MX2013002668A - Uso de celulas t de memoria central anti-tercera parte para el tratamiento anti-leucemia/linfona. - Google Patents

Abstract

Se describe un método para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo. El método que comprende: (a) trasplantar una célula o injerto de tejido no singeneico al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito de memoria central (Tcm), las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los ganglios linfáticos después del trasplante, y además en donde las células son ya sea: (i) no singeneicas con tanto el sujeto como el injerto; o (ii) no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto, para de esta manera tratar al sujeto.

Description

USO DE CÉLULAS T DE MEMORIA CENTRAL ANTI-TERCERA PARTE PARA EL TRATAMIENTO ANT -LEUCEMA/LINFOMA CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se relaciona a células anti-tercera parte que inducen no injerto contra la enfermedad del hospedero (GVHD) que comprenden un fenotipo de T-linfocito de memoria central y, más particularmente, pero no exclusivamente, al uso de las mismas para el tratamiento de injerto contra leucemia/linforna .

Las opciones de tratamiento para pacientes con afecciones malignas hematológicas tal como linfoma no de Hodgkin (NHL) son muchas y variadas. Estos protocolos de tratamiento modernos conducen a remisión completa (CR) en una proporción considerable de los pacientes. Sin embargo, muchos de estos pacientes recaen finalmente, implicando que las células tumorales residuales permanecen en los pacientes que logran una CR clínica. Para tratar este desafío la infusión de linfocitos donadores (DLI) dotada con reactividad de injerto contra leucemia/linforna (GVL) está siendo actualmente desarrollada. En particular, se ha hecho progreso en el contexto de trasplante de médula ósea (BMT) alogeneica en conjunción con DLI después del trasplante [Grigg A y Ritchie D, Biol Blood Marrow Transplant (2004) 10: 579-590]. De esta manera, se ha mostrado que las células T CD8+ donadoras presentes en el injerto de células madre o en la DLI tienen el beneficio adicionado de efecto GVL que puede exterminar células malignas residuales [Ho WY y colaboradores, J Clin Invest. (2002) 110: 1415-1417] . Sin embargo, este beneficio se anula por la enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD) , asociada con células T CD8, que impactan adversamente la mortalidad relacionada con trasplante.

El trabajo previo hecho por los presentes inventores ha mostrado que la estimulación ex vivo de células T CD8+ de murino contra estimuladores de tercera parte, bajo privación de IL-2, conduce al crecimiento selectivo de clones de T-linfocito citotóxicos (CTL) CD8+ restringidos de 3ra parte que pueden facilitar el injerto BMT agotado de células T (TDBMT) sin provocar GVHD [Bachar-Lustig E. y colaboradores, Blood (2003) 102:1943-1950; Reich-Zeliger S. y colaboradores, Immunity (2000) 13: 507-515]. Recientemente, los presentes inventores mostraron que las células CD8+ anti-3ra parte activadas con fenotipo de memoria central (Tcm) , pueden soportar adicionalmente y mejorar el injerto de médula ósea (BM) , probablemente debido a la migración la nodo linfático mejorada de las células Tcm, su capacidad proliferativa y persistencia prolongada en recipientes BMT [Ophir E y colaboradores, Blood (2010) 115: 2095-2104].

Adicionalmente, los presentes inventores han mostrado que en humanos, las CTLs anti-3ra parte, aunque agotadas de aloreactividad, muestran exterminio in vitro potente de B-CLL y diferentes tipos de células de linfoma primario [Lask A y colaboradores (enviado 2010) ; Arditti FD y colaboradores, Blood (2005) 105:3365-3371]. Se mostró que esta forma única de GVL es independiente de reconocimiento TCR y se descubrió que es mediada tanto por CTLs anti-3ra parte autólogas como alogeneicas. Adicionalmente, este exterminio independiente de TCR de afecciones malignas de células B por CTLs anti-3ra parte se mostró que es mediado a través de una rápida adhesión a través del enlace ICAMl-LFAl, seguido por la lenta inducción de apoptosis en una interacción critica entre CD8 en la CTL y MHC clase I en la célula tumoral. Por otra parte, se mostró que es independiente de las moléculas muertas de CTLs clásicas: FASL, perforina, TNF y Trail [Lask A y colaboradores, supra] .

La técnica antecedente adicional incluye WO/2010/049935.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende: (a) trasplantar una célula o injerto de tejido no singeneico al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los ganglios o nodos linfáticos después del trasplante, y. además en donde las células son ya sea: (i) no singeneicas con tanto el sujeto como el injerto; o (ii) no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto, para de esta manera tratar al sujeto.

De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante, como un tratamiento adyuvante para la erradicación de una enfermedad en un sujeto quien ha sido trasplantado con una célula o injerto de tejido no singeneico, en donde las células son ya sea: (i) no singeneicas con tanto el sujeto como el injerto; o (ii) no singeneicas con el injerto o singeneicas con el sujeto.

De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no GVHD que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante, y además en donde las células son ya sea: (i) no singeneicas con tanto un sujeto hospedero como un injerto, en donde el sujeto y el injerto no son singeneicos; o (ii) no singeneicas con un injerto y singeneicas con un sujeto hospedero, en donde el sujeto y el injerto no son singeneicos .

De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende: (a) trasplantar células hematopoyéticas inmaduras al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprende células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante, en donde cuando las células hematopoyéticas inmaduras son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células son singeneicas seleccionadas con el sujeto o no singeneicas con el sujeto.

De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende: (a) trasplantar células hematopoyéticas inmaduras al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante, en donde cuando las células hematopoyéticas inmaduras no son singeneicas co el sujeto, la población aislada de las células son singeneicas seleccionadas con el sujeto o no singeneicas con tanto el sujeto como las células hematopoyéticas inmaduras.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la célula o injerto de tejido no singeneico se deriva de un donador seleccionado del grupo que consiste de un donador idéntico HLA y un donador no idéntico HLA.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el sujeto y el donador ambos son humanos.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el sujeto es un sujeto humano.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la célula o injerto de tejido no es autólogo y la población aislada de células son autólogas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la célula o injerto de tejido y la población aislada de células son de diferentes donadores.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la enfermedad comprende una afección maligna.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la afección maligna comprende una afección maligna de células B.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la afección maligna comprende una leucemia.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la afección maligna comprende un linfoma.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el injerto comprende células de médula ósea.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células de médula ósea comprenden células hematopoyéticas inmaduras.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células hematopoyéticas inmaduras no son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células son singeneicas con el sujeto.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células hematopoyéticas inmaduras no son autólogas y la población aislada de células son autólogas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención cuando las células hematopoyéticas inmaduras no son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células no son singeneicas con tanto el sujeto como con el injerto.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células hematopoyéticas inmaduras y la población aisladas de células son de diferentes donadores.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el método comprende además administrar por lo menos un fármaco inmunosupresor al sujeto.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el sujeto se acondiciona además bajo acondicionamiento subletal, letal o supraletal antes de la etapa (a) .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la etapa (a) y la etapa (b) se llevan a cabo concomitantemente .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la etapa (b) se lleva a cabo antes de la etapa (a) .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención la etapa (b) se lleva a cabo un día después de la etapa (a) .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central comprende una firma CD8+/CD62L+.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención por lo menos 50% de la población aislada de células tiene la firma.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención los nodos linfáticos comprenden nodos linfáticos periféricos.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención los nodos linfáticos comprenden nodos linfáticos mesentéricos .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto comprenden células autologas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto hospedero son autologas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células hematopoyéticas inmaduras y la población aislada de células son autologas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células hematopoyéticas inmaduras son autologas y la población aislada de células no son autologas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células hematopoyéticas inmaduras no son autologas y la población aislada de células son autologas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células hematopoyéticas inmaduras y la población aislada de células son de diferentes donadores.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las células anti-tercera parte que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante son generadas por: (a) al poner en contacto células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con un antigeno o antigenos de tercera parte en presencia o ausencia de IL-21 bajo condiciones que permiten la eliminación de células reactivas GVH; y (b) cultivar las células que resultan de la etapa (a) en presencia de IL-15 en un entorno sin antigeno bajo condiciones que permiten la proliferación de células que comprenden el fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, para de esta manera generar la población aislada de células .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las condiciones que permiten la eliminación de células reactivas GVH comprenden cultivo durante 1-5 días.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las condiciones que permiten la eliminación de células reactivas GVH comprenden 1-5 días en un cultivo primado de citocinas .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el antigeno o antigenos de tercera parte comprenden células dendriticas .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el antigeno o antigenos de tercera parte se seleccionan del grupo que consiste de células de tercera parte, un antigeno de células, un antigeno viral, un antigeno viral, un antigeno bacteriano, un extracto de proteína, una proteína purificada y un péptido sintético presentado por células presentadoras autólogas, células presentadoras no autólogas o sobre una célula presentadora de vehículo artificial o antígeno artificial.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las condiciones que permiten la proliferación de células comprenden además IL-7.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el cultivo en presencia de IL-15 se afecta durante 3-30 días.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el cultivo en presencia de IL-15 se afecta durante 6-30 días.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención el cultivo en presencia de IL-15 se afecta durante 3-20 días.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las condiciones que permiten la proliferación de células comprenden cultivo durante 3-10 días.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención las condiciones quelas condiciones que permiten la proliferación de células comprende cultivo durante 3-7 días.

A menos que se defina de otra manera, todos los térmicos técnicos y/o científicos usados en la presente tiene el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual la invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de las modalidades de la invención, los métodos y/o materiales ejemplares se describen posteriormente. En caso de conflicto, la especificación de patente, incluyendo definiciones, lo controlarán. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen para ser necesariamente limitantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Algunas modalidades de la invención se describen en la presente, a manera de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia especifica ahora a los dibujos con detalle, se resalta que los detalles mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de planteamiento ilustrativo de las modalidades de la invención. En este aspecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a aquellas personas expertas en la técnica como las modalidades de la invención se pueden practicar.

En los dibujos: Las FIGs. 1A-I representan la inhibición de la recaída tumoral por células Tcm c anti-3ra parte derivadas singeneicas después del trasplante de médula ósea singeneico. Ratones BALB/c (H-2+) letalmente irradiados (8 Gy) recibieron intravenosamente un trasplante de 3 x 106 células de médula ósea agotadas de células T singeneicas (BALB/c-NUDE (H-2d) en presencia o ausencia de 5 x 103 células de linfoma A20-luc (día 0) . Los ratones luego se inyectaron intravenosamente con o sin los números indicados de células Tcm anti-3ra parte derivadas BALB/c (indicadas como células de leucemia + Tcm, n 7; o con solamente células de leucemia, n =7, respectivamente) en el día- +1. Las Figuras 1A-H son fotografías que representan el crecimiento tumoral supervisado mediante formación de imágenes de bioluminiscencia (BLI) del día 14 en intervalos semanales; la Figura II es una gráfica que representa la tasa de supervivencia de los animales de los diferentes grupos de tratamiento. El eje X indica días después de la inyección de células tumorales y el eje y indica la proporción de supervivencia de ratones recipientes o recibidores.

Las FIGs. 2A-G representan la inhibición de la recaída tumoral por células T CD8 anti-3ra parte derivadas de Fl después del trasplante de médula ósea singeneico. Ratones BALB/c (H-2d) letalmente irradiados (8 Gy) recibieron intravenosamente un trasplante de 3 x 106 células de médula ósea agotadas de células T singeneicas (BALB/c-NUDE (H-2d) en presencia o ausencia de 5 x 103 células de linfoma A20-luc (día 0) . Los ratones luego se inyectaron intravenosamente con o sin 2 x 107 células Tcm anti-3ra parte derivadas de Fl (células de leucemia + Tcm, n = 7) o sin (células de leucemia solas, n=5) en el día +1; las Figuras 2A-F son fotografías que representan el crecimiento tumoral supervisado por BLI del día 14 en intervalos semanas. La Figura 2G es una gráfica que representa la tasa de supervivencia de los animales de los diferentes grupos de tratamiento. El eje X indica los días después de la inyección de células tumorales y el eje y indica la proporción de la supervivencia de ratones recipientes .

Las FIGs. 3A-I representan la inhibición de la recaída tumoral por células Tcm anti-3ra parte derivadas alogeneicas después del trasplante de médula ósea alogeneico. Ratones BALB/c (H-2d) letalmente irradiados (8 Gy) recibieron intravenosamente un trasplante de 3 x 106 células de médula ósea agotadas de células T alogeneicas (C57BL/6-NUDE (H-2b) en presencia o ausencia de 5 x 103 de células de linfoma A20-luc (día 0) . Los ratones luego se inyectaron intravenosamente con células derivadas C57BL/6 (en el día +1) . Las Figuras 3A-H son fotografías que representan el crecimiento tumoral supervisado por BLI del día 13 en intervalos semanales; la Figura 31 es una gráfica que representa la tasa de supervivencia de los animales de los diferentes grupos de tratamiento. El eje X indica días después de la inyección de células tumorales y el eje y indica la proporción de supervivencia de ratones recipientes.

Las FIGs. 4A-B son gráficas que representan la proliferación y fenotipo de células de células de memoria central T anti-tercera parte de la presente invención. La Figura 4A representa la proliferación de células Tcm del día 0 hasta el día 12 del cultivo; y la Figura 4B representa el fenotipo de células usando el mismo cultivo contra Allo-DC.

La FIG. 5 es una gráfica que representa el porcentaje de células apoptóticas después de 22 horas de reacción de linfocitos mezclada (MLR) con lineas de células de linfoma de células B y de leucemia de células plasmáticas. Lineas de células Daudi pre-etiquetadas con CalceinAM, mutante H . My2 CIR HLA A2 K66A o L363 se incubaron durante 22 horas con o sin exceso de 5 veces de Tcm anti-3ra parte. Células V+ de anexina se determinaron por FACS. Los datos se muestran como media ±SD de cultivos pentaplicados . Los valores ***p<0.001 indican cambios estadísticamente significativos comparados con las muestras cultivadas en la ausencia de Tcm.

La FIG. 6 es una gráfica que representa el número de células vivas después 22 horas de reacción de linfocitos mezclados (MLR) con líneas de células EBV-LCL de linfoma de células B y de leucemia de células plasmáticas. Líneas de células Daudi pre-etiquetadas con CalceinAM, mutante H . My2 CIR HLA A2 K66A o L363 se incubaron durante 22 horas con o sin exceso de 5 veces de Tcm anti-3ra parte. Los números de células CalceinAM"1" viables se determinaron por FACS. Los datos se muestran como media ±SD de cultivos pentaplicados. Los valores ***p<0.001 indican cambios estadísticamente significativos comparados con las muestras cultivadas en la ausencia de Tcm.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se refiere a células anti-tercera parte que inducen no injerto contra la enfermedad del hospedero (GVHD) que comprenden un fenotipo de T-linfocito de memoria central y, más particularmente, pero no exclusivamente, al uso de las mismas para el tratamiento de injerto contra leucemia/linforna .

Los principios y operación de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y descripciones acompañantes.

Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención con detalle, se va a entender que la invención no se limita necesariamente en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o ser practicada o ser llevada a cabo en varias formas. También, se va a entender que la fraseología y terminología empleadas en la presente es para el propósito de la descripción y no se deben considerar como limitantes.

Mientras que se reduce la presente invención a la práctica, los presentes inventores han descubierto que las células de memoria central T (Tcm) CD8+ anti-3ra parte comprenden actividad de injerto contra leucemia/linfoma (GVL) in vivo y por lo tanto se pueden usar para tratar enfermedades hematopoyéticas malignas, tales como linfoma y leucemia .

Como se muestra en la presente a continuación y en la sección de ejemplos que sigue, los presentes inventores han mostrado la reactividad GVL de células Tcm CD8+ anti-3ra parte en un modelo de ratón in vivo diseñado específicamente para estimular el trasplante de médula ósea alogeneico (BMT) en pacientes con linfoma. Inicialmente, los inventores confirmaron in vitro que las células Tcm anti-3ra parte de murino derivadas no aloreactivas actúan similarmente a la CTLs anti-3ra parte humanas y erradican directamente células de linfoma de murino A20 (ver el Ejemplo 1 de la sección de Ejemplos que sigue) . Subsecuentemente, los presentes inventores establecieron un modelo de ratón de enfermedad residual mínima para linfoma de células B usando línea de células de linfoma de células B A20 en las cuales el gen reportero de luciferasa se integró establemente en su genoma (A20-luc) . Estas células permitieron la supervisión sensible de la progresión de tumor in vivo mediante formación de imágenes de bioluminiscencia (BLI) . Usando este modelo, los inventores descubrieron que las células Tcm anti-3ra parte tanto singeneicas como alogeneicas mostraron reactividad GVL marcada sin provocar enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD) cuando se administraron en conjunción con un trasplante de médula ósea singeneico (Ejemplos 2 y 3, respectivamente, de la sección de Ejemplos que sigue) . Adicionalmente, los presentes inventores mostraron un efecto GVL efectivo carente de GVHD cuando se administran células Tcm anti-3ra parte alogeneicas (tipo donador) en conjunción con un trasplante de médula ósea alogeneico (Ejemplo 4, de la sección de Ejemplos que sigue) . Tomados conjuntamente, todos estos descubrimientos justifican el uso de células Tcm anti-tercera parte como células de injerto contra leucemia/linforna para la erradicación de células enfermas. Por otra parte, los presentes resultados muestran la capacidad de usar células Tcm anti-tercera parte de un donador no singeneico con respecto al recipiente y al donador de trasplante (por ejemplo de dos diferente donadores) .

De esta manera, de acuerdo a un aspecto de la presente invención se proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende: (a) trasplantar una célula o injerto de tejido al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia incapaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante, y además en donde las células son ya sea: (i) no singeneicas con tanto el sujeto con el injerto; o (ii) no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto, para de esta manera tratar al sujeto.

Como se usa en la presente, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, desacelerar o revertir la progresión de una condición, mejorar sustancialmente síntomas clínicos o estéticos de una condición o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéricos de una condición.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" o "sujeto en necesidad del mismo" se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano, hombre o mujer en cualquier edad que esté en necesidad de una célula o injerto de tejido. Típicamente el sujeto está en necesidad de una célula o injerto de tejido (también referido en la presente como recipiente, debido a un desorden o una condición patológica o indeseada, estado, o síndrome, o una anormalidad física, morfológica o fisiológica que es susceptible al tratamiento a través del trasplante de una célula o injerto de tejido. Ejemplos de tales desórdenes se proporcionan a continuación adicionalmente .

Como se usa en la presente, la frase "célula o injerto de tejido" se refiere a una célula corporal (por ejemplo una sola célula o un grupo de células) o tejido (por ejemplo tejidos sólidos o tejidos blandos que se pueden trasplantar en totalidad o en parte). Tejidos ejemplares que se pueden trasplantar de acuerdo con las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, tejidos de linfoides/hematopoyéticos (por ejemplo nodo linfático, parches de Peyer, timo o médula ósea) . Las células ejemplares que se pueden trasplantar de acuerdo con las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, células madre hematopoyéticas (por ejemplo células hematopoyéticas inmaduras) .

De acuerdo con una modalidad específica, las células madre hematopoyéticas de la presente invención son CD34+.

Dependiendo de la aplicación, el método se puede llevar a cabo usando una célula o injerto de tejido que es singeneico o no singeneico con el sujeto.

Como se usa en la presente, el término "singeneico" se refiere a una célula o tejido que se deriva de un individuo que es esencialmente de manera genética idéntico con el sujeto. Típicamente, esencialmente mamíferos completamente innatos, clones de mamífero, o mamíferos gemelos homocigóticos son singeneicos.

Ejemplos de células o tejidos singeneicos incluyen células o tejidos derivados del sujeto (también referidos en la técnica como "autólogos") , un clon del sujeto, o un gemelo homocigótico del sujeto.

Como se usa en la presente, el término "no singeneico" se refiere a una célula o tejido que se deriva de un individuo quien es alogeneico xenogeneico con los linfocitos del sujeto (también referido en la técnica como "no autólogos") .

Como se usa en la presente, el término "alogeneico" se refiere a una célula o tejido que se deriva de un donador quien es de la misma especie como el sujeto, pero que es sustancialmente no clonal con el sujeto. Típicamente, mamíferos gemelos no zigóticos, no congénito de la misma especie son alogeneicos entre sí. Se apreciará que un donador alogeneico puede ser HLA idéntico o HLA no idéntico con respecto al sujeto.

Como se usa en la presente, el término "xenogeneico" se refiere a una célula o tejido que expresa sustancialmente antígenos de una especie diferente relativa a las especies de una proporción sustancial de los linfocitos del sujeto. Típicamente, mamíferos no congénitos de diferentes especies son xenogeneicos entre sí.

La presente invención contempla que las células o tejidos xenogeneicos se derivan de una variedad de especies tales como, pero no limitado a, bovinos (por ejemplo, vacas), équidos (por ejemplo, caballos) , porcinos (por ejemplo cerdos) , óvidos (por ejemplo, cabra, oveja) , felinos (por ejemplo, Felis doméstica) , caninos (por ejemplo, Canis doméstica) , roedores (por ejemplo, ratón, rata, conejo, conejillo de indias, jerbo, hámster) o primates (por ejemplo, chimpancé, mono Rhesus, mono macaco, mono tití) .

Las células o tejidos de origen xenogeneico (por ejemplo origen porcino) se obtienen preferiblemente de fuente que es conocida por estar libre de zoonosis, tal como retrovirus endógenos porcinos. Similarmente , las células o tejidos derivados de humano se obtienen preferiblemente de fuentes sustancialmente sin patógenos.

De acuerdo con una modalidad de la presente invención, tanto el sujeto como el donador son humanos.

Dependiendo de la aplicación y fuentes disponibles, las células o injertos de tejido de la presente invención se pueden obtener de un organismo prenatal, organismo postnatal, un adulto o un donador cadáver. Por otra parte, dependiendo de la aplicación necesaria, las células o tejidos pueden ser puros o genéticamente modificados. Tales determinaciones están muy dentro de la capacidad de una persona de experiencia ordinaria en la técnica.

Cualquier método conocido en la técnica se puede emplear para tener una célula o tejido (por ejemplo para trasplantes) .

El trasplante de la célula o injerto de tejido en el sujeto se puede efectuar en varias formas, dependiendo de varios parámetros, tales como, por ejemplo, el tipo de célula o tejido; el tipo, etapa o gravedad de la enfermedad del paciente (por ejemplo insuficiencia orgánica) ; los parámetros físicos o fisiológicos específicos al sujeto; y/o el resultado terapéutico deseado.

El trasplante de una célula o injerto de tejido de la presente invención se puede efectuar al trasplantar la célula o injerto de tejido en cualquiera de varias ubicaciones anatómicas, dependiendo de la aplicación. La célula o injerto de tejido se puede trasplantar en una ubicación anatómica homotópica (una ubicación anatómica normal para el trasplante) , o en una ubicación anatómica ectópica (una ubicación anatómica normal para el trasplante) . Dependiendo de la aplicación, la célula o injerto de tejido se puede implantar ventajosamente bajo la cápsula renal, o en el riñon, la grasa testicular, el tejido subcutáneo, el omento, la vena portal, el hígado, el bazo, los huesos, la cavidad cardíaca, el corazón, la cavidad del pecho, el pulmón, la piel, el páncreas y/o el espacio a intra-abdominal .

Por ejemplo, en casos que requieran trasplante de células hematopoyéticas inmaduras, las células hematopoyéticas autólogas, alogeneicas o xenogeneicas inmaduras (por ejemplo células madre) que se pueden derivar, por ejemplo, de médula ósea, sangre periférica movilizada (mediante por ejemplo leucaferesis ) , hígado fetal, saco vitelino y/o sangre del cordón umbilical del donador singeneico o no singeneico se pueden trasplantar a un recipiente que sufre de una enfermedad.

De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la enfermedad es una enfermedad maligna. De acuerdo con una modalidad específica, la enfermedad maligna es una afección maligna de tejidos hematopoyéticos o linfoides. De acuerdo con otra modalidad específica, la enfermedad maligna es una afección maligna de células B (es decir que implican linfocitos B) .

Tal enfermedad incluyen, pero no se limita a, leucemia [por ejemplo, linfática aguda, linfoblástica aguda, de células pre-B linfoblástica aguda, leucemia de células T linfoblástica aguda, megacarioblástica aguda, monocítica, mielogenosa aguda, mieloide aguda, mieloide aguda con eosinofilia, células B, basofílica, mieloide crónica, crónica, células B, eosinofílica, Friend, granulocítica o mielocítica, célula pilosa, linfocítica, megacarioblástica, monocítica, monocítica-macrófago, mieloblástica, mieloide, mielomonocítica, célula plasmática, célula pre-B, promielocítica , subaguda, células T, neoplasma linfoide, predisposición a afección maligna mieloide, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica aguda de células T (T-ALL) y leucemia linfocitica crónica de células B (B-CLL) ] , linfoma [por ejemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, células B, linfoma de células B grandes difusas (DLBCL) , leucemia/linforna linfocitico crónico de células B, linfoma de Burkitt, célula T, célula T cutánea, leucemia/linforna de células T precursora, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma MALT, histiocitica, linfoblástica, timica and Mycosis fungoides] , enfermedades asociadas con trasplante de un injerto (por ejemplo rechazo de injerto, rechazo de injerto crónico, rechazo de injerto sub-agudo, rechazo de injerto hiperagudo, rechazo de injerto agudo y enfermedad de injerto contra hospedero) , enfermedades autoinmunes tales como diabetes tipo 1, síndrome de inmunodeficiencia combinados graves (SCID) , que incluyen adenosina desaminasa (ADA) , osteoporosis, anemia aplásica, enfermedad de Gaucher, talasemia y otras anormalidades hematopoyéticas congénitas o genéticamente determinadas.

Se apreciará que las células hematopoyéticas singeneicas o no singeneicas (por ejemplo células hematopoyéticas inmaduras) de la presente invención se pueden trasplantar en un recipiente usando cualquier método conocido en la técnica para el trasplante de células, tal como pero no se limita a, infusión de células (por ejemplo I.V.) o a través de una vía intraperitoneal .

Opcionalmente, cuando se trasplanta una célula o injerto de tejido de la presente invención en un sujeto que tiene un órgano defectuoso, puede ser ventajoso primero remover por lo menos parcialmente el órgano con falla del sujeto para permitir el desarrollo óptimo del injerto, e integración estructural/funcional del mismo con la anatomía/fisiología del sujeto.

Después del trasplante de la célula o injerto de tejido en el sujeto de acuerdo con las presentes enseñanzas, es aconsejable, de acuerdo con la práctica médica estándar, supervisar la funcionalidad de crecimiento de inmunocompatibilidad del órgano de acuerdo con uno de las diversas técnicas estándares. Por ejemplo, el desarrollo estructural de las células o tejidos se puede supervisar a través de tomografia computarizada o formación de imágenes de ultrasonido mientras que el injerto de la célula no singeneica o injertos de la médula ósea se pueden supervisar por ejemplo mediante prueba de quimerismo [por ejemplo por procedimientos basados en PCR usando el análisis de repetición en tándem corto (STR) ] .

Sin considerar el tipo de trasplante, para evitar el rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra hospedero y de eliminar cualquiera de células tumorales residuales, el método de la presente invención usa células Tcm anti-tercera parte.

De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, el sujeto se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante.

La frase "población aislada de células" como se usa en la presente se refiere a células que se han aislado de su medio ambiente natural (por ejemplo, el cuerpo humano) .

El término "no GVHD" como se usa en la presente se refiere a tener reactividad inductora no de injerto contra hospedero. De esta manera, las células de la presente invención se generan para no provocar significativamente enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD) .

La frase "células anti-tercera parte" como se usa en la presente se refiere a linfocitos (por ejemplo T-linfocitos) que se dirigen (por ejemplo mediante reconocimiento de células T) contra un antigeno o antígenos de tercera parte.

Como se usa en la presente la frase "antigeno o antigenos de tercera parte" se refiere a un antigeno o antigenos solubles o no solubles (tal como asociadas con membrana) que no están presentes en ya sea el donador o recipiente, como se representa con detalle a continuación.

De acuerdo con una modalidad, el antígeno o antígeno de tercera parte de la presente invención se seleccionan del grupo que consiste de células de tercera parte, un antigeno celular, un antigeno viral un antigeno bacteriano, un extracto de proteína, una proteína purificada y un péptido sintético presentado por células presentadoras autólogas, células presentadoras no autólogas o sobre una célula presentadora de vehículo artificial o de antígeno artificial .

Por ejemplo, los antígenos de te tercera parte pueden ser células de tercera parte, antígenos de virus, tales como por ejemplo virus de Epstein-Barr (EBV) . o cito-megalovirus (CMV) o antígenos de bacterias, tal como flagelina. Los antígenos virales o bacterianos se pueden presentar por células (por ejemplo, línea de células) infectadas con los mismos o de otra manera hechos para expresar proteínas virales/bacterianas. Las células presentadoras de antígenos autologos o no autologos se pueden usar para presentar péptidos sintéticos cortos fusionados o cargados a los mismos. Tales péptidos cortos pueden ser péptidos derivados virales o péptidos que representan cualquier otro antígeno.

Se puede usar software dedicado para analizar secuencias virales u otras para identificar péptidos cortos inmunogénicos , es decir, péptidos presentables en el contexto de MHC clase I o MHC clase II.

Las células de tercera parte pueden ser ya sea alogeneicas o xenogeneicas con respecto al recipiente (explicado con detalle adicional posteriormente) . En el caso de las células de tercera parte alogeneicas, tales células tienen antigenos HLA diferentes de aquellos del donador pero que no son de reacción cruzada con los antigenos HLA recipientes, tales que las células anti-tercera parte generadas contra tales células no son reactivas contra un trasplante o antigenos recipientes.

De acuerdo con una modalidad de la presente invención las células de tercera parte alogeneicas o xenogeneicas son células estimuladoras tales como, pero no limitadas a, células purificadas de linfocitos de sangre periférica (PBL) , en bazo o nodos linfáticos, PBLs movilizadas con citocina, células dendriticas presentadoras de antigeno expandidas in vitro (APC) , lineas de células B, células presentadoras de antigeno (APC) tal como APC artificiales (por ejemplo linea de células K562 transfectadas con HLA y/o moléculas co-estimuladoras ) .

De acuerdo con una modalidad, el antigeno o antigeno de tercera parte comprenden células dendriticas.

Los antigenos de tercera parte se pueden presentar sobre las superficies celulares, virales o bacterianas o derivadas y/o purificadas de las mismas. Adicionalmente, un antígeno viral, bacteriano o cualquier extraño se puede expresar en una célula infectada o se puede expresar sobre un vehículo artificial tal como un liposoma o una APC artificial (por fibroblasto o línea de células de leucémicas transíectadas con el antígeno o antígeno de tercera parte) .

Además, los antígenos de tercera parte pueden, por ejemplo, ser proteínas extraídas o purificadas a partir de una variedad de fuentes. Un ejemplo de una proteína purificada que puede servir como un antígeno de tercera parte de acuerdo con la presente invención es ovalbúmina. Otros ejemplos son contemplados.

El uso de células, virus, bacterias, células presentadoras viralmente infectadas, infectadas con bacterias, de péptidos virales o de péptidos bacterianos como antígenos de tercera parte es particularmente ventajoso puesto que tales antígenos de tercera parte incluyen un arreglo diverso de determinantes antigénicos y como tal dirigen la formación de células anti-tercera parte de una población diversa, que puede servir adicionalmente en la rápida constitución de células T en casos donde tal reconstitución es requerida, por ejemplo, después del procedimiento de irradiación o quimioterapia letal o sub-letal .

Adicionalmente, cuando las células anti-tercera parte se dirigen contra antígenos de tercera parte, es ventajoso obtener por lo menos alguna actividad de injerto contra enfermedad (por ejemplo células cancerosas tal como injerto contra leucemia) debido a un exterminio independiente de TCR mediado por el enlace LFA1-ICAM1 [Arditti y colaboradores, Blood (2005) 105 ( 8 ): 3365-71. Epub 2004 Jul 6].

De acuerdo con algunas modalidades, las células anti-tercera parte de la presente invención comprenden un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central.

La frase "fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central" como se usa en la presente se refiere a un subconjunto de células citotóxica T que se albergan a los nodos linfáticos. Las células que tienen el fenotipo Tcm, en humanos, expresan típicamente CD8+/CD62L+/CD45R0+/L-selectin+/CD45RA- . De acuerdo con una modalidad más específica el fenotipo Tcm comprende una firma CD8+/CD62L+. Se apreciara que las células Tcm pueden expresar todos los marcadores de firma en una sola célula o pueden expresar solamente parte de los marcadores de firma en una sola célula .

Se apreciará que por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 100% de la población aislada de células comprenden células que tienen la firma de células.

Como se menciona, las células Tcm se albergan típicamente a los nodos linfáticos después del trasplante. De acuerdo con algunas modalidades las células Tcm anti-tercera parte de la presente invención pueden albergarse a cualquiera de los nodos linfáticos después del trasplante, como por ejemplo, los nodos linfáticos periféricos y los nodos linfáticos mesentéricos . La naturaleza de migración de estas células les permite ejercer su efecto de tolerancia en una manera rápida y eficiente.

De esta manera, las células Tcm anti-tercera parte de la presente invención son células inductoras de tolerancia .

La frase "células inductoras de tolerancia" como se usa en la presente se refiere a células que provocan respuesta disminuida de las células del recipiente (por ejemplo células T del recipiente) cuando entran en contacto con las mismas. Las células inductoras de tolerancia incluyen células veto (es decir células T que conducen a la apoptosis de las células T del hospedero en el contacto con las mismas) como se describió previamente en las publicaciones de PCT Nos. WO 2001/049243 y O 2002/102971.

El uso de células inductoras de tolerancia es especialmente benéfico en situaciones en las cuales existe una necesidad de eliminar el rechazo de injerto y superar la enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD) , tal como en el trasplante de células o tejidos alogeneicos o xenogeneicos .

De acuerdo co algunas modalidades, las células Tcm de la presente invención pueden ser células puras (por ejemplo no genéticamente modificadas) o células genéticamente modificadas (por ejemplo células que se han diseñado genéticamente para expresar o no expresar genes específicos, marcadores o péptidos o para secretar o no secretar citocinas específicas) . Cualquier método conocido en la técnica se puede implementar en diseñar genéticamente las células, tal como mediante inactivación del gen/s relevante o mediante la inserción de un RNA antisentido que interfiere con la expresión de polipéptido (ver por ejemplo WO/2000/03929 , que se incorpora en la presente a manera de referencia) .

Cualquier método usado para la generación de células no aloreactivas anti-tercera parte (carentes de actividad de injerto contra hospedero (GVH) ) se pueden usar de acuerdo con las presentes enseñanzas.

Las células Tcm anti-tercera parte de la presente invención se generan típicamente primero al poner en contacto células mononucleares de sangre periféricas singeneicas o no singeneicas (PBMC) con un antígeno o antígenos de tercera parte (tal como se describe en lo anterior) en un cultivo privado de citocinas (es decir, sin la adición de citocinas) . Esta etapa se lleva a cabo típicamente durante aproximadamente 12-72 horas, 24-48 horas, 1-10 días, 1-7 dias, 1-5 dias, 2-3 dias o 2 dias y permite la eliminación de células reactivas GVH (por ejemplo células T) . Alternativamente, las células Tcm anti-tercera parte se pueden generar carentes Tcm de actividad de injerto contra hospedero (GVH) al complementar el cultivo de otra manera sin citocinas con IL-21 (0.001-3000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0.1-100 ng/ml, 0.1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml o 1-10 ng/ml) . Esta etapa se lleva a cabo típicamente durante aproximadamente 12-72 horas, 24-48 horas, 1-10 días, 1-10 días, 1-7 días, 1-5 días, 2-3 días o 3 días.

Después, las células anti-tercera parte se cultivan en presencia de IL-15 (0.05-500 ng mi, 0.001-3000 ng/ml, 10 -1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0.1-100 ng/ml, 0.1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml o 1-10 ng/ml. De acuerdo a una modalidad específica, la concentración es 5 ng/ml) durante un período de aproximadamente 3-30 días, 6-30 días, 3-20 días, 10-20 días, 3-15 días, 5-15 días, 7-15 días, 7-14 días, 3-10 días, 3-7 días o 14 días en un entorno sin antígeno. El cultivo se puede llevar a cabo adicionalmente en presencia de citocinas adicionales tales como IL-7 (0.05-500 ng/ml, 0.001-3000 ng/ml, 10 - 1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0.1-100 ng/ml, 0.1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml o 1-10 ng/ml. de acuerdo con una modalidad específica la concentración es 5 ng/ml) y/o IL-21 (0.001-3000 ng/ml, 0.001-3000 ng/ml, 10 - 1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0.1-100 ng/ml, 0.1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml o 20-50 ng/ml . De acuerdo con una modalidad especifica la concentración es 30 ng/ml) . Este proceso permite la proliferación de células anti-tercera parte que comprenden un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central y se priva de reactividad GVHD.

Se apreciará que una etapa adicional que permita la selección de células T CD8+ se puede llevar a cabo, tal como mediante el uso de cuentas de ACS, antes de el cultivo de las células en presencia de IL-15. Tal etapa puede ser benéfica sin incrementar la pureza de las células CD8+ dentro del cultivo (es decir eliminar otros linfocitos dentro del cultivo celular por ejemplo células T CD4+) a fin de incrementar el número de células T CD8+. De esta manera, el aislamiento de las células CD8+ se puede hacer antes del cultivo con el antigeno o antigenos de tercera parte o después del cultivo con el antigeno o antigenos de tercera parte y antes del cultivo con CD15.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, las PBMCs singeneicas (por ejemplo del sujeto) se pueden usar de acuerdo con las presentes enseñanzas (es decir en situaciones cuando las células Tcm singeneicas pueden ser benéficas para el tratamiento) . Del mismo modo, las PBMCs no singeneicas (por ejemplo alogeneicas o xenogeneicas con respecto al sujeto) se pueden usar de acuerdo con las presentes enseñanzas. La fuente de las PBMCs se determinará con respecto al uso propuesto de las células (ver detalles adicionales) posteriormente en la presente) y estarán dentro de la capacidad de una persona experta en la técnica, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente.

Como se describe con detalle en la sección de ejemplos que sigue, los presentes inventores han mostrado que las células Tcm anti-tercera parte pueden ser del mismo origen como la célula o injerto de tejido (por ejemplo células de la médula ósea) , específicamente, se pueden derivar tanto de un donador singeneico (por ejemplo o por ejemplo del sujeto, ver Ejemplo 2 y Figures 1A-I) o ambas se pueden derivar de un donador no singeneico (por ejemplo de un donador alogeneico, ver el Ejemplo 4 y Figures 3A-I) . A la inversa, las células Tcm anti-tercera parte pueden provenir de un origen diferente comparado con la célula o injerto de tejido (por ejemplo las células de médula ósea pueden provenir del sujeto y las células anti-tercera parte pueden provenir de un donador alogeneico, Ejemplo 3 y Figures 2A-G) .

De esta manera, de acuerdo con una modalidad de la presente invención, las células Tcm anti-tercera parte pueden ser no singeneicas (por ejemplo alogeneicas o xenogeneicas ) con tanto el sujeto como el injerto.

Como se usa en la presente, la frase "no singeneica con tanto el sujeto como el injerto" cando se relacionan con células Tcm anti-tercera parte de la presente invención califica la célula Tcm anti-tercera parte por ser alogeneicas o xenogeneicas con el sujeto, y alogeneicas o xenogeneicas con el injerto en cualquier combinación. De esta manera, las células Tcm anti-tercera parte se pueden obtener de un origen diferente de sujeto y del donador de injerto.

De acuerdo con una modalidad especifica, las células Tcm anti-tercera parte no son singeneicas con tanto el sujeto como el injerto (por ejemplo de un segundo donador) .

De acuerdo con otra modalidad, las células Tcm anti-tercera parte pueden ser no singeneicas con respecto a solo el sujeto. De acuerdo con otra modalidad, las células Tcm anti-tercera parte pueden ser no singeneicas con respecto a solo la célula o injerto de tejido.

De acuerdo con una modalidad, las células Tcm antitercera parte son no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto (por ejemplo de un origen autólogo en situaciones en las cuales el injerto es de un origen no autólogo) .

De acuerdo con una modalidad especifica, cuando el injerto comprende células hematopoyéticas inmaduras que no son singeneicas con el sujeto (por ejemplo no autólogas) , la población aislada de células son singeneicas con el sujeto (por ejemplo autólogo) .

Como se usa en la presente, el término "células hematopoyéticas inmaduras" se refiere a cualquier tipo de células incompletamente diferenciadas que son capaces de diferenciarse en uno o más tipos de células hematopoyéticas completamente diferenciadas. Las células hematopoyéticas inmaduras incluyen sin limitación tipos de células referidas en la técnica como "células progenitoras" , "células precursoras", "células madre", "células pluripotentes" , "células mult ipotentes" y similares.

Preferiblemente las células hematopoyéticas inmaduras son células madre hematopoyéticas.

Preferiblemente, donde las células hematopoyéticas inmaduras se derivan de un humano, las células hematopoyéticas inmaduras son células CD34+, tales como células CD34+CD133+.

Tipos de injertos de la presente invención que comprenden células hematopoyéticas inmaduras incluyen injertos de células de médula ósea completas (agotadas de células T no agotadas de células T) , injertos de células hematopoyéticas inmaduras de aspirados de médula ósea, injertos de células hematopoyéticas inmaduras de sangre periférica e injertos de células hematopoyéticas inmaduras derivadas del cordón umbilical. Se describen posteriormente en la presente métodos para obtener tales injertos.

Un injerto que comprende células madre hematopoyéticas derivadas de sangre periférica humanas se pueden obtener de acuerdo con métodos estándares, por ejemplo al movilizar células CD34+ en la sangre periférica mediante el tratamiento de citocinas del donador, y recolectar las células CD34+ movilizadas a través de leucaferesis . Se proporciona una orientación amplia en la literatura de la técnica para practicar el aislamiento de células madre derivadas de médula ósea de la médula ósea o la sangre (referirse, por ejemplo, a: Arai S, Klingemann HG., 2003. Arch Med Res. 34:545-53; and Repka T. and Weisdorf D. , 1998. Curr Opin Oncol. 10:112-7; Janssen E . y colaboradores, 1994. Cáncer Control 1:225-230; Atkinson K . , 1999. Curr Top Pathol. 92:107-36).

Un injerto de células madre hematopoyéticas derivadas de cordón umbilical humano se pueden obtener de acuerdo con métodos estándares (referirse, por ejemplo, a: Quillen K, Berkman EM . , 1996. J Hematother. 5:153-5).

Un injerto de células madre hematopoyéticas de la presente invención también se puede derivar de tejido del hígado o saco vitelino.

Un número requerido de células madre hematopoyéticas se puede proporcionar mediante la expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas primarias (revisada en Emerson, 1996, Blood 87:3082, y se describe con más detalle por Petzer y colaboradores, 1996, Proc. Nati. Acad.

Sci. U. S. A. 3:1470; Zundstra y colaboradores, 1994, BioTechnology 12:909; y O 95 11692). De acuerdo con otra modalidad especifica, cuando el injerto comprende células hematopoyéticas inmaduras que no son singeneicas con el sujeto (por ejemplo no autólogas) , la población aislada de células no son singeneicas con tanto el sujeto como con el injerto. (Por ejemplo las células hematopoyéticas i'nmaduras y la población aislada de células son de diferentes donadores) .

De acuerdo con otra modalidad, se proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende: (a) trasplantar células hematopoyéticas inmaduras al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células antitercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante, en donde cuando las células hematopoyéticas inmaduras son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células se selecciona singeneicas con el sujeto o no singeneicas con el sujeto.

De acuerdo con una modalidad especifica, tanto las células hematopoyéticas inmaduras como la población aislada de células son autólogas (por ejemplo del sujeto) .

De acuerdo con otra modalidad específica, las células hematopoyéticas inmaduras son autólogas (por ejemplo del sujeto) y la población aislada de células no son autólogas (por ejemplo de un donador) .

De acuerdo con otra modalidad, se proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende: (a) trasplantar células hematopoyéticas inmaduras al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células antitercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nodos linfáticos después del trasplante, en donde cuando las células hematopoyéticas inmaduras no son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células se seleccionan singeneicas con el sujeto o no singeneicas con tanto el sujeto y las células hematopoyéticas inmaduras.

De acuerdo con una modalidad específica, las células hematopoyéticas inmaduras no son autólogas (por ejemplo de un donador) y la población aislada de células son autólogas (por ejemplo del sujeto) .

De acuerdo con otra modalidad, cuando las células hematopoyéticas inmaduras no son singeneicas con el sujeto (por ejemplo no autólogas), las células Tcm anti-tercera parte no son singeneicas con tanto el sujeto como el injerto (por ejemplo dos donadores diferentes) .

De acuerdo con una modalidad especifica, las células hematopoyéticas inmaduras y la población aislada de células son de diferentes donadores.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los nudos linfáticos después del trasplante, y en donde adicionalmente las células- no son singeneicas con tanto un sujeto como una célula o injerto de tejido. (i) no singeneicas con tanto un sujeto hospedero como un injerto; o (ii) no singeneicas con un injerto y singeneicas con un sujeto hospedero.

De acuerdo con una modalidad, las células no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto hospedero son autólogas.

De esta manera, la presente invención contempla la administración a un sujeto de células Tcm anti-tercera parte (por ejemplo no singeneicas con tanto el sujeto como el injerto o no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto) lo cual da por resultado la erradicación de una enfermedad (por ejemplo leucemia o linfoma) y aumentará concomitantemente el injerto de un trasplante de célula o tejido (por ejemplo células de médula ósea autólogas o no autólogas) al ser células tolerogénicas y no GVHD.

Se apreciará que las células anti-tercera parte se pueden administrar concomitantemente con una célula o injerto de tejido (por ejemplo con una terapia adyuvante), se pueden administrar antes del trasplante de una célula o injerto de tejido (por ejemplo a fin de erradicar células cancerosas o residuales antes del trasplante y de eliminar el rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra hospedero), o se puede administrar después del trasplante de una célula o injerto de tejido (por ejemplo a fin de erradicar células cancerosa residuales después del trasplante y de eliminar el rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra hospedero) .

Se apreciará que las células anti-tercera parte se pueden administrar en cualquier tiempo después del trasplante. Típicamente, las células Te, anti-tercera parte se administran en el día 0, día 1, día 2, día 3, día 4, día 5, día 6, día 7, día 8 o día 10 después del trasplante. Sin embargo, las células Tcm anti-tercera parte se pueden administrar en tiempos prolongados después del trasplante, como por ejemplo, dos semanas, un mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 18 meses o 24 meses después del trasplante .

Las células Tcm anti-tercera parte se pueden administrar a través de cualquier método conocido en la técnica para trasplante de células, tal como pero no se limita a, infusión de células (por ejemplo I.V.) o a través de una vía intraperitoneal .

Sin que se limite por la teoría, una cantidad terapéuticamente es una cantidad, de células Tcm anti-tercera parte eficientes para tolerización, efecto anti-tumor y/o reconstitución inmune sin inducir GVHD. Puesto que las células Tcm de la presente invención se albergan a los nodos linfáticos después del trasplante, cantidades menores de células (comparadas con aquellas de células previamente usadas, ver por ejemplo WO 2001/049243) pueden ser necesarias para lograr el efecto/s benéfico de las células (por ejemplo tolerización, efecto anti-tumor y/o reconstitución inmune) . Se apreciará que niveles menores de fármacos inmunosupresores pueden ser necesarios en conjunción con las células Tcm de la presente invención (tal como exclusión de rapamicina del protocolo terapéutico) .

La determinación de la cantidad terapéuticamente efectiva está muy dentro de la capacidad de aquellas personas expertas en la técnica, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente.

Para cualquier preparación usada en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente efectivas se puede estimar inicialmente de ensayos de cultivo in vitro y celulares. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una concentración o titulo deseado. Tal información se puede usar para determinar más con precisión dosis útiles en humanos.

Por ejemplo, en el caso de injerto de tejido el número de células Tcm anti-tercera parte infundidas a un recipiente deben ser más de 1 x 104 /Kg de peso corporal. El número de células Tcm anti-tercera parte infundidas a un recipiente deben ser típicamente en el intervalo de 1 x 104/Kg de peso corporal a 1 x 109 /Kg de peso corporal.

A fin de facilitar el injerto de la célula o injerto de tejido, el método puede comprender ventajosamente además acondicionar el sujeto con un régimen inmunosupresor ante de, concomitantemente con, o después del trasplante de la célula o injerto de tejido.

De esta manera, de acuerdo con una modalidad de la presente invención, el sujeto se condiciona bajo condiciones subletales, letales o supraletales antes del trasplante de una célula o injerto de tejido.

Por ejemplo, el sujeto se puede tratar con un acondicionamiento mieloablático o no mieloablático . El tipo de acondicionamiento se puede determinar por una persona de experiencia ordinaria en la técnica y toma en cuenta la edad y gravedad de la enfermedad del sujeto. De esta manera, por ejemplo, un sujeto de edad (por ejemplo uno quien es de más de 40 años de edad) se puede tratar con un régimen inmunosupresor leve.

Los ejemplos de tipos adecuados de regímenes inmunosupresores incluyen administración de fármacos inmunosupresores, poblaciones de células inductoras de tolerancia (como se describe con detalle en lo anterior en la presente), y/o irradiación inmunosupresora.

La orientación amplia para seleccionar y administrar regímenes inmunosupresores adecuados para el trasplante se proporcionan en la literatura de la técnica (por ejemplo, referirse a: Kirkpatrick CH. and Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. y colaboradores, 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. and Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. y colaboradores, 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. y colaboradores, 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW, 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. y colaboradores, 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. y colaboradores, 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. y colaboradores 1998. Lancet 351, 623) .

Preferiblemente, el régimen inmunosupresor consiste en administrar por lo menos un agente inmunosupresor al suj eto .

Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina) , sales de oro, D-penicillamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE) , etanercept, bloqueadores de TNF.alfa., un agente biológico que fija como objetivo una citocina inflamatoria, y fármaco antiinflamatorio no esteroidal (NSAIDs) . Los ejemplos de NSAIDs incluyen, pero no se limitan a ácido acetil salicilico, salicilato de magnesio, colina, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofen, flurbiprofen, indometacina, ketoprofen, ketorolac, meclofenamato, naproxen, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetin, acetaminofen, ibuprofen, inhibidores de Cox-2, tramadol, rapamicina (sirolimus) y análogos de rapamicina (tales como CCI-779, RADOOl, AP23573) . Estos agentes se pueden administrar individualmente o en combinación.

Como se usa en la presente el término "aproximadamente" se refiere a 10%.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluyen pero no se limitan a".

El término "que consiste de, significa "que incluye y se limita a".

El término "que consiste esencialmente de" significa que la composición, método o estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solamente si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reclamados.

Como se usa en la presente, la forma singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "por lo menos un compuesto" pueden incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Por toda esta solicitud, varias modalidades de esta invención se pueden presentar en un formato de intervalo. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es simplemente para conveniencia y brevedad y no se debe considerar como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, la descripción de un intervalo se debe considerar que ha divulgado específicamente todos los subintervalos posibles así como valores numéricos individuales con ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 se debe considerar que tiene subintervalos específicamente divulgados tales como de 1 a 3, de l a 4, de l a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de este intervalo, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Esto aplica sin considerar la amplitud del intervalo.

Siempre que un intervalo numérico se indique en la presente, se propone para incluir cualquier número citado (fraccional o integral) dentro del intervalo indicado. Las frases "que varía/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varía/varía de" un primer número indicado "a" un segundo número indicado se usan en la presente intercambiablemente y se proponen para incluir el primero y segundo números indicados y todos los números fracciónales e integrales entre los mismos.

Como se usa en la presente el término "método" se refiere a manera, medios, técnicas y procedimientos para lograr una tarea dada incluyendo, pero no limitado a, aquella maneras, medios, técnicas y procedimientos ya sea conocidos por, o desarrollados fácilmente de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, bilógicas, bioquímicas y médicas .

Se aprecia que ciertas características de la invención, que son, para claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. A la inversa, varias características de la invención, que son, para brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar separadamente o en cualquier subcombinación adecuada o como sea adecuado en cualquier otra modalidad descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias modalidades no se van a considerar características esenciales de aquellas modalidades, a menos que la modalidad sea inoperativa sin aquellos elementos.

Varias modalidades y aspectos de la presente invención como se exponen anteriormente en la presente y como se reclaman en la sección de reivindicaciones posterior encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención en una forma no limitante.

En general, la nomenclatura usada en la presente y en los procedimientos de laboratorio usados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de DNA recombinante . Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y colaboradores, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M . , ed. (1994); Ausubel y colaboradores, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson y colaboradores, "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren y colaboradores (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se exponen en las patentes norteamericanas Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E . , ed. (1994); Stites y colaboradores (eds) , "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition) , Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la patente y la literatura científica, ver, por ejemplo, patentes norteamericanas Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,01 1 ,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J. , eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. , and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y colaboradores, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas de las cuales se incorporan a manera de referencia como si se expusieran completamente en la presente. Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en la presente se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en la presente se incorpora en este documento a manera de referencia.

MATERIALES GENERALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Animales Ratones BALB/c, CB6 (Fl), FVB, C57BL/6, y BALB/c-NUDE de 6 a 12 semanas de edad hembras se obtuvieron de Harían Laboratories. La progenie de ratones B6-NUDE se reprodujeron en el Weizmann Institute Animal Center. Todos los ratones se mantuvieron en jaulas pequeñas (5 animales en cada jaula) y se alimentaron con alimento estéril y agua ácida. Todos los estudios se aprobaron por the Weizmann Institute of Science Institutional Animal Care and Use Committee.

Células La linea de células de linfoma de murino A20, linea de linforna/leucemia de células B derivadas de BALb/c (H-2d) , descrita previamente [Kim KJ y colaboradores, J. Immunol . (1979) 122: 549-554], y el transíectante estable de A20, el A20 yfp/luc+, descrito previamente [Edinger M y colaboradores, Blood. (2003) 101: 640-648] ambos se mantuvieron en un medio RP I 1640 complementado con FCS al 5%, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales, antibióticos y 50 µ? de 2-pmercaptoetanol .

Preparación de Tcm anti-3ra parte no reactivo hospedero Tcm anti-tercera-parte se prepararon como se describe previamente [Ophir E y colaboradores, Blood (2010) 115: 2095-2104] brevemente, esplenocitos de- los ratones donadores se cultivaron contra esplenocitos de tercera-parte irradiados durante 60 horas bajo deprivación de citocina. Subsecuentemente, se seleccionaron positivamente células CD8+ usando Partículas Magnéticas (BD Pharmingen) y se cultivaron en un medio ambiente sin Ag. rhIL-15 (20 ng/mL; R&D Systems) se agregaron cada segundo día. Para lograr una población purificada al final del cultivo (día 16) , las células Tcm se seleccionaron positivamente para la expresión de CD62L mediante clasificación de células activadas magnéticas [MACS, Milteny, Bergisch Gladbach, Alemania] .

Análisis citométrico de flujo Se llevó a cabo el análisis de clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS) usando un FACScan Becton Dickinson modificado. Las células se tiñeron con anticuerpos etiquetados específicos para CD8-ficoeritrina (PE) /isotiocianato de fluoresceína (FITQ/aloficocianina (APC) (BD Pharmingen), CalceinAM (Molecular Probes, INC., Eugene, OR, EUA) . Se hizo la tinción con Anexina V y 7-amino-actinomicina D (7AAD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen) .

Cultivo MLR y ensayo de citotoxicidad Células Tcm y de linfoma anti-3ra-parte y se obtuvieron mediante centrifugación gradiente de densidad Ficoll y células de linfoma se etiquetaron con 0.15 g/ml de CalceinAM (Molecular Probes, INC., Eugene, OR, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se llevó a una concentración de 1 x 106 células/ml en el medio requerido. 3 x 105 de las células de linfoma se incubaron con CTLs anti-3ra-parte de acuerdo con las relaciones indicadas e intervalos de tiempo para placas de 24 cavidades. Las células se recubrieron y se analizaron para supervivencia usando marcadores de superficie tal como Anexina-V (BD) y al medir el número de células de linfoma teñidas con CalceinAM mediante FACS.

Detección de apo tosis mediante tinción con Anexina V Se usó Anexina V APC para detectar células apoptóticas. Las muestras de cultivos in vitro se incubaron con una mezcla de anticuerpos monoclonales seleccionados etiquetados con fluorocromos diferentes durante 20 minutos a 4°C. Después de lavar el anticuerpo libre no enlazado usando una -solución amortiguadora de enlace de Anexina-V, las muestras se complementaron con 5 µ? de Anexina V-APC (BD) . Las células luego se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad y se lavaron con una solución amortiguadora de enlace de Anexina-V. Las muestras se analizaron mediante FACS para células vivas que se tiñeron positivamente de Anexina-V.

Modelo in vivo de enfermedad residual mínima Ratones recipientes hembras BALB/c de 12 semanas de edad se expusieron a una sola dosis de irradiación de cuerpo total (TBI) de 8 Gy de un haz de Gamma 150-A 60 Co source (fabricado por Atomic Energy of Canadá, Kanata, ON, Canadá) (día -1). Al siguiente día (día 0) los ratones recipientes se infundieron intravenosamente con 3 x 106 de médula ósea agotadas de células T de ratones BALb/c-Nude (singeneicos) o con 3 x 106 de médula ósea agotada de células T de ratones B6-Nude, complementadas con 5 x 103 de células de linfoma A20 luc por ratón. Al siguiente dia (día +1) los ratones recibieron o no recibieron 10 x 106 de Tcm anti-3ra-parte derivadas de BALB/c ( singeneicas ) o 5 x 106 Tcm anti-3ra-parte derivadas de C57BL/6 (alogeneicas) , intravenosamente. La localización del tumor, los patrones migratorios de células A20 y la reactividad de anti-linfoma de la CTLs anti-3ra-parte se examinaron usando un sistema de formación de imágenes in vivo.

Formación de imágenes in vivo Se anestesiaron ratones con Cetamina (100 mg/kg intraperitonealmente (i.p) (Kepro Holand Países Bajos) y Xylazine (Kepro Holand Países Bajos) (20 mg/Kg i.p), y una solución acuosa de D-Luciferina (150 mg/Kg i.p) (Cat#XR-1001 , 30 mg/ml en PBS; Xenogen) se inyectó 10 minutos antes de la formación de imágenes. Los animales se colocaron en la cámara a prueba de luz del sistema de formación de imágenes In Vivo Imaging system (IVISMR 100, Xenogen) acoplada con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) Pixelfly QE (PCO, K, Alemania) en Department of Veterinary Resources of the Weizmann Institute. Se tomó una imagen de referencia de superficie corporal de escala de grises (fotografía digital) después de una exposición de 10 segundos, bajo iluminación potente. El procesamiento de datos de imágenes y el análisis se llevaron a cabo el software Living Image 2.5. Los ratones se supervisaron para el crecimiento de tumor desde el día 14 en intervalos semanales.

Análisis estadístico El análisis de los datos de supervivencia se llevó a cabo usando curvas Kaplan-Meier (prueba de rango logarítmico) . La comparación de medios se condujo usando la prueba del Estudiante t.

EJEMPLO 1 Establecimiento de un modelo de ratón Para establecer un modelo de ratón apropiado, los inventores verificaron inicialmente que las células Tcm anti-3ra-parte derivadas de (B6 x BALB/c) Fl muestran exterminio independiente de TCR de células de linfoma A20 de BALB/c de origen (34.8 ± 12.1% en 4 experimentos, relación de células Tcm/linfoma 5:1, en comparación con células A20 incubadas sin Tcm, p<0.05). Por otra parte, después de 16 horas de incubación con células Tcm, la tinción de AnexinaV de células A20 se aumentó significativamente comparado con el nivel de tinción basal (14.8 ± 4.5% y 5.2 ± 2.2% respectivamente, en 3 experimentos, p<0.05), sugiriendo un mecanismo basado en apoptosis, similar a aquel descrito previamente para exterminio de células de linfoma humanas [Lask A y colaboradores (enviado 2010) ; Arditti FD y colaboradores, Blood (2005) 105:3365-3371].

EJEMPLO 2 Protocolo de tratamiento para trasplante de médula ósea singeneico y células Tcm Usando células A20 que expresan luciferasa, los inventores fueron capaces de seguir el destino de las células malignas in vivo, y estudian el efecto anti-linfoma de las Tcm anti-3ra parte donadoras adicionadas al trasplante de médula ósea ya sea singeneico o alogeneico (BMT, posteriormente en la presente) , en una enfermedad residual mínima de simulación modelo. En el modelo singeneico, 3 x 106 células Nude BALB/c BM se trasplantaron en ratones BALB/c letalmente irradiados junto con 5000 células A20. Al siguiente día, se infundieron Tcm singeneicas. Como se puede observar en las Figuras 1A-D, ninguno de los ratones no tratados sobrevivió (0/7) 100 días después del trasplante de médula ósea (BMT, 23 días de supervivencia media) . Sin embargo, la administración de 1 x 107 o 2 x 107 de células Tcm singeneicas condujo a una carga tumoral significativamente disminuida (Figuras 1E-H) y supervivencia total mejorada de 28% de ratones (2/7, P<0.0001) y 40% d ratones (2/5, P<0.002) 100 días después del BMT, con supervivencia media de 49 y 80 días, respectivamente (Figura II).

EJEMPLO 3 Protocolo de tratamiento para trasplante de médula ósea singeneico y células Tcm alogeneicas Un estudio temprano llevado a cado en el laboratorio de los inventores [Ophir E. y colaboradores, Blood (2010) 115: 2095-2104] mostró que las células Tcm anti- 3ra parte estuvieron dotadas con actividad tolerizante, traducido en persistencia prolongado después del BMT, aun cuando se usan donadores parcialmente igualados. Los inventores sometieron a prueba por lo tanto en el modelo BMT singeneico descrito en lo anterior el efecto anti-linfoma de 2 x 107 células Tcm derivadas de Fl (CB6) , reemplazando las células Tcm singeneicas administradas previamente. Aunque se esperó que estas células Tcm derivadas de Fl se rechacen debido a la disparidad MHC, estuvieron continuamente presentes y no se rechazaron aun 2 meses después del trasplante (datos no mostrados) . Su persistencia a largo plazo fue probablemente el resultado de su actividad tolerizante descrita en lo anterior. El efecto clínico significativo de estas células Te, derivadas de Fl se mostró por una supervivencia total mejorada de 57.1% de ratones (4/7, Figuras 2D-G) en comparación con supervivencia de 0% de ratones (0/5, Figuras 2A-C y 2G) en el grupo no tratado. De esta manera, estos resultados muestran conclusivamente que las células Tcm anti-3ra parte, derivadas de donadores alogeneicos, se pueden usar como terapia de células malignas anti-células B, ya sea sola o combinada con células de la médula ósea.

EJEMPLO 4 Protocolo de tratamiento para trasplante de médula ósea alogenelco y células Tcm alogenexcas Cuando se examinaron en las instalaciones alogeneicas, se mostró la mejora de radicación del tumor. Este efecto fue probablemente debido a la aloreactividad residual que proporcionó un efecto de injerto contra leucemia/linforna (GVL) adicional sobre el exterminio de células independientes del receptor de células T (TCR) recientemente descubierto. Significativamente, este efecto aditivo se logró sin provocar GVHD. En este modelo alogeneico, 3 x 106 células Nude B6 BM alogeneicas se trasplantaron junto con 5000 células A20 en ratones BALB/c letalmente irradiados. Al siguiente día, los ratones se trataron con Tcm de tipo donadoras. Similar a los resultados en el modelo singeneico (descrito en el Ejemplo 2 y 3, anterior) , ninguno de los ratones no tratados sobrevivió 100 días después del BMT (0/8, 23 días de supervivencia media, Figuras 3A-D y 31), mientras que la administración de 5 x 106 células Tcm de tipo donadoras, condujo a una supervivencia total notable de 100% (7/7) 100 días después del BMT (Figuras 3E-I) . Aunque las células Tcm alogeneicas mostraron actividad de GVL aumentada comparada con las células Tcm singeneicas, este efecto no se asoció con ninguna manifestación de GVHD. De esta manera, como se describe previamente, el peso y apariencia total de los ratones que reciben células Tcm anti-3ra parte alogeneicas fueron las mismas como aquellas de los ratones en el grupo de control, radioprotegidos con un trasplante de Nude BM solas.

Colectivamente, los presentes inventores demostraron por primera vez, mediante formación de imágenes in vivo, la reactividad de GVL de las Tcm anti-3ra parte de murino. Estos resultados sugieren que las células Tcm anti-3ra parte pueden proporcionar un "efecto de soporte doble" al promover tanto el injerto BM, como inducir concurrentemente la reactividad de GVL sin provocar GVHD. Tal terapia de células es altamente atractiva, en particular para pacientes de edad con B-CLL y otras afecciones malignas de células B quienes no podrían tolerar el acondicionamiento agresivo, y se puede desarrollar potencialmente en un producto fácilmente disponible "comercial, que se usa como una terapia de células anti-cáncer .

EJEMPLO 5 Generación de células T de memoria central anti-tercera parte MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Enriquecimiento de células t CD8+ puras Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante centrifugación gradiente de densidad Ficoll de capas leucocitarias de donadores sanos. Las PBMCs del donador luego se transfirieron a una solución de congelación DMSO al 10% y se crioconservaron en nitrógeno-líquido.

En el día -2: las PBMCs Congeladas del Donador se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se transfirieron a un medio de descongelación caliente ( DC Cellgro complementado con 10% de suero humano y medio Pen/Strep suplementado con Nucleasa Benzonase™ para evitar la formación de grumos de células como resultado de la deshidratación de las células) . Las PBMCs del donador descongeladas se lavaron dos veces con medio de descongelación caliente. A fin de agotar las células adherentes, las PBMCs del donador luego se resuspendieron en un medio de cultivo (Cellgro DC complementado con 5% de suero humano y Pen/Strep y 10 ng/ l de IL-7) y se colocaron en placas en placas de 6 cavidades especialmente recubiertas para incubación durante la noche a 37 °C.

En el día -1: Se removieron las células no adherentes (este proceso incrementó la concentración de las células T deseadas, al remover los monocitos adheridos y además se permitió que las células descongeladas se recuperaran del proceso de descongelación antes de ser sometidas a proceso de enriquecimiento magnético) .

En el dia 0: Se aislaron células T CD8+ no tocadas usando el equipo de aislamiento CD8 de Miltenyi de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después, las células T CD8 con fenotipo puro se obtuvieron de la población CD8 total al agotar las células que expresan el marcador de activación CD45RO usando cuentas magnéticas CD45RO.

Generación de células dendríticas (DCs) derivadas de monocitos DCs derivadas de monocitos se generaron de PBMC crioconservadas alogeneicas. Los monocitos se enriquecieron de las PBMC mediante adherencia plástica y se cultivaron en GM-CSF e IL-4 durante el transcurso de 3 días. Se indujo la maduración sobre el final de 24 horas del cultivo con la adición de LPS e IFN-?.

Generación de células Tan anti-tercera parte (células T CD8 puras que fijan como objetivo DCs derivadas de monocitos) Las células T CD8+ puras se activaron con DCs derivadas de monocitos irradiadas (30 gy) en una relación de 1:0.25, en un medio de cultivo (Cellgro DC complementado con 5% de suero humano y Pen/Strep) complementado con IL-21 durante 3 días. Después, las células T CD8+ no recibieron activación adicional y se desarrollaron con IL-7 e IL-15 hasta el dia 12.

RESULTADOS En el dia 11 de cultivo, la composición celular y el fenotipo de células se evaluaron usando análisis FACS y el número de células se determinó por la exclusión de azul tripan. Los resultados indicaron que la composición de células (de Lymphogate, los datos no se muestran) comprendieron predominantemente de 94.6% de células T CD8+ (CD3+CD8+ ), con trazas de 1.2% de células NK CD56+ (CD3-CD56+) y 1.1% de células T NK (CD3+CD56+) . Adicionalmente, las Células T CD8+ comprendieron grandemente de 76% de células Tcm, 9% de células puras, 8.5% de Teff/Tem y 6.5% de Temra.

EJEMPLO 6 Ensayo de injerto Tcm contra leucemia (GVL) MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Ensayo GVL Las lineas de células B se etiquetaron con 0.15 g/ml de CalceinAM, un tinte vital que se libera en la muerte de las células, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después, 0.3 x 106 de lineas de células etiquetadas con Calceina se incubaron con o sin 1.5 x 106 de Tcm anti-3ra parte durante 22 horas en placas de 24 cavidades. Las citocinas no exógenas se adicionaron al MLR . Después de 22 horas las células se recuperaron y se analizaron para supervivencia al medir el número de células teñidas con Calceina sobrevivientes mediante FACS.

Para obtener valores absolutos de células, las muestras se suspendieron en volumen constante y se obtuvieron conteos citométricos de flujo para cada muestra durante un periodo de tiempo predeterminado, constante y se compararon conteos citométricos de flujo obtenidos con volumen fijo y números fijos de células de entrada.

Detección de apoptosxs Para la detección de apoptosis por tinción con AnexinaV las muestras se incubaron con 5 µ? de AnexinaV-APC (BD) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Subsecuentemente, la AnexinaV no enlazada se lavó, y las muestras se analizaron mediante FACS.

Aunque la invención se ha descrito en conjunción con modalidades especificas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica. Por consiguiente, se propone abarcar tales de todas alternativas, modificaciones y variaciones que se encuentran dentro del espíritu y alcance amplio de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente en su totalidad en la especificación, al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente fuera específica e individualmente indicada que se incorporada en la presente a manera de referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se considerará como una admisión que tal referencia esté disponible como técnica previa a la presente invención. En la medida en que los títulos de las secciones se usen, no se considerarán como necesariamente limitantes.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Uso de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a ganglios linfáticos después del trasplante, como un tratamiento adyuvante para la erradicación de una enfermedad en un sujeto quien ha sido trasplantado con una célula o injerto de tejido no singeneico, en donde las células son ya sea: (i) no singeneicas con tanto el sujeto como el injerto; o (ii) no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la célula o injerto de tejido no es autólogo y la población aislada de células son autólogas .

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la célula o injerto de tejido y la población aislada de células son de diferentes donadores.

4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la enfermedad comprende una afección maligna y opcionalmente una afección maligna de células B.

5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el injerto comprende células de médula ósea y opcionalmente células hematopoyéticas inmaduras.

6. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde las células hematopoyéticas inmaduras no son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células son singeneicas con el sujeto.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde las células hematopoyéticas inmaduras no son autólogas y la población aislada de células son autólogas.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde las células hematopoyéticas inmaduras no son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células no son singeneicas con tanto el sujeto como con el injerto.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde las células hematopoyéticas inmaduras y la población aislada de células son de diferentes donadores.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central comprende una firma CD8+/CD62L y opcionalmente en donde por lo menos 50% de la población aislada de células tienen la firma.

11. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde los ganglios linfáticos comprenden ganglios linfáticos periféricos o ganglios linfáticos mesentéricos .

12. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto comprenden células autólogas.

13. Una población aislada de células, caracterizada porque comprende células anti-tercera parte que inducen no GVHD que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los ganglios linfáticos después del trasplante, y en donde además las células son ya sea : (i) no singeneicas con tanto un sujeto hospedero como un injerto, en donde el sujeto y el injerto no son singeneicos; o (ii) no singeneicas con un injerto y singeneicas con un sujeto hospedero, en donde el sujeto y el injerto no son singeneicos.

14. La población aislada de células de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque las células no singeneicas con el injerto y singeneicas con el sujeto hospedero son autólogas.

15. Uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los ganglios linfáticos después del trasplante como un tratamiento adyuvante para la erradicación de una enfermedad de un sujeto quien ha sido trasplantado con células hematopoyéticas inmaduras, y en donde además cuando las células hematopoyéticas inmaduras son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células se seleccionan singeneicas con el sujeto o no singeneicas con el sujeto.

16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde las células hematopoyéticas inmaduras y la población aislada de células son autólogas o en donde las células hematopoyéticas inmaduras son autólogas y la población aislada de células no son autólogas.

17. Uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una población aislada de células que comprenden células anti-tercera parte que inducen no injerto contra hospedero (GVHD) que tienen un fenotipo T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductoras de tolerancia y capaces de albergarse a los ganglios linfáticos después del trasplante como un tratamiento adyuvante para la erradicación de una enfermedad en un sujeto quien ha sido trasplantado con células hematopoyéticas inmaduras, y en donde además cuando las células hematopoyéticas inmaduras no son singeneicas con el sujeto, la población aislada de células se seleccionan singeneicas con el sujeto o no singeneicas con tanto el sujeto como las células hematopoyéticas inmaduras.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde las células hematopoyéticas inmaduras no son autólogas y la población aislada de células son autólogas o en donde las células hematopoyéticas inmaduras y la población aislada de células son de diferentes donadores.

19. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 15 o 17 o población aislada de células de la reivindicación 13, en donde las células anti-tercera parte que tienen un fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, las células que son células inductores de tolerancia y capaces de albergarse a los ganglios linfáticos después del trasplante se generan al: (a) poner en contacto células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con un antigeno o antigenos de tercera parte en presencia o ausencia de IL-21 bajo condiciones que permiten la eliminación de células reactivas a GVH; y (b) cultivar las células que resultan de la etapa (a) en presencia de IL-15 en Un medio ambiente sin antigeno bajo condiciones que permitan la proliferación de células que comprenden el fenotipo de T-linfocito (Tcm) de memoria central, para de esta manera generar la población aislada de células .