MX2010012471A - Nuevo gen de bacillus thuringiensis con actividad antilepidopteros. - Google Patents

Abstract

La invención provee ácidos nucleicos, y sus variantes y fragmentos, obtenidos de cepas de Bacillus thuringiensis que codifican polipéptidos con actividad pesticida contra plagas de insectos, incluso Lepidoptera. Las formas particulares de realización de la invención proveen ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas pesticidas, composiciones pesticidas, construcciones de ADN, y microorganismos y plantas transformadas que comprenden un ácido nucleico de las formas de realización. Estas composiciones se usan en métodos para el control de plagas, especialmente plagas vegetales.

Description

NUEVO GEN DE BACILLUS THURINGIENSIS CON ACTIVIDAD ANTI LEPIDÓPTEROS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a ácidos nucleicos naturales y recombinantes ácidos nucleicos obtenidos a partir de nuevos genes de Bacillus thuríngiensis que codifican polipéptidos pesticidas caracterizados por actividad pesticida contra plagas de insectos. Las composiciones y los métodos de la invención utilizan los ácidos nucleicos descritos, y sus polipéptidos pesticidas codificados, para controlar las plagas vegetales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plagas de insectos son un factor importante en la pérdida de los cultivos agrícolas mundiales. Por ejemplo, la alimentación de gusanos cascarudos, el daño por gusanos cortadores negros, o el daño por perforador de maíz europeo puede ser económicamente devastador para los productores agrícolas. Las pérdidas de cultivos relacionadas con plagas de insectos debidas a ataques de perforador de maíz europeo tan sólo en el maíz de campo y el maíz dulce alcanzaron aproximadamente mil millones de dólares por año de daños y gastos de control.

Tradicionalmente, el método primario para producir un impacto poblaciones de plagas de insectos es la aplicación de insecticidas químicos de amplio espectro. Sin embargo, tanto los consumidores como los reguladores del gobierno muestran creciente preocupación por los peligros ambientales asociados con la producción y el uso de pesticidas químicos sintéticos. Debido a estos problemas, los reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los pesticidas más peligrosos. En consecuencia, hay sustancial interés por desarrollar pesticidas alternativos.

El control biológico de las plagas de insectos de significancia agrícola mediante el uso de un agente microbiano tal como hongos, bacterias u otra especie de insecto genera una alternativa protectora del ambiente y atractiva comercialmente respecto de los pesticidas químicos sintéticos. En términos generales, el uso de biopesticidas presenta menor riesgo de contaminación y peligros ambientales, y los biopesticidas proveen mayor especificidad de objetivos de lo que es característico de los insecticidas químicos de amplio espectro tradicionales. Además, los biopesticidas a menudo tienen menor costo de producción y en consecuencia mejoran el rendimiento económico de una amplia variedad de cultivos.

Ciertas especies de microorganismos del género Bacillus son conocidos por poseer actividad pesticida contra un amplio rango de plagas de insectos que incluyen Lepidoptera, Díptera, Coleóptera, Hemiptera, y otros. Bacillus thuringiensis (Bt) y Bacillus papilliae se encuentran entre los agentes de biocontrol más exitosos descubiertos hasta la fecha. La patogenicidad de los insectos también se ha atribuido a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus (Harwook, ed., ((1989) Bacillus (Plenum Press), 306) y B. cereus (documento WO 96/ 0083). La actividad pesticida parece estar concentrada en inclusiones proteicas cristalinas paraesporales, aunque también se han aislado proteínas pesticidas a partir de la etapa de crecimiento vegetativo de Bacillus. Se han aislado y caracterizado varios genes codificadores de estas proteínas pesticidas (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.° 5.366.892 y 5.840.868).

Los insecticidas microbianos, particularmente los obtenidos a partir de cepas de Bacillus, han jugado un papel importante en la agricultura como alternativas para el control químico de plagas. Recientemente, los científicos agrícolas han desarrollado plantas de cultivo con aumento de la resistencia a insectos mediante plantas de cultivo sometidas a ingeniería genética para producir proteínas pesticidas provenientes de Bacillus. Por ejemplo, se han sometido a ingeniería genética de plantas de maíz y de algodón para producir proteínas pesticidas aisladas de cepas de Bt (ver, por ejemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol Mol Biol Rev. 62(3):775-806). Estos cultivos obtenidos por ingeniería genética se usan ahora ampliamente en la agricultura de los Estados Unidos y se han suministrado a los granjeros con una alternativa protectora del ambiente respecto de los métodos de control de insectos tradicionales. Además, las papas obtenidas por ingeniería genética para contener toxinas pesticidas Cry han sido vendidas al granjero estadounidense. Si bien se ha demostrado que tienen gran éxito comercial, estas plantas de cultivo resistentes a insectos obtenidas genéticamente sólo proveen resistencia a un estrecho rango de las plagas de insectos comercialmente importantes.

En consecuencia, aún persiste la necesidad de nuevas toxinas Bt con un rango más amplio de actividad insecticida contra plagas de insectos, por ejemplo, toxinas que sean activas contra una mayor variedad de insectos del orden Lepidoptera. Además, aún persiste la necesidad de biopesticidas que tengan actividad contra una variedad de plagas de insectos y de biopesticidas que tengan mayor actividad insecticida.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para producir un impacto sobre plagas de insectos. Más específicamente, las formas de realización de la presente invención se refieren a métodos para producir un impacto sobre insectos que utilizan secuencias de nucleótidos que codifican péptidos insecticidas a fin de producir microorganismos transformados y plantas que expresan un polipéptido insecticida de las formas de realización. Dichas plagas incluyen plagas agrícolamente significativas, tales como, por ejemplo: perforador de maíz europeo por ejemplo Ostrinia nubilalis Hübner, gusano de mazorca de maíz por ejemplo, Helicoverpa zea Boddie, enroscador de poroto de soja por ejemplo Pseudoplusia includens Waiker y oruga de poroto terciopelo por ejemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner. En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos codifican polipéptidos que son pesticida durante al menos un insecto perteneciente al orden Lepidoptera.

Las formas de realización proveen un ácido nucleico y sus fragmentos y variantes que codifican polipéptidos que poseen actividad pesticida contra plagas de insectos (por ejemplo SEQ ID NO: 1 que codifica SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 que codifica SEQ ID NO: 4). La secuencia de nucleótidos de tipo salvaje (por ejemplo, natural) de las formas de realización, que se obtuvo de Bt, codifica un nuevo péptido insecticida. Las formas de realización también proveen fragmentos y variantes de la secuencia de nucleótidos descrita que codifica polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, insecticidas).

Las formas de realización también proveen polipéptidos pesticidas aislados (por ejemplo, insecticidas) codificados por un ácido nucleico natural, o modificado (por ejemplo, mutagenizado o manipulado) de las formas de realización. En ejemplos particulares, las proteínas pesticidas de las formas de realización incluyen fragmentos de proteínas de longitud total y polipéptidos que se producen a partir de ácidos nucleicos mutagenizados diseñados para introducir secuencias de aminoácidos particulares en los polipéptidos de las formas de realización. En formas de realización particulares, los polipéptidos se han mutagenizado y tienen mayor actividad pesticida respecto de la actividad del polipéptido natural a partir del cual se derivan (por ejemplo SEQ ID NO: 3 que codifica SEQ ID NO: 4).

Los ácidos nucleicos de las formas de realización también se pueden usar para producir plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas transgénicas (por ejemplo, transformadas) caracterizadas por genomas que comprenden al menos una construcción de nucleótido incorporada en forma estable que comprende una secuencia codificadora de las formas de realización ligadas operativamente a un promotor que dirige la expresión del polipéptido pesticida codificado. En consecuencia, se proveen sus células vegetales, tejidos vegetales, plantas y semillas transformados.

En una forma particular de realización, se puede producir una planta transformada mediante el uso de un ácido nucleico que ha sido optimizado para incrementar la expresión en una planta huésped. Por ejemplo, uno de los polipéptidos pesticidas de las formas de realización puede ser traducido al revés a fin de producir un ácido nucleico que comprende codones optimizados para la expresión en un huésped particular, por ejemplo una planta de cultivo tal como una planta de maíz (Zea mays). La expresión de una secuencia codificadora por dicha planta transformada (por ejemplo, dicotiledónea o monocotiledónea) dará por resultado la producción de un polipéptido pesticida y confiere aumento de la resistencia a insectos de la planta. Algunas formas de realización proveen plantas transgénicas que expresan polipéptidos pesticidas que se utilizan en métodos para producir un impacto sobre diversas plagas de insectos.

Las formas de realización también incluyen composiciones pesticidas o insecticidas que contienen polipéptidos insecticidas de las formas de realización, y opcionalmente pueden comprender otros péptidos insecticidas. Las formas de realización abarcan la aplicación de dichas composiciones al ambiente de las plagas de insectos a fin de producir un impacto sobre las plagas de insectos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las formas de realización de la invención están trazadas para las composiciones y los métodos para producir un impacto sobre las plagas de insectos, particularmente las plagas vegetales. Más específicamente, los ácidos nucleicos de las formas de realización, y sus fragmentos y variantes, comprenden secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos pesticidas (por ejemplo, proteínas). Las proteínas pesticidas descritas son biológicamente activas (por ejemplo, pesticida) contra plagas de insectos tales como, sin limitaciones, plagas de insectos del orden Lepidoptera. Las plagas de insectos de interés incluyen, sin limitaciones: perforador de maíz europeo, por ejemplo, Ostrinia nubilalis; oruga de mazorca de maíz, por ejemplo, Helicoverpa zea; perforador de tallo común, por ejemplo, Papiapema nebris; perforador de maíz del sudoeste, por ejemplo, Diatraea grandiosella; gusano cascarudo de remolacha, por ejemplo, Spodoptera exigua; polilla de espalda con rombo, por ejemplo, Plutella xilostella; oruga de mazorca de maíz por ejemplo, Helicoverpa zea Boddie; enrollador de poroto de soja por ejemplo Pseudoplusia includens Walker; y oruga de poroto terciopelo por ejemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner.

Las composiciones de las formas de realización comprenden ácidos nucleicos, y sus fragmentos y variantes, los cuales codifican polipéptidos pesticidas, casetes de expresión que comprende secuencias de nucleótidos de las formas de realización, proteínas pesticidas aisladas, y composiciones pesticidas. Algunas formas de realización proveen polipéptidos pesticidas modificados caracterizado por temer mayor actividad insecticida contra Lepidópteros respecto de la actividad pesticida de la correspondiente proteína de tipo salvaje. Las formas de realización también proveen plantas y microorganismos transformados con estos nuevos ácidos nucleicos, y los métodos que incluyen el uso de dichos ácidos nucleicos, composiciones pesticidas, organismos transformados, y sus productos en la producción de impacto sobre plagas de insectos.

Los ácidos nucleicos y las secuencias de nucleótidos de las formas de realización se pueden usar para transformar cualquier organismo para producir las proteínas pesticidas codificadas. Se proveen métodos que incluyen el uso de duchos organismos transformados para producir un impacto o controla las plagas vegetales. Los ácidos nucleicos y las secuencias de nucleótidos de las formas de realización también se pueden usar para transformar organelas tales como cloroplastos (McBride et al. (1995) Biotechnology 13: 362-365; y Kota et al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 1840-1845).

Las formas de realización también se refieren a la identificación de fragmentos y variantes de la secuencia codificadora natural que codifica las proteínas pesticidas biológicamente activas. Las secuencias de nucleótidos de las formas de realización encuentran uso directo en métodos para producir un impacto sobre las plagas, particularmente plagas de insectos tales como plagas del orden Lepidoptera. En consecuencia, las formas de realización proveen nuevos abordajes para producir un impacto sobre plagas de insectos que no dependen den uso de insecticidas químicos sintéticos tradicionales. Las formas de realización incluyen el descubrimiento de pesticidas biodegradables naturales y de los genes que los codifican.

Las formas de realización también proveen fragmentos y variantes de la secuencia codificador natural que también codifica polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, pesticida). Los ácidos nucleicos de las formas de realización abarcan ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos que han sido optimizados para la expresión por las células de un organismo particular, por ejemplo las secuencias de ácidos nucleicos que han sido traducidas en reversa (es decir, traducción inversa) mediante el uso de codones vegetales preferidos sobre la base de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene mayor actividad pesticida. Las formas de realización también proveen mutaciones que confieren propiedades mejoradas o alteradas a los polipéptidos de las formas de realización. Ver, por ejemplo, las solicitudes copendientes de los Estados Unidos N.° 10/606.320, presentada el 25 de junio de 2003, y 10/746.914, presentada el 24 de diciembre de 2003.

En la descripción siguiente, cierta cantidad de términos se usan extensamente. Las siguientes definiciones se proveen para facilitar el conocimiento de las formas de realización.

Las unidades, los prefijos y los símbolos se pueden denotar en su forma aceptada por SI. A menos que se indique otra cosa, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. Los aminoácidos se pueden referir en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. De modo similar, los nucleótidos se pueden referir por sus códigos de letra única comúnmente aceptados. Los términos antes definidos se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

Tal como se usa en la presente, "ácidos nucleico" incluye referencias a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en su forma monocatenaria o bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, abarca análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos) que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en cuanto a que se hibridan a ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a la de los nucleótidos naturales.

Tal como se usa en la presente, los términos "codificadores" o "codificados" cuando se usan en el contexto de un ácido nucleico especificado significan que el ácido nucleico comprende la información requerida para dirigir la traducción de la secuencia de nucleótidos en una proteína específica. La información por la cual una proteína es codificada está especificada por el uso de los codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de regiones traducidas de los ácidos nucleicos o puede carecer de dichas secuencias intervinientes no traducidas (por ejemplo, como en cADN).

Tal como se usa en la presente, "secuencia de longitud total" en referencia a un polinucleótido específico o su proteína codificada significa que tiene toda la secuencia de ácidos nucleicos o la totalidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa (no sintética), endógena. Un polinucleótido de longitud total codifica la forma catalíticamente activa de longitud total de la proteína especificada.

Tal como se usa en la presente, el término "antisentido" usado en el contexto de orientación de una secuencia de nucleótidos se refiere a un doblete de secuencias de polinucleótidos que está ligada operativamente a un promotor en una orientación en la cual se transcribe la cadena antisentido. La cadena antisentido es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno de manera tal que la traducción del producto de transcripción endógena a menudo es inhibida. En consecuencia, cuando se usa el término "antisentido" en el contexto de una secuencia de nucleótidos particular, el término se refiere a la cadena complementaria del producto de transcripción de referencia.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para referir a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un correspondiente aminoácido natural, así como los polímeros de aminoácidos 'naturales.

Los términos "residuo" o "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se usan indistintamente en la presente para referirse a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido (colectivamente "proteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido natural y, a menos que esté limitado de otro modo, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de manera similar a los aminoácidos naturales.

Los polipéptidos de las formas de realización se pueden producir a partir de un ácido nucleico descrito en la presente, o mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, una proteína de las formas de realización se puede producir mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante de las formas de realización en una célula huésped adecuada, o alternativamente por una combinación de procedimientos ex vivo.

Tal como se usa en la presente, los términos "aislado" y "purificado" se usan indistintamente para referirse a ácidos nucleicos o polipéptidos o sus porciones biológicamente activas que están sustancialmente o esencialmente libres de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con los ácidos nucleicos o polipéptidos según se encuentran en su ambiente natural. En consecuencia, un ácido nucleico o polipéptido aislado o purificado está sustancialmente libre de otros materiales celulares o medio de cultivo cuando se producen por técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetizan por medios químicos.

Un ácido nucleico "aislado" generalmente está libre de secuencias (tales como, por ejemplo, secuencias codificadoras de proteínas) que flanquean naturalmente los ácidos nucleicos (es decir, las secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' de los ácidos nucleicos) en el ADN genómico del organismo a partir del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas formas de realización, los ácidos nucleicos aislados pueden contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ó 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente los ácidos nucleicos en ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico.

Tal como se usa en la presente, el término "aislado" o "purificado" tal como se usa para referirse a un polipéptido de las formas de realización significa que la proteína aislada está sustancialmente libre de material celular e incluye preparaciones de proteína que tienen aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de las formas de realización o su porción biológicamente activa se produce en forma recombinante, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos químicos proteicos sin interés.

En toda la memoria descriptiva los términos "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se entenderán con la implicancia de la inclusión de un elemento establecido, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero sin la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas.

Tal como se usa en la presente, el término "producir un impacto sobre plagas de insectos" se refiere a efectuar cambios en la alimentación de insectos, el crecimiento, y/o el comportamiento en cualquier etapa de desarrollo incluso sin limitaciones: matar el insecto; retardar el crecimiento; prevenir la capacidad reproductora; actividad antialimentación; y similares.

Tal como se usa en la presente, los términos "actividad pesticida" y "actividad insecticida" se usan como sinónimos para referirse a la actividad de un organismo o una sustancia (tales como, por ejemplo, una proteína) que se puede medir por ejemplo, pero sin limitaciones, mortalidad de la plaga, pérdida de peso de la plaga, repelencia a la plaga, y otros cambios de comportamiento y físicos de una plaga después de la alimentación y la exposición durante un periodo de longitud adecuada. En consecuencia, un organismo o sustancia que tiene actividad pesticida produce un impacto adverso sobre al menos un parámetro medible de la capacidad de la plaga. Por ejemplo, " proteínas pesticidas" son proteínas que muestran actividad pesticida por sí mismos o en combinación con otras proteínas.

Tal como se usa en la presente, el término "cantidad efectiva como pesticida" connota una cantidad de una sustancia u organismo que tiene actividad pesticida cuando está presente en el ambiente de una plaga. Para cada sustancia u organismo, la cantidad efectiva como pesticida se determina empíricamente para cada plaga afectada en un ambiente específico. De modo similar, una "cantidad efectiva como insecticida" se puede usar en referencia a una "cantidad efectiva como pesticida" cuando la plaga es una plaga de insectos.

Tal como se usa en la presente, el término "producido por ingeniería recombinante" o "por ingeniería" connota la utilización de tecnología de ADN recombinante para introducir (por ejemplo, incorporar por ingeniería) un cambio en la estructura proteica sobre la base del conocimiento del mecanismo de acción de la proteína y la consideración de los aminoácidos que se introducen, eliminan o sustituyen.

Tal como se usa en la presente, el término "secuencia de nucleótidos mutante" o "mutación" o "secuencia de nucleótidos mutagenizada" connota una secuencia de nucleótidos que ha sido mutagenizada o alterada para contener uno o más residuos de nucleótidos (por ejemplo, par de bases) que no están presentes en la correspondiente secuencia de tipo salvaje. Dicha mutagénesis o alteración consiste de una o más adiciones, deleciones, o sustituciones o reemplazos de residuos de ácidos nucleicos. Cuando las mutaciones se realizan por agregado, remoción o reemplazo de un aminoácido de un sitio proteolítico, dicho adición, remoción o reemplazo puede estar dentro o adyacente al motivo del sitio proteolítico, siempre que se logre el objeto de la mutación (es decir, siempre que se modifique la proteólisis en el sitio).

Una secuencia de nucleótidos mutante puede codificar una toxina insecticida mutante que muestra aumento o disminución de la actividad insecticida, o una secuencia de aminoácidos que confiere aumento o disminución de la actividad insecticida sobre un polipéptido que lo contiene. Tal como se usa en la presente, el término "mutante" o "mutación" en el contexto de una proteína, un polipéptido o una secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia que ha sido mutagenizada o alterada para contener uno o más residuos de aminoácidos que no están presentes en la correspondiente secuencia de tipo salvaje. Dicha mutagénesis o alteración consiste de una o más adiciones, deleciones o sustituciones o reemplazos de residuos de aminoácidos. Un polipéptido muíante muestra aumento o disminución de la actividad insecticida, o representa una secuencia de aminoácidos que confiere aumento de la actividad insecticida sobre un polipéptido que lo contiene. En consecuencia, el término "mutante" o "mutación" se refiere a alguno o ambos de la secuencia de nucleótidos mutante y los aminoácidos codificados. Los mutantes se pueden usar solos o en cualquier combinación compatible con otros mutantes de las formas de realización o con otros mutantes. Por otra parte, un "polipéptido mutante" puede mostrar una disminución de la actividad insecticida. Cuando se agrega más de una mutación a un ácido nucleico o proteína particular, las mutaciones se pueden añadir al mismo tiempo o en secuencia; si en secuencia, las mutaciones se pueden añadir en cualquier orden adecuado.

Tal como se usa en la presente, la expresión "aumento de la actividad insecticida" o "aumento de la actividad pesticida" se refiere a un polipéptido insecticida de las formas de realización que tiene aumento de la actividad insecticida respecto de la actividad de su correspondiente proteína de tipo salvaje, y/o un polipéptido insecticida que es efectivo contra un rango más amplio de insectos, y/o un polipéptido insecticida que tiene especificidad por un insecto que no es susceptible a la toxicidad de la proteína de tipo salvaje. Un hallazgo de aumento o mejoramiento de la actividad pesticida requiere una demostración de un incremento de la actividad pesticida de al menos 10%, contra el insecto objetivo, o al menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200% o 300% o mayor incremento de actividad pesticida respecto de la actividad pesticida del polipéptido insecticida de tipo salvaje determinado contra el mismo insecto.

Por ejemplo, un aumento de la actividad pesticida o insecticida se provee cuando se produce un rango más amplio o más angosto de impacto sobre insectos por el polipéptido respecto del rango de los insectos que son afectados por una toxina de Bt de tipo salvaje. Puede ser deseable un rango más amplio de impacto cuando se desee versatilidad, mientras que puede ser deseable un rango más angosto de impacto, por ejemplo, cuando de otro modo se produzca un impacto sobre insectos beneficiosos mediante el uso o la presencia de la toxina. Mientras que las formas de realización no están ligadas a ningún mecanismo de acción particular, una mayor actividad pesticida también se puede proveer mediante cambios en una o más características de un polipéptido; por ejemplo, la estabilidad o la longevidad de un polipéptido de un intestino de insecto se puede mejorar respecto de la estabilidad o la longevidad de una proteína correspondiente de tipo salvaje.

El término "toxina" tal como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que muestra actividad pesticida o actividad insecticida o mayor actividad pesticida o mayor actividad insecticida. La toxina "Bf o "Bacillus thuringiensis" pretende incluir la clase más amplia de toxinas Cry halladas en diversas cepas de Bt, las cuales incluyen toxinas tales como, por ejemplo, Cryls, Cry2s o Cry3s.

Las expresiones "sitio proteolítico" o "sitio de escisión" se refieren a una secuencia de aminoácidos que confiere sensibilidad a una clase de proteasas o una proteasa particular de manera tal que un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos es digerida por la clase de proteasas o una proteasa particular. Se dice que un sitio proteolítico es "sensible" a la(s) proteasa(s) que reconocen dicho sitio. Se aprecia en la técnica que la eficiencia de la digestión varía, y que un descenso de la eficiencia de digestión puede conducir a un incremento de la estabilidad o la longevidad del polipéptido en un intestino de insecto. En consecuencia, un sitio proteolítico puede conferir sensibilidad a más de una proteasa o clase de proteasas, pero la eficiencia de la digestión en dicho sitio por diversas proteasas puede variar. Los sitios proteolíticos incluyen, por ejemplo, sitios de tripsina, sitios de quimiotripsina, y sitios de elastasa.

La investigación ha demostrado que las proteasas de intestino de insecto de Lepidópteros incluyen tripsinas, quimiotripsinas y eiastasas. Ver, por ejemplo, Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212; y Hedegus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47. Por ejemplo, se han hallado aproximadamente 18 diferentes en el intestino medio de larvas de Helicoverpa armígera (ver Gatehousé et al. (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 929-944). Se han investigado los sitios de sustrato proteolítico preferido de estas proteasas. Ver, por ejemplo, Peterson eí al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 765-774.

Se han hecho esfuerzos tendientes a comprender el mecanismo de acción de las toxinas de Bt y para obtener las toxinas por ingeniería con propiedades mejoradas. Se demostró que las proteasas de intestino de insecto pueden afectar el impacto de proteínas Bt Cry sobre el insecto. Algunas proteasas activan las proteínas Cry al procesarlas a partir de una forma de "protoxina" en una forma tóxica o "toxina". Ver, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42: 1-12; y Carroll et al. (1997) J. Invertebrate Pathology 70: 41-49. Esta activación de la toxina puede incluir la remoción de los péptidos N- y C-term¡nal de la proteína y también puede incluir la escisión interna de la proteína. Otras proteasas pueden degradar las proteínas Cry. Ver Oppert, ibid.

Una comparación de las secuencias de aminoácidos de las toxinas Cry de diferentes especificidades revela cinco bloques de secuencias altamente conservadas. Estructuralmente, las toxinas comprenden tres dominios diferenciados que son, desde el terminal N al C: un cúmulo de siete hélices alfa implicadas en la formación de poros (referida como "dominio 1"), tres láminas beta antiparalelas implicadas en la fijación celular (referida como "dominio 2"), y un emparedado beta (referido como "dominio 3"). La ubicación y las propiedades de estos dominios son conocidas por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Li et al. (1991) Nature, 305:815-821 y Morse et al. (2001 ) Estructura, 9:409-417. Cuando se hace referencia a un dominio particular, tal como el dominio 1 , se entiende que los puntos finales exactos del dominio respecto de una secuencia particular no son esenciales siempre que la secuencia o la porción de ella incluya una secuencia que provea al menos parte de la función atribuida al dominio particular. En consecuencia, por ejemplo, cuando se refiere al "dominio 1", se pretende que una secuencia particular incluya un cúmulo de siete hélices alfa, pero los puntos terminales exactos de la secuencia usada o referida respecto de dicho cúmulo no son esenciales. Un experto en la técnica conoce la determinación de dichos puntos terminales y la evaluación de dichas funciones.

En un esfuerzo tendiente a caracterizar mejor y mejorar las toxinas Bt, se estudiaron cepas de la bacteria Bt. Se descubrió que las preparaciones cristalinas obtenidas de cultivos de las cepas de Bt tenían actividad pesticida contra perforador de maíz europeo (ver, por ejemplo, los Ejemplos experimentales 1 , 2, y 3). Se realizó un esfuerzo tendiente a identificar las secuencias de nucleótidos codificadores de las proteínas cristalinas a partir de las cepas seleccionadas, y se aislaron los ácidos nucleicos de tipo salvaje (es decir, naturales) de las formas de realización a partir de estas cepas bacterianas, se clonaron en un vector de expresión, y se transformaron en E coli. Según las características de una preparación dada, se reconoció que la demostración de la actividad pesticida en ocasiones requería pretratamiento con tripsina a fin de activare las proteínas pesticidas. En consecuencia, se entiende que algunas proteínas pesticidas requieren la digestión por proteasas (por ejemplo, por tripsina, quimotripsina, y similares) para la activación, mientras que otras proteínas son biológicamente activas (por ejemplo, pesticida) en ausencia de activación.

Dichas moléculas pueden ser alteradas por los medios descritos, por ejemplo, en las solicitudes de los Estados Unidos Nros. 10/606.320, presentada el 25 de junio de 2003, y 10/746.914, presentada el 24 de diciembre de 2003. Además, las secuencias de ácidos nucleicos se pueden obtener por ingeniería a fin de codificar polipéptidos que contienen mutaciones adicionales que confieren mejor o alteración de la actividad pesticida respecto de la actividad pesticida del polipéptido natural. Las secuencias de nucleótidos de dichos ácidos nucleicos obtenidos por ingeniería comprenden mutaciones que no se encuentran en las secuencias de tipo salvaje.

Los polipéptidos mutantes de las formas de realización se preparan generalmente por un proceso que incluye las etapas de: obtención de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la familia Cry; analizar la estructura del polipéptido a fin de identificar sitios "objetivo" particulares para la mutagénesis de la secuencia génica subyacente sobre la base de la consideración de la función propuesta del dominio objetivo en el modo de acción de la toxina; introducir una o más mutaciones en la secuencia de ácidos nucleicos a fin de producir un cambio deseado de uno o más residuos de aminoácido de la secuencia codificada del polipéptido; y analizar el polipéptido producido para la actividad pesticida.

Muchas de las toxinas Bt insecticidas se relacionan en grado variable por similitudes en sus secuencias de aminoácidos y la estructura terciaria y son bien conocidos los medios de obtención de las estructuras cristalinas de las toxinas Bt. Los ejemplos de solución de la estructura cristalina de alta resolución de ambos polipéptidos Cry3A y Cry3B están disponibles en la bibliografía. La estructura resuelta delk gen Cry3A (Li et al. (1991 ) Nature 353:815-821 ) provee detalles sobre las relaciones entre estructura y función de la toxina. Una consideración combinada de los análisis estructurales publicados de las toxinas Bt y la función informada asociada estructuras, motivos, y similares particulares indica que regiones específicas de la toxina se correlacionan con funciones particulares y etapas diferenciadas del modo de acción de la proteína. Por ejemplo, muchas toxinas aisladas de Bt generalmente se describen por comprender tres dominios: un haz de siete hélices que interviene en la formación de poros, un dominio de tres láminas que se ha implicado en la fijación del receptor, y un motivo de emparedado beta (Li er a/. (1991 ) Nature 305: 815-821).

Tal como se informa en la patente de los Estados Unidos N.° 7.105.332, y en la solicitud pendiente de los Estados Unidos N.° 10/746.914, presentada el 24 de diciembre de 2003, la toxicidad de las proteínas Cry se puede mejorar mediante dirección hacia la región ubicada entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 de la toxina. Esta teoría fue enfrentada con un cuerpo de conocimiento referido a toxinas insecticidas, incluso: 1) que se ha informado que las hélices alfa 4 y 5 del dominio 1 de las toxinas Cry3A se insertan en la bicapa lipídica de células que revisten el intestino medio de los insectos susceptibles (Gazit et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 12289-12294); 2) el conocimiento de los inventores sobre la ubicación de los sitios de escisión de la tripsina y la quimotripsina dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína de tipo salvaje; 3) la observación de que la proteína de tipo salvaje era más activa contra ciertos insectos después de la activación in vitro por tratamiento con tripsina o quimotripsina; y 4) informes de que la digestión de las toxinas desde el extremo 3' da por resultado menor toxicidad para los insectos.

Se puede crear y ubicar una serie de mutaciones en una variedad de secuencias de fondo a fin de crear nuevos polipéptidos que tienen actividad pesticida mejorada o alterada. Ver, por ejemplo, las solicitudes de los Estados Unidos Nros. 10/606.320, presentada el 25 de junio de 2003, ahora abandonada, y 10/746.914, presentada el 24 de diciembre de 2003. Estos mutantes incluyen, sin limitaciones: la adición de al menos otro sitio sensible a la proteasa (por ejemplo, sitio de escisión de tripsina) en la región ubicada entre las hélices 3 y 4 del dominio 1 ; el reemplazo de un sitio original sensible a proteasa en la secuencia de de tipo salvaje por un sitio sensible a proteasa diferente; la adición de múltiples sitios sensibles a proteasa en una ubicación particular; la adición de residuos de aminoácido cerca de sitios sensibles a proteasa a fin de alterar el plegamiento del polipéptido y en consecuencia mejorar la digestión del polipéptido en el sitio sensible a proteasa; y agregar mutaciones para proteger el polipéptido contra la digestión degradativa que reduce la toxicidad (por ejemplo, genera una serie de mutaciones en las cuales el aminoácido de tipo salvaje es reemplazado por valina a fin de proteger el polipéptido contra la digestión). Las mutaciones se pueden usar en forma aislada o en cualquier combinación a fin de proveer polipéptidos de las formas de realización.

De esta manera, las formas de realización proveen secuencias que comprenden una variedad de mutaciones, tales como, por ejemplo, una mutación que comprende un sitio sensible a proteasa adicional, o alternativo ubicado entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codificado. Una mutación que está en el sitio sensible a proteasa adicional o alternativo puede ser sensible a varias clases de proteasas tales como serina proteasas, las cuales incluyen tripsina y quimotripsina, o enzimas tales como elastasa. En consecuencia, se puede diseñar una mutación que está en un sitio sensible de proteasa adicional o alternativo de manera tal que el sitio se reconoce fácilmente y/o es escindido por una categoría de proteasas, tales como proteasas de mamífero o proteasas de insecto. También se puede diseñar un sitio sensible a proteasas que sea escindido por una clase particular de enzimas o una enzima particular que se sabe es producida por un organismo, tal como, por ejemplo, una quimotripsina producida por el gusano de mazorca de maíz Heliothis zea (Lenz et al. (1991 ) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212). Las mutaciones también pueden conferir resistencia a la digestión proteolítica, por ejemplo, a la digestión por quimotripsina en el C-terminal del péptido.

La presencia de un sitio sensible de proteasa adicional y/o alternativo en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado puede mejorar la actividad pesticida y/o la especificidad del polipéptido codificado por los ácidos nucleicos de las formas de realización. En consecuencia, las secuencias de nucleótidos de las formas de realización pueden ser producidas por ingeniería recombinante o manipuladas para producir polipéptidos que tienen mayor o alteración de la actividad insecticida y/o especificidad, comparado con la de una toxina no modificada de tipo salvaje. Además, las mutaciones descritas en la presente pueden estar ubicadas o usadas en conjunción con otras secuencias de nucleótidos para proveer propiedades mejoradas. Por ejemplo, un sitio sensible a proteasa que se escinde fácilmente por la quimotripsina de insecto, por ejemplo, una quimotripsina hallada en la oruga de cascarudo o el gusano de mazorca de maíz (Hegedus eí al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47; y Lenz er a/. (1991 ) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212), se pueden ubicar en una secuencia de antecedente de Cry para proveer mayor toxicidad a dicha secuencia. De esta manera, las formas de realización proveen polipéptidos tóxicos con propiedades mejoradas.

Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos mutagenizada Cry puede comprender mutantes adicionales que comprenden codones adicional que introducen una segunda secuencia de aminoácidos sensible a tripsina (además del sitio natural de tripsina) en el polipéptido codificado. Una muíante alternativa adicional de las formas de realización comprende codones adicionales diseñados para introducir al menos un sitio sensible a proteasa adicional diferente en el polipéptido, por ejemplo, un sitio sensible a quimiotripsina ubicado inmediatamente 5' o 3' respecto del sitio de tripsina natural. Alternativamente, se pueden creare mutantes de sustitución en las cuales se destruye al menos un codón de los ácidos nucleico que codifica el sitio sensible a proteasa natural y se introducen codones alternativos en la secuencia de ácidos nucleicos a fin de proveer un sitio sensible a proteasa diferente (por ejemplo, sustituto). También se puede añadir un mutante de reemplazo a una secuencia Cry en la cual el sitio de escisión natural de tripsina presente en el polipéptido codificado es destruido y se introduce un sitio de escisión de quimotripsina o elastasa en su lugar.

Se reconoce que se puede usar cualquier secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos que son sitios proteolíticos o posibles sitios proteolíticos (por ejemplo, secuencias tales como NGSR, RR o LKM) y que la identidad exacta de los codones usados para introducir cualquiera de estos sitios de escisión en una variante de polipéptido puede variar según el uso, es decir, la expresión en una especie vegetal particular. También se reconoce que cualquiera de las mutaciones descritas puede ser introducida en cualquier secuencia de polinucleótidos de las formas de realización que comprende los codones de los residuos de aminoácidos que proveen el sitio de escisión de la tripsina nativa que es el objetivo de la modificación. En consecuencia, las variantes de las toxinas de longitud total o sus fragmentos se pueden modificar para contener sitios de escisión adicionales o alternativos, y estas formas de realización pretenden ser abarcadas por el alcance de las formas de realización descritas en la presente.

Los expertos en la técnica apreciarán que se puede añadir cualquier mutación útil a las secuencias de las formas de realización siempre que los polipéptidos codificados retengan la actividad pesticida. En consecuencia, las secuencias también se pueden mutar de manera tal que los polipéptidos codificados sean resistentes a la digestión proteolítica por quimotripsina. Se puede añadir más de un sitio de reconocimiento en unan ubicación particular en cualquier combinación, y se pueden añadir o extraer múltiples sitios de reconocimiento de la toxina. En consecuencia, las mutaciones adicionales pueden comprender tres, cuatro o más sitios de reconocimiento. Se debe reconocer que se pueden obtener por ingeniería múltiples mutaciones en cualquier secuencia de polinucleótidos adecuada; en consecuencia, las secuencias de longitud total o sus fragmentos pueden ser modificados para contener sitios de escisión adicionales o alternativos así como para ser resistentes a la digestión proteolítica. De esta manera, las formas de realización proveen toxinas Cry que contienen mutaciones que mejoran la actividad pesticida así como mejoran las composiciones y los métodos para producir un impacto sobre las plagas mediante el uso de otras toxinas Bt.

Las mutaciones pueden proteger el polipéptido contra la degradación por proteasas, por ejemplo al extraer posibles sitios proteolíticos tales como posible sitios de serina proteasas y sitios de reconocimiento de elastasas de diferentes áreas. Parte o la totalidad de dichos sitios posibles pueden ser extraídos o alterados de manera tal que disminuya la proteólisis en la ubicación del sitio original. Los cambios de la proteólisis pueden ser evaluados al comparar un polipéptido mutante con las toxinas de tipo salvaje o al comparar toxinas mutantes que difieren en su secuencia de aminoácidos. Los posibles sitios de proteólisis y los sitios proteolíticos incluyen, sin limitaciones, las siguientes secuencias: RR, un sitio de escisión de tripsina; LKM, un sitio de quimotripsina; y NGSR, un sitio de tripsina. Estos sitios pueden ser alterados por la adición o deleción de cualquier cantidad o tipo de residuo de aminoácido, siempre que se aumente la actividad pesticida del polipéptido. En consecuencia, los polipéptidos codificados por las secuencias de nucleótidos que comprenden mutaciones comprenderán al menos un cambio o adición de aminoácido respecto de la secuencia nativa o anterior, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 ó 280 o más cambios o adiciones de aminoácido. La actividad pesticida de un polipéptido también se puede mejorar por truncación de la secuencia nativa o de longitud total, tal como es conocido en la técnica.

Las composiciones de las formas de realización incluyen ácidos nucleicos, y sus fragmentos y variantes, que codifican polipéptidos pesticidas. En particular, las formas de realización proveen moléculas aisladas de ácidos nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 2 y 4, o las secuencias de nucleótidos que codifican dichas secuencias de aminoácidos, por ejemplo las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NOs: 1 y 3, y sus fragmentos y variantes.

También interesan las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican las proteínas pesticidas de las formas de realización. Tal como se usa en la presente, la frase "secuencias optimizadas de nucleótidos" se refiere a ácidos nucleicos que están optimizados para la expresión en un organismo particular, por ejemplo una planta. Las secuencias optimizadas de nucleótidos se pueden preparar para cualquier organismo de interés mediante métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las solicitudes de los Estados Unidos N.° 10/606.320, presentada el 25 de junio de 2003, ahora abandonada, y 10/746.914, presentada el 24 de diciembre de 2003, la cual describe una secuencia optimizada de nucleótidos que codifican una proteína pesticida descrita. En este ejemplo, la secuencia de nucleótidos se preparó por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos de la proteína y modificación de la secuencia de nucleótidos de manera tal que comprenda codones preferidos de maíz a la vez que codifica la misma secuencia de aminoácidos. Este procedimiento se describe con mayor detalle en Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Las secuencias optimizadas de nucleótidos se usan para incrementar la expresión de una proteína pesticida en una planta, por ejemplo plantas monocotiledóneas de la familia Gramineae (Poaceae) tales como, por ejemplo, una planta de maíz.

Las formas de realización también proveen polipéptidos pesticidas (por ejemplo, insecticidas) codificados por un ácido nucleico natural o modificado de las formas de realización. Más específicamente, las formas de realización proveen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NOs: 2 y 4, y los polipéptidos codificados por ácidos nucleicos descritos en la presente, por ejemplo los establecidos en SEQ ID NOs: 1 y 3, y sus fragmentos y variantes. En formas de realización particulares, los polipéptidos han sido modificados y tienen mayor actividad pesticida respecto de la actividad del polipéptido natural del cual derivan (por ejemplo SEQ ID NO: 3 que codifica SEQ ID NO: 4).

En formas particulares de realización, las proteínas pesticidas de las formas de realización proveen polipéptidos insecticidas de longitud total, fragmentos de polipéptidos insecticidas de longitud total, y variantes de polipéptidos que son producidos a partir de ácidos nucleicos mutagenizados diseñados para introducir e secuencias de aminoácidos particulares en polipéptidos de las formas de realización. En formas particulares de realización, las secuencias de aminoácidos que son introducidas en los polipéptidos comprenden una secuencia que provee un sitio de escisión para una enzima tal como una proteasa.

Es sabido en la técnica que la actividad pesticida de las toxinas Bt generalmente es activada por la escisión del péptido en el intestino del insecto por diversas proteasas. Dado que los péptidos no siempre son escindidos con total eficiencia en el intestino del insecto, los fragmentos de una toxina de longitud total pueden tener mayor actividad pesticida en comparación con la propia toxina de longitud total. En consecuencia, algunos de los polipéptidos de las formas de realización incluyen fragmentos de un polipéptido insecticida de longitud total, y algunos de los fragmentos, variantes, y mutaciones del polipéptido tendrán aumento de la actividad pesticida respecto de la actividad del polipéptido insecticida natural del cual derivan, particularmente si el polipéptido insecticida natural no está activado in vitro con una proteasa antes del análisis de la actividad. En consecuencia, la presente solicitud abarca versiones truncadas o fragmentos de las secuencias.

Las mutaciones pueden estar ubicadas en cualquier secuencia antecedente, incluso duchos polipéptidos truncados, siempre que el polipéptido retenga la actividad pesticida. Un experto en la técnica podrá comparar fácilmente dos o más proteínas respecto de la actividad pesticida mediante el uso de ensayos conocidos en la técnica o descritos en otra parte en la presente. Se debe entender que los polipéptidos de las formas de realización se pueden producir por expresión de un ácido nucleico descrito en la presente, o por el uso de técnicas de biología molecular estándar.

Se reconoce que las proteínas pesticidas pueden ser oligoméricas y variarán en peso molecular, cantidad de residuos, componente de péptidos, actividad contra plagas particulares, y otras características. Sin embargo, por los métodos establecidos en la presente, se pueden aislar y caracterizar las proteínas activas contra diversas plagas. Las proteínas pesticidas de las formas de realización se pueden usar en combinación con otras Bt toxinas particulares u otras proteínas insecticidas a fin de incrementar el rango de objetivo de insectos. Además, el uso de las proteínas pesticidas de las formas de realización en combinación con otras toxinas Bt u otros principios insecticidas de naturaleza diferenciada tiene particular utilidad para la prevención y/o el manejo de la resistencia de insectos. Otros agentes insecticidas incluyen inhibidores de proteasa (de tipo serina y cisteína), a-amilasa, y peroxidasa.

Los fragmentos y variantes del nucleótido y la secuencia de aminoácidos y los polipéptidos así codificados también están abarcados por las formas de realización. Tal como se usa en la presente, el término "fragmento" se refiere a una porción de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido o una porción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de las formas de realización. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa o la correspondiente longitud total y en consecuencia posee actividad pesticida. En consecuencia, se reconoce que parte del polinucleótido y las secuencias de aminoácidos de las formas de realización se pueden referir correctamente como fragmentos y mutantes.

Se debe entender que el término "fragmento" tal como se usar en referencia a las secuencias de ácidos nucleicos de las formas de realización, también abarca secuencias que son útiles como sondas de hibridación. Esta calase de secuencias de nucleótidos generalmente no codifica fragmentos de proteínas que retienen actividad biológica. En consecuencia, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar desde al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la longitud total de la secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas de las formas de realización.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos de las formas de realización que codifica una porción biológicamente activa de una proteína pesticida de las formas de realización codifica al menos 5, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100 ó 1.200 aminoácidos contiguos, o hasta la cantidad total de aminoácidos presente en un polipéptido pesticida de las formas de realización (por ejemplo, 711 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y 712 aminoácidos de la SEQ ID NO: 4). En consecuencia, se entiende que las formas de realización también abarcan polipéptidos que son fragmentos de los ejemplos de proteínas pesticidas de las formas de realización y que tienen longitudes de al menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100 ó 1.200 aminoácidos contiguos, o hasta la cantidad total de aminoácidos presentes en un polipéptido pesticida de las formas de realización (por ejemplo, 711 y 712 aminoácidos para las SEQ ID NOs: 2 y 4, respectivamente). Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las formas de realización que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una proteína pesticida. En consecuencia, un fragmento de un ácido nucleico de las formas de realización puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína pesticida, o puede ser un fragmento que se puede usar como sonda de hibridación o cebador de PCR mediante el uso de métodos descritos en la presente. Una porción biológicamente activa de una proteína pesticida se puede preparar por aislamiento de una porción de una de las secuencias de nucleótidos de las formas de realización, que expresa la porción codificada de la proteína pesticida (por ejemplo, por expresión recombinante in vitró), y evaluar la actividad de la porción codificada de la proteína pesticida.

Los ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las formas de realización comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1.000, 1.200, 1.400, 1.600, 1.800 ó 2.000 nucleótidos, o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos descrita en la presente (por ejemplo, 2.136 y 2139 nucleótidos para la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente). Las formas particulares de realización incluyen fragmentos derivados (por ejemplo, producidos) de un primer ácido nucleico de las formas de realización, en donde el fragmento codifica una toxina truncada caracterizada por la actividad pesticida. Los polipéptidos truncados codificados por los fragmentos de polinucleótido de las formas de realización son caracterizados por la actividad pesticida que es equivalente, o mejorada respecto de la actividad del correspondiente polipéptido de longitud total codificado por el primer ácido nucleico del cual se deriva el fragmento. Se entiende que dichos fragmentos de ácido nucleico de las formas de realización pueden estar truncados en el extremo 3' de la secuencia codificadora nativa o correspondiente de longitud total. Los fragmentos de ácido nucleico también pueden estar truncados en ambos extremos 5' y 3' de la secuencia codificadora nativa o correspondiente de longitud total.

El término "variantes" se usa en la presente en referencia a secuencias sustancialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes conservadoras incluyen las secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican las secuencias de aminoácidos de uno de los polipéptidos pesticidas de las formas de realización. Las variantes alélicas naturales tales como estas pueden ser identificadas mediante el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación tal como se reseña en la presente.

Las secuencias variantes de nucleótidos también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas por síntesis, tales como las generadas, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida a sitio, pero aún codifican una proteína pesticida de las formas de realización, tal como una toxina muíante. Generalmente, las variantes de una secuencia particular de nucleótidos de las formas de realización tendrá al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más identidad de secuencia con la secuencia particular de nucleótidos determinada por programas de alineamiento de secuencia descritas en otra parte de la presente mediante el uso de parámetros predeterminados. Una variante de una secuencia de nucleótidos de las formas de realización puede diferir de la secuencia en apenas 1-15 nucleótidos, apenas 1-10, tales como 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2, o incluso 1 nucleótido.

Las variantes de una secuencia particular de nucleótidos de las formas de realización (es decir, un ejemplo de secuencia de nucleótidos) también se pueden evaluar por comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una secuencia variante de nucleótidos y el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos referencia. En consecuencia, por ejemplo, se describen los ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido con determinado porcentaje de identidad de secuencia respecto del polipéptido de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos polipéptidos se puede calcular mediante el uso de programas de alineamiento de secuencia descritos en otra parte en la presente mediante el uso de parámetros predeterminados. Cuando se evalúa cualquier par dado de polinucleótidos de las formas de realización por comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificado es de al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, generalmente al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, o al menos aproximadamente 98%, 99% o más de identidad de secuencia.

Tal como se usa en la presente, la expresión "proteína variante" abarca polipéptidos derivados de una proteína nativa por: deleción (denominada truncación) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. En consecuencia, el término "proteína variante" abarca fragmentos biológicamente activos de una proteína nativa que comprende una cantidad suficiente de residuos contiguos de aminoácido para retener la actividad biológica de la proteína nativa, es decir, para tener actividad pesticida. Dicha actividad pesticida puede ser diferente o mejorada respecto de la proteína nativa o puede no estar modificada, siempre que mantenga la actividad pesticida.

Las proteínas variantes abarcadas por las formas de realización son biológicamente activas, es decir que continúan en posesión de la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad pesticida descritas en la presente. Dichas variantes pueden ser el resultado de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína nativa pesticida de las formas de realización tendrá al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa determinada por programas de alineamiento de secuencia descritos en otra parte en la presente usando parámetros predeterminados. Una variante biológicamente activa de una proteína de las formas de realización puede diferir de dicha proteína en apenas 1-15 residuos de aminoácido, apenas 1-10, tales como 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido.

Las formas de realización también abarcan un microorganismo que es transformado con al menos un ácido nucleico de las formas de realización, con un cásete de expresión que comprénde el ácido nucleico, o con un vector que comprende el cásete de expresión. En algunas formas de realización, el microorganismo es uno que se multiplica en las plantas. Una forma de realización de la invención se refiere a una proteína pesticida encapsulada que comprende un microorganismo transformado capaz de expresar al menos una proteína pesticida de las formas de realización.

Las formas de realización proveen composiciones pesticidas que comprenden un microorganismo transformado de las formas de realización. En dichas formas de realización, el microorganismo transformado generalmente está presente en la composición pesticida en una cantidad efectiva como pesticida, junto con un portador adecuado. Las formas de realización también abarcan composiciones pesticidas que comprenden una proteína aislada de las formas de realización, sola o en combinación con un organismo transformado de las formas de realización y/o una proteína pesticida encapsulada de las formas de realización, en una cantidad efectiva como insecticida, junto con un portador adecuado.

Las formas de realización también proveen un método para incrementar el rango de insectos objetivos mediante el uso de una proteína pesticida de las formas de realización en combinación con al menos otra o "segunda" proteína pesticida. Toda proteína pesticida conocida en la técnica se puede emplear en los métodos de las formas de realización. Dichas proteínas pesticidas incluyen, sin limitaciones, toxinas Bt, inhibidores de proteasa, a-amilasas y peroxidasas.

Las formas de realización también abarcan plantas transformadas o transgénicas que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de las formas de realización. En algunas formas de realización, la planta está transformada en forma estable con una construcción de nucleótido que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de las formas de realización ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal. Tal como se usan en la presente, las expresiones "planta transformada" y "planta transgénica" se refieren a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra en forma estable dentro del genoma de una planta transgénica o transformada de manera tal que el polinucleótido se pasa a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante.

Se debe entender que tal como se usa en la presente el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de planta, o planta cuyo genotipo haya sido alterado por la presencia de ácidos nucleicos heterólogos que incluyen los transgénicos inicialmente así alterados, así como los creados por cruzamientos sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico" tal como se usa en la presente no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo de plantas o por eventos naturales tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante, o mutación espontánea.

Tal como se usa en la presente, el término "planta" incluye plantas enteras, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, y su progenie. Las partes de las plantas transgénicas están dentro del alcance de las formas de realización y comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callos, embriones así como flores, tallos, frutas, hojas, y raíces originadas a partir de plantas transgénicas o su progenie previamente transformada con una molécula de ADN de las formas de realización y que por consiguiente consiste al menos en parte de células transgénicas.

Tal como se usa en la presente, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido de células vegetales de los cuales se pueden regenerar plantas, callos de plantas, nudos de plantas, y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, fruta, granos, mazorcas, marlos, cáscaras, troncos, raíces, puntas de raíces, anteras, y similares. La clase de plantas que se puede usar en los métodos de las formas de realización generalmente es tan amplia como la clase de plantas superiores capaz de ser sometida a técnicas de transformación, incluso plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Dichas plantas incluyen, por ejemplo, Solanum tuberosum y Zea mays.

Si bien las formas de realización no dependen de un mecanismo biológico particular para incrementar la resistencia de una planta a una plaga vegetal, la expresión de las secuencias de nucleótidos de las formas de realización en una planta puede dar por resultado la producción de las proteínas pesticidas de las formas de realización y en un incremento de la resistencia de la planta a una plaga vegetal. Las plantas de las formas de realización se usan en agricultura en métodos para producir un impacto sobre las plagas de insectos. Ciertas formas de realización proveen plantas de cultivo transformadas, tales como, por ejemplo, plantas de maíz, las cuales se usan en métodos par producir impacto sobre plagas de insectos de la planta, tales como, por ejemplo, perforador de maíz europeo.

Una "planta o célula vegetal sujeto" es aquella en la cual se ha efectuado una alteración genética, tal como una transformación, a un gen de interés, o es una planta o célula vegetal que desciende de una planta o célula así alterada y que comprende la alteración. Un "control" o "planta control" o "célula vegetal control" proveen un punto de referencia para medir cambios del fenotipo de la planta o célula vegetal sujeto.

Una planta o célula vegetal control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula de tipo salvaje, es decir, del mismo genotipo que el material de inicio para la alteración genética que dio por resultado la planta o célula sujeto; (b) una planta o célula vegetal del mismo genotipo que el material de inicio pero que ha sido transformada con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto conocido sobre el rasgo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una planta o célula vegetal que es un segregante no transformado entre la progenie de una planta o célula vegetal sujeto; (d) una planta o célula vegetal genéticamente idéntica a la planta o célula vegetal sujeto pero que no está expuesta a condiciones o estímulos que inducirían la expresión del gen de interés; o (e) la propia planta o célula vegetal sujeto, en condiciones en las cuales no se expresa el gen de interés.

Un experto en la técnica reconocerá rápidamente que los adelantos en el campo de la biología molecular tales como mutagénesis específica de sitio y aleatoria, metodologías de reacción en cadena de polimerasa, técnicas de ingeniería de proteínas proveen una extensa colección de herramientas y protocolos adecuados para el uso, a fin de alterar o someter a ingeniería la secuencia de aminoácidos y las secuencias genéticas subyacentes de proteínas de interés agrícola.

En consecuencia, las proteínas de las formas de realización se pueden alterar de diversas maneras que incluyen sustituciones de aminoácidos, deleciones, truncaciones, e inserciones. Los métodos para dichas manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de las proteínas pesticidas se pueden preparar mediante la introducción de mutaciones en un ácido nucleico sintético (por ejemplo, molécula de ADN). Los métodos de mutagénesis y alteraciones de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden introducir cambios designados en una técnica de mutagénesis dirigida a sitio mediada por un oligonucleótido. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de los Estados Unidos N.° 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York), y las referencias allí citadas.

Las secuencias de nucleótidos mutagenizadas de las formas de realización se pueden modificar a fin de cambiar aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 o más de los aminoácidos presentes en la secuencia primaria del polipéptido codificado (por ejemplo SEQ ID NO: 3 que codifica SEQ ID NO: 4).

Alternativamente, se pueden introducir aún más cambios de la secuencia nativa de manera tal que la proteína codificada puede téner al menos aproximadamente 1% o 2%, o aproximadamente 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, o incluso aproximadamente 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, o 25%, 30%, 35%, o 40% o más de los codones alterados, o de otro modo modificados en comparación con la correspondiente proteína de tipo salvaje. De la misma manera, la proteína codificada puede tener al menos aproximadamente 1% o 2%, o aproximadamente 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, o incluso aproximadamente 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, o 25%, 30%, 35%, o 40% o más codones adicionales comparado con la correspondiente proteína de tipo salvaje. Se debe entender que las secuencias de nucleótidos mutagenizadas de las formas de realización pretenden abarcar los péptidos biológicamente funcionales, equivalentes que tienen actividad pesticida, tales como una mayor actividad pesticida determinada por las propiedades antialimentarias contra larvas de perforador de maíz europeo. Dichas secuencias se pueden originar como consecuencia de la redundancia de codones y una equivalencia funcional que se sabe ocurre naturalmente dentro de las secuencias de ácidos nucleicos y las proteínas así codificadas.

Un experto en la técnica reconocerá que las adiciones y/o sustituciones de aminoácido generalmente se basan en la relativa similitud de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, carga, tamaño, y similares. Los ejemplos de grupos de sustitución de aminoácidos que toman adoptan diversas de las anteriores características en consideración son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y Usina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina, e isoleucina.

Las pautas respecto de las adecuadas sustituciones de aminoácido que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden hallar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence ans Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado en la presente por referencia. Se pueden hacer sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido por otro con propiedades similares.

En consecuencia, los genes y secuencias de nucleótidos de las formas de realización incluyen las secuencias naturales y las formas mutantes. De modo similar, las proteínas de las formas de realización abarcan las proteínas naturales y sus formas de variaciones (por ejemplo, polipéptidos truncados) y modificaciones (por ejemplo, mutantes). Dichas variantes continúan en posesión de la actividad pesticida deseada. Obviamente, las mutaciones que se pueden hacer en la secuencia de nucleótidos que codifica la variante no deben ubicar la secuencia fuera del marco de lectura y generalmente no crean regiones complementarias que puedan producir una estructura de mARN secundaria. Ver, publicación de solicitud de patente EP N.° 75.444.

Las deleciones, inserciones, y sustituciones de las secuencias de proteína abarcadas en la presente no pretenden producir cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción, o inserción antes de realizarla, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante ensayos de análisis de rutina, tales como ensayos de alimentación de insectos. Ver, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol. 78: 290-293 y Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485, incorporados en la presente por referencia.

Las variantes de secuencias de nucleótidos y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento de mutagénesis y recombinogénico tal como transferencia de ADN. Mediante dicho procedimiento, una o más secuencias codificadoras diferentes pueden ser manipuladas a fin de crear una nueva proteína pesticida que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se general bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprende regiones de secuencia que tienen sustancial identidad de secuencia y que se pueden recombinar homólogamente in vitro o in vivo. Por ejemplo, mediante este abordaje, se puede transferir la longitud total de las secuencias codificadoras, los motivos de secuencia que codifican a dominio de interés, o cualquier fragmento de una secuencia de nucleótidos de las formas de realización entre las secuencias de nucleótidos de las formas de realización y las correspondientes porciones de otras secuencias de nucleótidos Cry conocidas a fin de obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada.

Las propiedades de interés incluyen, sin limitaciones, la actividad pesticida por unidad de proteína pesticida, estabilidad de proteína, y toxicidad para especies no objetivo, particularmente humanos, ganado en pie, y plantas y microbios que expresan los polipéptidos pesticidas de las formas de realización. Las formas de realización no están ligadas a una estrategia particular de transferencia, sólo que al menos una secuencia de nucleótidos de las formas de realización, o parte de ella, interviene en dicha estrategia de transferencia. La transferencia puede incluir solo las secuencias de nucleótidos descritas en la presente o además puede incluir la transferencia de otras secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica. Las estrategias de transferencia de ADN son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri er al. (1998) Nature 391 :288-291 ; y las patentes de los Estados Unidos Nros. 5.605.793 y 5.837.458.

Las secuencias de nucleótidos de las formas de realización también se pueden usar para aislar las correspondientes secuencias de otros organismos, particularmente otras bacterias, y más particularmente otras cepas de Bacillus. De esta manera, se pueden usar métodos tales como PCR, hibridación, y similares para identificar dichas secuencias sobre la base de su homología de secuencia respecto de las secuencias establecidas en la presente. Las secuencias seleccionadas sobre la base de su identidad de secuencia con la totalidad de las secuencias establecidas en la presente o sus fragmentos están abarcadas por las formas de realización. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descritas. El término "ortólogos" se refiere a los genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como resultado de la especialización. Los genes hallados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteínas codificadas comparten sustancial identidad tal como se define en otra parte en la presente.

Las funciones de los ortólogos a menudo están muy conservadas entre las especies.

En un abordaje por PCR, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos para usar en las reacciones de PCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN a partir de cADN o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación de PCR se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York), en adelante "Sambrook". Ver también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. ( 999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, sin limitaciones, los métodos que utilizan cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores específicos únicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente no coincidentes, y similares.

En las técnicas de hibridación, se usa la totalidad o parte de una secuencia de nucleótidos conocida como sonda que se híbrida selectivamente a otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos genómicos clonados de ADN o fragmentos de cADN (es decir, bibliotecas genómicas o de cADN) de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos genómicos de ADN, fragmentos de cADN, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y se pueden rotular mediante un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. En consecuencia, por ejemplo, se pueden hacer sondas para hibridación mediante el rotulado de oligonucleótidos sintéticos sobre la base de las secuencias de las formas de realización. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación y para la construcción de bibliotecas de cADN y genómicas se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook.

Por ejemplo, se puede usar la totalidad de una secuencia descrita en la presente, o una o más de sus porciones, como sonda capaz de hibridarse específicamente a las correspondientes secuencias y ARN mensajeros. A fin de lograr la hibridación específica según diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son singulares respecto de las secuencias de las formas de realización y generalmente tienen al menos aproximadamente 10 o 20 nucleótidos de longitud. Dichas sondas se pueden usar para amplificar las correspondientes secuencias Cry a partir de un organismo elegido por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias codificadoras adicionales a partir de un organismo de interés o como ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificadoras en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen el análisis por hibridación de bibliotecas de ADN en placas (en placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook).

La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo en condiciones rigurosas. La expresión "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" tal como se usa en la presente se refiere a condiciones en las cuales la sonda se híbrida a su secuencia objetivo en un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces, 5 veces, o 10 veces más que el fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en distintas circunstancias. Mediante el control de la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, se pueden identificar secuencias objetivo que son 100% complementarias con la sonda (sonda homologa). Alternativamente, se pueden ajustar las condiciones de rigurosidad para permitir cierta falta de coincidencia en las secuencias por lo que se detectan menores grados de similitud (sonda heteróloga). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 ó 500 nucleótidos de longitud.

Generalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sales es inferior a aproximadamente 1,5 M de ion Na, generalmente de concentración de aproximadamente 0,01 a 1 ,0 M de ion Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden lograr al adicionar agentes desestabilizantes tales como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja rigurosidad incluyen hibridación con una solución buffer de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS (dodecilsulfato de sodio) a 37 °C, y un lavado en 1X a 2X de SSC (20X de SSC = 3,0 M de NaCI/0,3 M de citrato trisódico) a 50 a 55 °C. Los ejemplos de condiciones de moderada rigurosidad incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, 1 ,0 M de NaCI, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en 0,5X a 1X de SSC a 55 a 60 °C. Los ejemplos de elevadas condiciones de rigurosidad incluyen hibridación en 50% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado final en 0,1X de SSC a 60 a 65 °C durante al menos aproximadamente 20 minutos. Opcionalmente, los buffer de lavado pueden comprender aproximadamente 0, 1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente inferior a aproximadamente 24 horas, usualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es generalmente la función de los lavados poshibridación, en donde los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución del lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, Tm (punto de fusión térmico) se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81 ,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, "% form" es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (con fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de una a secuencia objetivo complementaria se híbrida a una sonda perfectamente coincidente. Los lavados generalmente se realizan al menos hasta alcanzar el equilibrio y se obtiene un bajo nivel de hibridación de fondo, tal como durante 2 horas, 1 hora, o 30 minutos.

Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1% de falta de coincidencia; en consecuencia, se pueden ajustar Tm, condiciones de hibridación, y/o de lavado para hibridarse a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, se puede reducir Tm 10 °C. Generalmente, Las condiciones rigurosas se seleccionan en aproximadamente 5 °C menos que Tm para la secuencia específica y su complemento para una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 , 2, 3 ó 4 °C menos que Tm; las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10 °C menos que Tm; las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11 , 12, 13, 14, 15 ó 20 °C menos que Tm.

Mediante el uso de la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos en la técnica comprenderán que se describen inherentemente las variaciones de la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia resulta ser Tm inferior a 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se puede incrementar la concentración de SSC para poder usar una mayor temperatura. Una guía extensa de hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridation with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nueva York). Ver también Sambrook. En consecuencia, las secuencias aisladas que codifican una proteína Cry de las formas de realización y que se híbrida en condiciones rigurosas a las secuencias Cry descritas en la presente, o a sus fragmentos, están incluidas en las formas de realización.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "sustancial identidad". (a) Tal como se usa en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, como segmento de una longitud total de cADN o secuencia génica, o la totalidad del cADN o secuencia génica. (b) Tal como se usa en la presente, "ventana de comparación" se refiere a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, brechas) comparada con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede medir 30, 40, 50, 100, o más de longitud. Los expertos en la técnica comprenden que para evitar una elevada similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de brechas en la secuencia de polinucleótidos, generalmente se introduce una penalidad de brecha y se resta de la cantidad de coincidencias.

Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. En consecuencia, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos secuencias se puede lograr mediante el uso de un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitantes de dichos algoritmos matemáticos son los algoritmos de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 1-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de alineamiento local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Las implementaciones de computación para estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para comparar secuencias a fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, sin limitaciones: CLUSTAL del programa PC/Gen (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EE.UU.). Los alineamientos que utilizan estos programas se pueden llevar a cabo mediante el uso de parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está bien descrito en Higgins eí al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Se puede usar una tabla de peso de residuos PAM120, una penalidad de longitud de brecha de 12, y una penalidad de brecha de 4 con el programa ALIGN, cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul er al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTN, calificación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de las formas de realización. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, calificación = 50, longitud de palabra = 3, a fin de obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o un polipéptido de las formas de realización. Para obtener alineamientos con brechas con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) tal como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, se puede usar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para llevar a cabo una búsqueda reiterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Ver el sitio de red de National Center for Biotechnology Information en el sitio de la red mundial de ncbi.hlm.nih.gov. También se puede realizar el alineamiento manualmente por inspección.

A menos que se establezca otra cosa, los valores de identidad de secuencia/similitud provistos en la presente se refieren al valor obtenida mediante el uso de GAP Versión 10 usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos que usa peso GAP de 50 y longitud de peso de 3, y la matriz de calificación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos que usa peso GAP de 8 y peso de longitud de 2, y la matriz de calificación BLOSUM62; o cualquiera de los programas equivalentes. El término "programa equivalente" tal como se usa en la presente se refiere a cualquier programa de comparación de secuencias que para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genere un alineamiento que tiene idénticas coincidencias de nucleótidos o residuos de aminoácidos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con el correspondiente alineamiento generado por GAP Versión 10.

GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) supra, para hallar el alineamiento de dos secuencias completas que maximicen la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de brechas. GAP considera todos los posibles alineamientos y posiciones de brecha y crea el alineamiento con la mayor cantidad de coincidencia de bases y la menor cantidad de brechas. Permite proveer una penalidad para la creación de una brecha y una penalidad para la extensión de brecha en unidades de bases coincidentes. GAP debe obtener una ganancia por la penalidad de la creación de brechas con la cantidad de coincidencias para cada brecha que inserta. Si se elige una penalidad de extensión de brecha mayor de cero, GAP debe además, lograr una ganancia por cada brecha insertada de la longitud de la brecha por la penalidad de la extensión de la brecha. Los valores predeterminados de penalidad por creación de brecha y los valores de penalidad por extensión de brecha en Versión 10 del GCG Wisconsin Genetics Software Package para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Pata las secuencias de nucleótidos, la penalidad predeterminada de creación de brecha es de 50, mientras que la penalidad predeterminada por extensión de brecha es 3. Las penalidad por creación de brecha y extensión de brecha se pueden expresar como un entero seleccionado del grupo de enteros que consisten de 0 a 200. En consecuencia, por ejemplo, las penalidades de creación de brecha y de extensión de brecha pueden ser 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayores.

GAP presenta a un miembro de la familia los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro cifras métricas para los alineamientos: calidad, proporción, identidad y similitud. La calidad es la métrica maximizada a fin de alinear las secuencias. La proporción es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. El porcentaje de identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. El porcentaje de similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos enfrentados a las brechas se ignoran. Se califica una similitud cuando el valor de la matriz de calificación para un par de símbolos es superior o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de calificación usada en la Versión 10 de GCG Wisconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). (c) Tal como se usa en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para la máxima correspondencia para una ventana de comparación específica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticos a menudo difieren debido a substituciones conservadoras de aminoácidos, en donde los residuos de aminoácido son sustituidos por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y en consecuencia no cambia las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar para arriba a fin de corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar estos ajustes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Generalmente esto incluye la calificación de una sustitución conservadora como falta de coincidencia parcial más que total, por lo que se incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. En consecuencia, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una calificación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una calificación de cero, una sustitución conservadora recibe una calificación entre cero y 1. La calificación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, tal como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Tal como se usa en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias de alineamiento óptimo para una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, brechas) comparado con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar la cantidad de posiciones en las cuales aparecen bases idénticas de ácidos nucleicos o residuos de aminoácido en ambas secuencias, a fin de dar un número de posiciones coincidentes, dividir la cantidad de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. (e)(¡) La expresión "sustancial identidad" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 70%. 80%, 90%, o 95% o más identidad de secuencia cuando se compara con una secuencia de referencia mediante el uso de uno de los programas de alineamiento descrito usando parámetros estándar. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajusfar adecuadamente para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tener en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, la posición del marco de lectura, y similares. La sustancial identidad de las secuencias de aminoácidos con estos fines generalmente significa la identidad de secuencia de al menos 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% o más Identidad de secuencia.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustanclalmente idénticas ocurre cuando dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan en aproximadamente 5 °C inferior a Tm para la secuencia específica para determinados fuerza iónica y pH. Sin embargo, las condiciones rigurosas abarcan temperaturas en el rango desde aproximadamente 1 °C hasta aproximadamente 20 °C menos que Tm, según el grado deseado de rigurosidad tal como se califica por otra parte en la presente. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas son aún sustanclalmente Idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico mediante el uso del máximo de degeneración de codones permitido por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticos ocurre cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico forma reacciones inmunológicas cruzadas con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. (e)(ii) La expresión "sustancial identidad" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, o más identidad de secuencia respecto de una secuencia de referencia para una ventana de comparación específica. Se puede conducir el óptimo alineamiento con este fin mediante el uso del algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) supra. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas ocurre cuando un péptido forma reacciones inmunológicas con anticuerpos generados contra el segundo péptido. En consecuencia, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos sólo difieren en una sustitución conservadora. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias tal como se observó con anterioridad, excepto en que las posiciones de los residuos que no son idénticos pueden diferir en cambios conservadores de aminoácidos.

El uso de la expresión "construcción de nucleótido" en la presente no pretende limitar las formas de realización a construcciones de nucleótido que comprende ADN. Los expertos en la técnica reconocerán que las construcciones de nucleótidos, particularmente los polinucleótidos y oligonucleótidos compuestos por ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, también se pueden emplear en los métodos destritos en la presente. Las construcciones de nucleótido, los ácidos nucleicos, y las secuencias de nucleótidos de las formas de realización también abarcan todas las formas complementarias de dichas construcciones, moléculas, y secuencias. Además, las construcciones de nucleótido, las moléculas de nucleótido, y las secuencias de nucleótidos de las formas de realización abarcan todas las construcciones de nucleótido, moléculas, y secuencias que se puedan emplear en los métodos de las formas de realización para transformar plantas incluso, sin limitaciones, los comprendidos por desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y sus combinaciones. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen moléculas naturales y los análogos sintéticos. Las construcciones de nucleótido, ácidos nucleicos, y secuencias de nucleótidos de las formas de realización también abarcan todas las formas de construcciones de nucleótido que incluyen, sin limitaciones, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de tallo y bucle, y similares.

Otra forma de realización se refiere a un organismo transformado tal como un organismo que se selecciona del grupo que consiste de células de plantas e insectos, bacterias, levaduras, baculovirus, protozoos, nematodos, y algas. El organismo transformado comprende: una molécula de ADN de las formas de realización, un cásete de expresión que comprende dicha molécula de ADN, o un vector que comprende dicho cásete de expresión, el cual se puede incorporar de manera estable en el genoma del organismo transformado.

Las secuencias de las formas de realización se proveen en construcciones de ADN para la expresión en el organismo de interés. Las construcciones incluyen secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas operativamente a una secuencia de las formas de realización. El término "ligada operativamente" tal como se usa en la presente se refiere a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, ligada operativamente significa que las secuencias de ácidos nucleicos ligadas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificadoras de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura. La construcción además contiene al menos un gen adicional que se cotransforma en el organismo. Alternativamente, los genes adicionales se pueden proveer en múltiples construcciones de ADN.

Dicha construcción de ADN se provee con una pluralidad de sitios de de restricción para la inserción de la secuencia de la toxina Cry bajo la regulación de la transcripción de las regiones reguladoras. La construcción de ADN también puede contener genes de marcadores seleccionares.

La construcción de ADN incluye en la dirección de transcripción 5' a 3': una región de inicio de la transcripción y la traducción (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de las formas de realización, y una región de terminación de la transcripción y la traducción (es decir, región de terminación) funcional en el organismo que actúa como huésped. La región de inicio de la transcripción (es decir, el promotor) puede ser nativo, análogo, extraño o heterólogo respecto del organismo huésped y/o la secuencia de las formas de realización. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. El término "extraño" tal como se usa en la presente indica que el promotor no se encuentra en el organismo nativo en el cual se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de las formas de realización, se pretende que el promotor no es nativo o un promotor natural para la secuencia ligada operativamente de las formas de realización. Tal como se usa en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia codificadora ligada operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga de la secuencia codificadora. Cuando el promotor es una secuencia nativa o natural, la expresión de la secuencia ligada operativamente se altera respecto de la expresión de tipo salvaje, lo cual da por resultado una alteración del fenotipo.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de interés de ADN ligada operativamente, puede ser nativa de la planta huésped, o se puede derivar de otra fuente (es decir, es extraña o heteróloga respecto del promotor, la secuencia de interés, la planta huésped, o cualquiera de sus combinaciones).

Las regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopinsintasa y nopalinasintasa. Ver también Guerineau et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991 ) Ce// 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 : 151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando corresponde, se puede optimizar un ácido nucleico para incrementar la expresión en el organismo huésped. En consecuencia, cuando el organismo huésped es una planta, los ácidos nucleicos sintéticos se pueden sintetizar mediante el uso de codones vegetales preferidos para mejorar la expresión. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para un análisis del uso preferido de codones de huésped. Por ejemplo, si bien las secuencias de ácidos nucleicos de las formas de realización se pueden expresar en especies vegetales de monocotiledóneas y dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para considerar las preferencias de codón específicas y las preferencias de contenido de GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas, dado que se ha demostrado que estas preferencias difieren (Murray eí al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Así, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular se puede derivar de secuencias génicas conocidas provenientes de maíz. El uso de codones de maíz para 28 genes provenientes de plantas de maíz se muestra en la Tabla 4 de Murray eí al., supra. En la técnica se dispone de métodos para sintetizar genes vegetales preferidos. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.° 5.380.831 , y 5.436.391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados en la presente por referencia.

Se conocen modificaciones adicionales de secuencias para mejorar la expresión génica en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme de exones-intrones, repeticiones símil transposones, y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser dañinas para la expresión génica. El contenido de GC de la secuencia se puede ajustar a niveles promedio para determinado huésped celular, calculado por referencia a los genes conocidos que se expresan en la célula huésped. El término "célula huésped" tal como se usa en la presente se refiere a una célula que contiene un vector y sostiene la replicación y/o la expresión del vector de expresión pretendida. Las células huésped pueden ser células procariontes tales como E. coli, o células eucariontes tales como células de levaduras, insectos, anfibios, o mamíferos, o células vegetales monocotiledóneas o dicotiledóneas. Un ejemplo de una célula huésped monocotiledónea es una célula huésped de maíz. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras secundarias previstas de mARN en horquilla.

Los casetes de expresión también pueden contener secuencias guía 5'. Dichas secuencias guías pueden actuar para aumentar la traducción. Las guías de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: guías de picornavirus, por ejemplo, guía EMCV (región no codificadora 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein eí al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); guías de potivirus, por ejemplo, guía TEV (virus de orín de tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), guía MDMV (virus de mosaico enano de maíz), proteína fijadora de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); guía no traducido del mARN de la proteína de cubierta del virus de mosaico de alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling eí al. (1987) Nature 325: 622-625); guía de virus mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology og ARN, ed. Cech (Liss, Nueva York), pp. 237-256); y guía de virus de mancha clorótica de maíz (MCMV) (Lommel eí al. (1991 ) Virology 81 : 382-385). Ver también, Della-Cioppa eí al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968.

Al preparar el cásete de expresión, los diversos fragmentos de ADN se pueden manipular a fin de proveer las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, si corresponde, en el marco de lectura adecuado. Con este fin, se pueden emplear adaptadores o ligadores para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones que intervienen para proveer los sitios de restricción convenientes, la remoción de ADN superfluo, la remoción de sitios de restricción, o similares. Con este fin, se puede utilizar mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, empalme, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Se pueden utilizar numerosos promotores para la puesta en práctica de las formas de realización. Los promotores se pueden seleccionar sobre la base del resultado deseado. Los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, con preferencia de tejido, inducibles, u otros promotores para la expresión en el organismo huésped. Los promotores constitutivos adecuados para el uso en una célula huésped vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en el documento WO 99/43838 y la patente de los Estados Unidos N.° 6.072.050; el promotor nuclear CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubicuitina (Christensen er al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991 ) Theor. Appl. Genet. 81 : 581-588); MAS (Velten er al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente de los Estados Unidos N.° 5.659.026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los analizados en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121 ; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611.

Según el resultado deseado, puede ser beneficioso expresar el gen a partir de un promotor inducible. De particular interés para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de las formas de realización en plantas son los promotores inducibles por heridas. Dichos promotores inducibles por heridas pueden responder al daño causado por la alimentación de insectos, e incluyen el gen inhibidor de proteinasa de papa (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498); wun1 y wun2, patente de los Estados Unidos N.° 5.428.148; win1 y win2 (Stanford eí al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200-208); sistemina (McGurl eí al. (1992) Science 225: 1570-1573); WIP1 (Rohmeier eí al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783-792; Eckelkamp eí al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76); gen MPI (Corderok eí al. (1994) Plant J. 6(2): 141-150); y similares, incorporados en la presente por referencia.

Además, se pueden emplear promotores inducibles por patógenos en los métodos y las construcciones de nucleótidos de las formas de realización. Dichos promotores inducibles por patógenos incluyen los provenientes de proteínas relacionadas con la patogenia (proteínas PR), las cuales son inducidas después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 ,3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi eí al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes eí al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. Ver también el documento WO 99/43819, incorporados en la presente por referencia.

Son de interés los promotores que se expresan localmente en o cerca del sitio de la infección por patógenos. Ver, por ejemplo, Marineau eí al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton eí al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331 ; Somsisch eí al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch eí al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; y Yang (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 14972-14977. Ver también, Chen eí al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang eí al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :2507-251 1 ; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201 ; Siebertz et al. (1989) Plant Ce// 1 :961-968; la patente de los Estados Unidos N.° 5.750.386 (inducible por nematodos); y las referencias allí citadas. De particular interés es el promotor inducible para el gen de maíz PRms, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium moniliforme (ver, por ejemplo, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41 : 189-200).

Se pueden usar promotores regulados por compuestos químicos para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Según el objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible por compuestos químicos, en donde la aplicación del compuesto químico induces la expresión génica, o un promotor represor por compuestos químicos, en donde la aplicación del compuesto químico reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles por compuestos químicos son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitaciones, el promotor de maíz ln2-2, el cual es activado por aseguradores de herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor de maíz GST, que es activado por compuestos electrofílicos hidrofóbicos que se usan como herbicidas preemergentes, y el promotor de tabaco PR-1a, el cual es activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados por compuestos químicos de interés incluyen promotores que responden a esteroides (ver, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10421- 10425 y McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) y los promotores inducibles por tetraciclina y reprimidos por tetraciclinas (ver, por ejemplo, Gatz et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las patentes de los Estados Unidos N.° 5.814.618 y 5.789.156), incorporados en la presente por referencia.

Los promotores específicos de tejido se pueden utilizar para dirigir el aumento de la expresión de proteína pesticida dentro de un tejido vegetal particular. Los promotores preferidos de tejido incluyen los estudiados en Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell er al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart er al. (1996) Plant Physiol. 1 12(3):1331-1341 ; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 1 12(2):5 3-524; Yamamoto er al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco er al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; y Guevara-Garda er al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Dichos promotores se pueden modificar, de ser necesario, para una expresión débil.

Los promotores de hoja preferidos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Yamamoto er al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor er a/. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco er a/. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1 129-1 138; y Matsuoka et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

Los promotores preferidos de raíz o específicos de raíz son conocidos y se pueden seleccionar de los muchos disponibles en la bibliografía o aislados de novo de diversas especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hire er al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de glutamina sintetasas específica de raíz de poroto de soja); Keller y Baumgartner (1991 ) Plant Cell 3(10): 1051-1061 (elemento control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de poroto francés); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de raíz del gen de manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao er al. (1991 ) Plant Cell 3(1):1 1-22 (longitud total del clon de cADN que codifica la glutamina sintetasa citosólica (GS), la cual se expresa en raíces y nodulos de la raíz de poroto de soja). Ver también Bogusz er al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641 , en donde se describen dos promotores específicos de raíz aislados de genes de hemoglobina provenientes de la no leguminosa fijadora de nitrógeno Parasponia andersonii y la no legumbre no fijadora de nitrógeno relacionada Trema tomentosa. Los promotores de estos genes se ligaron a un gen informador de ß-glucuronidasa y se introdujeron en la no legumbre Nicotiana tabacum y la legumbre Lotus corniculatus, y en ambas instancias se mantuvo la actividad de promotor específica de raíz. Leach y Aoyagi (1991) describen su análisis de los promotores de los genes de elevada expresión inductora de raíz rolC y roID de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79(1 ):69-76). Estos autores concluyeron que los determinantes incrementadores y ADN preferidos de tejido están disociados en estos promotores. Teeri er al. (1989) usaron fusión génica para lacZ para demostrar que el gen de Agrobacterium T-ADN que codifica octopinasintasa es especialmente activo en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2' es específico de raíz en la planta intacta y es estimulado por la lesión del tejido de la hoja, una combinación especialmente conveniente para el uso cono un gen insecticida o larvicida (ver EMBO J. 8(2): 343-350). El gen TR1 ' fusionado con nptll (neomicinafosfotransferasa II) mostró características similares. Otros promotores con preferencia por la raíz incluyen el promotor de gen VfENOD- GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4)759-772); y el promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4): 681-691. Ver también las patentes de los Estados Unidos Nros. 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; y 5.023.179.

Los promotores con "preferencia por la semilla" incluyen los promotores "específicos de semilla" (los promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como los promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) así como los promotores de "germinación de semillas" (los promotores que están activos durante la germinación de las semillas). Ver Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, incorporado en la presente por referencia. Dichos promotores con preferencia por la semilla incluyen, sin limitaciones, Cim1 (mensaje inducido por citosina); cZ19B1 (zeína de maíz de 19 kDa); y milps (mio-inositol-1-fosfatosintasa) (ver patente de los Estados Unidos N.° 6.225.529, incorporada en la presente por referencia). La gamma zeína y Glob-1 son promotores específicos de endosperma. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, sin limitaciones, ß-faseolina de poroto, napina, ß-conglicinina, lectina de poroto de soja, cruciferina, y similares. Para las monocotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, sin limitaciones, zeína de maíz de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, waxy, shrunken 1 , shrunken 2, globulina 1 , etc. Ver también el documento WO 00/12733, en donde se describen los promotores preferidos de semilla provenientes de los genes end1 y end2; incorporado en la presente por referencia. Un promotor que tiene expresión "preferida" en un tejido particular se expresa en ese tejido con mayor grado que en al menos uno otro tejido vegetal. Algunos promotores con preferencia de tejido muestran la expresión casi exclusivamente en el tejido particular.

Cuando se desea un bajo nivel de expresión, se usan promotores débiles. Generalmente, la expresión "promotor débil" tal como se usa en la presente se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificador a un nivel bajo. Pos niveles de expresión bajos se pretenden niveles de aproximadamente 1/1000 transcripciones hasta aproximadamente 1/100.000 transcripciones hasta aproximadamente 1/500.000 transcripciones. Alternativamente, se reconoce que el término "promotores débiles" también abarca promotores que dirigen la expresión en sólo unas pocas células y no en otras, para dar un bajo nivel total de expresión. Cuando un promotor dirige la expresión en niveles inaceptablemente elevados, las porciones de la secuencia de promotor se pueden eliminar o modificar para disminuir los niveles de expresión.

Dichos promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo el promotor nuclear del promotor Rsyn7 (documento WO 99/43838 y patente de los Estados Unidos N.° 6.072.050), el promotor nuclear 35S CaMV, y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los descritos en las patentes de los Estados Unidos Nros. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121 ; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611 ; incorporados en la presente por referencia.

Generalmente, el cásete de expresión comprende un gen marcador seleccionable para la selección de las células transformadas. Los genes de marcadores seleccionares se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican la resistencia antibióticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas, y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Otros ejemplos de genes marcadores seleccionares adecuados incluyen, sin limitaciones, los genes que codifican resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella er al. (1983) Nature 303:209-213; y Meijer et al. (1991 ) Plant Mol. Biol. 6:807-820); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 270:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille er al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:127-136); bromoxinilo (Stalker et al. (1988) Science 242:419^423); glifosato (Shaw er al. (1986) Science 233:478-481 ; y las solicitudes seriadas de los Estados Unidos Nros. 10/004.357; y 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock er al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511 ; Christopherson et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71 : 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley er al. (1980) en The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al. (1987) Cell 49: 603-612; Figge er a/. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle er al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 5400-5404; Fuerst er al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2549-2553; Deuschle er al. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, Universidad de Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921 ; Labow er a/. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 88: 5072-5076; Wyborski ef al. (1991 ) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chepolillaer. 35: 1591-1595; Kleinschnidt er a/. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, Universidad de Heidelberg; Gossen ef al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 ; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chepolillaer. 36: 913-919; Hlavka ef al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); y Gilí et al. (1988) Nature 334: 721-724. Dichas descripciones se incorporan en la presente por referencia.

La lista anterior de genes marcadores seleccionares no pretende ser limitante. Se puede usar cualquier gen marcador seleccionare en las formas de realización.

Los métodos de las formas de realización incluyen introducir un polipéptido o polinucleótido en una planta. Por "introducir se entiende el significado de presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de manera tal que la secuencia logre acceder al interior de una célula de la planta. Los métodos de las formas de realización no dependen de un método particular para introducir un polinucleótido o polipéptido en una planta, solo dicho polinucleótido o polipéptido accede al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir el polinucleótido o los polipéptidos en las plantas son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitaciones, los métodos de transformación estable, los métodos de transformación transitoria, y los métodos mediados por virus.

Por "transformación estable" se pretende entender que la construcción del nucleótido introducido en una planta se integra al genoma de la planta y es capaz de ser heredado por su progenie. Por "transformación transitoria" se pretende entender que un polinucleótido es introducido en la planta y no se integra en el genoma de la planta o se introduce un polipéptido en una planta.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir las secuencias de nucleótidos en las plantas pueden variar según el tipo de planta o la célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células vegetales y la posterior inserción en el genoma vegetal incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (patentes de los Estados Unidos N.° 5.563.055 y 5.981.840), transferencia directa de gen (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), y aceleración balística de partículas (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos N.° 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; y 5.932.782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); y transformación Lecl (documento WO 00/28058). Pata la transformación de papa ver Tu er al. (1998) Plant Molecular Biology 37: 829-838 y Chong et al. (2000) Transgenic Research 9: 71-78. Se pueden hallar procedimientos adicionales de transformación en Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (poroto de soja); McCabe et al. (1988) Bio Technology 6: 923-926 (poroto de soja); Finer y McMullen (1991) en Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (poroto de soja); Singh ef al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (poroto de soja); Datta ef al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein ef al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (maíz); Klein ef al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes de los Estados Unidos Nros. 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein ef al. (1988) Plant Physiol. 91 : 440-444 (maíz); Fromm ef al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311 : 763-764; patente de los Estados Unidos N.° 5.736.369 (cereales); Bytebier ef al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet ef al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman ef al. (Longman, Nueva York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler ef al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 y Kaeppler ef al. (1992) Tfteor. App/. Genet. 84: 560-566 (transformación mediada por brotes); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 y Christou y Ford (1995) Annals de Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda ef a/. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (maíz via Agrobacterium tumefaciens); que se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.

En formas de realización específicas, las secuencias de las formas de realización se pueden proveer a una planta mediante el uso de una variedad de métodos de transformación transitoria. Dichos métodos de transformación transitoria incluyen, sin limitaciones, la introducción de la proteína de toxina Cry o sus variantes y fragmentos directamente a la planta o la introducción de la transcripción de la toxina Cry en la planta. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, microinyección o bombardeo de partículas. Ver, por ejemplo, Crossway ef al. (1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura ef al. (1986) Plant Sci. 44: 53-58; Hepler er al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 91 : 2176-2180 y Hush er al. (1994) The Journal of Cell Science 107: 775-784, todos los cuales son incorporados en la presente por referencia. Alternativamente, el polinucleótido de la toxina Cry se puede transformar en forma transitoria dentro de la planta mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica. Dichas técnicas incluyen un sistema de vector viral y la precipitación del polinucleótido de manera tal que impide la posterior liberación del ADN. En consecuencia, puede ocurrir la transcripción a partir del ADN ligado a la partícula, pero la frecuencia con la cual es liberado para integrase al genoma es muy reducida. Dichos métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma #P3143).

Son conocidos en la técnica los métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma vegetal. En una forma de realización, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra mediante el uso de un sistema de recombinación específico de sitio. Ver, por ejemplo, los documentos WO 99/25821 , WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 y WO 99/25853, todos los cuales son incorporados en la presente por referencia. Brevemente, el polinucleótido de las formas de realización puede estar contenido en un cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticas. El cásete de transferencia es introducido en una planta que ha incorporado en forma estable en su genoma un sitio objetivo que es flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se provee una recombinasa adecuada y el cásete de transferencia se integra al sitio objetivo.

El polinucleótido de interés se integra sí en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas de acuerdo con vías convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Estas plantas luego se pueden cultivar, y polinizar con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido obtenido contiene la expresión constitutiva o inducible de la característica fenotípica identificada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene en forma estable y se hereda y luego se cosechan las semillas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada.

Las secuencias de nucleótidos de las formas de realización se pueden proveer a la planta al poner en contacto la planta con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, dichos métodos incluyen la incorporación de la construcción de nucleótido de interés dentro de una molécula de ADN o ARN viral. Se reconoce que las proteínas recombinantes de las formas de realización se pueden sintetizar inicialmente como parte de una poliproteína viral, la cual luego puede ser procesada por proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína pesticida deseada. También se reconoce que dicha poliproteína viral, que comprende al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína pesticida de las formas de realización, puede tener la actividad pesticida deseada. Dichas poliproteínas virales y las secuencias de nucleótidos que las codifican están abarcadas por las formas de realización. Los métodos para proveer plantas con construcciones de nucleótido y producir las proteínas codificadas en las plantas, que incluyen moléculas de ADN o ARN viral son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nros. 5.889.191 ; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367; y 5.316.931 ; incorporados en la presente por referencia.

Las formas de realización también se refieren a un material de propagación de una planta transformada de las formas de realización que incluyen, sin limitaciones, semillas, tubérculos, marlos, bulbos, hojas, y recortes de raíces y brotes.

Las formas de realización se pueden usar para la transformación de cualquier especie vegetal, incluso, sin limitaciones, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, sin limitaciones, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, 6. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente las especies de Brassica de utilidad como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz {Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado {Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo dactilar (Eleusine cornearía)), girasol (Helianthus annuus), sasafrás (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), poroto de soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), cajú (Anacardium occidentale), macadam (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera {Beta vulgaris), caña de azúcar {Saccharum spp.), avena, cebada, vegetales, ornamentales, y coniferas.

Los vegetales incluyen tomates {Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), chauchas {Phaseolus vulgaris), porotos lima {Phaseolus limensis), arvejas {Lathyrus spp ), y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), calabaza (C. cantalupensis), y melón escrito (C. meló). Los ornamentales incluyen azalea {Rhododendron spp.), hidrangea {Macrophilla hydrangea), hibiscus {Hibiscus rosasanensis), rosas {Rosa spp.), tulipanes {Tulipa spp.), narcisos {Narcissus spp.), petunias {Petunia hybrida), clavel {Dianthus caryophillus), estrella federal {Euphorbia pulcherrima), y crisantemo. Las coniferas que se pueden emplear en la puesta en práctica de las formas de realización incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino de mar {Pinus taeda), pino eliotis {Pinus elliotii), pino ponderosa {Pinus ponderosa), pino contorta {Pinus contorta), y pino de Monterrey {Pinus radiata); pino de Douglas {Pseudotsuga menziesii); tuya occidental {Tsuga canadensis); abeto de Sitka {Picea glauca); sequoia {Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto plateado {Abies amabilis) y abeto balsámico {Abies balsamea); y cedros tales como cerdo rojo occidental {Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska {Chamaecyparis nootkatensis). Las plantas de las formas de realización incluyen plantas de cultivos (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, poroto de soja, algodón, sasafrás, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), tales como plantas de maíz y poroto de soja.

Los pastos de césped incluyen, sin limitaciones: bluegrass anual (Poa annua); ryegrass anual {Lolium multiflorum); bluegrass de Canadá (Poa compressa); festuca {Festuca rubra); pasto colonial {Agrostis tenuis); pasto rastrero (Agrostis palustris); pasto crespo {Agropyron desertorum); pasto común (Agropyron cristatum); festuca dura (Festuca longifolia); bluegrass de Kentucky (Poa pratensis); pasto de frutales (Dactilis glomerata); ryegrass perenne (Lolium perenne); festuca roja (Festuca rubra); redtop (Agrostis alba); bluegrass duro (Poa trivialis); festuca ovejera (Festuca ovina); bromegrass suave (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); tipolillay (Phleum pratense); bentgrass de terciopelo (Agrostis canina); weeping alkaligrass (Puccinellia distans); wheatgrass occidental(Agropyron smithii); pasto de Bermuda (Cynodon spp.); pasto de St. Augustín (Stenotaphrum secundatum); pasto zoysia (Zoysia spp.); pasto de Bahía (Paspalum notatum); pasto de césped (Axonopus affinis); pasto centípedo (Eremochloa ophiuroides); pasto kikuyu (Pennisetum clandesinum); paspalum de la costa (Paspalum vaginatum); gramilla azul (Bouteloua gracilis); pasto de búfalo (Buchloe dactiloids); gramilla (Bouteloua curtipendulá).

Las plantas de interés incluyen plantas de grano que proveen semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas, y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de granos, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, mijo, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, poroto de soja, colza, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, lino, ricino, oliva, etc. Las plantas leguminosas incluyen porotos y arvejas. Los porotos incluyen guar, poroto pallar, fenugreek, poroto de soja, poroto de jardín, poroto común, mungbean, poroto lima, poroto fava, lentejas, arvejas, etc.

En ciertas formas de realización las secuencias de ácidos nucleicos de las formas de realización se pueden apilar con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés a fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de las formas de realización se pueden apilar con cualquier otro polinucleótido que codifica polipéptidos con actividad pesticida y/o insecticida, tales como otras proteínas Bt tóxicas (descritas en las patentes de los Estados Unidos Nros. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881 ; y Geiser eí al. (1986) Gene 48: 109), pentina (descrita en la patente de los Estados Unidos N.° 5.981.722) y similares. Las combinaciones generadas también incluyen de múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de las formas de realización también se pueden apilar con cualquier otro gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos deseados que incluyen sin limitaciones rasgos deseables para alimentos animales tales como genes de alto contenido de aceite (por ejemplo, patente de los Estados Unidos N.° 6.232.529); aminoácidos equilibrados (por ejemplo hordotioninas (patentes de los Estados Unidos Nros. 5.990.389; 5.885.801 ; 5.885.802; y 5.703.049); cebada elevada en lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; y el documento WO 98/20122) y proteínas altas en metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261 : 6279; Kirihara eí al. (1988) Gene 71 : 359; y Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); mayor digestibilidad (por ejemplo, proteínas de almacenamiento mejoradas (solicitud de los Estados Unidos serie N.° 10/053.410, presentada el 7 de noviembre de 2001 ); y tioredoxinas (solicitud de los Estados Unidos serie N.° 10/005.429, presentado el 3 de diciembre de 2001 )), cuyas descripciones se incorporan en la presente por referencia.

Los polinucleótidos de las formas de realización también se pueden apilar con rasgos deseables para la resistencia a enfermedad o a herbicida (por ejemplo, genes de destoxificación de fumonisina (patente de los Estados Unidos N.° 5.792.931 ); genes de avirulence y resistencia a enfermedad (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78: 1089); mutantes de acetolactatosintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicida tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutaminasintasa tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar); y resistencia a glifosato (gen EPSPS y gen GAT tal como se describe en las solicitudes de los Estados Unidos Nros. de serie 10/004.357; y 10/427.692); y rasgos deseables para procesar o productos de proceso tales como elevado contenido de aceite (por ejemplo, patente de los Estados Unidos N.° 6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de desaturasa de ácidos grasos (patente de los Estados Unidos N.° 5.952.544; documento WO 94/1 1516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintasas (SS), enzimas ramificadoras de almidón (SBE) y enzimas desramificadoras de almidón (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos N.° 5.602.321 ; beta-cetotiolasa, polihidroxibutiratosintasa, y acetoacetil-CoA-reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)), cuyas descripciones son incorporadas en la presente por referencia. También se pueden combinar los polinucleótidos de las formas de realización con polinucleótidos que proveen rasgos agronómicos tales como esterilidad masculina (por ejemplo, ver patente de los Estados Unidos N.° 5.583.210), resistencia del tallo, tiempo de floración, o rasgos de tecnología de transformación tales como regulación del ciclo celular o dirección de genes (por ejemplo los documentos WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), cuyas descripciones son incorporadas incorporados en la presente por referencia.

Testas combinaciones apiladas se pueden crear por cualquier método que incluye sin limitaciones plantas de cultivos cruzados por cualquier metodología convencional o TOPCROSS®, o transformación genética. Si los rasgos se apilan por transformación genética de las plantas, las secuencias de polinucleótidos de interés se pueden combinar en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más rasgos deseados se puede usar como objetivo para introducir otros rasgos por posterior transformación. Los rasgos se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés provistos por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se busca introducir dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en distintos casetes de transformación (trans) o pueden estar contenidas en el mismo cásete de transformación (cis). La expresión de las secuencias puede ser dirigida por el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprime la expresión del polinucleótido de interés. Este se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de rasgos en la planta. También se reconoce que las secuencias de polinucleótidos se pueden apilar en una ubicación genómica deseada mediante el uso de un sistema específico de recombinación. Ver, por ejemplo, los documentos WO 99/25821 , WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 y WO 99/25853, todos los cuales son incorporados en la presente por referencia.

Las composiciones de las formas de realización se usan para proteger plantas, semillas, y productos vegetales de muchas maneras. Por ejemplo, las composiciones se pueden usar en un método que incluye ubicar una cantidad efectiva de la composición pesticida en el ambiente de la plaga por un procedimiento que se selecciona del grupo que consiste de rociado, espolvoreado, voleo, o cubierta de semillas.

Antes de que el material de propagación vegetal (fruta, tubérculo, bulbo, mazorca, grano, semilla), pero especialmente semilla, sea vendido como producto comercial, por lo general se lo trata con una cubierta de protector que comprende herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea junto con otros portadores, agentes tensioactivos, o coadyuvantes promotores de la aplicación de uso habitual en la técnica de la formulación a fin de proveer protección contra el daño causado por plagas bacterianas, fúngicas, o animales. A fin de tratar la semilla, la cubierta de protector se debe aplicar a las semillas por impregnación de los tubérculos o granos con una formulación líquido o por cubierta con una formulación combinada seca o húmeda. Además, en casos especiales, son posibles otros métodos de aplicación a las plantas, por ejemplo, el tratamiento dirigido a los brotes o la fruta.

La semilla de la planta de las formas de realización que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína pesticida de las formas de realización se puede tratar con una cubierta protectora de semillas que comprende un compuesto de tratamiento de semillas, tales como, por ejemplo, captano, carboxina, tram, metalaxilo, pirimifosmetilo, y otros de uso común para el tratamiento de semillas. En una forma de realización, una cubierta protectora que comprende una composición pesticida de las formas de realización se usa sola o en combinación con una de las cubiertas protectoras de semillas usadas habitualmente para el tratamiento de semillas.

Se reconoce que los genes que codifican las proteínas pesticidas se pueden usar para transformar organismos patogénicos de insectos. Dichos organismos incluyen baculovirus, hongos, protozoos, bacterias, y nematodos.

Un gen que codifica una proteína pesticida de las formas de realización se puede introducir a través de un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped se aplica al ambiente, o las plantas o animales. El término "introduce" en el contexto de insertar un ácido nucleico en una célula, significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucarionte o procarionte en la cual el ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN de cromosoma, plásmido, plástido, o mitocondria), convertido en un replicón autónomo, o expresan en forma transitoria (por ejemplo, mARN transfectado).

Se pueden seleccionar los microorganismos huésped conocidos por ocupar la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera, y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de manera tal que sean capaces de competir con éxito en el ambiente particular con los microorganismos de tipo salvaje, proveer el mantenimiento estable y la expresión de los gene que expresan la proteína pesticida, y de preferencia, proveer una mayor protección del pesticida contra la degradación y la inactivación ambiental.

Dichos microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. De particular interés son los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methiüus, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De particular interés son las especies bacterianas de la fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xilinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xili y Azotobacter vinelandii y las especies de levaduras de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. De particular interés son los microorganismos pigmentados.

Se dispone de numerosas formas para introducir un gen que expresa la proteína pesticida en el microorganismo huésped en condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión del gen. Por ejemplo, se pueden construir casetes de expresión que incluyen la construcción del nucleótido de interés ligada operativamente con las señales reguladoras de la transcripción y la traducción para la expresión de las construcciones del nucleótido, y una secuencia de nucleótidos homóloga con una secuencia en el organismo huésped, por lo cual ocurre la integración, y/o un sistema de replicación que es funcional en el huésped, por lo que tiene lugar una integración o mantenimiento estable.

Las señales reguladoras de la transcripción y la traducción incluyen, sin limitaciones, promotores, sitios de inicio de la transcripción, operadores, activadores, mejoradores, otros elementos reguladores, sitios fijadores de ribosomas, un codón de iniciación, señales de terminación, y similares. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nros. 5.039.523 y 4.853.331 ; EPO 0480762A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York), en adelante "Sambrook II"; Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, Nueva York; y las referencias allí citadas.

Las células huésped adecuadas, en las cuales las células que contienen la proteína pesticida son tratadas para prolongar la actividad de las proteínas pesticidas en la célula cuando la célula tratada se aplica al ambiente de las plagas objetivo, pueden incluir procariontes o eucariontes, normalmente limitadas a las células que no producen sustancias tóxicas para los organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, los organismos que producen sustancias tóxicas para organismos superiores pueden ser usados cuando la toxina es inestable o el nivel de aplicación es suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un huésped mamífero. Como huéspedes, de particular interés son los procariontes y los eucariontes inferiores, tales como hongos. Los procariontes ilustrativos, gramnegativos y grampositivos, incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichla, Erwinia, Shigella, Salmonella, y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, tales como Rhizobium; Spirillaceae, tales como fotobacteriias, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter, Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae. Entre los eucariontes están hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, los cuales incluyen levaduras, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces,y levaduras Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, y similares.

Las características de particular interés en la selección de una célula huésped a los fines de la producción de proteína pesticida incluyen la facilidad para introducir el gen de la proteína pesticida en el huésped, la disponibilidad de sistemas de expresión, la eficiencia de la expresión, la estabilidad de la proteína en el huésped, y la presencia de capacidad genéticas auxiliares. Las características de interés para el uso como microcápsula pesticida incluye calidades protectoras del pesticida, tales como gruesas paredes celulares, pigmentación, y empaquetamiento intracelular o formación de cuerpos de inclusión; afinidad de hojas; ausencia de toxicidad para mamíferos; atracción para plagas por ingestión; facilidad para matar y fijar sin dañar la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulación y manipulación, economía, estabilidad de almacenamiento, y similares.

Los organismos huésped de particular interés incluyen levaduras, tales como Rhodotorula spp. , Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (tales como S. cerevisiae), Sporobolomyces spp., organismos fitoplanos tales como Pseudomonas spp. ('tales como P. aeruginosa, P. fluorescens), Erwinia spp., y Flavobacterium spp., y otros de dichos organismos, incluso Bt, E. coli, Bacillus subtilis, y similares.

Los genes que codifican las proteínas pesticidas de las formas de realización se pueden introducir en microorganismos que se multiplican en plantas (epífitas) para proveer proteínas pesticidas a posibles plagas objetivo. Las epífitas, por ejemplo, pueden ser bacterias grampositivas o gramnegativas.

Las bacterias colonizadoras de las raíces, por ejemplo, se pueden aislar de la planta de interés por métodos conocidos en la técnica. Específicamente, se puede aislar una cepa de Bacillus cereus que coloniza las raíces de una (ver, por ejemplo, Handelsman et al. (1991 ) Appl. Environ. Microbio!. 56:713-718). Los genes que codifican las proteínas pesticidas de las formas de realización pueden ser introducidas a un Bacillus cereus colonizante de raíces por métodos estándar conocidos en la técnica.

Los genes que codifican proteínas pesticidas pueden ser introducidos, por ejemplo, en el Bacillus coloniante de raíz mediante electrotransformación. Específicamente, los genes que codifican las proteínas pesticidas pueden ser clonados en un vector de transferencia, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218. El vector de transferencia pHT3101 que contiene la secuencia codificadora del gen particular de proteína pesticida, por ejemplo, puede ser transformado en el Bacillus colonizador de raíz por electroporación (Lerecius er a/. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 21 1-218).

Se pueden diseñar sistemas de expresión para que las proteínas pesticidas puedan ser secretadas fuera del citoplasma de bacterias gramnegativas, tales como E. coli, por ejemplo. Las ventajas de tener proteínas pesticidas secretadas son: (1) se evitan los posibles efectos citotóxicos de la proteína pesticida expresada; y (2) mejoramiento de la eficiencia de purificación de la proteína pesticida, incluso, sin limitaciones, mayor eficiencia en la recuperación y purificación de la proteína por volumen de caldo celular y reducción del tiempo y/o los costos de recuperación y purificación por unidad de proteína.

Las proteínas pesticidas se pueden preparar para ser secretadas por E. coli, por ejemplo, al fusionar un péptido señal adecuado de E. coli al extremo aminoterminal de la proteína pesticida. Los péptidos señal reconocidos por E. coli se pueden hallar en proteínas ya conocidas por ser secretadas por E. coli, por ejemplo la proteína OmpA (Ghrayeb et al. (1984) EMBO J, 3:2437-2442). OmpA es una proteína importante de la membrana externa de E. coli, y en consecuencia se cree que este péptido señal es eficiente para el proceso de traslocación. Además, el péptido señal OmpA no requiere ser modificado antes del procesamiento, como puede ser el caso de otros péptidos señal, por ejemplo el péptido señal de la lipoproteína (Duffaud et al. (1987) Meth. Enzymol. 153: 492).

Las proteínas pesticidas de las formas de realización se pueden fermentar en un huésped bacteriano y la bacteria obtenida se procesa y se usa como rocío microbiano de la misma manera que se han usado las cepas Bt como rocíos insecticidas. En el caso de una proteína pesticida que es secretada por Bacillus, la señal de secreción se extrae o muta mediante procedimientos conocidos en la técnica. Dichas mutaciones y/o deleciones impiden la secreción de la proteína pesticida al medio de cultivo durante el proceso de fermentación. Las proteínas pesticidas son retenidas dentro de la célula, y las células luego son procesadas para producir las proteínas pesticidas encapsuladas. Cualquier microorganismo adecuado se puede usar con este fin. Se ha usado Pseudomonas para expresar toxinas Bt como proteínas encapsuladas y las células obtenidas se procesan y rocían como insecticida (Gaertner et al. (1993), en: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim).

Alternativamente, las proteínas pesticidas se producen al introducir un gen heterólogo en un huésped celular. La expresión del gen heterólogo da por resultado, en forma directa o indirecta, la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. Estas células luego son tratadas en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de las plagas objetivo. El producto obtenido retiene la toxicidad de la toxina. Estas proteínas pesticidas naturalmente encapsuladas luego se pueden formular de acuerdo con técnicas convencionales para la aplicación al ambiente que aloja una plaga objetivo, por ejemplo, suelo, agua, y follaje de las plantas. Ver, por ejemplo el documento EPA 0192319, y las referencias citadas allí.

En las formas de realización, se puede formular un microorganismo transformado (que incluye organismos enteros, células, espora(s), proteínas pesticidas, componentes pesticidas, componentes que producen impacto en las plagas, mutantes, células muertas o vivas y componentes celulares, incluso mezclas de células muertas y vivas y componentes celulares, e incluyen células rotas y componentes celulares) o una proteína pesticida aislada con un portador aceptable en una composición pesticida que es por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo para espolvorear, un gránulo dispersable o sedimento, un polvo humectable, y un concentrado emulsionable, un aerosol o rocío, un gránulo impregnado, un coadyuvante, una pasta para recubrir, un coloide, y también encapsulaciones, por ejemplo, en sustancias poliméricas. Dichas composiciones formuladas se pueden preparar por medios convencionales tales como desecación; liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido.

Dichas composiciones descritas con anterioridad se pueden obtener por adición de un agente tensioactivo, un portador inerte, un conservador, un humectante, un estimulante de la alimentación, un atractor, un agente encapsulante, un aglutinante, un emulsificante, un colorante, un protector de UV, un buffer, un agente de flujo o fertilizante, donantes de micronutrientes, u otras preparaciones que influyen sobre el crecimiento de la planta. Se pueden combinar uno o más compuestos agroquímicos que incluyen, sin limitaciones, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, acaricidas, reguladores del crecimiento de las plantas, auxiliares de la cosecha, y fertilizantes, con portadores, agentes tensioactivos o coadyuvantes comúnmente usados en la técnica de la formulación u otros componentes para facilitar la manipulación del producto y la aplicación a plagas objetivo particulares. Los portadores y coadyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias comúnmente empleadas en la tecnología de la formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, viscosantes, aglutinantes, o fertilizantes. Los ingredientes activos de las formas de realización normalmente se aplican en la forma de composiciones y se pueden aplicar a la superficie de cultivo, planta, o semilla a tratar. Por ejemplo, las composiciones de las formas de realización se pueden aplicar a granos en preparación o durante el almacenamiento en un granero o silo, etc. Las composiciones de las formas de realización se pueden en forma simultánea o sucesiva con otros compuestos. Los métodos para aplicar un ingrediente activo de las formas de realización o una composición agroquímica de las formas de realización que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas de bacterias de las formas de realización incluyen, sin limitaciones, la aplicación foliar, la cubierta de semillas, y la aplicación sobre el suelo. La cantidad de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, sin limitaciones, compuestos aniónicos tales como un carboxilato, por ejemplo, de un metal; un carboxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o diésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol graso o las sales de dichos ésteres; sulfatos de alcohol graso tales como dodecilsulfato de sodio, octadecilsulfato de sodio o cetilsulfato de sodio; sulfatos etoxilados de alcohol graso; sulfatos etoxilados de alquilfenol; ligninosulfonatos; sulfonatos de petróleo; alquilarilsulfonatos tales como alquilbencenosulfonatos o alquilo inferior naftalenosulfonatos, por ejemplo, butilnaftalenosulfonato; sales de condensados de naftalenformaldehído sulfonatados; sales de condensados de fenol-formaldehído sulfonatado; sulfonatos más complejos tales como los amidsulfonatos, por ejemplo, el producto de condensación sulfonated de ácido oleico y N-metiltaurino; o los dialquilsulfosuccinatos, por ejemplo, el sulfonatp de sodio de dioctiisuccinato. Los agentes no iónicos incluyen productos de condensación de ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas de ácidos grasos o fenoles grasos sustituidos con alquilo o alquenilo con óxido de etileno, ésteres grasos de éteres de alcohol polihídrico, por ejemplo, ésteres de ácido graso de sorbitano, productos de condensación de dichos ésteres con óxido de etileno, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitano, copolímeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como 2,4,7, 9-tetraetil-5— decin— 4,7-diol, o glicoles acetilénicos acetilados. Los ejemplos de un agente tensioactivo catiónico incluyen, por ejemplo, una mono-, di- o poliamina alifática tales como un acetato, naftenato u oleato; o amina que contiene oxígeno como un óxido de amina de polioxietilenalquilamina; una amina unida a amida preparada por condensación de un ácido carboxílico con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternario.

Los ejemplos de materiales inertes incluyen, pero sin limitación minerales inorgánicos tales como caolín, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos o materiales botánicos tales como corcho, mazorcas de maíz en polvo, cáscara de maní, cáscara de arroz y cáscaras de nuez.

Las composiciones de las formas de realización pueden estar en una forma apropiada para aplicación directa o como un concentrado de composición primaria que requiere dilución con una cantidad apropiada de agua u otro diluyente antes de aplicación. La concentración pesticida variará según la naturaleza de la formulación particular, específicamente si es un concentrado o si se usa directamente. La composición contiene del 1 al 98% de un portador inerte sólido o líquido y del 0 al 50% ó 0,1 al 50% de un tensioactivo. Estas composiciones se administrarán en la tasa rotulada para el producto comercial, por ejemplo, aproximadamente 0,01 Ib— 5,0 Ib. por acre cuando está en forma seca y a aproximadamente 0,01 pts. - 10 pts. por acre cuando está en forma líquida.

En otra forma de realización, las composiciones, así como los microorganismos transformados y las proteínas pesticidas de las formas de realización se pueden tratar antes de la formulación para prolongar la actividad pesticida cuando se aplica al medio ambiente de una plaga blanco, siempre que el pretratamiento no sea nocivo para la actividad pesticida. Este tratamiento puede ser por medios químicos y/o físicos siempre que el tratamiento no afecte nocivamente las propiedades de las composiciones. Los ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero sin limitación, agentes de halogenación; aldehidos tales como formaldehído y glutaraldehído; agentes antiinfecciosos tales como cloruro de zefirano; alcoholes tales como isopropanol y etanol; y fijativos histológicos tales como fijativo de Bouin y fijativo de Helly (ver, por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W. H. Freeman and Co.).

En otras formas de realización, puede ser ventajoso tratar los polipéptidos de toxina Cry con una proteasa, por ejemplo, tripsina, para activar la proteína antes de la aplicación de una composición proteica pesticida de las formas de realización al medio ambiente de la plaga blanco. Los métodos para la activación de la protoxina por una serina proteasa son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454 y Carroll y Ellar (1989) Biochem. J. 261 :99-105, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente por referencia. Por ejemplo, un protocolo de activación apropiado incluye, pero sin limitación, la combinación de un polipéptido por activar, por ejemplo, un nuevo polipéptido Cry purificado (por ejemplo, con una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4), y tripsina en una relación en peso de 1/100 de proteína/tripsina en 20 nM de NaHC03, pH 8 y digestión de la muestra a 36 °C durante 3 horas.

Las composiciones (incluyendo los microorganismos transformados y proteínas pesticidas de las formas de realización) se pueden aplicar al medio ambiente de una plaga de insectos por, por ejemplo, pulverización, atomización, espolvoreado, esparcido, recubrimiento o vertido, introducción en o sobre el suelo, introducción en el agua de irrigación, por tratamiento de semillas o aplicación general o espolvoreo en el momento en que la plaga comenzó a aparecer o antes de la aparición de las plagas como medida de protección. Por ejemplo, la proteína pesticida y/o los microorganismos transformados de las formas de realización se pueden mezclar con granos para proteger a dicho grano durante el almacenamiento. En general, es importante obtener un buen control de plagas en las primeras etapas del crecimiento de las plantas, porque este es el momento en el que la planta se puede dañar severamente en la mayoría de los casos. Las composiciones de las formas de realización pueden contener convenientemente otro insecticida si se cree necesario. En una forma de realización, la composición se aplica directamente sobre el suelo, al momento de la plantación, en forma granular de una composición de un portador y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de las formas de realización. Otra forma de realización es una forma granular de una composición que comprende un producto agroquímico como, por ejemplo, un herbicida, un insecticida, un fertilizante, un portador inerte y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de las formas de realización.

Los expertos en la técnica reconocerán que no todos los compuestos son igualmente efectivos contra todas las plagas. Los compuestos de las formas de realización muestran actividad contra plagas de insectos, que pueden incluir estructuras económicamente importantes de agronomía, forestación, invernadero, viveros, ornamentales, alimentación y fibras, salud pública y animal, hogares y comercios, domicilios, y plagas de productos almacenados. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados del los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleóptera y Lepidoptera.

Las larvas del orden Lepidoptera incluyen, sin limitaciones, gusanos cascarudos, gusanos cortadores, enrolladores, y heliotinas en la familia Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Sm'ith (gusano cascarudo del otoño); S. exigua Hübner (gusano cascarudo de remolacha); S. litura Fabricius (gusano cortador de tabaco, oruga acuminada); Mamestra configúrate Walker (gusano cascarudo berta); M. brassicae Linnaeus (polilla del repollo); Agrotis ípsilon Hufnagel (gusano cortador negro); A. orthogonia Morrison (gusano cortador del oeste); A. subterránea Fabricius (gusano cortador granulado); Alabama argillacea Hübner (gusano de la hoja de algodón); Tríchoplusia ni Hübner (enrollador de repollo); Pseudoplusia includens Walker (enrollador de poroto de soja); Anticarsia gemmatalis Hübner (oruga de poroto terciopelo); Hypena scabra Fabricius (gusano de trébol verde); Heliothis virescens Fabricius (gusano de brote de tabaco); Pseudaletia unipuncta Haworth (gusano cascarudo); Athetis mindara Barnes y Mcdunnough (gusano cortador de piel rugosa); Euxoa messoria Harris (gusano cortador de lado oscuro); Earias insulana Boisduval (gusano tejedor); £ vittella Fabricius (gusano manchado); Helicoverpa armígera Hübner (gusano norteamericano); H. zea Boddie (gusano de mazorca de maíz o gusano de algodón); Melanchra pida Harris (oruga cebra); Egira (Xilomyges) curialis Grote (gusano cortador de cítricos); perforadores, cascarudos, tejedores, gusanos cónicos, y esquetizadores de la familoa Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (perforador de maíz europeo); Amyelois transitella Walker (gusano naranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (polilla de la harina mediterránea); Cadra cautella Walker (polilla de la almendra); Chilo suppressalis Walker (perforador del tallo de arroz); C. partellus, (perforador de sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (polilla de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (gusano tejedor de raíz de maíz); C. teterrellus Zincken (gusano tejedor de bluegrass); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (enrollador de hoja de arroz); Desmia funeralis Hübner (plegador de hoja de vid); Diaphania hyalinata Linnaeus (gusano del melón); D. nitidalis Stoll (gusano picador); Diatraea grandiosella Dyar (perforador de maíz del sudoeste), D. saccharalis Fabricius (perforador de caña de azúcar); Eoreuma loftini Dyar (perforador de arroz mexicano); Ephestia elutella Hübner (polilla de tabaco (cacao)); Gallería mellonella Linnaeus (polilla cerosa grande); Herpetogramma licarsisalis Walker (gusano tejedor del hollín); Homoeosoma electellum Hulst (polilla del girasol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (perforador de tallo de maíz menor); Achroia grisella Fabricius (polilla cerosa menor); Loxostege sticticalis Linnaeus (gusano tejedor de remolacha); Orthaga thyrisalis Walker (polilla de red de té); Maruca testulalis Geyer (perforador de brote de poroto); Plodia interpunctella Hübner (polilla de harina india); Scirpophaga incertulas Walker (perforador de tallo amarillo); Udea rubigalis Guenée (enrollador de hoja de apio); y enrolladotes de hojas, gusanos de los brotes, gusanos de las semillas, y gusanos de las frutas de la familia Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (gusano de los brotes de cabeza negra del oeste); A. variana Fernald (gusano de los brotes de cabeza negra del este); Archips argyrospila Waiker (enrollador de hojas de árboles frutales); A. rosana Linnaeus (enrollador de hojas europeo); y otras especies de Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rósslerstamm (polilla de verano tortrix); Cochilis hospes Walsingham (polilla de banda de girasol); Cydia latiferreana Walsingham (filbertworm); C. pomonella Linnaeus (polilla codificada); Platynota flavedana Clemens (enrollador de hojas variegado leafroller); P. stultana Walsingham (enrollador de hojas omnívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (polilla de vid europeo); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (polilla de brotes manchada); Endopiza viteana Clemens (polilla de bayas); Eupoecilia ambiguella Hübner (polilla de vid); Bonagota salubricola Meyrick (enrollador de hojas de manzana brasilero); Grapholita molesta Busck (polilla de fruta oriental); Suleima helianthana Riley (polilla de brotes de girasol); Argyrotaenia spp:, Choristoneura spp..

Otras plagas agronómicas seleccionadas del orden Lepidoptera incluyen, sin limitaciones, Alsophila pometaria Harris (fall cankerworm); Anarsia lineatella Zeller (perforador de rama de duraznero); Anisota senatoria J.E. Smith (orange striped oakworm); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Polilla Chínese Oak Tussah); Bombyx morí Linnaeus (gusano de seda); Bucculatríx thurberíella Busck (cotton leaf perforador); Colias eurytheme Boisduval (oruga de alfalfa); Datana integerrima Grote & Robinson (oruga de nogal); Dendrolimus sibirícus Tschetwerikov (polilla Siberian silk), Ennomos subsignaria Hübner (elm spanworm); Erannis tiliaria Harris (enrollador de tilo); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (polilla de cola marrón); Harrisina americana Guérin-Méneville (grapeleaf skeletonizer); Hemileuca oliviae Cockrell (oruga range); Hyphantria cunea Drury (fall webworm); Keiferia lycopersicella Walsingham (pinworm de tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (enrollador Eastern hemlock); L. fiscellaria ¡ugubrosa Hulst (enrollador Western hemlock); Leucoma salicis Linnaeus (polilla de satén); Lymantria dispar Linnaeus (polilla de yeso); Manduca quinquemaculata Haworth (polilla five spotted hawk, hornworm de tomate); M. sexta Haworth (hornworm de tomate, hornworm de tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (polilla de invierno); Paleacrita vernata Peck (cankerworm de primavera); Papilio cresphontes Cramer (giant swallowtail, orange dog); Phryganidia californica Packard (California oakworm); Phillocnistis citrella Stainton (citrus leafminer); Phillonorycter blancardella Fabricius (spotted tentiform leafminer); Pieris brassicae Linnaeus (mariposa blanca grande); P. rapae Linnaeus (mariposa blanca pequeña); P. napi Linnaeus (mariposa blanca con vena verde); Platyptilia carduidactila Riley (polilla de alcaucil); Plutella xilostella Linnaeus (polilla de lomo en rombo); Pectinophora gossypiella Saunders (pink bollworm); Pontia protodice Boisduval & Leconte (Southern cabbageworm); Sabulodes aegrotata Guenée (enrollador omnívoro); Schizura concinna J.E. Smith (oruga roja); Sitotroga cerealella Olivier (polilla Angoumois); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (oruga pine processionary); Tineola bisselliella Hummel (polilla de ropa); Juta absoluta Meyrick (leafminer de tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (polilla ermitaña); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. y Orgyia spp.

Son de interés las larvas y los adultos del orden Coleóptera incluso ácaros de las familias Anthribidae, Bruchidae, y Curculionidae (incluso, sin limitaciones: Anthonomus grandis Boheman (boíl weevil); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (ácaro de arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (ácaro de grano); S. oryzae Linnaeus (ácaro de arroz); Hypera punctata Fabricius (ácaro de hoja de trébol); Cilindrocopturus adspersus LeConte (ácaro de tallo de girasol); Smicronyx fulvus LeConte (ácaro de girasol rojo); S. sordidus LeConte (ácaro de girasol gris); Sphenophorus maidis Chittenden (maíz billbug)); cascarudos de pulgas, cascarudos de pepino, gusanos de raíz, cascarudos de hoja, cascarudos de papa, y cascarudos de raíz de la familia Chrysomelidae (incluso, sin limitaciones: Leptinotarsa decemlineata Say (cascarudo de papa de Colorado); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (gusano de raíz de maíz del oeste); D. barberi Smith & Lawrence (gusano de raíz de maíz del norte ; D. undecimpunctata howardi Barber (gusano de raíz de maíz del sur); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (corn flea beetle); Phillotreta cruciferae Goeze (corn flea beetle); Colaspis brunnea Fabricius (grape colaspis); Oulema melanopus Linnaeus (cereal leaf beetle); Zygogramma exclamaciónis Fabricius (cascarudo de girasol)); cascarudos de la familia Coccinellidae (incluso, sin limitaciones: Epilachna varivestis Mulsant (Mexican bean beetle)); escarabajos y otros ácaros de la familia Scarabaeidae (incluso, sin limitaciones: Popillia japónica Newman (Japanese beetle); Cyclocephala borealis Arrow (northern masked chafer, white grubj; C. immaculata Olivier (southern masked chafer, white grubj; Rhizotrogus majalis Razoumowsky (European chafer); Phillophaga crinita Burmeister (white grub); Ligyrus gibbosus De Geer (cascarudo de zanahoria)); cascarudos de alfombra de la familia Dermestidae; gusanos de cables de la familia Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.¡ Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; cascarudos de la corteza de la familia Scolytidae y cascarudos de la familia Tenebrionidae.

Son de interés los adultos e inmaduros del orden Díptera, incluso ácaros Agromyza parvicornis Loew (corn blotch leafminer); gorgojos (incluso, sin limitaciones: Contarinia sorghicola Coquillett (gorgojo de sorgo); Mayetiola destructor Say (Hessian fly); Sitodiplosis mosellana Géhin (gorgojo de trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (gorgojo de semilla de girasol)); moscas de la fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (mosca de la fruta); orugas (incluso, sin limitaciones: Delia platura Meigen (oruga de semilla de maíz), D. coarctata Fallen (mosca de bulbo de trigo); y otros Delia spp., Meromyza americana Fitch (oruga de tronco de trigo); Musca domestica Linnaeus (mosca doméstica); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (mosquita doméstica); Stomoxys calcitrans Linnaeus (mosca de establo)); moscas de cara, moscas con cuerno, mosquitas, Chrysomya spp.; Phormia spp.; y otras plagas de moscas muscoides, tábanos Tabanus spp.; mosquitas Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; mosca de ganado Hypoderma spp.; mosca del ciervo Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (jejenes); y 0ther Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Simulium spp.; moscas picadoras, moscas de arena, sciárides, y otros Nematocera.

Se incluyen como insectos de interés los adultos y las ninfas de los órdenes Hemiptera y Homoptera tales como, sin limitaciones, adélgidos de la familia Adelgidae, ácaros de plantas de la familia Miridae, chicharras de la familia Cicadidae, langostas saltadoras, Empoasca spp.; de la familia Cicadellidae, langostas verdes de las familias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae y Delphacidae, langostas de árbol de la familia Membracidae, psílides de la familia Psillidae, moscas blancas de la familia Aleyrodidae, áfidos de la familia Aphididae, filoxeras de la familia Philloxeridae, cascarudos de harina de la familia Pseudococcidae, ácaros de las familias Asterolecanidae, Coccidae, Dactilopiidae, Diaspididae, Eriococcidae, Ortheziidae, Phoenicococcidae y Margarodidae, cascarudos de la familia Tingidae, cascarudos picadores de la familia Pentatomidae, chinches, Blissus spp.; y otros cascarudos de semillas de la familia Lygaeidae, cascarudos de la familia Cercopidae cascarudos de zapallo de la familia Coreidae, y cascarudos rojos y del algodón de la familia Pyrrhocoridae.

Los miembros agronómicamente importantes del orden Homoptera también incluyen, sin limitaciones: Acyrthisiphon pisum Harris (áfido de arveja); Aphis craccivora Koch (áfido de poroto); A. fabae Scopoli (áfido de poroto negro); A. gossypii Glover (áfido de algodón, áfido de melón); A. maidiradicis Forbes (áfido de de raíz del maíz); A. pomi De Geer (áfido de manzana); A. spiraecola Patch (áfido de spirea); Aulacorthum solani altenbach (áfido de guante de zorro); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (áfido de frutilla); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (áfido de trigo ruso); Dysaphis plantaginea Paaserini (áfido de manzana roja); Eriosoma lanigerum Hausmann (áfido de manzana); Brevicoryne brassicae Linnaeus (áfido de repollo); Hyalopterus pruni Geoffroy (áfido de ciruela); Lipaphis erysimi Kaltenbach (áfido de nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (áfido de cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (áfido de papa); Myzus persicae Sulzer (áfido de durazno, áfido de durazno verde); Nasonovia ribisnigrí Mosley (áfido de lechuga); Pemphigus spp. (áfido de raíz y de galladura); Rhopalosiphum maidis Fitch (áfido de hoja de maíz); R. padi Linnaeus (áfido de cerezo); Schizaphis graminum Rondani (greenbug); Sipha flava Forbes (áfido de caña de azúcar amarillo); Sitobion avenae Fabricius (áfido de grano inglés); Therioaphis maculata Buckton (áfido de alfalfa moteado); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (áfido de citrus negro); y T. citricida Kirkaldy (áfido de citrus marrón); Adelges spp. (adelgids); Philloxera devastatríx Pergande (pecan philloxera); Bemisia tabaci Gennadius (mosca blanca de tabaco, mosca blanca de batata); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca blanca de silverleaf); Dialeurodes citri Ashmead (mosca blanca de citrus); Trialeurodes abutiloneus (mosca blanca de hoja con banda) y T. vaporariorum Westwood (mosca blanca de invernadero); Empoasca fabae Harris (langosta de papa); Laodelphax striatellus Fallen (langosta marrón); Macrolestes quadrilineatus Forbes (langosta de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (langosta verde); N. nigropictus Stál (langosta de arroz); Nilaparvata lugens Stál (langosta marrón); Peregrinas maidis Ashmead (langosta de maíz); Sogatella furcifera Horvath (langosta de lomo blanco); Sogatodes orizicola Muir (delphacid de arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (langosta de manzana blanca); Erythroneoura spp. (langosta de uva); Magicicada septendecim Linnaeus (chicharra periódica); Icerya purchasi Maskell (cottony cushion scale); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (San José scale); Planococcus citri Risso (citrus mealybug); Pseudococcus spp. (otros complejos de mealybug); Cacopsilla pyricola Foerster (psilla de pera); Trioza diospyri Ashmead (persimmon psilla).

Las especies de importancia agronómica de interés del orden Hemiptera incluyen, sin limitaciones: Acrosternum hilare Say (chinche verde); Anasa tristis De Geer (chinche de zapallo); Blissus leucopterus leucopterus Say (chinche); Corythuca gossypii Fabricius (cascarudo de algodón); Cyrtopeltis modesta Distant (cascarudo de tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Scháffer (cotton stainer); Euschistus servus Say (chinche marrón); E. variolarius Palisot de Beauvois (chinche manchada); Graptostethus spp. (complejo de cascarudos de semillas); Leptoglossus corculus Say (cascarudo de semilla de pino); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (cascarudo moteado); L Hesperus Knight (cascarudo moteado del oeste); L pratensis Linnaeus (cascarudo común); L rugulipennis Poppius (cascarudo moteado europeo); Lygocoris pabulinus Linnaeus (cápside verde común); Nezara viridula Linnaeus (chinche verde del sur); Oebalus pugnax Fabricius (chinche del arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (cascarudo lechoso grande); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga del algodón).

Además, las formas de realización de la presente invención pueden ser efectivas contra Hemiptera tales como, Calocoris norvegicus Gmelin (acaro de la frutilla); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (cápside de mañana); Cyrtopeltis modestus Distant (ácaro de tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca picadora); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga con marca blanca); Diaphnocoris chlorionis Say (cascarudo honeilocust); Labopidicola allii Knight (cascarudo de la cebolla); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga del algodón); Adelphocoris rapidus Say (ácaro rápido); Poecilocapsus lineatus Fabricius (ácaro de cuatro rayas); Nysius ericae Schilling (chinche falsa); Nysius raphanus Howard (chinche falsa); Nezara viridula Linnaeus (chinche verde del sur); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp.; y Cimicidae spp.

También se incluyen los adultos y las larvas del orden Acari (ácaros) tales como Acería tosichella Keifer (ácaro del trigo); Petrobia latens Müller (ácaro marrón del trigo); arañas y ácaros rojos de la familia Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro rojo europeo); Tetranychus urticae Koch (araña de dos motas); (T mcdanieli McGregor (ácaro de McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (araña carmine); T. turkestani Ugarov & Nikolski (araña de la frutilla); ácaro planos de la familia Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano del citrus); roya y ácaro de brotes de la familia Eriophyidae y otros ácaros de alimentación foliar y ácaro importantes para la salud humana y animal, es decir ácaro del polvo de la familia Epidermoptidae, ácaro de folículo de la familia Demodicidae, ácaro de granos de la familia Glycyphagidae, garrapatas del orden Ixodidae. Ixodes scapularis Say (garrapata del ciervo); /. holocyclus Neumann (garrapata australiana); Dermacentor variabilis Say (garrapata del perro); Amblyomma americanum Linnaeus (garrapata americana); y ácaros de escabies y picadores de las familias Psoroptidae, Pyemotidae, y Sarcoptidae.

Las plagas de insectos del orden Thysanura son de interés, tales como Lepisma saccharina Linnaeus (lepisma); Thermobia domestica Packard (termobio).

Otras plagas de artrópodos cubiertas incluyen: arañas del orden Araneae tales como Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (araña reclusa parda); y Latrodectus mactans Fabricius (araña viuda negra); y ciempiés del orden Scutigeromorpha tales como Scutigera coleoptrata Linnaeus (ciempiés doméstico).

Las plagas de insectos se pueden estudiar por la actividad pesticida de las composiciones de las formas de realización en las etapas tempranas de desarrollo, por ejemplo, como larvas u otras formas inmaduras. Los insectos se pueden criar en oscuridad total desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 30 °C y desde aproximadamente 30% hasta aproximadamente 70% de humedad relativa. Los bioensayos se pueden realizar tal como se describe en Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485. Los métodos para criar larvas de insectos y realizar los bioensayos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Una amplia variedad de técnicas de bioensayo son conocidas por los expertos en la técnica. Los procedimientos generales incluyen la adición del compuesto experimental u organismo de la fuente de dieta en un recipiente cerrado. La actividad pesticida se puede medir, sin limitaciones, por cambios de mortalidad, pérdida de peso, atracción, repelencia y otros cambios de comportamiento y físicos después de alimentarse y de la exposición durante un periodo adecuado. Los bioensayos descritos en la presente se pueden usar con cualquier plaga de insectos que se alimenten en la etapa de larva o adulto.

Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración, no como limitación.

EXPERIMENTAL Ejemplo 1 : Bioensayo para pruebas de la actividad pesticida de la toxina de fi. thuríngiensis contra insectos seleccionados Se condujeron bioensayos para evaluar los efectos del péptido de la toxina insecticida Bt, establecida en SEQ ID NO: 2, sobre diversas especies de lepidópteros tal como se muestra en la Tabla 1. Los ensayos de alimentación se condujeron con una dieta artificial que contiene la proteína insecticida. La proteína insecticida se aplicó tópicamente mediante el uso de una dieta artificial específica para lepidópteros. La toxina se aplicó con una tasa de 0,3 pg por 25 pL de muestra por cavidad y se dejó secar. La proteína está en 10 mM de buffer de carbonato a un pH de 10. Se colocó una larva recién nacida en cada cavidad para alimentar ad libitum durante 5 días. Los resultados se expresaron como positivos para reacciones de la larva tales como inmovilización y /o mortalidad. Los resultados se expresaron como negativos si las larvas eran similares al control negativo que se alimentó de dieta a la que solo se aplicó el buffer anterior.

Tabla 1 : Resultados del bioensayo de alimentación para SEQ ID NO: 2 Insecto estudiado Resultado perforador de maíz europeo (Ostrinia nubilalis) + Gusano de mazorca de maíz (Helicoverpa + zea) Enrollador de poroto de soja (Pseudoplusia + includens) Oruga de poroto terciopelo Caterpillar + {Anticarsia gemmatalis) Gusano cortador negro (Agrotis Ípsilon) + Gusano cascarudo del otoño (Spodoptera frugiperda) Ejemplo 2: Determinación de LC50 Se condujeron bioensayos para determinar una LC50 del péptido de toxina insecticida, establecido en SEQ ID NO: 2, en perforador de maíz europeo (Ostrinia nubilalis), gusano de mazorca de maíz (Helicoverpa zea), gusano cortador negro (Agrotis ípsilon), gusano cascarudo del otoño (Spodoptera frugiperda), enrollador de poroto de soja (Pseudoplusia includens) y oruga de poroto terciopelo (Anticarsia gemmatalis). Los ensayos de alimentación se condujeron con una dieta artificial que contenía la proteína insecticida. La proteína insecticida se diluyó con 10 mM de buffer carbonato a pH 10 y con dieta de insectos para dar una concentración final de toxina de 1000, 100, 50, 10, 1 y 0, 1 ppm. Una larva recién nacida se colocó en cada cavidad para alimentación ad libitum durante 5 días. Cada bioensayo se llevó a cabo con ocho duplicados para cada dosis y el bioensayo se replicó tres veces. Los resultados se expresaron como LC50 para mortalidad. Los resultados de los estudios de LC50 para el péptido de toxina insecticida se establecieron en la Tabla 2.

Tabla 2: Resultados de LC50 GS018 LC50 ppm perforador de maíz europeo 21 ,30 (13,12-32,09) Gusano de mazorca de maíz 96,33 (73,49-135,1 ) Gusano cortador negro >200 Gusano cascarudo del otoño >200 Enrollados de poroto de soja 10, 11 Oruga de poroto terciopelo 42,3 Ejemplo 3: Transformación de maíz por bombardeo de partículas regeneración de plantas transgénicas Embriones inmaduros de maíz provenientes de plantas donantes de invernadero se bombardearon con una molécula de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de la toxina (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ó 3) ligada operativamente a un promotor de ubicuitina y el gen de marcador seleccionable PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25-37), el cual confiere resistencia al herbicida Bialaphos. Alternativamente, el gen de marcador seleccionable se provee en una molécula de ADN diferente. La transformación se realiza como sigue. Las recetas de los medios siguen a continuación.

Preparación del tejido objetivo Las mazorcas se pelan y se esterilizan en superficie en 30% de blanqueador CLOROX™ más 0,5% de detergente Micro durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extraen y se colocan con el lado del eje del embrión hacia abajo (el lado del escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, en medio 560Y durante 4 horas y luego se alinean dentro de la zona objetivo de 2, 5 cm en preparación para el bombardeo.

Preparación de ADN Se preparar un vector plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos de toxina (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ó 3) ligada operativamente a un promotor de ubicuitina. Por ejemplo, un vector de transformación adecuado comprende un promotor UBI1 de Zea mays, un 5' UTR de UBI1 y un intrón UBI1 , en combinación con un terminador Pinll. El vector también contiene un gen marcador seleccionare PAT dirigido por un promotor CA V35S y que incluye un terminador CAMV35S. Opcionalmente, el marcador seleccionare puede residir en un plásmido separado. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de toxina así como un marcador seleccionable PAT se precipita sobre 1 , 1 µ?? (diámetro promedio) de pellet de tungsteno mediante un procedimiento de precipitación de CaC^ como sigue: 100 µ?. de partículas preparadas de tungsteno en agua 10 µ?_ (1 µg) de ADN en buffer Tris EDTA (1 µg total de ADN) lOQ^L de ^S-M de CaCfe 10 µ?_ 0,1 M de espermidina Cada reactivo se agrega en secuencia a una suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene en un agitador multitubo. La mezcla final se sónica brevemente y se deja incubar con inversión continua durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se extrae el líquido, se lavan con 500 ml_ de 100% de etanol, y se centrifugan durante 30 segundos. Nuevamente se extrae el líquido, y se añade 105 µ?_ de 100% de etanol al sedimento final de partículas de tungsteno. Para el bombardeo con pistola partículas, las partículas de tungsteno/ADN se sonican brevemente y se colocan 10 µ?_ en el centro de cada macroportador y se deja secar durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.

Tratamiento de la pistola de partículas Las placas de muestra se bombardean en nivel #4 de la pistola de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un único disparo a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo partículas preparadas/ADN.

Tratamiento posterior Después del bombardeo, los embriones se mantienen en medio 560Y durante 2 días, luego se transfieren a medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos, y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, se transfieren los clones de callos resistentes a la selección a medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración somática de los embriones (2-4 semanas), los embriones somáticos bien desarrollados son transferidos a medio de germinación y se transfieren a la sala de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días después, se transfieren las plantas en desarrollo a medio 272V sin hormonas en tubos durante 7-10 días hasta que los plantines están bien establecidos. Las plantas luego son transferidas en placas (equivalentes a macetas de 2,5") que contienen tierra de macetas y se cultivan durante 1 semana en cámara de cultivo, luego se cultivan durante otras 1-2 semanas en el invernadero, luego se transfieren a macetas clásicas de 600 (1 ,6 galones) y se dejan crecer hasta la maduración. Las plantas se monitorean y califican respecto de la expresión de la toxina por ensayos conocidos en la técnica o tal como se describió con anterioridad.

Bombardeo y medio de cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-14 6), 1 ,0 mL/L de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-15 1), 0,5 mg/L de tiamina HCI, 120,0 g/L de sacarosa, 1 ,0 mg/L de 2,4-D, y 2,88 g/L de L-prolina (llevado a volumen con di H20 seguido de ajuste de pH 5,8 con KOH); 2,0 g/L de Gelrite™ (añadido después de llevar a volumen con di H20); y 8,5 mg/L de nitrato de plata (añadido después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende 4,0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 mlJL de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-1511 ), 0,5 mg/L de tiamina HCI, 30,0 g/L de sacarosa, y 2,0 mg/L de 2,4-D (llevado a volumen con dl H20 seguido de ajuste de pH 5,8 con KOH); 3,0 g/L de Gelrite™ (añadido después de llevar a volumen con dl H20); y 8,5 mg/L de nitrato de plata y 3,0 mg/L de Bialaphos (ambos añadidos después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente).

El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4,3 g/L de sales de MS (GIBCO 1 1117-074), 5,0 mL/L de solución madre de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCI, 0,10 g/L de piridoxina HCI, y 0,40 g/L de glicina llevado a volumen con D-l H20 pulido) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473), 100 mg/L de mioinositol, 0,5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarosa, y 1 ,0 mL/L de 0,1 mM de ácido abscísico (llevado a volumen con dl H20 después de ajustar el pH 5,6); 3,0 g/L de Gelrite™ (añadido después de llevar a volumen con di H20); y 1 ,0 mg/L de ácido indolacético y 3,0 mg/L de Bialaphos (añadido después de esterilizar el medio y enfriar a 60 °C).

El medio sin hormonas (272V) comprende 4,3 g/L de sales de MS (GIBCO 1 11 17-074), 5,0 mL/L de solución madre de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCI, 0, 10 g/L de piridoxina HCI, y 0,40 g/L de glicina llevado a volumen con dl H20), 0,1 g/L de mioinositol, y 40,0 g/L de sacarosa (llevado a volumen con dl H20 después de ajustar el pH a 5,6); y 6 g/L de Bacto-agar (añadido después de llevar a volumen con dl H20), esterilizado y enfriado a 60 °C.

Ejemplo 4: Transformación de maíz mediada por Agrobacterium y regeneración de plantas transgénicas Para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium con una secuencia de nucleótidos de toxina (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ó 3), se puede usar el método de Zhao (patente de los Estados Unidos N.° 5.981.840, y la publicación de patente PCT W098/32326; cuyos contenidos se incorporan así por referencia). Brevemente, se aislan los embriones inmaduros de maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium en condiciones en las cuales la bacteria es capaz de transferir la secuencia de nucleótidos de toxina (SEQ ID NO: 1 ó 3) al menos a una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1 : etapa de infección). En esta etapa se pueden sumergir los embriones inmaduros en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones se cocultivan durante cierto tiempo con Agrobacterium (etapa 2: etapa de cocultivo). Los embriones inmaduros se pueden cultivar en medio sólido luego de la etapa de infección. Después de este periodo de cocultivo se contempla una etapa opcional de "reposo". En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un antibiótico conocido por inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin adicionar un agente selectivo para transformantes vegetales (etapa 3: etapa de reposo). Los embriones inmaduros se pueden cultivar en medio sólido con antibótico, pero sin un agente de selección para la eliminación de Agrobacterium y durante una fase de reposo para las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivan en medio que contiene un agente selectivo y se recupera el callo transformado en crecimiento (etapa 4: etapa de selección). Los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con un agente selectivo para dar como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. El callo luego se regenera en plantas (etapa 5: etapa de regeneración), y los callos cultivados en medio selectivo se pueden cultivar en medio sólido para regenerar las plantas.

Ejemplo 5: Transformación de embriones de poroto de soja Los embriones de poroto de soja se bombardean con un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos de toxina de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 ligada operativamente a un promotor pinll como sigue. Para inducir los embriones somáticos, los cotiledones de 3-5 mm de longitud disecados de las semillas inmaduras esterilizadas en superficie de un cultivar adecuado de poroto de soja se cultivan en la luz o la oscuridad a 26 °C en un medio de agar adecuado durante seis a diez semanas. Luego se extraen los embriones somáticos que producen embriones secundarios y se colocan en un medio líquido adecuado. Luego de la selección repetida de cúmulos de embriones somáticos que se multiplican como embriones tempranos de etapa globular, las suspensiones se mantienen tal como se describe a continuación.

Los cultivos en suspensión embriogénicos de poroto de soja se pueden mantener en 35 mL de medio líquido en un agitador rotatorio, 150 rpm, a 26 °C con luces fluorescentes con un esquema de 16:8 horas de día/noche. Los cultivos subcultivan cada dos semanas por inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio líquido.

Los cultivos en suspensión embriogénicos de poroto de soja luego se pueden transformar por el método de bombardeo de pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature (London) 327: 70-73, patente de los Estados Unidos N.° 4.945.050). Se puede usar un instrumento Du Pont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste de helio) para estas transformaciones.

Un gen de marcador seleccionable que se puede usar para facilitar la transformación de poroto de soja es un transgén compuesto por promotor 35S proveniente de virus mosaico de coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), el gen de higromicina fosfotransferasa proveniente del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25: 179-188), y la región 3' del gen de nopalinasintasa del T-ADN del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. El cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de toxina (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ó 3) ligada operativamente al promotor pinll se puede aislar como fragmento de restricción. Este fragmento luego se puede insertar en un único sitio de restricción del vector portador del gen marcador.

A 50 pL de una suspensión de 60 mg/mL 1 µ?t? de partículas de oro se añade (en orden): 5 pL de ADN (1 pg/pL), 20 pL de espermidina (0, 1 M), y 50 µ?_ de CaCl2 (2. ,5 M). La preparación de partículas luego se agita durante tres minutos, se centrifuga en una microcentrífuga durante 10 segundos y se extrae el sobrenadante. Las partículas recubiertas por ADN luego se lavan una vez en 400 µ? de 70% de etanol y se resuspenden en 40 pL de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se puede sonicar tres veces durante un segundo cada vez. Luego se cargan cinco microlitros de las partículas de oro recubiertas por ADNen cada macrodisco portador.

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos semanas se colocan en una placa de Petri vacía de 60 x 15 mm y el líquido residual se extrae del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, normalmente se bombardean 5- 0 placas de tejido. La presión de ruptura de membrana se fija en 1100 psi, y la cámara se evacúa hasta vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3,5 pulgadas de distancia de la pantalla de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir por la mitad y volver a colocar en líquido y cultivar como se describió con anterioridad.

Cinco a siete días después del bombardeo, se puede cambiar el medio líquido con medio fresco, y de once a doce días después del bombardeo se agrega medio fresco que contiene 50 mg/mL de higromicina. Este medio selectivo se puede agregar fresco semanalmente. Siete a ocho semanas después del bombardeo se puede observar tejido transformado verde que crece de lo cúmulos embriogénicos necróticos no transformados. Se extrae el tejido verde aislado y se inocula en frascos individuales para regenerar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados propagados por clonación. Cada línea nueva puede ser tratada como evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego se pueden subcultivar y mantener como cúmulos de embriones inmaduros o regenerar en plantas entera por maduración y germinación de los embriones somáticos individuales.

Ejemplo 6: Bioensayo para analizar la actividad pesticida de la toxina mutada de B. thuríngiensis contra insectos seleccionados Se condujeron bioensayos para evaluar los efectos del péptido de toxina insecticida Bt, establecido en SEQ ID NO: 2, y el péptido de toxina insecticida mutado Bt, establecido en SEQ ID NO: 4, sobre diversas especies de lepidópteros tal como se muestra en la Tabla 3. Se condujeron ensayos de alimentación con una dieta artificial que contenía las proteínas insecticidas. Las proteínas insecticidas se diluyeron en 50 mM de bicarbonato de sodio, pH 8 y 10 µ? de las muestras diluidas se mezclaron con 40 µ? de dieta de insectos artificial fundida preparada con agarosa fundida a baja temperatura. La mezcla de la dieta luego se colocó en cada cavidad de una placa de microtitulación de 96 cavidades. Se colocaron larvas recién nacidas en cada cavidad para alimentarse ad libitum durante 4 días. Después de 4 días a 27 °C, se calificó la respuesta de los insectos hacia las proteínas mediante un sistema de calificación numérico de 0-3 basado en el tamaño y la mortalidad de las larvas. Si no se observó respuesta o había crecimiento normal, se otorgó una calificación de 0. Cuando el crecimiento estaba algo retrasado, pero sin mortalidad, se otorgó una calificación de 1. Una calificación de 2 significó muerte parcial de algunas de las larvas y fuerte inhibición del crecimiento en las larvas sobrevivientes. Una calificación de 3 indicó completa mortalidad de las larvas. Cada tratamiento se repitió 6 veces para una calificación posible acumulativa total de 18. En este sistema de calificación, una calificación acumulativa de 9 con 6 repeticiones de un tratamiento indicó 50% de respuesta (9 de 18) del tratamiento y se denomina ILC50 (concentración de inhibición y letalidad del 50% de respuesta).

Tabla 3: ILC50 en ppm (partes por millón en dieta por peso húmedo para SEQ ID NOs: 2 y 4) Insectos estudiados SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4 Gusano de mazorca de maíz 6,6 ppm 2,6 ppm (Helicoverpa zea) Enrollador de poroto de soja 4,8 ppm 1 ,0 ppm (Pseudopl sia includens) Gusano cortador negro (Agrotis 6% de 40% de ípsilon) respuesta a respuesta a 224 ppm* 216 ppm* Gusano cascarudo del otoño 10% de 24% de (Spodoptera frugiperda) respuesta a respuesta a 224 ppm* 216 ppm* *con estas concentraciones máximas estudiadas, no se obtuvo 50% de respuesta Ejemplo 7: Determinación de LC50 Se condujeron bioensayos para determinar LC50 del péptido de toxina insecticidas, establecido en SEQ ID NOs: 2 y 4, sobre perforador de maíz europeo (Ostrinia nubilalis) y perforador de maíz del sudoeste (Diatraea grandiosella). Se condujeron ensayos de alimentación en una dieta artificial que contiene proteínas insecticidas. Las proteínas insecticidas se diluyeron con 10 mM de buffer carbonato a pH 10 y con dieta de insectos para dar una concentración de final de toxina de 1000, 100, 50, 10, 1 y 0,1 ppm. Una larva recién nacida se colocó en cada cavidad para alimentar ad libitum durante 4 días. Cada bioensayo se realizó con ocho duplicados en cada dosis y el bioensayo se replicó tres veces. Los resultados se expresaron como LC50 parea mortalidad. Los resultados de los estudios de LC50 para el péptido de toxina insecticida se establecen en la Tabla 4.

Tabla 4: Resultados de LC50 Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente son incorporadas en la presente por referencia hasta el mismo grado en que sería si cada publicación individual, patente o solicitud de patente hubiera sido indicada específicamente e individualmente para ser incorporada por referencia.

Si bien la invención anterior ha sido descrita con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo a los fines de claridad de comprensión, será obvio que se pueden poner en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las formas de realización.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula aislada de ácido nucleico, CARACTERIZADA PORQUE está seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 ó 3, o una longitud total de su complemento; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ó 4; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 98% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b); y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b).

2. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADA PORQUE dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta.

3. Una construcción de ADN CARACTERIZADA PORQUE comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

4. La construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADA PORQUE además comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

5. Una célula huésped CARACTERIZADA PORQUE contiene la construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 3.

6. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5 CARACTERIZADA PORQUE es una célula bacteriana.

7. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5 CARACTERIZADA PORQUE es una célula vegetal.

8. Una planta transgénica CARACTERIZADA PORQUE comprende la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 7.

9. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, repollo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, poroto de soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semilla oleaginosa.

10. La semilla transformada de la planta de acuerdo con la reivindicación 9, CARACTERIZADA PORQUE la asemilla comprende la construcción de ADN.

11. Un polipéptido. aislado con actividad pesticida, CARACTERIZADO PORQUE está seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ó 4; y (b) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 ó 3.

12. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 11 CARACTERIZADO PORQUE además comprende secuencias de aminoácidos heterólogas.

13. Una composición CARACTERIZADA PORQUE comprende el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 1.

14. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, CARACTERIZADA PORQUE se selecciona del grupo que consiste de un polvo, polvillo, pellet, granulo, rocío, emulsión, coloide, y solución.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, CARACTERIZADA PORQUE se prepara por desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis.

16. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, CARACTERIZADA PORQUE comprende desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 99% en peso de dicho polipéptido.

17. Un método para controlar una población de plagas de lepidópteros, CARACTERIZADO PORQUE comprende poner en contacto dicha población con una cantidad efectiva como pesticida de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

18. Un método para matar una plaga de lepidópteros, CARACTERIZADO PORQUE comprende poner en contacto dicha plaga, o alimentar dicha plaga, con una cantidad efectiva como pesticida de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 11.

19. Un método para producir un polipéptido con actividad pesticida, CARACTERIZADO PORQUE comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 4 en condiciones en las cuales se expresa una molécula ácido nucleico que codifica el polipéptido, en donde dicho polipéptido es seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 Ó 4; (b) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 ó 3; (c) una secuencia de polipéptido que tiene al menos 98% de identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de (a) o (b); y (d) una secuencia de polipéptido que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de (a) o (b).

20. Una planta que ha incorporado en forma estable en su genoma una construcción de ADN, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad pesticida, en donde dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende ja secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 ó 3, o una longitud total de su complemento; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ó 4; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 98% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b)¡ y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b); en donde dicha secuencia de nucleótidos está ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificadora en una célula vegetal.

21. La planta de acuerdo con la reivindicación 20, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una célula vegetal.

22. Un método para proteger una planta contra una plaga, CARACTERIZADO PORQUE comprende introducir en dicha planta o su célula al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida, en donde dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 ó 3, o una longitud total de su complemento; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ó 4; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 98% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b); y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 99% de identidad de secuencia respecto de una secuencia de aminoácidos de (b).

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta produce un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida contra una plaga de lepidóptero.

24. Una variante aislada de SEQ ID NO:1 , CARACTERIZADA PORQUE codifica un polipéptido que tiene aumento de actividad pesticida.

25. La variante aislada de acuerdo con la reivindicación 24, CARACTERIZADA PORQUE codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. RESUMEN La invención provee ácidos nucleicos, y sus variantes y fragmentos, obtenidos de cepas de Bacillus thuringiensls que codifican polipéptidos con actividad pesticida contra plagas de insectos, incluso Lepidoptera. Las formas particulares de realización de la invención proveen ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas pesticidas, composiciones pesticidas, construcciones de ADN, y microorganismos y plantas transformadas que comprenden un ácido nucleico de las formas de realización. Estas composiciones se usan en métodos para el control de plagas, especialmente plagas vegetales.