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MX2014002953A - Genomas lentivirales quimericos no integrativos como vacunas innovadoras contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (vih-1). - Google Patents

Genomas lentivirales quimericos no integrativos como vacunas innovadoras contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (vih-1).

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MX2014002953A
MX2014002953A MX2014002953A MX2014002953A MX2014002953A MX 2014002953 A MX2014002953 A MX 2014002953A MX 2014002953 A MX2014002953 A MX 2014002953A MX 2014002953 A MX2014002953 A MX 2014002953A MX 2014002953 A MX2014002953 A MX 2014002953A
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MX
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retrovirus
nucleic acid
hiv
virus
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MX2014002953A
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Yahia Chebloune
Delphine Aldebert
Géraldine Arrode-Bruses
Original Assignee
Centre Nat Rech Scient
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Publication date
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Abstract

La presente invención tiene por objetivo los ácidos nucleicos que comprenden los genomas retrovirales quiméricos no integrativos que comprenden las secuencias terminales repetidas (LTR) 5' y 3' de lentivirus caprino: el virus de la Artritis-Encefalitis Caprina (CAEV) o de otro retrovirus que no se integra en las células humanas y al menos un gen viral de otro retrovirus. La invención se refiere igualmente a un vector que comprende un ácido nucleico tal, una composición inmunogénica o de vacuna que comprende el vector o el ácido nucleico, así como su utilización para el tratamiento y/o la prevención de una infección por un retrovirus o una enfermedad inducida por un agente patógeno.

Description

GENOMAS LE TIVIRALES QUIMERICOS NO INTEGRATIVOS COMO VACUNAS INNOVADORAS CONTRA EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (VIH-1) Campo de la Invención La presente invención tiene por objetivo los ácidos nucleicos que comprenden los genomas retrovirales quiméricos no integrativos , que comprenden secuencias terminales repetidas (STR, o LTR para Long Terminal Repeat por su acepción en Inglés) 5' y 3' del lentivirus caprino: virus de la Artritis -Encefalitis Caprina (VAEC, o CAEV para Caprine Arthritis Encephalitis Virus en Inglés) o de otro retrovirus que no se integra en las células humanas y al menos un gen viral de otro retrovirus. La invención se refiere igualmente a un vector que comprende un ácido nucleico tal, una composición inmunogénica o de vacuna que comprende el vector o el ácido nucleico, así como su utilización para el tratamiento y/o la prevención de una infección por un retrovirus o una enfermedad inducida por un agente patógeno.
Antecedentes de la Invención Hoy en día, el desarrollo de las vacunas eficaces contra las infecciones retrovirales es un reto mayor de la salud pública a nivel mundial. Recientemente, se han desarrollado vacunas basadas en la utilización de vectores y tienen la capacidad de expresar proteínas inmunogénicas en el Ref. 247404 hospedero vacunado. Estos vectores de vacuna, después de la amplificación en las bacterias, son purificados y directamente inyectados en el hospedero que necesita una vacunación. El vector es de este modo tomado a cargo por las células del hospedero, las proteínas inmunogénicas son expresadas y presentadas a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de la clase I y II, permitiendo de este modo generar respuestas inmunitarias contra estas proteínas inmunogénicas. Las primeras pruebas de vacunación con la ayuda de vectores de vacuna retrovirales han permitido mostrar que una inmunización contra el virus del sarcoma de Rous (Cheblouneet al., 1991, J Virol, 65, 5374-5380), el virus de la enfermedad de New Castle (Cosset, Bouquet et al., 1991, Virology 185, 862-866) además de la influenza (Robinson, Hunt y Webster, 1993, Vaccine, 11(9) : 957-960) sería posible en el pollo.
Este procedimiento de vacuna es particularmente interesante para luchar contra el virus de la inmunodef iciencia humana (VIH) . El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) continúa siendo hoy en día un problema de la salud pública mundial con más de 33 millones de individuos infectados, y con más de 2 millones de de decesos y casi 3 millones de nuevas infecciones por año. África es el continente más afectado, pero la infección crece rápidamente en Asia y en ciertos países de Europa del Este, siendo este fenómeno ciertamente debido a la falta de medios para la detección precoz o a la falta de tratamiento de la infección. Además, debido al hecho de las limitaciones de orden económico, numerosos pacientes infectados por el VIH en los países en desarrollo no se benefician de ningún tratamiento, y contribuyen pues a la diseminación masiva de la infección. El impacto económico del SIDA será por lo tanto ciertamente muy importante en el curso de los próximos años. En Europa, el SIDA sigue siendo una de las patologías transmisibles más importantes, con aproximadamente 1 millón de personas que viven con el SIDA y más de 20000 nuevas infecciones por año en Europa del Oeste y en Europa Central; y con aproximadamente 1.5 millones de personas que viven con el SIDA y más de 200000 nuevas infecciones por año en Europa del Este. El desarrollo de una vacuna profiláctica que detenga esta infección es pues una prioridad.
A pesar de numerosos esfuerzos, hoy en día no existe ninguna vacuna segura y satisfactoria que permita la protección del hombre contra la infección por el VIH o contra la patogénesis inducida por este virus. No obstante, numerosas investigaciones efectuadas han permitido acumular preciosos conocimientos para comprender los fracasos de las estrategias de vacuna utilizadas hasta hoy en día, y para definir las propiedades requeridas de una vacuna que induzca respuestas inmunitarias protectoras contra los lentivirus responsables del SIDA.
La vacuna debe inducir principalmente una respuesta linfocitaria T CD8+, que está asociada al control del virus luego de la primo-infección, y por lo tanto la presencia ha sido mostrada como indispensable para el control de la carga viral en los monos no humanos infectados (Jinet al., 1999, J Exp Med, 189: 991-998). Además, los linfocitos T citotóxicos (LTC) están presentes en pacientes no progresadores a largo plazo (LTNP, por sus siglas en inglés) (Rinaldo et al., 1995, J Virol, 69: 5838-5842), o incluso en sujetos expuestos pero no infectados por el VIH (Makedonas et al., 2002, AIDS, 16: 1595-1602) . Estos elementos y otros, muestran la importancia de tales respuestas en el control de la replicación viral y/o la prevención de la enfermedad.
Además, la vacunación debe inducir una respuesta a las células T CD4+ , que son indispensables para la estimulación y mantenimiento de la respuesta a base de linfocitos T CD8+ anti-VIH (Kalams et al., 1999, J Virol, 73: 6715-6720) . Las células T CD4+ son de este modo indispensables para la colocación y el mantenimiento de la respuesta a base de anticuerpos producidos por los linfocitos B (LB) . De este modo, se ha mostrado que los macacos infectados por el VIS y agotado por LB controlan menos bien su carga viral que los signos testigos (Johnsonet al., 2003, J Virol, 77: 375-381) . En vista de estos resultados y los precedentes, parece pues necesario que una vacuna contra el VIH deba estimular las respuestas B y T del sistema inmunitario .
Entre las numerosas estrategias de vacunas probadas se encuentran aquellas que hacen intervenir los lentivirus denominados atenuados. De este modo, se han mostrado que éstos permiten inducir de manera reproducible la mejor protección contra los virus de prueba homólogos y heterologos (Yankee et al., 2009, Virology, 383: 103-111; Genesca, McChesney y Miller, 2009, J Intern Med, 265: 67-77; Reynolds et al., 2008, J Exp Med, 205: 2537-2550; Amara et al., 2005, J Virol, 79: 15356-15367; Whitney y Ruprecht, 2004, Curr Opin Infect Dis, 17: 17-26) . No obstante, debido al hecho de su integración irreversible en el genoma del hospedero y de la probabilidad de infección recurrente vinculada a las latencias provirales, estos virus son patogénicos en ciertos adultos y en los neonatos (Desrosiers, 1994, AIDS Res Hum Retroviruses , 10: 331 -332; Hofmann-Lehmann et al., 2003, AIDS, 17: 157-166; Baba et al., 1999, Nat Med, 5: 194-203; Baba et al., 1995, Science, 267: 1820-1825; Yankee et al., 2009, Virol, 383: 103-111) . Por razones de ética y seguridad, estos lentivirus atenuados no pueden pues en ningún caso ser utilizados en el ser humano.
La vacunación basada en ADN sobre los vectores virales por si misma nunca ha sido asociada a un desarrollo de patologías, ni en el hombre, ni en los animales, y por este hecho es más segura. No obstante, probados en el mono, se comprueba que estos vectores son incapaces de proteger a los animales contra una infección experimental (Liu et al., 2006, Virology, 351: 444-454; Singh et al., 2005, J Virol, 79 : 3419-3428) .
Existe pues la necesidad de nuevos vectores de vacuna que permitan expresar los antígenos lentivirales a niveles más elevados tanto en cantidad como en calidad, con un objetivo de inducir respuestas protectoras contra los virus patógenos.
Los inventores han descrito previamente los genomas virales infecciosos que comprenden un genoma viral completo que incluye los LTR del CAEV así como uno o dos genes de otro genoma retroviral (Bouzar et al., 2007, Virology, 364(2) :269-280; Bouzar et al., 2004, Virology, 326(1): 47-56; Bouzar et al., 2003, Virology, 309(1) : 41-52; Yuhai et al., 2009, Retrovirology, 6(2) : 22) . Estos genomas han sido utilizados para estudiar los mecanismos de la patogénesis inducida por los retrovirus altamente patógenos del hombre y de los monos.
Breve Descripción de la Invención Los inventores han descubierto que la utilización de secuencias terminales repetivas (STR, o LTR para Long Terminal Repeat en Inglés) del virus de la Artritis-Encefalitis Caprina (VAEC, o CAEV en Inglés para Caprine Arthritis Encephalitis Virus) permitiría mejorar la expresión de los genomas retrovirales de vacuna y la inducción de respuestas protectoras contra los retrovirus patógenos, evitando siempre su integración en las células hospederas. Los inventores han demostrado en particular que las Secuencias Terminales Repetivas (LTR, por sus siglas en Inglés) del virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV) permitirían la expresión constitutiva de los genes que le están asociados, y no serían dependientes del gen tat viral del CAEV, más particularmente de la proteína del gen tat viral del CAEV, para expresar los genes de un genoma viral a los cuales éstos son fusionados, permitiendo de este modo una expresión fuerte de los antígenos virales. Los inventores de este modo han desarrollado los genomas quiméricos, entre los lentivirus de los primates del tipo SIV y VIH y el CAEV, que tienen las propiedades de ser no integrativos y no replicativos , siendo siempre capaces de efectuar un ciclo de replicación para expresar todos los antígenos del VIH y del SIV presentes en los genomas. Los inventores han demostrado que la transfección de estos genomas en las células de primates (HEK293) permiten la expresión de todas las proteínas de los genes presentes, y que estas proteínas son ensambladas en partículas virales capaces de efectuar un ciclo único de infección (es decir, un pseudo-ciclo) en las células objetivo, sin integración del genoma viral en estas células objetivo. La inmunización de ratones NOD/SCID humanizados con células mononucleadas humanas ha demostrado la presencia de fuertes respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas contra los antígenos virales.
Definiciones Por "ácido nucleico" se entiende la forma polimérica de éster de fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o de los desoxirribonucléosidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina , desoxitimidina, o desoxicitidina; "moléculas de ADN") bajo la forma monocateriana o bajo la forma de una hélice bicatenaria. Las hélices bicatenarias de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN son posibles. El término ácido nucleico y en particular, molécula de ADN o de ARN, no se refieren más que a la estructura primaria o secundaria de la molécula, y no se limita de ninguna manera a las formas terciarias particulares. De este modo, este término comprende el ADN bicatenario que se encuentra, entre otras, en las moléculas de ADN lineal o circular (por ejemplo, fragmentos de restricción), los virus, los plásmidos y los cromosomas. Cuando se evoca la estructura de las moléculas de ADN bicatenario particulares, las secuencias pueden ser descritas aquí de conformidad a la convención normal que no da la secuencia más que en la dirección 5' hacia 3' longitudinalmente de la hebra no transcrita del ADN (es decir, la hebra que tiene una secuencia homologa al ARNm) .
En el contexto de la invención, "un ácido nucleico que comprende un genoma retroviral quimérico no integrativo" designa un ácido nucleico que comprende las secuencias de acido nucleico que actúan en cis de al menos dos retrovirus, el ácido nucleico no es capaz integrarse en el genoma de una célula hospedera. El ácido nucleico incluye las Secuencias Terminales Repetivas (LTR) en 5' y 3' de un primer retrovirus, y al menos un gen viral de un segundo retrovirus.
Por "retrovirus" se entiende un virus donde el genoma consiste de una molécula de ARN y que comprende una transcriptasa inversa, es decir, un miembro de la familia de los Retroviridae . Los retrovirus son divididos en tres géneros: oncovirus, lentivirus y eespumavirus. Los oncovirus están principalmente compuestos de las siguientes especies: el virus de la leucemia murina (MLV, por sus siglas en inglés) , el virus de la leucosis aviar (ALV, por sus siglas en inglés) , el virus del sarcoma de Rous (VSR o RSV por su acepción en Inglés para Rous Sarcoma Virus) , o el virus de Mason-Pfizer de simio. Los lentivirus están compuestos de las siguientes especies: el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1 o VIH-1 por su acepción en Inglés para Human Immunodeficiency Virus tipo 1) , el virus de inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2 , o VIH-2 por su acepción en Inglés para Human Immunodeficiency Virus tipo 2) , el virus de inmunodeficiencia de simio (VIS o SIV por su acepción en Inglés Simian Immunodeficiency Virus) , el virus de inmunodeficiencia felina (VIF o FIV por su acepción en Inglés para Feline Immunodeficiency Virus) , el virus de inmunodeficiencia bovina (VIB o BIV por su acepción en Inglés para Bovine Immunodeficiency Virus) , el virus de Maedi Visna (MW) del carnero, el virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV) o el virus de la anemia infecciosa equina (VAEI o EIAV por su acepción en Inglés para Equine Infectious Anemia Virus) . El eespumavirus puede ser el HFV. Cuando el retrovirus es el VIH-1, éste puede ser, no importa de cuál serotipo, por ejemplo del serotipo M (serotipo A-D, F-H, J, K) , 0, N o P. Cuando el retrovirus es el VIH-2, éste puede ser no importa de cuál serotipo, por ejemplo del serogrupo A o B.
Por "gen viral" se entiende un gen presente en un genoma retroviral. En el contexto de la invención, el gen viral puede ser el gen gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu o env.
El gen "gag" que significa "antígeno específico de grupo" codifica para la poliproteína precursora Gag que es escindida para dar las proteínas estructurales fundamentales del retrovirus, que son las proteínas de la cápside, las proteínas de la nucleocápside , y las proteínas de la matriz. Por ejemplo, la proteína Gag del HIV es el precursor de la proteína de cápside p24, las proteínas de la nucleocápside p6 y p7, y de la proteína matriz pl7. A manera de ejemplo no limitante, el gen gag es el gen gag del VIH-1 (NCBI gen ID No. 155030, actualizado el 20 de agosto del 2011), del VIH-2 (NCBI gen ID No. 14900001, actualizado el 27 de agosto del 2011), SIV (NCBI gen ID No. 956108, actualizado el 27 de agosto 2011) o del FIV (NCBI gen ID No. 1489988, actualizado 20 de agosto de 2011) .
El gen "pol" codifica para una transcriptasa inversa, una integrasa y una proteasa. A manera de ejemplo no limitante, el gen pol es del pol del gen VIH-1 (NCBI gen ID No. 155348, actualizado el 27 de agosto de 1201), VIH-2 (NCBI ID gen No. 1490001, actualizado el 27 de agosto de 2011), FIV (NCBI gen ID No. 1489989, actualizado el 27 de agosto de 2011) o del SIV (NCBI gen ID No. 956107, actualizado el 20 de agosto 2011) .
El gen "vif" o "factor de infectividad viral" codifica para una proteína requerida para la producción de viriones infecciosos. A manera de ejemplo no limitante, el gen vif es el gen vif del VIH-1 (NCBI gen ID No. 155459, actualizado el 7 agosto de 2011), del VIH-2 (NCBI gen ID No. 1724712, actualizado el 21 de enero de 2010) , FIV (NCBI gen ID No. 1724709, actualizado el 7 de febrero 2010), o del SIV (NCBI gen ID 490005 No. 1490005, actualizado el 21 de enero del 2010) .
El gen "vpr" codifica para la proteína viral R que juega un papel importante en la detección del ciclo celular en fase G2 y en la regulación del transporte del complejo de pre- integración del citoplasma hacia el núcleo, la replicación viral. A manera de ejemplo no limitante, el gen vpr es el pr del VIH-1 (NCBI gen ID No. 155807, actualizado el 7 de agosto del 2011), del VIH-2 (NCBI gen ID No. 1724718, actualizado el 21 de enero del 2010) o del SIV (NCBI gen ID No. 956112, actualizado el 15 de enero del 2011) .
El gen "vpx" codifica para la proteína viral X y está emparentado al gen vpr. A manera de ejemplo no limitante, el gen vpx es el gen vpx del VIH-2 (NCBI gen ID No. 1724714, actualizado el 19 de marzo de 2011) o del SIV (NCBI gen ID No. 490006, actualizado el 16 de julio 2011) .
El gen "nef" codifica para la proteína miristilada de 27-25 kDa, denominada Factor de Regulación Negativa, que juega un papel clave en el agotamiento de los linfocitos CD4 in vivo. A manera de ejemplo no limitante, el gen nef es el gen nef del VIH-1 (NCBI gen ID No. 156110, actualizado el 7 de agosto del 2011) , del VIH-2 (NCBI gen ID No. 1724715, actualizado el 19 marzo de 2011) o del SIV (NCBI gen ID No. 1490008, actualizado el 2 de julio del 2011) .
El gen "tat" codifica para una proteína de 86 a 101 aminoácidos, denominada "trans-activador de la transcripción" , que aumenta la tasa de transcripción del genoma retroviral. A manera de ejemplo no limitante, el gen tat es el gen tat del VIH-1 (NCBI gen ID No. 155871, actualizado del 20 de agosto de 2011) , del VIH- 2 (NCBI ID gen No. 724713, actualizado el 7 de febrero del 2010) o del SIV (NCBI gen ID No. 956113, actualizado el 07 de febrero 2010).
El gen "rev" codifica para una proteína denominada "Regulador de la Expresión del Virión", que permite la exportación del ARN viral del núcleo hacia el citoplasma. A manera de ejemplo no limitante, el gen rev es el gen rev del VIH-1 (NCBI gen ID No. 155908, actualizado el 7 agosto de 2011), del VIH-2 (NCBI gen ID No. 1724716, actualizado el 21 de mayo del 2011) o del SIV (NCBI gen ID No. 1490003, actualizado el 15 de enero del 2011) .
El gen "vpu" codifica para una proteína denominada "Proteína Viral U" que está implicada en el brote viral y el mejoramiento de la liberación de los viriones. A manera de ejemplo no limitante, el gen vpu es el vpu del VIH-1 (NCBI gen ID No. 155945, actualizado el 7 agosto de 2011) o del SIV (NCBI gen ID No. 2828723, actualizado el 21 de enero del 2010) .
El gen "env" codifica para la proteína precursora de gpl60 que es madurada y escindida para dar las proteínas de la envoltura gpl20 y gp41. A manera de ejemplo no limitante, el gen env del VIH-1 (NCBI gen ID No. 155971 actualizado el 07 de agosto del 2011) del VIH-2 (NCBI gen ID No. 724717, actualizado el 18 de junio del 2011), del FIV (NCBI gen ID No. 489987, actualizado el 18 de junio del 2011) o del SIV (NCBI gen ID No. 1490007, actualizado el 18 de junio de 2011) .
En el sentido de la presente solicitud, el término "comprende" o "que comprende" designa de acuerdo a una modalidad particular "consiste en" o "que consiste en" . Ácido nucleico Los Inventores han demostrado que las Secuencias Terminales Repetivas (LTR) del virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV) permitirían la expresión constitutiva de los genes que les están asociados, y no son dependientes de gen fcat viral para expresar los genes de un genoma viral a los cuales éstas son fusionadas, permitiendo de este modo una expresión fuerte de los antígenos virales. Además, los inventores han mostrado que la sola presencia de éstas LTR impediría la integración de un genoma retroviral heterólogo al cual éstas están fusionadas.
La invención se refiere pues a un ácido nucleico que comprende un genoma retroviral quimérico, no integrativo, en el cual el genoma retroviral quimérico comprende: Las Secuencias Terminales Repetivas (LTR) en 5' y en 31 de un primer retrovirus, el primer retrovirus es un lentivirus, tal como el virus de la Artritis-Encefalitis Caprina (CAEV) , el virus Maedi Visna (VMV) del carnero, el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) , o un oncovirus o un espumavirus, y al menos un gen viral de un segundo retrovirus, el segundo retrovirus no es el primer retrovirus.
Las secuencias LTR utilizadas provienen de preferencia de un retrovirus que no se integra en el genoma de un "hospedero" o "paciente", el hospedero o el paciente es un hospedero o paciente en el genoma del cual el segundo y/o el tercero retrovirus pueden integrarse. Por ejemplo, cuando el primer retrovirus es el CAEV dicho hospedero o paciente no es un caprino, pero puede ser un hombre, un mono, un gato o un caballo, o cuando el primer retrovirus es el EIAV, el hospedero o el paciente no es un caballo, pero puede ser un hombre, un mono, un gato, o un bovino, y cuando el primer retrovirus es el VMV, el hospedero o el paciente no es un bovino, pero puede ser un hombre, un mono, un gato o un caballo .
En una modalidad particular preferida, el "primer retrovirus" es el virus de la Artritis-Encefalitis Caprina o CAEV. El CAEV es un retrovirus del tipo lentivirus de la cabra que está emparentado al virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) , pero que no provoca la patología del tipo SIDA en su hospedero.
Por "Secuencias Terminales Repetivas" (LTR, por sus siglas en Inglés) se designa una secuencia que permite el control de la transcripción, es decir que comprende un aumentador, un promotor, una o varias señales del inicio de la transcripción, una o varias señales de terminación de la transcripción, una o varias señales de poli-adenilación. En el contexto de la invención, las LTR del CAEV comprenden un aumentador, un promotor y una señal de inicio de la transcripción, así como una señal de terminación de la transcripción, y una señal de poliadenilación. De manera preferida, las LTR en dirección 5' y en 31 del CAEV son idénticas y comprenden o consisten de la secuencia SEQ ID No . : 3.
En otras modalidades de realización, las LTR del Virus Maedi Visna LTR (VMV) o aquellas de lentivirus de los équidos EIAV son utilizados. La LTR en 5' de VMV comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 1 a 161 de la Secuencia de Referencia NCBI NC_001452.1 (actualizada el 8 diciembre del 2008). La LTR en 3' del VMV comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 9106 a 9202 de Secuencia de Referencia NCBI NC_001452.1 (actualizada el 8 diciembre del 2008). La LTR en 5' del EIAV comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 61 a 381 de Secuencia de Referencia NCBI NC_001450 (actualizado el 11 marzo del 2010) . El LTR en 31 del EIAV comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 7269 a 8289 de la Secuencia de Referencia NCBI NC_001450 (actualizado el 11 marzo del 2010) .
En otras modalidades adicionales de realización, las LTR de un oncovirus, tal como el virus de la leucemia murina (MLV) , el virus de la leucemia aviar (ALV) , el virus del sarcoma de Rous (RSV) , o el virus de Mason-Pfizer de simio, o las LTR o un espumavirus, tal como el HFV son utilizadas. El LTR en 5' del MLV comprende o consiste de la secuencia que se encuentra en la posición de 1 a 210 de la Secuencia de Referencia NCBI NC_001702.1 (actualizado el 5 de febrero del 2011) . El LTR en 3 ' de MLV comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 5735-8135 de la Secuencia de Referencia del NCBI NC_001702.1 (actualizado el 5 de febrero del 2011). El LTR en 5 ' de ALV comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 1 a 594 de la Secuencia de Referencia NCBI NC_015116.1 (actualizado el 18 de abril del 2011). El LTR en 3' del ALV comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 5338 a 7489 de la Secuencia de Referencia del NCBI NC_015116.1 (actualizado el 18 de abril de 2011). El LTR en 51 de RSV comprende o consiste en la secuencia situada en la posición 22 a 102 de la Secuencia de Referencia NCBI NC_001407.1 (actualizado el 8 diciembre del 2008). El LTR en 31 del RSV comprende o consiste en la secuencia situada en la posición 9058 a 9292 de la Secuencia de Referencia NCBI NC 001407.1 (actualizado el 8 diciembre del 2008). El LTR en 5' del virus de Mason-Pfizer de simio comprende o consiste en la secuencia situada en la posición 26 a 123 de la Secuencia de Referencia NCBI NC_001550.1 (actualizado el 8 diciembre del 2008). El LTR en 3' del virus Mason-Pfizer de simio comprende o consiste en la secuencia situada en la posición en 7573 a 7811 de la Secuencia de Referencia NCBI NC_001550.1 (actualizado el 8 diciembre del 2008). El LTR en 5 ' de VAF comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 1 a 1760 de Secuencia de Referencia NCBI NC_001364.1 (actualizado el 22 de abril de 2009). La LTR en 3¦ de VAF comprende o consiste en la secuencia que se encuentra en la posición 11487 a 13246 de Secuencia de Referencia NCBI NC_001364.1 (actualizado el 22 de abril del 2009).
Los Inventores han demostrado que las Secuencias Terminales Repetivas (LTR) del virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV) no fueron dependientes del gen fcat viral para expresar los genes de un genoma viral a los cuales éstas son fusionadas, ventajosamente, el ácido nucleico de acuerdo a la invención no contiene el gen tat del primer retrovirus.
En el contexto de la invención, el "segundo retrovirus" es diferente del primer retrovirus. Éste puede ser un oncovirus, un lentivirus o un espumavirus. De este modo, por ejemplo, cuando las LTR del CAEV, son utilizadas, el segundo retrovirus no es CAEV. De manera preferida, el segundo retrovirus es un oncovirus, tal como el virus de la leucemia murina (MLV) , el virus de la leucosis aviar (ALV) , el virus del sarcoma de Rous (RSV) , o el virus de Mason-Pfizer de simio, un lentivirus tal como el virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) , el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2) , el virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV) , el virus de la inmunodef iciencia felina (FIV) o el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) , o un espumavirus tal como el HFV. De manera particularmente preferida, el segundo retrovirus es el VIH-1, el VIH-2, el SIV o el FIV.
De manera preferida, al menos un gen viral del segundo retrovirus es seleccionado entre los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu y env. En un aspecto particular, el genoma retroviral quimérico comprende al menos dos, tres (por ejemplo, los genes gag, pol, vif, o los genes gag, pol, env) , cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez genes virales del segundo retrovirus. Ventajosamente, el genoma retroviral quimérico comprende el gen tat del segundo retrovirus. De manera todavía más preferida, el genoma retroviral quimérico comprende el conjunto de los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu y env del segundo retrovirus .
En un aspecto particularmente preferido, el genoma retroviral quimérico comprende los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu y env del SIV, del VIH-1 o VIH-2 o del FIV. En un aspecto todavía más preferido, el genoma retroviral quimérico comprende o consiste de la secuencie del genoma retroviral del SIV (SEQ ID No.: 4), el genoma retroviral de VIH-1 (SEQ ID No. : 2) , el genoma retroviral del VIH-2 (SEQ ID No. : 5) , o del genoma retroviral de FIV (SEQ ID No. : 6) .
Los genomas retrovirales quiméricos de SIV, del VIH-1, del VIH-2 y del FIV son respectivamente representados de manera esquemática en las Figuras 1 a la 4.
En una modalidad particular, el genoma retroviral quimérico comprende además un gen viral de un tercer retrovirus, el tercer retrovirus no es el primer retrovirus, es decir, es diferente del primer retrovirus. De este modo, por ejemplo, cuando las LTR del CAEV son utilizadas, el tercer retrovirus no es el CAEV. El "tercer retrovirus" puede ser elegido entre uno de los retrovirus tales como se definieron anteriormente.
Cuando el genoma retroviral quimérico comprende al menos un gen viral del segundo retrovirus y al menos gen viral de un tercer retrovirus, el segundo retrovirus y el tercer retrovirus son diferentes. El segundo retrovirus y el tercer retrovirus pueden ser o no ser de géneros diferentes, por ejemplo, el segundo y el tercer retrovirus pueden ser cada uno un oncovirus, un lentivirus, o un espumavirus, o el segundo y el tercer retrovirus pueden ser respectivamente, (i) un lentivirus y un espumavirus, o un inversamente un espumavirus y un lentivirus, (ii) un oncovirus y un lentivirus, o inversamente un lentivirus y un oncovirus, o (iii) un espumavirus y un oncovirus, o inversamente un oncovirus y un espumavirus.
Preferentemente, cuando el genoma retroviral quimérico comprende al menos un gen viral de un segundo retrovirus y al menos gen viral de un tercer retrovirus, el segundo retrovirus y el tercer retrovirus son cada uno un lentivirus, y de manera preferida, el lentivirus se selecciona entre el VIH-1, el VIH-2, el SIV, el FIV o el EIAV. De manera todavía más preferida, el segundo retrovirus y el tercer retrovirus son el lentivirus de especie, de serogrupo, o de serotipo diferentes. De este modo, por ejemplo, cuando el segundo retrovirus es el VIH-1, el tercer retrovirus es el VIH-2, o incluso cuando el segundo retrovirus es el VIH-1 del serogrupo M, el tercer retrovirus es el VIH-1 del serogrupo O, o incluso cuando el segundo retrovirus es el VIH-1 del serogrupo M y del serotipo 1, el tercer retrovirus es el VIH-1 del serogrupo M y del serotipo B.
De manera preferida, al menos un gen viral del tercer retrovirus se selecciona entre los genes gag, pol, vif, vpx , vpr, nef, tat, rev, vpu y env. En un aspecto particular, el genoma retroviral quimérico comprende además al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez genes virales del tercer retrovirus, ventajosamente del gen tat.
De manera todavía más preferida, el genoma retroviral quimérico comprende además el conjunto de los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu y env del tercer retrovirus, es decir, que el genoma retroviral quimérico comprende el conjunto de los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu y env del segundo retrovirus y el conjunto de los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu y env del tercer retrovirus.
El genoma retroviral quimérico puede por lo tanto comprender un gen viral del segundo retrovirus y nueve genes virales del tercer retrovirus, o dos genes virales del segundo retrovirus y ocho genes virales del tercer retrovirus, o tres genes virales del segundo retrovirus y siete genes virales del tercer retrovirus, o cuatro genes virales del segundo retrovirus y seis genes virales del tercer retrovirus, o cinco genes virales del segundo retrovirus, y cinco genes virales del tercer retrovirus, o seis genes virales del segundo retrovirus, y cuatro genes virales del tercer retrovirus, o siete genes virales del segundo retrovirus, y tres genes virales del tercer retrovirus, u ocho genes virales del segundo retrovirus, y dos genes genes virales del tercer retrovirus, o nueve genes virales del segundo retrovirus, y un gen viral del tercer retrovirus. A manera de ejemplos no limitantes, el genoma retroviral quimérico puede pues comprender el gen gag del segundo retrovirus y los genes pol, vif, vpx, nef, tat, rev, vpu y env del tercer retrovirus; o los genes gag y p i del segundo retrovirus y los genes vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, v u y env del tercer retrovirus; o los genes gag , pol, vif del segundo retrovirus y los genes vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu y env del tercer retrovirus, o los genes gag, pol, vif, vpx del segundo retrovirus y los genes vpr, nef, tat, rev, vpu, y env del tercer retrovirus; o los genes gag, pol, if, vpx, vpr del segundo retrovirus y los genes nef, tat, rev, vpu y env del tercer retrovirus; o los genes gag, pol. vif, vpx, vpr, nef del segundo retrovirus y los genes tat, rev, vpu y evn del tercer retrovirus; o los genes ^g, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat del segundo retrovirus y los genes rev, vpu y env del tercer retrovirus; o los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev del segundo retrovirus y los genes vpu y env del tercer retrovirus; o los genes gag, pol, if, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu del segundo retrovirus y el gen env del tercer retrovirus.
En un aspecto particularmente preferido, el genoma retroviral quimérico comprende los genes gag, pol, vif, vpx y vpr del segundo retrovirus y los genes gag, pol, vif, vpx y vpr del segundo retrovirus y los genes nef, tat, rev, vpu y env del tercer retrovirus.
En otro aspecto incluso más preferido, el genoma retroviral quimérico comprende los genes gag, pol, vif, vpx y pr del SIV y los genes nef, tat, rev, vpu y env del VIH-1, o inversamente los genes gag, pol, vif, vpx y vpr del SIV. En otro aspecto particularmente preferido, el genoma retroviral quimérico comprende los genes gag, pol, vif, vpx y vpr del VIH-1 y los genes nef, tat, rev, vpu y env del VIH-2, o inversamente los genes gag, pol, vif, vpx y vpr del VIH-2 y los genes nef, tat, rev, vpu y env del VIH-1. En un aspecto incluso más preferido, el genoma retroviral quimérico comprende o consiste de la secuencia SEQ ID No.: 7 (una representación esquemática de este genoma retroviral quimérico se encuentran en la figura 5) .
En una modalidad particular, cuando el gen pol está presente en el genoma retroviral quimérico, el gen pol es un gen pol suprimido de las secuencias que codifican para la integrasa (in). De manera preferida, el gen pol está suprimido de la secuencia SEQ ID No. : 8 (secuencia de la integrasa del SIV), la SEQ ID No.: 9 (secuencia de la integrasa del VIH-1) , la SEC ID No. : 10 (secuencia de la integrasa del VIH-2) , o la SEQ ID No . : 11 (secuencia de la integrasa del FIV) .
De este modo, en una modalidad particularmente preferida, el genoma retroviral comprende o consiste de la secuencia SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No. : 14 O SEQ ID No. : 15.
Los genomas retrovirales quiméricos que comprenden o consisten de la secuencia SEQ ID No.: 1, SEQ ID No. : 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 14 o SEQ ID No.: 15 son respectivamente representados de manera esquemática en las Figuras 6 a la 10.
La invención se refiere igualmente a un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención.
El término "vector" designa un elemento extracromosómico por el cual una secuencia de ADN o de ARN (es decir un gen "extraño") puede ser introducido en una célula hospedera, de manera para transformar el hospedero y para permitir la expresión (es decir, la transcripción y la traducción) de la secuencia introducida. El elemento extracromosómico puede ser una secuencia auto-replicativa, una secuencia del fago o una secuencia nucleotídica , un ADN o un ARN simple o de doble hebra o un plásmido, o un cósmido. Un vector que contiene típicamente el ADN de un agente transmisible, en el cual un ADN extraño es insertado y un marcador de selección. Un medio común de insertar un fragmento de ADN en otro segmento de ADN implica la utilización de enzimas, denominadas enzimas de restricción, que rompen el ADN al nivel de los sitios específicos (grupos específicos de nucleótido) denominados sitios restricción. En general, el ADN extraño es insertado al nivel de uno o varios sitios de restricción del vector de ADN, y en seguida transportado por el vector en una célula hospedera con el ADN del agente transmisible. Un segmento o una secuencia de ADN que comprende un ADN agregado o insertado, tal como un vector, puede también ser denominado una "construcción de ADN" . Un tipo común de vector es un "plásmido", que en general es una molécula autónoma de ADN de doble hebra, en general de origen bacteriano, que puede aceptar fácilmente un ADN adicional (extraño) y que puede ser fácilmente introducido en una célula hospedera apropiada. Un número importante de vectores, que incluyen los plásmidos, han sido descritos para la replicación y/o la expresión en diferentes hospederos eucariotes y procariotes . En el contexto de la invención, el vector incluye un marcador de selección, tal como un gen de resistencia a un antibiótico, y un ácido nucleico de acuerdo a la invención. De manera preferida, el gen de resistencia es un gen de resistencia a la ampicilina o a la kanamicina.
Los ácidos nucleicos y/o el vector de acuerdo con la invención pueden ser utilizados para transformar o transfectar una célula o un organismo hospedero, es decir, para la expresión del genoma retroviral quimérico de acuerdo a la invención.
El término "célula hospedera" designa no importa cuál célula ni importa cuál organismo que sea seleccionado, modificado, transformado, transíectado, transducido, cultivado, o utilizado o manipulado de una manera o de otra, para la producción de una sustancia por la célula, por ejemplo, para la expresión de un gen, de una secuencia de ADN, de una proteína, de un virión por la célula. En el contexto de la invención, la célula hospedera es una célula de mamífero. Las células hospederas apropiadas incluyen, sin ser limitantes, las células HEK293, las líneas linfocitarias T CD4+ humanas CEMxl74 y M8166, los linfocitos T CD4+ humanos, los linfocitos T CD8+ humanos, las células mononucleares de sangre humana.
La transformación de la célula o del organismo hospedero por el nucleico ácido y/o el vector de acuerdo con la invención puede ser realizada de acuerdo a las técnicas estándares conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo mediante transíección, electroporación, microinyección, transducción, fusión de células, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, o la utilización de pistolas de genes, o un transportador del vector de ADN (ver, por ejemplo, Wu et al, 1992, J. Biol . Chem. 267: 963- 967; Wu et al, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624; Hartmut et al, solicitud de Patente Canadiense No. 2 012 311, publicada el 15 de marzo de 1990) .
Composición inmunogenica o de vacuna y sus usos El ácido o el vector de acuerdo a la invención pueden ser utilizados con un objetivo inmunogénico o de vacuna .
De este modo, la invención se refiere igualmente a una composición inmunogénica o de vacuna que comprende un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la invención.
En el contexto de la presente solicitud, el término "de vacuna" está relacionado a la vacunación profiláctica o terapéutica .
Por composición inmunogénica o de vacuna se entiende una composición que permite inducir una respuesta inmune contra un retrovirus como se definió anteriormente. Por respuesta inmune se entiende una respuesta que hace intervenir los linfocitos T, por ejemplo, los linfocitos T CD4+ y CD8+, y los linfocitos B.
De acuerdo a una modalidad, la composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo a la invención, es monovalente, es decir, ésta permite una respuesta inmunitaria contra un solo retrovirus, por ejemplo contra el VIH-1 o el VIH-2.
De acuerdo a otra modalidad, la composición inmunogénica de vacuna de acuerdo a la invención es multivalente , es decir, ésta permite una respuesta inmunitaria contra varios retrovirus, por ejemplo contra el VIH-1 o el VIH-2 o varios agentes patógenos, por ejemplo contra el HIP-1 y el VHC (HCV, por sus siglas en Inglés para Hepatitis C Virus) . En este caso, el vector de vacuna expresa los antígenos de uno y del otro agente patógeno.
De acuerdo a otra modalidad, la composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo a la invención es polivalente. Una composición inmunogénica o de vacuna de este tipo puede ser obtenida combinando varias composiciones inmunogénicas o de vacuna monovalentes de acuerdo a la invención. La composición inmunogénica o de vacuna puede además comprender al menos otra vacuna, es decir, un virus vivo atenuado, un virus inactivado o un subunidad viral, contra otro virus, tal como otro virus sexualmente transmisible, como por ejemplo, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C y el papiloma virus.
En una modalidad preferida, la composición inmunogénica de vacuna de acuerdo a la invención comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" designa cualquier vehículo en el cual la composición inmunogénica de vacuna de acuerdo a la invención pueda ser formulada. Ésta incluye una solución salina tal como un amortiguador salino de fosfato. En general, un diluyente o un vehículo es elegido de acuerdo a la modalidad y a la vía de administración, y de acuerdo a la práctica farmacéutica estándar. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, sin limitación, los intercambiadores de iones, el aluminio, estearato de aluminio, lecitina, los sistemas de distribución de medicamentos auto-emulsificante tales como el succinato D-oc-tocoferol-polietilenglicol 1000, los tensioactivos utilizados bajo la forma de dosis farmacéuticas, tales como los Tweens u otras matrices de distribución poliméricas, las proteínas del suero tales como la albúmina humana, las sustancias amortiguadoras tales como los fosfatos, la glicina, el ácido sórbico, el sorbato de potasio, las mezclas de glicéridos de ácidos grasos saturados de vegetales, de agua, de sales o de electrolitos, tales como el sulfato de protamina, el fosfato ácido disódico, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, la sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, las sustancias a base de celulosa, polietilenglicol , carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos , ceras, los bloques de polímeros de polietileno-polioxipropileno y la grasa de lana. Las ciclodextrinas tales como las A-, B-, y G-ciclodextrinas , o los derivados químicamente modificados tales como las hidroxialquilciclodextrinas , comprendidas las 2- y 3-hidroxipropil-b-ciclodextrinas, u otros derivados solubilizados , pueden igualmente ser ventajosamente utilizados para mejorar la distribución de las composiciones de acuerdo a la invención.
Las composiciones de acuerdo a la invención pueden además contener un adyuvante. Cualquier adyuvante o mezcla de adyuvantes farmacéuticamente aceptables clásicamente utilizados en el dominio de las vacunas, pueden ser utilizados para este fin. Se pueden citar, a manera de ejemplos de adyuvantes apropiados, las sales de aluminio, tales como el hidróxido de aluminio o el fosfato de aluminio, el DC-Chol. Cualquier adyuvante o mezcla de adyuvantes farmacéuticamente aceptables clásicamente utilizados en el dominio de las vacunas pueden ser utilizados para este fin. A manera de ejemplo de adyuvante, se puede citar las sales de aluminio tales como el hidróxido de aluminio o el fosfato de aluminio, y el DC-Chol.
Las composiciones de acuerdo a la invención pueden contener los genes adyuvantes, es decir, los genes que expresan proteínas que van a jugar el papel del adyuvantes aumentando la inmunogenicidad de las proteínas virales expresadas. Por ejemplo, los genes que codifican para las citocinas tales como las interleucinas (II) [IL-2, IL-12, IL-15, ... o el GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos) ] . Estos genes adyuvantes son ya sea incorporados en el plásmido viral o bien co- inyectados bajo la forma de plásmidos de expresión separados.
No importa cuál método de administración conocido por el experto en la materia, puede ser utilizado. En particular, el ácido nucleico, el vector, la composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo a la invención pueden ser administrados por la vía oral, por inhalación, o por la vía parenteral (en particular mediante inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, intramedular o intramuscular) . Cuando la vía parenteral es utilizada, el ácido nucleico, el vector, la composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo con la invención pueden estar bajo la forma de soluciones y suspensiones inyectables, acondicionadas en ampolletas o en frascos. Las formas para una administración parenteral son en general obtenidas mezclando el ácido nucleico, el vector, la composición inmunogénica o la vacuna de acuerdo a la invención con amortiguadores, emulsificantes , estabilizantes, conservantes, y agentes solubilizadores . De acuerdo a las técnicas conocidas, estas mezclas pueden ser en seguida esterilizadas y acondicionadas bajo la formación de inyecciones intradérmica, subcutánea, intravenosa, intramedular o intramuscular. La persona experta puede utilizar amortiguadores basados en sales de fosfato orgánico en calidad de amortiguador. Los ejemplos de agentes emulsionantes incluyen la metilcelulosa, la acacia, la carboximetilcelulosa de sodio. Los ejemplos de estabilizadores incluyen el sulfito de sodio, el metasulfito de sodio, y los ejemplos de conservantes incluyen el p-hidroxibenzoato de sodio, el ácido sórbico, el cresol, y el clorocresol. El ácido nucleico, el vector, la composición inmunogénica o de vacuna pueden igualmente estar bajo la forma liofilizada.
La solución de ADN de vacuna puede ser inyectada directamente o bien administrada mediante electroporación in vivo utilizando un electroporador comercial, o bien encapsulada en liposomas o en nanopar ículas o utilizando cualquier procedimiento de transfección in vivo que permita una mejor introducción de ADN de vacuna en la célula del hospedero vacunado.
En otro aspecto más, la invención se refiere a un ácido nucleico de acuerdo a la invención, un vector de acuerdo con la invención y/o una composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo a la invención para su utilización en la prevención y/o el tratamiento de una infección por un retrovirus .
Por "prevenir" o "prevención" , se entiende la inhibición de una infección retroviral, es decir, para impedir que el retrovirus provoque una infección, o prevenir la propagación del retrovirus en el interior de un sujeto infectado o de un sujeto a otro.
Por "tratar" o "tratamiento" se entiende la limitación de la severidad de la enfermedad, la prevención de las infecciones recurrentes, es decir, limitar la reactivación de las infecciones latentes o persistentes, y palear los síntomas de las infecciones por un retrovirus. El retrovirus es tal como se definió anteriormente, y de manera preferida el retrovirus es el VIH-1, el VIH-2 o el VIF.
El término "paciente" o "sujeto" u "hospedero" designa un mamífero humano o no humano, o un ave. Preferentemente, el paciente es un primate, un murino (ratón) , un felino (gato) , un canino, un équido (caballo) , un ave, un humano, incluyendo mujeres, hombres, adultos e infantes .
La presente invención se refiere igualmente a un método de vacunación o de tratamiento de un sujeto que la necesita, que comprende la administración de una cantidad profilácticamente y terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico de acuerdo a la invención, o de un vector de acuerdo a la invención, o de una composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo a la invención.
Una "cantidad profilácticamente o terapéuticamente efectiva" designa una cantidad de ácido nucleico, del vector de la composición inmunogénica o de vacuna que permite conferir un efecto terapéutico o profiláctico sobre el sujeto tratado. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, mensurable por pruebas o marcadores) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de un efecto o resiente un efecto) . Una cantidad efectiva puede variar desde aproximadamente 0.01 µg/Kg hasta 5000 g/Kg, alternativamente de aproximadamente 0.1 a 1000 g/Kg, alternativamente de aproximadamente 1 a 500 ug/Kg. Las cantidades respectivas van a variar también de acuerdo a la vía de administración, la utilización o no del método de transfección in vivo, el tamaño y el peso del sujeto, así como de acuerdo a la posibilidad de una co-utilización con los otros agentes.
En el contexto de la invención, el modo de administración del ácido nucleico de acuerdo con la invención, o del vector de acuerdo con la invención, o de la composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo a la invención, puede ser realizada mediante la vía intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramedular o intramuscular.
La invención va a ser explicada más detalladamente con los ejemplos siguientes, sin limitar su alcance.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No.: 2.
Figura 2 : Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No. : 4.
Figura 3 : Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No.: 5.
Figura 4 : Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No. : 6.
Figura 5 : Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No. : 7.
Figura 6: Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No. : 1.
Figura 7 : Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No.: 12.
Figura 8 : Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No.: 13.
Figura 9 : Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No.: 14.
Figura 10: Representación esquemática del ácido nucleico codificado por la secuencia SEQ ID No.: 15.
Figura 11: Representación esquemática de la construcción del genoma de CAEV, del plásmido pSHIVKu2, pCA-LTR-SHIVKTOIN- y de pA4SHIVku2.
Figura 12 : Evaluación del número de linfocitos T que secretan IFN-? de ratones Balb/c. Las células del bazo de ratones inmunocompetentes BALB/c testigos e inmunizados con pÁ4SHIVKU2 y PCA-LTR-SHIVKU2lN y estimuladas por los péptidos Gag, Env y el combinado peptídico Tat+Rev+Nef. El número de puntos ha sido calculado para 1 millón de PBMCs .
Figura 13 : Evaluación del número de linfocitos T humanos que secretan IFN-? en ratones NOD/SCID-hu inmunizados. Células del bazo de ratones inmunodeficientes reconstituidas por las células mononucleares de sangre humana, e inmunizadas con pA4SHIVKU2 o pCA-LTR-SHIVKU2IN o PSHIVKU2 son estimuladas por los péptidos Gag, Env y por el combinado peptídico Tat+Rev+Nef. El número de puntos ha sido calculado para 1 millón de PBMC y normalizado a 20%.
Figura 14 : Representación de la preparación del vector CA-LTR-SHIVKU2-IN- .
Figura 15 : Representación esquemática del vector CA-LTR-SHIVKU2- · Figura 16: Representación esquemática del vector CA-LTR-SHIVKU2-IN- .
Figura 17: Representación de la preparación del vector CAL-HIV-IN-.
Figura 18 : Representación esquemática del vector CAL-HIV-IN- .
Breve Descripción del Listado de Secuencias La SEQ ID No. : 1 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del SAEV y el genoma del SHIV suprimido de las secuencias que codifican para la integrasa.
La SEQ ID No. : 2 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del CAEV y el genoma del VIH-1.
La SEQ ID No. : 3 representa la secuencia de la LTR de CAEV.
La SEQ ID No. : 4 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del CAEV y el genoma del SIV.
La SEQ ID No. : 5 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del CAEV y el genoma del VIH-2.
La SEQ ID No. : 6 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del CAEV y el genoma del FIV.
La SEQ ID No. : 7 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del CAEV y el genoma del SHIV.
- La SEQ ID No.: 8 representa la secuencia de integrasa del SIV.
La SEQ ID No. : 9 representa la secuencia de integrasa del VIH-1.
La SEQ ID No.: 10 representa la secuencia de integrasa del VIH-2.
La SEQ ID No.: 11 representa la secuencia de integrasa del FIV.
La SEQ ID No . : 12 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del CAEV y el genoma del VIH-1 suprimido de las secuencias que codifican para la integrasa.
La SEQ ID No . : 13 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del CAEV y el genoma del VIH-2 suprimido de las secuencias que codifican para la integrasa.
La SEQ ID No. : 14 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del genoma de CAEV y el genoma FIV eliminado que codifican para la integrasa.
La SEQ ID No. : 15 representa la secuencia de un genoma retroviral quimérico que comprende las LTR del genoma de CAEV y el genoma SIV eliminado que codifican para la integrasa.
La SEQ ID No. : 16 representa la secuencia del vector de pCA-LTR-SHIVKU2.
La SEQ ID No. : 17 representa la secuencia del vector de pCA-LTR-SHIVKU2-IN.
La SEQ ID No. : 18 representa la secuencia del vector de CAL-HIV-IN- .
Descripción Detallada de la Invención EJEMPLOS 1. Material y métodos 1.1. Los vectores de vacuna (Figura 1) 1.1.1 Vectores pCA-LTR-SHIVKU2 y pCA-LTR-SHIVKU2- IN- El vector CA-LTR-SHIVu2 contiene el genoma del virus de inmunodeficiencia de simio y humano (SHIV) suprimida de LTR de SIV y reemplazadas por la LTR del CAEV. El SHIV contiene un genoma quimérico compuesto de aquel de VIS-mac239, en el cual los genes tat, env y rev del SIV han sido suprimidos y reemplazados por los genes vpu tat, env y rev del VIH-1. El vector lleva por lo tanto los genes vpr, vpx, gag, pol, vip y net del SIV y los genes tat, rev, vpu y env de VIH-1 bajo el control transcripcional de la LTR en dirección 5' y 3' del CAEV. El gen pol ha sido suprimido de las secuencias codificantes de la integrasa (in) . El vector de vacuna pCA-LTR-SHIVKu2 no suprimido de la secuencia SEQ ID No.: 16 (Figura 15). El vector de pCA-LTR-SHIV^-IN- , suprimido de las secuencias codificantes de la integrasa consiste de la secuencia SEQ ID No.: 17 (Figura 16) .
La construcción del vector CA-LTR-SHIVKU2-IN- , ha sido realizada de la manera siguiente (Figura 14) . El vector SHIVKu2 ha sido digerido con EcoRI y NarI , luego el fragmento LTR de 0.8 kb ha sido obtenido. El vector CAEV-pBSCA ha sido en seguida digerido con EcoRI y NarI y el fragmento LTR de 0.5 kb ha sido purificado. Los dos fragmentos han sufrido en seguida una ligadura. El vector SVIH-1LTRCA ha sido en seguida digerido con Stul y Aval y el fragmento LTR de 0.8 kb ha sido obtenido. La LTR en dirección 3' del CAEV ha sido amplificada con los cebadores Stul y Aval, los productos de la PCR han sido digeridos con Stul y Aval y el fragmento LTR de 0.5 kb ha sido purificado. Los dos fragmentos han sufrido una ligadura para generar el CAL-SHlVKu2- Finalmente, una ligadura con Kpnl y Accl en el gen pol ha sido realizada para obtener 314 pb del gen de la integrasa del SHIV para generar el CAL-SHIVKU2-IN- . 1.1.2 Vectores pSHIVKU2 y A4SHIVKU2 Los plásmidos pSHIVKu2 y A4SHIVKU2 son los plásmidos utilizados como testigos. Sus construcciones han sido descritas en numerosas publicaciones (Liu ZQ et al. 2006, Ramakrisna Hegde et al. 2005). 1.2 Producción del ADN de vacuna 1.2.1 Cultivo bacteriano Las bacterias E. coli K12 (JM109) que contienen el plásmido son puestas en precursores en pre-cultivo en 5 mi de medio LB que contiene 0.05 mg/ml de kanamicina y luego incubadas una noche a 30°C bajo agitación a 150 revoluciones/minuto (rpm) . A partir del pre-cultivo, la suspensión bacteriana es diluida hasta 100,000mo en el medio LB, luego 50 µ? de la dilución son extendidos sobre la superficie de agar/LB/kanamicina contenido en una caja de Petri que es en seguida incubada a 32 °C durante una noche. Las colonias aisladas desarrolladas sobre el agar de la caja de Petri son sembradas en 5 mi de medio líquido LB que contiene 0.05 mg/ml de kanamicina y colocadas en cultivo bajo agitación a 150 rpm a 30°C durante una noche. Una porción (1 mi) del cultivo es utilizada para una extracción rápida del ADN con la ayuda del kit Mini-prep de Macherey-Nagel o Qiagen, de acuerdo con el protocolo recomendado, luego el ADN extraído es separado sobre gel de agarosa al 1% para verificar su calidad. Las bacterias que corresponden al ADN juzgado satisfactorio son utilizadas para sembrar los cultivos de 1 litro que son cultivados en las mismas condiciones que se indican anteriormente, para el aislamiento del ADN en maxipreparación . 1.2.2. Maxi-preparación: extracción plasmídica Las bacterias cultivadas bajo agitación (150 rpm) a 30°C durante una noche son recolectadas en un botón por centrifugación (4000 g, 4°C, 15 minutos) y el botón es resuspendido en 8 mi de amortiguador de resuspensión (Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 10 mM) . Las células son en seguida lisadas por la adición de 8 mi de amortiguador de lisis alcalina (NaOH 200 mM, 1% de SDS) para liberar el ADN plasmídico. El lisado es neutralizado por la adición de 8 mi de amortiguador de neutralización (acetato de potasio 3M, pH 5.5) . La mezcla ha sido incubada 5 minutos en hielo y después centrifugada 15 minutos a 15 000 g a 4°C. La solución que contiene el ADN es trasbasada en una colonia previamente equilibrada que permite retener el ADN plasmídico. La columna es lavada tres veces con el amortiguador de lavado y luego el ADN es diluido y precipitado con isopropanol. El botón del ADN precipitado es obtenido mediante centrifugación (30 min, 15 000 g a 4°C) . El ADN es enseguida lavado con 2 mi de etanol al 70% y centrifugado 10 minutos a 4°C a 15 000 g para eliminar el exceso de impurezas y de sales luego el botón es secado y resuspendido en un volumen apropiado de agua ultrapura.
La concentración de la solución de ADN es entonces determinada mediante espectrofotometría a una longitud de onda ? igual a 260 nm, y luego la calidad del plásmido es verificada por migración electroforética sobre un gel de agarosa al 1%. El tamaño del plásmido y la integridad del plásmido son verificados por el gel de agarosa después de la digestión por las enzimas de restricción BamHI y EcoRI , por ej emplo . 1.2.3 Verificación de plásmido PCA-LTR-SHIVKU2- IN por digestión enzimática Una fracción de alícuota de 0.5 \ig del plásmido es sometida a digestión con 2 unidades de enzimas EcoRI, BamHI y Sphl durante 60 minutos a 37°C en amortiguador IX apropiado para cada enzima, y en un volumen final de 20 µ? . El perfil de la digestión es verificado por migración electroforética en un gel de agarosa al 1% con un amortiguador de TAE IX y revelado con bromuro de etidio (BET) y observación del gel bajo luz UV. 1.3 Cultivos celulares y tratamientos: 1.3.1. Modelos celulares y condiciones de los cultivos Las líneas celulares han sido obtenidas de los Institutos Nacionales de la Salud (National Institute of health AIDS Research) del Programa de Investigación del SIDA y Reactivos de Referencia (AIDS Research and Rerefence Reagent Programa) de los Estados Unidos. Las células son crioconservadas en 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a - 170°C en nitrógeno líquido. Éstas son descongeladas y luego cultivadas en matraces de cultivo.
Las células HEK293T (riñon embrionario humano 293 inmortalizado) constituyen una línea permanente de células de riñon embrionario humano. Éstas son utilizadas debido al hecho de que son muy fáciles de transfectar, con eficiencias de transfeccion muy elevadas que pueden alcanzar el 100%. El genoma lentiviral es expresado fuertemente en estas células y las proteínas se ensamblan en partículas infecciosas y su co-cultivo con las células indicadoras (CEM o M8166) permite la formación de sincitios típicos. Las células HEK293T son adherentes cultivadas en monocapa a la superficie de los matraces en el medio MEM suplementado con 10% de suero fetal de ternera (SVF) , 1% de penicilina de 5,000 Unidad/ml de estreptomicina 5,000 µg/ml y 1% de gentamicina a 10 mg/ml. Las células son mantenidas a 37°C bajo atmósfera húmeda a 5% de C02 · El medio de cultivo es cambiado los tres días. Para efectuar los subcultivos, el medio nutritivo es eliminado, las células son lavadas con PBS/EDTA e incubadas 1 minuto a 37°C en presencia de tripsina a 0.5%-EDTA 0.01%. Después del desprendimiento de las células, un volumen del medio MEM es inmediatamente agregado a las células, luego las células son homogeneizadas y transferidas a nuevos matraces.
Las células CEMxl74 y M8166 son líneas de linfocitos T CD4+ humanos que son permisivas para la infección por los lentivirus humanos y de simio y forman efectos citopáticos (CPE) típicos. Éstas son no adherentes y son cultivadas en el medio RPMI suplementado con 10% de SVF, 1% de penicilina-estreptomicina, y 1% de gentamicina. Las células son mantenidas a 37°C bajo atmósfera húmeda a 5% de C02. El medio es cambiado los tres días efectuando una etapa de centrifugación a 1500 g durante 5 minutos . El botón es enseguida suspendido por aspiraciones y las presiones y expulsiones sucesivas en un volumen apropiado del medio de cultivo. 1.3.2 Evaluación funcional con prueba biológica in vitro Transf cción de células HEK293T con los plásmidos pCA-LTR-SHIVKU2-IN O pSHIViojs El método de transfección usado es el método con ExGen500. El ExGen500 (Euromedex, Francia) está compuesto de un polímero catiónico a base de polietilenimina lineal. Este polímero posee una gran densidad de carga catiónica que permite formar los complejos con el ADN mediante ligaduras iónicas. Estos complejos ExGen500/ADN son entonces capaces de integrarse con las membranas plasmáticas de las células en general aniónicas (interacción vía los proteoglicanos sulfatados) . Viene enseguida una endocitosis de los complejos por las células y su transporte hacia los endosomas/lisosomas . Por su capacidad de protonación a pH ácido, el ExGen500 permite amortiguar el medio de las vesículas ácidas impidiendo de este modo la degradación del ADN transfectado . Esta propiedad provoca también un choque osmótico, que permite al ADN ser liberado en el citoplasma de la célula. El ExGen500 favorece en seguida el transporte del ADN hacia el núcleo y evita su degradación por las nucleasas citoplásmicas .
Cinco µg del ADN del plásmido son agregados a 350 µ? en solución de NaCl 150 mM y a 15 µ? de ExGen 500. La mezcla es incubada a 40 minutos a temperatura ambiente. Luego la mezcla es agregada y los matraces que contienen las células HEK-293T recubiertas del medio recién renovado.
Infección, de CEMxl74 y amplificación del material viral Las HEK-293T transfectadas por el ADN del pCA-LTR-SHIVKu2-IN- del pSHIVKU2 son puestas en co-cultivo con las CEMxl74, y a partir de las 48 horas las CEMxl74 desarrollan los signos de infección que se traducen en la formación de ECP que resulta de la fusión de CEMxl74 para formar los sincitios. Las CEMxl74 infectadas son transferidas a un nuevo matraz en presencia de CEMxl74 frescas para amplificar el virus que es recolectado en el sobrenadante.
Producción viral La recolección del material viral se efectúa a partir de las 48 horas con la ayuda de una jeringa, luego los desechos celulares son eliminados mediante el pase a través de un filtro de diámetro de 0.22 µ?? antes de ser colocado en tubos que son almacenados a -80°C.
Inoculación de células por el virus Una fracción de alícuota (10 a 100 µ?) del sobrenadante del virus es utilizada para inocular las células objetivo con el fin de evaluar su infectividad por el desarrollo citopático o por detección de la expresión de genes marcadores.
Titulación del virus sobre las células no adherentes El sobrenadante que contiene el virus es diluido de diez en diez (diluciones sucesivas) en el medio para obtener diluciones de 10"1 a 10"6 que son utilizadas para inocular una cuadriplaca de pozos que contiene lxlO5 células por pozo en 0.5 a 1 mi del medio RPMI en una placa de 24 pozos. Las células inoculadas de este modo son incubadas a 37°C y 5 % de C02, y conservadas por cambio del medio cada 3 días. Estas son observadas regularmente para el desarrollo de ECP. 1.4. Microscopía electrónica de células HEK293T transfectadas con el pCA-LTR-SHIVKÜ2-IN- Con el objetivo de examinar si las proteínas producidas por el genoma de vacuna pCA-LTR-SHIVKU2-IN- se ensamblaban en partículas virales, los inventores han realizado estudios morfológicos mediante microscopía electrónica (ME) .
Las muestras de las células HEK293T transfectadas con el pCA-LTR-SHIVKU2-IN- , pSHIV^ O A4SHIVKU2 son fijadas en una solución de glutaraldehído al 2.5 % diluido en un amortiguador de cacodilato (0.1M de cacodilato de sodio). Estas son enseguida post- fij adas , a 4°C, en un amortiguador de cacodilato que contiene 1 % de tetraóxido de Osmio (0s04) durante 60 minutos. Las muestras son enseguida incubadas durante una noche a 4°C en la oscuridad en acetato de uranilo a pH 4. Las muestras son enseguida sumergidas en baños sucesivos de 10 minutos de etanol diluido respectivamente al 30 %, 60 %, 90 % y 100 %. Enseguida, las muestras son sumergidas durante dos horas en una mezcla 50/50 de etanol puro y de resina Epóxica (8 mi de DDSA, 7 mi de MNA, y 13 mi de Epoxi) . Las muestras son enseguida colocadas dos horas en la resina epóxica pura antes de ser incluidas en las cápsulas Beem y puestas a polimerizar durante 48 horas a 60°C.
Cortes ultrafinos de estas regiones son efectuados con la ayuda de un cortador de diamante con la ayuda de un ultra-microtomo . Estos cortes de 70 mm de espesor son depositados sobre rejillas de cobre para ser observadas bajo una tensión de 80 kV con la ayuda de un ME de transmisión Jeol 1200 EX. 1.5. Inmunización de ratones con el ADN de vacuna pCA-LTR- SHIVKu2- IN- . 1.5.1. Humanización y vacunación de ratones NOD/SCID Ratones de 6 semanas de edad son irradiados con una dosis de 120 Centigray de radiación gama de 50 segundos.
Humanización de ratones con PBMC de sangre humana La sangre total recogida sobre citrato de sodio es centrifugada (2000 g, 10 minutos, 20°C) para recuperar la capa de glóbulos blancos entre el plasma y los glóbulos rojos. Las células son diluidas 3 veces en PBS/EDTA, depositadas delicadamente por arriba de una almohadilla de Ficoll (medio de separación de linfocitos) y luego centrifugado a 45 minutos a 2000 g a 20°C. Las PBMC son recuperadas, lavadas varias veces en PBS/EDTA y resuspendidas en PBSxl luego 50xl06 PBMC en 0.1 mi son inyectadas para cada ratón por la vía intraperitoneal .
Inmunización de ratones Después de 48-72 horas post-humanización, los ratones SCID-hu son inyectados por la vía intramuscular (IM) con 50 µg de ADN de pCA-LTR-SHIVKU2-IN- , pSHI ^ o PA4SHIVKU2. Los ratones BAL/c de 6 a 8 semanas de edad son directamente inmunizados por inyección IM con 100 µg de cada uno de los ADNs . 1.5.2 Método de evaluación de la respuesta humoral Prueba de ELISA en Emparedado Abnova : Esta prueba está basada en la detección de los anticuerpos dirigidos contra los antígenos virales que son fijados en el fondo de la placa de 96 pozos. Los sueros a probar (recuperados a diferentes tiempos post-inmunización) , los controles positivos y negativos son depositados en los pozos. Los Ac anti-HIV eventualmente presentes se fijan sobre los antígenos virales.
Después de varios lavados de los pozos para eliminar el exceso y las fijaciones no específicas, se agrega un Ac secundario de detección que lleva una molécula de biotina que interactúa con la estreptavidina acoplada a la enzima HPRO. Los complejos antígeno/Ac formados serán luego detectados por la adición del sustrato de la enzima, el TMB, que dará surgimiento a una reacción coloreada. La coloración es traducida en densidad óptica mediante lectura con un fotómetro lector de ELISA.
Los reactivos y los productos son llevados a temperatura ambiente. Los controles negativos y positivos (100 µ?) proporcionados en el kit, los testigos (100 µ?) y las muestras de suero 10 y 50 µ? son depositados en los pozos en un volumen final de 100 µ? . La placa es incubada durante 30 minutos a 37°C, luego enjuagada con la solución de lavado. La solución del Ac secundario diluida a un céntimo es agregada (100 µ?) en todos los pozos excepto en los testigos. La placa es enseguida recubierta con papel parafilm e incubada a 20 minutos a 37°C. Una solución A y B de TMB es agregada después de una etapa de lavado y la placa es incubada a 15 minutos a temperatura de laboratorio. Para detener la etapa de coloración, se agregan por pozo 100 µ? de H2S04 2N. La lectura de la placa es realizada a 450 nm.
Son consideradas como positivas las muestra que tienen un valor de absorbancia igual o superior al valor de umbral, el valor de umbral es determinado de acuerdo a la fórmula siguiente: Valor de Corte = NCx + 0.100 con NCx = la media de los valores de absorbancia de dos controles negativos .
Prueba de sero-neutralización Esta técnica se basa en la capacidad de los Ac seroneutralizadores (sero-N) para inhibir la infección de las células sensibles al virus. Para la detección de los Ac sero-N séricos, una cantidad constante de virus infeccioso es puesta en contacto con diluciones en serie del suero a probar, luego la mezcla es inoculada a un cultivo celular permisivo sobre microplacas, e incubado 3 a 5 días. El virus es más frecuentemente una cepa citopatógena, y por consecuencia la ausencia o la reducción en el número de ECP se traduce en la presencia de Ac en el suero probado.
El material viral SHIVKu2 es diluido a un milésimo en RPMI (el volumen del sobrenadante del virus es determinado para 100 TCID50, lo que corresponde a la dilución del virus para el cual 50 % de los pozos presentan sincitios) y los sueros recuperados de los ratones NOD/SCID testigo, humanizados y vacunados con pCA-LTR-SHIVKU2- IN- o pSHIVKu2 son diluidos en el mismo medio (a diluciones de 10, 20, 40, 80, 160 y 320) . El virus diluido y las diluciones de suero son mezcladas en una placa de 96 pozos (100 µ?/????) y la mezcla es puesta a incubar 1 hora a 4°C. La mezcla es enseguida depositada sobre las células M8166 (lxlO5 células/pozos) previamente colocadas en cultivo en una placa de 24 pozos. En este experimento, el control positivo es representado por el virus proveniente del pSHIVKu2 sin suero, y el control negativo corresponde a las células solas.
Método de evaluación de la respuesta celular: Prueba Elispot Esta prueba tiene por objetivo poner en evidencia y evaluar la proporción de los linfocitos T (LT) que secreta IFM-? en respuesta específica a una estimulación antigénica.
Los ratones son previamente anestesiados profundamente, luego la sangre total y el bazo son recolectados . Los bazos de los ratones son puestos en el medio RPMI en hielo. La sangre en los tubos secos es utilizada para aislar el suero. Los esplenocitos son aislados luego de una trituración del bazo en una caja de petri entre un par de laminillas en presencia de PBS y EDTA al 1 % . Las células son lavadas 2 veces en PBS/EDTA (centrifugación a 2000 g, 5 minutos a 20°C) con el fin de purificar y de enriquecer en esplenocitos. Antes de sembrar los pozos con las células, la placa es lavada con PBS y luego incubada a 30 minutos con PBS+SVF al 10 % a temperatura de laboratorio. Las células (5x10s esplenocitos) son sembradas en cada pozo, y son inoculadas con los combinados de péptidos de las proteínas Gag, Env, Tat, Rev y Nef a una concentración final de 2 µ9/??1) . Los controles positivos (CD3-2 incluidos en el kit) y negativos, son agregados al ensayo. La placa es recubierta de una bolsa de aluminio y es colocada en la incubadora a 37°C durante 19 horas. Las células y los péptidos son lavados, luego el Ac monoclonal anti-IFN-? biotinilado (7-b6-biotina) es agregado, y la placa es recubierta e incubada durante 2 horas a temperatura ambiente. La estreptavidina diluida en PBS que contiene 0.5 % de SVF es agregada (100 µ?/pozos) y la placa es incubada a 1 hora a temperatura ambiente. El TMB, el substrato revelador, es agregado subsecuentemente después de otra etapa de lavado, luego la placa es lavada y secada después de la aparición de puntos azules. La lectura de la placa es realizada con lupa binocular a una amplificación de *40.
Los criterios de positividad de un pozo son determinados para cada condición calculando la media del número de puntos de los duplicados, así como las desviaciones estándares. El número de puntos es calculado para 1 millón de PBMC y es normalizado al 20 % para los datos obtenidos en los ratones NOD/SCID. La prueba es considerada como positiva si el valor de la media de los puntos es superior a 10 puntos por millón de PBMC lo que corresponde a la media de los puntos obtenidos con los controles de cultivo. 1.6 Exámenes Eenotípicos y funcionales de las células T especificas del antígeno mediante citometría de flujo 1.6.1. Aislamiento de las células mononucleadas periféricas Las células mononucleadas de sangre periférica humana son preparadas como se indica anteriormente. Los esplenocitos de los bazos de los ratones, aislados de acuerdo al protocolo descrito anteriormente, son también resuspendidos en el medio AIM V sin suero para el cultivo y las pruebas de citometría. 1.6.2 Estimulación antigénica y puesta en cultivo de las células Para examinar si las células específicas del antígeno son capaces de proliferar y de producir las citocinas y las moléculas líticas, los esplenocitos y las PBMCs son marcadas con CFSE (1 µg/ml) durante 10 minutos a 37°C, luego las células son lavadas con PBS IX para eliminar el exceso. Las células marcada son sembradas en los pozos profundos de placas de 96 pozos a razón de 2xlOs/pozo en 1 mi del medio AIM V, luego estimuladas con los diferentes combinados de pép idos (Gag, Env y Tat+Rev+Nef) a razón de 2 µg/ml en presencia de los anticuerpos de co-estimulación anti-CD49 y CD28. Las células sin péptidos son utilizadas como control negativo y las células adicionadas de fitohemaglutinina (PHA) 2 µ9/??1 son utilizadas como control positivo. Las células son cultivadas durante 5 días (37°C bajo humedad) luego re-estimuladas con los mismos combinados de péptido durante 6 horas antes de marcarlas. Las células son recolectadas mediante centrifugación (2000g, 5 min, 4°C) , resuspendidas en 100 µ? de PBS y en primer lugar marcadas con los anticuerpos de superficie (CD3, CD4 y CD8) [CD3 antihumano Pacific Blu CD3 (5 µ?) , PE CD4 anti-humano (10 µ?) y CD8 APC/Cy7 anti-humano (10 µ?)] durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células son enseguida centrifugadas y lavadas con PBS IX y luego fijadas y permeabilizadas en 100 µ? de Cytofix Cytoperm de BD. Las células son enseguida incubadas durante 20 minutos a 4°C con los anticuerpos "anti-IFN-? PE-Cy7 humano" y "Alexa Fluor 647 anti-Granzyme A humano" (5 µ?) para las marcaciones citoplásmicas . Las células son finalmente lavadas con PBS y fijadas con PFA al 4 % antes de la adquisición y el análisis de la citometría de flujo. 1.6.3. Instrumentación Un citómetro de flujo LSRII en BD conectado al programa BD FACSDiva6 ha sido utilizado. Este instrumento permite medir hasta 13 parámetros de fluorescencia y dos parámetros físicos que son el tamaño FSC (Dispersión Delantera) y la complejidad o granulosidad SSC (Dispersión Lateral) . El instrumento está equipado de tres láseres. El láser azul que emite a 488 nm puede excitar independientemente varios fluorocromos (FITC, PE, PE-Cy7) . El láser rojo que emite a 633nm puede excitar los fluorocromos APC y APC-Cy7. Y finalmente el láser violeta que emite a 405 nm puede excitar el fluorocromo Pacific Blue. 1.7 Inmunización de macacos Un total de 12 macacos cynomolgus son utilizados en este estudio. Seis macacos que constituyen el grupo control y los otros seis el grupo de los vacunados. Los animales han sido inmunizados por una sola inyección doble de ADN por la vía intramuscular (4 mg/animal) y 1 mg/animal mediante electroporación (EP) .
Las razones de esta estrategia de inmunización por una dosis única de vacuna son múltiples. Una de las razones principales es no perturbar la generación, la maduración y la amplificación de las células T de memoria por las células T efectoras primarias, asociadas a cada etapa de la reinmunización.
Los animales inmunizados han sido sometidos a un seguimiento longitudinal (1 vez por semana durante 4 semanas, luego una semana sobre 2 hasta la semana 32, luego 1 semana sobre 4 durante 10 meses para examinar las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna. Las muestras de sangre tomadas a la semana -2 y -1 antes de la inmunización han sido utilizadas para examinar las eventuales respuestas básales.
Las células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) son aisladas y utilizadas para evaluar las respuestas de las células T por la prueba de ELISPOT INF-?, mediante marcaciones de la superficie e intracitoplásmica, y el análisis mediante citometría de flujo. 2. Resultados 2.1. Verificación cualitativa y cuantitativa de la construcción del plásmido pCA-LTR-SHIVKU2- IN- 2.1.1. Presencia del plásmido pCA-LTR-SHIVKU2-IN- Cuando el ADN plasmídico ha sido aislado a partir de un cultivo bacteriano policlonal obtenido de un precultivo en el medio LB, utilizado para sembrar un gran volumen del medio líquido de LB, una proporción importante de episoma es observada alrededor de 2000pb. El perfil electroforético pone igualmente en evidencia la presencia de una sola banda de ADN alrededor de 14 000 pb (que en teoría hace 13 739 pb) que corresponde al plásmido.
Cuando el ADN es aislado a partir de un cultivo bacteriano realizado primeramente en caja de petri para obtener las colonias aisladas, estas colonias que han sido utilizadas para el precultivo y el cultivo en masa sirven para el aislamiento y purificación del ADN plasmídico, el perfil electroforético obtenido después de la separación de 0.5 µ9 de ADN muestra la ausencia de episoma y pone en evidencia tres bandas de ADN de alto peso molecular, que corresponden a las forma circulares, enrolladas y superenrolladas del plásmido pCa-LTR-SHIVKu2- IN- . La pureza y la evaluación cuantitativa de los ADN plasmídicos de nuestras dos preparaciones han sido verificadas mediante espectrofotometría . Los valores de las mediciones de la absorbancia a las longitudes de 230, 260 y 280 han sido utilizados para determinar las relaciones 260/280 que serían de 1.75 y 1.82 y a 260/230 de 2.4 y 1.92 respectivamente, que atestiguan una calidad satisfactoria de nuestro ADN. Las concentraciones de ADN son respectivamente de 545 g/ml y de 765 g/ml. 2.1.2 Digestión enzimática de pCA-LTR-SHIVKu2-IN El perfil de la digestión del plásmido con EcoRI revela la presencia de dos bandas de aproximadamente 5000 y 7500 pb provenientes de los cortes a nivel de dos sitios EcoRI, tres bandas con Bam HI de 2400 pb, 4900 pb y 7400 pb resultantes de los cortes a nivel de dos sitios Bam HI, y una banda con Sphl situada a 10 000 pb resultante del corte a nivel del sitio único Sphl. Una banda suplementaria de 2400 pb es igualmente observada con la digestión con BamHI y ésta resultaría del episoma. 2.2. Evaluación de la funcionalidad: Efecto del ADN plasmídico sobre las células Las células HEK293T han sido transíectadas con un plásmido control pCG-GFP que expresa la GFP, el plásmido pSHIVKU2, luego con el plásmido pCA-LTR-SHIVKU2-IN- . Las células transfectadas con el plásmido pCG-GFP han permitido estimar la eficacia de la transfección mediante el número de células GFP+ .
Para verificar que las células HEK293T transfectadas con pCA-LTR-SHIVU2-IN- o pSHIVKu2/ produzcan viriones que inducen los sincitios típicos, estas células han sido puestas en co-cultivo con las CEMxl74, luego la aparición de las ECP ha sido seguida por observación bajo el microscopio. Uno y el otro co-cultivo han producido las ECP características .
Para verificar que el virus SHIVKU2 producido por las células transfectadas se replica varias veces, el sobrenadante de las células transfectadas ha sido utilizado para infectar la línea línfocitaria T CD4+ humana M8166. Los resultados obtenidos con el SHIVKU2, muestran claramente que éste infecta e induce las ECP sobre todo con la línea celular altamente permisiva M8166. Estas ECP aparecen desde las 48 horas pero también en estados tardíos .
Posteriormente para verificar que el ADN del vector de vacuna pCA-LTR-SHIVicu2-IN- no permite más que un solo ciclo de replicación (como éste está suprimido del gen in) el sobrenadante recuperado que contiene el virus CA-LTR-SHIVKu2-IN ha sido inoculado una primera vez, luego una segunda vez, en las M8166 en cultivo. La primera inoculación ha producido las ECP a partir de las 48 horas y al cabo de 76 horas estos producen varios números. El sobrenadante de estas células infectadas ha sido recuperado e inoculado una vez más en las M8166. De manera contraria a la inoculación precedente, ninguna ECP es visible ni a las 48 ni a las 76 horas después de la inoculación. Estos resultados permiten concluir que el CA-LTR-SHIVKU2-IN- permite transducir una sola vez las células objetivo en cultivo.
La presencia de las ECP típicas, sugiere que el ADN plasmídico es replicado en las células HEK293T y ha producido los viriones CA-LTR-SHIVKU2- IN- . Las ECP de la primera infección atestiguan la infectividad de la línea LT CD4+ humana M8166 por las partículas producidas, y su ausencia luego de la segunda infección atestigua el déficit de replicación productiva en estas células. 2.3. Análisis en microscopio electrónico de la morfogénesis de las partículas virales en lata células HEK293T transfectadas con el pCA-LTR-SHIVKu2-IN- Enseguida se ha determinado si las proteínas producidas por el genoma de vacuna PCA-LTR-SHIVKU2-IN- se ensamblan correctamente en partículas virales en las células HEK293T. La morfología de las células HEK293T transfectadas con el plásmido PCA-LTR-SHIVKU2-IN- ha sido examinada mediante ME.
Los resultados han mostrado que las partículas virales están presentes en la superficie de las células bajo la forma de brotes y de partículas virales maduras que son desprendidas de las células. De este modo, las proteínas virales de vacuna pCA-LTR-SHIV^-IN- se ensamblan para dar partículas virales que brotan hacia el exterior de las células. 2.4. Prueba in vivo de la vacuna sobre los ratones SCID humanizados, y sobre los ratones BALB/c 2.4.1. Evaluación de la respuesta humoral en ratones SCI-hu vacunados con el pCA-LTR-HIVKu2- IN- Las muestras de suero de los ratones inmunizados, tomadas aproximadamente 1 mes después de la inmunización, son examinadas para la presencia del anticuerpo que se enlaza específicamente a los antígenos del virus con la ayuda de una prueba de ELISA comercial. Los resultados de este análisis son sintetizados en la tabla 1 (más adelante) . Estos resultados muestran que aproximadamente la mitad de las muestras provenientes de los ratones inmunizados con el ADN de vacuna pCA-LTR-SHIVKu2- IN- , como aquellos inmunizados con el ADN de SHIVKU2, poseen proporciones menos elevadas de positivos (44 % y 37 % respectivamente) de manera contraria a aquellos provenientes de ratones inmunizados con el pA4SHIVKu2 (50 %) . Estos resultados demuestran la capacidad del ADN de vacuna pCA-LTR-SHIVu2-IN- para inducir las respuestas humorales en el ratón NOD/SCID-hu. Una muestra de tres del suero de ratones inmunizados con pA4SHIVKU2, tiene su valor de DO superior a aquellas obtenidas con las muestras de suero de ratones inmunizados con el pCA-LTR-SHIVKu2-IN-y el pSHIVKu2- Este plásmido es no replicativo, las proteínas del virus quedan asociadas a la membrana de las células transfectadas y por lo tanto debería inducir menos del anticuerpo.
Tabla 1: Detección del anticuerpo en las muestras de suero de ratones SCID testigos, SCID-hu y SCID-hu humanizados con pÁ4SHIVKu2, pCA-LTR-SHIVKu2- IN- y pSHIVKu2 y los controles . 2.4.2 Análisis de la actividad neutralizadora por sero-neutralización Los ratones SCID-hu vacunados con los plásmidos pCA-LTR-SHIVKU2-IN- o pSHIVKu2 seleccionados son aquellos donde la DO ha sido encontrada positiva por ELISA. A causa de la pequeña cantidad de suero, ciertas muestras con un fuerte valor para la prueba de ELISA, no han podido ser examinadas mediante sero-neutralizació . Una muestra de suero de ratones SCID-hu y vacunados con el pCA-LTR-SHIVKU2-IN- encontrada negativa ha sido igualmente utilizada para la prueba de ELISA para asegurar la conflabilidad de la prueba.
Tabla 2: Análisis de la actividad neutralizadora de los sueros de ratones inmunizados. Las diluciones (1/10, 1/20, ... 1/320) han sido mezcladas con el virus SHIVu2 (100 TCID50) , incubadas y luego utilizadas para inocular las células M8166. Al cabo de 5 días después de la inoculación, las EPC inducidas son contadas y utilizadas para evaluar la actividad sero-neutralizadora . Leyendas: +++ correspondiente a una fuerte neutralización, ++ neutralización muy elevada, + menos de neutralización, - ninguna acción de neutralización. Para los CA-LTR-SHIVU2 , dos tipos de muestra son representados, un tipo de muestra que tiene un perfil menos neutralizador con relación a las otras dos muestras.
El número de ECP obtenido es más elevado en las células M8166 infectadas con el virus SHIVKU2 incubados sin suero (76 ECP) o con el suero de los ratones no inmunizados (42 ECP) (controles negativos) , lo que nos ha permitido fijar el umbral de negatividad de neutralización viral a 42 ECP (datos no representados en la tabla) . Por el contrario, el número de ECP se vuelve casi nulo cuando el virus es incubado con suero diluido a 1/10 de ratones inmunizados con el ADN del CA-LTR-SHIVKU2-IN- O SHIVKu2. Este número aumenta poco a poco y a medida que se aumenta la dilución de los sueros, indicando un efecto de dosis. Por ejemplo, con el suero de un ratón inmunizado con pCA-LTR-SHIVKU2-IN- a la dilución de 1/10 se obtienen 5 ECP, mientras que a la dilución de 1/320 se obtiene un valor de 69 ECP, valor similar a aquel del control sin suero. 2.4.3. Evaluación de la inmunogenicidad de pCA- LTR-SHIVKU2- IN- en los ratones BALB/c vacunados Para estudiar la inmunogenicidad de la vacuna pCA-LTR-SHIVKU2-IN- en los ratones BALB/c, los animales han sido inyectados con una dosis única de 100 µg de ADN por la vía intramuscular. La proporción de la células del bazo (esplenocitos) específicas de los antígenos, ha sido examinada mediante ELISPOT. Los resultados de estos virus y que secretan IFN-? estudian bien la capacidad de los ADN utilizados para inducir las respuestas inmunitarias específicas, dirigidas contra todos los antígenos estudiados (Figura 12) . Las respuestas de células T con el plásmido pA4SHIVKu2 son dos veces más elevadas que con el plásmido pCA-LTR-SHIVKu2-IN- . Esta pequeña diferencia de la eficacia entre los dos ADN podría estar vinculada a un mejor calidad el ADN de pA4SHIVKU2 que del PCA-LTRSHIVKU2- IN- . Estos resultados permiten no obstante conocer el nivel de base de las respuestas inmunitarias inducidas por estas vacunas en los ratones normales, y permiten hacer la comparación con las respuestas inmunitarias obtenidas en el ratón SCID-hu. 2.4.4. Evaluación de la respuesta celular en los ratones NOD/SCID-hu inmunizados con los diferentes ADNs Los ratones NOD SCID-hu han sido inmunizados mediante inyección intramuscular con una sola dosis de 50 de ADN de CA-LTR-SHIVKU2- IN, A4SHIVKU2 o SHIVKU2, luego los esplenocitos han sido utilizados para examinar la respuesta inmunitaria para ELISPOT para evaluar la proporción de células específicas del antígeno y que producen IFN-?. Como lo muestra la Figura 13, existe un número importante de células T que producen IFN-? humano en respuesta a una estimulación por los antígenos Gag, Env o Tat+Ref+Nef bajo la forma de péptidos del SIV o del HIV. Es interesante notar que las respuestas obtenidas después de la inmunización con el pCA-LTR-SHIVKU2-IN- son casi similares a aquellas obtenidas con el pSHIVKU2 y que las dos son muy netamente superiores a aquellas obtenidas después de la inmunización con el pA4SHIVKU2. La predominancia de las respuestas inducidas por el pCA-LTR-SHIVKU2 es contra los antígenos Gag y Tat+Rev+Nef.
El conjunto de estos resultados demuestra que el ADN pCA-LTR-SHIVKu2 es muy inmunogénico en los ratones NOD/SCID-hu y que induce preferentemente respuestas contra los antígenos conocidos por estar asociados a la protección contra los virus patógenos. 2.5. Exámenes fenotípicos y funcionales de las células T específicas del antígeno mediante citómetría de flujo 2.5.1. Monomarcación efectuada en el día cero (realizado el día de la recuperación de los bazos de conejos) Estas monomarcaciones sirven por una parte para examinar que los anticuerpos elegidos detecten bien los objetivos, y por otra parte para evaluar la presencia y la proporción de las células humanas en los bazos de ratones SCID-hu.
Los linfocitos no marcados de los ratones humanizados y no humanizados han sido analizados en citometría de flujo para medir la fluorescencia en el estado basal de las células (control negativo) .
La detección de las LT CD3+ es efectuada con el anticuerpo anti-CD3 humano acoplado al fluorocromo "Pacific Blue" . Estas células forman un pico 102 en el perfil de las células aisladas en los ratones SCID-hu vacunados con el plásmido pCA-LTR-SHICKU2-N- . Este pico no esta presente en las células recuperadas de los ratones SCID no hu.
Para las células mono-marcadas con el anticuerpo anti-CD4+ (PE anti-C4 humano) , ya sea que éste sea para el testigo o para nuestra muestra probada, no ha sido observado ningún pico significativo. Esto sería debido al anticuerpo anti-CD4 utilizado que sería no funcional.
Para la detección de las LT CD8+ , un anticuerpo monoclonal anti-CD8 humano acoplado al fluorocromo APC/Cy7 ha sido utilizado. Esto permite la puesta en evidencia de un pico situado entre 102 y 103 en el perfil de las células aisladas en los ratones SCID-hu vacunados con el pCA-LTR-SHIVKU2-IN- y no en los ratones SCID no hu.
La proporción de linfocitos que producen las moléculas de GRA no ha podido ser evaluada debido al hecho de que ninguna diferencia del pico ha sido observada sobre las células provenientes de los ratones inmunizados y no inmunizados marcados con el anticuerpo anti-GRA A acoplado a Alexa Flúor 647.
Por el contrario, las células marcadas con el anticuerpo Anti -IFN-?-humano acoplado al fluorocromo PE-Cy7 han mostrado un pico neto situado a 102 con las células de ratón SCID-hu vacunados con pCA-LTR-SHIVK02-IN que está ausente en las células de ratón SCID no hu no inmunizados. 2.5.2 Fenotipificación y funciones de las células T en los animales inmunizados Para examinar al fenotipo y las funciones de las células T específicas de los antígenos del virus, las células marcadas con CFSE son incubadas durante 5 días con los péptidos (Gag, Env y tat+Rev+Nef) , luego reestimuladas durante 6 horas con los mismos péptidos. Las células son enseguida marcadas con los anticuerpos y examinadas como se indicó anteriormente.
Los resultados de este análisis muestran la presencia de las células CD3+ y CD8+ que producen IFM-? y que poseen moléculas de GRA sobretodo con las células provenientes de ratones NOD/SCID-hu vacunados. En efecto, al menos 6 % de las LT CD8+ producen IFN-? y 1.7 % producen el GRA A en los ratones NOD/SCID-hu inmunizados, solamente contra 2.5 % y 0.6 % respectivamente en los ratones control. Estos resultados demuestran la presencia de las células CD3+ CD8+ activadas, productoras de GRA y de IFN-? que corresponden a una respuesta inmunitaria celular efectora, inducida por nuestra vacuna pCA-LTR-SHIV^-IN- . 2.6. Análisis de las respuestas inmunitarias y humorales en los macacos 2.6.1. Análisis de las respuestas inmunitarias de las células T por la prueba ELISPOT IFN-? Una fracción de las células mononucleadas aisladas a partir de las muestras de sangre recolectadas, ha sido utilizada para evaluar las proporciones de las células que secretan IFN-? en respuesta a la estimulación por los antígenos virales Gag, Pol. Env y Tat+Rev+Nef con la ayuda de un kit comercial. Los resultados de las 20 primeras semanas de análisis son presentadas en la tabla 3. Estos demuestran claramente que después de una sola administración del vector de vacuna CAL-SHIV- IN- , todos los animales han desarrollado respuestas inmunitarias celulares caracterizadas por células específicas de los antígenos, que secretan IFN-?. Estas respuestas son heterogéneas según los animales que poseen los haplotipos CMH-1 diferentes uno de los otros. Las respuestas simultáneas están caracterizadas por la presencia de un primer pico de respuesta primaria a las 2-4 semanas después de la inmunización (PI) , luego las respuestas más tardías a partir de las 8-10 semanas pl, y esto en ausencia de una segunda inmunización. Es muy interesante notar que la intensidad del segundo pico es frecuentemente mucho más importante que aquella del 1er pico, sobre todo para el animal BX80 donde el número de células que secretan IFN-? es multiplicado por 3.
Tabla 3 : Recapitulación de las proporciones de las células T secretoras de la citocina interferon gamma (IFN-?) en respuesta a la estimulación por los antígenos virales (Gag, Pol, Env y Tat+Rev+Nef) expresados por la vacuna en los monos vacunados. Las cifras corresponden a los números de células secretoras que forman un punto por millón (106) de células mononucleadas de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) . Las semanas de análisis son reportadas en la parte alta de la tabla. 5 15 2.6.2. Análisis de las respuestas inmuni tarias de las células T mediante citometría de flujo muí t iparamétrico en los monos vacunados Los resultados de los análisis mediante citometría de flujo muí t iparamétrica vienen a confirmar aquellos obtenidos por ELISPOT revelando que todos los animales han desarrollado una respuesta compuesta de células T que proliferan y que son específicas de todos los antígenos expresados por el vector de vacuna (Tabla 4) . Estas respuestas son heterogéneas entre los animales y revelan también una primera fase de respuesta primaria que se extiende hasta aproximadamente 8 semanas PI, seguida de una fase de contracción (2-4 semanas) luego una fase de reemergencia. Este seguimiento longitudinal de la respuesta inmunitaria por citometría de flujo mult iparamétrica , es proseguida hasta la prueba virulenta por el virus de prueba SIVmac251 que es realizada a la semana 52.
Tabla 4: Recapitulación de los valores de las células T CD4+ y CD8+ prol i ferat ivas en respuesta a las estimulaciones antigénicas al momento de las fases de expansión primaria, de contracción y finalmente de reemergencia o de expansión secundaria en los monos vacunados. Las semanas que corresponden a cada una de las fases son indicadas . Los números correspondientes a los porcentajes de células T específicas de cada uno de los antígenos que proliferan la respuesta a la estimulación con relación al número total de células T. 2.6.3. Análisis de la respuesta humoral en los macacos La detección de los anticuerpos anti-antígenos del SHIV ha sido realizada por un kit de ELISA comercial que permite detectar los anticuerpos anti-Env del VIH-1. El examen longitudinal de los sueros recolectados en cada punto de la recolección de sangre, ha mostrado la presencia de anticuerpos anti-Env a partir de la semana 20 PI en el animal BX80 y a partir de la semana 8 para el animal BX73. La presencia de anticuerpos en los sueros positivos ha sido conformada mediante transferencia de Western (Western blot) contra las proteínas el SHIV que muestran una fuerte señal contra la proteína Gag-p27, así como una señal contra las glucoproteinas gp 160/gpl20. 2.6.4 Conclusión Estos resultados demuestran claramente que una sola inyección del ADN de vacuna (CAL-SHIV-IN- ) permite inducir respuestas inmunitarias celulares T y humorales (anticuerpos) . Las respuestas celulares T están dirigidas contra todos los antígenos virales expresados por el vector de vacuna. Estas son persistentes y prosiguen un esquema clásico de expansión, contracción y memorización. La presencia de las células T de memoria del tipo central y efector de memoria, ha sido confirmada por la fenotipificaeion . 2.7. Construcción y análisis funcional de un nuevo vector que expresa el conjunto de los anticuerpos del VIH-1: el vector CAL-HI-IN- A partir del genoma del vector CAL-SHIVKU2-IN, los genes gagr, pol , vi, vx y vpr del SIV han sido suprimidos después de la doble digestión con las enzimas NarI y Sphl, y el gen nef del SIV ha sido suprimido después de la digestión parcial con la enzima NruI y la digestión total con la enzima Notl . El fragmento restante ha sido enseguida purificado. Este fragmento, que lleva los genes tat, rev y env del HIV enmarcados por las LTR de CAEV y transportados por el plásmido pET, ha sido utilizado para introducir el fragmento de 5kb que lleva los genes gag, pol, vif, vpr del VIH-1 y el 7 fragmento de 620 pb que lleva el gen nef del VIH-1, y para generar el vector CAL-HIV-IN (Figura 17) . El vector CAL-HI-IN- , suprimido de las secuencias codificantes de la integrasa, consiste de la secuencia SEQ ID No. : 18. 2.7. 1 Evaluación de la funcionalidad; Efecto del ADN plasmídico sobre las células El ADN de este vector ha sido introducido en las células GHST-CXCR4 y HEK293 T mediante transfección utilizando el gen y el protocolo publicado por el fabricante. Las células GH0ST-CXR4 transfectadas son luego hechas fluorescentes para atestiguar a la expresión de las proteínas virales del VIH-1 por el vector de vacuna y más particularmente la proteína Tat que transactiva la expresión del gen GFP (Proteína Fluorescente Verde) bajo el control de la LTR del HIV.
El sobrenadante de las células HEK-293T transfectadas por el vector de vacuna CAL-HIV-IN- ha sido utilizado para inocular las células T CD4+ indicadoras M8166 que han desarrollado efectos citopáticos característicos de la infección por el HIV. Estos resultados aportan la prueba de que las proteínas expresadas por el vector de vacuna son ensambladas en partículas virales que permiten la infección de las células indicadoras M8166. Estas células con los efectos citopáticos no han producido virus capaces de infectar nuevamente las células indicadoras M8166, e inducir los efectos citopáticos. Este resultado indica que el CAL-HIV-IN- está asociado a un ciclo único de replicación en ausencia de la integración.
Para evaluar las proteínas virales producidas después de la transfección, los sobrenadantes de las células HEK-293T transfectadas con el vector de vacuna, han sido recolectadas 24, 48 y 72 horas después de la transfección, luego examinadas para la presencia de los antígenos Gag p24 por ELISA. Las mediciones de las cantidades de esta proteína son reportadas en la Tabla 5. Estas demuestran una acumulación creciente de esta proteína que va desde 100 ng/ml a las 24 horas hasta 135 ng/ml a las 72 horas después de la transfección.
Tabla 5: Evaluación de la proteína Gag p24 del VIH-1, secretada en el sobrenadante de las células HEK 293T transfectadas por el vector de vacuna CAL-HIV-IN-. Cuantificación de la proteína p24 acumulada en el sobrenadante de las células HEK 293T después de 24, 48 72 horas después de la transfección con el ADN del vector CAL-HIV-IN-. 24 h 48 h 72 h Concentración de Gag p24 100 ng/ml 110 ng/ml 135 ng/ml 2.7.2. Inmunización de ratones BALC/C y caracterización de las respuestas inmunitarias inducidas Tres grupos de ratones BALB/c (6 por grupo) de 6 semanas han sido utilizados: 2 grupos han sido utilizados para una inmunización y el tercer grupo es un grupo control. Los 2 grupos de ratones inmunizados han sido inyectados con 100 µg/ratón de ADN del vector CAL-HIV-IN- por la vía intramuscular. Los animales de un grupo han sido sacrificados a las 2 semanas y del otro a las 3 semanas después de la inmunización (PI) . Los ratones control han sido sacrificados a las 2 semanas PI . Los bazos de cada uno de los ratones han sido recolectados, los esplenocitos han sido aislados y después utilizados ya sea para la prueba ELISPOT o bien para el análisis en citometría de flujo multiparamétrica como se describe anteriormente. Los resultados del análisis por ELISPOT son reportados en la Tabla 6. Estos demuestran la presencia de células específicas de todos los antígenos que segregan IF -?. La mayoría de estas células son específicas de los antígenos Gag y Tat+Rev+Nef . Las respuestas de las semanas 2 y 3 después de la inmunización son sensiblemente similares.
Tabla 6: Recapitulación de los resultados del análisis por ELISPOT sobre los esplenocitos de ratones BABL/c inmunizados con el vector de vacuna CAL-HIV-IN- a las 2 y 3 semanas después de la inmunización. Los esplenocitos aislados de los bazos de ratones inmunizados con 100 g por ratón vía intramuscular han sido examinados por la prueba ELISPOT de IFN-? para evaluar el número de células T que secretan esta citocina en respuesta a las estimulaciones con los combinados de péptidos (Gag, Env y Tat+Rev+Nef , TFN) . Las medias de los números de puntos para cada antígeno y para los 6 ratones examinados después de 2 y 3 semanas después de la inmunización, son reportadas. — Los resultados del análisis por citometría de flujo (Tabla 7) demuestran las respuestas inmunitarias en las células T CD4+ y CD8+ específicas de todos los antígenos expresados por el vector de vacuna CAL-HIV- IN- .
Tabla 7 : Recapitulación de los resultados de análisis por citometría de flujo multiparamétrica . Las cifras corresponden a los porcentajes de células T específicas de cada uno de los antígenos que proliferan en respuesta a la estimulación antigénica con relación al número total de células T.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un ácido nucleico, caracterizado porque comprende un genoma retroviral quimérico, en el cual el genoma retroviral quimérico comprende: las secuencias terminales repetidas (LTR) en 5' y 3' de un primer retrovirus, el primer retrovirus es el virus de la Artritis-Encefalitis Caprina (CAEV) , el virus Maedi Visna (VMV) , el virus de la anemia infecciosa de los équidos (EIAV) , un oncovirus o un espumavirus, y al menos un gen viral de un segundo retrovirus, el segundo retrovirus no es el primer retrovirus.
2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el genoma retroviral quimérico comprende al menos tres genes virales del segundo retrovi us .
3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el genoma retroviral quimérico comprende los genes gag, pol, vif, vpx. vpr, nef, tat , rev, vpu y env del segundo retrovirus.
4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el genoma retroviral quimérico comprende además al menos un gen viral de un tercer retrovirus, el tercer retrovirus es diferente del primero y el segundo retrovirus.
5. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, caracterizado porque al menos un gen del segundo retrovirus o del tercer retrovirus es elegido entre los genes gag, pol, vif, vpx, cpr, nef, tat, rev, vpu y env.
6. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, caracterizado porque el genoma retroviral quimérico comprende los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, del segundo retrovirus y los genes tat, rev, vpu y env del tercer retrovirus.
7. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el segundo retrovirus es elegido entre un oncovirus, un lentivirus o un espumavirus.
8. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 6, caracterizado porque el segundo y el tercer retrovirus son cada uno elegidos entre un oncovirus, un lentivirus o un espumavirus .
9. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 8, caracterizado porque el segundo y tercer retrovirus son cada uno un lentivirus.
10. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque el lentivirus se selecciona entre el virus de inmunodeficiencía humana de tipo I (VIH-1) , el VIH-2, el virus de inmunodeficiencia de simio (SIV) , el virus de inmunodeficiencia felina (FIV) o el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) .
11. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, y 4 a 10, caracterizado porque el genoma quimérico quimérico lentiviral comprende los genes gag, pol , vif, vpx, vpr del SIV y los genes nef, tat, rev, vpu y env de VIH-1.
12. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el genoma quimérico lentiviral comprende los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, re, vpu y env del VIH-1 los genes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu y env del VIH-2.
13. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el gen pol, cuando está presente, es un gen pol suprimido de las secuencias que codifican para la integrasa Un) .
14. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el genoma retroviral quimérico no integrativo comprende las secuencias SEQ ID No.: 1, SEQ ID No. : 2 O SEQ ID No . : 6.
15. Un vector recombinante , caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. La composición inmunogénica de vacuna, caracterizada porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o un vector de conformidad con la reivindicación 15.
17. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, el vector de conformidad con la reivindicación 15, o la composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 16, para su usarse en la prevención o el tratamiento de una infección por un retrovirus .
18. El ácido nucleico, el vector o la composición de vacuna para usarse de conformidad con la reivindicación 17, en la cual el retrovirus es un oncovirus, un lentivirus o un espumavirus.
19. El ácido nucleico, el vector o la composición de vacuna para usarse de conformidad con la reivindicación 17 o 18, en la cual el retrovirus es el VIH-1, el VIH-2 o el FIV.
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US20180179256A1 (en) * 2015-05-04 2018-06-28 Epivax, Inc. Modified H7 Hemagglutinin Glycoprotein of the Influenza A/Shanghai/2/2013 H7 Sequence
IT201600117326A1 (it) * 2015-11-24 2018-05-21 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Linee cellulari stabili per la produzione retrovirale.
TW202430633A (zh) * 2022-12-07 2024-08-01 科羅拉多大學董事會法人團體 新穎的ｈｉｖ－１變異體及其在動物激發模型中的使用方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
JPH09510361A (ja) 1994-03-24 1997-10-21 シンジェニックス・リミテッド パッケージング欠陥性レンチウイルス
US7488485B2 (en) * 2003-09-16 2009-02-10 University Of Kansas Medical Center DNA vaccine compositions and methods of use
US6602505B2 (en) * 1998-04-30 2003-08-05 University Of Southern California Viral chimeras comprised of CAEV and HIV-1 genetic elements
DE102005003207A1 (de) 2005-01-17 2006-07-27 Geneering Gmbh Lentivirales Gentransfersystem für Ribozym-vermittelte RNA-Reparatur

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