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MX2013011547A - Metodos para detectar contaminantes de polimeros de glucosa. - Google Patents

Metodos para detectar contaminantes de polimeros de glucosa.

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MX2013011547A
MX2013011547A MX2013011547A MX2013011547A MX2013011547A MX 2013011547 A MX2013011547 A MX 2013011547A MX 2013011547 A MX2013011547 A MX 2013011547A MX 2013011547 A MX2013011547 A MX 2013011547A MX 2013011547 A MX2013011547 A MX 2013011547A
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pgn
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tlr2
preparation
Prior art date
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MX2013011547A
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Héla Hacine-Gherbi
Fabrice Allain
Mathieu Carpentier
Agnès Denys
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Roquette Freres
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Publication date
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Application filed by Roquette Freres filed Critical Roquette Freres
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Abstract

La invención se relaciona con un método para detectar contaminantes de polímeros de glucosa, contaminantes que son capaces de actuar en sinergia entre sí para generar una reacción inflamatoria, caracterizado por que comprende un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza líneas celulares modificadas.

Description

MÉTODOS PARA DETECTAR CONTAMINANTES DE POLÍMEROS DE GLUCOSA Campo de la Invención La presente invención se relaciona con métodos para detectar contaminantes de polímeros de glucosa, en particular, circuitos para producir polímeros de glucosa, más particularmente, aquellos para la diálisis peritoneal.
Por extensión, este método también permite la detección de contaminantes de polímeros de glucosa, en particular circuitos para producir polímeros de glucosa, para la alimentación enteral y parenteral, o aún para la alimentación de bebés recién nacidos.
Un objeto de la invención también radica en la necesidad de identificar contaminantes pro-inflamatorios.
Antecedentes de la Invención La empresa solicitante ha elegido desarrollar la presente invención en un campo que es conocido por la peligrosidad de los contaminantes que pueden introducirse mediante polímeros de glucosa. Dichos contaminantes son responsables de las reacciones inflamatorias que son muy dañinas para la salud humana: el ámbito de la diálisis peritoneal .
La diálisis peritoneal es un tipo de diálisis cuyo objetivo es remover residuos tales como la urea, la creatinina, el exceso de potasio o agua que los ríñones no manejan o ya no administran para purificar el plasma sanguíneo. El tratamiento médico se indica en caso de una insuficiencia renal crónica en etapa terminal.
Se trata de una purificación intracorpórea que utiliza - - el peritoneo como una membrana de diálisis. Los residuos tóxicos de la sangre cruzan la membrana semi-permeable del peritoneo, a una solución conocida como dializado. El dializado se introduce en la cavidad peritoneal mediante un catéter permanente. Existen dos tipos de diálisis peritoneal: DPCA (diálisis peritoneal continua ambulatoria) , un tratamiento que se basa en el pasaje a través de cuatro bolsas de dializado por día de conformidad con la indicación médica, - DPA (diálisis peritoneal automatizada) , un tratamiento continuo nocturno que corresponde a aproximadamente 15 litros de dializado cada 8 horas de conformidad con la indicación médica.
Los dializados comúnmente utilizados están compuestos por una solución tampón (de lactato o de bicarbonato) con un pH ácido (5.2 - 5.5) o psicológico (7.4), a la cual se agregan electrolitos (sodio, calcio, magnesio, cloro) y un ácido osmótico (glucosa o un polímero de glucosa, como "icodextrina" presente en la solución de diálisis peritoneal ambulatoria Extraneal® comercializada por la empresa Baxter) .
El polímero de glucosa, como icodextrina mencionada anteriormente, se prefiere a la glucosa como agente osmótico dado que, debido a su tamaño pequeño, la glucosa que cruza rápidamente el peritoneo, deriva en una pérdida del gradiente osmótico en el plazo de 2 a 4 horas tras la infusión.
Los polímeros de glucosa estándar se producen mediante un ácido o hidrólisis enzimática de almidón de los cereales o de las plantas tuberosas.
La hidrólisis ácida del almidón, que es totalmente aleatoria, o la hidrólisis enzimática de esta, que es apenas - - más ordenada, proporciona mezclas de glucosa (monómero) y cadenas de glucosa que comprenden moléculas muy cortas (oligómeros) , con un grado bajo de polimerización (o DP) y moléculas muy largas (polímeros) con una DP alta. Los polímeros de glucosa tienen una gran variedad de pesos moleculares .
En la técnica más particular del uso de los polímeros de glucosa para la diálisis peritoneal continua ambulatoria, se tornó rápidamente evidente que estos hidrolizados de almidón (mezcla de glucosa y de oligómeros y polímeros de glucosa) no pudieron utilizarse como tales.
La solicitud de patente europea EP 207 676 divulga que se prefieren los polímeros de glucosa que forman soluciones claras e incoloras en un 10% de agua, que tienen un peso molecular medio (Mw) de 5, 000 a 100, 000 daltons y un peso molecular de número medio (Mn) menor que 8,000 daltons.
Dichos polímeros de glucosa también comprenden preferentemente al menos 80% de polímeros de glucosa cuyo peso molecular oscila entre 5000 y 50000 daltons, poca o ninguna glucosa o pocos o ningún polímero de glucosa con una DP menor que o igual a 3 (peso molecular 504) y pocos o ningún polímero de glucosa con un peso molecular mayor que 100,000 (DP de aproximadamente 600).
En otras palabras, los polímeros de glucosa preferidos son polímeros de glucosa con un índice de polidispersidad bajo (valor obtenido mediante el cálculo de la relación Mw/Mn) .
Los métodos propuestos en la solicitud de patente EP 207 676 para obtener estos polímeros de glucosa con un índice bajo de polidispersidad de hidrolizados de almidón consisten - - en : realizar una precipitación fraccionada de una maltodextrina con un disolvente miscible en agua, o realizar una filtración molecular de esta misma maltodextrina a través de varias membranas que poseen un umbral de corte o un umbral de exclusión adecuado.
En los dos casos, estos métodos tienen como objetivo remover los polímeros de peso molecular alto y los monómeros y oligómeros de peso molecular bajo al mismo tiempo.
Sin embargo, estos métodos no son satisfactorios desde el punto de vista de su implementación y desde el punto de vista de los rendimientos y de la calidad de los productos que permiten obtener.
Con el fin de desarrollar un método para producir un polímero de glucosa totalmente soluble en agua con un índice bajo de polidispersidad preferentemente menor que 2.5, preferentemente con un Mn menor que 8000 daltons y un M entre 12,000 y 20,000 daltons, donde dicho método carece de los problemas de la técnica anterior, la empresa solicitante se comprometió a resolver este problema en su patente EP 667 356 comenzando con un almidón hidrolizado en lugar de maltodextrina .
El polímero de glucosa obtenido por fraccionamiento cromatográfico contiene preferentemente menos del 3% de glucosa y de polímeros de glucosa que tienen una DP menor o igual que 3 y menos del 0.5% de polímeros de glucosa con una DP mayor que 600.
Los expertos en la técnica de la diálisis peritoneal finalmente aceptan que estos polímeros de glucosa, utilizados por su poder osmótico, son totalmente satisfactorios.
- - Sin embargo, existen grandes riesgos de contaminación microbiana de estas preparaciones destinadas a la diálisis peritoneal .
Se sabe que los circuitos de producción de polímeros de glucosa pueden contaminarse con microorganismos o con sustancias pro-inflamatorias contenidas en dichos microorganismos .
La' contaminación de almidón de maíz o trigo con microorganismos como levadura, moho y bacterias y más particularmente con la bacteria acidotermófila del tipo Alicyclobacillus acidocaldarius (bacteria extremófila que crece en zonas calurosas o ácidas del circuito) se describe, por ejemplo, en la industria del almidón.
El riesgo principal para el paciente que recibe estos productos contaminados es la peritonitis.
La sospecha clínica de peritonitis se diagnostica cuando hay un dialisado turbio junto con manifestaciones clínicas variables, como dolor abdominal, náusea, vómitos, diarrea y fiebre .
Estos episodios de peritonitis son causados por infecciones bacterianas intraperitoneales y el diagnóstico suele establecerse con mayor facilidad a través de cultivos de dializado positivos.
La "peritonitis estéril", que también se describe como peritonitis aséptica con cultivo negativo o química es, por su parte, causada generalmente por un irritante químico o un cuerpo extraño.
Desde la introducción de icodextrina para la preparación de soluciones para la diálisis peritoneal, se han informado casos aislados de peritonitis aséptica, que puede - - relacionarse con varios casos, y en particular con la inducción por sustancias pro-inflamatorias potencialmente presentes .
Los episodios inflamatorios asépticos son complicaciones importantes que se observan después de la inyección de soluciones para diálisis.
Aunque algunos de estos episodios inflamatorios están relacionados con un problema de naturaleza química (inyección accidental de contaminantes químicos o dosis incorrectas de algunos compuestos) , la mayoría de los casos está asociada directamente con la presencia de contaminantes de origen microbiano que están presentes en las soluciones utilizadas para preparar soluciones para diálisis.
Los lipopolisacáridos (LPS) y los peptidoglicanos (PGN) son los principales contaminantes de origen microbiano que presentan un alto riesgo de causar inflamación cuando están presentes en cantidades ínfimas.
Los ensayos estándar posibilitan teóricamente el desecho de lotes que se cargan con contaminantes de este tipo y que por lo tanto, presentan un riesgo para la salud. Sin embargo, estos ensayos no son satisfactorios dado que aún se informa sobre episodios inflamatorios asépticos, aunque las soluciones se habían declarado saludables.
Por lo tanto, a pesar de la atención constante de quienes participan en la técnica, en términos de reducción del riesgo de contaminaciones, en particular mediante la mejor detección de estas, existe necesidad de mejorar los niveles de rendimiento de la detección de contaminantes que pueden inducir una inflamación.
- - Sumario de la Invención El método de conformidad con la invención se relaciona con un método para detectar los contaminantes pro-inflamatorios de polímeros de glucosa, en particular aquellos para la preparación de una solución para diálisis peritoneal, que comprende un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro.
De conformidad con una primera realización, la línea celular utilizada en el ensayo de respuesta inflamatoria es un macrófago o una línea celular diferenciada de macrófagos.
De conformidad con la segunda realización, la línea celular utilizada para llevar a cabo el ensayo de inflamación in vitro es una línea que permite detectar la actividad de uno o más receptores de inmunidad innatos.
Breve Descripción de las Figuras de la Invención La invención se entenderá con mayor claridad mediante ejemplos que aparecen a continuación, que pretenden ser ilustrativos y no limitantes.
Figura 1: producción de RANTES en respuesta a PGN y a LPS en células THP-1 sensibilizadas con MDP a 10 ug/ml .
Figura 2 : producción de TNF-OÍ en respuesta a PGN y a LPS en las células THP-1 sensibilizadas con MDP a 10 pg/ml.
Figura 3: Producción de RANTES en respuesta a PGN en células THP-1 sensibilizadas con f-MLP (10 nM) .
Figura 4 : Producción de RANTES en respuesta a PGN en células THP-1 sensibilizadas con LPS (25 pg/ml) .
Figura 5: Efecto de la concentración del polímero de glucosa en la producción de RANTES inducido por PGN en las - - células THP-1.
Figura 6: Efecto de la concentración de células THP-1 en la producción de RANTES inducido por PGN.
Figura 7: Producción de RANTES mediante las células THP-1 sensibilizadas en respuesta a varias muestras de polímero de glucosa.
Figura 8: Ensayo de respuesta celular HEK-Blue. Estas células se estimularon con PGN, MDP y TNF-a, que es un control positivo para la estimulación de células de HEK-Blue™.
Figura 9: La respuesta SEAP como una función del volumen del sobrenadante de un cultivo agregado al medio de reacción. La activación de las células (HEK-TLR2) se realizó con TNF-OÍ.
Figura 10: Optimización del tiempo de reacción entre SEAP y su sustrato. Las células HEK-TLR2 (figura 10A) y Raw-Blue (figura 10B) se estimularon en presencia de mayores concentraciones de PGN. Después de 20 horas de estimulación, los sobrenadantes que contenían SEAP se incubaron en presencia de la solución Quanti-blue en los tiempos indicados y posteriormente se midió la absorbancia a 620 nm.
Figura 11: Efecto de la concentración del polímero de glucosa en la producción de SEAP por células HEK-TLR2 (figura 11A) y Raw-Blue (figura 11B) en respuesta a las mayores concentraciones de PGN.
Figura 12: Comparación de las respuestas SEAP de las células HEK-NOD2 cultivadas de conformidad con el método proporcionado por el proveedor frente al procedimiento mejorado sin la etapa de subcultivo previo a la estimulación.
Figura 13: Producción de SEAP en respuesta a PGN en células HEK-TLR2 y HEK-Null.
- - Figura 14: Producción de SEAP en respuesta a LTA en células HEK-TLR2 y HEK-Null.
Figura 15: Producción de SEAP en respuesta a PGN y LPS en células Raw-Blue.
Figura 16: Producción de SEAP en respuesta a MDP en células HEK-N0D2.
Figura 17: Actividad SEAP en células HEK-TLR2 en respuesta a varias muestras del polímero de glucosa.
Figura 18: La actividad SEAP en células Raw-Blue en respuesta a varias muestras de polímero de glucosa.
Figura 19: La actividad SEAP en células HEK-NOD2 en respuesta a varias muestras de polímero de glucosa.
Figura 20: Producción de SEAP en células Raw-Blue y HEK-TLR2 en respuesta a varias muestras de polímero de glucosa antes (total) y después de la ultrafiltración a 30 kDa (Filtrado) .
Figura 21: Curva de calibración de las respuestas celulares como una función del nivel de PGN S. aureus. La Figura 21A, curva teórica. La Figura 21B, curva obtenida con células hTLR2 de HEK-Blue™ .
Figura 22: La actividad SEAP en células HEK-TLR2 en respuesta a varias muestras del polímero de glucosa con anterioridad y posterioridad al tratamiento con mutanolisina .
Figura 23: La producción de SEAP mediante células HEK-TLR2 en respuesta a PGN con anterioridad y posterioridad al tratamiento con mutanolisina.
Descripción Detallada de la Invención Se debe reconocer que la empresa solicitante ha tenido en cuenta la presencia de moléculas capaces de exacerbar la - - respuesta inflamatoria inducida por otros contaminantes, en particular LPS o PGN, especialmente mediante un mecanismo de cooperación entre los TLR (receptores de tipo toll) y receptores de tipo NOD (proteina que contiene un dominio de oligomerización de unión a nucleótidos) . En realidad, para considerar solo el efecto de los contaminantes aislados en la inflamación es una simplificación.
A diferencia de LPS, que es un ligando reconocido por receptores del tipo TLR4 (receptor tipo peaje), PGN (asi como también numerosos glicolipidos y lipopéptidos) es un ligando reconocido por receptores del tipo TLR2 que induce una respuesta inflamatoria débil en modelos in vivo e in vitro, lo que implica que estas moléculas deben estar presentes en concentraciones mayores para ser detectadas.
Por lo tanto, en los modelos que utilizan células mononucleares (PBMC, monocitos/macrófagos primarios o líneas de monocitos) , LPS induce una respuesta significativa para concentraciones de aproximadamente 1 ng/ml, mientras que se requieren concentraciones de PGN al menos 100 veces mayores para obtener una respuesta similar (relación peso/peso) .
Asimismo, mientras que PGN solubles (M « 125 kDa) inducen una respuesta inflamatoria a través de la activación de TLR2, los productos de despolimerización de estos, cuya estructura mínima aún bioactiva es muramil dipéptido (MDP) , interactúan con receptores intracelulares tipo NOD.
Estos derivados, considerados de manera aislada no son muy inflamatorios in vitro y generan una respuesta significativa para valores > 1 pg/ml .
Por otra parte, la presencia de estas moléculas tiene un efecto sinérgico en la respuesta inflamatoria, mediante un - - mecanismo de cooperación entre TLR y receptores de tipo NOD, independientemente del modelo experimental utilizado (ratón, lineas de monocitos/macrófagos, células sanguíneas mononucleares ) .
Además de los productos de despolimerización de PGN, los péptidos microbianos formilados, cuyo prototipo es f-MLP (tripéptido formil-Metil-Leu-Phe) , también tienen actividad sinérgica sustancial. Originalmente, estos péptidos se identificaron para su actividad quimiotáctica en leucocitos, a pesar de que no son capaces de inducir una respuesta con citocinas por sí mismos.
Sin embargo, cuando se combinan con agonistas de TLR, contribuyen a aumentar la producción de citocina mediante la sensibilización de células diana.
Por lo tanto es importante no ignorar estas "moléculas pequeñas" dado que pueden generar de manera indirecta episodios inflamatorios asépticos exacerbando los efectos de rastros de PGN y/o de LPS .
En los últimos años, se han desarrollado muchos ensayos que utilizan células primarias para reemplazar modelos animales en ensayos de respuesta inflamatoria.
Sin embargo estos modelos in vitro están sujetos a variabilidad intraindividual considerable, que puede ser responsable de sesgos experimentales.
Por otra parte, las líneas de monocitos dan respuestas constantes, lo que explica por qué los ensayos actualmente realizados utilizan cada vez más células de este tipo en cultivo. Sin embargo, estos ensayos tienen el defecto de generar una respuesta inflamatoria general a todos los contaminantes presentes como una mezcla en una solución y por - - lo tanto no permiten caracterizar la naturaleza del contaminante .
También es importante notar que la respuesta inflamatoria exacerbada es visible para citocinas de la fase aguda de la inflamación como TNF- (factor de necrosis tumoral alfa) , IL-?ß (interleucina-?ß) y quimiocinas como CCL5 (quimiocina (C-C motif) ligando 5) /RANTES (regulada con la activación, Célula T expresada normal, y secretada) , pero no o apenas para IL-6 ( interleucina 6) . Por lo tanto estos métodos basados en la producción de esta última (US2009/0239819 y US2007/0184496) no son adecuados para detectar contaminantes como una mezcla en una solución.
Por lo tanto, la empresa solicitante ha llegado a las siguientes conclusiones: (i) es difícil detectar contaminantes bacterianos presentes en cantidades ínfimas en soluciones biológicas, (ii) es importante no estar limitado a la detección de PGN y de LPS, debido a los efectos sinérgicos, (iii) es necesario desarrollar nuevos métodos de detección que sean sensibles y reproducibles, y (iv) es ventajoso utilizar métodos de detección sensibles y reproducibles capaces de caracterizar la naturaleza de los contaminantes.
Por lo tanto, se le reconoce a la empresa solicitante el desarrollo de métodos sensibles y efectivos para detectar los contaminantes microbianos que tienen una acción pro-inflamatoria, por debajo del umbral de sensibilidad de los procedimientos utilizados actualmente y/o descritos en la bibliografía y por lo tanto, para identificar la familia, o aún la naturaleza de las moléculas pro-inflamatorias presentes en cantidades ínfimas en los lotes que se originan de los circuitos de producción.
De hecho, un método muy sensible para medir las respuestas inflamatorias in vitro permitirá retener o no retener lotes en base a los niveles de contaminación que "no son significativos", en el sentido de que esos niveles serán menores a los niveles actualmente medidos utilizando ensayos estándar .
Será posible proponer estos lotes para crear la composición de las soluciones para uso terapéutico en seres humanos (por ejemplo, soluciones para diálisis peritoneal) .
Asimismo, la identificación de moléculas responsables de las respuestas inflamatorias permitirá detectar las fuentes de contaminación durante los métodos de producción e introducir modificaciones correctivas para reducir los niveles de contaminantes o incluso eliminarlos.
El método de conformidad con la invención se relaciona con un método para detectar los contaminantes pro-inflamatorios de polímeros de glucosa, en particular aquellos para la preparación de una solución para diálisis peritoneal, que comprende un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro.
Los polímeros de glucosa pueden utilizarse para la diálisis peritoneal, la alimentación enteral y parenteral y la alimentación de niños recién nacidos. En una realización preferida, los polímeros de glucosa que se probarán utilizando los métodos de la presente invención son icodextrina o maltodextrinas . Pueden probarse en una o más etapas de su preparación, y en particular al nivel de la - - materia prima, en cualquier etapa dentro de su proceso de preparación y/o al nivel del producto definitivo del proceso. También pueden probarse como una muestra de una solución para diálisis peritoneal.
Como se mencionó anteriormente, algunas moléculas de origen bacteriano, como MDP y f-MLP, son inductores inflamatorios débiles, pero pueden actuar en combinación o en sinergia y aumentar la respuesta inducida por otros contaminantes .
Esta propiedad se basa en el hecho de que estas moléculas actúan mediante la intervención de receptores diferentes a TLR.
Además de LPS que reacciona con TLR4, la mayoría de las moléculas con un potencial inflamatorio que pueden estar presentes en los lotes son agonistas de TLR2.
Estos contaminantes son difíciles de detectar dado que están presentes en concentraciones bajas y la respuesta inflamatoria que generarán se acerca con mayor frecuencia al ruido de fondo .
Por lo tanto, la presencia de moléculas con actividad sinérgica puede exacerbar la respuesta inflamatoria inducida por los ligandos de TLR2, que pueden aprovecharse para detectar dosis bajas de contaminantes.
Las muestras contaminadas con MDP (agonista de NOD2) , f-MLP (ligando del receptor del péptido microbiano) , o aún con LPS (para generar la sinergia TLR4/TLR2) generarán, como resultado, una respuesta inflamatoria in vitro.
Por lo tanto, los contaminantes pro-inflamatorios detectados a través del método de la invención son capaces de generar, de manera independiente o en combinación, una - - reacción inflamatoria. En particular, estos contaminantes pueden ser inductores inflamatorios débiles cuando se consideran de manera independiente, pero pueden inducir una reacción inflamatoria sustancial cuando están en combinación. El método de conformidad con la invención permite considerar el efecto del grupo de contaminantes presentes en la preparación de polímero de glucosa en consideración y no solo el efecto particular de cada uno de ellos.
El método de conformidad con la invención comprende al menos un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro utilizando una línea celular que permite detectar al menos un factor de respuesta inflamatoria. Preferentemente, la línea celular es un macrófago o una línea celular diferenciada de macrófago, o una célula que expresa uno o más TLR o receptores de tipo NOD como TLR2, TLR4, o NOD2, o una combinación de estos.
De conformidad con una primera realización, la línea celular utilizada en el ensayo de respuesta inflamatoria es un macrófago o una línea celular diferenciada de macrófagos. En particular, la línea celular produce TNF-ot y la quimiocina CCL5/RA TES. Preferentemente, el ensayo se realiza con células THP-1 diferenciadas de macrófago.
En una realización preferida, los macrófagos o las células diferencias de macrófago, en particular las células THP-1 diferenciadas de macrófago, se utilizan a una densidad entre 0.5 y 1 x 106 células/ml del medio de cultivo, preferentemente entre 0.7 y 0.8 x 106 células/ml, y aún más preferentemente aproximadamente 0.75 x 106 células/ml.
El ensayo de respuesta inflamatoria in vitro puede basarse en la producción de TNF-a y/o de la quimiocina - - CCL5/RANTES por macrófagos, en particular células THP-1 diferenciadas de macrófago, dado que el efecto sinérgico (efecto obtenido por la combinación de estos varios contaminantes) está especialmente marcado para las citocinas de la fase aguda de la inflamación (TNF-a, IL-?ß, quimiocinas) , pero no para citocinas de la fase demorada, como IL-6.
Por lo tanto, de conformidad con una realización particular, el ensayo de respuesta inflamatoria consiste en colocar las células de la linea celular, preferentemente macrófagos, en presencia de una preparación de polímeros de glucosa que pueden contener contaminantes pro-inflamatorios y en la medición de la producción de citocinas de la fase aguda de inflamación, en particular TNF-a, IL-?ß y/o quimiocinas, en particular CCL5/RANTES ; la producción de estas citocinas indican que la preparación contiene contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria. En una realización preferida particular, el ensayo comprende medir la producción de TNF-a y/o of CCL5/RANTES, preferentemente de CCL5/RANTES . Los ensayos de citocina pueden llevarse a cabo a través de cualquier medio conocido por los entendidos en la técnica, y en particular mediante ELISA. En una realización preferida, el ensayo comprende medir la producción de TNF-a después de 8 horas de estimulación. En otra realización preferida, el ensayo comprende medir la producción de RANTES después de 20 horas de estimulación, en particular a través de un ensayo ELISA.
Para poder aumentar la respuesta celular inducida por contaminantes pro-inflamatorios, por ejemplo, por LPS y/o PGN, se puede agregar, a la muestra del ensayo, un componente - - que permite actuar en sinergia con los contaminantes. De hecho, esto permite detectar dosis bajas de contaminantes. Preferentemente, este componente puede ser MDP o una molécula relacionada (N-glicolil-MDP, L18-MDP) , un péptido microbiano formilado (f-MLP), o LPS . Preferentemente, este componente es MDP, f-MLP o LPS. Aún más preferentemente, este componente es MDP o LPS. En particular, el LPS es un LPS E. coli.
En una realización preferida, se agrega MDP, en particular MDP S. aureus, a la muestra. Preferentemente, el MDP se agrega a la muestra a una concentración mayor que 1 µg/ml, preferentemente a una concentración que oscila entre 1 y 100 pg/ml. En una realización más particularmente preferida, el MDP se agrega a la muestra a una concentración de 10 µg/ml.
En otra realización preferida, f-MLP se agrega a la muestra a una concentración mayor que 10 nM, preferentemente de al menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 nM.
En otra realización preferida, se puede agregar LPS, en particular LPS E. coli, a la muestra a una concentración de al menos 10 pg/ml, por ejemplo, a una concentración de 25 pg/ml .
En una realización preferida, la preparación del polímero de glucosa probada tiene una concentración del polímero de glucosa de entre 5 y 50 mg/ml, preferentemente entre 5 y 10, 20, 30 o 40 mg/ml. En una realización particular, la preparación del polímero de glucosa probada tiene una concentración de polímero de glucosa de aproximadamente 5 mg/ml. En una realización preferida, la preparación del polímero de glucosa probada tiene una concentración de polímero de glucosa de aproximadamente 25 - - mg/ml .
Opcionalmente, una muestra de la preparación del polímero de glucosa puede tratarse con mutanolisina antes del ensayo. Esta enzima, a través de su actividad muramidasa, es capaz de despolimerizar PGN. Por ejemplo, la enzima a una concentración de aproximadamente 2500 U/ml puede colocarse en presencia de la muestra, diluida opcionalmente para tener una concentración de polímero de glucosa del 7.5 al 37.5% (peso/volumen) , durante 6 a 16 horas, preferentemente aproximadamente 16 horas. La muestra tratada se someterá posteriormente al ensayo con macrofagos de conformidad con la presente invención. Opcionalmente, el resultado, es decir la producción de citocina, obtenido con la muestra tratada con una mutanolisina puede compararse con el resultado obtenido sin tratamiento.
Opcionalmente, en otra alternativa, la muestra de la preparación de polímero de glucosa puede filtrarse antes del ensayo. El objetivo de esta filtración es básicamente remover las moléculas de alto peso molecular, como PGN de alto peso molecular y realizar el ensayo en el filtrado para analizar, más particularmente, los contaminantes de tamaño pequeño. El umbral de corte para la filtración puede, por ejemplo, estar entre 30 kD y 150 kD, preferentemente entre 30 y 100 kD o entre 30 y 50 kD, y en particular aproximadamente 30 kD. Preferentemente la filtración se realiza por ultrafiltración . También puede realizarse a través de cualquier medio conocido en la técnica. Por lo tanto, la muestra filtrada, el filtrado, se someterá al ensayo con macrofagos de conformidad con la presente invención. Opcionalmente, el resultado, es decir, la producción de citocina, obtenida con el filtrado - - puede compararse con el resultado obtenido sin filtración o antes de esta. Esto permitirá deducir la contribución inflamatoria especifica de las moléculas de tamaños pequeños.
En una realización preferida particular, el método tiene una o más de las siguientes características: - la línea celular se utiliza a una densidad entre 0.5 y 1 x 106 células/ml, preferentemente entre 0.7 y 0.8 x 106 células/ml, y aún más preferentemente aproximadamente 0.75 x 106 células/ml; y/o la concentración del polímero de glucosa es menor que 50 mg/ml, preferentemente aproximadamente 25 mg/ml; y/o la producción de citocina se mide después de 20 horas de estimulación para RANTES y/u 8 horas de estimulación para TNF- ; y/o - se agrega MDP en la preparación del polímero de glucosa, a una concentración entre 1 y 100 µg/ml, preferentemente aproximadamente 10 µg/ml .
Preferentemente, el método comprende todas las características .
Por lo tanto, en un modo muy particular, el método comprende : colocar macrófagos en presencia, durante aproximadamente 20 horas, de una preparación de polímeros de glucosa que pueden contener contaminantes pro-inflamatorios en presencia de MDP, preferentemente a una concentración entre 1 y 100 µg/ml, la concentración de polímero de glucosa es menor que 50 mg/ml, preferentemente aproximadamente 25 mg/ml, y los macrófagos tienen una densidad entre 0.5 y 1 x 106 células/ml, preferentemente entre 0.7 y 0.8 x 106 células/ml, y aún más - - preferentemente aproximadamente 0.75 x 106 células/ml; y medir la producción de CCL5/RA TES, la producción de CCL5/RANTES que indica que la preparación contiene contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria.
De manera muy particular, esta primera realización permite detectar la contaminación del polímero de glucosa con PGN y/o LPS, preferentemente con PGN de tamaño medio (en particular de aproximadamente 120 kDa) y/o LPS, aún más particularmente con LPS .
En particular, el método puede comprender la cuantificación de los contaminantes. Por ejemplo, esta cuantificación puede realizarse utilizando una curva dosis-respuesta. Esta curva dosis-respuesta puede producirse con las mismas células, en las mismas condiciones, con mayores dosis de contaminantes. Preferentemente, dicha curva dosis-respuesta puede producirse con mayores dosis de LPS.
La primera realización puede implementarse en los métodos de conformidad con la presente invención por si sola o en combinación con una segunda realización.
De conformidad con la segunda realización, la línea celular utilizada para llevar a cabo el ensayo de inflamación in vitro es una línea que permite detectar la actividad de uno o más receptores de inmunidad innatos.
En particular, esta línea celular puede obtenerse mediante transfección estable con uno o más vectores que codifican uno o más receptores de inmunidad innatos.
La actividad de un receptor de inmunidad innato puede detectarse, por ejemplo, utilizando un gen marcador que está - - sujeto a control directo de la vía de señalización asociada con dicho receptor. Preferentemente, este gen marcador codifica una proteína coloreada o fluorescente o codifica una proteína cuya actividad puede medirse con o sin un sustrato. En particular, el gen marcador codifica una fosfatasa alcalina.
Por lo tanto, el método comprende la colocación de una o más líneas celulares que expresan uno o más receptores de TLR o tipo NOD en presencia de la preparación de polímeros de glucosa, y la medición de la actividad de los receptores, en particular, a través de la señal de un gen marcador. Esta señal del gen marcador indica la presencia en la preparación de un contaminante que es un agonista del receptor.
Preferentemente, la línea celular permite detectar la actividad de uno o más receptores de TLR o tipo NOD, como los receptores TLR2, 3, 4, 5, 7, 8 o 9 o N0D2. Preferentemente, la línea celular permite detectar la actividad de uno o más receptores seleccionados de TLR2, TLR4 y NOD2. En una realización particular, la línea celular expresa los receptores TLR2, TLR4 y N0D2 y permite detectar su actividad.
Las líneas celulares utilizadas pueden, por ejemplo, ser líneas HEK-Blue™ (vendidas por la empresa InvivoGen) , modificadas por transfección estable con vectores que codifican receptores de inmunidad innatos. Sin embargo, debe notarse que los entendidos en la técnica también pueden utilizar otras líneas comercialmente disponibles (Imgenex) o pueden prepararlas.
Estas células también pueden cotransfectarse con un gen marcado que produce, por ejemplo, una forma secretada de fosfatasa alcalina (SEAP: fosfatasa alcalina embriónica - - secretada) , cuya síntesis está sujeta al control directo de la vía de señalización asociada con los receptores expresados en la misma línea celular. En una realización preferida, la reacción enzimática se produce utilizando una relación 1:3 del medio de ensayo versus el reactivo SEAP (por ejemplo 50 µ? de medio y 150 µ? del reactivo SEAP) . Asimismo, se preferirá el tiempo de reacción de al menos 60 minutos.
Las líneas celulares pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste de: - la línea hTLR2 de HEK-Blue™ (línea que responde específicamente a agonistas de TLR2) , - la línea hN0D2 de HEK-Blue™ (línea que responde efectivamente a los productos de despolimerización de PGN y a moléculas relacionadas (MDP, L18-MDP, etc.), y - la línea de Raw-Blue™ (línea macrófaga de ratón transfectada para expresar una fosfatasa alcalina) . La línea Raw-Blue™ expresa receptores de inmunidad innatos, y particularmente los receptores TLR2, TLR4 and NOD2.
Estas líneas se detallan más adelante en la descripción. En una realización preferida, se utilizarán una línea que expresa TLR2 y permite detectar su actividad y/o una línea que expresa los receptores TLR2, TLR4 y NOD2 y permite detectar sus actividades. A modo ej emplificativo, se utilizarán las líneas celulares hTLR2 de HEK-Blue™ y/o de Raw-Blue™. Más particularmente, el método implementará un ensayo que utiliza las líneas celulares hTLR2 de HEK-Blue™ y de Raw-Blue™.
En otra realización preferida, se utilizarán dos líneas que expresan TLR2 y N0D2 respectivamente y permiten detectar - - su actividad (de manera independiente) , y una linea que expresa los receptores TLR2, TLR4 y N0D2 y permite detectar sus actividades. A modo ejemplificativo, se utilizarán las lineas celulares hTLR2 de HEK-Blue™, hN0D2 de HEK-Blue™ y Raw-Blue™. Más particularmente, el método implementará un ensayo que utiliza las lineas celulares hTLR2 de HEK-Blue™, hN0D2 de HEK-Blue™ y Raw-Blue™.
El uso de dichas lineas permite, por lo tanto, reemplazar los ensayos de citocina con un ensayo enzimático (actividad de fosfatasa) y obtener algunas familias de moléculas de origen bacteriano de conformidad con los receptores expresados por la linea.
Asimismo, estas lineas permiten detectar contaminantes a umbrales muy bajos, en particular para los agonistas de TLR2 (PGN, LTA (ácido lipoico) , LM (Lipomanano) , etc.) y agonistas de NOD2 (productos de despolimerización de PGN y MDP) . Por lo tanto, la linea que expresa NOD2, en particular hNOD2 de HEK-Blue™, permite más particularmente detectar una contaminación con productos de despolimerización de PGN y MDP, preferentemente MDP. La linea que expresa TLR2, en particular hTLR2 de HEK-Blue™ y/o Raw-Blue™, permite más particularmente detectar una contaminación con PGN.
De conformidad con esta segunda realización, el ensayo de respuesta inflamatoria in vitro consiste en colocar las células de la linea celular haciendo posible detectar la actividad de uno o más receptores de inmunidad innatos en presencia de una preparación de polímeros de glucosa que pueden contener contaminantes pro-inflamatorios y en la medición de la actividad del receptor o de la señal del gen - - marcador que se asocia con él .
La detección de esta actividad o de su señal indica que la preparación contiene contaminantes capaces de activar uno o más receptores de inmunidad innatos y de generar una reacción inflamatoria.
En una realización preferida, la preparación del polímero de glucosa probada tiene una concentración de polímero de glucosa entre 5 y 50 mg/ml, preferentemente entre 5 y 10, 20, 30 o 40 mg/ml. En una realización particular, la preparación del polímero de glucosa probada tiene una concentración de polímero de glucosa de aproximadamente 5 mg/ml. En la realización preferida, la preparación del polímero de glucosa probada tiene una concentración del polímero de glucosa de aproximadamente 37.5 mg/ml cuando se utilizan células hTLR2 de HEK-Blue™ y/o hNOD2 de HEK-Blue™. En otra realización preferida, la preparación del polímero de glucosa probada tiene una concentración de polímero de glucosa de aproximadamente 50 mg/ml cuando se utilizan células Raw-Blue™.
Opcionalmente, una muestra de la preparación del polímero de glucosa puede tratarse con una mutanolisina previo al ensayo. Esta enzima, a través de su actividad de muramidasa, es capaz de despolimerizar los PGN. Por ejemplo, se puede colocar la enzima a una concentración de 2500 U/ml en presencia de la muestra, opcionalmente diluida para tener una concentración de polímero de glucosa entre 7.5% y 37.5% (peso/volumen) , durante 6 a 16 horas, preferentemente aproximadamente 16 horas. La muestra tratada se someterá a los métodos de conformidad con la segunda realización.
- - Opcionalmente, el resultado obtenido con la muestra tratada con una mutanolisina puede compararse con el resultado obtenido sin tratamiento.
Opcionalmente, en otra alternativa, la muestra de la preparación del polímero de glucosa puede filtrarse con anterioridad al ensayo. El objetivo de esta filtración es remover, básicamente, las moléculas de alto peso molecular, como PGN de alto peso molecular y llevar a cabo el ensayo en el filtrado para analizar, más particularmente, los contaminantes de tamaños pequeños. El umbral de corte para la filtración puede oscilar entre, por ejemplo, 30 kD y 150 kD, preferentemente entre 30 y 100 kD o entre 30 y 50 kD, y en particular aproximadamente 30 kD. Preferentemente, la filtración se produce mediante ultrafiltración . También puede realizarse a través de cualquier medio conocido en la técnica. Por lo tanto, la muestra filtrada, el filtrado, se someterá a los métodos de conformidad con la segunda realización. Opcionalmente, el resultado obtenido con el filtrado puede compararse con el resultado obtenido sin la filtración o antes de esta. Esto permitirá deducir el aporte inflamatorio específico de las moléculas de tamaño pequeño.
En una realización preferida y particular de esta segunda realización, el método tiene una o más de las siguientes características: la línea celular se utiliza a una densidad de aproximadamente 50,000 células/pocilio para una placa de 96 pocilios y para hTLR2 de HEK-Blue™ o Raw-Blue™ y de 10,000 células/pocilio para una placa de 96 pocilios para hNOD2 de HEK-Blue™; y/o la preparación del polímero de glucosa probada tiene una - - concentración del polímero de glucosa entre 5 y 50 mg/ml, preferentemente una concentración del polímero de glucosa de aproximadamente 37.5 mg/ml cuando se utilizan células hTLR2 de HEK-Blue™ y/o hNOD2 de HEK-Blue™ y una concentración de polímero de glucosa de aproximadamente 50 mg/ml cuando se utilizan células Raw-Blue™; y/o el contacto de la preparación del polímero de glucosa con las células dura aproximadamente entre 16 y 24 horas; y/o la señal del gen marcador de SEAP se detecta con una relación sobrenadante de cultivo: SEAP de 20:180, preferentemente de 50:150, preferentemente después de al menos 60 minutos de incubación, idealmente 60 minutos.
En una realización particular, el método comprende todas las características.
En particular, el método puede comprender la cuantificación de los contaminantes. Por ejemplo, esta cuantificación puede realizarse utilizando una curva dosis-respuesta. Esta curva dosis-respuesta puede producirse, particularmente, con las mismas células, en las mismas condiciones, con mayores dosis de contaminantes. Preferentemente, dicha curva dosis-respuesta puede producirse para las células que expresan TLR2 (por ejemplo, hTLR2 de HEK-Blue™ y Raw-Blue™) con mayores dosis de PGN y para las células que expresan NOD2 (por ejemplo, hNOD2 de HEK-Blue™) con mayores dosis de MDP.
El método de conformidad con la invención puede comprender una etapa que consiste en la identificación de los contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria.
Para esto, se coloca una línea celular que permite - - detectar la actividad de un receptor de inmunidad innato o varios receptores de inmunidad innatos, como se describió anteriormente, en presencia de la preparación del polímero de glucosa a ser probada. Se mide la actividad del receptor o la señal del gen marcador asociada con este receptor. La detección de esta actividad o de esta señal indica la presencia, en la preparación, de un contaminante que es un agonista del receptor.
Por lo tanto, la línea que expresa N0D2, en particular hNOD2 de HEK-Blue™ permite detectar, más particularmente, una contaminación con productos de despolimerización de PGN y MDP, preferentemente MDP. La línea que expresa TLR2, en particular hTLR2 de HEK-Blue™ y/o Raw-Blue™, permite detectar, más particularmente, una contaminación con PGN. Asimismo, los macrófagos, en particular los macrófagos THP-1, permiten detectar, más particularmente, una contaminación con LPS .
De conformidad con una realización, el método de conformidad con la invención comprende las etapas que consisten en: (a) llevar a cabo al menos un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro, como se describió en la primera realización, que consiste en colocar las células de una línea celular, preferentemente macrófagos, en presencia de una preparación de polímeros de glucosa que pueden contener contaminantes pro-inflamatorios y en medir la producción de citocinas de la fase aguda de inflamación, en particular TNF-OÍ, IL-?ß y/o quimiocinas como CCL5/RA TES, la producción de estas citocinas indican que la preparación contiene - - contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria, y/o (b) colocar una línea celular que permite detectar la actividad de un receptor de inmunidad innato o varios receptores de inmunidad innatos, como se describió anteriormente en la segunda realización, en presencia de la preparación y detectar la actividad del receptor o de la señal del gen marcador asociado con este receptor, la detección de esta actividad o de la señal indica la presencia, en la preparación, de un contaminante que es un agonista del receptor.
De conformidad con una realización preferida, el método de conformidad con la invención comprende las etapas que consisten en: (a) llevar a cabo al menos un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro que consiste en colocar las células de una línea celular, preferentemente macrófagos, en presencia de una preparación de polímeros de glucosa que pueden contener contaminantes pro-inflamatorios y en medir la producción de citocinas de la fase aguda de inflamación, en particular TNF-OÍ, IL-?ß y/o quimiocinas como CCL5/RANTES, la producción de estas citocinas indica que la preparación contiene contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria, y (b) cuando la preparación contiene contaminantes, colocar una línea celular que permite detectar la actividad de un receptor de inmunidad innato o varios receptores de inmunidad innatos, como se describió anteriormente, en presencia de la preparación y detectar la actividad del receptor o de la señal del gen marcador asociado con este - - receptor, la detección de esta actividad o de la señal indica la presencia, en la preparación, de un contaminante que es un agonista del receptor.
Las etapas a) y b) de este método se llevan a cabo de conformidad con los detalles anteriormente proporcionados. Preferentemente, el método comprende las dos etapas.
En una realización preferida, se utilizará una linea celular que expresa el receptor TLR2 y que permite detectar su actividad como hTLR2 de HEK-Blue™ y/o una linea que expresa varios receptores de inmunidad innatos, como se describió anteriormente, en particular TLR2, TLR4 y NOD2, como Raw-Blue™. Más particularmente, el método implementará un ensayo utilizando las lineas celulares hTLR2 de HEK-Blue™ y Raw-Blue™.
En otra realización preferida, se utilizará una linea celular que expresa el receptor TLR2 y que permite detectar su actividad como hTLR2 de HEK-Blue™, una linea celular que expresa el receptor NOD2 y permite detectar su actividad, como hN0D2 de HEK-Blue™ y/o una linea que expresa receptores de inmunidad innata, como se describió anteriormente, en particular TLR2, TLR4 y NOD2, como Raw-Blue™. Más particularmente, el método implementará un ensayo utilizando las lineas celulares hTLR2 de HEK-Blue™, hN0D2 de HEK-Blue™ y Raw-Blue™.
Por lo tanto, este método permite no solo detectar la presencia de contaminantes pro-inflamatorios en una preparación de polímero de glucosa sino que también permite obtener información acerca de la naturaleza de estos - - contaminantes. Es particularmente posible definir si estos contaminantes son agonistas de TLR o receptores de tipo NOD, como TLR2, TLR4 o NOD2. De conformidad con una realización preferida, se pueden utilizar varias lineas para proporcionar información adicional a la obtenida, por ejemplo, con el ensayo de respuesta de citocina en las células THP-1 diferenciadas : linea hTLR4 de HEK-Blue™: esta linea responde específicamente a agonistas TLR4. Permite evaluar LPS particularmente; - línea hTLR2 de HEK-Blue™ : esta línea responde específicamente a agonistas TLR2. Permite evaluar PGN particularmente .
Por lo tanto, su uso permite determinar el aporte de estos contaminantes en generar respuestas inflamatorias.
En una realización particular, la muestra de la preparación del polímero de glucosa puede filtrarse como se describió anteriormente, preferentemente con un umbral de corte de 30 kDa, en particular mediante ultrafiltración, para remover PGN, en particular PGN de gran tamaño. Por lo tanto, los lipopéptidos y glicopéptidos de tamaño pequeño, que son otros agonistas de TLR2, se mantienen en el filtrado y su respuesta solo se medirá probando el filtrado.
Asimismo, el tratamiento de soluciones con lisozima y/o ß-glucanasa permite eliminar PGN y/o ß-glucanos, y por lo tanto determinar la importancia de otros agonistas de TLR2 que pueden estar presentes en los lotes contaminados (glicolípidos y lipopéptidos) . Asimismo, una muestra de la preparación del polímero de glucosa puede tratarse con - - mutanolisina antes del ensayo, en particular como se detalla anteriormente; La linea hN0D2 de HEK-Blue™ : esta linea responde específicamente a agonistas de NODS . Permite evaluar MDP en particular.
El uso de esta línea permite detectarlos en concentraciones bajas. Este análisis es sumamente ventajoso dado que la presencia de PGN implica que sus productos de degradación también están presentes, y que pueden actuar de manera sinérgica con los agonistas de TLR; línea Nuil2 de HEK-Blue™: esta es una línea de control, cuyo uso es necesario para verificar que las soluciones de polímero de glucosa no inducen la producción de la enzima mediante un mecanismo intrínseco; - línea Raw-Blue™: es la línea macrófaga de ratón transfectada con SEAP.
La ventaja de esta línea es que expresa naturalmente de manera virtual todos los receptores de inmunidad innatos.
Sirve como control positivo en los ensayos, dado que se supone que responde a los contaminantes microbianos de cualquier tipo.
Un objeto de la invención también consiste en el medio para identificar los contaminantes pro-inflamatorios.
Los ensayos de LPS y PGN pueden realizarse a través de cualquier medio conocido por los entendidos en la técnica. Por ejemplo, el contenido de peptidoglicano puede determinarse de acuerdo a dos ensayos: ensayo estándar SLP vendido por la empresa WAKO Puré Chemical Industries Ltd., - - ensayo SLP-HS, ensayo de alta sensibilidad desarrollado y validado por la empresa solicitante como se detalla en la solicitud de patente WO 2010/125315.
Estos ensayos tienen reactivos diferentes (reactivos SLP, estándares de PGN) que exhiben reactividades biológicas ante impurezas de PGN sustancialmente diferentes y por lo tanto tienen diferentes criterios de rendimiento: • Ensayo estándar SLP: el reactivo SLP n° 297-51501- icrococcus luteus PGN estándar n° 162-18101.
· Ensayo SLP-HS (alta sensibilidad) : SLP-HS, kit n°293-58301 (incluye un PGN estándar Staphylococcus aureus).
El método SLP-HS desarrollado por la empresa solicitante i es más sensible. Tiene limites de detección (LD) y limites de cuantificación (LQ) por debajo del método estándar de SLP: Ensayo SLP-HS LD de 1 ng/g y LQ de 3 ng/g.
Ensayo SLP estándar de 20 ng/g y LQ de 40 ng/g.
Por lo tanto, salvo que se determine lo contrario, el análisis de PGN de conformidad con los métodos convencionales se lleva a cabo en la presente solicitud utilizando el ensayo i SLP-HS, dado que, como se ejemplificará y describirá a continuación, el ensayo SLP-*HS es más sensible que el ensayo SLP estándar.
Los ensayos de "respuesta inflamatoria" como se describió anteriormente, por ejemplo, utilizando las células HEK-Blue™ permiten identificar la naturaleza de los contaminantes principales (LPS, PGN, ß-glucanos, MDP y moléculas relacionadas) y estimar su aporte en la inducción de la respuesta inflamatoria.
Los otros contaminantes que pueden estar presentes en - - los lotes de ensayo son básicamente glicolípidos y lipopéptidos que son agonistas de TLR2, o péptidos microbianos ; para los glicolípidos y lipopéptidos, se lleva a cabo un procedimiento de fraccionamiento en base a su naturaleza anfifílica para recuperarlos y concentrarlos.
El tratamiento con una mezcla de cloroformo/metanol permite extraer estas moléculas de las soluciones de polímero de glucosa y concentrarlas después de la evaporación del cloroformo.
Una vez que se han recuperado las moléculas, se toman en un volumen mínimo de DMSO (o cualquier otro disolvente que es no tóxico para las células) y se analizan en los ensayos de respuesta inflamatoria previamente descritos.
Por lo tanto, el uso de una línea celular que permite detectar la actividad de un receptor como TLR2, por ejemplo, la línea de hTLR2 HEK-Blue™, permite confirmar la presencia o ausencia de rastros de agonistas de TLR2 diferentes a PGN en los lotes a analizar.
Los compuestos también pueden probarse en un modelo utilizando células que expresan todos los tipos de receptores, como las células de Raw-Blue™, pero, en este caso, las soluciones de polímero de glucosa son pretratadas en Detoxi-gel, para eliminar los rastros de LPS .
En función de los montos recuperados, se lleva a cabo un análisis más preciso de los contaminantes.
En particular, la muestra puede filtrarse. Por ejemplo, la muestra de la preparación del polímero de glucosa puede filtrarse con un umbral de corte de 30 kDa, en particular - - mediante ultrafiltración. Esto permite remover PGN, en particular PGN de gran tamaño. Por lo tanto, los lipopéptidos y los glicopéptidos de tamaño pequeño, que son otros agonistas de TLR2, se retienen en el filtrado y el filtrado puede analizarse para determinar la naturaleza de los contaminantes .
Asimismo, el tratamiento con la mezcla de cloroformo/metanol permite extraer los productos que posteriormente se fraccionan en resina C18 y/o una columna de carbono. Los compuestos se eluyen posteriormente utilizando un gradiente de agua/acetonitrilo . En función de la pureza de las fracciones y la cantidad de material, un análisis más preciso permite determinar la naturaleza bioquímica de estos compuestos, o aún sus estructuras.
Para los péptidos microbianos, una etapa de ultrafiltración en un filtro de 5 kDa permite extraerlos de las soluciones de polímero de glucosa. De ser necesario, pasar por una columna de carbono permite librar el filtrado de los compuestos más hidrófobos de un tamaño < 5 kDa.
Las soluciones se concentran posteriormente y se prueban para verificar sus propiedades biológicas. Dado que estos péptidos son quimiotácticos para leucocitos, su presencia puede detectarse en un ensayo de migración celular in vitro en el laboratorio.
Puede suceder que los polímeros de glucosa estén contaminados con otras moléculas conocidas por generar respuestas inflamatorias, como flagelina, que es una proteína agonista de TLR5, y derivados de ácidos nucleicos y moléculas relacionadas, agonistas de TLR3, 7, 8 y 9 (los primeros tres están involucrados en reacciones de compuestos de origen - - viral, mientras que TLR9 se activa por el ADN del origen bacteriano) .
En este caso, las lineas celulares que permiten detectar la actividad de estos varios TLR, en particular las lineas de HEK-Blue™, están disponibles y pueden utilizarse para analizar el impacto de estas moléculas en respuestas inflamatorias .
Asimismo, la presencia de compuestos oligonucleótidos puede confirmarse o de lo contrario, mediante análisis bioquímicos.
El método de la invención permite detectar los contaminantes de polímeros de glucosa para la diálisis peritoneal, dichos contaminantes son capaces de actuar en sinergia con el otro para poder generar una reacción inflamatoria, caracterizada en que comprende al menos un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza líneas celulares modificadas.
En una realización particular, la presente invención también proporciona un método para cuantificar PGN en una muestra, en particular de polímeros de glucosa para la diálisis peritoneal, que comprende incubar la muestra con una línea celular que permite detectar la actividad del receptor TLR2 y medir la activación de la vía de señalización asociada con TLR2, permitiendo, por lo tanto, determinar la cantidad de PGN contenido en la muestra.
En particular, esta línea es una línea modificada por transfección (preferentemente transfección estable) con un vector que codifica el receptor TLR2. Preferentemente, esta línea no expresa otros receptores de inmunidad innatos. Asimismo, esta línea puede contener un gen marcador que está - - sujeto al control directo de la vía de señalización asociada con el receptor TLR2. Preferentemente, este gen marcador codifica una proteina coloreada o fluorescente o codifica una proteina cuya actividad puede medirse con o sin sustrato. En particular, el gen marcador codifica una fosfatasa alcalina. Estas células pueden, por ejemplo, cotransfectarse con un gen marcador produciendo, por ejemplo, una forma secretada de fosfatasa alcalina (SEAP: fosfatasa alcalina embriónica secretada), cuya síntesis está sujeta al control directo de la vía de señalización asociada con el receptor TLR2. Esta línea puede ser una línea hTLR2 de HEK-Blue™, por ejemplo.
Para determinar la cantidad de PGN contenido en la muestra sobre la base de la medición de la activación de la vía de señalización asociada con TLR2, se establece de manera simultánea una curva dosis-respuesta con un intervalo de calibración que comprende mayores concentraciones de PGN, preferentemente de PGN S. aureus.
Con anterioridad al ensayo, la muestra que se analizará puede purificarse parcialmente de manera opcional para eliminar, por ejemplo otros contaminantes molestos. Los glicopéptidos y lipopéptidos pueden eliminarse de la muestra mediante la extracción de cloroformo. Después de la centrifugación, el análisis puede realizarse en la fase acuosa, de la cual se han eliminado, normalmente, los contaminantes de naturaleza lipofílica. El fraccionamiento en un microconcentrador, en filtros con umbrales de 30 o 50 kDa, puede realizarse y el análisis se lleva a cabo posteriormente en el retenido. El tratamiento anterior con ß-glucanasa permite que el análisis sea más exacto al eliminar las - - moléculas relacionadas.
De manera alternativa y preferentemente, la muestra a analizar se trata con anterioridad al ensayo con una mutanolisina . Por ejemplo, se puede colocar la enzima a una concentración de aproximadamente 2500 U/ml en presencia de la muestra, preferentemente diluida para tener una concentración de polímero de glucosa entre el 7.5% y el 37.5% (peso/volumen), de ser necesario. El tratamiento puede durar entre 6 y 16 horas, preferentemente aproximadamente 16 horas. En la realización preferida, el tratamiento se realiza durante aproximadamente 16 horas a aproximadamente 37 °C en una muestra que tiene una concentración de polímero de glucosa de aproximadamente el 7.5% (peso/volumen). La muestra tratada entrará en contacto con células que expresan TLR2, en particular, células hTLR2 de HEK-Blue™. De manera opcional, el resultado obtenido con la muestra tratada con una mutanolisina puede compararse con el resultado obtenido sin tratamiento.
Este mismo método también puede realizarse para detectar los contaminantes de polímeros de glucosa para la alimentación enteral y parenteral, o aún para la alimentación de niños recién nacidos.
Ejemplo 1: Preparación de los polímeros de glucosa para la diálisis peritoneal La materia primera para obtener los polímeros de glucosa de conformidad con la invención se produce de almidón de maíz ceroso de la siguiente manera: limpieza del maíz para mantener exclusivamente los granos de maíz enteros, - - remojo del maíz limpio, en presencia de ácido láctico para ablandar los granos, molienda húmeda, posteriormente separación de varios constituyentes, es decir, germen, cáscara de celulosa, proteínas y almidón, limpieza del almidón de manera concurrente con agua purificada para purificar el almidón tanto fisicoquímica como bacteriológicamente, centrifugación y secado del almidón, - suspensión del almidón en agua purificada con un contenido de materia seca definitiva del 40% y a una temperatura entre 45°C y 50°C, acidificación de la suspensión de almidón mediante la incorporación de HC1 con un pH < 2, y aumentando la temperatura a 115 - 120°C durante 6 a 8 minutos, floculación de las proteínas y de las grasas con este pH, neutralización de la suspensión con pH 5, filtración de la suspensión a través de tierras diatomeas (para retener las proteínas residuales, grasas y celulosa) , desmineralización en resina catiónica fuerte y resina aniónica débil, tratamiento con carbono activado a una temperatura de 70-80°C y con un pH entre 4 y 4.5; que remueve las impurezas coloreadas y reduce el nivel de impurezas microbiológicas .
El polvo de carbono activado que se agrega a una concentración entre el 0.2% y el 0.5% en una base seca se mantiene en un filtro de cerámica de 10 um cargado con anticipación con un agente filtrante, - - concentración pasándolo a través de un evaporador de película descendente, secado por pulverización de la solución concentrada en un secador por pulverización MSD vendido por la empresa Niro.
Este hidrolizado de almidón cumple con el monógrafo de la Farmacopea Europea (ref Maltrodextrinas : 1542). o pH: 4.0 - 7.0 para una solución al 10%, o I . d. : cumple, o Pérdida con el secado: 6% máximo, o DE: < 20 o Ceniza sulfatada: 0.5% máximo o S02: 20 ppm máximo o Metales pesados: < 10 ppm o E. coli: ausente/g o Salmonella:¦ ausente/10 g o Total de microorganismos viables: 100 CFU/g máximo (EP 1000 CFU/g) o Moho: 100 CFU/g máximo Asimismo, los lotes producidos se analizan sobre la base de los valores de: levadura + contaminación con moho: 150 CFU/10 g máximo, es decir, 15/g máximo - microorganismos aeróbicos: 500 CFU/10 g máximo, es decir, 50/g máximo - endotoxinas (ensayo LAL con gel-clot) : 20 EU/g máximo - peptidoglicanos : 2700 ng/g máximo Las condiciones para obtener los polímeros de glucosa de conformidad con la invención a partir del hidrolizado de almidón obtenido son las siguientes: - - 1) Preparación de agua / calidad del agua purificación del agua mediante filtración a través de 3 µp?; tratamiento sobre carbono activado, desmineralización en resinas de intercambio de cationes y aniones y filtración nuevamente (UA) , - dos tanques utilizados: o 10 m3 para disolver el hidrolizado de almidón, y el enjuagado a seco y etapas de limpieza, o 60 m3 para el proceso principal (limpieza de tanques, sus suspensiones de carbono activado y cromatografía) . 3) Cromatografía - solubilización del hidrolizado de almidón con agua purificada para obtener un contenido de materia seca de 35 - 45% a una temperatura entre 60 - 85°C, - esterilización de la filtración del hidrolizado de almidón pasándolo a través de 0.45 m y posteriormente 0.22 µp?; a ?? < 3 bar, separación por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) llevada a cabo utilizando un sistema continuo compuesto por seis series de placas dobles, cada una de 1 m3 de resina.
La resina utilizada es PCR145K vendida por la empresa Purolite .
La solución que pasa a través de la resina tiene una temperatura entre 75 y 85°C con un contenido de materia seca del 35-45%.
La duración de cada secuencia define el proceso. En el presente caso, la duración de cada secuencia es de 15 minutos.
El control se realiza mediante el análisis de la distribución del peso molecular y el análisis del rendimiento - - de la cromatografía de la siguiente manera: (cantidad de materia seca de la fracción deseada) / (cantidad de materia seca de la alimentación) .
Los pesos moleculares más bajos interactúan con la resina y los pesos moleculares altos se eluyen con agua purificada.
La concentración se realiza mediante evaporación de película descendente con un contenido de materia seca de 35 -45%.
Se realiza un tratamiento de calor a una temperatura de 120°C durante 2 minutos.
Se agrega carbono activado entre el 0.5% y el 1.5% del peso total del hidrolizado de almidón a 75°C con resinas catiónicas (1 a 3 1) para controlar el pH (4 - 4.5) y resinas aniónicas (5 a 10 1) para controlar el pH (5.5 - 6) .
La filtración se realiza a través de filtros de bolsa de propileno con ?? < 5 bar, en 5 a 6 horas por lote.
Se llevan a cabo una segunda y una tercera filtración a través de 1.5 y 0.45 µ??, y posteriormente a través de 0.22 y 0.1 µp?, y una ultrafiltración a través de una membrana con un umbral de corte de aproximadamente 40,000 Da.
Para el secado por pulverización: alimentación a 500 kg/h con una solución con un contenido seco de 40% y a 250°C en un secador por pulverización MSD vendido por la empresa Niro.
El producto secado por pulverización tiene, al salir, un contenido húmedo menor que el 6%.
Posteriormente, el producto se enfría en un lecho de aire fluidizado que comprende tres zonas de enfriamiento con aire a 40, 30 y 20°C. El producto obtenido posteriormente se - - filtra a través de un filtro de 800 µ?a para remover los agregados .
Se obtienen cerca de 500 kg del producto final a partir de 800 kg de maltodextrinas de partida, es decir, un rendimiento de aproximadamente el 60%.
Se determina la posible contaminación del circuito mediante el análisis del contenido de peptidoglicano y endotoxina en el producto final.
Por ejemplo, los contenidos observados y medidos en los lotes del producto final (expresado por gramo de polimero de glucosa) son, para el criterio anteriormente especificado, los siguientes: - Levadura y moho: 0/g - Microorganismos aeróbicos: 0/g - Endotoxinas (ensayo LAL gel-clot) : = 0.3 EU/g - Peptidoglicanos : < 3 ng/g - B. acidocaldarius: 1 /g Ejemplo 2: uso de la linea celular THP-1 "sensibilizada" para detectar contaminantes pro-inflamatorios Materiales y métodos Las células THP-1 (88081201, ECACC) se cultivan de manera rutinaria en el laboratorio.
Para los experimentos de activación pro-inflamatoria, las células THP-1 se diferencian durante 3 días en presencia de ésteres de forbol (PMA) . En particular, las células se colocan en el cultivo en 200 µ? del medio completo en presencia de 20 nM de pMA durante 72 horas (densidad celular final: 0.75xl06 células/ml ) .
- - Las muestras de polímero de glucosa se preparan conformidad con el ejemplo 1.
Tabla 1: Muestras de polímero de glucosa Las moléculas estándar para establecer los valores de calibración son para: - Ensayo LAL: E.coli 055B5 LPS - Ensayo SLP estándar: M. luteus PGN - Wako - Ensayo SLP-HS S. aureus PGN - Wako.
Los valores PGN analizados difieren entre los ensayos Wako debido a la diferente reactividad y sensibilidad de estos ensayos y potencialmente debido a su especificidad limitada y relativa (en particular, respuestas posibles a ß- gl canos) .
Los estudios de optimización se realizan con soluciones de polímero de glucosa 1-10.01 (tabla 1) cargados artificialmente con moléculas inflamatorias estándar: PGN y MDP (fuente: S. aureus), LPS (fuente: E. coli) , f-MLP - - (péptido sintético) .
La solución para la dilución de estándares es 1-10-01 con < 0.3 EU/g de LPS (ensayo LAL) , < 20 ng/g de PGN (ensayo SLP estándar) y < 3 ng/g (ensayo SLP-HS) y se utiliza en la concentración final de 5 mg/ml.
Los análisis se realizan posteriormente en una primera serie de muestras que corresponden a varios lotes seleccionados sobre la base de los niveles de contaminación con impurezas medidas utilizando los ensayos LAL y SLP (PGN, LPS y ß-glucanos) .
Los kits ELISA para el análisis de TNF-a y CCL5/RANTES se compran de AbCys, los agonistas estándar (PGN, LPS, f-MLP y MDP) de sigma Aldrich e InvivoGen.
Las células THP-1 diferenciadas (0.75xl05 células/ml) se colocan en cultivo en 200 µ? de medio completo y se incuban en presencia de varias muestras de ensayo.
Cada análisis se realiza por triplicado.
Los sobrenadantes se recolectan para analizar las citocinas secretadas después de 8 horas de estimulación para TNF-a, y 20 horas para RANTES .
Los ensayos ELISA se realizan de conformidad con las indicaciones dadas por el proveedor.
Resultados Los primeros ensayos consistieron en probar el potencial sinérgico de MDP y de f-MLP, y también la combinación PGN/LPS, en la producción de citocinas proinflamatorias mediante células THP-1 diferenciadas.
El MDP se probó en dosis de 1, 10 y 100 ug/ml . La - - dosis mínima no indujo un efecto sinérgico significativo. Por otra parte, las dosis de 10 y 100 yg/ml tuvieron actividad sinérgica similar en la producción de RANTES y de TNF- en respuesta a PGN y LPS.
Los resultados presentados en las figuras 1 y 2 muestran claramente un efecto sinérgico de MDP en la producción de RANTES. Por otra parte, este efecto sinérgico no está muy marcado para TNF- . Asimismo, el umbral de detección (cantidad de PGN o de LPS que da una respuesta mayor que tres veces SD del ruido de fondo) es menor para RANTES (ver Tabla 2) .
El f-MLP se utilizó en dosis de 1 nM, 10 nM y 100 nM. Sin embargo, no se observó efecto sinérgico alguno en las células THP-1 (figura 3) .
El efecto sinérgico de LPS se analizó incorporando una dosis sub-óptima (25 pg/ml) a mayores dosis de PGN (figura 4) . El efecto sinérgico de los dos agonistas es visible con posterioridad al ensayo de dos citocinas. Sin embargo, el efecto sinérgico inducido por LPS en la producción de RANTES sigue siendo menor al inducido por MDP.
La respuesta se cuantificó midiendo la producción de RANTES y de TNF-OÍ. En todos los casos, la sinergia es claramente visible para el ensayo de RANTES, con una sensibilidad alta. Este ensayo se prefiere y mantiene para el resto de los experimentos.
Los resultados muestran que la incorporación de MDP a células THP-1 en una dosis de 10 pg/ml, con un análisis de RANTES, es el modo más efectivo de sensibilización para detectar niveles bajos de PGN y de LPS. En teoría, estos umbrales de detección permitirían detectar los contaminantes - - presentes en productos manufacturados.
Los primeros análisis se realizaron diluyendo moléculas inflamatorias estándar en presencia del polímero 1-10.01. Las soluciones se agregaron en células THP-1 para obtener una concentración de polímero de glucosa final de 5 mg/ml y una densidad celular final de 0.75xl06 células/ml. Para poder aumentar la sensibilidad del análisis, se realizaron ensayos con variaciones de estos dos parámetros.
La presencia del polímero de glucosa no impide la producción de RA TES en concentraciones menores o iguales a 25 mg/ml. Este aumento en la sensibilidad no está relacionado con un efecto pro-inflamatorio del polímero en las células, dado que la respuesta es idéntica al ruido de fondo en ausencia de PGN (figura 5) .
Por otra parte, el aumento de la densidad celular por encima de 0. 5xl06/ml reduce la producción de RANTES en respuesta a PGN (agotamiento del medio de cultivo o de la modificación celular) (figura 6).
Los ensayos de sensibilidad con MDP a 10 pg/ml se reprodujeron tres veces para LPS y seis veces para PGN con células THP-1 que se originaron de diferentes preparaciones. Los datos obtenidos permitieron determinar los umbrales de detección y EC50 (tabla 2) . Para la estimación de la sensibilidad, los valores se expresaron en gramo de polímero, con la consideración de la concentración de 25 mg/ml.
Este efecto sinérgico inducido por MDP es idéntico para LPS y PGN, dado que permite aumentar la sensibilidad de células THP-1 por un factor de 5 en ambos casos.
- - Tabla 2: Detección de umbrales y EC50 para PGN y LPS en el modelo de THP-1 sensibilizado.
Estos estudios muestran gue las células THP-1 sensibilizadas pueden utilizarse para desarrollar un ensayo de respuesta inflamatoria sensible para detectar rastros de contaminantes en preparaciones de polímero de glucosa.
Se seleccionan las siguientes condiciones experimentales: - concentración final de células THP-1 diferenciadas: 0.75xl06 células/ml, - agente sensibilizante: MDP (S. aureus) a 10 pg/ml, - concentración final de polímero de glucosa: 25 mg/ml, - respuesta: ensayo ELISA de la producción de RANTES después de 20 horas de estimulación.
- - Para validar el método, se realizaron los ensayos de células THP-1 MDP sensibles con las muestras presentadas en la tabla 1.
La prueba en base a la producción de RANTES por células THP-1 sensibilizadas permite detectar las muestras de polímeros contaminados con LPS : 1-11.12 con referencia a polímeros, MP-10.07 y en menor medida, MM-10.04 y MM.10.05 ( figura 7 ) .
Por otra parte, las muestras contaminadas únicamente con PGN (por ejemplo, I 10-02) no respondieron, lo que indica que este ensayo celular es más adecuado para detectar endotoxinas. Sin embargo, .la amplitud de las respuestas no es directamente proporcional al nivel de LPS medido utilizando la prueba LAL (ver, por ejemplo, las respuestas obtenidas con 1-11.12 en comparación con MM-10.05), lo que sugiere que los contaminantes diferentes a PGN probablemente actúan con LPS en la respuesta de las células THP-1.
Las células THP-1 responden a las soluciones del PGN de control, pero casi no responden o no responden a las muestras que se originan de lotes contaminados únicamente con PGN natural .
El tamaño de PGN es muy heterogéneo, y algunas de estas moléculas pueden alcanzar pesos impresionantes (> 105 Da) . Estas últimas tienen baja solubilidad, que afecta su poder pro-inflamatorio pero promueve su remoción por filtración. Por otra parte, PGN solubles y por ende, activos, tienen un peso medio de 120 kDa y no se remueven por filtración. Por lo tanto, es posible prever que los dos ensayos Wako SLP permiten un análisis general de PGN, mientras que los ensayos celulares detectan PGN activos únicamente.
- - Ejemplo 3: Uso de lineas celulares HEK-Blue™ (hTLR2, hN0D2, Null2) y Raw-Blue™ para detectar contaminantes Materiales y métodos Las líneas celulares HEK-Blue™ (InvivoGen) son líneas modificadas por transfección estable con vectores que codifican receptores de inmunidad innatos. Estas células también se cotransfectan con un gen marcador que produce una forma secretada de fosfatasa alcalina (SEAP: fosfatasa alcalina embriónica secretada) , cuya síntesis está sujeta al control directo de la vía de señalización asociada con los receptores expresado en la misma línea celular.
Para los experimentos relacionados con la detección de contaminantes inflamatorios, se utilizan cuatro líneas: - línea hTLR2 de HEK-Blue™ (HEK-TLR2) : esta línea responde específicamente a agonistas TLR2 (en particular, PGN y la mayoría de glicolípidos y lipopéptidos) , - línea hNOD2 de HEK-Blue™ (HEK-NOD2) : esta línea responde a MDP y moléculas relacionadas como PGN monómeros, - línea Null2 de HEK-Blue™ (HEK-Null) : es una línea de control, cuyo uso es necesario para verificar que las soluciones de polímero de glucosa no inducen la producción de la enzima mediante un mecanismo intrínseco, - Línea de Raw-Blue™: esta es una línea de macrófago de ratón transfectada con SEAP. Esta línea, que expresa naturalmente de manera virtual todos los receptores de inmunidad innatos, se utiliza como un control positivo en los ensayos .
- - Las células de Raw-Blue™ y HEK-Blue™ se cultivan de conformidad con recomendaciones del proveedor. En particular, la presión de selección para los plásmidos que codifican los receptores de molécula inflamatoria (TLR2 o NOD2) y que codifican SEAP se proporciona agregando, en el medio de cultivo, los antibióticos de Selección/blasticidina HEK-Blue. Con la confluencia del 75%, las células se vuelven a suspender a una densidad celular de 0.28xl06 células/ml. Antes de la estimulación, 180 µ? de la suspensión celular se distribuyen en los pocilios de cultivo (placa de 96 pocilios), es decir 50,000 células/pocilio. Las células se estimulan durante 24 horas agregando 20 µ? de las muestras de ensayo (en una forma diez veces concentrada) . La estimulación dura entre 16 y 24 horas.
La producción de SEAP en respuesta a las moléculas contaminadas se estima midiendo la actividad de fosfatasa de conformidad con el protocolo suministrado por el fabricante: 20 µ? del sobrenadante del cultivo se diluyen en 180 µ? de Quanti-Blue. El color se desarrolla a 37°C y se realiza la lectura, en momentos diferentes, a 620 nm. Los datos se expresan como absorbancia después de la sustracción del ruido de fondo, obtenidos mediante la incorporación del mismo volumen del medio de cultivo no condicionado en el medio de reacción de la enzima.
Los estudios de optimización se realizan con soluciones de polímero de glucosa 1-10.01 (tabla 1) cargadas artificialmente con moléculas inflamatorias estándar: PGN, LTA y MDP (fuente: S. aureus) y LPS (fuente: E.coli). Los análisis se llevan a cabo sobre la serie de muestras que - - corresponden a varios lotes seleccionados sobre la base de los niveles de contaminación con PGN y LPS (tabla 1) .
Resultados Las células HEK-Blue se reciben en forma de viales congelados. Antes de comenzar con los ensayos de respuesta inflamatoria, es necesario asegurarse la reanudación del crecimiento de las células y de su capacidad de respuesta a las moléculas inflamatorias. Asimismo, estas células transíectadas se degeneran rápidamente después de varios pasajes, lo que puede resultar en una pérdida de los vectores de expresión para los receptores de inmunidad innatos, o aún del vector que codifica SEAP.
Por lo tanto se recomienda verificar la capacidad de las células para responder a los factores inflamatorios al comienzo de la colocación en el cultivo y posteriormente, después de varias etapas de subcultivo. Estos ensayos se realizan con PGN para HEK-TLR2, MDP para HEK-NOD2 y TNF-OÍ, este último es un activador poderoso de la vía NF- ?. De hecho, las células HEK poseen naturalmente el receptor de esta citocina, y producirán SEAP (el vector de expresión que está bajo control de la via NF-??) en respuesta a TNF- .
Los resultados presentados en la Figura 8 muestran los ensayos realizados para verificar la reanudación del crecimiento de tres lineas. Como se esperaba, las células HEK-TLR2 y HEK-Null responden a TNF- con una producción equivalente de SEAP. Asimismo, la linea HEK-Null no es sensible a PGN y MDP, mientras que la célula HEK-TLR2 responde efectivamente a PGN únicamente. Estas dos lineas adquirieron sus características fenotípicas y será posible - - utilizarlas para el resto de los experimentos. En este ejemplo, la linea HEK-N0D2 responde únicamente de manera muy débil a TNF-a y a MDP, lo que indica que no adquirió las características esperadas.
La respuesta de las células HEK-Blue y Raw-Blue a las moléculas pro-inflamatorias está relacionada directamente con la producción de SEAP. El proveedor recomienda la incorporación de 20 µ? de sobrenadante de cultivo en 180 µ? de sustrato SEAP. Los experimentos se realizaron en estas condiciones, y posteriormente se optimizaron aumentando el volumen del sobrenadante de cultivo y por ende, la cantidad de enzima en la solución (figura 9) .
Los resultados demuestran que la relación 50/150 proporciona una respuesta mayor que la relación recomendada por el proveedor. Por otra parte, la relación 100/100 no es más efectiva, probablemente debido a la falta de sustrato SEAP en el medio de reacción.
La intensidad de la coloración (620 nm) es proporcional a la cantidad de SEAP secretada por las células, pero también al tiempo para la hidrólisis del sustrato por parte de la enzima. Los distintos tiempos de visualización se prueban utilizando los mismos sobrenadantes de las células HEK-TLR2 y Raw-Blue activadas por PGN (figura 10) .
La coloración óptima se logra comenzando con 60 minutos de reacción entre SEAP y su sustrato para las células HEK-TLR2. Se observó un ligero aumento a los 90 minutos para las células Raw-Blue, pero este aumento tal vez esté relacionado con el hecho de que estas células producen menos SEAP.
El efecto de la concentración del polímero de glucosa en las respuestas celulares se analizó estimulando las células - - HEK-TLR2 y Raw-Blue con PGN estándar diluido en el medio complementado con el polímero 1-10.01. Las soluciones se agregaron posteriormente a las células para obtener concentraciones finales de polímero que oscilan entre 5 y 50 mg/ml (figura 11) .
Las concentraciones hasta 37.5 mg/ml no modifican significativamente la amplitud de la respuesta a PGN en la línea HEK-TLR2. Se nota una mejora en la respuesta a concentraciones bajas de PGN para concentraciones de polímero por encima de los 25 mg/ml, probablemente relacionada con una mejor dispersión del contaminante. Respecto de las células Raw-Blue, la producción de SEAP no se modifica, independientemente de la concentración de polímero de glucosa .
La línea HEK-NOD2 muestra una baja amplitud de respuesta a MDP y aún a TNF-a, que parece estar relacionada a un ruido de fondo alto. En estas células, el gen SEAP está sujeto al control de un promotor débil, que es más sensible a la tensión celular que la utilizada para otras células HEK-Blue. Para reducir el ruido de fondo y aumentar la amplitud de la respuesta a los contaminantes, las condiciones de cultivo se modificaron para reducir la tensión de las células.
De conformidad con las recomendaciones del proveedor, las células con una confluencia del 75% se vuelven a suspender a una densidad de 0.28x10s células/ml, y posteriormente 180 µ? de la suspensión celular se distribuyen en el pocilio de cultivo (placa de 96 pocilios) , es decir, 50,000 células/pocilio, antes de la estimulación durante el día .
En el nuevo procedimiento denominado sin subcultivo, las - - células HEK-N0D2 se condicionan en pocilios (10, 000/pocillo) y se cultivan durante tres días. Antes de la estimulación el medio de cultivo se remueve y reemplaza con un medio que contiene 1% de FCS y las soluciones a probar. En este caso, la respuesta de SEAP es 5 a 6 veces mayor que el control negativo, el cual es compatible con un ensayo para detectar MDP en soluciones contaminadas (figura 12) .
Estos primeros estudios demuestran que las células HEK-Blue y Raw-Blue pueden utilizarse para desarrollar ensayos de respuesta inflamatoria sensible para detectar rastros de contaminantes en preparaciones de polímero de glucosa .
Se seleccionaron las siguientes condiciones experimentales : - concentración final de polímero de glucosa: 37.5 mg/ml para células HEK-Blue, y 50 mg/ml para células Raw-Blue, - reacción enzimática: 50 µ? de medio condicionado + 150 µ? de reactivo SEAP, - tiempo mínimo de reacción: 60 min.
Las figuras 13 a 16 muestran ejemplos de ensayos de la actividad SEAP producida por las células HEK-TLR2 y Raw-Blue en respuesta a varias moléculas inflamatorias.
Las células HEK-TLR2 responden a PGN de manera muy efectiva, mientras que la respuesta a LTA es más débil. Sin embargo, estas respuestas son más efectivas que aquellas observadas con células del tipo monocito/macrófago . Asimismo, el polímero de glucosa no tiene un efecto directo en la producción de SEAP, dado que no se observa respuesta en los sobrenadantes de células HEK-Null.
- - Las células Raw-Blue responden bien a PGN, pero son menos sensibles que las células HEK-TLR2. La respuesta a LPS es débil y sigue siendo mucho menor que la observada cuando se mide la producción de RANTES por las células THP-1.
A diferencia de otras lineas celulares, las células HEK- NOD2 responden de manera efectiva a MDP, que puede aprovecharse para detectar los productos de degradación de PGN.
Los experimentos con PGN, LPS y MDP estándar se reprodujeron con preparaciones celulares diferentes, que permitieron determinar las características presentadas en la tabla 3. Para la estimación de la sensibilidad, los valores se agregaron en gramo de polímero, con la concentración de 37.5 mg/ml considerada para las células HEK-Blue y 50 mg/ml para las células Raw-Blue.
Tabla 3: Los umbrales de detección y EC50 para PGN, LPS y MDP en los modelos de HEK-Blue y Raw-Blue - - Las lineas HEK-TLR2 y Raw-Blue son muy efectivas para detectar PGN en concentraciones bajas. En particular, la linea HEK-TLR2 detecta niveles PGN por debajo de 2 ng/g de polímero de glucosa, es decir, un umbral de sensibilidad que es 50 veces mayor que el obtenido con células THP-1 sensibilizadas. La línea Raw-Blue detecta de manera efectiva pequeños rastros de PGN, pero no es reactiva respecto de LPS, con un umbral de detección aproximadamente 50 veces mayor que el umbral de las células THP-1 sensibilizadas.
Para validar estos ensayos, se realizaron los análisis con muestras de polímero de glucosa.
La línea HEK-TLR2 permite detectar contaminaciones en los lotes 1-10.02, 1-11.12 y MM-10.05 y en menor medida, en los lotes MP-10.06 y MP-10.07 (la respuesta observada con MM-10.04 no es significativa en comparación con 1-10.01 y por lo tanto no se retiene) .
Por otra parte, no se detecta la muestra 1-10.03, que puede correlacionarse con un nivel muy bajo de PGN, cerca del límite de detección del ensayo SLP-Wako (figura 17) .
Aunque se esperaban respuestas positivas obtenidas con 1-10.02, 1-11.12, MM-10.05 y MP-10.07, dado el alto nivel de PGN presente en estas cuatro muestras, puede notarse que no existe proporcionalidad entre la concentración dada por el ensayo SLP y la respuesta de las células.
Es más, los polímeros de glucosa 1-10.02 e 1-11.12 generan las mayores respuestas, mientras que los niveles de PGN son menores a 1 ug/g. Por el contrario, la muestra MP-10.07, que es una con la mayor carga de PGN, genera una respuesta cercana al ruido de fondo. Los PGN son - - macromoléculas de un peso muy variable, y se ha demostrado que su reactividad es inversamente proporcional a su peso molecular. Por lo tanto, se puede prever que los PGN de I-10.02 e 1-11.12 son más pequeños en tamaño que los PGN presentes en las muestras MM-10.05 y MP-10.07 que explicarían su mayor potencial pro-inflamatorio.
También es sorprendente ver una respuesta con el lote MP 10.06, aunque no contiene PGN. Sin embargo, las células HEK-TLR2 reaccionan con otras moléculas inflamatorias, como lipopéptidos, LTA o L7AM ( lipoarabinomananos ) , que son todos agonistas de TLR2. Por lo tanto, este resultado sugiere que esta muestra, que no está contaminada en términos de ausencia de LPS y de PGN, contiene otras moléculas pro-inflamatorias que son agonistas de TLR2.
Con la excepción de las muestras 1-10.01 e 1-10.03, todas las muestras generan una respuesta positiva con las células Raw-Blue (figura 18) .
El nivel de LPS presente en la muestra 1-10.02 se acerca al umbral de detección del ensayo LAL, que indica que la respuesta observada se debe a la presencia de PGN. Este resultado confirma que, contrario a las células THP-1 que no responden a esta muestra, las células Raw-Blue son efectivas para detectar pequeñas contaminaciones con PGN. Esta respuesta fuerte de los lotes 1-11.12, MM-10.05 y MP-10-07 parece deberse a la presencia de dos contaminantes (PGN y LPS) .
Al igual que las células HEK-TLR2, las células Raw-Blue responden de manera positiva a MP-10.06, que confirma la presencia de un contaminante diferente a LPS y PGN en la muestra.
- - Finalmente, las células HEK-N0D2 reaccionan de manera potente en presencia de MP-10.07, y tienen una respuesta débil pero significativa con las muestras 1-10.03, M-10.04 y MP-10.06, lo que indica que estas muestras fueron contaminadas con PGN durante la etapa de su producción y que estos últimos se degradaron parcialmente durante la fabricación del producto (figura 19) .
Las células HEK-TLR2 y Raw-Blue son efectivas para detectar rastros de contaminantes inflamatorios en productos del tipo 1-10.01 e 1-10.03.
Tienen características que son complementarias a las células THP-1 sensibilizadas. De hecho, los ensayos que utilizan los tres permiten detectar la mayoría de los contaminantes inflamatorios que pueden estar presentes en muestras de polímero de glucosa.
THP-1: cualquier contaminante inflamatorio con una alta reactividad para LPS.
- Raw-Blue: cualquier contaminante inflamatorio con una alta reactividad para PGN.
- HEK-TLR2 : específica para los agonistas de TLR2 con una alta reactividad para PGN.
HEK-NOD2 : específica para MDP y por ende, para productos de degradación de PGN. En cuanto a las células THP-1, también se nota una ausencia de proporcionalidad entre los niveles de PGN y/o LPS y las amplitudes de las respuestas celulares .
Este problema está relacionado indudablemente con el tamaño de estas macromoléculas y/o a su presencia en la forma de agregados, que afecta su reactividad respecto de las células. Por lo tanto, se observó que pasar PGN estándar a - - través de un filtro de 0.22 um reduce en aproximadamente 50% la reactividad para las células HEK-TLR2. Por lo tanto, en todos los ensayos, las soluciones de polímero de glucosa se preparan en condiciones asépticas pero sin una etapa de filtración de las moléculas estándar.
Ejemplo 4: Caracterización de contaminantes mediante el uso de líneas celulares THP-1 sensibilizada, HEK-Blue™ (hTLR2 , hNOD2) y Raw-Blue™ Los ejemplos 2 y 3 muestran que las líneas THP-1 sensibilizada, HEK-TLR2, HEK-NOD2 y Raw-Blue son efectivas para detectar rastros de contaminantes inflamatorios en las muestras de polímero de glucosa. Además de LPS y MDP, cuya presencia se detecta mediante los receptores TLR4 y NOD2, los otros contaminantes que pueden estar presentes en la muestra son predominantemente ligandos TLR2 (PGN, LTA y lipopéptidos ) . Por lo tanto, las líneas no permiten establecer la contribución de PGN en la respuesta específica de TLR2. Sin embargo, los PGN son macromoléculas cuyo peso oscila entre ~ 100 kDa a varios millones de Da. Por el contrario, LTA y lipopéptidos tienen pesos bajos, menores que 15 kDa. Por lo tanto, la introducción de una etapa de ultrafiltración (30 kDa) debería permitir la retención de PGN y la medición de la respuesta a los ligandos TLR2 de tamaños pequeños únicamente.
Procedimientos experimentales Para los experimentos relacionados con este ejemplo, se - - utilizan cinco lineas celulares presentadas en los ejemplos 2 Y 3: - linea monocitica THP-1: respuesta a cualquier contaminante inflamatorio con una alta reactividad para LPS, - linea Raw-Blue™: respuesta a cualquier contaminante inflamatorio con una alta reactividad para PGN, - linea hTLR2 de HEK-Blue™: especifica para agonistas TLR2 con una alta reactividad para PGN, - linea hNOD2 de HEK-Blue™: especifica para los productos de despolimerización total de PGN (MDP) - linea Nuil HEK-Blue™: control de respuesta negativo. Las muestras de polímero de glucosa están presentes en el ejemplo 2 (tabla 1). Estas muestras se preparan en solución en las concentraciones descritas en los ejemplos 2 y 3. Las respuestas celulares (producción de RANTES para las células THP-1 y la secreción de SEAP para las células Blue®) se analizan con muestras no filtradas: respuesta total, o con los filtrados obtenidos mediante ultrafiltración en un microconcentrador con un umbral de corte a 30 kDa (Sartorius) : respuesta de filtrado.
Antes de su uso, los microconcentradores se trataron con una solución salina (150 mM de NaCl) preparada con agua no pirógena. Los retenidos y filtrados se probaron con líneas celulares, y solo los filtrados que dieron una respuesta negativa en cada ensayo se mantuvieron para los análisis con las muestras de polímero de glucosa.
Resultados Los resultados presentados en la figura 20 muestran las - - respuestas de las células HEK-TLR2 y Raw-Blue obtenidas en presencia de varias muestras antes y después de la ultrafiltración.
Las respuestas totales son similares a las observadas en el ejemplo 3 (figuras 17 y 18) .
Las respuestas del filtrado se reducen en gran medida para las muestras 1-10.02 e 1-11.12 en los dos tipos celulares, con valores cercanos o iguales a los umbrales de detección. Estos datos confirman que estas dos muestras están contaminadas con PGN, que fue retenido por el filtro.
La respuesta del filtrado de MM-10.05 se redujo en las células HEK-TLR2 pero no en las células Raw-Blue, lo que indica que esta muestra está contaminada con una combinación de varias moléculas, con una parte considerable contribuida por PGN.
Las muestras MM-10.04, MP-10.06 y MP-10.07 no están significativamente contaminadas con PGN dado que las respuestas total y de filtrado son idénticas en las células HEK-TLR2. Por otra parte, se notó una disminución del 50% en la respuesta del filtrado para la muestra MP-10.07 en las células Raw-Blue. El ensayo LAL demostró que esta muestra se carga con LPS. A pesar de que el peso de las endotoxinas es menor que 30 kDa, estas moléculas son capaces de formar agregados, que pueden representar la pérdida de respuesta después de la filtración.
Las respuestas total y de filtrado se analizaron en los tipos celulares THP-1, Raw-Blue, HEK-TLR2 y HEK-NOD2. Los resultados aparecen en la tabla .
Para las células HEK-NOD2, las respuestas total y de - - filtrado son idénticas, lo cual se esperaba dado que MDP y las moléculas relacionadas tienen un peso mucho menor que 30 kDa (MW~500 Da) . En la tabla 4, se reproducen las respuestas totales únicamente.
Tabla 4: Caracterización de los contaminantes mediante el análisis de las respuestas celulares. Los niveles de contaminación se expresan como una función de los limites del umbral de detección (LOD) y de EC50 definidas en los ejemplos 2 y 3 para cada tipo celular (tablas 2 y 3) con las curvas dosis-respuesta respecto de LPS para las células THP-1 sensibilizadas, respecto de PGN para las lineas Raw-Blue y HEK-TLR2 y respecto de MDP para la linea HEK-NOD2 (-) : nivel < LOD; (±) : LOD < nivel < 3 x LOD; ( + ) : 3 x LOD < nivel < 0.3 x EC50; (++) : 0.3 x EC50 < nivel < 3 x EC50; (+++): nivel > 3 x EC50 - - Los datos permiten caracterizar los tipos de contaminantes presentes en cada solución de polímero de glucosa y establecer su aporte en la respuesta inflamatoria: 1-10.01: muestra no contaminada. 1-10.02: muestra fuertemente contaminada con PGN. La ausencia de respuesta de las células THP-1 y HEK-N0D2 y de los filtrados indica que el aporte de otros contaminantes es insignificante . 1-10.03: muestra débilmente contaminada con residuos que probablemente se originaron de productos de degradación de tamaño pequeño. De hecho, las respuestas total y de filtrado se encuentran en el limite del ruido de fondo en todos los ensayos . 1-11.12: muestra fuertemente contaminada con PGN. La respuesta débil de las células THP-1 también hace referencia a los rastros de LPS .
MM-10.04: muestra débilmente contaminada con LPS y moléculas activadoras de TLR2 de tamaño pequeño (LTA, lipopéptidos ) . La presencia de MDP también apunta a los productos de degradación de PGN.
MM-10.05: muestra contaminada con PGN y otras moléculas de tamaños pequeños. Las respuestas débiles de otros ensayos sugieren la presencia de rastros de LPS y de otros ligandos de TLR2.
MP-10.06: muestra contaminada con numerosas moléculas pequeñas. Por otra parte, las respuestas débiles de THP-1 y HEK-TLR2 indican la ausencia de PGN y de LPS.
MP-10.07: muestra contaminada con numerosas moléculas - - pequeñas, con una alta proporción de LPS y de MDP.
Puede notarse que los resultados coinciden con los ensayos Wako SLP-HS para las muestras 1-10.01, 1-10.02, I-10.03 e 1-11.12, que son productos terminados y las muestras MM-10.04, y P-10.06, que se identificaron como carentes de PGN.
Por otra parte, las dos muestras MM-10.05 y MP-10.07 dieron respuestas de PGN que son más débiles que las esperadas con los datos de las muestras de SLP. Sin embargo, es posible que estas muestras hayan dado positivos falsos con los ensayos de SLP, mediante efecto reciproco con ß-glucanos, por ejemplo. Otra posibilidad es que estas muestras contengan PGN muy grandes, cuya baja solubilidad evita que se produzca una respuesta en los ensayos celulares.
Ejemplo 5: Método de ensayo de peptidoglicano El ensayo se basa en el reconocimiento especifico de PGN por una linea que expresa el receptor TLR2 y en la producción de una actividad enzimática que se puede medir mediante la activación de la vía de señalización asociada con TLR2.
Procedimientos experimentales Para los experimentos relacionados con este ensayo, se utilizaron dos lineas: - linea hTLR2 de HEK-Blue™; - linea Null2 de HEK-Blue™.
Las dos lineas están representadas en el ejemplo 3.
Establecimiento de la curva dosis-respuesta - - La curva dosis-respuesta se produjo con PGN S. aureus estándar (figura 21) .
Las células de HEK-Blue™ se incuban con mayores concentraciones del estándar y la respuesta celular se mide cuantificando la actividad enzimática producida.
El resultado es una curva, de respuesta celular sigmoide convencional : parte (A) corresponde a las respuestas obtenidas con concentraciones bajas de PGN, por debajo de aquellas que activan efectivamente TLR2. Esta zona no lineal corresponde al limite del umbral de detección del método. Para poder incluir la variabilidad del método, este umbral de detección se estima como tres veces mayor que el valor del ruido de fondo (respuesta obtenida en ausencia de un estimulo) . - parte (B) es la más interesante dado que se observa una respuesta lineal. Esta zona de respuesta efectiva permite determinar una relación directa entre la respuesta celular y el nivel de PGN. Por lo tanto, se trata de la zona de ensayo; parte (C) corresponde a una saturación de la respuesta celular en presencia de concentraciones de PGN que son muy altas. De hecho, hay una saturación de los receptores TLR2.
La curva estándar para respuesta de las células HEK-TLR2 ante PGN exhibe una zona de linealidad para concentraciones entre 0.07 y 10 ng/ml (es decir, entre 2 y 267 ng/g) .
En el caso de las muestras que pueden estar altamente contaminadas con PGN, será necesario realizar varias diluciones de serie para estar siempre en la zona de linealidad. Por el contrario, bajas concentraciones de PGN - - requieren una etapa de concentración de la muestra si se desea aumentar la sensibilidad del ensayo.
Preparación de la muestra Los ensayos de PGN se realizan en soluciones de polímero de glucosa. La muestra que requiere la cuantificación de PGN se incuba con células hTLR2 de HEK-Blue™, y la respuesta celular se mide cuantificando la actividad enzimática producida. La cantidad de PGN contenido en la muestra puede determinarse haciendo referencia a las curvas dosis-respuesta .
Los primeros ensayos se realizaron con muestras contaminadas que se originaron de lotes de polímero de glucosa manufacturados (ejemplo 3, figura 15).
Las células HEK-TLR2 permiten detectar la presencia de PGN en la mayoría de las muestras. Por otra parte, se ha observado que no existe correlación entre los niveles de PGN medidos por el método SLP-Wako y las amplitudes de las respuestas celulares a PGN. De hecho, las muestras con la mayor carga de PGN no son aquellas que inducen la producción más fuerte de SEAP.
A modo ilustrativo, la muestra MP-10.07, que es la muestra con mayor carga de PGN (645 ng/mg) no genera una respuesta celular marcada con las células HEK-TLR2. Por otra parte, las muestras 1-10.02 e 1-11.12 están menos contaminadas (253 y 393 ng/g, respectivamente) , pero son las más reactivas en términos de respuesta celular.
Los PGN tienen tamaños muy heterogéneos. Las formas más pesadas (> 106 Da) tienen baja solubilidad y por lo tanto no - - son muy reactivos en los ensayos celulares. Por otra parte, se prueban mediante el ensayo SLP-Wako. Los PGN de tamaño intermedio (~ 100 kDa) son muy solubles y son inductores potentes de TLR2. A pesar de los niveles bajos, son capaces de generar una respuesta inflamatoria fuerte. Esta dispersión de tamaño y la dispersión de actividad es un obstáculo importante para relacionar el nivel de contaminación con el riesgo de desarrollar una respuesta inflamatoria cuando se utilizan ensayos cuantitativos convencionales (LAL y SLP- ako) .
Los PGN presentes en las muestras 1-10.02 e 1-11.12 son solubles y, por ende, muy reactivos. Por otra parte, la muestra MP-10.07 contiene probablemente PGN de gran tamaño, que pueden eliminarse durante la producción del producto final.
En base a estos primeros resultados, el método de ensayo de PGN en base al uso de las células HEK-TLR2 permitiría cuantificar los PGN biológicamente activos, capaces de causar reacciones inflamatorias in vivo.
Un procedimiento particularmente ventajoso para el ensayo de PGN capaces de generar una respuesta inflamatoria es reducir su tamaño y aumentar su solubilidad para el ensayo de respuesta celular in vitro.
La mutanolisina es una enzima que, a través de su actividad muramidasa, es capaz de despolimerizar los PGN. Para probar su actividad, se prepararon soluciones de PGN estándar (S. aureus) diluyendo la molécula en un medio de cultivo en ausencia o en presencia del polímero 1-10.01 (polímero no contaminado) en concentraciones del 7.5% y el 37.5% (peso/volumen).
- - Las muestras se trataron en presencia de 2500 U/ml de mutanolisina durante 16 horas a 37°C y se agregaron a las células HEK-TLR2. La respuesta celular se midió siguiendo la actividad de SEAP producido, de acuerdo con las condiciones descritas en el ejemplo 3.
Ante la ausencia del polímero de glucosa, el tratamiento con mutanolisina durante 16 horas reduce la respuesta de las células HEK-TLR2 en más del 50%, lo que indica que la despolimerización fue muy potente y redujo la reactividad del PGN respecto de las células. Por otra parte, la presencia del polímero de glucosa reduce la actividad de la enzima, dado que la respuesta de las células se mejora en presencia de 7.5% de polímero, mientras que se mantiene sin modificaciones en presencia de 37.5% del polímero.
La mutanolisina por sí sola no induce respuesta celular alguna, lo que indica que no está contaminada y no tiene efecto de activación en las células.
Para verificar el efecto de este tratamiento, los polímeros 1-10.01, 1-10.02, 1-10.03, 1-11.12, M-10.05 y MP-10.07 se diluyeron en la concentración de 7.5% y posteriormente se trataron durante 16 horas a 37°C en ausencia o en presencia de 2500 U/ml de mutanolisina.
La respuesta celular fue inducida agregando entre 40 µ? y 160 µ? de suspensión celular (concentración final de polímero: 15 mg/ml) .
- - Resultados Las respuestas de las células HEK-TLR2 en presencia de polímeros no tratados son débiles, lo cual se esperaba dada la concentración baja de polímero en comparación con el ejemplo 3.
Después del tratamiento con mutanolisina, las respuestas a las soluciones de polímero de glucosa aumentan claramente (figura 22). Asimismo, puede notarse que el polímero 1-10.03 genera una respuesta equivalente a los polímeros 1-10.02 y MM-10.05, aunque no fue reactiva en los ensayos anteriores.
Estos resultados indican que la mutanolisina parcialmente despolimerizada y por lo tanto, los PGN solubilizados son total o parcialmente insolubles debido a su tamaño excesivamente grande.
Los valores de absorbancia se reportaron en las curvas de calibración establecidas en las mismas condiciones con el PGN estándar (figura 23), para determinar las concentraciones de PGN presentes en los polímeros de glucosa.
Los resultados expresados como ng de PGN/g del polímero de glucosa aparecen en la tabla 5. Después del tratamiento con mutanolisina, los valores son menores que los obtenidos con los ensayos SLP- ako, pero reflejan la carga de los polímeros de glucosa en términos de PGN con actividad pro-inflamatoria (Tabla 1).
El polímero 1-10.03 otorga un alto valor, cercano a I- 10.02, después del tratamiento con mutanolisina. Este dato es interesante dado que los dos polímeros han sido objeto de reclamos por episodios de peritonitis aséptica. El tratamiento con mutanolisina de 1-10.03 permitió revelar la carga activa de PGN, probablemente permitiendo que el - - contaminante se solubilice.
Los valores de las muestras MM-10.05 y MP-10.07 siguen siendo más bajos que aquellos obtenidos con los ensayos SLP. Sin embargo, estas muestras están contaminadas con otras moléculas inflamatorias diferentes a los PGN. Estas moléculas, y en particular los ß-glucanos, probablemente interfirieron en los ensayos SLP, aumentando la respuesta de los ensayos SLP.
Tabla 5: Ensayo de PGN presentes en los polímeros de glucosa antes y después del tratamiento con mutanolisina . Los valores se expresan en ng, PGN S.aureus equivalente/g de polímero .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (30)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la . invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para detectar contaminantes pro-inflamatorios de polímeros de glucosa, contaminantes que son capaces de generar, de manera separada o en combinación, una reacción inflamatoria, caracterizada por que comprende al menos un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro utilizando una línea celular que permite detectar al menos un factor de respuesta inflamatoria, la línea celular es una línea celular de macrófago o diferenciada de macrófago, una célula que expresa uno o más receptores de tipo toll (TLR) o receptores de tipo NOD como TLR2, TLR4 o NOD2 y permite detectar las respuestas de los receptores, o una combinación de estos.
2. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que los polímeros de glucosa se seleccionan del grupo de polímeros de glucosa para la diálisis peritoneal, la alimentación enteral o parenteral y la alimentación de niños recién nacidos y son, más particularmente, polímeros de glucosa para la diálisis peritoneal.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la línea celular es un macrófago, preferentemente una línea celular diferenciada de macrófago, más preferentemente la línea THP-1 diferenciada de macrófago.
4. El método de la reivindicación 3, caracterizado por que la linea celular se utiliza a una densidad entre 0.5 y 1 x 106 células/ml, preferentemente entre 0.7 y 0.8 x 106 células/ml, y aún más preferentemente aproximadamente 0.75 x 106 células/ml.
5. El método de una de las reivindicaciones 3 y 4, caracterizado por que el ensayo de respuesta inflamatoria consiste en colocar las células de la línea celular en presencia de una preparación de polímeros de glucosa que puede contener contaminantes pro-inflamatorios y en medir la producción de citocinas de la fase aguda de la inflamación, la producción de estas citocinas que indican que la preparación contiene contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria.
6. El método de la reivindicación 5, caracterizado por que las citocinas de la fase aguda de inflamación se seleccionan del grupo que consiste en TNF-oc, IL-?ß y quimiocinas como CCL5/RA TES e IL-8/CXCL8, preferentemente la quimiocina es RANTES.
7. El método de la reivindicación 5 o 6, caracterizado por que la citocina es RANTES.
8. El método de la reivindicación 6 o 7, caracterizado por que la producción de citocina se mide después de 20 horas de estimulación para RANTES y/u 8 horas de estimulación para TNF-a.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado por que la molécula seleccionada de entre el dipéptido de muramilo (MDP) , y moléculas relacionadas (L-18-MDP, glicolil-MDP) , péptidos microbianos formilados del tipo f-MLP (tripéptido formil-Metil-Leu-Phe) , y lipopolisacáridos (LPS) , preferentemente MDP S. aureus, f-MLP, o LPS purificado de Escherichia coli se agrega a la preparación del polímero de glucosa
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado por que la molécula elegida de MDP y LPS se agrega a la preparación del polímero de glucosa.
11. El método de la reivindicación 10, caracterizado por que se agrega MDP en la preparación del polímero de glucosa, a una concentración entre 1 y 100 µg/ml, preferentemente aproximadamente 10 µg/ml·.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, caracterizado por que el método tiene una o más de las siguientes características, preferentemente todas las características : - la línea celular se utiliza a una densidad entre 0.5 y 1 x 106 células/ml, preferentemente entre 0.7 y 0.8 x 106 células/ml, y aún más preferentemente aproximadamente 0.75 x 106 células/ml; y/o - la concentración de polímero de glucosa es menor que 50 mg/ml, preferentemente aproximadamente 25 mg/ml; y/o - la producción de citocina se mide después de 20 horas de estimulación para RANTES y/u 8 horas de estimulación para TNF-OÍ; y/o - Se agrega MDP a la preparación de polímero de glucosa a una concentración entre 1 y 100 pg/ml, preferentemente aproximadamente 10 pg/ml .
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, caracterizado por que permite detectar la contaminación del polímero de glucosa con peptidoglicanos (PGN) y/o LPS, preferentemente con PGN de tamaño medio de aproximadamente 120 kDa y/o LPS, aún más particularmente con LPS.
14. El método de la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la línea celular permite detectar la actividad de uno o más receptores de tipo toll (TLR) o receptores de tipo NOD como TLR2, TLR4 y N0D2, y por que, en la línea celular, un gen marcador está sujeto al control directo de la vía de señalización asociada con los TLR o receptores de tipo NOD, preferentemente un gen marcador que codifica una proteína coloreada o fluorescente o que codifica una proteína cuya actividad puede medirse con o sin sustrato, aún más preferentemente que codifica una fosfatasa alcalina secretada .
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado por que la línea celular permite detectar la actividad de un receptor TLR2, en particular la línea hTLR2 de HEK-Blue™.
16. El método de la reivindicación 14, caracterizado por que la línea celular permite detectar la actividad de un receptor N0D2, en particular la linea hN0D2 de HEK-Blue™.
17. El método de la reivindicación 14, caracterizado por que la linea celular permite detectar la actividad de un receptor TLR4, en particular la linea hTLR4 de HEK-Blue™.
18. El método de la reivindicación 14, caracterizado por que la linea celular permite detectar la actividad de los receptores TLR2, TLR4 y N0D2, en particular la linea Raw-Blue™.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizado por que el ensayo de respuesta inflamatoria consiste en colocar las células de la linea celular en presencia de una preparación de polímeros de glucosa que puede contener contaminantes pro-inflamatorios y en medir la actividad del receptor o la señal del gen marcador, la detección de esta actividad o de esta señal que indica que la preparación contiene contaminantes capaces de activar uno o más receptores de inmunidad innatos y de generar una reacción inflamatoria .
20. El método de la reivindicación 16, caracterizado por que lo anterior permite detectar la contaminación del polímero de glucosa con MDP.
21. El método de la reivindicación 15 o 18, caracterizado por que lo anterior permite detectar la contaminación del polímero de glucosa con PGN.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado por que la preparación del polímero de glucosa probada tiene una concentración de polímero entre 5 y 50 mg/ml.
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado por que comprende una etapa de tratamiento de la preparación de polímero de glucosa con mutanolisina antes de la incubación de dicha preparación con las células.
24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado por que comprende también una etapa de filtración de la preparación de polímero de glucosa con un umbral de corte entre 30 kDa y 150 kDa, preferentemente entre 30 y 100 kD o entre 30 y 50 kD, y en particular, aproximadamente, 30 kD y por que el filtrado se incuba con las células, y opcionalmente, por que los resultados en el filtrado se comparan con los resultados en la preparación del polímero de glucosa.
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado por que el método de conformidad con la invención comprende las etapas que consisten en: (a) llevar a cabo al menos un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro que consiste en colocar macrófagos en presencia de una preparación de polímeros de glucosa que puede contener contaminantes pro-inflamatorios y en medir la producción de citocinas de la fase aguda de inflamación, en particular TNF- o RANTES, preferentemente RA TES, la producción de estas citocinas que indica que la preparación contiene contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria, y (b) colocar una linea celular que permite detectar la actividad de un receptor de inmunidad innato o de varios receptores de inmunidad innatos, como TLR2, TLR4 o N0D2, en presencia de la preparación y detectar la actividad del receptor o de la señal del gen marcador asociado con este receptor, la detección de esta actividad o de la señal que indica la presencia, en la preparación, de un contaminante que es un agonista del receptor.
26. El método de la reivindicación 25, caracterizado por que comprende llevar a cabo un ensayo con macrofagos (a) y un ensayo (b) con células que permiten detectar la actividad del receptor TLR2, y opcionalmente un ensayo (b) con células que permiten detectar la actividad del receptor NOD2 y/o ensayo (b) con células que permiten detectar la actividad de los receptores TLR2, TLR4, y NOD2; preferentemente comprende llevar a cabo un ensayo con macrofagos (a) y un ensayo (b) con células que permiten detectar la actividad del receptor TLR2, como hTLR2 de HEK-Blue™, células que permiten detectar la actividad del receptor NOD2, como hNOD2 de HEK-Blue™, y células que permiten detectar la actividad de los receptores TLR2, TLR4 y NOD2, como Raw-Blue™.
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado por que también comprende una etapa que consiste en identificar o cuantificar los contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria.
28. El método de la reivindicación 27, caracterizado por que los contaminantes capaces de generar una reacción inflamatoria se identifican o cuantifican colocando la preparación del polímero de glucosa en presencia de las células de una línea celular como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 y midiendo la actividad del receptor o la señal del gen marcador, la detección de esta actividad o de esta señal que indica la presencia, en la preparación, de un contaminante que es un agonista del receptor .
29. El método de la reivindicación 28, caracterizado por que el método permite la cuantificación de peptidoglicanos (PGN) , en donde la línea celular utilizada permite detectar la actividad de un receptor TLR2, en particular mediante un gen marcador en control directo de la vía de señalización asociada con el receptor de inmunidad TLR2.
30. El método de la reivindicación 29, caracterizado por que el método comprende una etapa de tratamiento de la preparación del polímero de glucosa con mutanolisina, incubación de las preparaciones del polímero de glucosa tratadas con una mutanolisina y/o preparaciones del polímero de glucosa no tratadas y la cuantificación de PGN. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un método para detectar contaminantes de polímeros de glucosa, contaminantes que son capaces de actuar en sinergia entre sí para generar una reacción inflamatoria, caracterizado por que comprende un ensayo de respuesta inflamatoria in vitro que utiliza líneas celulares modificadas.
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