incluyendo terapia para enfermedad de injerto contra huésped o terapia después de haber recibido un trasplante de órgano. Una terapia inmunosupresora también puede ser una terapia para una enfermedad autoinmune tal como esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus tipo I o una miopatía inflamatoria idiopática tal como dermatomiositis, polimiositis y miositis corporal por inclusión esporádica. Los biomarcadores descritos en este documento también pueden utilizarse para diagnosticar la competencia inmune de un sujeto que recibe o espera recibir agente bloqueador de a4-integrina a largo plazo, agente bloqueador de VLA-4 y/o un tratamiento con un agente bloqueador de LPAM-1 o de un sujeto quien/que es V1H positivo. Los biomarcadores descritos en este documento también pueden utilizarse para diagnosticar el riesgo del sujeto de padecer PML. Diagnóstico o detección de riesgo aumentado de ocurrencia de PML puede ayudar a modificar una terapia actual de un sujeto o iniciar una terapia para reducir el riesgo de ocurrencia de PML. En algunas modalidades los biomarcadores anteriores pueden utilizarse en paneles que incluyen más de un biomarcador, para estratificación de riesgo, para diagnóstico de PML existente, para monitorear un nivel de riesgo, incluyendo un incremento de riesgo potencial, de PML, y para predicción de un resultado medico futuro, tal como terapia inmunosupresora mejorada o empeorada y/o de terapia de V1H, con respecto a la ocurrencia de una enfermedad inducida por JCV en un sujeto. Aunque la infección de V1H permanece como el factor de predisposición más común para PML, PML por ejemplo también puede ocurrir como una complicación de una condición, en particular una enfermedad crónica, asociada con inmunosupresión secundaria tal como Lupus Eritematoso (supra). Como se indica en la introducción, también se ha encontrado que PML se asocia con el uso del anticuerpo anti-CD20 monoclonal Rituximab, utilizado en el tratamiento de linfomas. Después de las fechas de prioridad de la presente solicitud también se ha reportado un caso donde PML ocurrió después de la combinación de tratamiento con Rituximab y el agente de alquilación Bendamustine, donde se sospechó una asociación con Bendamustine (Warsch, S, et al., Int J Hematol. (2012) 96, 2, 274-278). Como un ejemplo adicional, PML también se ha reportado como una complicación de polimiositis. Debe entenderse que un método de la invención puede aplicarse a cualquier condición, donde sea aplicable con un ajuste de la medicación de un tratamiento al cual se expone el sujeto.
PML es una enfermedad desmielinizante del cerebro anteriormente rara, pero severa, subaguda, rápidamente progresiva, que se caracterizó primero en 1958. PML ha alcanzado a la fecha proporciones epidémicas, mayormente debido al hecho de que V1H/SIDA ha resultado en un incremento remarcable en la frecuencia de PML. En algunos locales, se ha encontrado que la infección de V1H considera más de 90% de los trastornos predispuestos asociados con PML. Como se indica arriba, PML se causa por una infección lítica de células de oligodendroglia con JCV en el cerebro. JCV infecta a niños, y seropositividad en adultos se reporta que es entre 50% y 60%, con prevalencia más alta en hombres que en mujeres (Soelberg Sarensen, P., et al., Múltiple Sclerosis Journal (2012) 18, 2, 143-152). Debería observarse que la seropositividad parece aumentar con la edad. Del mismo modo, la seropositividad parece aumentar con la duración de exposición a Natalizumab (Outteryck, O., et al., J Neurol (2012) DOI 10.1007/s00415-012-6487-5). JCV se aisló primero en 1971 de tejido cerebral de un paciente con linfoma de Hodgkin quien desarrolló PML. El virus tiene un genoma de ADN de doble filamento superenrollado. El modo de transmisión de JCV hasta ahora no se ha definido bien, aunque se sospecha de transmisión respiratoria.
La infección de JCV de células se inicia por la unión de la proteína 1 viral (VP1) de JCV al tetrasacárido c de lactoseries de oligosacárido (LSTc) en células huésped (Neu, U., et al., Cell Host & Microbe (2010) 8, 309-319). El virón JCV no desarrollado se toma entonces en las células a través de endocitosis mediada por el receptor dependiente de clatrin. La forma supuestamente transmisible de JCV comúnmente se ha referido como el arquetipo JCV, ya que se ha asumido que todos los otros genotipos se originan de él. Estas suposiciones, sin embargo, hasta ahora no se soportan por evidencia sólida, es decir, no se establece si la forma transmisible de JCV es en realidad la forma arquetipo del virus. No se sabe además si las superfinfecciones con JCV pueden ocurrir después de la infección inicial en la infancia (White, M.K., & Khalili, K., J. Infect. Disease
[2011] 203, 5, 578-586). Se considera que PML se causa por reactivación de JCV, que puede permanecer latente en una variedad de tejidos tales como los riñones, las amígdalas, linfocitos B, y órganos linfoide así como el sistema nervioso central. Fragmentos de AND de JCV se han encontrado en oligodendrocitos y astrocitos en cerebro sin PML. La forma arquetipo de JCV parece encontrarse exclusivamente en los riñones de individuos sin PML. Las variantes del tipo PML de JCV patológicas, que siempre tienen, en relación al arquetipo JCV, una región reguladora alterada, se forman en el huésped a través de un mecanismos desconocido. En comparación con el arquetipo JCV, se ha encontrado que las variantes de tipo PML de JCV patológicas contienen en > 80% de los casos una sustitución de aminoácido en la proteína cápside principal, VPl, típicamente en uno de los bucles exteriores. Además, se han reportado las eliminaciones, duplicaciones y mutaciones de punto en la región reguladora sin codificar y/o la región de codificación JCV causa la infección y muerte de los oligodendrocitos que producen mielina en la material blanca. También infecta los astrocitos en una manera no productiva; una infección abortiva puede conducir a astrocitos gigantes multinucleados. PML típicamente da como resultado déficits neurológicos focales tales como afasia, hemiparesia y ceguera cortical. Actualmente se diagnostica al analizar fluido cerebroespinal o un espécimen de biopsia cerebral para la presencia de ADN de JCV.
Se ha encontrado que ambos incidentes PML durante V1H/SIDA y el riesgo de muerte atribuible a PML disminuyen bajo HAART como se describe por Khanna et al. (Clinical Infectious Diseases
[2009] 48, 1459-1466). Este documento se incorpora en la presente para referencia en su totalidad para todos los propósitos. En case de conflicto, se controlará la presente especificación, incluyendo definiciones. En Individuos infectados con V1H, la estrategia supuestamente más efectiva para combatir PML es optimizar HAART para suprimir completamente la carga viral de VIG y permitir la mejor recuperación inmune de la célula T CD4+. Ya que la terapia antirretroviral no tienen ningún efecto en la réplica de JCV in vitro, se considera que el efecto in vivo se debe solamente a restauración inmune (Hernández et al., 2009, supra). En este sentido los niveles más altos de conteos de célula CD4+ se han asociado con una sobrevivencia mejorada en varias observaciones clínicas. Sin embargo, en el contexto de ocurrencia de PML, las respuestas de célula T específicas a JCV en lugar del conteo de célula CD4+ total parecen ser el factor crítico para sobrevivencia de PML (Khanna et al., 2009, supra). Se ha identificado que una vía de la entrada de célula de JCV incluye el receptor 5-HT2a, de manera que puede asumirse que los antagonistas HT2a pueden ser adecuados para obtener tiempo antes de que se logre la reconstitución inmune (Focosi, D, et al., The Neuroscientist
[2010] 16, 3, 308-323). Los antagonistas HT2a, sin embargo, pueden no sacar el virus del huésped. Además, se ha reportado un caso donde la mefloquina análoga de quinina, disponible bajo la marca comercial Lariam® de Roche para la prevención y terapia de P. falciparum, es decir, malaria, se utilizó para tratar un paciente con V1H bajo terapia antirretroviral, quien ha desarrollado PML (resumen de Adachi, E., et al., Int J STD & AIDS (2012) 23, 8, 603). Con terapia antirretroviral continúa se reportó que el estado neurológico del paciente se ha mejorado sustancialmente. Se ha mostrado que mefloquina inhibe la infección por virus JC in vitro (Brickelmaier, M, et al., Antimicrob Agents Che other (2009) 53, 1840-1849).
También se ha reportado un caso donde mefloquina podría utilizarse para tratar PML en un paciente con MS remitente-recurrente durante y después del intercambio de plasma (Schróder, A., et al.. Archives of Neurology (2010) 67, 11, 1391-1394).
En el contexto de tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o un agente bloqueador de VLA-4, tal como tratamiento con Natalizumab, los factores de riesgo conocidos para desarrollo de PML incluyen la duración de exposición al agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4, antes de la terapia inmunosupresora y la presencia de anticuerpos anti-JCV (Soelberg Sorensen et al., 2012, supra). Los riesgos elevados asociados con uso previo de inmunosupresores, la duración de exposición al agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 y presencia de anticuerpos anti-JCV parecen ser independientes entre sí. La incidencia total de PML se reporta que es aproximadamente dos en 1000 pacientes tratados con Natalizumab (ibid.). PML anterior asociada con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 se diagnostica y trata, lo mejor es el resultado clínico.
Un método de la invención es un método para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico del riesgo de desarrollo de una condición asociada con JCV en un sujeto. Las condiciones asociadas a JCV y síntomas de PML generalmente incluyen defectos de desempeño motriz y/ cognitivo. Síntomas/condiciones que pueden ocurrir son, por ejemplo, debilidad, hemiparesia, hemiplejía, es decir, parálisis parcial, ataxia, estado mental alterado, perturbaciones del campo visual incluyendo pérdida de visión, habla deteriorada incluyendo afasia, deterioro cognitivo, así como el así llamado síndrome de mano de extraña.
Un método relacionado de la invención es un método para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico del riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto. El sujeto en algunas modalidades está infectado con V1H. Este método para valorar el riesgo de ocurrencia de PML también puede tomarse como un método para diagnosticar la probabilidad de que el sujeto desarrollará PML o para diagnosticar la predisposición del sujeto para desarrollar PML. Debe entenderse que un diagnóstico/valoración respectiva incluye una valuación, la cual, puede resultar a su vez puede posteriormente ser menor a 100% precisa para un individuo dado. Tal valoración en algunas modalidades está por tomarse como una indicación del equilibrio de probabilidades en lugar de como un predicamento sólido.
Un método respectivo de acuerdo a la presente invención generalmente incluye análisis de una muestra del sujeto in vitro. Típicamente la muestra es, esencialmente consiste de, o incluye fluido corporal del sujeto. La muestra en algunas modalidades puede ser una muestra sanguínea completa del sujeto. En algunas modalidades la muestra es una muestra de hematocito. Tal una muestra contiene células de la sangre, sin embargo sin el suero, que, por ejemplo, pudo haberse removido por centrifugación. La muestra es en algunas modalidades una muestra de linfa, tomada del sujeto en un punto previo de tiempo, incluyendo tomada inmediatamente antes de usar en un método de acuerdo a la invención. En algunas modalidades la muestra es una muestra de fluido cerebroespinal. En algunas modalidades el método puede incluir proporcionar una muestra del sujeto. La muestra pudo haberse tomado en cualquier punto deseado en el tiempo antes de realizar el método de la invención. Generalmente se selecciona el intervalo de tiempo entre tomar la muestra y llevar a cabo el método de la invención para permitir el análisis de células viables. Está dentro de la experiencia del experto determinar un intervalo respectivo de tiempo durante el cual puede esperarse que las células T en una muestra permanezcan viables. Como una orientación general, los inventores han encontrado que en la forma de sangre EDTA, es decir, despues de agregar una cantidad final de aproximadamente 1 - 2 mg/ml EDTA (típicamente EDTA de potasio), las células permanecen viables y adecuadas para llevar a cabo un método de acuerdo a la invención durante un intervalo de tiempo de hasta 48 horas durante el cual la muestra se mantiene en forma fluida a temperatura ambiente, es decir, aproximadamente 18°C. Células, por ejemplo, pueden mantenerse a una temperatura en el rango de aproximadamente 2°C a aproximadamente 37°C, tal como de aproximadamente 4°C a aproximadamente 37°C o abajo. En algunas modalidades la muestra se mantiene a aproximadamente 32°C o abajo. En algunas modalidades la muestra se mantiene a una temperatura de aproximadamente 25°C o abajo. Como un ejemplo ilustrativo, una muestra de sangre entera puede mantenerse a aproximadamente 25°C o abajo. Como un ejemplo adicional una muestra de fluido cerebroespinal puede mantenerse a aproximadamente 25°C o abajo. Como todavía un ejemplo adicional una muestra de linfa puede mantenerse a aproximadamente 25°C o abajo. En algunas modalidades la muestra se mantiene a una temperatura de aproximadamente 22°C o abajo, tal como aproximadamente 18°C o abajo. En algunas modalidades la muestra se mantiene a aproximadamente 15°C o abajo, tal como abajo 10°C. En algunas modalidades la muestra se mantiene a aproximadamente 4°C o a aproximadamente 8°C. Como un ejemplo ilustrativo, una muestra de sangre entera puede mantenerse a aproximadamente 8°C o abajo. Como un ejemplo adicional una muestra de fluido cerebroespinal puede mantenerse a aproximadamente 8°C o abajo. Como se explica abajo, la expresión de biomarcador en células T en la muestra puede compararse con expresión en una muestra de referencia. Tal una muestra de referencia en algunas modalidades puede ser o mantenerse a condiciones comparables o las mismas por aproximadamente el mismo periodo de tiempo como la muestra del paciente. La muestra de referencia en algunas modalidades puede almacenarse para esencialmente el mismo periodo de tiempo como la muestra del paciente. En algunas modalidades la muestra de referencia puede almacenarse a al menos esencialmente la misma temperatura como la muestra del paciente. La muestra de referencia pudo haberse obtenido en al menos esencialmente la misma manera como la muestra del paciente. La muestra de referencia pudo haberse procesado en al menos esencialmente la misma manera como la muestra del paciente.
En algunas modalidades la muestra se ha tomado en el mismo día o el previo, tal como aproximadamente 48 horas o aproximadamente 42 horas, antes de que el método de la invención se lleve a cabo. Como un ejemplo ilustrativo, la muestra puede ser una muestra de hematocito tomada aproximadamente 48 horas antes de uso en un método de la invención. La muestra también puede ser una muestra de sangre entera tomada aproximadamente 48 horas antes, es decir, antes de realizar un método de la invención. La muestra además puede ser una muestra de fluido cerebroespinal tomada aproximadamente 48 horas antes. En algunas modalidades la muestra se ha tomado aproximadamente 36 horas antes de realizar un método de la invención. En algunas modalidades la muestra se ha tomado aproximadamente 30 horas antes de realizar un método de la invención. En algunas modalidades la muestra se ha tomado aproximadamente 28 horas o aproximadamente 24 horas antes de que el método de la invención se lleve a cabo. La muestra, por ejemplo, puede ser una muestra de linfa, tomada aproximadamente 24 horas antes. En algunas modalidades la muestra puede ser una muestra de sangre entera tomada del sujeto aproximadamente 24 horas antes de realizar un método de la invención. En algunas modalidades la muestra es una muestra de fluido cerebroespinal tomada aproximadamente 24 horas antes de uso en un método de acuerdo a la invención. En algunas modalidades la muestra se ha tomado aproximadamente 18 horas antes. En algunas modalidades la muestra se ha tomado aproximadamente 15 horas antes de que el método de la invención se lleve a cabo. La muestra también pudo haberse tomado aproximadamente 12 horas antes. Como un ejemplo ilustrativo, la muestra puede ser una muestra de sangre entera tomada del sujeto aproximadamente 12 horas antes de realizar un método de la invención. En algunas modalidades la muestra es una muestra de linfa, tomada aproximadamente 12 horas antes de uso en un método de acuerdo a la invención. En algunas modalidades la muestra es una muestra de fluido cerebroespinal tomada del sujeto aproximadamente 12 horas antes de realizar un método de la invención. La muestra también puede ser una muestra de hematocito tomada aproximadamente 12 horas antes. En algunas modalidades la muestra se ha tomado aproximadamente 10 horas antes. En algunas modalidades la muestra se ha tomado aproximadamente 8 horas, aproximadamente 6 horas o menos antes de que el método de la invención se lleve a cabo. En algunas modalidades la muestra se ha tomado dentro de un periodo de hasta aproximadamente 48 horas, es decir, 0 a aproximadamente 48 horas. La muestra, por ejemplo, pudo haberse tomado dentro de aproximadamente 48 horas y se ha almacenado a aproximadamente 25°C o abajo. En algunas modalidades la muestra se ha tomado dentro de un periodo de hasta aproximadamente 42 horas. Como un ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre entera tomada del sujeto dentro de un periodo de hasta aproximadamente 42 horas antes de realizar un método de la invención. En algunas modalidades la muestra es una muestra de linfa, tomada dentro de un periodo de hasta aproximadamente 42 horas antes de emplear un método de acuerdo a la invención. La muestra en algunas modalidades pudo haberse tomado dentro de un periodo de hasta aproximadamente a aproximadamente 36 horas. Como un ejemplo ilustrativo, la muestra pudo haberse tomado dentro de aproximadamente 36 horas y se ha almacenado a aproximadamente 37°C o abajo. En algunas modalidades la muestra se ha tomado dentro de un periodo de hasta aproximadamente 30 horas antes de realizar un método de la invención. Como un ejemplo, la muestra, por ejemplo, puede ser una muestra de linfa, tomada dentro de hasta aproximadamente 30 horas antes. En algunas modalidades la muestra puede ser una muestra de sangre entera tomada del sujeto dentro de hasta aproximadamente 30 horas antes de realizar un método de la invención. En algunas modalidades la muestra es una muestra de fluido cerebroespinal tomada dentro de un periodo de hasta aproximadamente 30 horas antes de uso en un método de acuerdo a la invención. La muestra en algunas modalidades se ha tomado dentro de un periodo de hasta aproximadamente 28 horas, hasta aproximadamente 24 horas, a aproximadamente 18 horas, a aproximadamente 15 horas o 0 a aproximadamente 12 horas antes de que se realice un método de la invención. Como se indica arriba, el sujeto, también dirigido como un paciente o un individuo en este documento, del cual/quien se ha obtenido la muestra, es un animal, incluyendo un humano.
En algunas modalidades la muestra del individuo es una muestra congelada. Generalmente la muestra se congela dentro de uno de los intervalos de tiempo arriba detallados, e.g. 0 a aproximadamente 48 o 0 a aproximadamente 42 horas, y/o en los puntos de tiempo arriba ejemplificados, tal como aproximadamente 48 horas, aproximadamente 36 horas o menos, después de que se ha obtenido la muestra del individuo. Una muestra congelada puede formarse al congelar una muestra obtenida después de agregar un agente crioprotector tal como DMSO, glicerol y/o almidón de hidroxietilo. En algunas modalidades, por ejemplo donde la muestra es una muestra de hematocito, el suero puede agregarse además a. Como un ejemplo ilustrativo DMSO puede utilizarse en una concentración final en el rango de aproximadamente 2% a aproximadamente 10%, tal como aproximadamente 2%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5% o aproximadamente 10% DMSO. Típicamente la muestra se congela entonces a una tasa controlada a una temperatura menor a -50°C, después la muestra, por ejemplo, puede almacenarse, incluyendo almacenamiento a largo plazo, a una temperatura debajo de -130°C tal como -160°C, e.g. en nitrógeno líquido por periodos de tiempo extendidos.
En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención una muestra como se proporciona del individuo se libra de eritrocitos, en algunas modalidades al menos esencialmente se libra eritrocitos, si se requiere. La eliminación o retiro de eritrocitos, por ejemplo, puede requerirse en el caso donde la muestra es una muestra de sangre entera o una muestra de hematocito. Lisis de eritrocitos puede llevarse a cabo osmóticamente o químicamente. La lisis osmótica es adecuada en el contexto de la presente invención ya que los eritrocitos se lisan a una osmolaridad a la cual los leucocitos permanecen intactos. En la téenica típicamente una solución de cloruro de amonio se utiliza para lisis osmótica, que puede incluir además bicarbonato de potasio y/o EDTA. Puede utilizarse un reactivo comercialmente disponible, tal como la solución de lisis FCM por Santa Cruz (orden no sc-3621), Regulador de Lisis de Glóbulo Rojo Eritrolisis por AbD Serotec o Solución de Lisis RBC por 5 PRIME. La lisis química de eritrocitos, por ejemplo, puede lograrse utilizando un solvente orgánico tal como dietiléter o cloroformo, y/o un agente tensoactivo, una solución que contiene cobre o a través de agregar una de ciertas toxinas bacterianas o animales. Después de lisis de eritrocitos pueden recolectarse los glóbulos rojos restantes, por ejemplo por medio de centrifugación.
En un método de acuerdo a la invención se detecta el nivel de células T en la muestra que tienen la(s) proteína(s) L-selectina, PSGL-1 y/o LFA-1 en su superficie. Las células T se conocen por el experto como linfocitos, es decir, glóbulos rojos nucleados que también se llaman glóbulos blancos. Las células T maduran en el tipo y pueden distinguirse de otros linfocitos en que tienen el receptor de célula T en su superficie celular. El papel conocido principal de la célula T es reconocimiento de antígenos unidos a moléculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). El receptor de célula T (TCR) es un heterodímero, que en aproximadamente 95% de células T consiste de una a-cadena 34 kD, unida por un enlace de disulfuro a una a-cadena 34 kD. Ambas cadenas abarcan la membrana de plasma y tienen, de acuerdo con lo anterior, una porción extracelular, cada una de las cuales incluye una región variable, denominada Va y nb, respectivamente. Aproximadamente 5% de células T tiene un receptor de célula T que consiste de una g- y una d-cadena en lugar de una a- y una b-cadena, las cuales probablemente tienen regiones variables extracelulares. El receptor de célula Ts puede, como inmunoglobulinas, reconocer un número más grande de diferentes epítopos.
En algunas modalidades la presencia del receptor de célula T en la superficie de una célula puede utilizarse para identificar la célula como una T célula. Ya que el receptor de célula T tiene regiones variables puede, sin embargo, ser ventajoso utilizar otra proteína de superficie celular para identificar una célula T. Un ejemplo de proteína adecuada en este sentido es un co-receptor de célula T. Dos ejemplos ilustrativos de un co-receptor del receptor de célula T son el compuesto de protexna CD3 (Grupo de Diferenciación 3) y la proteína CD247. CD3 tiene cuatro cadenas, que están en los mamífero una cadena D3y, una cadena CD35, y dos cadenas CD3E. Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como el receptor de célula T y al menos una cadena zeta CD3 de glicoproteína de superficie en célula T también conocida como la cadena zeta T3 de receptor de célula T o CD247 (Grupo de Diferenciación 247). CD247 puede estar presente sobre la superficie celular como ya sea un compuesto x2 o un compuesto x/h. El compuesto de TCR, CD247 y CD puede generar una señal de activación en T linfocitos. TCR, x-s3?e^ (3), y molécula CD3 juntos definen el compuesto TCR. En la práctica de un método de acuerdo a la invención el identificar la presencia de CD3 en una célula particular o pluralidad de células con frecuencia es una manera conveniente de identificar células T. Por lo tanto los términos "célula T CD3+" y "célula T" generalmente pueden utilizarse de manera intercambiable para dirigirse a una célula T y para distinguir una célula T de otros tipos de célula.
Un ejemplo adicional de un co-receptor del receptor de célula T, presente en algunas pero no en todas las células T, es la proteína de transmembrana CD8 (Grupo de Diferenciación 8). La mayoría de las células T que tienen CD8 en su superficie son células T citotóxicas. CD8 juega un papel importante en la unión al compuesto de histocompatibilidad principal clase I. Se conocen dos isoformas de la proteína, especialmente CD8-alfa y -beta. Cada cadena contiene un campo que se parece a un dominio variable de inmunoglobulina. CD8 es un dímero de dos de estas cadenas, ya sea un homo- o un heterodímero.
Las células T CD4+ tienen, generalmente además de CD3, la proteína CD4 (Grupo de Diferenciación 4) en su superficie, una glicoproteína que consiste de cuatro dominios de inmunoglobulina extracelulares, denominados Di a D4, y una región citoplásmica pequeña. La proteína CD4 se conoce por utilizarse por V1H-1 para obtener entrada en células T de un huésped. Las células T CD4+ pueden clasificarse en una variedad de poblaciones celulares con diferentes funciones y de esta manera no deben tomarse para definir un conjunto unitario de células. Los ejemplos típicos de una célula T CD4 son una célula T auxiliar, una célula T reguladora y una célula T de memoria.
En algunas modalidades un método de acuerdo a la invención incluye identificar células T CD3+ en la muestra, por ejemplo al emplear una inmunoglobulina, un fragmento de inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina como se explica abajo. En algunas de estas modalidades identificar células T CD3+ en la muestra sirve para distinguir células T CD3+ de otras células tales como células CD3~ o células no T. En algunas modalidades las células T CD4+ se identifican en la muestra. La identificación de las células T CD4+ típicamente sirve para distinguir células T CD4+ de otras células tales como células T CD4 o células no T. En algunas modalidades las células T CD8+ se identifican en la muestra. La identificación de células T CD8+ típicamente sirve para distinguir células T CD8+ de otras células tales como células T CD8 o células no T. Debe entenderse que las células T CD4+ y células T CD8+ son típicamente también células T CD3+ de manera que una célula T CD3+ identificada también puede ser una célula T CD4+ en lugar de distinguirse de una célula T CD4+. De acuerdo con lo anterior, en algunas modalidades en una primer etapa una célula T puede identificarse como una célula T CD3+. En una segunda etapa puede determinarse si la célula T CD3+ es una célula T CD4+. También puede determinarse si la célula T CD3+ es una célula T CD8+. Como se explica arriba, en algunas modalidades las células T se identifican por la presencia de CD3. De las células T de esta manera identificadas, las células T CD4+ se distinguen de células T CD8+.
En algunas modalidades un método de acuerdo a la invención incluye enriquecer y/o aislar células T CD3+ de la muestra. En algunas modalidades un método de acuerdo a la invención incluye enriquecer y/o aislar células T CD4+ y/o células T CD8+ de la muestra. En algunas modalidades las células T se enriquecen, incluyendo clasifican, en base a la presencia de CD3 sobre la superficie celular. De las células T de esta manera enriquecidas, aquellas células T que tienen CD4 en su superficie, es decir, células T CD4+, pueden enriquecer más. En algunas modalidades, de las células T se han enriquecido en base a la presencia de CD3, aquellas células T que tienen CD8 en su superficie, es decir, células T CD8+, pueden enriquecerse más. Como un ejemplo ilustrativo, la muestra puede ser de un individuo V1H positivo. Las células T CD3+ pueden enriquecerse en una primer etapa, de la cual las células T CD4+ pueden enriquecerse en una segunda etapa, obteniendo así células T CD3+CD4+ enriquecidas. Las células T CD3+CD4+ del Individuo V1H positivo pueden entonces utilizarse en un método de acuerdo a la invención. Además, las células T CD8+ pueden enriquecerse en una segunda etapa, obteniendo así células T CD3+CD8+ enriquecidas del individuo VIH positivo. Las células T CD8 positivas o células T CD4 positivas del individuo VIH positivo, por ejemplo, pueden utilizarse para analizar la expresión de PSGL-1 en las mismas. Del mismo modo, las células T CD4 positivas del individuo VIH positivo, por ejemplo, pueden utilizarse para analizar la expresión de CD62L en las mismas. Como un ejemplo ilustrativo adicional, donde el individuo VIH positivo es de un estadio antes del estadio C3 (e.g. en el estadio Al, A2, A3, Bl, B2, B3, C1 o C2), las células T CD8 positivas del individuo V1H positivo, por ejemplo, pueden utilizarse para analizar la expresión de CD62L en las mismas. Como un ejemplo ilustrativo adicional, la muestra puede ser de un individuo que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de VLA-4 y/o un agente bloqueador de LPAM-1. Las células T CD3+ pueden enriquecerse en una primer etapa, de las cuales las células T CD4+ pueden enriquecerse en una segunda etapa, obteniendo así células T CD3+CD4+ enriquecidas. Del mismo modo, las células T CD8+ pueden enriquecerse en una segunda etapa, obteniendo así células T CD3+CD8+enriquecidas. Tantlo las células T CD3+CD4+ como las células T CD3+CD8+ del individuo V1H positivo pueden entonces utilizarse en un método de acuerdo a la invención.
En algunas modalidades enriquecer y/o aislar células T CD3+, células T CD4+ y/o células T CD8+ de la muestra incluye clasificación y/o selección de célula, por ejemplo a través de inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo. En algunas modalidades enriquecer y/o aislar tales células consiste de clasificación o selección de célula. Tal una téenica puede basarse en contactar las células con una pluralidad de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Como un ejemplo ilustrativo, para enriquecer las células CD4+ por selección negativa, una pluralidad de anticuerpos puede incluir anticuerpos dirigidos a CD14, CD20, CDllb, CD16, HLA-DR, y CD8, mientras para enriquecer células CD8+por selección negativa, una pluralidad de anticuerpos puede incluir anticuerpos dirigidos a CD14, CD20, CDllb, CD16, y HLA-DR.
En algunas modalidades puede desearse enriquecer o seleccionar positivamente células T que expresan CD3+. En algunas modalidades las células indeseadas se eliminan al contactarlas con partículas/perlas en las cuales los ligandos tales como anticuerpos se inmovilizan, que se unen a proteínas encontradas en las células indeseadas, pero no en células deseadas. En algunas modalidades las células deseadas se recolectan de la muestra al contactarlas con perlas en las cuales los ligandos tales como anticuerpos se inmovilizan, que se unen a proteínas encontradas en las células deseadas, pero no en células indeseadas.
Para aislamiento de una población de células deseada por selección positiva o negativa, puede variarse la cantidad y concentración de células y superficie de partícula/perla. En ciertas modalidades puede desearse reducir el volumen en el cual perlas y células se contactan, por ejemplo para asegurar contacto máximo de células y perlas. Por ejemplo, en una modalidad, se utiliza una concentración de aproximadamente 2 billones células/ml. En una modalidad, se utiliza una concentración de aproximadamente 1 billones células/ml. En una modalidad adicional, se utiliza una concentración de más de aproximadamente 100 millones células/ml. En algunas modalidades se utiliza una concentración de células de aproximadamente 10 millones células/ml o más. En algunas modalidades las células están a una concentración de aproximadamente 15, incluyendo aproximadamente 20, aproximadamente 25 o aproximadamente 30 millones células/ml. En algunas modalidades se utiliza una concentración de células de aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50 millones células/ml o más. En algunas modalidades se utiliza una concentración de células de aproximadamente 75 millones células/ml. En algunas modalidades las células están a una concentración de aproximadamente 80 millones células/ml. En algunas modalidades las células están a una concentración de aproximadamente 85 millones células/ml. La concentración de células, por ejemplo, puede ser aproximadamente 90, incluyendo aproximadamente 95, aproximadamente 100, o aproximadamente 125 millones células/ml o más. En algunas modalidades se utiliza una concentración de células de aproximadamente 150 millones células/ml o más. El uso de altas concentraciones de célula pueden resultar, en algunas modalidades, en producción aumentada de célula, activación celular, y expansión celular. En algunas modalidades el uso de altas concentraciones de célula puede permitir la captura más eficiente de células que pueden expresar e.g. CD62L o PSGL-1 en bajo número.
Donde se desea, la materia adicional puede agregarse a la muestra para análisis, por ejemplo disolverse o suspenderse en la muestra. Debe entenderse que cualquier dilución debida a tal adición de materia tiene que considerarse y puede necesitar considerarse cuando se calcula el nivel de células T que expresan L-selectina (CD62L). Del mismo modo, cualquier dilución debido a la adición de materia tiene que considerarse y puede necesitar considerarse cuando se calcula el nivel de células T que expresan PSGL-1. Como un ejemplo ilustrativo uno o más compuestos reguladores pueden agregarse a la muestra. Se utilizan numerosos compuestos reguladores en la materia y pueden utilizarse para realizar los diversos métodos descritos en la presente. Ejemplos de reguladores incluyen, pero no se limitan a, soluciones de sales de fosfato, carbonato, succinato, carbonato, citrato, acetato, formato, barbiturato, oxalato, lactato, eftalato, maleato, cacodilato, borato, N-(2-acetamido)-2-amino-etanosulfonato (también llamado (ACES), ácido N- (2-hidroxietil)-piperazina-N'-2-etanosulfónico (también llamado HEPES), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-propanosulfónico (también llamado HEPPS), piperazina-1,4-bis(ácido 2-etanosulfónico) (también llamado PIPES), ácido (2-[tris(hidroximetil)-metilamino]-1-etanosulfónico (también llamado TES), ácido 2-ciclohexil-amino-etanosulfónico (también llamado CHES) y N-(2-acetamido)-iminodiacetato (también llamado ADA). Puede utilizarse cualquier ion contador en estas sales; amonio, sodio, y potasio pueden servir como ejemplos ilustrativos. Ejemplos adicionales de reguladores incluyen, pero no se limitan a, trietanolamina, dietanolamina, etilamina, trietilamina, glicina, glicilglicina, histidina, tris (hidroximetil)aminometano (también llamado TRIS), bis-(2-hidroxietil)-imino-tris(hidroximetil)metano (también llamado BIS-TRIS), y N- [Tris(hidroximetil)-metil]-glicina (también llamada TRICINE), por nombrar unos pocos. Un regulador respectivo puede ser una solución acuosa de tal compuesto regulador o una solución en un solvente orgánico polar adecuado. Ejemplos adicionales de materia que puede agregarse a la muestra incluyen sales, detergentes o compuestos quelantes. Como aún un ejemplo ilustrativo adicional, puede necesitarse que los inhibidores de nucleasa se agreguen para mantener una molécula de ácido nucleico en un estado intacto.
Bi omarca dores En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención se detecta el nivel de células T que expresan L- selectina (CD62L), tales como células T CD3+, incluyendo células T CD4+ y/o células T CD8+, en la muestra. En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención se detecta el nivel de células T que expresan PSGL-1, tales como células T CD3+, en la muestra. En algunas modalidades se detecta el nivel de tanto células T que expresan CD62L como PSGL-1, e.g. células T que expresan CD62L y PSGL-1 CD3+, en la muestra.
La proteina L-selectina puede ser cualquier variante o isoforma respectiva de las especies respectivas, e.g. humano. La proteína, por ejemplo, puede ser la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P14151 (versión 145 a partir del 22 de Febrero de 2012) o la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q9UJ43 (versión 97 a partir del 22 de Febrero de 2012) . Esta proteína, por ejemplo, puede codificarse por el gen SELL de número de acceso de GenBank NG_016132 (versión NG_016132.1 a partir del 01 de Febrero de 2012; GI :270047500). La proteína, por ejemplo, puede codificarse por el ARNm de número de acceso de GenBank BC020758 (versión BC020758.1 a partir del 04 de Agosto de 2008; GI: 18088807). La proteína en algunas modalidades puede ser la proteína de ratón con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P18337 (versión 121 a partir del 11 de Julio de 2012), la proteína de ratón con el número de acceso de Swissprot/Uniprot B1B506 (versión 39 a partir del 03 de Octubre de 2012), o la proteína de ratón con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q3TCF3 (versión 53 a partir del 03 de Octubre de 2012). En algunas modalidades la proteína puede ser la proteína de rata con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P30836 (versión 94 a partir del 22 de Febrero de 2012) o la proteína de rata con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q63762 (versión 89 a partir del 22 de Febrero de 2012). La proteína también puede ser la proteína de bovino con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P98131 (versión 82 a partir del 22 de Febrero de 2012) o la proteína de bovino con el número de acceso de Swissprot/Uniprot F1N4U9 (versión 13 a partir del 03 de Octubre de 2012). En algunas modalidades la proteína puede ser la proteína de caballo con el número de acceso de Swissprot/Uniprot F7E0Z9 (versión 12 a partir del 03 de Octubre de 2012). La proteína también puede ser la proteína de mono Rhesus con el número de acceso de Swissprot/Uniprot F6VQ43 (versión 11 a partir del 03 de Octubre de 2012), la proteína de mono Rhesus con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q95198 (versión 85 a partir del 03 de Octubre de 2012) o la proteína de mono Rhesus con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H9YUD6 (versión 3 a partir del 03 de Octubre de 2012). La proteína también puede ser la proteína de chimpancé con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q95237 (versión 87 a partir del 03 de Octubre de 2012). En algunas modalidades la proteína puede ser la proteína del macaco cangrejero (Macaca fascicularis) con el número de acceso de Swissprot/Uniprot G8F369 (versión 5 a partir del 03 de Octubre de 2012). En algunas modalidades la proteína puede ser la proteína del orangután de Sumatra con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H2N4S6 (versión 7 a partir del 03 de Octubre de 2012) o la proteína del orangután de Sumatra con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H2N4S5 (versión 7 a partir del 03 de Octubre de 2012). En algunas modalidades la proteína puede ser la proteína del orangután de Borneo con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q95235 (versión 78 a partir del 03 de Octubre de 2012). La proteína también puede ser la proteína del gibón de mejillas blancas (Nomascus leucogenys) con el número de acceso de Swissprot/Uniprot G1RYC8 (versión 10 a partir del 03 de Octubre de 2012).
L-selectina media el linfocito dirigiéndose a vénulas endoteliales altas de tejido linfoide periférico y leucocito rolando en endotelio activo en sitios inflamatorios. La mayoría de los glóbulos rojos B periféricos, monocitos y granulocitos expresan CD62L/L-selectina. Sin embargo, algunas células asesinas naturales, linfocitos de bazo, linfocitos de médula ósea, células mieloide de médula ósea, timocitos, y ciertas células malignas hematopoyéticas también expresan CD62L. Su expresión se utiliza comúnmente para diferenciar entre células T de memoria efectoras y centrales.
En una modalidad de un método de acuerdo a la invención se detecta el nivel de células T que expresan LFA-1 en la muestra. LFA-1 es una molécula de adhesión de célula tipo integrina que se incluye predominantemente en extravasación y tráfico de leucocito. LFA-1 se une a CD54, la Molécula de Adhesión Intercelular 1, en células que presentan antígeno. LFA-l es un heterodímero que tiene una b-cadena, denominada CD18, y una a-cadena, denominada CDlla. Tanto la a-cadena como la b-cadena contienen un dominio tipo A factor von Willebrand (dominio VWFA) en su porción N-terminal, también llamada dominio insertado (I-dominio) que juega un papel central en regular la unión por ligando. También conocida como CDlla/CD18 o integrina aLp2, LFA-1 juega un papel crucial en muchos procesos inmunológicos y celulares (migración, presentación de antígeno, citotoxicidad, proliferación celular y hematopoyesis) al desplegar tanto propiedades de señalización como adhesivas. LFA-1 es el receptor de integrina primaria incluida en la detención de leucocito en endotelio inflamado.
La proteína CD18 (integrina beta-2) puede ser cualquier isoforma o variante respectiva de las especies respectivas, e.g. humano. En algunas modalidades CD18 es la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot número de acceso de Swissprot/Uniprot P05107 (versión 169 a partir del 11 de Julio de 2012), la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q6PJ75 (versión 60 a partir del 11 de Julio de 2012) o la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot B4E021 (versión 26 a partir del 16 de Mayo de 2012). La proteína también puede ser la proteína de cabra con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q5VI41 (versión 44 a partir del 11 de Julio de 2012), la proteína de porcino con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P53714 (versión 88 a partir del 11 de Julio de 2012), la proteína de bovino con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P32592 (versión 105 a partir del 11 de Julio de 2012), la proteína de chimpancé con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q5NKT5 (versión 56 a partir del 11 de Julio de 2012) o la proteína de mono Rhesus con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H9Z8N5 (versión 2 a partir del 11 de Julio de 2012). CD18 puede ser la proteína codificada por el gen ITGB2, por ejemplo el gen de ratón con ID de Gen No del GenBank 12575 a partir del 19 de Febrero de 2012 o el gen de humano con ID de Gen No del GenBank 3689 a partir del 19 de Febrero de 2012.
La proteína CD45 puede ser cualquier isoforma o variante respectiva de las especies respectivas, e.g. humano. La proteína, por ejemplo, puede ser la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P20701 (versión 137 a partir del 22 de Febrero de 2012) o la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q96HB1 (versión 76 a partir del 22 de Febrero de 2012). La proteína también puede ser la proteína de ratón con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P24063 (versión 108 a partir del 22 de Febrero de 2012) o la proteína de bovino con el número de acceso de Swissprot/Uniprot P61625 (versión 56 a partir del 22 de Febrero de 2012). CD45 puede ser la proteína codificada por el gen ITGAL, tal como el gen de humano con ID de Gen No del GenBank 3683 a partir del 05 de Febrero de 2012, el gen de bovino con ID de Gen No del GenBank 281874 a partir del 04 de Febrero de 2012 o el gen de ratón con ID de Gen No del GenBank 16408 a partir del 14 de Febrero de 2012.
En una modalidad de un método de acuerdo a la invención se detecta el nivel de células T que expresan PSGL-1 en la muestra. Ligando-1 de glicoproteína de P-selectina (PSGL-1), también denominado ELPLG, CLA, ligando de Selectina P o CD162 (Grupo de diferenciación 162), es un homodímero 240 kDa que consiste de dos cadenas de polipéptidol20 kD. PSGL-1 es una sialomucina muy glicosilada expresada constitutivamente en la mayoría de leucocitos. PSGL-1 puede unirse a las tres selectinas, P-, E- y L-selectina, y es un receptor de adhesión que media Ínter alia el anclaje de leucocito y activación de adhesión estable. PSGL-1 en monocitos circulantes, por ejemplo, puede interactuar con P- o E-selectina para anclar los monocitos al endotelio. PSGL-1 parece ser la molécula principal que media las interacciones de leucocito-endotelio y leucocito que rueda en endotelio estimulado. Se ha encontrado que la proteína es crítica en la transición de rodamiento lento a detención y para migración transendotelial eficiente. PSGL-1 también es un facilitador de célula T en reposo que yendo a los órganos linfoide. Además, se ha reportado que PSGL-1 transforma una señal intracelular que convierte LFA-1 en un estado parcialmente activado, en el cual LFA-1 es capaz de interactuar con ICA -1 (Lefort, C.T, and Lcy, K., Frontiers in Immunology (2012), 3, article 157).
La proteína PSGL-1 puede ser cualquier isoforma o variante respectiva de las especies respectivas, e.g. humano. La proteína, por ejemplo, puede ser la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q14242 (versión 110 a partir del 11 de Julio de 2012), la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot B4DHR9 (versión 15 como del 13 de Junio de 2012) o la proteína de humano con el número de acceso de Swissprot/Uniprot B7Z5C7 (versión 21 como del 13 de Junio de 2012). PSGL-1 también puede ser la proteína de ratón con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q62170 (versión 87 como del 11 de Julio de 2012), la proteína de ratón con el número de acceso de Swissprot/Uniprot Q99L34 (versión 49 como del 13 de Junio de 2012), la proteína de ratón con el número de acceso de Swissprot/üniprot Q3TA56 (versión 49 como del 11 de Julio de 2012), la proteína de perro con el número de acceso de Swissprot/üniprot F7J212 (versión 6 como del 13 de Junio de 2012), la proteína de rata con el número de acceso de Swissprot/üniprot Q8K5B0 (versión 45 como del 22 de Febrero de 2012), la proteína de rata topo lampiña con el número de acceso de Swissprot/üniprot G5AWZ5 (versión 3 como del 22 de Febrero de 2012) o la proteína de hámster con el número de acceso de Swissprot/üniprot G3HI97 (versión 2 como del 25 de Enero de 2012). En algunas modalidades la proteína puede ser la proteína de bovino con el número de acceso de Swissprot/üniprot F1MS77 (versión 7 como del 11 de Julio de 2012), la protelna de gorila con el número de acceso de Swissprot/üniprot G3R6X5 (versión 5 como del 11 de Julio de 2012), la proteína de gibón con el número de acceso de Swissprot/üniprot G1R504 (versión 5 como del 16 de Mayo de 2012), la proteína del g lago de orejas pequeñas (Otolemur garnettii) con el número de acceso de Swissprot/üniprot H0Y0C0 (versión 3 como del 16 de Mayo de 2012), o la proteína de la ardilla de tierra de trece franjas (Spermophilus tridecemlineatus) con el número de acceso de Swissprot/üniprot I3N665 (versión 1 como del 11 de Julio de 2012). PSGL-1 también puede ser la proteína PSGL-1 potencial del orangután de Sumatra con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H2NIJ3 (versión 2 como del 16 de Mayo de 2012), la proteína PSGL-1 potencial del chimpancé con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H2RCX5 (versión 2 como del 16 de Mayo de 2012). La proteína también puede ser la isoforma 1 de proteína de mono Rhesus con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H9EY51 (versión 2 como del 03 de Octubre de 2012), la isoforma 2 de proteína de mono Rhesus con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H9EY58 (versión 2 como del 03 de Octubre de 2012) o la isoforma 2 de proteína de mono Rhesus con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H9F2P7 (versión 2 como del 03 de Octubre de 2012). La proteína también puede ser la proteína PSGL-1 potencial del macaco cangrejero (Macaca fascicularis) con el número de acceso de Swissprot/Uniprot G7PI56 (versión 1 como del 25 de Enero de 2012) o la proteína PSGL-1 potencial de conejillo de Indias con el número de acceso de Swissprot/Uniprot H0UVZ8 (versión 4 como del 11 de Julio de 2012). Esta proteína, por ejemplo, puede codificarse por el gen SELPLG de humano con ID de Gen No del GenBank 6404 como del 25 de Febrero de 2012, el gen de ratón SELPLG con ID de Gen No del GenBank 20345 como del 25 de Febrero de 2012 o el gen de rata SELPLG con ID de Gen No del GenBank 363930 como del 11 de Noviembre de 2011.
Como se explica arriba, un método de acuerdo a la invención comprende determinar la cantidad o número de células T que expresan CD62L , que expresan PSGL-1 y/o que expresan LFA-1, e.g. células T CD3 positivas. El nivel de expresión, es decir, la cantidad presente, de una proteína, se determina por la tasa de síntesis y la tasa de degradación de la proteína. La tasa de síntesis de CD62L, por ejemplo, puede valorarse al determinar la tasa de síntesis de ARN mensajero (ARNm) codificado por el gen de selectina L ( SELL). La valoración de síntesis novo de una proteína dada sola, sin embargo, no da como resultado información acerca de la cantidad actual de la proteína presente en o en una célula, o en un organismo. Con el conocimiento los niveles de proteína y de la tasa de síntesis novo de una muestra de referencia, tal como una muestra de un sujeto saludable, el experto sin embargo generalmente puede realizar una predicción en términos de niveles relativos de proteína. Síntesis de ARNm CD62L se refiere a cualquier ARNm transcrito de un gen SELL (e.g. No. de acceso del GenBank NG_016132, versión NG_016132.1, GI: 70047500). Actualmente se conocen dos variantes de transcripción de SELL de humano, denominadas variante 1 (No. de acceso del GenBank NM_000655, versión NM_000655.4, GI:262206314) y variante 2 (No. de acceso del GenBank NR_029467, versión NR_029467.1; GI:262205323). La síntesis de ARNm CD18 se refiere a cualquier ARNm transcrito de un gen ITGB2. La síntesis de ARNm CD45 se refiere a cualquier ARNm transcrito de un gen ITGAL.
Del mismo modo, la tasa de síntesis de PSGL-1 en algunas modalidades puede valorarse al determinar la tasa de síntesis de ARNm codificado por el gen de ligando de selectina P ( SELPLG ) . La síntesis de ARNm SELPLG se refiere a cualquier ARNm transcrito de un gen SELPLG, tal como ARNm de humano. Actualmente se conocen dos variantes de transcripción de SELPLG de humano, denominadas variante 1 (No. de acceso del GenBank NM_001206609, versión NM_001206609.1, GI:331284237) y variante 2 (No. de acceso del GenBank NM_003006, versión NM_003006.4; GI:331284235). Ejemplos adicionales de ARNm PSGL-1, la síntesis del cual pueden determinarse, incluyen, pero no se limitan a, ARNm de ratón con la secuencia de No. de acceso del GenBank NM_009151 (versión NM_009151.3, GI:159110802), ARNm de bovino con la secuencia de No. de acceso del GenBank NM_001037628 (versión NM_001037628.1, GI:83035126), ARNm de porcino con la secuencia de No. de acceso del GenBank NM_001105307 (versión NM_001105307.1, GI:157427735), ARNm de perro con la secuencia de No. de acceso del GenBank NM_001242719 (versión NM_001242719.1, GI :337298526), ARNm de caballo con la secuencia de No. de acceso del GenBank NM_001105161 (versión NM_001105161.1, GI:157364981) o ARNm de chimpancé con la secuencia de No. de acceso del GenBank XM_001164136 (versión XM_001164136.2, GI:332840289.
La tasa de síntesis de LFA-1 en algunas modalidades puede detectarse al determinar la tasa de síntesis de ARNm codificado por el gen ITGAL y el gen ITGB2. La síntesis de ARNm ITGAL se refiere a cualquier ARNm transcrito de un gen ITGAL. Actualmente se conocen dos variantes de transcripción del gen alfa L integrina de humano, denominadas variante 1 (No. de acceso del GenBank NM_002209, versión NM_002209.2, GI:167466214) y variante 2 (No. de acceso del GenBank NM_001114380, versión NM_001114380.1; GI:167466216). ARNm de humano del gen ITGAL de humano tambien puede tener o incluir la secuencia de No. de acceso del GenBank BC008777 (versión BC008777.2, GI:33870544). Se conocen cuatro variantes de transcripción del gen de ratón ITGAL, denominadas variante 1 (No. de acceso del GenBank NM_001253872 , versión NM_001253872.1, GI:359751454), variante 2 (No. de acceso del GenBank NM_008400, versión NM_008400.3; GI:359751456), variante 3 (No. de acceso del GenBank NM_001253873, versión NM_001253873.1; GI:359751457) y variante 4 (No. de acceso del GenBank NM_001253874, versión NM_001253874.1; GI:359751459). Ejemplos adicionales ilustrativos de ARNm ITGAL del cual puede analizarse la tasa de síntesis, son ARNm de perro con la secuencia de No. de acceso del GenBank XM 547024 (versión XM_547024.2, GI:73958404), ARNm de jabalí con la secuencia de No. de acceso del GenBank EF585976 (versión EF585976.1, GI:156601155) y ARNm de rata con la secuencia de No. de acceso del GenBank BC101849 (versión BC101849.1, GI:74353690).
La síntesis de ARNm de ITGB2 se refiere a cualquier ARNm transcrito de un gen ITGB2. Actualmente se conocen dos variantes de transcripción del gen beta 2 de integrina de humano, denominadas variante 1 (No. de acceso del GenBank NM_000211, versión NM_000211.3, GI:188595673) y variante 2 (No. de acceso del GenBank NM_001127491, versión NM_001127491.1; GI:188595676). ARNm de humano del gen IT GAL de humano también puede tener o incluir la secuencia de No. de acceso del GenBank S75297 (versión S75297.1; Gl:242219).
Ejemplos adicionales de ARNm ITGB2, la síntesis del cual pueden determinarse, incluyen, pero no se limitan a, ARNm de ratón con la secuencia de No. de acceso del GenBank NM_008404 (versión N _008404.4, GI:145966904), ARNm de rata con la secuencia de No. de acceso del GenBank NM_001037780 (versión NM_001037780.2, GI:163937848), ARNm de perro con la secuencia de No. de acceso del GenBank XM_849290 (versión XM_849290.3, GI:359323519) y ARNm de pollo con la secuencia de No. de acceso del GenBank NM_205251 (versión NM_205251.1, GI:46048727).
Determinar el Nivel de un Biomarcador En el contexto de la presente invención los términos "detectar" o "detectando" típicamente se refieren a un método que puede utilizarse para determinar la cantidad de un ácido nucleico o una proteína, o una valoración de la cual tal una cantidad puede inferirse. Ejemplos de tales métodos incluyen, pero no se limitan a, RT-PCR, ensayo de protección RNAsa, análisis Northern, análisis Western, ELISA, radioinmunoensayo o ensayo de valoración de fluorescencia. La valoración de la cantidad de un biomarcador tal como PSGL-1 o CD62L en/sobre una célula puede incluir la valoración de la cantidad de un ácido nucleico, e.g. ARN, en una célula que codifica el biomarcador respectivo. Puede utilizarse una sonda de ácido nucleico para sondear una muestra por un método de hibridación común para detectar la cantidad de moléculas de ácido nucleico de e.g. la proteína PSGL-1 o CD62L. Para obtener sondas de ácido nucleico, puede llevarse a cabo la síntesis química. Las sondas de ácidos nucleicos sintetizadas pueden utilizarse primero como cebadores en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) llevada a cabo de acuerdo con téenicas PCR reconocidas, esencialmente de acuerdo a protocolos PCR estándar utilizando el templado apropiado, para obtener las sondas de la presente invención. Un experto en la materia fácilmente será capaz de designar tales sondas en base a la secuencia disponible para el biomarcador. Las sondas de hibridación pueden marcarse por técnicas de marcado estándar tales como una radiomarca, marca de enzima, marca fluorescente, marca de biotin-avidina, quimioluminiscencia o una nano-partícula. Después de hibridación, las sondas pueden visualizarse utilizando una técnica estándar. Como se explica arriba, la tasa de síntesis de una proteína no es igual a la expresión de la proteína, ya que la tasa de degradación de la proteína del mismo modo contribuye al nivel de expresión. Sin embargo, un cambio o una desviación en la tasa de síntesis generalmente puede tomarse como una indicación en un cambio o una desviación en el nivel de expresión de una proteína.
La tasa de síntesis de CD62L, PSGL-1, CD18 y/o CD45 también puede valorarse al determinar la tasa de síntesis de la proteína/polipéptido respectivo, incluyendo las modificaciones después de traducción de la producción de traducción inicial. CD62L, por ejemplo, se sintetiza en la forma de una pro-L-selectina después del retiro del péptido de señal N-terminal, que dirige la proteína a su ubicación de membrana celular. L-selectina se forma entonces después del retiro del polipéptido N-terminal. Además, ocurre una pluralidad de glicosilaciones N-enlazadas. Del mismo modo, CD162 se sintetiza, por ejemplo, en la forma de una pro-proteína después del retiro del péptido de señal N-terminal. El retiro del propéptido N-terminal produce la proteína madura PSGL-1. CD162 tiene oligosacáridos O-enlazados sialilados y fucosilados, de núcleo 2, complejos y contiene el glicano Sialil-Lewisx (sLex). Además, CD162 se modifica después de traducción por sulfación, que se requiere para unión de P- y L-selectina. Cualquiera de estas etapas de síntesis puede detectarse sola o en combinación, por ejemplo en base a la acumulación de productos de una modificación después de traducción. Debería observarse que las células T en reposo y activadas tienen diferentes perfiles de glicosilación y tienen, por ejemplo, diferentes glicoformas de PSGL-1 sobre la superficie celular.
Puede utilizarse cualquier método para detectar la presencia de un ácido nucleico o una proteína en el contexto de la presente invención. Tal un método puede incluir procedimientos estándar establecidos bien conocidos en la materia. Ejemplos de tales téenicas incluyen, pero no se limitan a, RT-PCR, ensayo de protección de RNAsa, análisis Northern, análisis Western, ELISA, radioinmunoensayo o ensayo de valoración de fluorescencia. La valoración de la cantidad de un biomarcador tal como PSGL-1 o CD62L en/sobre una célula puede incluir la valoración de la cantidad de un ácido nucleico, e.g. ARN, en una célula que codifica el biomarcador respectivo. Una sonda de ácido nucleico puede utilizarse para sondear una muestra por cualquier método de hibridación común para detectar la cantidad de moléculas de ácido nucleico del biomarcador. Para obtener sondas de ácido nucleico puede llevarse a cabo síntesis química. Las sondas de ácido nucleico sintetizadas pueden utilizarse primero como cebadores en una reacción en cadena de poli erasa (PCR) llevada a cabo de acuerdo con técnicas PCR reconocidas, esencialmente de acuerdo a protocolos PCR estándar utilizando el templado apropiado, para obtener la sonda respectiva. Un experto en la materia fácilmente será capaz de designar tal una sonda en base a las secuencias disponibles para el biomarcador. La sonda de hibridación puede marcarse por téenicas de marcado estándar tales como una radiomarca, marca de enzima, marca fluorescente, marca de biotin-avidina, quimioluminiscencia o una nano-partícula. Después de hibridación, las sondas pueden visualizarse utilizando una técnica estándar.
Un método de detección utilizado en el contexto de la presente invención puede incluir una amplificación de la señal causada por el ácido nucleico o proteína, tal como una reacción en cadena de polimerasa (PCR) o el uso del sistema de biotin-estreptavidina, por ejemplo en forma de una conjugación con una inmunoglobulina, como también se explica en más detalle abajo. El método de detección, por ejemplo, puede incluir el uso de un anticuerpo, e.g. una inmunoglobulina, que puede enlazarse a una marca anexa, tal como por ejemplo en análisis Western o ELISA. Donde se desea, puede utilizarse una inmunoglobulina intracelular para detección. Algunas o todas las etapas de detección pueden ser parte de un sistema de detección automático. Ejemplos ilustrativos de tales sistemas son plataformas de PCR en tiempo real automáticas, plataformas de aislamiento de ácido nucleico automáticas, analizadores del producto PCR y sistemas de detección en tiempo real. Como se indica arriba, el termino "anticuerpo" como se utiliza en la presente, se entiende que incluye una inmunoglobulina y un fragmento de inmunoglobulina que es capaz de unir una proteína seleccionada, e.g. L-selectina o una proteína específica para células T, así como una molécula de unión proteinácea respectiva con funciones similares a inmunoglobulina. Un anticuerpo, por ejemplo, puede ser un dominico similar a EGF, un dominio Kringle, un dominio de fibronectina tipo I, un dominio de fibronectina tipo II, un dominio de fibronectina tipo III, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio del Inhibidor de tripsina pancreática Kunitz/Bovina, tendamistato, un dominio de inhibidor de proteasa de serina tipo Kazal, un dominio Trefoil (tipo P), un dominio de factor von Willebrand tipo C, un dominio similar a Anafilatoxin, un dominio CUB, una repetición de tiroglobulina tipo I, un dominio de LDL-receptor clase A, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio de Tromboespondina tipo I, un dominio de inmunoglobulina o un dominio similar a inmunoglobulina (por ejemplo un anticuerpo de dominio o un anticuerpo de cadena pesada de camello), un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio de factor von Willebrand tipo A, un dominio Somato edina B, un dominio de núcleo de disulfuro cuatro tipo WAP, un dominio F5/8 tipo C, un dominio de Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio similar a EGF tipo Laminin, un dominio C2, un "Kappabody" (111. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-957), un "Minibody" (Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), un "Diabody" (Holliger et al., PNAS E.U.A. 90, 6444-6448 (1993)), un "Janusin" (Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659 o Traunecker et al., Int J Cáncer (1992) Suppl 7, 51-52), un nanocuerpo, una adnectina, una tetranectina, un microcuerpo, una afilina, un aficuerpo, o una anquirina, una cristalina, una knotina, una ubiquitina, una proteína de extremo de zinc, una proteína autofluorescente, una anquirina o proteína de repetición de anquirina o una proteína de repetición rica en leucina (cf. véase también abajo).
Una medición de un nivel o cantidad, por ejemplo, se basa en medios espectroscópicos, fotoquímicos, fotomé ricos, fluorométríeos, radiológicos, enzimáticos o termodinámicos. Un ejemplo de un método de detección espectroscópico es espectroscopia de correlación de fluorescencia. Un método fotoquímico es, por ejemplo, degradación fotoquímica. El uso de marcas fotoactivas, fluorescentes, radioactivas o enzimáticas respectivamente son ejemplos de métodos de detección fotométricos, fluorométricos, radiológicos y enzimáticos. Un ejemplo de un método de detección termodinámico es calorimetría de valoración isotérmica. Como un ejemplo ilustrativo de una marca, se ha dado un protocolo detallado en el uso de puntos de cuanto semiconductores bio-funcionalizados, solubles en agua por Lidke et al. (Current Protocols in Cell Biology,
[2007] Suppl. 36, 25.1.1-25.1.18). Tales puntos cuanto tienen una fotoestabilidad particularmente alta, permitiendo el monitoreo de su localización por minutos a horas a días. Existen nanopartículas típicamente fluorescentes. Ya que diferentes tipos de puntos cuanto pueden excitarse por una línea láser única, puede realizarse el marcado multi-color lineal. La detección, por ejemplo, puede llevarse a cabo convenientemente en diferentes canales de fluorescencia de un citómetro de flujo. Un punto cuanto puede acoplarse a un ligando de PSGL-1, CD62L o LFA-1 así como a una molécula de captura (cf. véase abajo).
Generalmente se selecciona que la medición utilizada sea una sensibilidad que permite la detección de células que expresan CD62L, PSGL-1 y/o LFA- en el rango de un valor umbral seleccionado, en particular de una sensibilidad que permite la determinación de si las células que expresan CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 están por debajo del valor umbral. Típicamente un ligando de CD62L, PSGL-1 y LFA-1, respectivamente, puede utilizarse en combinación con un marcador detectable. Tal un ligando de CD62L, PSGL-ly/o LFA-1 tiene una afinidad y especificidad detectables para CD62L, PSGL-1 y LFA-1, respectivamente. Típicamente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es más alta que 106 M. Un ligando de CD62L, PSGL-land LFA-1, respectivamente, tiene en algunas modalidades una afinidad de aproximadamente 108 M o más alta, o de aproximadamente 1CT9 M o más alta. Como se indica arriba, en algunas modalidades las células T en la muestra se identifican por la presencia de la proteína CD3 en su superficie; o las células T pueden enriquecerse o aislarse a través de la presencia de la proteína CD3 en su superficie. La identificación de las células T CD3+ de nuevo puede llevarse a cabo utilizando medios espectroscópicos, fotoquímicos, fotométricos, fluorométríeos, radiológicos, enzimáticos o termodinámicos. La identificación y enriquecimiento o aislamiento de las células T pueden llevarse a cabo del mismo modo al utilizar un ligando adecuado de CD3+. De acuerdo con lo anterior lo anterior aplica mutatis mutandis para identificar y enriquecer o aislar células T. Además, las células T pueden identificarse o aislarse en una manera similar, utilizando proteínas de superficie adecuadas conocidas en la materia, por ejemplo el receptor de célula T. En algunas modalidades un ligando adecuado de CD3 y un ligando adicional, adecuado de una proteína de superficie característica para células T tal como el receptor de célula T se combinan para identificar células T CD3+. Típicamente un ligando de CD3 puede utilizarse en combinación con un marcador detectable. Del mismo modo un ligando de CD3 puede utilizarse en combinación con un marcador detectable. En algunas modalidades un ligando adecuado de CD3, un ligando adecuado de una proteína de superficie característico para células T tal como el receptor de célula T y un ligando adecuado de CD62L se combinan para identificar células T CD62L que expresan CD3+. En algunas modalidades un ligando adecuado de CD3+, un ligando adecuado de una proteína de superficie característico para células T tal como el receptor de célula T y un ligando adecuado de LFA-1 se combinan para identificar células T LFA-1 que expresan CD3+. En algunas modalidades un ligando adecuado de CD3 y un ligando adecuado de CD62L se combinan para identificar células T que expresan CD62L. En algunas modalidades un ligando adecuado de CD3 y un ligando adecuado de PSGL-1 se combinan para identificar células T que expresan PSGL-1. En algunas modalidades un ligando adecuado de CD3+ y un ligando adecuado de LFA-1 se combinan para identificar células T que expresan LFA-1. En algunas modalidades un ligando adecuado de CD3+, un ligando adecuado de PSGL-1 y un ligando adecuado de LFA-1 se combinan para identificar células T que expresan tanto LFA-1 como PSGL-1.
Un ligando respectivo de e.g. CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3, así como un ligando para otra proteína característica de la célula seleccionada, puede ser una inmunoglobulina, un fragmento de la misma o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. Un fragmento de anticuerpo generalmente contiene una región variable o de unión a antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo (recombinante) son fragmentos de inmunoglobulina tales como los fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena única (scFv), diacuerpos o anticuerpos de dominio (Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol . (2003), 21, 11, 484-490). ün ejemplo de una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina es una muteína en base a un polipéptido de la familia lipocalina (WO 03/029462, Beste et al., Proc. Nati . Acad. Sci. USA (1999) 96, 1898-1903). Las lipocalinas, tales como las proteínas de unión de bilina, lipocalina asociada con gelatinasa de neutrofil de humano, Apolipoproteína D de humano o glicodelina, posee sitios de unión de ligando naturales que pueden modificarse de manera que se unen a regiones de proteína pequeña seleccionadas conocidas como heptenos. Ejemplos de otras moléculas de unión proteínicas son los así llamados glucuerpos (ver e.g. solicitud de patente internacional WO 96/23879 o Napolitano, E.W., et al., Chemistry & Biology (1996) 3, 5, 359-367), proteínas en base un andamio de ankirin (Mosavi, L.K., et al., Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448) o andamio cristalino (e.g. solicitud de patente internacional WO 01/04144), las proteínas descritas en Skerra, J. Mol . Recognit. (2000) 13, 167-187, AdNectinas, tetranectinas y avímeros. Los avímeros contienen los así llamados dominios A que ocurren como cadenas de múltiples dominios en varios receptores de superficie celular (Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). Adnectinas, derivadas de un campo de fibronectina de humano, contienen tres ciclos que pueden formarse para unión similar a inmunoglobulina a objetivos (Gilí, D.S. & Damle, N.K., Current Opinión in Biotechnology (2006) 17, 653-658). Tetranectinas, derivadas de la proteína homotrimérica de humano respectiva, contienen del mismo modo regiones de ciclo en un campo de lectina tipo C que puede formarse para unión deseada (ibid.). Los peptóides que pueden actuar como ligandos de proteína son oligo (N-alquil) glicinas que difieren de los péptidos en que la cadena lateral se conecta al nitrógeno de amida en lugar de al átomo de carbono a. Los peptóides son típicamente resistentes a proteasas y otras enzimas de modificación y pueden tener una permeabilidad celular mucho más alta que los péptidos (ver e.g. Kwon, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509). Un anticuerpo adecuado en algunas modalidades también puede ser un anticuerpo multiespecífico que incluyen varios fragmentos de inmunoglobulina.
Una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina puede PEGilarse o hiperglicosilarse si se desea. En algunas modalidades una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina es una proteína de fusión de una de las moléculas de unión proteínicas ejemplificativas de arriba y un dominio de unión de albúmina, por ejemplo un dominio de unión a albúmina de proteína streptococcal G. En algunas modalidades una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina es una proteína de fusión de un fragmento de inmunoglobulina, tal como un diacuerpo de cadena única, y un dominio de unión de inmunoglobulina, por ejemplo un dominio de unión de inmunoglobulina bacteriana. Como un ejemplo ilustrativo, puede fusionarse un diacuerpo de cadena única al dominio B de proteína A stafilococcal como se describe por Unverdorben et al. (Protein Engineering, Design & Selection
[2012] 25, 81-88).
Una molécula que forma un compuesto con un ligando de e.g. CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD4 del mismo modo puede ser una inmunoglobulina, un fragmento de la misma o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina, como se explica arriba. De esta manera, en una modalidad ejemplificativa que detecta la cantidad de CD62L, e.g. en una superficie celular, puede realizarse utilizando un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unir específicamente CD62L, así como un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unir específicamente el primero anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Una inmunoglobulina puede ser monoclonal o policlonal. El término "policlonal" se refiere a inmunoglobulinas que son poblaciones heterogéneas de moléculas de inmunoglobulina derivadas de los cuerpos de animales inmunizados con un antígeno o un derivado funcional antigénico del mismo. Para la producción de inmunoglobulinas policlonales, pueden inmunizarse uno o más de los varios animales huésped por inyección con el antígeno. Pueden utilizarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies huésped. "Inmunoglobulinas monoclonales", también llamados "anticuerpos monoclonales", son poblaciones sustancialmente homogéneas de inmunoglobulinas a un antígeno particular. Pueden obtenerse por cualquier téenica que proporciona la producción de moléculas de inmunoglobulina por líneas celulares continúas en cultivo. Las inmunoglobulinas monoclonales pueden obtenerse por métodos bien conocido por aquellos expertos en la materia (ver por ejemplo, Kóhler et al., Nature (1975) 256, 495-497, y Patente de E.U. No. 4,376,110). Una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina con afinidad de unión específica solamente para e.g. CD62L, PSGL-1, CD3, LFA-1, CD8 o CD4 puede aislarse, enriquecerse o purificarse de un organismo procariótico o eucariótico. Los métodos de rutina conocidos por aquellos expertos en la materia permiten la producción de tanto inmunoglobulinas como fragmentos de inmunoglobulina y moléculas de unión proteínicas con funciones similares a inmunoglobulina, en ambos organismos, procariótico y eucariótico.
En más detalle, una inmunoglobulina también puede aislarse al comparar su afinidad de unión con una proteína de interés, e.g. L-selectina, con su afinidad de unión con otros polipéptidos. Las formas humanizadas de los anticuerpos de la presente invención pueden generase utilizando uno de los procedimientos conocidos en la materia tales como quimerización o injerto CDR. En general, las téenicas para preparar anticuerpos monoclonales e hibridomas se conocen bien en la materia. Cualquier animal tal como una cabra, un ratón o un conejo que se conocen por producir anticuerpos puede inmunizarse con el polipéptido seleccionado, e.g. L-selectina. Los métodos para inmunización se conocen bien en la materia. Tales métodos incluyen inyección subcutánea o intraperitoneal del polipéptido. Un experto en la materia reconocerá que la cantidad de polipéptido utilizada para inmunización y el régimen de inmunización variará en base al animal que se inmuniza, incluyendo las especies de mamífero inmunizadas, su estado inmune y el peso corporal del mamífero, así como la antigenicidad del polipéptido y el sitio de inyección.
El polipéptido puede modificarse o administrarse en un adyuvante para incrementar la antigenicidad del péptido. Métodos para incrementar la antigenicidad de un polipéptido se conocen bien en la materia. Tales procedimientos incluyen acoplar el antígeno con una proteína heteróloga (tal como globulina o b-galactosidasa) o a través de la inclusión de un adyuvante durante inmunización.
Típicamente, los animales inmunizados sangran y el suero de cada muestra de sangre se analiza para anticuerpos particulares utilizando ensayos de selección apropiados. Como un ejemplo ilustrativo, inmunoglobulinas anti-CD62L, anti-PSGL-1 o anti-LFA-1 pueden identificarse por inmunoprecipitación de lisatos celulares 1251-marcados de Células que expresan CD62L, PSGL-1 o LFA-1. Inmunoglobulinas anti-CD62L, PSGL-1 o anti-LFA-1 también pueden identificarse por citometría de flujo, e.g., al medir la coloración fluorescente de células Ramos incubadas con una inmunoglobulina se cree que se reconocen CD62L, PSGL-1 o LFA-1, según sea aplicable.
Para inmunoglobulinas monoclonales, linfocitos, típicamente esplenocitos, de los animales inmunizados se remueven, fusionan con una línea celular inmortal, típicamente células de mieloma, tales como células de mieloma SP2/0-Agl4, y se dejan convertir en células hibridoma que producen inmunoglobulina monoclonal. Típicamente, la línea celular inmortal tal como una línea celular de mieloma se deriva de las mismas especies mamífero que los linfocitos. Las líneas celulares inmortales ilustrativas son líneas celulares mieloma de ratón que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Típicamente, las células de mieloma de ratón sensible a HAT se fusionan con los esplenocitos de ratón utilizando polietileno glicol de peso molecular 1500 ("PEG 1500"). Las células hibridoma que resultan de la fusión pueden entonces seleccionarse utilizando medio HAT, que mata las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera no productiva (esplenocitos no fusionados mueren después de varios días debido a que no se transforman).
Cualquiera de un número de métodos bien conocidos en la materia puede utilizarse para identificar una célula hibridoma que produce una inmunoglobulina con las características deseadas. Típicamente los sobrenadantes de cultivo de las células hibridoma se seleccionan para inmunoglobulinas contra el antígeno. Los métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, selección de hibridomas con un ensayo ELISA, análisis Western blot, o radioinmunoensayo. Hibridomas preparados para producir inmunoglobulinas anti-CD62L, anti-PSGL-1 o anti-LFA-1, por ejemplo, pueden seleccionarse al probar el sobrenadante de cultivo hibridoma para anticuerpos secretados que tienen la habilidad de unirse a una línea celular que expresa CD62L, PSGL-1 o LFA-1 recombinante. Para producir homólogos de anticuerpo que están dentro del alcance de la invención, incluyendo por ejemplo, homólogos de anticuerpo anti-CD62L, PSGL-1 o anti-LFA-1, que son inmunoglobulinas intactas, las células hibridoma que se probaron positivas en tales ensayos de selección pueden cultivarse en un medio nutriente bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que las células hibridoma secreten las inmunoglobulinas monoclonales en el medio de cultivo. Las téenicas de cultivo de tejido y medio de cultivo adecuado para células hibridoma se conocen bien en la materia. El sobrenadante de cultivo de hibridoma acondicionado puede recolectarse y por ejemplo las inmunoglobulinas anti-CD62L o las inmunoglobulinas anti-PSGL-1 opcionalmente se purifican además por métodos bien conocidos. Alternativamente, las inmunoglobulinas deseadas pueden producirse al inyectar las células hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón no inmunizado. Las células hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, secretando la inmunoglobulina que se acumula como fluido de ascitis. La inmunoglobulina puede recolectar al extraer el fluido de ascitis de la cavidad peritoneal con una jeringa.
Se clonan los hibridomas que secretan las inmunoglobulinas deseadas y se determinan la clase y subclase utilizando procedimientos conocidos en la materia. Para inmunoglobulinas policlonales, un antisuero que contiene inmunoglobulina se aísla del animal inmunizado y se selecciona por la presencia de inmunoglobulinas con la especificidad deseada utilizando uno de los procedimientos arriba descritos. Los anticuerpos arriba descritos, incluyendo inmunoglobulinas, también pueden inmovilizarse en un soporte sólido. Ejemplos de tales soportes sólidos incluyen plásticos tales como policarbonato, carbohidratos complejos tales como agarosa y sefarosa, resinas acrílicas y tales como poliacrilamida y perlas de látex. Las téenicas para acoplar anticuerpos a tales soportes sólidos se conocen bien en la materia.
Una pluralidad de tecnologías de despliegue convencionales está disponible para seleccionar una inmunoglobulina, fragmento de inmunoglobulina o molécula de unión proteinácea. Li et al. ( Organic & Biomolecular Chemistry (2006), 4, 3420-3426) por ejemplo han demostrado cómo un fragmento Fv de cadena única capaz de formar un compuesto con un adaptador de ADN seleccionado, puede obtenerse utilizando despliegue de fago. Las técnicas de despliegue, por ejemplo, permiten la generación de inmunoglobulinas adaptadas y ligandos con altas afinidades para una molécula objetivo seleccionada. De esta manera también es posible desplegar un conjunto de péptidos o proteínas que difieren solamente de manera ligera, típicamente por medio de ingeniería genética. Así es posible seleccionar y subsiguientemente incluir proteínas o péptidos en términos de propiedades de interacción y parámetros biofísicos. Las vueltas interactivas de mutación y selección pueden aplicarse en una base in vi tro.
La teenología de despliegue in vitro para la selección de péptidos y proteínas se basa en un enlace físico entre el péptido o proteína y un ácido nucleico que codifica la misma. Se ha establecido un gran panel de técnicas para este propósito, con el despliegue más comúnmente utilizado siendo fago/virus, despliegue de ribosoma, despliegue de superficie celular, 'péptidos en plásmidos', despliegue de AR m, despliegue de ADN, en compartimentalización in vitro incluyendo despliegue de micro-perla (para revisiones ver e.g. Rothe, A., et al., FASEB J. (2006) 20, 1599-1610; Sergeeva, A., et al., Advanced Drug Delivery Reviews (2006) 58, 1622-1654).
También están disponibles diferentes promedios para unir físicamente un péptido, incluyendo una proteína, y un ácido nucleico. La expresión en una célula con una molécula de superficie celular, expresión como un polipéptido de fusión con una proteína de revestimiento viral/fago, un compuesto in vitro estabilizado de una molécula ARN, el ribosoma y el polipétido respectivo, acoplamiento covalente in vitro a través de una molécula de puromicina o a través de micro-perlas son ejemplos de modos de enlazar la proteína/péptido y el ácido nucleico actualmente utilizado en la materia. Una téenica de despliegue adicional se basa en una emulsión de agua en aceite. Las gotas de agua sirven como compartimientos en cada uno de los cuales se transcribe un gen único y se traduce (Tawfik, D.S., & Griffiths, A.D., Nature Biotech. (1998) 16, 652-656, solicitud de patente de EU 2007/0105117). Este enlace físico entre el péptido incluyendo la proteína, y el ácido nucleico (codificándolo) proporciona la posibilidad de recuperar el ácido nucleico que codifica el péptido/proteína seleccionada. En comparación con técnicas tal como inmunoprecipitación, en técnicas de despliegue de esta manera no solamente pueden identificarse o seleccionarse los ligandos de una molécula objetivo seleccionada, sino que el ácido nucleico para este ligando puede recuperarse y utilizarse para procedimiento adicional. Las técnicas de despliegue presentes proporcionan de esta manera medios para e.g. descubrimiento objetivo, descubrimiento de plomo y optimización de plomo. Pueden seleccionarse potencialmente librerías vastas de péptidos o proteínas, e.g. anticuerpos, a gran escala.
Ejemplos ilustrativos de anticuerpos tales como inmunoglobulinas que se unen específicamente a PSGL-1, por ejemplo, se han descrito en la solicitud de patente internacional WO 2005/110475. Ejemplos de inmunoglobulinas y fragmentos de inmunoglobulina que se unen específicamente a epítopo conformacionales de PSGL-l, por ejemplo, se han descrito en la solicitud de patente internacional WO 2012/088265.
Como se indica arriba, un marcador detectable puede acoplarse a un ligando de CD62L, de PSGL-l, de LFA-1, de CD4, de CD8 o CD3, según sea el caso, o una molécula que forma un compuesto con el ligando de CD62L, PSGL-l, LFA-1, CD4, CD8 o CD3. Un marcador detectable respectivo, que puede acoplarse a un ligando de CD62L, PSGL-l, LFA-1, CD4, CD8 o CD3, o una molécula que forma un compuesto con el mismo, puede ser una marca ópticamente detectable, un fluoróforo, o un cromóforo. Ejemplos de marcas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, una molécula orgánica, una enzima, una porción radioactiva, fluorescente, y/o cromogénica, una porción luminiscente, un hapteno, digoxigenin, biotina, un compuesto metálico, un metal y oro coloidal. De acuerdo con lo anterior una tintura fluorescente excitable, un aminoácido radioactivo, una proteína fluorescente o una enzima, por ejemplo, pueden utilizarse para detectar e.g. el nivel de CD62L o el nivel de PSGL-l. Ejemplos de tinturas fluorescentes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína, 5,6-carboximetil fluoresceína, Cascade Blue®, Oregon Green®, rojo Texas, nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-ilo, cumarina, cloruro de dansil, rodamina, amino-metil cumarina, DAPI, Eosina, Eritrosina, BODIPY®, pireno, lisamina, xanteno, acridina, una oxazina, ficoeritrina, un tinte Cy tal como Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5PE, Cy5.5, Cy7, Cy7PE o Cy7APC; una tintura Alexa tal como Alexa 647, y NBD (tintura básica Naphthol). Ejemplos de proteína fluorescente adecuada incluyen, pero no se limitan a, EGFP, esmeralda, EYFP, una ficobiliproteína tal como ficoeritrina (PE) o aloficocianina, Proteína Fluorescente Roja Monomérica (mRFP), mNaranja, mCiruela y mCereza. En algunas modalidades puede emplearse una proteína fluorescente reversiblemente fotointercambiable tal como Dronpa, bsDronpa y Padrón (Andresen, M., et al., Nature Biotechnology (2008) 26, 9, 1035). Considerando las enzimas adecuadas, fosfatasa alcalina, peroxidasa de semilla de soya, o peroxidasa de rábano picante pueden servir como unos pocos ejemplos ilustrativos. En algunas modalidades un método de detección puede incluir electroforesis, HPLC, citometría de flujo, espectroscopia de correlación de fluorescencia o una forma modificada de estas téenicas. Algunas o todas de estas etapas pueden ser parte de un sistema de separación/detección automático.
En algunas modalidades el ligando de e.g. CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3, así como un ligando para otra proteína característica de célula seleccionada, incluye además una molécula de captura. Tal una molécula de captura permite la inmovilización del ligando, y también así de un compuesto formado entre e.g. CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3, una proteína característica de célula seleccionada, en una superficie o en una molécula polimérica, incluyendo una inmunoglobulina, un fragmento de inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. Una superficie respectiva, por ejemplo, puede ser la superficie de una micro- o nanopartícula, la superficie de un recipiente o la superficie de una dispositivo particularmente designado, utilizado para propósitos de presentación durante medición. Una micro- o nanopartícula en algunas modalidades puede incluir, esencialmente consistir de o consistir de un metal, un metaloide o un polímero. En algunas modalidades la micro-o nanopartícula es magnética, tal como paramagnética o supermagnética. La molécula de captura puede inmovilizarse en la superficie a través de un enlace covalente o un enlace no covalente.
La molécula de captura tiene una afinidad a un ligando de la molécula de captura y es capaz de formar un compuesto con el ligando de la molécula de captura. Por lo tanto, la molécula de captura y el ligando de la molécula de captura definen un par de unión específico. De acuerdo con lo anterior, puede seleccionarse un par de molécula de captura y ligando de la molécula de captura según se desee, por ejemplo de acuerdo al ligando de CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3 o a las condiciones de medición utilizadas en la detección de, por ejemplo, CD62L. Ejemplos de una molécula de captura incluyen, pero no se limitan a, un molécula de ácido nucleico, un oligonucleótido, una proteína, un oligopéptido, un polisacárido, un oligosacárido, un polímero sintético, una molécula candidata de fármaco, una molécula de fármaco, un metabolito de fármaco, un ión metálico, y una vitamina. Tres ejemplos ilustrativos de molécula de captura adecuada son biotina, dinitrofenol o digoxigenina. Donde el ligando de la molécula de captura es una proteína/polipéptido, o un péptido, los ejemplos adicionales de una molécula de captura incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta de unión de estreptavidina tal como STREP-TAGS® descrita en la Solicitud de patente de EU US 2003/0083474, patente de EU 5,506,121 o 6,103,493, un campo de inmunoglobulina, proteína de unión a maltosa, glutationa-S-transferasa (GST), péptido de unión a calmodulina (CBP), péptido FLAG (e.g. de la secuencia Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), el epítopo T7 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), proteína de unión a maltosa (MBP), el epítopo HSV de la secuencia Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp de glicoproteína de virus de herpes simplex D, la Glicoproteína del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV-G) epítopo of la secuencia Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys, el epítopo de hemaglutinina (HA) de la secuencia Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala y el epítopo "myc" del factor de transcripción c-myc de la secuencia Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu. Donde el ligando de la molecula de captura es un ácido nucleico, un polinucleótido o un oligonucleótido, una molécula de captura puede ser además un oligonucleótido. Tal etiqueta de oligonucleótido tag, por ejemplo, pueden utilizarse para hibridarse a un oligonucleótido inmovilizado con una secuencia complementaria.
Como un ejemplo ilustrativo, la molécula de captura puede ser un ión metálico unido por un quelador metálico respectivo, tal como etilenediamina, ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA), ácido tetraacético de etilenglicol (EGTA), ácido dietilenotriaminepentaacético (DTPA), N,N-bis(carboximetil)glicina (también llamado ácido nitrilotriacético, NTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), 2,3-dimercapto-1-propanol (dimercaprol), porfina o heme. Un ión metálico respectivo puede definir una molécula receptora para un péptido de una secuencia definida, la cual también puede incluirse en una proteína. En línea con el método estándar de afinidad de metal inmovilizada, la cromatografía utilizada en la materia, por ejemplo una etiqueta de oligohistidina de una proteína o péptido respectivo es capaz de formar un compuesto con iones de cobre (Cu2+), níquel (Ni2+), cobalto (Co2+), o cinc (Zn2+), los cuales, por ejemplo, pueden presentarse por medio del ácido nitrilotriacético quelante (NTA).
La molécula de captura puede inmovilizarse en una superficie (ver abajo) tal como la superficie de una partícula tal como una perla que contiene metal. La molécula de captura puede inmovilizarse por cualquier medio. Puede inmovilizarse en una porción o el área total de una superficie. Un ejemplo ilustrativo es la localización mecánica de una molécula de captura de ácido nucleico sobre una superficie de metal. Esta localización puede llevarse a cabo manualmente, e.g. por medio de una pipeta, o automáticamente, e.g. por medio de un micro robot. Como un ejemplo ilustrativo, una molécula de captura de proteína, una molécula de captura de péptido o la estructura de polipéptido de una molécula de captura PNA puede enlazarse de manera covalente a una superficie de oro a través de un enlace tio-éter.
En modalidades donde tanto la molécula de captura como el ligando de un biomarcador son una molécula de ácido nucleico, incluyendo un oligonucleótido, la molécula de captura típicamente tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una porción de un filamento del ligando de la molécula de captura. Como un ejemplo ilustrativo adicional, Avidina o estreptavidina pueden emplearse para inmovilizar un ácido nucleico biotinilado, o puede emplearse una monocapa que contiene biotina de oro (Shumaker-Parry, J.S., et al., Anal . Chem. (2004) 76, 918). Como otro ejemplo ilustrativo, la molécula de captura puede ser un ión de metal unido por un quelador de metal respectivo (ver arriba).
Como se explica arriba, un ligando puede unir una molécula de ácido nucleico, un péptido, una proteína, un sacárido, un polisacárido o un lípido. En algunas modalidades el ligando es una molécula PNA. Como se indica arriba, una molécula PNA es una molécula de ácido nucleico en la cual la estructura es un pseudopéptido en lugar de una azúcar. De acuerdo con lo anterior, PNA generalmente tiene una estructura neutral de carga, en contraste con ADN o ARN. Sin embargo, PNA es capaz de hibridar filamentos de ácido nucleico al menos complementarios y sustancialmente complementarios, justo como e.g. ADN o ARN (para el cual PNA se considera una imitación estructural). En algunas modalidades el ligando es un aptámero, incluyendo un Spiegelmer®, descrito en e.g. WO 01/92655. Un aptámero típicamente es una molécula de ácido nucleico que puede seleccionarse de un grupo de ácido nucleico aleatorio en base a su habilidad para unir otra molécula seleccionada tal como un péptido, una proteína, una molécula de ácido nucleico o una célula. Los aptámeros, incluyendo Spiegelmers, son capaces de unir moléculas tales como péptidos, proteínas y compuestos de bajo peso molecular. Spiegelmers® se componen de L-isómeros de oligonucleótidos naturales. Los aptámeros se forman a través de vueltas repetidas de selección in vitro o a través de la teenología SELEX (evolución sistémica de ligandos por enriquecimiento exponencial). La afinidad de Spiegelmers con sus moléculas objetivo con frecuencia se basa en el rango pico- a nanomolar y de esta manera es comparable con inmunoglobulinas. Un aptámero también puede ser un péptido. Un aptámero de péptido consiste de un dominio de péptido variable corto, unido a ambos extremos a un andamio de proteína.
En modalidades típicas el ligando es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina como se define arriba. En algunas modalidades el ligando puede marcarse de manera detectable como se explica arriba, por ejemplo donde se propone utilizar el ligando junto con un agente de detección que se une al biomarcador y/o el ligando. El ligando y/o un agente de detección respectivo puede marcarse de manera detectable al enlazar el mismo, típicamente de manera covalente, a un marcador detectable tal como una etiqueta radioactiva, una porción fluorescente, una entidad química de bajo peso molecular, un oligonucleótido, una enzima, o una proteína tal como una proteína fluorescente tal como una Proteína Verde Fluorescente (cf. véase arriba). Debe entenderse que el método también puede incluir cualquier molécula que puede utilizarse para indicar de manera indirecta el nivel de la molécula objetivo de interés tal como CD62L, PSGL-1, CD3, CD4, CD8, CD18 o CDlla. El ligando en algunas modalidades puede ser una inmunoglobulina, una porción de la misma, una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina, un receptor para el biomarcador o una porción del mismo o un ligado para el biomarcador o una porción del mismo. El agente de detección en algunas modalidades puede ser una inmunoglobulina, una porción de la misma, una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina, un receptor para el biomarcador o una porción del mismo, un ligando para el biomarcador o una porción del mismo un ligando o una porción del mismo.
En algunas modalidades un ligando capaz de unir una molécula de ácido nucleico objetivo particular tal como una molécula ARNm que codifica e.g. CD62L, PSGL-1, CD18 o CDlla, es una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una porción de un filamento de tal una molécula de ácido nucleico objetivo. Una secuencia de nucleótidos es el complemente de otra secuencia de nucleótidos si todos los nucleótidos de la primer secuencia son complementarios a todos los nucleótidos de la segunda secuencia. De acuerdo con lo anterior, la secuencia de nucleótidos respectiva específicamente se hibridará a, o se someterá a formación dúplex con, la porción respectiva de la molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones adecuadas de ensayo de hibridación, en particular de resistencia iónica y temperatura.
Como un ejemplo ilustrativo, una molécula de ácido nucleico de filamento único puede seleccionarse como un ligando de ácido nucleico. Tal una molécula de ácido nucleico de filamento único puede tener una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos parcialmente complementaria a al menos una porción de un filamento de la molécula de ácido nucleico objetivo. La secuencia de nucleótidos respectiva del ligando de ácido nucleico, por ejemplo, puede ser 70, por ejemplo 80 o 85, incluyendo 100% idéntica a otra secuencia de ácidos nucleicos. Mientras más alto sea el porcentaje al cual las dos secuencias son complementarias entre sí (es decir, el número inferior de diferencias), más alta será típicamente la sensibilidad del método de la invención. En modalidades típicas la secuencia de nucleótidos respectiva es sustancialmente complementaria a al menos una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo. "Sustancialmente complementaria" como se utiliza en este documento se refiere al hecho de que una secuencia de ácidos nucleicos dada es al menos 90% idéntica a otra secuencia de ácidos nucleicos. Una secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente complementaria es en algunas modalidades 95%, tal como 100% idéntica a otra secuencia de ácidos nucleicos. El término "complementaria" o "complemento" se refiere a dos nucleótidos que pueden formar múltiples interacciones favorables entre sí. Tales interacciones favorables son de asociación específica entre pares opuestos o adyacentes de filamentos de ácido nucleico (incluyendo análogo de ácido nucleico) a través de bases coincidentes, e incluyen formación de pares base Watson-Crick. Como un ejemplo ilustrativo, en dos moléculas de ácido nucleico dadas (e.g. moléculas de ADN) la adenosina base es complementaria a timina o uracil, mientras la citosina base es complementaria a guanina. Una sonda de ácido nucleico utilizada en el contexto de la presente invención puede utilizarse para sondear la muestra por métodos de hibridación usuales para detectar la presencia de moléculas de ácido nucleico que codifica e.g. CD62L, PSGL-l, CD18 o CDlla.
Las interacciones entre dos o más moléculas de ácido nucleico generalmente son interacciones accionadas por secuencia referidas como hibridación. La interacción accionada por secuencia es una interacción que ocurre entre dos nucleótidos o análogos de nucleótido o derivados de nucleótido en una manera específica de nucleótido (supra). Típicamente las interacciones accionadas por secuencia ocurren en el lado Watson-Crick o lado Hoogsteen del nucleótido respectivo. La hibridación de dos ácidos nucleicos se afecta por un número de condiciones y parámetros conocidos por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, las concentraciones de sal, pH, y temperatura de la reacción afectan si se hibridarán dos moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, en algunas modalidades las condiciones de hibridación selectivas pueden definirse como condiciones de hibridación estrictas. Por ejemplo, exigencia de hibridación se controla por tanto temperatura como concentración de sal de cualquiera o ambas de las etapas de hibridación y enjuague. Por ejemplo, las condiciones de hibridación que logran interacciones selectivas entre secuencias complementarias pueden incluir la hibridación en solución de alta resistencia iónica (6 x SSC o 6 x SSPE) a una temperatura que está en el rango de aproximadamente 12 a aproximadamente 25°C abajo Tm, la temperatura de fusión a la cual la mitad de las moléculas se disocian de sus patrones de hibridación, seguido por enjuague a una combinación de temperatura y concentración de sal se eligen de manera que la temperatura de enjuague está en el rango de aproximadamente 5°C a aproximadamente 20°C bajo la Tm. La temperatura y condiciones de sal se determinan fácilmente de manera empírica en experimentos preliminares en los cuales las muestras de ADN de referencia inmovilizadas en filtros se hibridan a un ácido nucleico marcado de interés y después se enjuagan bajo condiciones de diferentes severidades. Las temperaturas de hibridación son típicamente más altas para hibridaciones de ADN-ARN y ARN-ARN que para hibridaciones ADN-AD .
Para obtener las sondas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos que corresponden a porciones alteradas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés, puede llevarse a cabo síntesis química. Las sondas de ácido nucleico sintetizadas pueden utilizarse primero como cebadores en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) llevada a cabo de acuerdo con téenicas PCR reconocidas, esencialmente de acuerdo a protocolos PCR estándar utilizando el templado apropiado, para obtener las sondas que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención.
Un experto en la materia fácilmente será capaz de designar tales sondas en base a una secuencia como se refiere en la presente utilizando métodos de alineación por computadora y análisis de secuencia bien conocidos en la materia. Como se explica arriba, una sonda de hibridación respectiva puede marcarse por técnicas de marcado estándar utilizando un marcador detectable, tales como una radiomarca, marca de enzima, marca fluorescente, marca de biotin-avidina, o quimiolu iniscencia (supra). Después de hibridación, las sondas pueden visualizarse utilizando métodos conocidos. Una sonda de ácido nucleico puede inmovilizarse en un soporte sólido. Ejemplos de tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, plásticos tales como policarbonato, carbohidratos compuestos tales como agarosa y sefarosa, y resinas acrílicas, tales como poliacrilamida y perlas de látex. Como un ejemplo ilustrativo una o más sondas de ácido nucleico pueden unirse a o inmovilizarse en un soporte sólido. El soporte sólido puede ser un chip, por ejemplo un microchip de ADN. Las téenicas para acoplar sondas de ácido nucleico a tales soportes sólidos se conocen bien en la materia.
Los métodos utilizados más frecuentemente para determinar la concentración de ácidos nucleicos incluyen la detección por autoradiografia, fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminiscencia así como técnicas electroquímicas y eléctricas. Una técnica adecuada adicional es la detección eléctrica de una molécula de ácido nucleico objetivo como se describe en las solicitudes de patente internacionales WO 2009/041917 y WO 2008/097190, ambas incorporándose en la presente para referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, se controlará. Una técnica para la detección específica de un ácido nucleico seleccionado bien establecida en la materia se basa en la hibridación entre un ligando de ácido nucleico y un ácido nucleico objetivo.
Típicamente el ligando de ácido nucleico respectivo se inmoviliza sobre un soporte sólido, y posteriormente se emplea uno de los métodos de detección arriba mencionados.
Como se indica arriba, una inmunoglobulina marcada con una tintura de fluorescencia, por ejemplo, puede utilizarse para detectar ópticamente la presencia de una cierta proteína o polipéptido. Las tinturas de intercalado de ácido nucleico, tales como YOYO, JOJO, BOBO, POPO, TOTO, LOLO, SYBR, SYTO, SYTOX, PicoGreen, o Oligreen como disponibles de Sondas Moleculares, pueden utilizarse para detección óptica.
En algunas modalidades la determinación del nivel de expresión del gen de interés comprende determinar el nivel de transcripción en ARNm. ARN que codifica la proteína de interés en la muestra, tal como CD62L, PSGL-1, CD11A, CD18, CD3, CD4 o CD8 puede amplificarse utilizando cualquier téenica de amplificación disponible, tal como reacción en cadena de polimerasa (PCR), incluyendo PCR multiplex, PCR en red y PCR específica de mutación refractaria de amplificación (ARMS) (también llamado PCR específica de alelo (AS-PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), amplificación a base de secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), reacción en cadena de ligasa (LCR), reacción en cadena de replicasa QB, amplificación isotérmica mediada por ciclo (LAMP), amplificación mediada por transcripción (TMA) y amplificación de desplazamiento de filamento (SDA), incluyendo amplificación de desplazamiento de filamento de genoma (WGSDA), amplificación de desplazamiento de filamento múltiple (MSDA), y amplificación de desplazamiento de filamento específico de gen (GS-MSDA). La detección de los productos de amplificación obtenidos puede realizarse en numerosas maneras conocidas en la materia. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, métodos electroforéticos tales como electroforesis de gel de agarosa en combinación con una coloración tal como coloración de bromuro de etidio. En otras modalidades el método de la invención se acompaña por detección en tiempo real, tal como PCR en tiempo real. En estas modalidades se monitorea el curso de tiempo del proceso de amplificación. Un medio de detección en tiempo real comúnmente usado en la materia incluye la adición de una tintura antes del proceso de amplificación. Un ejemplo de tal tintura es la tintura de fluorescencia SYBR Verde, que emite una señal de fluorescencia solamente se une a ácidos nucleicos de doble filamento.
Como se explica arriba, se utiliza típicamente una marca detectable o marcador. Tal un marcador o marca puede incluirse en un ácido nucleico que incluye la secuencia a amplificarse. Un marcador también puede incluirse en un cebador o una sonda. También puede incorporarse en el producto de amplificación en el curso de la reacción. En algunas modalidades tal un compuesto marcador, e.g. incluido en un ácido nucleico, es una marca ópticamente detectable, un fluoróforo, o un cromóforo. Un ejemplo ilustrativo de un compuesto marcador es 6-carboxifluoresceina (FAM).
Como un ejemplo ilustrativo, PCR en tiempo real puede utilizarse para determinar el nivel de ARN que codifica la proteína de interés en la muestra, tal como CD62L, PSGL-1, CD11A, CD18, CD3, CD4 o CD8. Tal un procedimiento PCR se lleva a cabo bajo detección en tiempo real, de manera que se monitorea el curso de tiempo del proceso de amplificación. PCR se caracteriza por una amplificación logarítmica de las secuencias objetivo. Para la amplificación de ARN, se utiliza una PCR de transcriptasa inversa. El diseño de los cebadores y sondas requeridos para detectar la expresión de un biomarcador de la invención está dentro de la experiencia de un practicante con experiencia en la materia. En algunas modalidades ARN de la muestra se aísla bajo condiciones libres de RNAsa y después se convierten en ADN a través del uso de una transcriptasa inversa. La transcripción inversa puede realizarse antes del análisis RT-PCR o de manera simultánea, dentro de un envase de reacción único. Las sondas RT-PCR son oligonucleótidos que tienen una porción fluorescente, también llamada tintura de reporte, anexa al extremo 5' y una porción de templado acoplada al extremo 3' (o vice versa). Estas sondas típicamente se designan para hibridarse a una región interna de un producto PCR. En el estado sin hibridar, la proximidad del flúor y las moléculas de templado previene la detección de señal fluorescente de la sonda. Durante amplificación PCR, cuando la polimerasa replica un templado en el cual se unió una sonda RT-PCR, la actividad de 5'-3' nucleasa de la polimerasa separa la sonda. Así, se desacoplan las porciones fluorescentes y de templado. La fluorescencia incrementa entonces en cada ciclo, en una manera proporcional a la cantidad de división de sonda. La señal de fluorescencia emitida de la reacción puede medirse o seguirse con el tiempo utilizando equipo que está comercialmente disponible utilizando téenicas convencionales y de rutina. La cuantificación de ARN biomarcador en una muestra que se evalúa puede realizarse por comparación de la señal de amplificación con aquella de una o más curvas estándar donde las cantidades conocidas de ARN se evalúan en una manera similar. En algunas modalidades, la diferencia en expresión de biomarcador se mide como la diferencia en tiempo de ciclo PCR para alcanzar una fluorescencia umbral, o "dCT." Como se indica arriba, en algunas modalidades las células T tales como células T CD3+ se aíslan por medio de una superficie magnética, tal como paramagnética o supermagnética. En algunas modalidades las células T CD4+ y/o células T CD8+ también pueden aislarse por medio de una superficie magnética. Tal una superficie, por ejemplo, puede ser la superficie de una micro- o nanopartícula (supra). Típicamente una superficie respectiva tiene ligando unido de manera covalente o de manera no covalente tales como anticuerpos acoplados sobre él. En algunas modalidades pueden utilizarse las partículas magnéticas monodimensionadas como las disponibles de Life Technologies. En algunas modalidades puede emplearse la téenica de clasificación celular activada magnética (MACS®). En esta técnica los compuestos formados de células T y partículas magnéticas se cargan sobre una columna colocada en un campo magnético fuerte. Aunque otra materia pasa a través de la columna, los compuestos de las partículas magnéticas y células T permanecen debido a la acción del campo magnético. Del mismo modo, en algunas modalidades las células T, incluyendo células T CD3+, células T CD4+ y/o células T CD8+, se aíslan utilizando una método basado en citometría de flujo, tal como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), un método explicado más abajo. La clasificación celular puede ser automática utilizando una variedad de tecnologías. Por ejemplo, puede iniciarse una o más etapas, o pueden ajustarse los parámetros de clasificación de célula, utilizando una serie de instrucciones ejecutables por computadora que residen en un medio legible por computadora, adecuado. Como un ejemplo ilustrativo, las instrucciones ejecutables por computadora pueden controlar un elemento de cambio que puede configurarse para volver el suministro de células en la medición "encendida" o "apagada".
En algunas modalidades el nivel o cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1 y/o CD3 en la superficie de células en la muestra se determina utilizando análisis a base de citometría de flujo. Tal una modalidad de un método o uso de la invención puede tomarse para definir un método para llevar a cabo citometría de flujo. El análisis a base de citometría de flujo típicamente se combina con detección óptica para identificar y clasificar las células. Esto permite tasa, selectividad/especificidad, y una naturaleza no invasiva de la téenica. Típicamente se utilizan marcadores fluorescentes, los cuales son compuestos que se unen a moléculas o estructuras específicas en la superficie o dentro de células objetivo. Tales marcadores fluorescentes se introducen en la mezcla de células, donde después la mezcla se enjuaga para remover el exceso de marcadores fluorescentes. En algunas modalidades se combina citometría de flujo con inmunofluorescencia.
Inmunofluorescencia generalmente se logra utilizando un ligando como se describe arriba, que se enlaza a, o incluye, un fluoróforo como un marcador detectable (supra). Citometría de flujo es una técnica para contar, examinar, y clasificar partículas microscópicas tales como células biológicas suspendidas en una corriente de fluido.
Permite un análisis multiparamétrico simultáneo de las características físicas y químicas de células únicas que fluyen a través de un dispositivo de detección óptico o electrónico. Un ejemplo ilustrativo de un análisis a base de citometría de flujo bien establecido en la materia es FACS. FACS permite la clasificación de una mezcla heterogénea de células en una pluralidad de recipientes, una célula en un momento, en base a la difusión específica de luz y características fluorescentes de cada célula. Así FACS permite la clasificación de subpoblaciones de células de interés y su uso adicional en ensayos in vi tro e in vivo. FACS con frecuencia se utiliza en combinación con inmunoglobulinas monoclonales como un reactivo para detectar células como teniendo un antígeno particular, indicativo de una proteína expresada (supra).
Esta téenica permite la grabación rápida concurrente, objetiva y cuantitativa de señales fluorescentes de células individuales y la separación física de células respectivas de acuerdo a un interés particular. Las señales fluorescentes utilizadas en citometría de flujo, por ejemplo cuando se cuantifican y/o clasifican células por cualquier marcador presente sobre o en la célula, típicamente son preparaciones de anticuerpo fluorescentemente marcadas o ligandos fluorescentemente marcados para unirse a anticuerpos u otro agente específico de antígeno, epítopo o ligando, tal como con sistemas de unión de biotin/avidina o perlas fluorescentemente marcadas y opcionalmente dirigibles (e.g. microesferas LUMINEX®). Dependiendo del equipo utilizado, cualquier marcador detectable deseado o combinación de marcadores detectables puede detectarse por las ópticas y/o electrónicas de un citómetro de flujo. Las máquinas FACS, "multidimensionales", de tres láseres actuales, permiten hasta 14 mediciones de célula única simultáneas, tales como detectores difusores de luz y 12 detectores de fluorescencia más avanzados permitiendo, por ejemplo, la detección de marcadores de superficie/intracelulares fluorescentes. Como un ejemplo ilustrativo, los tres láseres de una máquina FACS puede ser un láser de criptón que opera a 407 nm, un láser de argón que opera a 488 nm, y un láser de tintura que opera a 595 nm.
La téenica FACS se ha utilizado extensivamente en relación con los antígenos expresados en la superficie de las células, incluyendo las células que permanecen vivas durante, y después de, FACS. De manera similar, el método se ha utilizado con sistemas de gen de reporte intracelular en base a la expresión de un producto genético detectablemente marcado por la célula. De acuerdo con lo anterior, la técnica no solamente permite la detección de la presencia de e.g. CD62L, PSGL-1, LFA-1, CD4 o CD8 sobre la superficie celular, sino que también detecta la presencia de ARN o ADN dentro de la célula, por ejemplo ARN que codifica CD62L, PSGL-l y CD3 o CD4 (ver abajo). Por lo tanto FACS también pueden utilizarse para determinar la cantidad de formación de ácido nucleico del gen SELL, que codifica CD62L, en células, tales como células T, incluyendo células T CD4+ o células T CD8+, de la muestra del sujeto.
En algunas modalidades la determinación de la cantidad de CD62L, PSGL-l, LFA-1, CD3, CD4 y/o CD8 en la superficie de células en la muestra se lleva a cabo al determinar la cantidad de CD62L, PSGL-l, LFA-1, CD4 y/o CD8 que es accesible en la muestra. Tal un método puede tomarse por ser un método para determinar CD62L, PSGL-l, LFA-1, CD3, CD4 y/o CD8 extracelular en la muestra. En modalidades donde las células tales como células T se inmovilizan en una superficie, por ejemplo utilizando un reactivo de captura como se detalla arriba, antes de la determinación de la cantidad de e.g. CD62L, PSGL-l, LFA-1 y/o CD3, cualquier LFA-1, PSGL-l, CD62L y/o CD3 soluble, es decir, LFA-1, PSGL-l, CD62L y/o CD3 que no se inmoviliza en la superficie de una célula, puede removerse fácilmente, por ejemplo por medio de enjuague. En tales modalidades por lo tanto solamente CD62L, PSGL-l, LFA-1 y/o CD3 en la superficie de células se está determinando. Un ejemplo ilustrativo de una téenica adecuada en este sentido es un ensayo de radiomarca tal como un Radioinmunoensayo (RIA) o un inmunoensayo de enzima tal como un Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA). Mientras un RIA se basa en la medición de radioactividad asociada con un compuesto formado entre una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina y un antígeno, un ELISA se basa en la medición de una reacción enzimática asociada con un compuesto formado entre una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina y un antígeno. Típicamente un ensayo de radiomarca o un inmunoensayo de enzima incluye una o más etapas de separación en las cuales un ligando de e.g. CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3 que no ha formado un compuesto con CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3 se está removiendo, dejando así solamente ligando de CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3 detrás, el cual ha formado un compuesto con CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3. Esto permite la generación de señales específicas que se originan de la presencia de CD62L, PSGL-1, LFA-1 o CD3.
Una prueba ELISA o RIA puede ser competitiva para medir la cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1, CD3, CD4 y/o CD8, es decir, la cantidad de antígeno. Por ejemplo, un antígeno marcado con enzima se mezcla con una muestra de prueba que contiene antígeno, que compite por una cantidad limitada de inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. El antígeno reaccionado (unido) se separa entonces del material libre, y su actividad enzimática se estima por adición de sustrato. Un método alternativo para medición de antígeno es la téenica de sándwich doble de inmunoglobulina/molécula de unión proteinácea. En esta modificación se reviste una fase sólida con inmunoglobulina específica o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. Esto se reacciona entonces con la muestra del sujeto que contiene el antígeno. Se agrega entonces la inmunoglobulina específica marcada con enzima/molécula de unión proteinácea, seguido por el sustrato de enzima. El 'antígeno' en la muestra de prueba se 'captura' así e inmoviliza en la fase sólida sensibilizada donde por sí mismo inmoviliza entonces la inmunoglobulina marcada con enzima/molécula de unión proteinácea. Esta técnica es análoga a los ensayos inmunoradiométricos.
En un método ELISA indirecto, un antígeno se inmoviliza por absorción pasiva sobre la fase sólida. Un suero de prueba puede entonces incubarse con la fase sólida y cualquier inmunoglobulina en el suero de prueba forma un compuesto con el antígeno en la fase sólida. Similarmente una solución de una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina puede incubarse con la fase sólida para permitir la formación de un compuesto entre el antígeno en la fase sólida y la molécula de unión proteinácea. Después de enjuagar para remover componentes de suero sin reaccionar, una inmunoglobulina o molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina, enlazada a una enzima, se contacta con la fase sólida y se incuba. Donde se selecciona el segundo reactivo por ser una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina, se utiliza una molécula de unión proteinácea respectiva que se une específicamente a la molécula de unión proteinácea o la inmunoglobulina dirigida contra el antígeno. Se forma un compuesto de la segunda molécula de unión proteinácea o inmunoglobulina y la primer molécula de unión proteinácea o inmunoglobulina, unida al antígeno. El enjuagar de nuevo remueve material sin reaccionar. En el caso de RIA se están detectando las señales de radioactividad. En el caso de ELISA se agrega el sustrato de enzima. Su cambio de color será una medición de la cantidad del compuesto inmovilizado incluyendo el antígeno, que es proporcional al nivel de anticuerpo en la muestra de prueba.
En otra modalidad la inmunoglobulina o la molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina puede inmovilizarse sobre una superficie, tal como la superficie de una perla de polímero (supra), o revestirse sobre la superficie de un dispositivo tal como una placa de polímero o una placa de vidrio. Como un resultado, los compuestos inmunes pueden separarse fácilmente de otros componentes presentes al enjuagar simplemente la superficie, e.g. las perlas o placa. Este es el método más común actualmente utilizado en la materia y se refiere como ELISA o RIA de fase sólida. Esta modalidad puede ser particularmente útil para determinar la cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1, CD4 y/o CD8 en la superficie de células (cf. véase también arriba). En una base general, en cualquier modalidad de un ensayo de radiomarca o de una absorción pasiva de inmunoensayo de enzima a la fase sólida puede utilizarse en la primer etapa. La absorción de otros reactivos puede prevenirse por inclusión de agentes humectantes en todos los enjuagues y etapas de incubación posteriores. Puede ser ventajoso realizar el enjuague para prevenir el mantenimiento de reactivos de una etapa a la siguiente.
Varias otras modificaciones de ELISA se han utilizado en la materia. Por ejemplo, un sistema donde la segunda molécula de unión proteinácea o inmunoglobulina utilizada en el método de sándwich de anticuerpo doble es de una especie diferente, y esta se reacciona entonces con un conjugado de enzima de anti-inmunoglobulina o un conjugado de enzima de anti-molécula de unión proteinácea. Esta téenica viene con la ventaja potencial de que evita el marcado de la inmunoglobulina específica o molécula de unión proteinácea, que puede estar en suministro corto y de baja potencia. Esta misma técnica puede utilizarse para ensayar inmunoglobulina o molécula de unión proteinácea donde solamente está disponible un antígeno impuro; los antígenos reactivos específicos se selecciona por el anticuerpo inmovilizado en la fase sólida.
En otro ejemplo de un ensayo ELISA para un antígeno, una superficie, un antígeno específico se inmoviliza en una superficie, e.g. una placa utilizada, y la superficie se incuba entonces con una mezcla de inmunoglobulinas o moléculas de unión proteínicas de referencia y una muestra de prueba. Si no existen antígeno en la muestra de prueba la inmunoglobulina o molécula de unión proteinácea de referencia se fija a una superficie sensibilizada con antígeno. Si existen antígeno en la solución de prueba este se combina con la inmunoglobulina o molécula de unión proteinácea de referencia, que no pueden reaccionar con la fase sólida sensibilizada. La cantidad de inmunoglobulina/molécula de unión proteinácea anexa se indica entonces por un conjugado de molécula marcada con enzima de anti-globulina/anti-unión y sustrato de enzima. La cantidad de inhibición de degradación de sustrato en la muestra de prueba (en comparación con el sistema de referencia) es proporcional a la cantidad de antígeno en el sistema de prueba.
Aún una téenica adicional que también puede llevarse a cabo para cuantificar y de esta manera determinar la cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1, CD3, CD4 y/o CD8 en la superficie de células en la muestra es Microscopía de Fluorescencia, incluyendo Microscopía de Fluorescencia de Proporción. Microscopía de fluorescencia se ha utilizado por largo tiempo como un anexo descriptivo a teenicas bioquímicas cuantitativas en estudios de organización celular y fisiología. A finales de los 10 ' s, los detectores de formación de imágenes sensibles se vuelven comercialmente disponibles y dan a la microscopía de fluorescencia el potencial para ser una herramienta cuantitativa. Sin embargo, debido al costo prohibitivo y sofisticación de las computadoras de procesamiento de imágenes de alta tasa, se limitó generalmente la microscopía de fluorescencia cuantitativa a relativamente pocos laboratorios con un interés específico en "microscopía de formación de imágenes digitales". Esta situación ha cambiado en los últimos 10 años con la revolución en tecnología digital. Las computadoras personas económicas ahora son capaces de tareas que alguna vez requirieron computadoras con estructura grande.
Los sistemas de formación de imágenes ópticas integrados están comercialmente disponibles, que son capaces de procesar un ensayo completo de la preparación biológica para los datos finales. En paralelo, las mejoras significativas se han hecho en elementos ópticos y hardware de formación de imágenes. Se han introducido los indicadores fluorescentes sensibles de una variedad de propiedades fisiológicamente importantes, y continuamente se están desarrollando nuevos reactivos fluorescentes para caracterizar sensible y específicamente la distribución intracelular de proteínas, nucleótidos, iones, y lípidos.
Ya que una microscopía cuantitativa se vuelve más ampliamente disponible, un usuario nuevo en cuanto a microscopía de fluorescencia debe estar atento a los factores que pueden complicar la cuantificación de fluorescencia. La cantidad de fluorescencia detectada se afecta por las propiedades de fuentes de iluminación, las propiedades ópticas y espectroscópicas del microscopio, y las propiedades de resolución, sensibilidad, y señal a ruido del detector. Las emisiones de fluorescencia se atenúan por el fotoblanqueado que acompaña la iluminación. A altas concentraciones de fluoróforo, las interacciones entre porciones de fluoróforo pueden alterar la cantidad y/o espectro de emisiones de fluorescencia. Para ciertos fluoróforos, la fluorescencia también es sensible al ambiente físico inmediato (es decir, por ejemplo, composición iónica) del fluoróforo.
En microscopía de fluorescencia de proporción se recolectan dos imágenes de fluorescencia y el parámetro de interés se cuantifica como una proporción de la fluorescencia en una imagen a aquella en la otra imagen. Un ejemplo ilustrativo de un indicador de ión fluorescente de proporción incluye, pero no se limita a, fluoresceína y fura-2, los espectros de excitación de los cuales cambian la forma en la unión de protones o iones de calcio, respectivamente. En el caso de fluoresceína, fluorescencia excitada por luz de 490 nm se templa eficientemente por unión de protón, mientras la fluorescencia excitada por luz de 450 nm no se afectó relativamente. Aunque la cantidad de fluorescencia por fluoresceína emitida por un volumen cuando se excita con luz de 490 nm depende del pH de ese volumen, también se afecta por otros factores, incluyendo la concentración de fluoresceína en el volumen. Sin embargo, la proporción de fluorescencia excitada por luz de 90 nm a aquella excitada por 450 nm depende de pH, pero es relativamente independiente de muchas variables que afectan la cuantificación en imágenes de longitud de onda únicas: concentración de fluoróforo, fotoblanqueado, heterogeneidad lateral en iluminación y sensibilidad del detector; y diferencias en la longitud de trayectoria óptica. La variación espectroscópica en iluminación y detección se eluye al calibrar el sistema microscópico con estándares de pH conocidos.
Las imágenes de proporción de fluorescencia pueden recolectarse al excitar secuencialmente la muestra con dos longitudes de onda de luz diferentes y recolectar secuencialmente dos imágenes diferentes, al excitar la muestra con una longitud de onda de luz única y recolectar las imágenes formadas de luz de dos longitudes de onda de emisión diferentes, o al excitar la muestra con dos longitudes de onda y recolectar emisiones de dos longitudes de onda. Los indicadores de ión se han desarrollado tanto para microscopía de proporción por excitación (es decir, por ejemplo, fura-2 para calcio y fluoresceína para pH) como para microscopía de proporción por emisión (es decir, por ejemplo, indo-l para calcio y SNARF para pH).
Una téenica adicional adecuada para determinar la cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1, CD3, CD4 y/o CD8 en la superficie de células es transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET). En FRET una molécula donadora fluorescente excitada, en lugar de emitir luz, transfiere esa energía a través de una interacción de dipolo-dipolo a una molécula aceptadora en proximidad. Si la aceptadora es fluorescente, entonces la disminución en fluorescencia de donador debida a FRET se acompaña por un incremento en fluorescencia aceptadora (es decir, por ejemplo, emisión sensibilizada). De esta manera en la excitación del fluoróforo donador, un excitón, que es una emisión de energía de menos radiación, se trasfiere de un fluoróforo al otro. Como un resultado, el fluoróforo aceptador emite luz que se cambia a rojo en comparación con la luz que se emitiría del fluoróforo aceptador. La cantidad de FRET depende fuertemente de la distancia, típicamente disminuyendo como la sexta energía de la distancia, de manera que los fluoróforos pueden reportar directamente en el fenómeno que ocurre en la escala de unos pocos nanómetros, bien por debajo de la resolución de microscopios ópticos. Entre otros propósitos, FRET se ha utilizado para trazar distancias y estudiar los estados de reunión, dinámicas de membrana, o hibridación de ADN.
En principio, las mediciones de FRET pueden proporcionar información acerca de cualquier sistema, los componentes del cual pueden manipularse para cambiar la proximidad de donadores y aceptores en la escala de unos pocos nanómetros. En la práctica, la habilidad de marcar un sistema de interés con donadores y aceptores apropiados se limita por varios factores médicos e instrumentales. Además del requerimiento de que el donador y aceptador estén en proximidad, el espectro de emisión del donador y absorción del aceptador debería sobreponerse significativamente con sobreposición mínima de los espectros de excitación directa de los dos fluoróforos. Las diferencias instrumentales entre un microscopio de fluorescencia y un espectrofluorómetro, es decir, confinación espacial de la señal, sensibilidad reducida, y selección de longitud de onda generalmente limitada, afectan toda la calidad y cantidad de información que puede extraerse de un experimento FRET utilizando un microscopio. El uso de FRET en su encarnación tradicional como una regla molecular para medir las distancias absolutas con frecuencia no es factible en el microscopio de fluorescencia. Preferentemente, la microscopía de formación de imágenes de proporción FRET con frecuencia se utiliza como un indicador de proximidad, sujeta a algún grado de calibración El planteamiento experimental más simple es excitar el donador y medir tanto la emisión de donador directa "DD" como la emisión sensibilizada "DA" del aceptador (la primer letra representa las especies que se están excitando, y la segunda letra representa la emisión observada). La proporción de fluorescencia de aceptador a donador, DA/DD, varía entre dos extremos: no transferencia de energía y transferencia de energía máxima. Cuando el donador y aceptador están suficientemente distantes, ocurre no transferencia de energía y la fluorescencia de donador (DD) está en su máximo, mientras la emisión sensibilizada es cero. Los resultados de fluorescencia de aceptador solamente de excitación directa del aceptador, y DA/DD está en su mínimo. La mayor cantidad de transferencia de energía ocurre cuando el donador y aceptador se separan por la distancia más corta posible, y los donadores excitados pierden la mayoría de su energía al aceptador.
La cuantificación completa de FRET puede incluir cálculos significativos, pero, una estimación de FRET puede obtenerse fácilmente al medir la intensidad en dos puntos de tiempo fijos y tomando la proporción de estas intensidades.
Para cuantificar la cantidad relativa de un aceptador, el aceptador también puede excitarse directamente con la longitud de onda ideal para fluorescencia de aceptador, de manera que "AA" se registra en lugar de DA. Con AA utilizada como la referencia, la proporción DD/AA también puede utilizarse como una medición de FRET. La medición de AA generalmente no afecta la medición de DD debido a que las longitudes de onda de excitación del aceptador siempre son más largas (energía inferior) que las longitudes de onda de excitación del donador, evitando así el fotoblanqueado del donador.
Aunque el fotoblanqueado usualmente debe minimizarse, en algunos casos puede actualmente explotarse para medir FRET. El fotoblanqueado del donador usualmente ocurre cuando está en el estado excitado: antes de que ocurra la emisión de fluorescencia existe alguna probabilidad de que el fotoblanqueado removerá ese fluoróforo del estado excitado, y también de ciclos de emisión de excitación futuros. Cuando ocurre FRET, el donador se remueve del estado excitado antes de la emisión o fotoblanqueado, y la tasa de blanqueado disminuye debido a que el donador permanece disponible para otro ciclo de emisión de excitación. La eficiencia de FRET puede determinarse de la tasa de blanqueado de fluorescencia de donador en la presencia de aceptador en comparación con la tasa de blanqueado del donador en la ausencia del aceptador. Experimentalmente, la intensidad instantánea, I(t), se normaliza a la intensidad inicial 1(0) y se analiza la disminución de intensidad de fluorescencia. Una ventaja principal del método de fotoblanqueado es que utiliza solamente una longitud de onda de excitación única y solamente una longitud de onda de emisión única. La tasa de blanqueado del donador en la ausencia de aceptador deberla medirse bajo condiciones experimentales idénticas a aquellas del par donador -aceptador, debido a que las tasas de blanqueado pueden variar significativamente para diferentes ambientes intracelulares.
Si (i) la cantidad de FRET es relativamente pequeña; (ii) el aceptador no es fluorescente; o (iii) el fotoblanqueado rápido evita la medición de intensidades de fluorescencia estáticas, un método de fotoblanqueado puede proporcionar la única medición práctica de FRET. En particular, el método de fotoblanqueado debe ser útil con altas intensidades de iluminación típicas con láseres utilizados para microscopía confocal.
Cuantificación y Capacidad de Comparación de Niveles de Biomarcador Determinar el nivel o cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1, CD4, CD8 y/o CD3 en la muestra típicamente incluye la formación de señales, e.g. señales generadas por un marcador detectable (supra) que puede cuantif icarse. La cuantificación de las señales para determinar el nivel de e.g. CD62L, PSGL-1, CD3 y/o LFA-1 en la muestra puede llevarse a cabo al comparar señales obtenidas con aquellas de una o más mediciones de referencia. Como será aparente de lo anterior, la palabra "comparar" como se utiliza en la presente se refiere a una comparación de parámetros o valores en términos de cantidades/niveles absolutos que corresponden entre sí. Como un ejemplo, un número de células se compara con un número de referencia de células, una concentración se compara con una concentración de referencia, o una intensidad de señal obtenida de una muestra de prueba se compara con la intensidad de un tipo de señal correspondiente obtenida en una muestra de referencia. Una medición de referencia respectiva puede basarse en la señal generada por una cantidad conocida de CD62L, PSGL-1, LFA-1 y/o CD3. Tal una cantidad conocida de CD62L, PSGL-1, LFA-1 y/o CD3, por ejemplo, puede estar presente en una muestra con una composición que se parece a la muestra del sujeto, en la cual está por determinarse la cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1 y/o CD3. Puede tomarse una muestra de referencia respectiva para definir una muestra de referencia externa. En algunas modalidades de un método de la invención una muestra de referencia interna puede utilizarse además o alternativamente. Tal una muestra de referencia interna es una muestra obtenida del sujeto en un punto previo de tiempo. La cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1 y/o CD3 en tal una muestra puede determinarse para identificar los cambios en los niveles de CD62L, PSGL-1, LFA-1 y/o CD3 en el sujeto. En algunas modalidades el nivel o cantidad de CD62L, PSGL-1, LFA-1 y CD3, respectivamente, en la muestra puede normalizarse por una comparación con el nivel de una o más otras proteínas, típicamente proteínas de superficie celular que se conocen en la materia por expresarse de manera estable. En algunas modalidades una téenica para determinar el número, cantidad o proporción de células T que tienen e.g. CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en su superficie incluye calibrar el equipo de análisis. En modalidades donde se utiliza la citometría de flujo, una muestra de glóbulos rojos estandarizada, por ejemplo, puede utilizarse tal como las Células de Control IMMUNO-TROL® comercialmente disponibles de Beckman Coulter Inc . (Fullerton, CA, USA, order No. 6607077).
En algunas modalidades de un método o uso de la invención la cantidad o nivel de células T que tienen tanto CD62L como CD3 determinadas en la muestra, puede compararse con un valor umbral. En algunas modalidades del método de la invención la cantidad o nivel de células T que tienen tanto LFA-1 como CD3 determinadas en la muestra puede compararse con un valor umbral. En algunas modalidades la cantidad/nivel de células T que tienen tanto PSGL-1 como CD3 determinadas en la muestra puede compararse con un valor umbral. En algunas modalidades la cantidad de células T que tienen PSGL-1, CD62L y CD3 determinadas en la muestra puede compararse con un valor umbral PSGL-1. En algunas modalidades la cantidad de células T que tienen PSGL-1, CD62L, LFA-1 y CD3 determinadas en la muestra puede compararse con un valor umbral PSGL-1. En algunas modalidades la cantidad o nivel de células T que tienen CD62L, LFA-1 y CD3 determinadas en la muestra puede compararse con un valor umbral. En algunas modalidades la proporción de células T que tienen CD62L y/o LFA-1 y CD3 a células T que tienen solamente CD3, pero no CD62L y/o LFA-1, pueden determinarse en la muestra y compararse con un proporción umbral. En algunas modalidades la proporción de células T que tienen tanto CD62L como CD3 o tanto LFA-1 como CD3 para todas las células T que tienen CD3 pueden determinarse en la muestra y compararse con un proporción umbral. En algunas modalidades la proporción de células T que tienen CD62L, LFA-1 y CD3 determinadas en la muestra puede compararse con un valor umbral. En algunas modalidades la cantidad o nivel de células T que tienen CD62L y/o PSGL-1, así como CD3 determinadas en la muestra puede compararse con un valor umbral. En algunas modalidades la proporción de células T que tienen CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 y CD3 a células T que tienen solamente CD3, pero no CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1, puede determinarse en la muestra y puede compararse con un proporción umbral. En algunas modalidades la proporción de células T que tienen tanto PSGL-1 como CD3 para todas las células T que tienen CD3 puede determinarse en la muestra y compararse con un proporción umbral. En algunas modalidades la proporción de células T que tienen CD62L, PSGL-1, LFA-1 y CD3 determinadas en la muestra puede compararse con un valor umbral.
Un valor umbral respectivo en algunas modalidades puede ser un valor umbral predeterminado. En algunas modalidades el valor umbral se basa en la cantidad de células que tienen tanto CD62L como CD3 en una muestra de control o tanto LFA-1 como CD3 en una muestra de control. Del mismo modo, tal un valor umbral se basa en la cantidad de células que tienen tanto PSGL-1 como CD3 en una muestra de control o tanto PSGL-1 como CD3 en una muestra de control. Como es aplicable, en algunas modalidades el valor umbral se basa en la cantidad de células que tienen CD62L, PSGL-1, LFA-1 y CD3 en una muestra de control. En algunas modalidades el valor umbral es una proporción umbral en base a la proporción de células que tienen tanto CD62L y/o LFA-1 como CD3 a células T que tienen solamente CD3, pero no CD62L y/o no LFA-1, o a todas las células T que tienen CD3 en una muestra de control. En algunas modalidades el valor umbral es una proporción umbral en base a la proporción de células que tienen tanto PSGL-l como CD3 a células T que tienen solamente CD3, pero no PSGL-1, o a todas las células T que tienen CD3 en una muestra de control. Una muestra de control respectiva puede tener cualquier condición que varía de la medición principal de muestra por sí misma. Tal una muestra de control puede ser una muestra de, incluye o esencialmente consiste del fluido corporal correspondiente como la muestra del sujeto. Una muestra de control, por ejemplo, puede ser una muestra, tal como una muestra sanguínea, una muestra de plasma, una muestra de suero o una muestra de fluido cerebroespinal (licor), de un sujeto conocido por no padecer PML o de aspectos de una enfermedad inducida por JCV. En algunas modalidades una muestra de control respectiva es de un sujeto que coincide en edad. En algunas modalidades una muestra de control respectiva es de un sujeto conocido por no tener una enfermedad confusa, en algunas modalidades de un sujeto conocido por no tener ya sea V1H/SIDA o PML, o de un sujeto conocido por padecer MS, según sea aplicable, y en algunas modalidades de un sujeto conocido por no tener una enfermedad. Como puede tomarse de la Fig. ID y Fig.3A, tanto la infección de V1H como tratamiento con Natalizumab generalmente se asocian con una expresión reducida de CD62L en células T, sin que tenga lugar la ocurrencia de PML. Por lo tanto, en algunas modalidades puede ser deseable seleccionar una muestra de control como originándose de un sujeto conocido por no padecer PML, pero por estar bajo terapia con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 tal como Natalizumab o que padece infección de V1H, según sea aplicable. Como puede tomarse además de Fig. 3B, tanto infección de V1H como tratamiento con Natalizumab en algunos casos pueden asociarse con una exposición, posiblemente ligeramente, incrementada de PSGL-1 en células T, sin tener lugar ocurrencia de PML. En algunas modalidades por lo tanto puede ser deseable seleccionar una muestra de control como originándose de un sujeto conocido por no padecer PML, pero por estar bajo terapia con un agente bloqueador de ot4-integrina/VLA-4 tal como Natalizumab o que padece infección de VIH, según sea aplicable.
En algunas modalidades un valor umbral se basa en un valor de referencia o control obtenido concomitantemente con el valor de la muestra del sujeto. En algunas modalidades un valor de referencia o control respectivo se determina a un punto diferente en el tiempo, por ejemplo se lleva a cabo en un punto en el tiempo anterior a la medición de la muestra del sujeto. Debe entenderse que los términos control y referencia en algunas modalidades puede ser un rango de valores.
Los estudios de población también pueden utilizarse para seleccionar un valor umbral. La Característica Operativa del Receptor ( "ROC") surgió del campo de teoría de detección de señal desarrollada durante la Segunda Guerra Mundial para el análisis de imágenes de radar, y análisis ROC con frecuencia se utiliza para seleccionar un umbral capaz de distinguir mejor una subpoblación enferma de una subpoblación no enferma. Un falso positivo en este caso ocurre cuando una persona se prueba positiva, pero en realidad no tiene la enfermedad. Un falso negativo, por otro lado, ocurre cuando la persona se prueba negativa, sugiriendo que la persona es saludable, cuando en realidad tiene la enfermedad. Para dibujar la curva ROC, se determinan la tasa positiva verdadera (TPR) y tasa positiva falsa (FPR) ya que el umbral de decisión se varía continuamente. Ya que TPR es equivalente con sensibilidad y FPR es igual a 1 -especificidad, la gráfica ROC algunas veces se llama la sensibilidad vs (1 - especificidad) gráfico. Una prueba perfecta tendrá un área bajo la curva ROC de 1.0; una prueba aleatoria tendrá un área de 0.5. Un umbral se selecciona para proporcionar un nivel aceptable de especificidad y sensibilidad.
Además de las comparaciones de umbral, otros métodos para correlacionar los resultados de ensayo con una clasificación de paciente (ocurrencia o no ocurrencia de enfermedad, probabilidad de un resultado, etc.) incluyen árboles de decisión, conjuntos de regla, métodos Bayesianos, y métodos de red neural. Estos métodos pueden producir valores de probabilidad que representan el grado al cual un sujeto pertenece a una clasificación fuera de una pluralidad de clasificaciones.
La comparación con un valor umbral, que puede ser un valor umbral predeterminado, puede llevarse a cabo manualmente, semi-automáticamente o en una manera completamente automática. En algunas modalidades la comparación puede auxiliarse por computadora. Una comparación auxiliada por computadora puede emplear valores almacenados en una base de datos como una referencia para comparar un valor obtenido o una cantidad determinada, por ejemplo a través de un algoritmo implementado por computadora. Del mismo modo, la comparación con una medición de referencia puede llevarse a cabo manualmente, semi-automáticamente o en una manera completamente automática, incluyendo en una manera auxiliada por computadora. Una comparación auxiliada por computadora puede basarse en el almacenamiento de datos, por ejemplo en conexión con la determinación de un valor umbral, en el uso de medios legibles por computadora. Los medios legibles por computadora adecuados pueden incluir memoria volátil, e.g. RAM, y/o no volátil, e.g. ROM y/o disco, memoria, ondas portadoras y medios de transmisión tales como alambre de cobre, cable coaxial, medio de fibra óptica. Las ondas portadoras ejemplificativas pueden tomar la forma de señales eléctricas, electromagnéticas u ópticas que transmiten corrientes de datos digitales a lo largo de una red local o una red públicamente accesible tal como Internet.
El nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 determinado en o de una muestra de un sujeto puede expresarse en términos de números celulares, es decir, el número de células T que son positivas para CD62L, para PSGL-1 y/o para LFA-1. El nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 también puede expresarse en términos de la cantidad total de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en una muestra. Como se explica arriba, donde se emplea la inmovilización de células sobre una superficie, por ejemplo un ligando inmovilizado específico para células T, la cantidad total de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 presente en las células respectivas puede utilizarse para expresar la cantidad total de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1. En algunas modalidades puede esperarse que se incluya un alto nivel de CD62L en la muestra de un paciente. CD62L soluble, es decir, CD62L que no se inmoviliza en una superficie celular, se origina, por ejemplo, de granulocitos. En tales modalidades puede ser ventajoso distinguir CD62L soluble y CD62L presente en la superficie de células o remover CD62L soluble antes de detectar CD62L en el método de detección. Si se esperan altos niveles de CD62L soluble en una muestra, puede probarse fácilmente, por ejemplo, al medir un valor único de la muestra con y/sin inmovilizar células T y posteriormente enjuagar las mismas. Una diferencia significativa de los valores obtenidos indica una alta cantidad de CD62L soluble en la muestra. El término "significativa" se utiliza para indicar que el nivel de disminución o incremento es de relevancia estadística, y típicamente significa una desviación de un valor con relación a otro valor de aproximadamente 2 veces o más, incluyendo 3 veces o más, tal como al menos aproximadamente 5 a aproximadamente 10 veces o incluso más.
El nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 determinado en o de una muestra de un sujeto puede compararse con una muestra de control única o una pluralidad de muestras de control, tal como una muestra de un sujeto de control, en cualquier manera adecuada. Como un ejemplo ilustrativo, el nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en una muestra de control puede caracterizarse por un valor promedio (medio) acoplado con un valor de desviación estándar, por ejemplo a un punto de tiempo dado. En algunas modalidades el nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en un sujeto puede considerarse diferente cuando es una desviación estándar o más alta o inferior al valor promedio del nivel de expresión correspondiente determinado en una o más muestras de control.
En algunas modalidades el nivel de expresión determinado de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 se considera como diferente donde el valor obtenido es aproximadamente 1.5 desviaciones estándar más alta o inferior, incluyendo aproximadamente dos, aproximadamente tres, aproximadamente cuatro o más desviaciones estándar más altas o inferiores al valor promedio determinado en una muestra de control. En algunas modalidades el nivel de expresión determinado de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 se considera como diferente donde el valor obtenido es aproximadamente 1.2 veces o más alta o inferior, incluyendo aproximadamente 1.5 veces, aproximadamente dos veces, aproximadamente 2.5 veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente 3.5 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces o más alta o inferior al nivel de expresión determinado en una muestra de control. En algunas modalidades el nivel de expresión determinado de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 se considera como diferente donde el valor obtenido es aproximadamente 0.8 veces o menor al nivel de expresión determinadas en una muestra de control. El nivel de expresión determinado de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1, por ejemplo, puede considerarse como diferente si un valor es aproximadamente 70%, tal como aproximadamente 60% o aproximadamente 50% inferior al nivel de expresión determinado en una muestra de control. En algunas modalidades un nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 se considera como diferente si el valor obtenido es aproximadamente 40%, incluyendo aproximadamente 30% inferior al nivel de expresión determinado en una muestra de control. Un nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en algunas modalidades se considera como diferente si el valor obtenido es aproximadamente 25%, tal como aproximadamente 20% o inferior al nivel de expresión determinado en una muestra de control.
Un valor umbral predeterminado en algunas modalidades puede fijarse sobre la base de datos recolectada de uno o más sujetos conocidos por no padecer y no estar en riesgo elevado de PML o de aspectos de una enfermedad inducida por JCV. En algunas modalidades un cierto percentil de tales datos puede utilizarse como un valor umbral. El rango de los valores de un conjunto de datos obtenido de tales individuos puede dividirse en 100 partes iguales, es decir, pueden determinarse porcentajes del rango. Un percentil representa el valor dentro del rango respectivo bajo el cual cae un cierto por ciento de los datos, en otras palabras el porcentaje de los valores que son más pequeños que ese valor. Por ejemplo 95to percentil es el valor por debajo del cual se encuentra el 95 por ciento de los datos. En algunas modalidades un nivel de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 puede considerarse como disminuido o bajo si está por debajo del 90mo percentil, por debajo del 80mo percentil, por debajo del 70mo percentil, por debajo del 60mo percentil, por debajo del 5Orno percentil o por debajo del 4Orno percentil.
Al evaluar el riesgo de ocurrencia de una enfermedad inducida por JCV tal como PML, en algunas modalidades una cantidad reducida de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 relativa a un valor umbral, indica un riesgo elevado de ocurrencia de una enfermedad inducida por JCV, típicamente PML, en un sujeto. Una cantidad de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 que no está por debajo de un valor umbral o que está arriba de un valor umbral indica que no existen riesgo elevado de ocurrencia de PML en el sujeto. Un nivel de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 por debajo de un valor umbral puede indicar una condición donde el sujeto se encuentra con necesidad de terapia o con necesidad de un cambio de una terapia a la cual se expone el sujeto. Si se detecta que un nivel de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 está arriba de, posiblemente predeterminado, valor umbral, esto puede indicar que no ha ocurrido PML, así como que el riesgo de ocurrencia de PML es bajo. Del mismo modo, un nivel de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 que es aproximadamente el mismo que un valor umbral puede indicar que no ha ocurrido PML, así como que el riesgo de ocurrencia de PML no es elevado cuando se compara con otros sujetos en un estado de enfermedad similar. El riesgo que el sujeto pueda padecer PML puede ser bajo.
Mediciones Repetidas y Monitoreo de Niveles de Biomarcador En algunas modalidades una pluralidad de mediciones se lleva a cabo en una pluralidad de muestras del mismo paciente. En cada una de la muestras se determina el nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1. Típicamente el nivel de expresión determinado en cada una de la muestras se compara con un valor umbral como se detalla arriba. En algunas modalidades la pluralidad de muestras del mismo individuo se toma durante un periodo de tiempo a ciertos intervalos de tiempo, incluyendo a intervalos de tiempo predeterminados. Tal una modalidad puede tomarse como un método para monitorear la expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1. Las muestras coincidentes en algunas modalidades pueden utilizarse para determinar un valor umbral para cada punto de tiempo correspondiente. El valor promedio puede determinarse y calcularse la desviación estándar para cada punto de tiempo dado. Un valor determinado en la muestra del sujeto que cae fuera de la desviación estándar promedio más 1 puede ser indicativa de un riesgo incrementado de ocurrencia de una enfermedad inducida por JCV tal como PML.
En algunas modalidades, un método de la invención incluye monitorear el riesgo de ocurrencia de una enfermedad inducida por JCV tal como PML de un sujeto que padece V1H o una enfermedad autoinmune, y bajo tratamiento con un agente bloqueador de cc4-integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4, o con una terapia anti- retroviral, según sea aplicable. En el método se determinan niveles de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 y el(los) resultado(s) se correlacion (n) con la probabilidad de ocurrencia o no ocurrencia de una enfermedad inducida por JCV, típicamente PML, en el sujeto. Como se explica arriba, la(s) concentración(s) medid (s) puede(n) compararse con un valor umbral. Cuando el nivel de expresión medido está por debajo del umbral, puede asignarse un riesgo aumentado de PML al sujeto; alternativamente, cuando la concentración medida está en o arriba del umbral, puede asignarse riesgo no elevado de PML al sujeto.
En una modalidad el nivel de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 se mide a ciertos, e.g. intervalos de tiempo, predeterminados. Pueden proporcionarse las muestras del sujeto que se han obtenido en los puntos de tiempo correspondientes. Como un ejemplo ilustrativo, las muestras pueden tomarse del mismo sujeto después de un intervalo de tiempo de aproximadamente 3 meses, incluyendo aproximadamente cada mes. En algunas modalidades las muestras pueden tomarse del mismo sujeto a un intervalo de tiempo de aproximadamente 6 meses. En algunas modalidades una muestra puede tomarse del mismo sujeto después de un intervalo de tiempo de aproximadamente un año, es decir, aproximadamente 12 meses. En algunas modalidades una muestra puede tomarse del mismo sujeto después de aproximadamente 18 meses. Un valor obtenido de una muestra respectiva en algunas modalidades puede compararse con una muestra tomada del mismo sujeto en un punto previo de tiempo, por ejemplo la medición previa y/o la primer medición tomada. De esta manera puede detectarse un cambio en el nivel de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1. Las muestras coincidentes en algunas modalidades pueden utilizarse para determinar un valor umbral para cada punto de tiempo correspondiente. El valor promedio puede determinarse y calcularse la desviación estándar para cada punto de tiempo dado. Como un ejemplo ilustrativo, un valor determinado en la muestra del sujeto que cae fuera de la desviación estándar promedio más 1, por ejemplo, puede ser indicativa de la ocurrencia o del riesgo de ocurrencia de PML.
En algunas modalidades se repite una medición llevada a cabo a un cierto punto de tiempo si durante el monitoreo, es decir, medición de la cantidad de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 a ciertos intervalo de tiempos, se detecta una disminución, en particular si se detecta una disminución más allá de un valor umbral. En algunas modalidades los intervalos de tiempo después de los cuales se está determinando el nivel de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 pueden acortarse si durante el monitoreo de la cantidad de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 se ha detectado una disminución. Como un ejemplo ilustrativo, una disminución en niveles de uno o más de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 puede encontrarse a un cierto punto de tiempo durante mediciones llevada a cabo a intervalos de 12 meses o durante mediciones llevadas a cabo a intervalos de 18 meses. Después de que se ha encontrado tal una disminución en niveles, el monitoreo del nivel de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 puede continuarse a intervalos de tiempo de aproximadamente un mes. Como se indica arriba, el monitoreo de la cantidad de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 puede incluirse en el contexto de monitorear una terapia, por ejemplo para valorar la eficacia de la misma o evaluar una respuesta del sujeto a un cierto tratamiento.
En modalidades donde el sujeto se encuentra por tratarse, por ejemplo con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4, los niveles de monitoreo de expresión en algunas modalidades pueden iniciar antes del tratamiento. En algunas modalidades el monitoreo puede iniciar al mismo tiempo o a una etapa temprana del tratamiento, e.g. administración de un agente bloqueador de cc4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4.
Como se indica arriba, en algunas modalidades un método o uso de acuerdo a la presente invención incluye medir la expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en células T en una muestra u obtenida de una muestra, y comparar el resultado obtenido de la misma con un valor de referencia. En el contexto de una terapia o de infección de V1H, en algunas modalidades el detectar el nivel de células T que expresan CD62L así como monitorear el mismo comprende determinar si una o más de las siguientes indicaciones están presentes: (1) En el contexto de terapia con un agente bloqueador de a4-integrina y/o un agente bloqueador de VLA-4, puede observarse una falta de expresión de CD62L después de la administración de un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4. La falta de expresión de CD62L puede observarse en un punto de tiempo, tal como dentro de aproximadamente la primer semana. En algunas modalidades la falta de expresión de CD62L puede detectarse dentro de aproximadamente la segunda semana o dentro de aproximadamente la tercer semana. A falta de expresión de CD62L en algunas modalidades puede detectarse dentro de aproximadamente el 1er mes, dentro de aproximadamente el 2do mes, dentro de aproximadamente el 3er mes, dentro de aproximadamente el 4to, 5to, 6to, 7to, 8vo, 9no, 10mo, llvo, 12vo, 13vo, 14vo, 15vo o dentro de aproximadamente el 16vo mes. En algunas modalidades una falta de expresión de CD62L puede detectarse en el 17vo mes. En algunas modalidades la falta de expresión de CD62L puede detectarse en el 18vo mes. A falta de expresión de CD62L en algunas modalidades puede detectarse dentro del 19vo, el 20vo, 21ro, 22do, 23ro, 24to, 25to mes o más. Por ejemplo, la Fig.12 muestra que solamente podrían detectarse los niveles muy bajos de CD62L en una muestra de un sujeto quien desarrolló después PML después de 15 meses de tratamiento. (2) Un nivel de expresión diferencial de CD62L en la superficie de célula T comparado con un nivel de referencia obtenido de "sujetos de control", como se indica arriba. Una expresión diferencial en algunas modalidades se refiere a una expresión "disminuida" comparada con una referencia. En el contexto de terapia con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 los sujetos de control pueden definirse como aquellos que se someten a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 por aproximadamente un año o más, tal como aproximadamente 1.5 años o más, aproximadamente 2 años o más, o aproximadamente 3 años o más pero quienes no se han diagnosticado con PML. Las muestras a compararse en algunas modalidades se obtienen del mismo o sustancialmente el mismo punto de tiempo después del inicio del tratamiento. Por ejemplo, una muestra de 1 mes en algunas modalidades se compara con otra muestra de 1 mes. En el contexto de infección de V1H un sujeto de control puede ser un individuo de una etapa comparable de SIDA, quien se conoce por no tener PML. Se observa una expresión "diferencial" al comparar un nivel medido de expresión con un nivel correspondiente de uno o más sujetos de control. En caso de un nivel reducido de un biomarcador, como en el contexto de un nivel disminuido de CD62L, la expresión diferencial es una expresión "disminuida" en comparación con una referencia.
La expresión de CD62L en/sobre células T determinada de una muestra de un sujeto puede compararse con uno o más sujetos de control en cualquier manera adecuada. Por ejemplo, la expresión de CD62L en el sujeto de control puede caracterizarse por un valor promedio (medio) acoplado con un valor de desviación estándar a un punto de tiempo dado. La expresión de CD62L en un sujeto, por ejemplo, puede considerarse diferente cuando es más de una desviación estándar diferente del valor promedio. (3) Un número inferior de células T que expresan CD62L. Esto puede representarse mediante, por ejemplo, proporción de tales células a PBMC total, el número de células por muestra (e.g. mm3 de sangre), proporción de tales células a todas las células T, o de otra manera, como sea adecuado para tal representación. Cuando el número se representa por porcentaje de células T que expresan CD62L, un "bajo" porcentaje se define como menor a aproximadamente 10%. En algunas modalidades un bajo porcentaje se define como menor a aproximadamente 9%, tal como menor a aproximadamente 8%, tal como menor a aproximadamente 7%, 6%, 5%, 4%, o 3%. Un bajo porcentaje de células T que expresan CD62L en algunas modalidades se define como menor a aproximadamente 2%. En algunas modalidades un bajo porcentaje se define como 1% o menos, incluyendo aproximadamente 0.5%, o menos. Si se emplean otros métodos, un experto es capaz de convertir los valores aquí dados de acuerdo al método usado y conocimiento común. Si el valor observado es repetidamente bajo, por ejemplo persistentemente bajo durante un periodo de una pluralidad de meses, tal como aproximadamente 5 meses o más, probablemente el sujeto padece PML en la actualidad o en el futuro. En algunas modalidades un periodo extendido de tiempo es un periodo de 6 meses o más, tal como aproximadamente 7, 8, 9, 10, o 11 meses. En algunas modalidades un periodo extendido de tiempo es un periodo de 12 meses o más. Como un ejemplo ilustrativo, Fig.12 muestra que los niveles de CD62L en células T de sujetos quienes desarrollaron después PML fueron persistentemente bajos. (4) Una falta de "recuperación" del porcentaje de células T que expresa CD62L. El término "recuperación" se determina al comparar la cantidad o nivel obtenido con un valor umbral, que puede basarse en un nivel de referencia. Como se utiliza en la presente, "recuperación" se define como un regreso del porcentaje de células T que expresa CD62L de nuevo al rango del nivel de referencia o más alto.
El nivel de referencia para este propósito puede determinarse por varios métodos. En algunas modalidades, la referencia se obtiene del mismo sujeto en el primer mes del tratamiento de agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4. En algunas modalidades, el nivel de referencia puede ser un valor determinado de un punto anterior en el tiempo, tal como aproximadamente 3 meses atrás. En algunas modalidades el punto anterior en el tiempo puede ser 4 meses atrás, tal como aproximadamente 5 meses atrás. El punto anterior en el tiempo en algunas modalidades puede ser aproximadamente 6 meses atrás. En algunas modalidades el punto anterior en el tiempo puede ser aproximadamente 7 o aproximadamente 8 meses atrás, o nivel de referencia histórico del curso pasado de tratamiento. En algunas modalidades, el nivel de referencia se obtiene de uno o más sujetos de control, tal como aproximadamente 30 o más sujetos de control que se someten a tratamiento de agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 por más de 1 año. El nivel de referencia en algunas modalidades se obtiene de aproximadamente 40 o más sujetos de control, incluyendo aproximadamente 50 o más, aproximadamente 60 o más o aproximadamente 70 o más sujetos de control que se someten a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 por más de 1 año, tal como más de aproximadamente 1.5 años, más de aproximadamente 2 años, aproximadamente 2.5 años, aproximadamente 3 años, o más. En algunas modalidades, el nivel de referencia se mide dentro de aproximadamente el primer mes después de la primer administración del agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4.
La Fig.12 muestra los niveles de CD62L de sujetos de control recuperados (excediendo el nivel de referencia tomado en el primer mes) después de 15 meses de tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4.
En algunas modalidades, una muestra del sujeto a probarse se toma aproximadamente un mes después del tratamiento. PMBC se aísla de la muestra y se somete a una téenica de detección adecuada tal como análisis FACS. Se mide el porcentaje de células T, incluyendo células T CD4+ y/o células T CD8+, que son CD62L positivas y se compara con un nivel de referencia derivado de uno o más sujetos de control. Si el valor medido es inferior o más alto que el valor umbral, es indicativo de un riesgo incrementado para desarrollar PML.
Por ejemplo, lo siguiente indica niveles de referencia para CD62L que pueden utilizarse para fijar un valor umbral: Tabla 1: Valores de referencia ejemplificativos para CD62L para individuos que reciben Natalizumab Como un ejemplo ilustrativo, el nivel de referencia para un sujeto que ha recibido 1 mes tratamiento de Natalizumab puede ser 21%. Un nivel de expresión que es inferior a 21% puede considerarse "diferente" e indicar un riesgo de PML.
Cuando se observa una de las indicaciones anteriores, por ejemplo, cuando existen una falta de expresión de CD62L, o cuando persiste baja expresión de CD62L por un periodo extendido de tiempo, el médico debería considerar, combinado con otra información disponible, mediciones tales como detener o retener temporalmente el tratamiento, ajustar la dosificación, o realizar intercambio de plasma, hasta que el nivel de expresión aumenta o se recupera. Puede ser posible resumir el tratamiento después que se ha recuperado o incrementado el nivel de expresión de los biomarcadores en la presente invención.
Como puede tomarse de la Fig.3A y Fig. 12, los niveles de CD62L en células T tienden, con la excepción de aproximadamente los 12 meses iniciales de tratamiento del todo, a permanecer dentro de un rango relativamente estable durante el tratamiento de esclerosis múltiple remitente-recurrente con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4. En contraste a lo mismo, en el curso de V1H/SIDA los niveles de CD62L en células T tienden a, posiblemente ligeramente, disminuir. Sin embargo una caída de CD62L en células T típicamente puede observarse después del inicio de PML en cualquier situación, es decir, si un sujeto tiene V1H/SIDA o está bajo tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 (cf. véase también Fig. 12). De esta manera en algunas modalidades es útil monitorear el curso de tiempo de los niveles de CD62L en células T de un individuo, si es VIH positivo, bajo terapia con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 o cualquier otra condición particular. De esta manera puede detectarse cualquier alteración inesperada de los niveles de CD62L. Tal alteración es una indicación de un riesgo elevado de PML.
Como se explica arriba, en algunas modalidades de un método o uso de la invención se determina el nivel de expresión de LFA-1 en la muestra. En algunas modalidades se determina el nivel de expresión de LFA-1 en una pluralidad de puntos de tiempo, por ejemplo al determinar el nivel de expresión de LFA-1 en una pluralidad de muestras, que se han obtenido del mismo sujeto en puntos de tiempo particulares durante un periodo de tiempo. Si el nivel de expresión de LFA-1 observado es persistentemente diferente de un valor umbral durante un periodo extendido de tiempo, el sujeto se encuentra en un riesgo más alto de padecer PML. Como un ejemplo en este sentido, la Fig.11 muestra que los niveles de LFA-1 de dos pacientes quienes desarrollaron después PML fueron persistentemente inferiores a aquellos de pacientes de control después del mes 6 y 12.
Por ejemplo, puede utilizarse un nivel de referencia de LFA-1 como se indica a continuación para fijar un valor umbral: Tabla 2: Valores de referencia ejemplificativos para LFA-1 para individuos que reciben Natalizumab Para propósito de la presente invención, la detección de expresión de LFA-1 también puede incluir detectar la proteína o ARNm de CDlla y Runx3. En este caso, la determinación del riesgo puede llevarse a cabo utilizando generalmente el mismo planteamiento como para la proteína LFA-1.
Como será aparente de lo anterior, si por ejemplo se detecta que un nivel de células T, que tienen CD62L y/o tanto CD62L como LFA-1 está por debajo de un valor umbral (e.g. predeterminado), esto puede indicar un riesgo que el sujeto tendrá PML, con frecuencia en el último punto de tiempo. En modalidades donde la muestra es de un sujeto V1H positivo, si se detecta que un nivel de células T que tienen tanto CD62L como LFA-1 está por debajo de un valor umbral predeterminado, esto puede indicar la necesidad de cambiar de terapia. Como se explica arriba, puede discontinuarse la administración de un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4, incluyendo interrumpirse, y al sujeto puede administrarse un agente tal como un compuesto y/o un anticuerpo que se conoce por o se sospecha que es efectivo contra JCV. Un nivel de células T que tienen tanto CD62L como LFA-1 por debajo de un valor umbral predeterminado también puede indicar una condición donde el sujeto padece PML. En caso que se sospeche que un sujeto padece PML el practicante usualmente llevará a cabo formación de imágenes MRI. Por ejemplo, puede analizarse si existen lesiones en materia blanca subcortical. La presentación de síntomas de PML más comúnmente incluye cambios en el conocimiento, conducta, y personalidad, pero en algunos casos los ataques pueden ser el primer evento clínico. Tales síntomas pueden ocurrir ya sea solos o asociados con síntomas motrices, de lenguaje, o visuales.
Lo anterior aplica a la detección de PSGL-1 mutatis mutandis. Si se detecta que un nivel de células T que tienen PSGL-1 y/o tanto PSGL-1 como CD62L está por debajo de un valor umbral (e.g. predeterminado), esto puede indicar un riesgo de que el sujeto tendrá PML, con frecuencia en el último punto de tiempo. Típicamente, un nivel de PSGL-1 en células T que está por debajo de un valor umbral es indicativo de un riesgo de PML. La Fig. 3B muestra que los niveles de PSGL-1 en células T tienden a incrementar ligeramente durante el tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4. Sin embargo, antes del inicio de PML durante el tratamiento con un VLA-agente bloqueador, los niveles de PSGL-1 en células T típicamente caen. Como puede tomarse del mismo modo de la Fig.3B, los niveles de PSGL-1 en células T de sujetos infectados con V1H típicamente caen después del inicio de PML.
Si se detecta que el nivel de expresión de ya sea PSGL-1 o CD62L en células T de un sujeto está por debajo de un valor umbral, esto también puede indicar un riesgo de que el sujeto tendrá PML. Si el nivel de expresión de PSGL-1 observado es por ejemplo persistentemente diferente de, en particular por debajo de, un valor umbral durante un periodo extendido de tiempo, se diagnostica que el sujeto se encuentra en un riesgo elevado de desarrollar PML. Si el nivel de expresión de tanto PSGL-1 como CD62L observado es persistentemente diferente de, en particular por debajo de, un valor umbral durante un periodo extendido de tiempo, también se diagnostica que el sujeto se encuentra en un riesgo elevado de desarrollar PML. Del mismo modo, si el nivel de expresión de ya sea PSGL-1 o CD62L observado es persistentemente inferior a un valor umbral durante un periodo extendido de tiempo, también se diagnostica que el sujeto se encuentra en un riesgo elevado de desarrollar PML. Donde la muestra es de un sujeto V1H positivo, si se detecta que un nivel de células T que tienen PSGL-1 está por debajo de un valor umbral, esto puede indicar la necesidad de cambiar de terapia. Un nivel de células T que tienen PSGL-1 por debajo de un valor umbral también puede indicar una condición donde el sujeto padece PML. un nivel de células T que tienen al menos uno de PSGL-1 y CD62L por debajo de un valor umbral también puede indicar una condición donde el sujeto padece PML.
Como se explica arriba, PML es un factor de riesgo que puede tomarse como un efecto adverso para tratar a un sujeto con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4. En contraste a lo mismo, PML es un riesgo inherente asociado con infección de V1H. La introducción de terapia antirretroviral altamente activa (HAART) ha mejorado tanto los descubrimientos clínicos como radiológicos en sujetos infectados con V1H y redujo el número de infecciones oportunistas. En países que utilizan HAART, compuesto de demencia por SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) se está volviendo la complicación neurológica más común de infección de V1H, mientras las infecciones oportunistas aún son la causa principal de complicaciones neurológicas en pacientes de países que no utilizan comúnmente HAART. Síndrome inflamatorio de reconstitución inmune, que ocurre en algunos pacientes en las semanas a meses después de la institución de HAART, puede alterar la apariencia de formación de imágenes típica de enfermedades infecciosas que incluyen CNS. La aparición de HAART, que se ha utilizado en países Occidentales para tratar Pacientes infectados con VIH desde 1996, ha resultado en una disminución en la incidencia de complicaciones neurológicas, especialmente aquellas causadas por infecciones oportunistas. En países donde HAART está disponible, disfunción cognitiva y neuropatías periféricas que se causan directamente por VIH representan la mayoría de casos de trastornos neurológicos relacionados con VIH; en otros países, son más comunes infecciones oportunistas del CNS.
En modalidades donde el sujeto es VIH positivo, la determinación del riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto por lo tanto no necesariamente ordena la suspensión de la terapia actualmente utilizada. En este sentido los datos indican que HAART debería iniciarse preferentemente si se determina el riesgo de ocurrencia de PML, si un sujeto V1H positivo aun no está bajo HAART, como ya se detalló arriba. Sin embargo, donde se determina un riesgo incrementado de PML para un sujeto particular, puede discontinuarse la combinación de compuestos anti-retrovirales, típicamente incluyendo uno o más inhibidores de transcriptasa inversa y opcionalmente un inhibidor de proteasa, utilizados en HAART. En tal una modalidad el discontinuar la administración de la combinación de compuestos anti-retrovirales puede incluir una terapia de substitución. En tal una terapia de substitución puede administrarse al sujeto una combinación alternativa de compuestos anti-retrovirales.
Donde el sujeto es un sujeto V1H positivo, si se determina un riesgo incrementado de PML, puede iniciarse una terapia que ayuda a prolongar el tiempo hasta la ocurrencia de PML, dando así al organismo más tiempo para desarrollar una Respuesta inmune JCV. En este sentido puede administrarse un antagonista HT2a, como ya se indicó arriba. Donde se ha determinado un riesgo incrementado de PML para un sujeto VIH positivo, también puede iniciarse una terapia que ayuda a reducir la carga de JCV en el organismo del sujeto.
En una base general el descubrimiento de que la proteína 1 viral (VP1) de JCV se une al tetrasacárido de lactoseries de oligosacárido c (LSTc) en células huésped y la determinación de la estructura de cristal de VP1 en compuesto con LSTc (Neu et al., 2010, supra) puede esperarse que permita el desarrollo de compuestos farmacéuticamente activos en el futuro predecible que son efectivos en el tratamiento de infección de JCV, incluyendo PML. Se ha encontrado que los glicanos que terminan en el motivo LSTc sirven como receptores principales para JCV y esa infección de JCV puede bloquearse específicamente por incubación con LSTc soluble. Además, los términos de cadenas largas de oligosacáridos del así llamado antígeno 'I', que se expresa en una alta proporción de linfocitos periféricos de humano, pueden tomarse para definir homólogos de LSTc, en los cuales un GlcNAc reemplaza la terminal Glc de LSTc (ibid.).
En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención antes de un tratamiento planeado, el nivel de CD62L en células T de un sujeto se determina como se detalla arriba. Si un nivel disminuido de CD62L presente en células T, con relación a un valor umbral, se determina, puede diagnosticarse un riesgo incrementado de ocurrencia de PML. En modalidades donde el sujeto es V1H positivo la terapia planeada puede ajustarse para lograr una restauración inmune particularmente rápida y efectiva y/o para ayudar al organismo del sujeto a proporcionar respuestas de la célula T específica de JCV. En algunas modalidades puede considerarse incluir un antagonista HT2a en una terapia planeada. Como se indica arriba, en algunas modalidades el nivel de CD62L en células T de un sujeto puede monitorearse con el tiempo. Para este propósito las muestras congeladas que se obtuvieron del sujeto a diferentes puntos de tiempo, por ejemplo, puede analizarse dentro de la misma medición. El nivel de CD62L en células T, por ejemplo, puede medirse a intervalos de tiempo de uno o más meses tal como aproximadamente cada 6 meses, aproximadamente cada 8 meses, aproximadamente cada 10 meses, aproximadamente cada 12 meses o aproximadamente cada 14 meses durante un tratamiento, por ejemplo con un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4, o siempre que se diagnostique que el sujeto padece una enfermedad tal como V1H o esclerosis múltiple. Una disminución en el nivel de CD62L en células T puede indicar que el sujeto se encuentra en un riesgo de desarrollar PML. Dependiendo de los resultados de diagnóstico adicionales, un cambio del nivel de CD62L en células T también puede indicar que el sujeto se encuentra desarrollando PML. En algunas modalidades donde el sujeto se somete a tratamiento con un agente bloqueador de oc4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 el nivel de CD62L en células T puede determinarse antes de que inicie un tratamiento con un agente bloqueador de respectivo. Después un análisis adicional del nivel de CD62L en células T, por ejemplo, puede llevarse a cabo aproximadamente 1.5 años después del inicio de tratamiento. Posteriormente el nivel de CD62L en células T del sujeto puede analizarse aproximadamente cada 6 meses.
En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención antes de un tratamiento planeado se determina (supra)el nivel de PSGL-1 en células T de un sujeto. Una medición respectiva del nivel de PSGL-1, por ejemplo, puede servir como una referencia para mediciones posteriores que pueden llevarse a cabo durante el curso de la terapia planeada. El nivel de PSGL-1 en células T, por ejemplo, puede medirse a intervalos de tiempo de uno o más meses tal como aproximadamente cada 3 meses, aproximadamente cada 6 meses, aproximadamente cada 8 meses, aproximadamente cada 10 meses, aproximadamente cada 12 meses o aproximadamente cada 14 meses durante un tratamiento, por ejemplo con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4, o siempre que se diagnostique que el sujeto padece de una enfermedad tal como V1H o esclerosis múltiple. Se determina que la detección de nivel disminuido de PSGL-1 en células T, con relación a un valor umbral, puede ser la base de o un factor que conduce a la predicción/diagnóstico de un riesgo incrementado de ocurrencia de PML. Los niveles de PSGL-1 también pueden compararse entre mediciones llevadas a cabo en diferentes puntos de tiempo o entre muestras tomadas en diferentes puntos de tiempo del sujeto. Una disminución del nivel de PSGL-l en celulas T puede indicar un riesgo incrementado de ocurrencia de PML. De nuevo, en caso de que el sujeto sea V1H positivo puede ajustarse la terapia planeada para lograr una restauración inmune particularmente rápida y efectiva y/o para ayudar al organismo del sujeto a proporcionar respuestas de célula T específicas de JCV. En algunas modalidades puede considerarse (supra) la administración de un antagonista HT2a- Pueden utilizarse varios métodos de acuerdo a la presente invención para predecir si un sujeto probablemente desarrolla PML. Esto es de particular importancia ya que no está actualmente disponible terapia de PML y la mortalidad total es arriba del 50%, como se explica arriba. Además, una vez que se diagnostica PML en un sujeto que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4, se requiere intercambio de plasma o inmunoabsorción para remover más rápidamente el agente bloqueador de respectivo de plasma y acelerar la reconstitución de inmunovigilancia. En este sentido la inmunoabsorción solamente se establece como un procedimiento médico en Europa y Japón, pero no en Norteamérica. La reconstitución de la función inmune después del retiro de e.g. una inmunoglobulina monoclonal con procedimientos de intercambio de plasma, con frecuencia se acompaña por una respuesta inflamatoria patológica exagerada denominada síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (IRIS), también conocido como "enfermedad de restauración (IRD) ", "síndrome de reconstitución inmune (IRS)", "enfermedad de recuperación inmune", y "padecimiento de rebote inmune". A medida que se recupera el sistema inmune, el influjo de linfocitos citotóxicos y espectadores elimina los oligodendrocitos infectados y aumenta la inflamación espectadora. El sistema inmune se ha postulado para responder a una infección oportunística previamente adquirida con una respuesta inflamatoria apabullante que empeora paradójicamente los síntomas de infección. Ya que se ha encontrado que IRIS ocurre en la ausencia de cualquier infección aparente activa, también se ha postulado que se origina solamente debido a la restauración de la respuesta inmune inflamatoria previamente suprimida debida a la reactivación de células de memoria que se han activado previamente por exposición a antígeno. IRIS típicamente conduce un deterioro clínico, causando alta discapacidad y mortalidad. IRIS se describió primero en pacientes con V1H, sin embargo es más común en pacientes con MS tratados con Natalizumab.
En sujetos infectados con V1H IRIS típicamente se desarrolla dentro de semanas o meses (Post, M.J.D., et al., Am. J. Neuroradiol . (2013) 10.3174/ajnr.A3183). IRIS significativamente impacta de manera negativa la población infectada con V1H en HAART al incrementar el número de procedimientos, número de hospitalizaciones, y la morbidez total en este grupo de pacientes (ibid.). Entre los pacientes infectados con V1H JCV positivos que se han tratado con HAART, se ha reportado que el 18% puede desarrollar IRIS (ibid.). En pacientes VIH negativos en terapia inmunomoduladora tal como Natalizumab, PML-IRIS es supuestamente más severa que en pacientes infectados con VIH debido a la inmunovigilancia restaurada en los últimos (ibid.).
IRIS es una respuesta inflamatoria robusta, que puede ocurrir como una enfermedad leve, pero también como un deterioro que amenaza la vida. Un método de acuerdo a la invención permite la predicción temprana del riesgo de ocurrencia de PML y por lo tanto proporciona tiempo para ajustar el tratamiento antes del inicio de PML. De esta manera puede evitarse la ocurrencia de IRIS y así puede eludirse un riesgo de salud/vida adicional potencial.
El método descrito arriba, del mismo modo, puede utilizarse para diagnosticar la severidad de PML en un sujeto que padece infección de VIH o en un sujeto que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4. En algunas modalidades en un método de acuerdo a la invención como se describe arriba el sujeto de quien/cual se origina la muestra generalmente se conoce por tener V1H y PML. El detectar el nivel de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1 en una muestra del sujeto y comparar el mismo con un valor umbral puede llevarse a cabo como arriba. Un nivel de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1 por debajo de un valor umbral predeterminado puede indicar una condición donde el sujeto padece PML severa. En algunas modalidades en un método de acuerdo a la invención como se describe arriba el sujeto de quien/cual se origina la muestra generalmente se conoce por tener V1H, pero no PML. Tal un método puede ser un método para valorar el riesgo de desarrollo de PML. En tal una modalidad puede sospecharse que el sujeto esté en riesgo de desarrollar PML. Un nivel disminuido de una o ambas de las células T que expresan CD62L y PSGL-1 en una muestra del sujeto con relación al valor umbral indica el riesgo de desarrollo de PML.
Un método como se describe arriba también puede ser un método para valorar la ocurrencia de PML. En tal una modalidad el sujeto de quien/cual se origina la muestra generalmente se sospecha que padece PML. Una cantidad disminuida de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1, relativa al valor umbral, indica la presencia de PML. Un método como se describe arriba además en algunas modalidades puede ser un método para valorar las oportunidades de sobrevivencia de PML en un sujeto. En tal una modalidad el sujeto generalmente se conoce por tener PML. Un nivel disminuido de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1, con relación al valor umbral, puede indicar bajas oportunidades de sobrevivencia de PML.
Además, biomarcadores adicionales, ya conocidos o por descubrirse, pueden utilizarse opcionalmente como marcadores secundarios en el contexto de la presente invención para ayudar en la valoración del riesgo de ocurrencia de PML de un sujeto tal como un paciente que recibe uno o más agentes bloqueadores a4-integrina, agentes bloqueadores LPAM-1 y/o agentes bloqueadores VLA-4. Como se explica arriba, indicadores adicionales que pueden tomarse en cuenta para el diagnóstico de un riesgo de PML incluyen la duración de tratamiento, pretratamiento con inmunosupresores, así como la positividad de suero de anticuerpos JCV.
Tratamiento y Administración de Compuestos La presente invención también proporciona un método para tratar a un sujeto. El método comprende administrar un agente bloqueador de a4-integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o un agente antiviral al sujeto. El método comprende además determinar la expresión de uno o más biomarcadores en una o más células T del sujeto, tales como células T CD4+ o células T CD8+. Tal un biomarcador generalmente es CD62L, PSGL-1 o LFA-1. En algunas modalidades puede monitorearse la expresión de uno o más biomarcadores en una o más células T del sujeto. En algunas modalidades el método comprende además determinar, incluyendo monitorear, la migración de células inmunes CD45+CD49d+. En este sentido la invención también se refiere al uso de un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o un agente antiviral en la fabricación de un medicamento. Como se explica arriba, un sujeto que recibe a tratamiento de acuerdo con la invención puede ser individuo inmunocomprometido. El sujeto, por ejemplo, puede tener leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide crónica, colitis ulcerativa, la enfermedad de Crohn o infección de V1H.
Un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o un agente antiviral pueden administrarse a un paciente humano per se, o en composiciones farmacéuticas donde se mezclan con otros ingredientes activos, como en terapia de combinación, o portadores o excipiente(s) adecuados. Las vías ejemplificativas incluyen, pero no se limitan a, suministro oral, transdérmico, y parenteral.
Un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4, agente bloqueador de VLA-4 puede utilizarse para tratar un número de enfermedades y trastornos, incluyendo esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, meningitis, neuromielitis óptica, neurosarcoidosis, CNS vasculitis, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), encefalitis, mielitis transversal, rechazo de injerto de tejido u órgano, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad renal crónica, lesión de CNS, e.g., apoplejía o lesión de la médula espinal; enfermedad renal crónica; alergia, e.g., asma alérgico; diabetes tipo 1; trastorno del intestino inflamatorio, e.g., colitis ulcerativa; miastenia gravis; fibromialgia; trastornos artríticos, e.g., artritis reumatoide, artritis psoriatica; trastornos de la piel inflam torios/inmunes, e.g., psoriasis, vitÍligo, dermatitis, liquen plano; lupus eritematoso sistémico; Síndrome de Sjogren; cánceres hematológicos, e.g., mieloma múltiple, leucemia, linfoma; cánceres sólidos, e.g., sarcomas o carcinomas, e.g., del pulmón, mama, próstata, cerebro; y trastornos fibróticos, e.g., fibrosis pulmonar, mielofibrosis, cirrosis del hígado, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis crescéntica, neuropatía diabética, y fibrosis intersicial renal. Cualquier enfermedad o condición patológica que se ha tratado o se sabe que se puede tratar por el agente bloqueador es parte de la presente invención. De acuerdo con lo anterior, el tratamiento generalmente comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente bloqueador de a4-integrina/VLA-4 o de un agente antiviral. Los sujetos pueden someterse primero a selección anterior para determinar si el tratamiento sería adecuado. Por ejemplo, la selección puede basarse en la historia del paciente, el uso previo de inmunosupresor, Escala de Estado de Discapacidad Expandido (EDSS) en caso de pacientes con esclerosis múltiple, estado anti-anticuerpo JCV (seropositividad del anticuerpo JCV), los estudios de formación de imágenes MRI, lista de verificación pre-infusión para empeoramiento continúo de los síntomas neurológicos, y otros criterios comúnmente utilizados.
Las vías de administración adecuadas de compuestos/agentes utilizadas en el contexto de la presente invención, por ejemplo, pueden incluir administración por depósito, oral, rectal, transmucosal, o intestinal; suministro parenteral, incluyendo inyecciones intramuscular, subcutánea, intravenosa, intramedular, así como inyecciones intratecal, intraventricular directa, intraperitoneal, intranasal, o intraocular.
Alternativamente, uno puede administrar el compuesto en una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, a través de inyección del compuesto directamente en un tumor sólido, con frecuencia en un depósito o formulación de liberación prolongada. Además, uno puede administrar el fármaco en un sistema de suministro de fármaco objetivo, por ejemplo, en un liposoma revestido con un anticuerpo específico de glóbulos rojos. Los liposomas serán el objetivo y se tomarán selectivamente por las células respectivas.
Pueden fabricarse composiciones farmacéuticas que incluyen los compuestos de la presente invención en una manera que se conoce por sí misma, e.g., por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapado o liofilización.
De esta manera pueden formularse composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente invención en manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables incluyendo excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la vía de administración elegida.
Para inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, por ejemplo en reguladores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o regulador de salina fisiológica. Para administración transmucosal, se utilizan en la formulación los penetrantes apropiados para la barrera a pern earse. Tales penetrantes generalmente se conocen en la materia.
Para administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente al combinar los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la materia. Tales portadores permiten que los compuestos de la invención se formulen como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y lo similar, para ingestión oral por un paciente a tratarse.
Pueden obtenerse preparaciones farmacéuticas para uso oral al agregar un excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de tabletas o gragea. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azucares, incluyendo lactosa, sucrosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP).
Si se desea, pueden agregarse agentes desintegrantes, tales como la polivinilpirrolidona degradada, agar, o ácido algínico o una sal de los mismos tal como alginato de sodio.
Los núcleos de grageas se proporcionan con revestimientos adecuados. Para este propósito, pueden utilizarse soluciones de azúcar concentrada, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solvente orgánicos adecuados o mezclas de solvente. Tintes o pigmentos pueden agregarse a los revestimientos de gragea o tabletas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse oralmente incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas selladas, suaves hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con relleno tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas suaves, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como ácidos grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden agregarse estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deberían estar en dosificaciones adecuadas para tal administración. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o píldoras formuladas en manera convencional.
Para administración por inhalación, los compuestos para el uso de acuerdo a la presente invención se suministran convenientemente en la forma de una presentación de rocío en aerosol de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, ee..gg..,, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de e.g. gelatina para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, e.g., por inyección por bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, e.g., en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar tales formar como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección aceitosas apropiadas. Los vehículos o solventes lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tal como aceite de sésamo, o ésteres de ácido graso sintéticos, tales como etil oleato o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextran. Opcionalmente, la suspensión también puede contener agentes o estabilizadores adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Alternativamente, el ingrediente active puede estar en la forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, e.g., agua libre de pirogen estéril, antes de uso. Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, e.g., conteniendo bases supositorias convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también pueden formularse como una preparación de depósito. Tales formulación de larga duración pueden administrarse por implante (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales hidrofóbicos o poliméricos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio de ión, o como derivados solubles con moderación, por ejemplo, como una sal soluble con moderación.
Un vehículo farmacéutico para los compuestos hidrofóbicos de la invención es un sistema co-solvente que incluye alcohol de bencil, un agente tensoactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua, y una fase acuosa. El sistema co-solvente puede ser el sistema co-solvente VPD. VPD es una solución de 3% p/v alcohol de bencil, 8% p/v del agente tensoactivo no polar polisorbate 80, y 65% p/v polietilenglicol 300, hecho hasta volumen en etanol absoluto. El sistema co-solvente VPD (VPD: D5W) consiste de VPD diluido 1:1 con un 5% de dextrosa en solución de agua.
Este sistema co-solvente disuelve bien los compuestos hidrofóbicos, y por si mismo produce baja toxicidad en la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema co-solvente pueden variarse considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad.
Además, puede variarse la identidad de los componentes co-solventes: por ejemplo, otros agentes tensoactivos no polares de baja toxicidad pueden utilizarse en lugar de polisorbato 80; puede variarse el tamaño de fracción de polietilenglicol; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar polietilenglicol, e.g. polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden substituirse por dextrosa.
Alternativamente, pueden emplearse otros sistemas de suministro para compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro o portadores para fármacos hidrofóbicos. Ciertos solventes orgánicos tal como dimetilsulfóxido también pueden emplearse, aunque usualmente al costo de mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos pueden suministrarse utilizando un sistema de liberación prolongada, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido varios tipos de materiales de liberación prolongada y se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Las cápsulas de liberación prolongada, dependiendo de su naturaleza química, pueden liberar los compuestos por unas pocas semanas hasta arriba de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, pueden emplearse las estrategias adicionales para estabilización de proteína.
Una composición farmacéutica también puede incluir excipientes o portadores de fase de gel o sólidos adecuados. Ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen pero no se limitan a carbonato de calcio, fosfato de calcio, varias azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la presente invención incluyen composiciones donde los ingredientes activos se contienen en una cantidad efectiva para lograr su uso propuesto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de compuesto efectiva para prevenir, aliviar o mejorar síntomas de enfermedad o prolongar la sobrevivencia del sujeto que se trata. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva se encuentra bien dentro de la capacidad de aquellos expertos en la materia, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente.
Para cualquier compuesto utilizado en los métodos de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente de los ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un rango de concentración circulante que incluye IC50 como se determina en el cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media-máxima de la actividad deseada). Tal información puede utilizarse para determinar de manera más exacta dosis útiles en humanos.
Toxicidad y eficacia terapéutica de los compuestos descritos en la presente pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, e.g., para determinar LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción entre LD50 y ED50. Puede desearse utilizar compuestos que muestran altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios de animal pueden utilizarse para formular un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos yace típicamente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen ED50 con poca o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación pueden elegirse por cada médico en vista de la condición del paciente.
La cantidad e intervalo de dosificación puede ajustarse individualmente para proporcionar niveles de plasma de la porción activa que son suficientes para mantener los efectos moduladores de cinasa, o concentración efectiva mínima (MEC). MEC variará para cada compuesto pero puede estimarse de datos in vitro e.g., la concentración necesaria para lograr 50-90% de inhibición de la cinasa. Las dosificaciones necesarias para lograr MEC dependerán de las características individuales y vía de administración. Sin embargo, pueden utilizarse ensayos o bioensayos HPLC para determinar concentraciones en plasma.
Los intervalos de dosificación también pueden determinarse utilizando valor MEC. Los compuestos deberían administrarse utilizando un régimen que mantiene niveles de plasma arriba de la MEC por 10-90% del tiempo, por ejemplo de aproximadamente 30 a aproximadamente 90%, tal como de aproximadamente 50 a aproximadamente 90%.
En casos de administración local o toma selectiva, la concentración local efectiva del fármaco puede no relacionarse con la concentración de plasma. La cantidad de composición administrada, por supuesto, dependerá del sujeto que se trata, del peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la manera de administración y el juicio del médico prescrito.
Una composición adecuada puede, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo distribuidor que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El paquete, por ejemplo, puede incluir hoja de metal o plástico, tal como un paquete de ampolla. El paquete o dispositivo distribuidor puede acompañarse por instrucciones para administración. El paquete o distribuidor también pueden acompañarse con un aviso asociado con el recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso, o ventaja de farmacéuticos, tal aviso refleja la aprobación por la agencia de la forma del compuesto para administración en humano o veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede ser el etiquetado aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de E.U. u otra agencia gubernamental para fármacos de prescripción, o la pieza de inserción del producto aprobado.
Ciertos aspectos de la presente invención conciernen a un método para tratar a un sujeto tal como un paciente. En algunas modalidades el tratamiento comprende administrar uno o más compuestos antirretrovirales al paciente. En algunas modalidades de tal un método el nivel de expresión de PSGL-1 en células T del sujeto se mide/detecta. La administración del uno o más compuestos antirretrovirales se detiene o continúa, en base al nivel de expresión de PSGL-1 en las células T del sujeto. Como se explica arriba, el nivel de expresión de PSGL-1 en células T puede utilizarse para valorar el riesgo de ocurrencia o la ocurrencia de PML. Un valor umbral puede utilizarse como un umbral de decisión (supra). Por lo tanto, si se detecta un nivel de expresión de PSGL-1 que indica que no existen riesgo elevado de ocurrencia de PML, el tratamiento puede continuarse. Si se detecta un nivel de expresión de PSGL-1 que indica que existen un riesgo elevado de ocurrencia de PML, la administración del uno o más compuestos antirretrovirales deberla detenerse. El detener la administración del uno o más compuestos antirretrovirales puede incluir terminar o posponer la administración de uno o más compuestos antirretrovirales al sujeto. En algunas modalidades detener la administración del uno o más compuestos antirretrovirales comprende administrar uno o más compuestos antirretrovirales que difieren de aquel/aquellos compuesto(s) antirretroviral(es) previamente administrado(s) al sujeto.
En algunas modalidades de tal un metodo el nivel de expresión de CD62L en células T del sujeto se mide/detecta. La administración del uno o más compuestos antirretrovirales se detiene o continúa, en base al nivel de expresión de CD62L en las células T del sujeto. Como se explica arriba, el nivel de expresión de CD62L en células T puede utilizarse para valorar el riesgo de ocurrencia o la ocurrencia de PML. Como se explica arriba, un valor umbral puede utilizarse como un umbral de decisión. Por lo tanto, si se detecta un nivel de expresión de CD62L que indica que existen un riesgo elevado de ocurrencia de PML, la administración del uno o más compuestos antirretrovirales debería detenerse. Si se detecta un nivel de expresión de CD62L que indica que no existen riesgo elevado de ocurrencia de PML, el tratamiento puede continuarse. En una modalidad el nivel de expresión de tanto PSGL-1 como CD62L en células T del sujeto se mide/detecta. La administración del uno o más compuestos antirretrovirales se detiene o continúa, en base al nivel de expresión de PSGL-1 y CD62L en las células T del sujeto. Si se detectan tanto un nivel de expresión de PSGL-1 como un nivel de expresión de CD62L que indican que no existen riesgo elevado de ocurrencia de PML, el tratamiento puede continuarse. Si se detecta un nivel de expresión de PSGL-1 y/o un nivel de expresión de CD62L que indica que existen un riesgo elevado de ocurrencia de PML, la administración del uno o más compuestos antirretrovirales debería detenerse. De nuevo, el detener la administración del uno o más compuestos antirretrovirales puede incluir terminar o posponer administrar el uno o más compuestos antirretrovirales al sujeto. El detener la administración del uno o más compuestos antirretrovirales puede incluir administrar uno o más compuestos antirretrovirales que difieren de aquel/aquellos compuesto(s) antirretroviral(es) previamente administrado(s) al sujeto.
Además, si se detecta un nivel de expresión de PSGL-1 y/o CD62L que indica que un sujeto está en riesgo elevado de ocurrencia de PML, puede intensificarse el diagnóstico con respecto a PML. Como se explica abajo, puede emplearse la formación de imágenes MRI para identificar cualquier área de desmielinización. Además, puede analizarse fluido cerebroespinal para la presencia de ADN de JCV, o puede analizarse sangre o una muestra de cerebro con respecto a la presencia de TNFR1 o TNF-a. Si cualquiera de estas mediciones de diagnóstico se han llevado a cabo previamente en el sujeto, incluyendo llevada a cabo en una base regular, si sobre la base de niveles de expresión de PSGL-1 y/o CD62L, se encuentra que un sujeto está en un riesgo elevado de desarrollar PML, uno o más de tales promedios de diagnóstico PML puede llevarse a cabo en una base regular, incluyendo en una base más frecuente que la hecha previamente. Como un ejemplo ilustrativo, puede decidirse por el médico que cada tres meses la formación de imágenes MRI se lleva a cabo en el cerebro del sujeto.
En algunas modalidades el tratamiento comprende administrar un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 al sujeto. El método comprende además medir o detectar el nivel de expresión de PSGL-1 en células T del sujeto. En base al nivel de expresión de PSGL-1 en las células T del sujeto la administración del agente bloqueador de a4-integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 se detiene o continúa. Un valor umbral puede utilizarse como un umbral de decisión (supra). Si se detecta un nivel de expresión de PSGL-1 que indica que no existen riesgo elevado de ocurrencia de PML, la administración del agente bloqueador de puede continuarse. Si se detecta un nivel de expresión de PSGL-1 que indica que existen un riesgo elevado de ocurrencia de PML, la administración del agente bloqueador de debería detenerse. En algunas modalidades se toman medidas para remover la a4-integrina, LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 del plasma del sujeto si se ha determinado un riesgo elevado de ocurrencia de PML. Como se explica arriba el intercambio de plasma o inmunoabsorción puede llevarse a cabo en este sentido. En algunas modalidades el detener la administración de un agente bloqueador de significa que la terapia con un agente bloqueador de a4-integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 se detiene completamente, es decir, no se administra agente bloqueador de alternativo en lugar del agente bloqueador de a4-integrina, LPAM-1 o VLA-4 previamente administrado. En algunas modalidades un agente bloqueador de a4-integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 es una inmunoglobulina o un agente de unión proteínico con funciones similares a inmunoglobulina. En tal una modalidad el detener la administración de un agente bloqueador de significa que la terapia con una inmunoglobulina o un agente de unión proteínico que es un agente bloqueador de oc4-integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 se detiene completamente, es decir, no se administra inmunoglobulina o un agente de unión proteínico alternativo en lugar de la inmunoglobulina o un agente de unión proteínico previamente administrado. En tal una modalidad puede administrarse un agente bloqueador de a4- integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 que difiere de una inmunoglobulina o un agente de unión proteínico, por ejemplo un compuesto de bajo peso molecular. El terminar o posponer completamente la terapia con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 puede ayudar en la reconstitución de la in unovigilancia del sujeto. Además se observa en este sentido que un sujeto que padece MS y bajo terapia con un agente bloqueador de a4-integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 con frecuencia es un sujeto que/quien no respondió a una primer línea de terapia tal como interferón-b o acetato de glatiramer. El inicio de tal una terapia como un substituido de terapia con un agente bloqueador de a4-integrina, LPAM-1 y/o VLA-4 por lo tanto solamente puede tener una baja oportunidad de mejorar la condición del sujeto.
En algunas modalidades un método para tratar a un sujeto, que incluye administración de un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4, incluye además medir el nivel de expresión de CD62L en células T del sujeto. La administración del agente bloqueador de a4-integrina, agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 se detiene o continúa en base al nivel de expresión de PSGL-1 y CD62L en las células T del sujeto. Si se detecta uno o ambos de un nivel de expresión de PSGL-1 y un nivel de expresión de CD62L que indica que existen un riesgo elevado de ocurrencia de PML, la administración del agente bloqueador de respectivo debería detenerse, de otra manera puede continuar el tratamiento.
Como se explica arriba, la valoración/evaluación de la necesidad de discontinuar o no discontinuar la administración de un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o de uno o más compuestos antirretrovirales típicamente se basa en una comparación del nivel de expresión del sujeto de PSGL-1 y/o CD62L con un valor umbral. La determinación de si detener o no el tratamiento del sujeto puede basarse en comparar el nivel de expresión con una referencia. La referencia puede derivarse de uno o más pacientes conocidos por haber padecido PML u otras complicaciones, a uno o más pacientes conocidos por no haber padecido PML u otras complicaciones (supra). Como un ejemplo, un valor de referencia o nivel puede recolectarse de sujetos de control. Los niveles de expresión PSGL-1 y/o CD62L de los sujetos de control utilizando cualquier método adecuado, pueden registrarse durante un periodo de tiempo, tal como durante un periodo seleccionado en el rango de aproximadamente 2-3 años. Los niveles de expresión promedio, desviación estándar, y desviación estándar relativa en tiempos dados pueden calcularse para los sujetos de control para determinar un rango de niveles de expresión asociados con los sujetos de control. Cuando se recolecta un resultado de prueba de un sujeto a evaluarse, se comparará con el valor de referencia. Se determinarán diferencias estadísticas entre el resultado de prueba y la referencia para identificar las varianzas significativas entre los niveles de expresión respectivos. En base a expresión de PSGL-1 y/o CD62L, un médico es capaz de valorar si continua, reinicia o detiene un tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o de uno o más compuestos antirretrovirales. La información proporciona información significativa al médico considerando el riesgo asociado con el tratamiento, de manera que pueden tomarse decisiones informadas de beneficio-riesgo de acuerdo con lo anterior.
En algunas modalidades un método para tratar a un sujeto, ya sea que incluya la administración de un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o administración de uno o más compuestos antirretrovirales, incluye además medir el nivel de expresión de LFA-1 en las células T del sujeto. Como será aparente de lo anterior, las explicaciones anteriores con respecto a CD62L aplican mutatis mutandis a LFA-1. De esta manera en una modalidad la administración de la a4-integrina, LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o del uno o más compuestos antirretrovirales se detiene o continúa en base al nivel de expresión de PSGL-1 y LFA-1 en las células T del sujeto. Si se detecta uno o ambos de un nivel de expresión de PSGL-1 y un nivel de expresión de LFA-1 que indica que existen un riesgo elevado de ocurrencia de PML o al menos algunos aspectos de PML, la administración del agente bloqueador de VLA-4 o del uno o más compuestos antirretrovirales debería detenerse, de otra manera el tratamiento puede continuar. En una modalidad la administración de la a4-integrina, LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o del uno o más compuestos antirretrovirales se detiene o continúa en base al nivel de expresión de PSGL-1, CD62L y LFA-1 en las células T del sujeto. Si se detecta uno o más de un nivel de expresión de PSGL-1, un nivel de expresión de CD62L y un nivel de expresión de LFA-1 que indica que existen un riesgo elevado de ocurrencia de PML, la administración del agente bloqueador de respectivo o del uno o más compuestos antirretrovirales debería detenerse, de otra manera el tratamiento puede continuarse.
Un método para tratar a un sujeto con una infección retroviral tal como V1H de acuerdo a la invención puede incluir administrar una combinación de compuestos anti- retrovirales al sujeto durante un periodo de tiempo, seguido por una interrupción de la administración por un periodo de tiempo (supra). Como se explica arriba, interrupción de la administración típicamente comprende administrar una combinación alternativa de compuestos anti-retrovirales al sujeto. El método ayuda a evitar la ocurrencia adicional de PML. Generalmente se administran uno o más inhibidores de transcriptasa inversa y opcionalmente un inhibidor de proteasa al sujeto. En algunas modalidades tratar el sujeto con una infección retroviral comprende determinar, incluyendo monitorear, el nivel de expresión de CD62L y/o PSGL-1 en células T en o de una muestra del sujeto. El método para tratar el sujeto generalmente comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cada inhibidor de transcriptasa inversa y/o inhibidor de proteasa usado.
Cualquier combinación de compuestos antirretrovirales adecuada puede utilizarse en el contexto de la presente invención. Típicamente tres o más compuestos antirretrovirales se están administrando de manera simultánea. Uno de los compuestos antirretrovirales puede ser un inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa tal como Zidovudina (AZT), Didanosina (ddl), Zalcitabina (ddC), Estavudina (d4T), Lamivudina (3TC), Emtricitabina, Abacavir, Amdoxovir, Apricitabina o Elvucitabina . Uno de los compuestos antirretrovirales puede ser un inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa/nucleótido tal como Tenofovir, Tenofovir disoproxil fumarato (DF) o Adefovir. Uno de los compuestos antirretrovirales también puede ser un inhibidor de proteasa tal como Indinavir, gel duro Saquinavir, Ritonavir, Nelfinavir, Fosampernavir, Lopinavir, Atazanavir, Tipranavir o Darunavir. Además, uno de los compuestos antirretrovirales puede ser un inhibidor no nucleósido de transcriptasa inversa tal como Nevirapina, Delaviridina, Efavirenz, Etravirina o Rilpivirina. Uno de los compuestos antirretrovirales también puede ser un así llamado "inhibidor de entrada", es decir, un compuesto que bloquea la entrada del retrovirus en una célula. Dos ejemplos ilustrativos de inhibidores de entrada son Enfuvirtide, que bloquea la fusión de la cubierta de V1H a la membrana celular, y Maraviroc, que es un antagonista co-receptor CCR5 . Además, uno de los compuestos antirretrovirales puede ser un inhibidor de integrasa, es decir, un compuesto que inhibe la enzima de integrasa viral, que se requiere para réplica viral. Un ejemplo ilustrativo de un inhibidor de integrasa es Raltegravir.
Como se explica arriba, la presente invención proporciona además un método para tratar a un sujeto que/quien está en una condición inmunocomprometida, por ejemplo que tiene una enfermedad autoinmune, que puede ser una enfermedad desmielinizante. El método comprende administrar un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 al sujeto. Típicamente el método también incluye monitorear la expresión de al menos un biomarcador en células T, con el monitoreo llevándose a cabo en una muestra del sujeto. Un biomarcador respectivo puede ser CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1. El método también puede incluir determinar la capacidad migratoria de células inmunes CD45+CD49d+.
Típicamente el tratamiento de un sujeto que/quien está en una condición inmunocomprometida comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-l y/o un agente bloqueador de VLA-4. El agente bloqueador, por ejemplo, puede administrarse intravenosamente. Para Natalizumab, la dosis puede ser 1 a 6 mg por kilogramo de peso corporal. En una modalidad, una dosis estándar de 300 mg Natalizumab diluida con 100 mi 0.9% cloruro de sodio se inyecta intravenosamente una vez cada cuatro semanas. La dosis puede repetirse a intervalos de dos a ocho semanas. Por ejemplo, un régimen de tratamiento puede incluir 3 mg Natalizumab por kg de peso corporal repetido a aproximadamente un intervalo de cuatro semanas. Un experto en la materia es capaz de determinar la cantidad terapéutica efectiva.
Un sujeto puede someterse primero a selección previa para determinar si el tratamiento planeado sería adecuado. Por ejemplo, tal selección puede basarse en la historia del paciente, uso previo de inmunosupresor, Escala de Estado de Discapacidad Expandida (EDSS) en caso de pacientes con esclerosis múltiple, estado de anticuerpo anti-JCV (seropositividad de anticuerpo JCV), estudios de formación de imágenes MRI, lista de verificación de pre infusión para síntomas neurológicos continuamente empeorando, y otros criterios comúnmente utilizados. También puede realizarse una biopsia cerebral para determinar si pueden encontrarse los rasgos característicos de PML, conocidos por el practicante en el campo.
En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención se determina la presencia o ausencia de inmunoglobulinas anti-JCV en la sangre del sujeto. La presencia de inmunoglobulinas anti-JCV en la sangre del sujeto indica que el sujeto puede desarrollar potencialmente PML. Si se detectan inmunoglobulinas anti-JCV en la sangre del sujeto, puede determinarse el nivel de PSGL-1, LFA-1 y/o CD62L. La ausencia de inmunoglobulinas anti-JCV en la sangre del sujeto típicamente indica que el sujeto se encuentra en riesgo no elevado de desarrollar PML. La ausencia de inmunoglobulinas anti-JCV en la sangre del sujeto puede indicar que los niveles de inmunoglobulinas anti-JCV están bajo el límite de detección de la téenica utilizada. En tal caso puede utilizarse una prueba de inmunoglobulina alternativa. En tal caso puede emplearse la formación de imágenes MRI, o la presencia de JCV ADN en fluido cerebroespinal, puede determinarse la presencia de TNFR1 o de TNF-a en la sangre o en una muestra de cerebro. En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención se determina la presencia o ausencia de ADN JCV en la sangre del sujeto. Debe observarse que la presencia de ADN JCV en la sangre se correlaciona con inmunosupresión en lugar de con PML. Sin embargo en el contexto de un sujeto quien/que padece de una enfermedad retroviral, e.g. V1H, MS o la enfermedad de Crohn, la ausencia de ADN JCV en la sangre puede indicar que el sujeto se encuentra en riesgo elevado de desarrollar PML.
En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención se determina la presencia o ausencia de ADN JCV en el fluido cerebroespinal del sujeto. Si ADN JCV se detecta en fluido cerebroespinal del sujeto, puede determinarse el nivel de PSGL-1, LFA-1 y/o CD62L. Debe observarse que una prueba falsa positiva JCV DE ADN JCV en fluido cerebroespinal ocurre en 1-4% de Sujetos V1H positivos. Además, ADN JCV con frecuencia solamente es detectable en fluido cerebroespinal después del inicio de PML. En algunas modalidades de un método de acuerdo a la invención se determina el nivel de TNFR1 o de TNF-a en la sangre o en una muestra de cerebro del sujeto. Si se encuentran los niveles detectables de TNFR1 o de TNF-a en una muestra de cerebro el sujeto puede estar potencialmente en un riesgo elevado de desarrollar PML. En este caso puede determinarse el nivel de PSGL-1, LFA-1 y/o CD62L. Si se encuentran niveles elevados de TNFR1 o de TNF-a en la sangre el sujeto puede estar potencialmente en un riesgo elevado de desarrollar PML. En este caso puede determinarse el nivel de PSGL-1, LFA-1 y/o CD62L.
Típicamente se prueba un sujeto que se somete a tratamiento con a4-integrina, LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 para determinar el nivel de expresión de un biomarcador como se describe en este documento, e.g. el nivel de expresión de CD62L y/o PSGL-1 en células T en o de una muestra del sujeto. Como un ejemplo adicional, puede determinarse la capacidad migratoria de células inmunes CD45+CD49d+. Un método de acuerdo a la invención también puede incluir cualquier otra molécula o efecto que puede utilizarse para indicar de manera indirecta el nivel de tal biomarcador. Una o más muestras del sujeto se recolectan y analizan. En algunas modalidades la una o más muestras se envían a una instalación de prueba central para asegurar que puede llevarse a cabo el análisis de fenotipo y función bajo condiciones estandarizadas. Las muestras pueden tomarse y probarse antes del tratamiento y entonces regularmente después de que inicia el tratamiento, tal como mensualmente, bimestralmente, trimestralmente, cada seis meses, y cada año. La valoración de rutina para PML proporciona información oportuna considerando los asuntos de seguridad relacionados con el tratamiento. En una modalidad, las muestras se toman en el 1 mes, cada 3 meses hasta el primer año, y después cada 6 meses.
En algunas modalidades el tratar al sujeto que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 comprende determinar, incluyendo monitorear, el nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 en células T en o de una muestra del sujeto. Si se encuentra cualquier indicación que sugiera un riesgo incrementado de ocurrencia de PML o de la ocurrencia de otra complicación, o reproduce tal complicación más probable que en otros sujetos, pueden llevarse a cabo pruebas adicionales. Los sujetos que muestran vigilancia inmunocomprometida deben monitorearse clínicamente de manera muy cercana. El médico puede probar a los pacientes para biomarcadores adicionales tales como aquellos proporcionados en la presente invención o biomarcadores conocidos, tales como estado de anticuerpo anti-JCV u otro criterio clínico o MRI. En base a la información, el practicante valorará si continua, reinicia o detiene el tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4. La información proporciona información significativa al médico considerando el riesgo asociado con el tratamiento, de manera que puedan hacerse decisiones informadas de beneficio-riesgo de acuerdo con lo anterior. Como un ejemplo ilustrativo, el monitoreo puede incluir al inicio solamente la determinación del nivel de expresión de CD62L. Cuando el resultado indica un bajo nivel de expresión, en comparación con el valor de referencia como se describe arriba, puede probarse el nivel de expresión de LFA-1 y/o la capacidad de migración de células T. Cuando el resultado no indica una caída en niveles de CD62L, incluyendo cualquier alteración, por ejemplo al mostrar un nivel de expresión de CD62L normal o inadvertido, en comparación con el valor de referencia, puede analizarse el nivel de expresión de PSGL-1 en células T de la muestra. Como un ejemplo ilustrativo adicional, el monitoreo puede incluir inicialmente solamente determinar el nivel de expresión de PSGL-1. Cuando el resultado no indica una caída en los niveles de CD62L, incluyendo cualquier cambio, por ejemplo al mostrar un nivel de expresión de PSGL-1 normal o inadvertido, en comparación con el valor de referencia como se describe arriba, puede determinarse el nivel de expresión de CD62L en células T.
En algunas modalidades, un nivel o valor de referencia también puede recolectarse de sujetos quienes padecen PML como un resultado de a4-integrina, LPAM-1 y/o un tratamiento con un agente bloqueador de VLA-4. Los niveles de expresión de los biomarcadores de los pacientes con PML se registran durante un periodo de tiempo, tal como durante 2-3 años. Los niveles de expresión promedio, desviación estándar, y desviación estándar relativa en tiempos dados se calculan para los individuos para determinar un rango de niveles de expresión asociado con sujetos que tienen PML. Cuando se recolecta un resultado de prueba de un individuo a evaluarse, se comparará con el valor de referencia. Las diferencias estadísticas entre el resultado de prueba y la referencia se determinarán para identificar varianzas significativas entre ellas.
De acuerdo con lo anterior, determinar el nivel de expresión de CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 puede utilizarse para estratificar a un sujeto que se somete a o aproximadamente se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 para la suspensión del tratamiento. El determinar el nivel de expresión de CD62L y/o PSGL-1 también puede utilizarse para estratificar a un sujeto que se somete a HAART para suspensión de HAART respectiva, que puede incluir llevar a cabo una HAART alternativa. Como se explica arriba, la estratificación puede basarse en la valoración del riesgo de un sujeto a desarrollar PML. Como también se explica arriba, en algunas modalidades de un método de la invención se utiliza un ligando específico para CD62L, PSGL-1 y/o LFA-1 para seleccionar pacientes en riesgo que tienen una susceptibilidad más alta a PML.
Con respecto a individuos humanos, el uso de biomarcadores para estratificación de pacientes es un procedimiento bien establecido en la materia. Este procedimiento incluye o consiste de enlazar una o más subpoblaciones de pacientes, caracterizadas por un cierto riesgo, en el contexto de la presente invención el nivel de expresión de una proteína particular o capacidad migratoria de células, a un tratamiento particular. El objeto general de estratificación es acomodar a los pacientes con las terapias que es más probable que sean efectivas y seguras. En un contexto más general estratificar pacientes puede incluir evaluación de la historia del paciente y valoración física, combinada con pruebas de laboratorio sobre la base de un método de la presente invención, y observación clínica. Debe entenderse que estratificar pacientes solamente es factible si existen múltiples opciones de tratamiento con respuestas heterogéneas para la enfermedad. En el contexto de la presente invención terapia de V1H puede ajustarse o suspenderse el tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 por un cierto periodo de tiempo, tal como uno o más meses. Una revisión general de estratificación de paciente y medicina estratificada se ha dado por Trusheim, M.R., et al., Nature Reviews Drug Discovery (2007) 6, 4, 287-293.
Migración de Celulas Inmunes Como ya se observa arriba, en algunas modalidades un método de acuerdo a la invención comprende determinar, incluyendo monitorear, la migración de células inmunes expresando CD45 y CD49d. En algunas de estas modalidades el sujeto de quien se ha obtenido la muestra se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4. Generalmente, CD45d se expresa en todos los leucocitos, y CD49d se expresa en células T, B células, monocitos, eosinófilos y basófilos. En algunas modalidades la célula inmune a probarse es la célula T. En una modalidad la célula T es una célula T CD4+. En una modalidad la célula T es una célula T CD8+.
La capacidad migratoria de células inmunes es un prerequisito para reacciones inmunes. Un método respectivo de la invención que puede utilizarse para evaluar una competencia inmune del sujeto y estado de riesgo de desarrollar PML. Puede utilizarse cualquier téenica que es adecuada para determinar la capacidad migratoria de una célula inmune. Esto puede hacerse utilizando cualquier téenica conocida en la materia. En algunas modalidades se emplea un ensayos de quimiotaxis. Tales ensayos se basan en la migración funcional de las células inducida por un compuesto, y puede utilizarse para valorar la unión y/o efecto quimioatrayente de e.g. ligandos, inhibidores, o promotores. El uso de un ensayo in vitro se ilustra en los Ejemplos y también se describe en Pat. de E.U. No.5,514,555. En algunas modalidades el ensayo de quimiotaxis determina la migración a través del endotelia hacia un gel de colágeno (descrito en Kavanaugh et al, J. Immunol (1991) 146, 4149-4156). Tal ensayo puede incluir el uso de un equipo transwell. En algunas modalidades se disuelve un quimioatrayente en un lado de una barrera migratoria tal como un gel polimérico. Por el otro lado de la barrera migratoria se colocan las células de la muestra del paciente. La barrera migratoria es poros a un cierto grado de manera que las células de interés tales como células T son capaces de migrar a través de la misma. Los poros de la barrera migratoria porosa además permite el paso de moléculas quimioatrayentes, de manera que se forma un gradiente de difusión, que puede detectarse por las células de interés. Como un resultado las células se atraen para migrar a través de la barrera migratoria. Típicamente las células se dejan migrar en el equipo experimental para un cierto, e.g. predeterminado, periodo de tiempo, después de lo cual está por determinarse el número células migradas y/o la distancia de migración. Para este propósito barrera migratoria puede analizarse bajo un microscopio. Las células también pueden colorearse antes de iniciar el ensayo de quimiotaxis y su posición se determina de acuerdo a las señales obtenidas de la coloración.
En una modalidad, la capacidad migratoria se compara con aquella obtenida del mismo pacientes antes del tratamiento con a4-integrina, LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4. El valor obtenido puede fijarse a 100%. Después de que inicia el tratamiento, puede observarse y compararse una caída en migración celular inmune. La migración a un punto de tiempo dado puede caracterizarse por un valor promedio (medio) acoplado con un valor de desviación estándar. La migración celular en un sujeto puede considerarse diferente cuando es más de una desviación estándar diferente del valor promedio (supra). El valor de referencia puede definirse como la desviación estándar promedio menos 1. Cuando la diferencia cae por debajo del el valor de referencia, puede ser indicativa de un riesgo incrementado para ocurrencia de PML en el sujeto. Lo dicho arriba con respecto a un valor umbral en este aspecto aplica mutatis mutandis.
Como un ejemplo ilustrativo la siguiente tabla proporciona un nivel de referencia ejemplificativo para migración celular inmune que puede utilizarse. En este caso, la migración de células T CD3+ sobre el endotelio se ha monitoreado durante un periodo de tiempo.
Tabla 3: Valores de referencia ejemplificativos para migración de células T CD3+ Las células inmunes tienen una capacidad básica para migrar sobre barreras celulares y membranas permeables. Los inventores han encontrado que una falta o expresión de CD62L reducida y/o falta de o expresión reducida de PSGL-1 se asocia con una capacidad migratoria fuertemente reducida. Un ensayo de migración utilizado en un método de acuerdo a la presente invención puede incluir el uso de una membrana permeable. La membrana puede ser cualquier membrana comúnmente utilizada en el campo, tal como membrana de policarbonato (PC), poliéster (PET), y politetrafluoroetileno revestido con colágeno (PTFE), que están disponibles comercialmente (por ejemplo membrana Transwell®). Un ensayo de migración sobre una membrana permeable vacía, es decir, sin células, puede utilizarse para tal valoración. En algunas modalidades un ensayo migratorio incluye el uso de células. Las células tales como célula endotelial o líneas celulares están dentro del alcance de la presente invención. Ejemplos de células adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de la línea celular HMEC-1, de la línea celular endotelial del cerebro de humano HCMEC/D3, de las líneas celulares de murino mHEVa y mHEVc, de la línea celular endotelial vascular aórtica de ratón MAEC, de la Línea Celular Endotelial Cardiaca de Ratón MCEC, la línea celular de extremo c, y células de la línea celular de hibridoma mortal EA.hy926. Como un ejemplo adicional de células adecuadas, pueden utilizarse células endoteliales de la vena umbilical de humano (HUVEC), las cuales son células primarias aisladas de la vena umbilical de humano de un donador. En algunas modalidades se emplean las células epiteliales derivadas de plexos coroides de humano primarias. En algunas modalidades se utilizan células endoteliales microvasculares de cerebro de humano primarias.
Como se indica arriba, cualquier número de etapas de un método de acuerdo a un método de la invención, incluyendo el método completo, puede realizarse en una manera automático - también repetidamente, utilizando por ejemplo robots comercialmente disponibles. Las instrucciones ejecutables por computadora, por ejemplo, pueden ser análisis de datos de control o cursos mecánicos de control de movimientos empleados en un método de acuerdo a la invención. Como un ejemplo ilustrativo, el método puede ser un método de selección in vitro, por ejemplo llevado a cabo en microplacas de múltiples cavidades (e.g. placas convencionales de 48-, 96-, 384- o 1536 cavidades) utilizando estaciones de trabajo automáticas. El método también puede llevarse a cabo utilizando un kit de partes, por ejemplo diseñado para realizar el presente método. Como un ejemplo ilustrativo adicional, pueden iniciarse una o más etapas en la clasificación de célula, o pueden ajustarse los parámetros de clasificación de célula, utilizando una serie de instrucciones legibles por computadora. Tales instrucciones legibles por computadora pueden residir en un medio legible por computadora adecuado. Los medios legibles por computadora adecuados pueden incluir memoria volátil (e.g. RAM) y/o no volátil (e.g. ROM, disco), ondas portadoras y medios de transmisión (e.g. alambre de cobre, cable coaxial, medio de fibra óptica). Ondas portadoras ejemplificativas pueden tomar la forma de señales eléctricas, electromagnéticas u ópticas que transmiten corrientes de datos digitales a lo largo de una red local o una red públicamente accesible tal como Internet.
Kit Los reactivos necesarios o útiles en el contexto de la presente invención pueden proporcionarse en la forma de un kit. Tal un kit puede incluir en particular medios para detectar uno o más biomarcadores como se proporciona en la presente invención. Los medios para detectar un biomarcador se conocen en la materia, e incluyen, por ejemplo, el uso de un ligando tal como una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina, que opcionalmente se marca de manera detectable. Como se explica arriba el ligando puede utilizarse junto con un agente de detección que se une al biomarcador y/o el ligando. En una modalidad el kit puede incluir un ligando específico CD62L, y opcionalmente un ligando LFA-1. En una modalidad el kit puede incluir un ligando PSGL-1. En una modalidad el kit puede incluir tanto un ligando PSGL-1 específico y un ligando específico CD62L. El kit puede incluir además un ligando específico CD3. En algunas modalidades el kit puede incluir además un ligando específico CD4 y/o un ligando específico CD8. En algunas modalidades el kit puede incluir un recipiente que tiene una primer inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. La primer inmunoglobulina o molécula de unión proteinácea es capaz de unirse específicamente a PSGL-1. El kit también puede incluir un recipiente que tiene una segunda inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina. En algunas modalidades el kit también puede incluir un reactivo que permite la detección de una marca detectable, que se acopla a un ligando de PSGL-1, CD62L, LFA-1, CD3, CD4 y/o CD8. Como un ejemplo ilustrativo, la marca detectable puede ser una enzima y el reactivo puede ser un sustrato de la enzima. El sustrato, por ejemplo, puede convertirse por tal enzima en un producto que emite una señal tal como una señal fluorescente o una de color. En algunas modalidades el kit puede incluir un ligando multi-específico dirigido a CD3, CD62L y LFA-1, opcionalmente junto con un agente de detección. Un ligando multi-específico, por ejemplo, puede dirigirse a cualquiera de los dos CD3, CD62L, PSGL-1 y LFA-1. En una modalidad el kit incluye componentes para realizar un método para detectar CD3 y CD62L. En una modalidad el kit incluye componentes para llevar a cabo un método para detectar CD3 y PSGL-1. En una modalidad el kit incluye componentes para llevar a cabo un método para detectar CD62L y PSGL-1. En algunas modalidades el kit incluye una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina, o cualquier otro ligando dirigido a la proteína o ARNm de CDlla, y un ligando dirigido a la proteína o ARNm de CD18. Tal un kit también puede incluir un ligando dirigido a la proteína o ARNm de Runx3.
Un kit respectivo además puede incluir medios para inmovilizar el ligando a una superficie. Como se explica arriba, un ligando de ácido nucleico incluido en el kit puede tener una porción que permite, o facilita, una inmovilización en una superficie.
El kit puede incluir además instrucciones y/o impresión que indica que un paciente está por estratificarse por un método descrito en la presente; y/o instrucciones que consideran cómo llevar a cabo un método como se define en la presente. También puede incluir controles positivos y/o negativos que permiten una comparación con el control. El kit debe permitir la valoración de un progreso de tratamiento del paciente y el riesgo de ocurrencia de PML. Puede utilizarse un kit respectivo para llevar a cabo un método de acuerdo a la presente invención. Puede incluir uno o más dispositivos para acomodar antes los componentes anteriores, mientras se lleva a cabo un método de la invención, y a partir de ahí.
También se proporciona el uso de un kit que incluye componentes a emplearse en un ensayo de unión PSGL-1, y opcionalmente componentes a emplearse en un ensayo de unión CD62L y/o LFA-1 para determinar la competencia inmune de un sujeto. El sujeto puede someterse a tratamiento que incluye un agente bloqueador de a4-integrina, un agente bloqueador de LPAM-1 y/o un agente bloqueador de VLA-4 o uno o más compuestos anti-retrovirales. El ensayo de unión puede incluir un ligando PSGL-1 y opcionalmente un CD62L y/o LFA-1 un ligando como se describe arriba. El kit permite la valoración del riesgo de PML durante el curso del tratamiento. Por lo tanto, el médico puede determinar si detiene, continua, o resume el tratamiento de agente bloqueador de VLA-4 o uno o más compuestos anti-retrovirales, o hacer cualquier otro ajuste adecuado de un régimen de tratamiento respectivo.
El listado o exposición de un documento previamente publicado en esta especificación no necesariamente debería tomarse como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la téenica o es de conocimiento general.
La invención descrita de manera ilustrativa en la presente puede practicarse de manera adecuada en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no descritas específicamente en la presente. Adicionalmente, los términos y expresiones empleadas en la presente se han utilizado como términos de descripción y no de limitación, y no existen intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención reivindicada. De esta manera, debe entenderse que aunque la presente invención se ha descrito específicamente por modalidades ejemplificativas y características opcionales, la modificación y variación de las invenciones incorporadas, descritas en la presente pueden clasificarse por aquellos expertos en la materia, y que tales modificaciones y variaciones se consideran que están dentro del alcance de esta invención.
La invención se ha descrito amplia y genéricamente en la presente. Cada una de las especies más estrechas y agrupamientos subgenéricos que caen dentro de la descripción genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una provisión o limitación negativa que remueve cualquier materia sujeto del género, sin considerar si el material cortado se refiere específicamente o no en la presente.
Otras modalidades están dentro de las reivindicaciones anexas. Además, donde las características o aspectos de la invención se describen en los términos de grupos Markush, aquellos expertos en la materia reconocerán que la invención también se describe así en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.
Para que la invención pueda entenderse fácilmente y colocarse en efecto práctico, las modalidades particulares se describirán ahora a manera de los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS Los ejemplos ilustran las téenicas que pueden utilizarse en métodos de acuerdo a la invención así como modalidades ejemplificativas para determinar el nivel de células T que expresan L-CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1. Los estudios en años recientes han surgido con tres observaciones estadísticas para predecir un riesgo total del paciente con MS de desarrollar más tarde PML cuando se trata con Natalizumab, pero no existen posibilidad aún de medir el riesgo de PML del paciente. Esto, sin embargo, se necesita urgentemente para facilitar las decisiones de tratamiento de médicos y pacientes por igual, ya que muchos pacientes optan por continuar el tratamiento con Natalizumab aún cuando su riesgo estadístico de desarrollar PML aumenta hasta aproximadamente 1:120 con todos los tres factores de riesgo presentes. Una inmunovigilancia comprometida ha sido por mucho tiempo una hipótesis para explicar la ocurrencia de una infección oportunística, los inventores han diseñado un estudio para incluir una variedad de moléculas de adhesión en la superficie de las subpoblaciones de células inmunes. Los pacientes analizados incluyeron Ínter alia pacientes con MS bajo terapia a largo plazo con Natalizumab, pacientes con MS antes de la escalada a Natalizumab, pero con diversos tratamientos inmunomoduladores anteriores tales como e.g. Acetato de Glatiramer, Interferón-b, Azatioprina, o Metotrexato, pacientes infectados con V1H durante el estadio CDC B1-C2, y pacientes con V1H/SIDA durante el estadio CDC C3.
Los datos obtenidos muestran que dos moléculas de superficie se subregularon fuertemente en células T de pacientes quienes ya sea desarrollarían más tarde PML o, en el caso de VIH, han desarrollado recientemente PML. Estas moléculas fueron CD62L, y PSGL-1, ambas miembros de la familia de selectina. Además, LFA-1 fue del mismo modo subregulada fuertemente en células T de pacientes con MS bajo terapia con Natalizumab antes de la ocurrencia de PML. Estos marcadores por lo tanto son indicadores de riesgo, debido a su patrón de expresión durante terapia diferida con Natalizumab. La expresión de PSGL-1 subió continuamente durante tratamiento a largo plazo con Natalizumab, mientras la expresión de L-Selectina fue estable durante ese periodo de tiempo, significando que PSGL-1 debería considerarse un candidato ideal para predicción de riesgo mientras más dure la terapia y especialmente en células T CD8+, ya que la diferencia entre los pacientes no en riesgo y los pacientes en riesgo aumenta con el tiempo. Sin embargo, al inicio de la terapia, PSGL-1 mostró solamente una diferencia insignificante en pacientes en riesgo, mientras la expresión de L-Selectina se redujo ya fuertemente en algunos de los pacientes en riesgo posterior (hasta 45 meses antes del inicio de PML).
Ya que la expresión de L-Selectina fue usualmente más alta en células T CD4+ (debido en contraste a células T CD8+, no existen células CD4+CD62LCD45RA+), en algunos casos puede ser ventajoso utilizar células T CD4+ para el determinar riesgo cuando se utiliza L-Selectina. Como una nota adicional, un paciente solamente mostró la subregulación de L-Selectina, pero no PSGL-1 antes de PML. Por lo tanto, el realizar la medición combinada de ambas moléculas (L-Selectina y PSGL-1) en células T CD4+ y CD8+ en algunas modalidades puede ser ventajoso para valorar el riesgo de desarrollo de PML, y tomar una decisión de cambiar un régimen de tratamiento.
Sujetos tratados con Natalizuxnab Se valoró el estado y desarrollo longitudinal, así como la función de las poblaciones inmunes CSF y periféricas principales en pacientes bajo tratamiento a largo plazo con Natalizumab. El enfoque de los siguientes experimentos bajo estos ejemplos fue descubrir cambios en el estado inmune de pacientes para predecir posiblemente la ocurrencia de PML al valorar el impacto de Natalizumab en la función de la célula T al combinar el fenotipo inmune con ensayos funcionales in vítro y ex vivo.
Natalizumab, un anticuerpo IgG4 humanizado contra la a-cadena de VLA-4 (a4, CD49d), se ha aprobado para el tratamiento de esclerosis múltiple remitente-recurrente (RRMS) activa desde 2006. El tratamiento con Natalizumab a largo plazo se asocia con efectos secundarios severos, arriba de todo el desarrollo de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML). Además de la duración de tratamiento, la terapia inmunosupresora previa (Panzara, M.A., et al., Múltiple Sclerosis (2009) 15, 9, S132-S133) así como la presencia de virus JC, como se acierta por la presencia de anticuerpos anti-JCV en suero, contribuyen al riesgo de desarrollar PML asociada con Natalizumab (Bloomgren, G., et al., The New England Journal of Medicine (2012) 366, 20, 1870-1880). Cuando todos estos factores de riesgo están presentes, el riesgo estadístico de PML puede ser tan alto como 1:120 (Clifford, D. B., et al., Lancet Neurology (2010) 9, 4, 438-446; Bloomgren et al., 2012, supra). Aunque aún no está claro por qué y cómo el tratamiento (a largo plazo) con anti-CD49d contribuye al desarrollo de PML (Tan and Koralnik, 2010, supra), es probable un escenario multifactorial, incluyendo inmunovigilancia disminuida y réplica activa del virus JC (Schwab, N., et al. Múltiple Sclerosis [Houndmills, Basingstoke, Inglaterra] (2012) 18, 3, 335-344; Schwab, N., et al. Neurology (2012) 78, 7, 458-467). 114 pacientes con el diagnóstico de RRMS activa clínicamente definitiva de acuerdo a los criterios de diagnóstico de McDonald revisados del 2005 (Polman, C.H. et al., Ann Neurol (2005) 58, 840-846) se enlistaron en este estudio. 67 pacientes con MS se han tratado continuamente con Natalizumab por 18-66 meses, 21 pacientes con MS recibieron tratamientos inmunomoduladores base (Interferones, acetato de glatiramer) y 26 pacientes con MS no se trataron y clínicamente así como MRI-estable (cf. véase también Tabla 1, supra, para 22 de estos pacientes). Los donadores saludables (HD) que coinciden en edad y sexo sin historia previa de ninguna enfermedad mediada inmune o neurológica sirvieron como controles. Además, las muestras estuvieron disponibles de diferentes condiciones de PML asociada con terapia: asociada con Natalizumab (n=13), asociada con Rituximab (n=l) y asociada con Efalizumab (n=l). Seis casos de PML asociada con V1H sirvieron como controles adicionales. En 6 de los 13 casos asociados con Natalizumab de PML, estuvieron disponibles las muestras pre-PML (Fig. 14). La Tabla representa promedio + desviación estándar (si es aplicable).
El estudio se aprobó por el comité ético local (Ethik-Kommission der medizinischen Fakultát der Universitat Würzburg, número de registro 155/06; Ethik-Kommission der Árztekammer Westf len-Lippe und der Medizinischen Fakultát der Wesfálischen Wilhelms-Universitát, número de registro: 2010-245-f-S) y se obtuvo consentimiento escrito informado de todos los participantes. Este estudio se realizó de acuerdo a la Declaración de Helsinki.
Los datos mostrados en la Fig. ID, Fig.11, Fig.12 y Fig.13 se basan en un grupo más pequeño de pacientes. Se enlistaron 52 pacientes con el diagnóstico de RRMS activa clínicamente definitiva de acuerdo a los criterios de diagnóstico de McDonald revisados del 2005. Los pacientes con MS analizados se han tratado continuamente con Natalizumab por 18-50 meses y fueron estables por valoración de parámetros MRI y clínicos. 18 pacientes entre este grupo se sometieron a análisis de CSF en paralelo a la valoración de sangre periférica. 39 pacientes se siguieron longitudinalmente desde el inicio de tratamiento. Dos pacientes desarrollaron PML después de 26 o 29 meses, respectivamente. 45 donadores saludables (HD) que coinciden en edad y sexo sin historia previa de enfermedades mediadas inmunes o neurológicas sirvieron como controles. Además, 22 pacientes con MS no tratados sirvieron como controles (Tabla 1, supra). PBMC de pacientes que padecen PML (V1H+ (n=4), asociada con Natalizumab (n=3), asociada con Rituximab (n=l), asociada con Efalizumab (n=l)) se utilizaron como controles adicionales.
La sangre periférica (n=52) y fluido cerebroespinal (n=18) de pacientes bajo terapia con Natalizumab (³18 meses) se analizaron utilizando citometría de flujo y ensayos de migración transendotelial in vi tro.
Los datos mostrados en la Fig. 3A-B se basan en un grupo de pacientes de aún tamaño diferente. Se incluyeron 78 pacientes con el diagnóstico de RRMS activa clínicamente definitiva. Los pacientes con MS analizados se han tratado continuamente con Natalizumab por 18 a 60 meses y fueron estables por valoración de parámetros MRI y clínicos. Cinco pacientes desarrollaron PML. Además, se obtuvieron muestras de 30 pacientes con el diagnóstico de RRMS activa clínicamente definitiva antes del tratamiento con Natalizumab. 73 donadores saludables que coinciden en edad y sexo sin historia previa de enfermedades mediadas inmunes o neurológicas sirvieron como controles.
Pacientes con V1H Se analizaron muestras de 14 pacientes con V1H en diferente estadios de infección de VIH. Tres pacientes adicionales con VIH padecieron de PML. Las muestras de los 73 donadores saludables que coinciden en edad y sexo sin historia previa de enfermedades mediadas inmunes o neurológicas (supra) se incluyeron como controles.
Aislamiento de PBMC y Análisis Citométrico de Flujo Se aislaron células ononucleares de sangre periférica (PBMC) recientemente aisladas de EDTA por centrifugación de gradiente de densidad utilizando medio de separación de linfocito (PAA Laboratories, Pasching, Austria) como se describe previamente en Schwab et al J Immunol. (2010) 184, 9, 5368-5374, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. Se realizó análisis de citometría de flujo de CSF como se describe en Schwab et al. Múltiple Sclerosis (2009) 15, S275-S275, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. En caso de conflicto de un documento incorporado para referencia, la presente especificación, incluyendo definiciones, se controlará. Las células se crioconservaron entonces típicamente en medio de congelación (50% RPMI 40% FCS 10% DMSO).
Las células aisladas, cultivas o descongeladas ex vivo se enjuagaron con regulador FACS® (saliva fosfatoregulada (PBS) complementada con 0.1% albúmina de suero de bovino (BSA) y 0.1% NaN3) o regulador de coloración (salida fosfatoregulada (PBS) complementada con 0.1% albúmina de suero de bovino (BSA) y 200 mM EDTA). Las células se colorearon posteriormente con anticuerpos monoclonales marcados por fluorescencia (Mab) junto con IgG de ratón de bloqueo (Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemania) a 4°C por 30 min o a temperatura ambiente por 15 min. Después de enjuagar una vez con regulador de coloración, las células se miden inmediatamente en un FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y Citómetro de Flujo Gallios™ (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania) y se analizan utilizando software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) y Kaluza (Beckman Coulter). Debería observarse que la presencia de CD62L sobre la superficie celular tiende a ser inestable, de manera que el regulador de coloración no puede contener azida de sodio y necesita tener lugar la medición inmediatamente después del procedimiento de coloración.
En particular, la proteína LFA-1 se coloreó para CDlla, la a-cadena de LFA-1. VLA-4 se coloreó para CD49d (la a-cadena de VLA-4), ya que CD49d es la molécula precisa bloqueada por Natalizumab.
Inmunoglobulinas monoclonales utilizadas en estos Ejemplos fueron anti-CD62L (DREG-56, BioLegend), anti-CD3 (UCHT1, Beckman Coulter), anti-CD4 (13B8.2, Beckman Coulter), anti-CD8 (B9.ll, Beckman Coulter), anti-CDlla (HI111, BD Pharmingen), anti-CD14, (MoP9, BD Biosciences), anti-CD19 (HIB19, BD Biosciences), anti-CD45 (J33, Beckman Coulter), anti-CD45RA (HI100, Beckman Coulter), anti-CD56 (NCAM 16.2, BD Biosciences), anti-CD49d (9F10, Biolegend) y anti-CD197 (3D12, BD Biosciences).
Inmunohistoquimica Se investigaron de manera retrospectiva 2 muestras de tejido de plexos coroideos (autopsias) de 2 pacientes con esclerosis múltiple (ambas mujeres de 31 y 72 años de edad), y 15 muestras de tejido de pacientes sin enfermedades neurológicas (11 hombres, 4 mujeres; entre 24 y 81 años de edad, promedio 60 años). El estudio se aprobó por el Comité de Ética de la Universidad de Muenster. Para análisis histológico las muestras de tejido incrustadas en parafina se cortaron en secciones de 4 mm de grueso y se colorearon con hematoxilina y eosina (HE). Inmunohistoquímica para CD3 anti-humano de ratón (1:25) (Dako, Dinamarca) se realizó utilizando un inmunocolorante automático (autocolorante Link48, Dako) y la téenica de avidin-biotina. Se realizaron los parámetros a vapor (regulador de citrato pH6.1) para mejor recuperación de antigeno.
Ensayos de migración in vivo Las células endoteliales microvasculares de cerebro humano primarias (HBMEC) y células epiteliales de plexos coroideos (HCPEpiC) se compran de ScienCell Research Laboratories (San Diego, CA, USA). Las células se cultivaron en membrana de filtro de Transwells (3pm de tamaño de poro; Corning, New York, USA) por tres días hasta que se alcanzó la confluencia.
Los ensayos de transmigración se realizaron esencialmente como se describe en Schneider-Hohendorf et al.
Eur J Inmunol. (2010) 40, 12, 3581-3590, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, se controlará. Brevemente, PBMC en IOOmI de medio RPMI pre-calentado (RPMI, Penicilina/Estreptamicina (1%), complemento B27 (2%) [Invitrogen, Darmstadt, Alemania]) se agregó a la parte superior de las monocapas HBMEC, y 600 ml de medio se agregaron a la cámara exterior de las piezas de inserción. Las células se dejaron migrar por seis horas en una incubadora de cultivo celular húmeda a 37°C y 5% CO2-Los conteos absolutos de las células T se miden con Fluoroesferas de Conteo de Flujo siguiendo las instrucciones del fabricante (Beckman Coulter) para normalizar las tasas de migración a concentraciones de perla estandarizadas.
Análisis Estadísticos El significado estadístico de diferencias entre dos grupos se determinó utilizando la prueba t de Studen incomparable excepto para comparaciones entre sangre periférica y CSF del mismo paciente, donde se utiliza la prueba t de Studen incomparable. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con valores p* <0.05, con p**<0.01 y p***<0.001. el software para valoración de correlación y estadística fue Prisma 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA).
Cambios en la composición de los subconjuntos inmunes principales bajo -terapia a largo plazo con Na alizumab La caracterización de las subpoblaciones de célula inmune periférica principales en pacientes bajo tratamiento a largo plazo con Natalizumab (n=34, tratamiento ³ 18 meses) (Fig. 2). El porcentaje de células T CD4+ no se desvia significativamente de donadores saludables y pacientes con MS no tratados. El compartimiento CSF de estos pacientes (n=18) se caracterizó por porcentajes reducidos de células B y células T CD4+ en comparación con sangre periférica. La proporción CD4/CD8 en CSF se redujo a 0.54 (11.8:21.8), indicando un efecto más fuerte de Natalizumab en células T CD4 que en CD8 (Fig.4).
Impacto de tratamiento a largo plazo con Natalizumab en el fenotipo y función de la célula T Como se publicó previamente (Defer, G., et al., J Neurol Sci (2012) 314, 1-2, 138-142; Harrer, A., et al., J Neuroinmunol (2011) 234, 1-2, 148-154), el tratamiento con Natalizumab influenció la expresión de CD49d en células T CD4+ periféricas de pacientes con el tiempo. Sin embargo, podría observarse que después de una disminución de la expresión de superficie a un mínimo en el mes seis de tratamiento, se recuperaron sorprendentemente los niveles de CD49d. Como observación, podría mostrarse que un paciente, quien desarrolló anticuerpos contra Natalizumab, no subregula CD49d en células T CD4+, las cuales podrían utilizarse fácilmente como un marcador temprano para la detección de pacientes quienes no se beneficiarán de Natalizumab debido a la producción de anticuerpos, como se sugirió previamente por (Defer et al., 2012, supra). Sin embargo, citometría de flujo CSF mostró que los niveles de CD49d en células T CD4+ no se detectaron en estos pacientes en comparación con sus contrapartes periféricas, independiente de la recuperación periférica (datos no mostrados), mientras se ha mostrado repetidamente que los pacientes con MS de control usualmente muestran una expresión de CD49d fuertemente mejorada en células T CSF cuando se compara con la periferia (datos no mostrados y (Barrau, M.A. et al., J Neuroinmunol (2000) 111, 215-223). Adicionalmente, las T CD4+ células en pacientes bajo tratamiento a largo plazo se caracterizan por faltarles la expresión de CD45RA y CCR7 (indicando un fenotipo de memoria efectora). Esto permanece en contraste con el fenotipo similar a memoria central (CD45RA-CCR7+), que se ha publicado previamente para pacientes con MS (Kivisákk, P., et al., Ann Neurol (2004) 55, 627-638). Los resultados similares se obtuvieron para células T CD8+ (datos no mostrados). Los compartimientos de memoria efectora (como se determina por expresión de CCR7) en la periferia no se afectaron significativamente por terapia a largo plazo con Natalizumab (datos no mostrados) (Planas, R., et al., Eur J Inmuno1. (2011) doi: 10.1002/eji.201142108). CSF se genera en los plexos coroideos (CP), que también se ha mostrado en modelos animales que son el sitio de entrada principal para leucocitos durante inmunovigilancia CNS (Carrithers, M.D., et al., Brain (2000) 123 (Pt 6), 1092-1101) así como inflamación (Reboldi, A., et al., Nat Inmunol (2009) 10, 514-523). Los inventores podrían mostrar que esta vía es un sitio posiblemente de entrada para células T en el sistema de humano durante condiciones homeostáticas así como patológicas. En ambas muestras de tejido con MS así como en 7 fuera de 15 controles los inventores, los inventores detectaron células CD3 positivas en los plexos coroideos. La mayoría de las células T se ubicaron perivascularmente, sin embargo los inventores también observaron células T únicas en proximidad al epitelio. Como administración de Natalizumab se asume que reduce la invasión de CNS de leucocitos al inhibir la adhesión celular inmune a células endoteliales de la barrera cerebro-sanguínea (BBB), fue inesperado que la comparación comparativa de migración individual a través del endotelio microvascular derivado de cerebro de humano primario reveló una fuerte heterogeneidad entre pacientes tratados con Natalizumab en comparación con controles saludables o pacientes con MS no tratados (Fig. 5), aún cuando todos los pacientes tratados se consideraron clínicamente estables. En contraste a esto, la diapédesis a través del epitelio derivado de plexos coroideos primarios (simulando la barrera sanguínea-CSF) reveló una reducción significativa y homogénea en pacientes tratados a largo plazo con Natalizumab (Fig. 6). Ya que los inventores han observado una fuerte correlación entre la expresión de CD49d y duración de tratamiento, decidieron analizar la heterogeneidad aparente de migración transendotelial en relación con los meses de tratamiento con Natalizumab en más detalle.
Valoración Longitudinal de función de célula T bajo tratamiento con Natalizumab: Implicaciones para el desarrollo de PML PML asociada con terapia ha desarrollado un reto significativo en un número de especialidades médicas durante los últimos varios años (Vinhas de Souza, M., et al., Clinical Pharmacology and Therapeutics (2012) 91, 4, 747-750). PML asociada con Natalizumab ha atraído considerable atención, ya que el tratamiento anti-CD49d se ha asociado con un número particularmente grande de casos de PML en una población, que tradicionalmente no está en riesgo. Se han identificado tres factores que pueden utilizarse en herramientas de estratificación de riesgo. Dos, principalmente uso inmunosupresor anterior y duración de terapia, se basan en observaciones estadísticas, mientras uno, presencia de anticuerpos anti-JCV, se basa en un parámetro biológico específico del paciente. Sin embargo, incluso la seropositividad de JCV es relativamente no específica, ya que simplemente identifica pacientes quienes han tenido o actualmente tienen una infección de JCV y por lo tanto la posibilidad teórica de desarrollar PML, que se media por JCV (Panzara et al., 2009, supra; Clifford et al., 2010, supra,- Gorelik, L., et al. Annals of Neurology (2010) 68, 3, 295-303; Bloomgren et al., 2012, supra). Se necesita urgentemente un método para medir una respuesta biológica del individuo a tratamiento como una manera de monitorear el riesgo de PML. Los inventores utilizaron los siguientes grupos de donadores de sangre para diferenciar entre los efectos de MS, pre-tratamientos, y Natalizumab: 1) controles saludables, 2) pacientes con MS con tratamiento simple, 3) pacientes con MS antes del tratamiento con Natalizumab y 4) pacientes con MS bajo terapia a largo plazo con Natalizumab (18-66 meses). Los sujetos tratados con Natalizumab se reclutaron de cinco cohortes separados (Würzburg, Münster, Osnabrück (Alemania), French Grupo Study (Francia) y Brascia (Italia)). En parte entre estos cinco grupos, los inventores tuvieron acceso a muestras de 13 pacientes con PML. De manera importante, seis de estos pacientes han dado sangre antes del diagnóstico de PML (19, 26, 4, 15, 21, 20 meses antes del diagnóstico PML). Como controles adicionales, se analizaron las muestras de pacientes sin Natalizumab quienes desarrollaron PML (tanto asociada a terapia como asociada a V1H; ver diseño de estudio y Fig.14) . Sorprendentemente, nuestros resultados mostraron que porcentaje de Células que expresan CD62L fue consistentemente más bajo (por más de diez veces) en las Células T CD4 de pacientes quienes después desarrollarían PML con un promedio de 3.3% en comparación con un promedio de 46.6% de pacientes sin PML con Natalizumab (Fig.1A, y Fig.7 para diagramas de punto individuales).
Además, las muestras de pacientes que padecen PML agudo también mostraron una reducción o falta de expresión de CD62L, indicando una desregulación persistente al menos hasta el punto de Diagnóstico de PML. La expresión de CD62L mostró un patrón más diverso en pacientes con PML después del diagnóstico, tal vez debido a los tratamientos agudos administrados para anejo de la PML. Después de PML (fase de recuperación, síndrome de reconstitución post inmune, IRIS), el porcentaje células CD4+ expresando CD62L regresó a un rango más normal (45.4%) (Fig. IB). La expresión de superficie de CD62L en células T CD4+ fue más alta que en células T CD8+. Por lo tanto, la detección de niveles de CD62L en células T CD4+ permitió la discriminación más aguda de pacientes quienes desarrollaron eventualmente PML (datos no mostrados). Debe observarse que, los presentes inventores encontraron que el utilizar el porcentaje células positivas contra el isotipo (en contraste a MFI) dio los resultados más reproducibles en diferentes citómetros de flujo. El acceso detallado se traza en la Fig.7.
Los niveles de expresión de CD62L y LFA-1 se siguieron longitudinalmente en 39 pacientes con Natalizumab en relación a migración transendotelial. Notablemente, los niveles LFA-1 (Fig. 11) y CD62L (Fig. 12) periféricos mostraron una disminución pronunciada dentro de los primeros meses, con un mínimo de 6 meses de terapia, seguido por una recuperación gradual posterior. Funcionalmente, este cambio (niveles reducidos de CD49d, LFA-1, y CD62L) condujo a una reducción pronunciada de migración de célula T hasta 6 meses de terapia y una recuperación posterior (Fig.13). Entre los meses 3 y 12 de tratamiento, la migración transendotelial de células T in vitro se reduce severamente, lo que coincide con la expresión reducida de CD62L y LFA-1.
Dos pacientes en el grupo en el cual se basan los datos de la Fig. ID, Fig. 11, Fig. 12 y Fig. 13, desarrollaron PML después de 26 (Fig.11 a Fig.13, círculos grises) y 29 (11 a Fig. 13, círculos blancos) meses de terapia. Análisis de estas muestras de pacientes (punto de tiempo 0 no estuvo disponible) reveló que, en contraste con el desarrollo normal, los niveles de LFA-1 en células T CD4+ disminuyeron además después de 12 meses de terapia en lugar de la recuperación esperada (Fig.11). Adicionalmente, la expresión de CD62L estuvo completamente ausente durante el periodo de tiempo investigado para uno de los pacientes que desarrolló después PML (Fig.12) y la migración de células T ya es muy baja en el mes 1. La función migratoria no se recupera con el tiempo (Fig.13). Notablemente, el análisis de uno de estos pacientes más de un año después de PML reveló una expresión restaurada de migración transendotelial/CDlla con recuperación deficiente de la expresión de CD62L.
En comparación con los pacientes de control (pacientes que no desarrollaron PML), los pacientes con PML mostraron una falta de recuperación de LFA-1, (Fig.11), una falta o expresión reducida de CD62L y una falta de recuperación de CD62L (Fig.12), y migración transendotelial reducida (Fig.13).
Los pacientes que padecen PML (n=8) asociados con infección de V1H o tratamiento con anticuerpos monoclonales (Natalizumab, Rituximab, Efalizumab) mostraron una falta similar de expresión de CD62L en la superficie de células T CD4+ al inicio de su PML. De nuevo esto no se asocia con un cambio hacia las células T de memoria efectora como se delinea por las coloraciones CD45RA/CCR7 (datos no mostrados).
Tal vez de manera importante, también se alteró la distribución de memoria efectora (valorada por CCR7) (Schwab et al., Múltiple Sclerosis, 2012, supra; Sottini, A., et al. PLoS ONE (2012) 7, 4, e34493) de dos de estos pacientes, mientras los otros cuatro fueron comparables con HDs (datos no mostrados). Esto puede definir un grupo con riesgo inherente de desarrollo de PML bajo condiciones específicas.
Aunque se necesita más investigación, los resultados de los inventores sugieren un paradigma de tratamiento posible donde, después de más de 18 infusiones de Natalizumab (meses de terapia), se valora el porcentaje de células CD4+ CD62L positivas. Si el nivel de CD62L cae por debajo de un umbral definido, que en este estudio podría fijarse a aproximadamente 25%, (Fig.1A, línea punteada en la porción derecha inferior; definida como dos veces la desviación estándar (SD) del promedio (m) del grupo control (promedio=46.6; SD=11.1; umbral=24.5)) puede ser recomendable una re-valoración previa (e.g. un mes después) del porcentaje de células T que expresan CD62L. La falta continua de CD62L podría indicar un riesgo más alto de PML y garantizar ya sea monitoreo clínico muy cercano o un cambio potencial en los regímenes de tratamiento (cese de Natalizumab). Ya que PML aguda parece ejercer efectos variables, pero no bien entendidos en el sistema inmune, CD62L no debería utilizarse como un método de diagnóstico de PML per se, sino que como un factor de riesgo prospecto para desarrollar PML en el futuro.
Tomados juntos, el presente ensayo a base de célula para predicción de riesgo de PML puede proporcionar una herramienta inmensamente valuable para pacientes y practicantes en el campo de tratamiento de MS, sin embargo necesita validarse además en grupos multicentro, más grandes, así como utilizar más muestras de paciente recolectadas antes del desarrollo de PML.
Análisis PCR en Tiempo Real El aislamiento de ARN se realiza Trizol® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. ARNm se transcribe utilizando hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa MuLV (todos los reactivos suministrados por Applied Biosystems, Foster City, USA). Los ensayos de expresión genética para la detección y cuantificación de CDlla, Runx3 y CD62L y el gen cuidador hS18 se compraron de Applied Biosystems y se utilizaron de acuerdo al protocolo del fabricante. Se utilizó el sistema en tiempo real Applied Biosystems Step-One Plus, todas las muestras se corrieron por duplicado y cada corrida contuvo varios controles (muestras de donadores saludables, cavidades sin ADNc). No hubo diferencias significativas en el umbral de ciclo ni dentro ni entre los experimentos. La cuantificación de la expresión genética se realizó al comparar las eficiencias de amplificación de genes objetivo y cuidador. Todas las muestras se normalizaron a hS18. Por lo tanto, un valor CT inferior es igual a una expresión más alta de ARNm del objetivo específico. Las Figuras 10-12 muestran la cuantificación relativa de CDlla, Runx3, y CD62L en comparación con hS18 en PBMC descongelada de pacientes con MS antes (mes 0) y en el curso de tiempo de terapia (meses 1, 3, 6, 12, 15-20, 21-25, 26-30, 31-40, 41-50; n=27 pacientes) como se valora por PCR en tiempo real.
El tratamiento con Natalizumab a largo plazo conduce a cambios en la distribución de subcojunto inmune periférico, que es de acuerdo a reportes previos (números incrementados de células B periféricas, atribuidos al reclutamiento de células B precursoras (Krumbholz, M., et al., Neurology (2008) 71, 1350-1354) y números disminuidos de monocitos CD14+ periféricos (Skarica, M. , et al., J Neuroinmunol (2011) 235, 1-2, 70-76). El incremento en células T CD8+ periféricas sin cambios significativos en el compartimiento CD4 posiblemente puede contribuir a la proporción inversa CD4/CD8 en CSF, como se observó en el grupo de estos Ejemplos y previamente publicado (Stüve, O, et al., Arch Neurol (2006) 63, 1383-1387). No mutuamente exclusivo, las células CD4 también pueden someterse a apoptosis al encontrar el anticuerpo por un periodo de tiempo prolongado, que se ha publicado para exposición a corto plazo in vitro (Kivisákk, P., et al., Neurology (2009) 72, 1922- 1930). Las alteraciones en expresión de CD62L y LFA-1 en células T, que se han mostrado previamente por sus células madre CD34+ (Jing, D., et al., Bone Marrow Transplantation (2010) 45, 1489-1496), también pueden deberse a la co ubicación de CD49d con CD62L en microvilli de superficie celular (Wedepohl, S., et al., Eur J Cell Biol. (2012) 91, 4, 257-264). En contraste a CD62L, LFA-1 solamente se expresa en el cuerpo celular plano (ibid.), sugiriendo que la expresión de LFA-1 se regula en el nivel de expresión genética, ya que la conexión entre CD49d y LFA-1 ha mostrado en el marco invertido, donde el bloqueo de CDlla aumentó el porcentaje de células T CD49d+ (Harper, E.G., et al., J Invest Dermatol (2008) 128, 1173-1181).
LFA-1 y CD62L han estado juntos previamente con CD45RA como marcadores para distinguir células T simples, de memoria central, y efectoras-memoria (Maldonado, A., et al., Arthritis Res Ther (2003) 5, R91-R96; Okumura, M., et al., J Inmunol (1993) 150, 429-437). Estas subpoblaciones difieren de sus tareas funcionales con células de memoria central confiriendo inmunidad contra virus y células cancerígenas y células efectoras-memoria que producen citocinas como IFN-g e IL-4 (revisado en (Wherry, E., et al., Nat Inmunol. (2003) 4, 3, 225-234). CSF de pacientes con MS ha mostrado que consiste principalmente de células de memoria central (Giunti, D., et al., J Leukoc Biol (2003) 73, 584-590; Kivisákk et al., 2004, supra). Esta población se conocen por incluirse en daño de CNS inmunomediado durante EAE (Grewal, I.S., et al., Immunity (2001) 14, 291-302) invadiendo el CNS a través de los plexos coroides (Reboldi, A., et al., Nat Inmunol (2009) 10, 514-523). El CSF de pacientes bajo tratamiento a largo plazo con Natalizumab, sin embargo, casi exclusivamente contiene células T como efectoras-memoria. Además, migración transepitelial de pacientes tratados a largo plazo con Natalizumab permanentemente se reduce mientras la migración transendotelial se recupera durante terapia a largo plazo. Los plexos coroides dividen la sangre y CSF que consiste de dos barreras, una barrera endotelial en el lado de la sangre y una epitelial en el lado de CSF (Engelhardt, B., et al., Microsc Res Tech (2001) 52, 112-129) y revisado por (Wilson, E.H., et al., J Clin Invest (2010) 120, 1368-1379). En línea con descubrimientos previos en el sistema murino, mostrando que CD49d es mandatorio para adhesión a la barrera epitelial, pero no a la endotelial (Steffen, B.J., et al., Am J Pathol (1996) 148, 6, 1819-1838) de los plexos coroides, es concebible que Natalizumab afecte de manera eficiente esta ruta al CSF, resultando en un bajo conteo celular en el CSF de pacientes y los efectos anti-inflamatorios clínicos. La inmunovigilancia, que puede realizarse utilizando rutas alternativas e.g. a través del espacio subaraenoideo o directamente a través de la barrera hematoencefálica (revisado por Hickey, W.F., Semin Inmunol (1999) 11, 125-137), aún debería ser funcional en pacientes bajo tratamiento a largo plazo con Natalizumab, ya que solamente requieren cruzar una barrera endotelial. En línea con esto, las células T en el CSF de pacientes con Natalizumab no expresan CD49d, indicando que estas células no utilizan los plexos coroides como sitio de entrada en el CNS. Se mostró muy recientemente que las células Thl7 en EAE migran hacia la médula espinal independientemente de a4 integrina, mientras las células Thl, las cuales se supone que son principalmente responsables de patología MS, utilizan a4 integrina para la migración hacia el cerebro (Rothhammer, V., et al., J Exp Med. (2011) 21, 208, 12, 2465-2476). La invasión de estas células Thl putativamente patogénicas, por lo tanto, se inhibiría por Natalizumab.
Entre los meses 3 y 12 de tratamiento, se reduce severamente la migración transendotelial de células T in vitro. Esto coincide con una expresión reducida de LFA-1 y CD62L, ambas siendo moléculas imperativas para la migración endotelial (revisado por (Ransohoff et al., Nat Rev Inmunol. (2003) 3, 7, 569-581). De manera interesante, esto se ajusta a los datos previamente publicados, mostrando respuestas de la célula T a JCV máximas, pero también específicas de Epstein-Bar, Cytomegalo y MOBP en el mismo periodo de tiempo indicando que la mayoría de las células T efectoras cebadas se atrapan eficientemente en la periferia (Jilek,S., et al., Lancet Neurol. (2010) 9, 3, 264-272). Como una nota aparte, la modulación observada de LFA-1 debería tener mayores implicaciones para la función de célula T además de la migración, tal como formación de sinapsis inmunológica junto con CD49d, citotoxicidad y reestimulación específica de antígeno (Mittelbrunn, M., et al., Proc Nati Acad Sci E.U.A. (2004) 27, 101(30):11058-63; Rutigliano, J.A., et al., 2004, J Virol. (2004) 78, 6, 3014-3023; Yarovinsky, T.O., et al., Am J Respir Cell Mol Biol. (2003) 28, 5, 607-615).
Ciertamente, los paradigmas de migración aplicados solamente pueden reflejar parcialmente la situación in vivo, ya que especialmente el medio inflamatorio en las etapas de una posible recaída MS no puede simularse de manera apropiada in vitro a la fecha. Sin embargo, una barrera celular no inflamada que carece de estímulos de atracción en el lado basolateral más probablemente refleja las condiciones de inmunovigilancia básica que consideramos tan importante en términos de controlar un evento de reactivación de JCV. Además, los paradigmas in vitro se diseñaron para identificar individuos en riesgo de PML a gran escala y por lo tanto se mantuvieron tan básicos como fue posible para permitir la máxima reproducción experimental.
Cinco pacientes en el grupo de los inventores desarrollaron PML. Uno de estos pacientes se ha descrito previamente en un reporte del caso, principalmente enfocándose en la respuesta inmune durante PML e IRIS posterior (Schwab, N., et al., Mult Scler. (2012) 18, 335- 344). Impresionantemente, todos los 5 pacientes con PML compartieron tres diferencias remarcables con el resto del grupo investigado: 1) migración transendotelial reducida por el periodo de tiempo completo, 2) recuperación de LFA-1 faltante después de 12 meses, 3) expresión y recuperación de CD62L faltante. Los datos de pacientes PML asociados con Natalizumab después del intercambio de plasma revelaron que las tasas de migración se normalizaron después de parar el tratamiento con Natalizumab, mientras la expresión de CD62L solamente se recuperó a algún grado. Esto puede sugerir una posible condición pre-existente en algunos pacientes, posiblemente asociados con un cambio predispuesto en compartimentos de célula T efectora/memoria (Schwab et al., 2012, supra). Todas las muestras de paciente al inicio de PML mostraron la ausencia muy característica de CD62L mientras se dejan los porcentajes efectora-memoria intactos (valorados CCR7). Debería observarse que especialmente las células T CD4 (CD45RA+CCR7+) simples que carecen de la expresión de CD62L no existen en los controles. CD62L por lo tanto puede ser el primer biomarcador dinámico que une todos los tipos diferentes de PML (tratamiento concerniente asociado con anticuerpo con Natalizumab, Efalizumab, y Rituximab, así como asociado a V1H). Además necesitan conducirse estudios para descubrir si la pérdida de CD62L contribuye al desarrollo de PML o si no se asocia funcionalmente, sino que sintomáticamente.
Tomado juntos, los datos anteriores soportan la suposición de que parte de la eficacia clínica de Natalizumab se debe a la inhibición selectiva de la vía de tránsito de la célula T a través de los plexos coroides hacia el CNS responsable de la entrada de células efectoras durante los eventos inflamatorios, es decir, recaída de MS. La recuperación ausente de migración transendotelial podría resultar en inmunovigilancia CNS básica deteriorada, incrementando así el riesgo de desarrollar PML. No puede excluirse que otros biomarcadores también pueden ser importantes en pacientes en riesgo aumentado de PML. Por lo tanto, las hipótesis de los inventores debe evaluarse y expandirse en grupos más grandes. Sin embargo, los inventores sugerirían probar pacientes bajo tratamiento a largo plazo por su capacidad de migración transendotelial, sus niveles periféricos de LFA-1, y especialmente CD62L para valorar la competencia inmune básica. Los pacientes que muestran inmunovigilancia comprometida deberían monitorearse clínicamente de manera muy próxima.

Claims (84)

REIVINDICACIONES
1. Un método para valorar el riesgo de ocurrencia de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) en un sujeto, comprendiendo el método detectar el nivel de células T que expresan el ligando-1 de glicoproteína de P-selectina (PSGL-1) en una muestra del sujeto, en donde un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica un riesgo incrementado de ocurrencia de PML.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el valor umbral se basa en el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra de control.
3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además detectar el nivel de al menos una de las células T que expresan L-selectina (CD62L) y células T que expresan un antígeno-1 asociado con la función del linfocito (LFA-1) en la muestra, en donde un nivel disminuido de al menos una de las células T que expresan CD62L y LFA-1, con relación a un valor umbral, indica un riesgo incrementado de ocurrencia de PML.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el sujeto padece de una condición inmunocomprometida o se encuentra bajo terapia inmunosupresora.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el sujeto se encuentra (a) infectado con V1H, (b) bajo terapia contra rechazo de aloinjerto, (c) bajo terapia contra enfermedad de injerto contra huésped, o (d) bajo terapia contra una enfermedad autoinmune.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la enfermedad autoinmune es una de esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, psoriasis, y una miopatía inflamatoria idiopática.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sujeto se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o tratamiento con un agente bloqueador de VLA-4.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el agente bloqueador de a4-integrina y/o el agente bloqueador de VLA-4 es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en donde el valor umbral de CD62 se basa en el nivel de células T que expresan CD62L en una muestra de control, y en donde el valor umbral de LFA-1 se basa en el nivel de células T que expresan LFA-1 en una muestra de control.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 comprende detectar al menos uno de: (i) el número de células T en la muestra del sujeto que tienen PSGL-1 sobre la superficie celular, (ii) la cantidad de PSGL-1 presente en células T de la muestra del sujeto, y (iii) la cantidad de formación de ácido nucleico del gen SELPLG que codifica PSGL-1 en células T de la muestra del sujeto.
11. El método de la reivindicación 10, en donde (i) detectar el número de células T en la muestra que tienen PSGL-1 sobre la superficie celular y/o (ii) detectar la cantidad de PSGL-1 presente en células T de la muestra comprende poner en contacto las células T en/de la muestra con un ligando, en donde el ligando es específico para PSGL-1, y detectar la cantidad del ligando que se une a PSGL-1.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en donde detectar el nivel de células T que expresan CD62L y/o LFA-1, según sea aplicable, comprende detectar al menos uno de: (i) el número de células T en la muestra del sujeto que tienen CD62L y/o LFA-1 sobre la superficie celular, (ii) la cantidad de CD62L y/o LFA-1 presente en las células T de la muestra del sujeto, y (iii) la cantidad de formación de ácido nucleico de al menos uno de (a) el gen SELL que codifica CD62L, y (b) el gen ITGAL que codifica CD11A y el gen ITGB2 que codifica CD18, en células T de la muestra del sujeto.
13. El método de la reivindicación 12, en donde (i) detectar el número de células T en la muestra que tienen CD62L y/o LFA-1 sobre la superficie celular y/o (ii) detectar la cantidad de CD62L y/o LFA-1 presente en células T de la muestra comprende poner en contacto las células T en/de la muestra con un ligando, en donde el ligando es específico para CD62L y LFA-1, respectivamente, y detectar la cantidad del ligando que se une a CD62L y LFA-1, respectivamente.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método comprende además determinar la migración de células inmunes CD45+CD49d+.
15. El método de la reivindicación 14, en donde las células inmunes son células T.
16. Un método para estratificar a un sujeto que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o tratamiento con un agente bloqueador de VLA-4 para la suspensión del tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4, comprendiendo el método detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica que el sujeto se encuentra con necesidad de la suspensión del tratamiento con un agente bloqueador de oc4-integrina y/o tratamiento con un agente bloqueador de VLA-4.
17. El método de la reivindicación 16, en donde el valor umbral se basa en el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra de control.
18. El método de la reivindicación 16 ó 17, que comprende además detectar el nivel de células T que expresan al menos uno de CD62L y LFA-1 en la muestra, en donde un nivel disminuido de al menos una de las células T que expresan CD62L y LFA-1, con relación a un valor umbral, indica que el sujeto se encuentra con necesidad de la suspensión del tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o tratamiento con un agente bloqueador de VLA-4.
19. El método de la reivindicación 18, en donde el valor umbral se basa en el nivel de células T que expresan CD62L y células T que expresan LFA-1, respectivamente, en una muestra de control.
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende detectar repetidamente el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra del sujeto.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 y 18 a 20, que comprende detectar repetidamente el nivel de al menos una de las células T que expresan CD62L y/o células T que expresan LFA-1 en una muestra del sujeto.
22. Un método para estratificar a un sujeto que se somete a Terapia Antirretroviral Altamente Activa (HAART) para modificación de la HAART, comprendiendo el método detectar el nivel de células T que expresan al menos una de CD62L y PSGL-1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel disminuido de células T que expresan CD62L y/o PSGL-1, con relación a un valor umbral, indica que el sujeto se encuentra con necesidad de una modificación de la HAART.
23. El método de la reivindicación 22, en donde el sujeto tiene una infección de V1H.
24. El método de las reivindicaciones 22 ó 23, en donde el valor umbral de CD62 se basa en el nivel de células T que expresan CD62L en una muestra de control, y en donde el valor umbral de PSGL-1 se basa en el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra de control.
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde detectar el nivel de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1, según sea aplicable, comprende detectar al menos uno de: (i) el número de células T en la muestra del sujeto que tienen CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 sobre la superficie celular, (ii) la cantidad de CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 presente en células T de la muestra del sujeto, y (iii) la cantidad de formación de ácido nucleico de al menos uno de (a) el gen SELL que codifica CD62L, (b) el gen ITGAL que codifica CD11A y el gen ITGB2 que codifica CD18, y (c) el gen SELPLG que codifica PSGL-1 en células T de la muestra del sujeto.
26. El método de la reivindicación 25, en donde (i) detectar el número de células T en la muestra que tienen CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 sobre la superficie celular y/o (ii) detectar la cantidad de CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 presente en células T de la muestra comprende poner en contacto las células T en/de la muestra con un ligando, siendo el ligando específico para al menos uno de CD62L, LFA-1 y PSGL-1, y detectar la cantidad del ligando que se une a CD62L, LFA-1 o PSGL-1.
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, que comprende detectar repetidamente el nivel de al menos una de las células T que expresan CD62L, células T que expresan LFA-1 y células T que expresan PSGL-1 en una muestra del sujeto.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, en donde detectar el número de células T en la muestra del sujeto que tiene CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 sobre la superficie celular comprende determinar el número de células T en la muestra que no tienen CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 sobre la superficie celular.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra es una de una muestra sanguínea, una muestra de células sanguíneas, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
30. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células T son células T CD3+.
31. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células T son al menos una de células T CD4+ y células T CD8+.
32. El uso in vitro de un ligando específico para PSGL-1 para al menos uno de (i) valorar el riesgo de ocurrencia de PML en un sujeto, y (ii) estratificar a un sujeto que se somete a tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o tratamiento con un agente bloqueador de VLA-4 para la suspensión del tratamiento con un agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4.
33. El uso in vitro de un ligando específico para CD62L o específico para PSGL-1 para estratificar a un sujeto que se somete a HAART para modificación de la HAART.
34. El uso in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 32 ó 33, en donde el ligando específico para PSGL-1 es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para PSGL-1.
35. El uso in vitro de la reivindicación 32, en donde el ligando específico para CD62L es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina específicas para CD62L.
36. Un agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4 para utilizarse en el tratamiento de una condición inmunocomprometida para evitar la ocurrencia de PML, en donde el uso comprende la administración del agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4 en un sujeto durante un periodo de tiempo, seguido por una interrupción de la administración por un periodo de tiempo, en donde la interrupción de la administración del agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4 se efectúa después de la detección de un nivel disminuido de células T que expresan PSGL-1 en el sujeto, con relación a un valor umbral.
37. El agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4 para el uso de la reivindicación 36, en donde la condición inmunocomprometida es una enfermedad autoinmune.
38. El agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4 para el uso de la reivindicación 37, en donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste de una enfermedad inflamatoria patológica dentro del CNS, la enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico y una miopatía inflamatoria idiopática.
39. El agente bloqueador de a4-integrina y/o VLA-4 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 36 - 38, en donde el valor umbral de células T que expresan PSGL-1 se basa en el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra de control.
40. Una combinación de compuestos antirretrovirales para utilizarse en el tratamiento de infección retroviral para evitar la ocurrencia de PML, en donde el uso comprende la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales a un sujeto durante un periodo de tiempo, seguido por una interrupción de la administración por un periodo de tiempo, en donde la interrupción de la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales se efectúa después de la detección de un nivel disminuido o incrementado de células T que expresan CD62L, LFA-1 y/o PSGL-1 en el sujeto, con relación a un valor umbral.
41. La combinación para el uso de la reivindicación 40, en donde la interrupción de la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales comprende administrar una combinación alternativa de compuestos antirretrovirales.
42. La combinación para el uso de las reivindicaciones 40 ó 41, que comprende un inhibidor núcleosido de la transcriptasa inversa seleccionado de Zidovudina, Didanosina, Zalcit bina, Estavudina, Lamivudina, Emtricitabina, Abacavir, Amdoxovir, Apricitabina y Elvucitabina.
43. La combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, que comprende un inhibidor de proteasa seleccionado de Indinavir, Saquinavir, Ritonavir, Nelfinavir, Fosampernavir, Lopinavir, Atazanavir, Tipranavir y Darunavir.
44. La combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, que comprende un inhibidor no nucleósido de transcriptasa inversa seleccionado de Nevirapina, Delaviridina, Efavirenz, Etravirina y Rilpivirina.
45. Un método para tratar a un sujeto inmunocomprometido, comprendiendo el método: (a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de un agente bloqueador, siendo el agente bloqueador al menos uno de un agente bloqueador de <x4-integrina y un agente bloqueador de VLA-4; (b) detectar el nivel de células T del sujeto que expresan PSGL-1; y (c) interrumpir la administración del agente bloqueador si se detecta un nivel de células T que expresan PSGL-1, que se disminuye con relación a un valor umbral, y continuar la administración del agente bloqueador si se detecta un nivel de células T que expresan PSGL-1 que no se disminuye con relación a un valor umbral.
46. El método de la reivindicación 45, en donde el nivel de células T que expresan PSGL-1 se detecta en una muestra del sujeto.
47. El método de la reivindicación 46, en donde la muestra es una de una muestra sanguínea, una muestra de células sanguíneas, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
48. El método de la reivindicación 45, en donde el valor umbral se basa en el nivel de células T que expresan PSGL-1 en una muestra de control.
49. El método de la reivindicación 45, que comprende detectar repetidamente el nivel de células T que expresan PSGL-1 del sujeto.
50. El método de la reivindicación 45, que comprende además detectar el nivel de al menos una de las células T del sujeto que expresan CD62L y células T del sujeto que expresan LFA-1, en donde la administración del agente bloqueador se interrumpe si al menos se detecta uno de un nivel de células T que expresan CD62L y un nivel de células T que expresan LFA-1, que se disminuye con relación a un valor umbral, y en donde la administración del agente bloqueador se continua si se detecta un nivel de células T que expresan CD62L y un nivel de células T que expresan LFA-1, que no se disminuyen en relación a un valor umbral.
51. El método de la reivindicación 50, que comprende detectar repetidamente el nivel de al menos una de las células T que expresan CD62L y células T que expresan LFA-1 del sujeto.
52. El método de la reivindicación 45, en donde el sujeto inmunocomprometido padece de una enfermedad autoinmune.
53. El método de la reivindicación 52, en donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste de esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, psoriasis, y una miopatía inflamatoria idiopática.
54. El método de la reivindicación 45, en donde el agente bloqueador es una inmunoglobulina o una molécula de unión proteinácea con funciones similares a inmunoglobulina.
55. El método de la reivindicación 45, en donde la interrupción de la administración del agente bloqueador comprende no administrar ningún agente bloqueador.
56. El método de la reivindicación 45, en donde el nivel de células T del sujeto que expresan PSGL-1 se detecta después de interrumpir la administración del agente bloqueador.
57. El método de la reivindicación 56, que comprende además administrar el agente bloqueador si se detecta un nivel de células T que expresan PSGL-1 que no se disminuye con relación a un valor umbral.
58. El método de la reivindicación 45, en donde detectar el nivel de células T que expresan PSGL-1 comprende detectar al menos uno de: (i) el número de células T del sujeto que tienen PSGL-1 sobre la superficie celular, (ii) la cantidad de PSGL-1 presente en células T del sujeto, y (iii) la cantidad de formación de ácido nucleico del gen SELPLG que codifica PSGL-1 en células T del sujeto.
59. El método de la reivindicación 58, en donde (i) detectar el número de células T que tienen PSGL-1 sobre la superficie celular y (ii) detectar la cantidad de PSGL-1 presente en células T comprende poner en contacto las células T del sujeto con un ligando, en donde el ligando es específico para PSGL-1, y detectar la cantidad del ligando que se une a PSGL-1.
60. El método de la reivindicación 50, en donde detectar el nivel de células T que expresan CD62L comprende detectar al menos uno de: (i) el número de células T del sujeto que tienen CD62L sobre la superficie celular, (ii) la cantidad de CD62L presente en células T del sujeto, y (iii) la cantidad de formación de ácido nucleico del gen SELL que codifica CD62L en células T del sujeto.
61. El método de la reivindicación 60, en donde (i) detectar el número de células T que tienen CD62L sobre la superficie celular y (ii) detectar la cantidad de CD62L presente en células T comprende poner en contacto las células T del sujeto con un ligando, en donde el ligando es específico para CD62L, y detectar la cantidad del ligando que se une a CD62L.
62. El método de la reivindicación 50, en donde detectar el nivel de células T que expresan LFA-1 comprende detectar al menos uno de: (i) el número de células T del sujeto que tienen LFA-1 sobre la superficie celular, (ii) la cantidad de LFA-1 presente en células T del sujeto, y (iii) la cantidad de formación de ácido nucleico del gen ITGAL que codifica CD11A y el gen ITGB2 que codifica CD18 en células T de la muestra del sujeto
63. El método de la reivindicación 62, en donde (i) detectar el número de células T que tienen LFA-1 sobre la superficie celular y (ii) detectar la cantidad de LFA-1 presente en células T comprende poner en contacto las células T del sujeto con un ligando, en donde el ligando es específico para LFA-1, y detectar la cantidad del ligando que se une a LFA-1.
64. Un método para tratar una infección retroviral en un sujeto, comprendiendo el método: (a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de una combinación de compuestos antirretrovirales; (b) detectar el nivel de células T del sujeto que expresan al menos uno de PSGL-1 y CD62L; y (c) interrumpir la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales si se detecta un nivel de al menos una de las células T que expresan PSGL-1 y CD62L, que se disminuye con relación a un valor umbral; y continuar la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales si se detecta un nivel de células T que expresan PSGL-1 y células T que expresan CD62L que no se disminuye con relación a un valor umbral.
65. El método de la reivindicación 64, en donde el al menos uno de un nivel de células T que expresan PSGL-1 y células T que expresan CD62L se detecta en una muestra del sujeto.
66. El método de la reivindicación 65, en donde la muestra es una de una muestra sanguínea, una muestra de células sanguíneas, una muestra de linfa y una muestra de fluido cerebroespinal.
67. El método de la reivindicación 64, en donde la infección retroviral es una infección de V1H.
68. El método de la reivindicación 64, en donde la interrupción de la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales comprende administrar una combinación de compuestos antirretrovirales que difiere de la combinación hasta ahora administrada al sujeto.
69. El método de la reivindicación 64, en donde el valor umbral se basa en el nivel de células T que expresan PSGL-1 y/o células T que expresan CD62L en uno o más sujetos de control.
70. El método de la reivindicación 64, que comprende detectar repetidamente el nivel de al menos una de las células T que expresan PSGL-1 y células T que expresan CD62L del sujeto.
71. El método de la reivindicación 64, que comprende además detectar el nivel de células T del sujeto que expresan LFA-1, en donde la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales se interrumpe si se detecta un nivel de células T que expresan LFA-1, que se disminuye con relación a un valor umbral, y en donde la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales se continua si se detecta un nivel de células T que expresan LFA-1, que no se disminuye con relación a un valor umbral.
72. El método de la reivindicación 71, que comprende detectar repetidamente el nivel de células T que expresan LFA-1 del sujeto.
73. El método de la reivindicación 64, en donde la combinación de compuestos antirretrovirales comprende un inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa.
74. El método de la reivindicación 73, en donde el inhibidor nucleósido de la transcriptasa inversa se selecciona del grupo que consiste de Zidovudina, Didanosina, Zalcitabina, Estavudina, Lamivudina, Emtricitabina, Abacavir, Amdoxovir, Apricitabina y Elvucitabina.
75. El método de la reivindicación 64, en donde la combinación de compuestos antirretrovirales comprende un inhibidor de proteasa.
76. El método de la reivindicación 75, en donde el inhibidor de proteasa se selecciona del grupo que consiste de Indinavir, Saquinavir, Ritonavir, Nelfinavir, Fosampernavir, Lopinavir, Atazanavir, Tipranavir y Darunavir.
77. El método de la reivindicación 64, en donde la combinación de compuestos antirretrovirales comprende un inhibidor no nucleósido de transcriptasa inversa.
78. El método de la reivindicación 77, en donde el inhibidor no nucleósido de transcriptasa inversa se selecciona del grupo que consiste de Nevirapina, Delaviridina, Efavirenz, Etravirina y Rilpivirina.
79. El método de la reivindicación 64, en donde al menos uno del nivel de células T del sujeto que expresan PSGL-l se detecta después de interrumpir la administración de la combinación de compuestos antirretrovirales.
80. El método de la reivindicación 79, que comprende además administrar los compuestos antirretrovirales si se detecta un nivel de células T que expresan PSGL-l que no se disminuye con relación a un valor umbral.
81. El método de la reivindicación 64, en donde detectar el nivel de células T que expresan PSGL-l comprende detectar al menos uno de: (i) el número de células T del sujeto que tienen PSGL-l sobre la superficie celular, (ii) la cantidad de PSGL-l presente en células T del sujeto, y (iii) la cantidad de formación de ácido nucleico del gen SELPLG que codifica PSGL-l en células T del sujeto.
82. El método de la reivindicación 81, en donde (i) detectar el número de células T que tienen PSGL-l sobre la superficie celular y (ii) detectar la cantidad de PSGL-l presente en células T comprende poner en contacto las células T del sujeto con un ligando, en donde el ligando es específico para PSGL-1, y detectar la cantidad del ligando que se une a PSGL-1.
83. El método de la reivindicación 64, en donde detectar el nivel de células T que expresan CD62L comprende detectar al menos uno de: (i) el número de células T del sujeto que tienen CD62L sobre la superficie celular, (ii) la cantidad de CD62L presente en células T del sujeto, y (iii) la cantidad de formación de ácido nucleico del gen SELL que codifica CD62L en células T del sujeto.
84. El método de la reivindicación 83, en donde (i) detectar el número de células T del sujeto que tienen CD62L sobre la superficie celular y (ii) detectar la cantidad de CD62L presente en células T del sujeto comprende poner en contacto las células T del sujeto con un ligando, en donde el ligando es específico para CD62L, y detectar la cantidad del ligando que se une a CD62L.
MX2014004319A 2011-10-17 2012-10-16 Valoracion del riesgo de pml (leucoencefalopatia multifocal progresiva) y metodos basados en la misma. MX2014004319A (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11185439 2011-10-17
EP12158369 2012-03-07
PCT/EP2012/070472 WO2013057096A1 (en) 2011-10-17 2012-10-16 Assessment of pml risk and methods based thereon

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2014004319A true MX2014004319A (es) 2015-05-15

Family

ID=47215496

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014004319A MX2014004319A (es) 2011-10-17 2012-10-16 Valoracion del riesgo de pml (leucoencefalopatia multifocal progresiva) y metodos basados en la misma.
MX2014004025A MX2014004025A (es) 2011-10-17 2012-10-16 Metodos de valoracion de riesgo de lmp y aparatos relacionados.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014004025A MX2014004025A (es) 2011-10-17 2012-10-16 Metodos de valoracion de riesgo de lmp y aparatos relacionados.

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20150105278A1 (es)
EP (2) EP2769222A1 (es)
AU (2) AU2012325017A1 (es)
BR (2) BR112014009144A8 (es)
CA (2) CA2848587A1 (es)
MX (2) MX2014004319A (es)
WO (2) WO2013057092A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ602676A (en) 2010-04-16 2015-02-27 Biogen Ma Inc Anti-vla-4 antibodies
JP2016523931A (ja) * 2013-07-05 2016-08-12 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 脳卒中治療のための組成物及び方法
US20160223565A1 (en) * 2013-09-18 2016-08-04 The Johns Hopkins University Bk virus serology assessment of progressive multifocal leukoencephalopathy (pml) risk
EP3110976B1 (en) 2014-02-27 2020-05-13 Biogen MA Inc. Method of assessing risk of pml
WO2017134178A1 (en) * 2016-02-05 2017-08-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Imaging method for predicting the onset of multiple sclerosis
WO2018140510A1 (en) * 2017-01-25 2018-08-02 Biogen Ma Inc. Compositions and methods for treatment of stroke and other cns disorders
KR102848349B1 (ko) 2018-06-04 2025-08-21 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 감소된 효과기 기능을 갖는 항-ｖｌａ-4 항체

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
DE4237113B4 (de) 1992-11-03 2006-10-12 "Iba Gmbh" Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins
ATE182625T1 (de) 1993-01-12 1999-08-15 Biogen Inc Rekombinante anti-vla4 antikörpermoleküle
US5514555A (en) 1993-03-12 1996-05-07 Center For Blood Research, Inc. Assays and therapeutic methods based on lymphocyte chemoattractants
US5936065A (en) 1993-12-06 1999-08-10 Cytel Corporation CS-1 peptidomimetics, compositions and methods of using the same
US5821231A (en) 1993-12-06 1998-10-13 Cytel Corporation CS-1 peptidomimetics, compositions and methods of using same
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
US5811391A (en) 1994-08-25 1998-09-22 Cytel Corporation Cyclic CS-1 peptidomimetics, compositions and methods of using same
US6306840B1 (en) 1995-01-23 2001-10-23 Biogen, Inc. Cell adhesion inhibitors
WO1996023879A1 (en) 1995-01-30 1996-08-08 Terrapin Technologies, Inc. Glubodies - multiplicities of proteins capable of binding a variety of small molecules
GB9613112D0 (en) 1996-06-21 1996-08-28 Zeneca Ltd Chemical compounds
CA2261974A1 (en) 1996-07-25 1998-02-05 Biogen, Inc. Molecular model for vla-4 inhibitors
DE19641876B4 (de) 1996-10-10 2011-09-29 Iba Gmbh Streptavidinmuteine
DE69818049T2 (de) 1997-06-23 2004-07-15 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Inhibitoren der alpha4-beta1 vermittelten zelladhäsion
US6229011B1 (en) 1997-08-22 2001-05-08 Hoffman-La Roche Inc. N-aroylphenylalanine derivative VCAM-1 inhibitors
US6455550B1 (en) 1997-08-22 2002-09-24 Hoffmann-La Roche Inc. N-alkanoylphenylalanine derivatives
US6197794B1 (en) 1998-01-08 2001-03-06 Celltech Therapeutics Limited Phenylalanine derivatives
US6329372B1 (en) 1998-01-27 2001-12-11 Celltech Therapeutics Limited Phenylalanine derivatives
GB9811159D0 (en) 1998-05-22 1998-07-22 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9812088D0 (en) 1998-06-05 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US6685617B1 (en) 1998-06-23 2004-02-03 Pharmacia & Upjohn Company Inhibitors of α4β1 mediated cell adhesion
GB9821061D0 (en) 1998-09-28 1998-11-18 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
JP3180906B2 (ja) 1998-11-12 2001-07-03 日本電気株式会社 磁気抵抗効果型複合ヘッドの製造方法
KR100649819B1 (ko) 1999-02-18 2007-02-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 티오아미드 유도체
US6265572B1 (en) 1999-04-20 2001-07-24 Hoffmann-La Roche Inc. Pyrrolidincarbonylamino cyclic disulfide anti-inflammatory agents
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
US6365619B1 (en) 1999-07-22 2002-04-02 Novartis Ag Treatment of arteriosclerosis
DE60033684T2 (de) 1999-11-18 2007-12-06 Ajinomoto Co., Inc. Phenylalaninderivate
US6388084B1 (en) 1999-12-06 2002-05-14 Hoffmann-La Roche Inc. 4-pyridinyl-n-acyl-l-phenylalanines
US6380387B1 (en) 1999-12-06 2002-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. 4-Pyrimidinyl-n-acyl-l phenylalanines
DE19962936A1 (de) 1999-12-24 2001-06-28 Bayer Ag Neue beta-Aminosäureverbindungen als Integrinantagonisten
KR20020067050A (ko) 1999-12-28 2002-08-21 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 염증성, 자기면역 및 호흡기 질환의 치료에 유용한브이엘에이-4 의존성 세포 결합의 비펩티드계 억제제
WO2001070670A1 (en) 2000-03-23 2001-09-27 Ajinomoto Co., Inc. Novel phenylalanine derivative
SE517975C2 (sv) 2000-05-30 2002-08-13 Power Ab C Fackverkskonstruktion av balkar sammansatta till ett tredimensionellt ramverk samt användning av en sådan fackverkskonstruktion
US7015216B2 (en) 2000-07-21 2006-03-21 Elan Pharmaceuticals, Inc. Heteroaryl-β-alanine derivatives as alpha 4 integrin inhibitors
US6689781B2 (en) 2000-07-21 2004-02-10 Elan Pharmaceuticals, Inc. Phenylalanine derivatives as alpha 4 integrin inhibitors
NZ524122A (en) 2000-08-18 2005-02-25 Ajinomoto Kk Phenylalanine derivatives useful as pharmaceutical agents
BR0207166A (pt) 2001-02-22 2004-02-10 Celltech R&D Ltd Composto, e, composição farmacêutica
US20030077576A1 (en) * 2001-03-20 2003-04-24 Joann Trial Use of monoclonal antibodies and functional assays for prediction of risk of opportunistic infection
DE10113776B4 (de) 2001-03-21 2012-08-09 "Iba Gmbh" Isoliertes streptavidinbindendes, kompetitiv eluierbares Peptid, dieses umfassendes Fusionspeptid, dafür codierende Nukleinsäure, Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Gewinnung des Fusionsproteins
WO2003010135A1 (en) 2001-07-26 2003-02-06 Ajinomoto Co., Inc. Novel phenylpropionic acid derivatives
WO2003029462A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
WO2003053926A1 (en) 2001-12-13 2003-07-03 Ajinomoto Co.,Inc. Novel phenylalanine derivative
GB0216571D0 (en) 2002-07-17 2002-08-28 Celltech R&D Ltd Chemical compounds
GB0216568D0 (en) 2002-07-17 2002-08-28 Celltech R&D Ltd Chemical compounds
US7446125B2 (en) 2003-04-09 2008-11-04 Universidad Del Pais Vasco Derivatives of nitroproline compounds, processes of manufacture and uses in the treatment of integrin mediated disorders
US7527954B2 (en) 2003-10-01 2009-05-05 Eth Zurich Method for in vitro evolution of polypeptides
UY28886A1 (es) 2004-05-10 2005-12-30 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos que consisten en polipéptidos y derivados conprendiendo tres secuencias conteniendo respectivamente los siguientes números de seq. id: 1-3 y 4-6; 7-9 y 10-12 y 13-15 ó 16-18
US7196112B2 (en) 2004-07-16 2007-03-27 Biogen Idec Ma Inc. Cell adhesion inhibitors
ES2387317T3 (es) 2005-03-03 2012-09-20 Seedlings Life Science Ventures, Llc. Procedimiento de control de riesgos de pacientes en tratamiento con natalizumab
EP3620469A1 (en) 2006-02-28 2020-03-11 Biogen MA Inc. Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases with natalizumab
WO2008097190A1 (en) 2007-02-05 2008-08-14 Agency For Science, Technology And Research Methods of electrically detecting a nucleic acid by means of an electrode pair
AU2008219007A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple sclerosis by administration of alpha-fetoprotein in combination with an integrin antagonist
WO2009041917A1 (en) 2007-09-28 2009-04-02 Agency For Science, Technology And Research Method of electrically detecting a nucleic acid molecule
WO2010099205A1 (en) * 2009-02-24 2010-09-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for treating progressive multifocal leukoencephalopathy (pml)
EP2226392A1 (en) * 2009-03-03 2010-09-08 Assistance Publique - Hôpitaux de Paris Method for detecting JCV infection
DK2654781T3 (en) 2010-12-21 2018-05-28 Oklahoma Med Res Found Anti-P-selectin antibodies and methods for their use and identification

Also Published As

Publication number Publication date
US20150105278A1 (en) 2015-04-16
EP2769223A1 (en) 2014-08-27
CA2848587A1 (en) 2013-04-25
WO2013057096A1 (en) 2013-04-25
BR112014009310A2 (pt) 2017-04-11
BR112014009144A8 (pt) 2017-06-20
WO2013057092A1 (en) 2013-04-25
AU2012325017A1 (en) 2014-04-17
CA2850885A1 (en) 2013-04-25
EP2769222A1 (en) 2014-08-27
MX2014004025A (es) 2014-08-01
BR112014009144A2 (pt) 2017-06-13
AU2012325013A1 (en) 2014-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2014004319A (es) Valoracion del riesgo de pml (leucoencefalopatia multifocal progresiva) y metodos basados en la misma.
CN102576022B (zh) 诊断和治疗自闭症的方法
JP6243838B2 (ja) Ｐｍｌの危険性を査定する方法
US20120258093A1 (en) Vla-4 as a biomarker for prognosis and target for therapy in duchenne muscular dystrophy
JP5766606B2 (ja) 輸血関連急性肺障害（ｔｒａｌｉ）に関するスクリーニング方法
WO2017122203A1 (en) Methods of determining prognosis of sepsis and treating same
US20230236188A1 (en) Methods of diagnosing and treating lupus
EP3458477B1 (en) Anti-factor ix padua antibodies
EP3440461A1 (en) Infiltrating immune cell proportions predict anti-tnf response in colon biopsies
EP2210112B1 (en) Diagnostic methods for hiv infection
CN107076757A (zh) 基于RGMa片段的诊断测定
JP6078845B2 (ja) 可溶型ｃｌｅｃ−２に基づく血小板活性化測定方法
WO2018231339A2 (en) Anti-phosphotyrosinylated pd-1 antibodies and uses thereof
US20190107544A1 (en) Bk virus serology assessment of progressive multifocal leukoencephalopathy (pml) risk
Zhu et al. Cloned antibodies from patients with HIT provide new clues to HIT pathogenesis
AU2019255622B2 (en) Compositions and methods for treating cardiovascular disease in selected patients
US8206897B2 (en) Assay for soluble CD200
US20140315188A1 (en) Assessment of pml risk and methods based thereon
CN120129835A (zh) 以mmp12为指标的免疫介导的炎症性疾病的诊断、以及基于抑制mmp12的免疫介导的炎症性疾病的治疗用药物
US20250354998A1 (en) Methods of diagnosing and treating multiple sclerosis by detecting a biomarker in the cerebrospinal fluid
US20220137074A1 (en) Methods of blood screening
JP2025085666A (ja) 細胞表面部分の発現又はクラスター化を検出するための方法
Gladman Changes in Sclerostin, Dickkopf-1 and Serum Markers of Inflammation, Cartilage and Bone Turnover in Patients with Axial Spondyloarthritis