MX2013012346A

MX2013012346A - Induccion de gen de pequeña molecula de trail por celulas normales y tumorales como una terapia anticancer.

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Publication number: MX2013012346A
Application number: MX2013012346A
Authority: MX
Inventors: Wafik S El-Deiry; Joshua E Allen; Gen Sheng Wu
Original assignee: Penn State Res Found
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-30
Publication date: 2014-08-22
Also published as: WO2012149546A3; CA2832342A1; EP2701708B1; MX2019006379A; CA2832342C; EP3679934A1; US20220288079A1; HUE068623T2; US20170224690A1; ES2992934T3; EP3679934B1; HUE049207T2; JP2014514326A; SI2701708T1; RS60186B1; FI4335511T3; PL2701708T3; SMT202400421T1; US20140248264A1; US20240415841A1

Abstract

Se describen métodos y composiciones que se relacionan a TIC10 de acuerdo a aspectos de la presente invención. Las composiciones y métodos tienen utilidad para tratar enfermedad, particularmente cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, incluyendo un sujeto humano así como también sujetos de otras especies. Las composiciones tienen utilidad para tratar cáncer de cerebro en un sujeto en necesidad del mismo.

Description

INDUCCIÓN DE GEN DE PEQUEÑA MOLÉCULA DE TRAIL POR CÉLULAS NORMALES Y TUMORALES COMO UNA TERAPIA ANTICÁNCER DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente a métodos y composiciones para tratar enfermedad proliferativa, como cáncer, en un sujeto en necesidad del mismo.

El ligando inductor de apoptosis relacionado a TNF (TRAIL por sus siglas en inglés; Apo2L) es una proteina endógena que induce selectivamente apoptosis en células cancerosas.

TRAIL es un inductor poderoso de apoptosis en un intervalo amplio de líneas celulares de cáncer humano por medio del receptor 4 de muerte pro apoptótico (DR4 por sus siglas en inglés; TRAIL-R1) y receptor 5 de muerte (DR5 por sus siglas en inglés; TRAIL-R2) en la superficie celular a través del acoplamiento de trayectorias apoptóticas extrínsicas o intrínsicas. TRAIL juega un papel directo en supresión tumoral durante vigilancia inmunológica pero este mecanismo antitumoral se pierde durante la progresión de la enfermedad. La capacidad de TRAIL para iniciar apoptosis selectivamente en células cancerosas ha conducido a pruebas clínicas continuas con administración de TRAIL recombinante y los anticuerpos agonistas de TRAIL de vida más larga objetivando cualquiera de sus dos receptores de muerte pro apoptóticos.

A pesar de su potencia, TRAIL recombinante tiene propiedades limitantes en eficacia como vida media en suero corta, estabilidad, costo, y suministro. El suministro de TRAIL recombinante o anticuerpos agonistas de TRAIL al cerebro es limitado por incapacidad de TRAIL recombinante y anticuerpos agonistas de TRAIL para cruzar la barrera sangre-cerebro .

Hay una necesidad continua para composiciones y métodos anticáncer.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen también llamado TIC10 en la presente, un derivado sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, ; y un portador aceptable armacéuticamente, son proporcionados de acuerdo a aspectos de la presente invención. Las composiciones tienen utilidad para tratar enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, incluyendo un sujeto humano asi como también sujetos de otras especies. Las composiciones tienen utilidad para tratar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, incluyendo un sujeto humano asi como también sujetos de otras especies.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, las composiciones farmacéuticas son proporcionadas las cuales incluyen TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; un portador aceptable farmacéuticamente; y un segundo agente terapéutico.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, las composiciones farmacéuticas son proporcionadas las cuales incluyen TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; un portador aceptable farmacéuticamente; y un segundo agente terapéutico, en donde TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente es el primer agente anticáncer.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, son proporcionadas composiciones farmacéuticas las cuales incluyen TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; un portador aceptable farmacéuticamente; y un inhibidor mitótico.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, son proporcionadas composiciones farmacéuticas las cuales incluyen TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; un portador aceptable farmacéuticamente; y paclitaxel, docetaxel o una combinación del mismo.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas las cuales incluyen TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; un portador aceptable farmacéuticamente; y un agente anti-angiogénico .

De acuerdo a aspectos de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas las cuales incluyen TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; un portador aceptable farmacéuticamente; y bevacizumab.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, son proporcionadas composiciones farmacéuticas formuladas para administración oral las cuales incluyen TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente .

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solyato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, y un portador aceptable farmacéuticamente .

Se proporcionan métodos de tratamiento en un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10; y un portador aceptable farmacéuticamente.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de un derivado aceptable farmacéuticamente de TIC10; y un portador aceptable farmacéuticamente .

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, una sal, éster, amida, hdirato y/o solvato del mismo aceptables farmacéuticamente, y un portador aceptable farmacéuticamente.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10 o una sal, hidrato o solvato del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

Se proporciona métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente; y además que incluyen ensayar ligando inductor de apoptosis relacionado a TNF en una muestra obtenida del sujeto para evaluar el efecto del tratamiento.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente; y además que incluye ensayar ligando inductor de apoptosis relacionado a TNF en una muestra de sangre, suero, plasma o fluido cerebroespinal obtenida del sujeto para evaluar el efecto del tratamiento.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente; y además que incluye administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de un segundo agente anticáncer, en donde TIC10, el derivado,, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente es el primer agente anticáncer.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente; y además que incluye administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de un agente antimitótico.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente, y además que incluye administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de paclitaxel, docetaxel, bevacizumab o cualesquiera dos o más de los mismos.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administración oral de una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente, en donde la administración es por una ruta seleccionada del grupo que consiste de: rutas de administración rectal, nasal, pulmonar, epidural, ocular, ótica, intraarterial, intracardiaca, intracerebroventricular, intradérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraósea, intratecal, intravesical, subcutánea, tópica, transdérmica, transmucosal, sublingual, bucal, vaginal, y por inhalación.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer cerebral de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administrar una cantidad efectiva farmacéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que muestra actividad de reportador luciferasa en células HCT116 Bax_ " bajo control transcripcional de los primeros 504 pares de base del promotor de gen de TRAIL humano cadena arriba del inicio de transcripción; La Figura 2 es una gráfica que muestra el análisis RT-qPCR de niveles de ARNm de TRAIL en células HCT116 p53~ _; La Figura 3 es una gráfica que muestra niveles de TRAIL superficiales inducidos por TIC10 en un panel de células cancerosas; La Figura 4 es una gráfica que muestra niveles de TRAIL superficiales en células HCT116 p53-/" después del tratamiento con TIC10 en condiciones y puntos de tiempo indicados ; La Figura 5 es una gráfica que muestra niveles superficiales de TRAIL de HCT116p53_ " por citometria de flujo en 72 horas después del inicio de tratamiento con TICIO; La Figura 6 muestra perfiles de ciclo celular de células HCT116 p53- " y fibroblasto de prepucio humano (HFF por sus siglas en inglés) tratados con TICIO; La Figura 7 es una gráfica que muestra cuantificación de ensayos de formación de colonia de células cancerosas tratadas con TICIO; La Figura 8 es una gráfica que muestra experimentos paralelos como en la figura 7 pero con células HFF que son enumeradas en punto final; La Figura 9 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de células HCT116 WT, p53_ ", y Bax_ ~ después del tratamiento con DMSO, TICIO ó rhTRAIL (25 ng/ml) ; La Figura 10 es una imagen que muestra resultados de análisis Western blot; La Figura 11 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de células cancerosas tratadas con TICIO preincubadas con o sin zVAD-fmk; Figura 12 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de células MDA-MB-231 con knockdown estable de TRAIL por ARN de hairpina corta; La Figura 13 es una gráfica que muestra verificación de knockdown de MDA-MB-231 shTRAIL por análisis de citometria de flujo de células tratadas con TICIO; La Figura 14 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de muerte celular inducida por TIC10 en células H460 con DR5 endógena o sobreexpresión de una construcción de DR5 con su dominio de muerte reemplazada por EGFP; La Figura 15 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de células HCT116 tratadas con DMSO, TIC10, o rhTRAIL en la presencia o ausencia de un anticuerpo sucuestrante de TRAIL, RIK-2.

La Figura 16 es una gráfica que muestra TRAIL superficial inducida por TIC10 con células cancerosas de colon humano reseccionadas recientemente; La Figura 17 es una gráfica que muestra resultados de un ensayo de viabilidad celular de células cancerosas de colon primario de la Figura 16 tratadas con DMSO, TIC10 o 5-FU; La Figura 18 es una gráfica que muestra capacidad de TIC10 ó rhTRAIL para reducir viabilidad celular en células HCT116 después de una hora preincubación en las temperaturas indicadas .

La Figura 19 es una gráfica que muestra xenoinjerto de HCT116 p53"/_ tratado con TIC10, TRAIL o vehículo; La Figura 20 es una gráfica que muestra resultados de imagen bioluminiscente de xenoinjertos de HCT116 p53~/_ infectados con luciferasa tratados con TIC10 ó vehículo; La Figura 21 es una gráfica que muestra xenoinjerto de RKO tratado con TIC10, TRAIL o vehículo; La Figura 22 es una gráfica de caja y bigotes de volumen tumoral en el día 9 después de inicio de tratamiento en vector MDA-MB-231 o xenoinjertos shTRAIL con TIC10, TRAIL o vehículo ; La Figura 23 es una gráfica que muestra volumen tumoral relativo de xenoinjertos DLD-1 tratados con TRAIL, TIC10 ó DMSO; La Figura 24 es una gráfica que muestra comparación de administración i.p. contra oral de TIC10 en xenoinjertos SW480; La Figura 25 es una gráfica que muestra TIC10 o vehículo administrado como una dosis oral simple en el xenoinjerto HCT116; La Figura 26 es una gráfica que muestra peso corporal de ratones desnudos hembra, atímicos tratados con una dosis sencilla de TIC10.

La Figura 27 es una gráfica que muestra peso corporal de ratones hembra C57/B6 en el final de la semana 4 de tratamiento con TIC10 oral; La Figura 28 es una gráfica que muestra sobrevivencia total de ?µ-myc tratados durante las semanas 9-12 con TIC10 oral semanalmente; La Figura 29 es una gráfica que muestra viabilidad celular de células DLD-1 tratadas con TIC10 en combinación con paclitaxel; La Figura 30 es una gráfica que muestra viabilidad celular de células SW620 tratadas con TIC10 en combinación con paclitaxel; La Figura 31 es una gráfica que muestra viabilidad celular de células DLD-1 tratadas con TIC10 en combinación con taxotere; La Figura 32 es una gráfica que muestra viabilidad celular de células SW620 tratadas con TIC10 en combinación con taxotere; La Figura 33 es una gráfica que muestra porcentaje de cohortes en xenoinjerto H460 que retiene volumen de tumor después del tratamiento con TIC10 o taxotere solo, en combinación, o con vehículo; La Figura 34 es una gráfica que muestra una gráfica de volumen tumoral relativo para la Figura 33; La Figura 35 es una gráfica que muestra porcentaje de cohortes en xenoinjerto H460 que retiene volumen tumoral después del tratamiento con TIC10 o paclitaxel solo, en combinación o con vehículo; La Figura 36 es una gráfica que muestra una gráfica de volumen tumoral relativo para la Figura 35; La Figura 37 es una gráfica que muestra porcentaje de cohortes con implantes con tumores HCT116 p53_ ~ intracecales con tumores evidentes en los sitios primarios y distales en punto final, tratados con TIC10, bevacizumab o una combinación de TIC10 y bevacizumab; La Figura 38 es una gráfica que muestra peso corporal de ratones implantados con tumores HCT116 p53_/" intracecales tratados con vehículo, TIC10, bevacizumab o una combinación de TIC10 y bevacizumab; La Figura 39 es una gráfica que muestra niveles séricos de TRAIL en ratones libres tumorales después de TIC10 o doxorubicina; La Figura 40 es una gráfica que muestra el perfil de absorbancia de TIC10 con una absorbancia de pico en 239 nm; La Figura 41 es una gráfica que muestra una curva de calibración para TIC10 con alza en plasma de ratón y cuantificado por análisis HPLC usando área bajo la curva (AUC) ; La Figura 42 es una gráfica que muestra concentraciones de plasma de TIC10 después de la administración intravenosa en ratones hembra C57/B6; La Figura 43 es una gráfica que muestra análisis de TRAIL superficial de células HFF después del tratamiento con TIC10, 0, 2.5, 5 ó 10 µ? de izquierdo a derecho; La Figura 44 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de un co-cultivo de células HCT116 p53" _ y HFF pretratados; La Figura 45 es una gráfica que muestra TRAIL superficial en lineas celulares GMB después de la incubación con TIC10; La Figura 46 es una gráfica que muestra valores GI50 extrapolados a partir de los ensayos de viabilidad celular de lineas celulares GBM indicadas en 72 horas posttratamiento con TIC10 ó DMSO; La Figura 47 muestra resultados de un ensayo de viabilidad celular de tejido de glioblastoma humano reseccionado recientemente tratado con DMSO, TIC10, o temozolomida; La Figura 48 es una gráfica que muestra xenoinjerto subcutáneo de T98G con ratones que reciben una dosis simple de vehículo, TIC10 ó bevacizumab; La Figura 49 es una gráfica que muestra sobrevivencia total de ratones que alojan tumores intracraniales SF767 tratados con una dosis oral simple de vehículo, TIC10, bevacizumab, o TIC10 y bevacizumab; La Figura 50 es una gráfica que muestra cambios transcripcionales asociados con señalización FOXO a partir del perfil de expresión de gen de células HCT116 p53_/" en 48 horas post tratamiento con TIC10 contra DMSO; La Figura 51 es una imagen de análisis Western blot de DR5 en células HCT116 tratadas con TIC10 ó DMSO; La Figura 52 es una gráfica que muestra análisis de citometría de flujo de niveles DR5 superficial en células cancerosas y normales tratadas con TIC10; La Figura 53 es una imagen de análisis Western blot de lisados celulares enteros (W por sus siglas en inglés) y extractos citoplásmicos (C) y nucleares (N) a partir de células HCT116 tratadas con DMSO o TIC10; La Figura 54 es una imagen de resultados de un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para translocación inducida por TIC10 de Foxo3a al promotor TRAIL en 48 horas post tratamiento con TIC10 en células HCT116 p53_ ", 0, 2.5, 5, ó 10 µ? a partir de izquierdo a derecho; La Figura 55 es una gráfica que muestra resultados de análisis de citometria de flujo de niveles de TRAIL superficial celular inducidos por TIC10 con o sin knockdown temporal de Foxol y/o Foxo3a en células HCT116 p53~ _ usando siRNA; La Figura 56 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de muerte celular inducida por TIC10 con o sin knockdown estable de Foxo3a en células HCT116; La Figura 57 es una gráfica que muestra análisis de citometria de flujo de TRAIL superficial inducida por TIC10 con o sin knockdown estable de Foxo3a en células HCT116; La Figura 58 es una gráfica que muestra volumen tumoral de xenoinjerto HCT116 con o sin knockdown estable de Foxo3a después de una dosis oral simple de vehículo o TIC10; La Figura 59 es una imagen de análisis Western blot de células HCT116 ?53" tratadas con TIC10, 2.5, 5, 10 µ? por 72 horas; La Figura 60 es una imagen de análisis Western blot de células HCT116 p53_ " tratadas con TIC10; La Figura 61 es una gráfica que muestra curso de tiempo de niveles de expresión de proteina de efectos inducidos por TIC10 determinados por densitometría de Western blots a partir de experimentos replicados como en la Figura 60; La Figura 62 es una imagen de análisis Western blot de efectos inducidos por TIC10 en Foxo3a en células cancerosas de colon humanas DLD1, células cancerosas de mama humanas MDA-MB-468 y lineas celulares multiformes de glioblastoma humanas T98G; La Figura 63 es una imagen de análisis Western blot que muestra sobreexpresion de myr-Akt; La Figura 64 es una gráfica que muestra análisis de citometria de flujo de TRAIL superficial en células HCT116 que sobreexpresa un vector vacio o Akt miristilado (myr-Akt por sus siglas en inglés) con tratamiento con TIC10; La Figura 65 es una gráfica que muestra contenido sub-Gl de células HCT116 que sobreexpresan un vector vacio o myr-Akt con tratamiento con TIC10; La Figura 66 es una gráfica que muestra análisis Rt-qPCR de ARNm de TRAIL en células HCT116 p53" _ después de la incubación con A6730 (Akt inh (inhibidor de Akt)), monoetanolato U0126 (MEK inh (inhibidor de MEK) ) , o ambos; La Figura 67 es una gráfica que muestra inducción de TRAIL superficial como en la Figura 66 con o sin knockdown estable de Foxo3a; La Figura 68 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de MDA-MB-231 con o sin knockdown de TRAIL por shRNA después de la incubación con Akt inh, MEK inh, o ambos; La Figura 69 es una gráfica que muestra análisis de TRAIL superficial de células HCT116 p53_ " después de la incubación con A6730 (Akt inh) , monoetanolato U0126 (MEK inh) , o ambos ; La Figura 70 es una gráfica que muestra análisis RT-qPCR de niveles de ARNm de TRAIL después del knockdown temporal de Akt y/o ERK en células HCT116 p53_/"; La Figura 71 es una imagen que muestra confirmación de knockdown de Akt y ERK por análisis Western blot, y La Figura 72 es una gráfica que muestra análisis de TRAIL superficial después de knockdown temporal de Akt y/o ERK en células HCT116.

Los términos científicos y técnicos usados en la presente son propuestos para tener los significados entendidos comúnmente por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Los términos son encontrados definidos y usados en contexto en varias referencias estándar que incluyen ilustrativamente J. Sambrook y D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a Ed., 2001; F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5a Ed., 2002; B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4a Ed. Garland, 2002; D. L. Nelson y M.M. Cox, Lehninger Principies of Biochemistry, 4a Ed., W.H. Freeman & Company, 2004; Engelke, D.R., RNA Interference (RNAi); Nuts and Bolts of RNAi Technology, DNA Press LLC, Eagleville, PA, 2003; Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis; Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004; A. Nagy, M. Gertsenstein, K. Vintersten, R. Behringer, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Diciembre 15, 2002, ISBN-10: 0879695919; ursad Turksen (Ed.), Embryonic stem cells: methods and protocols in Methods Mol Biol. 2002; 185, Humana Press: Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 9780470151808.

Los terminus singulares "un, uno, una", y "el, ella" no se proponen para ser limitantes e incluyen referentes plurals a menos que se establezca explícitamente o el contexto indique claramente otra forma.

Los métodos y composiciones de acuerdo a aspectos de la presente invención se relacionan a compuesto inductor de TRAIL 10 (TIC10 por sus siglas en inglés), identificado por la presente invención como un inductor de transcripción de pequeña molécula del gen de TRAIL por un tamiz para compuestos que inducen TRAIL que sobreregulan el gen de TRAIL por un mecanismo que no depende de p53 ya que p53 es frecuentemente inactivado en los cánceres de etapa tardía, lo cual provoca resistencia a muchas terapias estándar de cuidado como 5-FU y doxorubicina .

TIC10 induce expresión de TRAIL en tanto células normales y cancerígenas. Los términos "induce expresión de TRAIL", "TRAIL inducido por TIC10" y equivalentes gramáticos de los mismos, usados en la presente para describir un efecto de TIC10 o derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, se refiere a producción de un incremento detectable de TRAIL por células contactadas con TIC10 o un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente. Un incremento detectable de TRAIL puede ser determinado por ensayos para proteína de TRAIL o ácidos nucleicos de TRAIL usando metodología de ensayo de proteína o de ácido nucleico bien conocida.

TRAIL inducido por TIC10 es sostenido en células cancerosas así como también células normales y suero, permitiendo un efecto espectador mediado por TRAIL en células cancerosas y tumores. TIC10 inactiva Akt y ERK llevando a la translocación nuclear de Foxo3a e inducción de transcripción de TRAIL.

TRAIL inducida por TIC10 es dependiente de Foxo3a, lo cual también sobreregula el receptor DR5 de muerte de TRAIL entre otros objetivos, permitiendo la sensibilización de algunas células tumorales resistentes a TRAIL. La inducción de TRAIL provocada por TIC10 es sostenida en células tumorales, estromales y huésped.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen TIC10 o un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, y métodos para su uso son proporcionados de acuerdo a aspectos de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen el compuesto de la estructura (I) son proporcionadas de acuerdo a aspectos de la presente invención El compuesto de la estructura (I) es también referido en la presente como compuesto 10 inductor de TRAIL (TIC10) y NSC350625.

El compuesto de la estructura (I) (TIC10) puede ser obtenido comercialmente o sintetizado usando metodología sintética química estándar.

Una composición farmacéutica de acuerdo a aspectos de la presente invención puede también ser un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco aceptables farmacéuticamente del compuesto de la estructura (I) .

Los derivados, sales, ésteres, amidas, hidratos, solvatos y/o profármacos del compuesto de la estructura (I) aceptables farmacéuticamente pueden ser obtenidos comercialmente o sintetizados usando metodología sintética química estándar.

El término "derivado aceptable farmacéuticamente" como se usa en relación al compuesto de la estructura (I) es el compuesto de la estructura (I) además substituido en cualquier posición substituible la cual retiene substancialmente la actividad descrita del compuesto de la estructura (I) para inducir expresión de TRAIL en una célula. Por ejemplo, el compuesto de la estructura (I) es opcionalmente además substituido en cualquier posición substituible por uno o más de los siguientes: F, Cl, Br o un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior o grupo alquilo inferior fluorinado, como CF3.

Una sal, éster, amida, hidrato, profármaco o solvato "aceptable farmacéuticamente" es adecuado para uso en un sujeto sin excesiva toxicidad o irritación al sujeto y es efectivo para el uso propuesto.

Sales aceptables farmacéuticamente incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base aceptables farmacéuticamente. Las sales aceptables farmacéuticamente son bien conocidas en la técnica, como aquellas detalladas en S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19, 1977. Sales aceptables farmacéuticamente de ejemplo son aquellas adecuadas para uso en un sujeto sin excesiva toxicidad o irritación al sujeto y las cuales son efectivas para su uso propuesto las cuales son formadas con ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhidrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido sulfámico; ácidos orgánicos como ácido acético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido bencensulfónico, ácido benzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido butírico, ácido alcanfórico, ácido alcanforsulfónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido diglucónico, ácido etansulfónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glutámico, ácido glicólico, ácido glicerofosfórico, ácido hemisúlfico, ácido heptanoico, ácido hexanoico, ácido 2-hidroxietansulfónico (ácido isetiónico) , ácido láctico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido mesitilensulfónico, ácido metansulfónico, ácido naftalensulfónico, ácido nicotinico, ácido 2-naftalensulfónico, ácido oxálico, ácido pamoico, ácido pectinico, ácido fenilacético, ácido 3-fenilpropiónico, ácido picrico, ácido piválico, ácido propiónico, ácido pirúvico, ácido pirúvico, ácido salicilico, ácido esteárico, ácido succinico, ácido sulfanílico, ácido tartárico, ácido p-toluensulfónico, ácido tricloroacético, ácido trifluoroacético y ácido undecanoico; bases inorgánicas como amoniaco, hidróxido, carbonato y bicarbonato de amonio; bases orgánicas como compuestos amina primarios, secundarios, terciarios y cuaternarios amonio, arginina, betaina, colina, cafeína, diolamina, dietilamina, dietanolamina, 2-dimetilaminoetanol , 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, diciclohexilamina, dibencilamina, N, N-dibencilfenetilamina, 1-efenamina, N, N ' -dibenciletilendiamina, etanolamina, etilamina, etilendiamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lh-imidazol, lisina, metilamina, N-etilpiperidina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, N,N-dimetilanilina, piperazina, trolamina, metilglucamina, purinas, piperidina, piridina, teobromina, compuestos de tetrametilamonio, compuestos de tetraetilamonio, trimetilamina, trietilamina, tripropilamina y tributilamina y cationes metálicos como aluminio, calcio, cobre, hierro, litio, magnesio, manganeso, potasio, sodio y zinc.

Solvatos aceptables farmacéuticamente incluyen ilustrativamente hidratos, etanolatos, metanolatos.

Amidas aceptables farmacéuticamente de ejemplo incluyen amidas derivadas de amoniaco, alquilaminas de C 1 -C6 primarias y dialquilaminas de C1 -C 6 secundarias incluyendo aquellas en la forma de un heterociclo que contiene nitrógeno de 5 ó 6 miembros .

Un profármaco de TIC10 es una forma de TIC10 enlazado covalentemente a una porción la cual es liberada de TIC10 produciendo el activo intacto TIC10. Las formas de profármaco son bien conocidas en la técnica como se ejemplifica en Sloan, K.B., Prodrugs, . Dekker, New York, 1992 y Testa, B . And ayer, J.;M, Hydrolysis in drug and prodrug metabolism: chemistry, biochemistry and enzimology, Wiley-VCH, Zurich, 2003 .

Las composiciones farmacéuticas son proporcionadas las cuales incluyen: O un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente como un primer agente terapéutico, un portador aceptable farmacéuticamente, y un segundo agente terapéutico, como un agente anticáncer.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo de acuerdo a aspectos de la presente invención que incluyen administración de una cantidad efectiva farmacéuticamente de (I) un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo son que incluyen administración de una cantidad efectiva farmacéuticamente de un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente; efectivos para inducir expresión de TRAIL en el sujeto.

La proteina TRAIL puede ser ensayada en una muestra de prueba obtenida a partir de un sujeto para detectar expresión de TRAIL inducida por TIC10.

Los métodos de inmunoensayo pueden ser usados para ensayar TRAIL en una muestra, que incluyen, pero no se limitan a, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA por sus siglas en inglés), ensayo de inmunofiltración ligado a enzima (ELIFA ligado a enzima) , citometria de flujo, inmunoblot, inmunoprecipitación, inmunohistoquimica, inmunocitoquimica, inmunoensayo luminiscente (LIA por sus siglas en inglés), inmunoensayo fluorescente (FIA por sus siglas en inglés), y radioinmunoensayo . Pueden ser usados métodos de ensayo para obtener resultados cualitativos y/o cuantitativos. Detalles específicos de métodos de ensayo adecuados para tanto ensayo cualitativo y cuantitativo de una muestra son descritos en referencias estándar, que incluyen ilustrativamente E. Harlow and D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; F. Breitling and S. Dübel, Recombinant Antibodies, John iley & Sons, New York, 1999; H. Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics: From Background to Bench, BIOS Scientific Publishers, 2000; B.K.C. Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003; F. M. Ausubel et al . , Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; S. lussman, Ed., The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Wiley, 2006; Ormerod, M. G., Flow Cytometry: a practical approach, Oxford University Press, 2000; Givan, A. L., Flow Cytometry: first principies, Wiley, New York, 2001; Gorczyca, W., Flow Cytometry in Neoplastic Hematology: morphologic-immunophenotypic correlation, Taylor & Francis, 2006; Crowther, J. R., The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2000; Wild, D., The Immunoassay Handbook, 3a edición, Elsevier Science, 2005, y J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edición, 2001.

Los aptámeros pueden ser usados para ensayar una muestra para TRAIL. El término "aptámero" se refiere a un péptido y/o ácido nucleico que enlaza especifica y substancialmente a una substancia especifica. En el caso de un aptámero de ácido nucleico, el aptámero es caracterizado por interacción de enlace con un objetivo diferente al par de base Wtason/Crick o enlace de triple hélice con un segundo y/o tercer ácido nucleico. La interacción de enlace puede incluir interacción de Van der Waals, interacción hidrofóbica, enlace de hidrógeno y/o interacciones electrostásticas , por ejemplo. Similarmente, los aptámeros a base de péptido se caracterizan por enlace especifico a un objetivo en donde el aptámero no es un ligando que ocurre natualmente para el objetivo. Las técnicas para identificación y generación de aptámeros de péptido y ácido nucleico y su uso son conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, iley 2002: S. Klussman, Ed. The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Wiley, 2006; y J. Sambrook and D. W. Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a Edición, 2001.

Se usa el análisis espectrométrico para ensayar una muestra para TRAIL. Por ejemplo puede ser usado el análisis de masa en un ensayo de acuerdo a aspectos de la presente invención. El análisis de masa se realiza usando, por ejemplo, espectrometría de masa con analizador de tiempo de vuelo (TOF por sus siglas en inglés) o espectrometría de masa de resonancia de ciclotrones de iones de transformada de Fourier. Las técnicas de espectrometría de masa son conocidas en la técnica y descripciones detalladas de ejemplo de métodos para ensayos de proteína y/o de péptido son encontrados en Li J. , et al., Clin Chem. , 48 (8) : 1296-304, 2002; Hortin, G.L., Clinical Chemistry 52: 1223-1236, 2006; Hortin, G.L., Clinical Chemistry 52: 1223-1237, 2006; A.L. Burlingame, et al. (Eds.), Mass Spectrometry in Biology and Medicine, Humana Press, 2000; y D.M. Desiderio, Mass Spectrometry of Peptides, CRC Press, 1990.

Puede ser ensayada localización de TRAIL en la superficie de células para detectar un efecto de una composición farmacéutica de la presente invención. La detección de localización de TRAIL puede ser realizada por inmunoensayo, como citometria de flujo, asi como también por inmunohistoquimica .

Una muestra de prueba puede ser cualquier fluido biológico, célula o tejido de un sujeto, que incluye ilustrativamente sangre, plasma, suero, orina, saliva, ascitis, fluido cerebroespinal, fluido cerebroventricular, fluidos pleurales, muestras de lvado pulmonar y bronquial, mucosa, sudor, lágrimas, semen, muestras de lavado de vejiga, fluido amniótico, linfático, fluido peritoneal, fluido sinovial, aspirado de médula ósea, células o tejido tumorales, células o tejido de órgano, como material de biopsia. En aspectos preferidos, una muestra de prueba es sangre, plasma o suero.

Una muestra de prueba a partir de un sujeto es opcionalmente purificada para TRAIL u otro ensayo biomarcador. El término "purificado" en el contexto de una muestra de prueba se refiere a separación de TRAIL u otro biomarcador a partir de por lo menos otro componente presente en la muestra de prueba. Se logra la purificación de muestra de prueba por técnicas que incluyen ilustrativamente métodos electroforéticos como electroforesis de gel, y electroforesis de gel 2-D; métodos de cromatografía como HPLC, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de capa fina y de papel.

Ensayo de TRAIL puede ser realizado en células y tejidos. Por ejemplo, métodos inmunohistoquímicos e hibridización in situ pueden ser usados para ensayar proteína y/o ácido nucleico de TRAIL en una muestra de prueba de célula o tejido.

Uno o más estándares pueden ser usados para permitir la determinación cuantitativa de TRAIL en una muestra.

Puede ser comparado el ensayo de TRAIL en una muestra de prueba con el ensayo de TRAIL en una muestra de control. Las muestras de control pueden ser obtenidas, por ejemplo, a partir de uno o más sujetos normales.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, se usan ensayos para TRAIL para monitorear un sujeto. De esta forma, por ejemplo, se obtiene una muestra de prueba a partir del sujeto antes del tratamiento con una composición farmacéutica de la presente invención y una o más veces durante y/o después del tratamiento con el fin de evaluar eficacia del tratamiento. En un ejemplo adicional, se obtiene una muestra de prueba a partir del sujeto varias veces con el fin de evaluar el curso o progreso de enfermedad o curación.

En aspectos particulares, uno o más biomarcadores adicionales son ensayados en una muestra de prueba obtenida de un sujeto para auxiliar en monitorear el tratamiento con una composición farmacéutica de la presente invención. Por ejemplo, se ensaya uno o más de fosfo-ERK, fosfo-Akt, localización y/o fosforilación de Foxo3a en una muestra de prueba obtenida de un sujeto para auxiliar en monitorear el tratamiento con una composición farmacéutica de la presente invención. Los biomarcadores adicionales son ensayados por métodos de inmunoensayo como aquellos descritos en la misma.

El ácido nucleico de TRAIL puede ser ensayado en una muestra de prueba obtenida de un sujeto para detectar expresión de TRAIL inducido por TIC10. Ensayos para detectar ácidos nucleicos de TRAIL, particularmente ARNm o ADNc, incluyen, pero no se limitan a, reacciones de cadena polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) como RT-PCR, dot blot, hibridización in situ, Northern blot y protección de ARNasa .

Se proporcionan métodos y composiciones de acuerdo a la presente invención para tratamiento de cáncer.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer, de acuerdo a aspectos de la presente invención que incluyen administración de una cantidad efectiva farmacéuticamente de un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptable farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer, que incluyen administración de una cantidad efectiva farmacéuticamente de un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, y un portador aceptables farmacéuticamente; efectivos para inducir expresión de TRAIL en el sujeto.

Los cánceres tratados usando métodos y composiciones descritos en la presente son caracterizados por proliferación celular anormal que incluyen, pero no limitado a, hiperproliferación preneoplástica, cáncer in situ, neoplasmas y metástasis. Métodos y composiciones de la presente invención pueden ser usados para profilaxis asi como también mejoramiento de signos y/o síntomas de cáncer. Los términos "tratar" y "tratamiento" usados para referir tratamiento de un cáncer en un sujeto incluyen: prevenir, inhibir o mejorar el cáncer en el sujeto, como progresión lenta del cáncer y/o reducir o mejorar un signo o síntoma del cáncer .

Una cantidad efectiva farmacéuticamente de una composición de la presente invención es una cantidad la cual tiene un efecto benéfico en un sujeto que es tratado. En sujetos que tienen cáncer o en riesgo de tener cáncer, como una afección caracterizada por proliferación celular anormal que incluye, pero no limitada a, hiperproliferación preneoplástica, cáncer in situ, neoplasmas, metástasis, un tumor, un crecimiento benigno u otra afección responsiva a una composición de la presente invención, una cantidad efectiva farmacéuticamente de una composición de la presente invención es efectiva para mejorar o prevenir uno o más signos y/o síntomas de la afección. Por ejemplo, una cantidad efectiva farmacéuticamente de una composición de la presente invención es efectiva para incrementar detectablemente apoptosis y/o disminuir proliferación de células de una afección de cáncer caracterizada por proliferación celular anormal que incluye, pero no limitado a, hiperproliferación preneoplástica, cáncer in situ, neoplasmas, metástasis, un tumor, un crecimiento benigno, u otra afección responsiva a una composición de la presente invención.

TIC10 posee actividad de amplio espectro descrita en la presente en muestras primarias de paciente y líneas celulares que son resistentes a terapias convencionales, indicativos que la acción terapéutica de TIC10 no depende exclusivamente de moléculas alteradas comúnmente en cáncer como EGFR, Her2, KRAS o PTEN. La elucidación del mecanismo celular terapéutico de TIC10 permite la identificación de mecanismos de resistencia como Akt sobre activado, descrito en la presente, y proporciona fosfo ERK, fosfo-Akt, localización y fosforilación de Foxo3a, y TRAIL superficial y de suero como biomarcadores correlativos de actividad terapéutica de TIC10 en cáncer.

De esta forma, de acuerdo a aspectos de la presente invención, se ensayan uno o más biomarcadores correlativos de actividad terapéutica de TIC10 en cáncer para evaluar tratamiento con una composición farmacéutica de la presente invención .

Un sujeto tratado de acuerdo a métodos y que usa composiciones de la presente invención puede ser mamífero o no mamífero. Un sujeto mamífero puede ser cualquier mamífero que incluye, pero no limitado a, humano; un primate no humano; un roedor como un ratón, rata, o cobayo; una mascota domesticada como un gato o perro; un caballo, vaca, cerdo, borrego, cabra o conejo. Un sujeto no mamífero puede ser cualquier no mamífero incluyendo, pero no limitado a, un pájaro como pato, ganso, pollo o guajolote. Los sujetos pueden ser ya sea de género y pueden ser de cualquier edad. En aspectos de métodos que incluyen administración de una composición farmacéutica inventiva a un sujeto, el sujeto es humano. Los términos "sujeto" y "paciente" son usados intercambiamente en la presente.

Una composición farmacéutica de acuerdo a la invención generalmente incluye aproximadamente 0.1-99% de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente. Las combinaciones de TIC10 y por lo menos un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente en una composición farmacéutica son también consideradas dentro del alcance de la presente invención. Adicionalmente, combinaciones de por lo menos dos de: un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente en una composición farmacéutica, están también consideradas dentro del alcance de la presente invención .

Se administran combinaciones de agentes terapéuticos de acuerdo a aspectos de la presente invención. De acuerdo a aspectos, de los métodos de la presente invención de tratamiento del cáncer en un sujeto incluyen administración de una composición farmacéutica de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y por lo menos un agente terapéutico adicional. De acuerdo a aspectos, de los métodos de la presente invención de tratamiento de cáncer en un sujeto incluyen administración de una composición farmacéutica de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y por lo menos dos agentes terapéuticos adicionales .

El término "agente terapéutico adicional" es usado en la presente para referirse a un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica (como un ácido nucleico, un anticuerpo, una proteína o porción del mismo, por ejemplo, un péptido) , o un extracto hecho de materiales biológicos como bacterias, plantas, hongos, o células o tejidos animales (particularmente mamíferos) el cual - es una substancia (o substancias) biológica, fisiológica o farmacológicamente activa que actúa local o sistemáticamente en un sujeto.

Los agentes terapéuticos adicionales incluidos de acuerdo a aspectos de métodos y composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, antivirales, agentes antineoplásticos, analgésicos, antipiréticos, antidepresivos, antipsicóticos, agentes anticáncer, antihistaminas, agentes anti-osteoporosis, agentes anti-osteonecrosis, agentes antiinflamatorios, anxioliticos, agentes quimioterapéuticos, diuréticos, factores de crecimiento, hormonas, agentes antiinflamatorios no esteroidales, esteroides y agentes vasoactivos.

Las terapias de combinación que utilizan TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente y uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden mostrar efectos sinergísticos, por ejemplo, un efecto terapéutico mayor que puede ser observado usando una composición farmacéutica de la presente invención que incluye TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, o uno o más agentes terapéuticos adicionales solos como una monoterapia.

De acuerdo a aspectos, terapias de combinación incluyen: (1) composiciones farmacéuticas que incluyen una composición farmacéutica que incluye TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente de la presente invención formulados juntos en una composición simple con uno o más agentes terapéuticos adicionales; y (2) coadministración de una composición farmacéutica que incluye TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente con uno o más agentes terapéuticos adicionales en donde la composición farmacéutica que incluye TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente de la presente invención y el uno o más agentes terapéuticos adicionales no han sido formulados en la misma composición. Cuando se usan formulaciones separadas, la composición farmacéutica que incluye TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente de la presente invención puede ser administrada al mismo tiempo, tiempos intermitentes, tiempos alternados, antes a, subsecuente a, o combinaciones de los mismos, con referencia a la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Tratamientos de combinación pueden permitir dosis efectiva reducida e Índice terapéutico incrementado de la composición farmacéutica que incluye TICIO, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente de la presente invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales usados en métodos de la presente invención.

De acuerdo a aspectos, terapias de combinación incluyen: (1) composiciones farmacéuticas que incluyen una composición farmacéutica que incluye TICIO, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente de la presente invención formulados juntos en una sola composición con uno o más agentes anticáncer adicionales; y (2) coadministración de una composición farmacéutica que incluye TICIO, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptable farmacéuticamente de la presente invención con uno o más agentes anticáncer adicionales en donde la composición farmacéutica que incluye TICIO, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente de la presente invención y el uno o más agentes terapéuticos adicionales no han sido formulados en la misma composición. Cuando se usan formulaciones separadas, la composición farmacéutica que incluye TICIO, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente de la presente invención puede ser administrada al mismo tiempo, tiempos intermitentes, tiempos alternados, antes a, subsecuente a, o combinaciones de los mismos, con referencia a la administración de uno o más agentes anticáncer adicionales.

Se describen los agentes anticáncer, por ejemplo en Goodman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a edición, acmillan Publishing Co., 1990.

Los agentes anticáncer incluyen ilustrativamente acivicina, aclarubicina, acodazol, acronina, adozelesina, aldesleucina, alitretinoina, alopurinol, altretamina, ambomicina, ametantrona, amifostina, aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, antramicina, trióxido de arsénico, asparaginasa, asperlina, azacitidina, azetepa, azotomicina, batimastat, benzodepa, bevacizumab, bicalutamida, bisantreno, dimesilato de bisnafida, bizelesina, bleomicina, brequinar, bropirimina, busulfan, cactinomicina, calusterona, capecitabina, caracemida, carbetimer, carboplatina, carmustine, carubicina, carzelesina, cedefingol, celecoxib, clorambucil, cirolemicina, cisplatina, cladribina, mesilato de crisnatol, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, decitabina, dexormaplatina, dezaguanina, mesilato de dezaguanina, diazicuona, docetaxel, doxorubicina, droloxifene, dromostanolona, duazomicina, edatrexato, eflomitina, elsamitrucina, enloplatina, enpromate, epipropidina, epirubicina, erbulozol, esorubicina, estramustina, etanidazol, etoposido, etoprina, fadrozol, fazarabina, fenretinido, floxuridina, fludarabina, fluorouracil, flurocitabina, fosquidona, fostriecina, fulvestrant, gemcitabina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, ilmofosina, interleucina II (IL-2, incluyendo interleucina recombinante II ó rIL2 por sus siglas en inglés) , interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon alfa-nl, interferon alfa-n3, interferon beta-la, interferon gamma-Ib, iproplatina, irinotecan, lanreotide, letrozol, leuprolide, liarozol, lometrexol, lomustine, losoxantrona, masoprocol, maitansina, clorhidrato de mecloretamina, megestrol, acetato de melengestrol, melfalan, menogaril, mercaptopurina, metotrexato, metoprina, meturedepa, mitindomida, mitocarcina, mitocromina, mitogilina, mitomalcina, mitomicina, mitosper, mitotano, mitoxantrona, ácido micofenólico, nelarabina, nocodazol, nogalamicina, ormnaplatina, oxisuran, paclitaxel, pegaspargasa, peliomicina, pentamustina, peplomicina, perfosfamida, pipobroman, piposulfan, clorhidrato de piroxantrona, plicamicina, plomestane, porfimer, porfiromicina, prednimustina, procarbazina, puromicina, pirazofurina, riboprina, rogletimida, safingol, semustina, simtrazeno, sparfosato, esparsomicina, espirogermanio, espiromustina, espiroplatina, estreptonigrina, estreptozocina, sulofenur, talisomicina, tamoxifen, tecogalan, tegafur, teloxantrona, temoporfina, tenipósido, teroxirona, testolactona, tiamiprina, tioguanina, tiotepa, tiazofurina, tirapazamina, topotecan, toremifeno, trestolona, triciribina, trimetrexato, triptorelin, tubulozol, uracilo mostaza, uredepa, vapreotida, verteporfina, vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, vinepidina, vinglicinato, vinleurosina, vinorelbina, vinrosidina, vinzolidina, vorozol, zeniplatino, zinostatin, zoledronato y zorubicin.

Efectos sinergísticos de tratamiento de combinación con una composición farmacéutica que incluye TIC10 con uno o más agentes anticáncer adicionales como uno o más inhibidores mitóticos y/o uno o más agentes anti-angiogénicos es encontrado inesperadamente como se describe en la presente.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer o en riesgo de tener cáncer incluye administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un inhibidor mitótico.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, un método para tratar un sujeto que tiene cáncer o en riesgo de tener cáncer incluye administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un inhibidor mitótico taxane, como, pero no se limita a, paclitaxel y docetaxel.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, un método para tratar un sujeto que tiene cáncer o en riesgo de tener cáncer incluye administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, y un agente antiangiogénico .

De acuerdo a aspectos de la presente invención, un método para tratar un sujeto que tiene cáncer o en riesgo de tener cáncer incluye administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de TIC10, un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un agente antiangiogénico, como, pero no limitado a, bevacizumab.

En aspectos particulares de composiciones inventivas, la cantidad del agente anticáncer adjunto administrado es menor a una cantidad del agente anticáncer adjunto necesario para lograr un efecto terapéutico si se administra sin administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de estructura (I), un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente. De esta forma, en aspectos particulares de composiciones de la presente invención, la cantidad del agente anticáncer adjunto en una dosis de unidad de la composición es por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, o por lo menos 90%, menos de una cantidad del agente anticáncer adjunto necesario para lograr un efecto terapéutico, si se administra sin la cantidad efectiva terapéuticamente de estructura (I), un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, TRAIL puede ser inducido o proporcionado por métodos o composiciones además de administración de TIC10, como por administración de uno o más inhibidores de histona deacetilasa (HDAC por sus siglas en inglés) como vorinostat, descrito en Nebbioso, A. et al., 2005, Nat Med 11, 77-84; uno o más anticuerpos agonistas de TRAIL como lexatumumab y mapatumumab; y/o TRAIL recombinante como TRAIL adenoviral como se describe en Abdulghani, J. et al., 2010, Exp. Opin. Ther. Targets 14:1091-1108.

Opcionalmente, un método para tratar un sujeto que tiene cáncer o en riesgo de tener cáncer además incluye un tratamiento anticáncer adjunto. Un tratamiento anticáncer adjunto puede ser un tratamiento de radiación de un sujeto o un área afectada de un cuerpo de sujeto.

La expresión de TRAIL inducida en el sujeto por administración de una composición farmacéutica de la presente invención es detectable en una muestra obtenida del sujeto, como una muestra sanguínea obtenida a partir del sujeto.

Aspectos de la presente invención incluyen sobreregulación del gen de TRAIL por tejidos normales y tumorales con niveles séricos sostenidos de TRAIL secretado, después de una dosis simple de TIC10, por 3-4 días. Normalmente la vida media sérica de la proteína de TRAIL es 20-30 minutos.

TIC10 tiene una masa calculada de 387.21 y cruza la barrera de sangre-cerebro. La administración de TIC10 permite la inducción de TRAIL en células del sistema nervioso central, ilustrativamente que incluye células gliales y neuronas del cerebro y médula espinal. Además, la administración de un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato o profármaco aceptables farmacéuticamente de TIC10 el cual cruza la barrera sangre-cerebro permite la inducción de TRAIL en células del sistema nervioso central.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o en riesgo de tener, cáncer del sistema nervioso central (CNS por sus siglas en inglés) de acuerdo a aspectos de la presente invención lo cual incluye administración de una cantidad efectiva farmacéuticamente de: y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente por una ruta de administración diferente a administración directa al CNS.

Los cánceres del CNS primarios y metástasis de CNS de cánceres no del CNS, también llamado cáncer cerebral en la presente, son tratados de acuerdo a aspectos de la presente invención. Los cánceres de CNS primarios tratados de acuerdo a aspectos de la presente invención incluyen pero no se limitan a gliomas, meningiomas, adenomas pituitarios y tumores de vaina nerviosa. Glioblastoma multiforme es un cáncer del CNS primario tratado de acuerdo con aspectos de la presente invención. Los oligodendrogliomas son cánceres del CNS primarios tratados de acuerdo con aspectos de la presente invención .

Métodos de la presente invención incluyen administración de una composición farmacéutica de la presente invención por una ruta de administración que incluye, pero no se limita a, oral, rectal, nasal, pulmonar, epidural, ocular, ótica, intraarterial, intracardiaca, intracerebroventricular, intradérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , intraóseo, intratecal, intravesical, subcutánea, tópica, transdérmica, y transmucosal, como por rutas de administración sublingual, bucal, vaginal e inhalación.

Se proporcionan métodos de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo de acuerdo a aspectos de la presente invención los cuales incluyen administración oral de una cantidad efectiva farmacéuticamente de: un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, formulados para administración oral.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede estar en cualquier forma de dosis adecuada para administración a un sujeto, ilustrativamente que incluye formas de dosis sólida, semisólida y liquida como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, supositorios, tabletas, soluciones, suspensiones, ungüentos, lociones, cremas, geles, pastas, dispersiones y aerosoles. Liposomas y emulsiones son tipos bien conocidos de formulaciones farmacéuticas que pueden ser usadas para suministrar un agente farmacéutico, particularmente un agente farmacéutico hidrofóbico. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención generalmente incluyen un portador aceptable farmacéuticamente como un excipiente, diluyente y/o vehículo. Pueden ser usadas formulaciones de liberación retrasada de composiciones y sistemas de liberación retrasada, como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos.

Una formulación farmacéutica de una composición de la presente invención puede incluir un portador aceptable farmacéuticamente. El término "portador aceptable farmacéuticamente" se refiere a un portador el cual es adecuado para uso en un sujeto sin demasiada toxicidad o irritación para el sujeto y el cual es compatible con otros ingredientes incluidos en una composición farmcéutica.

Los portadores aceptables farmacéuticamente, métodos para hacer composiciones farmacéuticas y varias formas de dosis, así como también modos de administración son bien conocidos en la técnica, por ejemplo como se detalla en Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds . H. A. Lieberman et al., New York: Marcel Dekker, Inc., 1989; y en L.V. Alien, Jr. Et al., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8a edición, Philadelphia, PA: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; A.R. Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21 st ed., 2005, particularmente capitulo 89; y J.G. Hardman et al., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Professional, 10a edición., 2001.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a aspectos de la presente invención son formuladas para administración oral.

Una forma de dosis sólida para administración o para suspensión en un liquido antes a administración incluye ilustrativamente cápsulas, tabletas, polvos y gránulos. En las formas de dosis sólidas, uno o más agentes activos, se mezcla con por lo menos un portador que incluye ilustrativamente un amortiguador como, por ejemplo, citrato de sodio o un fosfato de metal alcalino que incluye ilustrativamente fosfatos de sodio, fosfatos de potasio y fosfatos de calcio; un agente de relleno como, por ejemplo, almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, un aglutinante como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, . alignatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia; un humectante como, por ejemplo, glicerol; un agente desintegrante como, por ejemplo agar-agar, carbonato de calcio, almidones vegetales como papa o almidón de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos, y carbonato de sodio; un retardante de solución como, por ejemplo, parafina; un acelerador de absorción como, por ejemplo, un compuesto de amonio cuaternario; un agente humectante como, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerol, y un glicol; un adsorbente como, por ejemplo, caolina y bentonita; un lubricante como, por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, un polietilenglicol sólido o laurilsulfato de sodio; un conservador como un agente antibacteriano y un agente antifúngico, que incluye por ejemplo, ácido sórbico, gentamicina y fenol; y un estabilizante como, por ejemplo, sacarosa, EDTA, EGTA, y un antioxidante .

Formas de dosis sólidas incluyen opcionalmente un recubrimiento como un recubrimiento entérico. El recubrimiento entérico es típicamente un material polimérico. Los materiales de recubrimiento entérico preferidos tienen las características de ser polímeros gradualmente solubles en agua y/o gradualmente hidrolizables, bioerosionable . La cantidad de material de recubrimiento aplicado a una dosis sólida generalmente dicta el intervalo de tiempo entre ingestión y liberación del fármaco. Se aplica un recubrimiento que tiene un espesor de tal forma que el recubrimiento total no disuelve en los fluidos gastrointestinales en pH abajo de 3 asociado con ácidos estomacales, aún disuelve arriba de pH 3 en el ambiente de intestino delgado. Se espera que cualquier polímero aniónico que exhibe un perfil de solubilidad dependiente a pH sea usado fácilmente como un recubrimiento entérico en la práctica de la presente invención para lograr suministro del agente activo al tracto gastrointestinal inferior. La selección del material de recubrimiento entérico específico depende de las propiedades como resistencia a desintegración en el estómago; impermeabilidad a fluidos gástricos y difusión de agente activo mientras está en el estómago, capacidad para disipar en el sitio intestinal objetivo; estabilidad física y química durante almacenamiento; no toxicidad, y facilidad de aplicación.

Los materiales de recubrimiento entéricos adecuados incluyen ilustrativamente polímeros celulósicos como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxiprópilmetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, trimelitato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxiprópilmetilcelulosa, succinato de hidroxiprópilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica; polímeros y copolímeros de ácido acrílico, preferentemente formados de ácido acrílico, ácido metacrílico, acrilato de metilo, metilacrilato de amonio, acrilato de etilo, metacrilato de metilo y/o etilo, polímeros y copolímeros de vinilo como polivinilpirrolidona, acetato de polivinilo, ftalato de polivinilacetato, copolímero de ácido vinilacetato crotónico, y copolímeros de acetato de etilen-vinilo, laca; y combinaciones de los mismos. Un material de recubrimiento entérico particular incluye polímeros y copolímeros de ácido acrílico descritos por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,136,345.

El recubrimiento entérico opcionalmente contiene un plastificante para evitar la formación de poros y grietas que permiten la penetración de los fluidos gástricos en la forma de dosis sólida. Los plastificantes adecuados incluyen ilustrativamente, citrato de trietilo (Citroflex 2) , triacetina (triacetato de glicerilo) , citrato de acetiltrietilo (Citroflec A2) , Carbowax 400 (polietilenglicol 400) , ftalato de dietilo, citrato de tributilo, monoglicéridos acetilados, glicerol, ésteres de ácidos grasos, propilenglicol, y ftalato de dibutilo. En particular, un recubrimiento compuesto de un polímero acrílico carboxílico aniónico contiene típica y aproximadamente 10% a 25% en peso de un plastificante, particularmente ftalato de dibutilo, polietilenglicol, citrato de trietilo y triacetina. El recubrimiento puede también contener otros excipientes de recubrimiento como dispersantes, agentes antiespumantes, lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio) y estabilizantes (por ejemplo hidroxipropilcelulosa, ácidos o bases) para solubilizar o dispersar el material de recubrimiento, y mejorar el comportamiento de recubrimiento y el producto recubierto.

Las formas de dosis liquidas para administración oral incluyen uno o más agentes activos y un portador aceptable farmacéuticamente formulado como una emulsión, solución, suspensión, jarabe o elixir. Una forma de dosis liquida de una composición de la presente invención puede incluir un colorante, un estabilizante, un agente de humectación, un agente de emulsificación, un agente de suspensión, un edulcorante, un saborizante o un agente de perfumería .

Por ejemplo, una composición para administración parental puede ser formulada como un líquido inyectable. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles como propilenglicol, polietilenglicol, glicerol y similares, mezclas adecuadas de los mismos; aceites vegetales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables como etiloleato. La fluidez apropiada puede ser mantenida por ejemplo por el uso de un recubrimiento como lecitina, por el mantenimiento de un tamaño de partícula deseable en el caso de dispersiones, y/o por el uso de un tensioactivo, como laurilsulfato de sodio.

Un estabilizante es opcionalmente incluido como, por ejemplo, sacarosa, EDTA, EGTA, y un antioxidante.

Para administración tópica, una composición puede ser formulada para administración a la piel como para efecto local, y/o como una formulación de "parche" para suministro tránsdérmico . Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración tópica incluyen, por ejemplo, ungüentos, lociones, cremas, geles, pastas, dispersiones y polvos. Los ungüentos, lociones, cremas, geles y pastas pueden incluir, además de uno o más agentes activos, una base como una base de absorción, base removible de agua, base soluble de agua o base oleaginosa y excipientes como un agente espesante, un agente de gelificación, un colorante, un estabilizante, un agente emulsificante, un agente de suspensión, un agente edulcorante, un saborizante, o un agente de perfumería.

Las formulaciones transdérmicas pueden incluir incrementadores de absorción percutánea como acetona, azona, dimetilacetamida, dimetilformamida, sulfóxido de dimetilo, etanol, ácido oleico, polietilenglicol, propilenglicol y laurilsulfato de sodio. Yonotoforesis y/o sonoforesis pueden ser usados para incrementar el suministro tránsdérmico.

Los polvos y aspersiones para administración tópica de uno o más agentes activos pueden incluir excipientes como talco, lactosa y uno o más ácidos silícicos. Las aspersiones pueden incluir un propelente farmacéutico como un propelente de hidrocarburo fluorinado, bióxido de carbono, o un gas adecuado. Alternativamente, puede ser suministrado una aspersión a partir de un dispositivo de aspersión de estilo de bomba el cual no requiere un propelente. Un dispositivo de aspersión suministra una dosis medida de una composición contenida en el mismo, por ejemplo, usando una válvula para regulación de una cantidad suministrada.

Las formulaciones oftálmicas de uno o más agentes activos pueden incluir ingredientes como un conservador, un amortiguador y un agente espesante.

Los agentes tensioactivos adecuados útiles como un portador o excipiente aceptable farmacéuticamente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen tensioactivos no iónicos, catiónicos y/o aniónicos que tienen buenas propiedades emulsificantes , dispersantes y/o humectantes. Los tensioactivos aniónicos adecuados incluyen tanto jabones solubles en agua y agentes tensioactivos sintéticos solubles en agua. Los jabones adecuados son sales de metal alcalino o alcalino férreos, sales de amonio no substituidas o substituidas de ácidos grasos superiores (C10-C22), por ejemplo, las sales de sodio o potasio de ácido oleico o esteárico, o de mezclas de ácidos grasos naturales obtenibles de aceite de coco o aceite de sebo. Los tensioactivos sintéticos incluyen sales de sodio o calcio de ácidos poliacrilicos ; sulfonatos y sulfatos grasos; derivados de bencimidazol sulfonados y alquilarilsulfonatos . Los sulfonatos o sulfatos grasos están usualmente en la forma de sales de metal alcalino o alcalino férreos, sales de amonio no substituidas o sales de amonio substituidas con un radical alquilo o acilo que tiene de 8 a 22 átomos de carbono, por ejemplo la sal de sodio o calcio de ácido lignosulfónico o ácido dodecilsulfónico o una mezcla de sulfatos de alcohol graso obtenidos de ácidos grasos naturales, sales de metal alcalino o alcalino férreo de ésteres de ácido sulfúrico o sulfónico (como laurilsulfato de sodio) y ácidos sulfónicos de aductos de alcohol graso/óxido de etileno. Los derivados de bencimidazol sulfonados adecuados contienen preferentemente 8 a 22 átomos de carbono. Ejemplos de alquilarilsulfonatos son las sales de sodio, calcio o alcanolamina de ácido dodecilbencensulfónico o ácido dibutil-naftalensulfónico o un producto de condensación de ácido naftalensulfónico/formaldehido . También son adecuados los fosfatos correspondientes, por ejemplo sales de éster de ácido fosfórico y un aducto de p-nonilfenol con óxido de etileno y/o propileno, o fosfolipidos . Los fosfolípidos adecuados para este propósito son los fosfolípidos naturales (que se originan de células animales o vegetales) o sintéticos del tipo cefalina o lecitina como por ejemplo fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina, lisolecitina, cardiolipina, dioctanilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y sus mezclas.

Los tensioactivos no iónicos adecuados útiles como portadores o excipientes aceptables farmacéuticamente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen derivados polietoxilados y polipropoxilados de alquilfenoles , alcoholes grasos, ácidos grasos, aminas alifáticas o amidas que contienen por lo menos 12 átomos de carbono en la molécula, alquilarensulfonatos y dialquilsulfosuccinatos, como derivados de poliglicol éter de alcoholes alifáticos y cicloalifáticos , ácidos grasos saturados e insaturados y alquilfenoles, los derivados que contienen preferentemente 3 a 10 grupos glicol éter y 8 a 20 átomos de carbono en la porción hidrocarburo (alifática) y 6 a 18 átomos de carbono en la porción alquilo del alquilfenol. Los tensioactivos no iónicos adecuados adicionales son aductos solubles en agua de óxido de polietileno con propilenglicol, etilendiaminopolipropilenglicol que contiene 1 a 10 átomos de carbono en la cadena alquilo, los aductos que contienen 20 a 250 grupos etilenglicol éter y/o 10 a 100 grupos propilenglicol éter. Los compuestos usualmente contienen de 1 a 5 unidades de etilenglicol por unidad de propilenglicol. Ejemplos representativos de tensioactivos no iónicos son nonilfenol-polietoxietanol, éteres poliglicólicos de aceite de ricino, aductos de óxido de polipropileno/polietileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol y octilfenoxipolietoxietanol . Los esteres de ácidos grasos de polietilensorbitan (como trioleato de polioxietilensorbitan) , glicerol, sorbitan, sacarosa y pentaeritritol son también tensioactivos no iónicos adecuados.

Los tensioactivos catiónicos adecuados útiles como portadores o excipientes aceptables farmacéuticamente en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen sales de amonio cuaternario, preferentemente haluros, que tienen 4 radicales hidrocarburo opcionalmente substituidos con halo, fenilo, fenilo substituilo o hidroxi; por ejemplo sales de amonio cuaternario que contienen como N-substituyente por lo menos un radical alquilo de C8-C22 (por ejemplo cetilo, laurilo, palmitilo, miristilo, oleilo y similares) y, como substituyentes adicionales, alquilo inferior no substituido o halogenado, bencilo y/o radicales alquilo hidroxi inferior.

Una descripción más detallada de agentes tensioactivos adecuados para este propósito puede ser encontrada por ejemplo en "McCutcheon ' s Detergents and Emulsifiers Annual" (MC Publishing Crop., Ridgewood, New Jersey, 1981), "Tensid-Taschenbuch", 2a ed. (Hanser Verlag, Viena, 1981) y "Encyclopaedia of Surfactants (Chemical Publishing Co, New York, 1981).

Los agentes formadores de estructura, espesantes o formadores de gel pueden ser incluidos en las composiciones farmacéuticas y preparaciones combinadas de la invención. Agentes adecuados son en particular ácido silícico altamente dispersado, como el producto disponible comercialmente bajo el nombre comercial Aerosil; bentonitas; sales de tetraalquilamonio de montmorilonitas (por ejemplo, productos comercialmente disponibles bajo la marca Bentone) , en donde cada uno de los grupos alquilo puede contener de 1 a 20 átomos de carbono; alcohol cetoesterílico y productos de aceite de ricino modificados (por ejemplo el producto comercialmente disponible bajo la marca Antisettle) .

En aspectos particulares, un portador aceptable farmacéuticamente es un portador particulado como partículas de lípidos que incluyen liposomas, micelas, vesículas unilamilares o multilaminares, partículas poliméricas como partículas de hidrogel, partículas de ácido poliglicólico o partículas de ácido poliláctico; partículas inorgánicas como partículas de fosfato de calcio como se describen en por ejemplo la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,648,097; y portadores particulados inorgánicos/orgánicos como se describen por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,630,486.

Un portador aceptable farmacéuticamente particulado puede ser seleccionado de entre una partícula de lípidos, una partícula de polímero; una partícula inorgánica; y una partícula inorgánica/orgánica. Una mezcla de tipos de partículas puede también ser incluida como un portador aceptable farmacéuticamente particulado.

Un portador particulado es formulado típicamente de tal forma que las partículas tienen un tamaño de partícula promedio en el intervalo de aproximadamente 1 nm - 10 mieras. En aspectos particulares, un portador particulado es formulado de tal forma que las partículas tienen un tamaño de partícula promedio en el intervalo de aproximadamente 1 nm -100 nm.

La dosis de una composición farmacéutica inventiva variará en base a factores como, pero no limitados a, la ruta de administración; la edad, altura, sexo y peso del sujeto al cual se administra la composición/ la naturaleza y grado de los síntomas del sujeto, si los hay, y el efecto deseado. La dosis puede ser ajustada dependiendo de si el tratamiento es para ser agudo o continuo. Un experto en la técnica puede determinar una cantidad efectiva farmacéuticamente en vista de estas y otras consideraciones típicas en la práctica médica .

En general se contempla que una dosis diaria de una composición farmacéutica inventiva está en el intervalo de aproximadamente 0.001 a 100 miligramos por kilogramo del peso corporal del sujeto. Una dosis diaria puede ser administrada como dos o más dosis divididas para obtener el efecto deseado. Una composición farmacéutica inventiva puede también ser formulada para liberación sostenida para obtener resultados deseados.

Se encuentra información detallada con respecto a ingredientes de costumbre, equipo y procesos para preparar formas de dosis en Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds. H. A. Lieberman et al., New York: Marcel Dekker, Inc., 1989; y en L. V. Alien, Jr. Et al., Ansel ' s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8a edición, Philadelphia, PA: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; A.R. Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21 edición, 2005, particularmente capítulo 89; y J. G. Hardman et al., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Professional, 10a edición, 2001.

Los paquetes comerciales de acuerdo a aspectos de la presente invención incluyen una composición farmacéutica descrita en la presente. Las instrucciones para administrar la composición farmacéutica son incluidas de acuerdo a aspectos de la invención.

De acuerdo a aspectos de la presente invención, un paquete comercial incluye un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

Uno o más componentes secundarios es opcionalmente incluido en paquetes comerciales de la presente invención, como un amortiguador o diluyente.

Aspectos de composiciones inventivas y métodos son ilustrados en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son proporcionados para propósitos ilustrativos y no son considerados limitaciones en el alcance de composiciones y métodos inventivos.

Ejemplos Reactivos y Ensayos a Base de Células Todas las lineas celulares son obtenidas de ATCC excepto las células HCT116 Bax1A y HCT116 p53_ " obtenidas de Bert Vogelstein (Johns Hopkins University, Baltimore, MA) y lineas celulares GBM obtenidas de Akiva Mintz (Wake Forrest University, Winston-Salem, NC) . Se realiza la infección lentiviral con células MDA-MB-231 usando shRNA o vector de TRAIL y HCT116 usando shRNA o vector de Foxo3a comprado de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Se construyen células H460 DR5ADD-EGFP usando ADNc que codifica para un fragmento DR5 sin dominio de muerte por insertar aminoácidos 1 a 298 del gen DR5 humano en el vector pEGFP-Nl para expresar una proteina de fusión DR5 (1-298). La construcción de fusión es transfectada en células H460 con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y seleccionada con G418. Los clones positivos son verificados por microscopía de florescencia y análisis Western blot. El tamizado de alto rendimiento bioluminiscente usando el grupo II de diversidad NCI es realizado en células HCT116 Bax~ _ que son cotransfectadas establemente para expresar una construcción de luciferasa de luciérnaga bajo control transcripcional de las primeras 504 pares de bases del promotor de TRAIL cadena arriba del inicio de transcripción del gen de TRAIL humano. Los compuestos son probados en una concentración de trabajo de 20 nM, 200 nM, 500 nM y 1 µ? con evaluación bioluminiscente de actividad transcripcional en 12, 24, 36 y 48 horas post tratamiento. Se describen detalles de la metodología de tamizado en Wang et al., 2006, PNAS 103:11003-11008). Se obtiene TIC10 (NSC350625) de NCI DTP, reconstituido en DMSO en 20 mM, llevado a alícuota y almacenado en -20 °C. Se obtienen A6730 y monoetanolato U0126 de Sigma. Se produce TRAIL purificado, recombinante como se describe en Kim et al., 2004, J. Of Biol. Chem. 279:40044-40052. Se usa el anticuerpo RIK-2 (Santa-Cruz Biotechnology) en 1 µg/mL y zVAD-fmk (Promega) en 20 µ?.

Especímenes Primarios a Partir de Pacientes Humanos Todos los especímenes primarios a partir de pacientes humanos son recibidos inmediatamente después de la resección, digeridos manualmente en DMEM completo, filtrados con una malla de nylon de 100 µp\ y colocados en placa en 2xl05 células/ml en DMEM completo para uso en los Ejemplos descritos en la presente.

Ratones Para xenoinjertos subcutáneos, se inoculan ratones hembra de 4-6 semanas de edad, atímicos nu/nu (Laboratorios Charles River) con lxlO6 células (2.5 x 106 para T98G) de líneas celulares indicadas en cada flanco trasero como una suspensión de 200 µ? de un matrigel 1:1 (BD):PBS. Todas las inyecciones intraperitoneales e intravenosas son dadas en un volumen total de 200 µL. Las formulaciones orales de TIC10 son administradas usando un gavage oral y dadas como 200 µL de una suspensión que contiene 20% de Cremophor EL® (Sigma), 10% de DMSO, y 70% de PBS . Los tumores son monitoreados usando calibradores digitales en puntos de tiempo indicados. Todos los ¦ tumores subcutáneos son permitidos para establecerse 1-4 semanas post-inyección 1-4 hasta que alcanzan un volumen de ~125 mm3 antes de inicio de tratamiento. Se monitorea el alivio del volumen tumoral por 3 semanas después de la desaparición del tumor y se confirma por inspección visual después de eutanasia.

Se realiza la implantación intracecal como se describe en Céspedes, .V., et al., Am J Pathol, 2007, 170 (3) : pág 1077-1085.

Para xenoinjertos intracraniales, se implantan ratones desnudos atimicos anestesiados con 2xl05 células SF767 en 25 µ?> de una suspensión de RPMI libre de suero y antibiótico. El sitio de inyección es un orificio circular creado 1 mm lateral a la linea media del cráneo y 1 mm anterior a la sutura coronal. La inyección es gradualmente administrada durante 5 minutos con una jeringa Hamilton y el orificio circular es sellado usando una cera de hueso. El tumor tomado es evaluado por imagen bioluminiscente 2 semanas después de la implantación. La imagen bioluminiscente de tumores es realizada en un sistema de imágenes IVIS como se describe en Wang et al., 2003, PNAS 100:15095-15100.

La imagen de infrarrojos cercanos de ratones es realizada en un sistema de imagen Pearl Impulse (LI-COR) después de la inyección de la vena de la cola de AngioSense® 680 (VisEn Medical, Woburn, MA) de acuerdo a los protocolos del fabricante. Se obtienen ratones ?µ-myc de 6 semanas de edad del Laboratorio The Jackson (B6. Cg-Tg ( IghMyc) 22Bri/J) .

Para ensayos de química sérica y CC/diferencial, se cosecha 1 mi de sangre a partir de ratones anestesiados por punción cardiaca terminal del ventrículo izquierdo. Para química sérica, se coloca 500 µ? en un tubo de microcentrífuga y se permite coagular por 30 minutos en temperatura ambiente seguido por centrifugación. Se remueve el suero, se centrífuga otra vez para remover cualesquiera coágulos adicionales, y se somete el suero a análisis. Para CBC/diferenciales, se recolecta 500 µ? de sangre en tubos EDTA y se analiza.

Análisis Estadísticos: Para comparaciones de modo de pares, se analizan datos por la prueba t de Students de dos colas usando Excel (Microsoft) . El análisis estadístico de rango logarítmico es realizado usando un script de base web que tiene interfases con el paquete estadístico R.

RT-qPC Se extrae ARN total usando RNeasy Minikit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genera ADNc usando SuperScript II (Invitrogen) con 1 µg de ARN y oligodT. Los cebadores son: TRAIL hacia adelante (CAGAGGAAGAAGCAACACA T, SEQ ID NO:l), TRAIL inverso (GGTTGATGATTCCCAGGAGTTTATTTTG, SEQ ID NO:2), GAPDH hacia adelante (CCACATCGCTCAGACACCAT, SEQ ID NO: 3), GAPDH inverso (GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT, SEQ ID NO: 4). La amplificación PCR es realizada con el sistema Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time Detection. Las muestras son estandarizadas a 10 ng/µ? y se utiliza entonces veinte ng de ADNc por muestra como un molde para PCR de tiempo real usando una mezcla maestra SYBR Green (Qiagen Corp, USA) . Las muestras son normalizadas a GAPDH usadas bajo condiciones idénticas. La cuantificación usa el método 2AACt de umbrales de cruzamiento descritos en Livak et al., 2001, Methods . 2001 Dec; 25(4):402-8, con GAPDH como el control endógeno para normalización. Las reacciones son realizadas en placas ópticas de 384 pozos en un instrumento 7900HT (Applied Biosystems) , con 10 µ? de volúmenes de reacción. El análisis de datos usa el software ABI PRISM 7900 Sequence Detection System 2.2. Para excluir la posibilidad de contaminación de ADN genómico, las reacciones PCR de control sin ADNc molde y muestras de control no RT son también realizadas para cada grupo de cebador especifico a gen. Se realizan cuadruplicados de cada reacción PCR y se promedian los datos resultantes.

Inmunofluorescencia Las lineas celulares indicadas son propagadas en crecimiento de fase logarítmica en placas de seis pozos en la presencia o ausencia de TIC10 en concentraciones de trabajo indicadas por 72 horas. Las células son fijadas y permeabilizadas usando solución de Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, San José, CA) . Las células son incubadas con anti-TRAIL (ab2435, Abcam, Cambridge, MA) en 1:100 ó caspasa- 3 anti-activo (559565, BD Pharmingen, San Diego, CA) en 1:250 en solución Perm/Wash (BD Biosciences) para 1 hora en la ausencia de luz. Se incuba el Alexa Fluor 488 anticonejo en 1:200 en solución Perm/Wash por 20 minutos en temperatura ambiente y se enjuaga en PBS. Se usa Hoechst 33342 (Invitrogen) como un contratinción nuclear de acuerdo al protocolo del fabricante. Se realiza la imagen de fluorescencia en un microscopio invertido Axiovert (Cari Zeiss Microlmaging) usando un sistema de imagen iVision (Biovision) .

Citómetria de Flujo y Ensayos de Muerte Celular Para todos los análisis de citometria de flujo, las células flotantes y adherentes son analizadas en un citómetro Coulter-Beckman Elite Epics. Para los experimentos de TRAIL superficial, se cosechan células adherentes por tripsinización breve, se fija en 4% de paraformaldehido en PBS por 20 minutos, se incuban con un anticuerpo anti-TRAIL por 2 horas (Abcam) , se lavan y se incuban con Alexafluor 488 anticonejo (Invitrogen) por 30 minutos, y se analiza. Las células son llevadas a dispersión frontal y lateral para eliminar residuos y células muertas a partir del análisis. Los datos de TRAIL superficiales son expresados como intensidad de fluorescencia media con relación a aquella de muestras de control a menos que se indique otra cosa. Para los experimentos de perfil de Sub-Gl y ciclo celular, todas las células son granulados y fijadas en etanol seguido por tinción con yoduro de propidio (Sigma) en la presencia de ARNasa. Los ensayos de viabilidad celular son realizados en placas de fondo claro de pared negra de 96 pozos usando CellTiter-Glo® (Promega) de acuerdo a los protocolos de fabricante. Se realizan las imágenes y cuantificación de estos ensayos en un sistema de imagen IVIS (Xenogen) .

Ensayos de Formación de Colonias Las líneas celulares indicadas son colocadas en placa en 500 células por pozo y tratadas el día siguiente en medios completos frescos después de la adherencia. 3 días post-tratamiento, se reemplaza los medios con medios libres de fármacos y las células son propagadas por 10 días con medio fresco dado una vez cada 3 días. En el final del periodo de 10 días, las células son lavadas en PBS, se fijan con metanol, y se tiñen con azul de Coomasie, se enjuagan y se secan para cuantificación.

Análisis de Tejido: Los ratones son sacrificados humanamente en puntos de tiempo indicados y tejido normal escindido o tumores son fijados en 4% de paraformaldehído/PBS durante la noche en 4°C. Si se desea las muestras de plasma, se recolectan 500 µ? de sangre por punción cardiaco terminal bajo anestesia en tubos EDTA-Vacutainer (BD) . Las muestras séricas son recolectados en una forma similar pero en tubos de microcentrífuga seguido por una incubación de 30 minutos en temperatura ambiente para permitir la coagulación. El suero es entonces removido después de la centrifugación por 5 minutos. Los bloques embebidos en parafeina, portaobjetos de sección serial, y tinción de hematoxilina y eosina son preparados de acuerdo a procedimientos estándar. Se realiza la tinción de TUNEL usando el kit de detección de apoptosis in situ de peroxidasa ApopTag® (Millipore) . Para el análisis IHC, se elimina la cera a los portaobjetos en xileno y se hidratan en una gradiente decreciente de etanol. Se realiza la recuperación de antigeno por llevar a ebullición en ácido cítrico 10 mM (pH 6.0) por 6 minutos. Las muestras son bloqueadas con estreptavidina y soluciones de bloqueo de biotina y suero de cabra (Vector Laboratories) . Los anticuerpos primarios son incubados durante la noche en 4°C en una cámara de humedad. La incubación con anticuerpo secundario bioestañado y deposición DAB es realizada de acuerdo al protocolo del fabricante (kit de Substrato de Vector Laboratories DAB para peroxidasa) . Las muestras son contrateñidas con hematoxilina (DAKO) por 6 minutos, se enjuagan en dH20 por 5 minutos, se enjuaga con PBS, y se deshidrata y sella con cubre objetos. Se registran las imágenes en un microscopio Axioskop usando software QCapture (Qlmaging) .

Cocui i os Los cocultivos de células HCT116 p53~/_ y HFF son realizados en una mezcla 1:1 de DMEM completo y medio McCoy's 5A. Para imágenes de fluorescencia, se etiquetan las dos células por separado usando los kits de enlazadores de células fluorescentes para etiquetado de membrana celular de gen (Sigma) de acuerdo a los protocolos del fabricante. Las células son contrateñidas con Hoechst 33342 como se describe en la sección de inmunofluorescencia . Para el análisis de citometria de flujo de muerte celular, se determinan las dos poblaciones de células por dispersión de luz diferencial y analizadas como se describe para análisis sub-Gl en la sección de ensayos de muerte celular.

ELISA Se realiza ELISA para TRAIL usando el kit Quantikine® TRAIL/TNFSFIO de acuerdo al protocolo del fabricante (DTRL00, R&D systems, Minneapolis, MN) . Se realiza la corrección óptica como se sugiere por el fabricante con absorbancia en 540 nm. Las absorbancias son medidas con un lector de placa DTX 880 (Beckman Coulter) .

Análisis de Farmacocinética de TIC10 El perfil de absorbancia de TIC10 es determinado en un espectrómetro de Gene Spec III (Hitachi Solutions American, South San Francisco, CA) . Se realiza el análisis HPLC por detección de absorbancia en 239 nm en un sistema Agilent serie 1200 (Agilent, Santa Clara, CA) usando una columna Eclipse XDB-C18 (Agilent) y un circuito de inyección de 100 µ??. Se realiza la elusión isocrática en 1 ml/min en 1% de ácido trifluoroacético en dH20. Se realiza un gradiente de acetonitrilo (ACN por sus siglas en inglés) para elusión como 15-20% de ACN en 0-5 minutos, 20-23% por 5-12 minutos, 25% por 12-18 minutos. La curva estándar es generada por concentraciones pico de TIC10 en plasma cosechado a partir de ratones desnudos atímicos a partir de experimentos no relacionados. Para todas las muestras de plasma, se obtiene la sangre por punción cardiaca terminal del ventrículo izquierdo y recolectada en tubos EDTA (BD) . Se centrifugan las muestras en 500 g por 10 minutos. Se desproteina el plasma por agregar 30 µ? de ácido perclórico a 100 µ?? de muestras, se lleva a vórtex por 15 segundos, se centriguga por 2 minutos, y el sobrenadante es inyectado inmediatamente en el HPLC. Se normaliza AUC a un pico de suero interno con un tiempo de retención de 8.1 minutos. Los datos AUC contra tiempo se fijan con un modelo abierto de dos compartimientos con eliminación de primer orden a partir del compartimiento central usando la ecuación AUC=Ae"at + Be"Pt donde t=tiempo y A y B son las concentraciones extrapoladas en el inicio de las dos fases (distribución y eliminación) . Vidas medias calculadas como ti/2n=-693/a y ti/2p= .693/ß . Otras ecuaciones usadas para cálculo incluyen CL=dosis/AUCo-a y Vd=dosis/ (AUCo-a?ß) · Análisis de Expresión de Gen Se hacen crecer células HCT116 p53" _ en fase log y se tratan con DMSO o TIC10 (10 µ?) . En 48 horas, se aisla ARN usando el RNeasy MiniKit (Qiagen) . Se realiza el análisis Microarray usando el Illumina HT-12 (Beadchip (Illumina) . Se evalúa la calidad y concentración de ARN (RNA por sus siglas en inglés usando un bioanalizador Agilent 2100 con ARN Nano LabChip® (Agilent) . Se sintetiza ARNc por Amplificación TotalPrep™ (Ambion) a partir de 500 ng de ARN de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se usa transcripción inversa con cebador T7 oligo (dT) para producir ADNc de primera cadena. ADNc entonces sufre síntesis de segunda cadena y degradación de ARN por ADN polimerasa y RNasa H, seguido por limpieza por filtración. Se emplea transcripción in vitro (IVT por sus siglas en inglés) para generar múltiples copias de ARNc bioestañado. Se purifica ARNc etiquetado usando filtración, cuantificado por NanoDrop, y ajustado en volumen para un total de 750 ng/muestra. Las muestras son fragmentadas, y se desnaturalizan antes de la hibridización por 18 horas en 58 °C. Después de la hibridización, se lavan los beadchips y se etiquetan fluorescentemente. Se escanean los beadchips con un lector BeadArray (Illumina) . Se crea un proyecto con los datos de barrido resultantes importados en GenomeStudio 1.0 (Illumina). Los resultados son exportados a GeneSpring Gxll (Agilent Technologies). Las mediciones menores a 0.01 son entonces fijadas a 0.01, disposiciones normalizados a 50aVO porcentil, y los genes individuales normalizados a la media de controles. Para análisis de red de cambios transcripcionales inducidos por TIC10, se analiza el grupo de datos usando el software Ingenuity Pathway Análisis (Ingenuity Systems) .

Análisis Western blot Se realiza el análisis Western blot como se describe en Wang, W. et al., PNAS 103, 11003-1108, 2006, usando NuPAGE 4-12% Bis-Tris y visualiza usando Supersignal West Femto (Thermo Scientific) y película de rayos X. Se preparan los extractos nucleares y citoplásmicos usando un amortiguador de lisis citoplásmico (10 m M HEPES, 10 mM KC1, y 2 mM MgCl2, 1 mM DTT) seguido por amortiguador de lisis nuclear (20 mM HEPES, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 250 µ? EDTA, 25% glicerol) . Para todos los amortiguadores de lisis, se agrega inhibidor de proteasa fresco (Roche) y 1 mM de ortovanadato de sodio inmediatamente antes al uso.

Ensayos de Inmunoprecipitacion de Cromatina Se realiza los ensayos de inmunoprecipitacion de cromatina (ChiP por sus siglas en inglés) como se describe para el promotor de TRAIL en Nebbioso, A., et al., Nat Med, 11(1), 77-84, 2005 usando un anticuerpo grado ChIP para Foxo3a (Abcam) o una concentración equivalente de IgG de conejo (SouthernBiotech) como un control no especifico) .

TIC10 provoca inducción transcripcional independiente a p53 del gen de TRAIL Un tamiz de reportador de bioluminiscencia a base de células realizado en células cancerosas de colon humano HCT116 Bax-null resistente a TRAIL usando el promotor de gen de TRAIL produce la pequeña molécula TIC10 como un compuesto inductor de TRAIL.

TIC10 induce promotor de TRAIL dependiente a actividad transcripcional de una construcción de reportador de luciferasa bajo el control regulatorio de los primeros 504 pares de base del promotor TRAIL el cual excluye el elemento de respuesta de enlace de ADN de p53 identificado en Takimoto et al., 2000, Oncogene, 19, 1735-1743. Figura 1 es una gráfica que muestra actividad de reportador de luciferasa en células HCT116 Bax" _ bajo control transcripcional de las primeras 504 pares de bases del promotor de gen de TRAIL humano cadena arriba del inicio de transcripción (n=3) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d. por sus siglas en inglés) de replicados. *P<0.005 entre la condición indicada y controles.

TIC10 provoca un incremento dependiente a dosis en ARN mensajero de TRAIL. La Figura 2 es una gráfica que muestra análisis RT-qPCR de niveles de ARNm de TRAIL en células HCT116 p53~ _ (48 horas, n=4). Las barras de error indican s.d. de replicados). TIC10 provoca un incremento dependiente a dosis en proteína de TRAIL ubicada en la superficie celular de varias líneas celulares cancerosas en una forma independiente a p53. La Figura 3 es una gráfica que muestra niveles de TRAIL superficial inducidos por TIC10 en un panel de células cancerosas (10 µ??, 72 horas n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y controles.

La exposición de TIC10 lleva a una presencia significativa y sostenida de TRAIL en la superficie celular de células cancerosas. Un análisis de curso de tiempo encuentra que TRAIL es localizado en la superficie celular como un evento tardío pero que esta inducción puede ser sostenida temporalmente incluso después de la remoción de TIC10 a partir del medio. La Figura 4 es una gráfica que muestra niveles de TRAIL superficial en células HCT116 p53_ " después del tratamiento con TIC10 en condiciones y puntos de tiempo indicados (n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados. *P < 0.05 entre la condición indicada y controles. La Figura 5 es una gráfica que muestra niveles superficiales de TRAIL de HCT116 p53" _ por citometría de flujo en 72 horas después del inicio de tratamiento con TIC10 (5 µ?, n=3) . Se tratan las células por el tiempo indicado de pre-incubación y entonces el medio libre de fármaco es intercambiado por el periodo de tiempo restante hasta el análisis en 72 horas. Las barras de error indican s.d. de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y controles.

TIC10 induce apoptosis mediada por TRAIL El contenido de ADN sub-Gl inducido por TIC10 es sugestivo de muerte celular en células HCT116 p53~/_ sensibles a TRAIL sin alterar los perfiles de ciclo celular de fibroblastos normales en dosis equivalentes. La Figura 6 muestra perfiles de ciclo celular de células HCT116 p53_ " y HFF tratadas con TIC10 (5 µ?, 72 horas, n=3) .

TIC10 disminuye la sobrevivencia clonogénica de líneas celulares cancerosas mientras que se conservan fibroblastos normales. La Figura 7 es una gráfica que muestra cuantificación de ensayos de formación de colonias de células cancerosas tratadas con TIC10 (10 µ?, 72 horas, n=3) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d por sus siglas en inglés) de replicados. La Figura 8 es una gráfica que muestra experimentos paralelos como en la Figura 7 pero con células HFF que son enumeradas en punto final (n=3) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados.

TIC10 induce contenido sub-Gl en una forma independiente a p53 y dependiente a Bax. La Figura 9 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de células HCT116 WT, p53"{" y Bax_ " después del tratamiento con DMSO, TIC10 (1, 5 ó 10 µ?) ó rhTRAIL (25 ng/ml) por 72 horas (n=3) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

De acuerdo con muerte celular apoptótica, TICIO incrementa los niveles de caspasa-3 activa como se indica por ensayo de inmunofluorescencia en células HCT116 p53" _ tratadas con 5 µ? de TICIO por 72 horas y por análisis Western blot en células HCT116 p53_ ~ tratadas con 1 µ?, 2.5 µ?, 5 µ? ó 10 µ de TICIO por 72 horas. La Figura 10 es una imagen que muestra resultados de análisis Western blot. El contenido sub-Gl inducido por TICIO es inhibido significativamente por co-incubación con el inhibidor de apoptosis de pan-caspasa zVAD-fmk. La Figura 11 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de células cancerosas tratadas con TICIO preincubadas con o sin zVTAD-fmk (10 µ?, 72 horas, n=3) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P < 0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

La apoptosis inducida por TIC10 parece ser mediada específicamente por TRAIL, como se indica por inhibición de citotoxicidad inducida por TIC10 después de knockdown estable de TRAIL por shRNA. La Figura 12 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de células MDA-MB-231 con knockdown estable de TRAIL por ARN de hairpina corta (72 horas, n=3) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma. La Figura 13 es una gráfica que muestra verificación de knockdown de shTRAIL DA-MB-231 por análisis de citometria de flujo de células tratadas por TIC10 (5 µ?, 72 horas, n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados, *P< 0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

Se observa evidencia adicional para el requerimiento de TRAIL en muerte celular tumoral inducida por TIC10 después de la alteración del dominio de muerte DR5 que modula señalización de TRAIL proapoptótica . La Figura 14 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de muerte celular inducida por TIC10 en células H460 con DR5 endógeno ó sobreexpresión de una construcción DR5 con su dominio de muerte reemplazado por EGFP (10 µ?, 72 horas, n=3) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y el control a menos que se indique de otra forma.

El secuestro experimental de TRAIL por uso de un anticuerpo de bloqueo muestra el requerimiento de TRAIL en muerte celular tumoral inducida por TIC10. La Figura 15 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de células HCT116 tratadas con DMSO, TIC10 (10 µ?) , o rhTRAIL (25 ng/ml) en la presencia o ausencia de un anticuerpo secuestrante de TRAIL, RI -2 (72 horas, n =3). Las barras de error indican s.d. de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

Se examina la actividad de TIC10 en células tumorales de colon reseccionadas recientemente a partir de un paciente humano y se encuentra que TIC10 induce TRAIL y efectos citotóxicos potentes a diferencia de 5-FU. La Figura 16 es una gráfica que muestra TRAIL superficial inducido por TIC10 con células cancerosas de colon reseccionadas recientemente (10 µ?, 72 horas). El tejido es un adenocarcinoma mucinoso reseccionado de un paciente hembra de 85 años de edad. Los 'datos son expresados como intensidad de fluorescencia mediana. La Figura 17 es una gráfica que muestra resultados de un ensayo de viabilidad celular de células cancerosas de colon primarias a partir de la Figura 16 tratadas con DMSO, TIC10 (0.6, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 µ?) , ó 5-FU (5 µ?) (n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados .

La actividad citotóxica de TIC10 es térmicamente estable a diferencia de TRAIL. La Figura 18 es una gráfica que muestra capacidad de TIC10 (5 µ?) ó rhTRAIL (25 ng/ml) para reducir la viabilidad celular en células HCT116 después de una hora preincubación en las temperaturas indicadas (72 horas, n=3) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados.

TICIO es un agente an itumoral mediado por TRAIL potente in vivo TIC10 provoca regresión tumoral en el xenoinjerto de HCT116 p53_ " a un grado comparable a aquel observado con TRAIL cuando ambos son administrados como dosis múltiples. La Figura 19 es una gráfica que muestra xenoinjerto de HCT116 p53_ " tratado con 3 dosis de TIC10 (i.p.), TRAIL (i.v.) ó vehículo (i.p.) administrados en el día 0, 3 y 6 como se indica por las barras verticales grises (n=10) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P<0.05 y **P<0.005 entre la condición indicada y control a menos que se indique otra cosa.

Los experimentos de dosis simples en ratones que portan xenoinjerto de cáncer de colon humano HCT116 WT) y RKO corroboran la actividad antitumoral potente de TIC10, y demuestran claramente superioridad TRAIL en el xenoinjerto RKO bajo las condiciones dadas. La Figura 20 es una gráfica que muestra resultados de imagen bioluminiscente de xenoinjertos HCT116 p53_ " infectados con luciferasa que reciben una inyección i.p. simple de TIC10 ó vehículo (n=6) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P < 0.05 y **P<0.005 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

La Figura 21 es una gráfica que muestra xenoinjerto RKO con una dosis simple de TIC10 (i.p.), TRAIL (i.v.) ó vehículo (i.p., n=10) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P<0.05 y **P<0.005 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma .

TIC10 induce regresión de xenoinjertos de cáncer de mama humano MDA-MB-231, un efecto que es inhibido significativamente por knockdown estable de TRAIL mientras tumores tratados con TRAIL progresan. La Figura 22 es una gráfica de caja y bigotes de volumen tumoral en el día 9 después del inicio de tratamiento en vector MDA-MB-231 ó xenoinjertos shTRAIL con dosis simples de TIC10 (i.p.), TRAIL (i.v.) ó vehículo (DMSO, i.p.) (n=8) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P<0.05 y **P<.005 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma. La tinción TUNEL de tumores a partir del vector MDA-MB-231 y xenoinjertos shTRAIL 2 días posttratamiento con 50 mg/kg ó 100 mg/kg de TIC10 muestran tinción TUNEL incrementada en células tratadas con vector o no tratadas con shTRAIL.

Esto demuestra directamente que la actividad antitumoral de TIC10 es superior a aquella de TRAIL cuando se administra como dosis simples bajo estas condiciones y es modulada por lo menos en parte por TRAIL producido por células tumorales. En xenoinjertos DLD-1, TIC10 induce estancamiento tumoral 1 semana post-tratamiento mientras que tumores tratados con TRAIL progresan después de una dosis simple. La Figura 23 es una gráfica que muestra volumen tumoral relativo de xenoinjertos DLD-1 tratados con TRAIL (i.v.), TICIO ( i. p.) o DMSO (i.p.) como una dosis simple en el día 0 en concentraciones indicadas (n=8).

TICIO también induce una regresión sostenida del xenoinjerto SW480 como una dosis simple por suministro intraperitoneal u oral, sugiriendo biodisponibilidad favorable. La Figura 24 es una gráfica que muestra comparación de administración i.p contra oral de una dosis simple de TICIO en 30 mg/kg en xenoinjertos SW480 tratados en el día 0 (n=6) .

La titulación de una dosis simple de TICIO administrado oralmente en el modelo de xenoinjerto HCT116 revela eficacia antitumoral sostenida en 25 mg/kg. La Figura 25 es una gráfica que muestra TICIO o vehículo administrado como una dosis oral simple en el xenoinjerto HCT116 (n=6) . Las barras de error indican desviación estándar (s.d.) de replicados. *P<0.05 y **P<0.005 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

La carencia de aparente toxicidad en dosis múltiples suministradas en 4 veces arriba de esta dosis terapéutica en un xenoinjerto previo sin efectos adversos en peso corporal o histología hepática sugiere que TICIO tiene una amplia ventana terapéutica. La Figura 26 es una gráfica que muestra peso corporal de ratones desnudos hembra, atímicos tratados con una dosis simple de TIC10 (100 mg/kg, ?.?.)· La Figura 27 es una gráfica que muestra peso corporal de ratones hembra C57/B6 en el final de la semana 4 de tratamiento con una dosis semanal simple de TIC10 oral (25 mg/kg) por 4 semanas. El análisis histológico por tinción con H&E de hígado a partir de ratones desnudos hembra, atímicos cosechados 3 días post-tratamiento con TIC10 (100 mg/kg, i.p.) no muestra toxicidad de TIC10 aparente.

La exposición crónica a TIC10 oral en 25 mg/kg semanalmente por 4 semanas en ratones inmunocompetentes no provoca ningún cambio en un panel de marcadores químicos séricos como se muestra en las Tablas 1A y IB.

Las Tablas IA y IB muestran química sérica de ratones C57/B6 tratados con vehículo o TIC10 (25 mg/kg) semanalmente por 4 semanas. ra probar la eficacia de TICIO en un modelo de cáncer preclinico inmunocompetente, se usan ratones transgénicos ?µ-My que desarrollan espontáneamente linfoma. Se usa el mismo programa de dosificación oral como el anterior que es demostrado para ser seguro a partir de las semanas 9-12 de edad. TICIO prolonga significativamente la sobrevivencia de estos ratones por 4 semanas. La Figura 28 es una gráfica que muestra sobrevivencia total de ?µ-myc tratados durante las semanas 9-12 con TICIO oral semanalmente (25 mg/kg) . El valor P determinado por prueba de rango logarítmico. Para gráficas de volumen tumoral relativo, se expresa el tamaño tumoral con relación al tamaño tumoral en el día 0, lo cual es definido como el día del inicio del tratamiento. El análisis histológico por tinción de H&E de ?µ-myc y WT C57/B6 de nodulos linfáticos axilares en 14 semanas de edad no muestran toxicidad de TICIO aparente.

Combinaciones Sinergísticas de TICIO y Agentes Quimio-fcerapéuticos Sorpresivamente, se observa sinergia in vitro entre TIC10 y los taxanos paclitaxel y docetaxel (marca Taxotere) . La Figura 29 es una gráfica que muestra viabilidad celular de DLD-1 tratado con TIC10 en combinación con paclitaxel en condiciones indicadas (72 horas, n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados. La Figura 30 es una gráfica que muestra viabilidad celular de células S 620 tratadas con TIC10 en combinación con paclitaxel en condiciones indicadas (72 horas, n=3). Las barras de error indican s.d. de replicados. La Figura 31 es una gráfica que muestra viabilidad celular de células DLD-1 tratadas con TIC10 en combinación con taxotere en condiciones indicadas (72 horas, n=3) . Las barras de error indican s.d de replicados. La Figura 32 es una gráfica que muestra viabilidad celular de células S 620 tratadas con TIC10 en combinación con taxotere en condiciones indicadas (72 horas, n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados.

La combinación de TIC10 y ya sea taxano paclitaxel o docetaxel cooperan para producir curas sostenidas en el xenoinjerto de cáncer pulmonar de célula no pequeña H460. La Figura 33 es una gráfica que muestra porcentajes de cohortes en xenoinjerto H460 que retiene volumen tumoral después del tratamiento con TIC10 (30 mg/kg, i.p.) o taxotere (20 mg/kg, i.v.) solos, en combinación, o con vehículo (DMSO, i.p.) (n=8) como dosis simples. La Figura 34 es una gráfica que muestra una gráfica de volumen tumoral relativo para la Figura 33. Las barras de error indican s.d. de replicados.

La Figura 35 es una gráfica que muestra porcentaje de cohortes en xenoinjerto H460 que retiene volumen tumoral después del tratamiento con TIC10 (30 mg/kg, i.p.) o paclitaxel (20 mg/kg, i.v.) solos, en combinación, o con vehículo (DMSO, i.p.) (n=8) como dosis simples. La Figura 36 es una gráfica que muestra una gráfica de volumen tumoral relativo para la Figura 35. Las barras de error indican s.d. de replicados.

Se encuentra TIC10 en este ejemplo para cooperar con bevacizumab cuando ambos son dados una vez a la semana en modelo de ratón ortotopico metastásico de cáncer colorrectal deficiente en p53 para reducir la incidencia tumoral en el tumor cecal primario y sitios metastásicos distales incluyendo el pulmón, hígado, nodulos linfáticos y peritoneo. La Figura 37 es una gráfica que muestra porcentaje de cohortes con tumores HCT116 p53"/_ intracecales con tumores evidentes en los sitios primarios y distales en punto final (n=5) . Como se indica por la línea de tiempo, se administra tratamiento una vez a la semana iniciando en 2 semanas postimplantación con cohortes que reciben vehículo, TIC10 (25 mg/kg, oral), bevacizumab (bev, 10 mg/kg, i.v.), o la combinación de TIC10 y bevacizumab.

TIC10 solo y en combinación con bevacizumab es bien tolerado y no provoca cambios significativos en peso corporal en punto final con este régimen multidosis. La Figura 38 es una gráfica que muestra peso corporal de ratones en punto final. Las barras de error indican s.d. de replicados.

TICIO provoca muerte celular especifica a tumor por efectos directos mediados por TRAIL y efectos espectantes .

El análisis inmunohistoquimico (IHC por sus siglas en inglés) de tumores xenoinjerto HCT115 p53_/~ después de una dosis simple de TICIO en el día 0 (100 mg/kg, i.p.) revela niveles incrementados de proteina TRAIL y caspasa-8 escindida, la caspasa iniciadora implicada en apoptosis mediada por TRAIL.

Los núcleos fragmentados observados por histología y tinción incrementada (etiquetado Nick-End dUTP mediado por TdT) TUNEL además confirma que TICIO induce apoptosis en los tumores tratados. Adicionalmente, TICIO no solamente induce TRAIL en el tumor sino también en fibroblastos estromales que limitan el tumor como se muestra por análisis H&E y IHC para TRAIL en el límite de tumor y fibroblastos estromales a partir de tumores xenoinjerto HCT116 p53"/_ después del tratamiento con TICIO (100 mg/kg, i.p.) o vehículo en el día 2 post-tratamiento .

Destacando la expresión de TRAIL inducida por TIC10 en fibroblastos, se ensaya TRAIL soluble en ratones que portan tumor no tratado con TIC10 para determinar si las células normales secretan TRAIL en respuesta a TIC10. TIC10 eleva rápidamente niveles séricos de TRAIL en una forma que dura por más de 72 horas, más de la vida media en suero de TRAIL recombinante (~30 minutos) . La Figura 39 es una gráfica que muestra niveles séricos de TRAIL en ratones libres de tumor después de TIC10 (100 mg/kg, i.v.) ó doxorubicina (30 mg/kg, i.p.) (n=2) . Las barras de error indican s.d. de replicados .

TRAIL sérico inducido por TIC10 es detectado tan pronto como 2 horas después de la administración, lo cual es más rápido que las cinéticas observadas in vitro en ejemplos descritos en la presente. El análisis farmacocinético revela que TIC10 es distribuido rápidamente y tiene una vida media plasmática de ~6.5 horas. La Tabla II muestra resultados de análisis farmacocinéticos de TIC10 en plasma de ratones C57B6. La Figura 40 es una gráfica que muestra el perfil de absorbancia de TIC10 con una absorbancia pico en 239 nm. La Figura 41 es una gráfica que muestra una curva de calibración para TIC10 incrementado en plasma de ratón y cuantificado por análisis HPLC usando área bajo la curva (AUC por sus siglas en inglés) . La Figura 42 es una gráfica que muestra concentraciones de plasma de TIC10 después de administración intravenosa en 25 mg/kg en ratones hembra C57/B6 (n=3) . Las barras de error representan media de error estándar de replicados .

TIC10 tiene una vida media más larga que TRAIL recombinante y que los efectos de TIC10, es decir inducción de TRAIL, se sostiene temporalmente para los días in vivo como se observa in vitro.

El análisis IHC de tejidos normales en ratones que no portan tumor desnudos, atimicos después de la administración de TIC10 en el dia 0 (100 mg/kg, i.v.) revelan que TRAIL es sobreregulado en el nivel de proteina en el cerebro, riñon y vaso de ratones sin toxicidad aparente como se determina por histología y tinción de TUNEL. La sobreregulación de TRAIL en respuesta a TIC10 no es notada en otros tejidos que incluyen el hígado en cualquier punto de tiempo .

Se prueban los efectos de TIC10 en fibroblastos normales y su selectividad para células normales en este ejemplo. TIC10 induce selectivamente apoptosis en células tumorales deficientes en p53 pero no fibroblastos normales en experimentos co-cultivo, usando células HCT116 p53_/" y HFF tratadas con TIC10 (10 um) o DMSO por 3 días.

TIC10 induce una cantidad significativa aunque modesta de TRAIL en la superficie de fibroblastos normales.

La Figura 43 es una gráfica que muestra análisis de TRAIL superficial de células HFF después del tratamiento con TIC10 (0, 2.5, 5, ó 10 µ? de izquierda a derecha) (72 horas, n=3). Las barras de error indican s.d. de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

Para probar si las células normales contribuyen a la eficacia antitumoral de TIC10 a través de fibroblastos normales con efecto espectante mediado por TRAIL preincubados con TIC10 son trasplantadas en co-cultivo con células cancerosas de colon deficientes en p53. Esto resulta en un incremento modesto pero significativo en muerte celular específico a TRAIL de subpoblación celular cancerosa. La Figura 44 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de un co-cultivo de células HCT116 p53"/_ y HFF pretratados (24 horas, n=3) . El pretratamiento HFF consiste de 72 horas de incubación con TIC10 (10 µ?) o D SO. Estos experimentos son realizados en la presencia o ausencia de · un anticuerpo secuestrante de TRAIL (RIK 2) . Las barras de escala son 100 µp?. Las barras de error indican s.d de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

De esta forma como se demuestra en la presente, TIC10 tiene un índice terapéutico favorable e induce TRAIL en células tumorales, estromales y normales que pueden contribuir a la eficacia antitumoral de TIC10 a través de mecanismos directos asi como también espectantes.

TIC10 es un agente antitumoral efectivo en glioblastoma multiforme (GMB por sus siglas en inglés) TIC10 induce TRAIL en el cerebro y es útil como un agente antitumoral contra tumores cerebrales. Se prueba la actividad de TIC10 en lineas celulares GMB en este ejemplo y se encuentra que TIC10 induce TRAIL y tiene GI50 independiente a p53 en el intervalo micromolar bajo que es comparable con otras lineas celulares cancerosas. La Figura 45 es una gráfica que muestra TRAIL superficial en lineas celulares GBM después de incubación con TIC10 (5 µ?, 72 horas, n=3) . *P<0.05 entre la condición indicada y control. LA Figura 46 es una gráfica que muestra valores GI50 extrapolados a partir de ensayos de viabilidad celular de lineas celulares GMB indicadas en 72 horas psot-tratamiento con TIC10 ó DMSO (n=3) .

TIC10 tiene efectos citotóxicos en células GBM aisladas recientemente que son resistentes a temozolomida e irradiadas previamente en este ejemplo. La Figura 47 muestra resultados de un ensayo de viabilidad celular de tejido de glioblastoma reseccionado recientemente tratado con DMSO, TIC10 o temozolomida (TMZ, 10 µ?) (72 horas, n=3) . El tejido es un glioblastoma grado IV con componente oligodendroglial tomado de un paciente femenino de 38 años de edad que ha sufrido de cirugía citoreductiva y radiación anteriores.

Se prueba TIC10 en modelos preclínicos de GB como un monoagente y en combinación con bevacizumab. TIC10 ejerce citotoxicidad independiente a p53 contra un panel de líneas celulares GBM, incluyendo líneas celulares GBM resistentes a temozolomida como T98G, e induce una regresión sostenida de xenoinjertos T98G subcutáneos a un grado similar a bevacizumab cuando se da una dosis oral simple. La Figura 48 es una gráfica que muestra xenoinjerto subcutáneo de T98G con ratones que reciben una dosis simple de vehículo, TIC10 (30 mg/kg, PO) , o bevacizumab (10 mg/kg, i.v.) en día 0 (n=8) . *P<0.05 entre la condición indicada y control.

Una dosis simple de TIC10 duplica significativamente la sobrevivencia total de ratones como un monoagente en un xenoinjerto intracranial agresivo de GBM humano usando la línea celular SF767 y cooperando con bevacizumab para triplicar la duración de sobrevivencia de ratones que portan tumores cerebrales.

La Figura 49 es una gráfica que muestra sobrevivencia total de ratones que cosechan tumores intracraniales SF767 tratados con una dosis oral simple de vehículo (n=8), TIC10 (25 mg/kg, n=7), bevacizumab (10 mg/kg, i.v., n=6) ó TIC10 y bevacizumab (n=7) en 2 semanas postimplantación.

Tabla III muestra el cambio en sobrevivencia total de cohortes de ratón con tumores intracraniales SF767.

Sobreregulación de TRAIL Inducida por TIC10 es dependiente a Foxo3a Para identificar los eventos moleculares que sustentan sobreregulación de TRAIL inducida por TIC10, se determinan perfiles de expresión de gen en células HCT116 p53_ " tratadas con TIC10. se observan cambios transcripcionales en genes objetivos de la familia FOXO de factores de transcripción, lo cual incluye Foxo3a que ha sido previamente mostrado para regular el promotor de gen de TRAIL en un sitio de enlace contenido dentro de la región seleccionada como se describe en Modur, V. et al., 2002, J. Biol. Chem. 277.47928-47937. La Figura 50 es una gráfica que muestra cambios transcripcionales asociados con señalización de FOXO a partir de perfil de expresión de gen de células HCT116 p53_ " en 48 horas post tratamiento con TIC10 (10 µ?) contra DMSO (n=3) . Todos estos cambios son P<0.05 entre grupos de tratamiento con DMSO y TICIO. Las barras de error indican s.d. de replicados.

El gen de objetivo FOXO DR5 es sobreregulado por TICIO en varias lineas celulares de cáncer y a un grado mucho menor en células normales y esto se observa también en tumores tratados con TICIO. La Figura 51 es una imagen de análisis Western blot de DR5 en células HCT116 tratadas con TICIO o DMSO en concentraciones indicadas por 72 horas. Ran es mostrada como un control de carga. La Figura 52 es una gráfica que muestra análisis de citometria de flujo de niveles DR5 superficiales en células cancerosas y normales con TICIO (72 horas, n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique otra cosa.

El análisis IHC de DR5 en tumores de xenoinjerto HCT116 tratados con vehículo (i.p.) ó TICIO (100 mg/kg i.p.) muestra, de acuerdo con observaciones in vitro que expresión DR5 elevada es evidente en tumores xenoinjerto tratados con TICIO.

Los miembros de familia FOXO, Foxo3a (pero no Foxola) sufren una translocación nuclear en respuesta a TICIO como se determina por análisis de inmunofluorescencia y Western blot de Foxo3a en células HCT116 y análisis de inmunofluorescencia de Foxo3a en células H460 y SW480 tratadas con DMSO o TICIO, 10 µ?, 48 horas.

La Figura 53 es una imagen de análisis Western blot de lisados de célula entera (W por sus siglas en inglés) y extractos citoplásmicos (C por sus siglas en inglés) y nucleares (N por sus siglas en inglés) de células HCT116 tratadas con DMSO o TIC10 (48 horas, 10 µ?) . Se muestra beta-actina y lamina Bl como controles de carga citoplásmica y nucleares, respectivamente.

Se encuentra un incremento dependiente a dosis de TIC10 en la cantidad de Foxo3a localizado al promotor TRAIL como se muestra por ensayo de inmunoprecipitación de cromatina. La Figura 54 es una imagen de resultados de un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para translocación inducida por TIC10 de Foxo3a al promotor de TRAIL en 48 horas post tratamiento con TIC10 en células HCT116 p53_/" (0, 2.5, 5 ó 10 µ? de izquierda a derecha) .

El knockdown temporal de Foxo3a y Foxol revela que Foxo3a media específicamente sobreregulación de TRAIL inducida por TIC10. La Figura 55 es una gráfica que muestra resultados de análisis de citometría de flujo de niveles de TRAIL de superficie celular inducidos por TIC10 (10 µ?) con o sin knockdown temporal de Foxol y/o Foxo3a en células HCT116 p53" - usando siRNA (72 horas, n=3) . Se confirma knockdown por análisis Western blot. Las barras de error indican s.d de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

Knockdo n estable de Foxo3a inhibe significativamente sobreregulación inducida por TIC10 de producción de TRAIL y subsecuente muerte celular tumoral. La Figura 56 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de muerte celular inducida por TIC10 con o sin knockdown estable de Foxo3a en células HCT116 (10 µ?, 72 horas, n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma. La Figura 57 es una gráfica que muestra análisis de citometría de flujo de TRAIL superficial inducido por TIC10 con o sin knockdown estable de Foxo3a en células HCT116 (10 µ?, 72 horas, n=3) . Las barras de error indican s.d. de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma. Los resultados de knockdown estable de Foxo3a son confirmados por análisis Western blot.

Knockdown estable de Foxo3a en células tumorales también inhibe significativamente la actividad antitumoral de TIC10 y contrastes inducidos por TIC10 de apoptosis mediada por TRAIL en tumores in vivo. La Figura 58 es una gráfica que muestra volumen tumoral de xenoinjerto de HCT116 con o sin knockdown estable de Foxo3a después de una dosis oral simple de vehículo o TIC10 (25 mg/kg) en el día o (n=10) . Las barras de error indican s.d. de replicados. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique otra cosa .

Se realiza análisis de IHC y tinción TUNEL de tumores HCT116 con o sin knockdown estable de Foxo3a 3 días después de una dosis simple de TIC10 (25 mg/kg, oral) y muestra que knockdown estable de Foxo3a en células tumorales también inhibe significativamente la actividad antitumoral de TIC10 y contrastes inducidos por TIC10 de apoptosis mediada por TRAIL en tumores in vivo.

Inactivación dual de Akt ? ERK por TICIO induce cooperativamente TRAIL Se determinan cambios inducidos por TICIO en reguladores de Foxo3a como IKK, Akt y ERK son determinados. La Figura 59 es una imagen de análisis Western blot de células HCT116 p53_ " tratadas con TICIO (2.5, 5, 10 µ?) por 72 horas.

Tanto niveles pAkt y pERK son encontrados para ser abolidos con tratamiento con TICIO en una forma dependiente a dosis que es acompañado por desfosforilación de sus sitios de fosforilación respectivos en Foxo3a. Un análisis de curso de tiempo revela que inactivación de Akt y ERK inducida por TICIO ocurre después de 48 horas, las cinéticas que son concertadas con la desfosforilación de Foxo3a y sobreregulación de TRAIL. La Figura 60 es una imagen de análisis Western blot de células HCT116 p53" _ tratadas con TICIO (10 µ?) por periodos de tiempo indicados. La Figura 61 es una gráfica que muestra curso de tiempo de niveles de expresión de proteina de efectos inducidos por TIC10 determinados por densitometria de Western blot a partir de experimentos replicados como en la Figura 60 (n=3) . Los datos son expresados con relación a la muestra de control para cada punto de tiempo y normalizados a Ran. TRAIL es cuantificado por citometria de flujo como experimento paralelo (n=3) .

Estos efectos inducidos por TIC10 en Foxo3a son evidentes en varias lineas celulares de cáncer de diferentes tipos tumorales, lo cual incluye lineas celulares cancerosas humanas con antecedentes genéticos diversos que alojan alteraciones oncogénicas en p53, KRAS, PTEN y otras. La Figura 62 es una imagen de análisis Western blot de efectos inducidos por TIC10 en Foxo3a en células cancerosas de colon humano DLD1, células cancerosas de mama humano MDA-MB-4S8 y lineas celulares de glioblastoma multiforme humana T98G (10 µ?, 72 horas) .

Akt es encontrado para ser un determinante de sensibilidad citotóxico para TIC10 y su sobreregulación de TRAIL, y sobreactivar Akt puede suprimir incluso niveles básales de TRAIL como se muestra por análisis de inmunofluorescencia de Foxo3a en células HCT116 que sobreexpresan un vector vacio o Akt miristilado (myr-Akt) con tratamiento con TIC10 (10 µ?, 48 horas) . Se muestra confirmación de sobreexpresión de myr-Akt por análisis Western blot en la Figura 63. La Figura 64 es una gráfica que muestra análisis de citometria de flujo de TRAIL superficial en células HCT116 que sobreexpresan un vector vacío o Akt miristilado (myr-Akt) con tratamiento con TIC10 (10 µ?, 48 horas) . La Figura 65 es una gráfica que muestra contenido sub-Gl de células HCT116 que sobreexpresan un vector vacío o myr-Akt con tratamiento con TIC10 (10 µ?, 72 horas, n=3) .

La inhibición dual de las trayectorias de Akt y MAPK llevará cooperativamente a la translocación nuclear de Foxo3a y por lo tanto a la sobregulación de TRAIL. A6730 y monoetanolato U0126 son comercialmente disponibles e inhibidores previamente descritos de Aktl/2, Desplat, V. et al., 2008, J. Enz. Inhib. Med. Chem. , 23: 648-658, y MEK, Favate, M.F., et al., 1998, J. Biol . Chem., 273:18623-18632, respectivamente usado en este ejemplo para determinar si la inhibición dual de trayectorias de Akt y MAPK llevarán cooperativamente a la translocación nuclear de Foxo3a y por tanto a sobregulación de TRAIL. La combinación de inhibidores de MEK y Akt es encontrada para inducir cooperativamente sobreregulación de TRAIL dependiente a Foxo3a y muerte celular mediada por TRAIL sinergísticamente . La Figura 66 es una gráfica que muestra análisis de RT-qPCR de ARNm de TRAIL en células HCT116 p53" _ después de la incubación con 10 µ? de A6730 (inhibidor de Akt), monoetanolato U0126 (inhibidor de MEK), o ambos (48 horas, n=3) . Para inhibición de Akt + MEK, P<0.05 comparado con todas las otras condiciones. *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

La Figura 67 es una gráfica que muestra inducción de TRAIL superficial como en la Figura 66 con o sin knockdown estable de Foxo3a (n=3) . *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma.

La Figura 68 es una gráfica que muestra análisis sub-Gl de DA-MB-231 con o sin knockdown de TRAIL por shRNA después de incubación con 10 µ? inhibidor de Akt, inhibidor de MEK, o ambos por 48 horas (n=3) . *P<0.05 entre la condición indicada y control a menos que se indique de otra forma. La Figura 69 es una gráfica que muestra análisis de TRAIL superficial de células HCT116 p53_ " después de la incubación con 10 µ? de A6730 (inhibidor de Akt), monoetanolato de U0126 (inhibidor de MEK), o ambos (48 horas, n=3) .

Experimentos siRNA en este ejemplo muestran que ERK y Akt pueden ser inhibidos para sobregular cooperativamente TRAIL. La Figura 70 es una gráfica que muestra análisis RT-qPCR de niveles de ARNm de TRAIL después de knockdown temporal de Akt y/o ERK en células HCT116 p53" _ 48 horas post-knockdown (n=3) . Para combinación de siERK y siAkt, P<0.05, comparados a todas otras condiciones.

La Figura 71 es una imagen que muestra confirmación de knockdown de Akt y ERK por análisis de Western blot. Las barras de error indican s.d de replicados. La Figura 72 es una gráfica que muestra análisis de TRAIL superficial después de knockdown temporal de Akt y/o ERK en células HCT116 48 horas post knockdown (n=3) .

TIC10 provoca una inactivación dual de Akt y ERK, lo cual lleva cooperativamente a la translocación nuclear de su substrato mutuo Foxo3a que induce transcripcionalmente' el gen de TRAIL como un gen objetivo único para potenciar la muerte celular y efectos antitumorales potentes in vivo.

Cualesquiera patentes o publicaciones mencionadas en esta especificación son incorporadas en la presente para referencia al mismo grado como si cada publicación individual es indicada especifica e individualmente para ser incorporada para referencia.

Las composiciones y métodos descritos en la presente son actualmente representativos de aspectos preferidos, de ejemplo y no propuestos como limitaciones para el alcance de la invención. Los cambios en la misma y otros usos se les ocurrirá a aquellos expertos en la técnica. Los cambios y otros usos pueden ser hechos sin alejarse del alcance de la invención como se indica en las reivindicaciones .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende: un derivado, sal, ester, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente, y un portador aceptable farmacéuticamente.

2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un segundo agente terapéutico.

3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el segundo agente terapéutico es un agente anticáncer.

4. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el agente anticáncer es un inhibidor mitótico.

5. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el agente anticáncer es seleccionado del grupo que consiste de: paclitaxel, docetaxel y combinaciones de los mismos.

6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el segundo agente terapéutico es un agente anti-angiogénico .

7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el agente anti-angiogénico es bevacizumab.

8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se formula para administración oral.

9. Un método de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende: administración de una cantidad efectiva farmacéuticamente de un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende ensayar ligando inductor de apoptosis relacionado a TNF en una muestra obtenida a partir del sujeto.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el sujeto tiene, o está en riesgo de tener cáncer.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende administración de un agente anticáncer adicional.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente anticáncer adicional es un agente antimitótico.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente anticáncer adicional es paclitaxel, docetaxel, bevacizumab o cualesquiera dos o más de los mismos.

15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque se ensaya ligando inductor de apoptosis relacionado a TNF en una muestra sanguínea obtenida del sujeto.

16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la administración es administración oral .

17. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la administración es seleccionada del grupo que consiste de: rectal, nasal, pulmonar, epidural, ocular, ótico, intraarterial, intracardiaco, intracerebroventricular, intradérmico, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, intraóseo, intratecal, intravesical, subcutáneo, tópico, transdérmico, transmucosal , sublingual, bucal, vaginal y rutas de inhalación de administración .

18. Un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener, cáncer cerebral, caracterizado porque comprende: administración de una cantidad efectiva farmacéuticamente de: un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente.

19. Un método de tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende: administración de una cantidad efectiva farmacéuticamente de una sal, éster, amida, hidrato, o solvato del mismo aceptables farmacéuticamente; y un portador aceptable farmacéuticamente .

20. El uso de un derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente para la fabricación de un medicamento para tratar cáncer.

21. El compuesto derivado, sal, éster, amida, hidrato, solvato y/o profármaco del mismo aceptables farmacéuticamente para tratar cáncer .

22. Una composición farmacéutica substancialmente como se describe en la presente.

23. Un método de tratamiento substancialmente como se describe en la presente.