CN108004189B - 一种复合益生乳酸菌粉剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种复合益生乳酸菌粉剂及其制备方法与应用，所述复合益生乳酸菌粉剂由干酪乳杆菌Zhang菌粉、动物双歧杆菌V9菌粉、植物乳杆菌P‑8菌粉、植物乳杆菌C2菌粉与益生元、果蔬粉复合而成。复合益生乳酸菌粉剂对肠易激综合征，对口腔感染、鼻腔感染具有显著的保护作用，对上呼吸道感染发生具有显著预防作用，同时改善胃肠症状、调节肠道菌群，可以提高机体免疫力。

Description

一种复合益生乳酸菌粉剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合益生乳酸菌粉剂及其制备方法与应用。

背景技术

肠道是人体最大的消化器官，为人体消化食物和吸收营养物质提供重要作用。近15年随着高量测序技术的快速发展及对肠道的深入研究，肠道菌群这个词越来越频繁的出现在人们的视线中。肠道菌群已被认为是人体又一个重要的器官。人体肠道菌群在营养丰富的肠道中附着生长，为宿主代谢食物、提供能量和营养物质并抑制病原微生物的生长等重要作用。宿主出生后肠道菌群已经形成，肠道菌群从宿主早期生长发育开始就参与宿主代谢，免疫学和认知发育的形成。肠道菌群结构随宿主至幼儿期达到稳定，与宿主健康处于动态平衡。菌群失调对宿主健康产生危害，身体会出现多种不适或引起疾病，如肠胃不适、肥胖、糖尿病、心血管疾病及炎症性肠病等。

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是临床上常见的慢性肠道疾病，主要表现为间断性腹痛、腹胀伴大便性状和(或)排便习惯改变并且缺乏肠道形态学改变。根据患者大便性状可分为便秘型、腹泻型及便秘腹泻交替型，该疾病症状反复发作，不仅给患者带来痛苦，影响患者生活质量，由于反复发作、就医，还消耗大量医疗资源，给予社会经济带来沉重负担。但目前该疾病的发病原因和疾病发生机制尚不十分清楚，因此临床中多采用对症治疗。但近年研究发现肠易激综合征患者的肠道菌群出现了偏差，其中厚壁菌门含量与拟杆菌门含量比例升高，包括瘤胃球菌属(Ruminococcus)、梭菌属(Clostridium)、变形杆菌(Proteobacteria)、大肠杆菌(Escherichia Coli)、肠球菌(Enterococcus)、肠杆菌(Enterobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和多尔氏菌(Dorea)等；而肠道菌群的多样性是降低的，其中双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)、拟杆菌(Bacteroides)和柔嫩梭菌(Faecalibacterium)等有益菌的数量下降。从调节肠道菌群这一角度出发，近年来采用的益生菌治疗取得显著进步，但由于益生菌的菌株与含量不同而疗效各异。因此，亟需一种高效、安全的产品，缓解患者症状。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提出一种复合益生乳酸菌粉剂及其制备方法与应用。

为实现上述目的，第一方面本申请提供一种复合益生乳酸菌粉剂，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2，其保藏编号为CGMCC No.14532；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)。

结合第一方面，在第一方面第一种可能的实现方式中，植物乳杆菌C2的有效活菌数≥1.0×10⁹CFU/g，干酪乳杆菌的有效活菌数≥3.0×10⁹CFU/g，植物乳杆菌的有效活菌数≥3.0×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌的有效活菌数为≥4.0×10⁹CFU/g。

结合第一方面第一种可能的实现方式，在第一方面第二种可能的实现方式中，所述复合益生乳酸菌粉剂中总有效活菌数为≥1×10¹⁰CFU/g，优选为1.6×10¹⁰CFU/g。

结合第一方面第二种可能的实现方式，在第一方面第三种可能的实现方式中，所述的复合益生乳酸菌粉剂还包括益生元和\或果蔬粉；

所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚乳糖、低聚壳聚糖、大豆低聚糖、菊粉、聚葡萄糖中的一种或几种；

所述果蔬粉包括蓝莓粉、草莓粉、蔓越莓粉、樱桃粉、苹果粉、香蕉粉、木瓜粉、芒果粉、火龙果粉、南瓜粉、胡萝卜粉、葡萄粉、石榴粉、哈密瓜粉、枸杞粉、红枣粉、猕猴桃粉中的一种或几种；

果蔬粉是新鲜水果、蔬菜经过喷雾或冻干等工序加工而成粉末状产品，其中富含的蛋白质、不饱和脂肪酸、膳食纤维、多种矿物质和天然维生素等以提供机体多元的营养成分，同时赋予复合益生乳酸菌粉剂很好的风味；益生元是一种膳食补充剂，通过选择性的刺激一种或少数种菌落中的细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响从而改善寄主健康的不可被消化的食品成分，是益生乳酸菌的养料，与益生乳酸菌同时服用可以促进菌株生长定植，使益生作用发挥更佳。

在第一方面第四种可能的实现方式中，所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌Zhang，其保藏编号为CGMCC No.5469；植物乳杆菌为植物乳杆菌P-8，其保藏编号为CGMCC No.6312；动物双歧杆菌为动物双歧杆菌V9，其保藏编号为CGMCC No.5470。

在第一方面第五种可能的实现方式中，所述复合益生乳酸菌粉剂，包括重量份如下的组分：植物乳杆菌C2菌粉1-6份、干酪乳杆菌Zhang菌粉0.1-8份、植物乳杆菌P-8菌粉0.1-6份、动物双歧杆菌V9菌粉0.1-8份、益生元30-75份、果蔬粉5-35份。

在第一方面第六种可能的实现方式中，所述复合益生乳酸菌粉剂的水分含量不大于2％。

第二方面，本申请还提供上述复合益生乳酸菌粉剂在制备治疗肠易激综合征、上呼吸道感染、口腔感染、鼻腔感染产品中的应用。

本申请的有益效果：

1、本申请所述的复合益生乳酸菌粉剂由植物乳杆菌C2、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9复配而成，四种菌粉均具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、不携带耐药性质粒。采用复合益生乳酸菌粉剂治疗肠易激综合征患者，为治疗肠易激综合征提供一种安全有效的方法，缓解患者症状，提高其生活质量，节约社会、医疗资源。

2、本申请所述的复合益生乳酸菌粉剂具有有效治疗肠易激综合征，对口腔感染、鼻腔感染具有显著的保护作用，对上呼吸道感染发生具有显著预防作用，同时改善胃肠症状、调节肠道菌群，可以提高机体免疫力。

附图说明

图1：对照组与复合益生乳酸菌粉剂组样品间Unweighted UniFrac的距离比对图；

图2：IBS患者肠道菌群的物种丰度指数(图a，P＝2.98e-06)和多样性指数(图b，P＝0.009)比对图；

图3：志愿者每月出现的口腔炎症发生次数比对图；

图4：年龄20-50岁的志愿者每月出现的鼻腔炎症发生症状比对图；

图5：年龄＞50岁的志愿者每月出现的鼻腔炎症发生症状比对图；

图6：年龄20-50岁的志愿者每月出现的呼吸道炎症发生症状比对图；

图7：年龄＞50岁的志愿者每月出现的呼吸道炎症发生症状比对图；

图8：年龄20-50岁的志愿者每月出现的腹泻次数比对图；

图9：年龄＞50岁的志愿者每月出现的腹泻次数比对图；

图10：年龄20-50岁的志愿者血液中免疫球蛋白IgG含量比对图。

具体实施方式

下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

以下实施例中使用的植物乳杆菌C2，已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.14532，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株是2012年从四川省自然发酵的泡菜中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，发酵农作物或动物粪便能够快速产酸控制物料pH值，其中可高产一种有机酸为4-羟基苯乳酸，能够广谱抑制大肠杆菌致病菌和霉菌的生长及繁殖，该有机酸是本团队首次发现，具有很高的研究潜力。

所述植物乳杆菌P-8，已于2012年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6312，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株是2003年从内蒙古自治区牧民家庭中的自然发酵酸牛奶中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株。研究采用体外实验、动物模型和人体试验对菌株的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行了深入剖析。目前已经证实菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，调节血脂代谢，对肝脏具有保护修复作用，提高机体免疫能力。公开号为102994422A的中国发明专利《一种植物乳杆菌在改善酒精性肝损伤中的应用》已公开该菌株。

所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang，已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5469，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。公开号为102851222A的中国发明专利《一种能在豆乳发酵过程中转化异黄酮的干酪乳杆菌》已公开该菌株。

所述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)V9，已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5470，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp lactis)。公开号为103421711A的中国发明专利《用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌》已公开该菌株。

实施例1蓝莓口味复合益生乳酸菌粉剂

一种制备植物乳杆菌C2菌粉、干酪乳杆菌Zhang菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌V9菌粉的方法，包括如下步骤：

(1)分别将植物乳杆菌C2、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V94株发酵菌种单独进行高密度发酵：分别取一环活化后的植物乳杆菌C2、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9的斜面菌体，各自分别接种至MRS培养基中，在相同温度33-37℃，相同转速50-100rpm条件下培养18-24h，分别得到一级种子液；

(2)将培养好的一级种子液按接种量3％-10％(v/v)再次转接入MRS培养基进行二次活化，活化时间18-24h后得二级种子液；

(3)将二级种子液分别按照相同接种量3％-10％(v/v)分别各自接入到不同的发酵罐培养基中，温度均为33-37℃，转速均为50-100rpm，通风量均为0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.6-6.2条件下培养8-12小时，分别得到植物乳杆菌C2最终发酵液、干酪乳杆菌Zhang最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液、动物双歧杆菌V9最终发酵液，将得到的上述最终发酵液分别经5000-12000rpm，5-15min离心收集菌体；

所述发酵罐培养基(g/L)：蔗糖50-80，酵母粉20-40，大豆蛋白胨8-20，MgSO4.7H2O1.5-2.0，MnSO4.5H2O 0.08-0.12，吐温-80 0.8-1.0，余量为水，pH7.0；

本发明人发现，上述发酵条件下制得的发酵液中益生菌的活菌数丰富；

(4)向经离心后的植物乳杆菌C2、干酪乳杆菌Zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9的菌体中分别按照各自菌体与保护剂溶液质量比1：5-10的比例添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到植物乳杆菌C2菌粉、干酪乳杆菌Zhang菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌V9菌粉；

所述保护剂溶液的配方如下(g/L)：脱脂乳粉30-35，脱盐乳清粉15-20，工业海藻糖15-20，维生素C 3-4，卵磷脂0.05-0.08，余量为蒸馏水；本发明人发现，上述组分的保护剂与菌体的结合效果好，在能够很好地保护菌体的前提下，保证后续冻干工艺的效率。

复合益生乳酸菌粉剂制备：

按重量份计的组分：干酪乳杆菌Zhang菌粉8克，动物双歧杆菌V9菌粉8克，植物乳杆菌P-8菌粉6克，植物乳杆菌C2菌粉6克，低聚半乳糖40克，菊粉10克，蓝莓粉22克；

选取干酪乳杆菌Zhang菌粉、动物双歧杆菌V9菌粉、植物乳杆菌P8菌粉和植物乳杆菌C2菌粉依据所述活菌数含量要求：干酪乳杆菌Zhang活菌数量3.0×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌V9活菌数量4.0×10⁹CFU/g，植物乳杆菌P-8活菌数量3.0×10⁹CFU/g，植物乳杆菌C2活菌数量1.0×10⁹CFU/g；

按重量份数将菌粉进行预先混合；

选取相应重量份的低聚半乳糖、菊粉、蓝莓粉过120目筛，按重量比与预混的益生乳酸菌粉混匀；将粉末分装小条包密封，包装检验并装箱入库即可。

实施例2草莓口味复合益生乳酸菌粉剂制备

按重量份计的组分：干酪乳杆菌Zhang菌粉6克，动物双歧杆菌V9菌粉5克，植物乳杆菌P-8菌粉4克，植物乳杆菌C2菌粉5克，低聚果糖50克，草莓粉30克；

选取干酪乳杆菌Zhang菌粉、动物双歧杆菌V9菌粉、植物乳杆菌P8菌粉和植物乳杆菌C2菌粉依据所述活菌数含量要求：干酪乳杆菌Zhang活菌数量5.0×10⁹CFU/g，动物双歧杆菌V9活菌数量6.0×10⁹CFU/g，植物乳杆菌P-8活菌数量3.0×10⁹CFU/g，植物乳杆菌C2活菌数量2.0×10⁹CFU/g；

按重量份将菌粉进行预先混合；

选取相应重量低聚乳糖、草莓粉过80目筛，按重量比与预混的益生乳酸菌粉混匀；将粉末分装小条包密封，包装检验并装箱入库即可。

实施例1-实施例6的配方见表1。

表1各实施例复合益生乳酸菌粉剂配方表

实施例7复合益生乳酸菌粉剂对治疗肠易激综合征作用的影响

1、研究对象

选取在某医院消化内科门诊及住院部就诊，符合罗马Ⅲ诊断标准的IBS患者120例作为研究对象，年龄18-80岁，性别不限。所有病人均已完善血尿便常规、肝肾功能、腹部超声、胸部平片、胃肠镜、胶囊内镜检查，未发现明显器质性改变。排除标准：伴有其它消化道病变、心肝肾功能不全、恶性肿瘤、糖尿病、既往有腹部手术史者、妊娠或哺乳期妇女、试验前4周内曾服用影响本试验观察的药物(抗生素、中药等)、自身免疫性疾病及不能按期复诊及随访者。

2、实验方法

将120例IBS患者随机分为对照组和常规组，对照组实施常规治疗，试验组在常规治疗同时补充益适，每组60名患者。对照组给予常规基础治疗，复合益生乳酸菌粉剂组在在基础治疗的同时，将复合益生乳酸菌粉剂菌粉溶于温水或牛奶中(1袋口服1/日饭后)，治疗28d。

3、观察指标

(1)大便性状评分：根据Bristol评分标准将大便分为七种类型。第一型：一颗颗硬球(很难通过)；第二型：香肠状，但表面凹凸；第三型：香肠状，但表面有裂痕；第四型：像香肠或蛇一样，且表面很光滑；第五型：断边光滑的柔软块状(容易通过)；第六型：粗边蓬松块，糊状大便；第七型：水状，无固体块(完全液体)；第一型和第二型表示有便秘，分别记2分及1分；第三型和第四型是理想的便形，记为0分；第五至第七型则代表可能有腹泻，分别记为1分、2分及3分。

(2)IBS相关症状积分：治疗以前及治疗期间内，每天记录以下要点：腹痛时间，腹胀时间，排便时有无腹胀、腹痛，排便次数异常比例，排便性状异常比例，粘液便例及里急后重比例。按照表1的评分准则，计算各症状的积分总和，每周统计一次。

表2IBS相关症状积分表(分)

(3)疗效判断标准：根据患者症状总评分、大便性状评分，治愈：各项症状完全消失；显效：各项症状明显减轻(服用后症状总评分较服用前减少＞50％)，大便性状评分下降≥2个等级；有效：各项症状轻度减轻(服用后症状总评分较服用前减少20％～50％)，大便性状评分下降1个等级；无效：各项症状无明显减轻(服用后症状总评分较服用前减少20％)，大便性状评分等级无下降。

(4)肠道菌群检测：检测粪便中肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、产气荚膜杆菌的活菌数量。

4、观察方法

(1)于治疗0、7、14、21、28天记录三组患者大便性状、症状积分；

(2)于治疗0、7、14、28天记录三组患者肠道菌群情况；

(3)比较两组不同方法在大便性状改善、不适症状改善、治疗有效率及肠道菌群、小肠细菌过度生长等方面差异。

5、治疗结果

对照组和复合益生乳酸菌粉剂组对患者的治疗效果以及治愈率见表3。可以看出与对照组相比，复合益生乳酸菌粉剂对肠易激综合征有非常好的疗效，具有见效快，不复发的特点。

表3对照组和复合益生乳酸菌粉剂组对IBS患者的治疗效果以及治愈率

如图1所示，为对照组与复合益生乳酸菌粉剂组(图中简称为益生菌组)样品间Unweighted UniFrac的距离比对图。基于Unweighted UniFrac距离分析，随着治疗时间的延长，对照组样品间的距离之间增大，复合益生乳酸菌粉剂组在整个治疗阶段，样品间距离没有显著的变化趋势，表明复合益生乳酸菌粉剂组(图中简称为益生菌组)的治疗效果组内差异较小，药物治疗对不同患者的作用效果不尽相同，药物治疗组治疗效果组内差异较大，总的来说复合益生乳酸菌粉剂治疗效果更稳定。

如图2所示，为IBS患者肠道菌群的物种丰度指数(图a，P＝2.98e-06)和多样性指数；图b，P＝0.009)比对图。通过对患者肠道菌群比对发现，与对照组相比，复合益生乳酸菌粉剂组(图2中简称为益生菌组)患者肠道菌群在物种丰度指数和多样性指数均显著高于对照组。该结果表明与对照组相比，添加复合益生乳酸菌粉剂治疗更有利于增加患者肠道菌群的丰度和多样性，使患者肠道菌群更加趋于健康化，达到稳固治疗的目的。

实施例8复合益生乳酸菌粉剂对治疗上呼吸道感染作用的影响

上呼吸道感染简称上感，又称普通感冒，免疫功能低下和病原菌暴露是造成呼吸道感染的主要原因，多采用免疫调节剂治疗。上感是包括鼻腔、咽或喉部急性炎症的总称，是一种最常见的疾病，是儿科门诊就诊和住院病因的首位，包括上呼吸道感染(如普通感冒、急性中耳炎、扁桃体炎、鼻窦炎等)和下呼吸道感染(如支气管炎、肺炎等)。反复呼吸道感染指1年以内发生次数频繁、超出正常范围的上、下呼吸道感染。反复的呼吸道感染是困扰患者和医师的常见问题，经常使用抗生素和住院治疗，甚至需要外科手术(如中耳炎)，给患者带来困扰和经济损失。目前认为，机体免疫功能低下是造成反复呼吸道感染的主要原因，所以多主张采用免疫调节剂进行防治。免疫调节剂泛指调节、增强、兴奋和恢复机体免疫功能的药物，能增强淋巴细胞对抗原的免疫应答能力，提高机体内IgA、IgG水平，从而减少呼吸道感染的次数。益生菌可以通过多种途径参与局部和全身的免疫调节，包括定植抵抗力、增强自然杀伤细胞的数量与活性、释放细胞因子、提高抗体应答等。益生菌可以减少呼吸道感染患病次数，减轻症状的严重度，缩短病程，减少抗生素使用。

1、研究对象

90名中青年志愿者(20-50岁，复合益生乳酸菌粉剂组(简称益生菌治疗组)和安慰剂组各45名)和60名老年志愿者(≥51岁，复合益生乳酸菌粉剂组和安慰剂组各30名)进行随机双盲实验。选取的志愿者在实验前三个月及试验期间均没有服用抗生素。

2、实验方法

将中青年志愿者和老年志愿者各随机分为复合益生乳酸菌粉剂组和安慰剂组，复合益生乳酸菌粉剂组在实验期间每天摄入复合益生乳酸菌粉剂菌粉2g，采集调查问卷，评价对志愿者健康状况如鼻腔症状、口腔症状、呼吸道症状、胃肠道症状等的改善情况。另外，分别采集摄入复合益生乳酸菌粉剂组和安慰剂组0天，180天(6月)和360天(12月)志愿者粪便样品用于志愿者肠道菌群分析。

3、治疗结果

图3为在12个月期间内志愿者每月出现的口腔炎症发生次数比对图，结果显示复合益生乳酸菌粉剂组(图3-图10中简称为益生菌治疗组)的口腔炎症状发生次数要显著低于安慰剂组(p<0.05)，表明复合益生乳酸菌粉剂干预对口腔感染具有保护作用。

图4为在12个月期间内年龄20-50岁的志愿者每月出现的鼻腔炎症发生症状比对图，图5为在12个月期间内年龄＞50岁的志愿者每月出现的鼻腔炎症发生症状比对图，结果显示复合益生乳酸菌粉剂组鼻腔症状发生次数显著低于安慰剂组((p<0.05)，表明使用复合益生乳酸菌粉剂干预对鼻腔感染具有显著的保护作用。

图6为在12个月期间内年龄20-50岁的志愿者每月出现的呼吸道炎症发生症状比对图，图7在12个月期间内为年龄＞50岁的志愿者每月出现的呼吸道炎症发生症状比对图，结果显示复合益生乳酸菌粉剂组呼吸道症状发生天数和流感症状发生次数均极显著低于安慰剂组(p<0.01)，表明复合益生乳酸菌粉剂干预对上呼吸道感染发生具有显著预防作用。

图8为在12个月期间内年龄20-50岁的志愿者每月出现的腹泻次数比对图，图9为在12个月期间内年龄＞50岁的志愿者每月出现的腹泻次数比对图，结果显示复合益生菌粉剂复合益生乳酸菌粉剂组肠道腹泻发生次数与安慰剂组相比具有显著降低的趋势(p＝0.079接近于0.05)。复合益生乳酸菌粉剂老年干预组每周肠道排便次数与安慰剂组相比显著增加(p<0.05)，表明使用复合益生乳酸菌粉剂干预可以改善老年人群的排便频率。

图10为在12个月期间内年龄20-50岁的志愿者血液中免疫球蛋白IgG含量比对图。免疫球蛋白IgG是血液和细胞液中发现的主要抗体类型，占到人体血清抗体总量的75％，用于控制组织的感染；IgG由B细胞产生和分泌，通过与多种致病菌的结合发挥抗感染的作用。复合益生乳酸菌粉剂组干预显著增加了中青年组血液中IgG水平(p<0.01)，表明复合益生乳酸菌粉剂可以增加中青年的免疫抵抗作用。

表4老年组摄入复合益生乳酸菌粉剂12个月后变化的菌种

从表4可知，老年组的肠道菌群摄入复合益生乳酸菌粉剂12个月后发生明显变化，Eubacterium hallii和Blautia wexlerae菌种的相对含量显著下降，Parabacteroidesdistasonis的相对含量显著升高，表明复合益生乳酸菌粉剂可以促进老年志愿者肠道菌群年轻化。在复合益生乳酸菌粉剂干预期间，复合益生乳酸菌粉剂可以持续增加志愿者肠道菌群的物种丰度和多样性，促进志愿者肠道菌群多样性的稳定性，使之不会随季节、饮食等发生大的改变。

综上所述，由干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang)、动物双歧杆菌V9(Bifidobacterium animalis V9)、植物乳杆菌P8(Lactobacillus plantarum P8)和植物乳杆菌C2(Lactobacillus plantarum C2)复配的复合益生乳酸菌粉剂具有诸多益生功效，可以有效治疗肠易激综合征并降低复发；对口腔感染、鼻腔感染具有显著的保护作用，对上呼吸道感染发生具有显著预防作用，同时改善胃肠症状、调节肠道菌群，降低肠道菌群年龄指数，使老年人肠道菌群更加趋向年轻化；增加血液中IgG水平，可以提高机体免疫力。

以下对植物乳杆菌C2进行进一步说明。

植物乳杆菌C2菌株于2012年从四川省自然发酵的泡菜中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，发酵农作物或动物粪便能够快速产酸控制物料pH值，其中，可高产一种有机酸为4-羟基苯乳酸，能够广谱抑制大肠杆菌致病菌和霉菌的生长及繁殖，该有机酸是本团队首次发现，具有很高的研究潜力。

植物乳杆菌C2为革兰氏阳性无芽孢直杆菌，1.2vtm*6.2μm，无鞭毛，可运动，兼性厌氧，表面菌落直径约2.5mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，白色。20℃可以生长繁殖，最适生长温度为35～37℃。该菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达82.42％。

该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.14532，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

植物乳杆菌C2耐酸、耐胆盐及其抑菌性能测定

将冷冻保存的植物乳杆菌C2接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液；

所述的MRS液体培养基组成如下((g/L))：蛋白胨10、牛肉膏5、酵母浸粉4、葡萄糖20、磷酸氢二钾2、乙酸钠5、柠檬酸三钠2、吐温-80 1mL、硫酸镁0.2、硫酸锰0.05，加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

1、耐酸、耐胆盐性能测定

在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS缓冲液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将活化好的菌株离心收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。

在pH8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数，实验结果如表5所示：

存活率＝[N₁/N₀]×100％(N₀－0h活菌数；N₁－经模拟肠、胃液消化后的活菌数)

表5植物乳杆菌C2人工模拟胃液和肠液的存活率

2、抑菌性能测定

用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定植物乳杆菌C2发酵液的抑菌效果：将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(10⁶cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

每孔加入100μL植物乳杆菌C2发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果如表6所示：

表6植物乳杆菌发酵液中苯乳酸、4-羟基苯乳酸含量和抑菌特性

注：打孔器直径为8mm

由表5、表6实验结果可知，植物乳杆菌C2菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达82.42％。同时菌株C2具有广谱抑制致病菌的优良特性，且抑菌效果十分显著。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种复合益生乳酸菌粉剂在制备预防口腔感染产品中的应用，其特征在于，所述复合益生乳酸菌粉剂，包括：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2，其保藏编号为CGMCNo.14532；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang，其保藏编号为CGMCC No.5469；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8， 其保藏编号为CGMCC No.6312和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)V9，其保藏编号为CGMCC No.5470；

其中，植物乳杆菌C2的有效活菌数≥1.0×10⁹ CFU/g，干酪乳杆菌Zhang的有效活菌数≥3.0×10⁹ CFU/g，植物乳杆菌P-8的有效活菌数≥3.0×10⁹ CFU/g，动物双歧杆菌V9的有效活菌数为≥4.0×10⁹ CFU/g；

所述复合益生乳酸菌粉剂中总有效活菌数为≥1×10¹⁰ CFU/g；

所述复合益生乳酸菌粉剂中还包括益生元和/ 或果蔬粉；

所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚乳糖、低聚壳聚糖、大豆低聚糖、菊粉、聚葡萄糖中的一种或几种；

所述果蔬粉包括蓝莓粉、草莓粉、蔓越莓粉、樱桃粉、苹果粉、香蕉粉、木瓜粉、芒果粉、火龙果粉、南瓜粉、胡萝卜粉、葡萄粉、石榴粉、哈密瓜粉、枸杞粉、红枣粉、猕猴桃粉中的一种或几种；

所述复合益生乳酸菌粉剂中包括重量份如下的组分：植物乳杆菌C2菌粉1-6份、干酪乳杆菌Zhang菌粉0.1-8份、植物乳杆菌P-8菌粉0.1-6份、动物双歧杆菌V9菌粉0.1-8份、益生元30-75份、果蔬粉5-35份；

所述复合益生乳酸菌粉剂的水分含量不大于2%。

2.一种复合益生乳酸菌粉剂在制备预防上呼吸道感染产品中的应用，其特征在于，所述复合益生乳酸菌粉剂，包括：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2，其保藏编号为CGMC No.14532；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang，其保藏编号为CGMCC No.5469；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8， 其保藏编号为CGMCC No.6312和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)V9，其保藏编号为CGMCC No.5470；

其中，植物乳杆菌C2的有效活菌数≥1.0×10⁹ CFU/g，干酪乳杆菌Zhang的有效活菌数≥3.0×10⁹ CFU/g，植物乳杆菌P-8的有效活菌数≥3.0×10⁹ CFU/g，动物双歧杆菌V9的有效活菌数为≥4.0×10⁹ CFU/g；

所述复合益生乳酸菌粉剂中总有效活菌数为≥1×10¹⁰ CFU/g；

所述复合益生乳酸菌粉剂中还包括益生元和/ 或果蔬粉；

所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚乳糖、低聚壳聚糖、大豆低聚糖、菊粉、聚葡萄糖中的一种或几种；

所述果蔬粉包括蓝莓粉、草莓粉、蔓越莓粉、樱桃粉、苹果粉、香蕉粉、木瓜粉、芒果粉、火龙果粉、南瓜粉、胡萝卜粉、葡萄粉、石榴粉、哈密瓜粉、枸杞粉、红枣粉、猕猴桃粉中的一种或几种；

所述复合益生乳酸菌粉剂中包括重量份如下的组分：植物乳杆菌C2菌粉1-6份、干酪乳杆菌Zhang菌粉0.1-8份、植物乳杆菌P-8菌粉0.1-6份、动物双歧杆菌V9菌粉0.1-8份、益生元30-75份、果蔬粉5-35份；

所述复合益生乳酸菌粉剂的水分含量不大于2%。

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