MX2013005371A - Micro-organismos probioticos no replicantes que protegen contra las infecciones del tracto respiratorio superior. - Google Patents
Micro-organismos probioticos no replicantes que protegen contra las infecciones del tracto respiratorio superior.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a micro-organismos probióticos no replicantes y sus beneficios sobre la salud. Por ejemplo, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden micro-organismos probióticos no replicantes para ser usadas en el tratamiento de prevención de las infecciones del tracto respiratorio superior y/o sus síntomas. Las modalidades de la presente invención proveen medios para ayudar a los padres a proteger a sus niños de tales infecciones del tracto respiratorio superior.
Description
MICRO-ORGANISMOS PROBIOTICOS NO REPLICANTES QUE PROTEGEN CONTRA
LAS INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR
La presente invención se refiere a micro-organismos probióticos no replicantes y sus beneficios sobre la salud. Por ejemplo, la presente invención se refiere a I
composiciones que comprenden micro-organismos probióticos no replicantes para ser usados en el tratamiento de prevención de las infecciones del tracto respiratorio superior y/o sus síntomas. Las modalidades de la presente invención proveen medios para ayudar a los padres para proteger a sus niños de tales infecciones del tracto respiratorio superior.
Los organismos que producen ácido láctico como un componente metabólico principal han sido conocidos durante mucho tiempo. Estas bact rias se pueden encontrar en la leche o en fábricas de procesamiento de leche, respectivamente, en plantas vivas o en descomposición pero también en el intestino del hombre y de los animales. Estos microorganismos, resumidos bajo el término "bacterias del ácido láctico", representan un grupo bastante no-homogéneo y comprenden, por ejemplo a los; géneros
Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus, etc. ; '
Las bacterias del ácido láctico han sido utilizadas como agentes de
, i fermentación para la conservación de alimentos, tomando ventaja de un pH bajo y de la acción de productos de fermentación generados durante la actividad fermentativa^ de los mismos, para inhibir el crecimiento de bacterias de descomposición. Además, las bacterias del ácido láctico también se han utilizado para la preparación de una variedad de diferentes alimentos como queso, yogur y otros productos lácteos fermentados. Muy
| i recientemente, las bacterias del ácido láctico han atraído una gran cantidad de atención, en la que se ha encontrado que algunas cepas exhiben propiedades valiosas, para el hombre y animales tras la ingestión. En particular, se han encontrado cepas específicas de Lactobacillus o Bifidobacterium que son capaces de colonizar la mucosa intestinal y de ayudar en la mantención del bienestar del hombre y de los animales.
A este respecto, el documento EP 0 768 375 describe cepas específicas del género Bifidobacterium, que son capaces de implantarse en la flora intestinal y se pueden adherir a las células intestinales. Se ha informado que estas bifidóbacterias ayudan en la inmunomodulación, siendo capaces de excluir de manera competitiva la adhesión de bacterias patógenas a células intestinales, ayudando así en la manténción de la salud del individuo. '
La investigación también se ha centrado en el uso potencial de ' bacterias del ácido láctico como agentes probióticos. Se considera que los probióticos son preparaciones microbianas viables que promueven la salud del individuo mediante la preservación de la microflora natural en el intestino. Se considera que los probióticos se adhieren a la mucosa del intestino, colonizan el tracto intestinal y asimismo impiden la adhesión de microorganismos perjudiciales sobre el mismo. Un requisito fundamental para su acción reside en que tienen que llegar a la mucosa del intestino en una forma adecuada y viable y no ser destruidos en la parte superior del tracto gastrointestinal, especialmente por la influencia del bajo pH que prevalece en el estómago.
Mientras tanto, el trabajo de investigación está, en parte, dirigida a la provisión de cepas bacterianas probióticos adicionales que presenten nuevas propiedades beneficiosas para el hombre y/o los animales, tales como mascotas.
Como tal, la solicitud WO 2008042101 provee métodos para reducir las enfermedades respiratorias en niños, que comprende: proveer un L. acidophilus; proveer a un niño en riesgo de desarrollar una enfermedad y administrar el cultivo de L. acidophilus al niño en riesgo, bajo condiciones talés que se reduce el riesgo de desarrollar la enfermedad respiratoria.
Sin embargo, el hecho de agregar bacterias probióticas vivas a los i I productos de modo que estas permanezcan viables hasta el consumo no es üna tarea i trivial. En particular para los productos con tiempos de almacenamiento más largos, esto es difícil de lograr y puede requerir esfuerzos técnicos adicionales. !
Por lo tanto, sería
ofrecer los beneficios probióticos,
pérdida de actividad.
Los presentes inventores tienen por objeto proporcionar una composición
duran las infecciones del tracto respiratorio superior. También debe ser reducido jel riesgo de captar infecciones del tracto respiratorio superior. j j
Por lo cual, es un objetivo de la presente invención proveer al estado del arte de una composición que enfrente una o más de las necesidades arriba indicadas.
En consecuencia, la presente invención, se refiere a una composición que comprende micro-organismos probióticos no replicantes para uso en la preve in ¡ción o tratamiento de infecciones del tracto respiratorio superior. ¦ ' \<
La presente invención también se refiere al uso de micro-organismos probióticos no replicantes en la preparación de una composición para tratar o prevenir infecciones del tracto respiratorio superior.
Las composiciones de la presente invención pueden servir para ser administradas durante el otoño y/o el invierno. Durante este tiempo, la probabilidad de contraer infecciones del tracto respiratorio superior es particularmente elevada. '
Por ejemplo, las composiciones pueden ser administradas en la' mañana para reforzar el sistema de defensa del organismo contra las infecciones del tracto respiratorio superior durante el día.
La composición de la presente invención puede ser administrada a
I i humanos o mascotas. Por ejemplo, las mascotas pueden ser gatos o perros.
Los niños son muy propensos a contraer infecciones del tracto respiratorio superior ya que ellos entran en contacto cercano con muchos otros individuos, por
¦ i ejemplo, en la escuela o en la guardería infantil.
Por lo cual, la composición de la presente invención puede servir para ser administrada a niños, por ejemplo a lactantes o niños pequeños.
Para los humanos, los niños tienen hasta 18 años de edad. Los niños pequeños tienen hasta 12 años de edad y los lactantes son niños menores de 12 ¡meses de edad. ,
Los microorganismos probióticos "no replicantes" incluyen bacterias probióticas que han sido tratadas térmicamente. Esto incluye microorganismos que se encuentran inactivados, muertos, que no son viables y/o que están presentes' como fragmentos, tales como ADN, metabolitos, compuestos citoplasmáticos y/o materiales de paredes celulares. 1
La expresión "no replicantes" significa que no se detectan células' viables y/o unidades formadoras de colonias a través de los métodos clásicos de siembra o de plaqueo. Tales métodos clásicos de siembra se resumen en el texto de microbiología:
James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modém íood microbiology.7ma edición, Springer Science, New York, N.Y.790 p. Por lo : ge ineral, la ausencia de células viables se puede demostrar como sigue: no hay colonias visibles en las placas de agar o no hay una turbidez que aumente en el medio de crecimiento líquido después de la inoculación con diferentes concentraciones de preparaciones bao enanas
(muestras "no replicantes") y la incubación bajo condiciones apropiadas (atmósfera aeróbica y/o anaeróbica por al menos 24 horas).
La posibilidad de usar micro-organismos probióticos no replicantes ofrece diversas ventajas. En los lactantes o niños pequeños severamente inmunocomprometidos, el uso de probióticos vivos puede ser limitado en casos
í excepcionales, debido a un potencial riesgo de desarrollar bacteremia. Los probióticos no replicantes pueden ser utilizados sin ningún problema.
Además, la provisión de micro-organismos probióticos no :
permite la reconstitución en caliente mientras que a la vez se mantienen los sobre la salud.
I
La composición de la presente invención puede ser cualquier ¡tipo de composición adecuada para la administración a seres humanos o a animales donnjésticos. En consecuencia, la composición puede ser un producto alimenticio, un ¡producto
I 1 alimenticio para mascotas, un nutracéutico, un suplemento alimenticio, una corhposición nutritiva en polvo, un aditivo alimentario, o una bebida. i
Las infecciones del tracto respiratorio superior pueden ser seleccionadas del grupo que consiste de rinitis, rinosinusitis, nasofaringitis, faringitis, epiglotitis laringitis, laringotraqueitis, traqueitis, o combinaciones de los mismos. j I
Los síntomas de las infecciones del tracto respiratorio superior pueden ser
microorganismos probióticos replicantes. '¦
Además, La1 no replicante tratado térmicamente (NCC 533, número de
? i depósito CNCM 1-1225) indujo fuertemente la expresión de defensina. Las defensinas son una de las clases más importantes de péptidos antimicrobianos en los seres húrganos. Las defensinas son producidas por las células epiteliales del pulmón, la piel, la ¡cavidad
I :
oral, el tracto genitourinario, respiratorio y gastrointestinal. Entre éstas, existe la familia de las ß-defensinas que incluyen a la defensina 1 (hBD1 ) y 2 (hBD2). Por ejemplo, se encontró que L. johnsonii tratado térmicamente (La1 , NCC 533, número de depósito
i
CNCM 1-1225) regula de manera positiva a hBD1 más intensamente que su contraparte
i viva. HBD1 muestra actividad antibacteriana frente a un amplio espectro de bacterias incluyendo E. coli y Pseudomonas aeruginosa, H. pylori (Nuding, S., et ali, ! 2009, Microbes. Infect. 1 1 :384-393) y también contra levaduras tal como Candida aibicans
(O'Neil, D.A. 2003, Mol. Immunol 40:445-450) y virus (virus de la inmunodeficiencia humana) (Kota, S. Et al., 2008, J. Biol. Chem 283:22417-22429). Por lo tanto, estos péptidos antimicrobianos reforzarán la barrera de la mucosa y, en consecuencia limitan la adhesión y la invasión bacteriana.
En consecuencia, la composición de la presente invención puede servir para usarla en la protección de los niños frente a infecciones del tracto respiratorio superior. '
En particular, la composición de la presente invención permitirá a los padres proteger a sus niños frente a las infecciones del tracto respiratorio superior.1
La composición de la presente invención también puede servir para ser usada en el reforzamiento de una capacidad del niño para combatir las infecciones del tracto respiratorio superior. Un estilo de vida activo de los niños es muy importante para su desarrollo, pero también implica el contacto con muchas fuentes de posibles infecciones. Los mecanismos de defensa fuerte contra las infecciones no deseadas apoyarán su bienestar.
Por consiguiente, la composición de acuerdo con la presente invención puede también servir para ser usada en ayudar a los niños a adquirir infecciones del tracto respiratorio superior de manera menos frecuente. La probabilidad con la que los niños tendrán infecciones del tracto respiratorio superior puede ser reducida en al menos 10%, al menos 25%, al menos 30%, o preferentemente al menos 50%.
La mejora de las propiedades anti-inflamatorias, de los efectos de estímulo inmunológico de las composiciones de la presente invención y/o la expresión positivamente regulada de las defensinas, reforzará los mecanismos de defensa, lo que resulta en menos infecciones del tracto respiratorio superior.
La composición de la presente invención también puede servir para ser
I i
representan una alternativa segura y natural para los medicamentos. j 1
¡ i
La composición de la presente invención además puede contener prebióticos. Los prebióticos
han sido transformados a
alimenticias no digeribles q
para la salud y/o probiotico
el intestino superior o absorbidas en el tracto gastro intestinal de la persona !que las
; I ingiere, pero que son fermentados por la microbiota gastrointestinal y/o !p;or los
que promueven el crecimiento de probioticos o de microorganismos beneficiosos ! para la salud en los intestinos. Preferentemente, estos se pueden seleccionar del gru jp io que consiste en oligosacáridos, opcionalmente los que contienen fructosa, galactosa ¦, m ! a íñosa; fibras dietéticas, en particular fibras solubles, fibras de soya; inulina; o mezclasi de los
! i mismos. Los prebióticos preferidos son los fructo-oligosacáridos (FOS), galacto-oligosacáridos (GOS), ¡somalto-oligosacáridos (IMO), xilo-oligosacáridos (XOS), a'rábino-xilo oligosacáridos (AXOS), manano-oligosacáridos (MOS), oligosacáridos de; 'soya,
glicosilsacarosa (GS), lactosacarosa (LS), lactulosa (LA), palatinosa-oligosacáridos (PAO), malto-oligosacáridos, gomas y/o hidrolizados de las mismas, pectinas y/o hidrolizados de las mismas. Por ejemplo, las composiciones pueden ,contener oligofructosa, inulina o una combinación de los mismos.
i
La composición de acuerdo a la presente invención puede comprender microorganismos probióticos no replicantes en cualquier cantidad efectiva, por ejémplo en una cantidad que corresponde a alrededor de 106 a 1012 ufe/gramo de peso seco.'
Las composiciones de la presente invención comprenden microorganismos probióticos no replicantes en una cantidad suficiente para al menos generar parcialmente i I un beneficio para la salud. Una cantidad adecuada para lograr esto se define cómo "una dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este propósito dependerán de un número de factores, que son conocidos por aquellos expertos en el arte, tales como el peso y el estado de salud general del niño y del efecto de la matriz alimentaria. '
En las aplicaciones profilácticas, las composiciones de acuerdo con la invención se administran a una persona susceptible o al menos en riesgo de padecer un
! I desorden, en una cantidad que es suficiente para reducir al menos parcialmente el riesgo de desarrollar dicho desorden. Dicha cantidad se define por corresponder a uña "dosis profilácticamente eficaz". Nuevamente, las cantidades precisas dependen de un húmero de factores, tales como el estado de salud y del peso del niño y del efecto de la matriz alimentaria.
Aquellas personas expertas en el arte, serán capaces de ajustar de forma adecuada, la dosis terapéuticamente eficaz y/o la dosis profilácticamente eficaz.
En general, la composición de la presente invención contiene microorganismos probióticos no replicantes en una dosis terapéuticamente eficaz y/o en una dosis profilácticamente eficaz. i
Por lo general, la dosis terapéuticamente eficaz y/o la dosis profilácticamente eficaz está en el rango de alrededor de 0,005 a 1.000 . mg de microorganismos probióticos no replicantes por dosis diaria.
En términos de cantidades numéricas, los microorganismos no replicantes tratados a "alta temperatura en un período de tiempo breve" pueden estar presentes en la composición, en una cantidad que fluctúa entre 104 y 1012 ufe equivalentes/ gramo de la composición seca. Obviamente, los microorganismos no replicantes no forman 'colonias; en consecuencia, se debe entender este término como la cantidad de microorganismos no replicantes que se obtiene a partir de 104 y 1012 ufe/ gramo de bacterias replicantes. Esto incluye microorganismos que se encuentran inactivados, que son no viables o que están muertos o que están presentes como fragmentos, tales como ADN, o paredes celulares o compuestos citoplasmáticos. En otras palabras, la cantidad de microorganismos' que la composición contiene se expresa en términos de la capacidad de formar colonias (ufe) de dicha cantidad de microorganismos, como si todos los microorganismos estuvieran vivos, independientemente de si son, de hecho, no replicantes, tales como microorganismos
' i inactivados o muertos, fragmentados o una mezcla de cualquiera de todos estos estados.
Preferentemente, los microorganismos no replicantes están presentes en una cantidad equivalente a 104 a 109 ufe/ gramo de composición seca incluso, más preferentemente, en una cantidad equivalente a la comprendida entre 105 a |ip9 ufe/ gramo de composición seca.
Los probióticos se pueden llevar a ser no replicantes a través de cualquier método que sea conocido en el del arte.
Las tecnologías disponibles en la actualidad para originar cepas de probióticos no replicantes, generalmente son, el tratamiento con calor, la irradiaciqn ?, la luz UV o el uso de agentes químicos (formalina, paraformaldehído).
Sería preferible utilizar una técnica que transforme los probioticos no replicantes, la cual sea relativamente fácil de aplicar a nivel industrial, en la industria de los alimentos. j i
i
En la actualidad, la mayoría de los productos que hay en el mercado que i j contienen probioticos, son tratados térmicamente durante su producción. Por lo cual, sería conveniente ser capaz de tratar térmicamente a los probioticos, ya sea junto ' con el producto generado o, al menos, en un modo similar, mientras que los
mantengan o mejoren sus propiedades beneficiosas o incluso adquieran propiedad que sea de beneficio para el consumidor. ! i
Sin embargo, la inactivación de los microorganismos probioticos por medio de tratamientos térmicos, por lo general está asociada en la literatura, a una perdida al menos parcial de la actividad probiótica. I 1
De manera sorprendente, los inventores de la presente invención han
I
observado que al llevar los microorganismos probioticos a no replicantes, por ejemplo, mediante tratamiento térmico, no resulta en la pérdida de los beneficios para la salud de los probioticos, sino que - por el contrario - puede aumentar los beneficios para la salud existentes e incluso generar nuevos beneficios. | '
Por ello, una modalidad de la presente invención es una composición, donde los microorganismos probioticos no replicantes fueron generados corrió no
! i replicantes mediante un tratamiento térmico.
i
Dicho tratamiento térmico se puede llevar a cabo, al menos, a 71 >5°C, durante al menos 1 segundo. j j
Se pueden utilizar tratamientos térmicos de largo o corto plazo. !¦ 1 En la actualidad, por lo general a escala industrial, se prefieren los tratamientos térmicos de corto plazo, tales como los tratamientos térmicos tipo UH†.; Este tipo de tratamiento térmico reduce las cargas bacterianas y reduce el tiémpo de
replicantes con perfiles inmunes antinflamatorios, a través del uso de parám ' et 'ros de tratamiento térmico específico, que corresponden a tratamientos térmicos generalmente aplicables de manera industrial, incluso si las contrapartes vivas
antiinflamatorias.
De modo que, el tratamiento térmico puede corresponder a a alta temperatura, desde alrededor de 71 ,5 a 150°C, por alrededor de 1 a
El tratamiento a alta temperatura puede ser un tratamiento a alta temperatura/j breve periodo de tiempo (HTST, por su sigla en inglés), o un tratamiento a temper ;atu ir !a ultra elevada (UHT, por su sigla en inglés). J '
Los microorganismos probióticos pueden ser sometidos a un tratarr¡i¡ nto a alta temperatura de alrededor de 71 ,5 a 150°C, por un breve periodo de t 1ie ' m : ipo de alrededor de 1 a 120 segundos. I ' í i
Más preferentemente, los microorganismos pueden ser sometidos I a un tratamiento a alta temperatura de alrededor de 90 a 140°C, por ejemplo de 90° a jí20oC, por un breve periodo de tiempo de alrededor de 1 a 30 segundos. j
:' i Este tratamiento a alta temperatura, al menos parcialmente, da 'como
i i
resultado microorganismos no replicantes.
El tratamiento a alta temperatura se puede llevar a cabo bajo presión atmosférica normal, pero también se puede realizar bajo presión elevada. Los rangos de presión típicos fluctúan entre 1 hasta 50 bar, preferentemente entre 1 a 10 bar e incluso más preferentemente entre 2 y 5 bar. Obviamente, se prefiere que los probioticos sean tratados térmicamente en un medio que sea líquido o sólido, cuando se aplíca le! calor. Por lo tanto, una presión ideal para ser aplicada, dependerá de la naturaleza de la composición en la cual son proporcionados los microorganismos y de la temperatura utilizada.
El tratamiento a alta temperatura se puede llevar a cabo en un rango de temperatura de entre 71 ,5 a 150°C, preferentemente de alrededor de 90 a muy preferentemente de alrededor de 120 a 140°C.
El tratamiento a alta temperatura se puede realizar por un periodo de tiempo breve, desde alrededor de 1 hasta 120 segundos, preferentemente! desde alrededor de 1 hasta 30 segundos, incluso más preferentemente desde alrededor de 5 hasta 15 segundos. ;
Este espacio de tiempo determinado se refiere al tiempo durante el cual los microorganismos probioticos se someten a una temperatura determinada. Cabe señalar que dependiendo de la naturaleza y de la cantidad de composición donde se proveen los microorganismos y del diseño del aparato de calentamiento utilizado, podría diferir el tiempo de aplicación de calor.
Sin embargo, por lo general la composición de la presente invención y/p los microorganismos son tratados mediante un tratamiento a alta temperatura por un periodo de tiempo breve (HTST), por pasteurización ultra-rápida o por un tratamiento a temperatura ultra elevada (UHT).
destrucción de los organismos patógenos comunes, resistentes al calor. En el proceso i i
HTST, la leche se calienta a 71 ,7°C (161°F) por 15 a 20 segundos. ' i
La pasteurización ultra-rápida es un método de pasteurización térnjiica de
! I bebidas perecibles como jugos de frutas y verduras, cervezas y productos lácteos.' Esto
¦ ; i se realiza en forma anterior al vaciado en sus envases para así matar los
microorganismos causantes del deterioro, para hacer que los productos sean más seguros y así poder extender su vida en el almacenamiento. El líquido se desplaza en un flujo continuo controlado, mientras se somete a temperaturas de 71 ,5°C (160°R) ¡ a 74°C
( 65°F) por alrededor de 15 a 30 segundos. ; '
i
Para este propósito de la presente invención, el término "tratamiento a alta temperatura por un periodo de tiempo breve" debe incluir, por ejemplo, los tratamientos a alta temperatura por un periodo de tiempo breve HTST, tratamientos UrHT y la pasteurización ultra-rápida.
Debido a que dicho tratamiento térmico provee probióticos no replicantes con un mejor perfil antinflamatorio, la composición de la presente invención s ! puede i , utilizar en la prevención o en el tratamiento de enfermedades inflamatorias. i
Si se utilizan tratamientos térmicos de periodos prolongados de tiempo para obtener los microorganismos probióticos no replicantes, dicho tratamiento sé 1 puede realizar en el rango de temperatura que fluctúa entre 70 a 150°C por alrededor de 3 minutos a 2 horas, preferentemente en el rango de 80 a 140°C, de 5 a 40 minutos.
Mientras que el arte previo generalmente enseña que las bacterias obtenidas como no replicantes por tratamientos térmicos de periodos prolongados de tiempo son usualmente menos eficaces que las células vivas, en términos de ejercer sus propiedades probióticas, la presente invención ha demostrado que los probióticos tratados con calor son superiores en la estimulación del sistema inmune, en comparación con sus contrapartes vivas.
La presente invención también se relaciona con una composición que comprende microorganismos probióticos que se obtuvieron como no replicantes m'etiiante un tratamiento térmico a al menos 70°C, por al menos 3 minutos.
Los efectos de estimulación inmunológica de los probióticos no replicantes fueron confirmados por elaboración de perfiles inmunes in vitro. El modelo in vitro utilizado emplea perfiles de citoquinas de células mononucleares de sangre periférica humana
(PB C por su sigla en inglés) y es bien aceptado en el arte como modelo estándar para los ensayos de compuestos inmunomoduladores (Schultz et al., 2003, Journal pf Dairy
?
Research 70, 165-173; Taylor et al., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227- 1235; Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1 192-1203) j ¦
El ensayo PBMC in vitro ha sido utilizado por múltiples autores/ grupos de investigación, por ejemplo, para clasificar los probióticos según su perfil inmune, es decir, sus características anti- o pro-inflamatorias (Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203). Por ejemplo, este ensayo ha demostrado que^ permite la predicción de un efecto anti-inflamatorio de los candidatos probióticos en modelos de colitis intestinal de ratones (Foligne, B., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243). Además, este ensayo se utiliza regularmente como lectura en los ensayos clínicos y se demostró que conduce a resultados coherentes con los resultados clínicos (Schultz et al., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor et al., 2006, Clinical and
Experimental Allergy, 36, 1227-1235). ; 1
Las enfermedades alérgicas han aumentado constantemente durante las últimas décadas y actualmente la OMS las considera como epidemia. De modo general, la í alergia se considera como el resultado de un desequilibrio entre las respuestas Thl Th2 del sistema inmune, que lidera una fuerte tendencia hacia la producción de mediadores
Th2. Por lo tanto, la alergia puede ser mitigada, regulada a la baja o prevenirse mediante la restauración de un equilibrio adecuado entre las vertientes Th1 y Th2 del sistema inmune. Esto implica la necesidad de reducir las respuestas Th2 o de mejorar, al menos transitoriamente, las respuestas Th1 . Estas últimas serían características de; una respuesta inmune de estimulación, a menudo acompañadas de, por ejemplo, niveles más
altos de IFIMy, TNF-a e IL-12. (Kekkonen et al, 2008, World Journal of Gastroehterology,
14, 1 192-1203; Viljanen M. et al, 2005, Allergy, 60, 494-500.) !
i .
Por ello, la composición de la presente invención permite tratar o prevenir
¦ ¡ i desórdenes relacionados con una defensa inmuno-comprometida. , i i
I
La composición descrita en la presente invención permite i también
j I aumentar la respuesta a las vacunas, en particular a las vacunas orales. ,
Cualquier cantidad de microorganismos no replicantes será embargo, generalmente se prefiere que al menos 90%, al menos
preferentemente al menos 98%, mucho más preferentemente al menos 99%, al menos 99,9% y muy idealmente todos los probióticos son no replicantes. ¡ ,
En una modalidad de la presente invención, todos los son
no replicantes. I
i
En consecuencia, en la composición de la presente invención, aí menos
90%, preferentemente al menos 95%, más preferentemente al menos 98%, mucho más i ' preferentemente al menos 99%, idealmente al menos 99,9%, muy idealmente tqdos los probióticos son no replicantes. '
Todos los microorganismos probióticos se pueden utilizar para el pbjetivo de la presente invención. j '
salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johrisonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptdcbccus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris,
j i
Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Eécherichia coli y/o mezclas de los mismos. i. ,
La composición de acuerdo con la presente invención, por ejemplo; puede
La1 , Lactobacillus paracasei NCC 2461 , Lactobacillus rhamnosus NCC J 4007, Lactobacillus reuteri DSM17983, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptopoccus
I i thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus cas' éi NCC
4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC CC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococc CC 2287, o combinaciones de los mismos.
Todas estas cepas han sido depositadas bajo el Tratado de y/o se encuentran disponibles en el comercio.
Las cepas que han sido depositadas bajo el Tratado de Bud las
siguientes: ¡ ¡
Bifidobacterium longum NCC 3001 : ATCC BAA-999
Bifidobacterium longum NCC 2705: CNCM 1-2618
Bifidobacterium breve NCC 2950 CNCM I-3865
! I
Bifidobacterium lactis NCC 2818: CNCM I-3446
Lactobacillus paracasei NCC 2461 : CNCM 1-21 16
Lactobacillus rhamnosus NCC 4007: CGMCC 1.3724 l i
Streptococcus thermophilus NCC 2019: CNCM 1-1422
Streptococcus thermophilus NCC 2059: CNCM 1-4153
Lactococcus lactis NCC 2287: CNCM 1-4154
Lactobacillus casei NCC 4006: CNCM 1-1518
Lactobacillus casei NCC 1825: ACA-DC 6002
Lactobacillus acidophilus NCC 3009: ATCC 700396
Lactobacillus bulgaricus NCC 15: CNCM 1-1198
Lactobacillus johnsonii La1 CNCM 1-1225
Lactobacillus reuteri DSM17983 DSM17983
Lactobacillus reuteri ATCC55730 ATCC55730
Escherichia coli Nissle 19 7: DSM 6601
Las cepas denominadas ATCC fueron depositadas con la autoridad de depósito para patentes ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 201 10, USA.: ,
Las cepas nombradas CNCM fueron depositadas con la institución COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM), 25 rué du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, Francia.
Las cepas denominadas CGMCC fueron depositadas con la institución China General Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Chínese Academy of Sciences, Zhongguancun, P. O. Box 2714, Beijing 100080, China.
Las cepas denominadas ACA-DC fueron depositadas con la institución
Greek Coordinated Collections of Microorganisms, Dairy Laboratory, Department of ;Food
. i
Science and Technology, Agricultural University of Athens, 75, lera odos, Botánikos, Athens, 1 18 55, Grecia.
Las cepas denominadas DSM fueron depositadas con la institución DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7 B, 38 24 Braunschweig, Alemania.
Aquellas personas expertas en el arte entenderán que pueden combinar
libremente todas las características de la presente invención descritas aquí, sin apartarse del espectro de la invención tal como ha sido descrito. Í
A partir de los siguientes ejemplos y figuras se vuelven las ventajas y características adicionales de la presente invención.
Las figuras 1 A y 1 B muestran la mejora de los perfiles inmunes anti inflamatorios de probióticos tratados con "altas temperaturas de corta duración".
La figura 2 muestra cepas probióticas no anti-inflamatorias que se
La figura 7 muestra las relaciones IL-12p40/IL-10 de cepas vivas y tratadas térmicamente (85°C, 20 minutos). En general, el tratamiento térmico a 85°C durante 20 i : min conduce a un aumento de las proporciones IL-12p40/IL-10 al contrario i de los
tratamientos con "alta temperatura de corta duración" de la presente invención (Figuras 1 , 2, 3, 4 y 5).
La figura 8 muestra el aumento de la secreción de citoquina in vitro, a partir de células PBMC de humanos estimulados con bacterias tratadas térmicamente. :
La figura 9 muestra el porcentaje de la intensidad de diarrea en ratones sensibilizados a OVA desafiados con suero salino (control negativo), ! ratones sensibilizados a OVA desafiados con OVA (control positivo) y ratones sensibilizados a OVA desafiados con OVA y tratados con Bifidobactenum breve NCC 2950 vivo o tratado térmicamente. Los resultados se entregan como el porcentaje de la intensidad de diarrea
i
(Media ± SEM calculado a partir de 4 experimentos independientes) con un 100% de intensidad de diarrea que corresponde a los síntomas desarrollados por el grupo control positivo (sensibilizados y desafiados por el alérgeno). [
La figura 10 muestra que La1 tratado térmicamente (NCC533, número de depósito CNCM 1-1225) a 120°C por 15 segundos induce fuertemente in vitro al ARNm de hBD1 en células del epitelio intestinal comparado con otras cepas tratadas térmicamente.
Las células T84 fueron incubadas por 4 horas con las cepas tratadas térmicamente. La expresión génica de hBD1 fue analizada con PCR de tiempo real.' Las barras representan las medias ± sem estandarizadas a la expresión basál de las células no estimuladas:
La figura 1 1 muestra que un tratamiento de alta temperatura por tiempo breve de of La1 (NCC533, número de depósito CNCM 1-1225) tiende a ser la mejor en inducir la expresión del ARNm de hBD1 . Las células T84 fueron estimuladas por 4 horas con La1 (NCC533, número de depósito CNCM 1-1225) viva y tratada térmicamente a 120°C por 15 segundos o 85°C por 20 minutos. La expresión génica de hBD1 fue analizada por PCR de tiempo real. Las barras representan la media ± sem estandarizada a la expresión basal de células no estimuladas. '
Ejemplo 1 :
Metodología
Preparaciones bacterianas:
En general, los beneficios para la salud proporcionados por los probioticos
I
vivos sobre el sistema inmune del huésped, son considerados específicos de cada cepa. Los probioticos que inducen elevados niveles de IL-10 y/o que inducen bajos
1 niveles de citoquinas pro-inflamatorias in vitro (ensayo de PBMC) han demostrado ser potentes cepas antiinflamatorias in vivo (Foligné, B., et al., 2007, World J. Gastróénterol. 13:236-243).
Se utilizaron diversas cepas probióticas para investigar las propiedades anti-inflamatorias de los probioticos tratados térmicamente. Estos fueron Bifidobacterium i longum NCC 3001 , Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC' 2950,
Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461 , Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilús NCC 3009, Lactobacillus case/' ACA-DC 6002 (NCC 1825), y Escherichia coli Nissle. Diversas cepas de cultivo iniciadoras, que incluyen algunas cepas comercialmente utilizadas para producir los productos fermentados de Nestlé LC1 , también fueron ensayadas: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC ! 2059, Lactobacillus bulgarícus NCC 15 y Lactococcus lactis NCC 2287.
Se cultivaron las cepas bacterianas en condiciones optimizadas para 'cada cepa en biorreactores de 5 a 15 litros. Se pueden utilizar todos los medios de cultivo bacterianos típicos. Estos medios son conocidos por aquellas personas expertas; en el arte. Cuando se ajustó el pH a 5,5, se agregó continuamente solución de base al 30% (ya sea NaOH o Ca(OH)2). Cuando fue adecuado, se mantuvieron las condiciones aeróbicas gasificando el espacio de cabeza con C02. Se cultivó E. coli bajo condiciones aeróbicas estándar. ?
Las células bacterianas se recolectaron por centrifugación (5.000 k'g, 4°C) y se resuspendieron en tampón salino de fosfato (PBS) en volúmenes adecuados para poder alcanzar una concentración final de alrededor de 109 - 1010 ufc/ml. Pa te de la preparación se congeló a -80°C con 15% de glicerol. Otra parte de las células se trató térmicamente mediante:
- Temperatura Ultra Alta: 140°C durante 15 segundos; mediante inyecció 'n d ié ' vapor indirecto. ! ¡
- Temperatura elevada por periodo corto (HTST): 74°C, 90 C y 120°C dur ia ¡nte 15
I ! segundos mediante inyección de vapor indirecto | i
- Baja temperatura
Luego del
80°C hasta su uso.
Preparación in vitro de lo
Fueron e
bacterianas vivas y trata
de citoquinas especificas a partir de células sanguíneas humanas in vitro). Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de fi Ültrados
París, Francia), 1 % de L-glutamina (Sigma), 1 % de penicilina/estreptomicina (Sigma) y
r i
0,1 % de gentamicina (Sigma). Los PBMC (7 x I05 células/pocilio) fueron entonces
!' i incubados con bacterias vivas y bacterias tratadas térmicamente (con un equivalente de 7
; ¡ 1 1 I 1
(véase arriba) para cada cepa fueron transferidos al programa BioNumerics ! v5.10
(Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Un análisis del componente principal¡(PCA,
¦ ¦ i i técnica de dimensionamiento) se realizó sobre este conjunto de datos. En este ahális is se
¦ i ' incluyeron la sustracción de los promedios sobre los caracteres y la división ppr las varianzas sobre los caracteres.
Resultados
Perfiles antinflamatorios generados por los tratamientos con temperatura ultra elevada (UHT)/temperatura elevada por periodo corto (HTST).
Las cepas de probióticos bajo investigación, fueron sometidas a úna serie de tratamientos térmicos (ultra alta temperatura (UHT), alta temperatura por periodo corto (HTST) y 85°C por 20 minutos) y se compararon sus perfiles inmunológicos in vitro con aquellos de las células vivas. Los microorganismos vivos (probióticos y/o ; cultivos iniciadores de lácteos) indujeron diferentes niveles de la producción de citoquinas^ cuando
I
se incubaron con PBMC humanos (figuras 1A, 1B, 2, 3A, 3B, 4A, 4B y 5). El tratamiento térmico de estos microorganismos modificó los niveles de citoquinas producidas por los PBMC de una manera dependiente de la temperatura. Los tratamientos con "temperatura elevada por periodos cortos" (120°C o 140°C por 15 segundos) generaron bacterias no replicantes con perfiles inmunológicos antinflamatorios (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B;, 4A y 4B). Ciertamente, las cepas tratadas con el tipo UHT (ultra alta temperatura) (1409C, 15 segundos) indujeron menos citoquinas pro-inflamatorias (TNF-a, IFN-?, IL-†l2p40) mientras que se mantuvieron o indujeron la producción adicional de IL-10 (comparado con las contrapartes vivas). Las relaciones resultantes de IL-12p40/IL-10 fueron menores para cualquiera de las cepas tratadas con el tratamiento tipo UHT comparado con las Células vivas (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A y. 4B). Esta observación también fue válida para las i | bacterias tratadas por los tratamientos tipo HTST, es decir, sometidas a 120°C por 15 segundos (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A y 4B), o 74°C y 90°C durante 15 segundos (Figura 5). Los tratamientos térmicos (tratamientos UHT o tratamientos HTST) tuvieron un efecto similar sobre los perfiles inmunológicos in vitro de las cepas probióticas (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B y 5) y los cultivos iniciadores lácteos (Figuras 4A y 4B). Los análisis de componente principal sobre los datos de PBMC generados con las cepas probióticas
vivas y con las iniciadoras lácteas tratadas térmicamente (140°C, 15 segundos) revelaron que las cepas vivas se distribuyen todas a lo largo del eje x, ¡lustrando que las cepas exhiben perfiles inmunológicos muy diferentes in vitro, desde bajos inductores (lado izquierdo) hasta altos inductores (lado derecho) de citoquinas pro-inflamatorias. El agrupamiento de cepas tratadas térmicamente en el lado izquierdo del gráfico, ' muestra que las citoquinas pro-inflamatorias son mucho menos inducidas por las cepas (tratadas térmicamente (Figura 6). Por el contrario, las bacterias tratadas térmicamente hacia 85°C durante 20 minutos indujeron más citoquinas pro-inflamatorias y menos IL-10 que las células vivas que resultaron en mayores proporciones de IL-12p40/IL-10 (Figura 7). , Los perfiles antinflamatorios se mejoran o se generan por medio de los tratamientos tipo
UHT y tipo HTST. ;
Las cepas tratadas por UHT y HTST exhiben perfiles antinflamatorios independientemente de sus respectivos perfiles inmunológicos iniciales (células vivas). Se demostró que en las cepas probióticas que se sabe que son antiinflamatorias in vivo, y que exhiben perfiles anti-inflamatorios in vitro (S. longum NCC 3001 , B. longurri NCC i
2705, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818) exhiben perfiles antinflamatorios aumentados in vitro después de tratamientos a "temperaturas elevadas por periodos cortos". Tal como se muestra en la Figura 1 , las razones IL-12p40/IL-10 de cepas de Bifidobacteríum tratadas con el tipo UHT fueron menores que aquellos provenientes1, de las contrapartes vivas, mostrando de este modo perfiles antinflamatorios mejorados ;de las muestras tratadas con el tipo de tratamiento UHT. Más sorprendentemente, la generación de perfiles anti-inflamatorios por medio de los tratamientos UHT y tipo HTST también se confirmó para las cepas vivas no anti-inflamatorias. Ambas cepas vivas de L. rhamnosus NCC 4007 y L. paracasei NCC 2461 exhiben elevadas proporciones de IL-12p40/IL-10 in vitro (Figuras 2 y 5). Las dos cepas vivas mostraron que no son protectoras contra la colitis inducida por TNBS en ratones. Las razones de IL-12p40/IL-10 inducida por L. rhamnosus NCC 4007 y L. paracasei NCC 2461 se vieron dramáticamente reducidas luego de los tratamientos con "alta temperatura por periodos cortos" (UHT o . HTST) alcanzando niveles tan bajos como aquellos obtenidos con las cepas de
Bifidobacterium. Estas bajas razones de IL-12p40/IL-10 se deben a los bajos niveles de la producción de IL-12p40 combinados con la falta de cambio (L. rhamnosus NCC 4007) o una inducción dramática de la secreción de IL-10 (L. paracasei NCC 2461 ) (Figura 2).
Como consecuencia:
Se pueden mejorar los perfiles anti-inflamatoriós de microorganismos vivos mediante los tratamientos tipo UHT y tipo HTST (por ejemplo B. longum NCC 2705, B. longum NCC 3001 , B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818)j !
Se pueden generar perfiles anti-inflamatorios a partir de i microorganismos vivos no anti-inflamatorios (por ejemplo L. rhamnosus NCC 4007, L. paracasei NCC 2461 , los iniciadores lácteos S. thermophilus NCC 2019) por medio de los tratamientos térmicos tipo UHT y tipo HTST. . i ,
También se demostraron perfiles anti-inflamatorios para las cepas aisladas provenientes de productos comercialmente disponibles (Figuras 3A y ' 3B), incluyendo una cepa probiótica de E. coli.
El impacto de los tratamientos tipo UHT/HTST fue similar para todos los probióticos probados y para todos los iniciadores lácteos, por ejemplo lactobacilos, bifidobacterias y estreptococos.
Se aplicaron tratamientos tipo UHT/HTST a diversos lactobacilos, bifidobacterias y estreptococos que exhiben diferentes perfiles inmunológicos in vitro. Todas las cepas indujeron menos citoquinas pro-inflamatorias luego de los
tratamientos tipo UHT/HTST con relación a sus respectivas contrapartes vivas (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A, 4B, 5 y 6) demostrando que el electo de los tratamientos tipo UHT/HTST sobre las propiedades inmunes de las bacterias resultantes no replicantes puede ser generalizado para todos los probióticos, en particular para lactobacilos y bifidobacterias y para cepas de E. coli específicas y para todos los cultivos iniciadores lácteos, en particular, para estreptococos, lactococos y lactobacilos.
Ejemplo 2: '
i
Metodología ; ,
Preparaciones bacterianas: !
Se utilizaron cinco cepas probióticas para investigar las propiedades de inmunoestimulantes de probióticos no replicantes: 3 bifidobacterias {B. longum NCC3001 , ß. lactis NCC 2818, B. breve NCC 2950) y 2 lactobacilos (L. paracasei NCC 24,61 , L. rhamnosus NCC 4007). i
Las células bacterianas se hicieron crecer en MRS con fermentación en lote a 37°C durante 16 a 18 horas sin control de pH. Las células bacterianas se centrifugaron (5.000 x g, 4°C) y se resuspendieron en solución de tampón salina de fosfato antes de ser diluidas, en agua salina para poder alcanzar una concentración final de alrededor de 010 ufc/ml. Se trataron térmicamente las cepas B. longum NCC 3001 , B. lactis NCC 2818, L. paracasei NCC 2461 , L. rhamnosus NCC 4007 a 85°C durante 20 minutos en un baño de agua. Se trató térmicamente B. breve NCC 2950 a 90°C durante 30 minutos en un baño de agua. Las suspensiones bacterianas tratadas térmicamente fueron alicuotadas y se mantuvieron congeladas a -80°C hasta su uso. Se almacenaron ias bacterias vivas a -80°C en PBS-glicerol 15% hasta su uso.
Obtención in vitro de los perfiles inmunológicos de las preparaciones bacterianas.
Fueron evaluados los perfiles inmunológicos de las preparaciones
! 1 bacterianas vivas y tratadas térmicamente (es decir, la capacidad para inducir secreción de citoquinas especificas a partir de células sanguíneas humanas in vitró). Se1 aislaron
experimento y en el mismo lote de los PBMC) para las bacterias vivas y para sus contrapartes tratadas térmicamente. · j I
en los
ELISA
de BD OptEIA, IFN-? humano de BD OptEIA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El
I 1
IFN-?, IL-12p40 y TNF-a son citoquinas pro- inflamatorias, mientras que IL-10 íes un potente mediador antiinflamatorio. Se expresaron los resultados como medias (pg/ml) +/-SEM de 4 donantes individuales y son representativos de los dos experimentos
i i
i l
I i
en la
de B. 1666-
1667). Luego de la sensibilización (2 inyecciones intraperitoneales de ovoalbúmina! (OVA) y sulfato de aluminio potasio a un intervalo de 14 días; días 0 y 14) se desafió por Ij v 'ía oral i i a los ratones macho Balb/c con OVA por 6 veces (en los días 27, 29, 32, 34, ¡ 36, 39)
formadoras de colonias (ufe) o el equivalente de ufe/rata. ¡ !
|
I 1
estímulo con las cepas bacterianas tratadas térmicamente. Se compararon los perfiles inmunológicos basados en cuatro citoquinas, frente a la estimulación de los PBMC i mediante bacterias tratadas térmicamente, con aquellos inducidos por células bacterianas i 1 vivas, en el mismo ensayo in vitro. I 1 i ; Los preparaciones tratadas térmicamente fueron plaqueadas o sembradas
i i
Ü
I i
y evaluadas para verificar la ausencia de cualquier recuento de viables. Las preparaciones bacterianas tratadas térmicamente no produjeron colonias luego de la siembra o plaqueo.
Los probióticos vivos indujeron niveles de producción de cjtoquinas i | diferentes y dependientes de células, cuando se incubaron con PBMC de humanó ^Figura
8). El tratamiento térmico de los probióticos, modificó los niveles de citoquinas producidos por los PBMC al compararlos con sus contrapartes vivas. Las bacterias tratadas térmicamente indujeron más citoquinas pro-inflamatorias (TNF-a, IFN-?, IL-12p40), respecto de lo que hicieron sus contrapartes vivas. Por el contrario, las bacterias gatadas térmicamente indujeron cantidades similares o inferiores de IL-10 comparado 'con las células vivas (Figura 8). Estos datos muestran que las bacterias tratadas térmicamente son más capaces de estimular el sistema inmune que sus contrapartes vivas y por lo tanto son más capaces de despertar defensas inmunológicas debilitadas. En otras palabras los datos in vitro ilustran un efecto inductor inmunológico mejorado por parte de las ¡cepas bacterianas luego del tratamiento térmico. ! '
Para poder ilustrar el efecto aumentado de B. breve NCC 2950 tratado
¦ i térmicamente (comparado con las células vivas) sobre el sistema inmune, ambos B. breve
i :
NCC 2950 (cepa A) vivo y tratado térmicamente fueron probados en un modelo animal de diarrea alérgica.
Al compararlo con el grupo control positivo, la intensidad de la diarrea se vio significativamente y consistentemente disminuida luego del tratamiento con B. ^breve NCC 2950 tratado térmicamente (41 ,1 % ± 4,8), mientras que la intensidad de la diarrea disminuyo solamente en un 20 ± 28,3% luego del tratamiento con B. breve NC¿ 2950 vivo. Estos resultados demuestran B. breve NCC 2950 tratado térmicamente exhibe un efecto protector aumentado frente a la diarrea alérgica respecto de su contraparte viva (Figura 9). ¡ ?
Como consecuencia, la capacidad de los probióticos para aumentar las defensas inmunes demostró que es mejorado luego del tratamiento térmico.
Ejemplo 3:
Protocolo Experimental:
Se usaron células T84 de 30 a 40 pasadas y se cultivaron en ¡ medio
! 1 1 esencial de Dulbecco modificado/F-12 (Sigma D 6421 ) que contiene 5% de suero ¡bovino fetal (FCS) (Amined BioConcept) y glutamina 2mM. Las células fueron sembradas a una concentración de 2 x 106 célula/pocilio en placas de cultivo de 6 pocilios y se dejaron crecer como monocapas a 37°C en una atmósfera con C02 5% - aire 95%. Las células i cultivadas por 1 semana después de la confluencia fueron incubadas con suero y ,medio
»
expresión de defensina inducida por suero y previnieron cualquier influencia | de los
I I
minutos.
Resultados:
La1 tratada térmicamente (NCC533, número de depósito CNCM 1-1225) a 120°C, 15 segundos indujo fuertemente la expresión del ARNm de hBD1 después de 4
i ;
horas de incubación (Figura 10) en contraste con las otras cepas tratadas térmicamente que fueron ensayadas. Estos datos son únicos, como la expresión de HBD1 ,! que es i expresado de manera constitutiva, del cual actualmente se cree por parte 1 de la comunidad científica que virtualmente no es modulable por microbios, productos microbianos o inflamación. ; 1
Tanto La1 viva como tratada térmicamente (NCC533, número de depósito
CNCM 1-1225) indujo fuertemente la expresión del ARNm de hBD1 , pero la ,mayor i inducción de hBD1 fue inducida por La1 tratada térmicamente (tratamiento de alta temperatura por un período de tiempo corto) (Figura 1 1 ).
Claims (1)
- REIVINDICACIONES 5. Composición de acuerdo con cualquiera precedentes, que se usa para reforzar una capacidad del infecciones del tracto respiratorio superior. ¡ i . infecciones del tracto respiratorio superior. 8. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones I precedentes, que comprende micro-organismos probióticos no replicantes en una cantidad que corresponde de 106 hasta 1012 ufe. 9. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus júhnsbnii,
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