MX2014000914A - Novedoso anticuerpo anti-cxcr4 y su uso para la deteccion y diagnostico de canceres. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un novedoso anticuerpo anti-CXCR4 aislado para su uso en el diagnóstico del cáncer. En particular, el anticuerpo de la invención reconoce CXCR4 monomérico y homodimérico, pero no CXCR4 heterodimérico.

Description

NOVEDOSO ANTICUERPO ANTI-CXCR4 Y SU USO PARA LA DETECCIÓN Y DIAGNÓSTICO DE CÁNCERES La presente invención se refiere al campo de pronóstico y/o diagnóstico y/o supervisión de terapia de una enfermedad proliferativa en un paciente. En forma más particular, la invención se refiere a un anticuerpo capaz de ligar específicamente a CXCR4, así como las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo. La invención igualmente comprende el uso del anticuerpo, y procesos correspondientes, para detectar y diagnosticar desórdenes oncogénicos hiperproliferativos patológicos asociados con la expresión de CXCR4. En ciertas modalidades, los desórdenes son desórdenes oncogénicos asociados con la expresión incrementada de CXCR4 respecto a lo normal o cualquier otra patología conectada con la sobreexpresión de CXCR4. La invención finalmente comprende productos y/o composiciones o equipos que comprenden al menos este anticuerpo para el pronóstico o diagnóstico o supervisión de terapia de ciertos cánceres.

Las quimioquinas o quimioscinas son péptidos secretados pequeños que controlan la migración de leucocitos sobre un gradiente químico de ligando, conocido como gradiente de quimiocina, en especial durante reacciones inmunes (Zlotnick A. et al., 2000). Se dividen en dos subfamilias principales CC y CXC, con base en la posición de sus residuos cisterna NH2 terminales y el enlace a receptores acoplados a proteína G, de los cuales dos subfamilias principales se designan CCR y CXCR. Más de 50 quimiocinas humanas y 18 receptores de quimiocina se han descubierto hasta la fecha.

Muchos cánceres tienen una red de quimiocina compleja que influencia la infiltración de células inmunes de tumor, así como crecimiento de células de tumor, supervivencia, migración y angiogénesis . Células inmunes, células endoteliales y las células de tumor mismas expresan receptores de quimiocina y pueden responder a gradientes de quimiocina. Estudios de muestras de biopsia de cáncer humano y modelos de cáncer de ratón muestran que la expresión de receptor de quimiocina de célula de cáncer se asocia con incrementada capacidad metastásica. Células malignas de diferentes tipos de cáncer tienen diferentes perfiles de expresión de receptor de quimiocina, pero el receptor de quimiocina 4 (CXCR4) se encuentra más comúnmente. Células de al menos 23 diferentes tipos de cánceres humanos de origen epitelial, mesenquimal y hematopoyético expresan el receptor CXCR4 (Balkwill F. et al., 2004).

El receptor de quimiocina 4 (también conocido como fusina, CD184, LESTR o HUMSTR) existe como dos isoformas que comprenden 352 o 360 de aminoácidos. La isoforma a tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada bajo el número de acceso Genbank NP_001008540, mientras que la isoforma b tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada bajo el número de acceso Genbank NP_003458. El residuo Asnll está glicosilado, el residuo Tyr21 está modificado por la adición de un grupo sulfato y Cys 109 y 186 están ligados con un puente disulfuro en la parte extracelular del receptor (Juárez J. et al., 2004) .

Este receptor se expresa por diferentes tipos de tejidos normales, sin tratamiento previo, células T que no son de memoria, células T regulatorias , células B, neutrófilos, células endoteliales, monocitos primarios, células dendriticas, células Destructoras Naturales, células madre hematopoyéticas CD34+ y a un bajo nivel en el corazón, colon, hígado, ríñones y cerebro. CXCR4 juega un papel clave en tráfico de leucocitos, linfopoyesis de células B y mielopoyesis .

Receptor CXCR4 se sobreexpresa en una gran cantidad de cánceres incluyendo pero no limitados a linfoma, leucemia, mieloma múltiple, colon (Ottaiano A. et al., 2004), mama (Kato M. et al., 2003), próstata (Sun Y.X. et al., 2003), pulmones [carcinoma de células pequeñas y células no pequeñas (Phillips R.J. et al., 2003)], ovarios (Scotton C.J. et al., 2002), páncreas (Koshiba T. et al., 2000), ríñones, cerebro (Barbero S et al., 2002), glioblastoma y linfomas.

El ligando único del receptor CXCR4 descrito hasta la fecha es el Factor Derivado de células Estromales-1 (SDF-1) o CXCL12. SDF-1 es secretado en una gran cantidad en nodos linfáticos, médula ósea, hígado, pulmones y en una menor medida por los ríñones, cerebro y piel. CXCR4 también se reconoce por una quimiocina antagonista, la proteína inflamatoria de macrófago viral II (vMIP-II) codificada por el virus de herpes humano tipo III.

El eje CXCR4/SDF-1 juega un papel clave en cáncer y está implicado directamente en inmigración, invasión que llevaba metástasis. Sin duda, las células de cáncer expresan el receptor CXCR4, migran y entran a la circulación sistémica. Después, las células de cáncer son frenadas en lechos vasculares en órganos que producen altos niveles de SDF-1 en donde proliferan, inducen angiogénesis y forman tumores metastásicos (Murphy PM. , 2001). Este eje también está involucrado en proliferación celular mediante activación de la ruta Quinasa Regulada por Señal-Extracelular (ERK = Extracellular-signal-Regulated Kinase) (Barbero S. et al., 2003) y angiogénesis (Romagnani P., 2004). Sin duda, el receptor CXCR4 y su ligando SDF-1 claramente promueven angiogénesis por estímulo de expresión VEGF-A que a su vez aumenta la expresión de CXCR /SDF-1 (Bachelder R.E. et al., 2002). También se conoce que macrófagos asociados a tumor (TAM = Tumor Associated acrophages) se acumulan en áreas hipóxicas de tumores y se estimulan para cooperar con células de tumor y promover angiogénesis . Se observó que la hipoxia regula por incremento la expresión selectiva de CXCR4 en diversos tipos de células incluyendo TAM (Mantovani A. et al., 2004). Recientemente se ha demostrado que el eje CXCR4/SDF-1 regula el tráfico/retorno de células progenitoras/madre hematopoyéticas CXCR4+ (HSC) y puede jugar un papel en neovascularización . Evidencia indica que además de HSC, CXCR4 funcional también se expresa en células madre de otros tejidos (células madre comprometidas con tejido (TCSCs = Tissue-Committed Stem Cells) de manera tal que SDF-1 puede jugar un papel pivotal en quimioatracción de CXCR4+ TCSCs necesario para regeneración de órganos/tejidos, pero estos TCSC también pueden ser un origen celular de desarrollo de cáncer (teoría de células madre de cáncer) . Un origen de células madre de cáncer se demostró para leucemia humana y recientemente para varios tumores sólidos tales como cerebro y mama. Hay varios ejemplos de tumores CXCR4+ que pueden derivar de las células madre especificas de órgano/tejido CXCR4+ normales tales como leucemias, tumores del cerebro, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de mama, hepatoblastoma, cánceres de ovarios y cervicales (Kucia M. et al., 2005) .

Hacer blanco en metástasis de cáncer por interferencia con receptor CXCR4 se demostró in vivo utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor CXCR4 (Muller A. et al., 2001). Brevemente se mostró que un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor CXCR4 ( ab 173 R&D Systems) disminuyó significativamente el número de metástasis de nodos linfáticos en un modelo de cáncer de mama ortotópico (MDA-MB231) en ratones SCID. Otro estudio (Phillips R.J et al., 2003) también mostró el papel critico del eje SDF-1/CXCR4 en metástasis en un modelo de carcinoma pulmonar ortotópico (A549) utilizando anticuerpos policlonales contra SDF-1 pero en este estudio no hubo efecto ni en el crecimiento de tumor ni en angiogénesis . Varios otros estudios describen también la inhibición de cualquiera de metástasis in vivo utilizando dúplex siRNAs de CXCR4 (Liang Z. et al., 2005) antagonistas péptido CXCR4 bioestables (Tamamura H. et al., 2003) o crecimiento de tumor in vivo utilizando antagonista de molécula pequeña de CXCR4 como AMD 3100 (Rubin J.B. et al., 2003; De Falco V. et al., 2007) o Mab (patente WO2004/059285 A2). De esta manera, CXCR4 es un agente terapéutico validado para cánceres.

Receptor de quimiocina 2 (CXCR2), otro receptor de quimiocina también se describe como un blanco interesante en oncología. Sin duda, CXCR2 transmite una señal de crecimiento celular autócrina en varios tipos de células de tumor y puede también afectar el crecimiento de tumor indirectamente al promover angiogénesis (Tanaka T. et al. 2005) .

El receptor de quimiocina CXCR2 abarca 360 aminoácidos. Se expresa primordialmente en células endoteliales y en especial durante neovascularización . Varias quimiocinas ligan al receptor CXCR2 : CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-a, -ß y ? que pertenecen a las quimiocinas proangiogénicas ERL+. El receptor CXCR2 comparte homologías de secuencia con receptor CXCR4 : 37% de identidad de secuencia y 48% de homología de secuencia. El eje de CXCR2/ligandos está involucrado en varios mecanismos de crecimiento de tumor tales como metástasis (Singh RK. et al., 1994) proliferación celular (Owen J.D. et al., 1997) y en angiogénesis mediada por quimiocinas ERL+ (Strieter R.M. et al., 2004; Romagnani et al., 2004). Finalmente, macrófagos asociados con tumor y neutrófilos son élementos clave de crecimiento de tumor inducido por inflamación y quimiocinas tales como CXCL5, IL-8 y GRO-a inician reclutamiento de neutrófilos .

La dimerización ha surgido como un mecanismo universal para regular la función de receptores acoplados a proteína G, entre estos se encuentran receptores de quimiocina (Wang J. and Norcross M. , 2008). Homo- y heterodimerizacion en respuesta a enlace de quimiocina se ha mostrado que se requieren para el inicio y alteración de señalización por una cantidad de receptores de quimiocina. Creciente evidencia soporta el concepto que dímeros u oligómeros receptores probablemente son la unidad funcional básica de receptores de quimiocina. Dimeros de receptor de quimiocina se encuentran en la ausencia de ligandos y las quimiocinas inducen cambios de conformación de dimeros de receptor, CXCR4 se conoce que forma homodimeros pero también heterodimeros, por ejemplo con el receptor d-opioide (DOR) (Hereld D., 2008) o CCR2 (Percherancier Y. et al., 2005). En este último ejemplo, péptidos derivados de los dominios de transmembrana de CXCR4 inhiben activación al bloquear las transiciones de conformación inducidas por ligando del dimero (Percherancier Y. et al., 2005). Otro estudio mostró que CXCR4-TM4 péptido o un péptido sintético de la región de transmembrana de CXCR4, disminuye la transferencia de energía entre promotores de homodimeros CXCR4 e inhibe la migración inducida por SDF-1 y polimerización de actina en células malignas (Wang J. et al., 2006). Más recientemente, también se describió que CXCR7 formó heterodimeros funcionales con CXCR4 y mejoró la señalización inducida por SDF-1 (Sierro F. et al., 2007). Otros ejemplos de heterodimeros constitutivos incluyen estudios que muestran que CXCR1 y CXCR2 interactúan así como forman homodimeros respectivos. No se notaron interacciones de cualquiera de ellos con otro GPCR (alfa(lA)-adrenoreceptor) , indicando la especificidad de la interacción CXCR1 y CXCR2 (Wilson S. et al., 2005).

Como se mencionó previamente, los receptores CXCR4 y CXCR2 son interesantes blancos de tumor. La interferencia con estos receptores deberá inhibir el crecimiento de tumor y metástasis en una forma muy eficiente, al disminuir la proliferación de células de tumor, angiogénesis, migración e invasión de células de tumor, reclutamiento de neutrófilos y macrófagos por tumores y al inhibir células madre de cáncer CXCR4.

El solicitante ya ha descrito anticuerpos monoclonales , referidos como 515H7 y 414H5, que ligan e inducen cambios de conformación tanto de homodimeros CXCR /CXCR4 como heterodimeros CXCR4/CXCR2, y tienen fuertes actividades antitumor (ver WO 2010/037831) .

La presente invención se dirige a proporcionar cuando menos un reactivo que puede emplearse como una herramienta de diagnóstico o pronóstico para detectar y/o supervisar desórdenes oncogénicos, en especial aquellos caracterizados por la expresión CXCR4 o mediados por la expresión CXCR4 aberrante.

Específicamente, la invención proporciona un anticuerpo aislado novedoso capaz de ligar CXCR4 que puede utilizarse para propósitos de diagnóstico o pronóstico.

De manera sorprendente y en contraste con los anticuerpos de la técnica previa, el solicitante ha generado un anticuerpo presente capaz de ligar específicamente CXCR4, expresado como un monómero CXCR4 o como un homodímero CXCR4/CXCR4. Y por otra parte, el anticuerpo de la invención no liga significativamente a cualquiera de los heterodímeros CXCR4/X conocidos y en forma más particular no a, incluyendo el heterodímero CXCR4/CXCR2. Como se discutirá en la presente especificación a continuación, esta propiedad es de gran interés respecto al campo de diagnóstico.

Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de la descripción detallada y ejemplos que siguen .

En un primer aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos o derivados de enlace de antígeno, que liga a CXCR4 con alta afinidad, de preferencia CXCR4 humano, y de esta manera puede ser útil para diagnóstico de desórdenes oncogénicos hiperproliferativos patológicos mediados por expresión CXCR4.

Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción detallada y ejemplos que siguen.

De preferencia, la invención abarca los anticuerpos, sus compuestos derivados o sus fragmentos funcionales de acuerdo con la presente invención, que se obtienen por recombinación genética o síntesis química.

En una primera modalidad, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal.

Un "anticuerpo monoclonal" se entiende que significa un anticuerpo que surge de una población de anticuerpos casi homogénea. En forma más particular, los anticuerpo individuales de una población son idénticos excepto por unas pocas mutaciones de origen natural posibles, que pueden encontrarse en proporciones mínimas. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal consiste de un anticuerpo homogéneo que surge del crecimiento de un clon de una sola célula (por ejemplo hibridoma, una célula huésped eucariótica transfectada con una molécula de DNA que codifica el anticuerpo homogéneo, una célula huésped procariótica transfectada con una molécula de DNA que codifica el anticuerpo homogéneo, etc.) y en general se caracteriza por cadenas pesadas de una y sola una clase y subclase, y cadenas ligeras de solo un tipo. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un solo antígeno. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diversos anticuerpos dirigidos contra diversos determinantes o epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo epítopo del antígeno .

Un anticuerpo IgG típico está compuesto por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable. Cada región variable contiene tres segmentos denominados "región de determinación de complementariedad" ("CDRs Complementarity-Determining Regions") o "regiones hipervariables" , que son primordialmente responsables por ligar un epitopo de un antigeno. Usualmente se refieren como CDR1, CDR2, y CDR3, numerados secuencialmente desde el extremo N. Las porciones más altamente conservadas de las regiones variables se denominan las "regiones marco".

Existen tres CDRs de cadena pesada y 3 CDRs de cadena ligera. Los términos CDR o CDRs se emplean aqui a fin de indicar, de acuerdo con el caso, una o varias de estas regiones, o incluso todo de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos aminoácidos responsables por el enlace por la afinidad del anticuerpo para el antígeno o el epitopo que reconoce.

De acuerdo con la invención, las CDRs del anticuerpo serán definidas de acuerdo con el sistema de numeración IMGT. Será evidente para la persona con destreza en la especialidad el deducir CDRs de acuerdo con Kabat de las CDRs de acuerdo con IMGT. Las CDRs de acuerdo con Kabat deben considerarse como parte del alcance de la invención.

La numeración única IMGT se ha definido para comparar los dominios variables cualquiera que es el receptor de antígeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist , 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C, Ruiz, M. , Giudicelli, V., Foulquier, E . , Truong, L . , Thouvenin-Contet , V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeración única IMGT, los aminoácidos conservados siempre tienen la misma posición, por ejemplo cisteina 23 (lst-CYS), triptófano 41 (CONSERVED-TRP) , aminoácido hidrofóbico 89, cisteina 104 (2nd-CYS) , fenilalanina o triptófano 118 (J-PHE o J-TRP) . La numeración única IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones marco (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones de determinación de complementariedad: CDR1-I GT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT : 105 a 117. Ya que espacios representan posiciones no ocupadas, las longitudes CDR-IMGT (mostradas entre paréntesis cuadrado y separadas por puntos, por ejemplo [8.8.13]) se vuelven información crucial. La numeración única IMGT se emplea en representaciones gráficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics , 2, 21-30 (2007)], y en estructuras 3D en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucí. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

En una modalidad preferida, el anticuerpo de la invención o el fragmento de enlace de antigeno o su derivado, comprende al menos una región de determinación de complementariedad (CDR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo de secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs . 1 a 6, o al menos una CDR cuya secuencia tiene al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID NOs 1 a 6.

En una modalidad más preferida, el anticuerpo de la invención comprende i) una cadena pesada que comprende al menos uno de los siguientes CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, como se define de acuerdo con el sistema de numeración IMGT, en donde CDR-H1 comprende la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 comprende la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 que omprende la secuencia SEQ ID No. 3; y/o ii) una cadena ligera que comprende al menos una de las siguientes CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, como se define de acuerdo con el sistema de numeración IMGT, en donde CDR-L1 comprende la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 comprende la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 comprende la secuencia SEQ ID No. 6.

En una modalidad preferida adicional, el anticuerpo de la invención, o un fragmento de enlace de antigeno o su derivado, comprende una cadena pesada, la cadena pesada comprende las siguientes tres CDRs como se define de acuerdo con IMGT, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en donde CDR-H1 comprende la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 comprende la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 comprende la secuencia SEQ ID No. 3.

De acuerdo con otra modalidad preferida, el anticuerpo de la invención, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, comprende una cadena ligera, la cadena ligera comprende las siguientes tres CDRs como se define de acuerdo con IMGT, respectivamente CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3, en donde CDR-Ll comprende la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 comprende la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 comprende la secuencia SEQ ID No. 6.

En una modalidad preferida, el anticuerpo de la invención o su fragmento funcional o derivado, comprende una cadena pesada, la cadena pesada comprende las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, en donde: - CDR-H1 comprende la secuencia SEQ ID No. 1, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con una secuencia SEQ ID No. 1; - CDR-H2 comprende la secuencia SEQ ID No. 2, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 2; y - CDR-H3 comprende la secuencia SEQ ID No. 3, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con una secuencia SEQ ID No. 3.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo de la invención, o su fragmento funcional o derivado, comprende una cadena ligera, la cadena ligera comprende las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3, en donde: - CDR-Ll comprende la secuencia SEQ ID No. 4, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 4; - CDR-L2 comprende la secuencia SEQ ID No. 5, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 5; y - CDR-L3 comprende la secuencia SEQ ID No. 6, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 6.

Todavía en otra modalidad, el anticuerpo o su fragmento funcional o derivado comprende: - una cadena pesada, la cadena pesada comprende las siguientes tres CDRs como se define de acuerdo con IMGT, respectivamente CDR-H1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 3, o una secuencia que tiene cuando menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 o 3, respectivamente; y - una cadena ligera que comprende las siguientes tres CDRs como se define de acuerdo con IMGT, respectivamente CDR-L1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia SEQ ID No.6, o una secuencia que tiene al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 o 6, respectivamente .

En el sentido de la presente invención, el "por ciento de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos significa el por ciento de nucleótidos idénticos o residuos aminoácidos entre las dos secuencias a comparar, que se obtienen después de alineamiento óptimo, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen aleatoriamente sobre su longitud. La comparación de dos secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se lleva a cabo tradicionalmente al comparar las secuencias después de haberlas alineado en forma óptima, la comparación es capaz de realizarse por segmento o al utilizar una "ventana de alineamiento". Alineamiento óptimo de las secuencias para comparación puede llevarse a cabo además de comparación a mano, mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], mediante el algoritmo de homología local de Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson and Lipman (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444] o mediante soporte lógico de computadora utilizando estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y FASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, I, o por el soporte lógico o programa de comparación BLAST NR o BLAST P) .

El por ciento de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, se determina al comparar las dos secuencias alineadas en forma óptima en donde la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos a comparar pueden tener adiciones o deleciones comparadas con la secuencia de referencia para alineamiento óptimo entre las dos secuencias. Por ciento de identidad se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales el residuo aminoácido o nucleótido es idéntico entre las dos secuencias, dividir el número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de alineamiento y multiplicar el resultado por 100 para obtener por ciento de identidad entre las dos secuencias.

Por ejemplo, el programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede emplearse con los parámetros predefinidos (en forma notable por los parámetros "penalidad de espacio abierto": 5, y "penalidad de espacio de extensión": 2; la matriz selecta por ejemplo es la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa) ; el por ciento de identidad entre las dos secuencias para comparar se calcula directamente por el programa.

Para la secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, ejemplos preferidos incluyen aquellos que contienen la secuencia de referencia, ciertas modificaciones en forma notable una deleción, adición o sustitución de al menos un aminoácido truncado o extensión. En el caso de sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren sustituciones en donde los aminoácidos sustituidos se reemplazan por aminoácidos "equivalentes". Aquí, la expresión "aminoácidos equivalentes" se pretende que indique cualesquiera aminoácidos que probablemente sean sustituidos por uno de los aminoácidos estructurales sin que sin embargo se modifiquen las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y de los ejemplos específicos definidos a continuación.

Aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea en su homología estructural con los aminoácidos para los cuales se sustituyen o los resultados de pruebas comparativas de actividad biológica entre los diversos anticuerpos probablemente generados.

Como un ejemplo no limitante, la tabla 1 a continuación resume las sustituciones posibles que probablemente se llevan a cabo sin resultar en una modificación significante de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente; sustituciones inversas son naturalmente posibles bajo las mismas condiciones.

Tabla 1 Como se conoce por aquellos con destreza en la técnica, la mayor variabilidad (longitud y composición) entre las seis CDRs se encuentra en las tres CDRs de cadena pesada y más particularmente en CDR-H3 de esta cadena pesada.

En una modalidad especifica, la presente invención se refiere a un anticuerpo murino, o compuestos derivados o fragmentos funcionales de los mismos.

En otra modalidad, la invención describe un anticuerpo asi como fragmentos de enlace de antigeno y sus derivados, el anticuerpo comprende: una cadena pesada, la cadena pesada comprende las siguientes tres CDRs, con base en la definición "IMGT" de las CDRs : - CDR-H1 de la secuencia SEQ ID No. 1 o de una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 1; - CDR-H2 de la secuencia SEQ ID No. 2 o de una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 2; y - CDR-H3 de la secuencia SEQ ID No. 3 o de una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 3, y una cadena ligera, la cadena ligera comprende las siguientes tres CDRs: - CDR-L1 de la secuencia SEQ ID No. 4 o de una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 4; - CDR-L2 de la secuencia SEQ ID No. 5 o de una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 5; y - CDR-L3 de la secuencia SEQ ID No. 6 o de una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 6.

En una modalidad preferida, la invención se refiere a un anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, que comprende i) una cadena pesada que comprende las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR-Hl que tiene la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 3; y ii) una cadena ligera que comprende las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR-L1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 6.

En otra modalidad preferida de la invención, el anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, se elige de: a) un anticuerpo con una cadena pesada que comprende las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR-Hl que tiene la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 3; y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID No. 8; b) un anticuerpo con un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID No. 7; y una cadena ligera que comprende las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR-L1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 6; y c) un anticuerpo con un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID No. 7; y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID No. 8.

De acuerdo con todavía otra modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo 427aBl, o uno de sus fragmentos de enlace de antígeno o derivado, el anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 7 o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 7; y/o comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 8, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con la secuencia SEQ ID No. 8.

En una modalidad preferida adicional, la invención proporciona un anticuerpo 427aBl, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, el anticuerpo 427aBl comprende: a) una cadena pesada, la cadena pesada comprende: • las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR- Hl que tiene la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 3; y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID No. 8, y • un dominio variable de cadena pesada, el dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia SEQ ID No. 7; y b) una cadena ligera, la cadena ligera comprende: • las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR-L1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 6; y • un dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena ligera tiene la secuencia SEQ ID No. 8.

La invención también se refiere a cualquier compuesto derivado del anticuerpo como se describe en la invención .

Un "derivado de enlace de antigeno" o "derivado" de un anticuerpo significa en particular una proteina de enlace que está compuesta por un andamio péptido y al menos una de las CDRs del anticuerpo original a fin de preservar su capacidad para reconocimiento. Estos compuestos derivados son bien conocidos por una persona con destreza en la técnica .

En particular, el anticuerpo de la invención o su compuesto derivado o fragmento de enlace de antigeno, se caracteriza porque el compuesto derivado consiste de una proteina de enlace que comprende un andamio péptido en el que se injerta al menos una CDR, la CDR se injerta de manera tal que conserva todo o parte de las propiedades de reconocimiento de parátopo del anticuerpo inicial. En una modalidad preferida, la proteina de enlace de antigeno es una proteina de fusión de un andamio péptido y de la CDR como mínimo .

Una o más secuencias entre las seis secuencias CDR descritas en la presente invención también pueden estar presentes en los diversos andamios de proteína inmunoglobulina . En este caso, la secuencia de proteína hace posible recrear un esqueleto péptido adecuado para el plegado correcto de las CDRs injertadas, permitiéndoles conservar sus propiedades de reconocimiento de antígeno parátopo.

La persona con destreza en la técnica estará al tanto de medios para seleccionar el tipo de andamio de proteína para injertar CDR. En forma más particular, se conoce que para seleccionarse, estos andamios deben cumplir los más criterios posibles (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13:167-187) : buena conservación filogenética; conocida estructura tridimensional (como se determina por ejemplo por cristalografía, espectroscopia RMN o cualquier otra técnica conocida por una persona con destreza en la especialidad) ; tamaño pequeño; pocas o ningunas modificaciones post-transcripción; y/o fácil de producir, expresar y purificar.

Finalmente, como se describió con anterioridad, estos andamios péptidos comprenden una a seis CDRs que surgen del anticuerpo original. De preferencia, pero no a un requerimiento, una persona con destreza en la técnica seleccionará al menos una CDR de la cadena pesada, esta última se conoce que es primordialmente responsable por la especificidad del anticuerpo. La selección de una o más CDRs relevantes es obvia para una persona con destreza en la técnica, quien entonces seleccionará técnicas conocidas convenientes (Bes et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74).

La presente invención de esta manera se refiere a un anticuerpo, o su compuesto derivado o fragmento funcional, en donde el andamio péptido se elige entre proteínas que son a) filogenéticamente bien conservadas, b) de arquitectura robusta, c) con una organización molecular 3-D bien conocida, d) de tamaño pequeño y/o e) que comprende regiones que pueden ser modificadas por deleción y/o inserción sin modificar las propiedades de estabilidad.

De acuerdo con una modalidad preferida, el andamio de péptido se elige entre i) andamios que surgen de fibronectina, de preferencia fibronectina tipo 3 dominio 10, lipocalina, anticalina, proteína Z que surge de dominio B de proteína A de Staphylococcus aureus, tioredoxina A o proteínas con motivo repetido tal como la "repetición anquirina" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705) , la "repetición armadillo", la "repetición rica en leucina" y la "repetición tetratricopéptido" o iii) inhibidores de proteína de sintasa NO neuronal (PIN) .

Otro aspecto de la invención se refiere a los fragmentos funcionales del anticuerpo descrito anteriormente.

Más particularmente, la invención se dirige a un anticuerpo, o su compuesto derivado o fragmento funcional, en donde el fragmento funcional se elige entre los fragmentos Fv, Fab, (Fa ' )2f Fab' , scFv, scFv-Fc y diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media se ha incrementado tal como fragmentos PEGilados.

Por fragmentos de enlace de antígeno (o "fragmentos funcionales": para los propósitos de la solicitud, estos dos términos son sinónimos) del anticuerpo de acuerdo con la invención, aquí se refiere a, por ejemplo los fragmentos Fv, scFv (se = cadena sencilla), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media se ha incrementado por modificación química, tal como la adición de polialquilen glicol tal como polietilen glicol (PEGilación) (fragmentos PEGilados son referidos como Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG y Fab' -PEG) , o por incorporación en un liposoma, microesferas o PLGA. En particular, los fragmentos de acuerdo con la invención contienen al menos una de las CDRs características de la invención, tal que retienen la actividad y especificidad de enlace, incluso parcial del anticuerpo precursor.

De preferencia, los fragmentos de enlace de antígeno comprenden o incluyen una secuencia parcial de la cadena pesada o ligera variable del anticuerpo del cual se deriva, la secuencia parcial es suficiente para retener la misma especificidad de enlace que el anticuerpo del cual surge y suficiente afinidad. La afinidad del fragmento de preferencia al menos es igual a 1/100, más preferible al menos 1/10 del anticuerpo del cual surge.

Este fragmento de enlace de antígeno contiene cuando menos cinco aminoácidos, de preferencia 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 o 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo de la cual surge.

De acuerdo con la presente invención, fragmentos de enlace de antígeno pueden obtenerse de los anticuerpos de la invención por métodos tales como digestión de enzima, incluyendo pepsina o papaína y/o disociación de los puentes disulfuro por reducción química. Los fragmentos de anticuerpo también pueden obtenerse por técnicas genéticas recombinantes o por síntesis de péptido.

Por razones de claridad, la tabla 2 a continuación resumen las diversas secuencias de aminoácidos correspondientes al anticuerpo 427aBl de la invención.

Tabla 2 (en donde Mu. - murino) De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere a un hibridoma murino capaz de secretar un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención. De preferencia, el hibridoma es el hibridoma depositada en CNCM, Institut Pasteur, Paris, Francia, en junio 25, 2008, bajo la referencia 1-4018. El hibridoma se obtuvo por fusión de esplenocitos de ratón inmunizados Balb/C con células de las lineas Sp 2/O-Ag 14 de mieloma.

De acuerdo con otra modalidad preferida de la invención, el anticuerpo monoclonal, aquí referido como 427aBl, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, es secretado por el hibridoma.

Un aspecto novedoso de la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se elige de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, DNA o RNA, que codifica un anticuerpo o su compuesto derivado o fragmento funcional, de acuerdo con la invención; b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de DNA que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias SEQ ID No. 9 a 14, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID No. 9 a 14; c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de DNA que comprende las secuencias SEQ ID No. 15 o 16, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID No. 15 o 16; d) RNA traducido de los ácidos nucleicos como se define en a) , b) o c) ; e) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos como se define en a) , b) y c) ; y f) un ácido nucleico de al menos 18 nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alta severidad con las secuencias SEQ ID No. 15 o 16 o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID 15 o 16, o su secuencia complementaria.

La Tabla 3 a continuación resume las diversas secuencias de nucleótidos referentes al anticuerpo 427aBl de la invención.

Tabla 3 (en donde Mu. = murino) Los términos "ácido nucleico", "secuencia nucleica", "secuencia de ácido nucleico", "polinucleótido", "oligonucleótido", "secuencia de polinucleotidos" y "secuencia de nucleótidos", se emplean en forma intercambiable en la presente descripción, significan una secuencia precisa de nucleótidos, modificado o no, que define un fragmento o una región de un ácido nucleico, que contiene nucleótidos no naturales o no, y que ya es un DNA de doble hebra, un DNA de una hebra sencilla o productos de transcripción de los DNAs.

"Secuencias nucleicas que exhiben un por ciento de identidad de al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98%, después de alineamiento óptimo con una secuencia preferida" significan secuencias nucleicas que exhiben con respecto a la secuencia nucleica de referencia, ciertas modificaciones tal como en particular, una deleción, un truncado, una extensión, una fusión quimérica y/o una substitución, notablemente puntual. De preferencia, estas son secuencias que codifican las mismas secuencias de amino ácidos que la secuencia de referencia, esto relacionada a la degeneración del código genético, o secuencias de complementariedad que probablemente hibridizan específicamente con secuencias de referencia, de preferencia bajo condiciones de alta severidad, notablemente aquellas definidas a continuación.

Hibridización bajo condiciones de alta severidad significa aquellas condiciones relacionadas a temperatura y concentración iónica que se eligen de manera tal que permitan hibridización se mantenga entre dos fragmentos DNA complementarios. En una base puramente ilustrativa, las condiciones altamente severas de la etapa de hibridización con el propósito de definir los fragmentos polinucleótidos descritos anteriormente son ventajosamente como sigue.

Hibridización DNA-DNA o DNA-RNA se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridización a 42 grados C por tres horas en amortiguador fosfato (20 mM, pH 7.5) que contiene 5X SSC (IX SSC corresponde a una solución de 0.15 M NaCl + 0.015 M citrato de sodio) , 50% formamida, 7% dodecil sulfato de sodio (SDS), Denhardt 10X, dextran sulfato al 5% y ADN de esperma de salmón al 1%; (2) hibridización primaria por 20 horas a una temperatura que depende de la longitud de la sonda (es decir: 42 grados C por una sonda de >100 nucleótidos de longitud) seguido por dos lavados de 20-minutos a 20 grados C en 2X SSC + 2% SDS, un lavado de 20-minutos a 20 grados C en 0.1X SSC + 0.1% SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0.1X SSC + 0.1% SDS por 30 minutos a 60 grados C por una sonda >100 de nucleótidos de longitud. Las condiciones de hibridización altamente severas descritas anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido pueden adaptarse por una persona con destreza en la técnica para más largos o más cortos oligonucleótidos, de acuerdo con los procedimientos descritos en Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001) .

La invención también se refiere a un vector que comprende el polinucleótido de la invención.

Específicamente, la invención proporciona vectores de clonación y/o expresión que transportan dicha secuencia de nucleótidos .

Los vectores de la invención de preferencia contienen elementos que permiten la expresión de secuencias nucleótido en una célula hospedera determinada. A fin de expresar los anticuerpos de la invención, los polinucleótidos que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos se insertan en vectores de expresión tal que los genes se ligan operativamente con secuencias de transcripción y traducción. Secuencias "ligadas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. La expresión "secuencia de control de expresión" como se emplea aquí, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarios para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales se ligan. Secuencias de control de expresión incluyen secuencias de inicio, de terminación, promotora y mejoradora de transcripción apropiadas; señales de procesamiento de RNA eficientes tales como señales de corte y poliadenilación; secuencias que estabilizan mRNA citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de traducción (es decir, secuencia consenso Kozak) ; secuencias que mejoran la estabilidad de proteína; y cuando se desea, secuencias que mejoran la secreción de proteína. La naturaleza de estas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, estas secuencias de control en general incluyen promotor, sitio de enlace ribosomal, y secuencia de terminación de transcripción; en eucariotas en general, estas secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de transcripción. La expresión "secuencia de control" se pretende que incluya como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para expresión y procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo secuencias líder y secuencias de socio de fusión.

El término "vector", como se emplea aquí, se pretende que se refiera a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de DNA de doble hebra circular en el cual se pueden ligar segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de DNA adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) pueden ser integrados en el genoma de una célula huésped ante introducción en la célula huésped, y de esta manea replican junto con el genoma huésped.

Los vectores de acuerdo con la invención también pueden contener una secuencia que permite el mantenimiento estable de los vectores en la célula huésped. Se entenderá fácilmente que estas secuencias, designadas orígenes de replicación, varían de acuerdo con el tipo de células huésped. Estos diversos elementos pueden seleccionarse y optimizarse por una persona con destreza en la técnica de acuerdo con la célula huésped empleada. Para este propósito, las secuencias de nucleótido pueden ser insertadas en vectores auto-replicantes dentro del huésped selecto o vectores integrantes del huésped selecto.

Estos vectores se preparan por métodos típicamente empleados por una persona con destreza en la técnica y los clones resultantes pueden introducirse en un huésped conveniente por métodos estándar tal como métodos de lipofección, electroporación, choque térmico o químicos.

La invención también se dirige a células huésped transformadas por o que comprenden un vector como se describe en la presente invención.

La célula huésped puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos tales como células bacterianas, por ejemplo pero también células de levadura o células de animales, notablemente células de mamíferos. También pueden emplearse células de insectos o plantas.

La invención también se refiere a animales diferentes al humano, o plantas que contienen una célula transformada de acuerdo con la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo de acuerdo con la invención, un fragmento de enlace de antígeno o derivado, caracterizado por que el método comprende las etapas de a) desarrollar una célula huésped de acuerdo con la invención en un medio apropiado bajo condiciones apropiadas; y b) recuperar el anticuerpo, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado.

El anticuerpo expresado resultante puede entonces ser purificado por el medio de cultivo o extractos celulares. Formas solubles del anticuerpo de la invención pueden recuperarse del sobrenadante de cultivo. Pueden ser entonces purificadas por cualquier método conocido en la técnica para purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo por cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, afinidad, particularmente por afinidad de Proteína A para Fe, y así en adelante), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Métodos convenientes de purificación serán aparentes para una persona con destreza ordinaria en la especialidad .

Los polipéptidos de la invención también pueden prepararse por síntesis química. Estos métodos de preparación también están dentro del alcance de la invención. Varios métodos para síntesis química, tales como técnicas deen fase sólida (ver en forma notable Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.) o técnicas de fase sólida parcial, por condensación de fragmentos o por síntesis convencional en solución, se conocen por la persona con destreza ordinaria en la especialidad. Polipéptidos obtenidos por síntesis química y contienen aminoácidos no naturales correspondientes también están abarcados en la invención. Los anticuerpos o sus fragmentos de enlace de antígeno o derivados, obtenidos por el método de la invención también están comprendidos o abarcados dentro de la presente invención.

Como se mencionó anteriormente, el anticuerpo de la invención, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, es capaz de ligar a CXCR4 como monómero y/o homodímero.

De manera sorprendente, el solicitante también ha demostrado que el anticuerpo, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, no liga significativamente a CXCR4 como heterodímero . De preferencia, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno o derivado no liga a un heterodimero CXCR4 /CXCR2.

Anticuerpos de la técnica previa, tales como 515H7, se conoce que ya son capaces de ligar a CXCR4 como un monómero, homodímero o heterodimero (W0 2010/037831) . En contraste, el anticuerpo de la invención muestra fuerte especificidad respecto a las isoformas CXCR4 , ya que es capaz de discriminar entre homo- y heterodímeros . Esta propiedad hace al anticuerpo de la invención una herramienta preferida para criba diferencial y por ejemplo para caracterizar un tumor .

Por "CXCR4 como monómero y/u homodímero", o "CXCR4 monomérico/homodimérico" (para los propósitos de esta solicitud, estos dos términos son sinónimos y se pretende que se utilicen en forma intercambiable) , aquí se refiere como CXCR4 en forma monomérica, es decir no acoplado en ninguna interacción física con ningún socio de proteína, y/o en forma homodimérica, es decir acoplado en un complejo con otra molécula de CXCR4. La expresión "CXCR4 como un monómero y/o un homodímero", o "CXCR4 monomérico/homodimérico", se entiende que excluya específicamente heterodímeros CXCR4 , es decir dímeros de CXCR4 con cualquier otro socio de proteína, excepto el CXCR4 mismo. En particular, la expresión "CXCR4 como un monómero ylo un homodímero", o "CXCR4 monomérico/homodimérico", específicamente excluye heterodimeros CXCR /CXCR2.

La invención de esta manera se refiere al anticuerpo descrito anteriormente, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, para utilizar en diagnóstico y/o pronóstico in vi tro o ex vivo de un desorden oncogénico asociado con expresión de CXCR4.

La invención de esta manera se refiere a un método de diagnóstico y/o pronóstico in vitro o ex vivo de un desorden oncogénico asociado con expresión de CXCR4, que comprende la etapa de probar el enlace de un anticuerpo de la invención, o su fragmento o derivado con CXCR .

En una modalidad preferida, el desorden oncogénico consiste de un desorden oncogénico asociado con la expresión de monómero y/u homodimero CXCR4.

"Diagnóstico" de una enfermedad como se emplea aquí, se refiere al proceso de identificar o detectar la presencia de un desorden oncogénico hiperproliferativo patológico asociado con o mediado por expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico, monitorear el progreso de la enfermedad, e identificar o detectar células o muestras que son indicativas de un desorden asociado con la expresión de monómero y/u homodimero.

"Pronóstico" como se emplea, significa la probabilidad de recuperación de una enfermedad o la predicción del desarrollo o resultado probable de una enfermedad. Por ejemplo, si una muestra de un sujeto es negativa para tinción con el anticuerpo de la invención, entonces el "pronóstico" para este sujeto es mejor que si la muestra es positiva para tinción de CXCR4 monomérico/homodimérico. Muestras pueden ser calificadas para niveles de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en una escala apropiada como será más detallado a continuación.

El enlace del anticuerpo de la invención o su fragmento o derivado, a CXCR4, incluyendo los monómeros CXCR4, los homodímeros CXCR4 /CXCR4 y heterodimeros CXCR4/CXCR2, puede probarse en una cantidad de formas conocidas por la persona con destreza en la técnica. Un método semejante, es decir un ensayo BRET, se detalla descrito en WO 2010/037831. El anticuerpo 515H7 puede emplearse convenientemente como un control positivo para el ensayo de enlace.

El anticuerpo de la invención o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, puede ser un anticuerpo murino . Sin embargo, una versión quimérica o humanizada de este anticuerpo también deberá considerarse como parte del alcance de la presente invención, ya que estos anticuerpos comprenderán las CDRs del anticuerpo aqui descrito.

De manera importante, el anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado de la invención, no bloquea enlace de 515H7 con CXCR4. De esta manera es posible utilizar el anticuerpo de la invención durante un tratamiento con el anticuerpo 515H7 sin interferencia con tratamiento, ya que estos dos anticuerpos no compiten por CXCR4. El anticuerpo de la invención de esta manera es una herramienta critica para supervisión o monitoreo, por ejemplo para formación de imagen in vivo del tumor, la eficacia de una terapia con base en el anticuerpo 515H7.

En una modalidad más preferida de la invención, el anticuerpo o fragmento del antigeno o derivado, no tiene ninguna actividad anti-tumoral in vivo.

Esta propiedad es de mayor interés en la aplicación de diagnóstico ya que permite el uso de un anticuerpo para cribar pacientes, o después del progreso de un tratamiento utilizando un agente que no tendrá ningún impacto o consecuencia en el paciente. Esta propiedad hace el anticuerpo 427aBl una herramienta preferida para cribar a pacientes a tratar ya que no tendrá impacto para el paciente. Como se reconocerá por la persona con destreza en la técnica, el solicitante ha proporcionado un anticuerpo realmente novedoso e inventivo al generar un anticuerpo capaz de reconocer CXCR4, tanto como monómero como homodimero, sin actividad anti-tumoral in vivo.

El anticuerpo puede estar presente en la forma de un inmunoconj ugado o de anticuerpo etiquetado para obtener una señal detectable y/o cuantificable . Cuando se utiliza con etiquetas convenientes u otras biomoléculas o productos químicos detectables apropiados, el anticuerpo de la invención es particularmente útil para aplicaciones de diagnóstico, pronóstico in vitro e in vivo.

Etiquetas para utilizar en inmunoensayos, en general se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Estas etiquetas incluyen, ínter alia, enzimas, radioisótopos y substancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas, incluyendo partículas de color tales como perlas de látex u oro coloidal. Diversos tipos de etiquetas y métodos para conjugar las etiquetas a los anticuerpos de la invención son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica, tales como aquellos establecidos a continuación.

Como se emplea aquí, la expresión "un desorden oncogénico asociado con expresión de CXCR4 como monómero y/u homodímero" se pretende que se refiera a enfermedades y otros desórdenes en donde la presencia de altos niveles de CXCR4 monomérico/homodimérico (aberrante) en un sujeto que sufre del desorden se ha mostrado que es, o se sospecha que es, ya responsable de la patofisiología del desorden o un factor que contribuye al empeoramiento del desorden. Estos desórdenes pueden ser evidenciados por ejemplo por un aumento en los niveles de CXCR4, de preferencia CXCR4 como monómeros y/u homodímeros en la superficie celular en las células o tejidos afectados de un sujeto que sufre del desorden. El aumento en niveles de CXCR4 monoméricos y/u homodiméricos, puede detectarse por ejemplo utilizando el anticuerpo 427aBl de la invención .

En ciertas modalidades, "expresión incrementada" referente a CXCR4 como monómero y/u homodímero se refiere a niveles de expresión de genes o proteínas que demuestran un aumento significante estadístico en expresión (como se mide por la expresión de RNA o expresión de proteína) respecto a un control.

En otra modalidad, la invención se refiere a un método para detectar la presencia de un tumor que expresa CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto, el método comprende las etapas de: a) administrar el anticuerpo de la invención, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, al sujeto; y b) detectar el enlace de anticuerpo, en donde el enlace indica la presencia del tumor.

Un aspecto preferido de la invención es un método para detectar presencia ex vivo de un tumor que expresa CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto, en donde el proceso comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un anticuerpo de la invención o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, y (b) detectar el enlace del anticuerpo con la muestra biológica.

El enlace del anticuerpo de la invención puede ser detectado por diversos ensayos disponibles a la persona con destreza en la especialidad. Aunque cualesquiera medios convenientes para llevar a cabo los ensayos se incluyen dentro de la invención, puede mencionarse en particular FACS, ELISA, transferencia western y IHC.

En otra modalidad, la invención se refiere a un método para detectar la ubicación de un tumor que expresa CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto, que comprende las etapas de: a) administrar el anticuerpo de acuerdo con la invención o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, al sujeto; y b) detectar enlace del anticuerpo, en donde el enlace indica la presencia del tumor.

En cuanto a la detección de la presencia de un tumor de expresión, muchas técnicas conocidas por la persona con destreza en la técnica pueden emplearse. Sin embargo, medios preferidos son IHC o FACS.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para determinar el porcentaje in vitro o ex vivo de células que expresan CXCR4 como monómero y/u homodímero en un tumor de un sujeto, el método comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un anticuerpo de acuerdo con la invención o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, y (b) cuantificar el por ciento de células que expresan CXCR4 como monómero y/u homodimero en la muestra biológica .

Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un método para determinar el nivel de expresión in vitro o ex vivo de CXCR4 monomérico/homodimérico en un tumor de un sujeto, el método comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un anticuerpo de acuerdo con la invención o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, y (b) cuantificar el nivel de enlace del anticuerpo, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, con CXCR4 monomérico/homodimérico en la muestra biológica.

El nivel de enlace del anticuerpo al nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico puede medirse por inmunohistoquímica (IHC) o FACS, de preferencia por IHC.

Una vez que se realiza una determinación de la cantidad de CXCR4 como un monómero y/u homodimero presente en la muestra de prueba, los resultados pueden compararse con aquellos de muestras de control, que se obtienen en una forma similar a las muestras de prueba pero de individuos que no tienen un desorden oncogénico hiperproliferativo asociado con la expresión de CXCR4 como monómero y/u homodimero. Si el nivel de CXCR4 monomérico/homodimérico se eleva significativamente en la muestra de prueba, puede concluirse que hay una probabilidad incrementada del sujeto del cual se deriva o que desarrolle el desorden.

Con respecto al desarrollo de terapia antitumor dirigida, el diagnóstico con técnicas inmunohistológicas da información in situ del nivel de expresión de receptor y de esta manera permite seleccionar pacientes susceptibles a tratar siguiendo el nivel de expresión de receptores requeridos para este tratamiento.

Determinación de la etapa, tiene valor de pronóstico potencial y proporciona criterios para diseñar terapias óptimas. Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000) . Por ejemplo, la selección de tratamiento para tumores sólidos se basa en etapas de tumor, que usualmente se realiza utilizando la prueba de Tumor/Nodo/Metastasis (TN ) del Comité Conjunto Americano en Cáncer (AJCC = American Joint Committee on Cáncer) . Se reconoce en forma común que, mientras que esta prueba y sistema de separación en etapas proporciona cierta información valiosa referente a la etapa en la cual cáncer sólido se ha diagnosticado en el paciente, son imprecisos e insuficientes. En particular, falla el identificar las etapas tempranas de progreso de tumor.

La invención de esta manera se refiere a un método para determinar la calificación in vitro o ex vivo de un tumor de un sujeto, el método comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un anticuerpo de la invención o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, (b) cuantificar el nivel de enlace del anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, a CXCR4 monomérico/homodimérico en la muestra biológica; y (c) calificar el tumor al comparar el nivel cuantificado de enlace del anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, del sujeto a una escala apropiada .

En una modalidad preferida, el anticuerpo para diagnóstico es capaz de ligar al receptor dirigido cuando muestras de tejido se fijan en formalina, fijan en formol substituido, tal como fijan en Glico-fixx, incrustan en parafina y/o congelan.

De preferencia, el nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico se mide por inmunohistoquimica (IHC) o FACS, más preferiblemente por IHC.

Cualquier método de análisis de riesgos convencional puede emplearse para estimar el valor de pronóstico de CXCR4 como monómero y/u homodímero. Métodos de análisis representativos incluyen análisis de regresión Cox, que es un método semiparamétrico para modelar datos de tiempo-a-evento o supervivencia en la presencia de casos de censo (Hosmer and Lemeshow, 1999; Cox, 1972) . En contraste con otros análisis de supervivencia, por ejemplo Tablas Actuariales o de mortalidad o Kaplan-Meyer, Cox permite la inclusión de variables de pronóstico (variables) en los modelos. Utilizando método de análisis convencional, por ejemplo Cox, se puede probar hipótesis respecto a la correlación de estado de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en un tumor primario a tiempo-a-inicio de cualquier relapso de la enfermedad (tiempo de supervivencia libre de enfermedad o tiempo a enfermedad metastásica) , o tiempo a muerte por la enfermedad (tiempo de supervivencia total) . El análisis de regresión de Cox también se conoce como el análisis de riesgo proporcional Cox. Este método es estándar para prueba del valor pronóstico de un marcador de tumor en el tiempo de supervivencia de paciente. Cuando se utiliza en modo multivariado, el efecto de varias co-variables se prueba en paralelo de manera tal que co-variables individuales que tienen un valor de pronóstico independiente puedan ser identificadas, es decir los marcadores más útiles. El término "estado de CXCR4 monomérico/homodimérico" negativo o positivo también se refiere aquí como [CXCR4 (-) monomérico/homodimérico] o [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] .

Una muestra puede ser "calificada" durante el diagnóstico o monitoreo de cáncer. En su forma más simple, la calificación puede ser categórica negativa o positiva como se juzga por examen visual de muestras por inmunohistoquimica . Una calificación más cuantitativa involucra juicio de la intensidad de dos parámetros de tinción y la proporción de células teñidas ("positivas") que se muestrean.

"Estado CXCR4 monomérico/homodimérico" aqui se refiere a la clasificación de tumor como positivo para CXCR4 como un monómero y/u homodímero [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] o CXCR4 negativo como un monómero y/u homodímero [CXCR4 (-) monomérico/homodimérico] , con base en la determinación del nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico. La expresión de CXCR4 puede ser detectada y medida por cualquier método conveniente disponible a la persona con destreza en la técnica, tal como inmunohistoquimica (IHC) o FACS.

En una modalidad de la invención, para asegurar estandarización, pueden calificarse muestras para niveles de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en diferentes escalas, la mayoría de ellas se basa en la evaluación de la intensidad del producto de reacción y el por ciento de células positivas (Payne et al., Predictive markers in breast cáncer - the present, Histopathology 2008, 52, 82-90) .

En una modalidad más preferida, la calificación comprende utilizar una escala apropiada con base en dos parámetros que son la densidad de la tinción y el porcentaje de células positivas.

Como un primer ejemplo, con base en la enseñanza de la calificación Quick Allred para evaluación IHC de receptor de estrógeno y receptor de progesterona, pueden calificarse muestras para niveles de expresión CXCR monomérico/homodimérico en una escala global de 0 a 8 combinando calificaciones para intensidad de reactividad y para la proporción de células teñidas (Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol. 1999; 17; 1474-1481) . En forma más particular, el primer criterio de intensidad de reactividad se califica en una escala de 0 a 3, 0 corresponde a "Sin reactividad" y 3 corresponde a "Fuerte reactividad". El segundo criterio de proporción reactiva se califica en una escala de 0 a 5, 0 corresponde a "Sin reactividad" y 5 a "67-100% en proporción reactiva". La intensidad de la calificación reactiva y la calificación de proporción reactiva después se suman para producir una calificación total de 0 a 8.

Una calificación total de 0-2 se considera como negativa mientras que una calificación total de 3-8 se considera como positiva.

De acuerdo con esta escala, los términos negativo o positivo "estado CXCR4 monomérico/homodimérico" de tumores utilizados en la presente descripción se refieren a niveles de expresión de CXCR4 como un monómero y/u homodímero que corresponde a calificaciones 0-2 o 3-8 en la escala Allred, respectivamente .

La Tabla 4 a continuación, ilustra las guias para interpretar resultados IHC de acuerdo el método Allred.

Tabla 4 En una modalidad preferida, el proceso de acuerdo con la invención se refiere a una escala apropiada que es una escala de 0 a 8 en donde sin reactividad se califica 0 y una fuerte reactividad en una proporción de 67-100% de reactividad se califica 8.

En otra modalidad, se proporciona un método para determinar el estado in vitro o ex vivo de un tumor de un sujeto, el método comprende las etapas de: (a) calificar un tumor de un sujeto de acuerdo con la escala Allred; y (b) determinar que el estado del tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 3 a 8 ; o (c) determinar que el estado del tumor es [CXCR4 (-) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 0 a 2.

En un aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 3.

En un aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 4.

En un aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 5.

En un aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 6.

En un aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 7.

En un aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 8.

En otro aspecto particular, un tumor es [CXCR4 (+ ) monomérico/homodimérico] con una calificación Allred de 3 a 8.

Como un segundo ejemplo, con base en la enseñanza de la calificación convencional para evaluación de IHC de receptor HER-2, por ejemplo, las muestras pueden calificarse para niveles de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en un método de calificación algo más simple, el método de calificación integra la intensidad de tinción (de preferencia tinción membranosa) y la proporción de células que exhiben tinción en una escala combinada de 0 a 3+.

En esta escala, referida como la escala simplificada, 0 y 1+ son negativos mientras que 2+ y 3+ representan tinción positiva. Sin embargo, calificaciones 1+ -3+ pueden recodificarse como positivas debido a que cada calificación positiva puede estar asociada con un riesgo significativamente superior de relapso y enfermedad fatal cuando se compara con la calificación 0 (negativa) , pero incrementar la intensidad entre las calificaciones positivas puede proporcionar una reducción de riesgo adicional.

Hablando en general, los términos "estado CXCR4 monomérico/homodimérico" negativo o positivo de tumores empleados en la presente descripción se refieren a niveles de expresión de CXCR4 como monómero y/u homodimero que corresponden a calificaciones 0-1+ o 2H—3+ en la escala simplificada, respectivamente. Sólo reactividad membranosa circunferencial completa del tumor invasivo habrá de considerarse y a menudo semejarse a una apariencia de "alambre de gallinero". Bajo guias actuales, muestras calificadas como limítrofes (calificación de 2+ o 3+) para CXCR4 como monómero y/u homodimero se requiere que se sometan a mayor evaluación. El análisis IHC deberá ser rechazado, y ya sea repetido o probado por FISH o cualquier otro método si, como un ejemplo no limitante, no se esperan controles, artefactos involucran la mayoría de la muestra y la muestra tiene una fuerte positividad membranosa de ductos de mama normal (controles internos) sugiriendo excesiva recuperación de antígeno.

Para más claridad, la Tabla 5 a continuación resume estos parámetros.

Tabla 5 En una modalidad preferida, el proceso de acuerdo con la invención se refiere a una escala apropiada, que es una escala de 0 a 3+ en donde no se califica reactividad membranosa 0 y fuerte reactividad completa en más de 10% de las células de tumor se califica como 3+.

Con más detalles, como se describe anteriormente, la escala apropiada es una escala de 0 a 3 en donde no se califica con 0 la reactividad membranosa de células de tumor; reactividad membranosa débilmente perceptible en más de 10% de las células de tumor se califica 1+; reactividad membranosa débil a moderada completa en más de 10% de las células de tumor se califica 2+, y fuerte reactividad completa en más de 10% de células de tumor se califica 3+.

Por lo tanto, otra modalidad de la invención proporciona un proceso para determinar in vitro o ex vivo el estado de un tumor de un sujeto, el método comprende las etapas de: (a) calificar un tumor de un sujeto de acuerdo con la escala simplificada como se describió anteriormente, y (b) determinar que el estado del tumor es [CXCR4 ( + ) monomérico/homodimérico] con la calificación de 2+ o 3+, o (c) determinar que el estado del tumor es [CXCR4 (-) monomérico/homodimérico] con la calificación de 0 o 1+.

En un aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con la calificación de 2+.

En un aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 (+) monomérico/homodimérico] con la calificación de 3+.

En otro aspecto particular de la invención, un tumor es [CXCR4 ( + ) monomérico/homodimérico] con la calificación de 2+ o 3+.

Resultados de una prueba o ensayo de acuerdo con la invención se pueden presentarse en cualquiera de una variedad de formatos.

Resultados pueden exhibirse en forma cualitativa. Por ejemplo, el reporte de prueba puede indicar sólo si o no un polipéptido particular se detectó, probablemente también con una indicación de los limites de detección. Los resultados pueden ser exhibidos como semi-cuantitativos . Por ejemplo, pueden definirse diversos intervalos, y a los intervalos se les puede asignar una calificación (por ejemplo, 0 a 3+ o 0 a 8, dependiendo de la escala usada) que proporcionan un cierto grado de información cuantitativa. Esta calificación puede reflejar diversos factores, por ejemplo el número de células en donde CXCR4 como monómero y/u homodimero se detecta, la intensidad de la señal (que puede indicar el nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico o células que contienen CXCR4 ) , etc. Los resultados pueden ser obtenidos en una forma cuantitativa, por ejemplo como un porcentaje de células en donde el polipéptido (CXCR4) se detecta, como una concentración de proteina, etc.

Como se apreciará por una persona con destreza ordinaria en la especialidad, el tipo de salida que se proporciona por una prueba variará dependiendo de las limitaciones técnicas de la prueba y la significancia biológica asociada con la detección del polipéptido. Por ejemplo, en el caso de ciertos polipéptidos, una salida puramente cualitativa (ya sea o no que el polipéptido se detecta a un cierto nivel de detección) proporciona información significante. En otros casos, una salida más cuantitativa (por ejemplo, una proporción del nivel de expresión del polipéptido en la muestra que se prueba contra el nivel normal) es necesaria.

La invención también se refiere a un método para determinar si un desorden oncogénico es susceptible a tratamiento con un antagonista CXCR4, el método comprende las etapas de: (a) determinar in vitro o ex vivo el estado de un tumor de un sujeto como se describió anteriormente, y (b) determinar si el estado es [CXCR4 ( + ) monomérico/homodimérico] , el desorden oncogénico es susceptible a tratamiento con un antagonista CXCR4.

En una modalidad preferida, el antagonista CXCR4 es un anticuerpo anti-CXCR4, o su fragmento o derivado como se describió anteriormente.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para diagnosticar un desorden oncogénico hiperproliferativo patológico o una susceptibilidad a una condición patológica asociada con expresión de un CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto, el sujeto comprende: (a) determinar la presencia o ausencia de CXCR4 monomérico/homodimérico en una muestra, y (b) diagnosticar una condición patológica o susceptibilidad a una condición patológica con base en la presencia o ausencia de CXCR4 como monómero y/u homodimero.

En los métodos de la invención, la detección de células que expresan CXCR4 monomérico/homodimérico o un aumento en los niveles de CXCR4 monomérico/homodimérico, en general es indicativo de un paciente con o que se sospecha presenta un desorden mediado por CXCR4 monomérico/homodimérico .

La invención de esta manera proporciona un método para pronosticar el riesgo de que un individuo desarrolle cáncer, el método comprende detectar el nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en una muestra biológica, en donde un alto nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico indica un alto riesgo en desarrollar cáncer .

Se ha observado que la expresión de CXCR4 se asocia significativamente con etapas de tumor en progreso en varios tipos de cáncer (Schimanski et al, J Clin Oncol, ASCO Annual Meeting Actas Parte I., 24 (18S): el. 4018, 2006; Lee et al., Int J Oncol, 34 (2): 473-480, 2009;. Pagano, Tesi di Dottorato, Universitá degli Studi di Napoli Federico II, 2008) .

De esta manera la invención también se refiere a un método para evaluar agresividad del tumor. "La agresividad de tumor", como se emplea aquí, se refiere a un tumor que rápidamente crece y tiende a diseminarse rápidamente. En una modalidad, el método comprende la etapa de: (a) determinar el nivel de CXCR4 monomérico/homodimérico expresado por las células en una muestra de tumor de un individuo, y (b) determinar el nivel de CXCR4 monomérico/homodimérico expresado en una muestra de tejido equivalente que se toma del mismo individuo en un tiempo posterior, (c) calcular la proporción entre el nivel de expresión que se obtiene en el estado (a) y el nivel de expresión que se obtiene en la etapa (b) , en donde la proporción de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en la muestra de tumor con el tiempo proporciona información de los riesgos de progreso de cáncer.

En una modalidad preferida, una proporción del nivel que se obtiene de la etapa (a) al nivel que se obtiene de la etapa (b) es menor que 1 indica agresividad. En otra modalidad, una proporción mayor que o igual a 1 indica no agresividad.

Otro aspecto de la invención es el monitoreo de la expresión de CXCR4 como un monómero y/u homodimero en respuesta a una terapia dirigida a CXCR4 monomérico/homodimérico. Este monitoreo puede muy útil cuando la terapia activa la regulación a la baja y/o la degradación de CXCR4 monomérico/homodimérico.

En particular, monitorear la expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en la superficie celular puede ser una herramienta critica para evaluar la eficacia del tratamiento durante pruebas clínicas y terapias "personalizadas" .

La solicitud de esta manera proporciona métodos para determinar el régimen terapéutico apropiado para un sujeto .

Un aumento o disminución en el nivel de CXCR4 monomérico/homodimérico es indicativo de la evolución de un cáncer asociado con CXCR4 monomérico/homodimérico. De esta manera, al medir un aumento en el número de células que expresan CXCR4 monomérico/homodimérico o cambios en la concentración de CXCR4 monomérico/homodimérico presente en diversos tejidos o células, es posible determinar si un régimen terapéutico particular dirigido a mejorar una malignidad asociada con CXCR4, es efectivo.

Por lo tanto, la presente invención también se dirige a un método para determinar la eficacia de un régimen terapéutico diseñado para aliviar un desorden oncogénico asociado con CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto que sufre de un desorden, que comprende las etapas de: (a) determinar un primer nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en una muestra biológica que se extrae del sujeto en un primer punto en tiempo; (b) determinar un segundo nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en una muestra biológica que se extrae del sujeto en un segundo punto en tiempo posterior; (c) determinar la proporción del nivel que se obtiene en (a) al nivel obtenido en (b) ; y (d) determinar que la eficacia del régimen terapéutico es elevada cuando la proporción de la etapa (c) es superior a 1; o (e) determinar que la eficacia del régimen terapéutico es baja cuando la proporción de la etapa (c) es inferior o igual a 1.

En una modalidad preferida, el régimen terapéutico diseñado para aliviar un desorden oncogénico asociado con CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto que sufre del desorden, incluye la administración de un inhibidor CXCR4 al sujeto .

Otra modalidad preferida de la invención proporciona un método para seleccionar a un paciente de cáncer que se pronostica se beneficiará o no por la administración de una cantidad terapéutica de un inhibidor CXCR4, el método comprende las etapas de: (a) determinar el nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en el paciente; (b) determinar un nivel de expresión de referencia de CXCR4 monortiérico/homodimérico de un individuo sano; (c) determinar la proporción entre el nivel obtenido en la etapa (a) y el nivel de referencia que se obtiene de la etapa (b) , y (d) seleccionar el paciente al que se pronostica se beneficia por la administración de una cantidad terapéutica de un inhibidor CXCR4, si la proporción de la etapa (c) es mayor a 1; o (e) seleccionar que el paciente como no se pronostica se beneficie por la administración de una cantidad terapéutica de un inhibidor CXCR4, si la proporción de la etapa (c) es igual o menor que 1.

En el sentido de la presente especificación, la expresión "inhibidor CXCR4" o "compuesto inhibidor CXCR4" se refiere a cualquier compuesto o molécula capaz de ligar a CXCR4 e inhibir el enlace del ligando CXCR4. Como un ejemplo no limitante, los inhibidores CXCR4 incluyen AMD3100 y AMD3465. Otros inhibidores CXCR4 que pueden emplearse incluyen pero no están limitados a CTCE-0214; CTCE-9908; CP-1221 (péptidos lineales, péptidos cíclicos, aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y compuestos peptidomiméticos) ; T140 y análogos; 4F-benzoilo-TN24003; KRH-1120; KRH-1636; KRH-2731; análogo de polifemusina; ALX40-4C, o aquellos descritos en WO 01/85196, WO 99/50461, WO 01/94420, WO 03/090512, cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia.

En una modalidad preferida, los inhibidores son anticuerpos monoclonales tales como aquellos descritos en las patentes WO2008/060367 y WO2009/140124.

En la modalidad más preferida, el inhibidor CXCR4 es el anticuerpo monoclonal 515H7 (WO2010/037831) .

También un objeto de la invención es proporcionar un método in vivo para formar en imagen un desorden oncogénico asociado con la expresión de CXCR4 como monómero y/u homodímero. Este método es útil para localizar in vivo el tumor, asi como monitorear su capacidad de invasión. Igualmente, el método es útil para supervisar el progreso y/o la respuesta al tratamiento en pacientes a los que se diagnosticó previamente con un cáncer mediado por CXCR monomérico/homodimérico .

En un primer aspecto, la invención proporciona un reactivo de formación de imagen in vivo, el reactivo comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, el anticuerpo o el fragmento o derivado de preferencia está etiquetado, más preferiblemente radioetiquetado . El reactivo puede ser administrado a un paciente que sufre de un cáncer mediado por CXCR4 monomérico/homodimérico en combinación con un portador farmacéutico efectivo. La presente invención también contempla el uso del reactivo en formación de imagen médica de un paciente que sufre de un cáncer mediado por CXCR4 monomérico/homodimérico. El método de la invención comprende las etapas de: (a) administrar al paciente una cantidad efectiva para formación de imagen del reactivo de formación de imagen y (b) detectar el reactivo.

En una primera modalidad, el agente de formación de imagen comprende una porción dirigida y una porción activa.

Como se emplea aquí, la expresión "porción dirigida" se refiere a un agente que reconoce específicamente y liga a CXCR4 monomérico/homodimérico en la superficie celular. En una modalidad particular, la porción dirigida es un anticuerpo o su fragmento o derivado que liga específicamente a CXCR4 monomérico/homodimérico.

Específicamente, la porción dirigida es un anticuerpo o su fragmento o derivado como se describe anteriormente. Una "porción activa" como se emplea aquí es un agente que permite la detección in vivo del reactivo de formación de imagen. La porción activa de acuerdo con la invención incluye en particular radioelementos tales como tecnecio-99m (99mTc), cobre-67 (Cu-67), escandio-47 (SC-47), Lutecio-77 (Lu-177) cobre-64 (Cu-64), itrio-86 (y-86) o yodo-124 (1-124).

El agente de formación de imagen se administra en una cantidad efectiva para uso de diagnóstico en un mamífero tal como un humano y la localización y acumulación del agente de formación de imagen después se detecta. La localización y acumulación del agente para formación de imagen pueden detectarse por formación de imagen de radio nucleídos, radiogammagrafia, formación de imagen por resonancia magnética nuclear, tomografia computarizada, tomografia de emisión de positrones, tomografia axial computarizada, rayos X o método de formación de imagen por resonancia magnética, detección de fluorescencia y detección de quimioluminiscencia .

Una "muestra biológica" puede ser cualquier muestra que puede retirarse de un sujeto. Tal muestra debe permitir la determinación de los niveles de expresión del biomarcador de la invención. La naturaleza de la muestra de esta manera dependerá de la naturaleza del tumor. Muestras biológicas preferidas para determinación del nivel de expresión de biomarcadores por detección de las proteínas Akt y/o Erk activadas incluyen muestras tales como muestra de sangre, muestra de plasma o una muestra linfática si el cáncer es un tumor líquido. Por "tumor líquido" aquí se refiere a tumores en la sangre o médula ósea, es decir malignidades hematológicas tales como leucemia y mieloma múltiple. De preferencia, la muestra biológica es una muestra de sangre. Sin duda, esta muestra biológica puede obtenerse por una recolección de sangre completamente inocua del paciente y de esta manera permite diagnóstico no invasivo de un fenotipo que responde o no responde a inhibidor de CXCR4.

Una "muestra biológica" como se emplea aquí, también incluye una muestra de cáncer sólido del paciente a probar, cuando la muestra es un cáncer sólido. Esta muestra de cáncer sólido permite que la persona con destreza realice cualquier tipo de medición del nivel del biomarcador de la invención. En algunos casos, los métodos de acuerdo con la invención además pueden comprender una etapa preliminar de tomar una muestra de cáncer sólido del paciente. Por una "muestra de cáncer sólido" se refiere a una muestra de tejido de tumor. Incluso en un paciente con cáncer, el tejido que es el sitio del tumor todavía comprende tejido sano sin tumor. La "muestra de cáncer" de esta manera deberá ser limitada a tejido de tumor que se toma del paciente. La "muestra de cáncer" puede ser una muestra de biopsia o una muestra que se toma de una terapia de resección quirúrgica.

De acuerdo con un aspecto, la muestra del paciente es una célula de cáncer o un tejido de cáncer.

Esta muestra puede tomarse y de ser necesario se prepara de acuerdo con los métodos conocidos por una persona con destreza en la técnica.

La célula de cáncer o el tejido de cáncer en la presente invención no se limita en forma particular.

Como se emplea aquí, el término "cáncer" se refiere a o describe la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por una proliferación de células no reguladas. Los términos "cáncer" y "canceroso" como se emplea aquí, se entiende que abarquen todas las etapas de la enfermedad. De esta manera, un "cáncer" como se emplea aquí, puede incluir tanto tumores benignos como malignos. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides. En forma más específica, un cáncer de acuerdo con la presente invención se elige del grupo que consiste de cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epitelial) , cáncer pulmonar incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salivales, cáncer de ríñones o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, melanoma, melanoma de diseminación superficial, melanoma lentigo maligna, melanoma acral lentiginoso, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linfoma de célula B (incluyendo linfoma no Hodgkin folicular/bajo grado (NHL) ; NHL linfocitico pequeño (SL) ; NHL folicular grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células pequeñas no disociadas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa, linfoma de células de manto, linfoma relacionado a SIDA y macroglobulinemia de Waldenstrom) , leucemia linfocitica crónica (LLC = Chronic Lymphocytic Leukemia) , leucemia linfoblástica aguda (LLA = Acute Lymphoblastic Leukemia) , leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica (CML = Chronic Myeloblastic Leukemia) ; leucemia mieloblástica aguda (LMA = Acute Myeloblastic Leukemia) y desorden linfoproliferativo post-trasplante (PTLD = Post-Transplant Lymphoproliferative Disorder) , asi como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores de cerebro) , síndrome de Meigs, cerebro así como cáncer de cabeza y cuello y metástasis asociadas.

En una modalidad preferida, el cáncer se elige entre cáncer de próstata, osteosarcoma, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer endometrial, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer pancreático y cáncer de colon. En una modalidad más preferida, el cáncer comprende células de linfoma, células de leucemia o células de mieloma múltiple.

El nivel de expresión de CXCR4 como monómero y/u homodimero se compara o mide ventajosamente en relación a niveles en una célula o muestra de control también referida como "nivel de referencia" o "nivel de expresión de referencia". "Nivel de referencia", "nivel de expresión de referencia", "nivel de control" y "control" se emplean en forma intercambiable en la especificación. Como se emplea aqui, un "nivel de control" significa un nivel de referencia separado que se mide en una célula de control comparable, que en general está libre de enfermedad o cáncer. Puede ser del mismo individuo o de otro individuo que es normal o no presenta la misma enfermedad de la cual se obtiene la muestra de prueba o enferma. En el contexto de la presente invención, la expresión "nivel de referencia" se refiere a un "nivel de control" de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico empleado para evaluar un nivel de prueba de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en una muestra que contiene células de cáncer de un paciente.

Por ejemplo, cuando el nivel de CXCR4 como monómero y/u homodimero en la muestra biológica de un paciente es superior al nivel de referencia de CXCR4 como monómero y/u homodimero, las células se considerarán que tienen un alto nivel de expresión o sobreexpresión de CXCR4 como monómero y/u homodimero.

El nivel de referencia puede ser determinado por una pluralidad de métodos. Los niveles de expresión de esta manera pueden definir el número de células que expresan CXCR4 monomérico/homodimérico . En forma alterna, los niveles de expresión pueden definir el nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico, independientemente de una cantidad de células que expresan CXCR4 monomérico/homodimérico.

De esta manera, el nivel de referencia para cada paciente puede pronosticarse por un proporción de referencia de CXCR4 monomérico/homodimérico, en donde la proporción de referencia puede determinarse por cualquiera de los métodos para los niveles de referencia aquí descritos.

Por ejemplo, el control puede ser un valor predeterminado, que puede tomar una variedad de formas. Puede ser un valor de un solo corte, tal como mediana o promedio. El "nivel de referencia" puede ser un solo número, igualmente aplicable a todo paciente en forma individual, o el nivel de referencia puede variar, de acuerdo con sub poblaciones especificas de pacientes. De esta manera, por ejemplo, hombres mayores pueden tener un nivel de referencia diferente que hombres más jóvenes para el mismo cáncer, y mujeres pueden tener un nivel de referencia diferente que hombres para el mismo cáncer. En forma alterna, el "nivel de referencia" puede ser determinado al medir el nivel de expresión de CXCR4 como monómero y/u homodimero en células de cáncer no oncogénicas del mismo tejido que el tejido de las células neoplásicas a probar. Por igual, el "nivel de referencia" puede ser una cierta proporción de CXCR4 como monómero y/u homodimero en las células de un paciente respecto a CXCR4 como niveles de monómero y/u homodimero en células sin tumor en el mismo paciente. El "nivel de referencia" también puede ser un nivel de CXCR4 como monómero y/u homodimero de células cultivadas ín vitro, que pueden manipularse para similar células de tumor, o pueden manipularse en cualquier otra forma que produce niveles de expresión que determina en forma precisa el nivel de referencia. Por otra parte, el "nivel de referencia" puede ser establecido con base en grupos comparativos, tales como en grupos que no tienen niveles de CXCR4 de monoméricos/homodiméricos elevados y grupos que tienen niveles de CXCR4 monoméricos/homodiméricos elevados. Otro ejemplo de grupos comparativos serian grupos que tienen una particular enfermedad, condición o síntomas y grupos sin la enfermedad. El valor predeterminado puede disponerse, por ejemplo en donde una población probada se divide igualmente (o en forma no igual) en grupos, tal como un grupo de bajo riesgo, un grupo de riesgo medio y un grupo de alto riesgo.

El nivel de referencia también puede ser determinado al comparar el nivel de CXCR4 como monómero y/u homodimero en poblaciones de pacientes que tienen el mismo cáncer. Esto puede lograrse, por ejemplo por análisis de histograma, en donde toda una cohorte de pacientes se presenta en forma gráfica, en donde un primer eje representa el nivel de CXCR4 como monómero y/u homodimero, y un segundo eje representa el número de pacientes en la cohorte cuyas células de tumor expresan CXCR4 como monómero y/u homodimero a un nivel determinado. Dos o más grupos separados de pacientes pueden ser determinados por identificación de poblaciones de subconjuntos de la cohorte que pueden tener los mismos o similares niveles de CXCR4 como monómero y/u homodimero. Determinación del nivel de referencia puede ser entonces realizada con base en un nivel que distingue mejor estos grupos separados. Un nivel de referencia también puede representar los niveles de dos o más marcadores, uno de los cuales es CXCR4 monomérico/homodimérico . Dos o más marcadores pueden ser representados por ejemplo por una proporción de valores paran niveles en cada marcador.

Igualmente, una población aparentemente sana tendrá un intervalo "normal" diferente que una población que se conoce tiene una condición asociada con la expresión de CXCR4 como monómero y/u homodimero. De acuerdo con esto, el valor predeterminado selecto puede tomar en cuenta la categoría en la que cae un individuo. Intervalos y categorías apropiados pueden seleccionarse con no más que experimentación rutinaria por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Por "elevado" o "incrementado" se entiende alto relativo a un control selecto. Típicamente, el control se basará en individuos normales aparentemente sanos en un ámbito de edad apropiado .

También se entenderá que los controles de acuerdo con la invención pueden además de ser valores predeterminados, muestras de materiales probados en paralelo con los materiales experimentales. Ejemplos incluyen tejido o células que obtienen al mismo tiempo el mismo sujeto, por ejemplo partes de una sola biopsia o partes de una sola muestra celular del sujeto.

En otra modalidad, la invención se refiere a una composición farmacéutica para formación de imagen in vivo de un desorden oncogénico asociado con expresión de CXCR4 como monómero y/u homodímero, la composición comprende el anticuerpo monoclonal de la invención, o fragmento de enlace de antígeno o su derivado, el anticuerpo o su fragmento derivado se etiqueta y es capaz de ligar CXCR4 como un monómero y/u homodímero in vivo; así como un portador farmacéutico aceptable. En otro aspecto, la presente invención proporciona un equipo útil para los métodos descritos anteriormente, el equipo comprende el anticuerpo de la invención.

Materiales empacados que comprenden una combinación de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico, por ejemplo equipos, también están dentro del alance de la invención. El equipo contiene los anticuerpos para detección y cuantificación de CXCR4 monomérico/homodimérico in vi tro, por ejemplo en un ELISA o transferencia Western. El anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un equipo para detección y cuantificación de CXCR4 monomérico/homodimérico in vitro, por ejemplo en un ELISA o una transferencia Western. Cuando el anticuerpo está etiquetado con una enzima, el equipo incluye substratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de substrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable) . Además, otros aditivos pueden ser incluidos tales como estabilizantes, amortiguadores (por ejemplo, un amortiguador de bloqueo o amortiguador de lisis) y semejantes. Este equipo puede comprender un receptáculo compartamentalizado para recibir uno o más recipientes tales como ampolletas, tubos y semejantes, estos recipientes contienen elementos separados de la invención. Por ejemplo, un recipiente puede contener un primer anticuerpo ligado a un portador insoluble o parcialmente soluble. Un segundo recipiente puede contener un segundo anticuerpo soluble, etiquetado en forma detectable, en forma liofilizada o en solución. El receptáculo también puede contener un tercer recipiente que contiene un tercer anticuerpo etiquetado en forma detectable en forma liofilizada o en solución. Un equipo de esta naturaleza puede utilizarse en el ensayo emparedado de la invención. La etiqueta o inserto de empaque puede proporcionar una descripción de la composición asi como instrucciones para el uso pretendido in vítro o de diagnóstico .

Los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que al disolver proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

En un aspecto aún adicional de la invención, anticuerpos monoclonales, o su fragmento de enlace de antigeno o su derivado, como se detalla aquí, se proporcionan etiquetados con una porción detectable, de manera tal que puedan empacarse y utilizarse, por ejemplo en equipos para diagnosticar o identificar células que tienen el antigeno anteriormente mencionado. Ejemplos no limitantes de estas etiquetas incluyen fluoróforos tales como isotiocianato de fluoresceina; cromóforos, radionúclidos , biotina o enzimas. Estos anticuerpos etiquetados o fragmentos de enlace pueden emplearse para la ubicación histológica del antigeno, ELISA, plastificación celular, asi como otras técnicas inmunológicas para detectar o cuantificar CXCR4 monomérico/homodimérico, y células que contienen este antigeno, por ejemplo.

La invención también incluye equipos en donde el anticuerpo, o fragmento de enlace de antigeno o su derivado, se etiqueta.

También se proporcionan equipos para utilizar como un control positivo para purificación o inmunoprecipitación de CXCR4 monomérico/homodimérico de las células. Para aislamiento y purificación de CXCR4 monomérico/homodimérico, el equipo puede contener el anticuerpo aqui descrito, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de Sepharose) . Equipos pueden proporcionarse que contienen los anticuerpos para detección y cuantificación de CXCR4 monomérico/homodimérico in vitro o ex vivo, por ejemplo en un ELISA o transferencia Western. El equipo comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende cuando menos un anticuerpo, o su fragmento de enlace o derivado, de la invención. Recipientes adicionales pueden incluirse que contienen, por ejemplo diluyentes y amortiguadores, anticuerpos de control. La etiqueta o inserto de empaque puede proporcionar una descripción de la composición asi como instrucciones para el uso pretendido in vitro o de diagnóstico .

En forma más particular, la invención se refiere a un equipo para la determinación del estado CXCR4 monomérico/homodimérico de un tumor por cualquier método conocido por la persona con destreza en la especialidad. En una modalidad preferida, como se describirá en los ejemplos experimentales, la invención se refiere a un equipo para la determinación del estado CXCR4 monomérico/homodimérico de un tumor por métodos IHC o FACS .

En una modalidad particular, el equipo de la invención comprende cuando menos un anticuerpo CXCR4 monomérico/homodimérico como mínimo, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, como se describe anteriormente, el anticuerpo de preferencia está etiquetado.

En una modalidad preferida, el equipo para detectar la presencia in vitro y/o la ubicación de un tumor que expresa CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto, además comprende un reactivo para detectar la extensión de enlace entre el anticuerpo anti-CXCR4 y CXCR4 monomérico/homodimérico .

El equipo de acuerdo con la invención además puede comprender un reactivo para cuantificar el nivel de enlace entre el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno o su derivado, y CXCR4 monomérico/homodimérico.

Todavía en otra modalidad, el equipo de acuerdo con la invención además comprende muestras de control positivas y negativas para la calificación del nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico.

El equipo además puede comprender un anticuerpo policlonal que reconoce anticuerpos murinos específicamente. En forma ventajosa, el anticuerpo policlonal está etiquetado.

Otras características y ventajas de la invención aparecen a continuación en la descripción con los ejemplos y figuras cuyas leyendas se representan a continuación.

La Figura 1 muestra que 427aBl Mab reconoce a ambos monómeros y homodímeros CXCR4 en lisados celulares.

Las Figuras 2A y 2B muestran que 427aBl Mab inmunoprecipita tanto monómeros como homodímeros CXCR .

Las Figuras 3A, 3B, 3C, 3D y 3E muestran que 427aBl Mab reconoce CXCR4 en la membrana celular por análisis FACS.

Las Figuras 4A y 4B ilustran que 427aBl Mab liga a CXCR4 a membrana celular incluso en la presencia del Mab terapéutico anti-CXCR4 515H7 por análisis FACS.

La Figura 5 muestra que 427aBl Mab no modula la conformación de hetero-dímeros CXCR4/CXCR2.

La Figura 6 muestra que 427aBl Mab no tiene efecto en modelo de crecimiento de tumor de xenoinjerto MDA-MB-231 en ratones Nod/Scid.

La Figura 7 muestra a) Tinción de IHC utilizando m427aBl y b) Tinción de IHC utilizando mlgGl en RAMOS.

La Figura 8 muestra a) Tinción IHC utilizando 427aBl y b) Tinción IHC utilizando mlgGl en tumores de xenoinjerto KARPAS299.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpo monoclonal anti-CXCR4 427aBl (Mab) (F50067-006 (5C) 427aBl cllB, CNCM número 1-4018) Para generar anticuerpos monoclonales a CXCR4, ratones Balb/c se inmunizaron con células NIH3T3-CXCR4 recombinantes y/o péptidos correspondientes a extremo-N y bucles extracelulares CXCR4. Los ratones de 6-16 semanas de edad ante primera inmunización, se inmunizaron una vez con el antígeno en adyuvante completo de Freund en forma subcutánea (s.c.) seguido por 2 a 6 inmunizaciones con antigeno en adyuvante incompleto de Freund s.c. La inmuno respuesta se supervisó por sangrado retroorbitales. El suero se cribó por ELISA (como se describe a continuación) y ratones con superiores títulos de anticuerpos anti-CXCR4 se emplearon para fusiones. Ratones se reforzaron en forma intravenosa con antígeno dos días antes de sacrificio y eliminación del bazo .

- ELISA Para seleccionar los ratones que producen anticuerpos anti-CXCR4, suero de ratones inmunizados se prueba por ELISA. Brevemente, placas de microtitulación se revistieron con péptido N-terminal [1-41] purificado conjugado BSA a 5 g de equivalente péptido/mL, 100 L/pozo incubado a 4 grados C durante la noche, después bloquean con 250 µ?/???? de gelatina 0.5% en PBS. Diluciones de plasma de ratones inmunizados con CXCR4 se agregan a cada pozo e incuban 2 horas a 37 grados C. Las placas se lavaron con PBS y después se incubaron con un anticuerpo IgG anti-ratón cabra conjugado a HRP (Jackson Laboratories) por 1 hora a 37 grados C. Después de lavar, se revelaron placas con substrato TMB, la reacción se detuvo 5 min después por adición de 100 L/pozo de H2S04 1M. Ratones que desarrollan los superiores títulos de anticuerpos anti-CXCR4 se emplearon para generación de anticuerpo.

- Generación de hibridomas que producen Mabs a CXCR4 Los esplenocitos de ratón, aislados de un ratón Balb/c que desarrollaron los más altos títulos de anticuerpos anti-CXCR4 se fusionaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón Sp2/0. Células se revistieron a aproximadamente lx 105 /pozo en placas de microtitulación seguido por incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene medio de ultra cultivo + L-glutamina 2 mM + piruvato de sodio 1 mM + lx HAT. Pozos después se cribaron por ELISA para anticuerpo IgG monoclonal anti-CXCR4. Los hibridomas que secretan anticuerpo después se subclonaron al menos dos veces por dilución limitante, cultivaron in vítro para generar anticuerpo para mayor análisis.

Ejemplo 2 : 427aBl Mab reconoce tanto monómeros como homodimeros CXCR4 en Usados celulares Células transfectadas NIH3T3-hCXCR4 , MDA-MB-231 (mama) y U937 (AML) células de cáncer se lavaron dos veces en PBS. Después 100.106 células/ml se presentaron a lisis utilizando el siguiente amortiguador: Tris HC1 20 mM, pH8.5, (NH4)2S0 100 mM, glicerol al 10%, CHAPSO al 1% y cóctel de inhibidores de proteasa al 1% por 30 minutos a 4 grados C. El lisado celular se recolecta por centrifugación a 10,000 g a +4 grados C por 20 minutos y analiza por transferencia western utilizando 427aBl Mab como anticuerpo primario. Figura 1 muestra que Mab 427aBl reconoce tanto monómeros y homodímeros CXCR4 en NIH3T3-CXCR4. Lineas celulares de cáncer MDA-MB-231 y U937 parecen expresar primordialmente CXCR4 como homodímeros.

Ejemplo 3: 427aBl Mab inm noprecipita tanto monómeros como homodímeros CXCR4 Precipitados celulares de NIH3T3-CXCR4 se lavaron con Tris HC1 20 mM, pH 8.5 que contiene (NH4)2S04 100 mM y después suspendidos en amortiguador de lisis (Tris HC1 20 mM, pH 8.5 que contiene (NH4)2S04 100 mM, glicerol al 10%, CHAPSO 1% y 10 L/mL de cóctel inhibidor de proteasa) . Las células se disociaron con homogeneizador Potter Elvehjem. Las membranas solubilizadas se recolectaron por centrifugación a 105,000 g a +4°C por 1 h, después se incubaron durante la noche a 4°C con perlas de Sepharose 4B acopladas a 427aBl Mab y la mezcla se vació en una columna de vidrio y lavó con amortiguador de lisis. Las proteínas capturadas por 427aBl Mab fueron eludidas y analizaron por transferencia Western utilizando 427aBl Mab como anticuerpo primario. Fracciones Interesantes se recolectaron, concentraron y utilizan tanto para análisis WB como resolución SDS-PAGE preparativa (gel Bis-Tris 4 a 12%) . Después de tinción con plata, las bandas de interés se cortaron del gel y presentaron a digestión en gel utilizando un sistema de digestión con proteina automatizado, MassPREP (Waters, Milford, MA, E.U.A.) Los puntos de gel se lavaron dos veces con 50 µ? de NH4HCO3 25 mM (Sigma, Steinheim, Alemania) y 50 µ?. de acetonitrilo (Cario Erba Reactifs - SDS, Val de Reuil, Francia) . Los residuos cisteina se reducen a 60 °C por 1 hora con 50 L de DTT 10 mM preparado en NH4HCO3 25 mM y alquilaron a temperatura ambiente por 20 minutos por 50 µL de yodoacetamida 55 mM (Sigma) preparada en NH4HCO3 25 mM. Después de deshidratación de los puntos de gel con acetonitrilo, las proteínas se digieren durante la noche en gel al agregar 10 µL de 12.5 ng^L de tripsina porcina modificada (Promega, Madison, WI, E.U.A.) en NH4HCO3 25 mM a temperatura ambiente. Los péptidos generados se extraen con 35 µL de acetonitrilo al 60% que contiene ácido fórmico al 5% (Riedel-de Haen, Seelze, Dinamarca), seguido por eliminación del exceso de acetonitrilo y se sometieron a nano-LC-MS/MS . Datos de masa recolectados durante el análisis nano-LC-MS/MS se procesan y convierten en archivos *.MGF para presentar al motor de búsqueda MASCOT™. Las búsquedas se realizan con una tolerancia en mediciones de 0.25 Da en modos MS y MS/MS.

La Figura 2A muestra análisis de transferencia Western de fracciones concentradas eluidas después de inmunoprecipitación utilizando perlas de Sepharose acopladas con 427aBl Mab. Tres bandas a 37 a 43, 75 y 150 kDa de pesos moleculares aparentes se reconocieron por 427aBl Mab.

Fracción concentrada eluida después de inmunoprecipitación utilizando perlas de Sepharose acopladas con 427aBl Mab también se resuelve por SDS-PAGE y visualiza por tinción con plata. Las bandas a 37 a 43, 75 y 150 kDa se cortan del gel (Figura 2B) , digieren con tripsina y analizan por LC-MS/MS como se describió anteriormente. Las listas de pico recolectadas se presentan a Mascot para búsqueda en base de datos de secuencias de péptidos. CXCR4 se identificó en todas las bandas: Seis péptidos CXCR4 se identificaron en la banda 37 a 43 kDa (número de banda 1) por el motor de búsqueda MASCOT™: EENANFNK de 31 a 38 péptidos contenido en N-terminal; YLAIVHATNSQR de 135 a 146 péptidos y YLAIVHATNSQRPR de 135 a 148 péptidos y YICDR de 184-188 péptidos contenidos en el bucle extracelular 2; QGCEFENTVHK de 272 a 282 péptidos contenido en el bucle extracelular 3 y TSAQHALTSVSR de 311 a 322 péptidos contenidos en C-terminal.

La banda de 75 kDa (número de banda 2) contiene cinco péptidos CXCR4: EENANFNK de 31 a 38 péptidos contenidos en CXCR4 N-terminal; YLAIVHATNSQR de 135 a 146 ¦ péptidos contenidos en el bucle intracelular 2; YLAIVHATNSQRPR de 135 a 148 péptidos contenidos en bucle intracelular 2; QGCEFENTVHK de 272 a 282 péptidos contenidos en el bucle extracelular 3 y TSAQHALTSVSR de 311 a 322 péptidos contenido en C-terminal. Los péptidos se identificaron por del motor de búsqueda MASCOT™.

En la banda de 150 kDa (número de banda 3) , dos péptidos CXCR4 se identificaron por del motor de búsqueda MASCOT™. EENANFNK de 31 a 38 péptidos contenido en N-terminal y TSAQHALTSVSR de 311 a 322 péptidos contenido en C-terminal.

Los resultados obtenidos en este estudio claramente muestran que 427aBl Mab inmunoprecipita CXCR4. Además, 427aBl Mab reconoce CXCR4 tanto como un monómero como un homodimero.

Ejemplo 4: 427aBl Mab reconoce a CXCR4 localizado en la membrana celular por análisis FACS .

En este experimento, enlace especifico a CXCR4 humano de 427aBl Mab se evalúa por análisis FACS.

NIH3T3, células transfectadas NIH3T3-hCXCR4 , lineas celulares de cáncer MDA-MB-231, Hela, HT-29 y U937 se incubaron con anticuerpo monoclonal 427aBl (0-10 µ?/p?) . Las células después se lavaron con BSA al l%/PBS/NaN3 0.01%. A continuación, anticuerpos secundarios etiquetados Alexa se agregan a las células y se deja que incuben a 4°C por 20 min. Las células después se lavan de nuevo dos veces. Después del segundo lavado, se realiza análisis FACS.

Resultados de estos estudios de enlace se proporcionan en la Figura 3. Muestran que 427aBl liga a linea celular transfectada CXCR4 -NIH3T3 (Figura 3A) , pero no a las células NIH3T3 precursoras (no mostrado) . Este Mab también es capaz de reconocer lineas celulares de cáncer humano, por ejemplo células de cáncer de colon HT-29 (Figura 3B) , células de cáncer de mama MDA-MB-231 (Figura 3C) , células de cáncer promielociticas U937 (Figura 3D) y células de cáncer de cérviz Hela (Figura 3E) , sugiriendo que estas lineas celulares expresan naturalmente monómeros y/u homodimeros CXCR4.

Ejemplo 5: 427aBl Mab liga a CXCR4 en membrana celular incluso en la presencia del Mab terapéutico anti-CXCR4 515H7 por análisis FACS En este experimento, la competencia de enlace a CXCR4 humano de anti-CXCR4 Mabs 427aBl y 515H7 se examinó por análisis FACS.

Células transfectadas NIH3T3-hCXCR4 , primero se incuban con 515H7 Mab biotinilado (5 g/ml) [que reconoce células NIH3T3-CXCR4 (Figura 4A) ] , y después ya sea 427aBl Mab o 515H7 Mab (0-1 ug/ml) por 1 hora a 4°C. Las células después se lavan con BSA al l%/PBS/NaN3 0.01%. A continuación, estreptavidina etiquetada se agrega a las células y se deja que incube a 4°C por 20 min, antes de otro par de lavados.

Después del segundo lavado, análisis FACS se realiza. Resultados de estos estudios de enlace se proporcionan en la Figura 4B y muestran que anti-CXCR4 Mab 427aBl liga a células transfectadas CXCR4-NIH3T3 humanas incluso en la presencia de Mab 515H7. En contraste, la presencia de 515H7 Mab biotinilado inhibe el enlace de 515H7 Mab no etiquetado a CXCR4, como se esperaba.

Ejemplo 6: 427aBl Mab no modula la conformación de heterodimeros CXCR4/CXCR2 por análisis BRET Este análisis funcional permite la evaluación de los cambios de conformación inducidos sobre enlace de SDF-1 y/o 427aBl Mab al receptor CXCR4 en el nivel del heterodimero CXCR2/CXCR .

Vectores de expresión para cada uno de los socios de interacción investigados se construyen como proteínas de fusión con el colorante correspondiente (Renilla reniformis luciferasa, proteína fluorescente Rlue y amarilla, YFP) al aplicar técnicas de biología molecular convencionales. Dos días antes de realizar experimentos BRET, células HEK293 se transfectan en forma transitoria con vectores de expresión que codifican por los socios BRET correspondientes: [CXCR4-Rlue + CXCR2-YFP] . Al día siguiente, las células se distribuyen en placas de 96 MW blancas previamente revestidas con poli-lisina en medio de cultivo completo [DMEM suplementado con FBS al 10%] . Las células primero se cultivaron a 37 °C con CO2 al 5% a fin de permitir enlace celular a la placa. Las células después se agotan con 200 µ? de DMEM/pozo durante la noche. Inmediatamente antes del experimento BRET, DMEM se retira y las células rápidamente se lavan con PBS. Las células después se incuban en PBS en la presencia o ausencia de anticuerpo, 15 min a 37 °C antes de adición de coelenterazina H 5 µ? con y sin SDF-1 en un volumen final de 50 µ? . Después de incubación por 5 minutos a 37 °C y mayor incubación por 20 min a temperatura ambiente, adquisición de la emisión de luz a 485 nm y 530 nm se inicia utilizando el lector de Multietiquetas Mitra LB940 (Berthold) (ls/longitud de onda/pozo repetido 15 veces a temperatura ambiente) .

Cálculo de la proporción BRET se realiza como se describió previamente (Angers et al, 2000.): [ (Emisión53o nm) -(emisión485 nm) X Cf . ] / (emisión485 nm) en donde Cf = (emisión53o nm) / (emisión485 nm) para células que expresan la proteina de fusión Rlue sola bajo las mismas condiciones experimentales. Simplificando esta ecuación muestra que la proporción BRET corresponde a la proporción 530/485 nm que se obtiene cuando están presentes dos socios BRET corregido por la proporción 530/485 nm que se obtiene bajo las mismas condiciones experimentales, cuando sólo el socio fusionado a Rlue está presente en el ensayo. Por razones de legibilidad, los resultados se expresan como por ciento de la señal basal.

SDF1 (300 nM) disminuye en aproximadamente 20% la señal BRET que resulta de la proximidad espacial de los receptores CXCR4 y CXCR2. Es probable que indique formación de heterodimeros CXCR4/CXCR2 o cambios de conformación de dimeros de re-existentes (Figura 5) . 427aBl Mab no modula los cambios de conformación inducidos por SDF-1 para el heterodimero CXCR2/CXCR4 y no modula por si mismo la proximidad espacial CXCR4/CXCR2. Esto indica que 427aBl Mab no tiene influencia en conformación de heterodimeros CXCR4 /CXCR2 (Figura 5) .

Ejemplo 7 : evaluación de actividad 427aBl Mab en modelo de crecimiento de tumor de xenoinjerto MDA-MB-231 en ratones NOD/Scid La meta de este experimento fue estimar la actividad inhibidora de anti-CXCR4 Mab 427aBl contra un xenoinjerto MDB -MB-231 en ratones NOD/SCID.

Células MDA-MB-231 de ECACC se cultivaron en forma rutinaria en medio DMEM (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), FCS al 10% (Sigma, St Louis MD, E.U.A.) Las células se dividen 48 horas antes de injertar de manera tal que estaban en fase exponencial de crecimiento. Diez millones de células MDA-MB-231 se injertan en PBS ratones NOD/Scid de 7 semanas de edad (Charles River, Francia) . Cinco dias después de implante, los tumores eran medibles (34 mm3 < V3 < 40 mm3) y los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamaño de tumor comparable. Ratones tratados i.p. con una dosis de carga de 2 mg/ratón de Mab 427aBl. Después, los ratones se inyectaron dos veces a la semana a 1 mg/dosis/ratón de Mab 427aBl. Un grupo PBS se introduce como un grupo de control en este experimento. Volumen de tumor se mide dos veces a la semana y calcula por la fórmula: p/6 longitud x ancho x altura x. Análisis estadístico se realiza en cada medición utilizando una prueba Mann-Whitney.

No se observó mortalidad durante el tratamiento. Comparado con el grupo de control PBS, no se observó inhibición significante de crecimiento de tumor en D40 (p = 0.485) por 427aBl Mab 1 mg/dosis. Además, el volumen de tumor promedio después de 5 semanas de tratamiento no se reduce por mAb 427aBl contra PBS (Figura 6).

Ejemplo 8: 427aBl Mab reconoce CXCR4 presente en la membrana celular (Tinción IHC de Tumores Incrustados en Parafina) Secciones fueron desparafinadas , rehidratadas y colocadas a 98 °C por 5 minutos en EDTA precalentado a 98 °C pH 8 para recuperación de epítopo inducida por calor y por 5 minutos adicionales a temperatura ambiente en el amortiguador EDTA caliente. Portaobjetos después se enjuagaron en agua corriente por 5 minutos. Después de 3 lavados en amortiguador Tris salino-Tween 20 0.05% (TBS-T) (Dako S3006) , la actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó utilizando reactivos de bloqueo peroxidasa -(Dako K4007) por cinco minutos. Secciones se lavaron con TBS-T e incubaron en reactivo de bloqueo (UltraV block-TA-125UB-LabVision) por 5 minutos antes de incubación con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-CXCR-4 (5 yg/ml, clon 427aBl, Pierre Fabre) o IgGl/kappa de ratón (5 g/ml, X0931, Dako) como un control de isotipo durante la noche a 4°C. Secciones se lavaron con TBS-T e incubaron con reactivo para detección IHC de Refuerzo SignalStain (HRP, M) por 30 minutos a temperatura ambiente. Diaminobencidina se emplea para desarrollo de un producto de reacción café (Dako K3468) . Los portaobjetos se sumergen en hematoxilina por 4 minutos para contratinción (DAKO S3309) y lavaron en PBS antes de montarse en medio Faramount más cubre objetos. En este procedimiento inmunohistoquimica, el producto de reacción café se correlaciona con tinción positiva de la membrana celular y falta de producto de reacción café se correlaciona con tinción negativa sin visualización de la membrana celular. 427aBl Mab tiñe en forma diferencial la membrana celular de diversos tipos de tumor. Las Figuras 7 y 8 ilustran tinción realizada en 2 modelos de xenoinjerto en donde una actividad anti-tumoral con el anticuerpo anti-CXCR-4 hz515H7 terapéutico se ha descrito: RAMOS y KARPAS299.

Como se muestra en las Figuras 7 y 8, la expresión detectada es menor en KARPAS299 (Figura 8) que en RAMOS (Figura 7). Estos datos se correlacionan con el estudio de la expresión CXCR-4 por citometria de flujo. Sin duda, células RAMOS expresan aproximadamente 5 niveles más de CXCR-4 que KARPAS299 (Capacidad de Enlace de Anticuerpo: 200 000 para RAMOS y 40 000 para KARPAS299) . La tinción membranosa es más débil en KARPAS299 (Figura 8), mientras que tinción membranosa es significativamente superior en RAMOS (Figura 7) -

Claims (36)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, caracterizado porque comprende i) una cadena pesada que comprende las siguientes tres CDRs respectivamente CDR-H1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 que tiene la secuencia de SEQ ID No. 3; y ii) una cadena ligera que comprende las siguientes tres CDRs respectivamente CDR-Ll que tiene la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 6.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, en donde el anticuerpo se elige de: a. un anticuerpo con una cadena pesada que comprende las siguientes tres CDRs respectivamente CDR-H1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 3; y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID No. 8; b. un anticuerpo con un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID No. 7; y una cadena ligera que comprende las siguientes tres CDRs respectivamente CDR-Ll que tiene la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 6; o c. un anticuerpo con un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID No. 7; y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID No. 8.

3. El anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, en donde el anticuerpo 427aBl comprende: a) una cadena pesada, la cadena pesada comprende: · loas siguientes tres CDRs respectivamente CDR-H1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 1, CDR-H2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 2 y CDR-H3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 3; y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID No. 8, y · un dominio variable de cadena pesada, el dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia SEQ ID No. 7; y b) una cadena ligera, la cadena ligera comprende: · las siguientes tres CDRs respectivamente CDR-L1 que tiene la secuencia SEQ ID No. 4, CDR-L2 que tiene la secuencia SEQ ID No. 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia SEQ ID No. 6; y · un dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena ligera tiene la secuencia SEQ ID No. 8.

4. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, en donde el anticuerpo es capaz de ligar a CXCR4 como monómero y/u homodimero.

5. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, para utilizar en diagnóstico in vitro o ex vivo un desorden oncogénico asociado con expresión de CXCR4 o determinar in vitro o ex vivo el pronóstico para desarrollar un desorden oncogénico asociado con expresión de CXCR4.

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, en donde el desorden oncogénico consiste de un desorden oncogénico asociado con expresión de CXCR4 como monómero y/u homodimero.

7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, en donde el anticuerpo es un anticuerpo murino .

8. El anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, en donde el anticuerpo no bloquea el enlace del anticuerpo 515H7 a CXCR4.

9. El anticuerpo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 8, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, en donde el anticuerpo no tiene ninguna actividad anti-tumoral in vivo.

10. Un hibridoma murino capaz de secretar un anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. El hibridoma murino de conformidad con la reivindicación 10, el hibridoma murino está depositado en CNCM, Institut Pasteur, París, Francia en junio 25, 2008, bajo el número 1-4018.

12. Un ácido nucleico aislado, que se elige de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, DNA o RNA, que codifica un anticuerpo o su compuesto derivado o fragmento funcional, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8; b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de DNA que comprende una secuencia selecta del grupo que consiste de las secuencias SEQ ID No. 9 a 14, o una secuencia cuando menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID No. 9 a 14; c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de DNA que comprende las secuencias SEQ ID No. 15 o 16, o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID No. 15 o 16; d) el RNA traducido de los ácidos nucleicos como se define en a) , b) o c) ; e) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos como se define en a) , b) y c) ; y f ) un ácido nucleico de al menos 18 nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alta severidad con las secuencias SEQ ID No. 15 o 16 o una secuencia con al menos 80%, de preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de alineamiento óptimo con las secuencias SEQ ID 15 o 16, o su secuencia complementaria .

13. Un vector que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12.

14. Una célula huésped transformada por o que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 13.

15. Un método para producir un anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, caracterizado porque el método comprende las etapas de a) cultivar una célula huésped de conformidad con la reivindicación 14 en un medio de cultivo y bajo condiciones de cultivo apropiado; y b) recuperar el anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o su derivado, del medio de cultivo o la célula cultivada .

16. Un método para detectar in vitro o ex vivo la presencia de un tumor que expresa CXCR4 monomérico/homodimérico, caracterizado porque el proceso comprende las etapas de; (a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento de enlace de antigeno o su derivado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 u obtenido por el método de la reivindicación 15 o producido por hibridoma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11; y (b) detectar el enlace del anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, con la muestra biológica.

17. Método para determinar in vitro o ex vivo el porcentaje de células que expresan CXCR4 como monómero y/u homodimero en un tumor de un sujeto, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 u obtenido por el método de la reivindicación 15 o producido por hibridoma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11; y (b) cuantificar el porcentaje de células que expresan CXCR4 como monómero y/u homodimero en la muestra .

18. Un método para determinar in vitro o ex vivo el nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico como monómero y/u homodimero en un tumor de un sujeto, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra biológica del sujeto con un anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 u obtenido por el método de la reivindicación 15 o producido por hibridoma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11; y (b) cuantificar el nivel de enlace del anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, a CXCR4 monomérico/homodimérico en la muestra biológica.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el nivel de enlace del anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, a CXCR4 monomérico/homodimérico se mide por inmunohistoquimica (IHC) o FACS, de preferencia por IHC.

20. Un método para determinar in vitro o ex vivo la calificación de un tumor de un sujeto, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o que se obtiene por el método de la reivindicación 15 o produce por el hibridoma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11; (b) cuantificar el nivel de enlace del anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, con CXCR4 monomérico/homodimérico como monómero y/u homodimero en la muestra biológica; y (c) calificar el tumor al comparar el nivel cuantificado de enlace del anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, del sujeto a una escala apropiada .

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la escala apropiada se basa en dos parámetros que son la intensidad de la tinción y el porcentaje de células positivas.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, caracterizado porque la escala apropiada es una escala de 0 a 8 en donde "sin reactividad" se califica con 0, y una fuerte reactividad en una proporción de "67-100% proporción reactiva" se califica con 8.

23. Método para determinar in vitro o ex vivo el estado de un tumor de un sujeto, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) calificar un tumor de un sujeto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20, 21; o 22, y b) determinar que el estado del tumor es [CXCR4(+) monomérico/homodimérico] con una calificación de 3 a 8; o (c) determinar que el estado del tumor es [CXCR4 (-) monomérico/homodimérico] con una calificación de 0 a 2.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, caracterizado porque la escala apropiada es una escala de 0 a 3+ en donde sin reactividad membranosa de células de tumor se califica con 0, y fuerte reactividad completa en más de 10% de células de tumor se califica con 3+.

25. Un método para determinar in vitro o ex vivo el estado de un tumor de un sujeto, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) calificar un tumor de un sujeto de acuerdo con una de las reivindicaciones 20, 21 o 24; y (b) determinar que el estado de tumor es [CXCR4 ( + ) monomérico/homodimérico] con una calificación de 2+ o 3+; o (c) determinar que el estado del tumor es [CXCR4(-) monomérico/homodimérico] con una calificación de 0 o 1+.

26. Un método para determinar si un desorden oncogénico es susceptible a tratamiento con un antagonista CXCR4, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) determinar in vitro o ex vivo el estado de un tumor de un sujeto de acuerdo con la reivindicación 23 o 25, y (b) determinar que, si el estado es [CXCR4(+) monomérico/homodimérico] , el desorden oncogénico es susceptible a tratamiento con un antagonista CXCR4.

27. Un método para determinar vitro o ex vivo la eficacia de un régimen terapéutico diseñado para aliviar un desorden oncogénico asociado con un CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto que sufre el desorden, el método comprende las etapas de: (a) determinar un primer nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 en una muestra biológica que se extrae del sujeto en un primer punto en tiempo; (b) determinar un segundo nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 en una muestra biológica que se extrae del sujeto en un segundo punto en tiempo posterior; (c) determinar la proporción entre el nivel obtenido en (a) al nivel obtenido en (b) ; y (d) determinar que la eficacia de régimen terapéutico es alta cuando la proporción de la etapa (c) es mayor a 1; o (e) determinar que la eficacia del régimen terapéutico es baja cuando la proporción de la etapa (c) es inferior o igual a 1.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el régimen terapéutico diseñado para aliviar un desorden oncogénico asociado con CXCR4 monomérico/homodimérico en un sujeto que sufre de desorden incluye la administración de un inhibidor CXCR4 al sujeto.

29. Un método in vitro o ex vivo para seleccionar un paciente de cáncer pronosticado que se beneficia o no de la administración de una cantidad terapéutica de un inhibidor CXCR4 , el método comprende las etapas de: (a) determinar el nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico en el paciente de acuerdo con el proceso de la reivindicación 18 o 19; (b) determinar un nivel de expresión de referencia de CXCR4 monomérico/homodimérico de un individuo sano de acuerdo con el proceso de la reivindicación 18 o 19; y (c) determinar la proporción entre el nivel obtenido en (a) al nivel obtenido en (b) ; y (d) seleccionar que el paciente pronosticado se beneficia por la administración de una cantidad terapéutica de un inhibidor CXCR , si la proporción en la etapa (c) es mayor a 1; o (e) seleccionar que el paciente no se le ha pronosticado que se beneficie de una administración de una cantidad terapéutica de un inhibidor CXCR4, si la proporción de la etapa (c) es inferior o igual a 1.

30. El proceso de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el inhibidor CXCR4 es el anticuerpo monoclonal 515H7.

31. Un equipo que comprende al menos un anticuerpo o su fragmento de enlace de antígeno o derivado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 u obtenido por el método de la reivindicación 15 o producido por hibridoma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11.

32. El equipo de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, está etiquetado.

33. El equipo de conformidad con la reivindicación 31 o 32, caracterizado porque además comprende un reactivo para detectar la extensión de enlace entre el anticuerpo, o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, y CXCR4 monomérico/homodimérico .

34. El equipo de conformidad con la reivindicación 31 a 33, caracterizado porque además comprende un reactivo para cuantificar el nivel de enlace entre el anticuerpo o su fragmento de enlace de antigeno o derivado, y CXCR4 monomérico/homodimérico .

35. El equipo de conformidad con la reivindicación 31 a 34, caracterizado porque además comprende muestras de control positivo y negativo para calificación de nivel de expresión de CXCR4 monomérico/homodimérico.

36. El equipo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque además comprende un anticuerpo policlonal que reconoce específicamente anticuerpos murinos, y el anticuerpo policlonal de preferencia está etiquetado.