MX2013001360A

MX2013001360A - Ratones que producen proteinas de union que comprenden dominios vl.

Info

Publication number: MX2013001360A
Application number: MX2013001360A
Authority: MX
Inventors: Lynn Macdonald; Andrew J Murphy; Sean Stevens; Cagan Gurer; Karolina A Hosiawa
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2011-08-02
Publication date: 2013-06-28
Also published as: SMT201700023B; RU2017106292A3; IL271804A; JP2016054746A; CN113150121A; US20210163628A1; RU2612903C2; US10954310B2; KR102306967B1; EP2947151A1; EP3960865A1; HRP20170322T1; KR20200116547A; IL271804B1; BR112013002695A2; NZ606824A; PT2601298T; US20170226231A1; PL2601298T3; KR102434557B1

Abstract

La presente invención se refiere a ratones genéticamente modificados y a métodos de producción utilizándolos, en donde el ratón comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos de genes de la región V de cadena ligera, segmentos de genes de la región D, y segmentos de genes de la región J, con al menos un segmento de gen de la región y de cadena ligera y al menos un segmento de gen de la región J de cadena ligera. Se proporcionan ratones que producen proteínas de unión que comprenden un dominio variable de cadena ligera ligado de manera operable a una región constante de cadena pesada. Se proporcionan proteínas de unión que contienen un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo un dominio variable de cadena ligera somáticamente hipermutado, fusionado con una región constante de cadena pesada. Se proporcionan células, embriones y ratones modificados que codifican secuencias para la producción de proteínas de unión.

Description

RATONES QUE PRODUCEN PROTEINAS DE UNION QUE COMPRENDEN DOMINIOS VL Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteínas de unión similares a inmunoglobulina que comprenden una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina, así como a proteínas de unión que tienen un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina fusionado con un dominio constante de cadena ligera y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina fusionado con un dominio constante de cadena pesada. También se proporcionan células que expresan tales proteínas de unión, ratones que las producen, y métodos y composiciones relacionados.

Antecedentes de la Invención Los anticuerpos típicamente comprenden una estructura tetramérica que tiene dos cadenas pesadas idénticas cada una de ellas comprendiendo una región constante de cadena pesada (CH) fusionada con un dominio variable de cadena pesada (VH) asociado con una región constante de cadena ligera fusionada con un dominio variable de cadena ligera (CL). Una IgG humana típica, que es una molécula de anticuerpo, tiene aproximadamente de 150 a aproximadamente 170 kDa de tamaño (por ejemplo, la lgG3, que comprende una región de bisagra más grande), dependiendo de la subclase de IgG (por ejemplo lgG1, lgG3, lgG4) y de la longitud (variable) de la región variable.

En un anticuerpo típico, los dominios VH y VL se asocian para formar un sitio de unión que se une al antígeno blanco. Las características del anticuerpo con respecto a la afinidad y especificidad, por lo tanto, pueden depender en gran medida de las características de los dominios VH y VL. En los anticuerpos típicos en seres humanos y ratones, los dominios VH se acoplan con dominios VL ya sea ? ó ?. Sin embargo, también se sabe que se pueden preparar dominios VL que se unan específicamente a un antígeno blanco en ausencia de un dominio VH cognado (por ejemplo, un dominio VH que se exprese naturalmente en el contexto de un anticuerpo y esté asociado con el dominio VL particular), y que se pueden aislar dominios VH que se unan específicamente a un antígeno blanco en ausencia de un dominio VL cognado. De este modo, la útil diversidad en las proteínas de unión basadas en inmunoglobulina, generalmente es conferida por una recombinación que conduce a una VH ó VL particular (e hipermutación somática, hasta el grado en que ocurra), así como por la combinación de un par VH/VL cognado. Sería útil desarrollar composiciones y métodos que explotaran otras fuentes de diversidad.

En este campo existe la necesidad de proteínas de unión basadas en estructuras de inmunoglobulina, incluyendo regiones variables de inmunoglobulina tales como las regiones variables de cadena ligera, e incluyendo proteínas de unión que exhiban una mayor diversidad sobre los anticuerpos tradicionales. También existe la necesidad de otros métodos y animales para preparar proteínas de unión útiles, incluyendo proteínas de unión que comprendan las diversas secuencias de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera. También existe la necesidad de formatos de proteínas de unión basadas en inmunoglobulina, que proporcionen una mayor diversidad de proteínas de unión a partir de las cuales elegir y mejorar la diversidad de dominios variables de inmunoglobulina, incluyendo composiciones y métodos para generar dominios variables de inmunoglobulina somáticamente mutados y seleccionados por clonación, para utilizarse, por ejemplo, en la preparación de agentes terapéuticos para seres humanos.

Breve Descripción de la Invención En un aspecto, se describen proteínas de unión que comprenden dominios variables de inmunoglobulina que se derivan de la cadena ligera (es decir, dominios variables de inmunoglobulina kappa (?) y/o lambda (?)), pero no de dominios variables de inmunoglobulina de cadena pesada de longitud completa. También se proporcionan métodos y composiciones para preparar proteínas de unión, incluyendo ratones genéticamente modificados.

En un aspecto, se proporcionan construcciones de ácidos nucleicos, células, embriones, ratones y métodos, para preparar proteínas que comprendan una o más secuencias de inmunoglobulina de región variable de cadena ligera ? y/o ? y una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo proteínas que comprendan un dominio variable de cadena ligera ? ó ? y una secuencia de región constante de cadena pesada humana o murina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina, segmentos génicos de diversidad de cadena pesada (DH) y segmentos génicos de unión de cadena pesada (JH), en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina murina endógeno, con uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera (VL) y uno o más segmentos génicos de región de unión de cadena ligera (JL).

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH, con uno o más segmentos génicos VL y uno o más segmentos génicos JL, para formar una secuencia de segmento génico VL en un locus de cadena pesada endógena (locus VLH), en donde el locus VLH es capaz de recombinarse con un gen CH murino endógeno, para formar un gen rearreglado que se deriva de un segmento génico VL, un segmento génico JL, y un gen CH murino endógeno.

En una modalidad, los segmentos VL son segmentos VL humanos. En una modalidad, los segmentos JL son segmentos JL humanos. En una modalidad específica, los segmentos VL y JL son segmentos VL humanos y segmentos JL humanos.

En una modalidad, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH, son reemplazados con al menos seis segmentos génicos VK humanos y al menos un segmento génico JK. En una modalidad, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH son reemplazados por al menos 16 segmentos génicos VK (segmentos VK humanos) y al menos un segmento génico JK. En una modalidad, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH son reemplazados por al menos 30 segmentos génicos VK humanos y al menos un segmento génico JK. En una modalidad, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH son reemplazados por al menos 40 segmentos génicos VK humanos y al menos un segmento génico JK. En una modalidad, el al menos un segmento génico JK comprende dos, tres, cuatro o cinco segmentos génicos JK humanos.

En una modalidad, los segmentos VL son segmentos VK humanos. En una modalidad, los segmentos VK humanos comprenden 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5 y 1-6. En una modalidad, el segmento ? VL comprende 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16. En una modalidad, los segmentos VK humanos comprenden 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 y 2-30. En una modalidad, los segmentos VK humanos comprenden 3-31, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 y 2-40.

En una modalidad, los segmentos VL son segmentos VK humanos y comprenden 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15 y 1-16. En una modalidad, los segmentos VK además comprenden 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 y 2-30. En una modalidad, los segmentos VK comprenden además 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 y 2-40.

En una modalidad, los segmentos VL son segmentos \/? humanos y comprenden un fragmento de un grupo A del locus de cadena ligera ? humana. En una modalidad específica, el fragmento del grupo A del locus de cadena ligera ? humana se extiende desde el ????3-27 hasta el hV 3-1.

En una modalidad, los segmentos VL comprenden un fragmento del grupo B del locus de cadena ligera ? humana. En una modalidad específica, el fragmento del grupo B. del locus de cadena ligera ? humana se extiende desde el h\ 5-52 hasta h\ 1-40.

En una modalidad, los segmentos VL comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera ? humana que comprende un fragmento genómico del grupo A y un fragmento genómico del grupo B. En una modalidad, la secuencia de región variable de cadena ligera ? humana comprende al menos un segmento génico del grupo A y al menos un segmento génico del grupo B.

En una modalidad, los segmentos VL comprenden al menos un segmento génico del grupo B y al menos un segmento génico del grupo C.

En una modalidad, los segmentos VL comprenden hN? 3-1, 4-3, 2- 8, 3-9, 3-10, 2-11 y 3-12. En una modalidad específica, los segmentos VL comprenden una secuencia contigua del locus de cadena ligera ? humana que se extiende desde ?/?3-12 hasta \/?3-1. En una modalidad, la secuencia contigua comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 hV s. En una modalidad específica, la h\ s incluye 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 y 3-12. En una modalidad específica, la hV s comprende una secuencia contigua del locus ? humano que se extiende desde \/?3-12 hasta \/?3-1.

En una modalidad, la h\ s comprende de 13 a 28 o más hV s.

En una modalidad específica, la hVXs incluye 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3- 21, 3-22, 2-23, 3-25 y 3-27. En una modalidad específica, la hV s comprende una secuencia contigua del locus ? humano, que se extiende desde \/?3-27 hasta ? ?3-1.

En una modalidad, los segmentos VL comprenden de 29 a 40 h\ s. En una modalidad específica, los segmentos VL comprenden una secuencia contigua del locus ? humano que se extiende desde ??3-29 hasta ??3-1, y una secuencia contigua del locus ? humano que se extiende desde \?5-52 hasta \/?1-40. En una modalidad específica, la totalidad o sustancialmente la totalidad de las secuencias entre ??\/?1-40 y h\ 3-29 en el ratón genéticamente modificado, consiste esencialmente de una secuencia ? humana de aproximadamente 959 pb encontrada en la naturaleza (por ejemplo, en la población humana), en dirección 3' del segmento génico hN ??-40 (en dirección 3' de la porción 3' no traducida), que es un sitio de' enzima de restricción (por ejemplo Pl-Scel), seguido por una secuencia ? humana de aproximadamente 3,431 pb en dirección 5' del segmento génico h\ 3-29 encontrado en la naturaleza.

En una modalidad, el segmento JK es humano y se selecciona del grupo que consiste de J 1, JK2, JK3, JK4, JK5, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el segmento JK comprende de JK1 a JK5.

En una modalidad, los segmentos VL son segmentos \? humanos, y el segmento génico JK comprende una secuencia de señal de recombinación (SSR) que tiene un separador 12-mérico, en donde la SSR está yuxtapuesta en el extremo que da hacia 5' del segmento génico JK. En una modalidad, los segmentos génicos VL son ?? humanos y el locus VLH comprende dos o más segmentos génicos JK, cada uno incluyendo una SSR que tiene un separador 12-mérico, en donde la SSR está yuxtapuesta en el extremo que se encuentra en dirección 5' de cada segmento génico JK.

En una modalidad específica, los segmentos VL comprenden segmentos génicos ? humanos contiguos, que extienden el locus ? humano desde VK4-1 hasta VK2-40, y los segmentos JL comprenden segmentos génicos contiguos que extienden el locus ? humano desde JK1 hasta JK5.

En una modalidad, cuando los segmentos Vu son segmentos \/? y no hay presente ningún segmento DH entre los segmentos VL y J, los segmentos VL están flanqueados en dirección 3' (es decir, yuxtapuestos en el lado que se encuentra en dirección 3') por SSRs con separadores 23-méricos, y los segmentos JK, si los hay, o los segmentos ??, si los hay, están flanqueados en dirección 5' (es decir, yuxtapuestos en el lado que se encuentra hacia 5') por SSRs con separadores 12-méricos.

En una modalidad, cuando los segmentos génicos V son segmentos génicos VK y no hay presente ningún segmento génico DH entre los segmentos génicos V y J, cada segmento génico VK está yuxtapuesto en el lado que se encuentra en dirección 3' con una SSR con separador 12-mérico, y los segmentos JK, si los hay, o los segmentos ??, si los hay, cada uno está yuxtapuesto en el lado que se encuentra en dirección 5' con una SSR con separador 23-mérico.

En una modalidad, el ratón comprende un gen rearreglado que se deriva de un segmento génico VL, un segmento génico JL y un gen CH murino endógeno. En una modalidad, el gen rearreglado es somáticamente mutado. En una modalidad, el gen rearreglado comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más adiciones N. En una modalidad, las adiciones N y/o las mutaciones somáticas observadas en el gen rearreglado derivado del segmento VL y el segmento JL, superan en un factor de 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, o al menos 5, el número de adiciones N y/o mutaciones somáticas que se observan en un dominio variable de cadena ligera rearreglado (derivado del mismo segmento génico VL y el mismo segmento génico JL), que es rearreglado en un locus de cadena ligera endógeno. En una modalidad, el gen rearreglado está en una célula B que se une específicamente a un antígeno de interés, en donde la célula B se une al antígeno de interés con una KD en el rango nanomolar bajo o menor (es decir, una KD de 10 nanomolar o menor). En una modalidad específica, el segmento VL, el segmento JL, o ambos, son segmentos génicos humanos. En una modalidad específica, los segmentos VL y JL son segmentos génicos humanos. En una modalidad, el gen CH murino se selecciona del grupo que consiste de Ig , IgD, IgG, IgA e I g E . En una modalidad específica, la IgG murina se selecciona del grupo que consiste de I gG , lgG2A, lgG2B, lgG2C e lgG3. En otra modalidad específica, IgG murina es I gG 1.

En una modalidad, el ratón comprende una célula B, en donde la célula B produce a partir de un locus en un cromosoma de la misma, una proteína de unión que consiste esencialmente de cuatro cadenas polipeptídicas, en donde las cuatro cadenas polipeptídicas consisten esencialmente de (a) dos polípéptidos idénticos que comprenden una región CH murina endógena fusionada con una región VL; y (b) dos polípéptidos idénticos que comprenden una región CL murina endógena fusionada con una región VL que es cognada con respecto a la región VL que está fusionada con la región CH murina, y, en una modalidad, es una región VL humana (por ejemplo, una región ? humana). En una modalidad, la región VL fusionada con la región CH murina endógena, es una región VL humana. En una modalidad específica, la región VL humana fusionada con la región CH m.urina, es una región VK. En una modalidad específica, la región VL humana fusionada con la región CH murina es idéntica a una región V codificada por una secuencia nucleotídica de cadena ligera de línea germinal humana, rearreglada. En una modalidad específica, la región VL humana fusionada con la región CH murina comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis o más hipermutaciones somáticas. En una modalidad, la región VL humana fusionada con la región CH murina es codificada por un gen rearregiado que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más adiciones N.

En una modalidad, al menos el 50% de las moléculas IgG producidas por el ratón, comprenden un polipeptido que comprende una región CH de inmunoglobulina isotipo IgG y una región VL, en donde la longitud del polipéptido no es mayor que 535, 530, 525, 520 ó 515 aminoácidos. En una modalidad, al menos el 75% de las moléculas IgG comprenden el polipéptido mencionado en este párrafo. En una modalidad, al menos el 80, 85, 90 ó 95% de las moléculas IgG, comprenden el polipéptido mencionado en este párrafo. En una modalidad específica, todas las moléculas IgG producidas por el ratón comprenden un polipéptido que no es más largo que el polipéptido mencionado en este párrafo.

En una modalidad, el ratón produce una proteína de unión que comprende un primer polipéptido que comprende una región CH murina endógena, fusionada con un dominio variable codificado por un segmento génico V humano rearregiado y un segmento génico J, pero no un segmento génico DH, y un segundo polipéptido que comprende una región CL murina endógena fusionada con un dominio V codificado por un segmento génico V humano rearregiado y un segmento génico J, pero no un segmento génico DH, y la proteína de unión se une específicamente a un antígeno con una afinidad en el rango micromolar, nanomolar o picomolar. En una modalidad, el segmento J es un segmento J humano (por ejemplo, un segmento génico ? humano). En una modalidad, el segmento V humano es un segmento V humano. En una modalidad, el dominio variable que está fusionado con la región CH murina endógena, comprende un mayor número de hipermutaciones somáticas que la región variable que está fusionada con la región CL murina endógena; en una modalidad específica, la región variable fusionada con la región CH murina endógena comprende aproximadamente 1.5, 2, 3, 4 ó 5 veces más hipermutaciones somáticas, o más, que la región V fusionada con la región CL murina endógena; en una modalidad específica, la región V fusionada con la región CH murina comprende cuando menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15, o más, hipermutaciones somáticas, que la región V fusionada con la región CL murina. En una modalidad, la región V fusionada con la región CH murina es codificada por un gen rearreglado que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más adiciones N.

En una modalidad, el ratón expresa una proteína de unión que comprende un primer dominio variable de cadena ligera (VL1) fusionado con una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, y un segundo dominio variable de cadena ligera (VL2) fusionado con una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, en donde VL1 comprende un número de hipermutaciones somáticas que es mayor en un factor de 1.5 a aproximadamente 5 o más, que el número de hipermutaciones somáticas presentes en el dominio VL2. En una modalidad, el número de hipermutaciones somáticas en el dominio VL1 es mayor en un factor de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 que en el dominio VL2. En una modalidad, el número de hipermutaciones somáticas en el dominio VL1 es aproximadamente 2 a aproximadamente 3 veces mayor que en el dominio VL2. En una modalidad, el dominio VL1 es codificado por una secuencia que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más adiciones N.

En un aspecto, se proporciona un ratón genéticamente modificado que expresa un,a inmunoglobulina que consiste esencialmente de los siguientes polipéptidos: un primer par de polipéptidos idénticos, en donde cada uno consiste esencialmente de una región CH fusionada con un dominio variable que se deriva de segmentos génicos que consisten esencialmente de un segmento génico VL y un segmento génico JL, y un segundo para de polipéptidos idénticos en donde cada uno consiste esencialmente de una región CL fusionada con un dominio variable que se deriva de segmentos génicos que consisten esencialmente de un segmento VL y un segmento JL.

En una modalidad específica, el par de polipéptidos idénticos que tienen la región CH, tienen una región CH murina.

En una modalidad específica, el par de polipéptidos idénticos que tienen la región CL, tienen una región CL murina.

En una modalidad, el dominio variable fusionado con la región CL es un dominio variable que es cognado con el dominio variable fusionado con la región CH En una modalidad, el dominio variable que está fusionado con la región CH murina endógena, comprende un mayor número de hipermutaciones somáticas que el dominio variable que está fusionado con la región CL murina endógena; en una modalidad específica, el dominio variable fusionado con la región CH murina endógena comprende aproximadamente 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 ó 5 veces más, o más hipermutaciones somáticas, que el dominio variable fusionado con la región CL murina endógena. En una modalidad, el dominio variable fusionado con la región CL murina endógena es codificado por un gen que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más adiciones N.

En una modalidad, uno o más de los segmentos V y los segmentos J son segmentos génicos humanos. En una modalidad específica, ambos segmentos V y los segmentos J son segmentos génicos ? humanos. En otra modalidad específica, ambos segmentos V y los segmentos J son segmentos génicos ? humanos. En una modalidad, los segmentos V y segmentos J se seleccionan independientemente del grupo que consiste de segmentos génicos humanos y ? humanos. En una modalidad específica, los segmentos V son segmentos VK y los segmentos J son segmentos ??. En otra modalidad específica, los segmentos V son segmentos \/? y los segmentos J son segmentos JK.

En una modalidad, uno o más de los dominios variables fusionados con la región CL y los dominios variables fusionados con la región CH, son dominios variables humanos. En una modalidad específica, los dominios variables humanos son dominios VK humanos. En otra modalidad específica, los dominios variables humanos son dominios ??. En una modalidad, los dominios humanos se seleccionan independientemente del grupo que consiste de dominios VK y dominios ?? humanos. En una modalidad especifica, el dominio variable humano fusionado con la región CL es un dominio ??, y el dominio variable humano fusionado con la región C H es un dominio VK humano. En otra modalidad, el dominio variable humano fusionado con la región CL es un dominio VK humano y el dominio variable humano fusionado con CH es un dominio ?? humano.

En una modalidad, el segmento VL del primer par de polipéptidos idénticos, se selecciona del grupo que consiste de un segmento ?? humano y un segmento VK humano. En una modalidad, el segmento VL del segundo par de polipéptidos idénticos se selecciona del grupo que consiste de un segmento ?? humano y un segmento VK humano. En una modalidad específica, el segmento VL del primer par de polipéptidos idénticos es un segmento VK humano y el segmento VL del segundo par de polipéptidos idénticos se selecciona del grupo que consiste de un segmento VK humano y un segmento ?? humano. En una modalidad específica, el segmento VL de los primeros dos polipéptidos idénticos, es un segmento ?? humano y el segmento VL del segundo par de polipéptidos idénticos se selecciona del grupo que consiste de un segmento ?? humano y un segmento VK humano. En una modalidad específica, el segmento VL humano del primer par de polipéptidos idénticos es un segmento VK humano, y el segmento VL humano del segundo par de polipéptidos idénticos, es un segmento VK humano.

En una modalidad, la IgG del ratón comprende una proteína de unión producida en respuesta a un antígeno, en donde la proteína de unión comprende un polipéptido que consiste esencialmente de un dominio variable y una región CH, en donde el dominio variable es codificado por una secuencia nucleotídica que consiste esencialmente de un segmento VL rearreglado y un segmento J rearreglado, y en donde la proteína de unión se une específicamente a un epítopo del antígeno, con una KD en el rango micromolar, nanomolar o picomolar.

En un aspecto, se proporciona un ratón, en donde la totalidad o sustancialmente la totalidad de las moléculas IgG producidas por el ratón en respuesta a un antígeno, comprenden una cadena pesada que comprende un dominio variable, en donde el dominio variable es codificado por un gen rearreglado derivado de los segmentos génicos qUe consisten esencialmente de un segmento génico V y un segmento génico J. En una modalidad, el gen rearreglado comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más adiciones N.

En una modalidad, el segmento V es un segmento V de una cadena ligera. En una modalidad, la cadena ligera se selecciona del grupo que consiste de una cadena ligera ? y una cadena ligera ?. En una modalidad específica, la cadena ligera es una cadena ligera ?. En una modalidad específica, el segmento V es un segmento V humano. En una modalidad específica, el segmento V es un segmento VK humano y el segmento J es un segmento JK humano.

En una modalidad, el segmento J es un segmento J de una cadena ligera. En una modalidad, la cadena ligera se selecciona del grupo que consiste de una cadena ligera ? y una cadena ligera ?. En una modalidad específica, la cadena ligera es una cadena ligera ?. En una modalidad específica, el segmento J es un segmento J humano. En otra modalidad, el segmento J es un segmento J de una cadena pesada (es decir, un segmento JH). En una modalidad específica, la cadena pesada es de origen murino. En otra modalidad específica, la cadena pesada es de origen humano.

En una modalidad, el dominio variable de la cadena pesada se prepara a partir de no más que un segmento V y un segmento J es un dominio variable somáticamente mutado.

En una modalidad, el dominio variable de la cadena pesada que es producido a partir de no más de un segmento V y un segmento J, está fusionado con una región CH murina.

En una modalidad específica, la totalidad o sustancialmente la totalidad de las moléculas de IgG producidas por el ratón en respuesta a un antígeno, comprende un dominio variable que se deriva de no más de un segmento V humano y no más de un segmento J humano, y el dominio variable está fusionado con una región constante de IgG murina, y la IgG además comprende una cadena ligera que comprende un dominio VL humano fusionado con una región CL murina. En una modalidad específica, el dominio VL fusionado con al región Cu murina, se deriva de un segmento VK humano y un segmento JK humano. En una modalidad específica, el dominio VL fusionado con la región CL murina, se deriva de un segmento ?? humano y un segmento ?? humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón que produce una IgG que comprende una primera CDR3 en un polipéptido que comprende una región CH, y una segunda CDR3 en un polipéptido que comprende una región CL, en donde tanto la primera CDR3 como la segunda CDR3, se derivan independientemente de no más de dos segmentos génicos, en donde los dos segmentos génicos consisten esencialmente de un segmento génico VL y un segmento génico JL. En una modalidad, la CDR3 en el polipéptido comprende la región CH que comprende una secuencia que se deriva de una secuencia nucleotídica de CDR3 que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más adiciones N.

En una modalidad, el segmento VL y el segmento JL son segmentos génicos humanos. En una modalidad, el segmento VL y el segmento JL son segmentos génicos ?. En una modalidad, el segmento VL y el segmento JL son segmentos del gen ?.

En otro aspecto, se proporciona un ratón que produce una IgG que comprende una primera CDR3 en un primer polipéptido que comprende una región CH, y una segunda CDR3 en un segundo polipéptido que comprende una región CL, en donde tanto la primera CDR3 como la segunda CDR3 comprenden una secuencia de aminoácidos en donde más del 75% de los aminoácidos se derivan de un segmento génico V. En una modalidad, la CDR3 en el polipéptido comprende la región CH que comprende una secuencia que se deriva de una secuencia nucleotídica de CDR3 que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más adiciones N.

En una modalidad, más del 80%, más del 90%, o más del 95% de los aminoácidos de las primera CDR3; y más del 80%, más del 90%, o más del 95% de los aminoácidos de la segunda CDR3, se derivan de un segmento V de cadena ligara.

En una modalidad, no más de dos aminoácidos de la primera CDR3 ser derivan de un segmento génico diferente del segmento V de cadena ligera. En una modalidad, no más de dos aminoácidos de la segunda CDR3 se derivan de un segmento génico diferente a un segmento V de cadena ligera. En una modalidad específica, no más de dos aminoácidos de la primera CDR3 y no más de dos aminoácidos de la segunda CDR3, se derivan de un segmento génico diferente a un segmento V de cadena ligera. En una modalidad, ninguna de las CDR3 de la IgG comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un segmento génico D. En una modalidad, la CDR3 del primer polipéptido no comprende una secuencia derivada de un segmento D.

En una modalidad, el segmento V es un segmento génico V humano. En una modalidad específica, el segmento V es un segmento génico V humano.

En una modalidad, la primera y/o la segunda CDR3 tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis hipermutaciones somáticas. En una modalidad, la primera CDR3 es codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más adiciones N.

En una modalidad, la primera CDR3 consiste esencialmente de aminoácidos derivados de un gen V de cadena ligera y un segmento de un gen J de cadena ligera humano, y la segunda CDR3 consiste esencialmente de aminoácidos derivados de un gen V de cadena ligera humana y un gen J de cadena ligera humana. En una modalidad, la primera CDR3 se deriva de una secuencia de ácido nucleico que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más adiciones N. En una modalidad, la primera CDR3 se deriva de no más de dos segmentos génicos, en donde los no más de dos segmentos génicos son un segmento génico VK humano y un segmento génico J humano; y la segunda CDR3 se deriva de no más de dos segmentos génicos, en donde los no más de dos segmentos génicos son un segmento génico VK humano y un segmento génico J que se selecciona del grupo que consiste de un segmento JK humano, un segmento ??? humano, y un segmento JH humano. En una modalidad, la primera CDR3 se deriva de no más de dos segmentos génicos, en donde los no más de dos segmentos génicos son un segmento \/? humano y un segmento J que se selecciona del grupo que consiste de un segmento JK humano, un segmento J? humano, y un segmento JH humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón que produce una IgG que no contiene una secuencia de aminoácidos derivada de un segmento génico DH, en donde la IgG comprende un primer poli pépti do que tiene un primer dominio VL fusionado con una región CL murina, y un segundo polipéptido que tiene un segundo dominio VL fusionado con una región CH murina, en donde el primer dominio VL y el segundo dominio VL no son idénticos. En una modalidad, el primero y segundo dominios VL se derivan de diferentes segmentos V. En otra modalidad, el primero y segundo dominios VL se derivan de diferentes segmentos J. En una modalidad, el primero y segundo dominios VL se derivan de segmentos V y J idénticos, en donde el segundo dominio VL comprende un número más alto de hipermutaciones somáticas, en comparación con el primer dominio VL.

En una modalidad, el primero y segundo dominios VL se seleccionan independientemente del grupo que consiste de dominios VL humanos y murinos. En una modalidad, el primero y segundo dominios VL se seleccionan independientemente del grupo que consiste de dominios VK y ??. En una modalidad específica, el primer dominio VL se selecciona del grupo que consiste de un dominio VK y un dominio ??; y el segundo dominio VL es un dominio VK. En otra modalidad específica, el dominio VK es un dominio VK humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón en donde la totalidad o sustancialmente la totalidad de las moléculas de IgG producidas por dicho ratón, consiste esencialmente de una cadena ligera que tiene un primer dominio VL humano fusionado con un dominio CL murino, y una cadena pesada que tiene un segundo dominio VL humano fusionado con un dominio CH murino.

En una modalidad, el dominio VL humano fusionado con el dominio CH murino es un dominio VK humano.

En una modalidad, el primero y el segundo dominios VL humanos no son idénticos.

En un aspecto, se proporciona un ratón en donde al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o aproximadamente el 100% de la inmunoglobulina G producida por el ratón, consiste esencialmente de un dímero de (a) un primer polipéptido que consiste esencialmente de un dominio VL de inmunoglobulina y una región CL de inmunoglobulina; y (b) un segundo polipéptido de no más de 535 aminoácidos de longitud, en donde el segundo polipéptido consiste esencialmente de una región CH y un dominio V que carece de una secuencia derivada de un segmento génico DH.

En una modalidad, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-535 aminoácidos de longitud. En una modalidad específica, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-530 aminoácidos de longitud. En una modalidad específica, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-525 aminoácidos de longitud. En una modalidad específica, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-520 aminoácidos de longitud. En una modalidad específica, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-515 aminoácidos de longitud.

En una modalidad, en aproximadamente el 90% o más de las moléculas de IgG producidas por el ratón, el segundo polipéptido no tiene más de aproximadamente 535 aminoácidos de longitud.

En una modalidad, en aproximadamente el 50% o más de las moléculas de IgG producidas por el ratón, el segundo polipéptido no tiene más de aproximadamente 535 aminoácidos de longitud. En una modalidad, en aproximadamente el 50% o más de la inmunoglobulina G producida por el ratón, el segundo polipéptido tiene no más de 530, 525, 520, 515, 510, 505, 500, 495, 490, 485, 480, 475, 470, 465, 460, 455 ó 450 aminoácidos de longitud. En una modalidad, aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90% ó 95%, o más de la IgG producida por el ratón, es de la longitud mencionada. En una modalidad específica, la totalidad o sustancialmente la totalidad de la IgG producida por el ratón, es de la longitud mencionada.

En una modalidad, el dominio V del segundo polipéptido es un dominio VL. En una modalidad específica, el dominio V del segundo polipéptido se selecciona del grupo que consiste de un dominio VK y un dominio ??. En una modalidad específica, el dominio V del segundo polipéptido es un dominio VK o ?? humano.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa, a partir de una secuencia nucleotídica en su línea germinal, un polipéptido que comprende una secuencia variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V y/o J), una secuencia DH, y una región constante de cadena pesada.

En una modalidad, el ratón expresa el polipéptido a partir de un locus de cadena pesada murina endógeno, que comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos del locus variable de cadena pesada murina endógeno funcionales, por una pluralidad de segmentos génicos humanos en el locus de cadena pesada murina endógeno.

En una modalidad, el polipéptido comprende una secuencia VL derivada de un segmento génico \/? o de un segmento génico VK, en donde el polipéptido comprende una CDR3 derivada de un segmento génico DH, y el polipéptido comprende una secuencia derivada de un segmento génico JH o J o JK.

En una modalidad, el ratón comprende un locus de inmunoglobulina de cadena pesada murino endógeno que comprende un reemplazo de la totalidad de segmentos génicos VH funcionales, por uno o más segmentos génicos \/? de cadena ligera humana, en donde el uno o más segmentos \/? humanos tienen yuxtapuesta en el lado hacia el extremo 3', una secuencia de señal de recombinación (SSR) con separador 23-mérico, en donde los segmentos \/? están ligados de manera operable con un segmento DH humano o murino que tiene yuxtapuesta, en el lado en dirección 5' y en el lado en dirección 3', una SSR con separador 12-mérico; el segmento génico DH está ligado de manera operable con un segmento J yuxtapuesto en el lado hacia el extremo 5' a una SSR con separador 23-mérico que es adecuada para recombinarse con la SSR con separador 12- mérico yuxtapuesta con el segmento génico DH, en donde los segmentos V, DH y J están ligados de manera operable con una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región constante de cadena pesada.

En una modalidad, el ratón comprende un locus de inmunoglobulina de cadena pesada murina endógeno que comprende un reemplazo de la totalidad de segmentos génicos DH funcionales, por uno o más segmentos génicos VK humanos, cada uno yuxtapuesto en el lado hacia el extremo 3' con una secuencia de señal de recombinación (SSR) con separador 12-mérico, en donde los segmentos V están ligados de manera operable con un segmento DH humano o murino que está yuxtapuesto tanto en dirección 5' como en dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico, el segmento DH está ligado de manera operable con un segmento J yuxtapuesto en el lado en dirección 5' con una SSR con separador 12-mérico, que es adecuada para recombinarse con la SSR con separador 23-mérico yuxtapuesta con el segmento DH, en donde los segmentos V, DH y génicos están ligados de manera operable con una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región constante de cadena pesada.

En una modalidad, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada murina endógena. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico codifica para una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de un dominio CH1, una región de bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, y una combinación de los mismos. En una modalidad, uno o más de los dominios o regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3, son humanos.

En una modalidad, el locus de inmunoglobulina de cadena pesada murina endógeno comprende un reemplazo de la totalidad de los segmentos génicos VH funcionales, por una pluralidad de segmentos génicos ?? o VK humanos, cada uno yuxtapuesto en la dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico, una pluralidad de segmentos DH humanos yuxtapuestos tanto en dirección 5' como en dirección 3', con una SSR con separador 12-mérico, una pluralidad de segmentos J humanos (JH Ó ?? Ó ) yuxtapuestos tanto en dirección 5' como en dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico, en donde el locus comprende una secuencia de región constante murina endógena que se selecciona del grupo que consiste de CH1, bisagra, CH2, CH3, y una combinación de las mismas. En una modalidad específica, el ratón comprende la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos ?? o VK humanos funcionales, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos DH humanos, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos JH o J o JK.

En una modalidad, el ratón expresa una proteína de unión al antígeno que comprende: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de cadena ligera humana ligada con una secuencia constante de cadena pesada, que comprende una secuencia murina; y (b) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera humana ligada con una secuencia constante de cadena ligera humana o murina. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera es una secuencia de cadena ligera humana, y al exponerse a una proteasa que sea capaz de romper un anticuerpo en fragmentos Fe y Fab, se forma un Fab completamente humano que comprende al menos cuatro CDRs de cadena ligera, en donde las al menos cuatro CDRs de cadena ligera se seleccionan del grupo que consiste de secuencias ?, secuencias ?, y una combinación de las mismas. En una modalidad, la región Fab comprende al menos cinco' CDRs de cadena ligera. En una modalidad, la Fab comprende seis CDRs de cadena ligera. En una modalidad, al menos una CDR de la región Fab comprende una secuencia derivada de un segmento ?? o un segmento VK, y la al menos una CDR además comprende una secuencia derivada de un segmento D. En una modalidad, la al menos una CDR es una CDR3 y la CDR se deriva de un segmento VK humano, un segmento D humano, y un segmento JK humano.

En una modalidad, el polipéptido comprende una región variable derivada de un segmento génico ?? o VK humano, un segmento génico DH humano, y un segmento génico JH o ?? o JK humano. En una modalidad específica, la secuencia constante de cadena pesada se deriva de una secuencia CH1 humana y una secuencia CH2 murina y una secuencia CH3 murina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende en su línea germinal, un segmento génico VK O ?? humano no rearreglado, ligado de manera operable con un segmento génico J humano y una secuencia de región constante de cadena pesada, en donde el ratón expresa una proteína de unión VL que comprende un dominio VK humano fusionado con una región constante de cadena pesada, y en donde el ratón exhibe una población de células B esplénicas que expresa proteínas de unión VL en células B CD19+, incluyendo células B de transición (CD19+lg hilgDinl), y células B maduras (CD19+lgMintlgDhi).

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende en su línea germinal, un segmento génico VK o VX humano no rearreglado, ligado de manera operable con un segmento génico J humano y una secuencia de región constante de cadena pesada, en donde el ratón expresa en una célula B, una inmunoglobulina que comprende un dominio variable de cadena ligera fusionado con una región constante de cadena pesada, en donde la población linfocítica de la médula ósea del ratón, exhibe una población pro/pre célula B que es aproximadamente la misma en número que una población de células pro/pre B de un ratón de tipo silvestre (linfocitos en la médula ósea).

En una modalidad, el ratón comprende al menos 6 segmentos génicos hN/? no rearreglados y úno o más segmentos génicos hÜK no rearreglados, y el ratón comprende una población de células esplénicas activadas por linfocitos lgM+ que expresan una proteína de unión VL, en donde la población es al menos 75% tan grande como una población de células esplénicas activadas por linfocitos e IglVT de un ratón de tipo silvestre.

En una modalidad, el ratón exhibe una población de esplenocitos (CD19+) activados por células B maduras, de células lgD+ e lgM + , que en total constituyen aproximadamente el 90%; en una modalidad, la población de esplenocitos (CD19+) activados por células B maduras de células lgD+ e lgM+ del ratón modificado, es aproximadamente igual (por ejemplo, dentro del 10% o dentro del 5%) que el total de células I g D+ y células lgM+ de un ratón de tipo silvestre que son esplenocitos (CD19+) activados por células B maduras.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una proteína inmunoglobulina a partir de un locus de cadena pesada endógeno modificado en su línea germinal, en donde el locus de cadena pesada endógeno modificado carece de un segmento génico V de cadena pesada murina funcional y el locus comprende segmentos génicos V de cadena ligera no rearreglados y segmentos génicos J no rearreglados, en .donde los segmentos génicos V de cadena ligera no rearreglados y los segmentos génicos J no rearreglados, están ligados de manera operable con una secuencia de región constante de cadena pesada; en donde la proteína inmunoglobulina consiste esencialmente de un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido comprende una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina y una secuencia constante de cadena pesada de inmunoglobulina, y el segundo polipéptido comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región constante de cadena ligera.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una proteína inmunoglobulina, en donde la proteína inmunoglobulina carece de un dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada, y la proteína inmunoglobulina comprende un primer dominio variable derivado de un gen de cadena ligera, y un segundo dominio variable derivado de un gen de cadena ligera, en donde el primer dominio variable y el segundo dominio variable son cognados uno con respecto al otro, en donde el primero y segundo dominios variables de cadena ligera no son idénticos, y en donde el primero y segundo dominios variables de cadena ligera se asocian, y cuando están asociados, se unen específicamente al antígeno de interés.

En un aspecto, se proporciona un ratón que produce segmentos génicos no rearreglados en su línea germinal, una proteína inmunoglobulina que comprende regiones variables que se derivan por completo de segmentos génicos que consisten esencialmente de segmentos génicos humanos no rearreglados, en donde la proteína inmunoglobulina comprende una secuencia constante de cadena ligera de inmunoglobulina y una secuencia constante de cadena pesada de inmunoglobulina que se selecciona del grupo que consiste de CH1, una bisagra, una secuencia CH2, CH3, y una combinación de las mismas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que produce, a partir de segmentos génicos no rearreglados en su línea germinal, una proteína inmunoglobulina que comprende regiones variables, en donde todas las CDR3 de las regiones variables son generadas por completo a partir de segmentos génicos V y J de cadena ligera, y opcionalmente una o más hipermutaciones somáticas, por ejemplo una o más adiciones N.

En un aspecto, se proporciona un ratón que produce una proteína inmunoglobulina somáticamente mutada derivada de segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no rearreglada, en la línea germinal del ratón, en donde la proteína inmunoglobulina carece de una CDR que comprenda una secuencia derivada de un segmento génico D, en donde la proteína inmunoglobulina comprende una primera CDR3 en un dominio variable de cadena ligera, fusionada con una región constante de cadena ligera, comprende una segunda CDR3 en un dominio variable de cadena ligera fusionado con una región constante de cadena ligera, y en donde la segunda CDR3 se deriva de la secuencia de región variable de cadena ligera rearreglada que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 ó 10, o más adiciones N.

En un aspecto, en la presente se proporciona un ratón, en donde el ratón comprende un locus de cadena ligera funcionalmente silencioso que se selecciona del grupo que consiste de un locus ?, un locus K, y una combinación de los mismos. En una modalidad, el ratón comprende una deleción de un locus ? y/o un locus ?, en su totalidad o en parte, de tal modo que el locus ? y/o ? no es funcional.

En un aspecto, se proporciona un embrión de ratón que comprende una célula que comprende un locus de inmunoglobulina modificado como el aquí descrito. En una modalidad, el ratón es una quimera y cuando menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% de las células del embrión comprenden un locus de inmunoglobulina modificado de la manera aquí descrita. En una modalidad, cuando menos el 96%, 97%, 98%, 99% ó 99.8% de las células del embrión, comprenden un locus de inmunoglobulina modificado de la manera aquí descrita. En una modalidad, el embrión comprende una célula huésped y una célula derivada de una célula madre embrionaria (ME) donadora, en donde la célula derivada de la célula ME donadora comprende un locus de inmunoglobulina modificado tal como aquí se describe. En una modalidad, el embrión es un embrión huésped con células en la etapa 2, 4, 8, 16, 32 ó 64, o un blastoquiste, y además comprende una célula ME donadora que comprende un locus de inmunoglobulina modificado tal como aquí se describe.

En un aspecto, se proporciona un ratón o una célula obtenida utilizando una construcción de ácido nucleico como la aquí descrita.

En un aspecto, se proporciona un ratón obtenido utilizando una célula como la aquí descrita. En una modalidad, la célula es una célula ME murina.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón de la manera aquí descrita, para preparar una secuencia de ácido nucleico que codifica una primera secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (VL1), que es cognada con una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (VL2), en donde la VL1 fusionada con una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana (polipéptido 1) se expresa con VL2 fusionada con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana (polipéptido 2), en forma de un dímero del polipéptido /polipéptido 2, para formar un anticuerpo VL1-VL2.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como aquí se describe para preparar una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que está fusionada con una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica para un polipéptido Vu-CH, en donde el polipéptido VL-CH humano se expresa en forma de un dímero, y en donde el dímero se expresa en ausencia de una cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, en ausencia de una cadena ligera ? humana o humana). En una modalidad, el dímero VL-CH se une específicamente a un antígeno de interés, en ausencia de una cadena ligera ? y en ausencia de una cadena ligera ?.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como aquí se describe, para preparar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la totalidad o una porción de un dominio variable de inmunoglobulina. En una modalidad, el dominio variable de inmunoglobulina es un dominio \/? humano o VK humano.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón de la manera aquí descrita para preparar un fragmento Fab completamente humano (que comprende una primera región VL humana fusionada con una región constante de cadena ligera humana, y una segunda región VL humana fusionada con una secuencia de región constante de cadena pesada humana), o un fragmento F(ab)2 completamente humano.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como aquí se describe, para preparar una línea celular inmortalizada. En una modalidad, la línea celular inmortalizada comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un dominio ?? o VK humano, ligado de manera operable con una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de región constante murina.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón de la manera aquí descrita, para preparar un hibridoma o un cuadroma.

En un aspecto, se proporciona una célula que comprende un locus de inmunoglobulina modificado de la manera aquí descrita. En una modalidad, la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula totipotente, una célula pluripotente, una célula madre pluripotente inducida (CMPi), y una célula ME. En una modalidad específica, la célula es una célula de ratón, por ejemplo una célula ME murina. En una modalidad, la célula es homocigota para el locus de inmunoglobulina modificada.

En un aspecto, se proporciona una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un primer polipéptido que comprende una primera secuencia VK O ?? humana somáticamente mutada, fusionada con una secuencia de región constante de cadena pesada humana.

En una modalidad, la célula además comprende una segunda cadena polipeptídica que comprende una segunda secuencia VK O ?? somáticamente mutada, fusionada con una secuencia de región constante de cadena ligera humana.

En una modalidad, la secuencia VK O ?? humana del primer polipéptido es cognada con la secuencia VK O ?? humana del segundo polipéptido.

En una modalidad, la secuencia VK o ?? del primer polipéptido y la secuencia VK O ?? del segundo polipéptido, cuando se asocien, se unen específicamente a un antígeno de interés. En una modalidad específica, el primer polipéptido comprende un dominio variable que consiste esencialmente de una secuencia VK humana, y el segundo polipéptido comprende un dominio variable que consiste esencialmente de una secuencia VK humana que es cognada con la secuencia VK humana del primer polipéptido, y la secuencia de la región constante humana, es una secuencia de IgG.

En una modalidad, la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula CHO, una célula COS, una célula 293, una célula HeLa y una célula retinal humana que expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PERC.6™).

En un aspecto, se proporciona una célula somática de ratón que comprende un cromosoma que comprende una modificación genética tal como la aquí descrita.

En un aspecto, se proporciona una célula germinal murina que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una modificación genética como la aquí descrita.

En un aspecto, se proporciona una célula pluripotente, pluripotente inducida o totipotente, derivada de un ratón, de la manera aquí descrita. En una modalidad específica, la célula es una célula madre embrionaria (ME) murina.

En un aspecto, se proporciona el uso de una célula como la aquí descrita, para la producción de un ratón, una célula, o una proteína terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo u otra proteína de unión al antígeno).

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento génico DH humano yuxtapuesto en la dirección 5' y en la dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico. Una modalidad específica, la construcción de ácido nucleico comprende un segmento de homología que es homólogo a una secuencia genómica humana que comprende segmentos génicos VK humanos. En una modalidad, la construcción objetivo comprende la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos génicos DH humanos, cada uno yuxtapuesto en dirección 5' y en dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento génico JK humano yuxtapuesto en dirección 5' con una SSR con separador 12-mérico. En una modalidad específica, la construcción de ácido nucleico comprende un primer segmento de homología que es homólogo a una secuencia génica DH genómica humana que está yuxtapuesta en dirección 5' y en dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende un segundo segmento de homología que es homólogo a una secuencia génica J genómica humana, o que es homólogo a una secuencia de región constante de cadena pesada fnurina, o que es homólogo a una secuencia intergénica J-C que se encuentra en dirección 5' de una secuencia de cadena pesada de región constante murina.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento \ ? yuxtapuesto en dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico, un segmento DH humano yuxtapuesto en dirección 3' y en dirección 5' con una SSR con separador 12-mérico, y un segmento J humano que se selecciona del grupo que consiste de un segmento JK yuxtapuesto en dirección 5' con una SSR con separador 23-mérico, un segmento ?? humano yuxtapuesto en dirección 5' con una SSR con separador 23-mérico, y un segmento JH humano yuxtapuesto en dirección 5' con una SSR con separador 23-mérico. En una modalidad, la construcción comprende un segmento de homología que contiene una homología con una secuencia de región constante murina, una secuencia intergénica J-C murina, y/o una secuencia ? humana.

En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de región variable de cadena ligera ? humana que comprende un fragmento del grupo A del locus de la cadena ligera ? humana. En una modalidad específica, el fragmento del grupo A del locus de cadena ligera ? humana, se extiende desde h\ 3-27 hasta ????3-1.

En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de región variable de cadena ligera ? humana que comprende un fragmento del grupo B del locus de cadena ligera ? humana. En una modalidad específica, el fragmento del grupo B del locus de cadena ligera ? humana se extiende desde hV 5-52 hasta hV 1-40.

En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de región variable de cadena ligera ? humana que comprende un fragmento genómico del grupo A y un fragmento genómico del grupo B. En una modalidad, la secuencia de región variable de cadena ligera ? humana comprende al menos un segmento génico del grupo A y al menos un segmento génico del grupo B.

En una modalidad, la secuencia de región variable de cadena ligera ? humana comprende al menos un segmento génico del grupo B y al menos un segmento génico del grupo C.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento DH humano yuxtapuesto tanto en dirección 5' como en dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico, normalmente encontrada en la naturaleza flanqueando ya sea a un segmento JK, un segmento JH, un segmento ?? o un segmento VH. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende un primer segmento de homología que es homólogo a una región intergénica V-J humana, o es homólogo a una secuencia genómica humana que comprende un segmento génico V humano. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende un segundo segmento de homología que es homólogo a una secuencia de región constante de cadena pesada humana o murina. En una modalidad específica, la secuencia de región constante de cadena pesada humana o murina se selecciona del grupo que consiste de una región CH1, de bisagra, CH2, CH3, y una combinación de las mismas. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende un segmento génico J humano flanqueado en dirección 5' por una SSR con separador 12-mérico. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende un segundo segmento de homología que es homólogo a un segmento génico J flanqueado en dirección 5' por una SSR con separador 12-mérico. En una modalidad, el segmento génico J se selecciona del grupo que consiste de un segmento génico JK humano, ?? humano, y JH humano.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento DH humano yuxtapuesto tanto en dirección 5' como en dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico, y una secuencia de reconocimiento de recombinasa específica, por ejemplo una secuencia reconocida por una recombinasa específica de sitio, tal como una proteína Cre, Flp o Dre.

En un aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento \/? humano o V humano, un segmento VH yuxtapuesto tanto en dirección 5' como en dirección 3' con una SSR con separador 12-mérico o con separador 23-mérico, y un segmento J humano con una SSR con separador 12-mérico o con separador 23-mérico, en donde la SSR con separador 12-mérico o con separador 23-mérico está posicionada inmediatamente en dirección 5' al segmento J humano (es decir, con respecto a la dirección de la transcripción). En una modalidad, la construcción comprende un segmento \/? humano yuxtapuesto con una SSR con separador 23-mérico en dirección 3', un segmento DH yuxtapuesto tanto en dirección 5' como en dirección 3' con una SSR con separador 12-mérico, y un segmento JK humano yuxtapuesto en dirección 5' con una SSR con separador 23-mérico. En una modalidad, la construcción comprende un segmento V humano yuxtapuesto en dirección 3' con una SSR con separador 12-mérico, un segmento DH humano yuxtapuesto tanto en dirección 5' como en dirección 3' con una SSR con separador 23-mérico y un segmento ?? humano yuxtapuesto en dirección 5' con una SSR con separador 12-mérico.

En un aspecto, se proporciona un vector dirigido a un blanco, que comprende: (a) un primer segmento dirigido y un segundo segmento dirigido, en donde el primero y segundo segmentos dirigidos se seleccionan independientemente del grupo que consiste de segmentos dirigidos humanos y murinos, en donde los segmentos dirigidos dirigen al vector hacia un locus génico de región V de ¡nmunoglobulina endógeno o modificado; y (b) una secuencia contigua de segmentos génicos VL humanos o una secuencia contigua de segmentos génicos VL humanos y al menos un segmento génico JK humano; en donde la secuencia contigua se selecciona del grupo que consiste de (i) el segmento de hVK4-1 a hVKl-6 y el segmento JK1, (ii) el segmento de hV«4-1 a hVKl-6 y JK1 a JK2, (iii) el segmento de IIVK4-1 a hVKl-6 y el del segmento JK1 al JK3, (¡V) el segmento de hVK4-1 a hVKl-6 y del segmento JK1 a JK4, (V) el segmento de hVK4-1 a IIVK1-6 y del segmento JK1 al JK5, (V¡) el segmento de hVK3-7 a hVKl-16, (vi i) el segmento de ?\/?1-17 a hVK2-30, (viii) el segmento de hV«3-31 a hVK2-40 y (¡x) una combinación de los mismos.

En una modalidad, los segmentos dirigidos que dirigen el vector hacia un locus de inmunoglobulina endógeno o modificado, son idénticos o sustancialmente idénticos a una secuencia en el locus de inmunoglobulina endógeno o modificado.

En un aspecto, se proporciona el uso de una construcción de ácido nucleico tal como aquí se describe, para la manufactura de un ratón, una célula o una proteína terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo u otra proteína de unión a un antígeno).

En un aspecto, se proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico proveniente de un ratón, tal como se describe en la presente, para preparar una línea celular para la manufactura de un agente terapéutico humano. En una modalidad, el agente terapéutico humano es una proteína de unión que comprende una secuencia variable de cadena ligera humana (por ejemplo, derivada de un segmento ?? humano o un segmento VK humano), fusionada con una secuencia constante de cadena pesada humana. En una modalidad, el agente terapéutico humano comprende un primer polipéptido que es una cadena ligera de inmunoglobulina ? o ?, y un segundo polipéptido que comprende una secuencia variable ?? humana o VK humana fusionada con una secuencia constante de cadena pesada humana.

En un aspecto, se proporciona un sistema de expresión que comprende una célula de mamífero transfectada con una construcción de ADN que codifica para un polipéptido que comprende un dominio VL humano somáticamente mutado, fusionado con un dominio CH humano.

En una modalidad, el sistema de expresión comprende además una secuencia nucleotídica que codifica para un dominio VL de inmunoglobulina fusionado con un dominio CL humano, en donde el dominio VL fusionado con el dominio CL humano es una cadena ligera cognada con el dominio VL fusionado con el dominio CH humano.

En una modalidad, la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste de una célula CHO, una célula COS, una célula Vero, una célula 293, y una célula retinal que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™).

En un aspecto, se proporciona un método para preparar una proteína de unión, que comprende obtener una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio VL a partir de un gen que codifica para una región VL fusionada con una región CH proveniente de una célula de un ratón tal como se describe en la presente, y clonar la secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia de la región VL, dentro del marco de lectura, con un gen que codifica para a región CH humana, para formar una secuencia de proteína de unión humana que se expresa en una célula adecuada.

En una modalidad, el ratón fue inmunizado con un antígeno de interés, y la región VL fusionada con la región CH se une específicamente (por ejemplo, con una KD en el rango micromolar, nanomolar o picomolar) a un epítopo del antígeno de interés. En una modalidad, la secuencia nucleotídica que codifica para la región VL fusionada con la región CH, es somáticamente mutada en el ratón.

En una modalidad, la célula adecuada se selecciona del grupo que consiste de una célula B, una célula de hibridoma, una célula de cuadroma, una célula CHO, una célula COS, una célula 293, una célula HeLa y una célula retinal humana que expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PERC.6™).

En una modalidad, la región CH comprende un isotipo IgG humano. En una modalidad específica, la IgG humana se selecciona del grupo que consiste de lgG1, lgG2 e lgG4. En otra modalidad específica, la IgG humana es la lgG1. En un otra modalidad específica, la IgG humana es la lgG4. En otra modalidad específica, la lgG4 humana es una lgG4 modificada. En una modalidad, la lgG4 modificada comprende una sustitución en la región de bisagra. En una modalidad específica, la lgG4 modificada comprende una sustitución en el residuo de aminoácido 228 en relación con una lgG4 humana de tipo silvestre, numerada de conformidad con el índice de numeración de la UE de Kabat. En una modalidad específica, la sustitución en el residuo de aminoácido 228 es una sustitución S228P, numerada de conformidad con el índice de numeración de la * UE de Kabat.

En una modalidad, la célula además comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio VL a partir de una cadena ligera que es cognada con el dominio VL fusionado con la región CH, y el método además comprende expresar la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio VL cognado fusionado con un dominio CK o ?? humano.

En un aspecto, se proporciona un método para preparar un ratón genéticamente modificado, en donde el método comprende reemplazar, en un locus de cadena pesada murina endógena, uno o más segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina de un ratón, por uno o más segmentos génicos de cadena ligera de inmunoglobulina humanos. En una modalidad, el reemplazo es de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos de cadena pesada de inmunoglobulina murina funcionales (es decir, los segmentos VH, DH y JH), por uno o más segmentos de cadena ligera humana funcionales (es decir, segmentos VL y JL). En una modalidad, el reemplazo es de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos VHl DH y JH de cadena pesada murina funcionales por la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos \? o VK humanos y cuando menos un segmento ^ o JK. En una modalidad específica, el reemplazo incluye la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos J o JK humanos funcionales.

En un aspecto, se proporciona un método para producir un ratón que expresa un polipéptido que comprende una secuencia derivad de un segmento \/? o VK de inmunoglobulina humana y/o un segmento ?? o JK de inmunoglobulina humana fusionado con una región constante de cadena pesada murina, que comprende reemplazar los segmentos variables de inmunoglobulina de cadena pesada murina (VH, DH y JH) por al menos un segmento ?? o VK humano, y al menos un segmento o JK humano, en donde el reemplazo es en una célula de ratón pluripotente, pluripotente inducida, o totipotente, para formar una célula progenitora murina genéticamente modificada; la célula progenitora murina genéticamente modificada se introduce en un ratón huésped; y el ratón huésped que comprende la célula progenitora genéticamente modificada, se somete a gestación para formar un ratón que comprende un genoma derivado de la célula progenitora de ratón genéticamente modificada. En- una modalidad, el huésped es un embrión. En una modalidad específica, el huésped se selecciona del grupo que consiste de una premórula murina (es decir, de una etapa de 8 células o de 4 células), un embrión tetraploide, un agregado de células embrionarias, o un blastoquiste.

En un aspecto, se proporciona un método para preparar un ratón genéticamente modificado tal como aquí se describe, que comprende introducir, por transferencia nuclear, un ácido nucleico que contiene una modificación como la aquí descrita, en una célula, y mantener la célula bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, incluyendo el cultivo de la célula y la gestación de un embrión que comprende la célula, en una madre sucedánea), para que se desarrolle y forme un ratón tal como el aquí descrito.

En un aspecto, se proporciona un método para producir un ratón modificado, comprendiendo el método modificar de la manera aquí descrita una célula ME murina o una célula pluripotencial o totipotencial o pluripotencial inducida murina, para incluir uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no rearreglados, ligados de manera operable con una secuencia constante de cadena pesada de inmunoglobulina, cultivar la célula ME, introducir la célula ME cultivada en un embrión huésped para formar un embrión quimérico, e introducir el embrión quimérico en un ratón huésped adecuado, para que se desarrolle y se forme un ratón modificado. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no rearreglados son segmentos génicos ? humanos o K humano. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no rearreglados comprenden segmentos \/? humanos o segmentos VK humanos, y uno o más segmentos ?, JK O Jh. En una modalidad, la secuencia génica de región constante de cadena pesada es una secuencia humana que se selecciona del grupo que consiste de CH1, bisagra CH2, CH3, y una combinación de las mismas. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no rearreglados, reemplazan la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos de región variable de cadena pesada murina endógenos funcionales, en el locus de cadena pesada murina endógeno, y la secuencia constante de cadena pesada es una secuencia murina que comprende una CH1, una región de bisagra, o una CH2 y una CH3.

En un aspecto, se proporciona una región variable de inmunoglobulina (VR) (por ejemplo, que comprende una secuencia VL humana fusionada con una secuencia JL o JH, o DH y JH, O DH y JL humana) producida en un ratón como aquí se describe. en una modalidad específica, la VR de inmunoglobulina se deriva de un segmento génico humano de línea germinal que se selecciona del grupo que consiste de un segmento VK y un segmento ??, en donde la VR es codificada por una secuencia rearreglada a partir del ratón en donde la secuencia rearreglada es somáticamente hipermutada. En una modalidad, la secuencia rearreglada comprende de uno a cinco hipermutaciones somáticas. En una modalidad, la secuencia rearreglada comprende al menos 6, 7, 8, 9 ó 10 hipermutaciones somáticas. En una modalidad, la secuencia rearreglada comprende más de 10 hipermutaciones somáticas. En una modalidad, la secuencia rearreglada está fusionada con una o más secuencias se región constante de cadena pesada humana o murina (por ejemplo, que se seleccionan del grupo que consiste de regiones CH1, de bisagra, CH2, CH3 humanas o murinas, y una combinación de las mismas).

En un aspecto, se proporciona una secuencia de aminoácidos de dominio variable de inmunoglobulina de una proteína de unión, producida en un ratón de la manera aquí descrita. En una modalidad, la VR está fusionada con una o más secuencias de región constante de cadena pesada humana o murina (por ejemplo, que se seleccionan del grupo que consiste de una región CH1, de bisagra, CH2, CH3, humana o murina, y una combinación de las mismas.

En un aspecto, se proporciona un dominio variable de cadena ligera codificado por una secuencia de ácido nucleico derivada de un ratón como el aquí descrito.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo Fab, F(ab)2, scFv) producido en un ratón como el aquí descrito, o derivado de una secuencia producida en un ratón como el aquí descrito.

Breve Descripción de los Dibujos La FIG. 1A ilustra un esquema (no a escala) del locus de cadena pesada murina. El locus de cadena pesada murina tiene aproximadamente 3 Mb de longitud y contiene aproximadamente 200 segmentos génicos de región variable (VH) de cadena pesada, 13 segmentos génicos de región de diversidad (DH) de cadena pesada y 4 segmentos génicos de región de unión (JH) de cadena pesada, así como intensificadores (Enh) y regiones constantes (CH) de cadena pesada.

La FIG. 1B ilustra un esquema (no a escala) del locus de cadena ligera ? humana. El locus de cadena ligera ? está duplicado en fragmentos contiguos distal y proximal de polaridad opuesta que se extienden aproximadamente 440 kb y 600 kb, respectivamente. Entre los dos segmentos contiguos hay aproximadamente 800 kb de ADN que se piensa que está libre de segmentos génicos VK. El locus de cadena ligera ? humana contiene aproximadamente 76 segmentos génicos VK, 5 segmentos génicos JK, un intensificador intrónico (EnH) y una sola región constante (CK).

La FIG. 2 muestra una estrategia de dirigir al objetivo, para la inserción progresiva de 40 segmentos génicos VK humanos y 5 segmentos génicos JK humanos, en el locus de cadena pesada murina. Se muestran los cartuchos de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, R2, etcétera).

La FIG. 3 muestra un locus de cadena pesada murina que comprende segmentos génicos VK y JK humanos ligados de manera operable con las regiones CH murina.s.

La FIG. 4A muestra un ejemplo de estrategia de dirigir al blanco, para la inserción progresiva de un segmento génico ?? humano y un solo segmento génico J? humano en el locus de cadena pesada murina. Se muestran los cartuchos de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, R2, etcétera).

La FIG. 4B muestra un ejemplo de una estrategia de dirigir al blanco, para la inserción progresiva de segmentos génicos ?? humanos y cuatro segmentos génicos J humanos, en el locus de cadena pesada murina. Se muestran los cartuchos de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, R2, etcétera).

La FIG. 5A muestra un ejemplo de una estrategia de dirigir al blanco, para la inserción progresiva de segmentos génicos ?? humanos, DH humanos y JH humanos, en el locus de cadena pesada murina. Se muestran los cartuchos de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, R2, etcétera).

La FIG. 5B muestra un ejemplo de una estrategia de dirigir al blanco, para la inserción progresiva de segmentos génicos \/? humanos, DH humanos y JK humanos, en el locus de cadena pesada murina. Se muestran los cartuchos de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, R2, etcétera).

La FIG. 6A muestra gráficas de contorno de esplenocitos teñidos para la expresión de superficie de B220 e IgM, provenientes de un ratón de tipo silvestre (TS) representativo y un ratón representativo homocigoto para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVK-5hjK HO).

La FIG. 6B muestra gráficas de contorno de esplenocitos activados en células B CD19+ y teñidos para inmunoglobulina D (IgD) e inmunoglobulina M (IgM), provenientes de un ratón representativo de tipo silvestre (TS) y un ratón representativo homocigoto para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVK-5hJK HO).

La FIG. 6C muestra el número total de células B CD19+, células B de transición (CD 9+lgMhilgDint) y células B maduras (CD19+lgMinllgDhi), en bazos cosechados provenientes de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVK-5hÜK HO).

La FIG. 7A muestra gráficas de contorno de médula ósea activada en singletes teñidos por inmunoglobulina M (IgM) y B220, provenientes de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVK-5hJK HO). Se observan células B inmaduras, maduras y pro/pre B en cada uno de los recuadros.

La FIG. 7B muestra el número total de células pre7Pro (B220+lgM"), inmaduras (B220in,lgM+) y maduras (B220hilg +) en médula ósea aislada del fémur de ratones de tipo silvestre (TS) y de ratones homocigotos para seis, segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena ((6hVK-5hJK HO).

La FIG. 7C muestra gráficas de contorno de médula ósea activada en CD19+ y teñida para ckit+ y CD43+, proveniente de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVK-5hJK HO). Se observan células pro y pre B en cada uno de los recuadros.

La FIG. 7D muestra el número de células pro B (CD19+CD43+ckit+) y pre B (CD19+CD43"ckit") en médula ósea cosechada del fémur de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hV -5hÜK HO).

La FIG. 7E muestra gráficas de contorno de médula ósea activada en singletes teñida para CD19 y CD43 proveniente de un ratón de tipo silvestre (TS) y de un ratón homocigoto para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVK-5hÜK HO). Se observan células B inmaduras, pre y pro B en cada uno de los recuadros.

La FIG. 7F muestra histogramas de médula ósea activada en células pre B (CD19+CD43mt) y que expresa ¡nmunoglobulina M (IgM) proveniente de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVK-5hJK HO).

La FIG. 7G muestra el número de células pre B lgM + (CD19+lgM+CD43inl) y células B inmaduras (CD19+lgM + CD43"), en médula ósea cosechada del fémur de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6???-5??? HO).

La FIG. 8A muestra gráficas de contorno de esplenocitos activados en CD19+ y teñidos para la expresión de \g + e lgK+, provenientes de un ratón que contiene un locus de cadena pesada de tipo silvestre y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos, y un ratón homocigoto para treinta segmentos génicos I K y cinco segmentos JK, en el locus de la cadena pesada endógena y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos ((30hVK-5hJK HO).

La FIG. 8B muestra gráficas de contorno de médula ósea activada en células B inmaduras (B220in,lgM+) y maduras (B220'n,lgM + ), teñidas para la expresión de \gX e IgK, aislada del fémur de un ratón que contenía un locus de cadena pesada de tipo silvestre y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos y un ratón homocigoto para treinta segmentos génicos I K y cinco segmentos génicos JK, en el locus de cadena pesada endógena y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos ((30hVK-5hJK HO).

La FIG. 9 muestra una alineación de secuencia de nucleótidos de la unión VK-JK-mlgG de doce clonas por RT-PCR independientes, amplificadas a partir de ARN de esplenocitos de ratones nubiles (nunca expuestos) homocigotos para treinta segmentos génicos hVK y cinco segmentos génicos JK en el locus de cadena pesada murina y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos. Las bases en letra minúscula indican bases que no son de línea germinal resultantes ya sea por mutación y/o por adición N durante la recombinación. Se incluyeron espacios artificiales (periodos) para alinear apropiadamente la región de marco estructural 4 y mos.trar alineación de la secuencia de nucleótidos IgG de cadena pesada murina para clonas cebadas IgG 1 , lgG2a/c, e lgG3.

Descripción Detallada de la Invención La frase "proteína de unión biespecífica" incluye una proteina de unión capaz de unirse selectivamente a dos o más epítopos. Las proteínas de unión biespecíficas comprenden dos diferentes polipéptidos que comprenden un primer dominio variable de cadena ligera (VL1), fusionado con una primera región CH y un asegundo dominio variable de cadena ligera (VL2) fusionado con una segunda región CH- En general, la primera y segunda regiones CH son idénticas, o sin diferentes en una o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, de la manera aquí descrita). Las regiones VL1 y VL2 se unen específicamente a diferentes epítopos -ya sea en dos moléculas diferentes (por ejemplo, antígenos) o bien, en la misma molécula (por ejemplo, en el mismo antígeno). Si una proteína de unión biespecífica se une selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad de la VL1 por el primer epítopo generalmente será al menos de uno a dos o de tres a cuatro órdenes de magnitud más bajas que la afinidad de VL1 por el segundo epítopo, y viceversa, con respecto a la VL2. Los epítopos reconocidos por la proteína de unión biespecífica pueden estar en el mismo objetivo o en objetivos diferentes (por ejemplo, en el mismo antígeno o en antígenos diferentes). Las proteínas de unión biespecíficas pueden prepararse, por ejemplo, al combinar una región VL1 y una región VL2 que reconozcan diferentes epítopos del mismo antígeno. Por ejemplo, se pueden fusionar secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones VL que reconozcan diferentes epítopos del mismo antígeno, con secuencias de ácido nucleico que codifican para diferentes regiones CH, y tales secuencias pueden ser expresadas en una célula que exprese una cadena ligera de inmunoglobulina, o se pueden expresar en una célula que no exprese una cadena ligera de inmunoglobulina. Una proteína de unión biespecífica típica tiene dos cadenas pesadas, cada una conteniendo tres CDRs de cadena ligera, seguidas por (del extremo N-terminal al extremo C-terminal): un dominio CH1, una región de bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que, ya sea no confiere especificidad de unión al antígeno, pero puede asociarse con cada una de las cadenas pesadas, o bien, que pueda asociarse con cada una de las cadenas pesadas y pueda encontrar uno o más de los epítopos unidos a VL1 y/o VL2, o que pueda asociarse con cada una de las cadenas pesadas y hacer posible la unión o ayudar a la unión de una o ambas de las cadenas pesadas a uno o ambos epítopos.

Por lo tanto, dos tipos generales de proteínas de unión biespecíficas son: (1) VL1 -CH(dímero), y (2) VL1 -CH:cadena ligera + VL2-CH:cadena ligera, en donde la cadena ligera es igual o diferente. En cualquiera de los casos, la región CH (es decir, la región constante de cadena pesada) puede ser diferencialmente modificada (por ejemplo, para unirse diferencialmente a la proteína A, para incrementar la vida media en el suero, etc.) de la manera aquí descrita, o puede ser la misma.

El término "célula" cuando se utiliza con referencia a la expresión de una secuencia, incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen células procarióticas y eucarioticas (una sola célula o múltiples células), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células de hongos, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células de planta, células de insecto (por ejemplo, células SF-9, SF-21, células de insecto infectada por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animales no humanos, células humanas, células B, o fusiones celulares, tales como por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunas modalidades, la célula es eucariótica y se selecciona del grupo que consiste de: células CHO (por ejemplo, CHO K1 , DXB- 1 CHO, Veggie-CHO); COS (por ejemplo, COS-7); células retínales, Vero, CV1, de riñon (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK); HeLa, HepG2, WI38, RC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21 ), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmicas), CV-1, U937, 3T3, células L, células C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, células Sertoli, células BRL 3A, células HT1080, células de mieloma, células tumorales, y una linea celular derivada de las células anteriormente mencionadas. En algunas modalidades, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo una célula retinal que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™).

El término "cognado" cuando se utiliza en el sentido de "cognado con", por ejemplo un primero dominio VL que es "cognado con" un segundo dominio VL, se refiere a la relación entre dos dominios VL provenientes de una misma proteína de unión producida por un ratón de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, un ratón que es genéticamente modificado de conformidad con una modalidad de la invención, por ejemplo un ratón que tiene un locus de cadena pesada en el cual las regiones VH, DH y JH son reemplazadas por regiones VL y JL, produce proteínas de unión similares a anticuerpo que tienen dos cadenas polipeptídicas idénticas hechas de la misma región CH murina (por ejemplo un isotipo IgG) fusionada con un primer dominio VL humano, y dos cadenas polipeptídicas idénticas hechas de la misma región CL murina fusionadas con un segundo dominio VL humano. Durante la selección clonal en el ratón, el primero y segundo dominios Vu humanos fueron seleccionados por el proceso de selección clonal para que aparezcan juntos en el contexto de una sola proteína de unión similar a un anticuerpo. De este modo, el primero y segundo dominios VL que aparecen juntos, como resultado del proceso de selección clonal, en una sola molécula similar a anticuerpo, son referidos como "cognados". En contraste, un dominio VL que aparece en una primera molécula similar a anticuerpo y un dominio VL que aparece en una segunda molécula similar a un anticuerpo, no son cognados, a menos que la primera y la segunda moléculas similares a anticuerpo tengan cadenas pesadas idénticas (es decir, a menos que el dominio VL fusionado con la primera región de cadena pesada humana y el dominio VL fusionado con la segunda región de cadena pesada humana, sean idénticos).

La frase "región determinante de complementariedad" o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de los genes de inmunoglobulina de un organismo, que normalmente aparece (es decir, en un animal de tipo silvestre) entre dos regiones de marzo estructural en una región variable de una cadena ligera o pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de células T). Una CDR puede ser codificada, por ejemplo, por una secuencia de línea germinal, o por una secuencia rearreglada o no rearreglada, y, por ejemplo, por una célula B núbil o madura, o por una célula T. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDRs pueden ser codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, que están en una secuencia de ácido nucleico no rearreglada), pero que son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de célula B, por ejemplo, como resultado de un empalmamiento o por la conexión de las secuencias (por ejemplo, una recombinacion V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

La frase "segmento génico", o "segmento", se refiere a un segmento génico de inmunoglobulina V (de cadena ligera o pesada) o D ó J (de cadena ligera o pesada), que incluye secuencias no rearregladas en loci de inmunoglobulina (por ejemplo, en seres humanos y ratones) que pueden participar en un rearreglo (mediado por, por ejemplo, recombinasas endógenas), para formar una secuencia V/J o V/D/J rearreglada. A menos que se indique de otra manera, los segmentos V, D y J comprenden las secuencias de señal de recombinación (SSR) que permiten la recombinación V/J) o la recombinación V/D/J, de conformidad con la regla 12/23. A menos que se indique de otra manera, los segmentos además comprenden secuencias que están asociadas en la naturaleza o que son funcionalmente equivalentes a las mismas (por ejemplo, para secuencias promotoras y líderes de segmentos V).

La frase "cadena pesada" o "cadena pesada de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina proveniente de cualquier organismo, y a menos que se especifica de otra manera, incluye un dominio variable de cadena pesada (VH). Los dominios VH incluyen tres CDRs de cadena pesada y cuatro regiones de marco estructural (FR), a menos que se especifique de otra manera. Los fragmentos de cadena pesada incluyen CDRs, CDRs y FRs, y combinaciones de los mismos. Una cadena pesada típica consiste esencialmente del siguiente dominio variable (del extremo N-terminal al extremo C-terminal): un dominio CH1, una región de bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, y opcionalmente un dominio CH4 (por ejemplo, en el caso de la IgM o IgE), y un dominio transmembranal (M) (por ejemplo, en el caso de ¡nmunoglobulina unida a la membrana en los linfocitos). Una región constante de cadena pesada es una región de cadena pesada que se extiende (desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal) desde fuera de FR4 hasta el extremo C-terminal de la cadena pesada. Las regiones constantes de cadena pesada con desviaciones menores, por ejemplo truncamientos de uno, dos, tres o varios aminoácidos del extremo C-terminal, estarían abarcadas por la frase "región constante de cadena pesada", así como las regiones constantes de cadena pesada con modificaciones de secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 sustituciones de aminoácido. Las sustituciones de aminoácido pueden ser en una o más posiciones que se seleccionan del grupo que consiste de, por ejemplo (con referencia a la numeración UE de una región constante de ¡nmunoglobulina, por ejemplo una región constante de IgG humana): 228, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241 , 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301 , 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 y 439.

Por ejemplo, y no de manera limitante, una región constante de cadena pesada puede ser modificada para que exhiba una vida media sérica extendida (en comparación con la misma región constante de cadena pesada, sin la o las modificaciones mencionadas) y puede tener una modificación en la posición 250 (por ejemplo E ó Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o en la 433 (por ejemplo, L/R/SI/P/Q o K) y/o en la 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o en la 428; o una modificación en la posición 307 ó 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y en la posición 434. En otro ejemplo, la modificación puede comprender una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y una modificación 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y una modificación 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); una modificación 307 y/ó 308 (por ejemplo, 308F ó 308P).

La frase "cadena ligera" incluye una secuencia de región constante (CL) de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique de otra manera, incluye cadenas ligeras ? humana y ? humana. Los dominios variables (VL) de cadena ligera típicamente incluyen tres CDRs de cadena ligera y cuatro regiones de marco estructural (FR), a menos que se especifique de otro modo. En general, una cadena ligera de longitud completa (VL + CL) incluye, del extremo amino-terminal al extremo carboxilo-terminal, un dominio VL que incluye las regiones FR1-CDR1 ,FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una región CL. Las cadenas ligeras (VL + CL) que pueden ser usadas en la presente invención, incluyen aquéllas que, por ejemplo, no se unen selectivamente a un primer o segundo epítopo (en el caso de proteínas de unión biespecíficas) selectivamente unido por la proteína de unión (por ejemplo, el o los epítopos selectivamente unidos por el dominio VL fusionado con el dominio CH). Los dominios VL que no se unen selectivamente al o los epítopos unidos por el dominio VL que está fusionado con el dominio CH, incluyen aquéllos que pueden ser identificados mediante la selección de las cadenas ligeras más comúnmente empleadas en las bibliotecas de anticuerpos existentes (bibliotecas wet o in silico), en donde las cadenas ligeras no interfieren sustancialmente con la afinidad y/o selectividad de los dominios de unión al epítopo de las proteínas de unión. Las cadenas ligeras adecuadas incluyen aquéllas que pueden unirse (por sí solas o en combinación con su VL cognada fusionada con la región CH) a un epítopo que es unido específicamente por la región VL fusionada con la región CH.

La frase "rango micromolar" significa 1-999 micromolar; la frase "rango nanomolar" significa 1-999 nanomolar; la frase "rango picomolar" significa 1-999 picomolar.

El término "animales no humanos" incluye cualquier vertebrado, tal como ciclostomas, peces con esqueleto, peces cartilaginosos tales como tiburones y mantarrayas, anfibios, reptiles, mamíferos y aves. Los animales no humanos adecuados incluyen los mamíferos. Los mamíferos adecuados incluyen primates no humanos, cabras, ovejas, cerdos, perros, vacas y roedores. Los animales no humanos adecuados se seleccionan del grupo que consiste de la familia de roedores, incluyendo ratas y ratones. En una modalidad, los animales no humanos son ratones.

Ratones, secuencias de nucleótidos y proteínas de unión Se proporcionan proteínas de unión que son codificadas por elementos de loci de inmunoglobulina, en donde las proteínas de unión comprenden regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina fusionadas con dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, se proporcionan múltiples estrategias para modificar genéticamente un locus de cadena pesada de inmunoglobulina en un ratón, para codificar proteínas de unión que contengan elementos codificados por loci de cadena ligera de inmunoglobulina. Tales ratones genéticamente modificados representan una fuente para generar poblaciones únicas de proteínas de unión que tienen una estructura de inmunoglobulina, pero que todavía exhiben una mejor diversidad sobre los anticuerpos tradicionales.

Los aspectos de las proteínas de unión que aquí se describen, incluyen proteínas de unión que son codificadas por loci de inmunoglobulina modificados, los cuales son modificados de tal modo que segmentos génicos que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) codifican para dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina (o porciones de los mismos), están ligados de manera operable con secuencias de nucleótidos que codifican para regiones constantes de cadena pesada. Al rearreglar los segmentos génicos de cadena ligera, se obtiene una secuencia de nucleótidos rearreglada que comprende una secuencia que codifica para un dominio variable de cadena ligera, fusionada con una secuencia que codifica para una región constante de cadena pesada. Esta secuencia codifica para un polipéptido que tiene un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina fusionado con una región constante de cadena pesada. Así pues, en una modalidad, el polipéptido consiste esencialmente, del extremo N-terminal al extremo C-terminal, de un dominio VL, una región CH1, una región de bisagra, una región CH2, una región CH3, y opcionalmente una región CH4.

En los ratones modificados aquí descritos, se producen proteínas de unión que también comprenden una cadena ligera cognada, en donde, en una modalidad, la cadena ligera cognada se aparea con el polipéptido anteriormente descrito, para producir una proteína de unión que es similar a un anticuerpo, pero la proteína de unión comprende una región VL sin región VH fusionada con una región CH.

En varias modalidades, los ratones modificados producen proteínas de unión que comprenden una región VL fusionada con una región CH (una cadena pesada híbrida), en donde la región VL de la cadena pesada híbrida exhibe un mejor grado de hipermutación somática. En estas modalidades, la mejoría es sobre una región VL que está fusionada con una región CL (una cadena ligera). En algunas modalidades, una región VL de una cadena pesada híbrida exhibe aproximadamente 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 ó 5 veces más hipermutaciones somáticas o más, que una región VL fusionada con una región CL. En algunas modalidades, los ratones modificados en respuesta a un antígeno, exhiben una población de proteínas de unión que comprenden una región VL de cadena pesada híbrida, en donde la población de proteínas de unión exhibe un promedio de aproximadamente 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 veces más hipermutaciones somáticas, o más, en la región VL de la cadena pesada híbrida, que lo que se observa en un ratón de tipo silvestre en respuesta al mismo antígeno. En una modalidad, las hipermutaciones somáticas en la región VL de la cadena pesada híbrida, comprenden una o más, o dos ó más, adiciones N en una CDR3.

En varias modalidades, las proteínas de unión comprenden dominios variables codificados por secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina que comprenden un número mayor de adiciones N que las observadas en la naturaleza para las cadenas ligeras rearregaldas a partir de un locus de cadena ligera endógena, por ejemplo una proteína de unión que comprende una región constante de cadena pesada murina fusionada con un dominio variable derivado de segmentos génicos V de cadena ligera humana y segmentos génicos J humanos (de cadena ligera o pesada), en donde los segmentos V y J humanos se rearreglan para formar un gen rearreglado que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 76, 8, 9 ó 10, ó más, adiciones N.

En varias modalidades, el ratón de la presente invención produce proteínas de unión que en promedio son más pequeñas que los anticuerpos de tipo silvestre (es decir, anticuerpos que tienen un domino VH), y poseen ventajas asociadas con un tamaño menor. El menor tamaño se debe, al menos en parte, a la ausencia de una secuencia de aminoácidos codificada por una región DH, normalmente presente en un dominio VH. El menor tamaño también se puede deber a la formación de una CDR3 derivada, por ejemplo, de una región VK y una región ??.

En otro aspecto, se proporcionan un ratón y un método para producir una población de proteínas de unión que tienen dominios VL somáticamente hipermutados, por ejemplo dominios VK humanos somáticamente mutados y por ejemplo dominios VK humanos codificados por genes variables ? rearregaldos, que comprenden 1-10 ó más adiciones N. En una modalidad, en ausencia de una región VH para generar diversidad de anticuerpos, un ratón de la presente invención generará proteínas de unión, por ejemplo, en respuesta a un desafío con un antígeno, cuyos dominios V son exclusiva o sustancialmente dominios VL. El proceso de selección clonal del ratón, por lo tanto, se limita a seleccionar exclusiva o sustancialmente proteínas de unión que tienen dominios VL, en vez de dominios VH. La hipermutación somática de los dominios VL será tan frecuente, o sustancialmente más frecuente (por ejemplo, de 2 a 5 veces mayor, o más) que en los ratones de tipo silvestre (los cuales también tienen mutaciones en dominios VL con alguna frecuencia). El proceso de selección clonal en un ratón de la presente invención, generará proteínas de unión de alta afinidad a partir del locus de inmunoglobulina modificado, incluyendo proteínas de unión que se unen específicamente a un epítopo con una afinidad en el rango nanomolar o picomolar. Las secuencias que codifican para tales proteínas de unión, se pueden emplear para producir proteínas de unión terapéuticas que contengan regiones variables humanas y regiones constantes humanas, empleando un sistema de expresión apropiado.

En otras modalidades, se puede producir un ratón de conformidad con la invención, en donde los loci de inmunoglobulina de cadena pesada y/o de cadena ligera murina están deshabilitados, o se volvieron no funcionales, y se pueden colocar transgenes completamente humanos o transgenes quiméricos humano-murinos, en el ratón, en donde al menos uno de los transgenes contiene un locus de cadena pesada modificado (por ejemplo, que tiene segmentos génicos de cadena ligera ligados de manera operable con una o más secuencias génicas de cadena pesada). Tales ratones también pueden producir una proteína de unión como la aquí descrita.

En un aspecto, se proporciona un método para incrementar la diversidad, incluyendo por hipermutación somática o por adiciones N en un domino VL, que comprende colocar un segmento génico V de cadena ligera no rearreglado y un segmento génico J no rearreglado, ligados de manera operable con una secuencia génica CH murina en un animal; exponer al animal a un antígeno de interés; y aislar del animal una secuencia génica V(ligera)/J rearreglada y somáticamente hipermutada, en donde dicha secuencia génica V(ligera)/J rearregalda está fusionada con una secuencia nucleotídica que codifica para una región CH de inmunoglobulina.

En una modalidad, la cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región VL hipermutada, es una IgM; en otra modalidad, una IgG; en otra modalidad, una IgE; en otra modalidad, una IgA.

En una modalidad, el dominio VL de clase cambiada y somáticamente hipermutado contiene aproximadamente de 2 a 5 veces más hipermutaciones somáticas, o más, que las observadas para un anticuerpo de clase cambiada y rearreglado que tenga una secuencia VL, que esté operablemente ligada con una secuencia CL. En una modalidad, las hipermutaciones somáticas observadas en el dominio VL somáticamente hipermutado, son aproximadamente las mismas en número que las observadas en un dominio VH expresado a partir de un gen VH fusionado con una región CH- En un aspecto, se proporciona un método para preparar un dominio VL humano de alta afinidad, en donde el método comprende exponer un ratón de la presente invención a un antígeno de interés, permitir que el ratón desarrolle una respuesta inmunitaria hacia el antígeno de interés, y aislar un dominio VL humano de clase cambiada y somáticamente mutado del ratón, que se una específicamente al antígeno de interés con una alta afinidad.

En una modalidad, la KD de una proteína de unión que comprende el dominio VL humano de clase cambiada y somáticamente mutado, está en el rango nanomolar o picomolar.

En una modalidad, la proteína de unión consiste esencialmente de un polipéptido dimérico, en donde el polipéptido consiste esencialmente de la proteína de unión de clase cambiada y somáticamente mutada, que comprende un dominio VL humano fusionado con una región CH humana.

En una modalidad, la proteína de unión consiste esencialmente de un polipéptido dimérico y dos cadenas ligeras, en donde el polipéptido consiste esencialmente de la proteína de unión de clase cambiada y somáticamente mutada que tiene un dominio VL humano fusionado con una región CH humana; y en donde cada polipéptido del dímero está asociado con una cadena ligera cognada que comprende un dominio VL de cadena ligera cognado y una región C|_ humana.

En un aspecto, se proporciona un método para hipermutar somáticamente una secuencia génica VL humana, en donde el método comprende colocar un segmento génico VL humano y un segmento JL humano ligados de manera operable con un gen CH murino endógeno en un locus de ¡nmunoglobulina de cadena pesada murina endógeno; exponer al ratón a un antígeno de interés; y obtener del ratón una secuencia génica VL humana somáticamente hipermutada, que se una al antígeno de interés.

En una modalidad, el método además comprende obtener a partir del ratón, una secuencia génica VL de una cadena ligera, que sea cognada con la secuencia génica VL humana somáticamente hipermutada que se une al antígeno de interés.

Proteínas de Unión VL con Secuencia DH En varios aspectos, el ratón que comprende un segmento génico V de cadena ligera de ¡nmunoglobulina no rearreglado y un segmento génico J (por ejemplo, de cadena ligera o pesada) no rearreglado, también comprende un segmento génico DH ' no rearreglado que es capaz de recombinarse con el segmento J, para formar una secuencia D/J rearreglada, la cual, a su vez, es capaz- de rearreglarse con el segmento V de cadena ligera, para formar una secuencia variable rearreglada derivada de (a) el segmento V de cadena ligera, (b) el segmento DH, y (c) el segmento J (por ejemplo, de cadena ligera o pesada); en donde la secuencia variable rearreglada está ligada de manera operable con una secuencia constante de cadena pesada (por ejemplo, que se selecciona del grupo que consiste de las regiones CH1, de bisagra, CH2, CH3, y una combinación de las mismas; por ejemplo, ligada de manera operable con una región CH , de bisagra, CH2 y CH3 murina o humana).

En varios aspectos, los ratones que comprenden segmentos V de cadena ligera humana no rearreglados y segmentos J que también comprenden un segmento D, son útiles, por ejemplo, como fuente de una mayor diversidad de secuencias CDR3. Normalmente, las secuencias CDR3 surgen en la recombinación V/J de las cadenas ligeras, y en la recombinación V/D/J de las cadenas pesadas. Se proporciona diversidad adicional mediante la adición de nucleótidos que ocurren durante la recombinación (por ejemplo, adiciones N) y también como resultado de hipermutaciones somáticas. Las características de unión conferidas por las secuencias CDR3, generalmente están limitadas a aquellas conferidas por la secuencia CDR3 de cadena ligera, la secuencia CDR3 de cadena pesada, y una combinación de las secuencias CDR3 de cadena ligera y de cadena pesada, según pueda ser el caso. En los ratones como los aquí descritos, sin embargo, se dispone de una fuente de diversidad adicional debido a las características de unión conferidas como resultado de una combinación de una primera CDR3 de cadena ligera (en el polipéptido de cadena pesada) y una segunda CDR3 de cadena ligera (en el polipéptido de cadena ligera). Es posible una diversidad adicional, ya que la primera CDR3 de cadena ligera puede contener una secuencia derivada de un segmento génico D, como en un ratón como el aquí descrito, que comprende un segmento V no rearreglado proveniente de una región V de cadena ligera, ligado de manera operable con un segmento D y ligado de manera operable con un segmento J (de cadena ligera o pesada), empleando la ingeniería de manipulación de SSR tal como aquí se enseña.

Otra fuente de diversidad son las adiciones N y/o adiciones P que pueden ocurrir en las recombinacíones V/ligera)J ó V/ligera)/D/J, que son posibles en los ratones aquí descritos. Por lo tanto, los ratones que aquí se describen, no sólo proporcionan una diferente fuente de diversidad (cadena ligera-cadena ligera), sino que también una fuente de diversidad adicional a causa de la adición de, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más, adicionales N en un gen V/ligera)/J rearreglado o un gen v(lígera/D/J rearreglado), en un ratón como el aquí descrito.

En varios aspectos, el uso de un segmento génico D ligado de manera operable con un segmento génico J y un segmento génico V de cadena ligera, proporciona una mayor diversidad. El ligamiento operable de un segmento DH en este caso, requerirá que el segmento D sea capaz de recombinarse con el segmento J en cuestión. Así pues, se requerirá que el segmento D tenga yuxtapuesta una SSR en dirección 3' que coincida con la SSR yuxtapuesta en dirección 5' del segmento J, de tal modo que el segmento D y el segmento J puedan rearreglarse. Además, el segmento D requerirá una SSR apropiada yuxtapuesta en dirección 5' que. coincida con la SSR yuxtapuesta en dirección 3' del segmento D, de tal modo que el segmento D/J rearreglado y el segmento V puedan rearreglarse, para formar un gen que codifique para un dominio variable.

Una SSR, o secuencia de. señal de recombinación, comprende una secuencia heptamérica de ácido nucleico conservada, separada por 12 pares de bases (pb) o 23 pares de bases (pb) de secuencia no conservada, de una secuencia nonamérica de ácido nucleico conservada. Las SSR son utilizadas por las recombinasas para unir segmentos de genes de ¡nmunoglobulina durante el proceso de rearreglo, siguiendo la regla 12/23. De acuerdo con la regla 12/23, un segmento génico yuxtapuesto con una SSR que tiene un separador de 12 pb (no conservado), se rearregla con un segmento génico yuxtapuesto con una SSR que tiene un separador de 23 pb (no conservado), es decir, generalmente no se observan rearreglos entre segmentos génicos en los que cada uno tiene una SSR con un separador de 12 pb, o en donde cada una tiene una SSR con un separador de 23 pb.

En el caso del locus de cadena ligera ?, los segmentos génicos variables segmentos génicos \/?) están flanqueados en dirección 3' (con respecto a la dirección de la transición de la secuencia V) por una SSR que tiene un separador 23-mérico, y segmentos génicos de unión (y los segmentos génicos ??) están flanqueados en dirección 5' (con respecto a la dirección de la transición de la secuencia J= por una SSR que tiene un separador 12-mérico. Por lo tanto, los segmentos V y JX están flanqueados por SSRs que son compatibles con la regla 12/23, y por lo tanto son capaces de recombinarse durante el rearreglo.

Sin embargo, en el locus ? de un organismo silvestre, cada segmento VK funcional está flanqueado en dirección 3' por una SSR que tiene un separador 12-mérico. Los segmentos JK, por lo tanto, tienen separadores 23-méricos yuxtapuestos en el lado en dirección 5' del segmento JK. En el locus de cadena pesada, los segmentos génicos VH están yuxtapuestos en dirección 3' por una SSR que tiene un separador 23-mérico, seguido por un segmento DH yuxtapuesto en dirección 5' y en dirección 3' por un separador 12-mérico, y segmentos JH cada uno con un segmento 23-mérico yuxtapuesto en el lado hacia 5' del segmento JH. En el locus de la cadena pesada, primero ocurre la recombinación D/J, mediada por la SSR de DH en dirección 3' con el separador 12-mérico y la SSR de JH en dirección 5' con el separador 23-mérico, para obtener una secuencia D-J rearreglada intermediaria, que tiene una SSR yuxtapuesta en el lado en dirección 5' que tiene una SSR con un separador 12-mérico. El segmento D-J rearreglado que tiene la SSR con el separador 12-mérico yuxtapuesta en dirección 5', entonces, se rearregla con el segmento VH que tiene la SSR con el separador 23-mérico yuxtapuesto en su lado en dirección 3', para formar una secuencia V/D/J rearreglada.

En una modalidad, se emplea un segmento \/? en el locus de cadena pesada con un segmento génico J que es un segmento J?, en donde el segmento \/? comprende una SSR yuxtapuesta en dirección 3' de la secuencia \/?, y la SSR comprende un separador 23-mérico, y el segmento J es un segmento J? con una SSR yuxtapuesta en dirección 5' que tiene un separador 12-mérico (por ejemplo, tal como se encuentra en la naturaleza).

En una modalidad, se emplea un segmento ?? en el locus de cadena pesada con un segmento génico J que es un segmento génico JK o un segmento génico JH, en donde la secuencia ?? tiene yuxtapuesta en su lado hacia 3' una SSR que comprende un separador 23-mérico, y el segmento JK O Jh tiene yuxtapuesta una SSR en su lado en dirección 5', que comprende un separador 12-mérico.

En una modalidad, se emplea un segmento ?? en el locus de cadena pesada con un segmento génico DH y un segmento génico J. En una modalidad, el segmento V comprende una SSR yuxtapuesta en el lado en dirección 3' de la secuencia ??, con una SSR que tiene un separador 23-mérico; el segmento DH comprende una SSR yuxtapuesta en el lado en dirección 5' y en el lado en dirección 3' de la secuencia DH, que tiene un separador 12-mérico, y un segmento J que tiene una SSR yuxtapuesta en su lado en dirección 5' que tiene un separador 23-mérico, en donde el segmento J se selecciona del grupo que consiste de un segmento JX, JK, y JH.

En una modalidad, el segmento VK se emplea en el locus de cadena pesada con un segmento génico J (sin ningún segmento D interviniente), en donde el segmento VK tiene una SSR yuxtapuesta en el lado en dirección 3' del segmento VK, que comprende una SSR con un separador 12-mérico, y el segmento J tiene yuxtapuesta en su lado en dirección 5', una SSR con un separador 23-mérico, y el segmento JK se selecciona del grupo que consiste de un segmento JK, un segmento ?? y un segmento JH. En una modalidad, el segmento V y/o el segmento J son humanos.

En una modalidad, el segmento V se emplea en el locus de cadena pesada con un segmento D y un segmento J, en donde el segmento VK tiene una SSR yuxtapuesta en el lado en dirección 3' del segmento VK, que comprende una SSR con un separador 12-mérico, el segmento D tiene yuxtapuesta en su lado en dirección 5' y en su lado en dirección 3', una SSR con separador 23-mérico, y el segmento J tiene yuxtapuesta en su lado en dirección 5', una SSR con separador 12-mérico. En una modalidad, el segmento J se selecciona del grupo que consiste de un segmento JK, un segmento ?? y un segmento JH. En una modalidad, el segmento V y/o el segmento J son humanos.

Un segmento J? con una SSR que tiene un separador 23-mérico yuxtapuesta en su extremo en dirección 5', o un segmento JK O JH con una SSR que tiene un separador 12-mérico yuxtapuesta en su extremo en dirección 5', se prepara utilizando cualquiera de los métodos adecuados para preparar secuencias de ácido nucleico que se conocen en la técnica. Un método adecuado para preparar un segmento J que tenga una SSR yuxtapuesta en dirección 5', en donde la SSR tiene un separador seleccionado (por ejemplo, 12-mérico ó 23-mérico), comprende sintetizar químicamente un ácido nucleico que comprende el heptámero, el nonámero, y el separador seleccionado, y fusionarlo con una secuencia de segmento J que es químicamente 67 invención generará proteínas de unión, por ejemplo, en respuesta a un desafío con un antígeno, cuyos dominios V son exclusiva o sustancialmente dominios VL. El proceso de selección clonal del ratón, por lo tanto, se limita a seleccionar exclusiva o sustancialmente proteínas de unión que tienen dominios VL, en vez de dominios VH. La hipermutación somática de los dominios VL será tan frecuente, o sustancialmente más frecuente (por ejemplo, de 2 a 5 veces mayor, o más) que en los ratones de tipo silvestre (los cuales también tienen mutaciones en dominios VL con alguna frecuencia). El proceso de selección clonal en un ratón de la presente invención, generará proteínas de unión de alta afinidad a partir del Iocus de inmunoglobulina modificado, incluyendo proteínas de unión que se unen específicamente a un epítopo con una afinidad en el rango nanomolar o picomolar. Las secuencias que codifican para tales proteínas de unión, se pueden emplear para producir proteínas de unión terapéuticas que contengan regiones variables humanas y regiones constantes humanas, empleando un sistema de expresión apropiado.

En otras modalidades, se puede producir un ratón de conformidad con la invención, en donde los loci de inmunoglobulina de cadena pesada y/o de cadena ligera murina están deshabilitados, o se volvieron no funcionales, y se pueden colocar transgenes completamente humanos o transgenes quiméricos humano-murinos, en el ratón, en donde al menos uno de los transgenes contiene un Iocus de cadena pesada modificado (por ejemplo, que tiene Las proteínas de unión aquí descritas, y las secuencias de nucleótidos que las codifican, se pueden emplear para preparar proteínas de unión multiespecíficas, por ejemplo proteínas de unión biespecíficas. En este aspecto, un primer polipéptido que consiste esencialmente de un primer dominio VL fusionado con una región CH, se puede asociar con un segundo polipéptido que consiste esencialmente de un segundo dominio VL fusionado con una región CH- Cuando el primer dominio VL y el segundo dominio VL se unen específicamente a un epítopo diferente, se puede preparar una molécula de unión biespecífica empleando los dominios VL. La región CH puede ser igual o diferente. En una modalidad, por ejemplo una de las regiones CH puede ser modificada para eliminar una determinante de unión a proteína A, mientras que la otra región constante de cadena pesada no es modificada. Este arreglo particular simplifica el aislamiento de la proteína de unión biespecífica de, por ejemplo, una mezcla de homodímeros (por ejemplo, homodímeros del primero y segundo polipéptidos).

En un aspecto, los métodos y composiciones aquí descritos se utilizan para preparar proteínas de unión biespecíficas. En este aspect5o, una primera VL que está fusionada con una región CH y una segunda VL que está fusionada con una región CH, cada una independientemente es clonada dentro del marco estructural, con una secuencia de IgG humana del mismo isotipo (por ejemplo, una lgG1, lgG2, lgG3 ó lgG4 humana). La primera VL se une específicamente a un primer epítopo, y la segunda VL se une específicamente a un segundo epítopo. El primero y segundo epítopos pueden ser para antígenos diferentes, o para el mismo antígeno.

En una modalidad, el isotipo IgG de la región CH fusionada con la primera VL y el isotipo IgG de la región CH fusionado con la segunda VL, son el mismo isotipo, pero diferente en que un tipo IgG comprende al menos una sustitución de aminoácido. En una modalidad, la al menos una sustitución de aminoácido hace que la cadena pesada portadora de la sustitución sea incapaz o sustancialmente incapaz de unirse a la proteína A, en comparación con la cadena pesada que carece de la sustitución.

En una modalidad, la primera región CH comprende un primer dominio CH3 de una IgG humana, que se selecciona del grupo que consiste de lgG1, lgG2, e lgG4; y la segunda región CH comprende un segundo dominio CH3 de una IgG humana que se selecciona del grupo que consiste de IgG 1 , lgG2 e IgG 4, en donde el segundo dominio CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión del segundo dominio CH3 con la proteína A.

En una modalidad, el segundo dominio CH3 comprende una modificación 435R, numerada de conformidad el índice UE de Kabat. En otra modalidad, el segundo dominio CH3 además comprende una modificación 436F, numerada de conformidad con el índice UE de Kabat.

En una modalidad, el segundo dominio CH3 es el de una IgG 1 humana que comprende una modificación que se selecciona del grupo que consiste de D356E, L358 , N384S, K392N, V397M y V422I, numeradas de conformidad con el índice UE de Kabat.

En una modalidad, el segundo dominio CH3 es el de una lgG2 humana que comprende una modificación que se selecciona del grupo que consiste de N384S, K392N, y V422I, numeradas de conformidad con el índice UE de Kabat.

En una modalidad, el segundo dominio CH3 es el de una lgG4 humana que comprende una modificación que se selecciona del grupo que consiste de Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, y V422I, numeradas de conformidad con el índice UE de Kabat.

En una modalidad, la proteína de unión comprende regiones CH que tienen una o más modificaciones como las aquí descritas, en donde la región constante de la proteína de unión no es inmunogénica o sustancialmente no es inmunogénica en un ser humano. En una modalidad específica, las regiones CH comprenden secuencias de aminoácidos que no presentan un epítopo inmunogénico en un ser humano. En otra modalidad específica, la proteína de unión comprende una región CH que no se encuentra en una cadena pesada humana de tipo natural, y la región CH no comprende una secuencia que genere un epítopo para células T.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir cómo preparar y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar los alcances de lo que los inventores consideran su invención. A menos que se indique de otra manera, la temperatura que está en grados Celcius y la presión es la atmósfera o cercana a la atmosférica.

Ejemplo I Introducción de Segmentos Génicos de Cadena Ligera en un Locus de Cadena Pesada Se prepararon varias construcciones dirigidas a objetivo, utilizando la tecnología de ingeniería genética de VELOCIGENE® (veánse por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6,586,251 y Valenzuela, D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L, Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Domínguez, M.G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659), para modificar bibliotecas de Cromosomas Artificiales Bacterianos (BAC) genómicos murinos. El ADN BAC murino fue modificado por recombinación homologa para inactivar el locus de cadena pesada murino endógeno, mediante la eliminación dirigida al blanco de los segmentos génicos vH, DH y JH, para asegurar la inserción de segmentos de genes de cadena ligera ? de línea germinal humana no rearreglados (parte superior de la FIG. 2).

Brevemente, el locus de cadena pesada murina fue eliminado en dos eventos dirigidos sucesivos, utilizando una recombinación mediada por la enzima recombinasa. El primer evento dirigido incluyó un objetivo en el extremo 5' del locus de cadena pesada murina, utilizando un vector dirigido que comprende, de 5' a 3', un segmento de homología murino 5', un sitio de reconocimiento de recombinasa, un cartucho de neomicina, y un segmento de homología 3'. Los segmentos de homología 5' y 3' contenían la secuencia 5' del locus de cadena pesada murina. El segundo evento dirigido incluyó un objetivo en el extremo 3' del locus de cadena pesada murina, en la región de los segmentos génicos JH, utilizando un segundo vector dirigido que contenía, de 5' a 3', un segmento de homología murina 5', un sitio de reconocimiento de recombinasa 5', un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa, un cartucho de higromicina, un tercer sitio de reconocimiento de recombinasa, y un segmento de homología murina 3'. Los segmentos de homología 5' y 3' contenían una secuencia que flanqueaba los segmentos génicos JH murinos y en dirección 5' del intensificador intrónico, y las regiones constantes. Las células ME positivas que contenían un locus de cadena pesada modificado hacia el cual estaban dirigidos ambos vectores (como se describió anteriormente), fueron confirmadas por cariotipo. Después, se aisló ADN de las células ME doble objetivo y se sometió a tratamiento con una recombinasa, regulando de esta manera la deleción de ADN genómico del locus de cadena pesada murina, entre el sitio de reconocimiento de la recombinasa 5' en el primer vector dirigido, y el sitio de reconocimiento de recombinasa 5' en el segundo vector dirigido, dejando un solo sitio de reconocimiento de recombinasa y el cartucho de higromicina flanqueados por dos sitios de reconocimiento de recombinasa (véase la parte superior de la FIG. 2). De esta manera se creó un locus de cadena pesada murina modificado que contenía genes CH intactos, para insertar progresivamente segmentos génicos de linea germinal ? humana, de una manera precisa mediante el uso de vectores dirigidos, tal como se describe a continuación.

Se prepararon por ingeniería genética cuatro vectores dirigidos por separado, para insertar progresivamente 40 segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, en el locus de cadena pesada murina inactivado (anteriormente descrito), empleando las técnicas moleculares estándar reconocidas en este campo (FIG.2). Los segmentos génicos ? humanos utilizados para la preparación por ingeniería genética de las cuatro construcciones dirigidas, se encuentran en la naturaleza de manera contigua proximal al locus de cadena ligera humana de línea germinal (FIG. 1B y Tabla 1).

Se preparó por ingeniería genética un fragmento genómico humano de -110,499 pb que contenía los primeros seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, para que incluyera un sitio Pl-Scel 431 pb en dirección 3' del segmento génico JK5 humano. Otro sitio Pl-Scel fue preparado en el extremo 5' de un fragmento genómico de -7,852 pb, que contenía el intensificador intrónico de cadena pesada murina, la región de conmutación Ig (ßµ) y el gen Ig del locus de cadena pesada murina. Este fragmento murino se utilizó como un segmento de homología 3', al ligarlo al fragmento humano de -110.5 kb, lo cual creó una unión 3' que contenía de 5' a 3', la secuencia genómica de ~110.5 kb del locus de cadena ligera ? humana que contenía los primeros seis segmentos génicos VK consecutivos y cinco segmentos génicos JK, un sitio Pl-Scel, una secuencia de cadena pesada murina de -7,852 pb que contenía el intensificador intrónico murino, la región y la región constante IgM murino. En dirección 5' del segmento génico VK1-6 humano, se encontraba una secuencia ? humana adicional de 3,710 pb, antes del inicio del segmento de homología murina 5', que contenía 19,752 pb de ADN genómico murino correspondiente a la secuencia 5' del locus de cadena pesada murina. Entre el segmento de homología 5' y el inicio de la secuencia humana ?, había un cartucho de neomicina flanqueado por tres sitios de reconocimiento de recombinasa (véase el Vector Dirigido 1, FIG. 2). El vector dirigido final para la primera inserción de la secuencia ? humana, de 5' a 3', incluía un segmento de homología 5' que contenía ~20 kb de secuencia genómica murina en dirección 5' del locus de la cadena pesada, un primer sitio de reconocimiento de recombinasa (R1), un cartucho de neomicina, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa (R2), un tercer sitio de reconocimiento de recombinasa (R3), una secuencia ? humana de -110.5 kb que contenía los primeros seis segmentos génicos VK humanos consecutivos y cinco segmentos génicos JK humanos, un sitio Pl-Scel, y un segmento de homología 3' que contenía -8 kb de secuencia genómica murina, incluyendo el intensificador intrónico, la región S y el gen constante IgM murino (véase la FIG. 2, Vector Dirigido 1). La recombinación, homologa con este vector dirigido, creó un locus de cadena pesada murina modificado que contenia seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, ligados de manera operable con los genes constantes de cadena pesada murina endógenos, y después de la recombinación, se formó una cadena pesada híbrida (es decir, un dominio VK humano y una región CH murina).

Tabla 1 Tamaño de Vector la Secuen¬ Segmentos Génicos ? Humanos Añadidos Dirigido cia K Humana VK JK Introducción de 10 segmentos génicos VK humanos adicionales, en un locus de cadena pesada híbrido. Se preparó por ingeniería genética un segundo vector dirigido para la introducción de 10 segmentos génicos VK humanos adicionales, al locus de cadena pesada murina modificado anteriormente descrito (véase la FIG: 2, Vector Dirigido 2). Se preparó por ingeniería genética un fragmento genómico humano de 140,058 pb que contenía 12 segmentos génicos VK humanos consecutivos provenientes del locus de cadena ligera ? humano, con un segmento de homología 5' que contenía la secuencia genómica murina en dirección 5' del locus de cadena pesada murina y un segmento de homología 3' que contenía una secuencia ? genómica humana. En dirección 5' del segmento génico VK 1-16 humano, había una secuencia ? humana adicional de 10,170 pb, antes del inicio del segmento de homología murina 5', el cual era el mismo segmento de homología -5' utilizado para la construcción del Vector Dirigido 1 (véase la FIG. 2). Entre el segmento de homología 5' y el inicio de la secuencia humana, había un cartucho de higromicina flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa. El segmento de homología 3' incluía un traslapamiento de 31,165 pb de la secuencia ? genómica humana, correspondiente al equivalente al extremo 5' del fragmento de -110.5 kb de la secuencia ? genómica humana del Vector Dirigido 1 (FIG. 2). El vector dirigido final para la inserción de 10 segmentos génicos VK humanos adicionales, de 5' a 3', incluía un segmento de homología 5' que contenía -20 kb de secuencia genómica murina en dirección 5' del locus de la cadena pesada, un primer sitio de reconocimiento de recombinasa (R1), un cartucho de higromicina, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa ( 2), y una secuencia ? genómica humana de -140 kb, que contenía 12 segmentos génicos V humanos consecutivos, -31 kb de los cuales se traslapaban con el extremo 5' de la secuencia ? humana del Vector Dirigido 1 y servían como segmento de homología 3' para esta construcción dirigida. La recombinación homologa con este Vector Dirigido, creó un locus de cadena pesada murina modificado que contenía 16 segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, ligados de manera operable con los genes constantes de cadena pesada murina, y después de la recombinación, se formó una cadena pesada híbrida.

Introducción de catorce segmentos génicos VK humanos adicionales, en un locus de cadena pesada híbrida. Se preparó por ingeniería genética un Tercer Vector Dirigido para la introducción de 14 segmentos génicos VK humanos adicionales al locus de cadena pesada murina modificado anteriormente descrito (véase la FIG. 2, Vector Dirigido 3). Se preparó un fragmento genómico humano de 160,579 pb que contenía 15 segmentos génicos VK humanos consecutivos, con un segmento de homología 5' que contenía la secuencia genómica murina en dirección 5' del locus de cadena pesada murina y un segmento de homología 3' que contenía la secuencia ? genómica humana. En dirección 5' del segmento génico VK 2-30 humano, había una secuencia ? humana adicional de 14,687 pb, antes del inicio del segmento de homología murino 5', el cual era el mismo segmento de homología 5' utilizado para los dos Vectores Dirigidos anteriores (que se describieron anteriormente, véase también la FIG. 2). Entre el segmento de homología 5' y el inicio de la secuencia ? humana, había un cartucho de neomicina flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa. El segmento de homología 3' incluía un traslapamiento de 21,275 pb de la secuencia ? genómica humana, correspondiente al equivalente al extremo 5' del fragmento de -140 kb de la secuencia ? genómica humana del Vector Dirigido 2 (FIG. 2). El vector dirigido para la inserción de 14 segmentos génicos VK humanos adicionales, de 5' a 3', incluía un segmento de homología 5' que contenía una secuencia genómica murina de -20 kb, en dirección 5' del locus de la cadena pesada murina, un primer sitio de reconocimiento de recombinasa (R1), un cartucho de neomicina, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa (R2), y una secuencia ? genómica humana de -161 kb, que contenía 15 segmentos génicos V humanos, de los cuales -21 kb se traslapaban con el extremo 5' de la secuencia ? humana del Vector Dirigido 2 y servía como segmento de homología 3' para esta construcción dirigida. La recombinación homologa con este Vector Dirigido, creó un locus de cadena pesada murina modificado que contenía 30 segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, ligados de manera operable con los genes constantes de cadena pesada murina, y después de la recombinación, se formó una cadena pesada ? quimérica.

Introducción de 10 segmentos génicos VK humanos adicionales, en un locus de cadena pesada híbrida. Se preparó por ingeniería genética un cuarto Vector Dirigido, para la introducción de 10 segmentos génicos VK humanos adicionales al locus de cadena pesada murina modificado anteriormente descrito (véase la FIG. 2, Vector Dirigido 4). Se preparó por ingeniería genética un fragmento genómico humano de 90,398 pb, que contenía 16 segmentos génicos VK humanos consecutivos, con un segmento de homología 5' que contenía una secuencia genómica murina en dirección 5' del locus de cadena pesada murina, y un segmento de homología 3' que contenía una secuencia ? genomica humana. En dirección 5' del segmento génico VK 2-40 humano, había una secuencia ? humana adicional de 8,484 pb, antes del inicio del segmento de homología murina 5', el cual era el mismo segmento de. homología 5' que el de los Vectores Dirigido anteriores (anteriormente descritos, véase también la FIG. 2). Entre el segmento de homología 5' y el inicio de la secuencia ? humana, había un cartucho de higromicina flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa. El segmento de homología 3' incluía un traslapamiento de 61,615 pb de la secuencia ? genomica humana, que correspondía al equivalente al extremo 5' del fragmento de -160 kb de la secuencia ? genomica humana del Vector Dirigido 3 (FIG. 2). El vector dirigido final para la inserción de 10 segmentos génicos VK humanos adicionales, de 5' a 3', incluía un segmento de homología 5' que contenía una secuencia genomica murina de -20 kb, en dirección 5' al locus de la cadena pesada murina, un primer sitio de reconocimiento de recombinasa (R1), un cartucho de higromicina, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa (R2), y una secuencia ? genomica humana de -90 kb, que contenía 16 segmentos génicos ?? humanos, -31 kb de los cuales se traslapaban con el extremo 5' de la secuencia ? humana del Vector Dirigido 3, y servían como segmento de homología 3; para esta construcción dirigida. La recombinación homologa con este Vector Dirigido, creó un locus de cadena pesada murina modificado que contenía 40 segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, ligados de manera operable con los genes constantes de cadena pesada murina, y después de la recombínación, se formó una cadena pesada K quimérica (FIG. 3).

Utilizando un enfoque similar al anteriormente descrito, se construyeron otras combinaciones de dominios variables de cadena ligera en el contexto de regiones constantes de cadena pesada murina. Se pueden derivar dominios variables de cadena ligera adicionales a partir de segmentos génicos ?? y ?? humanos (FIGS. 4A y 4B).

El locus de la cadena ligera ? humana se extiende por más de 1,000 kb y contiene más de 80 genes que codifican para segmentos variables (V) o de unión (J). Entre los 70 segmentos génicos \/? del locus de cadena ligera ? humana, cualquier fracción entre 30 y 38 parecen ser segmentos génicos funcionales de conformidad con reportes publicados. Las 70 secuencias \? están rearregladas en tres grupos, todos los cuales contienen diferentes números de distintos grupos de familias génicos V (grupos A, B y C). En el locus de la cadena ligera ? humana, más de la mitad de los dominios \/? observados son codificados por los segmentos génicos 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, y 3-21. Existen siete segmentos génicos ??, sólo cuatro de los cuales se consideran como segmentos génicos ?? generalmente funcionales - J 1, J 2, J 3, y J 7. En algunos alelos, se ha reportado un quinto par de segmentos génicos ??-?? como un pseudogen (??6). La incorporación de múltiples segmentos génicos ?? humanos en un locus de cadena pesada híbrida, tal como se describe en la presente, se construye mediante síntesis de novo. De esta manera, un fragmento genómico que contiene múltiples segmentos génicos ?? humanos en configuración de línea germinal, se manipula por ingeniería genética con múltiples segmentos génicos ?? humanos y se permite la recombinación V-J normal en el contexto de una región constante de cadena pesada.

El acoplamiento de dominios variables de cadena ligera con regiones constantes de cadena pesada, representa una fuente potencialmente rica de diversidad para generar proteínas de unión VL únicas, con regiones VL humanas, en animales no humanos. La explotación de esta diversidad del locus de cadena ligera ? humana (o del locus ? humano, como se describió anteriormente) en ratones, da como resultado la producción de cadenas pesadas híbridas únicas, y da origen a otra dimensión de proteínas de unión al repertorio inmunitario de animales genéticamente modificados y su posterior uso como una plataforma de próxima generación para la producción de productos terapéuticos.

Adicionalmente, los segmentos génicos VH y JH (O JK) humanos, pueden ser incorporados con cualquiera de los segmentos génicos VK o \/? humanos, para construir loci híbridos novedosos que darán origen, después de la recombinación, a nuevos dominios variables obtenidos por ingeniería genética (FIGS. 5A y 5B). En este último caso, las combinaciones manipuladas por ingeniería de los segmentos génicos que normalmente no están contenidos en un solo locus, requeriría la atención específica a las secuencias de señal de recombinación (SSR) que están asociadas con los respectivos segmentos génicos, de tal modo que se pueda lograr una recombinación normal cuando éstos se recombinen en un solo locus. Por ejemplo, la recombinación v(D)J se sabe que está guiada por secuencias de ADN no codificadoras conservadas, conocidas como secuencias heptaméricas y nonaméricas que se encuentran yacentes a cada segmento génico en el lugar preciso en el cual se lleva a cabo la recombinación. Entre estas secuencias de ADN no codificadoras, hay regiones separadoras no conservadas de 12 ó 23 pares de bases (pb) de longitud. Generalmente, la recombinación sólo ocurre en segmentos génicos ubicados en el mismo cromosoma y los segmentos génicos flanqueados, por un separador de 12 pb pueden ser unidos a un segmento génico flanqueado por un separador de323 pb; es decir, la regla 12/23, aunque se ha observado la unión de dos segmentos génicos DH (cada uno flanqueado por separadores de 12 pb) en una pequeña proporción de anticuerpos. Para permitir la recombinación entre segmentos génicos que normalmente no tienen separadores compatibles (por ejemplo, VK y un DH o DH y JK), se sintetizaron separadores únicos y compatibles, en lugares adyacentes a los segmentos génicos deseados, para la construcción de cadenas pesadas híbridas únicas, que permiten una exitosa recombinación para formar cadenas pesadas únicas que contienen regiones variables de cadena ligera.

Así pues, el uso de la estrategia anteriormente señalada para la incorporación de segmentos génicos de cadena ligera ? humanos en un locus de cadena pesada endógeno, permite el uso de otras combinaciones de segmentos génicos de cadena ligera ? humana, así como segmentos génicos de cadena pesada humana específicos (por ejemplo, DH y JH) y combinaciones de los mismos.

Ejemplo (( Identificación de Células ME Dirigidas Portadoras de Segmentos Génicos de Cadena Ligera Humana, en un Locus de Cadena Pesada Endógeno El ADN BAC dirigido que se preparó en los Ejemplos anteriores, se utilizó para electroporar células ME murinas, para crear células ME modificadas para la generación de ratones quiméricos que expresen proteínas de unión VL (es decir, segmentos de genes de cadena ligera ? humanos ligados de manera operable con regiones constantes de cadena pesada murina). Las células ME que contenían una inserción de segmentos génicos de cadena ligera ? humana no rearreglados, fueron identificadas mediante el ensayo de PCR cuantitativo, TAQMAN® (Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). Se diseñaron conjuntos de cebadores específicos y sondas para la inserción de secuencias ? humanas y ios cartuchos de selección asociados, la pérdida de secuencias de cadena pesada murina y la retención de secuencias murinas que flanquean al locus de cadena pesada endógeno.

Las células ME portadoras de los segmentos génicos de cadena ligera ? humanos, pueden ser transfectadas con una construcción que exprese una recombinasa, con el fin de remover cualquier cartucho de selección no deseado que se haya introducido por la inserción de la construcción dirigida que contiene los segmentos génicos ? humanos. Opcionalmente, el cartucho de selección puede ser removido al aparear los animales con ratones que expresen la recombinasa (por ejemplo, Patente Norteamericana No. US 6,774,279). Opcionalmente, el cartucho de selección es retenido en el ratón.

Ejemplo III Generación y Análisis de Ratones que Expresan Proteínas de Unión VL Las células ME dirigidas anteriormente descritas, se utilizaron como células ME donadoras y se introdujeron en embriones de ratón en una etapa de 8 células, por el método VELOCIMOUSE® (véanse por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 7,294,754 y Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L, Dore, AT., Stevens, S., Adams, N.C., Domínguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007). Los ratones de generación F0 se derivaron completamente de células madre embrionarias con el gen objetivo, lo cual permitió análisis fenotípicos inmediatos (Nat Biotechnol 25, 91 -99). Se identificaron independientemente VELOCIMICE® (ratones F0 totalmente derivados de la célula ME donadora) portadores de segmentos génicos ? humanos en el locus de cadena pesada murina, mediante una genotipificación utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra), que detectaba la presencia de segmentos génicos ? humanos únicos en el locus de cadena pesada endógena (supra). Las crías fueron genotipificadas, y se seleccionó una cría heterocigota para el locus del gen de cadena pesada híbrido, para caracterizar la expresión de proteínas de unión VL.

Citometría de Flujo. La introducción de segmentos génicos de cadena ligera ? humana en locus de cadena pesada murina, se llevó a cabo en una línea de células ME F1 (F1H4; Valenzuela et al., 2007, supra) derivada de embriones heterocigotos 129S6/SvEvTac y C57BL/6NTac que contenían además un reemplazo in situ de los segmentos génicos de cadena ligera ? murina por segmentos génicos de cadena ligera ? humana (Patente Norteamericana No. US, 67,596,541). Los segmentos génicos variables de línea germinal de cadena ligera ? humana fueron dirigidos hacia el alelo 129S6, el cual es portador del haplotipo lgMa, mientras que el alelo C576BL/6N murino no modificado es portador del haplotipo lgMb. Estas formas alélicas de IgM pueden ser distinguidas por citometría de flujo, utilizando anticuerpos específicos contra los polimorfismos encontrados en los alelos lgMa o IgM b. Los ratones heterocigotos portadores de segmentos génicos de cadena ligera ? humana en el locus de cadena pesada endógeno, tal como se describió en el Ejemplo I, fueron evaluados con respecto a la expresión de proteínas de unión VL humanas, mediante citometría de flujo.

Brevemente, se tomó sangre de grupos de ratones (n=6 por grupo) y se mezcló con portaobjetos de vidrio. Se utilizaron ratones C57BL/6 y Balb/c como grupos de control. Después de la lisís de los eritrocitos (RBC) con amortiguador de lisis ACK (Lonza Walkersville), las células fueron resuspendidas en amortiguador de tinción BD Pharmingen FACS y se bloquearon con un anticuerpo CD16/32 antimurino (BD Pharmingen). Se tiñeron linfocitos con un anticuerpo lgMb-FITC antimurino (BD Pharmingen), lgMa-PE antimurino (BD Pharmingen), CD19 antimurino (Clona 1D3; BD Biosciences), y CD3 antimurino (17A2; BIOLEGEND®), seguido por una fijación con BD CYTOFIX™, todo de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las pellas de células finales, fueron resuspendidas en amortiguador de tinción, y se analizaron utilizando un software BD FACSCALIBUR™ y BD CELLQUEST PRO™. La Tabla 2 establece los valores porcentuales promedio de expresión de células B (CD19+), células T (CD3+), con cadena pesada híbrida (CD19+lgMa+), y con cadena pesada de tipo silvestre (CD19+lgMb+), observadas en los grupos de animales portadores de cada modificación genética.

En un experimento similar, el contenido de células B en el bazo, sangre y médula ósea de ratones homocigotos para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, ligados de manera operable con la región constante de cadena pesada murina (que se describen en el Ejemplo I, FIG. 2), se analizó con respecto al progreso hasta el desarrollo de las células B, por citometría de flujo de varios marcadores de superficie celular.

Brevemente, dos grupos (n= 3 cada uno, hembras de 8 semanas de edad) de ratones de tipo silvestre y homocigotos para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, ligados de manera operable con la región constante de cadena pesada murina, fueron sacrificados y se les tomó sangre, se les extirpó el bazo y la médula ósea. La sangre se colectó en tubos microtainer con AEDT (BD Biosciences). La médula ósea se colectó del fémur, mediante un lavado con medio RPMI completo (Medio RPMI suplementado con suero fetal de ternera, piruvato de sodio, HEPES, 2-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y gentamicina). Los glóbulos rojos de preparaciones del bazo y de médula ósea, se Usaron con amortiguador de lisis ACK (lonza Walkersville), seguido por un lavado con medio RPMI completo.

Se incubaron células (1 x106) con anticuerpos CD16/CD32 antimurino (2.4G2, BD) en hielo durante 10 minutos, seguido por un marcado con el siguiente cóctel de anticuerpos durante treinta minutos en hielo: FITC-CD43 antimurino (1B11 , BIOLEGEND®), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-lgM (11/41 , EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-lgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1 , EBIOSCIENCE®). Médula ósea: células B inmaduras (B220hl,lgM + ), células B maduras (B220hilgM+), células pro B (CD19+ckit+CD43+), células pre B (CD19+ckit"D43 ), células pre B (CD19+CD43in,lgM+ "), células B inmaduras (CD 9+CD43"lgM+/'). . Sangre y bazo: células B (CD19+), células B maduras (CD19+lgMin,lgDhi), células B de transición/inmaduras (CD19+lgMhilgDint).

Después de la tinción, las células se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2%. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo LSRII y se analizó con el software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Las FIGS. 6A, 6B y 6C muestran los resultados para el compartimento esplénico. Las FIGS. 7A - 7G muestran los resultados para el compartimiento de médula ósea. Los resultados obtenidos para el compartimiento de sangre de cada grupo de ratones, demostraron resultados similares en comparación a los provenientes del compartimiento esplénico de cada grupo (datos no mostrados).

En un experimento similar, se analizó el contenido de células B de los compartimentos del bazo, sangre y médula ósea de ratones homocigotos para treinta segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, ligados de manera operable con la región constante de cadena pesada murina (descritos den el Ejemplo I, FIG. 2), con respecto al progreso en el desarrollo de células B, por citometría de flujo de varios marcadores de superficie celular.

Brevemente, dos grupos de ratones (N = 3 cada uno, hembras de 6 semanas de edad) que contenían un locus de cadena pesada de tipo silvestre y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos, y ratones homocigotos para treinta segmentos génicos hVK y cinco segmentos génicos JK, y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos (30hVK-5hJK HO), fueron sacrificados y se obtuvieron los bazos y médula ósea. Se prepararon la médula ósea y los esplenocitos para una tinción con varios marcadores de superficie celular (como se describió anteriormente).

Se incubaron células (1 x 106) con un anticuerpo CD16/CD32 antimurino (2.4G2, BD Biosciences) en hielo durante 10 minutos, seguido por un marcado con paneles de médula ósea o esplenocitos durante treinta minutos en hielo. Panel de médula ósea: FITC-CD43 antimurino (1B11 , BIOLEGEND®), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-lgM (11/41, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1 EBIOSCIENCE®). Panel de médula ósea y bazo: FITC-lgi antimurino (187.1 BD Biosciences), PE-lg (RML-42, BIOLEGEND®), PeCy7-lgM (11/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-lgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), Pacific Blue-CD3 (17A2, BIOLEGEND®), APC-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-H7-CD19 (ID3, BD). Médula ósea: células B inmaduras (B220in,lgM + ), células B maduras (B220hilgM + ), células pro B (CD19+ckit+CD43+), células pre B (CD19+ckit"CD43"), células B inmaduras ¡gi + inmaduras células B \QK+ maduras (B220hilgM+lg maduras (B220hilgM + lgK*lg +).

Bazo: células B (CD19+), células B maduras (CD19+lgDhilgMint), células B de transición/inmaduras (CD19+lgD'n,lgMhi). Médula ósea y bazo: células lgK+ (CD19+lgi +lg "), células B \gX+ (CD1 ? ? '???*).

Después de la tinción, las células se lavaron y se fijaron con formaldehído al 2%. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo LSRII y se analizó con el software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Los resultados demostraron patrones de tinción similares y poblaciones de células también similares para los tres compartimentos, en comparación con los ratones homocigotos para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos (anteriormente descritos). Sin embargo, estos ratones demostraron una pérdida de expresión de cadena ligera ? endógena, tanto en el compartimiento esplénico como en el de médula ósea (FIGS. 8A y 8B, respectivamente), a pesar de que el locus de cadena ligera ? endógeno está intacto en estos ratones. Esto podría reflejar una incapacidad de los dominios de cadena ligera ? humanos rearreglados, en el contexto de regiones constantes de cadena pesada, para aparearse o asociarse con dominios de cadena ligera ? murinos, lo cual conduce a la deleción de células ^?+.

Expresión de isotipo. Se determinó la inmunoglobulina M (IgM) y la inmunoglobulina G1 ( I gG 1 ) total y de superficie (es decir, unida a la membrana), en ratones homocigotos para loci de genes variables de cadena pesada humanos y de cadena ligera ? (VELCO IMMUNE® Humanized Mice, véase la Patente Norteamericana No. 7,105,348) y ratones homocigotos para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, manipulados por ingeniería genética en el locus de cadena pesada endógeno ((6hVK-5hJK HO), mediante un ensayo de PCR cuantitativo utilizando sondas TAQMAN® (como se describió anteriormente en el Ejemplo II).

Brevemente, se purificaron células B CD19+ del bazo de grupos de ratones (n = 3 a 4 ratones por grupo), utilizando microcuentas CD19 murinas (Miltenyi Biotec), de conformidad con las instrucciones del fabricante. El ARN total se purificó utilizando el paquete RNEASY™ Mini kit (Qiagen). El ARN genómico se removió con el uso de DNasa libre de RNasa mediante un tratamiento en columna (Qiagen). Se sometieron a transcripción reversa aproximadamente 200 ng de ARNm para obtener ADNc, utilizando el paquete de síntesis de ADN First Stand cDNA Synthesis (Invitrogen) y después se amplificó con el cebador TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), utilizando el Sistema de Detección de Secuencia ABI 7900 (Applied Biosystems). Se emplearon combinaciones únicas de cebador/sonda para determinar específicamente la expresión de los isotipos IgM e I gG 1 totales, de superficie (es decir, transmembranal) y secretados (Tabla 3). La expresión relativa fue normalizada a la región constante ? murina (mCK).

Tabla 2 Tabla 3 Isotipo Secuencia (de 5' a 3') SEQ ID NOs: Los resultados del ensayo de PCR TAQ AN® cuantitativo demostraron una disminución de la IgM total y de la I gG 1 total. Sin embargo, la relación de las formas secretada versus superficial de la IgM y de la I gG 1 , pareció normal en comparación con los ratones humanizados VELCOIMMUNE® (datos no mostrados).

Análisis del uso del segmento génico ? humano y la unión VK-JK. Ratones prístinos homocigotos para treinta segmentos génicos hN ? y cinco segmentos génicos JK y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos (30hVK-5hJK HO) fueron analizados con respecto a rearreglos únicos VK-JK humanos en la cadena pesada murina (IgG), mediante una reacción en cadena catalizada con polimerasa, con transcripción reversa (RT-PCR), utilizando ARN aislado de esplenocitos.

Brevemente, se cosecharon los bazos y se perfundieron con 10 ml_ de RPMI-1640 (Sigma) con HI-FBS al 5%, en bolsas desechables estériles. Cada bolsa contenía un solo bazo, que posteriormente se colocó en un aparato STOMACHER™ (Seward) y se homogeneizó a velocidad media durante 30 segundos. Los bazos homogeneizados se filtraron utilizando un filtro celular de 0.7 µ?? y después se compactaron por centrifugación (1000 rpm durante 10 minutos) y los glóbulos rojos se Usaron con solución BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) durante tres minutos. Los esplenocitos se diluyeron con RPMI-1640 y se centrifugaron otra vez, lo cual fue seguido por una resuspensión en 1 ml_ de PBS (Irvine Scientific). El ARN se aisló de los esplenocitos utilizando las técnicas estándar conocidas en este campo.

La RT-PCR se realizó en ARN de esplenocitos, utilizando cebadores específicos para segmentos génicos hN ? humanos y la IgG murina. El cebador de IgG murina estaba diseñado de tal modo que fuera capaz de amplificar ARN derivado de todos los isotipos de IgG murinos. Los productos de las PCR se purificaron en gel y se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen) y se secuenciaron con cebadores M13 de avance (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ ID NO: 16) y M13 de retroceso (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO: 17), localizados en el vector en lugares que flanqueaban el sitio de clonación. El uso de los segmentos génicos VK y JK humanos entre doce clonas seleccionadas, se muestra en la Tabla 4. La FIG. 9 establece la secuencia de nucleótidos de la unión hVK-hÜK-mlgG de doce clonas seleccionadas por RT-PCR .

Como se muestra en este Ejemplo, los ratones homocigotos para seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, u homocigotos para treinta segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos, ligados de manera operable con la región constante de cadena pesada murina, demostraron la expresión de regiones variables de cadena ligera humanas a partir de un locus de cadena pesada modificado que contenía segmentos génicos variables de cadena ligera en su configuración de línea germinal. El progreso a través de las varias etapas del desarrollo de las células B, se observó en estos ratones, indicando múltiples eventos de recombinación productiva que involucraron a los segmentos génicos variables de cadena ligera de un locus de cadena pesada endógeno y la expresión de tales cadenas pesadas híbridas (es decir, la región variable de cadena ligera humana ligada con la región constante de cadena pesada), como parte del repertorio de anticuerpos.

Tabla 4 Ejemplo IV Propagación de Ratones que Expresan Proteínas de Unión VL Para crear una nueva generación de proteínas de unión VLl los ratones portadores de los segmentos génicos ? humanos no rearreglados, se pueden aparear con otros ratones que contienen una deleción de los otros alelos de cadena pesada endógenos. De esta manera, la progenie obtenida expresaría solamente cadenas pesadas híbridas como las descritas en el Ejemplo I. La crianza se llevó a cabo por las técnicas estándar reconocidas en este campo, y alternativamente, por empresas comerciales, por ejemplo The Jackson Laboratory. Las cepas de ratones portadores de un locus de cadena pesada híbrida, se seleccionaron con respecto a la presencia de cadenas pesadas híbridas · únicas y la ausencia de cadenas pesadas murinas tradicionales.

Alternativamente, los ratones portadores de segmentos génicos K humanos no rearreglados en el locus de la cadena pesada murina, pueden ser optimizados al aparearlos con otros ratones que contienen una o más deleciones de los loci de cadena ligera murina (K y ?). De esta manera, la progenie obtenida expresaría únicamente anticuerpos solo con cadena pesada ? humana únicos, como los descritos en el Ejemplo I. De manera similar, la crianza se realizó por las técnicas estándar reconocidas en este campo y, alternativamente, por empresas comerciales, por ejemplo, The Jackson Laboratory. Las cepas murinas portadoras de un locus de cadena pesada híbrida y una o más deleciones de los loci de cadena ligera murina, se seleccionaron con respecto a la presencia de cadenas pesadas híbridas únicas que contenían dominios de cadena ligera ? humanos y dominios constantes de cadena pesada murina, y la ausencia de cadenas ligeras murinas endógenas.

Los ratones portadores de un locus de cadena pesada híbrido no rearreglado, también son apareados con ratones que contienen un reemplazo del locus génico variable de cadena ligera ? murino endógeno por el locus génico variable de cadena ligera ? humano 8véase la Patente Norteamericana No. US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, The VELOCIMMUNE® Humanized Mouse Technology). El paquete VELOCIMMUNE® Humanized Mouse incluye, en parte, tener un genoma que comprende regiones variables de cadena ligera ? humanas ligadas de manera operable con loci de región constante variable de cadena ligera ? murina, de tal modo que el ratón produzca anticuerpos que comprendan un dominio variable de cadena ligera ? humano y un dominio constante de cadena pesada murino, en respuesta a una estimulación antigénica. El ADN que codifica para las regiones variables de las cadenas ligeras de los anticuerpos, puede ser aislado y ligado de manera operable con ADN que codifica para regiones constantes de cadena ligera humana. El ADN, entonces, puede ser expresado en una célula capaz de expresar la cadena ligera completamente humana del anticuerpo. Después de un programa de crianza y apareamiento adecuado, se obtuvieron ratones portadores de un reemplazo de la cadena ligera ? murina endógena por el locus de cadena ligera ? humana, y un locus de cadena pesada híbrida no rearreglado. Las proteínas de unión VL únicas que contienen dominios VK humanos somáticamente mutados, se pueden aislar después de una inmunización con un antígeno de interés.

Ejemplo V Generación de Proteínas de Unión L Después de un programa de crianza y apareamiento de los ratones que contienen el locus de cadena pesada híbrida no rearreglado hasta varias cepas deseadas que contienen modificaciones y deleciones de otros loci de Ig endógenos (tal como se describe en el Ejemplo IV), los ratones seleccionados pueden ser inmunizados con un antígeno de interés.

Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE® humanizado que contiene al menos un locus de cadena pesada híbrida, es desafiado con un antígeno, y las células (tales como las células B) son recuperadas del animal (por ejemplo, del bazo o de los ganglios linfáticos). Las células pueden ser fusionadas con una línea celular de mieloma, para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y tales líneas celulares de hibridoma son inspeccionadas y seleccionadas para identificar líneas de células de hibridoma que produzcan anticuerpos que contengan cadenas pesadas híbridas específicas contra el antígeno utilizado para la inmunización. El ADN que codifica para las regiones VK humanas de las cadenas pesadas híbridas puede ser aislado y ligado con las regiones constantes deseables, por ejemplo, de cadena pesada y/o de cadena ligera. A causa de la presencia de segmentos génicos VK humanos fusionados con regiones constantes de cadena pesada murinas, se produce un repertorio único de moléculas similares a anticuerpos y la diversidad del repertorio de inmunoglobulinas se incrementa drásticamente como resultado del formato de anticuerpo único creado. Esto contiene un nivel agregado de diversidad al repertorio específico contra el antígeno después de la inmunización. Las secuencias de anticuerpo clonadas resultantes, posteriormente pueden ser producidas en una célula, tal como una célula CHO. Alternativamente, el ADN que codifica para las proteínas de unión VL específicas contra el antigeno o los dominios variables, se puede aislar directamente de los linfocitos específicos contra el antígeno (por ejemplo, las células B).

Inicialmente, se aislan proteínas de unión VL de alta afinidad que tienen una región VK humana y una región constante murina. Como se describió anteriormente, las proteínas de unión VL están caracterizadas y se seleccionan por características deseables, las cuales incluyen la afinidad, selectividad, el epítopo, etcétera. Las regiones constantes murinas son reemplazadas por una región constante humana deseada, para generar proteínas de unión VL completamente humanas únicas, que contienen dominios VK humanos somáticamente mutados provenientes de un locus de cadena pesada híbrida no rearreglado. Las regiones constantes humanas adecuadas incluyen, por ejemplo, las regiones constantes de lgG1 ó lgG4 modificadas, o alternativamente CK O ??.

Cohortes por separado de ratones que contienen un reemplazo del locus de cadena pesada murina endógeno por seis segmentos génicos VK humanos y cinco segmentos génicos JK humanos (como se describe en el Ejemplo I) y un reemplazo de los segmentos génicos VK y JK endógenos por segmentos génicos VK y JK humanos, fueron inmunizados con una proteína receptora de superficie celular humana (antígeno X). El antígeno X se administró directamente en la almohadilla plantar de las patas traseras de los ratones con seis inyecciones consecutivas, cada 3-4 días. De dos a tres microgramos del antígeno X se mezclan con 10 µg de oligonucleotido CpG (Cat. # tlrl-modn - ODN1826 oligonucleotide; InVivogen, San Diego, CA) y 25 µg de Adju-Phos (adyuvante de gel de fosfato de aluminio Cat. # H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca) antes de la inyección. Se administra un total de 6 inyecciones antes de la recolección final del antígeno, las cuales se administran 3-5 días antes de sacrificar a los animales. Las tomas de sangre después de la cuarta y sexta inyección se colectan, y se monitorea la respuesta inmunitaria de anticuerpos mediante un inmunoensayo estándar específico contra el antígeno.

Cuando se logra una respuesta inmunitaria deseada, los esplenocitos se cosechan y se fusionan con células de mieloma murino, para conservar su viabilidad y para formar líneas celulares de hibrídoma. Las líneas celulares de hibridoma son inspeccionadas y seleccionadas para identificar líneas de células que produzcan proteínas de unión VL específicas contra el antígeno X. Con el uso de esta técnica, se obtuvieron varias proteínas de unión VL específicas contra el antígeno X (es decir, proteínas de unión que poseían dominios VK humanos en el contexto de dominios constantes de cadena pesada y ligera murinos).

Alternativamente, se aislan proteínas de unión VL contra el antígeno X directamente de las células B positivas para el antígeno, sin fusionarlas con células de mieloma, tal como se describe en la Patente Norteamericana US 2007/0280945A1 , la cual se incorpora en la presente específicamente y en su totalidad como referencia. Con el uso de este método, se obtuvieron varias proteínas de unión VL contra el antígeno X completamente humanas (es decir, anticuerpos que poseían dominios VK humanos y dominios constantes humanos).

Uso del Segmento Génico ? Humano. Para analizar la estructura de las proteínas de unión VL contra el antígeno X producidas, los ácidos nucleicos que codifican para los dominios VK humanos (tanto de las cadenas pesadas como de las ligeras de la proteína de unión VL), se clonaron y se secuenciaron con el uso de métodos adaptados a partir de los descritos en la Patente Norteamericana US 2007/0280945A1 {supra). A partir de las secuencias de ácido nucleico y de las secuencias de aminoácidos predichas de los anticuerpos, se. identificó el uso de los genes para la región variable de cadena pesada híbrida de las proteínas de unión VU seleccionadas obtenidas de ratones inmunizados (anteriormente descritos). La Tabla 5 presenta el uso de los genes de los segmentos VK y JK humanos provenientes de proteínas de unión VL contra el antígeno X seleccionadas, lo cual demuestra que los ratones de conformidad con la presente invención, generan proteínas de unión VL específicas contra el antígeno, a partir de una variedad de segmentos génícos VK y JK humanos, debido a una variedad de rearreglos en los loci de cadena pesada y los loci de cadena ligera ? endógenos, tanto aquellos que contenían segmentos génicos VK como aquellos contenían segmentos génicos JK humanos no rearreglados. Los segmentos génicos VK humanos se rearreglaron con una variedad de segmentos JK humanos, para producir proteínas de unión VL específicas con el antígeno, únicas.

Tabla 5 Cadena esada híbrida Cadena ligera Ensayo inmunosorbente de enzima ligada (ELISA).

Proteínas de unión VL humanas dirigidas contra el antígeno X, se probaron con respecto a su capacidad de bloquear la unión del antígeno X a su ligando natural (ligando Y), en un ensayo de ELISA.

Brevemente, el ligando Y fue recubierto en placas de 96 pozos a una concentración de 2 Mg/mL, diluido en PBS y se incubó durante una noche, seguido por cuatro lavados con PBS con Tween-20 al 0.05%. Después, la placa fue bloqueada con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) conteniendo BSA al 0.5% (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) durante una hora a temperatura ambiente. En una placa por separado, los sobrenadantes que contenían proteínas de unión VL contra el antígeno X, se diluyeron 1:10 en solución reguladora. Se utilizó un sobrenadante falso con los mismos componentes de las proteínas de unión Vu, como control negativo. El dominio extracelular (ECD) del antígeno X se conjugó con la porción Fe de la lgG2a murina (antígeno X-mFc). El conjugado antígeno X- mFc se agregó a una concentración final de 0.150 nM y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. La mezcla proteína de unión' VJantígeno X-mFc, posteriormente, fue agregada a la placa que contenía el ligando Y, y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. La detección del antígeno X-mFc unido al ligando Y, se determinó con peroxidasa de rábano (HRP) conjugada con un anticuerpo anti-Penta-His (Qiagen, Valencia, CA) y se reveló mediante una respuesta colorimétrica estándar, utilizando el sustrato tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San José, CA) neutralizado con ácido sulfúrico. La absorbancia se leyó a una DO450 durante 0.1 segundos. La absorbancia de fondo de una muestra sin el antígeno X, fue restada a todas las muestras. El porcentaje de bloqueo se calculó para >250 (tres placas de 96 pozos) proteínas de unión VL específicas contra el antígeno X, dividiendo el MFI al cual se le sustrajo el fondo, de cada muestra, entre el valor del control negativo ajustado, multiplicando por 100 y sustrayendo el valor resultante de 100.

Los resultados demostraron que varias proteínas de unión VL aisladas de ratones inmunizados con el antígeno X, se unieron específicamente al dominio extracelular del antígeno X fusionado con la porción Fe de la lgG2a murina (datos no mostrados).

Determinación de la Afinidad. Se determinaron las constantes de equilibrio de disociación (KD) para sobrenadantes de proteína de unión VL específicas contra el antígeno X, mediante la prueba RPS (Resonancia de Plasmón de Superficie), con el uso de un instrumento BIACORE™ T100 (GE Healthcare). Todos los datos se obtuvieron utilizando HBS-EP (HEPES 10 m , NaCI 150 mM, AEDT 0.3 mM, tensoactivo P20 al 0.05%, pH 7.4) tanto en el amortiguador de la prueba, como en el amortiguador de las muestras, a 25°C.

Brevemente, se capturaron proteínas de unión VL a partir de muestras de sobrenadante crudos en una superficie de chip sensor CM5 previamente derivada con anticuerpos contra Fe humana de alta densidad, utilizando la química de acoplamiento de aminas estándar. Durante la etapa de captura, los sobrendantes se inyectaron a lo largo de la superficie anti-Fc humano a una velocidad de flujo de 3 pL/min., por un total de 3 minutos. La etapa de captura fue seguida por una inyección ya sea del amortiguador de la prueba, o de la sustancia por analizar, a una concentración de 100 nM durante 2 minutos, a una velocidad de flujo de 35 mL/minuto. La disociación del antígeno de la proteína de unión VL capturada se monitoreó durante 6 minutos. La proteína de unión VL capturada fue removida mediante una breve inyección de glicina 10 mM, pH 1.5. Todos los sensogramas fueron referenciados por duplicado, sustrayendo los sensogramas de las inyecciones de amortiguador, de los sensogramas de las sustancias por analizar, removiendo de esta manera los artefactos causados por la disociación de la proteína de unión VL de la superficie de captura. Los datos de unión de cada proteína de unión VL, fueron ajustados a un modelo de unión 1:1 con un transporte de masa, utilizando el software de evaluación BIAcore T100 v2.1.

Las afinidades de unión de treinta y cuatro proteínas de unión VL seleccionadas, variaron dentro de un rango en que todas exhibían una KD nanomolar (de 1.5 a 130 nM). Además, aproximadamente el 70% de las proteínas de unión VL seleccionadas (23 de 34), demostró una afinidad nanomolar de un solo dígito. Las mediciones de T½ para estas proteínas de unión VL seleccionadas, demostraron un rango de aproximadamente 0.2 a 66 minutos. De las treinta y cuatro proteínas de unión VL, seis mostraron una afinidad mayor de 3 nM por el antígeno X (1.53, 2.23, 2.58, 2.59, 2.79 y 2.84). Los datos de afinidad son consistentes con las proteínas de unión VL resultantes de la asociación combinatoria de dominios variables de cadena ligera humana ligados con regiones constantes de cadena pesada y ligera (que se describen en la Tabla 4), siendo de alta afinidad, seleccionadas por clonación, y somáticamente mutadas. Las proteínas de unión VL generadas por los ratones aquí descritos, comprenden una colección de diversas proteínas de unión únicas y de alta afinidad, que exhiben especificidad por uno o más epítopos del antígeno X.

En otro experimento, las proteínas de unión VL humanas seleccionadas dirigidas contra el antigeno X, se probaron con respecto a su capacidad de bloquear la unión del antígeno X con su ligando natural (ligando Y), en un ensayo basado en cuentas LUMINEX® (datos no mostrados). Los resultados demostraron que, además de unirse específicamente al dominio extracelular del antígeno X con una afinidad en el rango nanomolar (anteriormente descrito), las proteínas de unión VL seleccionadas también fueron capaces de unirse al antígeno X de mono cinomolgus (Macaca fascicularis).

Claims

Reivindicaciones

1. Un ratón caracterizado porque comprende, en su línea germinal, un segmento V de cadena ligera no rearreglado y un segmento J no rearreglado, ligados de manera operable con una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena pesada.

2. El ratón de la reivindicación 1, caracterizado porque el segmento V de cadena ligera no rearreglado se selecciona del grupo que consiste de un segmento ? humano, un segmento ? humano, y una combinación de los mismos.

3. El ratón de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada, se selecciona del grupo que consiste de una secuencia CH1, una secuencia de bisagra, una secuencia CH2, una secuencia CH3, y una combinación de las mismas.

4. El ratón de la reivindicación 1, caracterizado porque el segmento V de cadena ligera no rearreglado y el segmento J no rearreglado, reemplazan un segmento V de cadena pesada murina endógeno y un segmento J de cadena pesada murina endógeno, en el locus de cadena pesada murina endógeno.

5. El ratón de la reivindicación 4, caracterizado porque el segmento V de cadena ligera no rearreglado reemplaza la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos V de cadena pesada murina funcionales del locus de cadena pesada murina endógeno.

6. El ratón de la reivindicación 4, caracterizado porque el segmento J no rearreglado comprende un segmento J de cadena ligera, y el segmento J de cadena ligera reemplaza la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos J de cadena pesada murina funcionales del locus de cadena pesada murina endógeno.

7. El ratón de la reivindicación 6, caracterizado porque el segmento V de cadena ligera no rearreglado y el segmento J de cadena ligera no rearreglado, están ligados de manera operable y el ratón carece de un segmento D funcional entre el segmento V de cadena ligera no rearreglado y el segmento J de cadena ligera no rearreglado.

8. El ratón de la reivindicación 7, caracterizado porque el segmento V de cadena ligera no rearreglado es un segmento ? humano y el segmento J de cadena ligera no rearreglado es un segmento ? humano.

9. El ratón de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una célula B que comprende, en su genoma, un gen de inmunoglobulina rearreglado que comprende una región variable ? humana ligada de manera operable con un gen de región constante murina.

10. El ratón de la reivindicación 1, caracterizado porque el gen de inmunoglobulina rearreglado está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina murina endógeno.

11. El ratón de la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende, en su línea germinal, un segmento V de cadena ligera humana y un segmento J de cadena ligera humana, ligados de manera operable con un gen constante de cadena ligera.

12. El ratón de la reivindicación 11, caracterizado porque el gen constante de cadena ligera es un gen constante de cadena ligera murino.

13. El ratón de la reivindicación 12, caracterizado porque el segmento V de cadena ligera humana es un segmento V ? humano.

14. El ratón de la reivindicación 13, caracterizado porque el gen constante de cadena ligera murina es un gen constante de cadena ligera ? murina.

15. Un ratón que expresa a partir de su línea germinal, una inmunoglobulina que comprende un primer polipéptido que comprende una primera secuencia de región variable de cadena ligera humana fusionada con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y un segundo polipéptido que comprende una segunda región variable de cadena ligera humana fusionada con una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

16. El ratón de la reivindicación 15, caracterizado porque la primera secuencia de región variable de cadena ligera humana comprende una secuencia de región variable ? humana, y la segunda región variable de cadena ligera humana se selecciona del grupo que consiste de una región variable ? humana y una región variable ? humana.

17. El ratón de la reivindicación 16, caracterizado porque la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona del que consiste de una región constante de cadena pesada humana y una región constante de cadena pesada murina.

18. El ratón de la reivindicación 16, caracterizado porque la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste de una región constante de cadena ligera humana y una región constante de cadena ligera murina.

19. El ratón de la reivindicación 16, caracterizado porque el primer polipéptido se expresa a partir de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina murina endógeno modificado, que carece de un segmento génico V de cadena pesada endógeno funcional.

20. El ratón de la reivindicación 19, caracterizado porque el segundo polipéptido se expresa a partir de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina murina endógeno modificado, que carece de un segmento génico V de cadena ligera endógeno funcional.

21. Un ratón caracterizado porque comprende un reemplazo en su línea germinal, en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina murina endógeno, de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos variables de cadena pesada murina endógenos, por al menos seis o más segmentos génicos V de cadena ligera no rearreglados, y uno o más segmentos génicos J no rearreglados, en donde los segmentos génicos V de cadena ligera no rearreglados y los segmentos génicos J están ligados de manera operable, en donde el ratón es incapaz de expresar una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de un segmento génico V de cadena pesada, y en donde el ratón comprende una población de células B esplénicas (B220+/lgM + ) que constituye aproximadamente el 75% del tamaño de una población de células B esplénicas (B220+/lgM + ) de un ratón de tipo silvestre.

22. El uso de un ratón de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para producir una proteína de unión que comprende un dominio variable de cadena ligera humana.

23. El uso de un ratón de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21 para producir un anticuerpo.

24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.

25. El uso de un ratón de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21 para producir un anticuerpo biespecífico.

26. Una célula o tejido derivado de un ratón de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21.

27. Una célula de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de una célula ME, una célula B y un hibridoma.