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MX2014000316A - Proteinas de fusion liberadoras de relaxina y usos de las mismas. - Google Patents

Proteinas de fusion liberadoras de relaxina y usos de las mismas.

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MX2014000316A
MX2014000316A MX2014000316A MX2014000316A MX2014000316A MX 2014000316 A MX2014000316 A MX 2014000316A MX 2014000316 A MX2014000316 A MX 2014000316A MX 2014000316 A MX2014000316 A MX 2014000316A MX 2014000316 A MX2014000316 A MX 2014000316A
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MX
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protein
hem
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MX2014000316A
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Ulrich Haupts
Andreas Wilmen
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Bayer Ip Gmbh
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Abstract

La presente invención proporciona proteínas de fusión de Relaxina, en las que un ligador conecta el extremo carboxi-terminal de Relaxina con un resto proteínico que prolonga la semivida y el ligador comprende un sitio de escisión de proteasa. En consecuencia, la invención proporciona polipéptidos de fusión de Relaxina con semivida prolongada por lo cual la proteína de fusión por sí misma sirve como depósito para la liberación de la Relaxina biológicamente activa. Además, la invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anteriores polipéptidos de fusión, vectores que contienen los mismos, células que expresan los polipéptidos de fusión de Relaxina, composiciones farmacéuticas y uso médico de tales polipéptidos de fusión.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN LIBERADORAS DE RELAXINA Y USOS DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona proteínas de fusión de Relaxina, en las que un ligador conecta el extremo carboxi-terminal de Relaxina con un resto proteínico que prolonga la semivida y el ligador comprende un sitio de escisión de proteasa. En consecuencia, la invención proporciona polipéptidos de fusión de Relaxina con semivida prolongada, por lo cual la proteína de fusión por sí misma sirve como depósito para la liberación de la Relaxina biológicamente activa. Además, la invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anteriores polipéptidos de fusión, vectores que contienen los mismos, células que expresan los polipéptidos de fusión de Relaxina, composiciones farmacéuticas y uso médico de tales polipéptidos de fusión.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Relaxina 2 (Relaxina H2, RLN2) como un miembro de la superfamilia de insulina es un péptido de 2 cadenas que exhibe, a nivel genético, la estructura de prohormona de cadena B - C - A típica, dispuesta del extremo N- al C-terminal. Otros elementos de esta superfamilia, codificada por 7 genes en los seres humanos, son los genes de Relaxina RLN 1 , RLN3, y los genes del péptido tipo insulina INSL3, INSL4, INSL5, y INSL6. La homología de secuencia global entre los elementos de esta familia es baja; no obstante, el análisis filogenético indica que estos genes han evolucionado del gen ancestral RLN3 (Hsu, S. Y. (2003); Wilkinson, T. N. et al. (2005)). La proteína madura tiene un peso molecular de aproximadamente 6000 Da y es el producto de una escisión enzimática de la prohormona catalizada por la Prohormona-Convertasa 1 (PC1) y 2 (PC2) (Hudson P. et al. (1983)). Las cadenas A y B resultantes están unidas por dos puentes de cisteína intermolecular; la cadena A exhibe un enlace disulfuro intramolecular adicional.
La Relaxina inicia efectos pleotrópicos a través de múltiples vías en una variedad de tipos celulares. Esta confiere su actividad por la unión al receptor acoplado a la proteína G de clase I (tipo rhodopsina) denominado LGR7 (receptor 7 acoplado a la proteína G rica en leucina 7) también llamado RXFP1 (receptor de péptido 1 de la familia de relaxina), y con afinidad significativamente más baja a LRG8/RXFP2 (receptor de péptido 2 de la familia de relaxina) (Kong RC et al. (2010)). En la molécula de Relaxina, un motivo de aminoácidos en la cadena B (Arg-X-X-X-Arg-X-X-lle/Val-X) (Schwabe y Büllesbach (2007), Büllesbach y Schwabe (2000)) se conserva en todos los péptidos de la Relaxina y es crítico para la interacción de estos péptidos con el correspondiente receptor. La unión de la Relaxina a LGR7/RXFP1 produce la activación de adenilato ciclasa y un aumento de la molécula segundo mensajero AMPc. Por medio de este mecanismo, la Relaxina 2 por ejemplo media la liberación del péptido natriurético auricular en los corazones de ratas (Toth, M. et al. (1996)). También se ha mostrado un efecto inotrópico positivo de la Relaxina 2 sobre los miocitos atriales de rata (Piedras-Renteria, E. S. et al. (1997)). Otras moléculas de transducción de señal que se activan por el complejo de Relaxina/LGR7 son la fosfoinositido-3 quinasa, tirosina quinasas, y fosfodiesterasas (Bartsch, O. et al. (2001), Bartsch, O. et al. (2004)). Las vías de transducción de señal adicionales activadas por este sistema incluyen la vía de óxido nítrico (NO) que llevan al aumento de los niveles de GMP cíclico en corazones de rata y cobayo (Bani-Sacchi, T. et al. (1995)).
La Relaxina actúa como una hormona pleotrópica (Dschietzig T. et al. (2006)) que posee actividad biológica sobre órganos tales como pulmón, riñon, cerebro, y corazón. La fuerte actividad antifibrótica y vasodilatadora de Relaxina es notablemente responsable por los efectos positivos obtenidos con este péptido en varios modelos de enfermedad animal, así también como en los estudios clínicos (McGuane J.T. et al. (2005)). El RLN2 tiene múltiples efectos beneficiosos en el sistema cardiovascular en condiciones patológicas. Este mantiene la homeostasis del tejido y protege el miocardio lesionado durante diversos procesos fisiopatológicos. Esto exhibe efectos vasodilatadores pronunciados, por ejemplo, que afectan el flujo y la vasodilatador! en arterias coronarias de roedores (Nistri, S. et al. (2003)) y en los lechos vasculares de otros órganos. En ratas espontáneamente hipertensas, el RLN2 redujo la presión arterial, un efecto mediado por el aumento de producción de NO.
Se ha evaluado una actividad cardioprotectora de la Relaxina 2 en diferentes modelos animales tales como cobayo, rata y cerdo (Perna A.M. et al. (2005), Bani, D. et al. (1998)). RLN2 mejora la lesión miocárdica, la infiltración celular inflamatoria y la posterior fibrosis, de este modo se alivia la disfunción ventricular grave (Zhang J. et al. (2005)).
La Relaxina 2 exhibe fuerte actividad antifibrótica. En los tejidos lesionados, la activación y proliferación de fibroblastos causa aumento de la producción de colágeno y la fibrosis intersticial. La fibrosis del corazón aumenta por sobrecarga biomecánica e influye en la disfunción, remodelado y arritmogénesis ventricular. En modelos animales, la infusión continua de Relaxina 2 inhibe o incluso revierte la disfunción cardíaca causada por cardiomiopatía, hipertensión, toxicidad cardíaca inducida por isoprenalina, cardiomiopatía diabética e infarto de miocardio. Esta inhibición de fibrogénesis o inversión de fibrosis establecida puede reducir el endurecimiento ventricular y aumentar la función diastólica. En particular, si bien la Relaxina 2 reduce la acumulación de colágeno aberrante, no afecta el contenido de colágeno basal en tejidos sanos, lo que destaca su seguridad para uso terapéutico.
Se ha analizado la Relaxina 2 en varios estudios clínicos como vasodilatador pleiotrópico para el tratamiento de los pacientes con insuficiencia cardíaca aguda con evolución muy promisoria. En estos estudios, la Relaxina 2 se asoció con alivio favorable de la disnea y otros resultados clínicos (Teerlink J.R. et al. (2009), Metra M. et al. (2010)) Debido a la limitada semivida in vivo de la Relaxina, el tratamiento de los pacientes se debe repetir cada 14 a 21 días, por el cual se debe realizar la administración del compuesto como una infusión continua durante al menos 48 horas.
Además, la Relaxina 2 también puede ser útil en el tratamiento de enfermedades tales como pancreatitis, enfermedades relacionadas con la inflamación como artritis reumatoides y cáncer (Cosen-Binker L.l. et al. (2006) Santora K. Et al. (2007)) o escleroderma, fibrosis pulmonar, renal, y hepática (Bennett RG. (2009)). La Relaxina 2 reduce el crecimiento del tumor por xenoinjerto de las células de cáncer de mama MDA-MB-231 (Radestock Y, Hoang-Vu C, Hombach-Klonisch S. (2008)).
La síntesis de Relaxina 2 por procedimientos químicos es difícil. Debido a la baja solubilidad de la cadena B y al requerimiento de la introducción específica y laboriosa de puentes de cisteína entre las cadenas A y B, los rendimientos del péptido activo obtenidos por estos procedimientos son extremadamente bajos (Barios K.K. et al. (2010)). De modo alternativo, se puede realizar la expresión recombinante de Relaxina 2. Para permitir la escisión eficiente del prepro-péptido durante las modificaciones postraducción y la secreción de los péptidos activos maduros y biológicos, las células huésped de expresión se cotransfectan rutinariamente con los constructos de expresión que codifican la Prohormona-Convertasa 1 y/o 2 (Park J.l. et al. (2008)). No obstante, la eficiencia del procesamiento endoproteolítico de los prepro-péptidos en las células heterólogas a menudo limita en forma significativa la producción de moléculas bioactivas (Shaw J.A. et al. (2002)).
Es importante destacar, que la semivida de la Relaxina 2 administrada por vía intravenosa en los seres humanos es menor de 10 minutos (Dschietzig T. et al. (2009)). Como consecuencia, en los ensayos clínicos la Relaxina 2 se debe administrar en forma continua durante 48 horas. En consecuencia, el aumento de la semivida biológica de los polipéptidos de fusión de la Relaxina o Relaxina de acción prolongada puede ser de gran ventaja.
El aumento de la semivida biológica se puede realizar por modificación química tal como PEGilación o HESilación del polipéptido de interés, introducción de sitios de N-glicosilación no naturales adicionales o por la fusión genética de este polipéptido con otras moléculas, tales como el fragmento Fe de la inmunoglobulina de los anticuerpos, transferrina, albúmina, módulos de unión que se unen in vivo a otras moléculas que median una semivida más larga, u otras proteínas, respectivamente. Sin embargo, la fusión del dominio Fe de una IgG al extremo C-terminal de la Relaxina 2 produce una molécula inactiva con respecto a la actividad de la Relaxina. De modo sorprendente, se halló que cuando el dominio Fe se escinde, se recupera la actividad de la Relaxina. Esto implica que a pesar de la inactividad de la proteína de fusión, la Relaxina se pliega correctamente pero la actividad se bloquea por el dominio Fe o la Relaxina recupera el plegamiento correcto después de la liberación del dominio Fe. Los polipéptidos de fusión de Fe para profármacos anti-complemento se describen en J Biol Chem. 2003 Sep 19;278(38):36068-76. En consecuencia, la invención proporciona polipéptidos de fusión de Relaxina en los que la Relaxina está fusionada a restos proteínicos que prolongan la semivida tal como un dominio Fe de una IgG, en los que la Relaxina se liga al resto proteínico que prolonga la semivida por medio de un polipéptido ligador que comprende un sitio de escisión de endo-proteasa, que produce un polipéptido con aumento de semivida en comparación con la Relaxina, de la cual se libera Relaxina activa por la acción de una endoproteasa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a polipéptidos de fusión de Relaxina de semivida prolongada como un profármaco para la liberación de Relaxina activa.
Una forma de realización de la invención es un polipéptido de fusión que comprende Relaxina, un péptido ligador que comprende un sitio de escisión de endoproteasa y un resto proteínico que prolonga la semivida, en el que el péptido ligador conecta la Relaxina con el resto que prolonga la semivida.
En una forma de realización la Relaxina anteriormente mencionada es una Relaxina 2 o una Relaxina 3. Se prefiere la Relaxina humana, tal como Relaxina 2 humana o Relaxina 3 humana.
En una forma de realización el resto proteínico que prolonga la semivida mencionado anteriormente es un polipéptido, tal como el dominio Fe de una IgG, albúmina sérica, transferrina, o una proteína o péptido de unión a albúmina sérica.
Se prefiere un resto proteínico que prolonga la semivida humano o humanizado tal como el dominio Fe de una IgG humana o albúmina sérica humana.
En una forma de realización preferente, el ligador mencionado anteriormente comprende un sitio de escisión para una endo-proteasa/endo-peptidasa, siendo la endo-proteasa/endo-peptidasa una endo-proteasa/endo-peptidasa extracelular. En una forma de realización preferente adicional el ligador mencionado anteriormente comprende un sitio de escisión para una endo-proteasa/endo-peptidasa, en el que la endo-proteasa/endo-peptidasa es una endo-proteasa/endo-peptidasa humana. En una forma de realización preferente adicional el sitio de escisión es de una endo-proteasa/endo-peptidasa que es activa en sangre tal como factor de coagulación sanguínea Xa. Además, se prefiere el sitio de escisión de una endo-proteasa/endo-peptidasa unida a membrana o extendida en la membrana que tiene sitios activos que se dirigen hacia el lumen de los vasos sanguíneos, tal como MMP12. En otra forma de realización preferente el sitio de escisión es de una endo-proteasa/endo-peptidasa, cuya actividad aumenta o es específica en los sitios donde se desea la acción de Relaxina, por ejemplo, la endo-proteasa/endo-peptidasa se expresa y/o activa específicamente en el sitio de la actividad de Relaxina deseada tal como órganos o tejidos específicos. En otra forma de realización preferente, el sitio de escisión es de una endo-proteasa/endo-peptidasa que se expresa y/o activa en puntos de tiempo específicos durante los procesos fisiológicos, por ejemplo en puntos de tiempo específicos del desarrollo de una enfermedad.
En otro aspecto, la invención proporciona un polinucléotido que codifica un polipéptido de fusión anteriormente mencionado. Tal polinucléotido también puede comprender una secuencia codificadora para un péptido señal que permite la secreción del polipéptido de fusión. También se incluyen los vectores que contienen polinucléotidos para tales polipéptidos de fusión. Son vectores adecuados por ejemplo vectores de expresión. Una forma de realización adicional de la invención es una célula huésped que comprende un polinucléotido, un vector, o vector de expresión que codifica los polipéptidos de fusión anteriormente mencionados. La célula huésped de la invención puede ser una célula eucariótica o una célula procariótica. Una célula eucariótica puede ser una célula de mamífero o una célula de levadura o insecto, preferentemente una célula de mamífero. Una célula procariótica puede ser por ejemplo una célula de E. coli.
En otra forma de realización la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de fusión anteriormente mencionados. La composición se puede formular para la administración intravenosa, intraperitoneal, tópica, inhalatoria o subcutánea.
Otra forma de realización de la invención proporciona una composición farmacéutica o un polipéptido de fusión como medicamento. Una forma de realización adicional es el uso de una composición farmacéutica o un polipéptido de fusión en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, pancreatitis, inflamación, cáncer, escleroderma, fibrosis pulmonar, renal y hepática.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fig. 1 muestra una representación esquemática de la organización de un polipéptido de fusión de Relaxina y su posterior activación en el torrente sanguíneo por una endo-peptidasa/endo-proteasa que escinde el ligador que comprende un Sitio de Escisión de Proteasa (Protease Cleavage Site, PCS). La cadena A, cadena B y cadena C representan las respectivas cadenas de Relaxina. El ligador con PCS es un ligador que comprende un PCS y las líneas negras indican los enlaces disulfuros inter- e intramoleculares de la Relaxina. El dominio Fe es un dominio Fe de una molécula de IgG.
Fig. 2 muestra una determinación de la actividad del constructo de fusión de Relaxina-Fc usando la línea celular CHO-CRE-LGR7. Como control, se usó hRelaxina 2 (R&D Systems, número de catálogo 6586-RN-025). Los datos se expresan como Unidades de Luz Relativas, lo que representa que la actividad de las variantes de Relaxina y hRelaxina 2 indujeron la expresión de luciferasa. Los símbolos representan medias, las barras de error representan S.E.M.
Fig. 3 a - d Muestran la determinación de la actividad de los constructos de Relaxina-Fusión 1 - 4 usando la línea celular CHO-CRE-LGR7. Como control, se usó la hRelaxina 2 (R&D Systems, número de catálogo 6586-RN-025). Los datos se expresan como Unidades de Luz Relativas, lo que representa que la actividad de las variantes de Relaxina y hRelaxina 2 indujeron la expresión de luciferasa. Los símbolos representan medias, las barras de error representan S.E.M.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones: El término "residuo de aminoácido" se considera que indica un residuo de aminoácido contenido en el grupo constituido por los residuos de alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Me o I), lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptofano (Trp o W), y tirosina (Tyr o Y).
El término "actividad de Relaxina" se define por la capacidad de Relaxina o sus variantes para activar las proteínas G estimulatorias Gs a través de la unión a sus receptores y en consecuencia la generación del segundo mensajero AMP cíclico, y/o la estimulación de PI3-quinasa. La Relaxina o sus variantes se unen a LGR7, lo que produce la activación intracelular de las proteínas G estimulatorias Gs, lo que produce la posterior generación del segundo mensajero AMP cíclico (AMPc). Sin embargo, la generación de AMPc es una respuesta bifásica dependiente del tiempo. Después de una respuesta corta inicial de AMPc mediada por la adenilato ciclasa de Gs, la señal del receptor cambia a una activación de la proteína G inhibidora y por esto a la respuesta mediada por PI3-quinasa. (Halls M.L., Bathgate R.A., Summers, R.J. (2005)).
El término "resto que prolonga la semivida" se refiere a un resto farmacéuticamente aceptable, dominio o "vehículo" unido covalentemente ("conjugado") al polipéptido de fusión de la Relaxina directamente o por medio de un ligador. Los mecanismos por los que el resto que prolonga la semivida influye positivamente en el comportamiento farmacocinético o farmacodinámico incluyen pero sin limitación (i) prevenir o reducir la degradación proteolítica in vivo u otra modificación química que disminuye la actividad del Polipéptido de fusión de Relaxina, (ii) aumentar la semivida u otras propiedades farmacocinéticas al reducir la filtración renal, disminuir la depuración mediada por receptor o aumentar la biodisponibilidad, (iii) reducir la toxicidad, (iv) aumentar la solubilidad, (v) aumentar la actividad biológica y/o selectividad blanco del polipéptido de fusión de Relaxina. Además el resto que prolonga la semivida puede tener efectos positivos en términos de aumentar la capacidad de fabricación, y/o reducir la inmunogenicidad del polipéptido de fusión de Relaxina, en comparación con la forma no conjugada del polipéptido de fusión de Relaxina. La expresión "resto que prolonga la semivida" incluye restos no proteínicos que prolongan la semivida, tales como PEG o HES, y restos proteínicos que prolongan la semivida, tales como albúmina sérica, transferrina o dominio Fe.
"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma indistinta en este documento e incluyen una cadena molecular de dos o más aminoácidos ligados a través de enlaces peptídicos. Los términos no se refieren a una longitud específica de la cadena. Los términos incluyen modificaciones pos-traducción del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Además, los fragmentos de proteína, análogos, proteínas mutadas o variantes, proteínas de fusión y similares se incluyen en la definición de polipéptido, péptido o proteína. Los términos también incluyen moléculas en que uno o más análogos de aminoácidos o aminoácidos no canónicos o no naturales se puede sintetizar o expresar en forma recombinante mediante técnicas de ingeniería genética de proteína. Además, las proteínas de fusión de la invención se pueden derivatizar como se describe en este documento por técnicas de química orgánica bien conocidas.
El término "variante funcional" se refiere a una variante de polipéptido que difiere en su estructura química del polipéptido natural y retiene al menos algo de su actividad biológica natural. En caso de las variantes de Relaxina 2 de acuerdo con la invención, una variante funcional es una variante que muestra al menos de su actividad natural, tal como la activación del receptor de Relaxina LGR7. La activación del receptor de Relaxina LGR7 se puede determinar por un procedimiento descripto en los procedimientos experimentales.
Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a los polipéptidos de la presente invención incluyen cualquier polipéptido que retiene al menos alguna de las propiedades de activación del receptor del correspondiente polipéptido de Relaxina natural. Los fragmentos de los polipéptidos de la presente invención incluyen fragmentos proteolíticos, así como los fragmentos de supresión, y también los polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a las sustituciones, supresiones, o inserciones de aminoácidos. Las variantes se pueden producir de forma natural o no natural. Las variantes no naturales se pueden producir por medio de técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Las variantes de polipéptidos pueden comprender sustituciones, supresiones, o inserciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Las variantes de polipéptidos también se pueden denominar en este documento como "análogos de polipéptido". Como se usa en este documento, un "derivado" de un polipéptido se refiere a un polipéptido presente que tiene uno o más residuos derivatizados químicamente por la reacción de un grupo funcional. También se incluyen como "derivados" los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo, la prolina se puede sustituir con 4-hidroxiprolina; lisina se puede sustituir con 5-hidroxilisina; histidina se puede sustituir con 3-metilhistidina; serina se puede sustituir con homoserina; y lisina se puede sustituir con ornitina.
El término "proteína de fusión" o "polipéptido de fusión" indica que la proteína incluye los componentes del polipéptido derivados de más de una proteína o polipéptido original y/o que la proteína de fusión incluye dominios de la proteína derivados de uno o más proteínas o polipéptidos originales que no están dispuestos en su orientación natural. Normalmente, una proteína de fusión se expresa a partir de un gen de fusión en que una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos de una proteína añadida en fase con, y opcionalmente separada por un ligador o extensor de, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos de una proteína diferente. El gen de fusión puede ser expresado por una célula huésped recombinante como una proteína única.
El término "secuencia de nucleótidos" o polinucléotido" se considera que indica una extensión consecutiva de dos o más moléculas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético o cualquiera de sus combinaciones.
El término "CE50" (concentración media máxima efectiva) se refiere a la concentración efectiva de un compuesto terapéutico que induce una respuesta media entre la inicial y la máxima en condiciones experimentales específicas.
El término "inmunogenicidad" como se usa en relación con una sustancia dada se considera que indica la capacidad de la sustancia de inducir una respuesta del sistema inmunitario. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta mediada por células o anticuerpos (véase, por ejemplo, Roitt: Essential Immunology (8th Edición, Black-well) para definición adicional de inmunogenicidad). Normalmente, la reducción de la inducción de los procesos involucrados en el desencadenamiento de una respuesta inmunitaria tal como proliferación de linficitos T será una indicación de reducción de la inmunogenicidad. La reducción de la inmunogenicidad se puede determinar por el uso de cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo in vivo o in vitro.
El término "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR" generalmente se refiere a un procedimiento para la amplificación de una secuencia de nucleótidos deseada in vitro, que se describe por ejemplo, en la Patente US Núm. 4.683.195 y US 4.683.195. En general, el procedimiento de PCR involucra ciclos repetidos de síntesis de extensión del cebador, mediante cebadores de oligonucleótidos capaces de hibridar preferentemente a un ácido nucleico templado.
El término "vector" se refiere a un plásmido u otras secuencias de nucleótidos que son capaces de replicarse dentro de una célula huésped o integrarse en el genoma de la célula huésped y como tal, son útiles para realizar funciones diferentes en conjunto con células huésped compatibles (un sistema vector-huésped): para facilitar la clonación de la secuencia de nucleótidos, es decir, producir cantidades utilizables de la secuencia, dirigir la expresión del producto génico codificado por la secuencia e integrar la secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula huésped. El vector contendrá diferentes componentes de acuerdo con la función que se va a realizar.
"Célula", "célula huésped", "línea celular" y "cultivo celular" se usan en forma indistinta en este documento y se debe entender que todos estos términos incluyen la progenie resultante del crecimiento o cultivo de una célula.
El término "semivida funcional in vivo" se usa en su significado normal, es decir el tiempo en que el 50% de la actividad biológica del polipéptido aún está presente en el cuerpo/órgano blanco, o el tiempo en que la actividad del polipéptido es 50% del valor inicial.
Como alternativa para determinar la semivida funcional in vivo, se puede determinar la "semivida sérica", es decir el tiempo en que el 50% del polipéptido circula en el plasma o torrente sanguíneo antes de depurarse independientemente de si el polipéptido retiene su función biológica. La determinación de la semivida sérica a menudo es más fácil que determinar la semivida funcional in vivo y la magnitud de la semivida sérica es usualmente una buena indicación de la magnitud de la semivida funcional in vivo. Términos alternativos a la semivida sérica incluyen "semivida plasmática", "semivida circulante", "depuración sérica", "depuración plasmática", "semivida terminal" y "semivida de la depuración". El polipéptido se elimina por la acción de uno o más de los sistemas reticuloendoteliales (RES), riñon, bazo o hígado, por el factor tisular, receptor SEC u otra eliminación mediada por receptor, o por la proteólisis específica o no específica. Normalmente, la depuración depende del tamaño (con respecto al límite para la filtración glomerular), carga, cadenas de carbohidrato unidas, y la presencia de receptores celulares para la proteína. La funcionalidad retenida se determina normalmente como unión al receptor o activación del receptor. La semivida funcional in vivo y la semivida sérica se pueden determinar por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica y por ejemplo, generalmente puede involucrar las etapas de administración adecuada a un mamífero de una dosis adecuada de la proteína o polipéptido de interés; recolección de muestras de sangre u otras muestras de dicho mamífero en intervalos regulares; determinar el nivel o concentración de la proteína o polipéptido de interés en dicha muestra de sangre; y cálculo, a partir de (un gráfico de) los datos así obtenidos, el tiempo hasta que se ha reducido el nivel o concentración de la proteína o polipéptido de interés en 50% en comparación con el punto de tiempo de referencia apropiada, por ejemplo, concentración inicial inmediatamente después de la aplicación i.v. Se hace referencia por ejemplo a los manuales estándares, tal como Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi y D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edición (1982).
"Glicosilación" es una modificación química en la que se adicionan restos de azúcar al polipéptido en sitios específicos. La glicosilación de polipéptidos está normalmente ligada a N o ligada a O. Ligado a N se refiere a la unión de un resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido Asn-X-Ser y Asn-X-Thr ("N-X-S/T"), donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. En consecuencia, la presencia de estas secuencias tripéptidos (o motivos) en up polipéptido crea un potencial sitio de glicosilación ligado a N. Ligado a O se refiere a la unión de un resto carbohidrato al oxígeno del grupo hidroxilo de serina y treonina.
Un polipéptido o polipéptido de fusión "aislado" es uno que se ha identificado y separado de un componente de la célula que lo expresó y/o el medio en que se secretó. Los componentes contaminantes de la célula son materiales que podrían interferir en los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido de fusión, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En formas de realización preferentes, el polipéptido de fusión se purifica (1) a más de 95% en peso del polipéptido de fusión determinado por ejemplo, por el procedimiento de Lowry, espectroscopia UV-Vis o por SDS-electroforesis en gel capilar (por ejemplo, en un Caliper LabChip GXII, GX 90 o dispositivo Biorad Bioanalyzer), y en formas de realización preferentes adicionales más de 99% en peso, (2) un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. Generalmente, sin embargo, los polipéptidos de fusión aislados se prepararán en al menos una etapa de purificación.
Panorama La solicitud proporciona una proteína de fusión de Relaxina con semivida prolongada. La presente solicitud describe proteínas de fusión de Relaxina mejoradas con semivida biológica significativamente prolongada y actividad biológica significativamente reducida. Debido al hecho, de que la Relaxina se conecta al resto que prolonga la semivida por una extensión de aminoácidos que codifican un sitio de escisión para una proteasa que es activa in vivo y libera la Relaxina funcional a partir de la proteína de fusión de Relaxina, esta proteína de fusión de Relaxina exhibe un defecto de depósito farmacológico.
Una forma de realización de la invención es una proteína de fusión que comprende Relaxina-PCS-HEM, en la que la Relaxina es un heterodímero de Relaxina que comprende las cadenas A y B procesadas o una variante funcional de la misma, PCS es un polipéptido ligador que comprende un sitio de escisión de proteasa (PCS) y HEM es un resto proteínico que prolonga la semivida (HEM).
Una forma de realización adicional de la invención es un polipéptido de fusión que comprende proRelaxina-PCS-HEM, en el que la proRelaxina es una proforma no procesada de Relaxina que aún no contiene la cadena C o una variante funcional de la misma, PCS es un polipéptido ligador que comprende un sitio de escisión de proteasa (PCS) y HEM es un resto proteínico que prolonga la semivida (HEM).
Otra forma de realización de la invención es una proteína de fusión que comprende HEM-PCS-Relaxina en la que Relaxina es un heterodímero de Relaxina que comprende la cadena A y B procesada o una variante funcional de la misma, PCS es un polipéptido ligador que comprende un sitio de escisión de proteasa (PCS) y HEM es un resto proteínico que prolonga la semivida (HEM).
Una forma de realización adicional de la invención es una proteína de fusión que comprende HEM-PCS-proRelaxina en la que la proRelaxina es una proforma no procesada de Relaxina que aún contiene la cadena C o una variante funcional de la misma, PCS es un polipéptido ligador que comprende un sitio de escisión de proteasa (PCS) y HEM es un resto proteínico que prolonga la semivida (HEM).
Se entiende la proRelaxina como la proforma de Relaxina que no es procesada por una prohormona convertasa y comprende la cadena B de Relaxina, la cadena C de Relaxina y la cadena A de Relaxina en su orientación natural.
La Relaxina-PCS-HEM y proRelaxina-PCS-HEM son formas de realización preferentes.
Dominio de Relaxina: En una forma de realización adicional la Relaxina comprende un polipéptido de la cadena A de la Relaxina 2 o un variante funcional de la misma. En una forma de realización adicional la Relaxina comprende un polipéptido de la cadena 2B de Relaxina o una variante funcional de la misma.
En una forma de realización adicional la Relaxina comprende un polipéptido de la cadena A de la Relaxina 2 o una variante funcional de la misma y un polipéptido de la cadena 2B de Relaxina o una variante funcional de la misma.
En una forma de realización preferente el polipéptido de la cadena A de Relaxina comprende un polipéptido mínimo de la cadena A de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 7) o una variante funcional de la misma, o comprende un polipéptido de la cadena A de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 6) o una variante funcional de la misma. En una forma de realización preferente el polipéptido de la cadena B de Relaxina comprende un polipéptido de la cadena B de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 8) o un variante funcional del mismo.
En una forma de realización más preferente la cadena A de Relaxina comprende un polipéptido mínimo de la cadena A de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 7) o una variante funcional de la misma, o comprende una polipéptido de la cadena A de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 6) o una variante funcional de la misma y el polipéptido de la cadena B de Relaxina comprende un polipéptido de la cadena B de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 8) o una variante funcional de la misma.
En una forma de realización adicional la Relaxina comprende un polipéptido de la cadena A de la Relaxina 3 o una variante funcional de la misma y/o un polipéptido de la cadena B de la Relaxina 3 o una variante funcional de la misma.
En una forma de realización adicional la cadena A de Relaxina comprende un polipéptido de la cadena 3 de Relaxina humana (SEC ID N°:9), polipéptido mínimo de la cadena A de la Relaxina 3 humana (SEC ID N°:12),o una variante funcional de la misma. En una forma de realización adicional el polipéptido de la cadena B de Relaxina comprende un polipéptido de la cadena B de la Relaxina 3 humana (SEC ID N°: 11) o una variante funcional de la misma. En una forma de realización preferente la Relaxina comprende un polipéptido de la cadena 3 de Relaxina humana (SEC ID N°: 10) o una variante funcional de la misma y comprende un polipéptido de la cadena B de la Relaxina 3 humana (SEC ID N°: 11) o una variante funcional de la misma.
En una forma de realización preferente una variante funcional de la cadena A o B de Relaxina tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, inserciones y/o supresiones de aminoácidos en comparación con la cadena A y B de Relaxina naturales, respectivamente. También se prefiere una variante B de Relaxina 2 adicional que también comprende el motivo conservado de Arg-X-X-X-Arg-X-X-lle/Val-X donde X representa aminoácidos que pueden formar una estructura helicoidal.
Las vanantes de la cadena A y B de Relaxina son conocidas en la técnica. La geometría del sitio de unión bien caracterizado de la Relaxina proporciona a los expertos orientación para diseñar las variantes de la cadena A y B de Relaxina, veáse por ejemplo Büllesbach y Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10; 275(45):35276-80 para las variaciones de la cadena B de Relaxina y Hossain et al. J Biol Chem. 2008 Jun 20; 283(25): 17287-97 para las variaciones de la cadena A de Relaxina y la cadena "mínima" A de Relaxina. Por ejemplo, para el motivo conservado de Relaxina 2 B (Arg-X-X-X-Arg-X-X-lleA/al-X) X representa aminoácidos que pueden formar un ejemplo de estructura helicoidal para seleccionar aminoácidos apropiados X en el motivo conservado, ya que los tres aminoácidos definidos forman una región de contacto del receptor sobre la superficie de la cadena B de Relaxina (Büllesbach y Schwabe, (2000)).
En una forma de realización aun más preferente el polipéptido de la cadena A de Relaxina es un polipéptido de la cadena A de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 6) o una variante funcional de la misma y el polipéptido de la cadena B de Relaxina es un polipéptido de la cadena B de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 8) o una variante funcional de la misma. En una forma de realización aun más preferente, la variante funcional del polipéptido de la cadena A de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 6) es una variante funcional que tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEC ID N°: 16. También se prefiere una variante funcional del polipéptido de la cadena B de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 8) en la que la variante funcional tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEC ID N°: 8. Se prefiere aún más una variante de Relaxina 2 B humana B anteriormente mencionada que además comprende el motivo conservado de Arg-X-X-X-Arg-X-X-lleA/al-X.
En una forma de realización aun más preferente el polipéptido de la cadena A de Relaxina es un polipéptido de la cadena A de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 6) o una variante funcional de la misma que tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 cambios de aminoácidos en comparación con la SEC ID N°: 6 y el polipéptido de la cadena B de Relaxina es un polipéptido de la cadena B de la Relaxina 2 humana (SEC ID N°: 8) o a variante funcional de la misma que tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 cambios de aminoácidos en comparación con la SEC ID N°: 18 y que comprende el motivo conservado Arg-X-X-X-Arg-X-X-lle/Val-X.
Los expertos en la técnica saben cómo obtener las variantes funcionales. Los ejemplos de las variantes funcionales se divulgan para la cadena de Relaxina A en Hossain et al J Biol Chem. 2008 Jun 20; 283(25): 17287-97 o en la Publicación de la Patente US N°. US2011/0130332 y para la cadena B de Relaxina en Schwabe y Büllesbach (2007) Adv Exp Med Biol. 612:14-25 y Büllesbach y Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10;275(45):35276-80).
Ligador de PCS: Para liberar la Relaxina de la proteína de fusión, la secuencia del ligador empleado PCS comprende una secuencia de escisión para una proteasa/peptidasa. Las proteasas/peptidasas son un grupo de enzimas cuya función catalítica es hidrolizar (ruptura) los enlaces peptídicos de las proteínas. Estas también se llaman enzimas proteolíticas o proteinasas. Las proteasas difieren en su capacidad para hidrolizar enlaces peptídicos, es decir las proteasas pueden tener preferencia para una secuencia de péptido específico como sitio de reconocimiento y escisión. Las proteasas se subdividen en seis grupos, considerando que las Serina proteasas, tales como factor de coagulación lia, Vlla, y Xa, y Metaloproteasas, tales como Metaloproteasa de la matriz 2 y 9, representan las familias más grandes.
La posición del sitio de escisión del sustrato de proteasa se denomina P1-P1', lo que significa que el aminoácido en el sitio N-terminal del sitio de escisión se define como P1 y en el sitio C-terminal se define como P1'. Los aminoácidos en la dirección N-terminal del enlace peptídico escindido se numeran como P2, P3, y P4. En el lado del carboxilo la numeración del sitio de escisión aumenta del mismo modo (?1', ?2', ?3' etc.) (Schlechter y Berger (1967 y 1968)).
En el contexto de la presente invención una proteasa/peptidasa es una endoproteasa/endopeptidasa. Las endopeptidasas o endoproteasas son peptidasas proteolíticas que rompen los enlaces peptídicos de los aminoácidos no terminales (es decir dentro de una proteína). En contraste con ello están las exopeptidasas, que hidrolizan los enlaces peptídicos N- o C-terminal y en consecuencia liberan el aminoácido N-terminal o C-terminal de un polipéptido. Por esta razón, las endopeptidasas que escinden el ligador PCS pueden liberar la Relaxina de una manera controlada formando una proteína de fusión del profármaco.
En una forma de realización preferente el PCS es un PCS de una endo-proteasa. En una forma de realización preferente el PCS es una PCS de una endo-proteasa extracelular. En otra forma de realización preferente, la endo-proteasa anteriormente mencionada es activa en sangre o en los sitios en el cuerpo donde se desea la acción de Relaxina. Aun se prefieren más las endo-proteasas que aparecen naturalmente en sangre, tal como el factor de coagulación Xa o en un tejido enfermo de una enfermedad tratable con Relaxina, tales como metaloproteasas MMP. También se prefieren las endo-proteasas que están unidas a membrana o acopladas a membrana pero que tienen su dominio catalítico y por ende su actividad catalítica en el lumen de los vasos sanguíneos (en consecuencia, en sangre humana) o expuestas al espacio intersticial en tejidos, tal como M P12. Aún se prefieren más las endo-proteasas mencionadas anteriormente que son activas en sangre humana y/o un tejido enfermo de una enfermedad tratable con Relaxina. Una enfermedad tratable con Relaxina es por ejemplo, una enfermedad fibrótica. El tejido enfermo de una enfermedad fibrótica en consecuencia por ejemplo, es tejido pulmonar, cardíaco, hepático o renal. Otras enfermedades tratables con Relaxina se listan a continuación. Las endo-proteasas más preferentes anteriormente mencionadas son de origen humano o humanizado.
Los expertos en la técnica conocen que de acuerdo con la nomenclatura EC las endoproteasas pertenecen al grupo de EC EC 3.4.21 - EC 3.4.24 (determinado por la Nomenclature Committee of the Internacional Union of Biochemistry and Molecular Biology). Las endoproteasas útiles por ejemplo son tripsina, trombina, factor Xa, factor Vlla, MMP2, MMP12 o Renina.
También se contempla que se pueda administrar una endo-proteasa exógena que escinda el PCS lo que produce una liberación de Relaxina del profármaco. En una forma de realización preferente esta proteasa endógena se dirige al sitio deseado de la actividad de Relaxina (por ejemplo, un tejido enfermo de una enfermedad tratable con Relaxina) a través de un resto de direccionamiento conectado a la proteasa.
El conocimiento acerca de la expresión de las endoproteasas anteriormente mencionadas está en el estado de la técnica. En algunos aspectos de la invención se prefiere no solo tener una Relaxina con semivida más larga que un profármaco sino también tener Relaxina liberada del profármaco en un órgano o parte específica del cuerpo. En consecuencia, se puede utilizar la información de la técnica donde una endoproteasa se expresa para adaptar el sitio de liberación de la Relaxina del profármaco.
Al tener una liberación sistémica de Relaxina del profármaco se puede elegir una endo-proteasa que esté presente en sangre. Tal proteasa por ejemplo, es el factor de coagulación Xa.
Debido a que la Relaxina liberada de su profármaco tiene una semivida corta, la adaptación de la liberación de Relaxina en órganos, tejidos o compartimientos específicos, en especial órganos, tejidos o compartimientos enfermos, también mejora su beneficio farmacéutico a medida que la Relaxina se libera en el sitio de enfermedad.
Por ejemplo, la Relaxina tiene un efecto anti-hipertrófico directo sobre los cardiomiocitos y actividad anti-fibrótica sobre los fibroblastos cardíacos (Moore XL. Et al. (2007); Wang P. et al. (2009)). En consecuencia, se prefieren las proteasas que se expresan predominantemente en el tejido cardíaco, tal como MMP2 (Overall CM. (2004)) o Quimasa (Matsumoto C. et al. (2009)). Otros órganos prominentes afectados por las enfermedades fibróticas son riñon (Klein J. et al. (2011)) y pulmón (Coward WR et al. (2010)). En estos órganos, la administración de Relaxina exhibe una fuerte actividad anti-fibrótica (Bennett RG (2009)). En consecuencia, se prefieren los sitios de escisión de proteasa como ligador provenientes de las proteasas expresadas principalmente en riñon y/o pulmón, tal como MMP12 en el pulmón (Garbacki N. et al. (2009)) o Renina en el riñon Castrop H. et al. (2010)).
El sitio de escisión de proteasa de las endo-proteasas es conocido en la técnica. Algunos ejemplos se dan en la tabla 1.
Tabla 1 : Ejemplos para Proteasas y sus correspondientes sitios de escisión. factor de coagulación Vlla catepsina S Tactor de coagulación Xa ADAMTS1 ADAM12 componente activado del complemento cis napsina ? reniña elastasa-1 MM>2 uroqtnnasa Quimasa Trombina Tripsina Es bien conocido en la técnica que las variaciones de los sitios de escisión de la proteasa pueden llevar a diferente recambio de los sustratos. Tales variaciones incluyen el intercambio conservador o no conservador de uno o más aminoácidos dentro de la secuencia de reconocimiento y pueden influir en la kcat y/o Km del recambio del sustrato. En consecuencia, la variación del PCS de la proteína de fusión de Relaxina proporciona una base para adaptar adicionalmente la cinética de liberación de la Relaxina.
Debido a que se conocen los sitios de escisión preferentes de las endoproteasas, se selecciona una combinación de PCS/endoproteasa, de modo que la endoproteasa escinda específicamente el PCS pero no escinda la Relaxina o el resto que prolonga la semivida. Además, existen procedimientos provistos en la técnica para determinar si una endo-proteasa también hidroliza los enlaces peptídicos de la Relaxina o el resto que prolonga la semivida.
Un PCS preferente es un sitio de escisión del factor de coagulación Xa, también se prefiere un PCS que tiene la secuencia HeGluGIyArgMetAsp.
En una forma de realización adicional el polipéptido ligador PCS de los polipéptidos/proteínas de fusión anteriormente mencionados también pueden tener un polipéptido extensor en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal. Una unidad extensora puede proporcionar mejor acceso de una endo-proteasa al PCS, en consecuencia proporciona mejor liberación de la Relaxina de la proteína de fusión. Los procedimientos para determinar una actividad de proteasa sobre un sustrato dado son conocidos en la técnica.
Tales extensores son conocidos en la técnica y son de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, son de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, son de 1 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, son de 1 a aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, son de 1 a 10 aminoácidos de longitud, o son de 1 a 5 aminoácidos de longitud.
La composición de aminoácidos de las secuencias extensoras es variable, si bien se prefiere un extensor que exhiba bajo potencial de inmunogenicidad. En una forma de realización de la invención un polipéptido extensor se puede componer de cualquier aminoácido.
En una forma de realización más preferente el polipéptido extensor comprende residuos de Gly y Ser. En una forma de realización preferente adicional el péptido extensor es un ligador rico en glicina tal como péptidos que comprende la secuencia [GGGGS]n que se divulga en la Patente U.S. Núm. 7.271.149, n es un número entero entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 10, más preferentemente entre 1 y 5 y aun más preferentemente entre 1 y 3. En otras formas de realización, se usa un polipéptido extensor rico en serina, como se describe n la Patente U.S. Núm. 5.525.491. Una forma de realización preferente adicional es un polipéptido extensor que comprende residuos Gly y Ser y tiene una relación de Gly a Ser de al menos 3 a 1.
Cuando una unidad extensora se introduce entre el PCS y la Relaxina, la unidad extensora permanecerá en la Relaxina después de la escisión con la respectiva endo-proteasa, además de los aminoácidos P o P' de los PCS, respectivamente. En consecuencia, se usan unidades extensoras que no disminuirán la actividad de Relaxina. En una forma de realización preferente la unidad extensora se inserta entre el PCS y el resto que prolonga la semivida.
En una forma de realización adicional los polipéptidos de fusión anteriormente mencionados liberan Relaxina activa. En una forma de realización preferente adicional la actividad de Relaxina es la activación del receptor de Relaxina LGR7. Los procedimientos para determinar la actividad de Relaxina son conocidos en la técnica o se proporcionan en este documento. En una forma de realización aun más preferente, la activación del receptor de Relaxina LGR7 se determina por un procedimiento desvelado en los procedimientos experimental de la presente. Una forma de realización aun más preferente, la determinación de la activación del receptor de Relaxina LGR7 es la determinación del valor de CE50. En una forma de realización aun más preferente, la actividad de Relaxina mencionada anteriormente es 105 veces, 104 veces, 103 veces, 100 veces, 75 veces, 50 veces, 25 veces o 10 veces menor en comparación con la correspondiente concentración efectiva de Relaxina natural que induce una actividad mitad de la máxima. Por ejemplo, la correspondiente Relaxina natural para un polipéptido de fusión sobre la base de la Relaxina 2 humana es la proteína de Relaxina 2 humana.
Extensión de la semivida por medio de restos proteínicos que prolongan la semivida: Para aumentar la semivida de un polipéptido de fusión de la invención, se contempla una fusión con un resto proteínico que prolonga la semivida, tal como el fragmento Fe de inmunoglobulina de las inmunoglobulinas, transferrina, receptor de transferrina o al menos la porción de unión a transferrina de este, albúmina sérica, o sus variantes o módulos de unión que se unen in-vivo a otras moléculas que median la semivida más larga, por ejemplo, proteína de unión a albúmina sérica.
Las "inmunoglobulinas" son moléculas que contienen cadenas de polipéptidos mantenidas entre sí por enlaces disulfuro, que normalmente tienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. En cada cadena, un dominio (dominio variable Fv) tiene una secuencia de aminoácidos variable de acuerdo con la especificidad del anticuerpo de la molécula. Los otros dominios (dominios constantes C) tienen una secuencia relativamente constante común a las moléculas de la misma clase.
Como se usa en este documento, la porción "Fe" de una inmunoglobulina tiene el significado comúnmente dado al término en el AMPco de inmunología. Específicamente, este término se refiere a un fragmento de anticuerpo que se obtiene por la remoción de las dos regiones de unión al antígeno (los fragmentos de Fab) del anticuerpo. Una vía para eliminar los fragmentos Fab es digerir la inmunoglobulina con papaína proteasa. En consecuencia, la porción Fe se forma de fragmentos de tamaño aproximadamente igual de la región constante de ambas cadenas pesadas, que se asocian a través de interacciones no covalentes y opcionalmente enlaces disulfuros. La porción Fe puede incluir las regiones bisagra y se extiende a través de los dominios CH2 y CH3 al extremo C terminal del anticuerpo. Las regiones bisagra representativas para las inmunoglobulinas humanas y de ratón se pueden hallar en Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K., ed., W.H. Freeman y Co., 1992.
Existen cinco tipo de regiones de Fe de inmunoglobulina humana con diferentes propiedades efectoras y farmacocinéticas: IgG, IgA, IgM, IgD, e IgE. La IgG es la inmunoglobulina más abundante en el suero. La IgG también tiene la semivida más larga en el suero de cualquier inmunoglobulina (23 días). A diferencia de otras inmunoglobulinas, la IgG recircula de modo eficiente después de la endocitosis después de la unión a un receptor de Fe. Existen cuatro subclases de IgG, G1 , G2, G3, y G4, cada una de las cuales tiene diferente efecto o funciones. Estas funciones efectoras generalmente son mediadas a través de la interacción con el receptor de Fe (FcyR) o por la unión de C1q y fijación del complemento. La unión a FcyR puede producir citólisis mediada por células dependiente de anticuerpo, mientras que la unión a los factores del complemento puede llevar a la lisis mediada por células. En el diseño de las proteínas de fusión de Fe heterólogas en que se utiliza únicamente por su capacidad para extender la semivida, es importante minimizar toda función efectora. Todas las subclases de IgG son capaces de unirse a los receptores de Fe (CD16, CD32, CD64), G1 y G3 son más efectivos que G2 y G4. La región de unión al receptor de Fe de la IgG está formada por residuos ubicados en las regiones de bisagra y carboxi terminal del dominio CH2.
De acuerdo con el efecto deseado in vivo, las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden contener alguno de los isotipos descritos anteriormente o pueden contener regiones Fe mutadas en que se han alterado las funciones de unión al complemento y/o receptor Fe. En consecuencia, las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden contener la porción Fe entera de una inmunoglobulina, fragmentos de la porción Fe de una inmunoglobulina, o sus análogos.
Es preferente que la región Fe usada para las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención derive de una región de Fe de lgG1 o lgG2.
Generalmente, la región Fe usada para las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención puede derivar de cualquier especie que incluye pero sin limitación a ser humano, rata, ratón y cerdo. Preferentemente, la región Fe usada para la presente invención deriva del ser humano o rata. Sin embargo, más preferentes son las regiones y fragmentos de Fe humanos y sus variantes para reducir el riesgo de la proteína de fusión de ser inmunogénica en los seres humanos. Una "región Fe de la secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe hallada en la naturaleza. Una "variante de la región Fe" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la región Fe de la secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido. Preferentemente, la variante de la región Fe tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fe de la secuencia nativa o con la región Fe de un polipéptido original, por ejemplo, de aproximadamente uno a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente de aproximadamente uno a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fe de la secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido original. La variante de la región Fe en este documento preferentemente poseerá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con una región Fe de la secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido original, y más preferentemente al menos aproximadamente 90% identidad de secuencia con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con este.
Los compuestos de Relaxina descritos anteriormente se pueden fusionar directamente o por medio de un extensor de péptidos a albúmina o uno de sus análogos, fragmentos o derivados. En general las proteínas de albúmina que constituyen parte de las proteínas de fusión de la presente invención se pueden derivar de albúmina clonada de algunas especies. Sin embargo, se prefieren la albúmina humana y sus fragmentos y análogos para reducir el riesgo de que la proteína de fusión sea inmunogénica en los seres humanos. La albúmina sérica humana (HSA) consiste en una cadena de polipéptidos no glicosilados únicos de 585 aminoácidos con una fórmula de peso molecular de 66.500. La secuencia de aminoácidos de HSA (SEC ID N°: 3) se ha descrito por ejemplo en Meloun, et al. (1975); Behrens, et al. (1975); Lawn, et al. (1981) y Minghetti, et al. (1986). Se ha descrito una variedad de variantes polimórficas asi como análogos y fragmentos de albúmina (véase Weitkamp, et al. (1973)). Por ejemplo, en los documentos EP0322094 y EP0399666 se divulgan varios fragmentos de albúmina sérica humana. Se entiende que las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención incluyen compuestos de Relaxina que comprende cualquier proteína de albúmina que incluye fragmentos, análogos, y derivados en los que tal proteína de fusión es biológicamente activa y tiene una semivida plasmática más larga que la correspondiente Relaxina tipo salvaje sola. En consecuencia, la porción de albúmina de la proteína de fusión no debe necesariamente tener una semivida plasmática igual a la de la albúmina humana nativa. Los fragmentos, análogos, y derivados son conocidos o se pueden generar los que tienen vidas medias más largas o tienen intermediario de semivida más larga al de la albúmina humana nativa y el compuesto de Relaxina de interés. Las técnicas son bien conocidas en la materia, véanse, por ejemplo, los documentos WO 93/15199, WO 93/15200, WO 01/77137 y EP0413622.
En una forma de realización de la invención el resto proteínico que prolonga la semivida tiene inmunogenicidad baja, es humano o humanizado. En una forma de realización preferente el resto proteínico que prolonga la semivida es humano, tal como Fe de transferrina humana (SEC ID N°: 2), albúmina sérica humana (SEC ID N°: 3), o lgG1 humana (SEC ID N°: 4).
Adicionalmente, otras proteínas, dominios de proteína o péptidos que aumentan la semivida biológica también se pueden usar como compañeros de fusión.
La prolongación de la semivida por medio de la fusión a albúmina sérica humana se divulga, por ejemplo en el documento W093/15199. La unión a albúmina como estrategia general para mejorar la farmacocinética de las proteínas se describe por ejemplo en Dennis et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, No 38, Issue of September 20, pp. 35035-35043. La prolongación de la semivida por medio de la fusión a la proteína de unión a albúmina sérica se divulga por ejemplo en el documento US20100104588. La prolongación de la semivida por medio de la fusión a albúmina sérica humana o proteínas de unión a IgG-Fc se divulga por ejemplo en el documento WO01/45746. Un ejemplo adicional de la extensión de la semivida por medio de la fusión a péptidos de unión a albúmina sérica humana se divulga en el documento WO2010/054699.
La prolongación de la semivida por medio de la fusión a un dominio Fe se divulga por ejemplo en el documento WO2001/058957.
La actividad biológica determina la orientación preferente de la proteína de interés a su asociado de fusión. Se incluyen las orientaciones C-terminal, así como N-terminal de los asociados de fusión. Además, para la mejora de la semivida biológica u otras funciones, se pueden modificar los asociados de fusión por fosforilación, sulfación, acrilación, glicosilación, deglicosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación u otras.
Los ejemplos de restos proteínicos que prolongan la semivida son transferrina, receptor de transferrina o al menos la porción de unión a transferrina de este, albúmina sérica, proteínas de unión a albúmina sérica, inmunoglobulinas, y el dominio Fe de una inmunoglobulina. Se prefieren los restos proteínicos humanos que prolongan la semivida, por ejemplo, transferrina humana, receptor de transferrina humana o al menos porción de unión a transferrina de este, albúmina sérica humana, inmunoglobulina humana o dominios Fe humanos.
En una forma de realización adicional los polipéptidos de fusión anteriormente mencionados que comprenden al menos un resto que prolonga la semivida tiene una semivida prolongada en comparación con la correspondiente Relaxina natural, siendo prolongación de la semivida al menos 5, 10, 20, 50, 100 o 500 veces. Preferentemente, la semivida se determina como semivida sérica, lo que significa la detección de la proteína de fusión en suero o sangre entera, por ejemplo, por el uso de un ensayo ELISA de cuantificación disponible en el comercio (por ejemplo R&D Systems, kit ELISA Relaxina-2 humana Quantikine, número de catálogo DRL200). La semivida preferentemente es una semivida sanguínea humana.
Clonación, sistemas de vector, expresión, huésped, y purificación La invención también proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión HEM-PCS-proRelaxina o proRelaxina-PCS-HEM de la invención. Este sistema de vector se une operativamente a una secuencia de expresión capaz de dirigir su expresión en una célula huésped.
Una célula huésped adecuada se puede seleccionar del grupo constituido por células bacterianas (tal como E. coli), células de levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae), células fúngicas, células vegetales, células de insecto y células animales. Las células animales incluyen, pero sin limitación, células HEK293, células CHO, células COS, células BHK, células HeLa y varias células de mamífero primarias. Los derivados de las células mamíferas tales como las células HEK293T también son aplicables.
Moléculas de ADN de la invención La presente invención también se refiere a las moléculas de ADN que codifican una proteína de fusión HEM-PCS-proRelaxina o proRelaxina-PCS-HEM de la invención.
Las moléculas de ADN de la invención no se limitan a las secuencias divulgadas en este documento, sino que también incluyen sus variantes. Las variantes de ADN dentro de la invención se pueden describir con referencia a sus propiedades físicas en la hibridación. Los trabajadores expertos reconocerán que el ADN se puede usar para identificar su complemento y, ya que el ADN es bicatenario, su equivalente u homólogo, mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. También se reconocerá que la hibridación puede producirse con menos de 100% de complementariedad. Sin embargo, dada la elección de condiciones, se pueden usar técnicas de hibridación para diferenciar entre las secuencias de ADN basadas en su parentesco estructural con una sonda particular. Para la orientación respecto a tales condiciones véase, Sambrook et al., 1989 supra y Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F.
M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley y Sons).
La semejanza estructural entre dos secuencias de polinucléotidos se puede expresar en función de la "rigurosidad" de las condiciones en las cuales las dos secuencias hibridarán entre sí. Como se usa en este documento, el término "rigurosidad" se refiere al grado en que las condiciones desfavorecen la hibridación. Las condiciones rigurosas desfavorecen fuertemente la hibridación, y solo las moléculas más estructuralmente relacionadas se hibridarán entre sí bajo tales condiciones. A la inversa, las condiciones no rigurosas favorecen la hibridación de moléculas que exhiben un menor grado de relación estructural. La rigurosidad de la hibridación, en consecuencia, se correlaciona directamente con la relación estructural de dos secuencias de ácidos nucleicos. Las siguientes relaciones son útiles para correlacionar la hibridación y el parentesco (donde Tm es la temperatura de fusión de un dúplex de ácido nucleico): a. Tm = 69,3 + 0,41 (G+C)% b. La Tm de un ADN dúplex disminuye en 1°C con cada aumento de 1% del número de pares de bases desapareadas. c. (Tm)M2 - (Tm) µ? = 18,5 logioM2/Ml donde µ1 y µ2 son las fuerzas iónicas de dos soluciones.
La rigurosidad de la hibridación es una función de muchos factores, que incluyen la concentración de ADN total, fuerza iónica, temperatura, tamaño de sonda y la presencia de agentes que alteran los enlaces de hidrógeno. Los factores que promueven la hibridación incluyen concentraciones de ADN totales, fuerzas iónicas altas, temperaturas bajas, tamaño de sonda más larga y la ausencia de agentes que alteran los enlaces de hidrógeno. La hibridación normalmente se realiza en dos fases: la fase de "unión" y la fase de "lavado".
Primero, en la fase de unión, la sonda se une al blanco en las condiciones que favorecen la hibridación. La rigurosidad usualmente se controla en esta etapa por la alteración de la temperatura. Para la rigurosidad alta, la temperatura está usualmente entre 65°C y 70°C, a menos que se usen sondas de oligonucleótidos cortos (< 20 nt). Una solución de hibridación representativa comprende 6X SSC, 0,5% de SDS, 5X solución de Denhardt y 100 pg de ADN vehículo no específico. Véase Ausubel et al., sección 2.9, suplemento 27 (1994). Obviamente, se conocen muchas condiciones de tampón diferentes, aún funcionalmente equivalentes. Cuando el grado de parentesco es menor, se puede elegir una temperatura más baja. Las temperaturas de unión de rigurosidad baja están entre aproximadamente 25°C y 40°C. La rigurosidad media está entre al menos aproximadamente 40°C a menos de aproximadamente 65°C. La rigurosidad alta es al menos aproximadamente 65°C.
Segundo, se elimina el exceso de sonda por lavado. En esta fase usualmente se aplican las condiciones más rigurosas. En consecuencia, esta etapa de "lavado" es la más importante para determinar el parentesco por medio de la hibridación. Las soluciones de lavado normalmente contienen concentraciones de sal más bajas. Un ejemplo de solución de rigurosidad media contiene 2X SSC y 0,1% de SDS. Una solución de lavado de alta rigurosidad contiene el equivalente (en fuerza iónica) de menos de aproximadamente 0,2X de SSC, una solución rigurosa preferente contiene aproximadamente 0,1X SSC. Las temperaturas asociadas con varias rigurosidades son las mismas que se describieron antes para la "unión". La solución de lavado normalmente se remplaza numerosas veces durante el lavado. Por ejemplo, las condiciones de lavado de rigurosidad alta comprenden el lavado dos veces durante 30 minutos a 55°C y tres veces durante 15 minutos a 60°C.
Una forma de realización de la invención es una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido de fusión de la invención.
Constructos y expresión de ADN recombinante La presente invención también proporciona constructos de ADN recombinante que comprenden una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Los constructos recombinantes de la presente invención se usan en relación con un vector, tal como un plásmido, fagémido, fago o vector viral, en el que se inserta una molécula de ADN que codifica un polipéptido de fusión de la invención.
Un polipéptido de fusión provisto en este documento se puede preparar por expresión recombinante de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de fusión en una célula huésped. Para expresar un polipéptido de fusión en forma recombinante, una célula huésped se puede transfectar en vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican un polipéptido de fusión de modo que el polipéptido de fusión se exprese en la célula huésped. Las metodologías de ADN recombinante estándares se usan para preparar y/u obtener ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de fusión, incorporar estos ácidos nucleicos en los vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en las células huésped, tales como las descritas en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en la Patente U.S. Núm. 4.816.397 por Boss et al.
Para expresar el polipéptido de fusión, se pueden usar procedimientos de expresión de ADN recombinante estándares (véase, por ejemplo, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Por ejemplo, el ADN que codifica el polipéptido deseado se puede insertar en un vector de expresión que posteriormente se transfecta en una célula huésped adecuada. Las células huésped adecuadas son células procarióticas y eucarióticas. Son ejemplos de células huésped procarióticas por ejemplo bacterias, ejemplos de células huésped eucarióticas levaduras, células de insecto o mamífero. Se entiende que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias regulatorias, está afectado por factores tales como la elección de la célula huésped, el nivel de expresión de la proteína deseada y si la expresión es constitutiva o inducible.
Expresión bacteriana Los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano se construyen por inserción de una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de iniciación y terminación de la traducción adecuadas en la fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es conveniente, proporcionar la amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphilococcus.
Los vectores bacterianos pueden ser, por ejemplo, basados en bacteriófagos, plásmidos o fagémidos. Estos vectores pueden contener un marcador seleccionable y origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles en el comercio que normalmente contienen elementos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y el cultivo de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se desreprime/induce con los medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un período adicional. Las células normalmente se recolectan por centrifugación, se alteran por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante se retiene para la purificación posterior.
En los sistemas bacterianos, numerosos vectores de expresión se pueden seleccionar de modo ventajoso de acuerdo con el uso deseado para la proteína que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de tal proteína pueden ser convenientes vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos del polipéptido de fusión que son fácilmente purificables. El polipéptido de fusión de la presente invención incluye los productos purificados, productos de procedimientos de síntesis química, y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótíco, que incluye, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphilococcus, preferentemente, de las células de E. coli.
Expresión en mamífero y purificación Las secuencias regulatorias preferentes para la expresión de la célula huésped mamífera incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en las células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), virus 40 Simio (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad LP)) y polioma. Para la descripción adicional de los elementos regulatorios virales, y sus secuencias, véase, por ejemplo, U.S. 5.168.062 por Stinski, U.S. 4.510.245 por Bell et al y U.S. 4.968.615 por Schaffner et al. Los vectores de expresión recombinantes también pueden incluir orígenes de replicación y marcadores seleccionabas (véase, por ejemplo, U.S. 4.399.216, 4.634.665 y U.S. 5.179.017, por Axel et al.). Los marcadores seleccionabas adecuados incluyen genes que confieren resistencia a fármacos tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en que se ha introducido el vector. Por ejemplo, el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) confiere resistencia al metotrexato y el gen neo confiere resistencia a G418.
La transfección del vector de expresión en una célula huésped se puede llevar a cabo usando técnicas estándares tal como electroporación, precipitación con fosfato de calcio, y DEAE-dextrano, lipofección o transfección mediada por policatión.
Las células huésped de mamíferos adecuadas para expresar los polipéptidos de fusión provistos en este documento incluyen las células de ovario de hámster chino (células CHO) (que incluyen células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 , células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En algunas formas de realización, el vector de expresión se diseña de modo que la proteína expresada se secreta en el medio de cultivo en que crecen las células huésped. La transfección/expresión transitoria de los anticuerpos por ejemplo se puede obtener siguiendo los protocolos de Durocher et al (2002) Nucl.Acids Res. Vol 30 e9. La transfección/expresión estable de anticuerpos por ejemplo, se puede obtener siguiendo los protocolos del sistema UCOE (T. Benton et al. (2002) Cytotechnology 38: 43-46).
El polipéptido de fusión se puede recuperar del medio de cultivo por medio de procedimientos de purificación estándares.
Un polipéptido de fusión de la invención se puede recuperar y purificar de los cultivos celulares recombinantes por procedimientos bien conocidos que incluyen, pero sin limitación, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de Proteína A, cromatografía de Proteína G, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfo-celulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") también se puede emplear para la purificación. Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por ejemplo, Capítulos 1 , 4, 6, 8, 9, 10, incorporado cada uno totalmente en este documento por referencia.
Los polipéptidos de fusión de la invención incluyen productos purificados o aislados, productos de procedimientos de síntesis química y productos obtenidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariótico, que incluye, por ejemplo, células de levaduras (por ejemplo Pichia), plantas superiores, insectos y mamíferos, preferentemente células de mamíferos. De acuerdo con el huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, el polipéptido de fusión de la presente invención puede estar glicosilado o no glicosilado, se prefiere glicosilado. Tales procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Sambrook, supra, Secciones 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20.
Uso terapéutico Una forma de realización de la invención es el uso de una composición farmacéutica o un polipéptido de fusión de la invención en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, enfermedades renales, pancreatitis, inflamación, cáncer, escleroderma, fibrosis pulmonar, renal y hepática.
Enfermedades cardiovasculares Los trastornos del sistema cardiovascular, o trastornos cardiovasculares, significan en el contexto de la presente invención por ejemplo los siguientes trastornos: hipertensión (presión arterial alta), trastornos vasculares periféricos y cardíacos, cardiopatía coronaria, angina de pecho estable e inestable, insuficiencia miocárdica, disfunción isquémica persistente ("miocardio hibernado"), disfunción posisquémica temporal ("miocardio atontado"), insuficiencia cardíaca, trastornos del flujo sanguíneo periférico, síndrome coronario agudo, insuficiencia cardíaca e infarto de miocardio.
En el contexto de la presente invención, el término insuficiencia cardíaca incluye las manifestaciones de insuficiencia cardíaca aguda y crónica, así como tipos más específicos o relacionados de enfermedad, tal como insuficiencia cardíaca aguda descompensada, insuficiencia ventricular derecha, insuficiencia ventricular izquierda, insuficiencia global, cardiomiopatía isquémica, cardiomiopatía dilatada, defectos cardíacos congénitos, defectos de la válvula cardíaca, insuficiencia cardíaca asociada con defectos de la válvula cardíaca, estenosis mitral, insuficiencia mitral, estenosis aórtica, insuficiencia aórtica, estenosis tricúspide, insuficiencia tricúspide, estenosis pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, defectos de la válvula cardíaca combinados, inflamación del miocardio (miocarditis), miocarditis crónica, miocarditis aguda, miocarditis viral, insuficiencia cardíaca diabética, cardiomiopatía alcohólica, trastornos de almacenamiento cardiaco e insuficiencia cardíaca diastólica y sistólica y fases agudas de insuficiencia cardíaca agravada.
Los compuestos de acuerdo con la invención también son adecuados para reducir el área del miocardio afectada por un infarto, y para la profilaxis de los infartos secundarios.
Los compuestos de acuerdo con la invención también son adecuados para la profilaxis y/o tratamiento de trastornos tromboembólicos, daño por reperfusión después de la isquemia, lesiones micro- y macrovasculares (vasculitis), trombosis arterial y venosa, edemas, isquemias tales como infarto de miocardio, accidente cerebrovascular y ataques isquémicos transitorios, para cardioprotección en relación con las operaciones de bypass arterial coronario (CABG), angioplastias coronarias transluminales percutáneas primarias (PTCA), PTCA después de la trombólisis, PTCA de rescate, trasplantes cardíacos y operaciones a corazón abierto, y para la protección de órganos en relación con los trasplantes, operaciones de bypass, exámenes de catéter y otros procedimientos quirúrgicos.
Otras áreas de indicación son, por ejemplo, la prevención y/o tratamiento de trastornos respiratorios, tales como, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (bronquitis crónica, COPD), asma, enfisema pulmonar, bronquiectasia, fibrosis quística (mucoviscidosis) e hipertensión pulmonar, en particular hipertensión arterial pulmonar.
Enfermedad renal La presente invención se refiere al uso de un polipéptido de fusión de la invención como medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de las enfermedades renales, en especial las enfermedades renales aguda y crónicas y las insuficiencias renales crónicas, así como la falla renal aguda y crónica, que incluye etapas aguda y crónicas de la falla renal con y sin requerimiento de diálisis, así como las enfermedades renales subyacentes o relacionadas tales como hipoperfusión renal, hipotensión inducida por diálisis, glomerulopatías, proteinuria glomerular y tubular, edema renal, hematuria, glomerulonefritis primarias, secundaria, así como aguda y crónica, glomerulonefritis membranosa y membranoproliferativa, síndrome Alport, glomerulosclerosis, enfermedades tubulares intersticiales, enfermedades nefropáticas, tales enfermedades renales primarias y congénitas, inflamación renal, enfermedades renales inmunológicas como rechazo al trasplante renal, enfermedades renales inducidas por el complejo inmune, así como enfermedades nefropáticas inducidas por intoxicación, enfermedades renales diabéticas y no diabéticas, pielonefritis, ríñones quísticos, nefrosclerosis, nefrosclerosis hipertensiva, síndrome nefrótico, que se caracteriza y se asocia diagnósticamente con una reducción anormal de la depuración de creatinina y/o excreción de agua, concentraciones sanguíneas aumentadas anormales de urea, nitrógeno, potasio y/o creatinina, alteración de la actividad de las enzimas renales, tales como glutamilsintetasas, osmolaridad urinaria y volumen urinario, aumento de microalbuminuria, macroalbuminuria, lesiones glomerulares y arteriolares, dilatación tubular, hiperfosfatemia y/o el requerimiento de diálisis.
Además, un polipéptido de fusión de la invención se puede usar como medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de los carcinomas renales, después de la resección incompleta del tumor del riñon, deshidratación después del uso excesivo de diuréticos, aumento de la presión arterial no controlada con hipertensión maligna, obstrucción e infección del aparato urinario, amiloidosis, así como enfermedades sistémicas asociadas con daño glomerular, tal como Lupus eritematoso, y enfermedades sistémicas inmunológicas reumáticas, así como estenosis arterial renal, trombosis arterial renal, trombosis de la vena renal, neuropatía inducida por analgésicos y acidosis tubular renal.
Además, un polipéptido de fusión de la invención se puede usar como medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de las enfermedades renales intersticiales aguda y crónica inducida por medio de contraste e inducida por fármacos, síndrome metabólico y dislipilemia.
Además, la presente invención incluye el uso de un polipéptido de fusión de la invención como medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de las secuelas asociadas con enfermedades renales aguda y/o crónica, tales como edema pulmonar, insuficiencia cardíaca, uremia, anemia, alteraciones electrolíticas (por ejemplo, hiperpotasemia, hiponatremia), así como metabolismo de hueso y carbohidratos.
Enfermedades pulmonares Además, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención también son adecuadas para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades pulmonares en especial de trastornos asmáticos, hipertensión arterial pulmonar (PAH) y otras formas de hipertensión pulmonar (PH) que incluyen hemicardiopatía izquierda, HIV, anemia drepanocítica, tromboembolismos (CTEPH), sarcoidosis, COPD o hipertensión pulmonar asociada a fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), síndrome disneico agudo (ARDS), lesión pulmonar aguda (ALI), deficiencia de alfa-1 -antitripsina (AATD), fibrosis pulmonar, enfisema pulmonar (por ejemplo enfisema pulmonar inducido por el humo de cigarrillo) y fibrosis quística (CF).
Trastornos fibróticos Las proteínas de fusión de acuerdo con la invención también son adecuadas para el tratamiento y/o profilaxis de los trastornos fibróticos de los órganos internos tales como, por ejemplo, el pulmón, el corazón, el riñon, la médula ósea y en particular el hígado, y también las fibrosis dermatológicas y trastornos oculares fibróticos. En el contexto de la presente invención, el término trastornos fibróticos incluye en particular los siguientes términos: fibrosis hepática, cirrosis hepática, fibrosis pulmonar, fibrosis endomiocárdica, nefropatía, glomerulonefritis, fibrosis renal intersticial, daño fibrótico resultante de la diabetes, fibrosis de médula ósea y trastornos fibróticos similares, escleroderma, morfea, queloides, cicatrización hipertrófica (también después de procedimientos quirúrgicos), nevos, retinopatía diabética, vitreorretinopatía proliferativa y trastornos del tejido conectivo (por ejemplo sarcoidosis).
Cáncer El cáncer es una enfermedad en que un grupo de células presenta crecimiento descontrolado. Los cánceres usualmente se clasifican en carcinomas que es un cáncer derivado de células epiteliales (Este grupo incluye muchos de los cánceres más comunes, que incluyen los de mama, próstata, pulmón y colon) sarcomas, que derivan del tejido conectivo, o células mesenquimáticas; linfoma y leucemia, derivados de las células hematopoyéticas; tumor de célula germinal, que deriva de células pluripotentes; y blastomas, que es un cáncer derivado de tejido "precursor" o embrionario inmaduro.
La presente invención también proporciona el uso de una proteína de fusión de la invención para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de trastornos, en particular los trastornos mencionados anteriormente.
La presente invención también proporciona un procedimiento para el tratamiento y/o prevención de trastornos, en particular los trastornos mencionados anteriormente, mediante una cantidad efectiva de al menos una proteína de fusión de la invención.
La presente invención también proporciona proteínas de fusión de la invención para usar en un procedimiento para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedad cardíaca coronaria, síndrome coronario agudo, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio.
Composiciones farmacéuticas y administración La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de Relaxina en un vehículo farmacológicamente aceptable. La proteína de fusión de Relaxina se puede administrar en forma sistémica o local. Se puede usar cualquier modo apropiado de administración conocido en la técnica que incluye, pero sin limitación, administración intravenosa, intraperitoneal, intraarterial, intranasal, por inhalación, oral, subcutánea, por inyección local o en la forma de un implante quirúrgico.
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que pueden comprender polipéptidos de fusión de la invención, solos o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que se puede administrar en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible y estéril, que incluye, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y agua. Cualquiera de estas moléculas se puede administrar a un paciente solo o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas, en composiciones farmacéuticas donde se mezcla con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una forma de realización de la presente invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable es farmacéuticamente inerte.
La presente invención también se refiere a la administración de composiciones farmacéuticas. Tal administración se lleva a cabo en forma oral o parenteral. Los procedimientos de administración parenteral incluyen administración tópica, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, o intranasal. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Detalles adicionales sobre técnicas para formulación y administración se pueden hallar en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).
Las composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden formular mediante vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas para la administración oral. Tales vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas como comprimidos, pastillas, cápsulas, grageas, líquidos, geles, jarabes, emulsiones, suspensiones y similares, para la ingestión por parte del paciente.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas del compuesto activo. Para inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución salina tamponada fisiológicamente. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetil celulosa sódica, sorbitol, o dextrano. En forma adicional, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Una proteína de fusión de acuerdo con la invención se puede usar sola o, si fuera necesario, en combinación con otros compuestos activos. La presente invención también proporciona medicamentos que comprenden al menos un polipéptido de fusión de acuerdo con la invención y uno o más ingredientes activos adicionales, en particular para el tratamiento y/o prevención de los trastornos mencionados anteriormente.
Los ingredientes activos adecuados para combinación son, a modo de ejemplo y como preferencia: ingredientes activos que modulan el metabolismo de los lípidos, anti-diabéticos, agentes hipotensivos, agentes potenciadores de la perfusión y/o antitrombóticos, antioxidantes, antagonistas de receptor de quimiocinas, inhibidores de p38-quinasa, agonistas de NPY, agonistas de orexina, anorexígenos, inhibidores de PAF-AH, antiflogísticos (inhibidores de COX, antagonistas de receptor de LTB4), analgésicos por ejemplo aspirina, antidepresivos y otros psicofármacos.
La presente invención se refiere en particular a combinaciones de al menos uno de los polipéptidos de fusión de acuerdo con la invención con al menos un ingrediente activo que altera el metabolismo lipídico, anti-diabético, ingrediente activo que reduce la presión arterial y/o agente que tiene efectos antitrombóticos.
Los polipéptidos de fusión de acuerdo con la invención preferentemente se pueden combinar con uno o más • ingredientes activos que modulan el metabolismo lipídico, a modo de ejemplo y a modo de preferencia del grupo de inhibidores de HMG-CoA reductasa, inhibidores de la expresión de HMG-CoA reductasa, inhibidores de la síntesis de escualeno, inhibidores de ACAT, inductores del receptor de LDL, inhibidores de la absorción de colesterol, adsorbentes de ácidos biliares poliméricos, inhibidores de la reabsorción de ácidos biliares, inhibidores de MTP, inhibidores de lipasa, activadores de LpL, fibratos, niacina, inhibidores de CETP, agonistas de PPAR-a, PPAR-? y/o PPAR-d, moduladores de RXR, moduladores de FXR, moduladores de LXR, hormonas tiropideas Y/o miméticos tiroideos, inhibidores de ATP citrato Nasa, antagonistas de Lp(a), antagonistas del receptor cannabinoide 1 , agonistas del receptor de leptina, agonistas del receptor de bombesina, agonistas del receptor de histamina y antioxidantes/depuradores de radicales; • antidiabéticos mencionados en el Vademécum alemán "Rote Liste" 2004/II, capítulo 12, y también, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, los del grupo de las sulfonilureas, biguanidas, derivados de meglitinida, inhibidores de glucosidasa, inhibidores de dipeptidil-peptidasa IV (inhibidores de DPP-IV), oxadiazolidinonas, tiazolidinodionas, agonistas del receptor de GLP 1 , antagonistas de glucagón, sensibilizadores de insulina, agonistas del receptor de CCK 1 , agonistas del receptor de leptina, inhibidores de enzimas hepáticas involucradas en la estimulación de gluconeogénesis y/o glugogenólisis, moduladores de la captación de glucosa y también agente de apertura del canal del calcio, tal como, por ejemplo, los desvelados en el documento WO 97/26265 y WO 99/03861 ; • ingredientes activos hipotensivos, a modo de ejemplo y a modo de preferencia del grupo de los antagonistas de calcio, antagonistas de angiotensina All, inhibidores de ACE, inhibidores de renina, bloqueantes del receptor beta, bloqueantes del receptor alfa, antagonistas de aldosterona, antagonistas del receptor nriineralocorticoide, inhibidores de ECE, inhibidores de ACE/NEP y los inhibidores de vasopeptidasa; y/o • agentes antitrombóticos, a modo de ejemplo y a modo de preferencia del grupo de los inhibidores de la agregación plaquetaria o los anticoagulantes; • diuréticos; • antagonistas del receptor de vasopresina; • nitratos orgánicos y dadores de NO; • compuestos con actividad inotrópica positiva; · compuestos que inhiben la degradación de guanosina monofosfato cíclico (cGMP) y/o adenosina monofosfato cíclico (AMPc), tal como, por ejemplo, inhibidores de fosfodiesterasas (PDE) 1 , 2, 3, 4 y/o 5, en particular inhibidores de PDE 5, tales como sildenafilo, vardenafilo y tadalafilo, y también inhibidores de PDE 3, tal como milrinona; · péptidos natriuréticos, tales como, por ejemplo, "péptido natriurético auricular" (ANP, anaritida), "péptido natriurético tipo B" o "péptido natriurético cerebral" (BNP, nesiritida), "péptido natriurético tipo C" (CNP) y también urodilatina; • agonistas del receptor de prostaciclina (receptor IP), tal como, a modo de ejemplo, iloprost, beraprost, cicaprost; · inhibidores del canal lf (canal funny), tal como, a modo de ejemplo, ivabradina; • sensibilizadores de calcio, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, levosimendan; • suplemento de potasio; · estimuladores de guanilato ciclasa independientes de NO, pero dependientes de hemo, tal como, en particular, los compuestos descritos en los documentos WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301 y WO 03/095451 ; • activadores de guanilato ciclasa independientes de NO y hemo, tal como, en particular, los compuestos descritos en los documentos WO 01/19355, WO 01/19776, WO 01/19778, WO 01/19780, WO 02/070462 y WO 02/070510; • inhibidores de la elastasa de los neutrófilos humanos (HNE), tal como, por ejemplo, sivelestat y DX-890 (Reltran); • compuestos que inhiben la cascada de transducción de señales, tal como, por ejemplo, inhibidores de tirosina quinasa, en particular sorafenib, imatinib, gefitinib y erlotinib; y/o • compuestos que modulan el metabolismo energético del corazón, tal como, por ejemplo, etomoxir, dicloroacetato, ranolazina y trimetazidina.
Los ingredientes activos modificadores del metabolismo de lípidos se entiende que significan, preferentemente, compuestos del grupo de los inhibidores de HMG-CoA reductasa, inhibidores de la síntesis de escualeno, inhibidores de ACAT, inhibidores de la absorción de colesterol, inhibidores de MTP, inhibidores de lipasa, hormonas tiroideas y/o miméticos tiroideos, agonistas del receptor de niacina, inhibidores de CETP, agonistas de PPAR- , agonistas de PPAR-?, agonistas de PPAR-d, adsorbentes de ácidos biliares poliméricos, inhibidores de la reabsorción de ácidos biliares, antioxidantes/depuradores de radicales y también los antagonistas del receptor cannabinoide.
En una forma de realización preferente de la invención, un polipéptido de fusión de acuerdo con la invención se administra en combinación con un inhibidor de HMG-CoA reductasa de la clase de estatinas, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, lovastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, rosuvastatina o pitavastatina.
En una forma de realización preferente de la invención, los polipéptidos de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de la síntesis de escualeno, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, BMS-188494 o TAK-475.
En una forma de realización preferente de la invención, los polipéptidos de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de ACAT, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, avasimibe, melinamida, pactimibe, eflucimibe o SMP-797.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de la síntesis de colesterol, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, ezetimibe, tiquesida o pamaquesida.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de MTP, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, implitapida, BMS-201038, R-103757 o JTT-130.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de lipasa, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, orlistat.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con una hormona tiroidea y/o mimético tiroideo, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, D-tiroxina o 3,5,3'-triyodotironina (T3).
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un agonista del receptor de niacina, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, niacina, acipimox, acifran o radecol.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de CETP tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, dalcetrapib, BAY 60-5521 , anacetrapib o vacuna CETP (CETi-1).
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un agonista de PPAR-?, por ejemplo de la clase de las tiazolidinodionas, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, pioglitazona o rosiglitazona.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un agonista de PPAR-d, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, GW-501516 o BAY 68-5042.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un adsorbente de ácidos biliares poliméricos, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, colestiramina, colestipol, colesolvam, CholestaGel o colestimida.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de la reabsorción de ácidos biliares, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, inhibidores de ASBT (= IBAT), tal como, por ejemplo, AZD-7806, S-8921 , AK-105, BARI-1741 , SC-435 o SC-635.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un antioxidante/depurador de radicales, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, probucol, AGI-1067, BO-653 o AEOL-10150.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un antagonista del receptor cannabinoide 1 , tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, rimonabant o SR-147778.
Se entiende que antidiabéticos significa, preferentemente, insulina y derivados de insulina, y también ingredientes activos hipoglucémicos efectivos por vía oral. En este documento, la insulina y derivados de insulina incluyen las insulinas de origen animal, humano o biotecnológico y también sus mezclas. Los ingredientes activos hipoglucémicos efectivos por vía oral preferentemente incluyen sulfonilureas, biguanidas, derivados de meglitinida, inhibidores de glucosidasa y agonistas de PPAR-gamma.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con insulina.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con una sulfonilurea, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, tolbutamida, glibenclamida, glimepirida, glipizida o gliclazida.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con una biguanida, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, metformina.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un derivado de meglitinida, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, repaglinida o nateglinida.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de glucosidasa, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, miglitol o acarbosa.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de DPP-IV, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, sitagliptina y vildagliptina.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un agonista de PPAR-gamma, por ejemplo de la clase de las tiazolinodionas, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, pioglitazona o rosiglitazona.
Preferentemente se entiende que los agentes hipotensivos significan compuestos del grupo de antagonistas de calcio, antagonistas de angiotensina All, inhibidores de ACE, bloqueantes del receptor beta, bloqueantes del receptor alfa y diuréticos.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un antagonista de calcio, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, nifedipino, amlodipino, verapamilo o diltiazem.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un antagonista de angiotensina All, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, losarían, valsarían, candesartan, embusartan, olmesartan o telmisartan.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de ACE, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, enalapril, captopril, lisinopril, ramipril, delapril, fosinopril, quinopril, perindopril o trandopril.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un bloqueante de receptor beta, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, propranolol, atenolol, timolol, pindolol, alprenolol, oxprenolol, penbutolol, bupranolol, metipranolol, nadolol, mepindolol, carazalol, sotalol, metoprolol, betaxolol, celiprolol, bisoprolol, carteolol, esmolol, labetalol, carvedilol, adaprolol, landiolol, nebivolol, epanolol o bucindolol.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un bloqueante de receptor alfa, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, prazosina.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un diurético, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, furosemida, bumetanida, torsemida, bendroflumetiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, metilclotiazida, politiazida, triclorometiazida, clorotalidona, indapamida, metolazona, quinetazona, acetazolamida, diclorofenamida, metazolamida, glicerol, isosorbida, manitol, amilorida o triamtereno.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión ¦ de acuerdo con la invención se administran en combinación con un antagonista del receptor de aldosterona o mineralocorticoide, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, espironolactona o eplerenona.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un antagonista del receptor de vasopresina, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, conivaptan, tolvaptan, lixivaptan o SR-121463.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un nitrato orgánico o dador de NO, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, nitroprusiato sódico, nitroglicerol, mononitrato isosorbida, dinitrato isosorbida, molsidomin o SIN-1 , o en combinación con NO inhalatorio.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un compuesto inotrópico positivo, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, glicósidos cardíacos (digoxina), agonistas beta-adrenérgicos y dopaminérgicos, tal como isoproterenol, adrenalina, noradrenalina, dopamina o dobutamina.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con antisimpaticotónicos, tal como reserpina, clonidina o alfa-metildopa, o en combinación con agonistas del canal de potasio, tal como minoxidilo, diazoxida, dihidralazina o hidralazina, o con sustancias que liberan óxido de nitrógeno, tal como nitrato de glicerol o nitroprusiato sódico.
Se entiende que antitrombóticos significan, preferentemente, compuestos del grupo de inhibidores de la agregación plaquetaria o los anticoagulantes.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de la agregación plaquetaria, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, aspirina, clopidogrel, ticlopidina o dipiridamol.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor de trombina, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, ximelagatran, melagatran, dabigatran, bivalirudina o clexano.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un antagonista de GPIIb/llla, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, tirofiban o abciximab.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un inhibidor del factor Xa, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, rivaroxaban (BAY 59-7939), DU-176b, apixaban, otamixaban, fidexaban, razaxaban, fondaparinux, idraparinux, PMD-3112, YM-150, KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021 , DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 o SSR-128428, con la condición de el PCS no sea un sitio de escisión de factor Xa.
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con heparina o un derivado de heparina de peso molecular bajo (LMW).
En una forma de realización preferente de la invención, las proteínas de fusión de acuerdo con la invención se administran en combinación con un antagonista de la vitamina K, tal como, a modo de ejemplo y a modo de preferencia, cumarina.
En el contexto de la presente invención, se da particular preferencia a las combinaciones que comprenden al menos una de las proteínas de fusión de acuerdo con la invención y también uno o más ingredientes activos adicionales seleccionados del grupo constituido por en inhibidores de HMG-CoA reductasa (estatinas), diuréticos, bloqueantes del receptor beta, nitratos orgánicos y dadores de NO, inhibidores de ACE, antagonistas de angiotensina All, antagonistas del receptor de aldosterona y mineralocorticoide, antagonistas del receptor de vasopresina, inhibidores de la agregación plaquetaria y anticoagulantes, y también su uso para el tratamiento y/o prevención de los trastornos mencionados anteriormente.
La presente invención también proporciona medicamentos que comprenden al menos una proteína de fusión de acuerdo con la invención, usualmente junto con uno o más coadyuvantes farmacéuticamente no tóxicos e inertes adecuados y también su uso para los fines mencionados anteriormente.
Dosis terapéuticamente efectiva Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para obtener el fin deseado, por ejemplo insuficiencia cardíaca. La determinación de una dosis efectiva está bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente en ensayos in vitro, por ejemplo activación del receptor LGR7, ex vivo en corazones de rata perfundidos aislados, o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal también se usa para obtener un intervalo de concentración y vía de administración convenientes. Tal información luego se puede usar para determinar dosis y vías útiles para la administración en los seres humanos.
Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de proteína de fusión que mejora los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de tales compuestos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándares in vitro o animales experimentales, por ejemplo, la DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) y DL50 (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéutico y tóxico es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación, DE50/DL50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de los ensayos in vitro y estudios en animales se usan para formular un intervalo de dosis para uso humano. La dosis de tales compuestos se halla preferentemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis varía en este rango de acuerdo con la forma de dosis empleada, sensibilidad del paciente, y la vía de administración.
Las cantidades de dosis normales pueden variar de 0,1 a 100.000 miligramos de dosis total, de acuerdo con la vía de administración. Las pautas en cuanto a dosis y procedimientos de administración particulares se proporcionan en la bibliografía. VéaNse las Patentes U.S. Núm. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Los expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para los polinucléotidos que para las proteínas o sus inhibidores. De modo similar, la administración de polinucléotidos o polipéptidos será específica para las células, condiciones, localizaciones, etc. particulares.
La presente invención también se describe con los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención con referencia a las formas de realización específicas. Estas ejemplificaciones, si bien ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no representan limitaciones ni circunscriben el alcance de la invención divulgada.
Todos los ejemplos se realizaron usando técnicas estándares, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la técnica, excepto cuando se describen de otro modo en detalle. Las técnicas de biología molecular de rutina de los siguientes ejemplos se pueden llevar a cabo como se describe en los manuales de laboratorio estándares, tal como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Las formas de realización más preferentes son: 1. Una proteína de fusión que comprende Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina, en la que la Relaxina comprende un polipéptido de la cadena A de Relaxina o una variante funcional de la misma, y un polipéptido de la cadena B de Relaxina o una variante funcional de la misma, PCS comprende un sitio de escisión de endo-proteasa, y HEM es un resto proteínico que prolonga la semivida. 2. Un polipéptido de fusión que comprende proRelaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-proRelaxina, en el que la proRelaxina comprende un polipéptido de la cadena A de Relaxina o una variante funcional de la misma, un polipéptido de la cadena de Relaxina C y un polipéptido de la cadena B de Relaxina o una variante funcional de la misma, PCS comprende un sitio de escisión de endo-proteasa, y HEM es un resto proteínico que prolonga la semivida. 3. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con los puntos 1 o 2, en la que el PCS es un sitio de escisión de una endo-proteasa extracelular. 4. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con el punto 3, en los que la endo-proteasa es una endo-proteasa endógena. 5. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con los números 3 o 4, en los que la endo-proteasa es una endo-proteasa expresada en corazón, hígado, riñon o pulmón. 6. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con el punto 3, en los que la endo-proteasa es una proteasa unida a membrana o acoplada a membrana que tiene su actividad catalítica sobre la parte extracelular de la membrana. 7. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 6, en los que la endo-proteasa se selecciona del grupo de endoproteasas representadas en la tabla 1. 8. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 6, en los que el PCS se selecciona del grupo de PCS representados por la tabla 1. 9. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos 3 - 8, en los que la endo-proteasa se selecciona del grupo constituido por factor Xa, Tripsina, MMP2, MMP9, MMP12, Renina, Elastasa y Quimasa. 10. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos 3 - 9, en los que la endo-proteasa es humana. 11. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 - 10, en los que el PCS tiene una secuencia comprendida en un grupo de secuencias constituido por lleGluGIyArgMetAsp (sitio de escisión FXa), RAKRFASL (sitio de escisión MMP9),INARVSTI (sitio de escisión de Tripsina), RVGFYESD (sitio de escisión de Quimasa) y GLRVGFYE (sitio de escisión de Elastasa). 12. Una proteína o polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 - 11 , en los que el PCS tiene un polipéptido estirador en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal. 13. Un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, en el que los restos proteínicos que prolongan la semivida están comprendidos en un grupo de restos proteínicos que prolongan la semivida constituido por el dominio Fe de inmunoglobulina, albúmina sérica, transferrina y proteína de unión a albúmina sérica. 14. Un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, en el que el resto proteínico que prolonga la semivida es un dominio Fe de lgGl 15. Un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, en el que el resto proteínico que prolonga la semivida es humano. 16. Un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, en el que la cadena A de Relaxina es la cadena de Relaxina 2 A humana y la cadena B de Relaxina es la cadena de Relaxina 2 B humana. 17. Un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, siendo el polipéptido de fusión proRelaxina-PCS-HEM. 18. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de los puntos precedentes, en el que el polipéptido de fusión es Relaxina-PCS-HEM. 19. Un polinucléotido que codifica un polipéptido de fusión de proRelaxina- PCS-HEM o HEM-PCS-proRelaxina de acuerdo con cualquiera de los puntos 2 -18. 20. Un vector que comprende un polinucléotido de acuerdo con el punto 19. 21. Una célula huésped que comprende un vector de acuerdo con el punto 20 o un polinucléotido de acuerdo con el punto 17. 22. Un procedimiento de producción de una proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de acuerdo con una cualquiera de los puntos 1 - 18 que comprende las etapas de cultivar una célula huésped del punto 21 que además comprende una actividad de prohormona convertasa y aislar la proteína. 23. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de Relaxina- PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 - 18. 24. Una composición farmacéutica de acuerdo con el punto 23 o una proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 - 18 como medicamento. 25. Una composición farmacéutica de acuerdo con el punto 23 o 24 o una proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de acuerdo con una cualquiera de los puntos 1 - 18 como medicamento para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar, trastorno fibrótico o enfermedad renal. 26. Un procedimiento de tratamiento de una enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar, trastorno fibrótico o enfermedad renal que comprende la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de acuerdo con el punto 23 y 24 o a proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 - 18. 27. Un tratamiento de acuerdo con los números 25 o 26, en el que la enfermedad cardiovascular está comprendida en el grupo de enfermedades cardiovasculares constituido por enfermedad cardíaca coronaria, síndrome coronario agudo, insuficiencia cardíaca, o infarto de miocardio.
Ejemplos Protocolos experimentales Construcción de proteínas de fusión Relaxina-Fc: Las secuencias ADNc de las variantes de Relaxina se generaron por síntesis química del gen. Los genes sintetizados se subclonaron en el vector de expresión de mamífero pCEP4 (Invitrogen, número de catálogo V044-50). Como secuencia líder señal para la secreción correcta de la proteína resultante, se usaron la secuencia líder de la proteína relacionada con el receptor de LDL (LRP, composición de aminoácidos MLTPPLLLLLPLLSALVAA) o de CD33 (composición de aminoácidos MPLLLLLPLLWAGALA). Para la subclonación de los constructos sintetizados se usaron las enzimas de restricción Hindlll y BamH1 de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Para aumentar la semivida plasmática, la parte Fe de la lgG1 humana se combinó con la Relaxina 2 humana por síntesis génica sobre base química. La parte carboxi-terminal de la Relaxina 2 humana (de acuerdo con su organización genómica dispuesta de la siguiente manera: cadena B - cadena C - cadena A) se fusionó al extremo N-terminal del resto Fe de la lgG1 humana, con lo cual estas dos partes de la proteína de fusión se conectaron con una secuencia ligadora de 6 aminoácidos de largo constituida por un polipéptido con la secuencia HeGluGIyArgMetAsp que codifica el sitio de escisión del factor de coagulación Xa.
La fusión de proRelaxina-Fc tiene la siguiente secuencia (proteína: SEC ID N°: 1 : secuencia de nucleótidos: SEC ID N°: 17): cadena B SW EEVIKLCGRELVRAQIAI CGMETTWSkrslsqedapqtprpvaewpsfi^ eefkklirnrqseaadsspselkylgldt s KSLSLSPGK cadena A dominio Fe La secuencia de la cadena C, que es escindida por la pro-hormona convertasa, está indicada en letras pequeñas. El sitio de escisión FXa está marcado en negrita, con letras subrayadas.
Otra opción para aumentar la semivida biológica de polipéptidos son las fusiones con los polipéptidos tipo Transferrina (número de referencia P02787) o Albúmina (número de referencia P02768). (SR Schmid (2009)).
Otra opción es el uso de otros sitios de escisión de proteasa que el de FXa, por ejemplo, los sitios de escisión expuestos en la tabla 1.
El constructo Relaxina-Fusión 1 que exhibe un sitio de escisión MMP9 tiene la SEC ID N°: 13 (polipéptido) y la secuencia de nucleótidos SEC ID N°. 29.
El constructo Relaxina-Fusión 2 que exhibe un sitio de escisión de Quimasa tiene la SEC ID N°: 14 (polipéptido) y la secuencia de nucleótidos SEC ID N°. 30.
El constructo Relaxina-Fusión 3 que exhibe un sitio de escisión de Tripsina tiene la SEC ID N°: 15 (polipéptido) y la secuencia de nucleótidos SEC ID N°. 31.
El constructo Relaxina-Fusión 4 que exhibe un sitio de escisión de Elastasa tiene la SEC ID N°: 16 (polipéptido) y la secuencia de nucleótidos SEC ID N°. 32.
Expresión de las proteínas de fusión de Relaxina-Fc: Para la expresión en pequeña escala (hasta 2 mililitros de volumen de cultivo) las células HEK293 (ATCC, número de catálogo CRL-1573) se transfectaron en forma transitoria con el plásmido de expresión que codifica el constructo de fusión de Relaxina-Fc por medio del reactivo de transfección Lipofectamine2000 (Invitrogen, número de catálogo 11668-019) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el procesamiento correcto de la Relaxina, las células se co-transfectaron con un vector de expresión que codifica la Prohormona Convertasa 1 humana (número de acceso NP_000430.3). Las células se cultivaron en D-Mem F12 (Gibco, #31330), 1% de Penicilina-estreptomicina (Gibco, #15140) y 10% de suero de carnero fetal (FCS, Gibco, #11058) en un incubador humidificado a 5% de dióxido de carbono a 37°C.
Tres a cinco días después de la transfección, se analizó el medio acondicionado de las células transfectadas para determinar la actividad por medio de la línea celular CHO-CRE-GR7 transfectada en forma estable.
Para la expresión en gran escala (10 mililitros de volumen de cultivo y más) los constructos se expresaron en forma transitoria en células de mamífero descritas en Tom et al., 2007. En breves palabras, el plásmido de expresión se transfectó en las células HEK293-6E y se incubó en matraces Fernbach o Wave-Bags. La expresión fue a 37°C durante 5 a 6 días en medio F17 (Invitrogen). Se añadieron suplemento de 5 g/l de triptona TN1 (Organotechnie), 1% de Ultra-Low IgG FCS (Invitrogen) y 0,5 mM de ácido valproico (Sigma) después de la transfección.
Purificación de proteína de fusión de Relaxina-Fc: Los constructos de fusión de Relaxina-Fc se purifican de los sobrenadantes del cultivo de células de mamífero. Los sobrenadantes primero se clarifican de los desechos celulares por centrifugación. Las proteínas se purifican por cromatografía de afinidad de Proteína A (MabSelect Sure, GE Healthcare) seguido por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). En consecuencia, el sobrenadante se aplica a una columna de Proteína A previamente equilibrada en PBS pH 7.4 (Sigma /Aldrich), los contaminantes se eliminan con 10 volúmenes de columna de PBS pH 7,4 + NaCI 500 mM. Los constructos de fusión de Relaxina-Fc se eluyen con acetato de Na 50 mM pH 3,5 + NaCI 500 mM y se purifican adicionalmente por SEC en una columna Superdex 200 en PBS pH 7,4.
Cuantificación de proteínas de fusión de Relaxina-Fc expresadas: Para la cuantificación de las variantes de Relaxina secretadas y purificadas, se usó el kit ELISA de cuantificación disponible en el comercio (R&D Systems, kit ELISA Relaxina-2 Quantikine, número de catálogo DRL200) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Además en algunos constructos, las proteínas se cuantificaron por medio de FC-ELISA. En el ELISA Fe, placas de microtitulación de 96 pocilios (Nunc, Maxi Sorp negra, número de catálogo 460918) se cubrieron con anticuerpo anti-Fc (SigmaAldrich, número de catálogo A2136) durante la noche a 4°C y una concentración de 5 pg por mililitro. Las placas se lavaron una vez por medio de 50 microlitros por pocilio de un buffer que consiste en tampón PBS y 0,05% de Tween 20 (SigmaAldrich, número de catálogo 63158). Se añadieron treinta microlitros de un tampón de bloqueo (Candor Bioscience, número de catálogo 113500) y la placa se incubó durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron 3 veces por medio de 50 microlitros por pocilio del tampón PBS/0,05% de Tween 20. Se añadieron las muestras y las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C. Si es necesario, las muestras se deben diluir por el uso del tampón de bloqueo mencionado anteriormente. Después de la incubación, las placas se lavaron 3 veces por medio de 50 microlitros por pocilio del tampón PBS/0,05% de Tween 20.
Para la detección, se añadieron 30 microlitros de Anti-h-Fc-POD (SigmaAldrich, número de catálogo A0170) diluido 1 :10000 en 10% de solución tampón de bloqueo y se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación, las placas se lavaron 3 veces por medio de 50 microlitros por pocilios de la solución tampón PBS/0,05% de Tween 20. Se añadieron treinta microlitros de sustrato BM Blue POD (Roche Diagnostics, número de catálogo 11484281001 ) y después de cinco minutos de incubación, la reacción se detuvo por la adición de una solución de ácido sulfúrico 1 molar. Se midió la absorción mediante el lector Tecan Infinite 500, modo de absorbancia, extinción 450 nm, emisión 690 nm.
Ensayo de actividad: Se transfectaron células CHO K1 (ATCC, número de catálogo CCL-61) en forma estable con el constructo del gel indicador de luciferasa como elemento de respuesta a AMP cíclico (CRE) (Biomyx Technology, pHTS-CRE, número de catálogo P2100) que produce en una línea celular CHO-CRE-Luciferasa.
Esta línea celular posteriormente se transfectó en forma estable con el receptor LGR7/RXFP1 humano (número de acceso NM_021634.2), clonado como el fragmento de ADN de 2271 pares de base de largo en el vector de expresión de mamífero pcADN3.1 (-) (Invitrogen, número de catálogo V79520), que produce la línea celular CHO-CRE-LGR7. Esta línea celular se cultivó en D-Mem F12 (Gibco, #31330) 2 mM de Glutamax (Gibco, #35050), 100 nM de piruvato (Gibco, # 11360-070), 20 mM de Hepes (Gibco, # 15630), 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, #15140) y 10% de suero de carnero fetal (FCS, Gibco, #11058).
Para la estimulación, el medio se cambió por OptiMem (Gibco, #11058) + 1% de FCS que contiene diferentes concentraciones de las proteínas de fusión Relaxina-Fc expresadas en forma recombinante (usualmente a partir de una concentración de 100 nM, seguido por diluciones 1 :2). Como control positivo, se usó Relaxina 2 humana expresada en forma recombinante disponible en el comercio (R&D Systems, número de catálogo 6586-RN-025). Posteriormente, las células se incubaron durante 6 horas en un incubador humidificado a 5% de dióxido de carbono a 37°C. Después de 6 horas las células se analizaron para determinar la actividad de Luciferasa por medio de un sistema de ensayo de Luciferasa (Promega, # E1500) y mediante el uso del lector Tecan Infinite 500, modo de luminiscencia, tiempo de integración de 1000 milisegundos, tiempo de medición de 30 segundos.
Se usaron unidades de luminiscencia relativa para determinar valores de CE50 de las diferentes moléculas por medio del programa de computación Graph Pad Prism Versión 5.
Para el análisis de actividad alternativo de la Relaxina así como de los polipéptidos de fusión de la invención, las líneas celulares (por ejemplo THP1 , ATCC número de catálogo TIB-202) o células primarias (por ejemplo Celprogen Inc., Human Cardiomyocyte Cell Culture, número de catálogo 36044-15) con expresión endógena del receptor LGR7. Estas células se cultivan de acuerdo con las instrucciones de fabricación.
Los procedimientos para la detección de generación de AMPc inducida por Relaxina o proteínas de fusión de Relaxina-Fc que indujeron son conocidos en la técnica. Por ejemplo, tal medición se realiza por medio de un ELISA de AMPc (por ejemplo IBL International GmbH, AMPc ELISA, número de catálogo CM 581001) de acuerdo con las instrucciones de fabricación.
Los procedimientos para la detección de la activación de PI3 quinasa inducida por Relaxina o proteínas de fusión de Relaxina-Fc son conocidos en la técnica. Por ejemplo, tal medición se realiza por medio de un ensayo de PI3-quinasa HTRF de acuerdo con las instrucciones de fabricación (por ejemplo Millipore, PI3-Kinase HTRF Assay, número de catálogo 33-016).
Tratamiento con proteasa de las proteínas de fusión de Relaxina-Fc y análisis de actividad Los sobrenadantes de las células HEK293 que expresan las Proteínas de fusión de Relaxina se incuban con las correspondientes proteasas como se indica a continuación: 2 mi de sobrenadante de células HEK293 que expresan Relaxina-Fc se incubaron con 1 pg de proteasa del Factor Xa (New England Biolabs, número de catálogo P8010) durante 6 horas a 23°C 2 mi de sobrenadante de células HEK293 que expresan Relaxina-Fusión 2 se incubaron a una concentración de 0,83 pg/ml de Quimasa (Sigma Aldrich, número de catálogo C8118) durante 6 horas a 37°C. 2 mi de sobrenadante de células HEK293 que expresan Relaxina-Fusión 3 se incubaron a una concentración de 10 pg/ml de Tripsina (Sigma Aldrich, número de catálogo T0303) durante 6 horas a 37°C. 2 mi de sobrenadante de células HEK293 que expresan Relaxina-Fusión 4 se incubaron a una concentración de 5 pg/ml de Elastasa (Sigma Aldrich, número de catálogo E7885) durante 6 horas a 37°C.
Antes del uso, MMP9 (R&D Systems, número de catálogo 911-MP) se debe activar por la incubación de la proteasa con APMA (acetato p-aminofenilmercúrico; Sigma Aldrich, número de catálogo A-9563). Para esto, MMP9 se debe diluir en solución tampón de ensayo (50mM de Tris, 10 mM de CaCI2, 150 mM de NaCI2, 0,05% de Brij35, pH 7,5) a una concentración de 100 pg/ml (por ejemplo 1 pg en un volumen final de 100 µ?). Se añade APMA a una concentración final de 1 mM (por ejemplo 20 pl de a 5 mM de solución patrón en un volumen final de 100 µ?). Esta mezcla se incuba durante 24 horas a 37°C. Después, el MMP9 activado se diluye en 2 mi de sobrenadante de las células HEK293 que expresan la Relaxina-Fusión 1 a una concentración final de 0,4 ng/ml, los sobrenadantes se incubaron con el MMP9 activado durante 6 horas a 37°C.
Los sobrenadantes de las células HEK293 que expresan la proteína de fusión Relaxina-Fc se analizaron en cuanto a la actividad por medio de la línea celular CHO-CRE-LGR7 como se describió anteriormente. Como control positivo, se usó Relaxina 2 humana.
En la proteína de fusión Relaxina-Fc, no se detectó actividad. En contraste, después de la incubación con FXa del sobrenadante que contiene proteína de fusión de Relaxina-Fc, se observó activación significativa de la línea celular CHO-CRE-LGR7. Si bien esta actividad fue menor que la actividad obtenida para el control positivo de Relaxina 2 humana, se demuestra que con el empleo de un PCS, se generó una molécula de Relaxina activa liberable.
El uso de Proteínas de fusión de Relaxina no purificadas es una posible explicación de la actividad ligeramente menor ya que las posibles impurezas de la muestra llevan a la determinación falsa de la concentración o pueden tener un impacto negativo sobre la exactitud del ensayo de luciferasa basado en células.
El uso de sobrenadantes de células HEK293 transfectados con el vector de expresión vacío lleva a una reducción en el ensayo de actividad en un factor de aproximadamente 3. Otra explicación podría ser la escisión incompleta de las Proteínas de fusión de Relaxina que producen una mezcla de Relaxina activa escindida y funcional y Proteínas de fusión de Relaxina inactivas.
Ejemplo 1 : Relaxina-Fc Para aumentar la semivida biológica la parte Fe de la lgG1 humana se combinó con Relaxina 2 humana por síntesis génica sobre base química. La parte carboxi-terminal de la Relaxina 2 humana (de acuerdo con su organización genómica dispuesta de la siguiente manera: cadena B - cadena C - cadena A) se fusionó al extremo N-terminal del resto Fe de la lgG1 humana, con lo cual estas dos partes de la proteína de fusión se conectaron con una secuencia ligadora de 6 aminoácidos de largo constituida por un polipéptido con la secuencia NeGluGIyArgMetAsp que codifica el sitio de escisión del factor de coagulación Xa. La Relaxina solo muestra actividad detectable por medio de la línea celular CHO-CRE-LGR7 después de incubar el constructo con la proteasa FXa como se describió anteriormente.
Ejemplo 2: Relaxina-Fusión 1 Para aumentar la semivida biológica la parte Fe de la lgG1 humana se combinó con Relaxina 2 humana por síntesis génica sobre base química. La parte carboxi-terminal de Relaxina 2 humana (de acuerdo con su organización genómica dispuesta de la siguiente manera: cadena B - cadena C - cadena A) se fusionó al extremo N-terminal del resto Fe de la lgG1 humana, con lo cual estas dos partes de la proteína de fusión se conectaron con una secuencia ligadora de 6 aminoácidos de largo constituida por un polipéptido con la secuencia ArgAlaLysArgPheAlaSerLeu que codifica el sitio de escisión de la proteasa MMP9. La Relaxina solo muestra actividad detectable por medio de la línea celular CHO-CRE-LGR7 después de incubar el constructo con la proteasa MMP9 descrita anteriormente.
Ejemplo 3: Relaxina-Fusión 2 Para aumentar la semivida biológica la parte Fe de la lgG1 humana se combinó con Relaxina 2 humana por síntesis génica sobre base química. La parte carboxi-terminal de Relaxina 2 humana (de acuerdo con su organización genómica dispuesta de la siguiente manera: cadena B - cadena C - cadena A) se fusionó al extremo N-terminal del resto Fe de la lgG1 humana, con lo cual estas dos partes de la proteína de fusión se conectaron con una secuencia ligadora de 6 aminoácidos de largo constituida por un polipéptido con la secuencia ArgValGIyPheTyrGIuSerAsp que codifica el sitio de escisión de la proteasa Quimasa. La Relaxina solo muestra actividad detectable por el uso de la línea celular CHO-CRE-LGR7 después de incubar el constructo con la proteasa Quimasa descrita anteriormente. Los valores de señal bajos obtenidos en el experimento de Quimasa se puede deber a la escisión del receptor LGR7 expresado por el análisis de la línea celular por la proteasa Quimasa añadida. Los expertos en la técnica saben cómo eliminar o reducir la actividad de Quimasa en el sistema de ensayo (por ejemplo, uso de inhibidores de proteasa específicos). No obstante, estos datos demuestran que la Relaxina funcional se puede liberar de la proteína de fusión.
Ejemplo 4: Relaxina-Fusión 3 Para aumentar la semivida biológica la parte Fe de la lgG1 humana se combinó con Relaxina 2 humana por síntesis génica sobre base química. La parte carboxi-terminal de Relaxina 2 humana (de acuerdo con su organización genómica dispuesta de la siguiente manera: cadena B - cadena C - cadena A) se fusionó al extremo N-terminal del resto Fe de la lgG1 humana, con lo cual estas dos partes de la proteína de fusión se conectaron con una secuencia ligadora de 6 aminoácidos de largo constituida por un polipéptido con la secuencia MeAsnAlaArgValSerThrlIe que codifica el sitio de escisión de la proteasa Tripsina. La Relaxina solo muestra actividad significativa después de incubar el sobrenadante con Tripsina como se describió anteriormente. El sobrenadante no incubado muestra actividad menor, posiblemente debido a los contaminantes de proteasa en el sobrenadante del cultivo celular, que reconoce similares sitios de escisión que la tripsina.
Ejemplo 5: Relaxina-Fusión 4 Para aumentar la semivida biológica la parte Fe de la lgG1 humana se combinó con Relaxina 2 humana por síntesis génica sobre base química. La parte carboxi-terminal de Relaxina 2 humana (de acuerdo con su organización genómica dispuesta de la siguiente manera: cadena B - cadena C - cadena A) se fusionó al extremo N-terminal del resto Fe de la lgG1 humana, con lo cual estas dos partes de la proteína de fusión se conectaron con una secuencia ligadora de 6 aminoácidos de largo constituida por un polipéptido con la secuencia GliLeuArgValGIyPheTyrGIu que codifica el sitio de escisión de la proteasa Elastasa. La Relaxina solo muestra actividad detectable por medio de la línea celular CHO-CRE-LGR7 después de incubar el constructo con la proteasa Elastasa como se describió anteriormente. El sobrenadante no incubado muestra actividad menor, posiblemente debido a los contaminantes de proteasa en los sobrenadantes del cultivo celular, que reconoce sitios de escisión similares a los de la Elastasa.
Tabla 2: Una lista de constructos y las correspondientes SEC ID N Citas: Arlaud.G.J., Rossi.V., Gaboriaud.C. and Thielens.N.M. Complement component C1s. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 2 edn (Barrett.A.J., Rawlings.N.D. and Woessner.J.F. eds), p.1620-1623, Elsevier, London (2004) auf dem Keller.U., Prudova.A., Gioia.M., Butler.G.S. and Overall,C.M.(2010) A statistics-based platform for quantitative N-terminome analysis and Identification of protease cleavage products. Mol Cell Proteomics 9:912-927 Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) Bani, D., Masini, E., Bello, M. G., Bigazzi, M. and Sacchi, T. B. (1998) Relaxin protects against myocardial injury caused by ischemia and reperfusion in rat heart. Am. J. Pathol. 152:1367-1376 Bani-Sacchi, T., Bigazzi, M., Bani, D., Mannaioni, P. F., and Masini, E. (1995) Relaxin-induced increased coronan/ flow through stimulation of nitric oxide production. Br J Pharmacol 116:1589-1594 Barios KK, Gatos D, Vasileiou Z, Barios K. (2010) An optimized chemical synthesis of human relaxin-2. J Pept Sci. 16:200-211 Bartsch, O., Bartlick, B., and Ivell, R. (2001). Relaxin signaling links tyrosine phosphorylation to phosphodiesterase and adenylyl cyclase activity. Mol Hum Reprod 7:799-809 Bartsch, O., Bartlick, B., and Ivell, R. (2004). Phosphodiesterase 4 inhibition synergizes with relaxin signaling to promote decidualization of human endometrial stromal cells. J Clin Endocrinol Metab 89:324-334 Behrens.Spiekerman and Brown (1975) Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 34, 591 Bennett RG. (2009) Relaxin and its role in the development and treatment of fibrosis. Transí Res. 154:1-6 Benton T, Chen T, McEntee M, Fox B, King D, Crombie R, Thomas TC, Bebbington C. (2002) The use of UCOE vectors in combination with a preadapted serum free, suspensión cell line allows for rapid production of large quantities of protein. Cytotechnology 38:43-46 Bjork.l., Danielsson.A., Fenton.J.W. and Jornvall (1981) The site in human antithrombin for functional proteolytic cleavage by human thrombin. FEBS Lett 126:257-260.
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U.S. 4.968.615 por Schaffner et al.
U.S. 5.168.062 por Stinski U.S. 5.179.017, por Axel et al.
Patente U.S. Núm. 4.657.760 Patente U.S. Núm. 4.816.397 por Boss et al. Patente U.S. Núm. 5.225.212.
Patente U.S. Núm.5.206.344 Patente U.S. Núm. 5.525.491 Patente U.S. Núm. 7.271.149 US 4.683.195 Patente US Núm. US4.683.195 Patente US Núm. US2011/0130332 US20100104588 WO 00/06568 WO 01/19355 WO 01/19778 WO 01/77137 WO 02/070462 WO 02/42301 WO 93/15199 WO 93/15200 WO 97/26265 WO01/45746 WO2001/058957 WO2010/054699 W093/15199

Claims (15)

REIVINDICACIONES:
1. Una proteína de fusión que comprende Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina, caracterizada porque la Relaxina comprende un polipéptido de la cadena A de Relaxina o una variante funcional de la misma, y un polipéptido de la cadena B de Relaxina o una variante funcional de la misma, PCS comprende un sitio de escisión de endo-proteasa, y HEM es un resto proteínico que prolonga la semivida.
2. Un polipéptido de fusión que comprende proRelaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-proRelaxina, caracterizado porque la proRelaxina comprende un polipéptido de la cadena A de Relaxina o una variante funcional de la misma, un polipéptido de la cadena C de Relaxina y un polipéptido de la cadena B de Relaxina o una variante funcional de la misma, PCS comprende un sitio de escisión de endo-proteasa, y HEM es un resto proteínico que prolonga la semivida.
3. La proteína o polipéptido de fusión de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque PCS es un sitio de escisión de una endo-proteasa extracelular.
4. La proteína o polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la endo-proteasa es una endo-proteasa endógena.
5. Un polipéptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los restos proteínicos que prolongan la semivida están comprendidos de un grupo de restos proteínicos que prolongan la semivida constituido por dominio Fe de inmunoglobulina, albúmina sérica, transferrina y proteína de unión a albúmina sérica.
6. Un polipéptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la cadena A de Relaxina es cadena de Relaxina 2 A humana y la cadena B de Relaxina es cadena de Relaxina 2 B humana.
7. Un polinucléotido que codifica un polipéptido de fusión de proRelaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-proRelaxina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.
8. Un vector, caracterizado porque comprende un polinucléotido de conformidad con la reivindicación 7.
9. Una célula huésped, caracterizada porque comprende al vector como el que se reclama en la reivindicación 8 o un polinucléotido como el que se reclama en la reivindicación 7.
10. El procedimiento de producción de una proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende las etapas de cultivar una célula huésped de conformidad con la reivindicación 9 que además comprende una actividad de prohormona convertasa y aislar la proteína.
11. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11 o una proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como medicamento.
13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11 o 12 o una proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como medicamento para el tratamiento de enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar, trastorno fibrótico o enfermedad renal.
14. Un procedimiento de tratamiento de una enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar, trastorno fibrótico o enfermedad renal, caracterizado porque comprende la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 11 y 12 o una proteína de Relaxina-PCS-HEM o HEM-PCS-Relaxina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
15. El tratamiento de conformidad con las reivindicaciones 13 o 14, cracterizado porque la enfermedad cardiovascular está comprendida en el grupo de cardiopatía coronaria, síndrome coronario agudo, insuficiencia cardíaca, o infarto de miocardio.
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