MX2013010345A - Gen de bacillus thuringiensis novedoso con actividad lepidoptera. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona ácidos nucleicos, y variantes y fragmentos de los mismos, obtenidos de cepas de Bacilllus thuringiensis que codifican polipéptidos que tienen actividad pesticida contra pestes de insectos, incluyendo Lepidóptera. Las modalidades particulares de la invención proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas pesticidas, composiciones pesticidas, constructos de DNA, y microorganismos transformados y plantas que comprenden un ácido nucleico de las modalidades. Estas composiciones encuentran uso en métodos para controlar pestes, especialmente pestes de plantas.

Description

GEN DE BACILLUS THURINGIENSIS NOVEDOSO CON ACTIVIDAD LEPIDÓPTERA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a ácidos nucleicos de origen natural y recombinantes obtenidos a partir de nuevos genes de Bacillus thuringiensis que codifican polipéptidos pesticidas caracterizados por la actividad pesticida contra plagas de insectos. Las composiciones y métodos de la invención usan los ácidos nucleicos descritos, y sus polipéptidos pesticidas codificados, para controlar las plagas de las plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plagas de insectos son un factor importante en la pérdida de cultivos agrícolas del mundo. Por ejemplo, la alimentación del gusano cogollero, el daño del gusano trozador, o el daño del taladro europeo del maíz puede ser económicamente devastador para los productores agrícolas. Las pérdidas de cultivos relacionadas con las plagas de insectos por los ataques del taladro europeo del maíz en el campo y el maíz dulce solo ha alcanzado aproximadamente mil millones de dólares al año en daños y gastos de control.

Tradicionalmente, el método primario para afectar las poblaciones de plagas de insectos es la aplicación de los insecticidas químicos de amplio espectro. Sin embargo, los consumidores y los reguladores del gobierno por igual están cada vez más preocupados por los riesgos ambientales asociados a la producción y el uso de plaguicidas químicos sintéticos. Debido a estas preocupaciones, los reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los plaguicidas más peligrosos. Así, existe un interés sustancial en el desarrollo de pesticidas alternativos.

El control biológico de plagas de insectos de importancia agrícola mediante el uso de un agente microbiano, tales como hongos, bacterias u otras especies de insectos ofrece una alternativa ecológica y comercialmente atractiva a los pesticidas químicos sintéticos. En términos generales, el uso de biopesticidas presenta un menor riesgo de contaminación y riesgos ambientales, y los biopesticidas proporcionan una mayor especificidad del objetivo que es característico de los insecticidas químicos tradicionales de amplio espectro. Además, frecuentemente cuesta menos producir los biopesticidas y así mejoran el rendimiento económico de una amplia variedad de cultivos.

Se conoce que ciertas especies de microorganismos del género Bacillus tienen actividad pesticida contra una gran variedad de plagas de insectos, que incluyen Lepidoptera , Díptera, Coleóptera , Hemiptera y otros. El Bacillus thuringiensis (Bt) y el Bacillus papilliae están entre los agentes de biocontrol más exitosos descubiertos hasta la fecha. La patogenicidad de los insectos se atribuye, además, a las cepas de las larvas B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus (Harwook, ed. , (1989) Bacillus (Plenum Press), 306) y B. cereus (solicitud de patente núm. WO 96/10083) . La actividad pesticida parece estar concentrada en inclusiones proteicas cristalinas parasporales, aunque las proteínas pesticidas también se aislaron a partir de la etapa de crecimiento vegetativo de Bacillus . Varios genes que codifican estas proteínas pesticidas se aislaron y caracterizaron (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos núms . 5,366,892 y 5,840,868).

Los insecticidas microbianos, particularmente los obtenidos de cepas de Bacillus, han desempeñado una función importante en la agricultura como alternativas para el control químico de plagas. Recientemente, los investigadores agrícolas desarrollaron plantas de cultivo con una resistencia mejorada a los insectos mediante la modificación genética de las plantas de cultivo para producir proteínas insecticidas de Bacillus . Por ejemplo, las plantas de maíz y algodón se diseñaron mediante ingeniería genética para producir proteínas pesticidas aisladas de cepas de Bt (ver, por ejemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59 (3) : 417-425; Schnepf et al (1998) Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3) : 775-806) . Estos cultivos genéticamente modificados se usan ampliamente en la agricultura estadounidense y proporcionan a los agricultores una alternativa ecológica a los métodos tradicionales de control de insectos. Adicionalmente, patatas modificadas genéticamente para contener toxinas pesticidas Cry se vendieron a los agricultores estadounidenses. Aunque demostraron ser muy exitosas comercialmente, estas plantas de cultivos modificadas genéticamente, resistentes a insectos, proporcionan resistencia a solo una limitada variedad de las plagas de insectos económicamente importantes.

Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad de nuevas toxinas de Bt con una variedad más amplia de la actividad insecticida contra plagas de insectos, por ejemplo, las toxinas que son activas contra una mayor variedad de insectos del orden, Lepidoptera. Adicionalmente, se mantiene la necesidad de bioplaguicidas que tengan actividad contra una variedad de plagas de insectos y de bioplaguicidas que tengan actividad insecticida mejorada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para afectar las plagas de insectos. Más específicamente, las modalidades de la presente invención se refieren a métodos para afectar insectos mediante el uso de secuencias de nucleótidos que codifican péptidos insecticidas para producir microorganismos y plantas transformadas que expresan un polipéptido insecticida de las modalidades. Las plagas incluyen plagas agronómicamente importantes, tales como, por ejemplo: Taladro europeo del maíz (Ostrinia nubilalis) , gusano cogollero (Spodoptera frugiperda), gusano trozador {Agrotis ípsilon) , gusano de la mazorca (Heliothis zea) y barrenador del maíz del suroeste {Diatraea grandiosella) . En algunas modalidades, las secuencias de nucleótidos codifican polipéptidos que son pesticidas para al menos un insecto que pertenece al orden Lepidópteros .

Las modalidades proporcionan un ácido nucleico y fragmentos y variantes de estos que codifican polipéptidos que poseen actividad pesticida contra plagas de insectos (por ejemplo la sec. con núm. de ident.: 1 que codifica la sec. con núm. de ident.: 2). La secuencia de nucleótidos silvestres (por ejemplo, de origen natural) de las modalidades, que se obtienen de Bt, codifica un nuevo péptido insecticida. Las modalidades proporcionan, además, fragmentos y variantes de la secuencia de nucleótidos descrita que codifica polipétidos (por ejemplo, insecticidas) biológicamente activos.

Las modalidades proporcionan, además, polipéptidos pesticidas aislados (por ejemplo, insecticidas) codificados por un ácido nucleico de origen natural, o uno modificado (por ejemplo, mutagenizado o manipulado) de las modalidades. En ejemplos particulares, las proteínas pesticidas de las modalidades incluyen fragmentos de proteínas de longitud completa y polipéptidos que se producen a partir de los ácidos nucleicos mutados diseñados para introducir secuencias particulares de aminoácidos en los polipéptidos de las modalidades. En modalidades particulares, los polipéptidos mejoran la actividad pesticida con respecto a la actividad del polipéptido de origen natural del que se derivan.

Los ácidos nucleicos de las modalidades pueden usarse además para producir plantas transgénicas (por ejemplo, transformadas) monocotiledóneas o dicotiledóneas que se caracterizan por genomas que comprenden al menos un constructo de nucleótidos incorporada de manera estable que comprende una secuencia codificante de las modalidades operativamente unida a un promotor que dirige la expresión del polipéptido pesticida codificado. Por consiguiente, se proporcionan además células vegetales transformadas, tejidos vegetales, plantas y semillas de estos.

En una modalidad particular, puede producirse una planta transformada con el uso de un ácido nucleico que se optimiza para una mayor expresión en una planta huésped. Por ejemplo, uno de los polipéptidos pesticidas de las modalidades puede traducirse de forma inversa para producir un ácido nucleico que comprende codones optimizados para la expresión en un huésped particular, por ejemplo, una planta de cultivo tal como una planta de maíz (Zea mays) . La expresión de una secuencia codificante de tal planta transformada (por ejemplo, dicotiledónea o monocotiledónea) resultará en la producción de un polipéptido pesticida y conferirá una resistencia incrementada a los insectos de la planta. Algunas modalidades proporcionan plantas transgénicas que expresan polipéptidos pesticidas que encuentran uso en los métodos para afectar diferentes plagas de insectos .

Las modalidades incluyen además composiciones pesticidas o insecticidas que contienen los polipéptidos insecticidas de las modalidades, y opcionalmente pueden comprender otros péptidos insecticidas. Las modalidades abarcan la aplicación de tales composiciones para el ambiente de las plagas de insectos con el fin de afectar las plagas de insectos .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención se preparan para composiciones y métodos para afectar plagas de insectos, particularmente plagas de las plantas. Más específicamente, el ácido nucleico aislado de las modalidades, y los fragmentos y variantes de este, comprende secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos pesticidas (por ejemplo, proteínas) . Las proteínas pesticidas descritas son activas biológicamente (por ejemplo, pesticidas) contra un amplio espectro de plagas de insectos tales como, pero sin limitarse a, plagas de insectos del orden Lepidópteros. Las plagas de insectos de interés incluyen, pero no se limitan a: taladro europeo del maíz (Ostrinia nubilalis) y gusano de la mazorca (Heliothis zea) .

Las composiciones de las modalidades comprenden los ácidos nucleicos aislados, y fragmentos y variantes de estos, que codifican polipéptidos pesticidas, casetes de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos de las modalidades, proteínas pesticidas aisladas, y composiciones pesticidas. Algunas modalidades proporcionan polipéptidos pesticidas modificados caracterizados por una actividad insecticida mejorada contra Lepidópteros con respecto a la actividad pesticida de la proteína silvestre correspondiente. Las modalidades proporcionan además plantas y microorganismos transformados con estos ácidos nucleicos nuevos, y métodos que involucran el uso de tales ácidos nucleicos para afectar las plagas de insectos, composiciones pesticidas, organismos transformados, y productos de estos.

Los ácidos nucleicos y las secuencias de nucleótidos de las modalidades pueden usarse para transformar cualquier organismo para producir las proteínas pesticidas codificadas. Se proporcionan métodos que implican el uso de tales organismos transformados para afectar o controlar las plagas de plantas. Los ácidos nucleicos y las secuencias de nucleótidos de las modalidades pueden usarse además para transformar organelos como cloroplastos (McBride et al (1995) Biotechnology 13: 362-365; y Kota et-al (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 1840-1845).

Las modalidades se refieren además a la identificación de los fragmentos y variantes de la secuencia codificante natural que codifica proteínas pesticidas biológicamente activas. Las secuencias de nucleótidos de las modalidades encuentran uso directo en los métodos para afectar plagas, particularmente plagas de insectos tales como las plagas del orden Lepidópteros. En consecuencia, las modalidades proporcionan nuevos enfoques para afectar las plagas de insectos que no dependen del uso de insecticidas químicos sintéticos, tradicionales. Las modalidades involucran el descubrimiento de pesticidas biodegradables de origen natural, y los genes que los codifican.

Las modalidades proporcionan, además, fragmentos y variantes de la secuencia codificante de origen natural que codifican además los polipéptidos (por ejemplo, pesticidas) biológicamente activos. Los ácidos nucleicos de las modalidades abarcan el ácido nucleico o las secuencias de nucleótidos que se optimizaron para la expresión por las células de un organismo particular, por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que se tradujeron de forma reversa (es decir, traducción inversa) mediante el uso de codones preferidos por las plantas basado en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene actividad pesticida mejorada. Las modalidades proporcionan además mutaciones que confieren propiedades mejoradas o alteradas en los polipéptidos de las modalidades. Ver, por ejemplo, las solicitudes copendientes de patente de los Estados Unidos núm. 10/606,320, presentada el 25 de junio de 2003, y 10/746,914, presentada el 24 de diciembre de 2003.

En la siguiente descripción, se usan ampliamente varios términos. Las definiciones siguientes se proporcionan para facilitar la comprensión de las modalidades.

Las unidades, los prefijos y los símbolos pueden indicarse en su forma aceptada en el SI (Sistema Internacional de Unidades) . A menos que se indique de cualquier otra forma, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha, en la orientación 5' a 3' las secuencias de aminoácido se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. En la presente descripción, los aminoácidos se pueden indicar con sus símbolos de tres letras conocidos o con los símbolos de una letra que recomienda la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Además, los nucleótidos se pueden indicar con sus códigos de única letra generalmente aceptados. Los términos definidos anteriormente se definen en mayor detalle con referencia a la descripción como un todo.

Como se usa en la presente descripción, "ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de cualquier otra forma, abarca los análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleico peptídicos) que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales puesto que se hibridizan a ácidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a los nucleótidos de origen natural.

Como se usa en la presente descripción, los términos "que codifica" o "codificado" cuando se usan en el contexto de un ácido nucleico especificado significan que el ácido nucleico comprende la información requerida para la traducción directa de la secuencia de nucleótidos en una proteína especificada. La información por la cual se codifica una proteina se especifica con el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteina puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer de tales secuencias no traducidas intermedias (por ejemplo, como en ADNc) .

Como se usa en la presente descripción, "secuencia de longitud completa" en referencia a un determinado polinucleótido o su proteina codificada significa que tiene toda la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos completa de una secuencia endógena (no sintética), nativa. Un polinucleótido de longitud completa codifica la forma catalíticamente activa de longitud completa de la proteína especificada.

Como se usa en la presente descripción, el término "no codificante" usado en el contexto de la orientación de una secuencia de nucleótidos se refiere a una secuencia híbrida de polinucleótido que está unida operativamente a un promotor en una orientación en la que se transcribe la cadena no codificante. La cadena no codificante es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno de modo que frecuentemente se inhibe la traducción del producto de transcripción endógeno. Así, cuando el término "no codificante" se usa en el contexto de una secuencia de nucleótidos particular, el término se refiere a la cadena complementaria del producto de transcripción de referencia.

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos, en donde uno o más residuos de aminoácidos es o son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural.

Los términos "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido, o péptido (colectivamente "proteína") . El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural y, a menos que se limite de cualquier otra forma, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar que los aminoácidos de origen natural.

Los polipéptidos de las modalidades pueden producirse a partir de un ácido nucleico descrito en la presente descripción, o por el uso de técnicas de biología molecular. Por ejemplo, una proteína de las modalidades puede producirse por la expresión de un ácido nucleico recombinante de las modalidades en una célula huésped apropiada, o alternativamente mediante una combinación de procedimientos ex vivo.

Como se usa en la presente descripción, los términos "aislado" y "purificado" se usan indistintamente para referirse a ácidos nucleicos o polipéptidos o porciones biológicamente activas de estos que son sustancialmente o esencialmente libres de componentes que normalmente acompañan o interaccionan con el ácido nucleico o polipéptido como se encuentra en su ambiente natural. Por lo tanto, un ácido nucleico o polipéptido aislado o purificado se encuentra sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes o se encuentra sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente.

Un ácido nucleico "aislado" está generalmente libre de secuencias (tales como, por ejemplo, secuencias codificadoras de proteínas) que flanquean de manera natural el ácido nucleico (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, los ácidos nucleicos aislados pueden contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de manera natural los ácidos nucleicos en el ADN genómico de la célula de donde se deriva el ácido nucleico.

Como se usa en la presente descripción, el término "aislado" o "purificado" como se usa para referirse a un polipéptido de las modalidades significa que la proteina aislada está sustancialmente libre de material celular e incluye preparaciones de proteina que tiene menos aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, o 5 % (en peso seco) de la proteina contaminante. Cuando la proteina de las modalidades o la porción biológicamente activa de esta se produce de manera recombinante, el medio de cultivo representa menos que aproximadamente 30 %, 20 , 10 %, o 5 % (en peso seco) de los precursores químicos o sustancias químicas que no son las proteínas de interés.

A lo largo de toda la descripción, cuando se usa el término "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "comprender" se entenderá que implica la inclusión de un elemento mencionado, entero o etapa o un grupo de elementos, enteros o etapas, sin excluir cualquier otro elemento, entero o etapa o grupo de elementos, enteros o etapas.

Como se usa en la presente descripción, el término "que afecta plagas de insectos" se refiere a efectuar cambios en la alimentación, crecimiento y/o comportamiento del insecto en cualquier etapa de desarrollo, que incluye, pero no se limita a: matar el insecto; retardar el crecimiento; evitar la capacidad reproductiva; actividad antialimentaria; y similares.

Como se usa en la presente descripción, los términos "actividad pesticida" y "actividad insecticida" se usan como sinónimos para referirse a la actividad de un organismo o de una sustancia (tal como, por ejemplo, una proteina) que puede medirse por, pero sin limitarse a, la mortalidad de la plaga, la pérdida de peso de la plaga, la repelencia de la plaga, y otros cambios de comportamiento y físicos de una plaga después de la alimentación y de la exposición durante un periodo de tiempo adecuado. Asi, un organismo o sustancia que tiene actividad pesticida afecta negativamente al menos un parámetro medible de la aptitud de la plaga. Por ejemplo, las "proteínas pesticidas" son proteínas que muestran actividad pesticida por sí mismas o en conjunto con otras proteínas.

Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad eficaz como pesticida" denota una cantidad de una sustancia u organismo que tiene actividad pesticida cuando está presente en el ambiente de una plaga. Para cada sustancia u organismo, la cantidad eficaz como pesticida se determina empíricamente para cada plaga afectada en un ambiente específico. Asimismo, una "cantidad eficaz como insecticida" puede usarse para referirse a una "cantidad eficaz como pesticida" cuando la plaga es una plaga de insecto.

Como se usa en la presente descripción, el término "modificado recombinantemente" o "modificado" denota la utilización de la tecnología de ADN recombinante para introducir un cambio en la estructura de la proteina (por ejemplo, una modificación por ingeniería genética) basado en la comprensión del mecanismo de acción de la proteína .y una consideración de los aminoácidos que se introducen, eliminan o sustituyen.

Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de nucleótidos mutante" o "mutación" o "secuencia de nucleótidos mutagenizada" denota una secuencia de nucleótidos que se mutageniza o altera para contener uno o más residuos de nucleótidos (por ejemplo, un par de bases) que no está presente en la secuencia silvestre correspondiente. Tal mutagénesis o alteración consiste en una o más adiciones, deleciones o sustituciones o reemplazos de los residuos de ácidos nucleicos. Cuando las mutaciones se hacen mediante adición, eliminación o sustitución de un aminoácido de un sitio proteolítico, tal adición, eliminación, o sustitución puede estar dentro o adyacente al motivo del sitio proteolítico, siempre que el objeto de la mutación se lleve a cabo (es decir, siempre que se cambie la proteólisis en el sitio) .

Una secuencia de nucleótidos mutante puede codificar una toxina insecticida mutante que muestra actividad insecticida mejorada o disminuida, o una secuencia de aminoácidos que confiere actividad insecticida en un polipéptido que la contiene. Como se usa en la presente descripción, el término "mutante" o "mutación" en el contexto de una proteína, un polipéptido o secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia que se mutageniza o altera para contener uno o más residuos de aminoácidos que no están presentes en la secuencia silvestre correspondiente. Dicha mutagénesis o alteración consiste en una o más adiciones, deleciones o sustituciones o reemplazos de residuos de aminoácidos. Un polipéptido mutante muestra una actividad insecticida mejorada o disminuida, o representa una secuencia de aminoácidos que confiere actividad insecticida mejorada en un polipéptido que la contiene. Por tanto, el término "mutante" o "mutación" se refiere tanto a una secuencia de nucleótidos mutante o los aminoácidos codificados o a ambos. Los imitantes pueden usarse solos o en cualquier combinación compatible con otros mutantes de las modalidades o con otros mutantes. Un "polipéptido mutante" puede mostrar a la inversa una disminución en la actividad insecticida. Cuando se añade más de una mutación a un ácido nucleico o proteína particular, las mutaciones pueden añadirse al mismo tiempo o secuencialmente; si es secuencialmente, las mutaciones pueden añadirse en cualquier orden adecuado.

Como se usa en la presente descripción, el término "actividad insecticida mejorada" o "actividad pesticida mejorada" se refiere a un polipéptido insecticida de las modalidades que aumenta la actividad insecticida con relación a la actividad de su proteina silvestre correspondiente, y/o un polipéptido insecticida que es eficaz contra una variedad más amplia de insectos, y/o un polipéptido insecticida que tiene especificidad para un insecto que no es susceptible a la toxicidad de la proteina silvestre. Un hallazgo de actividad pesticida mejorada o aumentada requiere una demostración de un aumento de la actividad pesticida de al menos 10 %, contra el insecto objetivo, o al menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 100 , 150 %, 200 %, o 300 % o mayor aumento de la actividad pesticida con relación a la actividad pesticida del polipéptido insecticida silvestre determinado contra el mismo insecto.

Por ejemplo, se proporciona una actividad pesticida o insecticida mejorada cuando una variedad más amplia o más estrecha de los insectos se afecta por el polipéptido con relación a la variedad de insectos que se ve afectada por una toxina Bt silvestre. Puede ser deseable una variedad más amplia de afectación cuando se desea flexibilidad, mientras que una variedad más estrecha de afectación puede ser deseable cuando, por ejemplo, los insectos beneficiosos podrían afectarse de otro modo por el uso o la presencia de la toxina. Aunque las modalidades no están vinculadas por ningún mecanismo de acción particular, una actividad pesticida mejorada puede proporcionarse además por cambios en una o más características de un polipéptido; por ejemplo, la estabilidad o la longevidad de un polipéptido en un intestino de insecto puede aumentarse en relación a la estabilidad o la longevidad de una proteína silvestre correspondiente.

El término "toxina" como se usa en la presente descripción se refiere a un polipéptido que muestra actividad pesticida o actividad insecticida o actividad pesticida mejorada o actividad insecticida mejorada. La toxina "Bt" o "Bacillus thuringiensis" pretende incluir la clase más amplia de toxinas Cry que se encuentra en varias cepas de Bt, la cual incluye toxinas tales como, por ejemplo, Cryls, Cry2s, o Cry3s .

Los términos "sitio proteolítico" o "sitio de clivaje" se refieren a una secuencia de aminoácidos que confiere sensibilidad a una clase de proteasas o una proteasa particular de modo que un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos se digiere por la clase de proteasas o la proteasa particular. Se dice que un sitio proteolítico es "sensible" a la(s) proteasas (s) que reconoce (n) ese sitio. Se aprecia en la técnica que la eficiencia de la digestión variará, y que una disminución en la eficiencia de la digestión puede conducir a un aumento en la estabilidad o la longevidad del polipéptido en un intestino de insecto. Por lo tanto, un sitio proteolítico puede conferir sensibilidad a más de una proteasa o clase de proteasas, pero la eficiencia de la digestión en ese sitio por diversas proteasas puede variar. Los sitios proteoliticos incluyen, por ejemplo, sitios de tripsina, sitios de quimotripsina, y sitios de elastasa.

La investigación demostró que las proteasas del intestino de insectos de lepidópteros incluyen tripsinas, quimotripsinas y elastasas. Ver, por ejemplo, Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212; y Hedegus et ai. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47. Por ejemplo, se encontraron aproximadamente 18 tripsinas diferentes en el intestino medio de larvas de Helicoverpa armígera (ver Gatehouse et al. (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 929-944) . Los sitios de sustrato proteolitico preferidos de estas proteasas se investigaron. Ver, por ejemplo, Peterson et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 765-774.

Se realizan esfuerzos para entender el mecanismo de acción de las toxinas de Bt y para modificar las toxinas con propiedades mejoradas. Se demostró que las proteasas intestinales de insecto pueden afectar el impacto de las proteínas Cry deBt en el insecto. Algunas proteasas activan las proteínas Cry al procesarlas de una forma de "protoxina" en una forma tóxica, o "toxina." Ver, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42: 1-12; y Carroll et al. (1997) J. Invertebrate Pathology 70: 41-49. Esta activación de la toxina puede incluir la eliminación de los péptidos N- y C-terminal de la proteina y puede incluir además el clivaje interno de la proteina. Otras proteasas pueden degradar las proteínas Cry. Ver Oppert, ibid.

Una comparación de las secuencias de aminoácidos de toxinas Cry de diferentes especificidades revela cinco bloques de secuencias altamente conservadas.

Estructuralmente, las toxinas comprenden tres dominios distintos que son, desde el extremo N- a C-terminal: un grupo de siete hélices alfa implicadas en la formación de poros (denominado "dominio 1") , tres láminas beta antiparalelas implicadas en la unión celular (denominado "dominio 2") , y un sándwich beta (denominado "dominio 3") . La ubicación y propiedades de estos dominios son conocidas por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Li et al. (1991) Nature, 305:815-821 y Morse et al (2001) Structure, 9:409-417. Cuando se hace referencia a un dominio particular, tal como el dominio 1, se entiende que los extremos exactos del dominio con respecto a una secuencia particular no son críticos siempre que la secuencia o porción de este incluya la secuencia que proporciona al menos alguna función atribuida al dominio particular. Así, por- ejemplo, cuando se hace referencia al "dominio 1," se pretende que una secuencia particular incluya un grupo de siete hélices alfa, pero los extremos exactos de la secuencia usada o que se refiere con respecto a ese grupo no son críticos. Un experto en la técnica está familiarizado con la determinación de estos extremos y la evaluación de tales funciones.

En un esfuerzo por caracterizar mejor y mejorar las toxinas de Bt, se estudiaron las cepas de la bacteria Bt. Se descubrió que las preparaciones de cristal preparadas a partir de cultivos de cepas Bt tienen actividad pesticida contra un amplio espectro de plagas de insectos que incluyen taladro europeo del maíz, barrenador del maíz del suroeste, gusano cogollero, gusano trozador y gusano de la mazorca (ver, por ejemplo, Ejemplo experimental 1) . Un esfuerzo se realizó para identificar las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas cristalinas de las cepas seleccionadas, y se aislaron los ácidos nucleicos silvestres (es decir, los de origen natural) de las modalidades de estas cepas bacterianas, se clonaron en un vector de expresión, y se transformaron en E coli. Dependiendo de las características de una preparación dada, se reconoció que la demostración de la actividad pesticida requirió a veces pretratamiento con tripsina para activar las proteínas pesticidas. Por lo tanto, se entiende que algunas proteínas pesticidas requieren digestión con proteasa (por ejemplo, por tripsina, quimotripsina, y similares) para la activación, mientras que otras proteínas son biológicamente activas (por ejemplo, las pesticidas) en ausencia de activación.

Las moléculas podrían alterarse mediante medios descritos, por ejemplo, en las solicitudes de patente de los Estados Unidos núm. 10/606,320, presentada el 25 de junio de 2003, y 10/746, 914, presentada el 24 de diciembre de 2003. Además, las secuencias de ácido nucleico pueden modificarse para codificar polipéptidos que contienen mutaciones adicionales que confieren actividad pesticida mejorada o alterada en relación a la actividad pesticida del polipéptido de origen natural. Las secuencias de nucleótidos de tales ácidos nucleicos modificados comprenden mutaciones que no se encuentran en las secuencias silvestres.

Los polipéptidos mutantes de las modalidades se preparan, generalmente, mediante un proceso que involucra las etapas de: obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la familia Cry; analizar la estructura del polipéptido para identificar sitios "objetivo" particulares para la mutagénesis de la secuencia del gen subyacente basada en una consideración de la función propuesta del dominio objetivo en el modo de acción de la toxina; introducir una o más mutaciones en la secuencia de ácido nucleico para producir un cambio deseado en uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia del polipéptido codificado; y ensayar el polipéptido producido para la actividad pesticida.

Muchas de las toxinas Bt insecticidas están relacionadas en diversos grados por similitudes en sus secuencias de aminoácidos y estructura terciaria y los medios para obtener las estructuras cristalinas de las toxinas de Bt son bien conocidos. La solución de la estructura cristalina de alta resolución ilustrativa de ambos polipéptidos Cry3A y Cry3B está disponible en la literatura. La estructura resuelta del gen Cry3A (Li et al. (1991) Nature 353:815-821) proporciona un indicio sobre la relación entre la estructura¦ la función de la toxina. Una consideración combinada de los análisis estructurales publicados de las toxinas de Bty la función informada asociada con las estructuras particulares, motivos, y similares indica que las regiones especificas de la toxina se correlacionan con funciones particulares y etapas distintas del modo de acción de la proteina. Por ejemplo, muchas toxinas aisladas de Bt se describen generalmente como que comprenden tres dominios: un haz de siete hélices que está implicado en la formación de poros, un dominio de tres hojas que se ha implicado en la unión al receptor, y un motivo beta tipo sándwich (Li et al. (1991) Nature 305: 815-821).

Como se informó en la patente de los Estados Unidos núm. 7, 105,332 y en la solicitud de patente de los Estados Unidos pendiente núm. 10/746,914, presentada el 24 de diciembre de 2003, la toxicidad de las proteínas Cry puede mejorarse al apuntar a la región ubicada entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 de la toxina. Esta teoría se basa en un conjunto de conocimientos acerca de las toxinas insecticidas, que incluye: 1) que las hélices alfa 4 y 5 del dominio 1 de las toxinas Cry3A se informó que se insertan en la bicapa lipidica de las células que recubren el intestino medio de los insectos susceptibles (Gazit et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 12289-12294); 2) el conocimiento de los inventores de la ubicación de los sitios de clivaje de la tripsina y la quimotripsina dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína silvestre; 3) la observación de que la proteína silvestre fue más activa contra ciertos insectos seguida de la activación in vitro por tratamiento con tripsina o quimotripsina; y 4) los informes de que la digestión de toxinas del extremo 3' resultó en una disminución de la toxicidad para los insectos .

Se puede crear una serie de mutaciones y colocarla en una variedad de secuencias de fondo para crear nuevos polipéptidos que tienen actividad pesticida mejorada o alterada. Ver, por ejemplo, las solicitudes de los Estados Unidos núm. 10/606,320, presentada el 25 de junio de 2003, ahora abandonada, y 10/746,914, presentada el 24 de diciembre de 2003. Estos mutantes incluyen, pero sin limitarse a: la adición de al menos un sitio más sensible a la proteasa (por ejemplo, sitio de clivaje de tripsina) en la región localizada entre las hélices 3 y 4 del dominio 1; la sustitución de un sitio original sensible a la proteasa en la secuencia silvestre con un sitio diferente sensible a la proteasa; la adición de múltiples sitios sensibles a la proteasa en un lugar en particular; la adición de residuos de aminoácidos cerca de sitio (s) sensible (s) a la proteasa para alterar el plegamiento del polipéptido y mejorar asi la digestión del polipéptido en el (los) sitio (s) sensible (s) a la proteasa; y la adición de mutaciones para proteger el polipéptido de la digestión degradante que reduce la toxicidad (por ejemplo, al realizar una serie de mutaciones en donde el aminoácido silvestre se sustituye por valina para proteger el polipéptido de la digestión) . Las mutaciones pueden usarse solas o en cualquier combinación para proporcionar los polipéptidos de las modalidades.

De esta manera, las modalidades proporcionan secuencias que comprenden una variedad de mutaciones, tales como, por ejemplo, una mutación que comprende un sitio sensible a la proteasa adicional, o alternativo, ubicado entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codificado. Una mutación que es un sitio sensible a la proteasa adicional o alternativo puede ser sensible a varias clases de proteasas tales como las serina proteasas, que incluyen la tripsina y la quimotrípsina, o enzimas tales como la elastasa. Por lo tanto, una mutación que es un sitio sensible a la proteasa adicional o alternativo se puede diseñar de manera que el sitio se reconozca y/o se clive fácilmente por una categoría de proteasas, tales como proteasas de mamífero o proteasas de insectos. Un sitio sensible a la proteasa puede diseñarse además para ser clivado por una clase particular de enzimas o una enzima en particular conocida que se produce en un organismo, tal como, por ejemplo, una quimotripsina producida por el gusano de la mazorca Heliothis zea (Lenz et al (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212). Las mutaciones pueden conferir además resistencia a la digestión proteolítica, por ejemplo, a la digestión por quimotripsina en el extremo C-terminal del péptido.

La presencia de un sitio adicional y/o alternativo sensible a la proteasa en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado puede mejorar la actividad pesticida y/o la especificidad del polipéptido codificado por los ácidos nucleicos de las modalidades. En consecuencia, las secuencias de nucleótidos de las modalidades pueden modificarse recombinantemente o modificarse para producir polipéptidos que tienen actividad insecticida y/o especificidad mejoradas o alteradas en comparación con la de una toxina no modificada silvestre. Además, las mutaciones descritas en la presente descripción se pueden colocar en o usarse junto con otras secuencias de nucleótidos para proporcionar propiedades mejoradas. Por ejemplo, un sitio sensible a la proteasa que se escinde fácilmente por la quimotripsina de insectos, por ejemplo, una quimotripsina que se encuentra en el gusano soldado o el gusano de la mazorca (Hegedus et al (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47; y Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212), se puede colocar en una secuencia de fondo Cry para proporcionar toxicidad mejorada a esa secuencia. De esta manera, las modalidades proporcionan polipéptidos tóxicos con las propiedades mejoradas.

Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos mutagenizada de Cry puede comprender mutantes adicionales que comprenden codones adicionales que introducen una segunda secuencia de aminoácidos sensible a la tripsina (adicionalmente al sitio de tripsina de origen natural) en el polipéptido codificado. Una adición alternativa mutante de las modalidades comprende codones adicionales diseñados para introducir al menos un sitio adicional sensible a la proteasa diferente en el polipéptido, por ejemplo, un sitio sensible a la quimotripsina localizado inmediatamente 5' o 3' del sitio de tripsina de origen natural. Alternativamente, pueden crearse mutantes de sustitución en los que se destruye al menos un codón del ácido nucleico que codifica el sitio sensible a la proteasa de origen natural y se introducen los codones alternativos en la secuencia de ácido nucleico con el fin de proporcionar un sitio sensible a la proteasa diferente (por ejemplo, sustituto) . Además puede añadirse una sustitución mutante a una secuencia Cry en la que se destruye el sitio de clivaje de la tripsina de origen natural presente en el polipéptido codificado y se introduce en su lugar un sitio de clivaje de quimotripsina o elastasa.

Se reconoce que cualquier secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos que son sitios proteoliticos o supuestos sitios proteoliticos (por ejemplo, las secuencias tales como NGSR, RR, o LKM) pueden usarse y que la identidad exacta de los codones usados para introducir cualquiera de estos sitios de clivaje en una variante de polipéptido puede variar en función del uso, es decir, la expresión en una especie vegetal particular. También se reconoce que cualquiera de las mutaciones descritas puede introducirse en cualquier secuencia de polinucleótidos de las modalidades que comprenden los codones para los residuos de aminoácidos que proporcionan el sitio de clivaje de tripsina nativa que está marcada para la modificación. En consecuencia, las variantes de cualquiera de las toxinas de longitud completa o fragmentos de estas pueden modificarse para contener sitios de clivaje adicionales o alternativos, y estas modalidades pretenden estar abarcadas por el alcance de las modalidades descritas en la presente descripción.

Los expertos en la técnica apreciarán que puede añadirse cualquier mutación útil a las secuencias de las modalidades siempre que los polipéptidos codificados retengan la actividad pesticida. Asi, las secuencias pueden mutarse además de manera que los polipéptidos codificados sean resistentes a la digestión proteolitica por la quimotripsina . Se puede añadir más de un sitio de reconocimiento en un lugar particular en cualquier combinación, y pueden añadirse o eliminarse múltiples sitios de reconocimiento de la toxina. Por lo tanto, las mutaciones adicionales pueden comprender tres, cuatro, o más sitios de reconocimiento. Es preciso reconocer que las mutaciones múltiples pueden diseñarse en cualquier secuencia de polinucleótido adecuada; en consecuencia, las secuencias de longitud completa o fragmentos de los mismos pueden modificarse para contener sitios de clivaje adicionales o alternativos, asi como para ser resistentes a la digestión proteolitica. De esta manera, las modalidades proporcionan toxinas Cry que contienen mutaciones que mejoran la actividad pesticida, asi como composiciones mejoradas y métodos para afectar a las plagas con el uso de otras toxinas Bt.

Las mutaciones pueden proteger al polipéptido de la degradación por proteasas, por ejemplo, mediante la eliminación de supuestos sitios proteoliticos tales como los supuestos sitios de serina proteasa y los sitios de reconocimiento de elastasa de diferentes áreas. Algunos o todos estos supuestos sitios pueden eliminarse o alterarse de modo que la proteólisis en el lugar del sitio original se reduzca. Los cambios en la proteólisis pueden evaluarse por comparación de un polipéptido mutante con las toxinas silvestres o por la comparación de las toxinas mutantes que difieren en su secuencia de aminoácidos. Los supuestos sitios proteoliticos y los sitios proteoliticas incluyen, pero sin limitarse a, las siguientes secuencias: RR, un sitio de clivaje de tripsina; LKM, un sitio de quimotripsina; y NGSR, un sitio de tripsina. Estos sitios pueden alterarse por la adición o supresión de cualquier número y tipo de residuos de aminoácidos, siempre que la actividad pesticida del polipéptido se incremente. Asi, los polipéptidos codificados por las secuencias de nucleótido que comprenden mutaciones comprenderán al menos un cambio de aminoácido o adición con ^relación a la secuencia nativa o de fondo, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, o 280 o más cambios o adiciones de aminoácidos. La actividad pesticida de un polipéptido puede mejorarse además por el truncamiento de la secuencia nativa o de longitud completa, como se conoce en la técnica.

Las composiciones de las modalidades incluyen ácidos nucleicos, y fragmentos y variantes de estos, que codifican polipéptidos pesticidas. Particularmente, las modalidades proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 2, o las secuencias de nucleótidos que codifican dicha secuencia de aminoácidos, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que se expone en la sec. con núm. de ident.: 1, y los fragmentos o variantes de estas.

Son además de interés las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican las proteínas pesticidas de las modalidades. Como se usa en la presente descripción, la frase "secuencias optimizadas de nucleótidos" se refiere a ácidos nucleicos que están optimizados para la expresión en un organismo particular, por ejemplo, una planta. Las secuencias de nucleótidos optimizadas pueden prepararse para cualquier organismo de interés usando métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 10/606,320, presentada el 25 de junio de 2003, ahora abandonada, y la patente de los EE. UU. núm. 7, 462, 760, las cuales describen una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica una proteína pesticida descrita. En este ejemplo, la secuencia de nucleótidos se preparó por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos de la proteína y el cambio de la secuencia de nucleótidos de modo que comprende codones preferentes de maíz mientras que todavía codifican la misma secuencia de aminoácidos. Este procedimiento se describe en más detalle por Murray et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Las secuencias de nucléótidos optimizadas encuentran uso en la expresión aumentada de una proteina pesticida en una planta, por ejemplo, las plantas monocotiledóneas de las Gramíneas de la familia (Poaceae), tales como, por ejemplo, un maíz o planta de maíz.

Las modalidades proporcionan además polipéptidos pesticidas aislados (por ejemplo, insecticidas) codificados por un ácido nucleico de origen natural o modificado de las modalidades. Más específicamente, las modalidades proporcionan polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácido que se expone en la sec. con núm. de ident.: 2, y los polipéptidos codificados por los ácido nucleicos descritos en la presente descripción, por ejemplo, los que se exponen en la sec. con núm. de ident.: 1, y los fragmentos o variantes de estas.

En modalidades ' particulares, las proteínas pesticidas de las modalidades proporcionan polipéptidos insecticidas de longitud completa, fragmentos de polipéptidos insecticidas de longitud completa y variantes de polipéptidos que se producen a partir de ácidos nucleicos mutagenizados diseñados para introducir secuencias particulares de aminoácidos en los polipéptidos de las modalidades. En modalidades particulares, las secuencias de aminoácidos que se introducen en los polipéptidos comprenden una secuencia que proporciona un sitio de cliva e para una enzima tal como una proteasa.

Se conoce en la técnica que la actividad pesticida de las toxinas Bt es típicamente activada por clivaje del péptido en el intestino del insecto por diversas proteasas. Debido a que los péptidos no siempre se pueden clivar con total eficiencia en el intestino del insecto, los fragmentos de una toxina de longitud completa pueden tener actividad pesticida mejorada en comparación con la toxina de longitud completa en sí. Así, algunos de los polipéptidos de las modalidades incluyen fragmentos de un polipéptido insecticida de longitud completa, y algunos de los fragmentos de polipéptidos, variantes y mutaciones tendrán una actividad pesticida mejorada en relación a la .' actividad del polipéptido insecticida- de origen natural del que se derivan, particularmente si el polipéptido insecticida de origen natural no se activa in vitro con una proteasa antes de la selección para la actividad. Por lo tanto, la presente solicitud abarca versiones truncadas o fragmentos -de las secuencias.

Las mutaciones se pueden colocar en cualquier secuencia de fondo, que incluyen dichos polipéptidos truncados, siempre que el polipéptido mantenga la actividad pesticida. Un experto en la técnica puede fácilmente comparar dos o más proteínas con respecto a la actividad pesticida mediante el uso de ensayos conocidos en la técnica o descritos en la presente descripción. Se entiende que los polipéptidos de las modalidades pueden producirse por la expresión de un ácido nucleico descrito en la presente descripción, como por el uso de técnicas de biología molecular estándar.

Se reconoce que las proteínas pesticidas pueden ser oligoméricas y variarán en peso molecular, número de residuos, péptidos componentes, actividad contra plagas particulares, y otras características. Sin embargo, por los métodos que se exponen en la presente descripción, las proteínas activas contra una variedad de plagas se pueden aislar y caracterizar. Las proteínas pesticidas de las modalidades pueden usarse en combinación con otras toxinas Bt u otras proteínas insecticidas para aumentar la variedad de insectos objetivo. Además, el uso de proteínas pesticidas de las modalidades en combinación con otras toxinas Bt u otros principios insecticidas de una naturaleza distinta tiene utilidad particular para la prevención y/o gestión de la resistencia a insectos. Otros agentes insecticidas incluyen inhibidores de proteasa (tanto los de tipo serina como cisteína) , -amilasa, y peroxidasa.

Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos y los polipéptidos codificados de ese modo se abarcan además en las modalidades. Como se usa en la presente descripción el término "fragmento" se refiere a una porción de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido o una porción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de las modalidades. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica nativa o de la correspondiente proteína de longitud completa y por lo tanto poseen actividad pesticida. Por lo tanto, se reconoce que algunos polinucleótidos y secuencias de aminoácidos de las modalidades correctamente pueden referirse como fragmentos y mutantes.

Se entiende que el término "fragmento", como se usa para referirse a las secuencias de ácido nucleico de las modalidades, abarca además las secuencias que son útiles como sondas de hibridación. Esta clase de secuencias de nucleótidos generalmente no codifican fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica. Por lo tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden encontrarse en el intervalo de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifican las proteínas de las modalidades.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos de las modalidades que codifica una porción biológicamente activa de una proteína pesticida de las modalidades codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600 o 650 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido pesticida de las modalidades (por ejemplo, 693 aminoácidos para la sec. con núm. de ident.: 2). De este modo, se entiende que las modalidades abarcan, además, los polipéptidos que son fragmentos de las proteínas pesticidas ilustrativas de las modalidades y tienen longitudes de al menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600 o 650 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido pesticida de las modalidades (por ejemplo, 693 aminoácidos para la sec. con núm. de ident.: 2). Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las modalidades que son útiles como sondas de hibridación o iniciadores de PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una proteína pesticida. Por lo tanto, un fragmento de un ácido nucleico de las modalidades puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína pesticida, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridación o iniciador de PCR con el uso de los métodos descritos en la presente descripción. Una porción biológicamente activa de una proteína pesticida puede prepararse por aislamiento de una porción de una de las secuencias de nucleótidos de las modalidades, que expresan la porción codificada de la proteína pesticida (por ejemplo, por expresión recombinante ín vitro) , y la evaluación de la actividad de la porción codificada de la proteína pesticida.

Los ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las modalidades comprenden por lo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 1950, 2000 o 2050 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos descrita en la presente descripción (por ejemplo, 2079 nucleótidos para la sec. con núm. de ident. : 1). Las modalidades particulares contemplan fragmentos derivados de (por ejemplo, producidos de) un primer ácido nucleico de las modalidades, en donde el fragmento codifica una toxina truncada caracterizada por una actividad pesticida Los polipéptidos truncados codificados por los fragmentos de polinucleótido de las modalidades se caracterizan por una actividad pesticida que es equivalente a, o mejorada, con relación a la actividad del correspondiente polipéptido de longitud completa codificado por el primer ácido nucleico del que se deriva el fragmento. Se contempla que tales fragmentos de ácido nucleico de las modalidades pueden estar truncados en el extremo 3' de la secuencia nativa o de longitud completa correspondiente. Los fragmentos de ácido nucleico también se pueden truncar en ambos extremos 5 ' y 3 ' de la secuencia nativa o de longitud completa correspondiente.

El término "variantes" se usa en la presente descripción para referirse a secuencias sustancialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la redundancia del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos pesticidas de las modalidades. Las variantes alélicas de origen natural, tales como estas se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular reconocidas, tales como, por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se describe en la presente descripción.

Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen además secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, como las generadas, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis sitio dirigida pero que aún codifican una proteína pesticida de las modalidades, tales como una toxina imitante. Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótidos particulares de las modalidades tendrán al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos particular determinado por programas de alineamiento de secuencias descritos en otra sección de la presente descripción con el uso de parámetros predeterminados. Una variante de una secuencia de nucleótidos de las modalidades puede diferir de la secuencia por tan pocos como 1-15 nucleótidos, tan pocos como 1-10, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, incluso 1 nucleótido.

Las variantes de una secuencia de nucleótidos particulares de las modalidades (es decir, una secuencia de nucleótidos ilustrativa) puede evaluarse además por comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos variante y el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia. Asi, por ejemplo, se describen los ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido con un porcentaje de identidad de secuencia dado con el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 2. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos cualesquiera puede calcularse con el uso de los programas de alineamiento de secuencia descritos en otra sección de la presente descripción con el uso de parámetros predeterminados. Si se evalúa cualquier par especifico de polinucleótidos de las modalidades por comparación del porcentaje de identidad de secuencia que comparten ambos polipéptidos a los que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es de al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, generalmente al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 , al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, o al menos aproximadamente 98 %, 99 % o más identidad de secuencia.

Como se usa en la presente descripción, el término "proteína variante" abarca polipéptidos que se derivan de una proteína nativa por: deleción (llamado truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. En consecuencia, el término "proteína variante" abarca fragmentos biológicamente activos de una proteína nativa que comprende un número suficiente de residuos de aminoácidos contiguos para retener la actividad biológica de la proteína nativa, es decir, para tener actividad pesticida. Dicha actividad pesticida puede ser diferente o mejorada con respecto a la proteína nativa o se puede cambiar, siempre que la actividad pesticida se conserve .

Las variantes de proteínas incluidas en las modalidades son biológicamente activas, o sea que aún tienen la actividad biológica deseada de la proteína natural, es decir, la actividad pesticida como se describe en la presente descripción. Tales variantes pueden resultar, por ejemplo, del polimorfismo genético o de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína pesticida nativa de las modalidades tendrán una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más con respecto a la secuencia de aminoácidos para la proteína nativa determinado por los programas de alineamiento de secuencias descritos en otra sección de la presente descripción con el uso de parámetros predeterminados. Una variante biológicamente activa de una proteína de las modalidades puede diferir de esa proteína por tan poco como 1-15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácidos.

Las modalidades abarcan además un microorganismo que se transforma con al menos un ácido nucleico de las modalidades, con un cásete de expresión que comprende el ácido nucleico, o con un vector que comprende el cásete de expresión. En algunas modalidades, el microorganismo es uno que se multiplica en plantas. Una modalidad de la invención se refiere a una proteína pesticida encapsulada que comprende un microorganismo transformado capaz de expresar al menos una proteína pesticida de las modalidades.

Las modalidades proporcionan composiciones pesticidas que comprenden un microorganismo transformado de las modalidades. En tales modalidades, el microorganismo transformado está generalmente presente en la composición pesticida en una cantidad eficaz como pesticida, junto con un vehículo adecuado. Las modalidades abarcan además composiciones pesticidas que comprenden una proteína aislada de las modalidades, sola o en conjunto con un organismo transformado de las modalidades y/o una proteína pesticida encapsulada de las modalidades, en una cantidad eficaz como insecticida, junto con un vehículo adecuado.

Las modalidades proporcionan además un método para aumentar la variedad de insectos objetivo mediante el uso de una proteína pesticida de las modalidades en conjunto con al menos una u otra "segunda" proteína pesticida. Cualquier proteína pesticida conocida en la técnica se puede emplear en los métodos de las modalidades. Tales proteínas pesticidas incluyen, pero sin limitarse a, toxinas de Bt, inhibidores de proteasa, a-amilasas, y peroxidasas.

Las modalidades abarcan además las plantas transgénicas o transformadas que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de las modalidades. En algunas modalidades, la planta se transforma de manera estable con un constructo de nucleótidos que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de las modalidades unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal. Como se usa en la presente descripción, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" se refieren a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra de manera estable dentro del genoma de una planta transgénica o · transformada, de tal manera que · el polinucleótido pase de generación en generación. El polinucleótido heterólogo se puede integrar · en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante .

Se debe comprender que, como se usa en la presente descripción, el término "transgénico" incluye cualquier célula, linea celular, callo, tejido, parte de una planta o planta cuyo genotipo se altera con la presencia de ácidos nucleicos heterólogos, que incluyen los transgénicos alterados inicialmente, asi como los creados por cruces sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico", como se usa en la presente descripción, no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de reproducción de plantas o por eventos naturales, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Como se usa en la presente descripción, el término "planta" incluye plantas completas, órganos de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas, células vegetales, y progenie de la misma. Las partes de las plantas transgénicas se encuentran dentro del ámbito de las modalidades y comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callo, embriones asi como flores, tallos, frutos, hojas y raices que se originan en plantas transgénicas o su progenie transformadas previamente con una molécula de ADN de las modalidades y, por lo tanto, que consisten, en parte, de células transgénicas.

Como se usa en la presente descripción, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales de los cuales pueden regenerarse plantas, callos vegetales, macollas y células vegetales que están intactas en plantes o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, tusas, chalas, pedúnculos, raices, puntas radiculares, anteras, y similares. El tipo de plantas que puede usarse en los métodos de las modalidades es generalmente tan amplio como la clase de las plantas superiores susceptibles a las técnicas de transformación, que incluyen las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las plantas incluyen, por ejemplo, Solanum tuberosum y Zea mays.

Aunque las modalidades no dependen de un mecanismo biológico particular para aumentar la resistencia de una planta a una plaga de plantas, la expresión de las secuencias de nucleótidos de las modalidades en una planta puede resultar en la producción de las proteínas pesticidas de las modalidades y en un aumento de la resistencia de la planta a una plaga de plantas. Las plantas de las modalidades encuentran uso en la agricultura en métodos para afectar plagas de insectos. Ciertas modalidades proporcionan plantas de cultivo transformadas, tal como, por ejemplo, plantas de maíz, que encuentran uso en métodos para afectar plagas de insectos de las plantas tales como, por ejemplo, taladro europeo del maíz.

Una "planta o célula vegetal sujeto" es aquella en la cual ha ocurrido una alteración genética, tal como una transformación, en un gen de interés, o es una planta o célula vegetal que desciende de una planta o célula alterada de esa forma y que comprende la alteración. Un "control", "planta control" o "célula vegetal control" proporciona un punto de referencia para medir los cambios en el fenotipo de la planta o célula vegetal objeto.

Una planta o célula vegetal control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula silvestre, es decir, del mismo genotipo que el material inicial para la alteración genética que resultó en la planta o célula sujeto; (b) una planta o célula vegetal del mismo genotipo que el material inicial, pero que se transformó con un constructo nulo (es decir, con un constructo que no tiene efecto conocido en el rasgo de interés, tal como un constructo que comprende un gen marcador) ; (c) una planta o célula vegetal que es un segregante no transformado entre la progenie de una planta o célula' vegetal objeto; (d) una planta o célula vegetal genéticamente idéntica a la planta o célula vegetal objeto, que no está expuesta a las condiciones o los estímulos que inducirían la expresión del gen de interés; o (e) la planta o célula vegetal objeto en sí, en condiciones en las cuales el gen de interés no está expresado.

Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que los avances en el campo de la biología molecular tales como la mutagénesis específica del sitio y aleatoria, las metodologías de reacción en cadena de la polimerasa, y las técnicas de ingeniería de proteínas proporcionan una amplia colección de herramientas y protocolos adecuados para su uso para modificar o diseñar tanto la secuencia de aminoácidos y secuencias genéticas subyacentes de las proteínas de interés agrícola.

Así, las proteínas de las modalidades pueden alterarse en varias formas que incluyen sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para esas manipulaciones se conocen, generalmente, en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos de las proteínas pesticidas pueden prepararse mediante la introducción de mutaciones en un ácido nucleico sintético (por ejemplo, la molécula de ADN) . Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones del ácido nucleico son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los cambios diseñados pueden introducirse por medio del uso de una técnica de mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótido . Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al, (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de los Estados Unidos núm. 4,873,192; Walker y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) , y las referencias citadas en estos.

Las secuencias de nucleótidos mutagenizadas de las modalidades pueden modificarse para cambiar aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 o más aminoácidos presentes en la secuencia primaria del polipéptido codificado. Alternativamente, aun más cambios de la secuencia nativa pueden introducirse de modo que la proteína codificada puede tener al menos aproximadamente el 1 % o 2 %, o aproximadamente el 3 %, 4 , 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 I, o aún aproximadamente 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, o 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, o 25 %, 30 %, 35 %, o 40 % o más de los codones alterados, o de cualquier otra forma modificados comparado con la proteína silvestre correspondiente. De la misma manera, la proteína codificada puede tener al menos aproximadamente el 1 % o 2 %, o aproximadamente 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, o aún aproximadamente 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, o 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, o 25 %, 30 %, 35 %, o 40 % o más codones adicionales comparado con la proteína silvestre correspondiente. Se debe entender que las secuencias de nucleótidos mutagenizadas de las modalidades pretenden abarcar los péptidos equivalentes biológicamente funcionales, que tienen actividad pesticida, tal como una actividad pesticida mejorada determinado por las propiedades antialimentarias contra las larvas del taladro europeo del maíz. Tales secuencias pueden surgir como consecuencia de la redundancia de codón y la equivalencia funcional que como se sabe ocurre naturalmente dentro de las secuencias de ácidos nucleicos y las proteínas así codificadas.

Un experto en la técnica podría reconocer que las adiciones de aminoácidos y/o sustituciones se basan generalmente en la similitud relativa de los sustxtuyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, carga, tamaño, y similares. Los grupos de sustitución de aminoácidos ilustrativos que tienen varias de las características anteriores en consideración son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina, e isoleucina.

La guía en cuanto a las sustituciones de aminoácidos que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), que se incorpora en la presente descripción como referencia. Se pueden realizar sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares.

Por lo tanto, los genes y secuencias de nucleótidos de las modalidades incluyen ambas secuencias de origen natural y las formas mutantes. Del mismo modo, las proteínas de las modalidades abarcan tanto las proteínas de origen natural y variaciones (por ejemplo, polipéptidos truncados) y formas modificadas (por ejemplo, mutantes) de estas. Tales variantes siempre tendrán la actividad pesticida deseada. Evidentemente, las mutaciones que se harán en la secuencia de nucleótidos que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y generalmente no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Ver la publicación de la solicitud de patente EP núm. 75.444.

No se pretende que las deleciones, inserciones y sustituciones de la secuencias de proteínas que abarca la presente invención produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción con antelación, un experto en la técnica apreciará que el efecto se evaluará por medio de ensayos de evaluación rutinarios, tales como ensayos de alimentación de insecto. Ver, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol. 78: 290-293 y Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485, incorporadas en la presente descripción como referencia.

Las variantes de secuencias de polinucleótidos y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinógeno, tal como la combinación aleatoria de ADN. Con tal procedimiento, es posible manipular una o más secuencias codificadoras para crear una nueva proteína pesticida que tenga las propiedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprende regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia (sustancial y que pueden recombinarse homólogamente in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, las secuencias codificadoras de longitud completa, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés, o cualquier fragmento de una secuencia de nucleótidos de las modalidades se pueden combinar aleatoriamente entre las secuencias de nucleótidos de las modalidades y las porciones correspondientes de otras secuencias de nucleótidos de Cry conocidas para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad mejorada de interés.

Las propiedades de interés incluyen, pero sin limitarse a, actividad pesticida por unidad de proteina pesticida, estabilidad de la proteina, y toxicidad para especies no objetivo, particularmente seres humanos, ganado, y plantas y los microbios que expresan los polipéptidos pesticidas de las modalidades. Las modalidades no están vinculadas por una determinada estrategia de combinación aleatoria, solo que al menos una secuencia de nucleótidos de las modalidades, o parte de esta, está implicada en tal estrategia de combinación aleatoria. La combinación aleatoria puede implicar solo secuencias de nucleótidos en la presente descripción o adicionalmente puede involucrar la combinación aleatoria de otras secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica. Las estrategias para la combinación aleatoria del ADN se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las patentes de los Estados Unidos núms . 5.605.793 y 5.837.458.

Las secuencias de nucleótidos de las modalidades puede usarse además para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras bacterias, y más particularmente de otras cepas de Bacillus . De esta manera, los métodos tales como la PCR, hibridación y similares pueden usarse para identificar tales secuencias en base a su homología de secuencias con las secuencias que se exponen en la presente descripción. Las secuencias que se seleccionan con base en su identidad de secuencia con las secuencias completas que se exponen en la presente descripción o fragmentos de estas son abarcadas por las modalidades. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogos de las secuencias descritas. El término "ortólogos" se refiere a genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en especies diferentes como resultado de la especiación. Los genes que se encuentran en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteínas codificadas comparten identidad sustancial como se define en otra parte en la presente descripción. Frecuentemente, las funciones de los ortólogos se conservan muy bien entre las especies.

En un método de' la PCR, los iniciadores de oligonucleótidos pueden diseñarse para usar en las reacciones de la PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico que se extrae de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar los iniciadores de la PCR y clonación de PCR se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.° ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) , de aquí en adelante "Sambrook". Ver, además, Innis et al., eds . (1990) PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); y Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York) . Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no se limitan a, los métodos que usan iniciadores emparejados, iniciadores anidados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos del gen, iniciadores específicos del vector, iniciadores parcialmente mal emparejados y similares.

En las técnicas de hibridación se usa toda o parte de una secuencia de nucleótidos conocida como una sonda que se hibridiza selectivamente a otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas genómicas o de ADNc) de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y se pueden marcar con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas para hibridación pueden fabricarse al marcar los oligonucleótidos sintéticos en base a las secuencias de las modalidades. Los métodos de preparación de las sondas para hibridación y para la construcción de ADNc y de las bibliotecas genómicas se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook .

Por ejemplo, una secuencia completa descrita en la presente descripción, o una o más porciones de esta, pueden usarse como sondas capaces de hibridarse específicamente a las secuencias correspondientes y ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas para las secuencias de las modalidades y son generalmente al menos aproximadamente 10 o 20 nucleótidos de longitud. Esas sondas pueden usarse para amplificar las secuencias de Cry correspondientes de un organismo seleccionado por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la selección por hibridación de genotecas de ADN cultivadas en placas (ya sea en placas o colonias); ver, por ejemplo, Sambrook) .

La hibridación de tales secuencias se puede realizar en condiciones rigurosas. El término "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" como se usa en la presente descripción se refieren a las condiciones bajo las cuales una sonda hibridará con su secuencia objetivo hasta un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces, 5 veces, o 10 veces más que con la de fondo) . Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar el rigor de las condiciones de hibridación y/o lavado, es posible identificar las secuencias objetivo que son 100 % complementarias a la sonda (sondeo de homólogos) . Alternativamente, pueden ajustarse las condiciones de rigor para permitir cierta falta de coincidencia de las secuencias con el fin de detectar grados más bajos de similitud (sonda heteróloga) . Generalmente, una sonda es menor que aproximadamente 1000 o 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, serán condiciones rigurosas aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de iones Na, típicamente, una concentración de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de iones Na (u otras sales) con un pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para las sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para las sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos) . Además, pueden lograrse las condiciones rigurosas mediante la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. Las condiciones de baja rigurosidad ilustrativas incluyen la hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, NaCl 1 , SDS (dodecil sulfato de sodio) al 1 % a 37 °C, y un lavado en IX a 2X de SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M /citrato trisódico 0.3 ) a 50 a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad moderada ilustrativas incluyen la hibridación en 40 a 45 % de formamida, NaCl 1.0 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en 0.5X a IX SSC de 55 a 60 °C. Las condiciones de rigurosidad alta ilustrativas incluyen la hibridación en 50 % de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado final en 0. IX SSC a 60 a 65 °C por al menos aproximadamente 20 minutos. Opcionalmente, las soluciones tampón de lavado pueden comprender aproximadamente de 0,1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, usualmente, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es, típicamente, la función de los lavados posteriores a la hibridación; los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la Tm (punto de fusión térmico) puede ser aproximado de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) - 0.61 (% form) - 500/L; en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, " form" es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases.

Tm es la temperatura (con la fuerza iónica y el pH definidos a continuación) a la cual se hibridiza el 50 % a una secuencia objetivo complementaria con una sonda perfectamente apareada. Los lavados se realizan típicamente al menos hasta que se alcanza el equilibrio y se consigue un bajo nivel de fondo de la hibridación, tal como por 2 horas, 1 hora, o 30 minutos.

Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, las condiciones de Tm/ la hibridación y/o lavado pueden ajustarse para la hibridación con las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se busca secuencias con =90 % de identidad, la Tm se puede disminuir 10 °C. Generalmente, las condiciones de rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C menos que la Tm para la secuencia específica y su complementaria con una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las' condiciones severamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4 °C menos que la Tm; las condiciones moderadamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10 °C menos que la Tm; las condiciones de baja rigurosidad pueden usar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20 °C menos que la Tm.

Al usar la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, las personas con conocimiento ordinario en la técnica comprenderán que se describen esencialmente variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de apareamiento erróneo deseado resulta en una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) , la concentración de SSC se puede aumentar de manera que pueda usarse una temperatura más alta. Puede encontrarse una guia extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) LaJoratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acíd Probes, Parte I, Capitulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds . (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capitulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York) . Ver además Sambrook. Asi, las secuencias aisladas que codifican una proteína Cry de las modalidades y se hibridan en condiciones rigurosas a las secuencias de Cry descritas en la presente descripción, o a fragmentos de esta, son abarcadas por las modalidades.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad sustancial". (a) Como se usa en la presente descripción, "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como base para la comparación de secuencias . Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o de ADNc de longitud total o la secuencia génica o de ADNc completa. (b) Como se usa en la presente descripción, la "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especifico de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, opcionalmente, puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga. Los expertos en la técnica comprenden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de interrupciones, se introduce en la secuencia de polinucleótidos, típicamente, una penalización de interrupción y se sustrae de la cantidad de coincidencias.

Los métodos de alineamiento de secuencias para la comparación se conocen bien en la técnica. Así, la determinación del porcentaje de identidad de secuencias entre dos secuencias se puede obtener con el uso de un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método para búsqueda de alineamientos locales de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Las implementaciones de programación de estos algoritmos matemáticos se pueden usar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencias. Tales implementaciones incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, ountain View, California); el programa disponible (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el paquete de programa GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, Estados Unidos) . Los alineamientos con el uso de estos programas se pueden realizar con los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL ha sido descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al, (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson y otros (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) más arriba. Con el programa ALIGN se puede usar una tabla de residuos de peso de PAM120, una penalización de longitud de interrupción de 12 y una penalización de interrupción de 4 al comparar secuencias de aminoácidos . Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) más arriba. Las búsquedas BLAST de nucleótidos pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación=100, longitud de la palabra=12, para obtener las secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de las modalidades. Las búsquedas BLAST de proteínas pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación=50, longitud de la palabra=3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de las modalidades. Para obtener alineamientos interrumpidos para propósitos de comparación, se puede usar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) tal como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, se puede usar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecta las relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) más arriba. Cuando se usa BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, es posible usar los parámetros predeterminados de los programas correspondientes (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) . Ver el Centro Nacional para la Información Biotecnológica sitio web en la Red Mundial en ncbi.hlm.nih.gov. El alineamiento también se puede realizar manualmente mediante la inspección.

A menos que se mencione de cualquier otra forma, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente descripción se refieren al valor obtenido con la versión 10 de GAP con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos con el peso de GAP de 50 y el peso de longitud de 3, y la matriz de puntaje nwsgapdna . cmp; el % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos con el peso de GAP de 8 y el peso de longitud de 2, y la matriz de puntaje BLOSUM62 o cualquier programa equivalente de este. El término "programa equivalente", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquier par de secuencias en cuestión, genera un alineamiento que tiene coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácidos y un por ciento idéntico de identidad de secuencias en comparación con el alineamiento correspondiente generado por la versión 10 de GAP.

El GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) más arriba, para buscar el alineamiento de dos secuencias completas que maximizan el número de coincidencias y minimiza el número de interrupciones. GAP toma en consideración todos los alineamientos posibles, asi como las posiciones de interrupción y crea el alineamiento con la mayor cantidad de bases coincidentes y la menor cantidad de interrupciones. Permite proporcionar la penalizacion de creación de interrupciones y una penalizacion de extensión de interrupciones en unidades de bases coincidentes. GAP debe beneficiarse de la cantidad de penalizaciones de creación de interrupciones de coincidencias para cada interrupción que inserta. Si se selecciona una penalización de extensión de interrupciones mayor que cero, GAP debe, adicionalmente, obtener beneficios para cada interrupción insertada de la longitud por la penalización de extensión de interrupción. Los valores predeterminados de penalización de creación de interrupción y los valores de penalización de extensión de interrupción en la versión 10 del GCG Wisconsin Genetics Software Package para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos la penalización predeterminada de creación de interrupción es 50, mientras que la penalización predeterminada de extensión de interrupción es 3. Las penalizaciones de creación y de extensión de interrupción se pueden expresar como un entero seleccionado del grupo de enteros que consiste en 0 a 200. Por lo tanto, por ejemplo, las penalizaciones de creación y de extensión de interrupción pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayores .

GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para alineamientos: calidad, relación, identidad y similitud. La calidad es la medida maximizada para alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. La identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. La similitud porcentual es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que están en las interrupciones se ignoran. Una similitud se determina cuando el valor de la matriz de puntajes para un par de símbolos es mayor o igual que 0.50, el umbral de similitud. La matriz de puntaje que se usa en la versión 10 del paquete de programa GCG isconsin Genetics es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915) . (c) Como se usa en la presente descripción, "identidad de secuencias" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando están alineadas para la máxima correspondencia en una ventana de comparación específica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren, frecuentemente, por sustituciones de aminoácidos conservadoras, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no alteran las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren de sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencias se puede ajustar ascendentemente para lograr la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por esas sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los expertos en la técnica conocen bien los medios para realizar este ajuste. Típicamente, ' esto requiere el puntaje de una sustitución conservativa como una falta de coincidencia parcial y no completa; así, se incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, en donde a un aminoácido idéntico se le da un puntaje de 1 y a una sustitución no conservadora se le da un puntaje de 0, a una sustitución conservadora se le da un puntaje entre 0 y 1. Los puntajes de las sustituciones conservadoras se calculan, por ejemplo, como implementados en el programa PC/GENE ( Intelligenetics , Mountain View, California). (d) Como se usa en la presente descripción, "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere al valor determinado por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Para calcular el porcentaje se determina la cantidad de posiciones en las cuales se produce la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idéntico en las dos secuencias para obtener la cantidad de posiciones coincidentes, se divide la cantidad total de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y el resultado se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias . (e) (i) El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos el 70 %. 80 %, 90 %, o 95 % o más de identidad de secuencia cuando se compara con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineamiento descritos usando parámetros estándar. Una persona con experiencia en la técnica reconocerá que esos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad de proteínas correspondientes codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la redundancia del codón, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos para estos propósitos se refiere generalmente a la identidad de secuencia de al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % o más de identidad de secuencia.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas consiste en que dos moléculas se hibridizan entre si bajo condiciones rigurosas. Generalmente, las condiciones de rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C menos que la Tm para la secuencia especifica, a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones de rigurosidad abarcan temperaturas en el intervalo de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 20 °C menos que la Tm según el grado deseado de rigurosidad, como se califica de otra manera en la presente descripción. Los ácidos nucleicos que no se hibridizan entre si bajo condiciones rigurosas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico mediante el uso de la máxima redundancia de codones permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas consiste en que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente de reacción cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. (e) (ii) El término "identidad sustancial" en el contexto de un péptido, indica que un péptido comprende una secuencia con al menos el 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, en una ventana de comparación especifica. El alineamiento óptimo para estos fines puede llevarse a cabo usando el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) anterior. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son prácticamente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos obtenidos contra el segundo péptidó. Por lo tanto, un péptido es prácticamente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren solamente en una sustitución conservadora. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como se denotó anteriormente excepto que las posiciones de residuos que nos son idénticas pueden diferir por cambios conservativos de aminoácidos.

El uso del término "construcción de nucleótidos" en la presente descripción no pretende limitar las modalidades de construcciones de nucleótidos que comprenden ADN. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que las construcciones de nucleótidos, particularmente polinucleotidos y oligonucleótidos compuestos de ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, pueden emplearse además en los métodos descritos en la presente descripción. Los constructos de nucleótidos, ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las modalidades incluyen, además, todas las formas complementarias de tales constructos, moléculas y secuencias. Además, los constructos de nucleótidos, las, moléculas de nucleótidos y las secuencias de nucleótidos de las modalidades incluyen todos los constructos de nucleótidos, moléculas y secuencias que se pueden usar en los métodos de las modalidades para transformar plantas que incluyen, pero no se limitan a, las compuestas de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y combinaciones de estos. Tales desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de origen natural como análogos sintéticos. Las construcciones de nucleótidos, ácidos nucleicos, y las secuencias de nucleótidos de las modalidades también abarcan todas las formas de construcciones de nucleótidos que incluyen, pero sin limitarse a, formas de cadena sencilla, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de tallo-lazo, y similares .

Una modalidad adicional se refiere a un organismo transformado, tal como un organismo seleccionado del grupo que consiste en células vegetales y de insectos, bacterias, levaduras, baculovirus, protozoos, nematodos y algas. El organismo transformado comprende: una molécula de ADN de las modalidades, un cásete de expresión que comprende dicha molécula de ADN, o un vector que comprende dicho cásete de expresión, que puede incorporarse de manera estable en el genoma del organismo transformado.

Las secuencias de las modalidades se proporcionan en construcciones de ADN para la expresión en el organismo, de interés. La construcción incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' unidas operativamente a una secuencia de las modalidades. El término "operativamente unida" como se usa en la presente descripción se refiere a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, unido (a) operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que están unidas son contiguas y, en donde sea necesario, se unen a dos regiones codificantes de proteina, contiguas y en el mismo marco de lectura. La construcción puede contener, además al menos un gen adicional para cotransformarlo en el organismo. Alternativamente, el o los genes adicionales pueden proporcionarse en múltiples construcciones de ADN.

Tal construcción de ADN se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de la toxina Cry esté bajo regulación transcripcional de las regiones reguladoras. La construcción de ADN puede contener además genes marcadores de selección.

La construcción de ADN incluirá en la dirección 5 ' a 3 ' de la transcripción: una región de iniciación de la transcripción y de la traducción (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de las modalidades, y una región de terminación de la transcripción y de la traducción (es decir, la región de terminación) funcionales en el organismo que actúa como un huésped. La región de iniciación de la transcripción (es decir, el promotor) puede ser nativa, análoga, extraña o heteróloga para el organismo huésped y/o para la secuencia de las modalidades. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o, alternativamente, una secuencia sintética. El término "extraño" como se usa en la presente descripción indica que el promotor no se encuentra en el organismo nativo en el que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de las modalidades, se refiere que el promotor no es nativo o de origen natural para la secuencia unida operativamente de las modalidades. Como se usa en la presente descripción, un gen quimérico comprende una secuencia codificante unida operativamente a una región de iniciación de transcripción heteróloga a la secuencia codificante. Cuando el promotor es una secuencia nativa o natural, la expresión de la secuencia unida operativamente se altera con respecto a la expresión silvestre, lo que resulta en una alteración en el fenotipo.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés operativamente unida, puede ser nativa con el huésped vegetal o puede derivarse de otra fuente (es decir, extraña o heterologa para el promotor, la secuencia de interés, la planta huésped, o cualquier combinación de estos) .

Las regiones terminadoras adecuadas están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones terminadoras de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Ver, además, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, un ácido nucleico puede optimizarse para aumentar la expresión en el organismo hospedero. Por lo tanto, cuando el organismo hospedero es una planta, los ácidos nucleicos sintéticos se pueden sintetizar mediante el uso de codones preferentes de plantas para la expresión mejorada. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión del uso de los codones preferentes del hospedero. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácidos nucleicos de las modalidades pueden expresarse en las especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para responder a las preferencias de codones específicos y las preferencias del contenido de GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas ya que se demostró que esas preferencias difieren (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Así, el codón preferente de maíz para un aminoácido particular puede derivarse de secuencias de genes conocidas de maíz. El uso de codones de maíz para los 28 genes de plantas de maíz se enumera en la Tabla 4 de Murray et al, más arriba. En la técnica hay métodos disponibles para sintetizar los genes específicos de las plantas. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms . 5,380,831, y 5,436,391, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, que se incorporan en la presente descripción como referencia.

Se conoce que las modificaciones adicionales de secuencias intensifican la expresión genética en un hospedero celular. Estas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales falsas de poliadenilación, señales del sitio de empalme exón-intrón, repeticiones similares a transposón y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido GC de la secuencia se puede ajusfar a niveles promedio para un hospedero celular específico, calculado con referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedera. El término "célula hospedera" como se usa en la presente descripción se refiere a una célula que contiene un vector y apoya la replicación y/o expresión del vector de expresión que se le destina. Las células hospederas pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como levaduras, insectos, anfibios o células de mamíferos, o células vegetales monocotiledóneas o dicotiledóneas. Un ejemplo de una célula hospedera monocotiledónea es una célula hospedera de maíz. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras secundarias de ARNm de horquillas.

Los casetes de expresión pueden contener, adicionalmente, secuencias líder 5'. Tales secuencias líder pueden actuar para intensificar la traducción. En la técnica se conocen los líderes de traducción y estos incluyen: líderes de picornavirus , por ejemplo, líder del EMCV (región 5' no codificante de encefalomiocarditis ) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); líderes de potivirus, por ejemplo, líder TEV (Virus Jaspeado del Tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), líder DMV (Virus del Mosaico Enano del Maíz) , la inmunoglobulina humana de cadena pesada de la proteína de unión (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); líder no traducido del ARNm de la proteína de revestimiento del virus del mosaico de la alfalfa (ARN de AMV 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625) ; líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. . (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), págs . 237-256); y líder del virus del moteado clorótico de maíz ¦ (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Ver, además, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968.

En la preparación del cásete de expresión se pueden manipular los diversos fragmentos de ADN con el fin de proporcionar a las secuencias de ADN la orientación adecuada y, según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin se debe usar adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN o puede haber involucradas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción o similares. Con este propósito puede haber mutagénesis in vitro, reparación de iniciadores, restricción, apareamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Es posible usar varios promotores en la práctica de las modalidades Los promotores se pueden seleccionar según el resultado que se desee. Los ácidos nucleicos pueden combinarse con promotores constitutivos, preferentes del tejido, inducibles u otros para la expresión en un organismo hospedero. Los promotores constitutivos adecuados para su uso en una célula vegetal hospedero incluyen, por ejemplo, el núcleo promotor del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. WO 99/43838 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,072,050; el promotor CaMV 35S del núcleo (Odell et al (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen et al (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al, (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al, (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente de Estados Unidos núm. 5,659,026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos mencionados en las patentes de Estados Unidos núms. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; y 6,177,611.

En función del resultado deseado, puede ser beneficioso expresar el gen a partir de un promotor inducible. De particular interés para la regulación de la expresión de las secuencias de nucleótidos de las modalidades en las plantas son los promotores inducibles por heridas. Tales promotores inducibles por lesiones pueden responder a los daños causados por la alimentación de insectos, e incluyen el gen inhibidor de proteinasa de patata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449; Duan et al (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498); wunl y wun2, patente de los Estados Unidos núm. 5, 428, 148; winl y win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200-208); sistemina (McGurl et al (1992) Science 225: 1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76); gen MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2): 141-150); y similares, incorporados en la presente descripción como referencia.

Adicionalmente, los promotores inducibles por patógenos pueden emplearse en los métodos y las construcciones de nucleótidos de las modalidades. Tales promotores inducibles por patógenos incluyen los de las proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR) , que son inducidas después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi et al (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al (1992) Plant Cell 4: 645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. Ver, además, la patente núm. WO 99/43819, incorporada en la presente descripción como referencia.

Son de interés los promotores que se expresan de manera local en el sitio de infección por patógenos o cerca de él. Ver, por ejemplo, arineau et al (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular PlantMicrobe Interactions 2:325-331; Somsisch et al, (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; y Yang (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Ver además, Chen et al (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; patente de los Estados Unidos núm. 5,750,386 (inducible por nematodos); y las referencias citadas en la presente. Es de particular interés el promotor inducible para el gen PRms del maíz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusariu moniliforme (ver, por ejemplo, Cordero et al, (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

Los promotores regulados por sustancias químicas pueden usarse para modular la expresión de un gen en una planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. Según cuál sea el objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible por sustancias químicas, en donde la aplicación de la sustancia química induce la expresión del gen, o un promotor reprimible por sustancias químicas, en donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles por sustancias químicas son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 del maíz, que se activa mediante protectores herbicidas de bencensulfonamida, el promotor GST del maíz, que se activa mediante compuestos electrofílicos hidrofóbicos que se usan como herbicidas previos a la emergencia y el promotor PR-la del tabaco, que se activa mediante ácido salicílico. Otros promotores de interés regulados por sustancias químicas incluyen promotores que responden a los esteroides (ver, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y McNellis et al. (1998) Plant J. 14 (2 ): 247-257 ) y promotores inducibles por tetraciclina y represibles por tetraciclina (ver, por ejemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 y las patentes de los Estados Unidos núm. 5,814,618 y 5,789,156), incorporadas en la presente descripción como referencia.

Los promotores preferentes de tejido pueden usarse para dirigir la expresión mejorada de proteínas pesticidas dentro de un tejido vegetal particular. Los promotores preferentes de tejido incluyen los descritos en Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al, (1997) Plant Cell Physiol. 38 ( 7 ): 792-803 ; Hansen et al (1997) Mol.

Gen Genet. 254 (3) : 337-343; Russell et al, (1997) Transgenic Res. 6 (2) : 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al, (1996) Plant Physiol. 112 (2) : 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2]:513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) : 773-778; Lam (1994) Results Probl . Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23 (6) : 1129-1138; atsuoka et al. (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90(20) :9586- 9590; y Guevara-García et al. (1993) Plant J. 4 (3) : 495-505.

Tales promotores se pueden modificar, si es necesario, para lograr una expresión débil.

Los promotores preferidos de la hoja son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2) :255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) :773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6) .1129-1138; y Matsuoka et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (20) : 9586-9590.

Los promotores preferentes de raíz o específicos de raíz se conocen y pueden seleccionarse de los muchos disponibles en la literatura o aislados de novo de varias especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hire et al, (1992) Plant Mol. Biol. 20 (2 ): 207-218 (gen de glutamina sintetasa de la raíz de soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 ( 10 ): 1051-1061 (elemento de control específico de la raíz en el gen de la GRP 1.8 de la judía verde); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 1 (3) : 33-443 (promotor específico de la raíz del gen de la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) ; y Miao et al. (1991) Plant Cell 3(l):ll-22 (clon de longitud completa que codifica para glutamina sintetasa citosólica (GS) , la cual se expresa en raíces y nodulos de raíces de frijol de soja) . Ver además Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2 (7 ): 633-641, en donde se describen dos promotores específicos de la raíz aislados de genes de hemoglobina de la no leguminosa fijadora de nitrógeno Parasponia andersonii y la no leguminosa relacionada que no fija el nitrógeno Trema tomentosa . Los promotores de estos genes se enlazaron a un gen reportero de ß-glucuronidasa y se introdujeron en la no leguminosa Nicotiana tabacum y la leguminosa Lotus corniculatus, y en ambos ejemplos se preservó la actividad del promotor especifico de raíz. Leach y Aoyagi (1991) describen su análisis de los promotores de los genes inductores de raiz rolC y rolD con alta expresión de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79 (1) : 69-76) . Concluyeron que el potenciador y los determinantes del ADN específicos del tejido se encuentran disociados en esos promotores. Teeri et al. (1989) usaron la fusión de genes a lacZ para demostrar que el gen ADN-T de Agrobacterium que codifica la octopina sintasa está especialmente activo en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2 ' es específico de la raíz en la planta intacta y se estimula por el daño en el tejido de la hoja, una combinación de características especialmente deseables para usar con un gen insecticida o larvicida (ver EMBO J. 8 (2): 343-350). El gen TR1 ' fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa II), presentó características similares. Los promotores adicionales preferentes de raíz incluyen el promotor del gen VfENOD-GRP3 (Kuster et all. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4) :759-772); y el promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25 ( ): 681-691. Ver, además, las patentes de los Estados Unidos núm. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; y 5,023,179.

Los promotores "preferidos de semilla" incluyen tanto los promotores "específicos de semillas" (promotores activos durante el desarrollo de las semillas, tales como los promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) así como los promotores "de germinación de semillas" (promotores activos durante la germinación de las semillas) . Ver Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, incorporada en la presente descripción como referencia. Tales promotores preferidos de semilla incluyen, pero no se limitan a, Ciml (mensaje inducido por citoquinina) ; cZ19Bl (zeína de maíz de 19 kDa) ; y milps (mio-inositol-l-fosfato sintasa) (ver la patente de los Estados Unidos .núm. 6,225,529, incorporada en la presente descripción como referencia) . La gamma-zeína y Glob-1 son promotores específicos de endospermo. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero sin limitarse a, ß-faseolina del frijol, ' napina, ß-conglicinina, lectina de soja, cruciferina y similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero sin limitarse a, zeína de maíz de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Ver además el documento WO 00/12733, donde se describen los promotores preferidos de semillas de los genes endl y end2; incorporadas en la presente descripción como referencia. Un promotor que tiene expresión "preferida" en un tejido particular se expresa en ese tejido en un grado mayor que en al menos otro tejido vegetal. Algunos promotores preferidos de tejidos muestran una expresión casi exclusivamente en el tejido particular.

Donde se desee bajo nivel de expresión, se usarán promotores débiles. Generalmente, el término "promotor débil", como se usa en la presente descripción, se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por bajo nivel de expresión se planifican niveles de aproximadamente 1/1000 transcriptos a aproximadamente 1/100,000 transcriptos a aproximadamente 1/500,000 transcriptos. Alternativamente, se reconoce que el término "promotores débiles" abarca además los promotores que dirigen la expresión en solo unas pocas células y no en otras, para dar un nivel total bajo de expresión. Cuando un promotor dirige la expresión en niveles inaceptablemente altos, porciones de la secuencia promotora se pueden eliminar o modificar para disminuir los niveles de expresión.

Tales promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo, el promotor del núcleo del promotor Rsyn7 (WO 99/43838 y patente de los Estados Unidos núm. 6,072,050), el promotor del núcleo 35S CaMV, y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los descritos en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; y 6,177,611; incorporadas en la presente descripción como referencia.

Generalmente, el cásete de expresión comprende un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores de selección se usan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican la resistencia a antibióticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) y higromicina fosfotransferasa (HPT) , asi como los genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2, 4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) . Los ej emplosadicionales de genes marcadores de selección adecuados incluyen, pero sin limitarse a, genes que codifican resistencia al cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; y Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136) ; bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481; y las solicitudes de los Estados Unidos con núm. de serie 10/004,357; y 10/427,692); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 5:2513-2518). Ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6314-6318; Yao et al (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu et al (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al (1987) Cell 49: 603-612; Figge et al (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle et al, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 5400-5404; Fuerst et al, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2549-2553; Deuschle et al (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Ph.D. Tesis, Universidad de Heidelberg; Reines et al, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow et al, (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3952-3956; Baim et al, (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 5072-5076; Wyborski et al (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al, (1991) Ar¡ ti/nicro¿>. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al, (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al, (1985) Handbook of Experime tal Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); y Gilí et al (1988) Nature 334: 721-724. Tales descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia.

El listado de los genes marcadores de selección descrito más arriba no pretende ser limitante. Cualquier gen marcador de selección puede usarse en las modalidades.

Los métodos de las modalidades incluyen introducir un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducir" se refiere a presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de tal manera que la secuencia gane el acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de las modalidades no dependen de un método particular para introducir un polinucleótido o polipéptido en una planta, solamente que el polinucleótido o. polipéptido gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en las plantas se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

"Transformación estable" se refiere a que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y tiene la capacidad de ser heredada por la progenie de esta. "Transformación transitoria" se refiere a que un polinucleótido se introduce en la planta y no se integra en el genoma de la planta o un polipéptido se introduce en la planta.

Los protocolos de transformación asi como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, objetivo de la transformación es decir, monocotiledónea o dicotiledónea. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células vegetales y posteriormente insertarlas en el genoma de plantas incluyen la microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium- (patentes de Estados Unidos núms . 5,563,055 y 5,981,840), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), y aceleración balística de partículas (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; y 5,932,782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); y transformación de Lecl (patente núm. WO 00/28058). Para la transformación de la patata ver Tu y otros (1998) Plant Molecular Biology 37: 829-838 y Chong et al (2000) Transgeníc Research 9: 71-78. Los procedimientos de transformación adicionales pueden encontrarse en Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (soja) ; Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes de los Estados Unidos núm. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311: 763-764; patente de los Estados Unidos núm. 5,736,369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et' al. (Longman, New York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformación mediada por microfibras) ; D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporación) ; Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (maíz a través de Agrobacterium tumefaciens) ; las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia.

En modalidades especificas, las secuencias de las modalidades pueden proporcionarse a una planta mediante el uso de una variedad de métodos de transformación transitoria. Tales métodos de transformación transitoria incluyen, pero sin limitarse a, la introducción de la proteina de la toxina Cry o variantes y fragmentos de esta directamente en la planta o la introducción del transcripto de la toxina Cry en la planta. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la microinyección o el bombardeo de partículas. Ver, por ejemplo, Crossway et al. (1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura et al (1986) Plant Sci. 44: 53-58; Hepler et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 91: 2176-2180 y Hush et al (1994) The Journal of Cell Science 107: 775-784, las que se incorporan en la presente descripción como referencia. Alternativamente, el polinucleótido de la toxina Cry puede transformarse transitoriamente en la planta con el uso de técnicas conocidas en la técnica. Tales técnicas incluyen el sistema de vectores virales y la precipitación del polinucleótido de manera de imposibilitar la liberación posterior del ADN. Por lo tanto, la transcripción a partir del ADN unido a partículas puede ocurrir, pero la frecuencia con la cual se libera para integrarse en el genoma se reduce en gran manera. Tales métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma núm. P3143) .

En la técnica se conocen métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido en un lugar específico del genoma de la planta. En una modalidad, la inserción del polinucleótido en un sitio genómico deseado se logra con el uso de un sistema de recombinación especifica de sitio. Ver, por ejemplo, las patentes núm. W099/25821, 099/25854, O99/25840, 099/25855 y W099/25853, que se incorporan en la presente descripción como referencia. En resumen, el polinucleótido de las modalidades puede estar contenido en el cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El cásete de transferencia se introduce en una planta que tiene, en su genoma, incorporado de manera estable, un sitio objetivo flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se proporciona una recombinasa adecuada y el cásete de transferencia se integra al sitio objetivo. Asi, el polinucleótido de interés se integra a una posición cromosómica especifica en el genoma de la planta.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas, de conformidad con los modos convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Después, estas plantas pueden cultivarse y polinizar con la misma cepa transformada o con cepas distintas, y' el híbrido resultante tiene una expresión constitutiva o inducible de la característica fenotípica deseada identificada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda en forma estable, y después se cosechan las semillas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada.

Las secuencias de nucleotidos de las modalidades pueden proporcionarse a la planta por contacto de la planta con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos implican incorporar la construcción de nucleotidos de interés dentro de una molécula de ADN o ARN viral. Se conoce que las proteínas recombinantes de las modalidades pueden sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteína viral, que después puede procesarse por proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína pesticida deseada. Se conoce además que tal poliproteína viral, que comprende al menos una porción de dicha secuencia de aminoácido de una proteína pesticida de las modalidades, puede tener la actividad pesticida deseada. Tales poliproteínas virales y las secuencias de nucleotidos que codifican para estas son abarcadas por las modalidades. Los métodos para proporcionar plantas con construcciones de nucleotidos y producir las proteínas codificadas en las plantas, involucran las moléculas de ADN o ARN viral conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms . 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; y 5,316,931; incorporadas en la presente descripción como referencia.

Las modalidades se refieren además al material de propagación vegetal de una planta transformada de las modalidades que incluyen, pero sin limitarse a, semillas, tubérculos, cormos, bulbos, hojas, y recortes de raices y brotes.

Las modalidades pueden usarse para la transformación de cualquier especie de planta, que incluyen, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de las plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea) , particularmente, las especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa {Medicago sativa) , arroz {Oryza sativa), centeno (Sécale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perla ( Pennisetum glaucum) , mijo poroso (Panicu miliaceum) , mijo cola de zorro (Setaria itálica) , mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus) , cártamo [Carthamus tinctorius) , trigo (Triticum aestivum) , soja (Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (Solanum tuberosum) , cacahuate (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote (Ipomoea batatus) , mandioca [Manihot esculenta) , café (Coffeaspp. ) , coco {Cocos nucífera), piña (Ananas comosus) , árboles cítricos (esp. Citrus) , cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis) , plátano (Musaspp. ) , aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica), olivo {Olea europaea) , papaya (Carica papaya), nuez de anacardo (Anacardium occidentale) , macadamia {Macadamia integrifolia) , almendra (Prunus amygdalus) , remolacha azucarera (Beta vulgaris) , caña de azúcar (esp. Saccharum) , avenas, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas.

Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa) , ejotes (Phaseolus vulgaris) , habas [Phaseolus limensis) , chícharos (Lathyrus spp.) y miembros del género Cucumis, tales como pepino (C. sativus) ., cantalupo (C. cantalupensis) y melón almizclero (C. meló) . Las plantas ornamentales incluyen azalea {Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea) , flor de jamaica (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida) , clavel (Dianthus caryophyllus) , nochebuena (Euphorbia pu1che rima) , y crisantemo. Las coniferas que pueden usarse en la práctica de las modalidades incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda) , pino de America Central (Pinus elliotii) , pino ponderosa [Pinus ponderosa), pino contorta (Pinus contorta), y pino de Monterey (Pinus radiata) ; abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii) ; tsuga occidental (Tsuga canadensis) ; abeto Sitka (Picea glauca); secuoya roja (Sequoia sempervirens) ; abetos verdaderos tales como abeto plateado {ñbies amabilis) y abeto balsámico {Abies balsamea) ; y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis) . Las plantas de las modalidades incluyen plantas de cultivo (por ejemplo, maiz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.) r tales como plantas de soja y maiz.

Los céspedes incluyen, pero no se limitan a: pastito de invierno (Poa annua) ; raigrás anual (Lolium multiflorum) ; zacate de Canadá (Poa compressa) ; festuca roja (Festuca rubra); agróstide común (Agrostis tenuís) ; agróstide estolonifera (Agrostis palustris) ; triguillo (Agropyron desertorum) ; triguillo crestado (Agropyron cristatum) ; festuca dura (Festuca longifolia) ; zacate poa (Poa pratensis) ; zacate ovillo (Dactylis glomerata) ; raigrás perenne (Lolium perenne); festuca roja (Festuca rubra); zacate de piedras (Agrostis alba); poa común (Poa trivialis) ; barcea (Festuca ovina); bromo inerme (Bromus inermis) ; festuca alta( estuca arundinacea) ; zacate timoteo (Phleum pratense) ; agróstide canina (Agrostis canina) ; zacate alcalino llorón (Puccinellia distans) ; triguillo corto (Agropyron smithii) ; zacate Bermuda (Cynodon spp.); zacate San Agustín ( Stenotaphrum secunda tum) ; zacate Zoisia (Zoysia spp..); zacate Bahia (Paspalum notatum); alfombrilla (Axonopus affinis) ; zacate cienpiés (Eremochloa ophiuroides) ; zacate kikuyu ( Pennisetum clandesinum) ; zacate paspalum costero (Paspalum vaginatum) ; navajita azul (Bouteloua gracilis) ; zacate búfalo (Buchloe dactyloids) ; banderilla (Bouteloua curfcipendula) .

Las plantas de interés incluyen plantas de cereales que proporcionan semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de cereales, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, mijo, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, frijol de soja, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, lino, castor, olivo etc. Las plantas leguminosas incluyen frijol y chícharos. Los frijoles incluyen guar, algarrobo, fenogreco, frijol de soja, frijoles de jardín, guisante pinto, frijol mungo, judía blanca, habas, lentejas, garbanzo, etc.

En ciertas modalidades las secuencias de ácidos nucleicos de las modalidades pueden agruparse con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de las modalidades pueden agruparse con cualquier otro polinucleótido que codifica polipéptidos que tienen actividad pesticida y/o insecticida, tal como otras proteínas tóxicas de Bt (descritas en las patentes de los Estados Unidos núms . 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; y Geiser et al (1986) Gene 48:109), pentina (descritos en la patente de Estados Unidos núm. 5,981,722) y similares. Las combinaciones generadas pueden incluir, además, múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la modalidades pueden agruparse además con cualquier otro gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos deseados que incluyen pero sin limitarse a rasgos deseables para alimento animal tales como, genes de alto contenido de aceite (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo hordotioninas (patentes de los Estados Unidos núms . 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; y 5,703,049); cebada con alto contenido de lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; y la patente núm. WO 98/20122) y proteínas con alto contenido de metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359; y Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); digestibilidad aumentada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud de los Estados Unidos núm. de serie 10/053,410, presentada el 7 de noviembre de 2001) ; y tioredoxinas (solicitud de los Estados Unidos núm. 10/005,429, presentada el 3 de diciembre de 2001)), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia .

Los polinucleótidos de las modalidades pueden agruparse, además, con los rasgos deseables para la resistencia a herbicidas o a las enfermedades (por ejemplo, genes de desintoxicación de fumonisina (patente de Estados Unidos núm. 5,792,931); genes de resistencia a las enfermedades y avirulencia (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas, tales como mutaciones de S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) ; y resistencia al glifosato (gen EPSPS y gen GAT, como se describe en la solicitud de los Estados Unidos núm. 10/004,357; y 10/427,692); y rasgos deseables para el procesamiento o productos del proceso tales como de alto contenido de aceite (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes de desaturasa de ácidos grasos (patente de los Estados Unidos núm. 5,952,544; la patente núm. WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPase) , almidón sintasas (SS) , enzimas ramificantes de almidón (SBE) y enzimas desramificantes de almidón (SDBE) ) ; y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 5,602,321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Se podrían combinar, además, los polinucleótidos de las modalidades con los polinucleótidos que proporcionan rasgos agronómicos tales como esterilidad de los machos (por ejemplo, ver la patente de los Estados Unidos núm. 5,583,210), resistencia del tallo, tiempo de floración o rasgos de la tecnología de transformación tales como la regulación del ciclo celular o selección de genes (por ejemplo WO 99/61619; O 00/17364; WO 99/25821) cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia .

Estas combinaciones agrupadas pueden crearse por cualquier método que incluye, pero no se limita a, fertilización cruzada de plantas mediante cualquier metodología convencional o TOPCROSS® o por transformación genética. Si los rasgos se agrupan por la transformación genética de las plantas, las secuencias de polinucleótidos de interés pueden combinarse en cualquier momento y orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende una o más características deseadas se puede usar como objetivo para introducir otras características por transformación posterior. Los rasgos pueden introducirse simultáneamente en un protocolo de transformación simultánea con los polinucleótidos de interés proporcionados por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se van a introducir dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación (trans) separados o en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de las secuencias puede estar controlada por el mismo promotor o por promotores diferentes. En ciertos casos puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación de características deseadas en la planta. Además, se reconoce que las secuencias de polinucleótidos pueden agruparse en un lugar genómico deseado por medio de un sistema de recombinación específica del sitio. Ver, por ejemplo, las patentes núm. W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, que se incorporan en la presente descripción como referencia.

Las composiciones de las modalidades encuentran uso en la protección de plantas, semillas y productos vegetales en una variedad de maneras. Por ejemplo, las composiciones pueden usarse en un método que implica la colocación de una cantidad eficaz de la composición pesticida en el ambiente de la plaga mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en pulverización, espolvoreo, emisión o revestimiento de semillas.

Antes de que se venda el material de propagación de la planta (fruto, tubérculo, bulbo, cormo, granos, semillas), pero especialmente las semillas, como un producto comercial, normalmente se trata con un revestimiento protector que comprende herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas , o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea junto con vehículos adicionales, surfactantes o adyuvantes que promueven la aplicación usados normalmente en la técnica de la formulación para proporcionar protección contra el daño causado por plagas bacterianas, fúngicas o animales. Con el fin de tratar la semilla, el revestimiento protector puede aplicarse a las semillas por medio de impregnar los tubérculos o granos con una formulación líquida o revestirlos con una formulación combinada seca o húmeda. Además, en casos especiales, otros métodos de aplicación a las plantas son posibles, por ejemplo, el tratamiento, dirigido a los brotes o los frutos.

La semilla de las plantas de las modalidades que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida de las modalidades puede tratarse con un recubrimiento protector de semillas que comprende un compuesto de tratamiento de semillas, tales como, por ejemplo, captán, carboxina, tiram, metalaxilo, pirimifos metilo, y otros que se usan comúnmente en el tratamiento de semillas. En una modalidad, un recubrimiento protector de semillas que comprende una composición pesticida de las modalidades se usa sola o en combinación con uno de los revestimientos protectores de semillas usados normalmente en el tratamiento de semillas.

Se reconoce que los genes que codifican las proteínas pesticidas pueden usarse para transformar organismos patógenos de insectos. Tales organismos incluyen baculovirus, hongos, protozoos, bacterias y nematodos.

Un gen que codifica una proteina pesticida de las modalidades puede introducirse mediante un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped se aplica al ambiente, o a plantas o animales. El término "introducido", en el contexto de insertar un ácido nucleico en una célula, significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica, en donde el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plástido o mitocondrial) , convertido en un replicón autónomo o expresado transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado) .

Los microorganismos huéspedes que se conoce que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplana) de uno o más cultivos de interés pueden seleccionarse. Estos microorganismos se seleccionan para que sean capaces de competir exitosamente en el ambiente particular con los microorganismos silvestres, proporcionar un mantenimiento estable y la expresión del gen que expresa la proteina pesticida, y, deseablemente, proporcionar una protección mejorada del pesticida de la degradación ambiental y la inactivación.

Tales microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Son de interés particular los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes, hongos, particularmente, levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. Son de particular interés las especies bacterianas de la fitosfera, tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroldes, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli y Azotobacter vinelandii y las especies de levaduras de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. De interés particular son los microorganismos pigmentados.

Un número de maneras están disponibles para introducir un gen que expresa la proteina pesticida en el microorganismo hospedero bajo condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión del gen. Por ejemplo, se puede construir casetes de expresión que incluyan las construcciones de nucleótidos de interés unidos operativamente con las señales reguladoras de transcripción y traducción para la expresión de las construcciones de nucleótidos y una secuencia de nucleótidos homologa con una secuencia en el organismo hospedero, con lo que ocurre la integración y/o un sistema de replicación que sea funcional en el hospedero, con lo que ocurre la integración o el mantenimiento estable.

Las señales reguladoras de transcripción y traducción incluyen, pero no se limitan a, promotores, sitios de comienzo de iniciación transcripcional, operadores, activadores, potenciadores, otros elementos reguladores, sitios de unión ribosómica, un codón de inicio, señales de terminación y similares. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms . 5,039,523 y 4,853,331; EPO núm. 0480762A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Lahoratory Manual, ed. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York), en adelante, "Sambrook' II"; Davis et al., eds . (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press) , Cold Spring Harbor, Nueva York; y las referencias citadas en la presente.

Las células huéspedes adecuadas, en donde las células que contienen proteínas pesticidas se tratarán para. prolongar la actividad de las proteínas pesticidas en la célula cuando la célula tratada se aplica al ambiente de la(s) plaga (s) objetivo, pueden incluir procariotas o eucariotas, normalmente se limitan a las células que no producen sustancias tóxicas para organismos superiores, como los mamíferos. Sin embargo, los organismos que producen sustancias tóxicas para los organismos superiores podrían usarse cuando la toxina es inestable o el nivel de aplicación es suficientemente bajo como para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un hospedero mamífero. Como huéspedes de particular interés son los procariotas y los eucariotas inferiores, tales como hongos. Los procariotas ilustrativos, tanto gram-negativo y gram-positivo, incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, Erwinia, Shigella , Salmonella, y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, tales como Rhizobium; Spirillaceae, tales como fotobacteria, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetojbacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae . Entre las eucariotas se encuentran los hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluyen levadura, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y levadura de Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyees, y similares.

Las características de interés particular para seleccionar una célula hospedera para los propósitos de producción de la proteina pesticida incluyen facilidad de introducir el gen de proteina pesticida en el hospedero, disponibilidad de sistemas de expresión, eficiencia de expresión, estabilidad de la proteina en el hospedero, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para usar como una microcápsula pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación y empaquetado intracelular o formación de cuerpos de inclusión; afinidad de la hoja; carencia de toxicidad en mamíferos; atractivo a las plagas para la ingestión; fácil de matar y fijar sin daño a la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen la facilidad de formulación y manejo, economía, estabilidad durante el almacenamiento y similares.

Los organismos huéspedes de particular interés incluyen levadura, tales como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (tales como S. cerevisiae) , Sporobolomyces spp., organismos filoplanos tales como Pseudomonas spp. (tales como P. aeruginosa, P. fluorescens) , Erwinia spp., y Flavobacterium spp., y otros organismos de este tipo, que incluyen Bt, E. coli, Bacillus subtilis, y similares .

Los genes que codifican las proteínas pesticidas de las modalidades pueden introducirse en los microorganismos que se multiplican en plantas (epífitas) para suministrar proteínas pesticidas a las plagas objetivo potenciales. Las epífitas, por ejemplo, pueden ser bacterias gram positivas o gram negativas.

Las bacterias colonizadoras de raíz, por ejemplo, pueden aislarse de la planta de interés por métodos conocidos en la técnica. Específicamente, una cepa de Bacillus cereus que coloniza las raíces puede aislarse de las raíces de una planta (ver, por ejemplo, Handelsman et al. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718). Los genes que codifican las proteínas pesticidas de las modalidades pueden introducirse en un Bacillus cereus colonizador de raíces por métodos estándar conocidos en la técnica.

Los genes que codifican proteínas pesticidas se pueden introducir, por ejemplo, en Bacillus colonizador de raíces por medio de electrotransformación . Específicamente, los genes que codifican las proteínas pesticidas pueden clonarse en un vector lanzadera, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius et al (1989) FEMS Microbiol. Letts . 60: 211-218. El vector lanzadera pHT3101 que contiene la secuencia codificante para el gen de la proteína pesticida particular puede, por ejemplo, transformarse en el Bacillus colonizador de raices por medio de electroporación (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218).

Los sistemas de expresión pueden diseñarse de modo que las proteínas pesticidas se secreten fuera del citoplasma de las bacterias gram-negativas, tales como E. coli, por ejemplo. Las ventajas de tener proteínas pesticidas segregadas son: (1) evitar los efectos citotóxicos potenciales de la proteína pesticida expresada; y (2) mejorar la eficiencia de la purificación de la proteína pesticida, que incluye, pero no se limita a, una mayor eficiencia en la recuperación y la purificación de la proteína por volumen de caldo de cultivo celular y la disminución del tiempo y/o costos de la recuperación y purificación por unidad de proteínas.

Las proteínas pesticidas pueden prepararse para ser secretadas en E. coli, por ejemplo, mediante la fusión de un péptido señal de E. coli adecuado al extremo amino-terminal de la proteína pesticida. Los péptidos señal reconocidos para E. coli pueden encontrarse en proteínas que ya se conoce que se secretan en E. coli, por ejemplo la proteína OmpA (Ghrayeb et al (1984) EMBO J, 3:2437-2442). OmpA es una proteína principal de la membrana externa de E. coli, y por lo tanto su péptido señal se cree que es efectivo en el proceso de translocación. Además, el péptido señal de OmpA no necesita modificarse antes del procesamiento como puede ser el caso de otros péptidos señal, por ejemplo, el péptido señal de lipoproteinas (Duffaud et al (1987) Meth. Enzymol. 153: 492).

Las proteínas pesticidas de las modalidades pueden fermentarse en un huésped bacteriano y la bacteria resultante puede procesarse y usar como un aerosol microbiano del mismo modo que las cepas de Bt se han usado como aerosoles insecticidas. En el caso de una proteína (s) pesticida(s) que se secret (n) a partir de Bacillus, la señal de secreción se retira o se muta mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica. Tales mutaciones y/o deleciones previenen la secreción de la(s) proteína (s) pesticida(s) en el medio de crecimiento durante el proceso de fermentación. Las proteínas pesticidas se retienen dentro de la célula, y las células se procesan después para producir las proteínas pesticidas encapsuladas . Cualquier microorganismo adecuado se puede usar para este propósito. Las Pseudomonas se usaron para expresar las toxinas Bt como proteínas encapsuladas y las células resultantes se procesaron y rociaron como un insecticida (Gaertner et al. (1993), en: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim) .

Alternativamente, las proteínas pesticidas se producen por medio de introducir un gen heterólogo en un hospedero celular. La expresión de los genes heterólogos resulta, directa o indirectamente, en la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. Estas células se tratan, después, bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de la(s) plaga (s) objetivo. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estas proteínas pesticidas encapsuladas de manera natural pueden formularse, después, de conformidad con técnicas convencionales para aplicar en el ambiente que aloja una plaga objetivo, por ejemplo, el suelo, el agua, y el follaje de las plantas. Ver, ¦ por ejemplo, la patente 'núm. EPA 0192319, y las referencias citadas en ella.

En las modalidades, un microorganismo transformado (que incluye organismos completos, células, esporas (s), proteína (s) pesticida (s) , componente (s) pesticidas (s ) , componente ( s ) que afectan a las plagas, mutantes(s), células vivas o muertas componentes celulares, que incluyen las mezclas de células vivas y muertas y componentes celulares, e incluyen las células rotas y componentes celulares) o una proteína pesticida aislada puede formularse con un vehículo aceptable en una composición (es) pesticida (s) esto es, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo para espolvorear, un gránulo dispersable o gránulo, un polvo humectable, y un concentrado emulsionable, un aerosol o dispersor, un gránulo impregnado, un adyuvante, una pasta aplicable como revestimiento, un coloide, y también encapsulaciones en, por ejemplo, las sustancias poliméricas. Tales composiciones formuladas pueden prepararse por medios convencionales tales como la desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprenden el polipéptido.

Tales composiciones descritas anteriormente pueden obtenerse al agregar un agente tensoactivo, un vehículo inerte, un conservante, un humectante, un estimulante de la alimentación, un agente atrayente, un agente encapsulante, un aglomerante, un emulsionante, un colorante, un protector UV, un regulador, un agente de flujo o fertilizantes, proveedores de micronutrientes u otras preparaciones que promueven el crecimiento vegetal. Uno o más agroquímicos que incluyen, pero sin limitarse a, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, acaricidas, reguladores de crecimiento vegetal, productos auxiliares para la cosecha y fertilizantes pueden combinarse con vehículos, surfactantes o adyuvantes que se usan normalmente en la técnica de formulación u otros componentes para facilitar el manejo del producto y la aplicación para plagas objetivo particulares. Los vehículos adecuados y los adyuvantes pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias usadas, usualmente, en la tecnología de la formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, adhesivos, ligandos o fertilizantes. Los ingredientes activos de las modalidades se aplican normalmente en forma de composiciones y pueden aplicarse en el área de cultivo, planta o semilla a tratar. Por ejemplo, las composiciones de las modalidades se pueden aplicar a granos en la preparación o durante el almacenamiento en un depósito o silo de granos, etc. Las composiciones de las modalidades se pueden aplicar simultáneamente o en sucesión con otros compuestos. Los métodos de aplicar un ingrediente activo de las modalidades o una composición agroquimica de las modalidades que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas bacterianas de las modalidades incluyen, pero sin limitarse a, la aplicación de la aplicación foliar, recubrimiento de semillas, y aplicación al suelo. La cantidad y la relación de las aplicaciones dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

Los agentes surfactantes incluyen, pero no se limitan a, compuestos aniónicos tales como un carboxilato de, por ejemplo, un metal; un carboxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o di-ésteres de ácido fosfórico con alcoholes grasos etoxilatos o sales de tales ésteres; sulfatos de alcoholes grasos, tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sulfato de sodio; sulfatos etoxilados de alcoholes grasos; sulfatos etoxilados de alquilfenol; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; alquil aril sulfonatos tales como alquil-benceno sulfonatos o alquilnaftaleno sulfonatos inferiores, por ejemplo. , butil-naftaleno sulfonato; sales de condensados sulfonados naftaleno-formaldehido; sales de sulfonado de fenol-formaldehido condensadas; sulfonatos más complejos tales como los sulfonatos de amida, por ejemplo, el producto de condensación sulfonado de ácido oleico y N-metil taurina; o los sulfosuccinatos de dialquilo, por ejemplo, el sulfonato sódico de succinato de dioctilo. Los agentes no iónicos incluyen productos de condensación de ásteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas de ácidos grasos o fenoles sustituidos con alquil graso o alquenil con óxido de etileno, ésteres grasos de éteres de alcohol polihidrico, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, productos de condensación de esos ésteres con óxido de etileno, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietileno, copolímeros en bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos, tales como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4, 7-diol, o glicoles acetilénicos etoxilados. Los ejemplos de un agente surfactante catiónico incluyen, por ejemplo, un alifático mono, di o poliamina tal como un acetato, naftenato u oleato; o amina que contiene oxigeno tal como un óxido de amina de polioxietileno alquilamina; una amina enlazada a amida preparada por la condensación de un ácido carboxilico con una di-o poliamina; o una sal de amonio cuaternario.

Los ejemplos de materiales inertes incluyen, pero no se limitan a, minerales inorgánicos, tales como caolín, filosilicatos , carbonatos, sulfatos, fosfatos o materiales botánicos, tales como corcho, mazorca de maíz en polvo, cáscara de cacahuate, cáscara del arroz y cáscara de nuez de Castilla.

Las composiciones de las modalidades pueden estar en una forma adecuada para la aplicación directa o como un concentrado de la composición primaria que requiere dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente antes de la aplicación. La concentración pesticida variará dependiendo de la naturaleza dé la formulación particular, específicamente, si es un concentrado o si se va a usar directamente. La composición contiene 1 a 98 % de un vehículo inerte sólido o líquido, y 0 a 50 % o de 0.1 a 50 % de un surfactante. Estas composiciones se administrarán de acuerdo al índice de la etiqueta para el producto comercial, por ejemplo, aproximadamente 0.00112 g/m2 - 0.560 g/m2 (0.01 Ib -5.0 Ib por acre) cuando están en forma seca y a aproximadamente 0.01 pts - 10 pts por acre cuando están en forma líquida.

En una modalidad adicional, las composiciones, así como los microorganismos transformados y las proteínas pesticidas de las modalidades, pueden tratarse antes de la formulación para prolongar la actividad pesticida cuando se aplica al ambiente de una plaga objetivo siempre que el pretratamiento no sea perjudicial para la actividad pesticida. Tal tratamiento puede ser por medios químicos y/o físicos, siempre y cuando el tratamiento no afecte perjudicialmente a las propiedades de la(s) composición (es) . Ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero no se limitan a los agentes de halogenación; aldehidos tales como formaldehído y glutaraldehído; los antiinfecciosos, tales como el cloruro de zefirán; alcoholes, tales como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tales como el fijador de Bouin y fijador de Helly (ver, por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.).

En otras modalidades, puede ser ventajoso tratar los polipéptidos de la toxina Cry con una proteasa, por ejemplo tripsina, para activar la proteína antes de la aplicación de una composición de proteína pesticida de las modalidades al ambiente de la plaga objetivo. Los métodos para la activación de la protoxina de una proteasa de serina son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454 y Carroll y Ellar (1989) Biochem. J. 261:99-105, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente descripción como referencia. Por ejemplo, un protocolo de activación adecuado incluye, pero sin limitarse a, combinar un polipéptido a ser activado, por ejemplo, un polipéptido nuevo purificado de Cry (por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident.:2), y la tripsina en una relación en peso 1/100 de la proteina/tripsina en NaHCO 320 nM, pH 8 y digerir la muestra a 36 °C durante 3 horas.

Las composiciones (que incluyen los microorganismos y proteínas pesticidas transformados de las modalidades) pueden aplicarse al ambiente de una plaga de insectos, por ejemplo, al rociar, atomizar, espolvorear, dispersar, revestir o verter, al introducirla en o sobre el suelo, al introducirla en el agua de riego, por tratamiento de semillas o aplicación general o espolvoreo al momento que la plaga haya empezado a aparecer o antes de la aparición de plagas como una medida protectora. Por ejemplo, la proteína pesticida y/o microorganismos transformados de las modalidades pueden mezclarse con grano para proteger el grano durante el almacenamiento. Generalmente, es importante controlar bien las plagas en las etapas prematuras del crecimiento vegetal, ya que en ese momento la planta puede sufrir el daño más severo. Las composiciones de las modalidades pueden contener convenientemente otro insecticida si se considera necesario. En una modalidad, la composición se aplica directamente al suelo, al momento de la siembra, en forma granular de una composición de un vehículo y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de las modalidades. Otra modalidad es una forma granular de una composición que comprende un agroquímico, tal como, por ejemplo, un herbicida, un insecticida, un fertilizante, un vehículo inerte, y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de las modalidades.

Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que no todos los compuestos son igualmente eficaces contra todas las plagas. Los compuestos de las modalidades exhiben actividad contra plagas de insectos, que pueden incluir agronómicos económicamente importante, bosques, invernaderos, viveros, plantas ornamentales, de alimentos y fibras, para la salud pública y la sanidad animal, la estructura doméstica y comercial, el hogar y las' plagas de productos almacenados. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de las órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente, Coleóptera y Lepidoptera.

Las larvas del orden Lepidoptera incluyen, pero no se limitan a, orugas militares, gusanos cortadores, orugas medidoras y heliotinas en la familia Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (gusano cogollero) ; 5. exigua Hübner (gusano soldado del betabel) ; S. litura Fabricius (gusano gris del tabaco, oruga del racimo) ; amestra configurata Walker (oruga militar bertha) ; M. brassicae Linnaeus (polilla del repollo) ; Agrotis ípsilon Hufnagel (gusano trozador) ; A. orthogonia Morrison (gusano cortador occidental) ; A. subterránea Fabricius (gusano cortador granulado) / Alabama argillacea Hübner (gusano de la hoja del algodón) ; Trichoplusia ni Hübner (gusano falso medidor del repollo); Pseudoplusia includens Walker (falso medidor de la soja) ; Anticarsia gemmatalis Hübner (oruga de las leguminosas) ; Hypena scabra Fabricius (gusano verde de la soja) ; Heliothis virescens Fabricius (gusano tabacalero) ; Pseudaletia unipuncta Ha orth (oruga militar) ; Athetis mindara Barnes y Mcdunnough (gusano cortador de piel áspera) ; Euxoa messoria Harris (oruga cortadora oscura) ; Earias insulana Boisduval (oruga espinosa del algodonero) ; E. vittella Fabricius (gusano moteado) ; Helicoverpa armígera Hübner (oruga del tomate) ; H. zea Boddie (gusano de la mazorca u oruga bolillera) ; Melanchra picta Harris (oruga cebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (gusano cortador de cítricos); barrenadores, taladrillos, gusanos tejedores, gusanos de las bellotas del pino y gusanos esqueletizadores de la familia Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (taladro europeo del maíz) ; Amyelois transitella Walker (gusano de la naranja de ombligo) ; Anagasta kuehniella Zeller (polilla de la harina) ; Cadra cautella Walker (palomilla de la almendra) ; Chilo suppressalis Walker (barrenador del tallo del arroz); C. partellus, (barrenador del sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (polilla del arroz); Crambus caliginosellus Clemens (oruga tejedora de la raíz del maíz); C. teterrellus Zincken (gusanos tejedores del pasto azul) ; Cnaphalocrocis medinalis Guenée (enrollador de hojas de arroz) ; Desmia funeralis Hübner (gusano enrollador de la uva) ; Diaphania hyalinata Linnaeus (gusano del melón) ; D. nitidalis Stoll (gusano del pepino); Diatraea grandiosella Dyar (barrenador del maíz del suroeste) , D. saccharalis Fabricius (barrenador de la caña de azúcar) ; Eoreuma loftini Dyar (barrenador mexicano del arroz) ; Ephestia elutella Hübner (polilla del tabaco (cacao) ) ; Gallería mellonella Linnaeus (polilla mayor de. la cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (gusano peludo del césped) ; Homoeosoma electellum Hulst (polilla del girasol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (barrenador menor del tallo del maíz) ; Achrola grisella Fabricius (polilla menor de la cera) ; Loxostege sticticalis Linnaeus (gusano de la remolacha) ; Orthaga thyrisalis Walker (polilla tejedora del árbol de té) ; Maruca testulalis Geyer (taladrador de la vaina) ; Plodia interpunctella Hübner (polilla de la fruta seca) ; Scirpcphaga incertulas Walker (barrenador amarillo del tallo); Udea rubigalis Guenée (gusano de las hojas del apio) ; y enrolladores de hojas, gusanos del capullo, gusanos de semilla, y gusanos de frutos en la familia Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (gusano occidental del capullo de cabeza negra) ; A. variaría Fernald (gusano de los capullos de cabeza negra oriental) ; Archips argyrospila Walker (enrollador de hojas de los frutos); A. rosana Linnaeus (enrollador de hojas europeo); y otras especies Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (oruga de la piel de los frutos) ; Cochylis hospes Walsingham (polilla de bandas del girasol); Cydia latiferreana Walsingham (gusano del avellano) ; C. pomonella Linnaeus (gusano del manzano) ; Platynota flavedana Clemens (enrollador abigarrado); P. stultana Walsingham (enrollador de hojas omnívoro) ; Lobesia botrana Denis y Schiffermüller (polilla europea de la vid) ; Spilonota ocellana Denis y Schiffermüller (polilla de las yemas); Endopiza viteana Clemens (hilandero de la vid); Eupoecilia ambiguella Hübner (polilla de las uvas); Bonagota salubricola Meyrick (enrollador de la manzana brasileña); Grapholita molesta Busck (palomilla oriental de la fruta) ; Suleima helianthana Riley (polilla del brote del girasol) ; Argyrotaenia spp. ; Choristoneura spp.

Otras plagas agronómicas del orden Lepidoptera seleccionadas incluyen, pero no se limitan a, Alsophila pometaria Harris (gusano del cancro de invierno) ; Anarsia lineatella Zeller (minadora del melocotonero) ; Anisota senatoria J.E. Smith (gusano del roble con rayas anaranjadas); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (polilla china de seda Tussah) ; Bombyx morí Linnaeus (gusano de la seda) ; Bucculatrix thurberiella Busck (perforador de la hoja del algodón) ; Colias eurythe e Boisduval (gusano de la alfalfa) ; Datana integerrima Grote y Robinson (gusano de la nuez) ; Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (polilla siberiana), Ennomos subsignaria Hübner (oruga del olmo) ; Erannis tiliaria Harris (polilla del invierno) ; Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (polilla de cola marrón) ; Harrisina americana Guérin-Méneville (gusano esqueletizador de la hoja de la uva); Hemileuca oliviae Cockrell (oruga medidora); Hyphantria cunea Drury (gusano tejedor de otoño) ; Keiferia lycopersicella Walsingham (gusano alfiler del tomate) ; Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (oruga geómetra); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (oruga geómetra de la tsuga del Pacifico) ; leucoma salicis Linnaeus (polilla blanca del chopo) ; Lymantria dispar Linnaeus (polilla gitana) ; Manduca quinquemaculata Haworth (polilla de cinco manchas, gusano del cuerno del tomate) ; M. sexta Haworth (gusano del cuerno del tomate, gusano del cuerno del tabaco) ; Operophtera brumata Linnaeus (polilla de invierno); Paleacrita vernata Peck (gusano del cancro de primavera) ; Papilio cresphontes Cramer (cola de golondrina gigante, perro anaranjado); Phryganidia californica Packard (gusano del roble de California) ; Phyllocnistis citrella Stainton (minador de cítricos) ; Phyllonorycter blancardella Fabricius (minador tentiforme) ; Pieris brassicae Linnaeus (mariposa blanca grande de la col); P. rapae Linnaeus (mariposa blanca pequeña de la col); P. napi Linnaeus (mariposa blanca verdinervada) ; Platyptilia carduidactyla Riley (taladro del alcaucil) ; Plutella xylostella Linnaeus (polilla de dorso de diamante) ; Peetijiop.nora gossypiella Saunders (oruga rosada) ; Pontia protodice Boisduval y Leconte (gusano sureño del repollo) ; Sabulodes aegrotata Guenée (falso medidor omnívoro) ; Schizura concinna J.E. Smith (oruga roja jorobada); Sitotroga cerealella Olivier (polilla del grano Angoumois) ; Thaumetopoea pityocampa Schiff rmuller (oruga procesionaria del pino) ; Tineola bisselliella Hummel (polilla de la ropa) ; Tuta absoluta Meyrick (polilla minadora del tomate) ; Yponomeuta padella Linnaeus (polilla de armiño) ; Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. y Orgyia spp.

Son de interés las larvas y adultos del orden Coleóptera que incluyen gorgojos de las familias Anthribidae, Bruchidae, y Curculionidae (que incluyen, pero sin limitarse a: Anthonomus grandis Boheman (gorgojo del algodón) ; Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgojo acuático del arroz) ; Sitophilus granarius Linnaeus (gorgojo del trigo) ; S. oryzae Linnaeus (gorgojo del arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgojo de la hoja del trébol) ; Cylindrocopturus adspersus LeConte (picudo del tallo del girasol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgojo rojo de las semillas de girasol) ; S. sordidus LeConte (gorgojo gris de la semilla del girasol) ; Sphenophorus maidis Chittenden (picudo del maíz) ) ; pulguillas americanas, escarabajo del pepino, gusano de la raiz, escarabajos de las hojas, escarabajos de la papa y minadores de hojas de la familia Chrysomelidae (que incluyen, pero no se limitan a: Leptinotarsa decemlineata Say (escarabajo de patata de Colorado) ; Diabrotica virgifera virgifera LeConte (gusano de la raiz del maíz del oeste) ; D. barberi Smith y Lawrence (gusano de la raiz de maíz del norte) ; D. undecimpunctata howardi Barber (gusano sureño de la raiz del maíz) ; Chaetocnema pulicaria Melsheimer (escarabajuelo del maíz) Phyllotreta cruciferae Goeze (escarabajuelo del maíz) ; Colaspis brunnea Fabricius (colaspis de la uva) ; Oulema melanopus Linnaeus (escarabajo de las hojas de cereales) ; Zygogramma exclamationis Fabricius (escarabajo del girasol) ) ; escarabajos de la familia Coccinellidae (que incluyen, pero no se limitan a: Epilachna vari estís Mulsant (escarabajo mexicano del frijol) ) ; escarabideos y otros escarabajos de la familia Scarabaeidae (que incluyen, pero no se limitan a: Popillia japónica Newman (escarabajo japonés); Cyclocephala borealis Arrow (gusano blanco del norte, larvas blancas) ; C. immaculata Olivier (gusano blanco del sur, larvas blancas); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (escarabidos europeos) ; Phyllophaga crinita Burmeister (larvas blancas) ; Ligyrus gibbosus De Geer (escarabajo de la zanahoria) ) ; escarabajos de las alfombras de la familia Dermestidae; gusanos alambre de la familia Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; escarabajos o escolitidos de la corteza de la familia Scolytidae y escarabajos de la familia Tenebrionidae.

Son de interés los adultos y especies inmaduras del orden Díptera que incluyen minadores de hojas Agromyza parvicornis Loew (minador manchado del maíz) ; mosquitos (que incluyen, pero no se limitan a: Contarinía sorghicola Coquillett (mosquito del sorgo) ; Mayetiola destructor Say (mosca de Hessian) ; Sitodiplosis mosellana Géhin (mosquito del trigo) ; Neolasioptera murtf ldtiana Felt, (mosquito de la semilla del girasol)); las moscas del fruto (Tephritidae) , Oscinella frit Linnaeus (moscas frit) ; larvas (que incluyen, pero sin limitarse a: Delia platura Meigen (gusano de la semilla del maíz) ; D. coarctata Fallen (mosca del bulbo de trigo); y otros Delia spp., Meromyza americana Fitch (larva de barrenador de tallo del maíz) ; Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas domésticas menores) ; Stomoxys calcitrans Linnaeus (mosca estable) ) ; moscas faciales, moscas de los cuernos, moscas de la muerte, Chrysomya spp.; Phormia spp.; y otras plagas de moscas muscoides, mosca del caballo Tabanus spp.; colmoyotes Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; tórsalos Hypoderma spp.; mosca del ciervo Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (mosca de la oveja) ; y otros braquiceros, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; mosca negra Prosimulium spp.; Símulium spp.; jejenes, mosquitos simúlidos, ciáridos y otros Nema tocera .

Se incluyen como insectos de interés los adultos y ninfas de los órdenes Hemiptera y Homoptera tales como, pero sin limitarse a, adelgidos de la familia Adelgidae, chinches de plantas de la familia iridae, chicharras de la familia Cicadidae, insectos saltadores, Empoasca spp.; de la familia Cicadellidae, saltadores de hojase de las familias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae y Delphacidae, saltadores de árboles de la familia Membracidae, psilidos de la familia Psyllidae, moscas blancas de la familia Aleyrodidae, áfidos de la familia Aphididae, filoxeras de la familia Phylloxeridae, chinches harinosas de la familia Pseudococcidae, escamas de las familias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae, Ortheziidae, Phoenicococcidae y Margarodidae, insectos de encaje de la familia Tingidae, chinches apestosas de la familia Pentatomidae, chinches, Blissus spp.; y otras chinches de semillas de la familia Lygaeidae, salivazos de la familia Cercopidae, insectos de la calabaza de la familia Coreidae y chinches rojas y manchadores del algodón de la familia Pyrrhocoridae .

Los miembros importantes para la agronomía del orden Homoptera incluyen, además, pero no se limitan a: Acyrthisiphon pisum Harris (pulgón del chícharo) ; Aphis craccivora Koch (pulgón negro de las leguminosas); A. fabae Scopoli (pulgón negro del frijol); A. gossypii Glover (pulgón del algodón, pulgón del melón) ; A. maidiradicis Forbes (pulgón de la raíz del maíz) ; A. pomi De Geer (pulgón del manzano) ; A. spiraecola Patch (pulgón verde de los cítricos); Aulacorthum solani Kaltenbach (pulgón de la I patata) ; Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (pulgón de la frutilla); Diuraphis noxia Kurdj umov/ ordvilko (pulgón ruso del trigo) ; Dysaphis plantaginea Paaserini (pulgón ceniciento del manzano) ; Eriosoma lanigeru Hausmann (pulgón lanígero del manzano) ; Brevicoryne brassicae Linnaeus (pulgón del repollo) ; Hyalopterus pruni Geoffroy (pulgón harinoso de la ciruela) ; Lipaphis erysimi Kaltenbach (pulgón verde de la col) ; Metopolophium dirrhodum Walker (pulgón de los cereales) ; Macrosiphum euphorbiae Thomas (pulgón de la papa) ; Myzus persicae Sulzer (pulgón del durazno-papa, pulgón verde del duraznero) ; Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgón de la lechuga) ; Pemphigus spp. (pulgones rizófagos y áfidos formadores de agallas) ; Rhopalosiphum maidis Fitch (pulgón del maíz) ; R. padi Linnaeus (pulgón del tallo) ; Schizaphis graminum Rondani (pulgón verde de los cereales); Sipha flava Forbes (pulgón amarillo de la caña de azúcar) ; Sitobion avenae Fabricius (pulgón verde oscuro de la espiga) ; Therioaphis maculata Buckton (pulgón manchado de la alfalfa) ; Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (pulgón negro de los cítricos); y G. cítricida Kirkaldy (pulgón café de los cítricos); Adelges spp. (adelgidos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera del nogal americano) ; Bemisia tabaci Gennadius (mosca blanca del tabaco, mosca blanca de la batata); 23. argentífolii Bellows y Perring (mosca blanca de la hoja plateada); Dialeurodes citri Ashmead (mosca blanca de los cítricos); Trialeurodes abutiloneus (mosca blanca de alas bandeadas) y T. vaporariorum estwood (mosca blanca de los invernaderos) ; Empoasca fabae Harris (saltador de la papa) ; Laodelphax striatellus Fallen (saltador de plantas marrón) ; Macrolestes quadrilineatus Forbes (saltador del áster); Wephotettix cinticeps Uhler (saltador verde); N. nigropictus Stál (saltador del arroz); Nilaparvata lugens Stál (saltador marrón de la planta) ; Peregrinus maidis Ashmead (saltador de la planta del maíz) ; Sogatella furcifera Horvath (saltador de lomo blanco); Sogatodes orizicola Muir (delfácidos del arroz) ; Typhlocyba pomaria McAtee (saltaho as blanca del manzano) ; Erythroneoura spp. (saltahojas de la vid); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica) ; Icerya purchasi Maskell (escama algodonosa) ; Quadraspídiotus perniciosus Comstock (escama de San José) ; Planococcus citri Risso (escama harinosa de cítricos); Pseudococcus spp. (otro complejo de escamas harinosas) ; Cacopsylla pyricola Foerster (psílido del peral); Trioza diospyri Ashmead (psílidos del caqui).

Las especies de interés agronómicamente importantes del orden Hemiptera incluyen, pero no se limitan a: Acrosternum hilare Say (chinche apestosa verde) ; Anasa tristis De Geer (chinche de la calabaza) ; Blissus leucopterus leucopterus Say (chinche) ; Corythuca gossypii Fabricius (chinche de encaje del algodonero) ; Cyrtopeltis modesta Distant (chinche del tomate) ; Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (manchadores de la fibra del algodón) ; Euschistus servus Say (chinche apestosa café) ; E. variolarius Palisot de Beauvois (chinche apestosa manchada) ; Graptostethus spp. (complejo de chinches de semillas) ; Leptoglossus corculus Say (insecto de la semilla del pie de la hoja del pino) ; Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (chinche manchadora) ; L. Hesperus Knight (chinche manchadora del oeste) ; L. pratensis Linnaeus (chinche común del prado) ; L. rugulipennis Poppius (chinche manchadora europea) ; Lygocoris pabulinus Linnaeus (chinche del manzano) ; Nezara viridula Linnaeus (chinche verde) ; Oebalus pugnax Fabricius (chinche apestosa del arroz) ; Oncopeltus fasciatus Dallas (chinche grande del algodón de seda) ; Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga saltona del algodonero) .

Además, las modalidades de la presente invención pueden ser efectivas contra los Hemiptera, tales como: Calocoris norvegicus Gmelin (chinche de la frutilla) ; Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugícollis Fallen (cápsida de la manzana) ; Cyrtopeltis modestus Distant (chinche del tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca succionadora) ; Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga saltona con marcas blancas); Diaphnocoris chlorionis Say (insecto de la planta de acacia) ; Labopidicola allii Knight (insecto de la planta de cebolla) ; Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga saltona del algodonero); Adelphocoris rapidus Say (insecto rápido de las plantas) ; Poecilocapsus lineatus Fabricius (chinche de las cuatro rayas); Nysius ericae Schilling (chinche falso); Nysius raphanus Howard (chinche falso) ; Nezara viridula Linnaeus (chinche verde); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp.; y Cimicidae spp.

Además, se incluyen los adultos y larvas del orden Acari (ácaros) , tales como Acería tosichella Keifer (ácaro del enrulado del trigo) ; Petrobia latens Müller (ácaro marrón del trigo) ; ácaros araña y ácaros rojos de la familia Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro rojo europeo) ; Tetranychus urticae Koch (ácaro araña manchado); ( T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel) ; T. cinnabarinus Boisduval (ácaro araña carmín); T. turkestani Ugarov y Nikolski (araña de la frutilla) ; ácaros planos de la familia Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano de los cítricos) ; los ácaros de las yemas y de la erinosis en la familia Eriophyidae y otros ácaros folífagos y ácaros importantes en la salud humana y animal, es decir, los ácaros del polvo en la familia Epidermoptidae, los ácaros foliculares en la familia Demodicidae, los ácaros del grano en la familia Glycyphagidae, las garrapatas en el orden Ixodidae. Ixodes scapularis Say (garrapata de pata negra) ; I. holocyclus Neumann (garrapata de Australia que produce parálisis) ; Dermacentor variabilis Say (garrapata americana del perro) ; Amblyomma americanum Linnaeus (garrapata estrella solitaria) ; y los ácaros de la sarna y del picor en las familias Psoroptidae, Pyemotidae y Sarcoptidae.

Las plagas de insectos del orden Thysanura son de interés, tales como Lepisma saccharina Linnaeus (pececillo de plata) ; Thermobia domestica Packard (insecto de fuego) .

Otras plagas de artrópodos consideradas incluyen: las arañas en el orden Araneae tales como Loxosceles reclusa Gertsch y Mulaik (araña café o violinista); y la Latrodectus mactans Fabricius (araña viuda negra) ; y centipedos del orden Scutigeromorpha tales como Scutigera coleoptrata Linnaeus (ciempiés doméstico) .

Las plagas de insectos pueden ensayarse para la actividad pesticida de las composiciones de las modalidades en las primeras etapas de desarrollo, por ejemplo, como formas larvas u otras formas inmaduras. Los insectos se pueden criar en la oscuridad total desde aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C y desde aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 % de humedad relativa. Los bioensayos se pueden realizar como se describe en Czapla y Lang (1990) J.

Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485. Los métodos de cría de larvas de insectos y la ejecución de bioensayos son bien conocidos por un experto en la técnica.

Una amplia variedad de técnicas de bioensayo son conocidas por un experto en la técnica. Los procedimientos generales incluyen la adición del compuesto experimental u organismo a la fuente de alimentación en un recipiente cerrado. La actividad pesticida se puede medir mediante, pero sin limitarse a, cambios en la mortalidad, pérdida de peso, atracción, repulsión y otros cambios físicos y de comportamiento después de la alimentación y de la exposición durante un periodo de tiempo adecuado. Los bioensayos descritos en la presente descripción pueden usarse con cualquier plaga de insectos de alimentación en el estado de larva o adulto.

Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración, no a modo de limitación.

Experimentación Ejemplo 1. Bioensayo para probar la actividad pesticida de la toxina B. thuringiensis contra insectos seleccionados Los bioensayos se realizaron para evaluar los efectos de la péptido de la toxina insecticida de Bt, que se exponen en la sec. con núm. de ident.: 2, en las plagas de insectos seleccionados como se muestra en la Tabla 1. Los ensayos de alimentación se llevaron cabo con una dieta artificial, que contenia la proteina insecticida. La proteina insecticida se aplicó tópicamente con una dieta artificial especifica para lepidópteros. La toxina se aplicó a una tasa de 0.3 µg por 25 µ? de muestra por pocilio y se dejó secar. La proteina se encuentra en tampón carbonato 10 mM a un pH de 10. Una larva recién nacida se colocó en cada pocilio para alimentar libremente durante 5 días. Los resultados se expresaron como positivo para las reacciones de larvas tales como retraso en el crecimiento y la mortalidad. Los resultados se expresaron como negativo si las larvas eran similares al control negativo, o sea, una dieta de alimentación a la que solo se aplicó el tampón anterior.

Tabla 1: Resultados del bioensayo de alimentación para la sec. con núm. de ident . : 2 Ejemplo 2: Resultados de plantas que expresan GS135 alimentadas a Colonia ECB resistente a CrylAb Se usaron colonias ECB susceptibles (Sus.) y resistentes (Res.) a CrylAb para evaluar plantas de maíz que expresan GS135 en 8 eventos. Se incluyo, además, un evento de control positivo que expresa una proteína CrylA y dos líneas de maíz de control negativo en el experimento de eficacia como se muestra en la Tabla 6. Para cada tratamiento de evento, se usaron 16 perforaciones de hoja para cada colonia ECB susceptible y resistente a CrylAb. Se puso una perforación de hoja en un pocilio en una bandeja Pittman con 128 pocilios en una cámara de crecimiento. Se usó una capa inferior de agar para regular la humedad en cada pocilio. Se ubicó una larva inmadura en cada pocilio para alimentarla por 4 días y se registró la mortalidad larvaria .

Los resultados mostraron buena actividad de eventos GS135 en larvas ECB susceptibles (todas 100 % de mortalidad) así como buena actividad en ECB resistente a CrylAb (68.8-81.3 % de mortalidad, media = 76.6 %) . En contraste, el evento de maíz que expresa CrylA mostró buena actividad en ECB susceptible (100 % de mortalidad) pero no en ECB resistente a CrylAb (12.5 % de mortalidad).

Tabla 2. Eficacia de plantas de maíz que expresan GS135 en colonia ECB resistente a CrylAb Ejemplo 3. Transformación del maíz por bombardeo de partículas y regeneración de las plantas transqénicas Los embriones inmaduros de maíz de plantas donantes de invernadero se bombardearon con una molécula de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de la toxina (por ejemplo, la sec. con núm. de ident . : 1) operativamente unida a un promotor de ubiquitina y el gen marcador de selección PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25-37), que confieren resistencia al herbicida Bialafos. Alternativamente, el gen marcador de selección se proporciona en una molécula de ADN separada. La transformación se realiza como sigue. Las recetas del medio sigue más abajo.

Preparación del tejido- objetivo Las espigas se descascaran y la superficie se esteriliza en blanqueador CLOROX™ al 30 % más el detergente Micro al 0.5 % durante 20 minutos y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirpan y se colocan con el eje del embrión hacia abajo (escutelo hacia arriba) , 25 embriones por placa, en medio 560Y durante 4 horas y después se alinean dentro de la zona objetivo de 2.5 cm en preparación para el bombardeo.

Preparación de ADN Se prepara un vector plasmidico que comprende una secuencia de nucleótidos de la toxina (por ejemplo, la sec. con núm. de ident . : 1) operativamente unido a un promotor de ubiquitina. Por ejemplo, un vector de transformación adecuado comprende un promotor UBI1 de Zea mays, un 5' UTR de UBI1 y un intrón UBI1, junto con un terminador Pinll. El vector contiene adicionalmente un gen marcador de selección PAT dirigido por un promotor CaMV35S e incluye un terminador CAMV35S. Opcionalmente, el marcador de selección puede residir en un plásmido separado. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de la toxina, asi como un marcador de selección PAT se precipita en gránulos de tungsteno de 1.1 µ?t? (diámetro promedio) usando un procedimiento de precipitación con CaCl2 como sigue: 100 µ? de partículas de tungsteno preparadas en agua 10 µ? (1 pg) de ADN en tampón Tris EDTA (1 g de ADN total) 100 µ? de CaCl2 2.5 M 10 µ? de espermidina 0.1 M Cada reactivo se añade de forma secuencial a una suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene en el agitador multitubos . La mezcla final se sónica brevemente y se deja incubar bajo agitación con vórtice constante por 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugaron brevemente, se eliminó el líquido y se lavaron con 500 mi de etanol al 100 % y se centrifugaron durante 30 segundos. El líquido se eliminó otra vez y a la microesfera final de partículas de tungsteno se agregó 105 µ? de etanol al 100 %. Para el bombardeo con pistola de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se someten brevemente a sonicación, se colocan 10 µ? en el centro de cada macroportador y se dejan secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.

Tratamiento con pistola de partículas Las placas de muestras se bombardean en el nivel núm. 4 en la pistola de partículas núm. HE34-1 o núm. HE34-2. Todas las muestras reciben un solo disparo a 4.481 MPa (650 PSI) con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de las particulas/ADN que se preparó.

Tratamiento posterior Después del bombardeo, los embriones se mantienen en el medio 560Y por 2 días y, después, se transfieren al medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos, y se subcultivaron cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callos resistentes a la selección se transfieren al medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas) , los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio para la germinación y se transfieren a un recinto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días después, las plántulas en desarrollo se transfieren a un medio 272V libre de hormonas en tubos por 7-10 días hasta que las plántulas estén bien establecidas. Después, las plantas se trasladan a los insertos en los recipientes (equivalentes a macetas de 6.35 cm (2.5")) que contienen tierra de abono y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, posteriormente, se cultivan de 1-2 semanas más en el invernadero, después, se trasladan a 600 macetas clásicas (6.06 1 (1.6 galones)) y se cultivan hasta la madurez. Las plantas se monitorean y se clasifican para la expresión de la toxina por ensayos conocidos en la técnica o como se describió anteriormente.

Bombardeo y medios de cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6(SIGMA C-1416) , 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511) , 0.5 mg/1 de tiamina HC1, 120.0 g/1 sacarosa, 1.0 mg/1' 2,4-D, y 2.88 g/1 de L-prolina (hasta un volumen con H20 desionizada seguido del ajuste a un pH de 5.8 con KOH) ; 2.0 g/1 de Gelrite™ (añadido después de llevar a volumen con H20 desionizada); y 8.5 mg/1 de nitrato de plata (que se agregó después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente) . El medio de selección (560R) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511), 0.5 mg/1 de tiamina HC1, 30.0 g/1 sacarosa, y 2.0 mg/1 2,4-D (llevado a volumen con H20 desionizada seguido del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3.0 g/1 de Gelrite™ (añadido después de llevar a volumen con H20 desionizada); y 0.85 mg/1 de nitrato de plata y 3.0 mg/1 de bialafos (ambos se agregaron después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente) .

El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1 de solución madre de vitaminas MS (0.100 g de ácido nicotinico, 0.02 g/1 de HC1 de tiamina, 0.10 g/1 de HC1 de piridoxina y 0.40 g/1 de glicina que se llevó a volumen con H20 desionizada aclarada) ( urashige and Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15: 473), 100 mg/1 de mio-inositol, 0.5 mg/1 de zeatina, 60 g/1 sacarosa, y 1.0 ml/1 de 0.1 mM ácido abscisico (llevado a volumen con H20 desionizada aclarada después de ajustar hasta un pH de 5.6); 3.0 g/1 de Gelrite™ (añadido después de llevar a volumen con H20 desionizada); y 1.0 mg/1 de ácido indolacético y 3.0 mg/1 de Bialafos (añadido después de esterilizar el medio y enfriar a 60 °C) .

El medio libre de hormonas (272V) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1 de solución madre de vitaminas MS (0.100 g/1 de ácido nicotinico, 0.02 g/1 de tiamina HC1, 0.10 g/1 piridoxina HC1, y 0.40 g/1 de glicina llevado a volumen con H20)' desionizada aclarada, 0.1 g/1 de mio-inositol, y 40.0 g/1 de sacarosa (llevado a volumen con H20 desionizada aclarada después de ajustar el pH a 5.6); y 6 g/1 de Bacto-agar (añadido después de llevar a volumen con H20 desionizada aclarada), esterilizada y enfriada a 60 °C.

Ejemplo 4. Transformación del maíz mediada por Agrobacterium y regeneración de las plantas transgénicas Para la transformación de maíz mediada por Agrojbacteriuin-con una secuencia de nucleótidos de una toxina (por ejemplo, la sec. con núm. de ident . : 1), se usa el método de Zhao (patente de los EE. UU. núm. 5, 981, 840 y patente de los Estados Unidos núm. 5,981,840, y la publicación de patente del PCT núm. 098/32326; cuyos contenidos se incorporan en la presente descripción como referencia) . En resumen, los embriones inmaduros se aislaron del maíz y los embriones se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium en condiciones en las cuales las bacterias son capaces de transferir la secuencia de nucleótidos de la toxina (sec. con núm. de ident. : 1) a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa los embriones inmaduros se sumergieron en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones se cocultivaron por un periodo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cocultivo) . Después de la etapa de infección, los embriones inmaduros se cultivaron en un medio sólido. Después de este periodo de cocultivo, se contempla una etapa de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incubaron en presencia de al menos un antibiótico conocido por inhibir el crecimiento deAgrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes de la planta (etapa 3: etapa de reposo) . Los embriones inmaduros se cultivaron en un medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para eliminar el Agrobacterium y proporcionar una fase de reposo para las células infectadas. Después, los embriones inoculados se cultivaron en medio que contenia un agente selectivo y se recuperaron los callos transformados en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Los embriones inmaduros se cultivaron en un medio sólido con un agente selectivo que produjo el crecimiento selectivo de las células transformadas. Después, el callo se regeneró en plantas (etapa 5: la etapa de regeneración) y los callos cultivados en medio selectivo se cultivaron en medio sólido para regenerar las plantas.

Ejemplo 5. Transformación y regeneración de frijol de soja (glicina max) Las lineas de frijol de soja transgénico se generaron mediante el método de bombardeo de partículas (Klein et al., Nature (Londres) 327:70-73 (1987); patente de los Estados Unidos núm. 4,945,050) mediante el uso de un instrumento BIORAD Biolistic PDS1000/He y un plásmido o fragmento de ADN. Los siguientes medios y soluciones madre se usaron para la transformación y regeneración de plantas de frijol de soja: Soluciones madre: Solución madre 100X de sulfato: 37.0 g de MgS04.7H20, 1.69 g de MnS04.H20, 0.86 g de ZnS04.7H20, 0.0025 g de CuS04.5H20 Solución madre 100X de haluro: 30.0 g de CaCl2.2H20, 0.083 g de KI, 0.0025 g de CoCl2.6H20 Solución madre 100X de P, B, Mo: 18.5 g de KH2P04, 0.62 g de H3B03, 0.025 g de Na2Mo0 .2H20 Solución madre 100X de Fe EDTA: 3.724 g de Na2EDTA, 2.784 g de FeS04.7H20 Solución madre 2, 4-D: 10 mg/ml de solución estándar 1000X de vitamina B5: 100.0 g de myo-inositol , 1.0 g de ácido nicotinico, 1.0 g de piridoxina HC1, 10 g de clorhidrato de tiamina .

Media (por litro) : Medio sólido de SB199: 1 paquete de sales MS (Gibco/ BRL - núm. de catálogo 11117-066) , 1 mi de solución madre 1000X de vitaminas B5, 30 g de sacarosa, 4 mi de 2, 4-D (40 mg/1 de concentración final), pH 7.0, 2 g de Gelrite Medio sólido de SB1 : 1 paquete de sales MS (Gibco/ BRL - cat. núm. de catálogo 11117-066) , 1 mi de solución madre 1000X de vitaminas B5, 31.5 g de glucosa, 2 mi de 2, 4-D (20 mg/1 de concentración final), pH 5.7, 8 g de TC agar SB196: 10 mi de cada una de las soluciones madre 1-4 anteriores, 1 mi de solución de madre de vitamina B5, 0.463 g de (NH4)2 S04, 2.83 g de KN03, 1 mi de solución madre 2,4 D, 1 g de asparagina, 10 g de sacarosa, pH 5.7 SB71-4: sales B5 de Gamborg, 20 g de sacarosa, 5 g de TC agar , pH 5.7.

SB103: 1 pk. mezcla de sales Murashige y Skoog, 1 mi de solución madre de vitamina B5, 750 mg de hexahidrato MgC12, 60 g de maltosa, 2 g de gelrite, pH 5.7.

SB166: SB103 suplementado con 5 g por litro de carbón activado .

Iniciación de los cultivos embriogénicos en suspensión de frijol de soja: Las vainas con semillas inmaduras disponibles de plantas de frijol de soja 45-55 días después de haberlas plantado se recolectaron, se extrajeron de sus cáscaras y se colocaron en una caja magenta esterilizada. Las semillas de frijol de soja se esterilizaron por medio de agitación durante 15 minutos en una solución de Clorox al 5 % con 1 gota de jabón ivory (es decir, 95 mi de agua destilada esterilizada en autoclave con 5 mi de Clorox y 1 gota de jabón, bien mezclados) . Las semillas se enjuagaron mediante el uso de 2 botellas de 1 litro de agua destilada estéril y las que miden menos de 3 mm se colocan en portaobjetos de microscopio individuales. El extremo pequeño de la semilla se cortó y los cotiledones se extrajeron de la testa por presión. Los cotiledones se transfirieron a placas que contienen medio SB199 (25-30 cotiledones por placa) durante 2 semanas, después, se transfirieron a SB1 durante 2 a 4 semanas. Las placas se envolvieron con cinta de fibra. Después de este tiempo, los embriones secundarios se cortaron y se colocaron en medio liquido SB196 durante 7 días.

Condiciones de cultivo: Los cultivos embriogénicos en suspensión del frijol de soja (cv. Jack) se conservaron en 50 mi de medio liquido SB196 en un agitador giratorio, 100 - 150 rpm, 26 °C en un fotoperiodo de 16:8 h día/noche a una intensidad de luz de 80-100 E/m2/s. Los cultivos se subcultivaron cada 7-14 dias por inoculación hasta una cantidad equivalente al tamaño de ½ moneda de 10 centavos de tejido (los grupos se amontonan juntos) en 50 mi de liquido fresco SB196.

Preparación de ADN para bombardeo: En procedimientos particulares de bombardeo de partículas, es posible usar 1) ADN plasmidico completo; o 2) fragmentos de ADN purificados que solo contienen el o los casetes de expresión de ADN de interés. Para cada diecisiete transformaciones de bombardeo, se preparó 85 µ? de suspensión que contiene de 1 a 90 picogramos (pg) de ADN plasmidico por par base de cada ADN plasmidico. Ambos ADN plasmídicos recombinantes se coprecipitaron en partículas de oro de la siguiente manera. Los ADN en suspensión se añadieron a 50 µ? de una suspensión de partículas de oro de 10- 60 mg/ml 0.6 µ?? y, después, se combinaron con 50 µ? de CaCl2 (2.5 M) y 20 µ? de spermidina (0.1 M). La mezcla se somete a agitación durante 5 segundos, se gira en una microcentrifugadora durante 5 segundos y se retira el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavaron, después, una vez con 150 µ? de etanol al 100 %, se agitaron y se giraron, nuevamente, en una microcentrifugadora, después, se resuspendieron en 85 µ? de etanol anhidro. Cinco µ? de partículas de oro recubiertas con ADN se cargaron, después, en cada disco macroportador .

Preparación del tejido y bombardeo con ADN: Aproximadamente 100 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas se colocó en una placa petri vacía de 60 mi X 15 mm y el liquido restante se retiró del tejido mediante el uso de una pipeta. El tejido se colocó aproximadamente 8.89 cm (3.5 pulgadas) lejos de la pantalla de retención y cada placa de tejido se bombardeó una vez. La fuerza de la presión de ruptura de membrana se estableció a 4.481 MPa (650 psi) y la cámara se evacuó a -94.8 kPa (28 pulgadas de Hg) . Después del bombardeo, el tejido de cada placa se divide entre dos frascos, se coloca, nuevamente, en el medio liquido y se cultiva como se describió anteriormente.

Selección de embriones transformados y regeneración de plantas : Después del bombardeo, el tejido de cada placa bombardeada se dividió y colocó en dos . frascos de medio de mantenimiento de cultivo liquido SB196 por placa de tejido bombardeado. Siete días después del bombardeo, el medio liquido en cada frasco se reemplazó con medio de mantenimiento de cultivo SB196 suplementado con 100 ng/ml de agente selectivo (medio de selección) . Para la selección de células de frijol de soja transformadas, las células de agente selectivo usado puede ser un compuesto de sulfonilurea (SU) con "el nombre químico, 2-cloro-N- ( (4-metoxi-6 metil-1, 3, 5-triazina-2-il ) aminocarbonilo) bencenosulfonamida (nombres comunes: DPX-W4189 y clorosulfuron) . El clorosulfuron es el ingrediente activo en el herbicida sulfonilurea de DuPont, GLEAN®. El medio de selección que contiene SU se remplazó cada dos semanas durante 8 semanas. Después de un periodo de selección de 8 semanas, se observó islas de tejido transformado y verde que crecían de los grupos embriogénicos necróticos no transformados. Estos eventos transgénicos putativos se aislaron y se mantuvieron en medio líquido SB196 con SU en 100 ng/ml durante otras 5 semanas con cambios de medio cada 1 a 2 semanas para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos, transformados y propagados por clonación. Los embriones estuvieron un total de aproximadamente 13 semanas en contacto con SU. Los cultivos en suspensión se subcultivaron y se mantuvieron como grupos de embriones inmaduros y se regeneraron, además, en plantas completas mediante maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Los embriones somáticos se convierten en adecuados para germinación después de cuatro semanas en medio de maduración (1 semana en SB166 seguida por 3 semanas en SB103) . Después, se retiraron del medio de maduración y se secaron en platos petri vacíos por hasta siete días. Los embriones secos se plantaron, después, en un medio SB71-4, en donde se dejaron germinar bajo las mismas condiciones de luz y temperatura como se describió anteriormente. Los embriones germinados se transfirieron a un medio de abono y crecieron a maduración para la producción de semillas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos con experiencia en la técnica a quienes se dirige la presente invención. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes se incorporan en la presente descripción como referencia con el mismo alcance, como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual se indicara especifica e individualmente para incorporarla como referencia.

Aunque la presente invención se ha descrito detalladamente a modo de ilustración y ejemplo para los fines de claridad de comprensión, resultará obvio que es posible practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las modalidades.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada se selecciona del grupo que consiste en: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.:l, o un complemento de longitud completa de estos; b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:2; y c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido con por lo menos 98 % de identidad para la secuencia de longitud completa que se expone en la sec. con núm. de iden . : 2.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, caracterizada además porque la secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que se diseña para la expresión en una planta.

3. Una construcción de ADN, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

4. La construcción de ADN de la reivindicación 3, que comprende, además, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

5. Una célula huésped que contiene la construcción de ADN de la reivindicación 3.

6. La célula huésped de la reivindicación 5, que es una célula bacteriana.

7. La célula huésped de la reivindicación 5, que es una célula vegetal.

8. Una planta transgénica que comprende la célula huésped de la reivindicación 7.

9. La planta transgénica de la reivindicación 8, caracterizada además porque la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza.

10. La semilla transformada de la planta de la reivindicación 9, caracterizada además porque la semilla comprende la construcción de ADN.

11. Un polipéptido aislado con actividad pesticida seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:2; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido con por lo menos 98 % de identidad para la secuencia de longitud completa que se expone en la sec. con núm. de ident: 2; y c) un polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótido de sec. con núm. de ident . : 1.

12. El polipéptido de la reivindicación 11, que comprende, además, las secuencias de aminoácidos heterólogas.

13. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 11.

14. La composición de la reivindicación 13, caracterizada además porque la composición se selecciona del grupo que consiste, en un polvo, bolilla, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, y solución.

15. La composición de la reivindicación 13, caracterizada además porque la composición se prepara mediante la desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de' un cultivo de células de Bacillus thuringiensis .

16. La composición de la reivindicación 13, que comprende aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % en peso del polipéptido.

17. Un método para controlar una población de plaga de insectos; el método comprende poner en contacto la población con una cantidad eficaz como pesticida de un polipéptido de la reivindicación 11.

18. Un método para matar una plaga de insectos; el método comprende poner en contacto la plaga con, o alimentar la plaga con, una cantidad eficaz como pesticida de un polipéptido de la reivindicación 11.

19. Un método para producir un polipéptido con actividad pesticida; el método comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 bajo condiciones en las que se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido que se expresa; el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. :2; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 98 % de identidad para la secuencia de longitud completa que se expone en la sec. con núm. de ident : 2; y c) un polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótido de sec. con núm. de ident . : 1.

20. Una planta que tiene incorporado establemente en su genoma un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad pesticida, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 1 , b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. :2; y c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido con por lo menos 98 % de identidad para la secuencia de aminoácido de longitud completa que se expone en la sec. con núm. de ident . : 2; caracterizado porque la secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal.

21. La planta de la reivindicación 20, caracterizado además porque la planta es una célula vegetal.

22. Un método para proteger una planta de una plaga; el método comprende introducir en la planta o célula de esta al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 1; b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. :2; y c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido con por lo menos 98 % de identidad para la secuencia de aminoácido de longitud completa que se expone en la sec. con núm. de ident . : 2.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la planta produce un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida contra plagas de insectos.