TW201315739A - 鬆弛素（ｒｅｌａｘｉｎ）融合多肽類及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供具有鬆弛素A鏈及鬆弛素B鏈非野生型陣列之鬆弛素融合多肽A-L-B，其中A鏈及B鏈係以連接子胜肽連接。本發明進一步提供具有延長之半衰期之鬆弛素融合多肽。再者，本發明提供編碼上述融合多肽之核酸序列、含彼等核酸序列之載體、此等融合多肽之醫藥組成物及醫療用途

Description

鬆弛素(RELAXIN)融合多肽類及其用途

本發明提供具有鬆弛素A鏈及鬆弛素B鏈非野生型陣列之鬆弛素融合多肽A-L-B，其中A鏈及B鏈係以連接子胜肽連接。本發明進一步提供具有延長之半衰期之鬆弛素融合多肽。再者，本發明提供編碼上述融合多肽之核酸序列、含彼等核酸序列之載體、此等融合多肽之醫藥組成物及醫療用途。

發明背景

為胰島素超級家族成員之鬆弛素2(H2鬆弛素，RLN2)係於基因層次展現從N至C端排列之典型B-C-A鏈前激素結構之2鏈胜肽。此超級家族之其他成員，由人類7個基因編碼，為鬆弛素基因RLN 1、RLN3、及類胰島素胜肽基因INSL3、INSL4、INSL5、與INSL6。此家族成員間之整體序列同源性低；然而，親緣關係分析顯示彼等基因係從RLN3祖先基因進化形成[Hsu,S.Y.(2003)；Wilkinson,T.N.et al.(2005)]。成熟蛋白質之分子量約6000 Da，為前激素-轉化酶1(PC1)與2(PC2)催化前激素後之酵素切割產物[Hudson P.et al.(1983)]。由此產生之A鏈與B鏈以兩個分子間半胱胺酸橋鍵連結；A鏈具有額外之分子內雙硫鍵。

鬆弛素經由多個路徑對各種細胞類型啟動多效性作用；其經由結合於I類(類視紫素)稱為LGR7之G蛋白 偶聯受體(富含白胺酸之G蛋白偶聯受體7)，亦稱為RXFP1(鬆弛素家族胜肽1受體)，而賦予其活性，及顯著降低對LRG8/RXFP2(鬆弛素家族胜肽2受體)之親和力[Kong RC et al.(2010)Mol Cell Endocrinol.320：1-15]。於鬆弛素分子內，B鏈內之胺基酸特徵結構(motif)(Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X)[Schwabe and Büllesbach(2007)Adv Exp Med Biol.612：14-25與Büllesbach and Schwabe J Biol Chem.2000 Nov 10；275(45)：35276-80]保存於所有鬆弛素胜肽中，及為彼等胜肽與相應受體相互作用之關鍵。鬆弛素與LGR7/RXFP1之結合導致腺核苷酸環化酶之活化及第二信使分子cAMP之增加。經由此機制，例如，鬆弛素2傳介大鼠心臟心房利尿肽之釋出[Toth,M.et al.(1996)]。鬆弛素2對大鼠心房肌細胞之正面影響心肌收縮作用亦已被證實[Piedras-Renteria,E.S.et al.(1997)]。被鬆弛素/LGR7複合物活化之其他訊息傳遞分子為磷酸肌醇-3激酶、酪胺酸激酶、與磷酸二酯酶[Bartsch,O.et al.(2001),Bartsch,O.et al.(2004)]。被此系統活化之額外訊息傳遞路徑包括於大鼠及天竺鼠心臟中導致環狀GMP量增加之一氧化氮(NO)路徑[Bani-Sacchi,T.et al.(1995)]。

鬆弛素表現多效性激素之作用[Dschietzig T.et al.(2006)]，具有對例如肺臟、腎臟、腦、及心臟器官之生物活性。於各種動物疾病模式以及臨床研究中，鬆弛素 之強大抗纖維化與血管擴張劑活性為使用此胜肽獲得正面作用之最明顯原由[McGuane J.T.et al.(2005)]。於病理情況下，RLN2在心血管系統中具有多種有益作用；於各種疾病生理過程期間，維持組織之自身穩定並保護受傷害之心肌；其展現顯著之血管擴張效應，例如，影響囓齒動物冠狀動脈中[Nistri,S.et al.(2003)]及其他器官血管床中之流動與血管擴張。於自發性高血壓大鼠中，RLN2降低血壓，一種經由增加NO生成所傳介之作用。

鬆弛素2之心臟保護活性已於不同動物模式例如天竺鼠、大鼠及豬中被評估[Perna A.M.et al.(2005),Bani,D.et al.(1998)]。RLN2改善心肌傷害、炎性細胞浸潤及隨後之纖維化，從而減輕嚴重之心室功能異常[Zhang J.et al.(2005)]。

鬆弛素2展現強大抗纖維化活性。於受傷組織中，纖維組織母細胞之活化與增殖導致膠原蛋白生成增加及間質纖維化。由於超過生物力學負荷而增加心臟之纖維化，影響心室功能異常、重塑、及心律不整。於動物模式中，鬆弛素2之持續灌流抑制或甚至逆轉由心肌病變、高血壓、異丙基腎上腺素誘發之心臟毒素、糖尿病性心肌病變及心肌梗塞引起之心臟功能障礙。此纖維增生之抑制或已建立纖維化之逆轉可減少心室硬化及改善舒張期功能。值得注意的是，雖然鬆弛素2減少異常膠原蛋白之累積，惟其不影響健康組織之基礎膠原蛋白含 量，突顯其於治療用途之安全性。

鬆弛素2已於數個臨床研究中被測試，為治療急性心臟衰竭病患非常有前景成果之多效性血管擴張劑。於彼等研究中，鬆弛素2與有利之減輕呼吸困難及其他臨床結果相關[Teerlink J.R.et al.(2009),Metra M.et al.(2010)]。

由於鬆弛素受限之體內半衰期，病患之治療必須每隔14至21天重複一次，因此化合物投與必須連續灌流進行至少48小時。

再者，鬆弛素2亦可用於治療例如胰臟炎、炎症相關疾病如類風溼性關節炎、及癌症[Cosen-Binker L.I.et al.(2006)Santora K.Et al.(2007)]，或硬皮病、肺、腎、與肝纖維化[Bennett RG.(2009)]等疾病。鬆弛素2減少人類MDA-MB-231乳癌細胞異種移植腫瘤之生長[Radestock Y,Hoang-Vu C,Hombach-Klonisch S.(2008)Breast Cancer Res.10：R71]。

利用化學方法合成鬆弛素2很困難；由於B鏈溶解度低及需要於A與B鏈間費力、特定引入半胱胺酸橋鍵，因此利用彼等方法所得活性胜肽之產率極低[(Barlos K.K.et al.(2010)]。替代地，可進行鬆弛素2之重組表現。為了容許後轉譯修飾期間預前胜肽(prepro-peptide)之切割及成熟與生物活性胜肽之分泌，乃以編碼前激素-轉化酶1及/或2之表現建構體，例行地共轉染表現宿主細胞[(Park J.I.et al.(2008)]。然而，異源細胞中預前胜 肽之內切蛋白水解處理之效率，常顯著地限制生物活性分子之生成[Shaw J.A.et al.(2002)]。

因此，產生展現完整生物活性之由特定蛋白酶傳介之無關內切蛋白水解處理，並能使用異源表現系統以顯著收率產生之鬆弛素分子，將具有很大優勢。

就人類胰島素而言，已產生由不能切割之多肽連接胰島素B鏈與胰島素A鏈之單鏈變異體[Rajpal G.et al.(2009)]。對於彼等變異體，內切蛋白水解處理並非必要。

令人驚奇地，申請人等鑑定出一種鬆弛素變異體，其中定名為A鏈及B鏈的兩個活性鏈方位對調，及以連接子胜肽取代可切割之C鏈。如於圖1所示，修飾分子鏈之方位為：A鏈-連接子胜肽-B鏈，而非基因決定之編碼鬆弛素單鏈之方位，即B鏈-C鏈-A鏈。所得分子展現完整之生物活性，無關任何內切蛋白水解處理。此由本發明提供之新穎單鏈鬆弛素變異體因而解決低表現產率之問題或以處理蛋白酶共轉染之需求。

於人體中，靜脈給與之鬆弛素2半衰期不到10分鐘[Dschietzig T.et al.(2009)]；因而，於臨床試驗中，鬆弛素2必須持續投與超過48小時。因此，增進鬆弛素生物半衰期可能具極大優勢。

增進生物半衰期可如下進行：利用化學修飾法，例如感興趣多肽之聚乙二醇化或羥乙基澱粉化(HESylation)、額外、非天然N-醣基化部位之引入；或 者利用基因融合法，使此多肽分別與其他分子例如抗體之免疫球蛋白Fc片段、轉鐵蛋白、白蛋白、體內結合於其他傳介較長半衰期分子之結合模組、或其他蛋白質。本發明提供具增進半衰期之融合於抗體Fc部分之單鏈鬆弛素變異體。令人驚奇地，彼等變異體顯示野生型鬆弛素範圍內之生物活性。

發明概述

本發明係有關融合多肽，下文中亦稱為單鏈鬆弛素(scRelaxin)。

鬆弛素生產之現行標準係化學合成此分子，為複雜及昂貴之步驟。由於鬆弛素進行後轉譯修飾之事實，特別是利用前激素轉化酶1與前激素轉化酶2之預前蛋白質之切割，選擇適當表現系統對重組表現是必須的。屬於胰島素超級家族蛋白質之內切蛋白水解處理時常限制異源細胞之生產生物活性分子。欲避免鬆弛素之內切蛋白水解處理，本發明之融合多肽為其中定名A鏈及B鏈的鬆弛素之二活性鏈之基因編碼之方位係反向之分子，其中A鏈及B鏈由連接子胜肽連接。詳言之，本發明提供之鬆弛素變異體中，DNA片段之方位為：A鏈-胜肽連接子-B鏈，而非編碼鬆弛素功能區之個別DNA片段之基因決定方位，即B鏈-C鏈-A鏈；如此產生其中鬆弛素A鏈之羧基端融合於連接子多肽L之胺基端，該連接子多肽L之羧基端融合於鬆弛素B鏈胺基端之單鏈鬆弛素，定名為A-L-B(參見圖1說明)；所得分子展 現與野生型鬆弛素相似之生物活性，惟其表現與內切蛋白水解處理無關。

本發明之一具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變異體，B包含鬆弛素B鏈多肽或其功能性變異體，L為連接子多肽。

於進一步具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含鬆弛素2A鏈多肽或其功能性變異體，鬆弛素B鏈多肽包含鬆弛素2B鏈多肽或其功能性變異體。

於較佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含人類最小鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：118)或其功能性變異體，或包含人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體。

於較佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素B鏈多肽包含人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體。

於更佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含人類最小鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：118)或其功能性變異體，或包含人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體及鬆弛素B鏈多肽包含人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體。

於又更佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽為人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體及鬆弛素B鏈多肽為人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體。

於一具體實例中，上述融合多肽A-L-B之連接子多肽L由6-14個胺基酸殘基長之多肽構成；進一步較佳者為7-13個胺基酸殘基長之多肽連接子L；進一步較佳者為8-12個胺基酸殘基長之多肽連接子L；又更佳者為7-11或9-11個胺基酸殘基長之多肽連接子L；又更佳者為9個胺基酸殘基長之多肽連接子L；於進一步較佳具體實例中，多肽連接子L長度之整數係選自包括整數6、7、8、9、10、11、12、13與14之組群。

連接子胜肽L可由任何胺基酸組成；於較佳具體實例中，連接子多肽L包含至少一個Gly、Ser、Arg、Leu、Cys、Ala、Leu及/或Lys殘基；於更佳具體實例中，連接子多肽L包含Gly與Ser殘基；進一步較佳具體實例為包含Gly與Ser殘基及具有至少3對1之Gly對Ser比之連接子L。

於進一步具體實例中，上述連接子L包含至少一個供半衰期延長基團共價偶合之連接部位。於本發明具體實例中，上述連接部位係Lys或Cys殘基。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，及L係6-14、7-13、8-12、7-11、9-11、或9個胺基酸殘基 長之連接子多肽。該連接子胜肽L可由任何胺基酸組成。於較佳具體實例中，連接子多肽L包含至少一個Gly、Ser、Arg、Leu、Cys、Ala、Leu及/或Lys殘基。於更佳具體實例中，連接子多肽L包含Gly與Ser殘基。進一步較佳具體實例為包含Gly與Ser殘基及具有至少3對1之Gly對Ser比之連接子L。於進一步具體實例中，上述連接子L包含至少一個供非蛋白性質聚合物半衰期延長基團共價偶合之連接部位。於本發明具體實例中，上述連接部位係Lys或Cys殘基。

本發明之較佳具體實例為進一步包含半衰期延長基團之融合多肽A-L-B。

於進一步具體實例中，上述融合多肽具有鬆弛素活性。於進一步較佳具體實例中，該鬆弛素活性為鬆弛素受體LGR7之活化。於又進一步較佳具體實例中，鬆弛素受體LGR7之活化係利用實驗方法中揭示之方法測定。

於另一態樣中，本發明提供編碼上述融合多肽之多核苷酸。此類多核苷酸可進一步包含容許分泌融合多肽之訊息胜肽之編碼序列；亦包括含有為得到此類融合多肽之多核苷酸之載體；適當載體為，舉例而言，表現載體。本發明之進一步具體實例為包含編碼上述融合多肽之多核苷酸、載體、或表現載體之宿主細胞。本發明之宿主細胞可為真核細胞或原核細胞。真核細胞可為哺乳動物細胞或酵母或昆蟲細胞，較佳為哺乳動物細胞。原 核細胞可為，舉例而言，大腸桿菌細胞。

於另一具體實例中，本發明提供包含上述融合多肽之醫藥組成物；該組成物可經配製以供靜脈內、腹膜內或皮下投與。

本發明之另一具體實例提供作為藥劑用之醫藥組成物或融合多肽。進一步具體實例為使用醫藥組成物或融合多肽治療心血管疾病、胰臟炎、炎症、癌症、硬皮病、肺、腎臟、與肝臟纖維化之用途。

發明之詳細說明 定義：

"胺基酸殘基"一詞意指包含於由丙胺酸(Ala或A)、半胱胺酸(Cys或C)、天冬胺酸(Asp或D)、麩胺酸(Glu或E)、苯丙胺酸(Phe或F)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、離胺酸(Lys或K)、白胺酸(Leu或L)、甲硫胺酸(Met或M)、天冬醯胺(Asn或N)、脯胺酸(Pro或P)、麩胺醯胺(Gln或Q)、精胺酸(Arg或R)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、纈胺酸(Val或V)、色胺酸(Trp或W)、與酪胺酸(Tyr或Y)殘基構成之組群中之胺基酸殘基。

“鬆弛素之活性”或“鬆弛素活性”等詞係界定為鬆弛素或其變異體活化刺激性G蛋白Gs，從而隨後產生第二信使環AMP，及/或刺激PI3激酶之能力。鬆弛素或其變異體結合LGR7，導致刺激性G蛋白Gs之細胞內活化，結果隨後產生第二信使環AMP(cAMP)。然而， cAMP產生係時間依賴性之雙相反應。於初始短暫Gs-腺核苷酸環化酶-傳介之cAMP反應後，受體訊號轉換為抑制性G蛋白之活化，並由此成為PI3激酶傳介之反應[Halls M.L.,Bathgate R.A.,Summers,R.J.(2005)Signal Switching after Stimulation of LGR7 Receptors by Human Relaxin 2,Ann.N.Y.Acad.Sci.1041：288-291]。

“半衰期延長基團”一詞係指直接或經由連接子，共價連接(“共軛結合”)於鬆弛素融合多肽之醫藥上可接受基團、功能區、或“媒介物(vehicle)”，相較於未共軛結合型之鬆弛素融合多肽，能防止或減輕鬆弛素融合多肽之體內蛋白水解降解或其他減少活性之化學修飾，增加鬆弛素融合多肽之半衰期或其他藥物動力學性質例如惟不限於增加吸收率、降低毒性、增進溶解度、增加生物活性及/或標靶選擇性，增加鬆弛素融合多肽之可製造性，及/或降低免疫原性。“半衰期延長基團”一詞包括非蛋白性質半衰期延長基團，例如PEG或HES；及蛋白性質半衰期延長基團，例如血清白蛋白、轉鐵蛋白或Fc功能區。

“多肽”、“胜肽”及“蛋白質”於本文中可交換使用及包括經由胜肽鍵連接之兩個或兩個以上胺基酸之分子鏈。彼等詞並非指特定長度之產物；其包括多肽之後轉譯修飾，例如，醣基化、乙醯化、磷酸化等。此外，蛋白質片段、類似物、突變或變異體蛋白、融合蛋白均包含於多肽之含義內。彼等詞亦包括其中包含可合成、或 使用已知蛋白質工程技術重組表現之一個或一個以上胺基酸類似物或非標準或非天然胺基酸之分子。此外，本發明之融合蛋白可利用熟知之有機化學技術如本文所述予以衍生化。

“功能性變異體”一詞係指至少保留若干其天然生物活性之變異體多肽。於根據本發明鬆弛素2變異體之情形下，功能性變異體係至少顯示若干其天然活性(例如鬆弛素受體LGR7之活化)之變異體。鬆弛素受體LGR7之活化可利用實驗方法中揭示之方法測定。

論及本發明多肽時之“片段”、“變異體”、“衍生物”及“類似物”等詞包括保留相應野生型鬆弛素多肽之至少若干受體結合性質之任何多肽。本發明之多肽片段包括蛋白水解片段、缺失片段、以及由於胺基酸之置換、缺失、或插入而具有改變胺基酸序列之多肽。變異體可天然發生或非天然發生。非天然發生變異體可使用技藝已知之突變技術產生。變異體多肽可包含保守性或非保守性胺基酸之置換、缺失、或加成。變異體多肽於本文中亦係指“多肽類似物”。本文所用多肽之“衍生物”係指具有經由官能性側基團反應而化學衍生之一個或一個以上殘基之主題多肽。“衍生物”亦包括含有二十個標準胺基酸之天然發生之一個或一個以上胺基酸衍生物之彼等多肽。舉例而言，4-羥脯胺酸可置換脯胺酸，5-羥離胺酸可置換離胺酸，3-甲基組胺酸可置換組胺酸，高絲胺酸可置換絲胺酸，及鳥胺酸可置換離胺酸。

“融合蛋白”一詞係指包含衍生自一個以上親代蛋白質或多肽之多肽成分之蛋白質，及/或包含衍生自一個或一個以上不呈其野生型方位排列之親代蛋白質或多肽之蛋白質功能區之融合蛋白。一般而言，融合蛋白係自融合基因表現，其中編碼一蛋白質多肽序列之核苷酸序列被附加於編碼不同蛋白質多肽序列之核苷酸序列之框架中，及視需要以連接子或延伸子隔開；然後利用重組宿主細胞可呈單一蛋白質表現該融合基因。

"核苷酸序列"或“多核苷酸“等詞意指兩個或兩個以上核苷酸分子之連續伸展。核苷酸序列可得自基因體、cDNA、RNA、半合成、合成來源、或其任何組合。

“EC₅₀”(半最大有效濃度)一詞係指治療化合物於若干特定暴露時間後，誘發基線與最大值間之一半反應之有效濃度。

與特定物質有關所用"免疫原性"一詞意指該物質從免疫系統誘發反應之能力。免疫反應可為細胞或抗體傳介之反應[關於免疫原性之進一步界定，參見，例如Roitt：Essential Immunology(8th Edition,Black-well)]。通常，抗體反應性減少為免疫原性降低之徵兆。降低之免疫原性可利用此項技藝中已知之任何(例如體內或體外)適當方法測定。

"聚合酶鏈反應"或"PCR"等詞通常係指體外擴增所需核苷酸序列之方法，例如，見述於US Pat.No.US 4,683,195與US 4,683,195者。通常，PCR方法涉及使用 能優先與模板核酸雜交之寡核苷酸引子之引子延伸合成重複循環。

"載體"一詞係指質體或其他核苷酸序列，其能於宿主細胞內複製或被嵌入宿主細胞基因體中，因此可用於聯合相容宿主細胞(載體-宿主系統)執行不同功能：促進核苷酸序列之轉殖，亦即產生可用量之序列；引導由序列編碼基因產物之表現及將核苷酸序列嵌入宿主細胞基因體中。載體視其欲執行之功能而含有不同成分。

"細胞"、"宿主細胞"、"細胞株"及"細胞培養物"於本文中可交換使用，所有此類詞應被理解為包括從細胞生長或培養產生之後代。

"功能性體內半衰期"一詞係呈其正常含義使用，亦即仍有50%多肽生物活性存在身體/標靶器官中之時間，或多肽活性為50%初始值之時間。

測定功能性體內半衰期之替代法，可測定"血清半衰期"，亦即被清除之前，血漿或血流中有50%多肽循環之時間。血清半衰期之測定常比測定功能性體內半衰期更簡單，血清半衰期之大小通常為功能性體內半衰期大小之良好指標。血清半衰期之替代用詞包括"血漿半衰期''、"循環半衰期"、"血清清除率"、"血漿清除率"及"清除率半衰期"。多肽之清除係利用一或多個網狀內皮組織系統(RES)、腎臟、脾臟或肝臟之作用，利用傳介排除之組織因子、SEC受體或其他受體，或利用特定或非特定之蛋白質水解。通常，清除率視大小(相對於腎小球濾過之 阻隔)、電荷、附加之碳水化合物鏈、及蛋白質細胞受體之存在而定。欲保留之功能性通常係選自受體結合或受體活化。功能性體內半衰期及血清半衰期可利用此項技藝中已知之任何適當方法測定，例如，通常涉及下述步驟：適當投與哺乳動物合適劑量之治療胺基酸序列或化合物；定期自該哺乳動物收集血液試樣或其他試樣；測定該血液試樣中本發明胺基酸序列或化合物之含量或濃度；及從如此得到之數據(作圖)計算相較於給藥時之初始濃度，本發明胺基酸序列或化合物之含量或濃度降低50%之時間。謹此述及參考標準手冊，例如Kenneth,A et al：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters et al,Pharmacokinete analysis：A Practical Approach(1996)；亦可參考Marcel Dekker發行之"Pharmacokinetics",M Gibaldi & D Perron,2nd Rev.edition(1982)。

“醣基化”為一種化學修飾，其中係添加糖基團至多肽之特定部位。多肽之醣基化一般為N-連接或O-連接。N-連接係指碳水化合物基團連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列，Asn-X-Ser及Asn-X-Thr(“N-X-S/T”)，其中X為脯胺酸以外之任何胺基酸，係供酵素性連接碳水化合物基團至天冬醯胺側鏈之辨識序列。因此，多肽中任一彼等三肽序列(或特徵結構)之存在，即產生潛在之N-連接醣基化部位。O-連接係指碳水化合物基團連接至絲胺酸與蘇胺酸之羥基氧。

"單離"之融合多肽為已經鑑定及與表現其之細胞成分分開者。細胞之污染成分係將干擾融合多肽之診斷或治療使用之物質，可包括酵素、激素、及其他蛋白性質或非蛋白性質溶質。於較佳具體實例中，融合多肽係純化至(1)例如以洛瑞(Lowry)法、紫外線-可見光分光術或以SDS-毛細管凝膠電泳(例如於Caliper LabChip GXII，GX 90或Biorad Bioanalyzer裝置上)測定之大於95%重量百分比融合多肽，及於進一步較佳具體實例中大於99%重量百分比；(2)足以得到至少15個殘基之N-端或內部胺基酸序列之程度；或(3)於還原或非還原條件下，使用考馬斯(Coomassie)藍或較佳為銀染，經由SDS-PAGE呈均一性。然而，通常，單離之融合多肽將由至少一個純化步驟製備。

綜述

本申請案提供一種A-L-B融合多肽，本文中亦使用之術語係縮寫為scRelaxin或scR之單鏈鬆弛素，其中“A”係鬆弛素A鏈，“B”係鬆弛素B鏈及“L”為連接子多肽。本申請案敘述一種增進之鬆弛素分子，其中A鏈之C端經由多肽連接子連接至B鏈之N端而使該融合多肽得以呈功能性scRelaxin被表現。本申請案部分係有關出乎意外地發現A-L-B融合多肽可不必如有關野生型鬆弛素已知之需要內切蛋白水解前激素處理，而可被功能性表現。

鬆弛素之單鏈形式 鬆弛素A及B功能區：

本發明之一具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變異體，B包含鬆弛素B鏈多肽或其功能性變異體及L為連接子多肽。

本發明之進一步具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變異體，B包含鬆弛素B鏈多肽或其功能性變異體及L為連接子多肽；其中鬆弛素係選自由鬆弛素1、鬆弛素2、鬆弛素3、INSL3、INSL4、INSL5、與INSL6構成之鬆弛素組群。於進一步較佳具體實例中，該鬆弛素係鬆弛素2或鬆弛素3。於進一步具體實例中，該上述鬆弛素為人類鬆弛素。

於進一步具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含鬆弛素2A鏈多肽或其功能性變異體。於進一步具體實例中，A-L-B之鬆弛素B鏈多肽包含鬆弛素2B鏈多肽或其功能性變異體。

於進一步具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含鬆弛素2A鏈多肽或其功能性變異體及鬆弛素B鏈多肽包含鬆弛素2B鏈多肽或其功能性變異體。

於較佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含人類最小鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：118)或其功能性變異體，或包含人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體。於較佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素B鏈多肽包含人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119) 或其功能性變異體。

於更佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含人類最小鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：118)或其功能性變異體，或包含人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，及鬆弛素B鏈多肽包含人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體。

於進一步具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含鬆弛素3A鏈多肽或其功能性變異體。於進一步具體實例中，A-L-B之鬆弛素B鏈多肽包含鬆弛素3B鏈多肽或其功能性變異體。

於進一步具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含人類鬆弛素3A鏈多肽(SEQ ID NO：124)或其功能性變異體。於進一步具體實例中，A-L-B之鬆弛素B鏈多肽包含人類鬆弛素3B鏈多肽(SEQ ID NO：125)或其功能性變異體。於較佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽包含人類鬆弛素3A鏈多肽(SEQ ID NO：124)或其功能性變異體及鬆弛素B鏈多肽包含人類鬆弛素3B鏈多肽(SEQ ID NO：125)或其功能性變異體。

於上述融合多肽A-L-B之較佳具體實例中，相較於野生型鬆弛素A及B鏈，鬆弛素A或B鏈之功能性變異體分別具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸之替換、插入、及/或缺失。進一步較佳者為上述鬆弛素2B變異體進一步包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X。

鬆弛素A及B鏈變異體為此項技藝中已知。已充分理解特徵之鬆弛素結合部位幾何學提供熟悉技藝人士設計鬆弛素A及B鏈變異體之指引，例如，關於鬆弛素B鏈之變化，參見Büllesbach and Schwabe J Biol Chem.2000 Nov 10；275(45)：35276-80；關於鬆弛素A鏈與“最小”鬆弛素A鏈之變化，參見Hossain et al.J Biol Chem.2008 Jun 20；283(25)：17287-97。舉例而言，就保守之鬆弛素2B特徵結構(Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X)而言，X代表能形成螺旋結構例示，以選擇保守特徵結構中之適當胺基酸X作為於鬆弛素B鏈表面形成三角形接觸區之三個界定胺基酸之胺基酸[Büllesbach and Schwabe J Biol Chem.2000 Nov 10；275(45)]。

於又更佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體及鬆弛素B鏈多肽係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體。於又更佳具體實例中，人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)之功能性變異體，相較於SEQ ID NO：117，為具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換、缺失及/或插入之功能性變異體。進一步較佳者為人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)之功能性變異體，其中該功能性變異體，相較於SEQ ID NO：119，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換、缺失及/或插入。又進一步較佳者為進一步包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X- Ile/Val-X之上述人類鬆弛素2B變異體。

於又更佳具體實例中，A-L-B之鬆弛素A鏈多肽係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其與SEQ ID NO：117相較時，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸交換之功能性變異體，及鬆弛素B鏈多肽係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其與SEQ ID NO：119相較時，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸交換且包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變異體。

熟習此項技藝者知道如何得到功能性變異體；功能性變異體之實例揭示於關於鬆弛素A鏈之Hossain et al J Biol Chem.2008 Jun 20；283(25)：17287-97，或美國專利公告案No.US2011/0130332；及關於鬆弛素B鏈之Schwabe and Büllesbach(2007)Adv Exp Med Biol.612：14-25及Büllesbach and Schwabe J Biol Chem.2000 Nov 10；275(45)：35276-80。

連接子L：

於一具體實例中，上述融合多肽A-L-B之連接子多肽L由6-14個胺基酸殘基長之多肽構成；進一步較佳者為7-13個胺基酸殘基長之多肽連接子L；進一步較佳者為8-12個胺基酸殘基長之多肽連接子L；又更佳者為7-11或9-11個胺基酸殘基長之多肽連接子L；又更佳者為9個胺基酸殘基長之多肽連接子L；於進一步較佳具體實例中，多肽連接子L長度之整數係選自包括整數6、 7、8、9、10、11、12、13與14之組群。

連接子之胺基酸組成可不同，惟以展現低免疫原性評分之連接子較佳。連接子之實例為熟習此項技藝者熟知及包含例如(GGGS)n、(GGSG)n等序列，其中n為整數。連接子胜肽L可由任何胺基酸組成。於較佳具體實例中，連接子多肽L包含至少一個Gly、Ser、Arg、Cys、Leu及/或Lys殘基。於更佳具體實例中，該連接子多肽L包含Gly與Ser殘基。於進一步較佳具體實例中，該連接子胜肽L為富含甘胺酸之連接子，舉例而言例如包含如揭示於美國專利案No.7,271,149之[GGGGS]_n序列之胜肽。於其他具體實例中，係使用例如美國專利案No.5,525,491中所述之富含絲胺酸之連接子。

進一步較佳具體實例為包含Gly與Ser殘基且Gly對Ser之比例至少為3比1之連接子L。

於進一步具體實例中，上述連接子L包含至少一個供非蛋白性質聚合物半衰期延長基團共價偶合之連接部位。於本發明具體實例中，上述連接部位為Lys或Cys殘基。

此類連接子之實例為[GlyGlyGlySerGlyGly](SEQ ID NO：137)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGly](SEQ ID NO：138)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly](SEQ ID NO：139)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer](SEQ ID NO：140)、[GlyGlyGlySerGlyCysGlyGlySerGly](SEQ ID NO：141)、 [GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly](SEQ ID NO：143)、[LysArgSerLeuSerArgLysLysArg](SEQ ID NO：144)、[GlyGlyGlySerGlyLysGlyGlySerGly](SEQ ID NO：142)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly](SEQ ID NO：145)、與[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly](SEQ ID NO：146)。

一般考量可利用此項技藝中已知之例行方法決定最適連接子之長度及胺基酸組成。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，或其相較於SEQ ID NO：117具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換之功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，或其相較於SEQ ID NO：119具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換且包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變異體，及L係6-14、7-13、8-12、7-11、9-11、或9個胺基酸殘基長之連接子多肽。

於較佳具體實例中，上述融合多肽A-L-B之連接子多肽L為7-11、或9-11個胺基酸殘基長。又更佳者為9個胺基酸殘基長之多肽連接子L。於進一步較佳具體實例中，多肽連接子L長度之整數係選自包括整數6、7、 8、9、10、11、12、13與14之組群。連接子多肽L可由任何胺基酸組成。於較佳具體實例中，連接子多肽L為可彎曲之連接子。

於較佳具體實例中，連接子多肽L包含至少一個Gly、Ser、Arg、Leu、Cys、及/或Lys殘基。於進一步較佳具體實例中，連接子多肽L由選自包括Gly、Ser、Arg、Leu、Cys、與Lys殘基之胺基酸組群之胺基酸殘基構成。

於更佳具體實例中，連接子多肽L包含Gly與Ser殘基。於進一步較佳具體實例中，連接子胜肽L為富含甘胺酸之連接子，例如包含如揭示於美國專利案No.7,271,149之[GGGGS]_n序列之胜肽。於其他具體實例中，係使用如美國專利案No.5,525,491中所述之富含絲胺酸之連接子胜肽L。

進一步較佳具體實例為包含Gly與Ser殘基且Gly對Ser之比例至少為2比1之連接子多肽L。

進一步較佳具體實例為包含Gly與Ser殘基且Gly對Ser之比例至少為3比1之連接子多肽L。

進一步較佳具體實例為包含Gly與Ser殘基且Gly對Ser之比例至少為1比2之連接子多肽L。

進一步較佳具體實例為包含Gly與Ser殘基且Gly對Ser之比例至少為1比3之連接子多肽L。

進一步較佳具體實例為具有上述較佳長度之連接子多肽L，其中連接子L之胺基酸殘基除了4個之外，全 部由Gly及/或Ser殘基構成，其餘4個胺基酸殘基則係選自天然胺基酸之組群。

進一步較佳具體實例為具有上述較佳長度之連接子多肽L，其中連接子L之胺基酸殘基除了3個之外，全部由Gly及/或Ser殘基構成，其餘3個胺基酸殘基則係選自天然胺基酸之組群。

進一步較佳具體實例為具有上述較佳長度之連接子多肽L，其中連接子L之胺基酸殘基除了2個之外，全部由Gly及/或Ser殘基構成，其餘2個胺基酸殘基則係選自天然胺基酸之組群。

進一步較佳具體實例為具有上述較佳長度之連接子多肽L，其中連接子L之胺基酸殘基除了1個之外，全部由Gly及/或Ser殘基構成，其餘胺基酸殘基則係選自天然胺基酸之組群。

於進一步較佳具體實例中，上述天然胺基酸組群不包括脯胺酸胺基酸。

進一步較佳具體實例為具有上述較佳長度之連接子多肽L，其中連接子L之胺基酸殘基除了1個之外，全部由Gly及/或Ser構成，其餘胺基酸殘基則係選自Cys與Lys之組群。

於進一步較佳具體實例中，連接子多肽L係由選自包括Gly與Ser殘基之胺基酸殘基組群之胺基酸殘基構成。

於進一步較佳具體實例中，連接子L係由選自包括 Gly與Ser殘基之胺基酸組群之胺基酸殘基構成，其中Gly對Ser之比例至少為2比1。

於進一步較佳具體實例中，連接子L係由選自包括Gly與Ser殘基之胺基酸組群之胺基酸殘基構成，其中Gly對Ser之比例至少為3比1。

於進一步較佳具體實例中，連接子L係由選自包括Gly與Ser殘基之胺基酸組群之胺基酸殘基構成，其中Gly對Ser之比例至少為1比2。

於進一步較佳具體實例中，連接子L係由選自包括Gly與Ser殘基之胺基酸組群之胺基酸殘基構成，其中Gly對Ser之比例至少為1比3。

於進一步具體實例中，上述連接子L包含至少一個供非蛋白性質聚合物半衰期延長基團共價偶合之連接部位。於本發明具體實例中，上述連接部位為Lys或Cys殘基。

較佳之連接子多肽L係選自包括下述序列之連接子多肽組群：[GlyGlyGlySerGlyGly](SEQ ID NO：137)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGly](SEQ ID NO：138)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly](SEQ ID NO：139)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer](SEQ ID NO：140)、[GlyGlyGlySerGlyCysGlyGlySerGly](SEQ ID NO：141)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly](SEQ ID NO：143)、[LysArgSerLeuSerArgLysLysArg](SEQ ID NO：144)、 [GlyGlyGlySerGlyLysGlyGlySerGly](SEQ ID NO：142)、[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly](SEQ ID NO：145)、與[GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly](SEQ ID NO：146)。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，及L係7、8、9或10個胺基酸長之連接子多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其相較於SEQ ID NO：117具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換之功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其相較於SEQ ID NO：119具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換且包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變異體，及L係7、8、9或10個胺基酸長之連接子多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)， B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，及L係7、8、9或10個胺基酸長之連接子多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，及L係9個胺基酸長之連接子多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其相較於SEQ ID NO：117具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換之功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其相較於SEQ ID NO：119具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換且包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變異體，及L係9個胺基酸長之連接子多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，及L係9個胺基酸長之連接子多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，及L係7、8、9或10個胺基酸長之連接子多肽，其包含比例至少為3比1之甘胺酸與絲胺酸殘基。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其相較於SEQ ID NO：117具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換之功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其相較於SEQ ID NO：119具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換且包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變異體，及L係7、8、9或10個胺基酸長之連接子多肽，其包含比例至少為3比1之甘胺酸與絲胺酸殘基。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，及L係7、8、9或10個胺基酸長之連接子多肽，其包含比 例至少為3比1之甘胺酸與絲胺酸殘基。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，及L係9個胺基酸長之連接子多肽，其包含比例至少為3比1之甘胺酸與絲胺酸殘基。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其相較於SEQ ID NO：117具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換之功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其相較於SEQ ID NO：119具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換且包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變異體，及L係9個胺基酸長之連接子多肽，其包含比例至少為3比1之甘胺酸與絲胺酸殘基。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，及 L係9個胺基酸長之連接子多肽，其包含比例至少為3比1之甘胺酸與絲胺酸殘基。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，及L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其相較於SEQ ID NO：117具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換之功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其相較於SEQ ID NO：119具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換且包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變異體，及L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)， B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，及L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽。

本發明之更佳具體實例為包含scR4(SEQ ID NO：4)序列之融合多肽。

本發明之更佳具體實例為包含無標記scR4(SEQ ID NO：45)序列之融合多肽。

本發明之較佳具體實例為包含A-L-B之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其相較於SEQ ID NO：117具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換之功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其相較於SEQ ID NO：119具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個胺基酸替換且包含保守特徵結構Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變異體，及L係選自包括具有SEQ ID NO：137-146胺基酸序列之連接子之連接子胜肽組群之連接子多肽。

連接子長度可介於6與14個胺基酸間，而較長連接子胜肽本身可傳介附加功能為可理解。

於進一步具體實例中，上述融合多肽A-L-B具有鬆弛素活性。於進一步較佳具體實例中，鬆弛素活性為鬆弛素受體LGR7之活化。測定鬆弛素活性之方法為此項技藝中已知，或於本文中提供。於又進一步較佳具體實 例中，鬆弛素受體LGR7之活化係利用本文實驗方法中揭示之方法測定。於又進一步較佳具體實例中，鬆弛素受體LGR7活化之測定係測定EC₅₀值。於又更佳具體實例中，上述鬆弛素活性相較於誘發半最大活性之相應野生型鬆弛素之有效濃度，降低小於10⁵倍、10⁴倍、10³倍、100倍、75倍、50倍、25倍或10倍。例如，就根據人類鬆弛素2之融合多肽而言，A-L-B之相應野生型鬆弛素係人類鬆弛素2蛋白。

單鏈鬆弛素變異體生物半衰期之增進

本發明融合多肽半衰期之增進可利用添加半衰期延長基團達成。

於本發明具體實例中，上述融合多肽A-L-B進一步包含至少一個半衰期延長基團。於一具體實例中，該半衰期延長基團為蛋白性質或非蛋白性質聚合物。

經由非蛋白性質聚合物半衰期延長基團之半衰期延長：

增進融合多肽A-L-B之生物半衰期，可利用共價偶合於包含供融合於A-L-B N及/或C端之非蛋白性質聚合物半衰期延長基團連接部位之延伸多肽之非蛋白性質聚合物半衰期延長基團而達成；連接此類基團之方法為此項技藝中已知。

非蛋白性質聚合物半衰期延長基團可共價偶合於融合多肽A-L-B之連接部位。連接部位可為於A、L或B之內，或添加包含重組融合於上述融合多肽A-L-B之N端及/或C端之此類連接部位之多肽。較佳者為經由連接 子多肽L、或融合包含連接部位之延伸子之融合多肽A-L-B之N及/或C端之偶合。連接部位可為連接胺基酸，例如Cys或Lys，或碳水化合物之醣部分。

欲偶合於變異體多肽之非蛋白性質聚合物分子可為任何適當之聚合物分子，例如天然或合成之同質聚合物或異質聚合物，一般為分子量介於約300-100,000 Da之範圍內，例如約500-20,000 Da；更佳為介於約500-15,000 Da之範圍內；又更佳為介於約2-12 kDa之範圍內，例如介於約3-10 kDa之範圍內。本文中有關特定分子量使用"約"一詞時，係表示近似之平均分子量，及反映出於給定聚合物之製備中，通常具特定分子量分佈之事實。同質聚合物之實例包括多醇(亦即多OH)、多胺(亦即多NH2)及多羧酸(亦即多-COOH)。異質聚合物為包含不同偶合組群(例如羥基組群與胺組群)之聚合物。

適當聚合物分子之實例包括選自由聚伸烷氧(PAO)包括聚伸烷二醇(PAG)例如聚乙二醇(PEG)與聚丙二醇(PPG)、分支鏈PEG、羥烷基澱粉(HAS)例如羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸(PSA)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚(乙烯基吡咯啶酮)、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、苯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、葡聚醣包括羧甲基-葡聚醣、或適用於減少免疫原性及/或增加功能性體內半衰期及/或血清半衰期之任何其他生物聚合物構成之組群之聚合物分子。聚合物分子之另一實例為人類白蛋白或另一含量高之血漿蛋白。通常，聚伸烷二醇衍生之聚合物為可 生物相容、無毒、無抗原性、無免疫原性、具多種水溶性、及容易自生物體排出。

PEG為較佳之聚合物分子，因其相較於例如多醣類(如葡聚醣)，僅具少數能交聯之反應基團。特別是，單官能性PEG，例如甲氧聚乙二醇(mPEG)，由於其偶合化學相當簡單(只有一個反應基團可用於與多肽上之連接基團共軛結合)而引起關注。結果，由於交聯之風險被排除，所得本發明之共軛結合融合多肽更具同質性，因此該聚合物分子與變異體多肽之反應更容易控制。

為了使聚合物分子與本發明融合多肽共價連接，聚合物分子之羥基端基團必須呈活化形式，亦即具反應性之官能基[其實例包括一級胺基、醯肼(HZ)、硫醇、琥珀酸根(SUC)、琥珀醯亞胺基琥珀酸根(SS)、琥珀醯亞胺基琥珀二醯胺(SSA)、琥珀醯亞胺基丙酸根(SPA)、琥珀醯亞胺基丁酸根(SBA)、琥珀醯亞胺基羧甲基(SCM)、苯并三唑碳酸根(BTC)、N-羥琥珀醯亞胺(NHS)、醛、硝苯基碳酸根(NPC)、與三氟乙磺酸根(TRES)]提供。適當活化之聚合物分子係市售可得，例如得自Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL,USA，或得自PolyMASC Pharmaceuticals plc,UK。

替代地，聚合物分子可利用此項技藝中已知(例如揭示於WO 90/13540中)之習用方法進行活化。用於本發明之經活化之直鏈或分支鏈聚合物分子之具體實例見述於Shearwater Polymers,Inc.1997及2000目錄 (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and Pharmaceuticals,Polyethylene Glycol and Derivatives，併入本文以資參考)。活化PEG聚合物之具體實例包括下述直鏈PEG：NHS-PEG(例如SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、與SCM-PEG)、NOR-PEG、BTC-PEG、EPOXPEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CD1-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、與MAL-PEG、及分支鏈PEG例如PEG2-NHS及US 5,932,462與US 5,643,575(二者均併入本文以資參考)中揭示者。再者，下述公告案揭示有用之聚合物分子及/或聚乙二醇化化學：US 5,824,778、US 5,476,653、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、US 4,902,502、US 5,281,698、US 5,122,614、US 5,219,564、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、US 5,736,625、WO 98/05363、EP 809 996、US 5,629,384、WO 96/41813、WO 96/07670、US 5,473,034、US 5,516,673、EP 605 963、US 5,382,657、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503與EP 154 316。

供偶合於半胱胺酸殘基之特佳活化PEG聚合物之具體實例包括下述直鏈PEG：乙烯碸-PEG(VS-PEG)，較佳為乙烯碸-mPEG(VS-mPEG)；順丁烯二醯亞胺-PEG(MAL-PEG)，較佳為順丁烯二醯亞胺-mPEG(MAL-mPEG)與鄰吡啶基-二硫化物-PEG(OPSS-PEG)，較佳為鄰吡啶基-二硫化物-mPEG(OPSS-mPEG)。一般而言，此類PEG或mPEG聚合物具有約5 kDa、約10 kD、約12 kDa或約20 kDa之大小。

本發明融合多肽與活化聚合物分子之共軛結合係藉由使用例如見述於下述參考文獻(其中亦敘述用於活化聚合物分子之適當方法)之任何習知方法進行：Harris and Zalipsky,eds.,Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications,AZC Washington；R.F.Taylor,(1991),"Protein immobilisation.Fundamental and applications",Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992),"Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking",CRC Press,Boca Raton；G.T.Hermanson et al.,(1993),"Immobilized Affinity Ligand Techniques",Academic Press,N.Y.)。

熟習人士知道，欲使用之活化方法及/或共軛結合化學視融合多肽之連接基團(其實例見上文)，以及聚合物之官能基(例如為胺、羥基、羧基、醛、巰基、琥珀醯亞胺基、順丁烯二醯亞胺、乙烯碸或鹵基乙酸根)而定。聚乙二醇化可直接針對融合多肽上所有可用的連接基團 (亦即暴露於多肽表面之此類連接基團)或可針對一或多個特定連接基團，例如見述於US 5,985,265中之N端胺基或針對半胱胺酸殘基之共軛結合。再者，共軛結合可以一個步驟或逐步方式(例如WO 99/55377中所述)達成。

針對半胱胺酸殘基之聚乙二醇化(見上文)，於聚乙二醇化之前，通常係以還原劑例如二硫蘇糖醇(DDT)處理融合多肽；接著利用任何習知方法(例如脫鹽法)移除還原劑。PEG與半胱胺酸殘基之共軛結合通常於pH6-9之適當緩衝液中，溫度4℃至25℃不等，進行多達16小時。

一般將理解，聚乙二醇化係經設計俾使產生有關連接之PEG分子數、此等分子之大小與形狀(例如彼等是否為直鏈或分支鏈)、及於融合多肽中之連接部位之最適分子。欲使用聚合物之分子量，舉例而言，可根據欲達成之期望功效進行選擇。

關於僅共軛結合於蛋白質上之單一連接基團(例如N端胺基)，可為直鏈或分支鏈之聚合物分子以具有高分子量(較佳為約10-25 kDa，例如約15-25 kDa，例如約20 kDa)為有利。

正常情況下，聚合物共軛結合於針對使許多可用的聚合物連接基團與聚合物分子反應之條件下進行；此係利用相對於多肽，適當莫耳過量之聚合物達成。通常，活化之聚合物分子對多肽之莫耳比為高達約1000-1，例 如高達約200-1，或高達約100-1；然而，於若干情形下，此比率可稍微低些，例如高達約50-1、10-1、5-1、2-1或1-1以獲得最適反應。

根據本發明亦考量經由連接子使聚合物分子連接於多肽。適當連接子為熟習人士所熟知；較佳實例為三聚氯化氰[Abuchowski et al.,(1977),J.Biol.Chem.,252,3578-3581；US 4,179,337；Shafer et al.,(1986),J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.,24,375-378])]。

共軛結合後，剩餘之活化聚合物分子根據此項技藝中之已知方法予以封阻，例如，添加一級胺於反應混合物中，所得失活聚合物分子再以適當方法移除。

一般將理解，視情況而定，例如融合多肽之胺基酸序列、所用活化PEG化合物性質及特定聚乙二醇化條件(包括PEG對多肽之莫耳比)，可獲得不同程度之聚乙二醇化；較高之PEG對融合多肽比，通常可獲得較高度之聚乙二醇化。然而，任何既定聚乙二醇化程序所產生之聚乙二醇化融合多肽通常包含隨機分佈之具稍微不同程度聚乙二醇化之共軛結合融合多肽。

就增進鬆弛素或本發明融合多肽之生物半衰期而言，例如聚乙二醇化、或羥乙基澱粉化等化學修飾法均適用。

HAS與HES非蛋白性質聚合物，以及產生HAS或HES共軛物之方法揭示於例如WO02/080979、WO03/070772、WO057092391及WO057092390中。

聚唾液酸化為另一技術，其係以天然聚合物聚唾液酸(PSA)延長半衰期及增進治療性胜肽與蛋白質之穩定性。PSA為唾液酸(一種糖)之聚合物；用於蛋白質與治療性胜肽藥物遞送時，聚唾液酸針對共軛結合提供保護性小環境；此增加治療性蛋白質於循環中之活性壽命，防止其被免疫系統識別。PSA聚合物天然存在於人體中；被演化超過數百萬年之特定細菌吸收，覆蓋於其細胞壁表面；隨後彼等天然聚唾液酸化之細菌憑藉分子擬態(molecular mimicry)而能阻擾人體之防禦系統。PSA，大自然之終極匿蹤技術(stealth technology)，可自此類細菌容易地大量生產及具預先確定之物理特性。細菌PSA由於與人體中之PSA化學上相同，因此即使連接於蛋白質時，亦完全無免疫原性。

經由蛋白性質半衰期延長基團之半衰期延長：

增進融合多肽A-L-B半衰期之進一步可能性，常用之方法為與蛋白性質半衰期延長基團例如抗體之免疫球蛋白Fc片段、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白結合部分、血清白蛋白、或其變異體或體內結合於其他傳介較長半衰期分子之結合模組例如血清白蛋白結合蛋白之融合。

上述sc鬆弛素多肽可直接或經由胜肽連接子融合於免疫球蛋白之Fc部分。“免疫球蛋白”係含有以二硫鍵連接在一起的多肽鏈之分子，通常具有兩條輕鏈及兩條重鏈。於各鏈中，一功能區(V)具有取決於分子抗體特異 性之可變胺基酸序列；其他功能區(C)具有相同類別分子共有之相當恒定之序列。

本文所用免疫球蛋白之“Fc”部分具有通常於免疫學領域中之術語給定之意義。具體而言，此術語係指自抗體移除兩個抗原結合區(Fab片段)獲得之抗體片段。移除Fab片段之一方法為以木瓜蛋白酶水解免疫球蛋白。因此，Fc部分係由得自經由非共價相互作用及二硫鍵結合在一起的兩條重鏈恒定區之大小約相同之片段形成。Fc部分可包括鉸鏈區並經由CH2與CH3功能區延伸至抗體C端。人類及小鼠免疫球蛋白之代表性鉸鏈區可於Antibody Engineering,A Practical Guide,Borrebaeck,C.A.K.,ed.,W.H.Freeman and Co.,1992中找到。

具有不同效應子及藥物動力學性質之人類免疫球蛋白Fc區有五種：IgG、IgA、IgM、IgD、與IgE。IgG為血清中最大量之免疫球蛋白；於任何免疫球蛋白之血清中，亦具有最長半衰期(23天)。不同於其他免疫球蛋白，IgG於結合於Fc受體後，有效地再循環。IgG亞群有G1、G2、G3、與G4四種，各者具有不同效應子功能。彼等效應子功能通常經由與Fc受體(FcγR)相互作用或利用結合C1q及固定補體而傳介。結合於FcγR會導致抗體依賴性細胞傳介之細胞溶解，而結合於補體因子會導致補體傳介之細胞分解。於設計其中Fc部分之被利用僅針對其半衰期延長能力之異源Fc融合蛋白時，重要的是使任何效應子功能減至最小。所有IgG亞群均能結合 於Fc受體(CD16、CD32、CD64)，以G1與G3比G2與G4更具效力。IgG之Fc受體結合區係由位於CH2功能區之鉸鏈區以及羧端區之殘基形成。

視所需體內效應而定，本發明之異源融合蛋白可含上述任何同型或可含其中補體及/或Fc受體結合功能已改變之突變Fc區。因此，本發明異源融合蛋白可含有整個免疫球蛋白Fc部分、免疫球蛋白Fc部分之片段、或融合於sc鬆弛素化合物之其類似物。

無論融合蛋白最終結構如何，該Fc或類Fc區必須對延長融合於C端或N端之sc鬆弛素化合物之體內血漿半衰期有用。較佳為，該融合之sc鬆弛素化合物保留若干生物活性。生物活性可利用此項技藝中已知之體外及體內方法測定。

較佳為，用於本發明異源融合蛋白之Fc區係衍生自IgG1或IgG2 Fc區。

一般而言，用於本發明異源融合蛋白之Fc區可衍生自任何物種，包括惟不限於人類、大鼠、小鼠與豬。較佳為，用於本發明之Fc區係衍生自人類或大鼠；然而，最佳者為人類Fc區與片段及其變異體，以降低該融合蛋白於人體中具免疫原性之風險。"原態序列Fc區"包含與自然界中發現之Fc區胺基酸序列完全相同之胺基酸序列。"變異Fc區"包含由於至少一個胺基酸改變而與原態序列Fc區不同之胺基酸序列。較佳為，變異Fc區相較於原態序列Fc區或母多肽Fc區，具有至少一個胺基酸 替換，例如，於原態序列Fc區或母多肽Fc區中之約一至約十個胺基酸替換，較佳為約一至約五個胺基酸替換。本文中之變異Fc區與原態序列Fc區及/或與母多肽Fc區較佳為具有至少約80%序列同一性，最佳為至少約90%序列同一性，更佳為至少約95%序列同一性。

上述sc鬆弛素化合物可直接或經由胜肽延伸子融合於白蛋白或其類似物、片段、或衍生物。通常，組成部分本發明融合蛋白之白蛋白蛋白質可衍生自從任何物種轉殖之白蛋白。然而，以人類白蛋白及其片段與類似物較佳，以降低該融合蛋白於人體中具免疫原性之風險。人類血清白蛋白(HSA)由具585個胺基酸之單一非糖基化多肽鏈組成，分子量為66,500。HAS之胺基酸序列(SEQ ID NO：123)已於例如Meloun,et al.(1975)；Behrens,et al.(1975)；Lawn,et al.(1981)與Minghetti,et al.(1986)中敘述。白蛋白之各種多型變異體以及類似物與片段已見敘述[參見Weitkamp,et al.(1973)]。舉例而言，EP0322094及EP0399666揭示各種人類血清白蛋白片段。一般理解，本發明之異源融合蛋白包含連接於包括片段、類似物、與衍生物之任何白蛋白蛋白質之sc鬆弛素化合物，其中此等融合蛋白具生物活性，比單獨sc鬆弛素化合物具有更長之血漿半衰期。因此，該融合蛋白之白蛋白部分不必然需要具有與原態人類白蛋白相等之血漿半衰期。彼等片段、類似物、與衍生物係已知或可產生具有較長半衰期或具有介於原態人類白蛋白與感 興趣sc鬆弛素化合物間之半衰期者。彼等技術為此項技藝中熟知，參見，例如，WO 93/15199、WO 93/15200、WO 01/77137與EP0413622。

於本發明具體實例中，蛋白性質半衰期延長基團具免疫原性，係人類或擬人化。於較佳具體實例中，蛋白性質半衰期延長基團為人類，例如人類轉鐵蛋白(SEQ ID NO：122)、人類血清白蛋白(SEQ ID NO：123)、或人類IgG1 Fc(SEQ ID NO：120)。

附加地，亦可使用增進生物半衰期之其他蛋白質、蛋白質功能區或胜肽作為融合夥伴。

經由融合於人類血清白蛋白之半衰期延長揭示於例如WO93/15199；為增進蛋白質藥物動力學一般策略之白蛋白結合見述於例如Dennis et al.,The Journal of Biological Chemistry,Vol.277,No 38,Issue of September 20,pp.35035-35043；經由融合於人類血清白蛋白結合蛋白質之半衰期延長揭示於例如US20100104588；經由融合於人類血清白蛋白或IgG-Fc結合蛋白質之半衰期延長揭示於例如WO01/45746；經由融合於人類血清白蛋白結合胜肽之半衰期延長之進一步實例揭示於WO2010/054699。

經由融合於Fc功能區之半衰期延長揭示於例如WO2001/058957。

生物活性決定感興趣蛋白質至其融合夥伴之較佳方位；融合夥伴之C端以及N端方位均包含在內。此外， 為了增進生物半衰期或其他功能，可利用磷酸化、硫酸化、丙烯醯化、醣基化、去醣基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)，乙醯化、醯胺化等修飾融合夥伴。

蛋白性質半衰期延長基團係重組融合於上述融合多肽A-L-B之N端及/或C端；該融合可有或無附加之延伸子多肽。蛋白性質半衰期延長基團之實例為轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白結合部分、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白、免疫球蛋白、及免疫球蛋白Fc功能區。較佳者為人類蛋白性質半衰期延長基團，例如人類轉鐵蛋白、人類轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白結合部分、人類血清白蛋白、人類免疫球蛋白或人類Fc功能區。融合夥伴直接或利用延伸胺基酸(亦稱為延伸子)連接。融合接合處係界定為融合蛋白中，第一個蛋白質或胜肽最後一個C端胺基酸與第二個蛋白質或胜肽第一個N端胺基酸間之位置。因此，融合接合處或延伸子包括N端融合夥伴最後一個胺基酸與C端融合夥伴第一個胺基酸間之任何胺基酸。

延伸子單元：

此類延伸子係此項技藝中已知及為1至約100個胺基酸長、為1至約50個胺基酸長、為1至約25個胺基酸長、為1至約15個胺基酸長、為1至10個胺基酸長、為4至25個胺基酸長、為4至20個胺基酸長、為4至15個胺基酸長、或為4至10個胺基酸長。

延伸子序列之胺基酸組成可改變，惟以展現低免疫 原性評分之延伸子較佳。於本發明具體實例中，連接融合多肽A-L-B與蛋白性質半衰期延長基團之延伸子多肽可由任何胺基酸組成；例如scR-Fc1中所用延伸子多肽係由帶電荷且龐大之胺基酸(例如Glu、Arg或Asp)組成，而scR-Fc2中之延伸子多肽則由未帶電荷之胺基酸(例如Gly與Ser)組成。

於較佳具體實例中，延伸子多肽包含至少一個Gly、Ser、Ile、Glu、Arg、Met、及/或Asp殘基。於更佳具體實例中，延伸子多肽包含Gly與Ser殘基。於進一步較佳具體實例中，延伸子胜肽係富含甘胺酸之連接子，例如包含如揭示於美國專利案No.7,271,149之[GGGGS]_n序列之胜肽。於其他具體實例中，係使用如美國專利案No.5,525,491所述之富含絲胺酸之延伸子多肽。進一步較佳具體實例為包含Gly與Ser殘基及具有至少3對1之Gly對Ser比之延伸子多肽。進一步較佳者為於C-及/或N-端末具有脯胺酸殘基之延伸子多肽。

較佳之延伸子胜肽為[GlyGlySerPro](SEQ ID NO：148)、[GlyGlySerGlyGlySerPro](SEQ ID NO：149)、與[GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro](SEQ ID NO：150)。

具增進半衰期之此類融合多肽可以包含(R1)_m-(S1)_n-A-L-B-(S2)_o-(R2)_p序列之融合多肽表示。

本發明之進一步具體實例為一種融合多肽，其包含 (R1)_m-(S1)_n-A-L-B-(S2)_o-(R2)_p，式中A、L與B具有如上文揭示之界定，R1與R2係蛋白性質半衰期延長基團，S1與S2係如上文界定之延伸子胜肽，及式中m、n、o、與p獨立地具有整數0或1，惟m、n、o、與p至少一者為1。舉例而言，(S1)n=0意指無連接子S1存在融合多肽中。

於進一步具體實例中，若m為整數1，則n為整數1。於進一步具體實例中，若p為整數1，則o為整數1。

於較佳具體實例中，n與m為0及o與p為1。於進一步較佳具體實例中，n與m為1及o與p為0。

本發明之進一步具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)_m=1-(S1)_n=0-A-L-B-(S2)_o=0-(R2)_p=0。

本發明之進一步具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)_m=0-(S1)_n=0-A-L-B-(S2)_o=0-(R2)_p=1。

於較佳具體實例中，蛋白性質半衰期延長基團係選自包括血清白蛋白、轉鐵蛋白、Fc功能區、IgG1 Fc功能區、與血清白蛋白結合蛋白之組群。

於進一步具體實例中，上述融合多肽進一步包含至少一個相較於相應野生型鬆弛素具有延長之半衰期之半衰期延長基團，其中該半衰期延長至少5、10、20、50、100或500倍。較佳為，半衰期係呈血清半衰期測定，意指於血清或全血中檢測融合蛋白，例如使用市售可得之定量ELISA分析(例如R&D Systems，Human Relaxin-2 Quantikine ELISA套組，目錄編號DRL200)。半衰期較佳為人類血液半衰期。較佳為，半衰期係呈功能性體內半衰期測定，意指測定血清或血液試樣中之融合多肽活性。測定本發明融合多肽A-L-B活性之分析為此項技藝中已知並於本文中敘述。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)_m-(S1)_n-A-L-B-(S2)_o-(R2)_p，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，L係9個胺基酸長之連接子多肽，R1與R2係半衰期延長基團，較佳為蛋白性質半衰期延長基團，S1與S2係如上文界定之延伸子胜肽，及式中m、n、o、與p獨立地具有整數0或1，惟m、n、o、與p至少一者為1，較佳為至少m或p為1，更佳為m與n為0及o與p為1，及最佳為m與n為1及o與p為0。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)_m-(S1)_n-A-L-B-(S2)_o-(R2)_p，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，L係9個胺基酸長之連接子多肽， R1與R2係半衰期延長基團，較佳為蛋白性質半衰期延長基團，S1與S2係如上文界定之延伸子胜肽，及式中m、n、o、與p獨立地具有整數0或1，惟m、n、o、與p至少一者為1，較佳為至少m或p為1，更佳為m與n為0及o與p為1，及最佳為m與n為1及o與p為0。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)_m-(S1)_n-A-L-B-(S2)_o-(R2)_p，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1與R2係半衰期延長基團，較佳為蛋白性質半衰期延長基團，S1與S2係如上文界定之延伸子胜肽，及式中m、n、o、與p獨立地具有整數0或1，惟m、n、o、與p至少一者為1，較佳為至少m或p為1，更佳為m與n為0及o與p為1，及最佳為m與n為1及o與p為0。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)_m-(S1)_n-A-L-B-(S2)_o-(R2)_p，式中 A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1與R2係半衰期延長基團，較佳為蛋白性質半衰期延長基團，S1與S2係如上文界定之延伸子胜肽，及式中m、n、o、與p獨立地具有整數0或1，惟m、n、o、與p至少一者為1，較佳為至少m或p為1，更佳為m與n為0及o與p為1，及最佳為m與n為1及o與p為0。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係半衰期延長基團，較佳為蛋白性質半衰期延長基團，及S1係如上文界定之延伸子胜肽。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中 A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係半衰期延長基團，較佳為蛋白性質半衰期延長基團，及S1係如上文界定之延伸子胜肽。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係蛋白性質半衰期延長基團，S1係4至10個胺基酸長之延伸子胜肽，較佳為選自包括GlyGlySerPro(SEQ ID NO：148)、GlyGlySerGlyGlySerPro(SEQ ID NO：149)、與GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro(SEQ ID NO：150)之組群。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)， B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係蛋白性質半衰期延長基團，S1係4至10個胺基酸長之延伸子胜肽，較佳為選自包括GlyGlySerPro(SEQ ID NO：148)、GlyGlySerGlyGlySerPro(SEQ ID NO：149)、與GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro(SEQ ID NO：150)之組群。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係蛋白性質半衰期延長基團，S1係10個胺基酸長之延伸子胜肽。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO： 139)序列之連接子多肽，R1係蛋白性質半衰期延長基團，S1係10個胺基酸長之延伸子胜肽。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係蛋白性質半衰期延長基團，S1係由GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro(SEQ ID NO：150)組成之延伸子胜肽。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係蛋白性質半衰期延長基團，S1係由GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro(SEQ ID NO：150)組成之延伸子胜肽。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含 (R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)或其功能性變異體，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)或其功能性變異體，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係抗體之Fc功能區，較佳為人類IgG1或IgG2 Fc功能區，S1係由GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro(SEQ ID NO：150)組成之延伸子胜肽。

本發明之較佳具體實例為一種融合多肽，其包含(R1)-(S1)-A-L-B，式中A係人類鬆弛素2A鏈多肽(SEQ ID NO：117)，B係人類鬆弛素2B鏈多肽(SEQ ID NO：119)，L係具有GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly(SEQ ID NO：139)序列之連接子多肽，R1係抗體之Fc功能區，較佳為人類IgG1或IgG2 Fc功能區，S1係由GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro(SEQ ID NO：150)組成之延伸子胜肽。

本發明之進一步較佳具體實例為一種融合多肽，其包含如表3中提出之多肽。

本發明之進一步較佳具體實例為如表3中提出之融 合多肽。

於進一步具體實例中，上述融合多肽A-L-B進一步包含具有鬆弛素活性之半衰期延長基團。於進一步較佳具體實例中，該鬆弛素活性為鬆弛素受體LGR7之活化。測定鬆弛素活性之方法為此項技藝中已知或於本文中提供。於又進一步較佳具體實例中，鬆弛素受體LGR7之活化係利用本文實驗方法中揭示之方法測定。於又進一步較佳具體實例中，鬆弛素受體LGR7活化之測定係測定EC₅₀值。於又更佳具體實例中，相較於相應野生型鬆弛素活性，上述鬆弛素活性降低小於10⁵倍、10⁴倍、10³倍、100倍、75倍、50倍、25倍或10倍。例如，就根據人類鬆弛素2之融合多肽A-L-B而言，相應野生 型鬆弛素係人類鬆弛素2蛋白。

轉殖、載體系統、表現、宿主、及純化

本發明亦提供包含編碼本發明融合多肽之單離核酸分子之載體；此載體系統有效地連接至能引導其於宿主細胞中表現之表現序列。

適當宿主細胞可選自包括細菌細胞(例如大腸桿菌)、酵母細胞[例如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)]、真菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞與動物細胞之組群。動物細胞包括，惟不限於，HEK293細胞、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、HeLa細胞及各種初代哺乳動物細胞；亦可應用哺乳動物細胞之衍生物，例如HEK293T細胞。

本發明之DNA分子

本發明亦有關編碼本發明融合蛋白質之DNA分子；彼等序列包括，惟不限於，於表4中提出之DNA分子。

本發明之DNA分子不限於本文揭示之序列，惟亦包括其變異體。本發明內之DNA變異體可參考其於雜合時之物理性質予以敘述。熟習工作者將認知，使用核酸雜合技術，DNA可用於鑑定其互補體及，由於DNA為雙股，其等效物或同系物；亦將認知，小於100%互補性可發生雜合，然而，於特定適當選擇條件下，雜合技術可根據其與特殊探針之結構關係，用以鑑別DNA序列間之差異。有關此類條件之指引，參見Sambrook et al.,1989(文獻同上)及Ausubel et al.,1995[Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,& Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons]。

二多核苷酸序列間之結構相似性，可表示為二序列彼此雜合之條件"嚴謹度"之函數。本文所用"嚴謹度(stringency)"一詞係指不利雜合條件之程度。嚴謹條件對雜合極為不利，於此條件下，僅有結構最相關之分子彼 此雜合。相反地，不嚴謹條件有利於顯示較小結構相關程度分子之雜合。因此，雜合嚴謹度與二核酸序列之結構關係直接相關。下述關係用於使雜合與相關性互相關聯(其中T_m為核酸雙鏈分子之熔解溫度)：

a. T_m=69.3+0.41(G+C)%

b.每增加1%誤配鹼基對數，DNA雙鏈分子之T_m下降1℃。

c.(T_m)_μ2-(T_m)_μ1=18.5 log₁₀μ2/μ1其中μ1與μ2為二溶液之離子強度。

雜合嚴謹度為許多因子之函數，包括整體DNA濃度、離子強度、溫度、探針大小及破壞氫鍵製劑之存在。促進雜合之因子包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較長之探針大小及破壞氫鍵製劑不存在。雜合一般分二階段進行：“結合”階段與“洗滌”階段。

首先，於結合階段中，在有利雜合之條件下，使探針與標靶結合。此階段通利用改變溫度控制嚴謹度。就高嚴謹度而言，除非使用短寡核苷酸探針(<20個核苷酸)，否則溫度通常介於65℃與70℃間。代表性雜合溶液包含6X SSC、0.5% SDS、5X登哈特(Denhardt)溶液與100微克非特異性載體DNA。參見Ausubel et al.,section 2.9,supplement 27(1994)。當然，許多不同，惟具相等功能之緩衝條件為已知。相關程度較低時，可選擇較低溫度。低嚴謹度結合溫度介於約25℃與40℃間；中嚴謹度介於至少約40℃至小於約65℃間；高嚴 謹度至少約65℃。

其次，利用洗滌移除過量探針。於此階段，通常施用更嚴謹之條件。因此，此“洗滌”階段在決定經由雜合之相關性上最為重要。洗滌溶液一般含較低之鹽濃度。一例示中嚴謹度溶液含2X SSC及0.1% SDS。高嚴謹度洗滌溶液含小於約0.2X SSC之等效物(於離子強度上)，較佳嚴謹溶液含約0.1X SSC。與各種嚴謹度相關之溫度係與上述有關“結合”之討論相同。洗滌期間，洗滌溶液通常亦更換許多次。舉例而言，一般高嚴謹度洗滌條件包含於55℃洗滌30分鐘兩次及於60℃洗滌15分鐘三次。

本發明之具體實例為編碼本發明融合多肽之單離核酸序列。

重組DNA建構體及表現

本發明進一步提供包含一或多個本發明核苷酸序列之重組DNA建構體。本發明之重組DNA建構體用於連接載體，例如質體、噬菌質體、噬菌體或病毒載體，其中插入編碼本發明融合多肽之DNA分子。

如本文提供之融合多肽可利用於宿主細胞中重組表現編碼融合多肽之核酸序列予以製備。欲重組表現融合多肽，可用攜帶編碼融合多肽之DNA片段之重組表現載體轉染宿主細胞，俾使該融合多肽於宿主細胞中表現。使用例如見述於Sambrook,Fritsch and Maniatis (eds.),Molecular Cloning；A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)；Ausubel,F.M.et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)及Boss等之美國專利案No.4,816,39中之標準重組DNA方法，製備及/或獲得編碼融合多肽之核酸，將彼等核酸併入重組表現載體中及將該等載體引進宿主細胞中。

欲表現融合多肽，可使用標準重組DNA表現方法[參見，例如，Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)]。舉例而言，可將編碼所需多肽之DNA插入表現載體，然後將其轉染入適當宿主細胞中。適當宿主細胞為原核及真核細胞；原核宿主細胞之實例為例如細菌，真核宿主細胞之實例為酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。一般理解，表現載體之設計，包括調控序列之選擇，受諸因素(例如宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量及表現係構成性或誘導性)之影響。

細菌表現

用於細菌之有效表現載體之建構係利用於具功能性啟動子之可操作閱讀相位中，插入編碼所需蛋白質之結構DNA序列連同適當轉譯起始與終止訊號。該載體包含一或多個表現型可選擇標記及複製起始點，以確保維護載體，及需要時，提供於宿主內之擴增。供轉形之適當原核宿主包括大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)及假單孢菌屬 (Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、與葡萄球菌屬(Staphylococcus)諸屬內許多品種。

細菌載體可為，例如，噬菌體、質體或噬菌質體系。彼等載體可含衍生自通常含有熟知之轉殖載體pBR322(ATCC 37017)元件之市售可得質體之選擇標記及細菌複製起始點。於適當宿主菌株轉形及該宿主菌株生長至適當細胞密度後，利用適當方法(例如，溫度轉變或化學誘導)將選擇之啟動子去抑制/誘導，使細胞再培養一段時期。通常以離心法收集細胞，利用物理或化學方式破壞，並保留所得粗萃取液供進一步純化。

於細菌系統中，視表現蛋白質之意指用途，可有利地選擇一些表現載體。舉例而言，當欲產生大量此類蛋白質時，可能需要引導大量表現容易純化之融合多肽產物之載體。本發明之融合多肽包括純化之產物、化學合成程序之產物、及利用重組技術自原核宿主(包括，例如，大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門桿菌及假單孢菌屬、鏈黴菌屬、與葡萄球菌屬諸屬內許多品種，較佳為自大腸桿菌細胞)生產之產物。

真核細胞表現

真核細胞可用於表現本發明多肽；表現蛋白質之系統為此項技藝中已知。此類系統包括例如真核細胞、生長培養基、與相應之表現載體。常見供表現之真核細胞為例如哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、或昆蟲細胞。

哺乳動物表現及純化

哺乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括引導於哺乳動物細胞中大量表現蛋白質之病毒元件，例如衍生自細胞巨大病毒(CMV)(例如，CMV動子/增強子)、猿猴病毒40型(SV40)(例如，SV40啟動子/增強子)、腺病毒[例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)]與多瘤病毒之啟動子及/或增強子。有關病毒調控元件及其序列之進一步敘述，參見例如Stinski之U.S.5,168,062、Bell等之U.S.4,510,245及Schaffner等之U.S.4,968,615。重組表現載體亦可包括複製起始點及可選擇標記(參見例如Axel等之U.S.4,399,216、4,634,665與U.S.5,179,017)。適當可選擇標記包括賦予已引進載體之宿主細胞對藥劑(例如G418、潮黴素或胺甲喋呤)之抗性之基因。舉例而言，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因賦予對胺甲喋呤之抗性，及抗新黴素基因賦予對G418之抗性。

表現載體之轉染入宿主細胞，可使用標準技術進行，例如電穿孔法、磷酸鈣沈澱法、及DEAE-聚葡萄糖法、脂質體轉染或多價陽離子傳介之轉染。

用於表現本文提供之融合多肽之適當哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)[包括與見述於例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中之DHFR可選擇標記一起使用之見述於Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中之dhfr-CHO細胞]、NSO骨髓癌細胞、 COS細胞與SP2細胞。於若干具體實例中，係設計表現載體，俾使表現之蛋白質分泌至宿主細胞生長之培養基中。抗體之短暫轉染/表現可例如根據Durocher et al(2002)Nucl.Acids Res.Vol 30 e9之實驗流程達成；抗體之穩定轉染/表現可例如根據UCOE系統[T.Benton et al.(2002)Cytotechnology 38：43-46]之實驗流程達成。

可使用標準蛋白質純化方法從培養基中回收融合多肽。

本發明之融合多肽可利用熟知方法，包括惟不限於硫酸銨或乙醇沉澱法、酸萃取法、蛋白A層析法、蛋白G層析法、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水作用層析法、親和層析法、羥基磷灰石層析法與凝集素層析法，從重組細胞培養中回收及純化。高效液相層析法(“HPLC”)亦可用於純化。參見，例如，Colligan,Current Protocols in Immunology、或Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各者全部內容均併入本文以資參考。

本發明之融合多肽包括純化或單離之產物、化學合成程序之產物、及利用重組技術自真核宿主{包括，例如，酵母[例如畢赤酵母菌屬(Pichia)]、高等植物、昆蟲與哺乳動物細胞，較佳為自哺乳動物細胞)生產之產物。視重組生產程序中所用宿主之不同，本發明之融合多肽可為醣基化或非醣基化，惟以醣基化較佳。此類方法見 述於許多標準實驗室手冊中，例如Sambrook，文獻同上，第17.37-17.42節；Ausubel，文獻同上，第10、12、13、16、18與20章。

治療用途

本發明之具體實例為使用本發明醫藥組成物或融合多肽治療心血管疾病、腎臟疾病、胰臟炎、炎症、癌症、硬皮病、肺、腎、與肝纖維化之用途。

心血管疾病

心血管系統疾患，或心血管疾患，於本發明說明書中意指例如下述疾患：高血壓、末梢與心臟血管疾患、冠心病、穩定與不穩定型心絞痛、心肌功能不全、持續缺血性功能障礙("休眠性心肌")、暫時性缺血後功能障礙("暈眩性心肌")、心臟衰竭、末梢血流異常、急性冠狀動脈症候群、心臟衰竭與心肌梗塞。

於本發明說明書中，心臟衰竭一詞包括急性與慢性兩種心臟衰竭表現，以及更具體或相關之疾病類型，例如急性非代償性心臟衰竭、右心衰竭、左心衰竭、整體衰竭、缺血性心肌病變、擴張性心肌病變、先天性心臟缺陷、心瓣膜缺陷、與心瓣膜缺陷關聯之心臟衰竭、二尖瓣狹窄、二尖瓣閉鎖不全、主動脈瓣狹窄、主動脈瓣閉鎖不全、三尖瓣狹窄、三尖瓣閉鎖不全、肺動脈瓣狹窄、肺動脈瓣閉鎖不全、複合型心瓣膜缺陷、心肌炎症(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病性心臟衰竭、酒精性心肌病變、心臟儲積疾患、及舒 張型與收縮型心臟衰竭與急性階段惡化心臟衰竭。

根據本發明之化合物進一步亦適用於減少受梗塞影響之心肌範圍，及用於預防二次梗塞。

再者，根據本發明之化合物適用於預防及/或治療血栓性栓塞疾患、缺血後再灌流傷害、微血管與大血管病變(血管炎)、動脈與靜脈血栓症、水腫、局部缺血例如心肌梗塞、中風與短暫性腦缺血發作；適用於與冠狀動脈繞道手術(CABG)、原發性經皮冠狀動脈血管成形術(PTCA)、血栓溶解後之PTCA、拯救性PTCA、心臟移植與開心手術相關之心臟保護；及適用於與移植、繞道手術、心導管檢查與其他外科程序相關之器官保護。

其他適應症範圍為，例如，預防及/或治療呼吸系統疾患，舉例而言，如，慢性阻塞性肺部疾病(慢性支氣管炎，COPD)、氣喘、肺氣腫、支氣管擴張症、囊狀纖維化症(胰管纖維性囊腫)及肺部高血壓，尤其是肺部動脈高血壓。

腎臟疾病

本發明係有關使用本發明融合多肽作為預防及/或治療腎臟疾病之藥劑之用途，彼等腎臟疾病尤指急性與慢性腎臟疾病及急性與慢性腎功能不全，以及急性與慢性腎衰竭，包括需要及不需要透析之急性與慢性階段腎衰竭，以及潛在或相關之腎臟疾病例如腎臟灌流不足、透析誘發之低血壓、非炎性腎小球病變、腎小球性與腎小管性蛋白尿、腎水腫、血尿、原發性、繼發性、以及 急性與慢性腎小球性腎炎、膜性與膜增殖性腎小球性腎炎、亞伯氏(Alport)症候群、腎小球硬化、腎小管間質病變、腎病(例如原發性與天生腎臟病)、腎發炎、免疫性腎病如腎移植排斥、免疫複合物誘發之腎病、以及中毒誘發之腎病、糖尿病性與非糖尿病性腎病、腎盂腎炎、囊腫性腎臟、腎硬化、高血壓性腎硬化、腎病症候群；彼等疾病之特徵及於診斷上與肌酸酐清除率及/或水份排泄異常減少、血液中尿素、氮、鉀及/或肌酸酐濃度異常增加、例如麩胺醯合成酶之腎臟酵素活性、尿液滲透壓與尿液量改變、增加之微量白蛋白尿、巨量白蛋白尿、腎小球與小動脈病變、腎小管擴張、高磷酸鹽血症及/或透析需求相關。

此外，本發明融合多肽可作為預防及/或治療腎臟不完全切除後之腎臟癌、過度使用利尿劑後之脫水、不能控制之帶有惡性高血壓之血壓上升、泌尿道阻塞與感染、類澱粉變性症、以及與腎小球損傷關聯之系統性疾病(例如紅斑性狼瘡、與風濕性免疫系統性疾病)、以及腎臟動脈狹窄、腎臟動脈血栓症、腎臟靜脈血栓症、止痛劑誘發之腎病變與腎小管性酸血症之藥劑用。

此外，本發明之融合多肽可作為預防及/或治療顯影劑(contrast medium)誘發及藥物誘發之急性與慢性間質性腎臟病、代謝症候群與異常血脂症之藥劑用。

此外，本發明包括使用本發明融合多肽作為藥劑以預防及/或治療與急性及/或慢性腎臟疾病例如肺水腫、 心臟衰竭、尿毒症、貧血、電解質異常(例如，高鉀血症、低鈉血症)、以及骨質與碳水化合物代謝相關之副作用之用途。

肺部疾病

再者，根據本發明之融合多肽亦適用於治療及/或預防肺部疾病，尤其是氣喘疾患、肺部動脈高血壓(PAH)與其他形式之肺部高血壓(PH)包括左心臟疾病、HIV、鐮刀狀細胞性貧血症、血栓栓塞(CTEPH)、類肉瘤症、COPD或肺部纖維化關聯之肺部高血壓、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)、肺部纖維化、肺氣腫(例如香煙煙霧誘發之肺氣腫)及囊狀纖維化症(CF)。

纖維化疾患

根據本發明之融合多肽再者適用於治療及/或預防內部器官(例如，肺臟、心臟、腎臟、骨髓及特別是肝臟)之纖維化疾患、以及皮膚纖維化與纖維化眼睛疾患。於本發明說明書中，纖維化疾患一詞特別包含下述諸詞：肝纖維化、肝硬化、肺部纖維化、心內膜肌纖維化、腎病變、腎小球性腎炎、腎間質性纖維化、糖尿病引起之纖維化傷害、骨髓纖維化與類似之纖維化疾患、硬皮病、硬斑病、疤痕增長症、結肥厚疤(亦繼外科手術後)、痣、糖尿病性視網膜病變、增殖性玻璃體視網膜病變與結締組織疾患(例如類肉瘤症)。

癌症

癌症為一群細胞展現不受控制之生長之疾病。癌症通常被分類為衍生自上皮細胞癌症之惡性腫瘤(此組涵蓋許多最常見之癌症，包括乳癌、攝護腺癌、肺癌與結腸癌)；衍生自結締組織、或間葉細胞之肉瘤；衍生自造血細胞之淋巴瘤與白血病；衍生自多功能性細胞(pluripotent)之生殖細胞腫瘤；及衍生自未成熟之"前驅"或胚胎組織之癌症之胚細胞瘤。

本發明此外提供使用本發明融合多肽製備藥劑以供治療及/或預防諸疾患(特別是上述諸疾患)之用途。

本發明此外提供使用有效量之至少一種本發明融合多肽治療及/或預防諸疾患(特別是上述諸疾患)之方法。

本發明此外提供於治療及/或預防冠心病、急性冠狀動脈症候群、心臟衰竭、與心肌梗塞方法中使用之本發明融合多肽。

醫藥組成物及投與

本發明亦提供一種醫藥組成物，其含有於藥物學上可接受之媒介物中之單鏈鬆弛素融合蛋白；該單鏈鬆弛素融合蛋白可全身性或局部投與；可使用此項技藝中已知之任何適當投與方式，包括，惟不限於，靜脈內、腹膜內、動脈內、鼻內、利用吸入法、經口、皮下投與、利用局部注射或呈手術植入物形式。

本發明亦有關一種醫藥組成物，其可包含單獨或組合至少一種其他製劑[例如可於任何無菌、生物相容之醫 藥載劑(包括，惟不限於，鹽液、緩衝鹽液、葡萄糖、與水)中投與之安定化化合物]之本發明融合多肽。任何彼等分子可單獨、或組合其他製劑、藥物或激素，於與(諸)賦形劑或醫藥上可接受之載劑混合之醫藥組成物中投與病患。本發明之一具體實例中，醫藥上可接受之載劑於醫藥上具惰性。

本發明亦有關醫藥組成物之投與；此類投與係經口或非經腸而達成。非經腸遞送方法包括局部、動脈內、肌內、皮下、髓內、鞘內、心室內、靜脈內、腹膜內、或鼻內投與。除了活性成分外，彼等醫藥組成物可含有包含醫藥上可使用及促進活性化合物加工成為製劑之賦形劑與輔助劑之適當醫藥上可接受之載劑。有關調配及投與之進一步細節可於最新版之Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed.Maack Publishing Co,Easton,Pa.)中找到。

經口投與用之醫藥組成物可使用此項技藝中熟知之醫藥上可接受之載劑，呈適用於口服投與之劑量調配。此類載劑使醫藥組成物得以調配為供病患攝取用之錠劑、丸劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿劑、懸浮劑等。

用於非經腸投與之醫藥調配物包含活性化合物之水性溶液。供注射用時，本發明醫藥組成物可於水性溶液[較佳為生理上相容之緩衝液例如漢克(Hank)溶液、林格(Ringer)溶液、或生理緩衝鹽液]中調配。水性注射懸浮 劑可含增加懸浮劑黏性之物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、或葡聚醣。附加地，活性化合物懸浮劑可製備為適當油性注射懸浮劑。適當之親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油例如芝麻油、或合成之脂肪酸酯類例如油酸乙酯或三酸甘油酯類、或脂質體。視需要，懸浮劑亦可含適當穩定劑或增加化合物溶解度使得以製備高度濃縮溶液之製劑。

根據本發明之融合多肽可單獨或，需要時，與其他活性化合物組合使用。本發明此外提供特別是用於治療及/或預防上述疾患之包含至少一種根據本發明融合多肽及一或多種進一步活性成分之藥劑。

供組合用之適當活性成分，舉例而言及優先考慮使用：調節脂質代謝之活性成分、抗糖尿病劑、低血壓劑、增進灌流及/或抗血栓製劑、抗氧化劑、趨化素受體拮抗劑、p38-激酶抑制劑、NPY促效劑、食慾激素促效劑、降食慾劑、PAF-AH抑制劑、消炎劑(COX抑制劑、LTB₄-受體拮抗劑)、止痛劑(例如阿司匹靈)、抗抑鬱劑及其他精神病藥物。

本發明特別是有關至少一種根據本發明融合多肽與至少一種改變脂質代謝之活性成分、抗糖尿病劑、降血壓活性成分及/或具抗血栓作用製劑之組合物。

根據本發明之融合多肽較佳為與一或多種下述活性成分組合： ˙調整脂質代謝之活性成分，舉例而言及優先考慮得自HMG-CoA還原酶抑制劑、HMG-CoA還原酶表現抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、ACAT抑制劑、LDL受體感應器、膽固醇吸收抑制劑、聚合膽汁酸吸附劑、膽汁酸再吸收抑制劑、MTP抑制劑、脂肪酶抑制劑、LpL活化劑、纖維酸類、菸鹼酸、CETP抑制劑、PPAR-α、PPAR-γ及/或PPAR-δ促效劑、RXR調節劑、FXR調節劑、LXR調節劑、甲狀腺激素及/或甲狀腺模擬劑、ATP檸檬酸鹽裂解酶抑制劑、Lp(a)拮抗劑、大麻素受體1拮抗劑、瘦素受體促效劑、鈴蟾素受體促效劑、組織胺受體促效劑及抗氧化劑/自由基清除劑組群者；˙於Rote Liste 2004/II第12章中述及之抗糖尿病劑，以及，舉例而言及優先考慮得自磺醯脲類、雙胍類、美格替耐(meglitinide)衍生物、葡萄糖苷酶抑制劑、二肽基肽酶IV抑制劑(DPP-IV抑制劑)、二唑啶酮類、噻唑啶二酮類、GLP 1受體促效劑、升糖素拮抗劑、胰島素增敏劑、CCK 1受體促效劑、瘦素受體促效劑、涉及刺激糖質新生及/或肝醣分解之肝酵素抑制劑、葡萄糖攝取調節劑以及鉀離子通道開放劑(舉例而言，如，揭示於WO 97/26265與WO 99/03861者)組群者；˙降血壓活性成分，舉例而言及優先考慮得自鈣拮抗劑、血管收縮素AII拮抗劑、ACE抑制劑、腎素抑制劑、β-受體阻斷劑、α-受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、 礦物性皮質素受體拮抗劑、ECE抑制劑、ACE/NEP抑制劑及血管肽酶抑制劑組群者；及/或˙抗血栓劑，舉例而言及優先考慮得自血小板凝集抑制劑或抗凝血劑組群者；˙利尿劑；˙血管加壓素受體拮抗劑；˙有機硝酸酯類與NO供體；˙具正面影響心肌收縮活性之化合物；˙抑制環鳥苷單磷酸(cGMP)及/或環腺苷單磷酸(cAMP)降解之化合物，舉例而言，如，磷酸二酯酶(PDE)1、2、3、4及/或5抑制劑，特別是PDE 5抑制劑，例如西地那非(sildenafil)、樂威壯(vardenafil)與犀利士(tadalafil)，以及PDE 3抑制劑，例如米力農(milrinone)；˙利尿肽舉例而言，如，"心房利尿肽"[ANP，阿那立肽(anaritide)]、"B型利尿肽"或"腦利尿肽"[BNP，奈西立肽(nesiritide)]、"C型利尿肽"(CNP)以及尿利鈉肽(urodilatin)；˙前列環素受體(IP受體)促效劑，舉例而言，如，伊洛前列素(iloprost)、貝拉前列素(beraprost)、西卡前列素(cicaprost)；˙I_f通道(奇趣通道)抑制劑，舉例而言，如，伊伐布雷定(ivabradine)； ˙鈣增敏劑，如，舉例而言及優先考慮，左西孟旦(levosimendan)；˙鉀補充劑；˙無關NO，惟依賴血紅素之鳥苷酸環化酶刺激劑，例如，特別是，見述於WO 00/06568,WO 00/06569,WO 02/42301與WO 03/095451中之化合物；˙無關NO與血紅素之鳥苷酸環化酶活化劑，例如，特別是，見述於WO 01/19355、WO 01/19776、WO 01/19778、WO 01/19780、WO 02/070462與WO 02/070510中之化合物；˙人類嗜中性細胞彈性蛋白酶(HNE)抑制劑，舉例而言，如，西維來司(sivelestat)與DX-890(Reltran)；˙抑制訊息傳遞級聯之化合物，舉例而言，如，酪胺酸激酶抑制劑，特別是索拉非尼(sorafenib)、依馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)與爾洛替尼(erlotinib)；及/或˙調節心臟能量代謝之化合物，舉例而言，如，乙莫克舍(etomoxir)、二氯乙酸鹽、雷諾(ranolazine)與曲美他(trimetazidine)。

修飾脂質代謝之活性成分欲被理解為意指，較佳為，得自HMG-CoA還原酶抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、ACAT抑制劑、膽固醇吸收抑制劑、MTP抑制劑、脂肪酶抑制劑、甲狀腺激素及/或甲狀腺模擬劑、菸鹼酸受體促效劑、CETP抑制劑、PPAR-α促效劑、PPAR-γ促效劑、PPAR-δ促效劑、聚合膽汁酸吸附劑、膽汁酸再吸收抑制 劑、抗氧化劑/自由基清除劑以及大麻素受體1拮抗劑組群之化合物。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與得自他汀類之HMG-CoA還原酶抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普拉伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、羅素他汀(rosuvastatin)或匹伐他汀(pitavastatin)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與角鯊烯合成抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，BMS-188494或TAK-475。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與ACAT抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，阿瓦西邁(avasimibe)、美利那邁(melinamide)、帕替邁(pactimibe)、伊福西邁(eflucimibe)或SMP-797。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與膽固醇吸收抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，伊增替邁(ezetimibe)、替奎安(tiqueside)或帕馬苷(pamaqueside)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與MTP抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，英利塔派(implitapide)、BMS-201038、R-103757或JTT-130。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽 係與脂肪酶抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，奧利司他(orlistat)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與甲狀腺激素及/或甲狀腺模擬劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，D-甲狀腺素或3,5,3'-三碘甲狀腺胺酸(T3)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與菸鹼酸受體促效劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，菸鹼酸、阿昔莫司(acipimox)、阿昔呋喃(acifran)或瑞帝可(radecol)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與CETP抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，達塞曲匹(dalcetrapib)、BAY 60-5521、安塞曲匹(anacetrapib)或CETP疫苗(CETi-1)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與例如得自噻唑啶二酮類之PPAR-γ促效劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，吡格列酮(pioglitazone)或羅格列酮(rosiglitazone)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與PPAR-δ促效劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，GW-501516或BAY 68-5042。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與聚合膽汁酸吸附劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，消膽胺(cholestyramine)、考來替泊(colestipol)、 考來索凡(colesolvam)、CholestaGel或考來替邁(colestimide)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與膽汁酸再吸收抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，ASBT(=IBAT)抑制劑舉例而言，如，AZD-7806、S-8921、AK-105、BARI-1741、SC-435或SC-635。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與抗氧化劑/自由基清除劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，普羅布考(probucol)、AGI-1067、BO-653或AEOL-10150。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與大麻素受體1拮抗劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，利莫納班(rimonabant)或SR-147778。

抗糖尿病劑欲被理解為意指，較佳為，胰島素與胰島素衍生物，以及口服有效之降血糖活性成分。於此，胰島素與胰島素衍生物包括動物、人類或生物技術來源之胰島素以及其混合物。口服有效之降血糖活性成分較佳為包括磺醯脲類、雙胍類、美格替耐衍生物、葡萄糖苷酶抑制劑與PPAR-γ促效劑。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與胰島素組合投與。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與磺醯脲組合投與，如，舉例而言及優先考慮，甲苯 磺丁脲、格列苯脲(glibenclamide)、格列美脲(glimepiride)、泌樂得(glipizide)或甲磺雙環脲(gliclazide)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與雙胍類組合投與，如，舉例而言及優先考慮，二甲雙胍。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與美格替耐衍生物組合投與，如，舉例而言及優先考慮，瑞格列耐(repaglinide)或那格列耐(nateglinide)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與葡萄糖苷酶抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，米格列醇(miglitol)或阿卡波糖(acarbose)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與DPP-IV抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，西他列汀(sitagliptin)與維格列汀(vildagliptin)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與例如得自噻唑啉二酮類之PPAR-γ促效劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，吡格列酮或羅格列酮。

低血壓劑較佳為被理解為意指得自鈣拮抗劑、血管收縮素AII拮抗劑、ACE抑制劑、β-受體阻斷劑、α-受體阻斷劑與利尿劑組群之化合物。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與鈣拮抗劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，硝苯地平(nifedipine)、氨氯地平(amlodipine)、維拉帕米 (verapamil)或地爾硫卓(diltiazem)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與血管收縮素AII拮抗劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，氯沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)、坎地沙坦(candesartan)、恩布沙坦(embusartan)、奧美沙坦(olmesartan)或替米沙坦(telmisartan)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與ACE抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，依那普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、賴諾普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、地拉普利(delapril)、福辛普利(fosinopril)、喹那普利(quinopril)、培朵普利(perindopril)或群多普利(trandopril)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與β-受體阻斷劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，普萘洛爾(propranolol)、阿替洛爾(atenolol)、噻嗎洛爾(timolol)、吲哚洛爾(pindolol)、阿普洛爾(alprenolol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、布拉洛爾(bupranolol)、美替洛爾(metipranolol)、納多洛爾(nadolol)、美吲哚洛爾(mepindolol)、卡拉洛爾(carazalol)、索他洛爾(sotalol)、美托洛爾(metoprolol)、倍他洛爾(betaxolol)、塞利洛爾(celiprolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡替洛爾(carteolol)、艾司洛爾(esmolol)、拉貝洛爾(labetalol)、卡維地洛(carvedilol)、阿達洛爾(adaprolol)、蘭地洛爾(landiolol)、奈必洛爾(nebivolol)、 依泮洛爾(epanolol)或佈新洛爾(bucindolol)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與α-受體阻斷劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，哌唑嗪(prazosin)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與利尿劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，服樂泄麥(furosemide)、布美他尼(bumetanide)、托泄麥(torsemide)、苄氟噻(bendroflumethiazide)、氯噻(chlorothiazide)、氫氯噻(hydrochlorothiazide)、氫氟噻(hydroflumethiazide)、甲氯噻(methyclothiazide)、泊利噻(polythiazide)、三氯噻(trichloromethiazide)、氯噻酮(chlorothalidone)、吲達帕胺(indapamide)、美托拉宗(metolazone)、喹乙唑酮(quinethazone)、乙醯唑胺(acetazolamide)、二氯苯磺胺(dichlorophenamide)、甲醋唑胺(methazolamide)、甘油、異山梨醇、甘露糖醇、阿米洛利(amiloride)或胺苯喋啶(triamteren)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與醛固酮或礦物性皮質素受體拮抗劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，螺內酯或依普利酮(eplerenone)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與血管加壓素受體拮抗劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，考尼伐坦(conivaptan)、托伐普坦(tolvaptan)、利昔伐坦(lixivaptan)或SR-121463。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽 係與有機硝酸酯或NO供體，如，舉例而言及優先考慮，硝普鈉(sodium nitroprusside)、硝酸甘油、單硝酸異山梨酯、二硝酸異山梨酯、嗎多明(molsidomin)或SIN-1，或與吸入性NO組合投與。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與正面影響心肌收縮之化合物組合投與，如，舉例而言及優先考慮，強心配糖體[地高辛(digoxin)]、β-腎上腺素與多巴胺能促效劑例如異丙腎上腺素(isoproterenol)、腎上腺素(adrenaline)、去甲腎上腺素、多巴胺或多巴酚丁胺(dobutamine)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與抗交感神經藥物(antisympathotonics)例如利血平(reserpine)、可樂定(clonidine)或α-甲基多巴(α-methyldopa)，或與鉀通道促效劑例如米諾地爾(minoxidil)、二氮(diazoxide)、雙肼肽(dihydralazine)或肼屈(hydralazine)，或與釋放氧化氮之物質[例如甘油硝酸酯或硝普鈉]組合投與。

抗血栓劑欲被理解為意指，較佳為，得自血小板聚集抑制劑或抗凝血劑組群之化合物。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與血小板聚集抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，阿司匹靈、氯吡格雷(clopidogrel)、噻氯匹定(ticlopidine)或雙嘧達莫(dipyridamol)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽 係與凝血酶抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，希美加群(ximelagatran)、美拉加群(melagatran)、達比加群(dabigatran)、比伐盧定(bivalirudin)或克立生(clexane)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與GPIIb/IIIa拮抗劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，替羅非班(tirofiban)或阿昔單抗(abciximab)。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與Xa因子抑制劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，利伐沙班(rivaroxaban)(BAY 59-7939)、DU-176b、阿哌沙班(apixaban)、奧米沙班(otamixaban)、非代沙班(fidexaban)、拉扎沙班(razaxaban)、磺達肝癸(fondaparinux)、依居帕努(idraparinux)、PMD-3112、YM-150、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX 9065a、DPC 906、JTV 803、SSR-126512或SSR-128428。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與肝素或低分子量(LMW)肝素衍生物組合投與。

於本發明較佳具體實例中，根據本發明之融合多肽係與維生素K拮抗劑組合投與，如，舉例而言及優先考慮，香豆素。

於本發明說明書中，特別優先考慮使用包含至少一種根據本發明之融合多肽以及一或多種選自包括HMG-CoA還原酶抑制劑(他汀類)、利尿劑、β-受體阻斷劑、有機硝酸酯與NO供體、ACE抑制劑、血管收縮素 AII拮抗劑、醛固酮與礦物性皮質素受體拮抗劑、血管加壓素受體拮抗劑、血小板聚集抑制劑與抗凝血劑組群之進一步活性成分之組合物，以及其治療及/或預防上述疾患之用途。

再者，本發明提供包含通常與一或多種惰性無毒之醫藥上適當之輔助劑一起之至少一種根據本發明融合多肽之藥劑，以及其供上述目的之用途。

有效治療劑量

適用於本發明之醫藥組成物包括其中含有效量之活性成分以達成意指目的(例如心臟衰竭)之組成物。有效劑量之決定完全在熟習此項技藝者能力範圍之內。

就任何化合物而言，有效治療劑量最初可於體外試驗(例如LGR7受體活化作用)中、擬體內於離體灌流大鼠心臟中、或於動物模式(通常為小鼠、兔、狗、或豬)中評估。動物模式亦用以達成期望之濃度範圍及投與途徑。然後可使用此等資訊確定於人體中之有用劑量及投與途徑。

有效治療劑量係指改善症狀或健康狀態之融合多肽之量。此等化合物之治療功效與毒性可於體外或實驗動物中利用標準醫藥程序測定，例如，ED50(50%族群治療有效之劑量)與LD50(使50%族群致命之劑量)。治療與毒性效應間之劑量比為治療指數，可以ED50/LD50比表示；以展現大的治療指數之醫藥組成物較佳。使用從體外試驗及動物研究獲得之數據制定供人類使用之劑 量範圍。此等化合物之劑量最好在包含極少或無毒性ED50之循環濃度範圍內。此範圍內之劑量視所用劑量型、病患敏感性、及投與途徑而不同。

視投與途徑而定，正常劑量可從總劑量0.1至100,000毫克有所不同。文獻中提供有關特定劑量及遞送方法之指引；參見美國專利案No.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。熟習此項技藝者使用比蛋白質或其抑制劑多之多核苷酸之不同調配物。同樣地，多核苷酸或多肽之遞送對特定細胞、條件、位置等具特異性。

茲利用下述實施例進一步敘述本發明。所提供之實施例僅藉由參照詳細具體實例說明本發明。彼等例示，於說明本發明特定具體態樣之同時，不擬對所揭示發明之範圍構成侷限。

除非另行詳細說明，否則所有實施例均使用熟習此項技藝者熟知及例行之標準技術進行。下述實施例之例行分子生物學技術可如標準實驗室手冊(例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)所述進行。

進一步較佳具體實例為：

1.一種具有包含A-L-B之鬆弛素活性之融合多肽，其中B包含鬆弛素B鏈多肽或其功能性變異體，A包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變異體，及 L係連接子多肽。

2.根據第1項之融合多肽，其中B係鬆弛素B鏈多肽或其功能性變異體，A係鬆弛素A鏈多肽或其功能性變異體，及L係連接子多肽。

3.根據第1或2項之融合多肽，其中該鬆弛素B鏈係鬆弛素2B或鬆弛素3B鏈。

4.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A鏈係鬆弛素2A或鬆弛素3A鏈。

5.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A鏈係鬆弛素2A鏈。

6.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A鏈係鬆弛素3A鏈。

7.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A鏈係鬆弛素2A鏈及該鬆弛素B鏈係鬆弛素2B鏈。

8.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A及B鏈為人類鬆弛素A及B鏈。

9.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該融合多肽進一步包含至少一個延長之半衰期基團。

10.根據第9項之融合多肽，其中該半衰期延長之基團係非蛋白性質或蛋白性質半衰期延長基團。

11.根據第9或10項之融合多肽，其中該多肽具下式(R1)m-(S1)n-A-L-B-(S2)o-(R2)p， 式中R1與R2係蛋白性質半衰期延長基團，S1與S2係延伸胜肽，及其中m、n、o與p獨立地為數字0或1，惟m、n、o與p至少一者為1。

12.根據第11項之融合多肽，其中m與n為0及o與p為1。

13.根據第11項之融合多肽，其中m與n為1及o與p為0。

14.根據第11項之融合多肽，其中m為1及n、o與p為0。

15.根據第11項之融合多肽，其中m、n與o為0及p為1。

16.根據第11至15項之任一項之融合多肽，其中R1與R2係包含於由免疫球蛋白Fc功能區、血清白蛋白、轉鐵蛋白與血清白蛋白結合蛋白構成之蛋白性質半衰期延長基團組群中之蛋白性質半衰期延長基團。

17.根據第10至16項之任一項之融合多肽，其中該蛋白性質半衰期延長基團係IgG1 Fc功能區。

18.根據第10至17項之任一項之融合多肽，其中該蛋白性質半衰期延長基團為人類。

19.根據第10項之融合多肽，其中該非蛋白性質半衰期延長基團係PEG或HES。

20.根據第11至19項之任一項之融合多肽，其中該延伸 多肽S1與S2為1至25個胺基酸長。

21.根據第11至20項之任一項之融合多肽，其中該延伸多肽S1與S2為4至10個胺基酸長，較佳為10個胺基酸長。

22.根據第21項之融合多肽，其中該延伸多肽S1與S2包含於由SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、與SEQ ID NOs：150所揭示多肽構成之延伸多肽組群中。

23.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L為6至14個胺基酸長。

24.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L為7至11個胺基酸長。

25.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L為8、9、或10個胺基酸長。

26.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L為9個胺基酸長。

27.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L包含於由具有6、7、8、9、10、11、12、13與14個胺基酸長的連接子構成之連接子組群中。

28.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中於連接子多肽L中，除4個胺基酸殘基外之該連接子L全部由Gly及/或Ser殘基構成，其餘4個胺基酸殘基則係選自天然胺基酸之組群。

29.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L至少包含一個Gly、Ser、Arg、Cys、Leu及/或Lys 殘基。

30.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L包含Gly與Ser殘基。

31.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L由Gly與Ser殘基構成。

32.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L包含Gly與Ser殘基，且Gly對Ser之比例至少為3比1。

33.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L包含於由如SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145與SEQ ID NO：146所揭示多肽構成之連接子多肽組群中。

34.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A鏈為人類鬆弛素2A鏈(SEQ ID NO：117)，及鬆弛素B鏈為人類鬆弛素2B鏈(SEQ ID NO：119)。

35.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中A係人類鬆弛素2A鏈(SEQ ID NO：117)，及B係人類鬆弛素2B鏈(SEQ ID NO：119)。

36.根據前述諸項任一項之融合多肽，其包含如表3所述之多肽。

37.根據前述諸項任一項之融合多肽，其中A-L-B係選自包括scR3、scR4、scR5、無標記scR3、無標記scR4、 無標記scR5、scR-Fc5、scR-Fc6與scR-Fc7之A-L-B多肽組群。

38.一種如表3所述之融合多肽。

39.一種融合多肽，其係選自包括scR3、scR4、scR5、無標記scR3、無標記scR4、無標記scR5、scR-Fc5、scR-Fc6與scR-Fc7之組群。

40.一種多核苷酸，其編碼根據前述諸項任一項之融合多肽。

41.一種載體，其包含根據第40項之多核苷酸。

42.一種宿主細胞，其包含根據第41項之載體或根據第40項之多核苷酸。

43.根據第42項之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核或原核細胞。

44.根據第42或43項之宿主細胞，其中該真核宿主細胞為哺乳動物、酵母、昆蟲或植物細胞。

45.根據第44項之宿主細胞，其中該哺乳動物宿主細胞為CHO細胞。

46.根據第43項之宿主細胞，其中該原核宿主細胞為細菌細胞，較佳為大腸桿菌細胞。

47.一種根據第1至39項之任一項之多肽之製法，該製法包括培養如第42至46項之宿主細胞及單離該多肽之步驟。

48.一種醫藥組成物，其包含根據第1至39項之任一項之融合多肽。

49.根據第48項之醫藥組成物或根據第1至39項之任一項之融合多肽，係作為藥劑用。

50.根據第48及49項之醫藥組成物或根據第1至39項之任一項之融合多肽，係作為藥劑用以治療心血管疾病、肺部疾病、纖維化病症或腎臟疾病。

51.一種心血管疾病、肺部疾病、纖維化病症或腎臟疾病之治療法，該治療法包括投與有效治療劑量之根據第48及49項之醫藥組成物或根據第1至39項之任一項之融合多肽。

52.根據第50及51項之治療法，其中該心血管疾病係冠心病、急性冠狀動脈症候群、心臟衰竭、與心肌梗塞。

實例 實驗流程 鬆弛素變異體之建構：

利用化學基因合成法產生鬆弛素變異體之cDNA序列；將合成之基因次轉殖至哺乳動物表現載體pCEP4(Invitrogen，目錄編號V044-50)中。有關用於正確分泌所得蛋白質之訊息領導序列，係使用LDL受體相關蛋白質(LRP，胺基酸組成MLTPPLLLLLPLLSALVAA)或CD33(胺基酸組成MPLLLLLPLLWAGALA)之領導序列。根據廠商說明，使用限制酶HindIII與BamH1，進行合成建構體之次轉殖。

鬆弛素變異體之表現：

就小規模表現(達2毫升培養容積)而言，係根據廠商說明，使用Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen，目錄編號11668-019)短暫轉染HEK293(ATCC，目錄編號CRL-1573)細胞株。於37℃，5%二氧化碳之潮濕培養箱中，使細胞於D-Mem F12(Gibco，#31330)、1%青黴素-鏈黴素(Gibco，#15140)與10%胎牛血清(FCS，Gibco，#11058)中進行培養。

轉染3至5天後，使用穩定轉染之CHO-CRE-GR7細胞株測定轉染細胞有條件培養液之活性。

就大規模表現(10毫升培養容積及更多)而言，則如Tom et al.,2007中所述，使建構體於哺乳動物細胞中短暫表現。簡言之，將表現質體轉染至HEK293-6E細胞中，並於費恩巴赫瓶(Fernbach-Flasks)或波浪袋(Wave-Bags)中培養。表現係於F17培養基(Invitrogen)中，37℃下，進行5至6天。轉染後，補充5克/公升胰蛋白腖TN1(Organotechnie)、1%超低(Ultra-Low)IgG FCS(Invitrogen)與0.5 mM丙戊酸(Sigma)。

鬆弛素變異體之純化：

從哺乳動物細胞培養上清液純化鬆弛素Fc-融合建構體。首先，離心以自細胞碎屑液中得到澄清上清液。利用蛋白A[蛋白A(MabSelect Sure，GE Healthcare)]親和層析法及隨後之粒徑排阻層析法(SEC)純化蛋白質；因此，將上清液施加於先前已於pH 7.4之PBS(Sigma /Aldrich)中平衡之蛋白A管柱中，以10倍管柱容積之pH 7.4 PBS+500 mM NaCl移除污染物。以50 mM乙酸鈉(pH 3.5)+500 mM NaCl溶洗出鬆弛素Fc融合建構體，然後於Superdex 200管柱之PBS(pH 7.4)中，利用SEC進一步純化。

關於c-Myc標記蛋白或多肽之純化，係根據廠商說明，使用c-Myc標記蛋白溫和純化凝膠(Biozol Diagnostic，Protein Mild Purification Gel，目錄編號3306)。

關於His標記蛋白或多肽之純化，係根據廠商說明，使用Ni-NTA離心層析管柱(Qiagen，Ni-NTA Spin Kit，目錄編號31314)。

表現鬆弛素變異體之定量：

關於分泌及純化重組鬆弛素變異體之定量，係根據廠商說明，使用市售可得之定量ELISA(R&D Systems，Human Relaxin-2 Quantikine ELISA Kit，目錄編號DRL200)。

此外，若干建構體蛋白係使用FC-ELISA定量。就Fc ELISA而言，係於4℃，每毫升5微克之濃度下，以抗-Fc抗體(SigmaAldrich，目錄編號A2136)塗覆96槽微量滴定盤(Nunc，Maxi Sorp black，目錄編號460918)過夜。洗滌滴定盤一次，每槽使用50微升由PBS與0.05% Tween 20(SigmaAldrich，目錄編號63158)緩衝液組成之緩衝液。添加30微升封阻緩衝液(Candor Bioscience， 目錄編號113500)，使滴定盤於37℃培養1小時。洗滌滴定盤3次，每槽使用50微升PBS/0.05% Tween 20緩衝液。添加試樣，使滴定盤於37℃培養1小時。若需要，則須使用上述封阻緩衝液稀釋試樣。培養後，洗滌滴定盤3次，每槽使用50微升PBS/0.05% Tween 20緩衝液。

欲檢測時，添加30微升已於10%封阻緩衝液中以1：10000稀釋之抗-h-Fc-POD(SigmaAldrich，目錄編號A0170)，於37℃培養1小時。培養後，洗滌滴定盤3次，每槽使用50微升PBS/0.05% Tween 20緩衝液。添加30微升BM藍色基質(Blue Substrate)POD(Roche Diagnostics，目錄編號11484281001)，培養5分鐘後，添加1 M硫酸溶液以終止反應。使用Tecan Infinite 500讀取計(吸光模式，450nm消光，690nm發射)測量吸光。

測定Myc標記蛋白濃度時，係根據廠商說明，使用人類c-Myc ELISA套組(EIAab & USCNLIFE，Wuhan EIAab Science Co.,Ltd，目錄編號E1290h)。

測定His標記蛋白濃度時，係根據廠商說明，使用His-標記蛋白質ELISA套組(BIOCAT GmbH，目錄編號AKR-130)。

測定HA(血球凝集素)標記蛋白濃度時，係根據廠商說明，使用人類血球凝集素(HA)ELISA套組(Hölzel Diagnostika，目錄編號CSB-E09360h)。

活性測試：

以環狀AMP反應元件(CRE)螢光素酶報導基因建構體(Biomyx Technology，pHTS-CRE，目錄編號P2100)穩定地轉染CHO K1細胞(ATCC，目錄編號CCL-61)，產生CHO-CRE-螢光素酶細胞株。

接著以轉殖2271個鹽基對長之DNA片段至哺乳動物表現載體pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目錄編號V79520)之人類LGR7/RXFP1受體(登錄號碼NM_021634.2)穩定地轉染此細胞株，產生CHO-CRE-LGR7細胞株。於D-Mem F12(Gibco，#31330)、2 mM Glutamax(Gibco，#35050)、100 nM Pyruvat(Gibco，#11360-070)、20 mM Hepes(Gibco，#15630)、1%青黴素-鏈黴素(Gibco，#15140)與10%胎牛血清(FCS，Gibco，#11058)中，培養此細胞株。

欲激發時，將培養基換成OptiMem(Gibco，#11058)+含不同濃度重組表現之鬆弛素變異體蛋白(通常自100 nM濃度開始，接著進行1：2稀釋)之1% FCS。正對照組係使用市售可得之重組表現人類鬆弛素2(Genbank登錄編號NP_604390.1)(R&D Systems，目錄編號6586-RN-025)。接著，於37℃，5%二氧化碳之潮濕培養箱中，培養細胞6小時。6小時後，使用螢光素酶分析系統(Promega，# E1500)及使用Tecan Infinite 500讀取計(發冷光模式，1000毫秒積分時間，測量時間30秒)測定細胞之螢光素酶活性。

應用電腦程式Graph Pad Prism第5版，使用相對發 冷光單位測定不同分子之EC50值。

欲測試鬆弛素以及本發明融合多肽之替代活性時，使用具有內源表現LGR7受體之細胞株(例如THP1，ATCC目錄編號TIB-202)或初代細胞[例如Celprogen Inc.，Human Cardiomyocyte Cell Culture(人類心肌細胞培養物)，目錄編號36044-15]，根據廠商說明培養彼等細胞。

檢測鬆弛素或鬆弛素變異體誘發之cAMP產生之方法為此項技藝中已知。例如，使用cAMP ELISA(例如IBL International GmbH，cAMP ELISA，目錄編號CM 581001)，根據廠商說明進行此類測量。

檢測鬆弛素或鬆弛素變異體誘發之PI3激酶活化之方法為此項技藝中已知。例如，使用PI3-激酶HTRF分析(例如Millipore，PI3-Kinase HTRF Assay，目錄編號33-016)，根據廠商說明進行此類測量。

聚乙二醇化

針對半胱胺酸殘基之聚乙二醇化，於聚乙二醇化之前，通常係以還原劑例如二硫蘇糖醇(DDT)處理融合多肽；接著利用任何習知方法(例如脫鹽法)移除還原劑。PEG與半胱胺酸殘基之共軛結合通常於pH 6-9之適當緩衝液中，溫度4℃至25℃不等，進行多達16小時。

一般將理解，聚乙二醇化係經設計俾使產生有關連接之PEG分子數、此等分子之大小與形狀(例如彼等是否為直鏈或分支鏈)、及於融合多肽中之連接部位之最適 分子。欲使用聚合物之分子量，舉例而言，可根據欲達成之期望功效進行選擇。

免疫原性測試

免疫原性測試係使用計算蛋白質或胜肽對MHCII複合物之可能結合親和力之電腦程式NetMHCIIpan(Center for Biological Sequence Analysis；Department of Systems Biology；Technical University of Denmark)進行。所計算之結合親和力越高，誘發感興趣蛋白質或多肽之抗體之風險越大。

T細胞抗原決定部位圖譜定位之體外測定係根據Reijonen與Kwok發表之實驗流程[Reijonen H.,Kwok WW.(2003)Use of HLA class II tetramers in tracking antigen-specific T cells and mapping T-cell epitopes.Methods 29：282-288]進行。

單鏈鬆弛素變異體之建構 單鏈鬆弛素變異體最適連接子長度之決定

如上述，產生以不同連接子長度連接A與B鏈之單鏈鬆弛素變異體。如諸序列所述，就蛋白質表現之替代測定方案而言，於若干建構體中，係添加Myc標記(胺基酸序列EQKLISEEDL)至有或無血球凝集素標記(胺基酸序列YPYDVPDYA)之A鏈之N終端(N terminal end)，以及添加6個組胺酸標記(胺基酸序列HHHHHH)至B鏈之C終端(C terminal end)。

實例1：scR1

於scR1中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為三個胺基酸長，係由具GlyGlyGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端，及添加血球凝集素標記與6個組胺酸標記至B鏈之C終端。

實例2：scR2

於scR2中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為五個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端，及添加血球凝集素標記與6個組胺酸標記至B鏈之C終端。

實例3：scR3

於scR3中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為七個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端，及添加血球凝集素標記與6個組胺酸標記至B鏈之C終端。

實例4：scR4

於scR4中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為九個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈 之N終端，及添加血球凝集素標記與6個組胺酸標記至B鏈之C終端。

實例5：scR5

於scR5中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為十一個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端，及添加血球凝集素標記與6個組胺酸標記至B鏈之C終端。

實例6：scR6

於scR6中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為十五個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端，及添加血球凝集素標記與6個組胺酸標記至B鏈之C終端。

實例7：scR7

於scR7中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為六個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例8：scR8

於scR8中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連 接子序列之組成為十二個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例9：scR9

於scR9中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為十三個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例10：scR10

於scR10中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為十四個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例11：scR11

於scR11中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為十個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyCysGlyGlySerGly序列之多肽構成。未聚乙二醇化融合多肽之活性測試係使用未純化之蛋白質。

為了增進此建構體之生物半衰期，乃遵循如上述之實驗流程，進行連接A鏈與B鏈之連接子內半胱胺酸之聚乙二醇化。根據如上述之實驗流程，測定聚乙二醇化變異體之活性。

實例12：scR12

於scR12中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為十個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyLysGlyGlySerGly序列之多肽構成。未聚乙二醇化融合多肽之活性測試係使用未純化之蛋白質。

為了增進此建構體之生物半衰期，遵循如上述之實驗流程將連接A鏈與B鏈之連接子內之離胺酸聚乙二醇化可為一種選擇。根據如上述之實驗流程，測定聚乙二醇化變異體之活性。

實例13：scR13

於scR13中，連接人類鬆弛素2之A鏈C終端與B鏈N終端之連接子序列之組成為九個胺基酸長，係由具LysArgSerLeuSerArgLysLysArg序列之多肽構成。活性測試係使用未純化之融合多肽。

實例14：scR14

於scR14中，連接人類鬆弛素3(登錄編號NP_543140.1)之A鏈C終端與B鏈N終端之連接子序列之組成為九個胺基酸長，將由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。根據如 上述之實驗流程測定活性；活性測試係使用未純化之融合多肽。

實例15：scR15

於scR15中，連接人類鬆弛素3(登錄編號NP_543140.1)之A鏈C終端與B鏈N終端之連接子序列之組成為九個胺基酸長，將由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例16：scR16

於scR16中，連接人類鬆弛素2之B鏈C端與A鏈N端之連接子序列之組成為九個胺基酸長，將由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例17：scR17

於scR17中，連接人類鬆弛素3(登錄編號NP_543140.1)之A鏈C端與人類鬆弛素2(登錄編號NP_604390.1)之B鏈N端之連接子序列之組成為九個胺基酸長，將由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例18：scR18

於scR18中，連接人類鬆弛素2(登錄編號NP_604390.1)之B鏈C端與人類鬆弛素3(登錄編號NP_543140.1)之A鏈N端之連接子序列之組成為九個胺基酸長，將由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例19：scR19

於scR19中，連接人類鬆弛素2(登錄編號NP_604390.1)之A鏈C端與人類鬆弛素3(登錄編號NP_543140.1)之B鏈N端之連接子序列之組成為九個胺基酸長，將由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例20：scR20

於scR20中，連接人類鬆弛素3(登錄編號NP_543140.1)之B鏈C端與人類鬆弛素2(登錄編號NP_604390.1)之A鏈N端之連接子序列之組成為九個胺基酸長，將由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

全部單鏈鬆弛素變異體之圖解表述示於圖2。

表1摘述有關各種scR建構體之表現以及生物活性之結果。鑑於連接子為3、5、及15個胺基酸長之單鏈鬆弛素變異體於上述分析中未顯示任何可檢測出之生物活性，出乎意外地，所測試之長度為6、7、9、10、11、12、13、及14個胺基酸之連接子導致產生展現生物活性可與人類鬆弛素2相較之單鏈變異體。

連接A鏈C端及B鏈N端之連接子長度對生物活性分子之產生雖然相當重要，惟連接子之胺基酸組成可變；其實例為scR11至scR13；從而，scR11及scR12於連接子序列中具有額外胺基酸(scR11連接子中之C及scR12連接子中之K)，或建構體scR13之情形下，具有與前述連接子序列未顯示任何同源性之連接子序列。

單鏈鬆弛素變異體之產生不限於鬆弛素2，建構體scR14與15為鬆弛素3之單鏈變異體。鬆弛素2與鬆弛素3間之整體序列同源性雖低，惟係胰島素超級家族成員之此二基因之基因體組織完全相同。如同鬆弛素2，鬆弛素3係由典型之B鏈-C鏈-A鏈結構組成。與鬆弛素2相同地，從鬆弛素3前胜肽利用前激素轉化酶I與II切割出C鏈，B及A鏈經由雙硫橋鍵連接，以此形成活性分子。scR14與scR15建構體為鬆弛素3之單鏈變異體，具有與鬆弛素2和建構體scR4前例已示之連接A鏈C端與B鏈N端之相同連接子分子。scR14與scR15展現可檢測出之生物活性。

scR16、scR17、scR18、scR19、與scR20為鬆弛素 3之A鏈與鬆弛素2之B鏈間(反之亦然)之嵌合體。從而，就活化LGR7受體而言，必須分別強制使鬆弛素2及鬆弛素3之B鏈位於鬆弛素3/鬆弛素2嵌合體之C端部位。

劑量效應曲線及比較hRelaxin2、scR3、scR4、與 scR5活性之相應EC50值示於圖4a；關於hRelaxin2、scR7、scR8、scR9、與scR10者示於圖4b；關於hRelaxin2、scR11與scR12者示於圖4c；關於hRelaxin2、hRelaxin3、scR14與scR15者示於圖4d；及關於hRelaxin3與scR17者示於圖4e。

結論：結果顯示，連接子長度大於5個胺基酸及小於15個胺基酸為單鏈鬆弛素變異體之生物活性所必須；其中A鏈之C端係經由此等連接子連接於B鏈之N端。再者，本發明單鏈鬆弛素之產生不局限於鬆弛素2。

鬆弛素2與其相應受體LGR7之結合為二步驟過程。於第一步驟中，人類鬆弛素2之A鏈結合於受體之N端胞外功能區。於第二步驟中，此結合之胞外功能區進行構形變化，鬆弛素B鏈與LGR7跨膜功能區間之二次交互作用傳介受體之訊息傳遞。此第二步驟對於配體-受體複合物之活化最為相關。因此，由於變異體scR17含人類鬆弛素3而非人類鬆弛素2之A鏈之事實，導致產生活性減少之建構體。於含人類鬆弛素3之B鏈而非人類鬆弛素2之B鏈之變異體scR19中，觀察到活性之進一步減少。與胞外功能區之結合經由人類鬆弛素2之A鏈發生，惟就活化LGR7而言，經由鬆弛素3之B鏈為次佳。鬆弛素3之相應受體為LGR8。因此，很可能，使用scR19作為配體及LGR8作為相應受體時，訊息強度高得多；此亦為調節本發明融合多肽活性之方法。

scR13未純化為活性降低之一種解釋，因為試樣中 之可能雜質導致濃度之不正確測定，或對細胞系螢光素酶分析之準確性可能具負面影響。

總之，此顯示有用之連接子序列不局限於富含甘胺酸/絲胺酸之序列，因為其他連接子序列(於本發明長度內)亦能導致完整活性之單鏈鬆弛素。

具增進之生物半衰期之單鏈鬆弛素融合蛋白之建構

為了增進單鏈鬆弛素變異體之生物半衰期，乃設計將免疫球蛋白分子之Fc部分添加於單鏈鬆弛素變異體N端或C終端之建構體。

從而，使單鏈鬆弛素變異體直接融合於免疫球蛋白之Fc部分，或利用不同長度及胺基酸組成之多肽連接。

增進多肽生物半衰期之另一選擇為以如轉鐵蛋白(登錄編號P02787)或白蛋白(登錄編號P02768)之多肽融合[SR Schmid(2009)]。

聚乙二醇化為增進多肽生物半衰期常見使用之方法；以此方式添加聚乙二醇聚合物鏈，使其共價連接於多肽。從而，使PEG之反應性衍生物與目標多肽一起培育。與PEG反應之較佳胺基酸為半胱胺酸與離胺酸。Pasut and Veronese(2009))

鬆弛素融合蛋白-鬆弛素-Fc之產生

欲增進生物半衰期，乃利用化學基因合成法，使人類IgG1之Fc部分與人類鬆弛素2結合。使人類鬆弛素2之羧基端部分(根據其基因體組織排列如下：B鏈-C鏈-A鏈)融合於人類IgG1 Fc部分之N終端，從而使融 合蛋白之此二部分利用由具有編碼凝血因子Xa切割位置之IleGluGlyArgMetAsp序列之多肽構成之6個胺基酸長之連接子序列連接。然而，利用CHO-CRE-LGR7細胞株測定結果，鬆弛素Fc顯示無活性。

實例16：scR-Fc 1

於scR-Fc 1中，連接scR 4之C終端與人類IgG1 Fc部分之N終端之連接子序列之組成為6個胺基酸長，係由具有編碼凝血因子Xa切割位置之IleGluGlyArgMetAsp序列之多肽構成。此多肽與Fc部分取代scR 4中之血球凝集素標記與6個組胺酸標記。就蛋白質表現之替代測定方案而言，係添加Myc標記至A鏈之N終端。

實例17：scR-Fc 2

於scR-Fc 2中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與人類IgG1 Fc部分之N終端之連接子序列之組成為4個胺基酸長，係由具GlyGlySerPro序列之多肽構成。與scR-Fc 1對照下，此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。

實例18：scR-Fc 3

於scR-Fc 3中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與人類IgG1 Fc部分之N終端之連接子序列之組成為7個胺基酸長，係由具GlyGlySerGlyGlySerPro序列之多肽構成。與scR-Fc 1對照下，此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。

實例19：scR-Fc 4

於scR-Fc 4中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與人類IgG1 Fc部分之N終端之連接子序列之組成為10個胺基酸長，係由具GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro序列之多肽構成。與scR-Fc 1對照下，此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。

實例20：scR-Fc 5

於scR-Fc 5中，連接單鏈鬆弛素scR4之N終端與人類IgG1 Fc部分之C終端之連接子序列之組成為4個胺基酸長，係由具GlyGlySerPro序列之多肽構成。該Fc部分取代A鏈N終端之Myc標記。此建構體之C終端不具血球凝集素標記及/或6個組胺酸標記。

實例21：scR-Fc 6

於scR-Fc 6中，連接單鏈鬆弛素scR4之N終端與人類IgG1 Fc部分之C終端之連接子序列之組成為7個胺基酸長，係由具GlyGlySerGlyGlySerPro序列之多肽構成。該Fc部分取代A鏈N終端之Myc標記。此建構體之C終端不具血球凝集素標記及/或6個組胺酸標記。

實例22：scR-Fc 7

於scR-Fc 7中，連接單鏈鬆弛素scR4之N終端與人類IgG1 Fc部分之C終端之連接子序列之組成為10個胺基酸長，係由具GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro序列之多肽構成。該Fc部分取代A鏈N終端之Myc標記。此建構體之C終端不具血球凝集素標記及/或6個組 胺酸標記。

實例23：scR-Fc 8

於scR-Fc 8中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與大鼠IgG2b Fc部分之N終端之連接子序列之組成為4個胺基酸長，係由具GlyGlySerPro序列之多肽構成。此外，6個組胺酸標記添加於Fc部分之C終端。與scR4對照下，此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。該大鼠IgG2b Fc部分取代血球凝集素標記及6個組胺酸標記。

實例24：scR-Fc 9

於scR-Fc 9中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與大鼠IgG2b Fc部分之N終端之連接子序列之組成為7個胺基酸長，係由具GlyGlySerGlyGlySerPro序列之多肽構成。此外，6個組胺酸標記添加於Fc部分之C終端。與scR4對照下，此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。該大鼠IgG2b Fc部分取代血球凝集素標記及6個組胺酸標記。

實例25：scR-Fc 10

於scR-Fc 10中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與大鼠IgG2b Fc部分之N終端之連接子序列之組成為10個胺基酸長，係由具GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro序列之多肽構成。此外，6個組胺酸標記添加於Fc部分之C終端。與scR4對照下，此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。該大鼠IgG2b Fc部分取代血球凝集素標 記及6個組胺酸標記。

實例26：scR-Fc 11

於scR-Fc 11中，連接單鏈鬆弛素scR4之N終端與大鼠IgG2b Fc部分之C終端之連接子序列之組成為4個胺基酸長，係由具GlyGlySerPro序列之多肽構成。此外，6個組胺酸標記添加於Fc部分之N終端。該大鼠IgG2b Fc部分取代Myc標記。同時，此建構體之C終端不具血球凝集素標記及/或6個組胺酸標記。

實例27：scR-Fc 12

於scR-Fc 11中，連接單鏈鬆弛素scR1之N終端與大鼠IgG2b Fc部分之C終端之連接子序列之組成為7個胺基酸長，係由具GlyGlySerGlyGlySerPro序列之多肽構成。此外，6個組胺酸標記添加於Fc部分之N終端。該大鼠IgG2b Fc部分取代Myc標記。同時，此建構體之C終端不具血球凝集素標記及/或6個組胺酸標記。

實例28：scR-Fc 13

於scR-Fc 11中，連接單鏈鬆弛素scR4之N終端與大鼠IgG2b Fc部分之C終端之連接子序列之組成為10個胺基酸長，係由具GlyGlySerGlyGlySerGlyGlySerPro序列之多肽構成。此外，6個組胺酸標記添加於Fc部分之N終端。該大鼠IgG2b Fc部分取代Myc標記。同時，此建構體之C終端不具血球凝集素標記及/或6個組胺酸標記。

實例29：scR-Fc 14

為了分析連接單鏈鬆弛素變異體與Fc部分之連接子序列之影響，乃於scR-Fc 14中，使序列scR4之C終端直接融合於人類IgG1之Fc部分。此Fc部分取代scR4中之血球凝集素標記與6個組胺酸標記。此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。

實例30：scR-Fc 15

於scR-Fc 15中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與人類IgG1 Fc部分之N終端之連接子序列之組成為6個胺基酸長，係由具GlySerGlySerGlySer序列之多肽構成。該人類IgG1 Fc部分取代血球凝集素標記與6個組胺酸標記。此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。

實例31：scR-Fc 16

scR-Fc 16係設計用以分析Fc部分內雙硫橋鍵對蛋白質表現與融合蛋白活性之影響；為此，以丙胺酸置換scR-Fc 15中人類IgG1 Fc部分內位置86之半胱胺酸殘基。

實例32：scR-Fc 17

於scR-Fc 17中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與大鼠IgG2b Fc部分之N終端之連接子序列之組成為6個胺基酸長，係由具GlySerGlySerGlySer序列之多肽構成。該大鼠IgG2b Fc部分取代血球凝集素標記及6個組胺酸標記。此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。

實例33：scR-Fc 18

於scR-Fc 18中，連接單鏈鬆弛素scR4之C終端與 人類IgG1 Fc部分之N終端之連接子序列之組成為21個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyThrLysValThrValSerSerGluSerLysTyrGly序列之多肽構成。該人類IgG1 Fc部分取代血球凝集素標記及6個組胺酸標記。此建構體A鏈之N終端不具Myc標記。

實例34：scR-Var1

於scR-Var1中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為9個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。此外，6個胺基酸長，及具GlyGlySerGlyCysGly序列之多肽添加於B鏈之C終端。未聚乙二醇化融合多肽之活性測試係使用未純化之蛋白質。

為了增進此建構體之生物半衰期，乃遵循如上述之實驗流程，進行融合於B鏈C終端之延伸多肽內半胱胺酸之聚乙二醇化。根據如上述之實驗流程，測定聚乙二醇化變異體之活性。

實例35：scR-Var2

於scR-Var2中，連接人類鬆弛素2之A鏈與B鏈之連接子序列之組成為9個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。此外，6個胺基酸長，及具GlyCysGlySerGlyGly序列之多肽添加於A鏈之N終端。未聚乙二醇化融合多肽之活性測試係使用未純化之蛋白質。

為了增進此建構體之生物半衰期，乃遵循如上述之實驗流程，進行融合於A鏈N終端之延伸多肽內半胱胺酸之聚乙二醇化。根據如上述之實驗流程，測定聚乙二醇化變異體之活性。

實例36：scR-Var3

於scR-Var3中，連接人類鬆弛素2之A鏈C終端與B鏈N終端之連接子序列之組成為9個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。於A鏈之N終端，具有編碼凝血因子Xa切割位置之IleGluGlyArgMetAsp之多肽連接此變異體與人類轉鐵蛋白(登錄編號NP_001054.1)之C終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例37：scR-Var4

於scR-Var4中，使野生型鬆弛素2(基因體組織)融合於轉鐵蛋白。為此，於B鏈之N終端，為連接此變異體與人類轉鐵蛋白(登錄編號NP_001054.1)之C終端之具有編碼凝血因子Xa切割位置之IleGluGlyArgMetAsp之多肽。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例38：scR-Var5

於scR-Var5中，連接人類鬆弛素2之A鏈C終端與B鏈N終端之連接子序列之組成為9個胺基酸長，係由具GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGly序列之多肽構成。於A鏈之N終端，具有編碼凝血因子Xa切割位置之IleGluGlyArgMetAsp之多肽連接此變異體與人類白蛋白 蛋白質(登錄編號NP_000468.1)之C終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例39：scR-Var6

於scR-Var6中，B鏈N終端之具有編碼凝血因子Xa切割位置之IleGluGlyArgMetAsp序列之多肽連接此變異體與人類白蛋白(登錄編號NP_000468.1)之C終端。根據如上述之實驗流程測定活性。

實例40：scR-Var7

於scR-Var7中，連接人類鬆弛素2之A鏈C終端與人類鬆弛素2之B鏈N終端之連接子序列之組成為9個胺基酸長，係由具LysArgSerLeuSerArgLysLysArg序列之多肽構成。

連接B鏈之C終端與人類IgG1 Fc部分之N終端之連接子序列為6個胺基酸長，係由具有編碼凝血因子Xa切割位置之IleGluGlyArgMetAsp序列之多肽構成。

實例41：scR-Var8

於scR-Var8中，連接A鏈之C終端與B鏈之N終端之連接子序列之組成為9個胺基酸長，係由具LysArgSerLeuSerArgLysLysArg序列之多肽構成。

連接A鏈之N終端與人類IgG1 Fc部分之C終端之連接子序列為6個胺基酸長，係由具有編碼凝血因子Xa切割位置之IleGluGlyArgMetAsp序列之多肽構成。

全部單鏈鬆弛素融合蛋白以及設計用於聚乙二醇化之變異體之圖解表述示於圖3。

表2摘述各種scR融合蛋白建構體之表現以及生物活性之結果。

針對所列出之所有變異體，可使用人類鬆弛素-2 Quantikine ELISA套組測定表現，及可使用CHO-CRE-LGR7細胞株測定活性。可為鑑戒地，scR-Fc 1、scR-Fc 5至scR-Fc 7、scR-Fc 11至scR-Fc 13、與scR-Var3至scR-Var6之劑量效應曲線分別示於圖5、圖6、圖7、與圖8。

以其B鏈-C鏈-A鏈定位融合於人類IgG分子Fc部分之人類野生型鬆弛素2分子未顯現任何可檢測出之活性。針對此分子不具活性之可能解釋為C鏈未完全處理。對照之下，含單鏈人類鬆弛素2之所有融合建構體可檢測出顯著活性。如上文所示，雖然未進行蛋白水解處理，該單鏈鬆弛素亦展現與人類野生型鬆弛素2可相較之活性。

就單鏈鬆弛素2融合建構體而言，Fc部分之定位似對彼等分子之活性具有顯著影響。於B鏈C終端攜帶Fc部分之建構體(例如，scR-Fc 1至scR-Fc 4及scR-Fc 13至scR-Fc 18)比A鏈N終端攜帶Fc部分之建構體(例如，scR-Fc 5至scR-Fc 6及scR-Fc 11至scR-Fc 12)展現稍低之活性。如上述，A鏈結合於相應受體LGR7之胞外功能區後，受體分子內之構形改變使B鏈與跨膜功能區細胞外環接觸；該第二步驟接著導致受體活化。因此，偶聯於B鏈之Fc部分能抑制B鏈之最佳結合，及因此抑制受體之完全活化。

Fc-單鏈鬆弛素之體內血漿穩定性分析

以240微克/公斤濃度之scR-Fc 13及hRelaxin2經 靜脈投與8週齡之威斯達(Wistar)公大鼠。於化合物投與0小時、1小時、3天、5天、與7天後之時間點，採取血液試樣，使用市售可得之定量ELISA(R&D Systems，人類鬆弛素-2 Quantikine ELISA套組，目錄編號DRL200)測定Fc-單鏈鬆弛素及未修飾hRelaxin2之濃度。

如圖9所示，施用3天後，未檢測出未修飾之hRelaxin2，而甚至在靜脈投與7天後，仍可檢測出顯著濃度之scR-Fc 13，其濃度甚至高於以CHO-LGR7為基礎之活性測試所得到之EC50值。

從血漿單離之Fc-單鏈鬆弛素活性之測定

為了測定靜脈投與3、5、及7天後，scR-Fc 13是否仍展現活性，乃使用CHO-CRE-LGR7細胞株測試血漿試樣。如圖10所示，針對所有三個試樣均可測定活性，及所有三個試樣之活性值與使用純化scR-Fc 13變異體所得到之EC₅₀值相似。

離體灌流大鼠心臟

使用腹腔注射戊巴比妥(Narcoren，100毫克/公斤)麻醉韋斯公大鼠(200-250公克)。迅速取出心臟並連接至藍金道夫(Langendorff)灌流系統(FMI GmbH，Seeheim-Ober Beerbach，Germany)。用已以95% O₂-5% CO₂平衡之克雷布斯-漢西萊特(Krebs-Henseleit)碳酸氫鹽緩衝液，以10毫升/分鐘之固定速率灌流心臟。灌流溶液含(毫莫耳/升)：NaCl 118；KCl 3；NaHCO₃ 22；KH₂PO₄ 1,2；MgSO₄ 1.2；CaCl₂ 1.8；葡萄糖10；丙酮 酸鈉2。以壓力轉換器顯示灌流系統中之灌流壓力。使用連接於經由左心室插入左心房之充水氣球之第二個壓力轉換器測量左心室壓力(LVP)。藉由調整氣球之體積，起初將舒張末期壓力設定於8毫米汞柱；心臟自然地跳動；將壓力轉換器之訊號放大、顯示及用於以個人電腦計算心臟頻率及+dp/dt。

如圖11所示，人類鬆弛素2(圖11a至d)以及scR-Fc 13(圖11e至h)之灌流導致心跳速率及冠狀動脈血流量之顯著增加，及左心室舒張壓與左心室壓力(+dp/dtmax)之減小。從而，hRelaxin2比scR-Fc 13具10倍多之效力，反映出以CHO-CRE-LGR7細胞株測定之sc鬆弛素融合蛋白變異體及鬆弛素2之EC50值間之差異。

進一步之引用文獻：Hsu, S. Y. (2003). New insights into the evolution of the relaxin-LGR signaling system. Trends Endocrinol Metab 14:303-309; Wilkinson, T. N., Speed, T. P., Tregear, G. W., Bathgate, R. A. (2005). Evolution of the relaxin-like peptide family. BMC Evol Biol 5:14; Hudson P, Haley J, John M, Cronk M, Crawford R, Haralambidis J, Tregear G, Shine J, Niall H. (1983) Structure of a genomic clone encoding biologically active human relaxin. Nature 301: 628-631; Toth, M., Taskinen, P., & Ruskoaho, H. (1996). Relaxin stimulates atrial natriuretic peptide secretion in perfused rat heart. J Endocrinol 150: 487-495; Piedras-Renteria, E. S., Sherwood, O. D., and Best, P. M. (1997). Effects of relaxin on rat atrial myocytes: I. Inhibition of I(to) via PKA-dependent phosphorylation. Am J Physiol 272:H1791-H1797; Bartsch, O., Bartlick, B., and Ivell, R. (2001). Relaxin signaling links tyrosine phosphorylation to phosphodiesterase and adenylyl cyclase activity. 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圖1 野生型鬆弛素與單鏈鬆弛素以及其相應多肽功能區之基因組織示意圖。

圖2 單鏈鬆弛素變異體示意圖。

圖3 為聚乙二醇化設計之單鏈鬆弛素融合蛋白變異體以及單鏈鬆弛素變異體之功能區組織示意圖。

圖4a-e 使用CHO-CRE-LGR7細胞株之scR 3、scR 4、與scR 5(圖4a)，scR 7、scR 8、scR9、與scR10(圖4b)，scR11與scE12(圖4c)，人類鬆弛素3、scR14、與scR15(圖4d)及scR17(圖4e)於功能性分析中之活性。對照組係使用hRelaxin2(R&D Systems，商品目錄編號6586-RN-025)。數據以相對吸光值(Relative Light Units)表示，代表單鏈鬆弛素變異體及鬆弛素2誘發螢光素酶表現之活性。符號表示平均值，誤差槓表示S.E.M.。

圖5 使用CHO-CRE-LGR7細胞株之scR-Fc 1於功能性分析中之活性。對照組係使用hRelaxin2(R&D Systems，商品目錄編號6586-RN-025)。數據以相對吸光值表示，代表scR-Fc 1及hRelaxin2誘發螢光素酶表現之活性。符號表示平均值，誤差槓表示S.E.M.。

圖6 使用CHO-CRE-LGR7細胞株之scR-Fc 5、scR-Fc 6、與scR-Fc 7於功能性分析中之活性。對照組係使用hRelaxin2(R&D Systems，商品目錄編號6586-RN-025)。 數據以相對吸光值表示，代表scR-Fc變異體及hRelaxin2誘發螢光素酶表現之活性。符號表示平均值，誤差槓表示S.E.M.。

圖7 使用CHO-CRE-LGR7細胞株之scR-Fc 11、scR-Fc 12、與scR-Fc 13於功能性分析中之活性。對照組係使用hRelaxin2(R&D Systems，商品目錄編號6586-RN-025)。數據以相對吸光值表示，代表scR-Fc變異體及hRelaxin2誘發螢光素酶表現之活性。符號表示平均值，誤差槓表示S.E.M.。

圖8 使用CHO-CRE-LGR7細胞株之scR-Var 3、scR-Var 4、scR-Var 5、與scR-Var 6於功能性分析中之活性。對照組係使用hRelaxin2(R&D Systems，商品目錄編號6586-RN-025)。數據以相對吸光值表示，代表scR-Fc變異體及hRelaxin2誘發螢光素酶表現之活性。符號表示平均值，誤差槓表示S.E.M.。

圖9 靜脈內投與hRelaxin2或scR-Fc 13之體內半衰期分析。8週齡之威斯達公大鼠(每組3隻動物)分別單次施用人類鬆弛素2及scR-Fc 13(0.24毫克/公斤)。施用後於指示時間點收集血液試樣，利用定量ELISA測定血清中各蛋白質含量。

圖10 血液試樣中鬆弛素2及鬆弛素變異體之活性。

使用CHO-CRE-LGR7細胞株測定得自scR-Fc 13處理大鼠之血液試樣中之鬆弛素活性。使靜脈內投與scR-Fc 13後3、5、及7天收集之血液試樣在CHO-CRE-LGR7細胞株中培育，並測定相對吸光值。使用hRelaxin2(R&D Systems，商品目錄編號6586-RN-025)及純化之scR-Fc 13測定校準曲線。劑量效應曲線內之EC50以X標記。數據以相對吸光值表示，代表scR-Fc變異體及hRelaxin2誘發螢光素酶表現之活性。符號表示平均值，誤差槓表示S.E.M.。

圖11：離體灌流大鼠心臟模式中，hRelaxin2及scR-Fc 13對心跳速率、冠狀動脈血流量及收縮性之影響。

1 nM濃度下，施用hRelaxin2導致心跳速率與冠狀動脈血流量增加，及展現負性肌力活性(圖11a-d)；以scR-Fc 13獲得可比較之功效，然而係於10倍高之濃度下。

<110> Bayer Intellectual Property GmbH

<120> 鬆弛素融合多肽及其用途

<130> BHC 11 1 007

<160> 161

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 1

<210> 2

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 2

<210> 3

<211> 84

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 3

<210> 4

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 4

<210> 5

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 5

<210> 6

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 6

<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 10

<210> 11

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 11

<210> 12

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 12

<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 13

<210> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 14

<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 15

<210> 16

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 16

<210> 17

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 17

<210> 18

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 18

<210> 19

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 19

<210> 20

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 20

<210> 21

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 21

<210> 22

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 22

<210> 23

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 23

<210> 24

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 24

<210> 25

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 25

<210> 26

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 26

<210> 27

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 27

<210> 28

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 28

<210> 29

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 29

<210> 30

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 30

<210> 31

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 31

<210> 32

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 32

<210> 33

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 33

<210> 34

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 34

<210> 35

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 35

<210> 36

<211> 746

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 36

<210> 37

<211> 846

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 37

<210> 38

<211> 652

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 38

<210> 39

<211> 752

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 39

<210> 40

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 40

<210> 41

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 41

<210> 42

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 42

<210> 43

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 43

<210> 44

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 44

<210> 45

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 45

<210> 46

<211> 63

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 46

<210> 47

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 47

<210> 48

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 48 50 55

<210> 49

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 49

<210> 50

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 50

<210> 51

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 51

<210> 52

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 52

<210> 53

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 53

<210> 54

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 54

<210> 55

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 55

<210> 56

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 56

<210> 57

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 57

<210> 58

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 58

<210> 59

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 59

<210> 60

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 60

<210> 61

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 61

<210> 62

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 62

<210> 63

<211> 264

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 63

<210> 64

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 64

<210> 65

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 65

<210> 66

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 66

<210> 67

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 67

<210> 68

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 68

<210> 69

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 69

<210> 70

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 70

<210> 71

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 71

<210> 72

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 72

<210> 73

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 73

<210> 74

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 74

<210> 75

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 75

<210> 76

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 76

<210> 77

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 77

<210> 78

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 78

<210> 79

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 79

<210> 80

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 80

<210> 81

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 81

<210> 82

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 82

<210> 83

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 83

<210> 84

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 84

<210> 85

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 85

<210> 86

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 86

<210> 87

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 87

<210> 88

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 88

<210> 89

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 89

<210> 90

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 90

<210> 91

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 91

<210> 92

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 92

<210> 93

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 93

<210> 94

<211> 2238

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 94

<210> 95

<211> 2538

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 95

<210> 96

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 96

<210> 97

<211> 2256

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 97

<210> 98

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 98

<210> 99

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 99

<210> 100

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 100

<210> 101

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 101

<210> 102

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 102

<210> 103

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 103

<210> 104

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 104

<210> 105

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 105

<210> 106

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 106

<210> 107

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 107

<210> 108

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 108

<210> 109

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 109

<210> 110

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 110

<210> 111

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 111

<210> 112

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 112

<210> 113

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 113

<210> 114

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 114

<210> 115

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 115

<210> 116

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 116

<210> 117

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人

<400> 117

<210> 118

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 118

<210> 119

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人

<400> 119

<210> 120

<211> 231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 120

<210> 121

<211> 226

<212> PRT

<213> 褐鼠(Rattus Norvegicus)

<400> 121

<210> 122

<211> 679

<212> PRT

<213> 智人

<400> 122

<210> 123

<211> 585

<212> PRT

<213> 智人

<400> 123

<210> 124

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人

<400> 124

<210> 125

<211> 27

<212> PRT

<213> 智人

<400> 125

<210> 126

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 126

<210> 127

<211> 72

<212> DNA

<213> 智人

<400> 127

<210> 128

<211> 48

<212> DNA

<213> 智人

<400> 128

<210> 129

<211> 84

<212> DNA

<213> 智人

<400> 129

<210> 130

<211> 693

<212> DNA

<213> 智人

<400> 130

<210> 131

<211> 678

<212> DNA

<213> 褐鼠

<400> 131

<210> 132

<211> 2037

<212> DNA

<213> 智人

<400> 132

<210> 133

<211> 1755

<212> DNA

<213> 智人

<400> 133

<210> 134

<211> 72

<212> DNA

<213> 智人

<400> 134

<210> 135

<211> 81

<212> DNA

<213> 智人

<400> 135

<210> 136

<211> 45

<212> DNA

<213> 智人

<400> 136

<210> 137

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 137

<210> 138

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 138

<210> 139

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 139

<210> 140

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 140

<210> 141

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 141

<210> 142

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 142

<210> 143

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 143

<210> 144

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 144

<210> 145

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 145

<210> 146

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 146

<210> 147

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 147

<210> 148

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 148

Gly Gly Ser Pro

1

<210> 149

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 149

<210> 150

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 150

<210> 151

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 151

<210> 152

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 152

<210> 153

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 153

<210> 154

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 154

<210> 155

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 155

<210> 156

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合多肽

<400> 156

<210> 157

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合體

<400> 157

<210> 158

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合體

<400> 158

<210> 159

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合體

<400> 159

<210> 160

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合體

<400> 160

<210> 161

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素融合體

<400> 161

Claims (16)

1. 一種融合多肽，其具有包含A-L-B之鬆弛素活性，其中B包含鬆弛素B鏈多肽或其功能性變異體，A包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變異體，及L係連接子多肽。
2. 根據申請專利範圍第1項之融合多肽，其中該融合多肽進一步包含至少一個半衰期延長之基團。
3. 根據申請專利範圍第2項之融合多肽，其中半衰期延長之基團為IgG1 Fc功能區、PEG或HES。
4. 根據前述申請專利範圍中任一項之融合多肽，其中該連接子多肽L為6至14個胺基酸長。
5. 根據前述申請專利範圍中任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A鏈為人類鬆弛素2A鏈(SEQ ID NO：117)及鬆弛素B鏈為人類鬆弛素2B鏈(SEQ ID NO：119)。
6. 一種融合多肽，其包含如表3所述之多肽。
7. 根據申請專利範圍第1至6項中任一項之融合多肽，其中A-L-B係選自由scR3、scR4、scR5、無標記scR3、無標記scR4、無標記scR5、scR-Fc5、scR-Fc6與scR-Fc7組成之A-L-B多肽組群。
8. 一種多核苷酸，其編碼根據前述申請專利範圍中任一項之融合多肽。
9. 一種載體，其包含根據申請專利範圍第8項之多核苷酸。
10. 一種宿主細胞，其包含根據申請專利範圍第9項之載體或根據申請專利範圍第8項之多核苷酸。
11. 一種製造根據申請專利範圍第1至7項中任一項之多肽之方法，其包括培養如申請專利範圍第10項之宿主細胞及單離該多肽之步驟。
12. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至7項中任一項之融合多肽。
13. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物或根據申請專利範圍第1至7項中任一項之融合多肽，其係作為藥劑。
14. 根據申請專利範圍第12及13項之醫藥組成物或根據申請專利範圍第1至7項中任一項之融合多肽，其係作為藥劑用以治療心血管疾病、肺部疾病、纖維化病症或腎臟疾病。
15. 一種治療心血管疾病、肺部疾病、纖維化病症或腎臟疾病之方法，其包括投與有效治療劑量之根據申請專利範圍第12及13項之醫藥組成物或根據申請專利範圍第1至7項中任一項之融合多肽。
16. 根據申請專利範圍第14及15項之治療方法，其中該心血管疾病係冠心病、急性冠狀動脈症候群、心臟衰竭、與心肌梗塞。