MX2013014773A

MX2013014773A - Procedimiento de purificacion de formas nativas o mutantes de la toxina difterica.

Info

Publication number: MX2013014773A
Application number: MX2013014773A
Authority: MX
Inventors: Aaron R Goerke; Thomas Svab; Patrick Mchugh; Kristin Valente
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2011-06-13
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2014-01-20
Also published as: EP2718306A1; US20140193876A1; BR112013032225A2; KR20140038517A; CN103732610A; AR086914A1; TW201309722A; WO2012173876A1

Abstract

La presente invención se refiere al uso de cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía multimodal para la purificación de la toxina diftérica, o una forma mutante del mismo, de una mezcla, por ejemplo, una mezcla de fermentación en célula huésped que contiene impurezas, tales como proteínas y ADN de la célula huésped; la presente invención se refiere además a la integración de dicho procedimiento en un procedimiento de múltiples etapas con otros procedimientos de fraccionamiento para la purificación de la toxina diftérica adecuados para aplicaciones in vitro e in vivo.

Description

PROCEDIMIENTOS DE PURIFICACIÓN DE FORMAS NATIVAS O MUTANTES DE LA TOXINA DIFTÉRICA REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS No aplicable CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procedimientos para la purificación de formas nativas o mutantes de la toxina diftérica usando cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía multimodal. En ciertas modalidades, la forma muíante de la toxina diftérica es CRM-|97.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La toxina diftérica es una toxina proteinácea que se sintetiza y secreta en cepas toxigénicas de Corynebacterium diphtheríae. La toxina diftérica y sus formas mutantes han encontrado aplicaciones en ambas vacunas, como proteína transportadora, y fármacos anticancerosos, como terapia dirigida. La toxina diftérica inactivada con formaldehído se ha usado para la vacunación contra C. diphtheríae desde la década de 1920. Las vacunas conjugadas usando formas mutantes de la C. diphtheríae comenzaron a estar disponibles ampliamente en la década de 1980. Véase Shinefield, 2010, Vaccine 28:4335-4339. La capacidad de la toxina diftérica para estimular la inmunidad por linfocitos T la convierte en una proteína transportadora atractiva para los antígenos independientes de linfocitos T (p. ej., polisacáridos). La toxina diftérica también se usa como terapia para el cáncer conjugando un ligando específicamente dirigido a las proteínas de superficie sobreexpresadas en células tumorales. Véase Michl y coi., 2004, Curr Cáncer Drug Targets, 4:689-702; y Pótala y coi., 2008, Drug Discovery Today 13:807-815.

Las formas mutantes de la toxina diftérica son altamente deseables en vacunas y en agentes anticancerosos. En vacunas, la toxina diftérica suele estar mutada para reducir la toxicidad. Dichas mutaciones pueden producir pérdida de actividad de ADP-ribosilación que, en la toxina nativa, bloquea la síntesis de proteínas. En los agentes anticancerosos, la toxina diftérica suele estar mutada para eliminar la unión a su receptor nativo sobre las células normales. Véase Pótala y col., 2008, Drug Discovery Today 13:807-815.

En aplicaciones de vacunas, la CRM197 es el mutante más usado de la toxina diftérica. CRM197 la produce una cepa mutante de C. diphtheríae y difiere de la toxina diftérica en la presencia de ácido glutámico en lugar de una glicina en la posición 52 y es esencialmente no tóxica. Véase Uchida y col., 1973, J Biol Chem 248:3838-3844. Actualmente, la CRM197 se usa ampliamente como transportador para vacunas de uso pediátrico. Véase Shinefield, 2010, Vaccine 28:4335-4339.

Entre los procedimientos para la purificación de la toxina diftérica y las formas mutantes de la toxina diftérica que se han usado se incluyen cromatografía de afinidad (Cukor y col., 1974, Biotech and Bioeng 16:925-931 ; y Antoni y col., 1983, Experientia 39:885-886), cromatografía de intercambio aniónico con cromatografía hidrofóbica (Rappuoli y col., 1983, J. Chromatog 268:543-548), y filtración de flujo tangencial (Sundaran y col., 2002, J Biosci and Bioeng 94:93-98).

Para uso clínico se necesitan grandes cantidades de la toxina diftérica muíante. No obstante, hay problemas en la producción de la toxina diftérica a partir de cepas productoras de toxina diftérica de C. diphtheríae y, además, se han encontrado dificultades en escalado de las condiciones de fermentación a escala de laboratorio para producir suficientes cantidades de la toxina diftérica y, en particular, formas mutantes de la toxina diftérica, para uso terapéutico. Por tanto, existen problemas en la obtención de la toxina diftérica en un rendimiento y pureza suficientes y la producción a gran escala tiende a ser ineficiente. Por ejemplo, el pH bajo induce cambios conformacionales y estimula la agregación, lo que dificulta el uso de los típicos intercambiadores de cationes (y pH menores). La escisión proteo lítica (por las proteasas del huésped o autocatalíticamente) también se produce con frecuencia para la mayoría de las toxinas que causan heterogeneidad. La heterogeneidad se puede detectar en forma de, por ejemplo, isoformas del producto, variantes del producto, fragmentos del producto o patrones de glicosilación. Estas formas del producto se deben eliminar, lo que sigue siendo un reto de la purificación de toxinas en general y para la toxina diftérica específicamente. Estas dificultades se tienen que superar para poder satisfacer las necesidades actuales con las vacunas pediátricas y explotar las promesas de los fármacos anticancerosos dirigidos.

Lo que se necesita son métodos de purificación para proporcionar una purificación eficiente y rendimientos altos de la toxina diftérica.

La mención o identificación de cualquier referencia en esta sección o cualquier otra sección de la presente solicitud no debe interpretarse como indicación de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procedimientos de purificación de la toxina diftérica mutante y formas mutantes de la misma por ejemplo CRM197, de células intactas que proporcionan una pureza y rendimientos elevados. Se ha descubierto que la etapa crucial en este procedimiento es la eliminación de la endotoxina y las proteínas residuales mediante el uso de una resina de hidroxiapatita. También se realiza una etapa de cromatografía mültimodal. En un aspecto, el uso de una resina de cromatografía multimodal sigue inmediatamente a la resina de hidroxiapatita. En otro aspecto, el uso de una resina de cromatografía multimodal precede inmediatamente a la resina de hidroxiapatita.

Por tanto, en una modalidad, la presente invención se refiere a un procedimiento de purificar la toxina diftérica, o un muíante de la misma, de una mezcla que contiene la toxina diftérica, o una forma muíante de la misma, que comprende: a) poner en conlaclo la mezcla con un primer agenle de separación en condiciones tales que la íoxina diftérica, o un mutaníe de la misma, se une al primer agente de separación; b) eluir la toxina diftérica, o un muíanle de la misma, del primer agente de separación; c) poner en contacto el material eluido obtenido en la tapa a) con un segundo agente de separación en condiciones tales que la toxina diftérica, o un muíante de la misma, se une al segundo agente de separación; y d) eluir dicha toxina diftérica, o un muíante de la misma, del segundo ageníe de separación; en el que 1) el primer agente de separación es hidroxiapatita y el segundo agente de separación es una resina mullimodal; o 2) el primer agenle de separación es resina multimodal y el segundo agente de separación es hidroxiapatita; y cuando el primer agente de separación o el segundo agente de separación es hidroxiapatita, aníes de eluir de la hidroxiapatita, la hidroxiapatita sufre una etapa de lavad en condiciones tales que se eliminan las impurezas.

En un cierto aspecto, el primer agente de separación es hidroxiapatita y el segundo agente de separación es una resina multimodal.

En ciertos aspectos, el lavado de la hidroxiapatita se realiza con una solución de lavado que comprende cloruro potásico o cloruro sódico de 0.01 a 1.0 M a un pH de 6.5 a 8.0. El tampón de lavado puede comprender además fosfato potásico o fosfato sódico de 0.1 a 20 mM.

En ciertos aspectos, la lución de la hidroxiapatita comprende i) elución por etapas con un tampón de elución que comprende cloruro potásico aproximadamente > 30 mM o fosfato potásico o fosfato sódico de aproximadamente > 15 mM, ii) elución por gradiente que comprende fosfato potásico o fosfato sódico de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 mM o cloruro sódico o cloruro potásico de aproximadamente 100 mM a 2 M; o iii) un cambio de pH de= 0.3 unidades.

En ciertos aspectos, la mezcla en contacto con la resina multimodal comprende Tris, MES, MOPS, HEPES, fosfato (p. ej., potásico), cloruro (p. ej., potásico o sódico) o fosfato (p. ej., sódico).

En ciertos aspectos, la mezcla eluida de la resina multimodal mediante i) elución por etapas con un tampón de elución que comprende cloruro potásico o cloruro sódico aproximadamente= 125 mM a pH de 6.8 a 9.5); ii) elución por gradiente que comprende cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, sulfato amónico o cloruro potásico de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.3 mM; iii) un cambio de pH de= 0.5 unidades dentro de un intervalo de pH 6.5 a 9.5 o iv) un cambio de temperatura > 1°C en una temperatura de 2 a 30 °C.

En ciertos aspectos de la invención, la resina multimodal contiene ligandos que comprenden una parte cargada y una parte hidrofóbica. En ciertos aspectos, la parte cargada es una parte cargada negativamente, por ejemplo un grupo carboxilato aniónico o grupo sulfo aniónico para intercambio de cationes. Un ejemplo de dicha resina multimodal es Capto-MMC™. En otros aspectos, la parte cargada es una parte cargada positivamente, por ejemplo un grupo amino. Un ejemplo de dicha resina multimodal es Capto Adhere™.

En ciertos aspectos de la invención, la mezcla en contacto con la resina multimodal comprende EDTA o un inhibidor de la proteasa. En otros aspectos de la invención, la elución de la resina multimodal se produce en presencia de EDTA o de un inhibidor de la proteasa.

En modalidades diferentes, la aplicación de la mezcla a hidroxiapatita o a una resina multimodal, lo que se produzca primero, puede venir precedida por uno o más de los siguientes: centrifugación, floculación, clarificación o cromatografía de intercambio aniónico. En ciertos aspectos de la invención, la mezcla está sujeta a dos o tres pases en la cromatografía de intercambio aniónico. En ciertos aspectos de la invención, la solicitud de la mezcla viene precedida por centrifugación, floculación, clarificación y cromatografía de intercambio aniónico. La clarificación se puede producir mediante centrifugación y filtración en profundidad.

En ciertas modalidades de la invención, la mezcla inicial es un cultivo de fermentación de las células huésped. En ciertos aspectos de esta modalidad, las células huésped cultivadas se recogen y someten a shock osmótico para liberar la toxina diftérica, o una mutante de la misma, del periplasma. En otros aspectos, las células de fermentación se recuperan mediante centrifugación o microfiltración.

En otras modalidades de la invención, la mezcla inicial se obtiene de un sistema de producción acelular.

En ciertas modalidades, la mezcla que contiene la toxina diftérica, o una mutante de la misma, se somete a una o más de las siguientes después del contacto y elución de la resina de hidroxiapatita y el contacto y la elución de la resina multimodal: centrifugación, ultrafiltración, microfiltración, filtración y cromatografía en membrana de intercambio aniónico. En ciertos aspectos, la mezcla que contiene la toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, se somete a ultrafiltración, microfiltración, filtración y cromatografía en membrana de intercambio aniónico.

En ciertas modalidades, la toxina diftérica, o la versión mutante de la misma, es CRM197.

En ciertas modalidades, las formulaciones líquidas finales obtenidas usando los procedimientos de la invención, en los que se elimina= 90% de la proteína de la célula huésped y de las impurezas de la célula huésped, y el rendimiento de la toxina diftérica, o la forma mutante de la misma, es= 25% o= 35%. En ciertas modalidades, la toxina diftérica, o la forma mutante de la misma, se purifica hasta una pureza de > 90%, > 95% o > 98%, evaluado mediante electroforesis en gel. La pureza se calcula en referencia únicamente al porcentaje de toxina diftérica intacta, o la forma mutante de la misma (los fragmentos de toxina diftérica son impurezas). En ciertas modalidades, las formulaciones líquidas de la toxina diftérica, o la forma mutante de la misma, tienen una concentración de aproximadamente= 10 g/l o= 50 g/l y mantienen una pureza del 90% a 2°C durante al menos 6 meses. En otras modalidades, se mantiene un nivel de pureza del 90 % a 25 °C durante al menos 5 días o al menos 3 semanas, evaluado mediante electroforesis en gel. La heteroegenidad es = 1 % del producto, evaluada mediante electroforesis en gel, la endotoxina es= 1 % UE/mg medido con el kit de ensayo cromogénico Kinetic-QCL y la agregación es < 0.2% o < 0.1 % mediante HPSEC/UV.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1. Resultados de SDS-PAGE para la purificación de CRM-I97 usando cromatografía de intercambio aniónico y en hidroxiapatita (Calles 4 y 5) en comparación con un proceso estándar de cromatografía de afinidad (Calle 3) y el patrón interno (Calle 2). Se usó un gel 4-12% Bis-Tris NuPAGE con tampón de carrera 1X MES.

FIGURA 2. Estabilidad (o integridad) de CRM197 a 25°C (estabilidad acelerada) de comparación del porcentaje de monómero intacto de CRM197 en el tiempo (semanas) cuantificado mediante SDS-PAGE. La CRM197 purificada se generó mediante un procedimiento de cromatografía de afinidad (cuadrados), un procedimiento de cromatografía en hidroxiapatita (rombos) y un procedimiento de cromatografía en hidroxiapatita combinada con cromatografía Capto-MMC™ a escala de laboratorio (círculos) y de fabricación (triángulos).

FIGURA 3. Resultados de SDS-PAGE para purificación de CRM197 a escala de fabricación (Lote n° 1 y n° 2) en comparación con un patrón interno. Los fragmentos de CRM197 (p37 y p25), que son difíciles de eliminar usando técnicas de purificación habituales, están a niveles bajos. Se usó un gel 4-12% Bis-Tris NuPAGE con tampón de carrera 1X MES.

FIGURA 4. Resultados de SDS-PAGE para purificación de CR i97 de comparación de hidroxiapatita con Capto Adhere™ (Calle 4) e hidroxiapatita con Capto-MMC™ (Calle 5). AXP (producto de intercambio aniónico) y HAP (producto de hidroxiapatita) (Calles 2 y 3) se muestran para exponer el aclaramiento de la heterogeneidad. Se usó un gel 4-12% Bis-Tris NuPAGE con tampón de carrera 1X MES.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía multimodal (p. ej., Capto-MMC™) para purificación de la toxina diftérica y formas mutantes de la toxina diftérica. La toxina diftérica se puede purificar en una mezcla que contiene la toxina diftérica, por ejemplo la toxina diftérica expresada en una célula huésped o cualquier mezcla de toxina diftérica parcialmente purificada. Las condiciones se determinaron usando la cromatografía en hidroxiapatita, de modo que= 90% de la proteína de la célula huésped y otras impurezas residuales se separó de CRM^, manteniendo un rendimiento del procedimiento de= 50 -60% antes de la ultrafiltración. Las condiciones se determinaron usando la cromatografía en hidroxiapatita y multimodal, de modo que = 95% de la proteína de la célula huésped y otras impurezas residuales se separó de CRM-I97, manteniendo un rendimiento del procedimiento de > 20 - 40%. El procedimiento de purificación descrito en el presente documento es susceptible a la fabricación a gran escala y se ha escalado para acomodar alimentaciones de caldo de fermentación de 250 y 1300 I.

Los procedimientos de la invención proporcionan un procedimiento de purificación consistente y sólido para la toxina diftérica, y generar toxina diftérica mutante intacta de alta calidad. La toxina diftérica muíante puede estar muy concentrada (> 100 g/l) en el volumen final, manteniendo la homogeneidad de la proteína (p. ej., masa intacta y forma monomérica). Esto es posible dada la pureza potenciada. Como tal, el almacenamiento del volumen se puede realizar en forma líquida, al contrario que los procedimientos convencionales, que requieren la liofilización del volumen. Las concentraciones altas de la toxina diftérica son particularmente importantes durante las reacciones de conjugación con polisacárido, ya que acelera la cinética de la reacción.

Las funcionalidades de la resina tratadas en el presente documento, por ejemplo hidroxiapatita y una resina multimodal, Se pueden usar en cualquier tecnología de purificación conocida, tal como una cromatografía en columna y cromatografía en membrana. Generalmente se prefiere la cromatografía en columna debido a su reutilizabilidad. Cuando los procedimientos de la invención se usan con una membrana, las propiedades de absorción se presentan sobre una superficie polimérica. En lugar de usar resinas empaquetadas en una columna, una membrana microporosa con grupos funcionales sobre el área de superficie interna permitirá la captura de la toxina diftérica. Estas membranas podrían estar compuestas por acetato de celulosa o difluoruro de polivinilideno, por ejemplo, en configuraciones de lámina plana o fibra hueca. Las ventajas sobre la cromatografía en columna incluyen un tiempo de operación más corto y menos volumen de membrana en comparación con el volumen de la columna requerido.

Como se usa en el presente documento, el término "toxina diftérica" se usa para hacer referencia a la proteína natural. Una "forma mutante de la misma", cuando hace referencia a la toxina diftérica, o una "toxina diftérica mutante", hace referencia a secuencias que tienen una identidad de > 70%, > 80%, > 90%,= 95%, > 98%, o > 99% con la toxina diftérica e incluye cualquier forma mutada conocida, en particular para mutantes no tóxicos tales como CRIv y CRIv y los descritos en la patente de EE.UU. n° 6.455.673. Una "forma mutante de la misma" se puede usar con cualquier referencia a la toxina diftérica en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, cuando se usa con valores de pH o pl, "aproximadamente" se refiere a una varianza de 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4 o 0.5 unidades. Cuando se usa con un valor de temperatura, "aproximadamente" se refiere a una varianza de 1 , 2, 3, 4 o 5 grados. Cuando se usa con otros valores, tales como la longitud y el peso, "aproximadamente" se refiere a una varianza de 1%, 2%, 3%, 4% 5% o 10%.

Como se usa en el presente documento, "aclarado" se refiere a una muestra (p. ej., célula viable o no viable) que ha sido sometida a una etapa de separación sólido-líquido que implica una o más de los procedimientos de centrifugación, microfiltración, filtración o sedimentación/decantación para eliminar las células huésped y/o los residuos celulares. Un caldo de fermentación aclarado puede ser el sobrenadante de la fermentación. En ocasiones, la clarificación se denomina etapa de recuperación primaria o inicial y normalmente se produce antes de cualquier cromatografía o una etapa similar.

Como se usa en el presente documento, una "mezcla" comprende la proteína de interés (para la que se desea la purificación) y uno o más contaminantes, es decir impurezas. La mezcla se puede obtener directamente de un sistema de producción acelular, una célula huésped o un organismo que produce el polipéptido. Sin pretender que sean limitantes, ejemplos de mezclas que se pueden purificar de acuerdo con un procedimiento de la presente invención incluyen cultivo celular cosechado/fluido o sobrenadante de fermentación, sobrenadante aclarado y sobrenadante acondicionado. Una mezcla que se ha "purificado parcialmente" ya se ha sometido a una etapa de cromatografía, por ejemplo cromatografía que no es de afinidad, cromatografía de afinidad etc. Una "mezcla acondicionada" es una mezcla, por ejemplo un cultivo celular/sobrenadante de fermentación que se ha preparado para una etapa de cromatografía, usada en un procedimiento de la invención sometiendo la mezcla a uno o más intercambios de tampón, dilución, adición de sal, titulación de pH o filtración con el fin de fijar el intervalo de pH y/o conductividad y/o matriz del tampón para alcanzar un rendimiento de cromatografía deseado. Una "mezcla acondicionada" se puede usar para normalizar las condiciones de carga sobre la primera columna de la cromatografía. En general, se puede obtener una mezcla por varios medios de separación bien conocidos en la técnica, separando físicamente las células de otros componentes en el caldo al final de una carrera en biorreactor usando filtración o centrifugación, o mediante concentración y/o diafiltración de la mezcla en intervalos específicos de pH, conductividad y concentración de las especies de tampón.

Como se usa en el presente documento, "cromatografía de pulido" se refiere a una o más etapas cromatográficas adicionales tras la cromatografía de captura y se usa para eliminar las impurezas de célula huésped residuales e impurezas relacionadas con el producto (heterogeneidad de la toxina diftérica que incluye fragmentos y/o especies agregadas).

Toxina diftérica Se han descrito la secuencia y la estructura de la proteína diftérica. Véase Delange y col., 1976, Proc Nat Acad Sci USA 73:69-72; y Falmagne y col., 1985, Biochim Biophys Acta 827:45-50. Las formas mutantes de la toxina diftérica, incluidas CRM107 y CRM197, se pueden purificar usando los procedimientos de la invención.

Las formas mutantes de la toxina, tales como las formas mutantes descritas por Laird y col, 1976, J. Virology 19:220-227, y por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Marcel Dekker, Inc, 1992, incluyendo CRM107, también se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante los procedimientos descritos en Laird et al., 1976, J. Virology 19:220-227 , así como mediante mutagénesis dirigida, en base a la secuencia nucleotídica conocida (Greenfield y col., 1993, Proc Nat Acad Sci 50:6953-7) del gen estructural de tipo silvestre para la toxina diftérica por corinabacteriófago ß.

Los procedimientos de la invención también pueden ser útiles para la purificación de otras toxinas bacterianas que son, preferentemente, antígenos o vehículos inmunológicamente eficaces que se han convertido en seguros por medios químicos o genéticos para administrar a un sujeto. Ejemplos incluyen toxinas bacterianas inactivadas, tales como toxinas de tipo RTX (toxinas MARTX), toxinas de Clostridium difficile y familias de toxinas glicosilantes de Clostridium, toxoide del tétanos, toxinas botulínicas, citotoxinas clostridiales, toxoide de pertussis, E. coli LT, E. coli ST, y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa También se pueden usar proteínas de la membrana, tales como el complejo c de la membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de unión a transferrina, neumolisina, proteína A de la superficie neumocócica (PspA), proteína de adhesina neumocócica (PsaA) o las proteínas de la superficie del neumococo BVH-3 y BVH-11. Otras proteínas, tales como el antígeno protectora (PA) o Bacillus anthracis, ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana, (KLH), seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina (BSA) y la proteína purificada derivada de la tuberculina (PPD) también se pueden usar. Preferentemente, las proteínas son proteínas que son no tóxicas y no reactogénicas y que se pueden obtener en cantidad y pureza suficiente para que sean susceptibles de conjugación.

Producción en células huésped/sin células La toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, se puede preparar a partir de una serie de sistemas de producción acelulares o células huésped. Por ejemplo, la toxina diftérica natural se puede purificar de cultivos de Corynebacteria diphtheriae y otras cepas a partir de diversas fuentes disponibles para el público que incluyen la Colección Americana de Cultivos Tipo.

Los sistemas de producción acelular son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un sistema se basa en la síntesis de proteínas usando elementos recombinantes (PURE) (véase, por ejemplo, Shimizu y col., 2001 , Nat Biotechnol 19:751-755 y Ohashi y col., 2007, Biochem Biophys Res Commun 352:270-276 Otros sistemas de producción acelulares se describen en Voloshin y col., 2005, Biotechnol Bioeng 91 :516-21 , Kim y col., 2001 , Biotechnol Bioeng 74:309-16, Calhoun y col.., 2005, Biotechnol Bioeng 90(5):606-13, Jewett y col., 2004, Biotechnol Bioeng 86:19-26, Jewett y col., 2004, Biotechnol Bioeng 87(4):465-72.

La toxina diftérica, y las formas mutantes de la misma, se pueden expresar en C. diphtheriae u otros microorganismos modificados genéticamente para producir la proteína. En la técnica se conocen bien los procedimientos de modificar genéticamente las células para producir proteínas, véase, por ejemplo, Ausabel y col., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York) y las patentes de EE.UU. n° 5.534.615 y 4.816.567. Dichos procedimientos incluyen introducir ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de la proteína en células huésped. Entre otras células huésped bacterianas se incluyen células de E. coli. CRM197 es producida por una cepa mutante de Corynebacterium diphtheriae. Véase Uchida y col., 1973, J Biol Chem 248:3838-3844.

En ciertas modalidades de la invención, se produce una toxina diftérica mutante usando P. fluorescens como sistema de expresión huésped. Véase H. Jin y col., Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens, Protein Expr. Purif. (2011), doi:10.1016/j.pep.201 1.03.002 y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 20090325230.

Producción de toxina diftérica La toxina diftérica, o una forma muíante de la misma, se puede producir mediante procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 20060270600. Preferentemente, el procedimiento implica cultivar un microorganismo, por ejemplo una bacteria, tal como C. diphtheriae. Una célula huésped que se ha modificado genéticamente con ácido nucleico que codifica la proteína de interés se puede cultivar en condiciones bien conocidos en la técnica que permiten la expresión de la proteína.

CRM-197 se puede producir mediante la metodología descrita por Park y col., J Exp Med (1896)1 :164-185.

En un sistema de expresión que usa P. fluorescens, el proceso de fermentación consiste en una 1a etapa de matraz de agitación para semillas (de vial congelado a matraz), 2a etapa en fermentador de semillas y fermentador de producción que incluye una fase de crecimiento y de inducción. El glicerol se usa como fuente de carbono y un promotor inducible por isopropilo-beta-D-tiogalacto-piranósido (IPTG) dirige la expresión de la proteína. La suspensión celular refrigerada se transfiere después al proceso de recuperación o purificación.

La producción de toxinas se puede monitorizar de diversos modos, tales como, por ejemplo, SDS PAGE, ELISA o un ensayo de ADP-ribosilación (véase Blanke y col., 1994, Biochemistry 33:5155) o una combinación de estos procedimientos.

En los procedimientos de producción descritos en el presente documento, el pH se controla óptimamente de acuerdo con procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica.

Pre-procesamiento La mezcla que se va a aplicar a la hidroxiapatita y a una resina multimodal puede ser, por ejemplo, un sobrenadante que contenga la toxina diftérica, una fracción celular que contenga la toxina diftérica o una preparación que contenga la toxina diftérica derivada de un sobrenadante de fermentación/cultivo, por ejemplo un sobrenadante concentrado, tal como un sobrenadante ultrafiltrado o un sobrenadante diafiltrado. La mezcla que se va a aplicar se procesa, preferentemente, usando procedimientos tales como floculación, clarificación y cromatografía de intercambio aniónico. En algunas modalidades, la mezcla se procesa usando estos tres procedimientos.

En el caso de C. diphtheriae, que secreta la toxina diftérica en el sobrenadante de fermentación, el procedimiento se puede llevar a cabo directamente sobre el sobrenadante de fermentación o en un derivado de preparación del mismo. En el caso de expresión en otros microorganismos, tal como £ coli modificada genéticamente para expresar la toxina diftérica, la toxina diftérica se puede encontrar intracelularmente, por ejemplo en el periplasma o el citoplasma. En estos casos, las etapas de recuperación primaria pueden depender de la localización celular. La toxina diftérica se puede extraer de las células mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como describen, por ejemplo, Skopes in Protein Purification, Principies and Practice, 3aed, Pub: Springer Verlag, seguido de purificación de acuerdo con los procedimientos de la invención.

En los casos en los que se usan células enteras, las células se someten, preferentemente, a shock osmótico. Una etapa de shock osmótico se incluye, preferentemente, en el procedimiento de purificación tras la concentración de las células. En general, esto es una combinación de un cambio en la etapa de osmolaridad y una etapa de floculación. Estos cambios ambientales tienen como resultado la liberación de impurezas citoplasmáticas mínimas y la eliminación fácil de los residuos celulares tras la clarificación. Para las moléculas proteicas en el espacio periplásmico de las bacterias se ha usado un procedimiento de shock osmótico discontinuo a escala de laboratorio para liberar selectivamente el contenido periplásmico sin una rotura completa de la célula. Normalmente dicho procedimiento comienza equilibrando el caldo de fermentación con una solución de sal o azúcar de alta molaridad (tampón de absorción) para generar una presión osmótica elevada dentro de las células. A esto le sigue mezclado con tampón de osmolaridad baja (tampón de absorción) en modo discontinuo durante un periodo de tiempo finito para la liberación del contenido periplásmico. En general, a la liberación le sigue la eliminación de los residuos celulares mediante un procedimiento de clarificación. Un procedimiento para el shock osmótico de las células se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. n° 20080182295.

La floculación es un proceso por el cual se añaden agentes químicos a una mezcla para aglomerar las partículas finas que hacen que sedimenten. Muchos floculantes son cationes multivalentes, tal como aluminio, hierro, calcio o magnesio. Estas moléculas cargadas positivamente interaccionan con partículas cargadas negativamente y moléculas para reducir las barreras a la agregación. Además, muchas de estas sustancias químicas, con el pH adecuado y otras condiciones, tales como la temperatura y la salinidad, reaccionan con agua para formar hidróxidos insolubles que, después de precipitar, se unen para formar cadenas largas o mallas, atrapando físicamente las partículas pequeñas en el agregado de mayor tamaño. Los floculantes adecuados incluyen alúmina, clorhidrato de aluminio, sulfato de aluminio, óxido calcico, hidróxido cálcico, sulfato de hierro (II), cloruro de hierro (II), poliacrilamida, poliDADMAC, aluminato sódico y silicato sódico. Las condiciones para la floculación son bien conocidas para los expertos en la técnica.

Otros agentes floculantes se describen en la patente de EE.UU. N° 7.326.555 como agentes de precipitación selectivos (SAP). Estos Incluyen, entre otros, copolímeros de amina, compuestos de amonio cuaternario y cualquier mezcla respectiva de los mismos. Las mezclas de estos agentes proporcionan un rendimiento similar para formas puras al tiempo que incorporan múltiples mecanismos de precipitación (es decir, sitios de unión primaria), Se puede añadir a la mezcla una mezcla de estos agentes como tampón de precipitación o se puede incorporar una metodología de corte alto/bajo corte de adición. Más específicamente, se ha demostrado que las muchas formas de polietilenimina (PEI) son muy eficaces, especialmente en condiciones de pH casi neutro. En teoría, los copolímeros de PEI modificados que tienen una masa molecular relativamente alta pueden ser eficientes.

Los compuestos de amonio cuaternario incluyen, entre otros, las clases siguientes y ejemplos de productos comercialmente disponibles, sales de monoalquiltrimetilamonio (ejemplos de productos comercialmente disponibles incluyen bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) o cloruro de cetiltrimetilamonio, bromuro o cloruro de tetradeciltrimetilamonio (TTA), cloruro de alquiltrimetilamonio, cloruro de alquilariltrimetilamonio, bromuro o cloruro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de dodecildimetil-2-fenoxietilamonio, sal bromuro o cloruro de hexadecilamina, sal cloruro de dodecilamina y bromuro o cloruro de cetildimetiletilamonio), sales de monoalquildimetilbencilamonio (ejemplos incluyen cloruros de alquildimetilbencilamonio y cloruro de benzetonio (BTC)), sales dialquildimetilamonio (productos comerciales incluyen bromuro de domifen (DB), haluros de didecildimetilamonio y cloruro o bromuro de octildodecildimetilamonio), sales de amonio heteroaromáticas (productos comerciales incluyen haluros de cetilpiridinio (p.ej., CPC) o sal bromuro y bromuro o cloruro de hexadecilpiridinio), isómero cis de 1-[3-cloroalil]-3,5,7-triaza-1-azonioadamantano, bromuro de alquil-isoquinolinio y cloruro de alquildimetilnaftilmetilamonio (BTC 1110), sales de amonio cuaternario polisustituido (entre los productos disponibles comercialmente se incluyen sacarinato de alquildimetilbencilamonio y ciclohexilsulfamato de alquildimetiletilbencilamonio), sales de amonio bis-cuaternario (ejemplos de productos incluyen 1 ,10-bis(cloruro de 2-metil-4-aminoquinolinio)-decano, 1 ,6-Bis{cloruro de 1-metil-3-(2,2,6-trimetil ciclohexil)-propildimetilamonio} hexano o cloruro de triclobisonio y el bis-cuat denominado CDQ por Buckman Brochures), y sales poliméricas de amonio cuaternario (incluye poliionenos tales como polo[oxietilen(dimetiliminio)etilen(dimetiliminio)etilen dicloruro], poli[N-3-dimetilamonio)propil]N-[3-etilneoxietilend¡metilamon¡o) propiljurea dicloruro y alfa-4-[1-tris(2-hidroxietil)amonio cloruro).

La clarificación del caldo se puede usar para obtener un sobrenadante que contiene toxina diftérica. Las bacterias se pueden separar del caldo de fermentación mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como centrifugación, sedimentación/decantación o filtración, por ejemplo microfiltración y diafiltración. La clarificación normalmente implica centrifugación para sedimentar los sólidos y recuperar el sobrenadante para su posterior procesamiento. Como alternativa, se pueden usar microfiltración, filtración en profundidad o una precipitación basada en pH (ácido o base) para eliminar los sólidos por filtración, recuperándose el filtrado para su posterior purificación. La clarificación puede también implicar una combinación de estas etapas, por ejemplo centrifugación acoplado con microfiltración o filtración en profundidad. Véase, por ejemplo, Wang y col., 2006, Biotechnol Bioeng 94:91-104.

La filtración para aclarar el caldo, que está opcionalmente floculado, puede efectuarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo con membranas tales como membranas de fibra hueca o enrolladas en espiral, tal como por medio de un filtro de 0.1 o 0.2 µ??, por ejemplo un filtro de fibra hueca, tal como la que se puede obtener en A/G Technology, o una fibra hueva de 0.4 o 0.65 pm para una membrana enrollada en espiral, o un filtro de 300K o 500K.

Se puede usar diafiltración para reducir la fuerza iónica eliminando sales y otros iones más pequeños que el tamaño de corte de peso molecular de la membrana de diafiltración. La reducción de la tensión iónico tiene beneficios para realizar la etapa de intercambio iónico, ya que a una fuerza iónica reducida la matriz de intercambio iónico retiene menos toxinas y, de este modo, mejora el rendimiento. Adicionalmente se consigue una purificación parcial mediante la membrana de diafiltración. Por tanto, la diafiltración se puede llevar a cabo contra tampón de fuerza iónica baja, por ejemplo Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS, sales inorgánicas (p. ej., sulfatos y fosfatos), en una concentración de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 100 mM, preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mM, por ejemplo 10 mM, que tiene un pH de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.0, preferentemente de aproximadamente 6.9 a aproximadamente 8.0, por ejemplo de aproximadamente 7.4 a 7.6, usando, por ejemplo, una membrana de corte de peso molecular nominal de 30.000 dalton que tendrá como resultado la eliminación de sales componentes del medio de peso molecular bajo y proteínas secretadas de peso molecular inferior a 30 000. Dichos componente pueden unirse, de otro modo, a la matriz de intercambio iónico y reducir su capacidad para unirse a toxinas.

La combinación de diafiltración y ultrafiltración no solo reduce la fuerza iónica, pero sirve como purificación inicial y permite reducir el volumen. Esto significa que se pueden usar columnas más pequeñas, de modo que se reduce el tiempo requerido para llevar a cabo las etapas cromatográficas.

Para facilitar la manipulación, particularmente cuando se hace referencia a volúmenes grandes, como sería el caso para la purificación a escala industrial para fines farmacéuticos, se puede conseguir un grado de concentración del sobrenadante antes de la etapa de intercambio iónico. El sobrenadante sin células se puede concentrar, en general de 5 a 50, preferentemente de 15 a 25 veces, tal como 20 veces, usando procedimientos de concentración de proteínas conocidos en la técnica mediante, por ejemplo, ultrafiltración con materiales porosos, por ejemplo en forma de filtros, membranas o fibras huecas. Para facilitar la manipulación se prefieren los filtros. Para ultrafiltración/concentración, se prefieren los filtros que tienen un corte de peso molecular más pequeño, preferentemente un 20 5 menor que la toxina diftérica, preferentemente filtros de 30 KDa (es decir, filtros que tienen un peso molecular nominal de 30.000 dalton). En la técnica se conocen los materiales adecuados para dichos filtros e incluyen materiales poliméricos, tales como celulosa mixta, poliétersulfona o OVDF, por ejemplo polisacáridos tales como celulosa y polisulfonas. Materiales preferidos son aquéllos que tienen una capacidad menor o capacidad para absorber la toxina diftérica.

Particularmente preferidos son los filtros de celulosa, por ejemplo filtros hechos de celulosa regenerada tale como filtros basados en YM y otras membranas que tienen poca capacidad de unión a proteínas, por ejemplo bioconcentradores de flujo tangencial en placa plana producidos por Amicon.

La cromatografía de intercambio aniónico se puede usar de forma independiente o en una combinación de sustituyentes de intercambio aniónico. A este respecto, varios sustituyentes aniónicos se pueden fijar a matrices con el fin de formar soportes aniónicos para cromatografía. Sustituyentes de intercambio aniónico incluyen dietilaminoetil (DEAE), trimetilaminoetil acrilamida (TMAE), aminoetil cuaternario (QAE) y grupos de amina cuaternaria (Q). Las resinas celulósicas de intercambio iónico tales como DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 y CM-52 están disponibles de Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Reino Unido. También se conocen intercambiadores iónicos reticulados basados en Sephadex. Por ejemplo, DEAE- y QAE-Sephadex, y DEAE- y Q-Sepharose están todos ellos disponibles en GE Healthcare, Piscataway, N.J Se puede usar una resina de intercambio iónico convencional. Ejemplos incluyen Q sefarosa y dimetilaminoetil (DEAE) y resinas de amina cuaternaria. El material de intercambio aniónico se puede empaquetar en una columna, cuyo tamaño dependerá del volumen del sobrenadante de cultivo que se va a usar. Los expertos en la técnica pueden determinar el tamaño adecuado de la columna de acuerdo con la proteína total en el medio concentrado. En general, para fermentación a gran escala del orden de 4-50 litros se puede aplicar a columnas de volumen de aproximadamente 1 litro. La columna puede equilibrarse primero con un tampón, por ejemplo un tampón de baja fuerza iónica, tal como HEPES, Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS, sales inorgánicas (p. ej., sulfatos o fosfatos), en una concentración de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 100 mM, preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mM, por ejemplo 10 mM, que tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.0, por ejemplo de aproximadamente 6.9 a 7.6, por ejemplo el tampón usado para diafiltración del sobrenadante concentrado, tal como Tris 10 Mm, KCI 20 mM, a pH 7.0. Después, el sobrenadante o concentrado de fermentación se puede cargar, lavar la columna con un tampón de fuerza iónica baja y al mismo pH que el tampón de equilibrado para eliminar mediante lavado cualquier proteína sin unir, por ejemplo el tampón de equilibrado.

Las sales de equilibrado o de lavado usadas pueden escogerse, por ejemplo, entre sales inorgánicas para cromatografía de intercambio iónico, tal como cloruro de Eligió, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de bario, acetato sódico, perclorato de litio, sulfato sódico, sulfato de magnesio, fosfato potásico y sulfato potásico, u otras sales de elución conocidas para el experto en la técnica.

La mezcla se puede aplicar a una columna de cromatografía de intercambio aniónico, en condiciones tales que la toxina diftérica queda inmovilizada en la columna. Se puede usar cualquier material de intercambio aniónico, pero se usa de forma ventajosa columnas de cromatografía de intercambio aniónico fuerte o débil que están disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, columnas con grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en aminoetil, dietilaminoetil, dimetilaminoetil, polietilenimina, trimetilaminometil, trimetilaminohidroxipropil, dietil-(2-hidroxipropil)aminoetil, polietilenimina cuaternizada, trietilaminoetil, trimetilaminoetil y 3-trimetilamino-2-hidroxipropil. Entre estos, se prefieren los intercambiadores aniónicos fuertes con grupos funcionales que comprenden amina cuaternaria, por ejemplo trimetilaminometil, trimetilaminohidroxipropil, dietil-(2-hidroxipropil)aminoetil, polietilenimina cuaternizada, trietilaminoetil, trimetilaminoetil y 3-trimetilamino-2-hidroxipropil. El experto sin experimentación indebida podrá determinar fácilmente las condiciones en las que la toxina diftérica se inmoviliza en la columna.

La elución de la toxina inmovilizada se realiza, en general, usando un gradiente de concentración de una solución de una sal de elución, de acuerdo con un procedimiento cromatográfico conocido. La sal de elución usada puede escogerse, por ejemplo, entre sales de elución inorgánicas para cromatografía de intercambio iónico, tal como cloruro d Eligió, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de bario, acetato sódico, perclorato de litio, sulfato sódico, sulfato de magnesio, fosfato potásico y sulfato potásico, u otras sales de elución conocidas para el experto en la técnica.

Después, la toxina unida se puede eluir de diversos modos.

Estos incluyen alterar el pH o incrementar la fuerza iónica del tampón. Por tanto, la toxina se puede eluir mediante un incremento de gradiente del tampón con fuerza iónica alta, tal como HEPES, Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS o fosfato, en una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1.0 M, preferentemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, que contiene sales como NaCI, KCI, o sulfato amónico a una concentración de aproximadamente 0.1 M a 1.0 M. Estos tampones pueden tener un pH de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5, preferentemente de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8, por ejemplo de aproximadamente 6.9 a 7.6. Un ejemplo de un tampón preferido es Tris 10 mM, fosfato potásico 1mM, que contiene KCI 100 mM a pH 7.0. La proteína eluirá entre a KCI de aproximadamente 60 a 90 mM en el tampón.

En ciertas modalidades, la mezcla está sujeta a un pase en la cromatografía de intercambio aniónico. En otras modalidades, la mezcla está sujeta a más de un pase, por ejemplo 2, 3 o 4 pases, en la cromatografía de intercambio aniónico. Cuando se realiza más de un pase en cromatografía de intercambio aniónico, los pases pueden ser en la misma columna o membrana o diferentes columnas o membranas.

Cromatografía en columna La presente invención proporciona un procedimiento de purificar la toxina diftérica, o una forma muíante de la misma, de un cultivo de bacterias productoras de la toxina diftérica (o una versión mutante de la misma), en el que dicho procedimiento comprende una etapa de cromatografía de hidroxiapatita y una etapa de cromatografía multimodal. Cualquier etapa se puede realizar primero, seguida de la otra etapa.

Las etapas cromatográficas se pueden llevar a cabo usando matrices según sea adecuado en forma discontinua o de columna, de las que se prefiere esta última tanto por velocidad como por comodidad. La matriz puede ser un soporte convencional como se conoce en la técnica, por ejemplo soportes inertes basados en celulosa, poliestireno, acrilamida, sílice, fluorocarbonos, dextrano reticulado o agarosa reticulada.

Hidroxiapatita La cromatografía en hidroxiapatita es un procedimiento de purificar proteínas que usa un fosfato calcico hidroxilado insoluble [Caio(P04)6(OH)2 o Ca5(P04)30H)2], que forma tanto la matriz como el ligando. Los grupos funcionales consisten en pares de iones de calcio cargados positivamente (sitios C) y agrupaciones de grupos fosfato cargado (sitios P). Las interacciones entre hidroxiapatita y proteínas son complejas y de moda mixta. No obstante, en un procedimiento de interacción, los grupos amino cargados positivamente en las proteínas se asocian con los sitios P cargados negativamente y los grupos carboxilo de las proteínas interaccionan mediante coordinación de los complejos con los sitios C. Véase Shepard, 2000, J. of Chromatography 891:93-98.

Se puede usar una serie de soportes cromatográficos en la preparación de columnas de HA, las más usadas son hidroxiapatita de tipo I y de tipo II. El tipo I tiene una capacidad de unión a proteínas alta y mejor capacidad para proteínas ácidas. No obstante, el tipo II tiene una capacidad de unión a proteínas menor, pero tiene una resolución mejor de los ácidos nucleicos y ciertas proteínas. Un experto en la técnica puede determinar la elección de un tipo de hidroxiapatita concreto.

Comercialmente se dispone de varias resinas cromatográficas de hidroxiapatita y, en la práctica de la invención se puede usar cualquier forma disponible del material. En una modalidad de la invención, la hidroxiapatita está en una forma cristalina. Las hidroxiapatitas para usar en la presente invención pueden ser las que se aglomeran para formar partículas y se sinterizan a temperaturas altas en una masa cerámica porosa estable.

El tamaño de partícula de la hidroxiapatita puede variar ampliamente, peri un tamaño de partícula típico varía de 1 µ?t? a 1.000 µ?t? de diámetro y puede ser de 10 pm a 100 pm. En una modalidad de la invención, el tamaño de partícula es de 20 pm. En otra modalidad de la invención, el tamaño de partícula es de 40 pm. En otra modalidad de la invención, el tamaño de partícula es de 80 pm, La presente invención se puede usar con la resina de hidroxiapatita que está suelta o empaquetada en una columna. En una modalidad de la invención, la resina de hidroxiapatita cerámica está empaquetada en una columna. Un experto en la técnica puede determinar la elección de las dimensiones de la columna. En una modalidad de la invención, se puede usar un diámetro de columna de al menos 0.5 cm con una altura de lecho de aproximadamente 20 cm para la purificación a pequeña escala. En una modalidad adicional de la invención, se puede usar un diámetro de columna de aproximadamente 35 cm a aproximadamente 60 cm. En otra modalidad adicional de la invención, se puede usar un diámetro de columna de 60 cm a 85 cm.

Composiciones del tampón v condiciones de carga Antes de poner en contacto la resina de hidroxiapatita con la mezcla, puede ser necesario ajustar parámetros tales como pH, fuerza iónica y temperatura, y, en algunos casos, la adición de sustancias de diferentes tipos. Por tanto, puede ser necesario realizar un equilibrado de la matriz de hidroxiapatita lavándola con una solución (p. ej., un tampón para ajustar el pH, la fuerza iónica, etc. o para la introducción de un detergente) proporcionando las características necesarias para purificación de la mezcla de toxina diftérica.

En la combinación de unión/cromatografía de hidroxiapatita en modo de flujo continuo, la matriz de hidroxiapatita se equilibra y lava con una solución, proporcionando las características necesarias para purificación de la preparación de la toxina diftérica. En una modalidad de la invención, la matriz se puede equilibrar usando una solución que contiene cloruro potásico o cloruro sódico de 0.01 a 2.0 M a un pH ligeramente básico o ligeramente ácido. El tampón de equilibrado puede también contener fosfato potásico o fosfato sódico de 0 a 20 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico de 1 a 10 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico de 2 a 5 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico 0 mM y en otra modalidad puede contener fosfato potásico 3 mM El tampón de equilibrado puede contener cloruro potásico o cloruro sódico 0.01 a 2.0M, en una modalidad cloruro potásico o cloruro sódico de 0.025 a 0.5M, en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.05M y en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.1M. El pH del tampón de carga puede variar de 6.5 a 8.0. En una modalidad, el pH puede ser de 6.8 a 7.6, y en otra modalidad el pH puede ser de 7.0. El tampón de equilibrado puede contener otros componentes, incluidos, entre otros, CaCI2, MgCI2, sulfato, acetato, glicina, arginina, imidazol, succinato y CaEDTA PO . Específicamente en una modalidad, cloruro cálcico de 0 a 10 mM, en otra modalidad puede contener CaCl2 0 mM y en otra modalidad puede contener CaCI2 1 mM. El tampón de equilibrado puede contener MOPS de 5 a 200 mM, en otra modalidad puede contener MOPS 20 mM y en otra modalidad puede contener MOPS 50 mM.

La mezcla de toxina diftérica puede estar también intercambiada o diluida con tampón en un tampón adecuado o tampón de carga en preparación para la unión/cromatografía en modo de flujo continuo. En una modalidad de la invención, la preparación de la toxina diftérica puede intercambiarse adicionalmente en un tampón de carga en un tampón de carga que contiene cloruro potásico o cloruro sódico de 0.01 a 2.5 M a un pH ligeramente básico o ligeramente ácido. El tampón de carga puede también contener fosfato potásico o fosfato sódico de 1 a 10 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 2 a 8 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 3 a 7 mM, y en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 5 mM. El tampón de carga puede contener NaCI de 0.2 a 2.5M en una modalidad, NaCI de 0.2 a 1.5M, en otra modalidad, NaCI de 0.3 a 1.0M y en otra modalidad, NaCI 110 mM. El pH del tampón de carga puede variar de 6.5 a 8.0. En una modalidad, el pH puede ser de 6.5 a 7.6, y en otra modalidad el pH puede ser de 7.1.

El contacto de una mezcla de toxinas con la resina de hidroxiapatita, ya sea en modo unión, en modo de flujo continuo o en combinaciones de ambos, se puede realizar en una columna de lecho empaquetado, una columna de lecho fluido/expandido que contiene la matriz en fase sólida y/o en una simple operación discontinua en la que la matriz de fase sólida se mezcla con la solución durante un tiempo determinado.

Después del contacto de la resina de hidroxiapatita con la mezcla de toxinas se produce un procedimiento de lavado. Los tampones de lavado usados dependerán de la naturaleza de la resina de hidroxiapatita, el modo de cromatografía de hidroxiapatita empleado, la resina se puede lavar usando una solución que contiene cloruro potásico o cloruro sódico de 0.01 a 1 M a un pH ligeramente básico o ligeramente ácido. Por ejemplo, el tampón de lavado puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 0 a 20 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 0.1 a 10 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 0.1 a 5 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 0.5 mM y en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 3 mM. El tampón de lavado puede contener cloruro potásico o cloruro sódico de 0 a 1 M, en una modalidad cloruro potásico o cloruro sódico de 0.025 a 0.5M, en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.4M y en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.06M. El pH del tampón de lavado puede variar de 6.5 a 8.0. En una modalidad, el pH puede ser de 6.8 a 7.6, y en otra modalidad el pH puede ser de 7.2, en otra modalidad, 7.4. El tampón de lavado puede contener otros componentes, incluidos, entre otros, CaC , MgC , sulfato, acetato, glicina, arginina, imidazol, succinato o CaEDTA P04.

Específicamente en una modalidad, cloruro cálcico de 0 a 10 mM, en otra modalidad puede contener CaCl2 0 mM y en otra modalidad puede contener CaCI2 1 mM. El tampón de lavado puede contener MOPS de 5 a 200 mM, en otra modalidad puede contener MOPS 20 mM y en otra modalidad puede contener MOPS 50 mM. El tampón de lavado se puede aplicar en modo de etapas o de gradiente.

En el modo de unión, la toxina se puede eluir de la columna tras uno o múltiples procedimiento de lavado. La elución se produce mediante i) elución por etapas con un tampón de elución; i¡) elución por gradientes con un tampón de elución; iii) elución por etapas o por gradiente con tampones de elución; o iv) elusiones por etapas o múltiples gradientes con tampones de elución. En una modalidad, para la elución de la toxina diftérica de la columna, la presente invención usa un tampón fosfato de fuerza iónica alta que contiene cloruro potásico o cloruro sódico de 0 a 1 M a un pH ligeramente básico o ligeramente ácido. El tampón de elución puede contener además fosfato potásico o fosfato sódico de 20 a 100 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 20 a 80 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 30 a 60 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 40 mM y en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 50 mM. El tampón de elución puede contener cloruro potásico o cloruro sódico de 0 a 1 M, en una modalidad cloruro potásico o cloruro sódico de 0.025 a 0.5M, en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.5M y en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.06M. El pH del tampón de elución puede variar de 6.5 a 8.0. En una modalidad, el pH puede ser de 6.8 a 7.6, y en otra modalidad el pH puede ser de 7.2, en otra modalidad, 7.0. El tampón de elución puede contener otros componentes, incluidos, entre otros, CaCb, MgCl2, acetato, glicina, arginina, imidazol, succinato o CaEDTA PO4. Específicamente en una modalidad, cloruro magnésico, cloruro cálcico, sulfato sódico o sulfato amónico de 0 a 1 mM, en otra modalidad puede contener CaCfe 0 mM y en otra modalidad puede contener CaC 1 mM y en otra modalidad puede contener MgCb.lM. El tampón de elución puede contener MOPS de 5 a 200 mM, en otra modalidad puede contener MOPS 20 mM y en otra modalidad puede contener MOPS 50 mM. El tampón de elución puede alterarse para elución de la toxina de la columna en un gradiente continuo o escalonado.

En modo de flujo continuo y la combinación modo de unión/flujo continuo, la toxina diftérica purificada obtenida después de un lavado de la columna se puede combinar con otras fracciones de la toxina diftérica purificada.

En ciertas modalidades, la elución se produce mediante i) elución por etapas con un tampón de elución que comprende cloruro potásico aproximadamente > 30 mM o fosfato potásico o fosfato sódico de aproximadamente= 15 mM, ii) elución por gradiente que comprende fosfato potásico o fosfato sódico de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 mM o cloruro sódico o cloruro potásico de aproximadamente 100 mM a 2 M; o iii) un cambio de pH de= 0.3 unidades.

Después de usar, la columna de hidroxiapatita puede limpiarse opcionalmente, desinfectarse y almacenarse en un agente adecuado y, opcionalmente, volver a usarse.

La hidroxiapatita usada en la invención puede estar en una de una serie de formas conocidas en la técnica. La hidroxiapatita puede estar en forma de cristales, un gel o una resina. La forma cristalina normal puede, como alternativa, sinterizarse a temperaturas altas para modificarla hasta una forma cerámica (Bio-Rad). Preferentemente, la hidroxiapatita está en forma de gel. Preferentemente, el gel está empaquetado en una columna, como se usa habitualmente en la purificación por cromatografía.

Si la hidroxiapatita está en forma particulada, preferentemente las partículas tienen un diámetro de 20 µ?? o más, preferentemente de 40 µ?? o más, preferentemente de 80 µ?? o más.

La hidroxiapatita cristalina fue el primer tipo de hidroxiapatita usada en la cromatografía, pero estaba limitada por dificultades estructurales. La cromatografía en hidroxiapatita cerámica (cHA) se desarrolló para superar algunas de las dificultades asociadas con la hidroxiapatita cristalina, tal como caudales limitados. La hidroxiapatita cerámica tiene una durabilidad elevada, buena capacidad de unión a proteínas y se puede usar a caudales y presiones más altos que la hidroxiapatita cristalina, Véase Vola y col., BioTechniques 14:650-655 (1993).

La hidroxiapatita se ha usado en la separación cromatográficas dé proteínas, ácidos nucleicos, así como anticuerpos. En la cromatografía en hidroxiapatita, la columna normalmente está equilibrada y lo mismo se aplica, en una concentración baja de tampón fosfato, y las proteínas adsorbidas se eluyen en un gradiente de concentraciones de tampón fosfato. En ocasiones, se usan con éxito gradientes pequeños de tampón fosfato para eluir proteínas, mientras que, en otros casos, se han usado con éxito gradientes de concentración de hasta 400 mM de fosfato sódico. Véase, por ejemplo, Stanker, 1985, J.lmmunological Methods 76:157-169 (gradiente de elución con fosfato sódico 10 mM a 30 mM); Shepard, 2000, J. Chromatography 891 :93-98 (gradiente de elución con fosfato sódico de 10 mM a 74 mM); Tarditi, 1992, J. Chromatography 599:13-20 (gradiente de elución con fosfato sódico de 10 mM a 350 mM).

Soportes para cromatografía multimodal La cromatografía multimodal implica el uso de soportes cromatográficos de fase sólida que emplean múltiples mecanismos químicos para adsorber proteínas u otros solutos. La cromatografía en modo mixto en ocasiones también se usa para describir dicha cromatografía y dichos términos se usan de forma intercambiable en el presente documento. Ejemplos de soportes cromatográficos multimodales incluyen, entre otros, soportes cromatográficos que explotan las combinaciones de dos o más de los mecanismos siguientes: Intercambio aniónico, intercambio catiónico, interacción hidrofóbica, interacción hidrofílica, puentes de hidrógeno, unión pipi y afinidad de metales. Dos de estos adsorbentes de intercambio iónico multimodal están disponibles comercialmente en GE Healthcare, Capto Adhere™ y Capto-MMC™. Estos combinan grupos de intercambio aniónico fuerte (p. ej., grupo amino) y catiónico débil, respectivamente, con grupos aromáticos hidrófobos.

Los soportes cromatográficos multimodales proporcionan selectividades únicas que no se pueden reproducir mediante procedimientos cromatográficos en modo sencillo, tales como intercambio iónico. La cromatografía multimodal proporciona potenciales ahorros, vidas más prolongadas de las columnas y flexibilidad de la operación en comparación con los procedimientos basados en afinidad. No obstante, el desarrollo de los protocolos de cromatografía multimodal pueden suponer una pesada carga para el desarrollo del proceso, ya que se requiere detección selectiva de múltiples parámetros para llegar a su potencial completo. El desarrollo del procedimiento es complicado, impredecible y puede requerir amplios recursos para alcanzar una recuperación adecuada debido a la complejidad del mecanismo cromatográfico.

La cromatografía multimodal se refiere a la cromatografía que implica sustancialmente una combinación de dos o más mecanismos químicos. En algunas modalidades, la combinación tiene como resultado selectividades únicas que no se pueden conseguir mediante un soporte de modo único. En ciertas modalidades, la resina multimodal comprende una parte cargada negativamente y una parte hidrofóbica. En una modalidad, la parte cargada negativamente es un grupo carboxilatq aniónico o grupo sulfo aniónico para intercambio de cationes. Ejemplos de dichos soportes incluyen, entre otros, Capto-MMC™ (GE Healthcare). Véase el cuadro 1.

Otros medios de cromatografía multimodal están disponibles comercialmente. Aunque no se espera que las resinas multimodales que no comprenden una parte cargada negativamente y una parte hidrofóbica se comporten de forma similar a Capto-MMC™, se pueden determinar las condiciones óptimas para otras resinas multimodales usando los procedimientos descritos en el presente documento. Ejemplos disponibles comercialmente incluyen, entre otros, hidroxiapatita cerámica (CHT) o fluoroapatita cerámica (DFT), MEP-Hypercel™, Capto-Adhere™, Bakerbond™ Carboxy-Sulfon™ y Bakerbond™ ABx™ (Advantor Performance Materials Inc., Phillipsburg, NJ). Véase el cuadro 1.

CUADRO 1 Resumen de los medios de cromatografía multimodal El soporte cromatográfico se puede poner en práctica en una columna de lecho empaquetado, una columna de lecho fluido/expandido y/o una operación discontinua, en el que el soporte multimodal es mixto con la mezcla de la toxina diftérica durante un tiempo determinado. Un soporte cromatográfico de fase sólida puede ser una partícula porosa, partícula no porosa, membrana o monolito. La expresión "fase sólica2 se usa para decir cualquier matriz no acuosa a la que uno o más ligandos se pueden adherir o, como alternativa, en el caso de la cromatografía de exclusión por tamaño, puede hacer referencia a la estructura en gel de una resina. La fase sólida puede ser cualquier matriz capaz de adherir los ligandos de este modo, por ejemplo una columna de purificación, una fase discontinua de partículas pequeñas, una membrana, un filtro, gel etc. Ejemplos de materiales que se pueden usar para formar la fase sólida incluyen polisacáridos (tales como agarosa y celulosa) y otras matrices mecánicamente estables tales como sílice (p. ej., cristal de poro controlado), polí(estirenodivinil)benceno, poliacrilamida, partículas cerámicas y derivados de cualquiera de estos.

En algunas modalidades, el soporte multimodal está empaquetado en una columna de al menos 5 mm de diámetro interno y una altura de al menos 25 mm, tal como las incorporadas en robótica de manipulación de líquidos. Dichas modalidades son útiles para, por ejemplo, evaluar los efectos de varias condiciones.

Otra modalidad usa el soporte multimodal empaquetado en una columna de cualquier dimensión requerida para soportar aplicaciones preparativas. El diámetro de la columna puede variar de menos de 1 cm a más de 1 metro y la altura de la columna puede variar de menos de 1 cm a más de 50 cm en función de los requisitos de una aplicación concreta. Las aplicaciones a escala comercial normalmente tendrán un diámetro de la columna (DI) de 20 cm o más y una altura de al menos 25 cm.

Un experto en la técnica puede determinar las dimensiones de la columna adecuadas.

En algunas modalidades, la resina multimodal está en una columna. La columna puede ser de presión baja (< 3 de contrapresión). En algunas modalidades, la columna está empaquetada con un medio que tiene un diámetro de partícula de aproximadamente > 30 µ?t?, por ejemplo, de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 µ?t?. En algunas modalidades, la columna tiene un tamaño de poro de aproximadamente 100 a aproximadamente 4000 ángstrom, por ejemplo de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 ángstrom. En algunas modalidades, la longitud de la columna es de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 cm, por ejemplo de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 cm. Preferentemente, la columna es una columna preparativa, es decir de escala preparativa y/o carga preparativa. Normalmente, la columna de escala preparativa tiene un diámetro de al menos aproximadamente 1 cm, por ejemplo de al menos aproximadamente 6 cm, hasta, e inclusive, aproximadamente 15 cm, aproximadamente 60 cm, o más. El medio de la columna puede ser cualquier material adecuado, incluidos medios basados en polímeros, medios basados en sílice o medios de metacrilato. En una modalidad, el medio está basado en agarosa.

La columna puede ser cualquier columna analítica o preparativa. La cantidad de toxina diftérica cargada en la columna es, en general, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 g de toxina diftérica/litro de volumen del lecho, por ejemplo de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 30 g de toxina diftérica/litro de volumen del lecho, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 g de toxina diftérica/litro de volumen del lecho o de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 g de toxina diftérica/litro de volumen del lecho. La columna de carga preparativa tiene una carga de molécula de al menos aproximadamente 0.1 g de toxina diftérica/litro de volumen del lecho, por ejemplo al menos aproximadamente 1 g de toxina diftérica/litro.

En general, el caudal es de aproximadamente 50 a aproximadamente 600 cm/hora o de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 volúmenes de columna (VC)/hora, en función de la geometría de la columna. El experto en la técnica puede determinar la velocidad del flujo adecuada.

La temperatura puede estar en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 °C, tal como a temperatura ambiente.

En la preparación para poner en contacto la preparación de la toxina diftérica con el soporte multimodal, en algunas modalidades el ambiente químico en el interior de la columna está equilibrado. Normalmente, esto se consigue haciendo fluir un tampón de equilibrado que es equivalente o similar a las condiciones del tampón de carga, tales como Tris, MES, MOPS, HEPES, solución tampón de fosfato potásico o fosfato sódico con o sin sales inorgánicas, por ejemplo cloruro sódico o cloruro potásico, a través de la columna para establecer el pH adecuado, la conductividad y otras variables pertinentes. El tampón de equilibrado es isotónico con una conductividad < 30 mS/cm y normalmente tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8. El tampón de equilibrado podría, como alternativa, tener una conductividad= 30 mS/cm y normalmente tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6.2 a 7.8 debido a su estructura multimodal.

En una modalidad de la invénción, la matriz se puede equilibrar usando una solución que contiene cloruro potásico o cloruro sódico de 0.01 a 0.5 M a un pH ligeramente básico o ligeramente ácido. El tampón de equilibrado puede también contener además fosfato potásico o fosfato sódico de O a 100 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 10 a 25 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 10 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 20 mM y en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 25 mM. El tampón de equilibrado puede contener cloruro potásico o cloruro sódico 0.01 a 0.5M, en una modalidad cloruro potásico o cloruro sódico de 0.025 a 0.2M, en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.05M y en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.1 M. El pH del tampón de carga puede variar de 6.5 a 8.0. En una modalidad, el pH puede ser de 6.8 a 7.3, y en otra modalidad el pH puede ser de 7.0. El tampón de equilibrado puede contener otros componentes, por ejemplo un inhibidor de proteasa, o mezclas que incluyen, entre otros, AEBSF, Leupeptina, EDTA, aprotinina, pepstatina, PMSF, quimostatina, 2-mercaptoetanol, benzamidina, EGTA, bisulfito sódico, ácido etilendiaminotetracético, mezclas de inhibidores de proteasa (p.ej., SigmaFAST™) y lactacistina. El tampón de equilibrado puede contener MOPS de 5 a 200 mM, en otra modalidad puede contener MOPS 20 mM y en otra modalidad puede contener MOPS 50 mM.

La mezcla de toxina diftérica puede estar también intercambiada o diluida con tampón en un tampón adecuado o tampón de carga en preparación para cromatografía multimodal. En una modalidad de la invención, la preparación de la toxina diftérica puede intercambiarse adicionalmente en un tampón de carga en un tampón de carga que contiene cloruro potásico o cloruro sódico de 0.01 a 0.5 M a un pH ligeramente básico o ligeramente ácido. El tampón de carga puede también contener fosfato potásico o fosfato sódico de 0 a 100 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico de 10 a 25 mM, en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 10 mM, y en otra modalidad puede contener fosfato potásico o fosfato sódico 25 mM. El tampón de carga puede contener cloruro potásico o cloruro sódico 0.01 a 0.5M, en una modalidad cloruro potásico o cloruro sódico de 0.025 a 0.2M, en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.05M y en otra modalidad cloruro potásico o cloruro sódico 0.1 M. El pH del tampón de carga puede variar de 6.5 a 8.0. En una modalidad, el pH puede ser de 6.8 a 7.3, y en otra modalidad el pH puede ser de 7.2. El tampón de carga puede contener otros componentes, por ejemplo un inhibidor de proteasa, o mezclas que incluyen, entre otros, AEBSF, Leupeptina, EDTA, aprotinina, pepstatina, PMSF, quimostatina, 2-mercaptoetanol, benzamidina, EGTA, bisulfito sódico, ácido etilendiaminotetracético, mezclas de inhibidores de proteasa (p.ej., SigmaFAST™) y lactacistina. El tampón de carga puede contener MOPS de 5 a 200 mM, en otra modalidad puede contener MOPS 20 mM y en otra modalidad puede contener MOPS 50 mM.

Se usa un tampón de elución para eluir la toxina de la resina de modo mixto. Tampones de elución adecuados incluyen, entre otros, HEPES, MOPS, TRIS, fosfato, BICINE o trietanolamina, que contienen cloruro sódico, fosfato potásico, sulfato sódico o sulfato amónico, cloruro potásico, cloruro de magnesio, cloruro cálcico, sulfato de litio, cloruro de litio, acetato sódico, cloruro amónico, etanol, urea, propilenglicol, arginina, guanidina, citrato sódico, o una combinación de los mismos tamponados a pH 7 a 9. En ciertas modalidades, el tampón de elución contiene al menos cloruro potásico o cloruro sódico 0.1 M. La toxina diftérica se puede eluir con elución en etapas con un tampón de elución que tiene una concentración de sales superior o inferior a la concentración de las sales de elución o por elución en gradiente con cualquier gradiente comenzando con una concentración de sales inferior o superior a la concentración de las sales de elución. En modalidades específicas, la elución se produce mediante i) elución por etapas con un tampón de elución que contiene cloruro sódico > aproximadamente 0.005M o cloruro potásico de 0 a 0.1 mM a cloruro sódico aproximadamente 1 M o cloruro sódico de 1 a aproximadamente 0.1M o sulfato sódico de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.0M; o ii) elución en gradiente de cloruro sódico de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5M o cloruro sódico de 0.5 a aproximadamente 0.1 M; o iii) elución por etapas co un tampón de elución a pH > 7.5; o iv) elución en gradiente a pH de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.0. Son aplicables cualquier combinación o perturbación de los procedimientos de elución. El tampón de elución puede contener otros componentes, por ejemplo una mezcla de inhibidores de proteasa, o mezclas que incluyen, entre otros, AEBSF, Leupeptina, EDTA, aprotinina, pepstatina, PMSF, quimostatina, 2-mercaptoetanol, benzamidina, EGTA, bisulfito sódico, ácido etilendiaminotetracético, mezclas de inhibidores de proteasa (p.ej., SigmaFAST™) y lactacistina. El tapón de elución para la elución por etapas puede contener NaCI de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.0M, por ejemplo NaCI o KCI 0.1 ± 0.1 M, tamponado a pH de 8.5 ± 0.1. Un tampón de elución para elución en gradiente puede ser cualquier gradiente que abarque, por ejemplo, NaCI de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5M o KCI de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 0.1 M, incluidos, entre otros, Na Cl de 0 a aproximadamente = 1.0M, de 0.1 a aproximadamente 0.5M. Normalmente, el tampón de elución se tampona a un pH de 7 a 9. Normalmente, la elución se produce sobre aproximadamente 5 a aproximadamente 20 volúmenes de columna.

En ciertas modalidades, la elución es mediante i) elución por etapas con un tampón de elución que comprende cloruro potásico o cloruro sódico aproximadamente= 125 mM a pH de 6.8 a 9.5); ii) elución en gradiente que comprende cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, sulfato amónico o cloruro potásico de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.3 mM; iii) un cambio de pH de= 0.5 unidades dentro de un intervalo de pH 6.5 a 9.5 o iv) un cambio de temperatura de > 1°C dentro de un intervalo de temperaturas de 2 a 30 °C.

Después de usar, la columna multimodal puede limpiarse opcionalmente, desinfectarse y almacenarse en un agente adecuado y, opcionalmente, volver a usarse.

En ciertas modalidades, opcionalmente se lava el soporte cromatográfico después de cargar. La columna se puede lavar para 1) eliminar la muestra de carga no unida de la columna antes de la elución y 2) eliminar las impurezas unidas débilmente. Por ejemplo, si la carga se realiza a pH 7, un lavado a pH 7.5 sin NaCI puede eliminar algunas impurezas unidas antes de incrementar la concentración de sales para la elución del producto. Con frecuencia se usan estrategias de lavado en lugar de una elución en gradiente a escala de proceso, ya que son fáciles de implementar. Normalmente, el tampón de lavado contiene Tris, HEPES, MOPS, fosfato, BICINA o trietanolamina, que tiene un pH entre aproximadamente 7.5 y aproximadamente 8.0, y una conductividad < 30 mS/cm cuando la carrera se efectúa en modo de catión primario y HIC secundario.

Preferentemente, la cromatografía multimodal se usa como etapa de pulido y, por tanto, sirve para purificar una toxina diftérica, en particular para reducir, disminuir o eliminar las proteínas los agregados y los fragmentos de producto de la célula huésped.

Purificado, cuando hace referencia a un componente o fracción, indica que su concentración relativa (peso del componente o fracción dividida por el peso de todos los componentes o fracciones en la mezcla) se incrementa en al menos aproximadamente un 20 %. Como se usa en el presente documento, la pureza se calcula en referencia al producto intacto, es decir, los fragmentos de toxina diftérica se consideran impurezas. En una serie de modalidades, la concentración relativa se incrementa en al menos aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 75%, aproximadamente 100%, aproximadamente 150% o aproximadamente 200%. También se puede decir que un componente o fracción está purificado cuando la concentración relativa de los componentes a partir de los cuales se purifica (peso del componente o fracción a partir de la cual se purifica dividido por el peso de todos los componentes o fracciones en la mezcla) disminuye en al menos aproximadamente 20%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 75%, aproximadamente 85%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% o 100%. En otra serie más de modalidades, el componente o fracción se purifica hasta una concentración relativa de al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 65%, aproximadamente 75%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproximadamente 99%.

En modalidades preferidas, usando los procedimientos de la invención, se elimina= 90%, > 95% o= 98% de la proteína de la célula huésped y otras impurezas y el rendimiento de la toxina diftérica, o la versión mutante de la misma, es= 30%,= 40%, más preferentemente= 50%. En ciertas modalidades, hay < 0.001%, < 0.0001%, < 0.00001% de ADN de la célula huésped.

En modalidades preferidas, una toxina diftérica, o la forma mutante de la misma, se purifica hasta una pureza de= 90%, > 95% o= 97% o= 99%, evaluado mediante SDS electroforesis.

En general, la electroforesis se lleva a cabo en condiciones desnaturalizantes y reductoras usando un gen de poliacrilamida, tal como un gel de 4 - 12%, 4 - 20%, 10%, o 12%, en un sistema de geles NuPAGE o Tris- glicina, tal como de Invitrogen (Carisbad, CA). Los geles se tiñen durante la noche con una tinción adecuada, por ejemplo tinción con proteína fluorescente Sypro Ruby o tinción Simply Blue Safe de Invitrogen y, después, se obtienen imágenes con un escáner de fluorescencia inducido con láser, tal como un aparato de obtención de imágenes Molecular Dynamics fluoroimager 595.

Los procedimientos de purificación de acuerdo con la invención tienen como resultado una pureza elevada de la toxina diftérica (es decir, sin niveles significativos de proteínas contaminantes), estabilidad de la toxina y baja heterogeneidad, sin sacrificio del rendimiento. Por tanto, los inventores han encontrado que llevando a cabo una etapa en hidroxiapatita seguida de una resina multimodal, se puede conseguir de forma reproducible una pureza de hasta aproximadamente el 98 % tras el escalado. En ciertas modalidades de la invención, la toxina diftérica purificada con los procedimientos de la invención mantiene la diana de la pureza a 2 °C y -60 °C durante al menos 6 meses o a 25 °C durante al menos 5 días o al menos 3 semanas, evaluado mediante electroforesis en gel. En ciertas modalidades de la invención, la heterogeneidad es = 1%. En ciertas modalidades de la invención, la concentración de endotoxina es <20 UEg, <10 UE/mg o <1 UE/mg evaluado usando procedimientos estándar. En ciertas modalidades de la invención, la agregación es <1%, <0.5%, <0.2% o <0.1% evaluado mediante HPSEC/UV.

Etapas adicionales La toxina diftérica recuperada obtenida tras la cromatografía en hidroxiapatita y multimodal puede estar sujeta, opcionalmente, a una o más de las siguientes: ultrafiltración, microfiltración, cromatografía en membrana de intercambio aniónico y filtración absoluta. En un aspecto de la invención, la toxina diftérica recuperada se somete a ultrafiltración, cromatografía de intercambio aniónico y filtración absoluta.

En ciertas modalidades se produce una etapa adicional de purificación y filtración tras eluir de la resina multimodal. Dicha purificación implica, preferentemente una o más etapas de cromatografía de pulido (tal como cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía en hidroxiapatita) para eliminar las proteínas, ácidos nucleicos y endotoxinas residuales de la célula huésped, así como procesar excipientes tales como el ligando multimodal expulsado. Preferentemente, la etapa de filtración implica ultrafiltración para eliminar las impurezas de bajo peso molecular y procesar excipientes y para intercambiar en el tampón de formulación del producto final. EDTA es una molécula pequeña que está incluida en el proceso de purificación. Se realiza una filtración en esterilidad para eliminar las partículas y controlar la carga biológica (según sea necesario).

Etapas opcionales adicionales La preparación de proteína eluida puede someterse a etapas adicionales de purificación o filtración antes, o después, de la etapa de cromatografía en hidroxiapatita y multimodal. Ejemplos de etapas de purificación adicionales, además de las descritas anteriormente, incluyen diálisis, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH), cromatografía multimodal adicional, precipitación en sulfato amónico, cromatografía de intercambio catiónico, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice; cromatoenfoque y filtración en gel.

En una modalidad de la invención, un proceso completo incluye recuperación y concentración de las células huésped, seguido de shock osmótico para liberar CRM197 del periplasma y la posterior floculación de residuos celulares. Después, un modo de clarificación en dos etapas (centrifugación + filtración en profundidad) elimina los residuos celulares. Después se usa cromatografía de intercambio aniónico para capturar la CRM-197 en las impurezas proteicas, los medios residuales y los componentes tampón. La eliminación adicional de endotoxinas y proteínas residuales se consigue mediante una etapa posterior de cromatografía en hidroxiapatita. Se usa ultrafiltración para concentrar el lote e intercambiar a fosfato potásico 00 mM a pH 7.2. La cromatografía de membrana de intercambio aniónico en flujo continuo se usa como etapa de pulido final y una filtración para reducción de la carga biológica completa el proceso.

A continuación se muestra un procedimiento de la invención, que usa hidroxiapatita seguida de una cromatografía multimodal.

ETAPA OBJETIVO Recolección Centrifugación Recuperación y concentración de células Shock osmótico/Floculación Liberación de CRM197 de las células y floculación de residuos celulares Clarificación Centrifugación Eliminación de residuos celulares floculados Filtración en profundidad Clarificación por pulido de residuos celulares Cromatografía de intercambio aniónico Cromatografía de captura. Etapa de reducción de endotoxina Clarificación del medio corriente arriba/componentes tampón Cromatografía de hidroxiapatita Cromatografía unión-elución para aumentar la pureza proteica y disminuir las endotoxinas, los ácidos nucleicos y otras impurezas Cromatografía Capto MMC Cromatografía de pulido para aumentar la pureza de las proteínas y disminuir los niveles de endotoxina Ultrafiltración Intercambio de tampón de formulación y reducir el volumen Cromatografía en membrana de 0.2 µ?? Aclaramiento de impurezas indeseadas Filtración final en 0.2 µG? Eliminar la carga biológica La toxina diftérica, o una versión mutante de la misma, obtenida de acuerdo con los procedimientos de la invención, se puede usar en formulaciones líquidas usando procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica.

Las modalidades específicas descritas en el presente documento se ofrecen a modo de ejemplo únicamente y la invención tiene que estar limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas junto con el alcance completo de los equivalentes a los que tienen derecho dichas reivindicaciones. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria descriptiva, se pondrán de manifiesto para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. También se pretende que dichas modificaciones entren dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS Reactivos de purificación Sulfato amónico, cloruro calcico, edentato disódico, sales de magnesio, fosfato potásico monobásico, cloruro potásico, hidróxido potásico, cloruro sódico, sacarosa, MOPS, Tris, hidróxido sódico y ácido clorhídrico, se obtuvieron en Advantor Performance Materials (Phillipsburg, NJ). Los reactivos glicerol, IPTG, polietilenimina y fosfato potásico dibásico se adquirieron en Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). Los medios para la cromatografía en hidroxiapatita se obtuvieron en Bio-Rad Laboratories Inc. (Hercules, CA). El tris clorhidrato se obtuvo en Amresco Inc. (Solón, OH). Los medios para cromatografía Capto Q, Capto-MMC™ y Capto Adhere se obtuvieron en GE Healthcare (Upsala, Suecia).

Fermentación Se preparó aproximadamente 200 I o 1300 I de caldo de fermentación de P. fluorescens en biorreactores de 250 I o 1500 I usando procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica (p. ej., como divulgan H. Jin y col., Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens, Protein Expr. Purif. (201 1), doi:10.1016/j.pep.201 1.03.002) excepto porque se escala. En general, el procedimiento de purificación del volumen de 1300 I produce ~9 I de CRM197 purificada a una concentración > 50 g/l. Esto se traduce a una recuperación del proceso de= 30% o a productividades= 0.3 g de CRM197/I de fermentación.

EJEMPLO 1 Purificación usando cromatografía en hidroxiapatita Se analizó la idoneidad de la cromatografía en hidroxiapatita. Antes de la cromatografía en hidroxiapatita se incluyó una etapa de cromatografía de intercambio aniónico estándar para incrementar la pureza de la proteína hasta > 90 % y reducir los niveles de endotoxina.

Se preparó un caldo de fermentación de 200 I como se ha descrito anteriormente.

Recuperación y recolección de células La recuperación y concentración de las células P. fluorescens se consiguió usando centrifugación continua. El lote de fermentación de 200 I se enfrió primero hasta < 8 °C en el birreactor con agitación. La cubeta de la centrífuga Westfalia se llevó a velocidad máxima con enfriamiento. Se introdujo el caldo de fermentación en la centrífuga para mantener un Q/? de aproximadamente 5 E-5 l/(min m2)). La etapa se realizó para recolectar la pasta de células para eliminar como residuo.

Se controló la temperatura a lo largo de toda la etapa de recolección para mantener la temperatura de la cubeta (< 8 °C). Después de cada descarga, la pasta celular recolectada se transfirió a un tanque.

Shock osmótico y floculación En esta etapa, la liberación de la proteína CRM197 del periplasma de P. fluorescens se consiguió mediante shock osmótico y se añadió un agente de floculación para ayudar en la clarificación. Se inició agitación para crear un mezclado enérgico a medida que se añadía tampón de resuspensión (50 % p/v de sacarosa, Tris 200 mM, EDTA 100 mM a pH 7.5) para resuspender la pasta celular recolectada. Después, las células resuspendidas se sometieron a shock osmótico añadiendo el lote resuspendido a un volumen 4X de tampón de shock osmótico (Tris 50 Mm, a pH 7.5) con agitación rápida, de modo que se libera la proteína CRM197. Con agitación reducida se añadió polietilimina (PEI) (10% p/v) como agente de floculación para alcanzar una concentración final de 0.2 % p/v de PEI.

Clarificación Centrifugación v Filtración en profundidad La eliminación del volumen de residuos celulares se efectuó mediante centrifugación y filtración en profundidad. La centrífuga se accionó de un modo similar al usado para la clarificación, no obstante se recogió el centrifugado como producto y los sólidos se desecharon como residuos usando tampón de centrifugación (Tris 10 mM, pH 7.5). De forma simultánea, el centrifugado recogido se transfirió a través de filtros de profundidad Cuno 120ZA08A para reducir la turbidez (200 l/ft2 de área de filtro).

Intercambio aniónico La etapa de captura primaria para CRMig7 de las impurezas proteicas, endotoxina, ácidos nucleicos e impurezas de fermentación se realizó con cromatografía de intercambio aniónico (AEX). La AEX se realizó a una velocidad lineal constante (284 cm/h) y a temperatura ambiente usando tampones a < 8 °C. El producto del filtro en profundidad se diluyó aproximadamente 3 veces con agua de proceso fría usando dilución en serie en el módulo de cromatografía para alcanzar una conductividad de 2.5 mS/cm en la corriente de proceso diluida. La corriente de alimentación diluida se cargó después directamente en la columna de AEX (Capto Q, GE Healthcare) que se ha equilibrado con KCI 20 mM, Tris 10 mM, KPi 0.5 mM (fosfato potásico), a pH 7.1. La columna se lavó con Tris 10 mM, KCI 20 mM, KPi 0.5 mM, a pH 7.1 hasta obtener la absorbancia basal. El producto eluyó en una etapa de KCI 110 mM usando un tapón MOPS 50 mM, KCI 110 mM, a pH 7.0. La recolección del producto comenzó a 0.5 VC después del inicio de la elución por etapas y concluyó a 11.5 VC.

Cromatografía en hidroxiapatita La cromatografía en hidroxiapatita (HA) es una etapa de pulido que aumenta la pureza proteica y reduce además los niveles de endotoxina. El proceso de HA se realizó a un caudal constante (tiempo de residencia de 10 min) y se ejecutó a temperatura ambiente, a excepción de la carga de columna que es < 8 °C. La columna de HA que se empaquetó con CHT Ceramic HA Tipo I (BioRad), resina de 40 µ??, se equilibró con KCI 110 mM, MOPS 50 mM a pH 7.0. La carga fue de aproximadamente 9 g de toxina diftérica/1. La columna se lavó como se describe en el cuadro 2.

CUADRO 2 Protocolos de lavado en cromatografía en hidroxiapatita para el Lote n° 1 v el Lote n° 2. Los volúmenes de la columna (VC) v las composiciones del tampón son como se ha descrito, en el que todos los tampones contienen MOPS 50 mM. pH 7.0.

CRM197 eluyó en la columna en un gradiente lineal de 10 VC a KCI 110 mM, KPi 30 mM, MOPS 50 mM, a pH 7.0, seguido por una retención de 5VC. El producto se recogió en 15 VC, 20 VC o hasta alcanzar el nivel basal de absorbancia.

Este ejemplo tuvo como resultado purificaciones reproducibles no limitadas a 200 I de cultivo/alimentaciones de fermentación, en las que= 90% de la proteína de la célula huésped y las impurezas de la célula huésped se eliminó y el rendimiento de la toxina diftérica del proceso fue= 50% mediante UV (Lote n° 1 : 55% y el Lote n° 2: 50%) antes de la ultrafiltración. En ciertas modalidades, la toxina diftérica se purificó hasta una pureza de= 94%, = 95% o= 98%, evaluado mediante electroforesis en gel.

Los resultados se muestran en la Figura 1. El tren de cromatografía AEX e hidroxiapatita produce material de una pureza similar o mejor en comparación con el producto producido en la cromatografía estándar y de afinidad (resina azul Mimetic de Prometic Life Sciences Inc. (Laval, Quebec). Se usó un gel 4-12% Bis-Tris NuPAGE con tampón de carrera 1X MES. La toxina diftérica a una concentración= 50 g/l mantuvo la diana de la pureza a= 25°C (estabilidad acelerada de pero caso) durante= 5 días. La toxina diftérica purificada normalmente se almacenó a -70 °C.

EJEMPLO 2 Purificación a escala comercial usando CAPTO-MMC Recuperación y recolección de células La recuperación y concentración de las células P. fluorescens se consiguió usando centrifugación continua. El lote de fermentación de 1300 I se enfrió primero hasta < 8 °C en el birreactor con agitación. La cubeta de la centrífuga Westfalia se llevó a velocidad máxima con enfriamiento. Se introdujo el caldo de fermentación en la centrífuga para mantener un Q/? de aproximadamente 1.25 E-4 l/(min m2)). La etapa se realizó para recolectar la pasta de células para eliminar el centrifugado como residuo.

Shock osmótico v floculación En esta etapa, la liberación de la proteína CRM197 del periplasma de P. fluorescens se consiguió mediante shock osmótico y se añadió un agente de floculación para ayudar en la clarificación. Se inició agitación para crear un mezclado enérgico a medida que se añadía tampón de resuspensión (50 % p/v de sacarosa, Tris 200 mM, EDTA 100 mM a pH 7.5) para resuspender la pasta celular recolectada. Después, las células resuspendidas se sometieron a shock osmótico añadiendo el lote resuspendido a un volumen 4X de tampón de shock osmótico (Tris 50 Mm, a pH 7.5) con agitación rápida, de modo que se libera la proteína CRM197.. Con agitación reducida se añadió polietilimina (PEI) (10% p/v) como agente de floculación para alcanzar una concentración final de 0.2 % p/v de PEI.

Clarificación Centrifugación y Filtración en profundidad La eliminación del volumen de residuos celulares se efectuó mediante centrifugación y filtración en profundidad. La centrífuga se accionó de un modo similar para recuperar las células para clarificación, no obstante se recogió el centrifugado como producto y los sólidos se desecharon como residuos usando tampón de centrifugación (Tris 10 mM, pH 7.5). De forma simultánea, el centrifugado recogido se transfirió a través de pilas de filtros de profundidad CUNO Z16E08AA120ZA08A de 6 x 1.84 m2 colocados en paralelo.

Cromatografía de intercambio aniónico La etapa de captura primaria para CRMig7 de las impurezas proteicas, endotoxina, ácidos nucleicos e impurezas de fermentación se realizó con cromatografía de intercambio aniónico (AEX). La AEX se realizó a una velocidad lineal constante (284 cm/h) y a temperatura ambiente usando tampones a < 8 °C. El producto del filtro en profundidad se diluyó aproximadamente 3 veces con agua para inyectables usando dilución en serie en el módulo de cromatografía para alcanzar una conductividad de 2.5 mS/cm en la corriente de proceso diluida. La corriente de alimentación diluida se cargó después directamente en la columna de AEX (Capto Q, GE Healthcare) que se ha equilibrado con KCI 20 mM, Tris 10 mM, KPi 0.5 mM a pH 7.1. La columna se lavó con Tris 10 mM, KCI 20 mM, KPi 0.5 mM, a pH 7.1 hasta obtener la absorbancia basal. El producto eluyó en una etapa de KCI 110 mM usando un tapón MOPS 50 mM, KCI 110 mM, a pH 7.0. La recolección del producto comenzó a 1 VC después del inicio de la elución por etapas y concluyó a 8 VC.

Cromatografía en hidroxiapatita La cromatografía en hidroxiapatita (HA) es una etapa de pulido que aumenta la pureza proteica y reduce además los niveles de endotoxina. El proceso de HA se realizó a un caudal constante (tiempo de residencia de 10 min) y se ejecutó a temperatura ambiente, a excepción de la carga de columna que es < 8 °C. La columna de HA que se empaquetó con CHT Ceramic HA Tipo I (BioRad), resina de 40 µ??, se equilibró con KCI 55 mM, MOPS 50 mM a pH 7.0. El producto de la AEX fría que se ha diluido de forma discontinua 2 veces con < 8o C, MOPS 50 mM a pH 7.0, se cargó en la columna. La carga fue de aproximadamente 10 g de toxina diftérica/l. La columna se cargó con tampón de equilibrado y se lavó con 8 VC de KCI 55 mM, MOPS 50 mM, fosfato potásico 3 mM, a pH 7.2. El pico principal del producto eluyó con una elución en gradiente de 8 WC a KPi 40 mM, MOPS 50 mM, KCI 55 mM, a pH 7.0. El eluato de HA se recolectó al principio del gradiente de elución. El gradiente continuó para 8 VC, seguido de 6VC de MOPS 50 mM, KCI 55 mM, KPi 40 mM a pH 7.0. La recolección del producto terminó al 10 % del pico máximo.

Cromatografía catiónica multimodal La cromatografía catiónica multimodal (Capto-MMC™, GE Healthcare) es una etapa de pulido que aumenta la pureza de las proteínas y elimina los agregados. La alimentación MMC se diluyó primero 0.25 veces con MOPS 50 mM, KCI 400 mM, KPi 25 mM a pH 7.0. El proceso de MMC se realizó a un caudal constante (equivalente a un tiempo de residencia de 10 minutos) y se ejecutó a temperatura ambiente. La columna se equilibró con MOPS 50 mM, KCI 125 mM, KPi 25 mM, EDTA 5 mM, a pH 7.1 y el producto de la HA cargado en la columna. La carga fue de aproximadamente 5 g de toxina diftérica/1. Después, la columna se lavó con 5 VC de tampón de equilibrado y se eluyó mediante un gradiente por etapas con 2.5 VC a Tris 50 mM, KCI 200 mM, EDTA 5 mM, pH 8.5, seguido de una elución en gradiente lineal a 10 VC a Tris 50 mM, KCI 500 mM, EDTA 5 mM, pH 8.5. La recolección del eluato comenzó inmediatamente tras el inicio del gradiente por etapas de pH y concluyó una vez alcanzada la resolución basal para una serie de volúmenes de la columna.

Ultrafiltración La CRM197 se concentró y se diafiltró en el tampón de formulación final mediante ultrafiltración. Se usó una membrana de celulosa regenerada NMWC de 10 kDa (Millipore, Billerica, MA) para la operación y se realizó usando caudales constantes. Todo el proceso se realizó a <8 °C. El producto MMC se concentró primero a aproximadamente 5 a 10 g de CRM197/L (en base a un volumen fijo), seguido de diafiltración de 20 diavolúmenes (DV) contra el tampón de formulación (KPi 0.1 M, pH 7.2). El producto se sobreconcentró hasta > 80 a 100 g CRM197/I, seguido de un aclarado de retención hasta una concentración diana de aproximadamente= 65 g CRM197/I para el producto de diafiltración (DFP).

Prefiltración y cromatografía en membrana La reducción de la turbidez se realizó mediante el prefiltro (membrana PES de 0.5/0.2 µ??, Millipore Corp.) y se proporcionó clarificación adicional de la endotoxina mediante cromatografía de membrana (Q membrana, Sartorius) en modo de flujo continuo. El material de ultrafiltración concentrado se dejó equilibrar a temperatura ambiente hasta realizar la prefiltración y la cromatografía en membrana. El producto concentrado se filtró a través de una cápsula de membrana PES de 0.5/0.2 pm y membranas Sartobind Q previamente desinfectadas (NaOH 0.5N) y equilibradas con tampón de formulación. Un aclarado de recuperación del tampón de formulación se pasa a través de la disposición filtro/membrana hasta una concentración final diana de aproximadamente 60 g/l para el producto de cromatografía en membrana (MCP).

Reducción de la carga biológica o filtración en esterilidad El MCP se pasó a través de una segunda cápsula de membrana PES de 0.5/0.2 µ?t? antes de la dispensación. El volumen se dispensó en condiciones asépticas y se congeló a -70 °C.

Este proceso tuvo como resultado purificaciones reproducibles no limitadas a 1 I, 15 I, 30 I, 250 I y 1300 I de cultivo/alimentaciones de fermentación, en las que= 95% de la proteína de la célula huésped y las impurezas de la célula huésped se eliminó y el rendimiento de la toxina diftérica del proceso fue = 30% mediante UV. En ciertas modalidades, la toxina diftérica se purificó hasta una pureza calculada en referencia al producto intacto de= 98%, evaluado mediante electroforesis en gel. La toxina diftérica estaba una concentración de aproximadamente= 50 g/l o= 60 g/l y se mantuvo la diana de la pureza a < 8 °C y <-60°C durante al menos= 6 meses y a= 25°C (estabilidad acelerada de pero caso) durante= 3 semanas, evaluado mediante electroforesis en gel.

El nivel medio de endotoxinas a escala de fabricación fue= 1 UE/mg medido mediante un kit de ensayo cromogénico Kinetic-QCL y agregación=0.1% mediante HPSEC (cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento analítico)/UV. No se detectó heterogeneidad o era < 1%, siendo un ejemplo los fragmentos p37 y p25 de CR 197, por tanto eliminación mediante las resinas cromatográficas.

Los resultados se muestran en el cuadro 3, la Figura 2 y la Figura 3. Los procedimientos AEX, hidroxiapatita y Capto-MMC™ produjeron toxina diftérica de mejor pureza (porcentaje de monómero intacto e impurezas de la célula huésped), homogeneidad y estabilidad en comparación con la AEX y las cromatografías de hidroxiapatita y de afinidad produjeron el producto (resina azul Mimetic de Prometic Life Sciences Inc. (Laval, Quebec). Se usó un gel 4-12% Bis-Tris NuPAGE con tampón de carrera 1X MES. Los puntos de datos y las barras de error representan la media y la desviación estándar de 3-5 duplicados.

CUADRO 3 Hidroxiapatita y Multimodal procesan características de alimentaciones de fermentación de 1300 I EJEMPLO 3 Comparación de resinas multimodales Un lote de producto de hidroxiapatita se dividió y pasó por Capto Adhere y Capto-MMC™ para ayudar a evaluar entre las dos resinas.

Las etapas del proceso para el proceso Capto Adhere se resumen en el cuadro 4. Se usó una columna de 370 mi con un tiempo de residencia de 8 minutos. La carga fue de ~8 mg de toxina diftérica/mi para este lote. Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente, con la excepción del hecho de que el producto de hidroxiapatita se enfrió antes de cargar. El tampón de equilibrado usado se escogió de modo que correspondiera con el tampón de elución en hidroxiapatita.

CUADRO 4 Etapas de procesamiento en Multimodal Capto Adhere Los resultados de pureza para los productos cromatográficos se muestran en la Figura 4. Como se ha mostrado, la pureza fue ligeramente mayor para el producto MMC con respecto al producto Adhere. Los rendimientos de la etapa de cromatografía para las dos columnas son 107 % para Capto Adhere y 56% para Capto-MMC™. Las concentraciones usadas para calcular los rendimientos se obtienen mediante Enfoque Isoeléctrico Capilar (alimentaciones multimodales) y UV (productos Adhere/MMC). La comparación deja claro que al menso para los esquemas de procesamiento usados en este lote, la elección entre MMC y Adhere se reduce al rendimiento frente a la pureza. Se usó un gel 4-12% Bis-Tris NuPAGE con tampón de carrera 1X MES.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento de purificar la toxina diftérica, o un mutante de la misma, de una mezcla que contiene la toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, que comprende: a) poner en contacto la mezcla con un primer agente de separación en condiciones tales que la toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, se une al primer agente de separación; b) eluir la toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, del primer agente de separación; c) poner en contacto el material eluido obtenido en la tapa a) con un segundo agente de separación en condiciones tales que la toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, se une al segundo agente de separación; y d) eluir dicha toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, del segundo agente de separación; en el que 1) el primer agente de separación es hidroxiapatita y el segundo agente de separación es una resina multimodal; o 2) el primer agente de separación es resina multimodal y el segundo agente de separación es hidroxiapatita; y cuando el primer agente de separación o el segundo agente de separación es hidroxiapatita, antes de eluir de la hidroxiapatita, la hidroxiapatita sufre una etapa de lavado en condiciones tales que se eliminan las impurezas.

2 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el lavado se realiza con una solución de lavado que comprende cloruro potásico o cloruro sódico de 0.01 a 1.0 M a un pH de 6.5 a 8.0.

3.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el tampón de lavado comprende además fosfato potásico o fosfato sódico de 0.1 a 20 mM.

4 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha elución de hidroxiapatita comprende a) elución por etapas con un tampón de elución, que comprende cloruro potásico o cloruro sódico > aproximadamente 30 mM o fosfato potásico o fosfato sódico aproximadamente= 15 mM; b) elución en gradiente que comprende fosfato potásico o fosfato sódico de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 mM o cloruro potásico o cloruro sódico de aproximadamente 100 mM a 2 M; o c) un cambio de pH= 0.3 unidades de pH.

5. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la mezcla o el material eluido en contacto con la resina multimodal comprende Tris, MES, MOPS, HEPES, fosfato, acetato, cloruro o sulfato.

6. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha elución de la resina multimodal comprende a) elución por etapas con un tampón de elución, que comprende cloruro potásico o cloruro sódico= aproximadamente 125 mM a pH 6.8 a 9.5; b) elución en gradiente que comprende cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, sulfato amónico, sulfato de litio, cloruro de litio o cloruro amónico de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.3 M; c) un cambio de pH= 0.5 unidades de pH dentro de un intervalo de pH de 6.5 a 9.5; o d) un cambio de temperatura= 1°C en una temperatura de 2 a 30 °C.

7. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la mezcla o el material eluido en contacto con la resina multimodal comprende EDTA o un inhibidor de la proteasa.

8. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha elución se produce en presencia de EDTA o de un inhibidor de la proteasa.

9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer agente de separación es hidroxiapatita y el segundo agente de separación es una resina multimodal.

10. - El procedimiento de conformidad con reivindicación 1 , caracterizado además porque la resina multimodal contiene ligandos que comprenden una parte cargada y una parte hidrofóbica.

11. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la parte cargada es una parte cargada negativamente.

12. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la parte cargada negativamente es un grupo carboxilato aniónico o un grupo sulfo aniónico para intercambio de cationes.

13. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha resina multimodal es Capto-MMC™.

14. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la parte cargada es una parte cargada positivamente.

15. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha resina multimodal es Capto-Adhere™.

16. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque, antes de realizar la etapa (a), la mezcla se somete a uno o más de los siguientes: centrifugación, floculación, clarificación o cromatografía de intercambio aniónico.

17.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la mezcla está sujeta a dos o tres pases en la cromatografía de intercambio aniónico.

18. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la mezcla se somete a centrifugación, floculación, clarificación y cromatografía de intercambio aniónico.

19. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha clarificación es centrifugación continua y filtración en profundidad.

20. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la mezcla se obtiene de células huésped cultivadas.

21. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque las células huésped cultivadas se han sometido a shock osmótico.

22.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dichas células de fermentación se recuperan mediante centrifugación o microfiltración.

23.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la mezcla se obtiene de un sistema de producción sin células.

24. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la toxina diftérica, o la forma mutante de la misma, se somete a una o más de las etapas siguientes (d): centrifugación, ultrafiltración, microfiltración, filtración y cromatografía en membrana de intercambio aniónico.

25. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, se somete a ultrafiltración, microfiltración, filtración y cromatografía en membrana de intercambio aniónico.

26. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la toxina diftérica mutante es CRM197.

27. - Una formulación que comprende la toxina diftérica, o una forma mutante de la misma, de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 1 y en forma líquida.

28. - La formulación de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque la pureza de la toxina diftérica, o una forma muíante de la misma, es superior al 90 % cuando se mantuvo concentración de 10 g/l o más a 2 °C durante al menos seis meses.