PT1694706E

PT1694706E - Anticorpo anti-cd52 modificado

Info

Publication number: PT1694706E
Application number: PT04817412T
Authority: PT
Inventors: Francis J Carr; Anita A Hamilton
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2003-11-01
Filing date: 2004-10-29
Publication date: 2012-06-19
Also published as: WO2005042581A2; BRPI0416141A; US20080075715A1; US7264806B2; BRPI0416141B1; US20080248529A1; DK1694706T3; US20050152898A1; EP1694706A2; CN1898267B; JP4804357B2; WO2005042581A3; BRPI0416141B8; CA2544365A1; CN1898267A; JP2007534304A; US7910104B2; ES2384105T3; ATE552276T1; WO2005042581A8

Description

1

DESCRIÇÃO "ANTICORPO ANTI-CD52 MODIFICADO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com polipeptideos para serem administrados especialmente a humanos e, em particular, para uso terapêutico. Os polipeptideos são polipeptideos modificados, em que a modificação resulta num número reduzido de epítopos de células T potenciais que providencia uma propensão reduzida para o polipeptideo despoletar uma resposta imune após a administração a um sujeito humano. A invenção em particular relaciona-se com a modificação de anticorpos reativos ao antigeno do leucócito CD52 humano para providenciar anticorpos anti-CD52 que têm um número reduzido de epitopos de células T potenciais, mas retêm a capacidade para se ligarem ao CD52.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Existem muitas situações em que a eficácia de uma proteina terapêutica é limitada por uma reacção imune indesejada à proteina terapêutica. Vários anticorpos monoclonais de ratinho demonstraram ser prometedores como terapias num número de cenários de doenças humanas mas em certos casos falharam devido à indução de graus significativos de uma resposta anticorpo antimurina humana (HAMA) [Schroff et al. (1985) Câncer Res. 45: 879-885;

Shawler et al. (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. Para anticorpos monoclonais, foi desenvolvido um número de técnicas na tentativa de reduzir a resposta HAMA [WOA8909622; EPA0239400; EPA0438310; WOA9106667; EPA0699755]. Estas abordagens com ADN recombinante reduziram, de uma forma geral, a informação genética de ratinho na montagem final do anticorpo enquanto aumentaram a informação genética humana na montagem final. Não obstante, os anticorpos "humanizados" resultantes ainda 2 despoletaram, em vários casos, uma resposta imune em pacientes [Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456;

Rebello et al. (1999) Transplantation 68 : 1417-1420].

Os anticorpos não são a única classe de molécula de polipeptídeo administrada como agente terapêutico contra a qual pode ser montada uma resposta imune. Mesmo proteínas de origem humana e com as mesmas sequências de aminoácidos, como ocorre entre seres humanos, podem ainda induzir uma resposta imune em seres humanos. Exemplos notáveis incluem o uso terapêutico de fator estimulante de colónias granulocito-macrofago [Wadhwa et al., (1999) Clin. Câncer

Res. 5: 1353-1361] e interferão oí2 [Russo et al. (1996)

Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein et al. (1988) New Engl. J.

Med. 318: 1409-1413] entre outros. A chave para a indução de uma resposta imune é a presença dentro da proteína de péptidos que podem estimular a atividade das células T através da apresentação em moléculas classe II do CMH, as designadas "epítopos de células T". Tais epítopos de células T são habitualmente definidos como qualquer sequência de resíduos de aminoácidos com a capacidade de se ligarem a moléculas classe II do CMH. Implicitamente, um "epítopo de célula T" significa um epítopo que, quando ligado a moléculas do CMH, pode ser reconhecido por um recetor de célula T (TCR) , e que pode, pelo menos em princípio, provocar a activação destas células T envolvendo um TCR para promover uma resposta da célula T.

As moléculas classe II do CMH são um grupo de proteínas altamente polimórficas que desempenham um papel central na seleção e ativação das células T auxiliares. O grupo dos antígenos dos leucócitos seres humanos DR (HLA-DR) são o isotipo predominante deste grupo de proteínas, contudo, os isotipos HLA-DQ e HLA-DP desempenham funções semelhantes. Na população humana, os indivíduos possuem dois a quatro alelos DR, dois alelos DQ e dois DP. A 3 estrutura de um número de moléculas DR foi resolvida e estas aparecem como um sulco de ligação de um péptido aberto com um número de bolsos hidrofóbicos que envolvem resíduos hidrofóbicos (resíduos dos bolsos) do péptido [Brown et al. , Nature (1993) 364: 33; Stern et al. (1994) Nature 368: 215]. 0 polimorfismo que identifica os diferentes alotipos da molécula classe II contribui para uma ampla diversidade de diferentes superfícies de ligação para péptidos dentro do sulco de ligação ao péptido e, ao nível da população, assegura flexibilidade máxima com respeito à capacidade para reconhecer proteínas estrangeiras e montar uma resposta imune a organismos patogénicos.

Uma resposta imune contra uma proteína terapêutica desenvolve-se através da via de apresentação do péptido classe II do CMH. Aqui proteínas exógenas são esmagadas e processadas para apresentação em associação com moléculas classe II do CMH dos tipos DR, DQ ou DP. As moléculas classe II do CMH são expressas por células apresentadoras de antígeno profissionais (APCs), tai como macrofagos e células dendríticas, entre outras. 0 envolvimento de um complexo peptídico classe II do CMH por um recetor cognato de célula T na superfície da célula T, junto com a ligação cruzada de certos outros co-recetores, tais como a molécula CD4, podem induzir um estado ativado dentro da célula T. A ativação conduz à libertação de citocinas ativando, ainda, outros linfócitos, tais como células B, para produzir anticorpos ou ativando células T assassinas como uma resposta imune celular completa. A identificação do epítopo de célula T constitui a primeira etapa para a eliminação do epítopo, como reconhecido em W098/52976 e WOOO/34317. Nestes ensinamentos, os epítopos de células T previstos são removidos pelo uso de substituições de aminoácidos judiciosas dentro da proteína de interesse. Além das 4 técnicas computacionais, existem métodos in vitro para medir a capacidade de péptidos sintéticos se ligarem a moléculas classe II do CMH. Um método exemplar usa as linhas de células B de alotipo de CMH definido como uma fonte de superfície de ligação classe II do CMH e pode ser aplicado na identificação de ligandos classe II do CMH [Marshall et al. (1994) J. Immunol. 152:4946-4956; 0'Sullivan et al. (1990) J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey et al. (1997) J. Immunol 159: 3238-3246]. Contudo, tais técnicas não estão adaptadas para a classificação de múltiplos epítopos potenciais para uma grande diversidade de alotipos de CMH, nem podem confirmar a capacidade de um péptido de ligação de funcionar como um epítopo de célula T.

Recentemente, o uso de técnicas que exploram complexos solúveis de moléculas de CMH recombinantes em combinação com péptidos sintéticos tem-se tornado mais frequente [Kern et al. (1998) Nature Medicine 4 : 975-978; Kwok et al. (2001) TRENDS in Immunol. 22:583-588]. Estes reagentes e procedimentos são usados para identificar a presença de clones de célula T a partir de amostras de sangue periférico de sujeitos animais seres humanos ou experimentais que são capazes de ligar complexos peptídicos de CMH particulares e não estão adaptados para a classificação de múltiplos epítopos potenciais para uma grande diversidade de alotipos de CMH.

Como descrito anteriormente e como consequência disso, seria desejável identificar e remover ou, pelo menos, reduzir os epítopos de células T potenciais de um dado, em princípio terapeuticamente valioso, mas originalmente imunogénico, péptido, polipeptídeo ou proteína. Uma destas moléculas terapeuticamente valiosas é um anticorpo monoclonal com especificidade de ligação para o antígeno leucocitário humano CD52. O anticorpo monoclonal preferido da presente invenção é uma forma modificada do anticorpo de 5 ratinho designado "CAMPATH". É um objetivo da invenção providenciar formas mofidicadas do anticorpo CAMPATH com um ou mais epitopos de células T potenciais removidos. A molécula CD52 tem um peso molecular de 21-28 kDa, e a proteína madura compreende um péptido com 12 aminoácidos com um oligossacarídeo N-ligado anexo à membrana pela sua âncora de glicofosfatidilinositol. 0 antígeno está presente em, pelo menos, 95% dos linfocitos do sangue periférico humano e também em células da série monocito/macrofago e, adicionalmente, espermatozóides. Não está presente em eritrocitos, plaquetas, tecido de células dendríticas ou células estaminais da medula óssea (Hale et al. (1990) Tissue Antigens 35:873; Buggins et al. (2002) Blood, 100:1715).

Os primeiros anticorpos CD52 foram produzidos a partir de um ratinho imunizado com linfocitos seres humanos numa tentativa de obter anticorpos que ativassem o complemento para uso para reduzir a medula do dador de células T antes da transplantação [Hale et al. (1983) Blood 62: 873-882]. A maioria dos anticorpos líticos eram anticorpos IgM anti-CD52. Apesar de úteis ex vivo, a ativação do complemento mediada pelo IgM CD52 (CAMPATH-1M) não era eficaz em eliminar células T in vivo. CAMPATH-1G, um anticorpo monoclonal IgG2b, obtido por mudança de isótopos de um clone do anticorpo IgG2a, liga recetores Fc seres humanos, medeia a morte celular pela toxicidade celular mediada pelo anticorpo (ADCCD) e é eficaz na eliminação de células in vivo [Friend et al. (1991) Transplant. Proc. 23: 2253-2254; Hale et al. (1998) Blood 92: 4581-4590]. Contudo, o uso de CAMPATH-1G é limitado pela resposta imune induzida nos pacientes [Cobbold, J.S. (1990) J. Immunol. Methods 127: 19-24; Dyer, M.J.S. (1989) Blood 73: 1431-1439]. Para reduzir a imunogenicidade, um anticorpo IgGl humanizado, CAMPATH-1H, foi fabricado por engenharia clonando as regiões hipervariáveis Kabat numa estrutura providenciada 6 pelas proteínas NEW humana e a mieloma Rei [Riechmann et al., (1988) Nature 332: 323-327] . Apesar de reduzirem a imunogenicidade comparada com o CAMPATH-1G, o anticorpo humanizado ainda induz respostas imunes em alguns pacientes. Num relatório inicial do tratamento para artrite reumatóide, não foi reportada qualquer resposta antiglobulina nos 8 pacientes tratados com uma primeira dose de administração intravenosa, mas 3 de 4 pacientes que receberam uma segunda dose de CAMPATH-1H desenvolveram anticorpos antiglobulinas (Issacs et al. (1992) Lancet, 21:1103-06). Num estudo subsequente de escalonamento intravenoso de dose única em pacientes com artrite reumatóide, 63% dos sujeitos desenvolveram respostas antiglobulinas, que foram primariamente respostas anti-idiotípicas [Weinblatt et al. (1995) Arthritis. Rheum. 38: 1589-1594]. As respostas antiglobulinas também foram reportadas para todos os 10 pacientes com artrite reumatóide que receberam doses escalonadas de CAMPATH-1H por administração subcutânea (Schnitzer et al., J. Rheumatol. (1997) 24:1031-36).

Assim, é desejável providenciar anticorpos anti-CD52 com um número reduzido de epítopos de células T potenciais, o que pode resultar num potencial reduzido ou ausente para induzir uma resposta imune no sujeito humano. Pode-se esperar que tais proteínas exibam um tempo de circulação aumentado dentro de um sujeito humano capaz de montar uma resposta imune ao anticorpo não modificado e pode ser de particular benefício em cenários de doença crónica ou recorrente, tal como é o caso de um número de indicações para CAMPATH. A presente invenção, em conformidade, providencia formas modificadas de um anticorpo anti-CD52 com números reduzidos de epítopos de células T potenciais que se espera que exibam uma imunogenicidade diminuída, enquanto, no entanto, retêm substancialmente as características terapêuticas benéficas associadas com a 7 eficácia do anticorpo parental não modificado. A invenção revela sequências identificadas dentro das sequências da região variável das cadeias pesada e leve de um anticorpo anti-CD52 que são epítopos de célula T potenciais em virtude do potencial de ligação da classe II do CMH.

Enquanto outros providenciaram moléculas de anticorpo anti-CD52 incluindo formas "humanizadas" [Patentes U.S. 5 846 543; 6 120 766; 6 569 430; W00230460] nenhum destes ensinamentos reconhece a importância dos epítopos das células T para as propriedades imunogénicas da proteína nem foram concebidos para influenciar directamente as ditas propriedades de uma maneira específica e controlada, de acordo com o esquema da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 representa um vetor exemplificado para uma cadeia pesada modificada, "camp VH." dhfr é seleção de dihidrofolato redutase; CMV pro é o promotor de CMV IE; pA é Poli A; e Amp R é resistência à ampicilina. A Figura 2 representa um vetor exemplificado para uma cadeia leve modificada, "camp VL". Neo é seleção de neomicina (G148); CMV pro é o promotor de CMV IE; pA é Poli A; e Amp R é resistência à ampicilina. A Figura 3 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de DIVHvl modificada. A Figura 4 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de DIVHv2 modificada. A Figura 5 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de DIVHv3 modificada. A Figura 6 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de DIVHv4 modificada. A Figura 7 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de DIVHv5 moifiçada. A Figura 8 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve de DIVKvl modificada. A Figura 9 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve de DIVKv2 modificada. A Figura 10 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve de DIVKv3 modificada. A Figura 11 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve de DIVKv4 modificada. A Figura 12 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve de DIVKv5 modificada. A Figura 13 representa o ADN e sequências de aminoácidos da região constante do IgGl humano. A Figura 14 representa o ADN e sequência de aminoácidos da região constante kappa humana A Figura 15 sumariza os resultados dos estudos preliminares usando o protocolo alternativo célula dendritica:célula T com o anticorpo DIVHv5/DIVKv2 modificado. A Figura 16 sumariza a comparação da imunogenicidade da célula T (célula dendritica:ensaio célula T) do CAMPATH-1H humanizado e o anticorpo DIVHv5/DIVKv2 modificado. Os valores cpm foram comparados (*) contra controlos não tratados usando o teste t de Student (p<0,05).

SUMÁRIO E DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção providencia um anticorpo modificado no qual a caracteristica imune é modificada por meio de redução dos números de epítopos de células T 9 potenciais. São reveladas sequências identificadas dentro das sequências da região variável do CAMPATH-1G de ambas cadeia pesada e cadeia leve que são epítopos de células T potenciais em virtude do potencial de ligação da classe II do CMH. A invenção revela as regiões principais da sequência da região V do anticorpo que pode ser imunogénica no homem e sequências modificadas para eliminar ou reduzir a eficácia imunogénica potencial destes locais.

Num aspeto, a invenção providencia uma molécula de anticorpo modificada que tem especificidade para o antigeno CD52 reconhecido pelo anticorpo de ratinho CAMPATH-1G em que um ou mais aminoácidos na região variável do anticorpo CAMPATH-1G é substituído para reduzir o reconhecimento dos péptidos derivados desta região pela classe II do CMH. Implícita nos termos "anticorpo anti-CD52" e "anticorpo CAMPATH", quando aplicados a anticorpos modificados da presente invenção, é uma capacidade para tais anticorpos modificados reterem uma capacidade de ligação ao CD52. Assim, o primeiro aspeto da presente invenção é um anticorpo de acordo com a reivindicação 1. Modalidades desse aspeto da invenção abrangem o anticorpo de qualquer das reivindicações 2, 3, ou 4. Em conformidade, numa modalidade a cadeia pesada do anticorpo anti-CD52 compreende, ainda, um domínio de região constante IgGl humano e a cadeia leve compreende, ainda, um domínio de região constante kappa humano (reivindicação 2).

Quadro 1 - Substituições dentro de epítopos de células T potenciais na cadeia pesada variável de CAMPATH-1G (SEQ. ID N.2 i)

Resíduo VH # Resíduo WT Substituição 3 K Q 5 L ACBZGHKPRST 12 V BEHKPQRST 13 Q AFHKNPQRST 15 G D Η P Q R S T 10

17 S G M P W 18 Μ A G P L 19 R A C F G I L M P V W Y 20 L A C F G H I K B M z P R S T V W Y 21 S P 23 A B Z G H K P R S T 25 S F G L P W Y 26 G B Z H K P R S T W Y 31 D A F G I M P V W Y 33 Y A G M P 35 N P 36 W A D E G H K N P Q R S T 37 I V 38 R F H P Y 40 P A 41 A B Z H K P R S T w 42 G I P T Y 44 A G H N P Q S T W Y 45 P L 48 L V I 71 T F L P W Y 72 I D E H K N P Q R s T 73 S A G P 74 R A F G I M P w Y 76 N A G M P W Y 77 T A H I P S 78 Q K 79 N A F G I M P V w Y 80 M A D E G H K N P Q R T S 82 Y A D E G H K N P Q R S T 84 Q A F G I L M P V w Y 85 M A D E G H K N P Q R S T 87 T S 8 L D E G H K N P Q R S T

11 89 R F P W Y 90 A B Z H K P R s T w Y 91 E P 92 D A F G I L M P V w Y 95 T V 109 D A F G I L M P V w Y 111 W A D E G H K N P Q R S T 114 G H P S T 115 V T 116 M L F I P T V W Y 117 V A F G I M P W Y

Quadro 2 - Substituições dentro de epitopos de células T potenciais na cadeia leve do CAMPATH-1G (SEQ. ID N.2 2)

Resíduo VK # Resíduo WT Substituição 3 K Q 10 F ABZGHKPRST 15 V A G Η P 17 D P 19 V P W 21 L P I 22 N T 24 K R 33 L ABZGHKPRST 40 L BZGHKPRST 42 E K 43 S A 46 L S 56 T AFGIMPSWY 58 I A G Μ P V 60 S AFGIMPWY 61 R P 63 S F L P W Y 64 G BZHKPRST 78 L BZGHKPRST 83 V ABZGHIKPRST 87 F Y 12

Por outras palavras, a invenção providencia anticorpos monoclonais variantes com um número reduzido de epítopos de células T potenciais, as ditas variantes compreendendo uma combinação da cadeia pesada da região V compreendendo uma sequência selecionada a partir das SEQ. ID N.° 3, 4, 6, e 7 e cadeia leve das regiões V compreendendo uma sequência selecionada a partir das SEQ. ID N.° 8 a 12. Numa modalidade o anticorpo anti-CD52 ainda compreende um domínio da região constante IgGl humano e um domínio da região constante kappa humano. Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-CD52 compreendendo uma região constante IgGl humana e uma região constante kappa humana compreende a cadeia pesada da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 4 e a cadeia leve da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 12, ou a cadeia pesada da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 7 e a cadeia leve da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 12, ou a cadeia pesada da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 7 e a cadeia leve da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 10, ou a cadeia pesada da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 3 e a cadeia leve da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 10, ou a cadeia pesada da região V compreendendo a SEQ. ID N.° 6 e a cadeia leve da região V compreendendo a SEQ. ID N.0 10 .

Um outro aspeto da presente invenção é uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 5.

Um outro aspeto da presente invenção é um vetor de expressão como definido nas reivindicações 8 e 11. Modalidades preferidas dos vetores de expressão são definidas nas reivindicações dependentes. Um exemplo de um vetor de expressão adequado para uma cadeia pesada da presente invenção é apresentado na Figura 1 e um exemplo de um vetor de expressão adequado para uma cadeia leve da presente invenção é apresentado na Figura 2. Um outro aspeto da presente invenção é uma célula cultivada como 13 definido na reivindicação 14. Um aspeto adicional da presente invenção é um método para preparar uma imunoglobulina, como ainda definido pela reivindicação 15. Outros aspetos da presente invenção são o uso dos anticorpos para fabricar um produto farmacêutico para tratar malignidades linfoides (incluindo leucemia ou linfoma) ou condições patológicas auto-imunes. A condição patológica auto-imune inclui esclerose múltipla, artrite reumatóide, vasculites sistémicas, uveites, doença inflamatória intestinal ou esclerodermia. Um outro aspeto da presente invenção é o uso dos anticorpos para fabricar um produto farmacêutico para imunossuprimir um paciente antes de ou subsequente a uma transplantação de um orgão. Em algumas modalidades, a transplantação de um órgão é um transplante renal. A referência a "substancialmente não-imunogénico" ou "potencial imunogénico reduzido" inclui imunogenicidade reduzida comparada com um anticorpo parental, isto é, um anticorpo monoclonal quimérico ou de roedor (regiões V de roedor; regiões constantes humanas) não modificado ou o anticorpo monoclonal CAMPATH-1H humanizado. 0 termo "imunogenicidade" inclui uma capacidade para provocar, induzir ou, senão, facilitar uma resposta humoral ou mediada pela célula T num animal hospedeiro e, em particular, em que o "animal hospedeiro" é um humano ou a capacidade para despoletar uma resposta num ensaio in vitro adequado, por exemplo, o ensaio célula dendritica/célula T descrito aqui.

Uma caracteristica preferida dos anticorpos modificados da presente é que eles retêm substancialmente as actividades funcionais do anticorpo não modificado ou "parental" CAMPATH-1G ou do anticorpo CAMPATH-1H humanizado. Assim, modalidades da invenção abrangem anticorpos modificados nos quais são exibidas uma ou mais das caracteristicas técnicas benéficas associadas com a 14 eficácia terapêutica do CAMPATH-1H ou do anticorpo parental não modificado. Tais anticorpos modificados são úteis num número de doenças importantes no homem incluindo especialmente malignidades linfoides tais como leucemia e linfoma, condições patológicas auto-imunes incluindo, mas não limitadas a, esclerose múltipla, artrite reumatóide, vasculites sistémicas, uveites, doença inflamatória intestinal e esclerodermia e também para uso em transplantações.

Em conformidade, o anticorpo modificado da presente exibe uma capacidade para ligar ao CD52 e em modalidades preferidas a afinidade para o seu antigeno CD52 alvo está dentro de uma ordem de grandeza maior ou menor do que a afinidade exibida pelo anticorpo monoclonal CAMPATH-1H.

Acredita-se que a eficácia terapêutica da molécula parental é também mediada pela capacidade do anticorpo em induzir citotoxicidade mediada pela célula dependente do anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Os fenómenos de ADCC e CDC são mediados pelo domínio da região constante da cadeia pesada de todas as moléculas do anticorpo, e a presente invenção contempla a produção de todas as moléculas do anticorpo compreendendo um domínio da região constante compatível com a indução de ADCC e CDC. Em modalidades preferidas, o anticorpo modificado compreende uma região constante IgGl humana e um domínio da região constante kappa humano.

Por "anticorpo" entende-se uma proteína da família da imunoglobulina que é capaz de combinar, interagir ou, senão, associar-se com um antigeno. 0 termo "antigeno" é usado aqui para se referir a uma substância que é capaz de interagir com o anticorpo e no contexto da presente invenção pretende-se que seja CD52. 0 termo "imunoglobulina" é usado aqui para se referir a uma proteína que consiste em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. 15

Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante κ, λ, α, γ (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), σ, ε e μ e, na natureza, múltiplos genes da região variável da imunoglobulina. Uma forma natural da imunoglobulina é um tetrâmero gue compreende dois pares idênticos no gual cada par tem uma cadeia leve e uma cadeia pesada. Em cada par as regiões variáveis da cadeia leve e pesada juntas providenciam a superfície de ligação capaz de interagir com o antígeno. 0 termo Vh é usado aqui para se referir à região variável da cadeia pesada, e o termo Vk é usado aqui para se referir à região variável da cadeia leve e, neste momento, em comum com numerosos anticorpos monoclonais a cadeia leve é uma cadeia de tipo "kappa" (k).

Como usado aqui, Vh sinifica um polipeptídeo que tem cerca de 110 a 125 resíduos de aminoácidos em comprimento, a sequência do qual corresponde a qualquer das cadeias Vh especificadas aqui que, em combinação com um Vk, são capazes de ligar ao antígeno CD52. De forma análoga, Vk significa um polipeptídeo que tem cerca de 95-130 resíduos de aminoácidos em comprimento, a sequência do qual corresponde a qualquer das cadeias Vk especificadas aqui que, em combinação com um Vh, são capazes de ligar ao antígeno CD52. Cadeias pesadas de imunoglobulina inteiras têm um peso molecular de cerca de 50 kDa e são codificadas por um gene Vh no N-terminal e um dos genes da região constante (por exemplo γ) no C-terminal. De forma análoga, as cadeias leves inteiras têm um peso molecular de cerca de 25 kDa e são codificadas por um gene da região V no N-terminal e um gene da região constante κ ou λ no C-terminal.

Além do anticorpo inteiro (tetrâmeros), as imunoglobulinas podem existir num número de outras formas derivadas por aplicação de técnicas de ADN recombinante ou bioquímica de proteínas. Estas formas incluem, por exemplo, moléculas Fv, Fab, Fab' e (Fab) 2 e poderiam conter todas 16 quaisquer das sequências Vh ou Vk da presente invenção. Um exemplo adcional pode incluir um anticorpo "bi-especifico" que compreende uma combinação Vh/Vk da presente invenção em combinação com uma segunda combinação Vh/Vk com uma especificidade antigeno diferente. 0 termo "epítopo de célula T potencial" significa, de acordo com o entendimento desta invenção, uma sequência de aminoácidos que tem potencial para se ligar à classe II do CMH. Tais sequências podem estimular as células T e/ou ligar (sem necessariamente ativar mensuravelmente) células T em complexo com classe II do CMH. 0 termo "péptido" como usado aqui e nas reivindicações em anexo é um composto que inclui dois ou mais aminoácidos. Os aminoácidos são ligados uns aos outros por uma ligação peptidica (definida aqui abaixo). Existem 20 aminoácidos diferentes que ocorrem naturalmente envolvidos na produção biológica de péptidos, e qualquer número deles pode ser ligado em qualquer ordem para formar uma cadeia ou anel peptidico. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente empregues na produção biológica de péptidos todos têm a configuração L. Péptidos sintéticos podem ser preparados empregando métodos sintéticos convencionais, utilizando L-aminoácidos, D-aminoácidos, ou várias combinações de aminoácidos das duas configurações diferentes. Alguns péptidos contêm apenas umas poucas unidades de aminoácidos. Péptidos curtos, por exemplo, com menos do que dez unidades de aminoácidos, são por vezes referidos como "oligopeptídeos". Outros péptidos contêm um grande número de resíduos de aminoácidos, por exemplo, até 100 ou mais, e são referidos como "polipeptídeos". Por convenção, um "polipeptídeo" pode ser considerado como qualquer cadeia peptidica contendo três ou mais aminoácidos, enquanto um "oligopeptídeo" é normalmente considerado como um tipo particular de polipeptídeo "curto". Assim, como usado aqui, entende-se que qualquer referência a um "polipeptídeo" 17 também inclui um oligopeptideo. Além disso, qualquer referência a um "péptido" inclui polipeptídeos, oligopeptídeos, e proteínas. Cada arranjo diferente de aminoácidos forma diferentes polipeptídeos ou proteínas. 0 número de polipeptídeos - e portanto o número de diferentes proteínas - que pode ser formado é praticamente ilimitado. 0 método geral que conduz aos anticorpos modificados anti-CD52 da presente invenção compreende as etapas seguintes: (a) Determinar a sequência de aminoácidos do polipeptideo ou parte do mesmo. (b) Identificar um ou mais epítopos de células T potenciais dentro da sequência de aminoácidos da proteína por qualquer método incluindo a determinação da ligação dos péptidos às moléculas do CMH usando técnicas in vitro ou in silico ou ensaios biológicos. (c) Desenhar novas variantes da sequência com um ou mais aminoácidos dentro dos epítopos de células T potenciais identificados, modificados de tal maneira que reduzem ou eliminam substancialmente a ligação dos péptidos às moléculas do CMH medidas por técnicas in vitro ou in silico ou ensaios biológicos. Tais variantes da sequência são criadas de tal maneira que evitam a criação de novos epítopos de células T potenciais pelas variações da sequência, a menos que tais novos epítopos de célula T potenciais sejam, por sua vez, modificados de tal maneira que reduzem ou eliminam substancialmente a ligação dos péptidos às moléculas classe II do CMH.

(d) Contruir tais variantes da sequência por técnicas de ADN recombinante e testando as ditas variantes de forma a identificar uma ou mais variantes com propriedades desejáveis. A identificação dos epítopos de células T potenciais, de acordo com a etapa (b) , pode ser realizada de acordo com métodos descritos previamente na arte. Métodos adequados são revelados em WO 98/59244; WO 18 00/34317; Pedido U.S. 20030153043.

Na prática, um número de anticorpos anti-CD52 variantes podem ser produzidos e testados para a caracteristica funcional e imune desejada. É particularmente importante quando se conduzem alterações à sequência proteica que as modificações contempladas não introduzam novos epítopos imunogénicos. Este evento é evitado na prática re-testando a sequência contemplada para a presença de epítopos e/ou de ligandos da classe II do CMH usando qualquer meio adequado.

Em várias modalidades, os anticorpos modificados da presente invenção são gerados por expressão de diferentes combinações dos genes Vh e Vk especificados aqui. Todas estas combinações de cadeia leve e pesada são abrangidas pela presente invenção. A invenção relaciona-se com um anticorpo anti-CD52 no qual foram realizadas substituições de, pelo menos, um resíduo de aminoácidos em posições dentro das regiões V da molécula que resultam na eliminação de um ou mais epítopos de célula T potenciais da proteína. É mais preferido providenciar moléculas do anticorpo modificado nas quais a modificação dos aminoácidos (por exemplo, uma substituição) é conduzida dentro das regiões mais imunogénicas da molécula parental. As várias modalidades da presente invenção compreendem moléculas do anticorpo modificado para as quais quaisquer ligandos da classe II do CMH são alterados de maneira a eliminar a ligação, ou senão, reduzir os números de alotipos do CMH nos quais o péptido pode ligar. Os inventores descobriram e revelam aqui, as regiões imunogénicas da molécula do anticorpo CAMPATH no homem. Entende-se que, em determinadas circunstâncias, regiões adicionais da sequência para aqueles revelados aqui podem tornar-se epítopos imunogénicos, por exemplo, na eventualidade de infecção com um patógeno que expressa uma proteína ou péptido com uma sequência semelhante à do caso 19 presente . A remoção do epítopo da classe II do CMH envolveu substituição de aminoácidos para criar variantes modificadas diminuídas em epítopos de células T potenciais. As substituições de aminoácidos foram realizadas em pontos apropriados dentro da sequência peptídica prevista para conseguir uma redução substancial ou eliminação da atividade do epítopo de célula T potencial indesejado. A este respeito, exemplos de substituições particularmente úteis são providenciados nos Quadros 1 e 2, em que o Quadro 1 relaciona-se com as substituições na região Vh e o Quadro 2 relaciona-se com as substituições na região Vk.

Como será evidente para alguém habilitado na arte, múltiplos conjuntos alternativos de substituições podem ser alcançados com os quais se atinge o objetivo de remover os epítopos indesejados. As sequências resultantes permaneceriam, contudo, largamente homólogas com as composições específicas reveladas aqui. Seria típico conseguir sequências que são cerca de 70%, or cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 99% ou mais homólogas com as sequências especificadas presentes ao longo da sua região menos homóloga e, ainda assim, permanecerem operacionalmente equivalentes. Entende-se que substituições únicas de aminoácidos dentro de um determinado epítopo de célula T potencial são a via mais preferida através da qual o epítopo pode ser eliminado. Podem ser contempladas combinações de substituição dentro de um único epítopo e, por exemplo, podem ser particularmente apropriadas onde epítopos individualmente definidos estão em sobreposição uns com os outros. Além disso, as substituições de aminoácidos, seja individualmente dentro de um determinado epítopo ou em combinação dentro de um único epítopo, podem ser realizadas em posições não equiparando-se aos "resíduos dos bolsos" com respeito ao sulco de ligação da classe II do CMH, mas em qualquer ponto dentro da sequência 20 peptídica.

Tanto quanto ao que esta invenção se refere com respeito aos anticorpos anti-CD52, a invenção contempla o uso e qeração de fragmentos de anticorpo incluindo fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2. Tais fragmentos podem ser preparados usando métodos padronizados [por exemplo; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons 1991-1997] . A presente invenção também contempla as várias formas recombinantes de espécies moleculares derivadas do anticorpo bem conhecidas na arte. Tais espécies incluem fragmentos estabilizados de Fv incluindo formas de cadeia simples de Fv (por exemplo, scFv) compreendendo um adaptador de péptido que junta os domínios Vh e Vk, ou um Fv estabilizado por ligação dissulfureto entre cadeias (dsFv) que contém resíduos de cisteína adicionais fabricados por engenharia para facilitar a conjunção dos domínios do Vh e Vk. Da mesma maneira, outras composições são familiares na arte e podem incluir espécies referidas como "minicorpos"; e domínio variável único "dAbs." Outras espécies ainda podem incorporar meios para aumentar a valência do domínio da região V do anticorpo modificado, isto é, espécies que têm múltiplos locais de ligação ao antígeno, por exemplo, pelo fabrico por engenharia de domínios de dimerização (por exemplo, "zipper de leucina") ou também estratégias de modificação química.

Sob o esquema da presente invenção são providenciadas um número de sequências diferentes da região V da cadeia H e da região V da cadeia L. A presente revelação não providencia qualquer limite às combinações possíveis de cadeia H e cadeia L que podem ser providenciadas para constituir uma molécula de anticorpo completa. A constituição da molécula de anticorpo completa pode ser conseguida através de técnicas de ADN recombinante e métodos para purificar e manipular moléculas de anticorpo bem conhecidos na arte. As técnicas necessárias estão 21 explicadas extensivamente na literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," segunda edição (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, editor, 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, editor, 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, editores); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, editores, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., editores, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction," (Mullis et al., editores, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan et al., editores, 1991).

As moléculas preferidas desta invenção podem ser preparadas em qualquer uma de várias maneiras mas é preferencialmente conduzida explorando métodos recombinantes de rotina. Trata-se de um procedimento relativamente hábil usar as sequências de proteína e informação providenciada aqui para deduzir um polinucleotideo (ADN) que codifica qualquer das regiões V preferidas do anticorpo. Isto pode ser conseguido, por exemplo, usando ferramentas de programas informáticos tais como o DNAstar software suite [DNAstar Inc, Madison, WI, USA] ou similares. Qualquer das sequências de ADN com a capacidade de codificar os polipeptideos preferidos da presente invenção ou homólogos significativos dos mesmos deveriam ser úteis de acordo com esta invenção.

Como esquema geral, qualquer dos genes da cadeia Vh ou Vk pode ser fabricado usando a síntese de genes e clonados num vetor de expressão adequado. Por sua vez, o vetor de expressão é introduzido numa célula hospedeira e as células selecionadas e cultivadas. As moléculas do anticorpo são prontamente purificadas a partir do meio de cultura e formuladas numa preparação adequada para administração terapêutica. A título de exemplo, um tal esquema envolve um 22 processo de síntese de genes usando painéis de oligonucleotídeos sintéticos. Os genes são montados usando uma reação em cadeia da ligase (LCR) em que aos oligonucleotídeos que compõem os terminais complementares é-lhes permitido hibridar seguido de amplificação e preenchimento usando uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) . A PCR é dirigida por adição de uma concentração aumentada dos oligonucleotídeos dos flancos para atuarem como primers. Os produtos da PCR são reunidos em genes completos de anticorpo através de outra PCR dos vetores contendo regiões 5' e 3' dos flancos do gene da imunoglobulina e subclonagem nos vetores de expressão para expressão do anticorpo inteiro. Os genes Vh e Vk montados podem servir como moldes para a mutagénese e construção de múltiplas sequências variantes de anticorpo tais como quaisquer das que são reveladas aqui. É particularmente conveniente usar a estratégia de "PCR por sobreposição-extensão" como descrito por Higuchi et al. [1988, Nucleic

Acids Res. 16: 7351], apesar de outras metodologias e sistemas poderem ser prontamente aplicados.

Genes inteiros de imunoglobulina contendo cassetes da região variável são montados de forma mais conveniente usando PCR de sobreposição e subclonados em vetores de expressão que contêm os domínios da região constante da imunoglobulina desejada. Os vetores de expressão podem ser introduzidos numa célula hospedeira de mamífero ou outra, por exemplo, usando técnicas de electroporação. A linha de células NSO é um mieloma de ratinho que produz uma não imunoglobulina, obtido a partir da Coleção Europeia de Culturas de Células Animais (ECACC) e é um exemplo particularmente adequado de linha de células hospedeiras para este procedimento. As linhas de células que secretam anticorpo são expandidas e o anticorpo pode ser prontamente purificado, por exemplo, através do uso de cromatografia de afinidade com proteína A [Harlow & Lane, ibidem]. A 23 concentração do anticorpo purificado pode ser determinada usando um ensaio imunosorvente ligado a enzimas (ELISA) que deteta a região constante kappa humano dos anticorpos de interesse. São também concebíveis métodos para tratamento terapêutico de seres humanos usando as composições do anticorpo modificado. Para administração a um indivíduo, quaisquer das composições do anticorpo modificado seriam produzidas para ser preferencialmente, pelo menos, 80% puras e livres de pirogénios e outros contaminantes. É ainda entendido que as composições terapêuticas das proteínas do anticorpo modificado podem ser usadas em conjunção com um excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são preparadas convencionalmente, compreendendo substâncias que são usadas habitualmente em produtos farmacêuticos, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, (Alfonso R. Gennaro, ed., 18a edição, 1990), incluindo excipientes, veículos, adjuvantes, e tampões. As composições podem ser administradas, por exemplo, por via parenteral, enteral, intramuscular, subcutânea, intravenosa, ou por outras vias úteis para atingir um efeito. Por exemplo: anticorpos anti-CD52 podem ser dados via intravenosa (Cloes et al. (1999) Ann. Neurol., 46:296-304; Moreau et al. (1996) Multiple Sclerosis, 1:357-65; Moreau et al. (1994) Lancet, 344:298-301) e subcutânea (Schnitzer et al. (1997) J. Rheumatol., 24:1031-6; Bowen et al. (1997) Br. J. Hematol., 96:617-9). Os excipientes convencionais incluem substâncias de veículos orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequadas para administração parenteral, enteral, e por outras vias, que não reajam de forma deletéria com os agentes. Para aplicação parenteral, são particularmente adequadas as soluções estéreis injetáveis, preferencialmente soluções aquosas e oleosas, bem como suspensões, emulsões ou implantes, incluindo supositórios.

As ampolas são dosagens unitárias convenientes. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com estabilizadores, agentes tensoativos, emulsificadores, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, ou outras substâncias gue não reajam de forma deletéria com os compostos ativos.

Em tais métodos de tratamento, a dosagem real dos anticorpos anti-CD52 da presente invenção empregue dependerá de uma variedade de fatores incluindo o tipo e severidade da disfunção a ser tratada, e de outras modalidade ou modalidades do tratamento selecionadas. Um guia para os regimes de dosagem é obtido a partir da dosagem de CAMPATH-1H conhecida na arte.

EXEMPLOS EXPERIMENTAIS EXEMPLO 1 - Construção dos genes VH e VK do anticorpo anti-CD52 . A sequência do anticorpo anti-CD52 de ratinho foi derivada a partir das entradas da base de dados RNIGHCC1G para a cadeia pesada de domínio variável (VH), e RNIGKCC1G para a cadeia leve de domínio variável (VK) . As sequências foram ligeiramente modificadas para remover os locais internos HindIII e BamRI sem alterar a sequência de aminoácidos. Os genes VH e VK foram feitos através da síntese de genes. Resumidamente, foi desenhado e sintetizado um painel de oligonucleotídeos sintéticos. Os genes foram montados usando uma reação em cadeia da ligase (LCR) em que aos oligonucleotídeos que compõem os terminais complementares é-lhes permitido hibridar seguido de amplificação e preenchimento usando uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) . A PCR é dirigida por adição de uma concentração aumentada dos oligonucleotídeos dos flancos para atuarem como primers. Os produtos da PCR são reunidos em genes completos de anticorpo através de outra PCR dos vetores contendo regiões 5' e 3' dos flancos do gene da imunoglobulina e sub-clonagem nos vetores de expressão para 25 expressão do anticorpo inteiro. Os genes VH e VK montados servem de moldes para a mutagénese e construção de múltiplas sequências de anticorpo variantes nas quais os epitopos de células T potenciais foram removidos.

Para a montagem do gene VH foram usados os oligonucleotídeos VH1 a VH20 detalhados no Quadro 3. Para a montagem do gene VK foram usados os oligonucleotídeos VK1 a VK20 detalhados no Quadro 4. Para ambos os genes, a LCR foi conduzida misturando 20μ1 de oligonucleotídeos fosforilados com 1 μΐ de Pfu ADN ligase (Stratagene, Amsterdam, NL), 10 μΐ de 10X tampão de reação (fornecido com enzima) e 69 μΐ de água. A mistura da reação foi colocada num termociclador para incubação a 95 °C durante 2 minutos segudo de 25 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, arrefecimento gradual para 50 °C, incubação a 50 °C durante 30 segundos, e 55 °C durante 20 minutos, seguido de uma incubação final de 3 horas a 55 °C. A análise de uma amostra da LCR usando electroforese em gel de agarose a 1% proporcionou um esfregaço com uma banda débil de tamanho correto pouco visível. Os oligonucleotídeos em todos os casos vieram da Sigma-Genosys (Pampisford, UK) e foram fosforilados in vitro usando quinase ADN T4 (Promega, Southampton, UK) e o protocolo recomendado pelo fabricante. Depois da LCR, foram transferidos 5 pL da reação para uma mistura de PCR para amplificar o fragmento montado. Os oligonucleotídeos VH1 e VH2 0 foram usados para dirigir a reação VH, com oligonucleotídeos VK1 e VK20 usados para dirigir a reação VK. A PCR foi conduzida num volume total de 50 μΐ durante 30 ciclos usando 1 μΐ de Pfu ADN polimerase (Stratagene, Amsterdam, NL) . A análise de uma amostra da PCR usando eletroforese em gel de agarose a 1% proporcionou uma banda de 380 pb para VH e 377 pb para VK.

As cassetes da região variável foram montadas usando PCR de sobreposição. Resumidamente, os ADN derivados dos vetores M13-VHPCR1 e M13-VKPCR1 [Orlandi et al. (1989), 26 PNAS, 89: 3833-7] foram usados como moldes para produzir dois fragmentos adicionais sobrepostos de PCR para cada cadeia VH e VK incluindo a sequência do flanco 5' que codifica o péptido sinal líder e a sequência do flanco 3' incluindo o local de união e as sequências de intrão. Os fragmentos de ADN produzidos para o VH e VK foram combinados numa PCR usando primers do flanco necessários para obter sequências de ADN inteiras. Os pares de primer usados nestas reações de "ligação" foram oligonucleotídeos VHVK5'CH0/VHVK3'SIG e VH19/VH12 para o gene VH, enquanto para o gene VK, foram usados os oligonucleotídeos VHVK5'CH0/VHVK3'SIG e VK19/VK3'CHO.

Após purificação usando um kit Qiagen PCR PREP (Crawley, UK) os produtos da PCR foram cortados com HindiII e BamHI (Promega, Southampton, UK) e corridos num gel de agarose a 1%. As bandas desejadas foram removidas e

purificadas usando um kit de extracção de ADN Qiagen (Crawley, UK) . Os produtos foram clonados num vetor pUC19 cortado com HindIII e BamHI e a sequência de ADN confirmada.

Quadro 3 - Oligonucleotídeos para síntese do gene VH.

Nome Sequência SEQ. ID N. 0 VH1 TCCACAGGTGTCCACTCCGA 141 VH2 CCAGATTCCAACAGTTTCACCTCGGAGTGGACACCTGTGGA 142 VH3 GGTGAAACTGTTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCC 143 VH4 GGAGAGTCTCATAGAACCCCCCGGCTGTACCAAGCCTCCT 144 VH5 GGGGGGTTCTATGAGACTCTCCTGTGCAGGTTCTGGATTCA 145 VH6 CAT GTAGAAAT CAGT GAAGGT GAAT C CAGAAC C T GCACA 146 VH7 CCTTCACTGATTTCTACATGAACTGGATTCGCCAGCCTGC 147 VH8 GCCACTCAGGTGCCTTCCCTGCAGGCTGGCGAATCCAGTT 148 VH9 AGGGAAGGCACC T GAGT GGC TGGGTTTTATT AGAGACAAA 149 VH10 TCTGTTGTGTAACCTTTAGCTTTGTCTCTAATAAAACCCA 150 27 VH11 GCTAAAGGTTACACAACAGAGTACAATCCATCTGTGAAGGGG 151 VH12 TCTGGAGATGGTGAACCGCCCCTTCACAGATGGATTGTAC 152 VH13 CGGTTCACCATCTCCAGAGATAATACCCAAAACATGCT 153 VH14 GGGTGTTCATTTGAAGATAGAGCATGTTTTGGGTATTATC 154 VH15 CTATCTTCAAATGAACACCCTAAGAGCTGAGGACACTGCC 155 VH16 TCTCTTGCACAGTAGTAAGTGGCAGTGTCCTCAGCTCTTA 156 VHl 7 ACTTACTACTGTGCAAGAGAGGGCCACACTGCTGCTCCTTTT 157 VH18 CTCCTTGGCCCCAGTAATCAAAAGGAGCAGCAGTGTGGCCC 158 VHl 9 GATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACCGTCTCCTCA 159 VH2 0 TGAGGAGACGGTGACCATGA 160 VHVK5'CHO GCATGTTGACCCTGACGCAAGCTTGCCGCCACCATGGG 161 VHVK3'SIG GGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGC 162 VHl 2 GCGATAGCTGGACTGAATGGATCCTATAAATCTCTG 163

Quadro 4 - Oligonucleotídeos para síntese do gene VK.

Nome Sequência SEQ. ID N. ° VK1 TCCACAGGTGTCCACTCCGAC 164 VK2 AGACTGGGTCATCTTGATGTCGGAGTGGACACCTGTGGA 165 VK3 ATCAAGATGACCCAGTCTCCCTCATTCCTGTCTGCATCTG 166 VK4 ATCAAGATGACCCAGTCTCCCTCATTCCTGTCTGCATCTG 167 VK5 T GGGAGACAGAGT CAC T C T CAACTGCAAAGCAAGTCAGAA 168 VK6 GTTTAAGTATTTGTCAATATTCTGACTTGCTTTGCAGTTG 169 VK7 TATTGACAAATACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTGGGA 170 VK8 TCAGGAGTTTGGGAGATTCTCCCAGCTTTTGCTGATACCA 171 VK9 GAATCTCCCAAACTCCTGATATATAATACAAACAATTTGC 172 vkio CCTTGATGGGATGCCCGTTTGCAAATTGTTTGTATTATATA 173 VKll AAACGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGG 174 VK12 GGTGAGTGTGAAATCAGTACCAGATCCACTGCCACTGAA 175 VK13 TACTGATTTCACACTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA 176 VK14 CAGAAATATGTGGCAACATCTTCAGGCTGCAGGCTGCTGAT 177 VK15 GATGTTGCCACATATTTCTGCTTGCAGCATATAAGTAGG 178 VK16 CCCAGTTCCAAACGTGCGCGGCCTACTTATATGCTGCAAG 179 VK17 CCGCGCACGTTTGGAACTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC 180 28 VK18 AAAGTTTAAATTCTACTCACGTTTCAGCTCCAGCTTGGT 181 VK19 GTGAGTAGAATTTAAACTTTGCTTCGTCGACTGGATCC 182 VK2 0 GGATCCAGTCGACGAAGC 183 VHVK5'CHO GCATGTTGACCCTGACGCAAGCTTGCCGCCACCATGGG 184 VHVK3'SIG GGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGC 185 VK3'CHO GCGATAGCTGGACTGAATGGATCCAGTCGACGAAGC 186

Os vetores de expressão das cadeias leve e pesada quiméricas foram construídos consistindo em regiões variáveis do anti-CD52 de ratinho ligadas às regiões constantes do IgGl humana [Takahashi et al. (1982) Cell 29: 671] ou κ [Heiter et al. (1980) Cell 22: 197]. Estes genes de anticorpo compostos foram depois transferidos para vetores de expressão para produção de anticorpo recombinante. Os genes do anticorpo estão sob o controlo do promotor precoce imediato do citomegalovírus humano. O vetor da cadeia pesada incui o gene dhfr e o vetor da cadeia leve o gene neo para seleção em células de mamíferos. A sequência de ADN foi confirmada como correta para o VH e VK nos vetores de expressão quiméricos. EXEMPLO 2 - Construção dos genes VH e VK de anticorpo modificado

Os genes VK e VH modificados foram construídos através de mutagénese por PCR usando as cassetes da região variável do anti-CD52 de ratinho geradas no Exemplo 1 como moldes. O Quadro 5 lista os oligonucleotídeos usados na produção dos genes VH modificados. As seguintes mutações são identificadas pelo número Kabat do resíduo com o número linear relacionando-se com a sequência de ácido polipeptídeo identificada respectivamente em parênteses. DIVHvl (polipeptídeo SEQ. ID N.° 3; polinucleotídeo SEQ. ID N. 0 71) incluídas as mutações K3Q (3) , M18L (18) , I37V (37), P40A (40) , A41P (41), A44G (44) , P45L (45) , L48V (48), T74S (77) , Q75K (78), M77T (80) , T82bS (87) , T89V (95), V107T (115) , M108L (116), . e os oligonucleotídeos 29

usados VHVK5'CHO, DIVH1, DIVH2, DIVH3, DIVH4, DIVH5, DIVH6, DIVH7, DIVH8, DIVH9, DIVH10, e VH12. DIVHv2 (polipeptídeo SEQ. ID N.° 4; polinucleotídeo SEQ. ID N.° 72) incluídas as mutações K3Q (3), M18L (18), A41P (41), L48I (48), T74S

(77), Q75K (78), M77T (80), T82bS (87), T89V (95), V107T (115), M108L (116), e os oligonucleotídeos usados VHVK5'CHO, DIVH1, DIVH2, DIVH3, DIVH4, DIVH5A, DIVH6A,

DIVH7, DIVH8, DIVH9, DIVH10, e VH12. DIVHv3 (polipeptídeo SEQ. ID N.° 5; polinucleotídeo SEQ. ID N.° 73) incluídas as mutações L5Q (5), L20I (20), A23S (23), A41P (41), A44G

(44), L48I (48), M77T (80), Y79H (82), M82A (85), T89V (95), V107T (115), M108T (106), e oligonucleotídeos usados VHVK5'CHO, DIVH11, DIVH12, DIVH13, DIVH14, DIVH15, DIVH16, DIVH17, DIVH18, DIVH19, DIVH20, e VH12. DIVHv4 (polipeptídeo SEQ. ID N.° 6; polinucleotídeo SEQ. ID N.° 74) incluídas as mutações K3Q (3), M18L (18), I37V (37),

P40A (40), A41P (41), A44G (44), P45L (45), L48V (48), T74A

(77) , Q75K (78), M77S (80), T82bS (87), T89V (95), V107T (115) , M108L (116), e oligonucleotídeos usados VHVK5'CHO,

DIVH1, DIVH2, DIVH3, DIVH4, DIVH5, DIVH6, DIVH7, DIVH8, DIVH9, DIVH10, DIVH21, DIVH22 e VH12. DIVHv5 (polipeptídeo SEQ. ID N.° 7; polinucleotídeo SEQ. ID N.° 75) incluídas as mutações K3Q (3), M18L (18), A41P (41), T74S (77), Q75K

(78) , M77T (80), T82bS (87), T89V (95), V107T (115), M108L (116) e oligonucleotídeos usados VHVK5'CHO, DIVH1, DIVH2, DIVH3, DIVH4, DIVH23, DIVH6A, DIVH7, DIVH8, DIVH9, DIVH10, e VH12.

Quadro 5 - Oligonucleotídeos usados na construção de VH' s anti-CD52 modificados.

Nome Sequência SEQ. ID N. 0 VHVK5'C HO GCATGTTGACCCTGACGCAAGCTTGCCGCCACCATGGG 187 DIVH1 CCACTCCGAGGTGCAACTGTTGGAATCTGG 188 30 30 DIVH2 CCAGATTCCAACAGTTGCACCTCGGAGTGG 189 DIVH3 AGCCGGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTG 190 DIVH4 CACAGGAGAGTCTCAGAGAACCCCCCGGCT 191 DIVH5 AGGGAAGGGACTTGAGTGGGTGGGTTTTATTAGAG 192 DIVH5A CGGGAAAGCACCTGAGTGGATTGGTTTTATTAGAG 193 DIVH6 CCACTCAAGTCCCTTCCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTTCATG 194 DIVH6A CCACTCAGGTGCTTTCCCGGGAGGCTGGCGAATCC 195 DIVH7 TCTTCAAATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTTTACTACTG 196 DIVH8 AGGGAGT T CAT T T GAAGATAGAGGGTGT T T T T GGAAT TAT C TC T GG 197 DIVH9 TGGGGCCAAGGAACACTGGTCACCGTCTCCTCAGG 198 DIVH10 GGAGACTGTGACCAGTGTTCCTTGGCCCCAG 199 DIVH11 TCCGAGGTGAAACTGCAGGAATCTGGAGGAGGC 200 DIVH12 CCAGATTCCTGCAGTTTCACCTCGGAGTGG 201 DIVH13 GGGGGTTCTATGAGAATCTCCTGTTCAGGTTCTGG 202 DIVH14 GAAC C T GAACAGGAGAT T C T CAT AGAACCC C C C GG 203 DIVH15 CGGGAAAGGACCTGAGTGGATTGGTTTTATTAGAG 204 DIVH16 CGGGAAAGGACCTGAGTGGATTGGTTTTATTAGAG 205 DIVH17 GCTAACACCCTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTTTACTACTG 206 DIVH18 CTCTTAGGGTGTTAGCTTGAAGATGGAGGGTGTTTTGGG 207 DIVH19 TGGGGCCAAGGAACTACCGTCACCGTCTCCTCAGG 208 DIVH20 GGAGACGGTGACGGTAGTTCCTTGGCCCCAG 209 DIVH21 GATAATGCCAAAAACTCCCTCTATCTTCAAATGAAC 210 DIVH22 ATAGAGGGAGTTTTTGGCATTATCTCTGGAGATGG 211 DIVH23 CGGGAAAGCACCTGAGTGGCTGGGTTTTATTAGAG 212 VHl 2 GCGATAGCTGGACTGAATGGATCCTATAAATCTCTG 213 O Quadro 6 lista os oligonucleotídeos usados na produção de VK's modificados. As seguintes mutações são identificadas pelos números Kabat dos residuos e são os mesmos que a numeração linear das sequências de polipeptídeos identificadas respetivamente. DIVKvl (polipeptídeo SEQ. ID N.° 8; polinucleotídeo SEQ. ID N.° e os 76) incluídas as mutações K3Q, FIOS, L21I, N22T, K24R, L40P, E42K, S43A, L46S, T56S, I58V, V83I, F87Y, 31 oligonucleotídeos usados VHVK5'CH0, DIVK1, DIVK2, DIVK3A, DIVK4A, DIVK5B, DIVK6, DIVK7, DIVK8A, DIVK9, DIVK10, e VK3' CHO. DIVKv2 (polipeptídeo SEQ. ID N.° 9; polinucleotídeo SEQ. ID N.° 77) incluídas as mutações K3Q, FIOS, L21I, N22T, L40P, E42K, S43A, I58V, V83I, F87Y, e os oligonucleotídeos usados VHVKSOHO, DIVK1, DIVK2, DIVK3, DIVK4, DIVK5, DIVK6, DIVK7, DIVK8, DIVK9, DIVK10, e VK3'CHO. DIVKv3 (polipeptídeo SEQ. ID N.° 10; polinucleotídeo SEQ. ID N.° 78) incluídas as mutações K3Q, FIOS, L21I, N22T, K24R, L40P, E42K, S43A, T56S, I58V, V83I, F87Y, e os oligonucleotídeos usados VHVK5'CHO, DIVK1, DINK2, DIVK3A, DIVK4A, DIVK5, DINK6, DIVK7, DIVK8A, DIVK9, DIVK10, e VK3'CHO. DIVKv4 (polipeptídeo SEQ. ID N.° 11; polinucleotídeo SEQ. ID N.° 79) incluídas as mutações K3Q, FIOS, L21I, N22T, L40P, E42K, S43A, L46S, I58V, V83I, F87Y, e os oligonucleotídeos usados VHVK5'CHO, DIVK1, DIVK2, DIVK3, DIVK4, DIVK5B, DIVK6, DIVK7, DIVK8, DIVK9, DIVK10, e VK3'CHO. DIVKv5 (polipeptídeo SEQ. ID N.° 12; polinucleotídeo SEQ. ID N.° 80) incluídas as mutações K3Q, FIOS, L21I, N22T, L40P, E42K, I58V, V83I, F87Y, e os oligonucleotídeos usados VHVK5'CHO, DIVK1, DIVK2, DIVK3, DIVK4, DIVK5A, DIVK6A, DIVK7, DIVK8, DIVK9, DIVK10, e VK3'CHO.

Quadro 6 - Oligonucleotídeos usados na construção de VK's anti-CD52 modificados.

Nome Sequência SEQ. ID N. 0 VHVK5'CHO GCATGTTGACCCTGACGCAAGCTTGCCGCCACCATGGG 214 DIVK1 ATGACCCAGTCTCCCTCATCCCTGTCTGCATC 215 DIVK2 ATGACCCAGTCTCCCTCATCCCTGTCTGCATC 216 DIVK3 CAGAGT CAC T AT CAC C T GCAAAGCAAGT CAGAAT 217 DIVK3A CAGAGT CAC T AT CAC C T GCAGAGCAAGT CAGAAT 218 DIVK4 ATTCTGACTTGCTTTGCAGGTGATAGTGACTCTGT 219 DIVK4A ATTCTGACTTGCTCTGCAGGTGATAGTGACTCTGT 220 DIVK5 CCCGGAAAAGCTCCCAAACTCCTGATATATAATAC 221 32 DIVK5A CCCGGAAAATCTCCCAAACTCCTGATATATAATAC 222 DIVK5B CCCGGAAAAGCTCCCAAATCCCTGATATATAATAC 223 DIVK6 TTTGGGAGCTTTTCCGGGCTTTTGCTGATACC 224 DIVK6A TTTGGGAG ATTTTCCGGGCTTTTGCTGATACC 225 DIVK7 CGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGG 226 DIVK8 GCCACTGAACCTTGATGGGACGCCCGTTTGC 227 DIVK8A CACTGAACCTTGATGGGACGCCAGATTGCAAATTG 228 DIVK9 GCCTGAAGATATTGCCACATATTACTGCTTGCAGC 229 DIVK10 TGCAAGCAGTAATATGTGGCAATATCTTCAGGCTG 230 VK3'CHO GCGATAGCTGGACTGAATGGATCCAGTCGACGAAGC 231

As cassetes de expressão do VH e VK modificadas produzidas foram clonadas como fragmentos HindiII para BamE.1 (ADN e sequências de aminoácidos para DIVHYvl DIVHvã estão representados na Figura 3 - Figura 7 e para DIVKvl - DIVKv5 estão representados na Figura 8 - Figura 12 respetivamente) no vetor plasmideo pUC19 e a sequência de ADN completa foi confirmada como correta para cada VH e VK modificado.

As cassetes de expressão do VH e VK modificadas foram ligadas às regiões contantes do IgGl humana (SEQ. ID N.° 139; Figura 13) [Takahashi et al. (1982) Cell 29: 671] e κ (SEQ. ID N.° 140; Figura 14) [Heiter et al. (1980) Cell 22: 197], respetivamente. Estes genes de anticorpo compostos foram depois transferidos para vetores de expressão para produção de anticorpo recombinante. Os genes do anticorpo estão sob o controlo do promotor precoce imediato do citomegalovirus humano. O vetor da cadeia pesada inclui o gene dhfr e o vetor da cadeia leve o gene neo para seleção em células de mamíferos. A sequência de ADN foi confirmada como correta para o VH e VK nos vetores de expressão. EXEMPLO 3 - Expressão, purificação e quantificação de anticorpos anti-CD52 A linha de células hospedeiras para a expressão do anticorpo foi a CHO dhFr -, obtida a partir da Coleção 33

Europeia de Culturas de Células Animais (ECACC N.° 94060607). Os vetores de expressão da cadeia leve e pesada foram co-transfetados em células CHO por electroporação. As colónias que expressaram os genes neo e dhfr foram selecionadas em meio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) sem nucleosideos, suplementado com 10% de soro fetal bovino dialisado e 400 pg/ml de geneticina (G-418 sulfato) (todos da Gibco, Paisley, UK) . Os clones das células transfetadas foram classificados para produção de anticorpo humano por ELISA para a IgG humana [Tempest et al. (1991) BioTechnology 9: 266]. As linhas de células que secretavam anticorpo foram expandidas e as maiores produtoras selecionadas e congeladas em azoto liquido. Os anticorpos anti-CD52 foram purificados usando Prosep®-A (Bioprocessing Ltd) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração foi determinada por ELISA para o anticorpo κ IgGl humano. O ensaio foi conduzido em placas com 96 poços e todas as determinações foram conduzidas em duplicado. Para o ensaio, as placas (Dynatech Immulon 2) foram revestidas usando 100 μΐ por poço de anticorpo κ anti-humano de ovelha (The Binding Site, Birmingham, UK) diluído a 1:250 em tampão de revestimento carbonato/bicarbonato com pH 9,6 (Sigma, Poole, UK) . O revestimento foi conduzido durante 1 hora a 37 °C e os poços lavados 3 vezes com PBST (PBS com 0,05% Tween 20). Os poços foram preenchidos com 100 pL de PBST e as diluições para o controlo e anticorpos teste foram realizadas. Os controlos negativos usam PBST apenas e nenhum anticorpo foi adicionado. O anticorpo padrão (proteína purificada do mieloma IgGl/κ humano, The Binding Site, UK) foi diluído para 2 microgramas por ml em PBST. Foram adicionados 100 pL para duplicar os poços na primeira coluna (dando uma concentração final de 1 pg/ml) e duplicando as diluições realizadas através da placa. As séries de diluições duplicadas foram também realizadas para 34 as preparações do anticorpo teste. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora e os poços lavados, tal como previamente. 0 anticorpo ligado foi detetado usando um reagente específico da cadeia IgG γ anti-humana de ovelha conjugado com peroxidase (The Binding Site, Birmingham, UK). Este anticorpo secundário foi diluído a 1:1000 em PBST e adicionados 100 μΐ a cada poço da placa. A placa foi incubada durante mais 1 hora à temperatura ambiente e lavada como previamente. A deteção foi feita com substrato o-fenileno-diamina (OPD) . Um comprimido (20 mg) de OPD (Sigma, Poole, UK) foi dissolvido em 45 ml de tampão de peroxidase (Sigma, Poole, UK) com 10 pL a 30% (w/w) de peróxido de hidrogénio (Sigma, Poole, UK) adicionados imediatamente antes do uso. Foram adicionados 100 pL de substrato por poço e incubados à temperatura ambiente durante cinco minutos ou como necessário. O desenvolvimento de cor foi detido adicionando 25 pL de 12,5% de H2S04 e os resultados a 492 nm. A concentração de anticorpo versus A492 foi ilustrada num gráfico e a concentração do anticorpo da amostra determinada por comparação com a curva padrão do anticorpo. EXEMPLO 4 - Teste dos anticorpos anti-CD52 modificados usando um ensaio de ligação A linha de células de célula T do linfoma humano HUT-78 é positiva ao CD52 e foi usada para avaliar a ligação dos anticorpos modificados da presente invenção. No presente exemplo, foram incubadas concentrações diferentes do anticorpo teste com as células e a quantidade de anticorpo de ligação foi avaliada após a incubação com um reagente repórter fluorescente. O repórter é medido usando um classificador de célula por ativação de fluorescência (FACS).

Resumidamente, para cada ensaio, foram incubadas 106 HUT-78 células com diluições em série do anticorpo teste e humanizado (CAMPATH-1H) e anticorpos anti-CD52 quiméricos 35 como controlos. As concentrações dos anticorpos em ng/ml foram: 40000, 20000, 10000, 5000, 2500, 1250, 625, 312,5, 156,25, 78,125, 39,06, 19,53 e 0. Todas as incubações foram realizadas numa placa com 96 poços num volume final de 100 μΐ de PBS/2% FBS.

As misturas de anticorpo e célula foram incubadas em gelo na escuridão durante 1 hora e lavadas duas vezes com 200 μΐ de PBS/2% FBS frio.

Para deteção, as células foram incubadas durante 1 hora em gelo com uma diluição de 1:1000 de domínio Fc d IgG anti-humano com FITC. Este reagente é um IgG anti-humano de cabra (específico de Fc) obtido da Sigma (Poole, UK) . As células foram lavadas como previamente e re-suspendidas em 100 μΐ de PBS/2% FBS e transferidas para tubos de 4 ml FACS (Becton Dickinson) contendo 900 μΐ de PBS/2% FBS/Iodeto de propídio (1:1000). As células foram analisadas usando um instrumento convencional Becton Dickenson FACS Calibur.

A ligação dos anticorpos controlo e teste foi determinada usando o valor de fluorescência mediano. A concentração de saturação do anticorpo foi determinada a partir dos valores da fluorescência medianos fluorescência mediana do anticorpo zero versus concentração do anticorpo. As curvas de ligação foram ajustadas a uma equação logística sigmoidal com 4 parâmetros usando o SigmaPlot, dando um ajuste excelente com intervalos de confiança a 95%. Os títulos, isto é, concentrações às quais 50% da ligação máxima ocorreu, são apresentados no Quadro 7. Os resultados indicam que muitos dos anticorpos da presente invenção apresentam uma ligação quase equivalente aos anticorpos CAMPATH-1G quimérico e CAMPATH-1H humanizado. 36

Quadro 7

Anticorpo Titulo (pg/ml) (concentração que deu 50% de ligação máxima) CAMPATH-1H humanizado 1,49, 1,44, 2,62, 2,99 CAMPATH-1G quimérico 1,03, 1,99, 2,55, 2,35, 4,20 DIVH1/DIVK1 2,99 DIVH1/DIVK2 1,66 DIVH1/DIVK3 1, 71 DIVH1/DIVK4 3,45 DIVH1/DIVK5 1,85 DIVH2/DIVK1 5,56 DIVH2/DIVK2 3, 70 DIVH2/DIVK3 3,89 DIVH2/DIVK4 6,21 DIVH2/DIVK5 1, 18 DIVH3/DIVK1 9,60 DIVH3/DIVK2 17, 79 DIVH3/DIVK3 >40, 0 DIVH3/DIVK4 8,63 DIVH3/DIVK5 3,30 DIVH4/DIVK1 4, 43 DIVH4/DIVK2 1,59 DIVH4/DIVK3 2,28 DIVH4/DIVK4 8,54 DIVH4/DIVK5 2,39 DIVH5/DIVK1 4, 01 DIVH5/DIVK2 2,45 DIVH5/DIVK3 2,55 DIVH5/DIVK4 4, 05 DIVH5/DIVK5 3,00 37 EXEMPLO 5 - Teste dos anticorpos anti-CD52 modificados usando um ensaio de competição

Foram conduzidos ensaios de ligação de competição usando os anticorpos modificados da presente invenção. Nestes ensaios os anticorpos teste foram avaliados pela sua capacidade em competir pela ligação ao CD52 contra o reagente do CAMPATH-1H humanizado. No presente exemplo, células HUT-78 são co-incubadas com uma quantidade sub-saturada de um CAMPATH-1H biotinilado e várias concentrações de anticorpo teste não rotulado de competição. A quantidade de anticorpo de referência biotinilado ligado às células foi determinada após incubação adicional com um repórter avidina-FITC e determinação por fluorescência usando um instrumento FACS como no Exemplo 4.

Resumidamente, para cada ensaio de competição, foram incubadas 106 HUT-78 células com 2 pg de CAMPATH-1H humano biotinilado. Tinham sido conduzidas previamente experiências piloto com o CAMPATH-1H biotinilado e CAMPATH-1H não rotulado para determinar a quantidade óptima de anticorpo biotinilado necessário para subsequente adição a cada ensaio.

Foram realizadas diluições em série dos anticorpos teste e controlo em placas com 96 poços num volume final de 100 μΐ de PBS/2% FBS. Os anticorpos teste foram utilizados a 0, 0, 1, 0, 5, 1,0, 5, 0, 10, 0, 50,0, 100, 500, e 1000 pg/106 células.

As misturas de anticorpo e célula foram incubadas em gelo na escuridão durante 1 hora e lavadas duas vezes com 200 μΐ de PBS/2% FBS gelado. O anticorpo ligado biotinilado foi detetado por incubação com uma diluição de 1:200 de um reagente avidina-FITC (Sigma, Poole, UK). A incubação decorreu durante 1 hora em gelo seguida de dois ciclos de lavagem como previamente. As células foram re-suspendidas em 100 μΐ de PBS/2% FBS e transferidas para tubos de 4 ml 38 contendo 900 μΐ de PBS/2% FBS/Iodeto de propídio (diluído a 1:1000). As células foram analisadas usando um instrumento Becton Dickenson FACS Calibur. A ligação dos anticorpos teste e controlo foi expressa como uma percentagem de inibição relativa à máxima ligação do controlo rotulado com biotina. O valor de percentagem de inibição foi determinado como a seguir: X100 Ψ Inibição - c^u'as reti^as sem competidor - % de células retidas com competidor] [% de células retidas sem competidor]

As curvas de ligação foram ajustadas a uma equação logística sigmoidal com 4 parâmetros usando o SigmaPlot, dando um ajuste excelente com intervalos de confiança a 95%. Os valores EC5o foram calculados e são apresentados no Quadro 8. Os resultados indicam que os anticorpos da presente invenção ligam ao CD52 e células HUT-78 com eficiência equivalente aos anticorpos CAMPATH-1G quimérico -1H humanizado. Quadro 8 Anticorpo EC50 CAMPATH-1H humanizado 1,13, 1,43, 1,00 CAMPATH-1G quimérico 1, 00, 2, 02, 0, 87 DIVH1/DIVK2 2,15, 2,84 DIVH1/DIVK3 0,93, 2,20 DIVH1/DIVK5 1,95, 2,75 DIVH2/DIVK5 O 1—1 Oh r- 0 DIVH4/DIVK2 1,25, 2,05 DIVH4/DIVK3 2,19, 2,40 DIVH4/DIVK5 2,20 DIVH5/DIVK1 2,05 DIVH5/DIVK2 2,25, 1,65 DIVH5/DIVK3 1,97, 1,10 DIVH5/DIVK5 1,39, 2,43 39

EXEMPLO 6 - Análise da imunogenicidade da Célula T O anticorpo modificado CAMPATH-1G DIVHv2/DIVKv5 foi preparado a partir da linha de células CHO CAMPATH-1G DIVH2/DIVK5 crescidas em meio livre de componente animal livre de proteína CHO (Sigma Cat No: G7513) suplementado com L-glutamina e Antibiótico-Antimicótico (Gibco/Invitrogen Cat N.° 15240-062). O anticorpo foi purificado por cromatografia PROSEP-A (Millipore) , eluída com 0,1 M de glicina pH 3,0, neutralizada e dialisada contra salina tamponada com fosfato (PBS), e finalmente esterilizada por filtração.

Ambos controlos do anticorpo modificado DIVH2/DIVK5 e do CAMPATH humanizado foram sujeitos a uma purificação em duas fases usando permuta de catiões e cromatografia de exclusão por tamanho. Após a permuta do tampão em 50 mM MES pH 6 num Sephadex G25 (coluna PD10), a proteína foi passada através de uma coluna de permuta de catiões (Mono-S 10/10) e eluída com um gradiente de cloreto de sódio (0 a 0,5 M). A proteína eluída contendo frações foram depois aplicadas a uma coluna preparativa Superdex 200 (XK16/60) corrida em PBS. As frações dos picos foram retiradas e armazenadas a 4 °C. As concentrações de anticorpo foram determinadas por ELISA para o IgG humano.

Experimental: Suspeitou-se que o anticorpo anti-CD52 CAMPATH seria, ele próprio, inibitório para as células T, e interferiria com a análise de imunogenicidade no ensaio padrão de célula T. Foram realizadas experiências preliminares para testar o efeito do anticorpo anti-CD52 CAMPATH nas células T. Foram preparados PBMC a partir de sangue de três dadores saudáveis normais. Estes foram incubados com CAMPATH-1H humanizado (fornecido por Ilex) isolado, hemocianina de lapa californiana (KLH) isolada, KLH e anticorpo CAMPATH-1H em conjunto e controlo não tratado. Os resultados mostraram que existe uma inibição completa da resposta ao controlo do antígeno KLH, em todos 40 os três dadores, devido ao efeito do anticorpo nas células T.

De modo a analisar a imunogenicidade do anticorpo anti-CD52 intato, foi usado um protocolo de ensaio de célula T mais complexo em que as células dendriticas (DC) foram carregadas com todo o anticorpo anti-CD52 e o antigeno exógeno (não processado) foi removido lavando antes da adição de células T autólogas. Desta forma, o efeito inibitório do anti-CD52 foi evitado e foram conseguidas respostas normais ao KLH. Um total de 10 dadores saudáveis foram usados neste protocolo alternativo usando CAMPATH-1H humanizado como um antigeno controlo teste.

Resumidamente, PBMC foram usados como uma fonte de monocitos, que foram isolados por aderência ao plástico da cultura de tecido (>90% CD14 + ) . Os monocitos foram cultivados em meio AIM V (Gibco) com 3% de soro AB humano desativado aquecido (Autogen Bioclear) (meio de crescimento) a uma densidade aproximada de 1 x 106 por poço (placa com 24 poços) . Para induzir um fenotipo tipo APC (CD40 + , CD80hi, CD83hl, CD86hl, MHC class IIhi) os monocitos foram incubados em meio de crescimento contendo IL-4 humano (Peprotech) e GM-CSF (Peprotech) durante 4 dias. No dia 4, foi adicionado 50 pg/ml do antigeno teste (anticorpo CAMPATH-1H humanizado ou anticorpo CAMPATH-1G DIVHv2/DIVKv5 modifcado). Os poços controlo receberam apenas meio. Após 24 horas o meio de crescimento e antigeno foram removidos e os poços lavados uma vez antes de adicionar meio de crescimento fresco contendo TNFa (Peprotech), GM-CSF e IL-4 durante 4 dias. Depois ambas células dendriticas aderentes e não aderentes (DC's) foram colhidas e contadas. As DC's foram distribuídas a 1 x 104 por poço de placas de fundo redondo com 96 poços, em cultivos sextuplicados por tratamento (anticorpo ou controlo de CAMPATH-1H humanizado ou CAMPATH-1G DIVHv2/DIVKv5 modificado) por dador. As DC 41 foram irradiadas com gamma com 4000 rads antes de adicionar as células T CD4+ autólogas gue foram isoladas negativamente do PBMC (kit de isolamento negativo Dynal CD4+ Humano) a 1 x 105 por poço. As placas foram incubadas durante 7 dias e a proliferação foi medida por incorporação de timidina tritiada (um pulso de 6 horas com 3H-Timidina a lpCi/poço). Estes dados são expressos como um indice de estimulação em que: , _ CPM do antígeno teste índice de Estimulação = - CPM do controlo não tratado

Um resultado positivo é definido por um indice de estimulação (SI) maior que 2. Os resultados preliminares (Figura 15) mostram que 2 de 10 destes dadores responderam ao CAMPATH-1H, um com um indice de estimulação muito alto.

Comparação do anticorpo CAMPATH-1H e DIVHv5/DIVKv2 modificado: Um painel de vinte dadores saudáveis foi selecionado com base numa tipagem HLA-DR (ver Quadro 9) para classificar os anticorpos humanizado e modificado em ensaios de célula T. Isto permitiu classificar os anticorpos contra mais de 80% dos alelos DR expressos na população mundial.

Quadro 9 - Haplotipos HLA DR do conjunto de 20 dadores saudáveis usados para testar a imunogenicidade de anticorpos CAMPATH humanizado e modificado. DADOR Alotipo 1 DRBl* 0 4, DRB4*01 2 DRBl* 03, DRBl* 04, DR4*01, DRB5 3 DRBl* 01, DRBl*13, DRB3 4 DRBl* 01, DRBl* 0 7, DRB4*01 5 DRBl*11 E DRBl*13 OU 14, DRB3 6 DRBl*03 E DRBl*08, 11 OU 13, DRB3 42 7 DRB1* 01, DRB1*11, DRB3 8 DRB1*10, DRB1*15, DRB5 9 DRB1* 0 4, DRbl*15, DRB4*01, DRB5 10 DRB1* 03, DRB1*15, DRB3, DRB5 11 DRB1*13, DRB1*16, DRB3, DRB5 12 DRB1* 03, DRB1* 0 7, DRB3, DRB4 13 DRB1* 03, DRB1*10, DRB3 14 DRB1* 0 4, DRB1* 0 9, DRB4*01 15 DRB1* 0 9, DRB1*15, DRB4*01, DRB5 16 DRB1* 03, DRB1*08, DRB3 17 DRB1* 0 8, DRB1*15, DRB5 18 DRB1*13 E DRB1*14 OU DRB13, DRB3 19 DRB1* 0 7, DRB4*01 20 DRB1* 0 7, DRB1*16, DRB4*01, DRB5 A Figura 16 mostra que o CAMPATH-1H humanizado induziu respostas proliferativas significativas (p<0,05) (cpm comparado com controlos não tratados) em três indivíduos saudáveis (dadores 14, 17 e 19). Contudo, apenas as células T dos dadores 14 e 17 produziram índices de estimulação suficientemente elevados (SI>2) de 4,2 e 2,5, respetivamente. A resposta do dador 19 foi excluída uma vez que o índice de estimulação foi consideravelmente mais baixo (Sl~l,5) do que o limiar estabelecido para esta experiência. Para o dador 8 o controlo não tratado produziu menos do que 400 cpm e foi, por conseguinte, excluído do estudo. Um aspeto importante é que nenhum dos dadores respondeu ao anticorpo DIVHv5/DIVKv2 modificado.

Assim, o anticorpo CAMPATH-1H humanizado tem o potencial de induzir uma resposta imune humoral dependente da célula T (marcada por anticorpos anti-CAMPATH-lH trocados por isotipos com afinidade madura) em alguns pacientes seres humanos com certos alotipos de classe II do CMH. Esta observação foi suportada pelos ensaios ex vivo de 43 célula T nos quais a ativação da célula T ocorreu em, pelo menos, dois indivíduos saudáveis (dadores 14 e 17) em resposta ao tratamento com antígeno CAMPATH-1H processado (expresso por DC madura). A comparação de respostas de célula T ex vivo usando antígeno processado do anticorpo DIVHv5/DIVKv2 modificado mostrou que esta falhou completamente na indução da proliferação da célula T em qualquer dos dadores testados. Estes dados demonstram que o anticorpo modificado provavelmente providencia uma molécula terapêutica melhorada quando substituído por CAMPATH-1H humanizado, particularmente quando usado para indicações em que a dosagem repetida é necessária.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Carr, Francis J.

Hamilton, Anita A.

<120> ANTICORPO ANTI-CD52 MODIFICADO

<130> ILEX:095WO <140> DESCONOCIDO <141> 29-10-2004 <150> 60/516.210 <151> 01-11-2003 <160> 231 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 1 44 44 Glu Vai Lys Leu Leu Glu Ser Gly 1 5 Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Gly 20 Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro 35 40 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys 50 . 55 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70 Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu 85 Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr 100 Gin Gly Vai Met Vai Thr Vai Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Rattus norvegicus Ser <400> 2

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 25 30

Ala Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 45

Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 60

Ser Arg Asp Asn Thr Gin Asn Met 75 80

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 90 95

Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110 45 Asp Ile Lys Met Thr Gin 1 5

Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15

Asp Arg Vai Thr Leu Asn 20

Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin 35

Lys Leu Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu Ile 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu 50

Gin Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Glu Asp Vai Ala Thr Tyr 85

Phe Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 90 95

Lys Leu Glu Leu Lys 105

Thr Phe Gly Thr Gly Thr 100 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinante mutado <400> 3 46

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 «o

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 no

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinante mutado <400> 4 47

Glu Vai Gin Lau Leu Glu Ser Gly Gly Gly I*eu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe ile Arg Asp Lya Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 50

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 S0

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinante mutado <400> 5

Glu Vai Lys Leu Gin Glu Ser Gly Gly Qly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 io 15 48

Ser Met Arg Ile Ser Cys Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lya Gly Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gin Asn Thr 65 70 75 80

Leu His Leu Gin Ala Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Vai Thr vai Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RECOMBINANTE MUTADO <400> 6 49

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 B0

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr B5 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinante mutado <400> 7 50

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10~ 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 05 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 lio

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MR <400> 8

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 51

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Aep Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His lie Ser Arg Pro Arg 35 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 9 52 Asp Ile Gin Met Thr Gin 1 5

Ser pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr 20

Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin 35

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu 50

Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 85

Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 90 95

Lys Leu Glu Leu Lys 105

Thr Phe Gly Thr Gly Thr 100

<210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 10 53 ASp 1 Ile Gin Met Thr -S- Gin Ser Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys 35 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin 50 55 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys 100 <2 10> 11 <2 11> 107 <2 12> PRT <2 13> art: IFICIAL <2 2 0> <2 23> MR <4 00> 11 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser 1 5

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly .10 ------------- - 15

Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 25 30

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly €0

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 90 95

Glu Leu Lys 105

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20

Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lye 35

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin 50 55

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60 54

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Lea Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Hie Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lya 100 105

<210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <400> 12

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 Θ0

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Hls Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 13 <211> 121 <212> PRT 55 <213> ART <220> <223> MR <400> 13

Glu Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gl] 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 - - ............—55 —..............60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala- Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 lio

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 14 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 14 56

Glu Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15 ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asa Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 no

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 15 57

Glu Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 16

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 58 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Abp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55..... 60 1

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr heu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 17 59 Glu Vai Lys Leu Gin Glu Ser 1 5

Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 is

Ser Met Arg Ile Ser Cys Ser 20

Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 25 30

Tyr Met Aan Trp Vai Arg Gin 35

Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala 50 55

Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gin Asn Thr 65 70 75 80

Leu His Leu Gin Ala Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 HO

Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 18 60

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 s 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asa Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 19

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 61 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp He Arg Gin pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 ... -60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 20 62

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly 1 s

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cye Ser Gly 20

Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys 50 55

Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 85

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 21 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 21 63

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr . Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <400> 22

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 64

1 - 5 10 IS

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55- eo

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 23 65

Glu Vai Lys Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 lo 15

Ser Met Arg Ile Ser Cys Ser Gly Ser Gly phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gin Asn Thr 65 70 75 80

Leu His Leu Gin Ala Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 24 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 24 66

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cye Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <400> 25

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 67 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 .......... -55 —------..... 60 . .

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Ala Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 26 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 26 68

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Phe Xle Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 eo

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Ala Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 HO

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 27 69

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Ala Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 28 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <400> 28

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 70

1 5 10 IS

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp lie 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp I*ys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55··· 60-

Ser Vai Lye Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 29 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 29 71

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 IS

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Aap Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gin Asn Ser 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 HO

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 30 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 30 72

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 31

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 73 73 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly 20

Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro 35 40

Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile 45

Oly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys • 50 ---- -55---

Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro .....60 -

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70

Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu 85

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr 100

Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120

<210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 32 74

Glll Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly 20

Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys 50 55

Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70

Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Ser 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 85

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr 100

Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120

<210> 33 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 33 75

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin. Pro Pro G-ly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 €0

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 34 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <400> 34

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro Gly Gly 76 1 Ser Met Tyr Met Gly Phe 50

Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 20 25

Asn Trp ile Arg Gin Pro pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu 55 - . 60

Ser Vai 65

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser 70 75

Leu Tyr

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 8S 90 15 Thr Asp Phe 30 Glu Trp Leu Tyr Asn Pro Lys Asn Thr 80 Ala Vai Tyr 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr 100

Ala Ala Pro Phe Asp 105

Tyr Trp Gly 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL

<220> <223> MR <400> 35 77

Glu Vai Lys Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly

Ser Met Arg lie Ser Cys Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gin Asn Thr 65 70 75 80

Leu His Leu Gin Ala Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 36 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <22 0> <223> MR <400> 36 78

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 37

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 79 15 10 is

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 -55-------- ------ 60 -

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 55 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 38 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 38 80

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly 20

Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 25 30

Tyr Met Asn Trp vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys 50 55

Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile €5 70

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 85

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr 100 Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser 115 120 <2 10> 39 <2 11> 121 <2 12> PRT <2 13> ARTIFICIAL <2 2 0> <2 23> MR Ser <400> 39

Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 105 . U0 81

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30

Tyr Met Asn Trp ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 40

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 82 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly 20

Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gin Pro 35 40

Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys - S0------------------------55 -------

Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro - ...........- 60 —------

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 85

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr 100

Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser

Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser 115 120

<210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 41 83

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 is

Asp Arg Vai Thr Pro Thr Cys Arg Ala ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Aân Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 5S eo

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 S0

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 05 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 42 84

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Pro Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Aan Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <2 10> 43 <2 11> 107 <2 12> PRT <2 13> ART IFICIAL <2 2 0> <2 23> MR <4 00> 43 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Pro Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30 Leu Asa Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala pro Lys Leu Leu Ile 85 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Aep Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg ----85.----------------------90............. ..... 95 ·

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 44 86

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 IS

Asp Arg Val Thr Pro Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 45 87

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5

Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15

Asp Arg Vai Thr Pro Thr Cys Lys 20

Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 25 30

Leu-Asn Trp TyrG-ln-Gln-Lys - Pro 35 40

Gly Lys· Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr 50 55

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 Θ0

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 85

Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 4 6 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 46 88

Asp Ile Qln Met Thr Gin Ser Pro 1 5

Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg 20

Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser 50 55

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys

Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 47 89

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 48

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30 90 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 35 40

Pro Lys Leu Leu Ile 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Vai Pro 50 55

Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro 80

Glu Asp Ile Ala -Thr-Tyr -Tyr Cys Leu- Gin His 85 90

Ile Ser Arg Pro-Arg, 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL

<220> <223> MR <400> 49 91

Asp IIe Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp· Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 50 92

Asp II e Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 51 93

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Pro Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lye Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 52 94

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Pro Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Ser Leu Gin pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <400> 53

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Pro Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30 95

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser GXy Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Xle Ser Arg Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Recombinante mutado <400> 54 96

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Pro Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 55 97 Asp Ile 61η Met 1

Thr Gin Ser 5

Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser lo

Asp Arg Vai Thr 20 Leu Asn Trp Tyr 35 Tyr Asn Thr Asn 50 Ser Gly Ser Gly 65 GlU Asp Ile Ala Thr Phe Gly Thr 100 <210> 56 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR Pro Thr Cys Gin Gin Lys Asn Leu Gin 55 Thr Asp Phe 70 Thr Tyr Tyr 85 Gly Thr Lys <400> 56

Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp 25 30

Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu 40 45

Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe 60

Vai Gly 15 Lys Tyr Leu Ile Ser Gly

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 75

Cys Leu Gin His Ile Ser Arg 90

Leu Glu Leu Lys 105

Gin Pro 80

Pro Arg 95 98

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Aan Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 63 70 75 Θ0

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> SEC ID 58 <400> 57 99

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn lie Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 58

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 100 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu 'Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg pro Arg .... _ ---85------- ---- -90 ........ 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 59 101

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 60 102

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu-Asn Trp Tyr-Gin-Gl-n—Lys-Ser-G-ly Lys Ser- Pro Lys -Leu--Leu Ile— 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 61 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 61 103

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu II e 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 62 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 62 104

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 63 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 63

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30 105

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 €0

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile-Ala Thr-Tyr Tyr-Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro-Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 64 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 64 106 Asp 11$ Gin Met Thr Gin 1 5

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr 20

Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin 3S

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu 50

Gin Thr Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 85

Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 50 95

Lys Leu Glu Leu Lys 105

Thr Phe Gly Thr Gly Thr 100

<210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 65 107

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 S 10 15

Asp Arg Vai Thr ile Thr cys Lys Ala Ser Gin Asn lie Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Met pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Hls Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 io5

<210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 66 108

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5

Ser Ser Leu ser Ala Ser Vai Gly 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg 20

Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser 35 40

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser 50 55

Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg Θ5 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <220> <223> MR <400> 67 109

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 68 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 68

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30 110

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Ser Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 ' 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lye Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 69 111

Asp Ile Gin Mefc Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Oln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 €0

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 35 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 70 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 70 112

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Ile Asp Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gin Thr Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Ile Ser Arg Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu hys 100 105 <210> 71 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 71 60 120 180 240 300 360 gaggtgcaac tgttggaatc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tctgagactc tcctgtgcag gttctggatt caccttcact gatttctaca tgaactgggt ccgccaggct ccagggaagg gacttgagtg ggtgggtttt attagagaca aagctaaagg ttacacaaca gagtacaatc catctgtgaa ggggcggttc accatctcca gagataattc caaaaacacc ctctatcttc aaatgaactc cctaagagct gaggacactg ccgtttacta ctgtgcaaga gagggccaca cfcgctgctcc ttttgattac tggggccaag gaacactggt caccgtctcc tca 363 113 <210> 72 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 72 gaggtgcaac tgttggaatc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcag gttctggatt caccttcact gatttctaca tgaactggat tcgccagcct 120 cccgggaaag cacctgagtg gattggtttt atfcagagaca aagctaaagg ttacacaaca 180 gagtacaatc catctgtgaa ggggcggttc accatctcca gagataattc caaaaacacc 240 ctctatcttc aaatgaaet-e-cctaagagete-gaggacactg ccgbttacta ctgtgcaaga*- 300-gagggccaca ctgctgctcc ttttgattac tggggccaag gaacactggt cacegtctcc 360 tca <210> 73 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 73 gaggtgaaac tgcaggaatc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tatgagaatc 60 tcctgttcag gttctggatt'caccttcact gatttctaca tgaactggat tcgccagcct 120 cccgggaaag gacctgagtg gattggtttt attagagaca aagctaaagg ttacacaaca 180 gagtacaatc catctgtgaa ggggcggttc accatctcca gagataatac ccaaaacacc 240 ctccatcttc aagctaacac cctaagagct gaggacactg ccgtttacta ctgtgcaaga 300 gagggccaca ctgctgctcc ttttgattac tggggccaag gaactaccgt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 74 114

<211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <4Ο Ο> 74 gaggtgcaac tgttggaatc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcag gttctggatt caccttcact gatttctaca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gacttgagtg ggtgggtttt attagagaca aagctaaagg ttacacaaca 180 gagtacaatc catctgtgaa ggggcggttc accatctcca gagataatgc caaaaactcc 240 ctctatcttc aaatgaactc cctaagagct gaggacactg ccgtttacta ctgtgcaaga 300 gagggccaca etgctgctcc ttttgattac tggggccaag gaacactggt caccgtctcc 360 tca 363

<210> 75 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <400> 75 gaggtgcaac tgttggaatc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tctgagactc . 60 tcctgtgcag gttctggatt caccttcact gatttctaca tgaactggat tcgccagcct 120 cccgggaaag cacctgagtg gctgggtttt attagagaca aagctaaagg ttacacaaca 180 gagtacaatc catctgtgaa ggggcggttc accatctcca gagataattc caaaaacacc 240 ctctatcttc aaatgaactc cctaagagct gaggacactg ccgtttacta ctgtgcaaga 300 gagggccaca ctgctgctcc ttttgattac tggggccaag gaacactggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 76 115

<211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <4Ο0> 76 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcacctgca gagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagccc 120 ggaaaagctc ccaaatccct gatatataat acaaacaatt tgcaatctgg cgtcccatca 180 aggttcagfcg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg ccacatatta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaage tggagctgaa a -321

<210> 77 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220>

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<210> 78 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL 116

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<210> 81 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220>

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<210> 100 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220>

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<210> 104 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 104 129 gaggtgcaac tgttggaatc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcag gttctggatt caccttcact gatttctaca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gacttgagtg gctgggtttt attagagaca aagctaaagg ttacacaaca 180 -gagtacaatG-catctgtgaa ggggcggttc-accatctcca gagataatgc caaaaactcc . 240 ctctatcttc aaatgaactc cctaagagct gaggacactg ccgtttacta ctgtgcaaga 300 gagggccaca ctgctgctcc ttttgattac tggggccaag gaacactggt caccgtctcc 360 tea 363

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<210> 106 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 106 130 gaggtgcaac tgttggaatc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcag gttctggatt caccttcact gatttctaca tgaactgggt ccgccaggcfc 120 ccagggaagg gacttgagtg ggtgggtttt attagagaea aagctaaagg ttacacaaca 180 gagtacaatc catctgtgaa ggggcggttc accatctcca gagataatgc caaaaactcc 240 ctctatcttc aaatgaactc cctaagagct gaggacactg ccgtttacta ctgtgcaaga 300 gagggccaca ctgctgctcc ttttgattac tggggccaag gaacaaccgt caccgtctcc 360 tea <210> 107 <211> 363 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 107 gaggtgcaac tgttggaatc tggaggaggc ttggtacagc cggggggttc tctgagactc . 60 tcctgtgcag gttctggatt caccttcact gatttctaca tgaactggat tcgccagcct 120 cccgggaaag cacctgagtg gctgggtttt attagagaea aagctaaagg ttacacaaca 180 gagtacaatc catctgtgaa ggggcggttc accatctcca gagataatte caaaaacacc 240 ctctatcttc aaatgaactc cctaagagct gaggacactg ccgtttacta ctgtgcaaga 300 gagggccaca ctgctgctcc ttttgattac tggggccaag gaacaaccgt caccgtctcc 360 tea 363

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<210> 118 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL

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<210> 128 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 128 60 141 gacatccaga tgacccagtc atcacctgca aagcaagtca ggaaaatctc ccaaactcct aggttcagtg gcagtggatc gaagatattg ccacatatta gggaccaagc tggagctgaa tccctcatcc ctgtctgcat gaatattgac aaatacttaa gatatataat acaaacaatt tggtactgat ttcacactca ctgcttgcag catataagta a ctgtgggaga cagagtcact actggtatca gcaaaagtct tgcaaacggg cgtcccatca ccatcagcag cctgcagcct ggccgcgcac gtttggaact 120 180 240 300 321 <210> 129 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 129 gacatccaga tgacccagtc atcacctgca gagcaagtca ggaaaagctc ccaaatccct aggttcagtg gcagtggatc gaagatattg ccacatatta gggaccaagc tggagctgaa

<210> 130 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR tccctcatcc ctgtctgcat gaatattgac aaatacttaa gatatataat acaaacaatt tggtactgat ttcacactca ctgcttgcag catataagta a ctgtgggaga cagagtcact actggtatca gcaaaagccc tgcaatctgg catgccatca ccatcagcag cctgcagcct ggccgcgcac gtttggaact 60 120 180 240 300 321 <400> 130 142 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact €0 atcacctgca aagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagccc -120 ggaaaagctc ccaaactcct gatatataat acaaacaatt tgcaaacggg catgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg ccacatatta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 131 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 131 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcacctgca gagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagccc 120 ggaaaagctc ccaaactcct gatatataat acaaacaatt tgcaatctgg catgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg ccacatatta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 132 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 132 143 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcacctgca aagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagccc 120 ggaaaagctc ccaaatccct gatatataat acaaacaatt tgcaaacggg catgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg ccacatatta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaagc. tggagctgaa. a . — 321

<210> 133 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220>

<223> MR <400> 133 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcacctgca aagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagccc 120 ggaaaatctc ccaaactcct gatatataat acaaacaatt tgcaaacggg catgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct . 240 gaagatattg ccacatatta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 134 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 134 144 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcacctgca gagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagtct 120 ggaaaagctc ccaaatccct gatatataat acaaacaatb tgcaatctgg catgccatca 160 aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg ccacatatta ctgcttgcag eatataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaage tggagctgaa a 321 <210> 135 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 135 tccctcatcc ctgtctgcat gaatattgac aaatacttaa gatatataat acaaacaatt tggtactgat ttcacactca ctgcttgcag eatataagta a gacatccaga tgacccagtc atcacctgca aagcaagtca ggaaaagctc ccaaactcct aggttcagtg gcagtggatc gaagatattg ccacatatta gggaccaage tggagctgaa ctgtgggaga cagagtcact actggtatca gcaaaagtct tgcaaacggg catgccatca ccatcagcag cctgcagcct ggccgcgcac gtttggaact 60 120 180 240 300 321

<210> 136 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 136 145 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcacctgca gagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagtct 120 ggaaaagctc ccaaactcct gatatataat acaaacaatt tgcaatctgg catgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg ccacatatta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 137 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 137 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcacctgca aagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagtct 120 ggaaaagctc ccaaatccct gatatataat acaaacaatt tgcaaacggg catgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg ccacatatta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 138 <211> 321 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> MR <400> 138 146 gacatccaga tgacccagtc tccctcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 atcacctgca aagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtatca gcaaaagtct 120 -ggaaaatGtc-ccaaactGGt-gatatataat- acaaacaatt .tgcaaacggg catgccatca lôO aggttcagtg gcagtggatc tggtactgat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatafctg ccacatatta ctgcttgcag eatataagta ggccgcgcac gtttggaact 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 139 <211> 330 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 139 147 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 1 S Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 20 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 35 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 50 55 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 65 70 Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 85 Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 100 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 115 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 130 135

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 10 15

Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 25 30

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 45

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 75 Θ0

Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 90 95

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 105 110

Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 125

Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 140 148

Vai Val Val Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 .Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 140 <211> 106 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 140 149

Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80

His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95

Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 141 <211> 20 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 141 tccacaggtg tccactccga 20 <210> 142 <211> 41 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 142 ccagattcca acagtttcac ctcggagtgg acacctgtgg a 41 150 <210> 143 <211> 39 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 143 ggtga; aactg ttggaatctg <210> 144 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 144 ggagagtctc atagaacccc <210> 145 <211> 41 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 145 ggggggttct atgagactct <210> 146 <211> 39 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 146 39 40 41 39 catgtagaaa tcagtgaagg tgaatccaga acctgcaca

<210> 147 <211> 40 <212> ADN 151

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <4 0 0> 147 ccttcactga tttctacatg aactggattc gccagcctgc

<210> 148 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 148 gccactcagg tgccttccct gcaggctggc gaatccagtt <210> 149 <211> 40

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 149 agggaaggca cctgagtggc tgggttttat tagagacaaa

<210> 150 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 150 tctgttgtgt-aacctttagc-tttgtctcta-ataaaaccca

<210> 151 <211> 42 <212> ADN <213> ARTIFICIAL 152 <220> <223> SINTETIZADO <400> 151 gctaaaggtt acacaacaga gtacaatcca tctgtgaagg gg 42

<210> 152 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 152 tctggagatg gtgaaccgcc ccttcacaga tggattgtac 40 <210> 153 <211> 38

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 153 cggttcacca tctccagaga taatacccaa aacatgct 38 <210> 154 <211> 40

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220>

<223> SINTETIZADO <400> 154 gggtgttcat ttgaagatag agcatgtttt gggtattatc 40

<210> 155 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220>

<223> SINTETIZADO 40 153 <400> 155 ctatcttcaa atgaacaccc <210> 156 <211 > 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 156 tctcttgcac agtagtaagt <210> 157 <211> 42 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 157 acttactact gtgcaagaga <210> 158 <211> 41 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <40 0> 158 ctccttggcc ccagtaatca <210> 159 <211> 39 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 159 40 42 41 154 gattactggg gccaaggagt catggtcacc gtctcctca 39 <210> 160 <211> 20 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 160 tgaggagacg gtgaccatga 20 <210> 161 <211> 38

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 161 gcatgttgac cctgacgcaa gcttgccgcc accatggg 38 <210> 162 <211> 27

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 162 ggagtggaca cctgtggaga gaaaggc 27 <210> 163 <211> 36 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 163 gcgatagctg gactgaatgg atcctataaa tctctg 36 155 <210> 164 <211> 21 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 164 tccacaggtg tccactccga <210> 165 <211> 39 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 165 agactgggtc atcttgatgt cggagtggac acctgtgga 39 <210> 16 6 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 166 atcaagatga cccagtctcc ctcattcctg tctgcatctg 40 <210> 167 <211> 41 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 167 41 agagtgactc tgtctcccac agatgcagac aggaatgagg g <210> 168 <211> 40 156 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 168 tgggagacag agtcactctc aactgcaaag caagtcagaa

<210> 169 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 169 gtttaagtat ttgtcaatat tctgacttgc tttgcagttg <210> 170 <211> 40

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 170 tattgacaaa tacttaaact ggtatcagca aaagctggga <210> 171 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 171 tcaggagttt gggagattct cccagctttt gctgatacca

<210> 172 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL 157 <220> <223> SINTETIZADO <4 0 0> 172 gaatctccca aactcctgat atataataca aacaatttgc 40

<210> 173 <211> 41 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 173 ccttgatggg atgcccgttt gcaaattgtt tgtattatat a 41

<210> 174 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 174 aaacgggcat cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg 40 <210> 175 <211> 39 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 175 ggtgagtgtg aaatcagtac cagatccact gccactgaa 39 <210> 176 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> 158

<223> SINTETIZADO <4 0 0> 176 tactgatttc acactcacca tcagcagcct gcagcctgaa 40 <210> 177 <211> 41 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 177 cagaaatatg tggcaacatc ttcaggctgc aggctgctga t 41 <210> 178 <211> 39 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 178 gatgttgcca catatttctg cttgcagcat ataagtagg 39 <210> 179 <211> 40 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 179 cccagttcca aacgtgcgcg gcctacttat atgctgcaag 40 <2 <2 <2 <2 <2 <2

10> 180 11> 40 12> ADN 13> ARTIFICIAL 2 0> 23> SINTETIZADO 40 159 <400> 180 ccgcgcacgt ttggaactgg <210> 181 <211> 39 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 181 aaagtttaaa ttctactcac <210> 182 <211> 38 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 182 gtgagtagaa tttaaacttt <210> 183 <211> 18 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 183 ggatccagtc gacgaagc 18 <210> 184 <211> 38 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 184 39 gcatgttgac cctgacgcaa gcttgccgcc accatggg 38 160 160 <210> 185 <211> 27 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 185 ggagtggaca cctgtggaga gaaaggc 27 <210> 186 <211> 36 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 186 gcgatagctg gactgaatgg atccagtcga cgaagc 36 <210> 187 <211> 38 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 187 gcatgttgac cctgac< <210> 188 <211> 3.0 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 188 30 ccactccgag gtgcaactgt tggaatctgg <210> 189 161 <211> 30

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <4 0 0> 189 30 30 ccagattcca acagttgcac ctcggagtgg <210> 190 <211> 30 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 190 agccgggggg ttctctgaga ctctcctgtg <210> 191 <211> 30 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 191 cacaggagag tctcag. <210> 192 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 192 30 35 agggaaggga cttgagtggg tgggttttat tagag

<210> 193 <211> 35 <212> ADN 162 162 <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 193 cgggaaagca cctgagtgga ttggttttat tagag 35

<210> 194 <211> 43 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 194 ccactcaagt cccttccctg gagcctggcg gacccagttc atg 43 <210> 195 <211> 35

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 195 gaggctggcg aatcc 35 ccactcaggt gctttcccgg <210> 196 <211> 48

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 196 tcttcaaatg aactccctaa gagctgagga cactgccgtt tactactg 48 <210> 197 <211> 46

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL

46 163 <220> <223> SINTETIZADO <400> 197 agggagttca tttgaagata <210> 198 <211 > 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 198 tggggccaag gaacactggt <210> 199 <211> 31 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 199 ggagactgtg accagtgttc <210> 200 <211> 33 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <40 0> 200 tccgaggtga aactgcagga <210> 201 <211> 30 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO 35 33 164 <400> 201 ccagattcct gcagtttcac ctcggagtgg 30 <210> 202 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 202 gggggttcta tgagaatctc <210> 203 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 203 gaacctgaac aggagattct <210> 204 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 204 cgggaaagga cctgagtgga <210> 205 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 205 ctgttcaggt tctgg 35 catagaaccc cccgg 35 ttggttttat tagag 35 165 ccaatccact caggtccttt cccgggaggc tggcg 35 <210> 206 <211> 41 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 206 <210> 207 <211> 39 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 207 <210> 208 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 208 gctaacaccc taagagctga ggacactgcc gtttactact g 41 ctcttagggt gttagcttga agatggaggg tgttttggg 39 tggggccaag gaactaccgt caccgtctcc tcagg 35 <210> 209 <211> 31

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 209 ggagacggtg acggtagttc cttggcccca g 31 16 6 <210> 210 <211> 36 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 210 gataatgcca aaaact <210> 211 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 211 atagagggag tttttggcat tatctctgga gatgg 35 <210> 212 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 212 cgggaaagca cctgag- <210> 213 <211> 36 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 213 35 36 gcgatagctg gactgaatgg atcctataaa tctctg <210> 214 167 167 <211> 38 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 214 gcatgttgac cctgacgcaa gcttgccgcc accatggg 38 <210> 215 <211> 32 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 215 atgacccagt ctccctcatc cctgtctgca tc 32 <210> 216 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 216 gagggagact gggtcatctg gatgtcggag tggac 35 <210> 217 <211> 34

<212> ADN

<213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 217 cagagtcact atcacctgca aagcaagtca gaat 34

<210> 218 <211> 34 <212> ADN 168 <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 218 cagagtcact atcacctgca gagcaagtca gaat 34 <210> <211> <212> <213> 219 35 ADN ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 219 attctgactt gctttgcagg tgatagtgac tctgt 35 <210> <211> <212> <213> 220 35 ADN ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 220 attctgactt gctctgcagg tgatagtgac tctgt 35 <210> <211> <212> <213> 221 35 ADN ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 221 cccggaaaag ctcccaaact cctgatatat aatac 35

<210> <211> <212> <213> 222 35 ADN ARTIFICIAL 169 <220> <223> SINTETIZADO <400> 222 cccggaaaat ctcccaaact cctgatatat aatac 35 <210> <211> <212> <213> 223 35 ADN ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 223 cccggaaaag ctcccaaatc cctgatatat aatac 35 <210> <211> <212> <213> 224 32 ADN ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 224 tttgggagct tttccgggct tttgctgata cc 32 <210> <211> <212> <213> 225 32 ADN ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 225 tttgggagat tttccgggct tttgctgata cc 32

<210> <211> <212> <213> 226 27 ADN ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO 170 <400> 226 cgtcccatca aggttcagtg gcagtgg 27 <210> 227 <211> 31 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 227 gccactgaac cttgatggga <210> 228 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 228 cactgaacct tgatgggacg <210> 229 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 229 gcctgaagat attgccacat <210> 230 <211> 35 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 230 cgcccgtttg c 31 ccagattgca aattg 35 attactgctt gcagc 35 171 tgcaagcagt aatatgtggc aatatcttca ggctg 35 <210> 231 <211> 36 <212> ADN <213> ARTIFICIAL <220> <223> SINTETIZADO <400> 231 gcgatagctg gactgaatgg atccagtcga cgaagc 36 172

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição wo 8909622 A [0002] EP 0239400 A [0002] EP 0438310 A [0002] WO 9106667 A [0002] EP 0699755 A [0002] WO 9852976 A [0007] WO 0034317 A [0007] [0030] US 5846543 A [0014] US 6120766 A [0014] US 6569430 A [0014] wo 0230460 A [0014] wo 9859244 A [0030] • US 20030153043 A [0030] • US 60516210 B [0074]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo anti-CD52 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ. ID N.° 3, SEQ. ID N.° 4, SEQ. ID N.° 6, e SEQ. ID N.° 7; e a dita cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ. ID N.° 8, SEQ. ID N.° 9, SEQ. ID N.° 10, SEQ. ID N.° 11, e SEQ. ID N.0 12.

2. O anticorpo da reivindicação 1, em que a dita cadeia pesada compreende, ainda, um dominio da reqião constante de IgGl humano e a dita cadeia leve compreende, ainda, um dominio da região constante kappa humano.

3. 0 anticorpo da reivindicação 1 ou 2, em que a dita cadeia pesada compreende a SEQ. ID N.° 4 e a dita cadeia leve compreende a SEQ. ID N.° 12.

4. O anticorpo da reivindicação 1 ou 2, em que a dita cadeia pesada compreende a SEQ. ID N.° 7 e a dita cadeia leve compreende a SEQ. ID N.° 12, ou a dita cadeia pesada compreende a SEQ. ID N.° 7 e a dita cadeia leve compreende a SEQ. ID N.° 10, ou a dita cadeia pesada compreende a SEQ. ID N.° 3 e a dita cadeia leve compreende a SEQ. ID N.° 10, ou a dita cadeia pesada compreende a SEQ. ID N.° 6 e a dita cadeia leve compreende a SEQ. ID N.° 10.

5. Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo de qualquer das reivindicações 1 a 4 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

6. Uso do anticorpo de qualquer das reivindicações 1 a 4 no fabrico de um produto farmacêutico para tratamento de malignidades linfoides, para tratamento de condições 2 patológicas auto-imunes, ou para imunossuprimir um paciente antes de ou subsequente à transplantação de um orgão.

7. Uso da reivindicação 6, em que a dita malignidade linfoide é leucemia ou linfoma, em que a dita condição patológica auto-imune é esclerose múltipla, artrite reumatóide, vasculite sistémica, uveíte, doença inflamatória intestinal ou esclerodermia, e em que a dita transplantação de um órgão é um transplante renal.

8. Um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada da região V como definido na reivindicação 1, ligada operativamente a uma sequência de controlo de expressão.

9. 0 vetor de expressão da reivindicação 8, em que a dita sequência que codifica a cadeia pesada da região V é a SEQ. ID N.° 12.

10. O vetor de expressão da reivindicação 8, o vetor compreendendo, ainda, uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio da região constante de IgGl humano.

11. Um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve da região V como definido na reivindicação 1, ligada operativamente a uma sequência de controlo de expressão.

12. O vetor de expressão da reivindicação 11, em que a dita sequência que codifica a cadeia leve da região V é a SEQ. ID N.0 80.

13. O vetor de expressão da reivindicação 11, o vetor compreendendo, ainda, uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio da região constante kappa humano.

14. Uma célula cultivada que compreende os vetores das 3 reivindicações 8 e 11, ou sendo transfetada com os vetores das reivindicações 8 e 11.

15. Um método para preparar uma imunoglobulina, o método compreendendo as etapas de (i) cultivar a célula transfetada duplamente da reivindicação 14 e (ii) purificar a imunoglobulina do meio da dita célula.