MX2013014083A - Anticuerpos anti-cd52 humanizados. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos humanizados contra CD52 y su uso en método para tratar o prevenir las enfermedades humanas.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CD52 HUMANIZADOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos humanizados contra CD52 humano y su uso en métodos de tratamiento o prevención de enfermedades humanas.

Antecedentes de la invención CD52 es una proteína de la superficie celular glicosilada anclada con glicosilfosfatidilinositol (GPI) que se encuentra abundantemente en una variedad de células linfoides normales y malignas especialmente las células B y T (Gilleece et al., Blood 82 807-812 (1993); Hale et al, J Biol Regul Homeost Agents, 15 P386-391 (2001); Rodig et al, Clin Cáncer Res 12, p7174-7179 (2006)). CD52 se expresa a niveles más bajos en las células mieloides tales como monocitos, macrófagos y células dendríticas (DC) con poca expresión encontrada en las células asesinas maduras naturales (NK), neutrófilos, y células madre hematológ ¡cas. CD52 también es producido por las células epiteliales en el epidídimo y conducto deferente, y se adquiere por el esperma durante el paso a través del tracto genital (Hale et al, ibid; Domagala et al, Med. Sci. Monit 7 P325-331 (2001 )). La función biológica exacta de CD52 sigue siendo poco clara, pero alguna evidencia sugiere que puede estar implicada en la migración y co-estimulación de células T (Masuyama et al, J. Exp. Med. 189 979-989 (1999); Watanabe et al, Clin Immunol 120 247 - 259 (2006)).

Campath-1H (alemtuzumab, Campath®, MabCampath ) es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD52 humano que exhibe potente citotoxicidad in vitro mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). CD52 está presente en al menos el 95% de todos los linfocitos de sangre periférica humana y monocitos/macrófagos (Hale, G. et al, The CAMPATH- antigen (CD52) Tissue Antigens 1990,35:.. 118-127). Campath-1H reconoce un epítopo que consiste en los terminales de cuatro aminoácidos carboxi de la proteína madura CD52 y una parte del anclaje GPI cargado negativamente. Debido a sus efectos citotóxicos significativos, Campath-1H es capaz de agotar las células CD52 positivas in vivo y es aprobado para la línea de frente y tercera línea de tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (CLL). Campath-1H ha sido evaluado para su utilidad en el tratamiento de varias enfermedades autoinmunitarias, como artritis reumatoide, vasculitis, miositis, enfermedad de Wegener y la diabetes. Los estudios más avanzados de Campath-1H son en el tratamiento de esclerosis múltiple remitente recidivante (MS). Estos estudios mostraron una mejora significativa en el tiempo de recaída en comparación con el interferón humano beta-1a (Rebif® (es decir, interferón beta-1a)).

Una limitación importante de Campath-1H es la inmunogenicidad mediante el cual los anticuerpos son inducidos en hasta el 70% de los pacientes (Therapeutics Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, ed Zhiqiang Un (2009) ISBN: 978-0-470-11791-0). Con el fin de mejorar la utilidad clínica de los anticuerpos anti-CD52, hay una gran necesidad de mejorar los anticuerpos anti-CD52 que no están asociados con la inmunogenicidad significativa en los pacientes.

Breve Descripción de la Invención La invención se refiere a inmunoglobulinas humanizadas que tienen especificidad de unión para CD52 humano (huCD52). La invención también proporciona anticuerpos humanizados que se unen a CD52 humano con una constante de disociación en equilibrio (Kd) de al menos 10"8 M. La invención también proporciona anticuerpos humanizados que se unen específicamente a CD52 humanos que tienen una cadena pesada de anticuerpos de cualquiera de lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4, o el uso de una región constante de IgG mutada especialmente una región constante que mejora la ADCC (citotoxicidad dependiente de anticuerpos celular) o la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). La invención también proporciona anticuerpos humanizados en los que la cadena ligera del anticuerpo es una cadena ligera kappa. El anticuerpo humanizado puede ser codificado por la cadena pesada de IgG humana y los ácidos nucleicos de cadena ligera kappa humanos que codifican las secuencias de proteínas en sus regiones variables tal como se expone en la SEQ ID NO. 20 a SEQ ID NO. 28.

La presente invención también proporciona anticuerpos humanizados que se unen específicamente a CD52 humano mediante el cual las regiones variables de anticuerpos se han seleccionado o modificado para excluir uno o más epítopos de células humanas CD4 + T. La presente invención también proporciona anticuerpos humanizados que se unen específicamente a CD52 humano mediante el cual las regiones variables de anticuerpos se han formado principalmente por segmentos de fusión de secuencias totalmente derivadas de secuencias de región variable de anticuerpos humanos existentes.

La presente invención también proporciona, anticuerpos anti-CD52 humanizados de la invención que comprende las secuencias de aminoácidos cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3, "RYGMS" (SEQ ID NO. 5), "MMKTKGGRTYYPDSVKG" (SEQ ID NO. 6) y "DGYY "(SEQ ID NO. 7), respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3, "KSSQSLLHSDGKTYLN" (SEQ ID NO. 8), "LVSKLDS "(SEQ ID NO. 9), y "WQGTHLWT" (SEQ ID NO. 10), respectivamente. La presente invención también proporciona anticuerpos anti-CD52 humanizados, de la invención que comprenden secuencias de aminoácidos de cadena pesada de región variable correspondientes a las SEQ ID NOS: 20 a 24 para la cadena pesada y SEQ ID NOS: de 25 a 28 para la cadena ligera. En una modalidad preferida de la invención, un anticuerpo anti-CD52 humanizado de la presente invención que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de región variable correspondientes a SEQ ID NO. 22 para la cadena pesada y SEQ ID NO. 28 se proporciona.

Los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden estar compuestos de cualquiera de las anteriores secuencias de CDR de la SEQ ID NO. 5 a la SEQ ID NO. 10 y variantes menores de estas secuencias de CDR, donde las alteraciones de uno o más aminoácidos no reduce significativamente el enlace a CD52 humano. Los anticuerpos humanizados pueden ser creados mediante el enlace de las secuencias de CDR con secuencias de marcos de la región variable humana, donde tales secuencias estructurales se derivan de otras secuencias de marco de región variable de anticuerpos humanos individuales o múltiples. Comúnmente tales secuencias de marco de región variable humanas incluirán una o más mutaciones que contribuyen al enlace óptimo o mejorado de los anticuerpos humanizados a CD52. En una modalidad preferida de la presente invención, dichas secuencias de marco de región variable humanas en los anticuerpos humanizados se derivan enteramente a partir de secuencias de otras regiones variables de anticuerpos humanos tal como se describe en EP1844074. Estas secuencias comprenden segmentos unidos de secuencias de otras regiones variables de anticuerpos humanos, junto con regiones constantes humanas. En particular, tales anticuerpos humanizados también contienen secuencias de CDR totalmente derivadas de secuencias de CDR en otras regiones variables de anticuerpos humanos, incluyendo segmentos unidos de secuencias de CDR de otros CDR humanos junto con regiones constantes humanas, creando de este modo anticuerpos humanizados en los que las secuencias de región variable se derivan enteramente a partir de secuencias de otras regiones variables de anticuerpos humanos junto con regiones constantes humanas, creando así un anticuerpo "completamente humano".

La invención también proporciona anticuerpos humanizados que se unen específicamente al CD52 humano, en el que dicho anticuerpo humanizado es producido por una célula procariota o eucariota, especialmente a partir de una línea celular de mamíferos, especialmente células CHO o NSO. La invención también proporciona un anticuerpo humanizado que se enlaza específicamente a CD52 humano que es un fragmento Fab o un Fv de cadena sencilla (scFv). La invención también proporciona proteínas multiespecíficas incluyendo al menos un anticuerpo humanizado a partir de las secuencias SEQ ID NOS: 20 a 24 para la cadena pesada y SEQ ID NOS: 25 a 28 para la cadena ligera mediante el cual la proteína multiespecífica se enlaza específicamente a CD52 humano y, adicionalmente, se enlaza o interactúa con uno o más moléculas adicionales. Diferentes anticuerpos o proteínas pueden ser incluidos en cada uno de anticuerpos m ultiespecíficos que pueden estar enlazados entre sí de forma covalente o no covalente.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado (ya sea como un anticuerpo proteínico o un gen que codifica al anticuerpo) que se enlaza específicamente a CD52 humano y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además uno o más agentes quimioterapéuticos ya sea enlazado o no enlazado al anticuerpo humanizado.

La invención proporciona un método para el tratamiento de la CLL y otras leucemias; varias enfermedades autoinmunitarias como la esclerosis múltiple, la artritis reumatoide, vasculitis, miositis, enfermedad de Wegener y la diabetes, y rechazo de órganos trasplantados y la enfermedad de injerto contra huésped, en cada caso, que comprende administrar al paciente una dosificación eficaz de un anticuerpo humanizado (ya sea como un anticuerpo proteínico o un gen que codifica el anticuerpo) que se enlaza específicamente al CD52 humano, en el que el anticuerpo causa la destrucción o la apoptosis de las células objetivo CD52+ tales como las células B y T. Además, la invención también proporciona un método para el diagnóstico de las enfermedades mencionadas anteriormente, por ejemplo, mediante la administración de anticuerpo humanizado unido a un marcador detectable y determinación del enlace del anticuerpo humanizado in vivo para proporcionar una base para la detección de células CD52 + , por ejemplo, en masas tumorales localizadas o en las lesiones inflamatorias. Alternativamente, los anticuerpos humanizados de la presente invención se pueden usar para ensayos in vitro para las células CD52+ como un medio para la detección de la enfermedad y también para las pruebas in vitro para anticuerpos que pueden ligarse a los anticuerpos humanizados se utilizan terapéuticamente. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados de la invención se puede usar como agentes de diagnóstico o terapéuticos in vivo e in vitro .

Los anticuerpos humanizados de la invención pueden englobar varios isotipos de anticuerpo, o mezclas de los mismos, tales como lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgAl, lgA2, IgAsec, IgD, IgE o formas mutadas de estos IgG tales como mutaciones que mejoran el enlace a receptores de Fe (por ejemplo, Horton et al., Blood 116 (2010) P3004-3012) o como complemento (por ejemplo, Natsume et al., Cáncer Res. 68 (2008) p3863-3872). Típicamente anticuerpos humanizados incluyen regiones constantes de cadena pesada IgGI y regiones constantes de la cadena ligera ?. Los anticuerpos humanizados pueden ser de longitud completa (por ejemplo, anticuerpo lgG / ) o pueden incluir sólo una porción de enlace a antígeno (por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento scFv).

Algunos anticuerpos anti-CD52 humanizados de la presente invención se pueden caracterizar por una o más de las siguientes propiedades: a) especificidad para el CD52 humano (que se enlaza específicamente a CD52 humano), b) una afinidad de unión a CD52 humano con una constante de equilibrio de disociación (Kd) de al menos 10~8 M.

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos humanizados, o porciones de unión a antígeno, de la invención. En consecuencia, los vectores de expresión recombinantes que incluyen los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de la invención, y células huésped transfectadas con tales vectores, también están englobados por la invención, como también los métodos de producción de los anticuerpos de la invención mediante el cultivo de estas células huésped.

Los anticuerpos monoclonales humanizados CD52 antihumanos de la invención, o sus porciones de enlace a antígenos (por ejemplo, Fab), pueden ser derivatizados o unidos a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab'). Por ejemplo, un anticuerpo o porción de enlace a antígeno de los anticuerpos humanizados de la invención puede ser unido funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más de otras entidades moleculares. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD52 humanizado, o su fragmento de enlace a antígeno del mismo, pueden conjugarse con un grupo funcional terapéutico, por ejemplo, un fármaco citotóxico, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento de la misma, un radioisótopo, un ácido nucleico terapéutico, o un medicamento contra el cáncer de molécula pequeña. Los anticuerpos de la invención también pueden conjugarse con productos farmacéuticos citotóxicos, por ejemplo, radiomarcadores con agentes citotóxicos, tales como, por ejemplo, 1311, o puede ser acoplado a una proteína que inactiva al ribosoma, por ejemplo, exotoxina A de Pseudomonas (fragmento PE38, toxinas vegetales o bacterianas tales como ricina, la cadena ? de la ricina, saporina, proteína antiviral de fitolaca, toxina de la difteria, o exotoxina A de Pseudomonas (Kreitman y Pastan (1998) Adv. Drug Delivery Rev. 31:53.).

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas y de diagnóstico, que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un anticuerpo humanizado monoclonal de la invención, o una porción de enlace a antígeno del mismo, que se enlaza específicamente a CD52 humano. Algunas composiciones también pueden comprender una combinación de los anticuerpos humanizados o porciones de unión a antígeno de la invención. Tales composiciones también pueden comprender combinaciones con una o más otras moléculas biológicamente activas como moléculas separadas, por ejemplo, una combinación de al menos un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención y otra molécula biológicamente activa, o puede combinar combinaciones con uno o más otras moléculas biológicamente activas en la misma molécula, por ejemplo como una molécula biespecífica o multiespecífica, ya sea como una combinación de dos o más anticuerpos humanizados de la invención o como una combinación con uno o más moléculas biológicamente activas diferentes.

Para los métodos in vivo, los anticuerpos humanizados, o porciones de unión a antígeno de los mismos (o una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención) se pueden administrar a un sujeto humano que sufra de una enfermedad relacionada con CD52+ en las células, o a una enfermedad que puede mejorarse o prevenirse mediante tratamiento con los anticuerpos humanizados de la invención.

Composiciones de anticuerpos monoclonales humanizadas de la invención también se pueden administrar en combinación con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anti-cáncer, una terapia para una enfermedad , autoinmune como la artritis reumatoide, o una terapia para la esclerosis múltiple. En consecuencia, la invención proporciona un método para tratar el cáncer o enfermedades inflamatorias en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de un anticuerpo humanizado, junto con un vehículo farmacéutico al sujeto.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método que utiliza anticuerpos de la invención para detectar in vitro o in vivo la presencia de antígeno CD52 humano en una muestra, por ejemplo, para el diagnóstico de una enfermedad relacionada con el CD52 humano. En algunos procedimientos, esto se consigue poniendo en contacto una muestra a ensayar, junto con una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humanizado de la invención, o una porción de enlace a antígeno del mismo (o una molécula biespecífica o multiespecífica), en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y el CD52 humano. La formación de complejos se detecta a continuación (por ejemplo, usando un ELISA) en las muestras de ensayo, y cualquier aumento estadísticamente significativo en la formación de complejos entre las muestras de ensayo y de control es indicativo de la presencia de antígeno CD52 humano en la muestra de ensayo.

Los expertos en la técnica entenderán que los anticuerpos humanizados de la presente invención tendrán usos adicionales o composiciones más allá de los descritos en este documento, en todos los casos en los que el anticuerpo humanizado se enlaza al antígeno CD52 humano por el cual dichos usos y composiciones se considerarán estar dentro del alcance de la invención. Los expertos en la técnica entenderán que las secuencias de región variable de los anticuerpos humanizados de la presente invención (SEQ ID NO. 20 a través de la SEQ ID NO. 28) o CDR de los anticuerpos humanizados de la presente invención (SEQ ID NO. 5 a través SEQ ID NO. 10) puede estar sujeta a variaciones que no alteran significativamente las propiedades de los anticuerpos humanizados de la presente invención en la que dichas variantes se consideran dentro del alcance de la invención. Además, tales variaciones ya sea dentro de la región variable o secuencias CDR de los anticuerpos humanizados se deben considerar dentro del alcance de la presente invención en los que tales variaciones tienen una homología significativa con las secuencias humanizadas de la presente invención. Por ejemplo, un ácido nucleico variante puede determinarse dentro del alcance de la invención esto incluye secuencias que contienen o sustancialmente idénticas a SEQ ID NO. 11 a SEQ ID NO. 19 como se determina por su capacidad para hibridarse en condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la presente invención. En una modalidad, una secuencia de ácido nucleico puede considerarse dentro del alcance de la invención (por ejemplo, es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO. 11 a SEQ ID NO. 19) por su capacidad para hibridarse en condiciones rigurosas a un ácido nucleico dentro del alcance de la invención (tales como SEQ ID NO. 11 a SEQ ID NO. 19). El término "híbrida" se refiere al enlace, formación de dúplex o hibridación de una molécula a una secuencia de nucleótidos particular en condiciones de hibridación rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, celular total o biblioteca de ADN o ARN), en el que la secuencia de nucleótidos particular se detecta en al menos aproximadamente 10 veces el fondo. Se seleccionarán condiciones de hibridación rigurosas, por ejemplo, 5-10°C más baja que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica. También se entenderá que los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden ser modificados en las regiones constantes de cadena pesada con el fin de mejorar ADCC y CDC. Para mejorar ADCC, formas agotadas de fucosa de los anticuerpos humanizados pueden ser producidas por la expresión de los anticuerpos en ciertas células de mamífero incluyendo una variante de línea CHO, Lecl3 una línea celular de hibridoma de rata (Shields et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) p26733-26740) , 220 YB2/0 (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) p3466-3473), y un FUT8 (a-1 ,6-fucosiltransferasa) línea celular CHO de bloqueo (Yamane-Ohnuki et al, Biotech nology Bioeng 87 (2004) ?614-622.)· Alternativamente, las mutaciones en las regiones constantes de cadena pesada pueden usarse para mejorar la ADCC tal como se describe por Schields et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) p6591-6604 y Lazar et al,. Proc Nati Acad Sci U.S. A. 2006; 103 (2006) p4005-4010. Alternativamente 225 mutaciones en las regiones constantes de cadena pesada pueden usarse para mejorar los CDC, por ejemplo, usando anticuerpos de lgG1/isotipo lgG3 humano mixtos (Natsume et al., Ibid).

Los expertos en la técnica entenderán, de lo anterior en otro lugar sobre todo a partir de estudios clínicos con Campath-IH (Zhiqiang Un, ibid), que los anticuerpos que se enlazan a antígeno CD52 humano son fundamentalmente ¡nmunogénicos en los pacientes, probablemente debido a la citotoxicidad inherente de los anticuerpos anti-CD52 que actúa como señal co-estimuladora de epítopos de células CD4 + T de los anticuerpos, lo que resulta en la respuestas y la inmugenicidad de las células auxiliares CD4+ T. Por lo tanto, será entendido por los expertos en la técnica que los anticuerpos de la presente invención son sorprendentemente carentes de respuestas de células auxiliares CD4 + T como se determinan por los estudios in vitro con sangre humana (véase ejemplo 9), y que tales anticuerpos anti-CD52 con bajas respuestas de células CD4 +T (<= 4% de respuestas de células T en ensayos de células T humanas) no son nuevos.

Breve descripción de los dibujos Dentro de las leyendas de las figuras, la nomenclatura 2E8 o ANT01 se utiliza indistintamente para anticuerpos de ratón quiméricos o humanizados se derivan del anticuerpo monoclonal de ratón 2E8.

La figura 1 muestra los vectores plasmídicos usados para la expresión de anticuerpos quiméricos y humanizados en células de mamífero que comprenden pANT17 para las cadenas pesadas y pANT13para cadenas ligeras.

La figura 2 muestra un análisis de citometría de flujo del enlace del anticuerpo monoclonal de ratón 2E8 a células NSO transfectadas con CD52 humano en comparación con el enlace a CD52-NS0. La tinción fue con anticuerpo anti-ratón conjugado con IgG-PE con señal derivada de PE en el eje Y.

La figura 3 muestra un análisis de cítometría de flujo del enlace de diluciones de células 2E8 quiméricas a Hut78 en comparación con Campath-1H. La tinción fue con el anticuerpo anti-humano conjugado con IgG-PE.

La figura 4 muestra un análisis de citometría de flujo de la competencia usando Campath-1 H-PE en la competencia con 255 2E8 quiméricos y Campath-1H para el enlace a las células HUT78.

La figura 5 muestra la citotoxicidad media de 5 muestras de PBMC humanas utilizado-s como células efectoras en un ensayo de ADCC para 2E8 quiméricos y Campath-1H con células objetivo REH.

La figura 6 - como la figura 5, excepto para 2 PBMC individuales con diluciones de 2E8 quimérico y Campath-1 H con células objetivo que expresan altos REH.

La figura 7 - que la figura 6 excepto que se utilizó el complemento humano para los ensayos de CDC con diluciones de 2E8 quiméricos y Campath-1H y células objetivo que expresan altos REH.

La figura 8 muestra una ELISA de péptido CD52 de competencia ELISA para el enlace de variantes 2E8 humanizados en competencia con 2E8 quiméricos biotinilados.

La figura 9 muestra un análisis de citometría de flujo para el enlace de diluciones de variantes humanizadas y Campath-1H a las células REH.

La figura 10 muestra la cite-toxicidad media de 4 muestras de PBMC humanas utilizadas como células efectoras en un ensayo de ADCC para las variantes 2E8 humanizadas y Campath-1H con células objetivo REH.

La figura 11 muestra los CDC para las variantes 2E8 humanizadas y Campath-1H con altos CD52 que expresan las células objetivo REH y complemento humano.

La figura 12 muestra un análisis de citometría de flujo de la competencia usando Campath-1 H-PE en competencia con 2E8 quimérico, Campath-1H y variantes seleccionadas para el enlace a las células REH.

La figura 13 muestra los efectos citotóxicos directos de anticuerpos anti-CD52 humanos en células REH, medidos por la apoptosis y la necrosis.

La figura 14 muestra la gráfica de Kaplan-Meier para los ratones SCID trasplantados con células de linfoma de Burkitt Raji humanos después del tratamiento con Campath-IH y la variante principal de 2E8 humanizada VH3/VK4 (región V SEQ ID NOS. 22 y 28).

Descripción Detallada de la Invención EJEMPLOS Lo reactivos disponibles comercialmente mencionados en los ejemplos se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los ejemplos y en toda la memoria por los números de acceso ECACC es la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury, Inglaterra. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado conocido por alguien experto en la técnica a la que pertenece esta invención. A continuación se describen métodos y materiales ejemplares, aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí también se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención. Los materiales, métodos, y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes en su alcance. EJEMPLO 1: GENERACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE RATÓN El péptido CD52 (GQNDTSQTSSPSC) fue sintetizado de la manera habitual y conjugado con KLH o BSA a través de un ligante maleimidocaproil-N-hidroxisuccinimida (Mimotopes, Wirral, Cheshire Reino Unido), dejando libre el péptido N-terminal. Las células Raji y HUT78 se obtuvieron de ECACC. Líneas de células NSO que expresan CD52 se generaron de la siguiente manera: el ADN que codifica CD52 humano (NCBI Secuencia de Referencia: NM_001803.2) (secuencia de longitud completa, incluyendo el péptido señal terminal N, péptido de señal de anclaje GPI terminal C despalzado y el péptido superficie anclado con GPI maduro) se amplificó por PCR y se subclonó en los vectores de expresión de anticuerpos pANT (figura la) a través de sitios B g 111 y Eagl. La transcripción del gen CD52 estaba bajo el control del promotor de CMV l/E (US5168062 y US5385839, Universidad de lowa). El plásmido de expresión pANT contenía un minigen mutante DHFR (Simonsen y LeviNSOn, 1983, PNAS 80:2495-2499) bajo el control de un promotor de SV40 y la secuencia poliA para la selección en células eucariotas, así como un gen de ß-lactamasa (ApR) para la selección y un origen procariótico PMBL de la replicación para la propagación en células procariotas. El plásmido de expresión se propagó en E. coli XLL-blue (Stratagene Cat. No. 200130). Líneas celulares estables que expresan CD52 se obtuvieron por transfección de 315 células NS0 por electroporación y la colocación de las células bajo selección con 200 nM metotrexato. Las células se hicieron crecer y se expandieron a continuación, probado por citometría de flujo para expresión de CD52. Las líneas celulares que expresan CD52 de forma elevada se congelaron y se utilizaron para inmunizar ratones como se describe a continuación.

Ratones Balb/c hembra fueron inmunizados primeramente mediante inyección intraperoneal (i.p.) o bien de 50ug de conjugado de péptido CD52-KLH en adyuvante completo de Freund (CFA), o se inmunizaron primeramente con 1x 10e clúlas RAJI que expresan CD52 en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Después de cuatro semanas, los ratones fueron reforzados por la inyección intraperitoneal de 1 O6 células HUT-78 en PBS con una inyección de refuerzo adicional dos semanas después. Cuatro semanas más tarde, todos los ratones recibieron un tercer refuerzo de 3 x 106 células de NSO que expresan CD52 en PBS ip en dos intervalos sucesivos de 107 células NSO que expresan CD52 en PBS fueron inyectadas ip a intervalos de dos semanas y algunos ratones recibieron un refuerzo adicional de 5 ug de péptido CD52-KLH.

Tres días antes de la fusión del mieloma, los dos ratones que mostraron la concentración más alta de anticuerpos se les dio 330 un refuerzo ip de 107 células NSO que expresan CD52 en PBS. En el día de la fusión, los dos ratones se sacrificaron, se les extrajeron los bazos, y se combinaron las células de cada bazo entero, se lavaron en medio de cultivo libre de suero y se dividieron en dos muestras iguales. La mitad de las células del bazo se fusionaron con células de mieloma FO y la mitad se fusionó a células de mieloma P3X63Ag8U.I por fusión mediada por PEG. Las placas 1-4 contenían las células y las placas 5-8 contenían las células fusionadas P3X63Ag8U.I FO. 335 El medio de fusión completo consistía en DMEM, 2% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina, 10% de suero fetal bovino, 5% de medio de la clonación de hibridoma BriClone (National Institute for Cellular Biotechnology, Dublín, Irlanda) y hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). Las fusiones resultantes se sembraron en placas de 96 pocilios a 200 ul por pocilio. Las células fusionadas no sembradas restantes fueron estabilizadas en cultivo durante hasta tres días, luego congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido. Las células de fusión sembradas se cultivaron a 37°C en 5% C02 durante dos semanas, se transfirieron a placas de 96 pocilios, y se ensayaron para la presencia de anticuerpos anti-CD52 secretados utilizando ELISA de péptido CD52 -KLH, tal como se describe a continuación. Las células de 24 pocilios se expandieron en cultivo inmunopositivo y el anticuerpo CD52 específico de péptido CD52 ELISA, NS0-CD52 ELISA basado en células y citometría de flujo.

Para ELISA con el péptido CD52, placas de ELISA (VWR, Lutterworth, Reino Unido) se recubrieron durante la noche a 4°C con 1 OOul/pocillo de péptido CD52-KLH, péptido CD52-BSA, KLH o BSA sólo a 0.5 pg/ml en PBS. Las placas se lavaron y se bloquearon con PBS que contenía 150ul/pocillo de BSA al 2%. La nata del cultivo celular o los anticuerpos purificados se diluyeron en PBS/2% de BSA y se agregaron 100ul a cada placa seguido de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween (0.05%) y se incubaron durante 1 hora con 10Oul/pocillo de Ig anti-ratón de cabra (específico de Fab) conjugado con peroxidasa de rábano (Sigma-Aldrich). Las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween después de lo cual se agregó el sustrato SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad para permitir que se desarrollara el color. La reacción fue detenida por la adición de 50 µ? de 3M HCI. Las placas se leyeron a 490 nm utilizando un lector de placas de Dynex (Dynex, Worthing, Reino Unido). Los hibridomas específicos del péptido CD52 fueron aquellos que se enlazaron al péptido CD52-KLH y péptido CD52-BSA pero no ya sea a KLH sólo o BSA sólo.

Para el ELISA basado en células NS0-CD52, 3xl05 células/pocilio (NSO tipo nativo o células NSO que expresan CD52) se sembraron en una placa de 96 pocilios de fondo en V- La placa se centrifugó, se eliminaron los sobrenadantes y la placa se transfirió sobre un papel absorbente. Muestras de hibridoma se diluyeron a 1 en 2 en tampón FACS (D-PBS que contenía 1% de BSA y 0.05% de azida de sodio) y 100µ? se transfirieron a cada una de dos placas que contienen ya sea células NSO (placa 1) o células NS0-CD52 (placa 2). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, las placas se lavaron dos veces por centrifugación de las placas y se resuspendieron las células en tampón FACS 200µ? entre centrifugación. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en tampón FACS que contenía 00 µ I de IgG anti ratón (específico de Fab) (Sigma) diluido 1:500. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron dos veces por centrifugación y las células se resuspendieron en PBS. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en 50 µ? PBS y se transfirieron a una placa para ELISA. Se agregaron 100 µ I de sustrato TMB (Invitrogen) y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad para permitir que el color se desarrollará. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µ? de HCI 3M. Las placas se leyeron a 450 nm utilizando un lector de placa Dynex. Clones específicos a CD52 fueron los que enlazaron a las células NS0-CD52 específicamente en comparación con las células NS0 de tipo nativo.

Para la citometría de flujo, 3x105 células NS0-CD52 o NS0 de tipo nativo fueron teñidas utilizando una dilución 1 en 2 de anticuerpos de hibridoma anti-CD52 junto con una dilución 1 en 100 de anticuerpos conjugado IgG-PE anti-ratón (Sigma). IgG de ratón (Sigma) también se incluyó como un control separado para los diferentes isotipos murinos presentes dentro de los hibridomas. Las células se tiñeron durante 1 hora a 4°C. También se incluyó un control de solo anticuerpo conjugado IgG-PE anti-ratón. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y finalmente se resuspendieron en tampón FACS y se realizó citometría de flujo utilizando un Becton DickiNSOn FACSCalibur (Becton DickiNSOn, Oxford, Reino Unido). Los ajustes del instrumento se determinaron mediante análisis de anticuerpos de control de isotipo pertinentes.

A partir de los resultados de ELISA para péptido CD52, ELISA basado en células NS0-CD52 y citometría de flujo, se clonaron los hibridomas huCD52 específicos, se expandieron en cultivo, se congelaron como caldos parentales y se almacenaron en nitrógeno líquido. Cada uno de los hibridomas seleccionados se diluyó en medio de clonación y se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad celular de una célula por tres pocilios. El medio de clonación consistía en DMEM, 2% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina, 10% de suero bovino fetal, 5% medio de clonación de hibridoma BriClone e hipoxantina-timidina (HT). Los cultivos se mantuvieron a 37°C en 5% C02 durante 2 semanas, las células clonadas recibieron medio fresco después de una semana en cultivo. Dos semanas después de la clonación, los sobrenadantes de todos los pocilios inoculados se transfirieron a nuevas placas de 96 pocilios y se ensayaron para la presencia de anticuerpos anti-CD52 utilizando ELISA de péptido CD52 y citometría de flujo como se describe anteriormente. Los pocilios positivos se expandieron en el cultivo y se ensayaron. Las células positivas se expandieron aún más y se ensayaron en cuanto isotipo de anticuerpo. Subclones positivos anti-CD52 se congelaron, se almacenaron en nitrógeno líquido y se utilizan para la producción de anticuerpo monoclonal para estudios posteriores.

Los anticuerpos monoclonales se isotipificaron usando el kit Rapid ELISA Mouse Antibody Isotyping (Perbio, Cramlington, Reino Unido). Los anticuerpos se purificaron en una columna de 1 mi de Proteína A-Sefarosa (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Antes de la purificación, tanto la tubería como la columna de Proteína A fueron despirogenadas usando NaOH 0.4 M. La columna fue re-equilibrada con 20 volúmenes de columna de PBS, pH 7.4. Los sobrenadantes de cultivo de células se recolectaron, se ajustó a 1x PBS pH 7.4 usando 10x PBS y se esterilizó por filtración. El sobrenadante filtrado se bombeó a través de la columna de proteína A-Sefarosa a 0.5 ml/min. La columna se lavó con PBS de pH 7.-4 1x y IgG se eluyó usando citrato de sodio 0.1M estéril pH 3, con 0.9 mi de las fracciones recolectadas y se neutralizó con 0.1 mi de Tris-HCM M estéril, pH 9. En condiciones estériles, el producto fue intercambiado de tampón en PBS, pH 7.4 para eliminar cualquier tampón de elución y concentrar la muestra. Después de la concentración, los anticuerpos se cuantificaron por OD280nm usando un coeficiente de extinción, Ec (0.1%) de 1.4. Los anticuerpos purificados se analizaron por SDS-PAGE usando un sistema de electroforesis NuPAGE Novex con de gel NuPage (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) y tampón MES. 1 mg de anticuerpo se preparó con tampón de muestra 4xNuPAGE más beta-mercaptoetanol y se calentó. El gel se tiñó con solución de tinción InstantBIue (Expedeon, Cambridge, Reino Unido) y el tamaño molecular se estimó comparando bandas teñidas con PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas, York, Reino Unido). Se identificaron dos bandas para cada anticuerpo sin contaminación detectable presente. Los anticuerpos purificados fueron probados usando la citometría de flujo de péptido CD52 como se describe anteriormente. A partir del análisis de citometría de flujo (figura 2), se muestra que el anticuerpo monoclonal principal designado 2E8 se liga selectivamente a las células NSO-CD52.

EJEMPLO 2 - SECUENCIACIÓN DE GENES DE REGIÓN VARIABLE El ARN total se extrajo a partir de células de hibridoma 2E8 utilizando el Kit de RNAq ueous-4PCR (Ambion, Warrington, Reino Unido) y se utilizan para la síntesis de ADNc. Fragmentos de región variable (V) de cadena pesada de inmunoglobulina de murina pesada y de cadena ligera kappa fueron amplificados por PCR usando cebadores de secuencia líder de ratón degenerados (Sigma) y cebadores de dominio constante únicos (Sigma) como se muestra en la Tabla 1. Los fragmentos resultantes de la PCR se subclonaron en el sistema de vector que pGEM-T Easy l(Promega, Southampton , Reino Unido) y los insertos se secuenciaron utilizando el cebador específico de vector, M 13Forward (Sigma). Toda la secuenciación del ADN se realizó por Geneservice Ltd, Cambridge, Reino Unido). Las secuencias de nucleótidos de la región V resultantes se muestran como SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2 y las secuencias de aminoácidos correspondientes como SEQ ID NO. 3 y SEQ NO: 4 para las regiones V de cadena pesada y ligera, respectivamente.

Tabla Las secuencias de las regiones hipervariables 2E8 (CDR) fueron las siguientes: SEQ ID NO. 5 CDRHI RYGMS SEQ ID NO. 6 CDRH2 MMKTKGGRTYYPDSVKG SEQ ID NO. 7 CDRH3 EFW SEQ ID NO. 8 CDRL1 KSSQSLLHSDGKTYLN SEQ ID NO. 9 CDRL2 LVSKLDS SEQ ID NO. 10 CDRL3 WQGTHLWT EJEMPLO 3 · ¦ GENERACIÓN DE ANTICUERPO QUIMÉRICO Las secuencias de la región V de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal 2E8 se amplificaron por PCR y se subclonaron en vectores de expresión de anticuerpos (figura 1b) con regiones V de cadena ligera y pesada clonadas en pANT17 y pANT13 respectivamente. Los genes de la región V de la cadena pesada fueron clonados en pANT17 a través de sitios Mlul y Hindlll en el marco con el gen de la cadena pesada humana ?1 (alotipo G1m3 (G1m(f))) y los genes de cadena ligera V de la región fueron clonados en pANT13 a través de sitios BssHIl y BamHI en el marco con el gen de región constante de cadena ligera kappa humana (alotipo Km3). La transcripción de los genes tanto de cadena pesada como ligera fue bajo el control del promotor de CMV l/E (US5168062 y US.5385839, Universidad de lowa) y el plásmido pANT17 contenía un minigen muíante DHFR (Simonsen y LeviNSOn, 1983, PNAS 80:2495-2499) bajo el control de un promotor de SV40 y la secuencia poliA para la selección en células eucariotas. Tanto pANT17 y pANT13 contenían un gen de ß-lactamasa (ApR) para la selección procariótica y un origen pMB1 de la replicación para la propagación en células procariotas. Todos los plásmidos se propagaron en E. coli XL1-Blue (Stratagene cat. No. 200130). Los cebadores utilizados para amplificar los genes de región variable para la clonación en los vectores de expresión pANT se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera fueron co-transfectados ya sea transitoriamente en células HEK293 mediante transfección con fosfato a base de calcio o transfectadas de forma estable en células NSO por electroporación . El anticuerpo secretado se purificó a partir de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de Proteína A. Como se muestra en la figura 3 mediante análisis de citometría de flujo como se detalla en el ejemplo 1, las diluciones del anticuerpo 2E8 mostraron un perfil de unión mejorado a las células CD52 + Hut78 en comparación con Campath-IH. Como se muestra en la figura 4, el anticuerpo 2E8 mostró un perfil de unión competitiva mejorada mediante análisis de citometría de flujo cuando compitió con Campath-IH para el enlace a células CD52 + HUT78.

EJEMPLO 4 - CITOTOXICIDAD MEDIADA POR CÉLULAS DEPENDIENTE DE ANTICUERPOS (ADCC) Ensayos de ADCC se realizaron con el anticuerpo monoclonal 2E8 de la siguiente manera. Las células objetivo (ya sea células Raji o REH) se recolectaron y se precargaron con 25 µ? (final) calceína-AM (Sigma). Después de la incubación con calceína durante 1 hora a 37°C, las células se lavaron en medios para eliminar calceína no incorporada. 1x104 células objetivo se agregaron a una placa de de fondo transparente en V que contenía 2?8· o anticuerpos de control a 50pg/ml final como en la figura 5 o como se representa en la Figura 6, y se incubaron durante 1 hora para pre-opsonisar las células objetivo. PBMC (células efectoras) se aislaron de la capa leuco-plaquetaria de donantes sanos (de la extracción de sangre dentro de las 24 horas) obtenida del Servicio Nacional de Transfusión de Sangre del Reino Unido (Hospital de Addenbrooke, en Cambridge, Reino Unido) y de acuerdo a la aprobación otorgada por el Comité de Ética de Investigación Local Hospital de Addenbrooke. PBMC fueron aisladas de la capa leuco-plaquetaria por centrifugación de densidad Lymphoprep (Axis-Shield , Dundee, Reino Unido). 5x105 células efectoras se añadieron a cada pocilio de la placa que contiene las células objetivo y el anticuerpo en un volumen final de 250µ? (50:1 proporción de efector a células objetivo). Las muestras se incubaron durante 4 horas a 37°C/5% C02. Después de 4 horas, se añadió Tritón X-100 a los pocilios que contenían células de control (células efectoras y/o objetivo) para establecer el control de la lisis máxima. Después de la centrifugación, 150 µ I de medios fueron transferidos de cada pocilio a una placa de pared negra y fondo transparente con 96 pocilios y la fluorescencia de la placa se midió a 520 nm. Los resultados se expresaron como: % de Citotoxicidad= (señal de la muestra de prueba menos liberación de la Calceína-AM) x 100 (Señal máxima lisis celular objetivo menos liberación de la Calceína-AM) La figura 5 muestra la ADCC media para PBMC de 5 donantes humanos para 2E8 quimérico ("???01") y Campath-1H para las células objetivo CD52 + REH que muestran una ADCC significativamente mejorada para 2E8 quiméricos. Subsecuentemente una variante que expresa una línea celular REH alta CD52 se aisló por FACS que exhibieron aproximadamente 2 veces el enlace de Campath-IH en comparación con las células madre REH. La figura 6 muestra una serie de dilución de 2E8 quiméricos y Campath-IH para la ADCC sobre células REH de alta CD52+ utilizando PBMC de dos donantes individuales. Esto también muestra el perfil de ADCC mejorado significativamente para 2E8 quiméricos en comparación con Campath-IH.

EJEMPLO 5 - CITOTOXICIDAD DEPENDIENTE DEL COMPLEMENTO (CDC) Ensayos de CDC se realizaron en el anticuerpo monoclonal 2E8 de la siguiente manera. Las células objetivo (ya sea células Raji o REH) se recolectaron y 5x104 células/pocilio se añadieron a una placa de pared negra y fondo transparente con 96 pocilios. Se agregaron anticuerpos 2E8 o de control para las concentraciones finales como se muestra en la figura 7 junto con suero humano ya sea activo o inactivado con calor (a 60°C durante 30 minutos) de (Pathway Diagnostics Ltd, Dorking, Reino Unido) por pocilio (25% de concentración final de suero). Las muestras se incubaron durante 3 horas a 37°C/5% C02. Después de 3 horas, se añadió Tritón X-100 a la célula de control que contiene los pocilios para establecer el control de la lisis máxima. Prestoblue (10X) reactivo de viabilidad celular (Invitrogen) se diluyó con medios de cultivo de ensayo y se agregaron a cada pocilio para obtener una dilución final de 1 en 10 de PrestoBlue. Después de la incubación durante 1 hora a 37°C/5% C02, la placa de fluorescencia se midió a 590 nm. Los resultados se expresaron como: % Viabilidad celular = (Muestra menos liberación de fondo) x 100 (Lectura máx (n lisis) menos ta lectura de fondo) La Figura 7 muestra un perfil de CDC significativamente mejorado para 2E8 quimérico en comparación con Campath-1 H.

EJEMPLO 6 - GENERACIÓN DE ANTICUERPOS HUMANIZADOS Los anticuerpos humanizados se generaron utilizando métodos descritos en EP1844074 (Antitope Ltd). Los modelos estructurales de las regiones V de ratón 2E8 se produjeron usando Swiss PDB y se analizaron con el fin de identificar los aminoácidos importantes que probablemente sean importantes para las propiedades de enlace a CD52 del anticuerpo ("residuos de restricción"). Una base de datos de secuencias de la región V humana se utilizó para identificar los segmentos de secuencias de la región V humana que contienen cada uno de los residuos de restricción para ser utilizados en el diseño de los anticuerpos humanizados. Por lo general dos o más segmentos de la secuencia de la región V alternativa se utilizan para proporcionar cada residuo de restricción dando por resulta en un gran rango de posibles secuencias de secuencias de la región V anti-CD52 humanizada para el 2E8. Estas secuencias se analizaron a continuación para la predicción del enlace de péptido clase II MHC no germinal por análisis in sil ico como se describe en Fothergill et al. (W09859244, cesionario Eclagen Ltd) y también para epítopos de células para CD4 + T conocidos que utilizan bases de datos, incluyendo "The Immune Epitope Datábase and Analysis Resource", http://www.immuneepitope.org/. Se descartaron las secuencias de la región V con péptidos de enlace a MHC de clase II no germinales predichos, o con importantes coincidencias contra bases de datos epítopos de células T. Esto dio lugar a un conjunto reducido de secuencias de la región V. Combinaciones seleccionadas de segmentos de la secuencia de la región V se combinaron para producir secuencias humanizadas de aminoácidos de región variable de cadena pesada y ligera. Cinco cadenas pesadas y cuatro secuencias de cadena ligera (designado VH1 a VH5, y VK1 a VK4 respectivamente) fueron seleccionados para 2E8 (SEC ID NOS. 20 a 24 y de 25 a 28, respectivamente).

Codificación de las regiones V humanizadas variante de ADN se sintetizaron y se subclonaron en los vectores de expresión pANT17 y pANT13 (figura 1) como se describe en el ejemplo 3. Todas las combinaciones de cadenas VH humanizadas y VK (es decir, un total de 20 emparejamientos de 2E8) se transfectaron transitoriamente en células HEK293 y también se transfectaron en células NSO, y el anticuerpo se purificó por cromatografía de proteína A a partir de los sobrenadantes de cultivo como se describe en el ejemplo 3. EJEMPLO 7 - ANÁLISIS DE ANTICUERPOS HUMANIZADOS Se evaluó el enlace de las variantes de 2E8 humanizadas derivadas de HEK y NSO al péptido de CD52 en un ELISA de competición contra el anticuerpo quimérico padre. El anticuerpo quimérico 2E8 parental se biotiniló utilizando un kit de microbiotinilación Biotin Tag™ (Sigma-Aldrich). Placas de 96 pocilios MaxiSorp (Nunc) se recubrieron con 0.025pg/ml péptido CD52-KLH en PBS de Dulbecco (PAA Laboratories, Yeovil, Reino Unido) (100µ? volumen final) a 4°C durante la noche. Las placas se bloquearon con PBS- 2%BSA de Dulbecco durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado (0.05% Tween 20 en PBS Dulbecco). Los anticuerpos humanizados probados en diversas concentraciones se mezclaron previamente con el anticuerpo quimérico biotinilado padre (concentración final 0.035pg/ml) y luego se agregan a la placa de péptido CD52-KLH ( 100 µ I volumen final). Todas las muestras se analizaron por duplicado. Las placas se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con tampón de lavado. 100 µ I de una dilución 1 en 1000 de estreptavidina HRP (Sigma-Aldrich) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado y 100 µ I de sustrato TMB y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad para permitir que el color se desarrollará (Invitrogen). La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µ? de HCI 3M. Las placas se leyeron a 450 nm utilizando un lector de placas Dynex.

Como se muestra en la figura 8, todas las variantes de 2E8 humanizado principales muestran perfiles de enlace competitivo similares para el anticuerpo quimérico padre. Variantes humanizadas se ensayaron posteriormente para el enlace pór citometría de flujo como se detalla en el ejemplo 1, para la ADCC como en el ejemplo 4, y para CDC como en el ejemplo 5. Como se muestra en la figura 9, las variantes humanizadas exhibieron un perfil de enlace mejorada por citometría de flujo con Campath-1H para el enlace a las células REH. Como se muestra en las figuras 10 y 11, las variantes humanizadas también mostraron ADCC mejorada y el perfil de CDC utilizando células objetivo REH para ADCC en una proporción célula objetivo:efectora de 50:1 o la línea celular superior CD52+ REH para CDC (como en el Ejemplo 4) en comparación con Campath-1H.

EJEMPLO 8 - GENERACIÓN DE scFv y Fab Variantes humanizadas 2E8 del ejemplo 6 se convirtieron en scFv y se clonaron en vectores M13 de presentación de fagos como se describe en Benhar I. y Reiter, Y., Current Protocols in Immunology, Unidad 10.19B, Wiley Online Library, mayo de 2002 (http://www. currentprotocols.com/protocol/im10 9b) usando el módulo de expresión RPA del vector pCANTAB5E (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Reino Unido). Genes VH y VK humanizados se amplificaron usando los cebadores que proporcionaron sitios de restricción terminales Sfil y Notl, un enlazador Gly4Ser interno y una etiqueta His6 C terminal. Las construcciones de scFv se insertaron en el vector pCANTAB5E como fragmentos Sfil-Notl y se transformaron en E. coli HB2151 lo que resultó en scFv exportado al periplasma y parcialmente al medio de crecimiento. Los scFv se purificaron a partir del medio de cultivo por cromatografía de afinidad de quelato de níquel utilizando cartuchos HF de selección HIS(Sigma-Aldrich). Los scFv de 2E8 purificado se ensayaron en un ensayo de competición, como se detalla en el ejemplo 7 para el enlace a péptido CD52 y todos los scFv humanizados presentaron un enlace competitivo a péptido CD52. Variantes de 2E8 humanizadas del ejemplo 6 también se convirtieron a Fab usando el método utilizado para el scFv con la excepción de que genes VH .y VK humanizados o amplificados fueron amplificados adicionalmente con genes de región constante CHI y CK para formar fragmentos VH-CH1 y VK-CK que se amplifican aún más con cebadores para unir estos fragmentos con una secuencia líder pelB de 22 aminoácidos (Lei SP et al., J Bacteriol. 169 (1987) p4379-4383) entre fragmentos de gen VH-CH1 cadena arriba y VK-CK que resulta en un gen dicistrónico Fab. Se generaron y se purificaron Fab de 2E8 variantes humanizadas como anteriormente para scFv y se ensayaron en ensayo de competición de péptido CD52 tal como se detalla en el ejemplo 7. Todos los Fab humanizados presentaron enlace competitivo al péptido CD52.

EJEMPLO 9 - ANÁLISIS DE RESPUESTAS DE CÉLULAS CD4 + T PBMC se aislaron de capa leuco-plaquetaria de donantes sanos (de la extracción de sangre dentro de las 24 horas) obtenida del Servicio Nacional de Transfusión de Sangre del Reino Unido (Hospital de Addenbrooke, en Cambridge, Reino Unido) y de acuerdo a la autorización concedida por el Comité de Ética de Investigación Local del Hospital de Addenbrooke. Las PBMC fueron aisladas de la capa leuco-plaquetaria por centrifugación de densidad Lymphoprep (Axis-Shield , Dundee, Reino Unido) y las células CD8 + T se agotaron con CD8 + RosetteSep™ (StemCell Technologies Inc, Londres, Reino Unido). Los donantes se caracterizaron mediante la identificación de haplotipos HLA-DR utilizando un kit de tipificación de tejidos basado en PCR-SSP H LA (Biotest, Solihull, Reino Unido). También se determinaron las respuestas de células T para controlar antígenos incluyendo el retiro del antígeno de toxina tetánica (KLH Pierce, Cramlingtom, Reino Unido y los péptidos derivados de los virus de Influenza A y Epstein Barr). Las PBMC se congelan y almacenan en nitrógeno líquido hasta que sea necesario.

Para preparar células dendríticas derivadas de monocitos (DC), 50 PBMC de donantes diferentes se seleccionan para proporcionar una distribución de frecuencias de alotipos HLA-DR y HLA-DQ similares a las frecuencias en la población global mundial. PBMC fueron revividas en medio de cultivo AIM-V® y células CD14 + aisladas utilizando microperlas Miltenyi CD 14 y columnas LS (Miltenyi Biotech, Oxford, Reino Unido). Los monocitos se resuspendieron en AIM-V® suplementado con 1000U/ml de IL-4 y 1000U/ml de GM-CSF ("medios de cultivo DC") a 4-6xl06 PBMC/ml y luego se distribuyen en placas de 24 pocilios (2 mi de volumen de cultivo final). Las células se alimentan el día 2 con la mitad del volumen de reemplazo del cultivo DC. Al día 3, los monocitos se habían diferenciado a DC semi-madura que fueron pre-incubadas con 40ug/ml de Campath-1H, anticuerpo quimérico 2E8, anticuerpos 2E8 humanizados, lOOpg/ml de KLH o sólo medio. DC semimaduras se incubaron con antígeno durante 24 horas después de lo cual el exceso de anticuerpo de prueba se eliminó por lavado de las células dos veces y se resuspendieron en medio de cultivo DC suplementado con 50 ng/ml de TNF-a (Peprotech, Londres, Reino Unido). DC se alimentaron el día 7 con medio volumen del cambio de medio de cultivo DC (suplementado con 50ng/ml TNFa) antes de cosechar DC maduras en el día 8. Las DC maduras cosechadas fueron contadss y la viabilidad se evaluó mediante tinción de exclusión con azul de tripán. Las DC fueron entonces irradiadas con rayos ? (4000 rads) y se resuspendieron a 2x105 células por mi en medio AIM-V antes de su uso en el ELISpot y los ensayos de proliferación. Además, en el día 8, células CD4 + T frescas fueron también preparadas. Para purificar las células CD4 + T, las PBMC fueron revividas en medio de cultivo AIM-V® y las células CD4+ fueron aisladas utilizando microperlas CD4 Miltenyi y columnas LS (Miltenyi Biotech, Oxford, Reino Unido) y resuspendidas en medio AIM-V ® media a 2xl0 6 células/ml.

El día 8, se establecieron ensayos de proliferación de células T mediante el cual 1x105 células autólogas de CD4+ T se añadieron a 1x104 de DC cargadas de anticuerpos 2E8 humanizados o quiméricos cargados (proporción de 10:1) en una placa con fondo en U con 96 pocilios, con medio AIM-V® agregados a un volumen final de 200ul/pozo). En el día 14, las placas de ensayo se sometieron a pulsos con 1uCi [3H] (Perkin Elmer, Beaconsfield , Reino Unido) por pocilio en 25 ul AIMV durante 6 horas antes de la cosecha en esteras de filtro- (Perkin Elmer) utilizando un cosechador celular Mach III de TomTec (Hamden CT, EE.UU.). Las conteos por minuto (cpm) para cada pocilio se determinaron por Meltilex™ (Perkin Elmer) en un contador de centelleo líquido 1450 Microbeta Wallac Trilux (Perkin Elmer) en Paralux, con bajo conteo de fondo. El conteo por minuto para cada muestra de anticuerpo se normalizó solo al control del medio.

Para los ensayos de ELISpot, las placas de ELISpot (Millipore, Watford, Reino Unido) se recubrieron con 100µ l/poci I lo de de anticuerpo de captura IL-2 (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) en PBS. Las placas fueron luego lavadas dos veces con PBS, se incubaron durante la noche en tampón de bloqueo (1% de BSA (Sigma) en PBS) y se lavaron en medio AIM ®. El día 8, 1x105 células CD4 + T autólogas se añadieron a 1x104 DC cargado con antígeno (proporción de 10:1) en placas ELISpot de 96 pocilios. Todas las preparaciones se probaron en cultivos sextuples. Para cada PBMC de donantes, un control negativo (solo medio AIM V®), sin control de las células y también un control positivo PHA (10 ug/ml).

Después de un periodo adicional de incubación de 7 días, las placas de ELISpot se desarrollaron de tres lavados secuenciales en dH20 y PBS antes de la adición de 100 µ I del anticuerpo de detección biotinilado filtrado (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) en PBS/1% BSA. Después de la incubación a 37°C durante 1.5 horas, las placas se lavaron adicionalmente tres veces con PBS y se agregaron 100 µ I de estreptavidina-AP (R&D Systems) en PBS/1% BSA se durante 1 hora (incubación a temperatura ambiente).

La estreptavidina-AP se desechó y las placas se lavaron cuatro veces con PBS. BCIP/NBT (R&D Systems) se añadió a cada pocilio y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. El desarrollo de puntos fue detenido por lavado de los pocilios y las partes posteriores de los pocilios tres veces con dH20. Las placas secas fueron digitalizadas en un Analizador Immunoscan™ y se determinaron las manchas por pocilio (spw) fueron determinadas utilizando el software Immunoscan™ versión 4.

Tanto para la proliferación y los ensayos de ELISpot IL-2, los resultados se expresaron como un índice de estimulación (SI), definido como la relación de cpm (ensayo de proliferación) o puntos (ensayo ELISpot) para el anticuerpo de prueba frente a un control de sólo medio usando un umbral de SI igual o mayor que 2 (Sl> 2.0) para las respuestas de células T positivas. Los datos mostraron que tanto el anticuerpo 2E8 Campath-IH y quimérico indujeron respuestas de células T en 10 o más de 50 PBMC de donantes probadas (>= 20%), mientras que ninguno de los anticuerpos humanizados 2E8 indujeron respuestas de células T en más de 2 de los 50 donantes (< = 4%) demostrando la eficacia del proceso de humanización en la eliminación de las respuestas de células T procedentes de las regiones V.

EJEMPLO 10 - ENSAYO DE CITOTOXICIDAD DIRECTA Efectos citotóxicos directos de anticuerpos anti-CD52 humanos se evaluaron utilizando co-tinción con anexina V/yoduro de propidio como marcadores de apoptosis y necrosis, respectivamente. 1x105 de células REH se cultivaron en presencia de 100Mg/ml de anticuerpos de prueba CD52 anti-humano o un anticuerpo de control adaptado al isotipo +/- 100pg/ml anticuerpo reticulante F(ab') (Jackson ImmunoResearch, Cat no. 109-006-008) (600ul volumen final). Las células se incubaron durante 72 horas antes de lavar en PBS/2%BSA seguido por la co-tinción con anexina V/yoduro de propidio de acuerdo al protocolo recomendado por los fabricantes (Invitrogen, Cat. no. V13245). Se generaron diagramas de dispersión utilizando análisis FACS y se dividieron en tres regiones para la cuantificación de células vivas (sin teñir), las células apoptóticas (FL1, anexina V positiva) y las células necróticas (FL1, anexina V positivo y FL3, yoduro de propidio positivo). Como se muestra en la figura 13, los anticuerpos humanizados 2E8 mostraron aumento de la apoptosis y la necrosis en comparación con Campath-IH de las células objetivo REH, con el % de células necróticas >40% de los anticuerpos humanizados en comparación con 19.9% para Campath-IH.

EJEMPLO 11 - MODELO ANIMAL DE TUMOR Un modelo animal del tumor fue utilizado para el análisis in vivo de anticuerpos anti-CD52 humanos en la inhibición de crecimiento del tumor. En el modelo, las células de linfoma de Burkitt Raji humanas fueron trasplantadas en ratones SCID y los animales fueron tratados con anticuerpos anti-CD52 humanos. Ratones hembra Fox Chase SCID de 7 semanas de edad femeninos (Charles River, Morrisville, Carolina del Norte, EE.UU.) fueron inyectados con 1x106 células Raji (Colección de Cultivos Tipo Americano, 0,2 mi de suspensión celular) a través de una inyección de bolo (iv) en la vena de la cola. Los anticuerpos CD52 anti-humanos de prueba o un anticuerpo de control de isotipo coincidente fueron cada uno administrado por vía intraperitoneal (ip) una vez al día en días alternos por un total de siete dosis, comenzando tres días después de la inyección de células tumorales. El volumen de dosificación de 10 ml/kg (0.20 ml/20 g de ratón) fue adaptado al peso corporal de cada animal, determinado dos veces por semana. Los resultados que se muestran en la figura 14 demostraron una tasa de supervivencia mejorada, tanto en dosis de 1 y 10 mg/kg por el anticuerpo anti-CD52 VH3/VK4 líder (región V de la SEQ ID: 22 y 28) en comparación con Campath 1H.

Secuencias >SEQ ID NO. 1 ADN de ratón VH 2E8 GAGGTGCACCTGATGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGGTATGGCA TGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAATG ATGAAAACTAAAGGTGGTAGGACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCG ATTCACCATTTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAG CAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATCTATTTCTGTGCAAGTGATGGTTA CTACTG G G G C C AAGGC AC C ACTCTC AC AGTCTC CTC A > SEQ ID NO. 2 ADN de ratón VK 2E8 CCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGT CCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAA TCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTATTGCTGGCAAGGT AC AC ATTTGTG G AC GTTC G GTG G AG GC AC C AAACTGG AAATC AAA > SEQ ID NO. 3 Aminoácido VH de ratón 2E8 EVHLMESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPD KRLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSS LKSEDTAI YFCASDGYYWGQGTTLTVSS > SEQ ID NO. 4 Aminoácido VK de ratón 2E8 DVLMTQTPLTLSVTIGQPASI SCKSSQSLLHSDGKTYLN WLLQ R PGQSPKRLI YLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDL GIYYCWQGTHLWTFGGGTKLEIK > SEQ ID NO. 5 Aminoácido VH CDR1 2E8 RYGMS > SEQ ID NO. 6 Aminoácido VH CDR2 2E8 MMKTKGGRTYYPDSVKG > SEQ ID NO. 7 Aminoácido VH CDR3 2E8 DGYY > SEQ ID NO. 8 Aminoácido VK CDR1 2E8 KSSQSLLHSDGKTYLN > SEQ ID NO. 9 Aminoácido VK CDR2 2E8 LVSKLDS > SEQ ID NO. 10 Aminoácido VK CDR3 2E8 > SEQ ID NO. 11 Variante 1 de ADN de VH humanizado con 2E8 GAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCC TGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTC > SEQ ID NO. 12 Variante 2 de ADN de VH humanizado con 2E8 CGGCTTCACCTTCTCCAGATACGGCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTG GCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCG GAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTC TGATGAAGACCAAGGGCGGCAGAACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGG CCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGA TGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTTTTGCGCCTCCGAC GGCTACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACQGTGTCATCA > SEQ ID NO. 13 Variante 3 de ADN de VH humanizado con 2E8 GAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCT CCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGATACGGC ATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCA TGATGAAGACCAAGGGCGGCAGAACCTAQTACCCCGACTCCGTGAAGGG C C G GTTC AC C ATCTC C C G G G AC AAC G C C AAG AACTC C CTGTAC CTG C AG A TGAACTCCCTGCGGGCCGAGGAQAQCGCCATCTACTACTGCGCCTCCGA CGGCTACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCATCA > SEQ ID NO. 14 Variante 4 de ADN de VH humanizado con 2E8 GAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCC TGGCGGCTCCQTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCAC CTTCTCCAGATACGGCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGG CAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCA > SEQ ID NO. 15 Variante 5 de ADN de VH humanizado con 2E8 CGGCTTCACCTTCTCCAGATACGGCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTG GCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCAGAGGTGCACCTGGTGGAATCCGGCG GAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTC TG ATG AAG AC C AAG G GC G G C AG AACCTACTAC C C C G ACTC C GTG AAG G G CCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGA TGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCTCCGA C G G CTACTACTGG G G C C AG G G C AC C ACC GTG AC C GTGTC ATC A > SEQ ID NO. 16 Variante 1 de ADN de VK humanizado con 2E8 GACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGACCCTGTCCGTGACCCTGGGCC AGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGCACTCCGAC GGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCCCCCA AGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACTCCGGCGTGCCCGACAG ATTCACCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGG TGGAAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCTGGCAGGGCACCCATCT GTG G AC CTTC G G C GG AG G C AC AAAG GTGG AAATC AAA > SEQ ID NO. 17 Variante 2 de ADN de VK humanizado con 2E8 CTCCCAGTCCCTGCTGCACTCCGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGC AGCAGCGGCCTGGCCAGTCTCCTCGACGTGCTGATGACCCAGACCCCCC TGACCCTGTCCGTGACCCTGGGCCAGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTC GGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACTCCGGCGTGCCCGACAG ATTCACCGGCTCTGGCTCCGGCACC > SEQ ID NO. 18 Variante 3 de ADN de VK humanizado con 2E8 G AC GTG CTG ATG AC C C AG AC C C C CCTGTC C CTGTC C GTG ACC CTG G G C C AGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGCACTCCGAC GGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCTCCTC GGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACTCCGGCGTGCCCGACAG ATTCACCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGG TGGAAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCTGGCAGGGCACCCATCT GTGGACCTTCGGCGGAGGCACAAAGGTGGAAATCAAA > SEQ ID NO. 19 Variante 4 de ADN de VK humanizado con 2E8 GACGTGGTGATGACCCAGACCCCCCTGTCCCTGTCCGTGACCCTGGGCC AGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGCACTCCGAC GGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCTCCTC > SEQ ID NO. 20 Variante 1 de aminoácido VH humanizado con 2E8 EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPG KGLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSS LKAEDTAI YFCCOMODGYYWGQGTTVTVSS > SEQ ID NO. 21 Variante 2 de aminoácido VH humanizado con 2E8 EVH LVESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPG KGLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAI YFCASDGYYWGQGTTVTVSS > SEQ ID NO. 22 Variante 3 de aminoácido VH humanizado con 2E8 EVH LVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYG SWVRQAPG KGLELVAM KTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQM NSLRAEDTAI YYCASDG YYWGQGTTVTVSS > SEQ ID NO. 23 Variante 4 de aminoácido VH humanizado con 2E8 EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPG KGLELVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAVYYCCOMODG YYWGQGTTVTVSS > SEQ ID NO. 24 Variante 5de aminoácido VH humanizado con 2E8 EVH LVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSR YGMSWVRQAPG KGLEWVAMMKTKGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTAI YYCASDG YYWGQGTTVTVSS > SEQ ID NO. 25 Variante 1 de aminoácido VK humanizado con 2E8 DVLMTQTPLTLSVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLQQR PGQSPKRUYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGI YYC WQGTHLWTFGGGTKVEIK > SEQ ID NO. 26 Variante 2 de aminoácido VH humanizado con 2E8 DVLMTQTPLTLSVTLGQPAS I SC KSS Q S LLHS DG KTYLN WLQQ R PGQSPRRLI YLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GIYYCWQGTHLWTFGGGTKVEIK > SEQ ID NO. 27 Variante 3 de aminoácido VH humanizado con 2E8 DVLMTQTPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLQQR PGQSPRRLI YLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GIYYCWQGTHLWTFGGGTKVEIK > SEQ ID NO. 28 Variante 4 de aminoácido VH humanizado con 2E8 DWMTQTPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLQQR PGQSPRRLI YLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGI YYCWQGTHLWTFGGGTKVEIK

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CD52 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de CDR seleccionadas de entre el grupo que consiste en (i) CDRH1 que comprenden la secuencia RYGMS (SEQ ID NO. 5) (ii) CDRH2 que comprende la secuencia MMKTKGGRTYYPDSVKG secuencia (SEQ ID NO. 6) (iii) CDRH3 que comprende la secuencia DGYY (SEQ ID NO. 7) (iv) CDRL1 que comprende la secuencia KSSQS LLHS DG KTYLN (SEQ ID NO. 8); (V) CDRL2 que comprenden la secuencia LVSKLDS (SEQ ID NO. 9) y; (Vi) CDRL3 que comprende la secuencia WQGTHLWT (SEQ ID NO. 10).

2. Un anticuerpo anti-CD52 que comprende una o más secuencias de región variable seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 20-24 para la región variable de la cadena pesada en combinación con una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 25 -28 para la región variable de cadena ligera.

3. Un anticuerpo anti-CD52 que comprende la SEQ ID NO. 22 para la región variable de la cadena pesada en combinación con la SEQ ID NO.: 28 para la región variable de cadena ligera.

4. Un anticuerpo anti-CD52 de las reivindicaciones 1 a 3, que, cuando se ensayaron in vitro para la inducción de las respuestas de células CD4 + auxiliar T en 50 muestras de sangre humana con una distribución de alotipos HLA-DR de la población humana, aumenta a < = 4% de las respuestas de las células T.

5. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 4, donde las secuencias de región variable se derivan enteramente a partir de secuencias de las regiones variables de anticuerpos humanos.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5 que está compuesto de regiones variables junto con regiones constantes humanas.

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, donde la región constante de la cadena pesada humana es ya sea el isotipo lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4, o una región constante de IgG mutado, y la región constante humana de la cadena ligera humana es del isotipo kappa.

8. El anticuerpo de la reivindicación 6, donde las regiones constantes humanas son lgG1 y kappa.

9. El anticuerpo de la reivindicación 6, donde las regiones constantes humanas son lgG4 y kappa.

10. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo es un scFv o Fab.

11. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 10, que es un componente de una proteína multiespecífica que se enlaza específicamente a CD52 humano y, además, se enlaza o interactúa con uno o más moléculas adicionales.

12. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

13. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 12.

14. Un vector de la reivindicación 13 en el que el vector es un vector de expresión.

15. Una célula huésped que comprende un vector de las reivindicaciones 13 o 14.

16. La célula huésped de la reivindicación 15 en donde la célula huésped es procariota.

17. La célula huésped de la reivindicación 15, en donde la célula huésped es eucariota.

18. La célula huésped de la reivindicación 17 en donde la célula huésped es de mamífero.

19. Una composición que comprende un anticuerpo anti-CD52 de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

20. Una composición que comprende un polinucleótido de la reivindicación 12 o un vector de las reivindicaciones 13 o 14.

21. Un método para el tratamiento de una enfermedad incluyendo CLL y otras leucemias, enfermedades autoinmunitarias como la esclerosis múltiple, la artritis reumatoide, vasculitis, miositis, y la diabetes, y el rechazo de órganos y la enfermedad de injerto contra huésped que comprende la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 o una composición de la reivindicación 19 o 20 a un sujeto en necesidad de tal tratamiento.

22. El método de la reivindicación 21, que comprende además la co-administración de una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, que comprende además administrar conjuntamente un vehículo farmacéutico.

24. Un método para detectar la presencia del antígeno CD52 humano en una muestra usando el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para el diagnóstico de una enfermedad relacionada con el CD52 humano.

25. Un método para detectar la presencia del antígeno CD52 humano en una muestra usando el polinucleótido o vectores de las reivindicaciones 12 a 14 para el diagnóstico de una enfermedad relacionada con el CD52 humano.

26. Un anticuerpo anti-CD52 que, cuando se ensaya in vitro para la inducción de las respuestas de las células CD4 + auxiliar T en 50 muestras de sangre humana con una distribución de alotipos HLA-DR de la población humana, aumenta a <= 4% de las respuestas de células T.