MX2013000333A - N-etil-n-fenil-1,2-dihidro-4-hidroxi-5-cloro-1-metil-2-oxoquinoli na-3-carboxamida deuterada, sales y usos de la misma. - Google Patents

Abstract

La invención actual proporciona N-etil-N-fenil-1,2-dihidro-4-hidro xi-5-cloro-1-metil-2-oxoquinolina-3-carboxamida deuterada, sus sales y usos.

Description

N-ETIL-N-FENIL-1 , 2-DIHIDRO-4-HIDROXI-5-CLORO-l-METIL-2- OXOQUINOLINA-3-CARBOXAMIDA DEUTERADA, SALES Y USOS DE LA MISMA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención describe N-étil-N-fenil-1 , 2-dihidro-4-hidroxi-5-cloro-1-metil-2-oxoquinolin-3-carboxamida deuterada, sus sales y usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El laquinimod es ün compuesto que se ha mostrado que es efectivo en un modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental aguda (aEAE) (Patente de EUA. No. 6,077, 851)-'. Su nombre químico es' N-etil-N-fenil-1 , 2-dihidro-4 -hidroxi-5-cloro-l-metil-2-oxoquinolin-3-carboxamida, y su número de Registro Químico es 248281-84-7. El proceso de síntesis de laquinimod y la preparación de su sal de. sodio se describen en la Patente EUA. No. 6,077,851. Un proceso adicional de la síntesis de laquinimod se describe en la Patente EUA. No. 6, 875,869.

Las composiciones farmacéuticas que. comprenden laquinimod sodio se describen en la Publicación de Solicitud Internacional PCT No. O 2005/074899.

El laquinimod sodio es un compuesto . sintético novedoso con una biodisponibilidad oral alta, que se ha sugerido como una formulación oral para el tratamiento de esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés):. (Polman, C. et al., (2005).. "Treatment with laquinimod reduces development of active MRI lesions in relapsing MS", Neurology. 6,4 : 987-991; Sandberg-Wollheim M, et al. (2005) "48-week open safety study with high-dose oral laquinimod in patients", Mult Scler. 11:S154) . Los estudios también han mostrado que el laquinimod puede reducir el desarrollo de lesiones MRI activas en MS con recaída. (Polman, C. et. al., (2005) "Treatment with laquinimod reduces development of active MRI lesions in relapsing MS", Neurology. 64:987-991).

La Publicación de Solicitud Internacional PCT. No. WO 2010/028015 propone variantes enriquecidas con deuterio . de laquinimod. Sin embargo, WO 2010/028015 han advertido que, "el intercambio metabólico puede llevar a proporciones diferentes de metabolitos conocidos asi como metabolitos completamente nuevos" y tal "perfil metabólico nuevo puede impartir más o menos toxicidad"' que "no' son predecibles , -a priori de nunguna clase de fármaco".. De esta manera, la WO 2010/028015 no proporciona al menos la dosificación para la administración de las variantes enriquecidas con deuterio de laquinimod, y no describen el perfil metabólico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención actual proporciona un método para. tratar un sujeto humano que padece de una enfermedad autoinmunitaria que comprende administrar al sujeto humano 0.2 mg-2.0 mg por día de un compuesto enriquecido con deuterio que tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y al menos uno de R1-R10. es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, efectiva para tratar el sujeto.

La invención actual también proporciona un método para inducir formación reducida de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada en un sujeto humano que comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto enriquecido con deuterio que tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y al menos uno de R1-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la formación reducida' . es relativa a la formación . de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida durante la administración de una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio.

La invención actual proporciona además una mezcla de al menos dos compuestos enriquecidos con deµterio, cada compuesto tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y cada uno de al . menos dos compuestos enriquecidos con deuterio contiene D en un R1-R10 diferente, o sales farmacéuticamente aceptables de los. mismos.

La invención actual aún- proporciona además una composición- farmacéutica que comprende la mezcla descrita en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención actual aún proporciona . además una composición farmacéutica que comprende una mezcla de: a) laquinimod enriquecido . con . deuterio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; b) al menos un portador farmacéuticamente aceptable;, y c) un compuesto, que. tiene la estructura: presente en una cantidad que es menos del 0.1% con base en el peso combinado del compuesto y laquinimod enriquecido con deuterio.

La invención actual aún proporciona además un. proceso para preparar la composición farmacéutica descrita en la presente, el proceso comprende: a) obtener un lote de laquinimod enriquecido con deuterio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;. b) determinar por un aparato' la cantidad total de .5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada. presente en el lote de laquinimod enriquecido con deuterio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y c) preparar la- composición farmacéutica usando el lote sólo si el lote sé determina que tiene menos del 0.1% en peso de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-l, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada.

La invención actual aún proporciona además un proceso para producir un lote validado de la composición farmacéutica descrita en la presente para distribución, el proceso comprende : a) obtener un lote de la composició farmacéutica; b) determinar por un aparato la cantidad total de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxaraida opcionalmente deuterada en una muestra del lote; y c) validar el lote para distribución sólo si la muestra del lote se determina que contiene menos del 0.1% en peso de 5-cloro-4 -hidroxi-l-met.i1-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada con relación, al peso combinado de laquinimod y 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihid.roquinolin-3-carboxamida ..

La invención actual aún proporciona además un. compuesto enriquecido con deuterio que tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y al menos uno de Rl-RlO es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en una cantidad de 0.2 mg - 2 mg por día en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE IAS FIGURAS La Figura 1 muestra el perfil de concentración-tiempo . en plasma promedio para DELAQ formado a partir de laquinimod vs . Compuesto 2 después de la administración oral a ratas en 0.2 mg/kg.

La Figura 2 muestra el perfil de concentración-tiempo en plasma promedio para laquinimod vs. Compuesto 2 después de la administración oral a ratas en 0.2 mg/kg. .' La Figura 3 muestra la comparación en Registro. Medio del Grupo en EAE que induce MOG en ratones tratados, con dos dosis de laquinimod- y con el .Compuesto 1, 2 y 3 en varias dosis,.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención actual proporciona un método para tratar un sujeto humano que padece de una enfermedad autoinmunitaria que comprende administrar al sujeto humano 0.2 mg - 2.0 mg por día de un compuesto enriquecido con deuterio que tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente. H o D, y al menos uno de R1-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, efectiva para tratar el sujeto.

En una modalidad del método, el compuesto enriquecido con deuterio es o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo..

En otra modalidad del método,, el compuesto enriquecido deuterio es o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. compuesto o" .una sal farmacéuticamente aceptable, del mismo.

Aún en otra, modalidad del método, la enfermedad autoinmunitaria es Esclerosis Múltiple, Lupus Eritematoso Sist'émico, nefritis por lupus, artritis por lupus, Enfermedad de Crohn o artritis Reumatoide.

Aún en otra modalidad del método, la enfermedad autoinmunitaria es Esclerosis Múltiple.

Aún en otra, modalidad del método, la administración del compuesto enriquecido . con deuterio es más efectiva para tratar la enfermedad autoinmunitaria que la administración de una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio.

Aún en otra modalidad del método, el nivel de 5-cloro-4- hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3- carboxamida . opcionalmente deuterada formada en el sujeto humano durante la administración del compuesto enriquecido con deuterio se reduce, comparado con el nivel- de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida formada cuando una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio se administra al sujeto humano.

Aún en otra modalidad del método, el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-l, 2-dihidroquinolin-3- . carboxamida opcionalmente deuterada se ¦ reduce por. al menos 50% . -¦ ¦ ' ¦ ¦ · Aún en otra modalidad del método, el nivel .de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida . opcionalmente deuterada se reduce por al menos 90%.

La invención actual también proporciona un método para inducir formación reducida' de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada en un sujeto humano que, comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto enriquecido Con deuterio que tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y al menos uno de R1-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la formación reducida es relativa a la formación de. 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-l, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida durante la administración de una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio.

En una modalidad del método, el nivel de .5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada se reduce por al menos 50%, comparado con: el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida formada cuando una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio se administra al sujeto humano.

En otra modalidad del método, el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxd-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada se reduce por al menos 90%.

La. invención actual proporciona además una mezcla de al menos dos compuestos enriquecidos con deuterio, cada compuesto tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente ? o D, y cada uno de al menos dos compuestos enriquecidos con deuterio contiene D en un R1-R10 diferente-, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En una modalidad de la mezcla, uno de al 'menos dos compuestos enriquecidos con deuterio tiene la estructura:. o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En otra modalidad de la mezcla, uno de al menos dos compuestos enriquecidos con deuterio tiene la estructura: o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Aún en otra modalidad de la mezcla, uno dé al menos dos compuestos enriquecidos con deuterio tiene la estructura: o sales farmacéuticamente aceptables de los. mismos..

La invención actual aún . proporciona además una composición farmacéutica que comprende la., mezcla descrita en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención actual aún proporciona además . una composición farmacéutica que comprende na mezcla de: a) laquinimod enriquecido con deuterio- o . una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; b) al menos un portador farmacéuticamente aceptable; y c) un compuesto que tiene la estructura: presente en una cantidad que es menos del 0.1% con base en el peso combinado del compuesto y laquinimod enriquecido con · deuterio .

En una modalidad de la composición farmacéutica, ' el compuesto está presente en una cantidad de menos de 3 ppm o menos de 2 ppm con base en el peso combinado del compuesto y laquinimod enriquecido con deuterio.

En otra modalidad de la composición farmacéutica, el laquinimod enriquecido con deuterio tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y al menos uno de R1-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Aún en otra modalidad de la composición farmacéutica, en el laquinimod enriquecido con deuterio, cada uno de R1-R5 es D y cada uno de R6-R10 es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. .

Aún en otra modalidad de la composición farmacéutica, en el laquinimod enriquecido con deuterio, cada uno de R1-R5 es H y cada uno de R6-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Aún en otra- modalidad de la composición farmacéutica, en el laquinimod enriquecido con deuterio,- cada uno de Rl-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Aún en otra modalidad de la composición farmacéutica, la composición farmacéutica está en la forma de un comprimido.

Aún en otra modalidad de la composición farmacéutica, cuando se ingiere, por un sujeto humano, la composición farmacéutica proporciona un nivel reducido de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida ópcionalmente deuterada formada en el sujeto humano, con relación al nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida formada cuando una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio se ingiere por el sujeto humano.

La invención actual aún proporciona además un proceso para preparar la composición farmacéutica descrita en la presente, el proceso comprénde: a) obtener un lote de laquinimod enriquecido con deuterio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; b) determinar por un aparato la cantidad total de 5-clor'o-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada presente en el lote de laquinimod enriquecido con deuterip o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y c) preparar, la composición farmacéutica usando el lote sólo si el lote se determina que tiene menos del 0.1% en peso de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-l, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada.

La invención actual aún proporciona además un proceso para producir un lote validado de la composición farmacéutica descrita en la presente para distribución, el proceso comprende : a) obtener un lote, de la composición farmacéutica; b) determinar por un aparato la cantidad total de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada en una muestra del lote; y c) validar el lote para distribución sólo si la muestra del lote se determina que contiene menos del 0.1% en peso de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada con relación al peso combinado de laquinimod y 5-clo.ro-4-hidrpxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada.

La invención actual aún proporciona además un compuesto enriquecido con deuterio que tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y. al menos uno de R1-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en una cantidad de 0.2 mg - 2 mg por día . en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria , en un sujeto humano.

Por cualquier intervalo descrito en la presente, significa que todas las cantidades' de unidad de centésimas, décimas y enteros dentro del intervalo se describen específicamente como parte de la invención. De esta manera, por ejemplo, 0.01 mg hasta 50 mg significa que 0.02, 0.03' 0.09; 0.1, 0.2 ... 0.9; y 1, 2 ... 49 mg cantidades unitarias se incluyen como modalidades de esta invención.

El deuterio (D o 2H) es un isótopo no radioactivo, estable, de hidrógeno y tiene un. peso atómico de 2.0144.. El átomo de hidrógeno en. un compuesto se presenta naturalmente como una mezcla de los isótopos 1H (hidrógeno, o protio) , . D (2H o deuterio) , y T (3H o tritio). La abundancia natural de deuterio es 0.0156%. De esta manera, un compuesto con un nivel de deuterio en cualquier sitio del átomo de hidrógeno en el compuesto que se ha enriquecido será mayor que su abundancia natural de 0.0156%, es novedoso sobre su contraparte no enriquecida.

Como se usa en la presente, un compuesto ."enriquecido con deuterio" significa que la abundancia de deuterio en cualquier sitio relevante del compuesto es más que la abundancia de deuterio que se presenta naturalmente en tal sitio en una cantidad del compuesto. Un sitio relevante en un compuesto como se usa antes es un sitio que puede designarse como "H" en una representación de estructura química del compuesto cuando no es enriquecido con deuterio. Que se presenta naturalmente como se usa antes se refiere a la abundancia de deuterio que puede presentarse ¦ en un sitio relevante en un compuesto si el compuesto se preparó sin ninguna etapa afirmativa para enriquecer la abundancia de deuterio. De esta manera, en un compuesto "enriquecido con deuterio", la abundancia de deuterio en cualquiera' de sus sitios relevantes puede estar en el intervalo desde más de 0.0156% hasta 100%. Los ejemplos de formas para obtener un compuesto enriquecido con deuterio son intercambiar hidrógeno con deuterio o sintetizar el compuesto con materiales de partida enriquecidos con deuterio.

Puede ser difícil obtener el 100% de deuteración en cualquier sitio relevante de un compuesto en una cantidad de miligramos o mayor. Por lo tanto, se entiende que algún porcentaje de hidrógeno puede todavía estar presente, aunque un átomo de deuterio se muestra específicamente en .. una estructura química. De esta manera, cuando una .estructura química contiene una "D", el compuesto representado por la estructura es enriquecido con deuterio en el sitio representado por "D" .

Una característica de un compuesto se refiere : a cualquier calidad que un compueto exhibe,, por ejemplo, picos o tiempos de retención, como se determina por espectroscopia magnética nuclear 1H, espectroscopia . de masa, espectrofotometría infrarroja, ultravioleta o. fluorescente, cromatografía de gas, cromatografía de capa . delgada, cromatografía líquida de alta resolución, análisis elemental, prueba Ames, disolución, estabilidad y cualquier otra calidad que puede determinarse por un método analítico. Una vez que las características, de un compuesto se conocen, la información puede usarse ¦ para, por ejemplo, seleccionar o probar la presencia. del compuesto en una muestra.

Como se usa . en .la presente, un portador o excipiente "farmacéuticamente aceptable" es uno que es apropiado para usar con humanos y/o animales sin efectos colaterales adversos (tales como' toxicidad, irritación, y respuesta alérgica) proporcional con una relación beneficio/riesgo razonable.

Como se usa en la presente, "sustancia fármaco" se refiere, al ingrediente activo en un producto.' fármaco, que proporciona actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento,, o prevención de enfermedad, o para afectar la estructura o cualquier función del cuerpo del humano o animales.

Como se usa en la presente, "producto fármaco" se refiere a la forma de dosificación terminada que contiene la sustancia fármaco asi como al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en la presente, un compuesto "aislado" es un compuesto aislado de la mezcla de reacción cruda siguiendo un acto afirmativo de aislado. El acto de aislado involucra necesariamente separar el compuesto ' de los otros componentes conocidos de la mezcla de reacción cruda, con algunas impurezas, productos laterales desconocidos y cantidades residuales de los otros componentes conocidos de la mezcla de reacción cruda que se permiten quedar. La purificación es un ejemplo de un acto afirmativo de aislado.

Como se usa en la presente, la composición que está "libre" de una entidad química significa .· que la composición contiene, si no en toda, una cantidad de la entidad química que no evita seguir un acto afirmativo pretendido para eliminar la presencia de entidad química en la composición.

Como se usa en la presente, "prueba de estabilidad" se refiere a pruebas conducidas en intervalos de tiempo específicos y varias condiciones ambientales (por ejemplo, temperatura y humedad) 'para apreciar sí y en que extensión un producto de fármaco se degrada durante su tiempo de vida de anaquel designado. Las condiciones y el tiempo específicos de las pruebas tales que aceleran las condiciones del producto fármaco se espera que se encuentren durante su vida de anaquel. Por ejemplo, los requerimientos detallados de pruebas de estabilidad para farmacéuticos terminados se codifican en 21 C.-F.R §211.166, el . contenido ; completo del cual se incorpora por ello para referencia.

Como se usa en la presente, "alrededor de", en .el contexto de un valor o' intervalo numérico significa +10%' del valor o intervalo numérico recitado o reividnicado .

El laquinimod es es una molécula pequeña que tiene la siguiente estructura química: Laquinimod Es un inmunomodulador oral que ha demostrado efecto terapéutico en varios modelos . animales inflamatorio/autoinmunitario experimental, tal como Encefalomielitis Autoinmunitaria Experimental (EAE.) , un modelo animal para . Esclerosis Múltiple (MS) , colitis inducida por Sulfato de Sodio Dextrano (DSS) para Enfermedad Inflamatoria del Intestino, ratones Diabéticos No Obesos (NOD) para Diabetes Tipo I ·( IDDM) , Neuritis Autoinmunitaria Experimental (EAN) para Síndrome Guillain-Barre, Lupus Eritematoso Sistémico (SLE) , nefritis por lupus, artritis por lupus, Enfermedad de. Crohn y artritis Reümatoide. La actividad terapéutica del laquinimod en estos modelos "resulta de una variedad de efectos mecánicos, incluyendo reducción de infiltración por leucocito en tejidos objetivo por modulación de adhesión de célula T mediada por quimiocina, modulación del balance de citoquina, subregulación de MHC clase II lo que resulta en la alteración de la presentación del antígeno, y efectos en subpoblaciones de células dendríticas.

Una sal farmacéuticamente aceptable de laquinimod, así como de los compeustos deuterados, en la presente, incluye litio, sodio, potasio,, magnesio, calcio,, manganeso, cobre, zinc, aluminio y hierro. Las formulaciones salinas de laquinimod y el proceso para preparar, la misma se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de EUA. No. 2005/0192315 y Publicación de \ Solicitud Internacional PCT No. WO 2005/074899, que se incorporan por ello para referencia en esta solicitud.

Una unidad de dosificación puede comprender un compuesto sencillo o mezclas de compuestos de la misma. Una unidad de dosificación puede prepararse para formas de dosificación oral, tales como comprimidos, cápsulas, pildoras, polvos, y granulos .

El laquinimod, asi como los compue.stos deuterados en la presente, pueden administrarse en mezcla con diluyentes, extendedores, excipientes, o portadores apropiados (referidos colectivamente en la presente como un portador farmacéuticamente aceptable) seleccionados de forma apropiada con respecto a la forma pretendida de administración y como sea consistente con las . prácticas farmacéuticas convencionales. La unidad está preferiblemente en una forma apropiada para administración oral. El laquinimod,. asi como los compuestos deuterados en este, pueden administrarse solos pero generalmente se mezclan con un portador farmacéuticamente aceptable, y co-administran en la forma de un comprimido o. cápsula, liposoma, o como un polvo aglomerado. Los ejemplos de portadores sólidos apropiados incluyen lactosa, sacarosa, gelatina y. agar. Las. cápsulas ' o comprimidos pueden formularse fácilmente y pueden hacerse fácilmente para tragar o masticar; otras formas sólidas incluyen gránulos, y polvos a granel. Los comprimidos . pueden contener aglutinantes, lubricantes, agentes desintegrantes, agentes colorantes, agentes saborizantes , agentes que inducen el flujo, y agentes de fusión apropiados. Por ejemplo, para administración oral en la forma unitaria de dosificación de un comprimido o ..cápsula, el componente ,. de fármaco activo puede combinarse con un portador inerte, farmacéuticamente aceptable, no tóxico, oral, tal como lactosa, gelatina, , agar, almidón/ sacarosa, glucosa, metil celulosa', fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, mánnitol, sorbitol, . celulosa microcristalina y similares. Los. aglutinantes apropiados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales .. tal como glucosa o beta-lactosa, almidón de maíz, gomas naturales y sintéticas tales, como acacia, tragacanto, o alginato dé sodio, povidona, carboximetilcelulosa, polietilen glicol, ceras, y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, benzoato de sodio, ' acetato de sodio, cloruro de sodio, . ácido esteárico, fumarato de sodio esteárilo, talco y similares. Los desintegrantes incluyen, sin limitación, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, goma de xantano, croscarmelosa de sodio, glicolato.de almidón de sodio y similares.

Los ejemplos específicos de las técnicas, portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse para formar, formas . de dosificación orales de la presente invención se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de EUA No. 2005/0192315, Publicaciones de Solicitud de Internacional PCT. Nos.. WO 2005/074899, O 2007/047863, y WO 2007/146248.

Las técnicas y composiciones generales para hacer las formas de dosificación útiles en la presente.- invención se describen en las siguientes referencias: 7 Modern Pharmaceutics, Capítulos 9 y 10 (Banker & Rhodés, Editores, 1979); Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Lieberman et al., 1981); Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2a Edición (1976); Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985); Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton,¦ Trevor Jones,. Eds., 1992); Advances in Pharmaceutical Sciences Vol 7. (David Ganderton, Trevor .Jones, James McGinity, . Eds., 1995) ; Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms (Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James cGinity, Ed. , 1989); ¦ Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic ¦ Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 61 (Alain Rolland, Ed. , 1993); Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract (Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J. G. Hardy, S. S. Davis, Clive G. Wilson, 'Eds.); Modern Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical , Sciences , Vol. 40 (Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.). Estas referencias en su totalidad se incorporan por ello para referencia en esta solicitud.

Los metabolitos de compuestos químicos, ya sean inherentes o farmacéuticos, se forman como parte del proceso bioquímico natural , de degradación y eliminación de los compuestos. La velocidad de degradación de un compuesto es una determinante importante de la duración e intensidad de esta acción. El perfil de los metabolitos de compuestos farmacéuticos, metabolismo del fármaco, es una parte importante del descubrimiento del fármaco, lo' que lleva al entendimiento de cualquiera de los efectos colraterales indeseables.

Metabolización de Laquinimod El laquinimod . se ha mostrado que se metaboliza lentamente por CYP3A4. (Citocromo P450 3A4) para . formar varios metabolitos menores y algunos de estos pueden experimentar metabolismo adicional por reacciones metabólicas de Fase 2. Ver, por ejemplo Tuvesson et al. "Cytochrome P450 3A4 is.the major enzyme résponsible for the metabolism of laquinimod, a novel iminunomodulator", Drug Metabolism . and Disposition, Vol . 33, No. 6, páginas 866-872. DELAQ ' (des-etil-laquinimod; 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida) , que tiene la siguiente estructura química, ..es uno de los metabolitos oxidantes de laquinimod..

Además, los datos clínicos han mostrado . que los niveles de DELAQ en el cuerpo humano están en - una cierta relación constante a los niveles de laquinimod ya sea en términos de Cmax o AUC. Tal comportamiento suguiere que la formación del metabolito, DELAQ, . es "relación de formación limitada" PK.

Se describen enseguida experimentos que muestran que la forma deuterada de laquinimod es más resistente a los cambios met.abólicos, especialmente aquellos cambios mediados por sistemas de citocromo P450. La deuteración del enlace C-H a oxidarse puede cambiar la trayectoria del metabolismo del fármaco (intercambio metabólico) . El siguiente esquema de. reacción metabólico ilustra la formación de .DELAQ mediada' por CYP3A4 más lenta con laquinimod deuterado: Laquinimod DELAQ alfa, alfa deuterado La deuteración de la porción fenilo puede afectar la posición del enlace amida con relación al centro catalítico CYP antes de la oxidación del carbono ? del grupo etilo. Esto puede explicar por qué el laquinimod deuterado con varias deuteraciones en las porciones etilo y/o fenilo resulta en, por ejemplo, la formación reducida de DELAQ opcionalmente deuterado .

DELAQ como una Impureza DELAQ también . es un sub-producto .sintético ..indeseable de síntesis de laquinimod. Cualquier actividad de DELAQ no se ha caracterizado completamente. También es generalmente preferible minimizar la cantidad de una impureza en una sustancia de fármaco y . el producto de fármaco final.

DELAQ como una impureza en la sustancia fármaco de laquinimod sodio, se prueba por un método de HPLC y la especificación para esta impureza se proporciona como no más del 0.1%. Lotes de sustancia fármaco de GMP de laquinimod sodio se han probado y los niveles de DELAQ en estos lotes se han encontrado que son de menos de 3 ppm. Por lo tanto se proporcionan parámetros similares para compuestos que contienen el producto de fármaco de esta invención.;.

Se desarroollaron varios métodos . analíticos .y bioanalíticos para la determinación de concentraciones DELAQ opcionalmente deuteradas.. Los métodos bioanalíticos actuales para análisis DELAQ opcionalmente deuterado en varias matrices se basan, en LC-MS y tienen sensibilidad en el nivel en plasma pg/mL bajo.

Esta invención se entenderá mejor por referencia a los Detalles Experimentales que siguen, pero aquellos expertos en la técnica apreciarán fácilmente que los experimentos específicos detallados sólo son ilustrativos de la . invención como se describe más completamente en las reivindicaciones que siguien posteriormente.

Detalles Experimentales : Ejemplo 1; Preparación de Laquinimod Deuterado Etapa 1: Síntesis de N-Etil-anilina Deuterado N-Etil-D5-anilina ¦D5-Etil-anilina N-Dll-Etil-anilina N-Dll-Etil-anilina Se disolvió la. anilina (0.01 mol) en tolueno (10 mi), enfriado hasta 0°C bajo nitrógeno, y se agregó anhídrido acético (0.02 mol) en una porción. Se removió el baño de enfriamiento ' y la mezcla se agitó por 90 minutos y luego se evapora en un evaporador rotatorio. La acetanilida intermediaria se secó al vacío y luego se disolvió en THF (20 mi) y es enfriado hasta 0°C bajo nitrógeno. Se agregó hidruro de. litio aluminio (0.025 mol) durante 25 minutos. La mezcla se puso a reflujo por 2 horas .y luego se enfría. Sé agregó gel de sílice (3 gr) seguido por la adición de solución de NaOH 1M (1.8 gr) . La mezcla se agitó por 30 minutos y luego se filtra a través de una almohadilla de sulfato de sodio. La torta filtro se lavó con éter de dietilo y la fase orgánica se concentró en un evaporador rotatorio para dar los compuestos del título.

Etapa 2: Síntesis de Laquinimod Deuterado N-etil-N-D5-fenil-1 , 2-dihidro-4-hidroxi-5-cloro-l-metil-2-oxoquinolin-3-carboxamida (Compuesto 1) Compuesto 1 N-D5-etil-N-fenil-1, 2-dihidro-4-hidroxi-5-cloro-l-metil-2- Compuesto 2 N-D5-etil-N-D5-feniÍ-l,.2-dihidro-4-hidroxi-5-cloro-l-metil-2-oxoquinolin-3-carboxamida (Compuesto 3) Compuesto .3 La- N-etil-anilina (0.01 mol) y 'MCQCA (ácidó 1,2-dihidró-4-hidroxi-5-cloro-l-metil-2-oxo-quinolin-3-carbóxilico) (2.03 gr, 0.008 mol) se agitaron en diclorometano . (32 mi) y se agregó trietilamina (4.2 mi). La mezcla se enfrió en un baño de hielo/agua bajo . nitrógeno' y se agregó, cloruro de tionilo (1.33 gr) gota a gota durante 30· minutos ... La mezcla se agitó a 0°C por 3 horas adicionales y luego se extrajo con ácido sulfúrico 1M acuoso frío. La fase orgánica se extrajo con solución de NaOH 1M y la fase acuosa se concentró un poco en un evaporador rotatorio para remover los rastros de solventes orgánicos. Se agregó HC1 5M hasta pH 1-1.5 y . la suspensión resultante se agita por 30 minutos. Se filtró el ^producto precipitado, se lava con agua y seca en vacio.. Se obtiene de esta manera laquinimod deuteradó (86-93% de rendimiento) .

Etapa 3: Preparación de sal de Sodio de Laquinimod Deuteradó' El laquinimod deuteradó preparado en la Etapa 2 se suspendió en etanol y se trata con solución de NaOH acuosa al 20%. La sal de sodio precipitada se agitó por 3 horas, se filtra y lava con etanol. El secado al vacio proporciona la sal de sodio de laquinimod deuteradó (92-94% de. rendimiento) . Se probaron la identidad y pureza por RMN, MS y HPLC.

Pureza isotópica y ensayo de compuestos deuterados 1-3 Ejemplo 2: Análisis de DELAQ Se forma DELAQ. como un metabolito en roedores asi como en el cuerpo humano durante la administración de laquinimod. Se desarrollaron varios métodos' analíticos y bioanalítico.s para la determinación de · concentraciones de DELAQ, como un metabolito representativo. Los métodos bioanalíticos actuales para análisis DELAQ en varias matrices están con base en LC-MS y tienen sensibilidad en el nivel de plasma pg/mL bajo.

Se usaron las siguientes condiciones en la determinación de DELAQ en plasma humano. El plasma se purifica por SPE en línea después de la precipitación con solución de . sílice coloidal LUDOX AS--4.0 seguido por el análisis con HPLC con detección MS/MS. .

Condición 1: También se determinó el DELAQ en plasma de rata bajo la siguiente condición. Se purificó el plasma por SPE en línea después de la precipitación con solución de sílice coloidal LUDOX AS-40 seguido por el análisis con HPLC con detección MS/MS.

Aparato LC/MS/MS SCIEX, QTRAP4000 Shimadzu Próminence HPLC Controlador de Sistema: Shimadzu CBM-20A Bombas: Bomba A:.. Shimadzu LC-20AD Bomba B: Shimadzu LC-20AD Bomba C: Shimadzu LC-20AB Automuestreador: Shimadzu SIL-20AC Horno de columna: Shimadzu CTO-20AC Ejemplo 3: Evaluación Metabólica Farmacocinética y Parcial Los objetivos principales de este ejemplo fueron: • Cuantificación de Compuesto 1, Compuesto 2, Compuesto 3 y Laquinimod en plasma de rata al usar el método bioanalitico LC/MS/MS.

• Caracterización del perfil farmacocinético . del Compuesto 1, Compuesto 2, Compuesto 3 y Laquinimod después de la administración oral (PO) a una dosis de 0.2 mg/kg.

• La medición, de concentraciones DELAQ en las muestras de plasma recolectadas.

El nivel de dosis seleccionado en este ejemplo sé ha usado en un estudio farmacológico efectuado previamente con laquinimod. · Diseño General Se usaron ratas canuladas en la vena yugular común derecha mediante tubería de polietileno. En la parte en vivo, se trataron tres ratas hembra canuladas con cada uno de los cuatro artículos de prueba' a una dosis de 0.2 mg/kg.

Se sacó la sangre de las ratas en cinco diferentes puntos de tiempo para la preparación del. plasma. Las concentraciones de Compuesto 1, Compuesto 2,. Compuesto 3, laquinimod, y DELAQ se determinaron en estas muestras de plasma, usando métodos aplicables LC/MS/MS.

Materiales Compuestos de Prueba a. Sal de sodio de N-etil-N-D5-fenil-1 , 2-dihidro hidroxi-5-cloro-l-metil-2-oxoquinolin-3-carboxamida (Compuesto 1) preparada en el Ejemplo 1: Peso molecular: 383.8 Apariencia: Polvo blanco Almacenamiento: 2°-8 °C, protegida de la luz Pureza: Se asume 100% de pureza. b. Sal de sodio de N-D5-etil-N-fenil-1 , 2-dihidro hidroxi-5-cloro-l-metil-2-oxoquinolin-3-carboxamida (Compuesto 2) preparada en el Ejemplo 1: Peso molecular: . 383.8 Apariencia: . · . ' Polvo blanco Almacenamiento: 2°-8 °C, protegida de la luz Pureza: Se asume 100% de pureza. ·. c. Sal de sodio de N-D5-etil-N-D5-fenil-1 , 2-dihidr.o hidroxi-5-cloro-l-metil'-2-oxoquinolin-3-carboxamida (Compuesto 3) preparada en el Ejemplo 1: Peso molecular: 388.8 Apariencia: Polvo blanco Almacenamiento: 2°-8 °C, protegida de la luz Pureza: Se asume 100% de pureza, d. Sal de sodio de Laquinimod Peso molecular: 37.8.8 Apariencia : Polvo blanco Almacenamiento : Temperatura ambiente controlada (15°-25 °C). , protegida de la luz Ensayo por HPLC: 100.8 o o Pureza: Se asume 100% de pureza.

Vehículo Agua, alta pureza (Direct Qr producida en él laboratorio) Otros materiales Isoflurano para anestesia (FORANE®, ABBOTT) EDTA (Dihidrato de sal de disodio del ácido etilenediaminatetraacético, Sigma Aldrich, Product No: E4884-lOOg) Sal de sodio de Heparina, de¦ Mucosa Intestinal Porcina, Sigma Aldrich, . Producto ?s: H9399-25KU) .

Sistema de Prueba Especificación Animal Especie: rata Cepa: SD (ratas Sprague Dawley CD) Estado de salud: SPF Edad ordenada: 8 semanas Número de animales: 20 hembras canuladas Intervalo de peso ordenado: 200-225 g Aclimatación: al menos 3 días Al inicio del tratamiento: Número de animales: 12 hembras canuladas Edad aproximada: 9 semanas Justificación de la Selección del Sistema de Prueba .

La rata SD es una especie y cepa de roedor adecuada para estudios farmacocinéticos y es aceptable para las autoridades reguladoras. Además, el perfil farmacocinético de laquinimod en ratas Sprague Dawley está bien caracterizado.

Sistema de Identificación Cada animal . fue identificado por marcas indelebles en el cuerpo. Las jaulas estuvieron marcadas con tarjetas individuales que especifican la cepa, códigos de animales, códigos de grupo, fecha y hora de la administración del fármaco, articulo de prueba y código de estudio.

Programa de mantenimiento especifico Alojamiento del Animal Antes y Después de la Administración de la Dosis Los animales . se alojaron en un cuarto ambientalmente controlado en jualas por grupo después de llegar a las instalaciones. Se acomodaron las ratas en jaulas individuales de policarbonato . o polisulfonato, con astillas de aserrín como cubierta para el piso.

Condiciones Ambientales Se fijaron controles para mantener la temperatura a 21±3°C y humedad relativa a . 30-70 %. Un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas luz/12 horas oscuridad se mantuvo automáticamente.

Agua Potable.

Se¦ proporcionó agua de la llave filtrada a través de un filtro de 0.2µ?? ad libitum. El agua se analizó de rutina (una vez cada tres meses) para un conteo total microbiano, y para ausencia de especies de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, y Clostridium.

Alimento Se proporcionó alimento tratado en autoclave Altromin VRF1 para los roedores ad libitum a lo largo del estudio. Se analizó periódicamente . la dieta.

Lecho Se usó un lecho tratado en autoclave LIGNOCEL (SAWI, astillas de madera) . La calidad del material del. lecho se certifica por el fabricante.

No se supo de contaminantes presentes en la dieta, agua o lecho a niveles ..que pudieran interferir con .los objetivos del estudio.

Diseño Experimental Aclimatación Cada animal fue inspeccionado por personal calificado, ¦ y la permeabilidad de la cánula se verificó por la capacidad de retirar una muestra de sangre al recibir el animal. Se aclimataron los animales que se juzgó estaban én buena salud durante al menos 3 días. Todos los animales recibieron un examen físico detallado por un. veterianrio responsable el último día del periodo de aclimatación.

Selección aleatoria Después del periodo de aclimatación, los animales juzagados por estar en buena salud y adecuados para prueba se asignaron al estudio con base en su peso corporal. En la selección aleatoria los pesos corporales de los animales estuvieron dentro del ± 20 % de la media global.

Organización ., del Nivel de Dosificación ' Animal y el Régimen de Tratamiento Tabla 1. Asignación de los animales canulados a los grupos experimentales dosis es con base en la forma no deuterada' de laquinimod libre de ácido.

La relación de peso molecular del articulo de prueba es 1.0757 para el Compuesto 1 y Compuesto 2. La relación de peso molecular del artículo de prueba es 1.0898 para el Compuesto 3. La relación de peso molecular del artículo de prueba es 1.0616 para Laquinimod sodio. Estos factores de corrección se aplicaron para ajustar las concentraciones equivalentes de ácido libre de laquinimod no deuterado.

La administración oral fue efectuada por cebadura oral a un volumen de dosificación de 5 ml/kg usando' una aguja acero inoxidable de. alimentación de puntas romas (Popper Sons, USA) . Se midieron los pesos corporales antes . de administración de la dosis y se calcularon las dosis sobre la base del peso corporal individual.

Justificación para Selección de la Dosis y Vía de Administración El nivel de dosis seleccionado en este estudio ya se había usado en un estudio farmacológico previamente efectuado con laquinimod. La vía de administración será oral ya que es la vía pretendida de exposición humana.

Preparación de Formulapiones y medición de la concentración alcanzada Preparación de soluciones de dosificación Se pesó la cantidad apropiada del artículo de prueba y se disolvió en agua (vehículo) para alcanzar la concentración requerida, la cual fue en cada caso equivalenta a 0.04 mg/mL de ácido libre de laquinimod no deuterado.

Las disoluciones de los artículos de prueba se alcanzaron por sacudimiento suave, agitación, vórtice de baja velocidad o un sonicador. No se aplicó factor de corrección para ajustar por pureza.

Almacenamiento y estabilidad de las formulaciones Todas las. soluciones de dosificación se almacenaron a 2-8°C en recipientes de vidrio ámbar herméticamente cerrados, protegidos de la luz. Previo al usó se. tomaron formulaciones del refrigerador, y se dejaron que ; alcanzaran la temperatura ambiente ( 1-5-25 °C) . Se · asumió que las soluciones dee dosificación eran estables durante al menos 48 h, con base en los datos de estabilidad de soluciones de dosificación similares dé laquinimod.

Concentración alcanzada para soluciones de dosificación Antes del tratamiento, las concentraciones de laquinimod en las soluciones de dosificación se determinaron por métodos validados de HPLC con detección UV en muestras por¦ duplicado tomadas de las soluciones. Las concentraciones alcanzadas estuvieron dentro de ± 10 % de . las concentraciones nominales.

Observación Clínica Se documentó la mortalidad, signo de enfermedad o reacción severa al tratamiento.

Muestreo de sangre, preparación de plasma Se retiró la sangre de los animales en los siguientes puntos de tiempo: 1, 2, 4, 8 y 24 horas después de la dosificación como se detalla en la tabla a continuación. Se registró el tiempo de muestreo real.

Tabla 2. Puntos de tiempo para recolección de sangre Recolección de sangre para las ratas canuladas Cada animal se sujetó firmemente. Después de la remoción del sello del puerto de la cánula se tuvo acceso con uña aguja de puntas romas adecuada montada en una jeringa que contenia PBS . Después, de haber retirado aproximadamente 100 µ?. de sangre, se cambió la jeringa a una jeringa limpia heparinizada . Aproximadamente se recolectaron 250 . µ? de sangre para la preparación del plasma. La primera fracción de sangre de 100 µ?. se regresó y se dieron 250 µ?, .de PBS al animal a través del catéter. El catéter se llenó con solución de glicerol. heparinizado (100 IU/ml) preparado al mezclar.10 mi de reserva de heparina (200 IU/ml) con 10 mi de glicerol estéril (d=1.26 g/mL) . Se mezclaron los espécimenes de sangre inmediatamente y se .colocaron en hielo con agua.

Preparación de plasma Se. llevó a cabo la centrifugación tan pronto como fue practicable y no más de 40 minutos a partir de la recolección .

Se centrifugó la sangre entera a 2500 g durante 10 rain a 4°C, y se transfirió el plasma separado dentro de tubos de polipropileno pre^-etiquetados y se congelaron los tubos a -70 °C dentro de los 70 minutos de la recolección..

Se transfirieron las muestras congeladas al Laboratorio Bioanalitico para determinación de la concentración de laquinimod donde se almacenaron a -70°C nominales . hasta 'el análisis .

Bioanálisis de muestras de plasma Las concentraciones de los artículos de prueba (Compuesto 1, Compuesto 2, Compuesto 3 y Laquinimod) y la concentración de DELAQ se determinaron en las muestras de plasma al usar un ensayo confiable de LC/MS/MS .

Análisis de datos farmacocinéticos Se evaluaron los parámetros . farmacocinéticos y los niveles medios de plasma calculados contra las curvas de tiempo.

Se determinaron los siguientes parámetros farmacocinéticos a partir. de los datos de tiempo- concentración media de plasma (media de. los tres animales en cada punto de tiempo) del Compuesto 1, Compuesto 2, Compuesto 3 y Laquinimod.

Sumario de los Resultados Como se muestra en las Tablas 3-6 a continuación y en la Figura 2, la concentración promedio en plasma de laquinimod enriquecido con deuterio es comparable con aquella de laquinimod no enriquecido con deuterio.

Los perfiles de concentración-tiempo de los artículos de prueba no difirieron significativamente. Las concentraciones máximas medias se alcanzaron por 1 o 2 horas después de la administración, y variaron entre - 703 y 798 ng/mL. Las concentraciones medias disminuyeron hasta 194-227 ng/mL por 24 horas posteriores a la' dosis. Los. valores AUC para laquinimod, Compuesto 1, Compuesto 2 y Compuesto 3 fueron 15506.0, 13783.4, 12289.8 y 15750.2, respectivamente también indicando ninguna diferencia importante en la exposición.

Tabla 3. Parámetros PK individuales y promedio para laquinimod en ratas después de administración oral a 0.2 mg/kg Tabla 4. Parámetros . PK individuales y promedio para Compuesto 1 en ratas después de administración oral a 0.2 mg/kg Tabla 5. Parámetros PK individuales y promedio, para el Compuesto 2 en ratas después de administración oral a 0.2 mg/kg Tabla 6. Parámetros PK individuales y promedio para Compuesto 3 en ratas después de administración oral a 0.2 mg/kg Como se muestra en las Tablas 7 y 8 a continuación y en la Figura 1, las cantidades de D.ELAQ formadas después de la administración . oral, de laquinimod enriquecido con déuterio es inferior a la cantidad de DELAQ formado después de la administración de laquinimod · no enriquecido con deuterio. En promedio se podía observar una reducción de alrededor de diez veces en las concentraciones de DELAQ medidas en el plasma de animales tratados con el Compuesto 2 en . comparación con el plasma de aquellos que se trataron con. laquinimod.' En el grupo anterior, las concentraciones medias de DELAQ variaron entre 18.3 y 75.4 pg/mL, y en el grupo que recibió laquinimod varió entre 142 y 878 pg/mL. En ambos grupos la concentración más baja de DELAQ se midió a 1 hora después, de la administración y las concentraciones dé DELAQ se incrementaron hasta que se tomó la última muestra a las 24 horas posteriores a la dosis.

Tabla 7. Parámetros PK individuales y promedio para DELAQ formado a partir de laquinimod en ratas después de administración oral a 0.2 mg/kg Tabla 8. Parámetros PK individuales y promedio para DELAQ formado a partir del Compuesto 2 en ratas después de administración oral a 0.2 mg/kg Los resultados de prueba muestran que el laquinimod enriquecido con deuterio reduce la formación de DELAQ, mientras mantiene un perfil- concentración-tiempo en plasma similar al del laquinimod no deuterado. .

Ejemplo 4 : Evaluación de eficacia de laquinimod deuterado (Compuestos 1, 2 y 3) en EAE (encefalomielitis autoinmunitaria experimental) inducida por MOG (mielina-oligodendrocito-glicoproteina) El propósito de este estudio fue evaluar la eficacia de tres formas deuteradas de laquinimod, compuestos 1,. 2 y 3, en comparación con laquinimod, usando la EAE inducida por MOG en ratones C57BL/6.

La EAE es un modelo animal aceptado para esclerosis Múltiple, e inducción .con MOG en C57BL/6 es un modelo bien establecido.

Diseño General La enfermedad se. indujo en los ratones por la inyección de la emulsión encefalitogénica .

Los compuestos 1, 2 y 3 en 10 mg/kg, laquinimod en 10, y 25 mg/kg o el vehículo se administraron desde el inicio del estudio (Día 0) hasta la terminación (Día 30) . Todos los grupos se trataron oralmente, diariamente.

Materiales : Los compuestos 1, 2 y 3 se prepararon como se describe en el Ejemplo 1.

Laquinimod, fabricado en Teva.

Agua purificada (Direct-Q, Millipore)¦'.

• Toxina de tosferina: Sigma, . Código # 2980, lote 044K1449.

MOG 35-55: Mnf Novatide, lote # 90016-71-1.

Adyuvante de Freund Completo (CFA) :. Sigma, código: F-5.881, lote 104?893?.

Solución salina: Mnf-DEMO S.A, Código 05029, lote # 0101610.

Mycobacterium tuberculosis H37 RA (MT) : Mnf-Difco.

Especie, cepa y proveedor Ratones hembra no preñados, nulíparas, saludables de. la cepa C57BL/6 obtenidos de Harían Animal Breeding Center, Israel el 26 de Enero de 2010 se usaron en el estudio. Los animales pesan 15-22 g, y fueron de aproximadamente 7-8 semanas de edad al llegar.- Los pesos corporales de los animales se registraron en el día del suministro. Abiertamente los animales saludables se asignaron a grupos de estudio arbitrariamente antes de que el tratamiento comience. Los ratones se identificaron individualmente al usar" marcar auriculares. Una. tarjeta codificada' en color en cada jaula da información incluyendo el número de jaula, número de grupo e identificación. Se mantuvieron las condiciones de. cuidado y alojamiento de los animales.

Inducción EAE Se indujo EAE al inyectar la mezcla encefalitogénica (emulsión) que consiste de MOG (150.0 µg/ratón) y CFA enriquecida con M. tuberculosis (1 mg/mL de CFA) .

Un volumen de 0.2 mi de emulsión se inyectó subcutáneamente en los flancos de los' ratones.

La toxina de tosferina se inyectó intraperitonealmente en el día de la inducción y 48 horas después, (la cantidad total fue 0.1 + 0.1=0.200 g/ratón . en 0.2 mi de volumen de dosificación) .

Los ratones se asignaron a 6 grupos de tratamiento: Vehículo, laquinimod (25 mg/kg y 10 mg/kg) , y Compuestos 1, 2 y 3, cada uno 10 mg/kg .' Preparación y administración de emulsión encefalitogénica Porción de aceite: CFA (que contiene 1 mg/ml T) Porción líquida: 15.0 mg de MOG se diluyó en 10.0. mi de Solución Salina Normal para proporcionar 1.5 mg/ml de solución madre MOG. La emulsión se hizo de partes iguales de aceite y porciones líquidas (1:1) en dos. jeringas conectadas una . con la otra con una cerradura Leur, transferida a la jeringa de insulina y 0.2 mi se inyectó . al flanco derecho .de cada ratón.

Preparación y administración de toxina de tosferina Se agregó 55 L de toxina de tosferina (200 pg/ml) a 21.945 mi de solución salina para proporcionar 500 ng/ml . la toxina de tosferina se administró intráperitonealménte en el día de la inyección de encefalitogen y 48 horas después (100.0 ng/0.2ml/ratón X 2 = 200.0. ng/ratón) .

Preparación y admi istración de las formulaciones de prueba Una concentración de 2.5mg/ml de laquinimod se preparó en agua purificada para nivel de dosis de 25.0 mg/kg. La formulación de prueba se almacenó a 2 hasta 8°C hasta el uso en botellas de color ámbar. Los ratones del grupo laquinimod de 25mg/kg se administraron con el laquinimod en: nivel de dosis de volumen de 200pl/ratón por sonda oral, una vez diario (como se muestra en la Tabla 4b) .

Una concentración de 1.0 mg/ml de laquinimod se preparó en agua purificada para laquinimod convencional o compuestos 1, 2 y 3 para el nivel de dosis 10.0 mg/kg. Las formulaciones de prueba se almacenaron a 2 hasta. 8°C en botellas, de color ámbar hasta su uso.

Los ratones se' administraron con el laquinimod convencional en el nivel de dosis de volumen de 200 l/ratón por sonda oral al grupo de laquinimod 1.0 mg/kg una vez al dia. La administración de los compuestos de prueba se realizó en una forma similar. El vehículo (agua destilada doble) se administró al grupo de control negativo (Grupo # 1) en una manera similar.

Morbidez y Mortalidad Todos los animales se examinaron una vez al día para detectar si hubiera moribundos. Los ratones se pesaron una vez a la semana. .

Signos clínicos EAE Los ratones se observaron diariamente desde el día décimo después de la inducción de EAE y . se registraron los signos clínicos EAE. Los registros se registraron en tarjetas de observación de acuerdo a los grados descritos en la Tabla 4a a continuación. .

Tabla 4a: Evaluación de los signos clínicos EAE Todos los ratones con registro 1. y de arriba se consideraron enfermos. Cuando el primer signo clínico aparece todos a los ratones se les dio comida mojada en agua, que se extendió en diferentes lugares en el lecho de las cajas.. Para propósitos de cálculo, el registro de animales que se sacarificaron o murieron (6) se llevó adelante. .

INTERPRETACION DE RESULTADOS Cálculo de la incidencia de la enfermedad (relación de la enfermedad) Se sumaron el. número de animales enfermos en cada grupo. La incidencia de la enfermedad se calculó como ( No.de ratones enfermos en grupo tratado INCIDENCIA de ENFERMEDAD = No. de ratones enfermos en grupo control ) porcentaje de inhibición de acuerdo a la incidencia se calculó como Número de ratones enfermos en grupo tratado INHIBICION (%)de INCIDENCIA = x l OO V Número de ratones enfermos en grupo control Cálculo de la tasa de mortalidad/moribundo . (relación de mortalidad) Se sumaron el número de animales muertos o moribundos en cada grupo. La mortalidad de la enfermedad se calculó como No. de ratons muertos o moribundos en grupo tratado MORTALIDAD de ENFERMEDAD -- No. de ratones muertos o moribundos en grupo control El porcentaje de inhibición dé acuerdo a la mortalidad se calculó como '.

Número de ratones muertos o moribundos en grupo tratado INHIBICION (%) de MORTALIDAD = xlOO Número de ratones muertos o moribundos en grupo control Cálculo de duración de la enfermedad La duración media de la enfermedad expresada en días se calculó como ? Duración de la enfermedad de cada ratón Duración Media = No. de ratones en el grupo Cálculo del retraso medio al comienzo de la enfermedad El comienzo . medio de la enfermedad expresado en días se calculó como ? Comienzo de enfermedad de cada ratón Comienzo Medio = No. de ratones en el grupo El retraso medio al comienzo, de la enfermedad expresado en días se. calculó al sustraer el comienzo, medio' de la enfermedad en el grupo de control del grupo de prueba .

Cálculo del registro máximo medio y porcentaje de inhibición El registro máximo medio (MMS) de cada grupo se calculó como ? Registro Máximo de cada ratón MMS = No. de ratones en el grupo porcentaje . de inhibición de acuerdo a MMS se calculó como MMS de grupo tratado INHIBICION (%) de MMS = xl OO MMS de grupo control Cálculo del registro medio del grupo, y porcentaje de inhibición Los registros diarios de cada ratón en. el grupo de prueba se sumaron y el registro diario medio individual (IMS) se calculó como ( ? Registro diario de ratón IMS-- Periodo de observación{dias)J El registro de grupo' medio (GMS) se calculó como ? IMS de cada ratón GMS = No. de ratones en el grupo porcentaje de inhibición se calculó como GMS de grupo tratado INHIBICION (%) deGMS = x lOO ^ GMS de grupo control Un resumen de la incidencia, mortalidad, . MMS, GMS, duración de la enfermedad, comienzo de la enfermedad y la actividad de cada grupo se muestra en la Tabla 4b a continuación.

Tabla 4b. Mortalidad, incidencia, MMS, GMS, Duración y Comienzo de la actividad E comparada con el vehículo 5 15 Incidencia y mortalidad 14/15 ratones se enfermaron debido a. EAE en el grupo de control tratado con vehículo. En el grupo, tratado con laquinimod (10 mg/kg),- 9/15 ratones se enfermaron comparados con 13/15, 10/15, y 8/15 en grupos tratados . con los compuestos 2, 3 y 1 .respectivamente. 4/15 ratones se enfermaron en el grupo de control positivo tratado con 25 mg/kg de laquinimod. No se observó mortalidad en ninguno de los grupos de tratamiento.

Hubo un retraso en la apariencia de signos clínicos en todos los grupos tratados con laquinimod (10 mg/kg). con el comienzo entre 15.3 y 22.1 días comparado con el grupo de control (comienzo .11.9+5.5 días). La duración de signos clínicos EAE en estos grupos de tratamiento comparados, con el grupo de control tratado' con vehículo fue entre 7.9 y 13.2 días comparado con 19.1+5.5 días en el grupo de control.

Registro Máximo Medio (MMS) y Registro Medio del Grupo (GMS) Los MMS y GMS del grupo de control negativo tratado con vehículo fueron 3.2+1.3 y 2.211.0, respectivamente. El grupo de control de laquinimod positivo (25 mg/kg) muestra 59.4% y 97.7% de inhibición de EAE de acuerdo a MMS (registro 1.3±1.8) y GMS (registro 0.5±0.1), respectivamente.

Cuando los grupos tratados con el Compuesto 1, 2 y 3 se compararon con laquinimod, no se observó diferencia importante en la actividad. Sin embargo hubo una tendencia que muestra que los grupos tratados . con el Compuesto 1, 2 y.3 fueron más activos que los' grupos de laquinimod.

Como se muestra en la Figura 3, en escala. GMS, el grupo laquinimod (10mg/kg) muestra 48.4% de actividad . comparado con 64.3%, 59.7% y 66.5% de actividad en grupos tratados con el Compuesto 2, 3 y 1 respectivamente. .

DISCUSIONES Los resultados de prueba muestran que laquinimod enriquecido con déuterio reduce la formación de metabolitos, en particular opcionalmente DELAQ deuterado, mientras que mantiene un perfil de tiempo-concentración de plasma similar a aquel de laquinimod no deuterado.

Los resultados de p eba también muestran que laquinimod enriquecido con deuterio son tan activos como o mejores que laquinimod en la inhibición de signos clínicos EAE. '·. Los resultados del estudio permiten desarrollar parámetros de dosificación para laquinimod enriquecido con deuterio.

Ejemplo 5: Evaluación In Vltro de Laquinimod y Compuesto 2 como Inductores de la Expresión de Citocromo P450 en Hepatocitos Humanos Cultivados 1. Introducción El objetivo de este estudio fue investigar los efectos para tratar cultivos primarios de hepatocitos humanos frescos con laquinimod o Compuesto 2 en la expresión de. enzimas CYP.

Los hepatocitos cultivados han probado ser un sistema de prueba confiable para evaluar los efectos inductivos de NCEs . Los hepatocitos pueden aislarse de hígados humanos no transplantables (Bjornsson et al., (2003), The conduct of in vitro and in vivo . drug-drug . interaction studies: a Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA) perspective. Drug Metab Díspos 31:815-832; Mudra and Parkinson, (2001) , . Preparation of hepatocytes, in Curren t Protocols in Toxicology, Volumen 2 (Maines MD ed) unidad 14.2, 13 p, John Wiley and Sons,. Inc., New York, New York) y cultivados en una monocapa confluente (LeClüyse et al., (1994), Formation of extensive canalicular networks by rat hepatocytes cultured in collagen-sandwich configuration . Am J Physiol 266 (Cell Physiol. 35): C1764-C177 ) . Después de dos hasta tres días eh cultivo, estas células recuperan su integridad morfológica, . y el tratamiento con inductores prototípicos resulta en la inducción de enzimas. CYP apropiada (LeClüyse et al., (1996), Cultured rat hepatocytes, in Pharmaceutical Biotechnology ; Vol. 8, Models for Assessing Drug Absorption and Metabolism. . (Borchardt RT, Wilson G and Smith P eds) página' 121-159, Plenum Press, New York; Robertson et al., (2000), In vitro inhibitíon and induction of human hepatic cytochrome P450 enzymes by modafinil. Drug Metab Dispos 28:664-671; adan et al., (2003), Effects of prototypical microsomal enzyme inducers on cytochrome. P450 expression in cultured human hepatocytes. Drug Me ab Dispos 31:421-431). Por esta razón, es, aceptable usar hepatpcitos humanos cultivados para determinar el potencial de . NCEs para provocar la inducción de enzimas CYP.

Este estudio se diseñó para permitir cualquiera de los efectos inductivos de los artículos de prueba para clasificarse con relación a dos inductores CYP relevantes clínicamente y distintos de forma mecánica, particularmente omeprazol (un activador AhR e inductor CYP1A2) y rifampina (un agonista PXR e inductor de CYP3A4) (Parkinson and Ogilvie, (2008),. Biotransformation . .of xenobiotics, in Casarett & Doull's- Toxicology, The Basic Science of Poisons. Séptima Edición, ( laassen CD ed) página .161-304 , The. McGraw Hill Companies, Inc., New York). Para este fin, una preparación de hepatocito.s humanos cultivados de un hígado se trató una vez al día durante tres dí.as consecutivos con DMSO (0.1% v/v, control de vehículo), una de cinco concentraciones de laquinimod (0.01, 0.05, 0.1, 1 o 10 µ?) o Compuesto 2 (0.01, 0.05, 0.1, o 10 µ?) .

Después del tratamiento, las células se incubaron in situ con sustratos marcadores para el análisis de O-desalquilación de fenacetin (marcador para CYP1A2) y 1'-hidroxilación de midazolam (marcador para CYP3A4/5) por LC/MS/MS. Después de la incubación in situ, los mismos hepatocitos de los mismos grupos de tratamiento se cosecharon con TRIzol para aislar ARN, que se. analizó por qRT-PCR para evaluar el efecto de. laqu.inimod y el Compuesto 2. en niveles de mARN CYP1A2 y.CYP3A4. El diseño del estudio,, el sistema de prueba y la selección y concentración de sustratos de sonda usados en este estudio fueron con base en recomendaciones en el Borrador de la. Guia de FDA en Diseño de Estudio-Estudios de¦ Interacción de Fármaco, Análisis de Datos, e Implicaciones para Dosificación y Etiquetado y artículos de revisión FDA actuales (Food and Drug Administration, (2006) , Draft Guidance for Industry: Drug Interaction St.udies—Study Design, Data Analysis, and Implications for Dosing y Labeling, página 55, U.S. Department of Health and Human Services, Rockville, MD; Huang et al., (2008), New. Era in Drug Interactions Evaluation: US Food and Drug Administration Update on CYP Enzymes, Transporters, and the Guidance Process. J Clin Pharmacúl 48: 662-670; Zhang et al., (2009), Predicting Drug-Drug Interactions: An FDA Perspective. The AAPS¦ Journal 11:300-306) y la perspectiva PhRMA en inducción de enzima (Chu et al., (2009), In vitro and . in vivo induction of cytochrome P450: a survey of the current practices and recommendations : a. Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA) perspectice. Drug Metab -'. Dispos 27029 (87pp) doi: 10.1124/dmd.109.0270) . 2. Materiales y métodos 2.1 Materiales 2.1.1 Ensayos de la actividad de Enzima 2.1.2 Otros ensayos 2.1.3 Otros reactivos 2.2 Sistema de Prueba Una preparación de hepatocitos humanos aislados recientemente (de aquí en adelante,, referidos como H971) suministrados por XenoTech, LLC en 16825 West 116th Street, Lenexa,, KS 66219, se trató en este estudio. 2.2.1 Tratamiento de hepatocitos humanos cultivados Los cultivos de hepatocito se trataron diariamente durante tres días consecutivos y cultivaron de acuerdo a SOP L5021.01 (XenoTech, LLC) y métodos previamente descritos (Robertson et al., (2000), In vitro . inhibition and induction of human hepatic cytochrome P450 enzymes by modafinil. Drug Metab Dispos 28:664-671; Madan et al., (2003), Effects of prototypical microsomal enzyme inducers on cytochrome P450 expression in cultured human hepatocytes. Drug Metab Dispos 31:421-431; París et al., (2009), In vitro inhibition and induction of human liver cytochrome P450 (CYP) enzymes by milnacipran. Drug. Metab Dispos 37:2045-2054). Los cultivos se trataron con MdVT complementados (cada pozo se trató con 0.2 mL) que contiene DMSO al 0.1% (vehículo, control negativo), una de cinco concentraciones de laquinímod (0.01, 0.05, 0.1, 1 o 10 µ ) o Compuesto 2 (0.01, .0.05, 0.1, 1 o .10 µ?) , mibefradil (10 µ ). o uno de dos inductores de enzima CYP humanos conocidos, particularmente, omeprazol (100 µ?) y rifampin (10 µ?) , controles positivos. 2.2.2 Aislamiento de ARN de hepatocitos humanos cultivados , purificación y cuantificación Aproximadamente 24 horas después del último tratamiento, los hepatocitos se lisaron en reactivo TRIzol después . de las incubaciones del sustrato marcador in' situ, y los lisados celulares se almacenaron a -75 ±.5°C. Para la preparación de hepatocito humano H971, se aspiró el medio de seis pozos por grupo de tratamiento, y aproximadamente 132 µ?, de TRIzol se agregaron a cada pozo. Los lisados celulares se mezclaron por pipeteado repetido. El ARN total se aisló de los lisados celulares usando el protocolo TRIzol (Invitrogen) y se purificó usando el Mini Kit RNeasy (Qiagen Inc.) de acuerdo a SOP L6161.02. Se determinaron la concentración y calidad de ARN al medir la absorbancia en 260 y 280 nm en un lector de placa BioTek Synergy HT (BioTek Instruments, Inc.) con software KC4 Signature (versión 3.4 Rev 21, BioTek Instruments, Inc.) de acuerdo con SOP L6162.02. Se llevó .a cabo el análisis de integridad de ARN con el Kit de Ensayo ARN 6000 Nano en un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.) de acuerdo con SOP L6162.02. Se preparó el cADN.de hebra sencilla de ARN con la Mezcla Principal RT usando el programa' de termociclado de sistema PCR de Tiempo Real AB 7300 o programa de termociclado de Sistema PCR de Tiempo Real Rápido AB 7900HT (Applied Biosystems) de acuerdo con SOP L6160.04. La Mezcla Principal RT se compone de 10X de solución amortiguadora RT, 25X- desoxiNTPs, 10X . hexámerós aleatorios, Inhibidor de RNasa (20 /]i ) , transcriptasa inversa MultiScribe (50 U/^L) y agua libre de RNasa. La Mezcla Principal RT se agregó a cada muestra de ARN para completar los componentes de la reacción. No se incluyeron controles de plantilla (NTCs) en el análisis. Para las reacciones NTC, se agregó agua libre de RNasa en lugar de la muestra de ARN. Las muestras preparadas de cADN se almacenaron a -20 ± 5°C antes del análisis por qRT-PCR. 2.3 Artículos de Prueba Se preparó laquinimod sodio de acuerdo con los procedimientos descritos en la Patente de E.U.A. No. 6, 077, 851 y el Compuesto 2 se preparó de acuerdo a los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.

Laquinimod Compuesto 2 Almacenamiento del Almacenamiento Almacenamiento articulo de prueba cerrado a 2 ha cerrado a 2 hasta °C) , protegido 8 °C) , .protegido luz y humedad de luz y humedad Cantidad recibida: . 53.09 mg 50.58 mg Masa molecular: 378.78 g/mol (sal 383 g/mol de sodio) 356.80 g/mol (ácido libre) Pureza : 100% 95.4% Apariencia : Polvo blanco Amarillo pálido Solvente usado para Agua estéril Agua estéril de disolución: alta pureza alta pureza Concentración de 0.01, 0.05, 0.1, 1, 0.01, .0.05, 0.1, 1 soluciones madre: 2, 10 y 20 mM y 10 mM Concentración 0.01, 0.05, 0.1, 1, 0.01, 0.05, 0.1, 1 soluciones de 2,. 10 y 20 µ y 10 µ? (solución trabaj o : (solución madre madre diluida en diluida en medio medio MCM MCM complementado; complementado; concentración final concentración de DMSO en medio de final de DMSO en cultivo = 0.1% v/v) medio de cultivo = 0.1% v/v) Almacenamiento de -20 ± 5 °C -20 ± 5 °C soluciones madre: Una solución de laquinimod o Compuesto 2 (10 mM en agua estéril de alta pureza) se preparó al disolver la cantidad apropiada de ya sea laquinimod o Compuesto 2 en agua estéril de alta pureza. Para laquinimod, la solución madre 10 mM se diluyó con agua estéril de alta pureza hasta 2, 1 y 0.1 µ?. Adicionalmente, la solución 1 µ? se diluyó con agua estéril de alta pureza hasta 0.05 y 0.01 mM. Para el Compuesto.2, la solución madre 10 mM luego se diluyó con agua estéril de alta pureza hasta 1 y 0.1 µ?. Adicionalmente, la solución 1 µ? se diluyó con agua estéril de alta pureza hasta 0.05 y 0.01. mM. Las soluciones de laquinimod y Compuesto 2 (todas las concentraciones en mM) . se dividieron en . un número suficiente de alícuotas para usarse individualmente en el estudio y se protegieron de luz con cristalería ámbar o papel aluminio y almacenaron congelados (-20 ± 5°C) con una fecha de expiración de dos meses.

Antes del tratamiento de cada día, una ' alícuota de las soluciones madre de laquinimod y Compuesto 2 se acondicionaron a temperatura ambiente y agitaron suavemente, o colocaron en vórtice en un ajuste bajo. Las soluciones madre de laquinimod (0.01, 0.05, 0.1, 1 y .10 mM) y Compuesto 2 (0.01, 0.05, 0.1., 1 y 10 mM) luego se diluyeron en medio de cultivo celular (dilución 1:1000) y la solución de dosis de trabajo resultante se agregó a los cultivos de hepatocito para dar las. concentraciones finales .de laquinimod' (0.01, 0.05, 0.1,. 1 y 10 µ?) y Compuesto 2 (0.01, 0.05, 0.1, 1 y 10 µ?) dentro de dos horas de dilución (aproximadamente 15 minutos hasta 65 minutos). Un examen visual cualitativo de las soluciones de dosificación y madre se condujo antes de . la aplicación a los . hepatocitos. con objeto de - determinar . ,1a solubilidad en el sistema de prueba.

Justo antes del tratamiento, en cada día del tratamiento., y justo antes de la incubación de los sustratos marcadores, los medios de cultivo usados (medio de dosificación usado.) se recolectaron de los grupos de tratamiento de vehículo, laquinimod y Compuesto . 2. Aproximadamente 150 \iL se recolectaron de cada uñó de los tres pozos, de cada uno de los grupos de tratamientos antes mencionados, y agrupados para cada muestra a un volumen final de aproximadamente 450 \i . Estas muestras del medio usado se analizaron para laquinimod residual,. Compuesto. 2 y el metabolito desetilado (DEL'AQ) . 2.4 Vehículo y controles positivos Los siguientes químicos o vehículos se usaron para hepatocitos de dosificación.

Número de Número de Condiciones de Químico Vehículo eedor catálogo lote almacenamiento* Pureza Prov 079K2305 Temperatura No No D SO D2650 Sigma-Aldrich 089K2310 ambiente aplicable aplicable Omeprazol O104 079K1584 2 hasta 8°C DMSO 99% . Sigma-Aldrich Rifampin. R3501 115K1498 -20 ± 5°C DMSO 100% Sigma-Altírich Temperatura Agua de ibeíradil 5441 026 47O34 ambiente pureza alta 99% Sigma-Aldric a Condiciones de almacenamiento de compuesto claro.

Se disolvieron omeprazol y rifampin. en DMSO de manera que la concentración final de DMSO en el. medio de cultivo fue 0.1% v/v. Se preparó mibefradil en agua estéril de pureza alta. De acuerdo con SOP L5021.01 (XenoTech, LLC) , . las soluciones de trabajo de los controles de vehículo y positivo se prepararon frescos de la solución madre en . menos de dos horas antes del tratamiento en cada día de tratamiento (aproximadamente 15 minutos hasta 65 minutos). 2.5 Condiciones de Ensayo 2.5.1 Incubación ¿n situ de sustratos de sonda con hepatocitos humanos cultivados Las incubaciones de hepatocitos con sustratos de sonda se condujeron de acuerdo con SOP L5041.02. Aproximadamente .24 horas después del último tratamiento, el medio usado se aspiró de los pozos, y cada pozo se enjuagó dos veces con medio de cultivo fresco pre-entibiado (.37 ± 2°C). El medio se aspiró de los pozos y reacciones se iniciaron por adición de 200 µL de medio p.re-entibiado que contiene el sustrato de sonda para cada pozo. Las placas de pozo múltiples de cultivo se colocaron en una cámara de cultivo humidificado (37 ± 1°C en 95% de humedad relativa, 95/5% de aire/C02) , y las incubaciones se llevaron a cabo durante 30 minutos (Tabla 1) . En 30 minutos, , una alícuota (150 pL) de la mezcla de incubación se removió y agregó a- un pozo.de una placa de 96 pozos que contiene 300 L.de reactivo de paro (acetonitrilo) y estándar interno (Tabla 2). Las mezclas se mezclaron completamente y permitieron agitar durante al menos 15 minutos a 2 - 8°C.. Las muestras se centrifugaron a 2000 ? g durante 10 minutos a 2 - 8°C, y las fracciones del sobrenadante se analizaron por LC/MS/MS. Para cada ensayo, las incubaciones se llevaron a . cabo bajo las condiciones indicadas en la Tabla 1.

Tabla 1: Resumen de las condiciones de ensayo para medir la actividad de enz ma CYP microsomal Enzima Sustrato Concentración Solvente de Tiempo de de sustrato sustrato (v/v,. incubación (µ?) concentración. (min) de incubación. final) CYP1A2 Fenacetin 100 Metanol .(0.4%) 30 CYP3A4/5 Midazolam¦ 30 Metanol (0.4%); 30 Volumen de incubación= 200 \i Tabla 2 : Resumen del análisis de metabolito por espectrometría de masa tándem de cromatografía liquida Enzima Metabolito Modo de SOP Estándar interno Concentración monitoreado . ionización3 analítico estándar seguido interna • (ng/mL)b CYP1A2 Acetaminofen ESI- L8120.06 Acetaminofen-d4 300 CYP3A4/5 1'- ESI+ L8170.05 1'- 100 Hidroximidazolam Hidroximidazolam-d^ a Indica el tipo de ionización (esto es, ionización por electrorocio [ESI]) y la polaridad (+ o -) b El valor indica la concentración madre del estándar interno. Esta concentración se diluye 16 veces cuando se agrega a la mezcla de incubación de paro. · Las muestras de. control de calidad y estándares prepararon similarmente con la adición de estándares metabolito auténticos. . 2.6 Métodos analíticos 2.6.1 Métodos LC/MS/MS Todos los análisis se realizaron con métodos LC/MS/MS validados. Los procedimientos usados para el análisis de cada metabolito siguen el método analítico LC/MS/MS aplicable SOPs y .se resumen en la Tabla 2. El equipo MS fue ya sea un instrumento ABI 'Sciex¦ (Applied Biosystems/MDS SCIEX) API 4000 o API 3000 con bombas Shimadzu HPLC y sistemas de automuestreador .

Enzima Metabolito Instrumento Columna HPLC monitoreado APIa CYP1A2 Acetaminofen 3000 . Waters Atlantis dC18 CYP3A4/5. l'-Hidroximidazolam 4000 (5 um, .100 mm x 2.1. . ' mm) a Modelo de sistema LC/MS/MS de Applied Biosystems/MDS SCIEX. b Todas las columnas HPLC se precedieron por una columna Phenomenex Luna C-8 guar (4.0 mm x 2.0 mm) .

Se usaron los estándares de metabolito auténticos, y se usaron metabolitos deuterados como estándares internos en todos los ensayos. Las incubaciones en tiempo cero sirven como blancos. Se condujeron análisis de muestra, integración y reportaje de acuerdo con SOP L8013.02, L8020.02 y L8011.02 (XenoTech, LLC), respectivamente.

Los metabolitos se cuantificaron por referencia a una curva de calibración estándar con base en el cálculo final de una regresión de mínimos cuadrados, lineal, en peso (1/x). El ajuste de regresión fue con base en la relación pico del analito para estándar interno calculado ¦ de ; muestras estándares de calibración, que se prepararon de estándares de metabolito auténticos. Las áreas pico se integraron con sistema de datos Applied Biosystems/MDS SCIEX Analyst, versión 1.4.2. 2.6.2 Análisis de xnARN Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa de acuerdo con SOP L6160.04 (XenoTech, LLC) y el protocolo Applied Biosystems. Cada PCR se realizó en triplicado. Una Mezcla de Cebador se preparó para cada, ensayo de Expresión de Gen. Una Mezcla de Cebador, típica, contiene Mezcla Principal Universal TaqMan (IX), Ensayo de la Expresión del Gen (IX, 900 nM cebadores delanteros e inversos), y agua libre de RNasa.. La Mezcla de Reacción se preparó al agregar la Mezcla de Cebador a cADN. Un porcentaje de muestra (no menos de 10%) incluye NAC.s . (NACs son muestras de ARN que no son transcritas inversas ; y se usan para mostrar, que mARN, ADN rio genómico, es la fuente de señal fluorescente de PCR.) Las reacciones se analizaron en un sistema de detección de secuencia PCR en. Tiempo Real Applied Biosystems (AB 7300 o AB 790???) . La cantidad relativa del cADN objetivo comparada . con la del cÁDN de control (GAPDH) se determinó por el método AACt (Boletín del usuario de Applied. Biosystems #2). La cuantificación relativa mide el cambio en la expresión mARN en una muestra de prueba con relación a . aquella¦ en una muestra de . control (por ejemplo, DMSO) . Este método asume que la eficiencia de la amplificación objetivo 'y la eficiencia de la amplificación de control endógena son aproximadamente iguales. 2.7 Procesamiento de Datos Los datos se procesaron y graficaron con el programa de computadora Microsoft Excel 2003 (Microsoft Inc .). ¦ Las¦ tasas individuales dé reacción de grupos- de tratamiento similares se promediaron, y para estos, grupos con n = 3, se determinaron las desviaciones estándares. Se determinaron los incrementos en veces al dividir la tasa . enzimática para cada grupo de tratamiento por aquella del control de vehículo. El porcentaje de control positivo se calculó con la siguiente ecuación: (actividad de células tratadas del articulo de pmeba - actívtíad (del «ntrol de vehículo) Porcentaje de control positivo = = : : ? 100 (actividad de control positivo - actividad del control de vehículo) Para qRT-PCR, se procesaron datos usando el Software del Sistema de Detección de Secuencia. (SDS) versión 1.4, para Cuantificación Relativa (Applied Biosystems). Este software analiza la expresión del gen. relativa usando . el método .Ct comparativo (AACt), que se refiere a la señal PCR del transcripto objetivo para la señal PCR del objetivo en un control no tratado. Tanto la muestra tratada como las señales de controles no tratadas se normalizan para el control endógeno (GAPDH) , para el cual la expresión no se afecta por el tratamiento y la expresión es constante a lo largo del tejido que se prueba. Los resultados de este . método se expresan como un cambio en veces en expresión con respecto a la expresión del transcripto objetivo en el control .no tratado.

Los cálculos son como sigue: 1. ACt = Ct (objetivo) - Ct (control endógeno) 2. AACt = ACt (muestra tratada) - ACt (control no tratado) 3. Veces de cambio en la expresión = 2-AACt Un algoritmo dentro del software automáticamente remueve los valores extremos del análisis. Los criterios para la aceptación de datos son propiedad de Applied Biosystems. Los valores extremos se consideran para ser pozos con valores. Ct que difieren significativamente de pozos replicados, asociados y típicamente son pozos qüe no amplifican, suficientemente en todo caso.

El nivel de expresión de mARN con relación al control positivo se calculó como sigue: . , . . . [(cambio en veces en la muestra tratada)-1] A„n Porcentaje de control positivo = ? 100 [(cambio en veces en el control positivo)-1] 3. Resultados y discusión Los efectos de tratar hepatocitos humanos con laquinimod y Compuesto 2 en actividad de enzima CYP y niveles de mARN se muestran en las Tablas '3-7. A menos que se señale de otra manera, los datos en las figuras ' y tablas se presentan como la desviación estándar ± media de . datos de incubaciones en triplicado de una preparación humana, redondeando a tres figuras importantes. Los incrementos en veces promedio se resumen en. las Tablas 4 y 6. El incremento . en. veces se presenta ya sea como fracción de control o como incremento en veces sobre el control, donde el control se refiere a las muestras tratadas con vehículo correspondientes. El incremento en veces se redondea a tres figuras importantes. La comparación del artículo de prueba, para el inductor prototípico (por. ciento de control positivo) se muestra en las Tablas 5 y 7, y se redondeó a tres figuras importantes..

Tabla 3 : Actividad CYP : Los efectos de tratar hepatocitos humanos cultivados con laquinimod, Compuesto 2 o inductores prototipicos en actividad de enzima de citocromo P450 (CYP) n situ Actividad de enzima (pmol/mg proteina/min) a Tratamiento Concentración O-desalquilación 1 ' -hidroxilación de de fenacetin midazolam (CYP1A2) (CYP3A4/5) Sulfóxido 0.1% (v/y) de dimetilo 2.99 + 0.13 0.195 ± 0.011 Laquinimod 0.01 µ? 25.2 ± .0.8 0.180 ± 0.023 Laquinimod 0.05 uM . 54.0 ± 4.5 0.161 ± 0.013 Laquinimod 0.1 µ? 65.1 + 1.9 0.151 ± 0.002 Laquinimod 1 µ? 131 ± 12 0.106.+ 0.004. ' Laquinimod 10 µ? 183 ± ? 0.0957 + 0.0067 Compuesto 2 0.01 µ? 22.1 ± 2.7 0.179 ± 0.006 Compuesto 2 0.05 µ? 31.6 ± 2.6. 0.151 ± 0.009 Compuesto 2 0.1 µ?. 48.2 ± 2.4 0.140 ± 0.010 Compuesto 2 1 µ? 90.8 ± 11.5 0.109 ± 0.010 Compuesto 2 10 µ? 180 ± 8 0.101 ± 0.003 Omeprazol 100 µ? 84.9 ± 5.4 ?? Mibefradil 10 µ -. 11.3· ± 2.1 ?? Rifampin 10 µ? ?? 0.941 ± 0.019 Los valores ssoonn la ddeessvviiaacciióónn eessttáánnddaarr ±± mmeeddiiaa ddee las determinaciones en triplicado de la preparación de hepatocito humano H971 que redondea a tres figuras importantes.

Tabla : Incremento en veces de la actividad CYP : Los efectos de tratar hepatocitos humanos cultivados con laquinimod, Compuesto 2 o inductores prototipicos en actividad de enzima de citocromo (CYP) P450 In situ Incremento en veces 1 '- Tratamiento Concentración Odesalquilación hidroxilación de fenacetin de midazolam (CYP1A2) (CYP3A4/5) Sulfóxido de 0.1% (v/v) dimetilo 1.00 1.00 Laquinimod 0.01 uM 8.43 0.92 Laquinimod 0.05 µ? 18.06 0.82 Laquinimod 0.1 µ? 21.75 0.78 Laquinimod 1 µ 43.79 0.54 Laquinimod 10 µ 61.02 0.49 Compuesto 2 0.01 µ? 7.39 0.91 Compuesto 2 0.05 µ? 10.54 0.77 Compuesto 2 0.1 µ? 16.12 0.72 Compuesto 2 1 µ? 30.36 0.56 Compuesto 2 10 µ? 60.21 . 0.51 Omeprazol 100 µ? 28.38 ?? Mibefradil 10 µ? 3.76 ?? Rifampin 10 µ? ?? 4.82 a Los valores son los · resultados de la preparación de hepatocito humano H971 que rodea; a tres figuras importantes.

Tabla 5: Control positivo por ciento de la actividad CYP: Los e ectos de tratar hepatoc tos humanos cultivados con laquinimod, Compuesto 2 o inductores prototípicos en la actividad de enzima de citocromo (CYP) P450 ín situ Por ciento del control positivo" O-desalquilación Midazolam Tratamiento Concentración Fenacetin 1 ' -hidroxilación (CYP1A2) (CYP3A4/5) Sulfóxido de dimetilo 0.1% (v/v) ? 0 Laquinimod 0.01 µ? 27.1 . -2.04 Laquinimod 0.05 µ? . 62.3 -4.63 Laquinimod 0.1 µ? 75.8 -5.89 Laquinimod 1 µ? 156 -12.0 Laquinimod 10 µ? 219 -13.4 Compuesto 2 0.01 µ 23.3 -2.24 Compuesto 2 0.05'µ? 34.9 . -5.94 Compuesto 2 0.1 µ? 55.2 -7.46 Compuesto 2 1 µ? 107 · -11.5 Compuesto 2 10 µ? 216 -12.7 Omeprazol 100 µ? 100 ND Mibefradil 10. µ? 10.1 ND Rifampin 10 µ?. ND 1 0 a Los valores son los resultados de la preparación de hepatocito humano H971 que rodea. a tres figuras importantes.

ND No se determina.

Para CYP1A2, el control positivo es omeprazol y el control de vehículo es DMSO.

Para CYP3A4/5, el control positivo es rifampin y el control de vehículo es DMSO.

Tabla 6: Incremento en veces de mARN: Los efectos de tratar hepatocitos humanos cultivados con laquinimod, Compuesto 2 o inductores prototipicos en niveles de mARN de citocromo microsomal (CYP) P450 como se determina por qRT-PCR (después las incubaciones ln situ) Incremento en veces3 Tratamiento Concentración CYP1A2 CYP3A4 Sulfóxido de dimetilo 0.1% (v/v) 1.00 1.00 Laquinimod 0.01 µ? 4.22 0.621.

Laquinimod 0.05 µ? 7.90 0.347 .

Laquinimod 0.1 µ? 9.50 0.427 Laquinimod 1 µ? 16.8 0.286 Laquinimod • 10 µ? 20.5 0.636 Compuesto 2 0.01 µ? 2.84 0.437 Compuesto 2 0.05 µ? 4.98 0.428 ¦ Compuesto 2 0.1 µ? 7.20 .0.339 Compuesto 2 1 µ? 13.1 0.252 Compuesto 2 10 µ? 24.3 0.689 Omeprazol 100 µ? 8.58 NT Mibefradil 10 µ? 0.423 NT Rifampin 10 µ? NT 4.63 Los valores son los resultados de¦ la preparación de hepátocito humano H971 que rodea a tres figuras importantes.

NT No se prueba por el diseño de estudio.

Tabla 7 : Control positivo en por ciento de mARN: Los efectos de tratar hepatocitos humanos cultivados con laquinimod, Compuesto 2 o inductores prototipicos en niveles de mARN de citocromo microsomal (CYP) P450 como se determina por qRT-PCR (después de las incubaciones In situ) Control positivo en porciento3 Tratamiento Concentración CYP1A2 CYP3A4 Sulfóxido de dimetilo .0.1% (v/v) 0 0 Laquinimod 0.01 µ? · 42.5 -10.4 Laquinimod 0.05 µ? 91.1 -18.0 Laquinimod 0.1 µ? 112 -15.8 Laquinimod. 1 µ? . 209 -19.7 Laquinimod 10 µ? - . 257 -10.0 Compuesto. 2 0.01 µ? ' 24.2 -15.5 Compuesto 2 0.05 µ? 52.5 -15.8 Compuesto 2 0.1 µ? 81.7 . -18.2 Compuesto 2 1 µ? 159 -20.6 Compuesto 2 10 µ? . 307 -8.57 Omeprazol 100 µ? 100 ND Mibefradil 10 µ?. -7.61 ND .

Rifampin 10 µ? ND . 100 a Los valores son los resultados de preparación de hepatocito humano H971 que rodea a tres figuras importantes.

ND No se determina Para CYP1A2, el control positivo es omeprazol y el control de vehículo ..es DMSO.

Para CYP3A4, el . control positivo es rifampin y el control de vehículo es DMSO. 3.1 Viabilidad y morfología de hepatocitos humanos cultivados Al momento del aislamiento la viabilidad de la preparación de hepatocito humano fue 70.9%. Durante y después de periodo de adaptación de 72 horas, el cultivo se observó diariamente por microscopía de luz y juzgó para ser morfológicamente normal con confluencia adecuada para tratamiento con artículos de control y prueba. Dentro de 24 horas después , del tratamiento final, los hepatocitos se fotografiaron para documentar su integridad morfológica . y cualquiera de. los signos públicos de toxicidad de los artículos de prueba. Las fotomicrografías representativas se mantienen en la Instalación de Prueba. Estas fotomicrografías muestran que, en general, los hepatocitos humanos tratados con vehículo (DMSO), laquinimod y Compuesto 2 o inductores CYP conocidos muestran morfología de hepatocito normal. Antes de y durante el tratamiento, los cultivos de hepatocito humano formados de monocapas confluentes con pocos espacios intercelulares; fueron cuboidales y contienen membranas celulares intactas y citoplasma granular con uno o dos núcleos centralmente ubicados. El tratamiento de cultivo de hepatocito humano . H971 con laquinimod, Compuesto 2 o laquinimod y mibefradil resulta sin cambios en¦ la morfología celular . 3.2 El efecto de laquinimod y Compuesto 2 en actividad CYP1A2 humana y niveles de mABN Determinación de actividad de O-desalquilasa de fenacetin (CYP1A2) En hepatocitos humanos cultivados, la O-desalquilación de fenacetin se cataliza por CYP1A2, que es la enzima CYP inducible de omeprazol principal. Los efectos de tratar hepatocitos. humanos cultivados con laquinimod o Compuesto 2 en actividad de O-desalquilasa de fenacetin (CYP1A2) in situ se muestran en la Tabla 3 y resumen en la Tabla 4. El tratamiento de hepatocitos humanos cultivados una vez al dia durante tres días consecutivos con omeprazol provoca, en promedio, un incremento de 28.4 veces . en la actividad de 0-desalq.uiloasa (CYP1A2) de fenacetin.

El tratamiento de cultivo de hepatocito H971 con laquinimod (hasta 10 µ?) provoca un incremento dependiente de concentración, hasta 61.0 veces en actividad CYP1A2 comparada con el control de vehículo. En las concentraciones probadas (0.01 µ? hasta. 10 µ?) , laquinimod fue 21.7% hasta 291% tan efectivo como el omeprazol de control positivo, al inducir la actividad CYP1A2. Además, el · tratamiento, una vez, al día para tres días consecutivos con mibefradil solo resulta en un incremento de 3.76 veces en la actividad CYP1A2.

Adicionalmente, el tratamiento de cultivo.de hepatocito H971 con el Compuesto 2 (hasta 10 µ?) provoca un incremento dependiente de concentración hasta 60.2 veces en la. actividad CYP1A2 comparada con el control de vehículo. En las concentraciones probadas (0.01 µ? hasta 10 uM) , el Compuesto 2 fue 23.3% hasta 216% .tan efectivo como el omeprazol de control positivo, al. inducir la actividad CYP1A2.

Determinación de niveles de mARN de CYP1A2 Los efectos de tratar los hepatocitos humanos cultivados con laquinimod y Compuesto 2 en la expresión mARN CYP1A2 se muestran en la Tabla 6. El tratamiento de hepatocitos humanos cultivados una vez al día durante tres días consecutivos con omeprazol provoca, . en promedio, un. incremento de 8.58 veces en niveles de mARN de CYP1A2.

Similar a la actividad CYP1A2, el tratamiento de cultivo de hepatocito H971 con laquinimod (hasta 10 µ?) provoca .ún incremento dependiente ' de la concentración hasta 20.5 veces en niveles, de mARN CYP1A2 comparados, con el control de vehículo. En las concentraciones probadas (0.01. µ? hasta 10 µ ) , laquinimod fue 42.5% hasta 257% tan efectivo como el omeprazol de control positivo, al inducir los' niveles de mARN CYP1A2. Contrario a la actividad CYP1A2, el tratamiento, una vez al día durante .tres días consecutivos con mibefradil solo provoca una disminución de 57.7%, en los niveles de mARN de CYP1A2, comparados con el control de vehículo.

Adicionalment.e, el tratamiento de cultivo de hepatocito H971 con el Compuesto 2 (hasta 10 µ?) provoca un incremento dependiente de concentración, hasta 24.3 veces en los niveles mARN de CYP1A2 comparados con el control de vehículo. En las concentraciones probadas (0.01 µ? hasta 10 µ?) , el Compuesto 2 fue 24.2% hasta 307% tan efectivo como el omeprazol de control positivo, al inducir los niveles mARN de CYP1A2. 3.3 El efecto de laquinimod y Compuesto 2 en actividad CYP3A4/5 humana y niveles mARN de CYP3A4 Determinación de la actividad de 1 ' -hidroxilasa midazolam (CYP3A4/5) En hepatocitos. humanos cultivados, la 1 ' -hidroxilación de midazolam se cataliza por CYP3A4/5. El CYP3A4 es la enzima CYP inducible de rifampin principal. Los efectos de tratar hepatocitos humanos cultivados con laquinimod y Compuesto 2 en actividad de 1 ' -hidroxilasa de midazolam (CYP3A4/5) in situ se muestran en la Tabla 3 y resumen en la Tabla 4.. El tratamiento de hepatocitos humanos cultivados una vez al día durante tres días consecutivos con rifampin provoca un incremento (4.82 veces) en actividad dé 1 ' -hidroxilasa de midazolam.

El tratamiento, de , cultivo de hepatocito H971 con ya sea laquinimod (hasta 10 µ?) o Compuesto 2 (hasta 10 µ ) provoca una disminución dependiente de concentración en la actividad CYP3A4/5 por 50.9% y 48.2%, respectivamente, comparada con el control de vehículo..

Determinación de los niveles mAB de CYP3A4 Los efectos de tratar hepatocitos humanos cultivados con laquinimod y Compuesto 2 en la expresión mARN GYP3A4 se muestran en la Tabla 6. El tratamiento de hepatocitos humanos cultivados una vez al día durante tres días consecutivos con rifampin provoca un incremento 4.63 veces en los niveles mARN de CYP3A .

Similar a la actividad CYP3A4/5, el tratamiento" de cultivo de hepatocito H971 con ya sea . laquinimod (hasta 10 µ ) o Compuesto 2 (hasta 10 µ?) provoca una . disminución dependiente de concentración por 36.4% y 31.1% comparado con el control de vehículo, respectivamente en los. niveles mARN de CYP.3A4.

Determinación del Compuesto 2 o laquinimod para relación DELAQ La concentración del Compuesto 2, laquinimod y DELAQ se midieron en alícuotas de medio usado para medios recolectados justo antes del tratamiento, en cada día de tratamiento, y justo antes de la incubación de los sustratos marcadores.. La concentración de DELAQ formados fue aproximadamente 2 veces superior en el medio laquinimod comparado con el medio del Compuesto 2. En las · concentraciones del tratamiento' 10 µ? de ya sea el Compuesto 2 o laquinimod, la relación del Compuesto 2 : DELAQ fue en promedio, 40.9 mientras que la relación de laquinimod: DELAQ fue en promedio, 15.7. Esto representa un incremento aproximadamente de 3 veces en la formación de DELAQ de laquinimod comparado con el Compuesto 2 y se explica por la presencia, de deuterio en la porción de etilo que resulta en N-desetilación lenta. 4. Conclusiones En conclusión,' bajo condiciones donde los inductores prototipicos provocan incrementos anticipados y apropiados en la actividad CYP y niveles mARN, el tratamiento con hasta 10 µ? de laquinimod. o Compuesto 2 (análogo deuterado de laquinimod) provoca incrementos dependientes de la concentración similares en la actividad CYP1A2 y niveles mARN y una disminución dependiente de la concentración en la actividad CYP3A4/5 y niveles mARN de CYP3A4, pero se observó una diferencia aproximada de 3 veces en el Compuesto 2 : DELAQ para la relación laquinimod: DELAQ.

Claims (30)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito, la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar un. sujeto humano que padece de una enfermedad autoinmunitaria caracterizado porque comprende administrar al sujeto humano 0.2 mg - 2.0 mg por dia de un en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y al menos uno de, R1-R10 es D, -o -una sal farmacéuticamente aceptable¦ del mismo, efectiva para tratar el sujeto.

2. El método de conformidad con. la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto enriquecido con deuterio es o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto enriquecido cón deuterio es , o . o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

4 El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto enriquecido con deuterio es o una sal¦ farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque, la enfermedad autoinmunitaria es Esclerosis Múltiple, Lupus Eritematoso Sistémico, nefritis por lupus, artritis por lupus, Enfermedad de Crohn o artritis Reumatoide.

6. El método de 'conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la enfermedad autoinmunitaria es Esclerosis Múltiple.

7. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la administración del compuesto enriquecido con deuterio es más. efectiva para tratar la enfermedad autoinmunitaria que la administración de una cantidad molar · equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio .

8. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada formada en el sujeto humano durante la administración del compuesto enriquecido con deuterio se reduce, comparado con el nivel : de 5-cloro-4-hidroxí-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida formada cuando una cantidad molar equivalente . de laquinimod no enriquecido con deuterio se administra al sujeto humano.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida ..opcionalmente deuterada se reduce por al menos 5.0%.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-f.enil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada se reduce por al menos 90%.

11. Un método para inducir formación reducida de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada en un sujeto humano caracterizado porque comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva, de un compuesto enriquecido con deuterio que tiene la estructura: en donde cada uno de- R1-R10 es independientemente ' H o D, y al menos uno de R1-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la formación reducida es relativa ' a la formación de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida durante la administración de una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada se reduce por al menos 50%, comparado con el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-l, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida formada cuándo una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio se administra al sujeto humano.

. . 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-l, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada se reducé por al menos 90%.

14. Una mezcla de al menos dos compuestos enriquecidos con deuterio, cada compuesto caracterizado porque tiene la estructura: en. donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o D, y cada uno de al menos dos compuestos enriquecidos . con deuterio contiene D en un R1-R10 diferente, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

15. La mezcla de conformidad con la' reivindicación 14, caracterizado porque uno de al menos dos compuestos enriquecidos con deuterio tiene la estructura: o sales farmacéuticamente aceptables de los. mismos .

16. La mezcla de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque uno de al menos dos compuestos enriquecidos con deuterio tiene la estructura: o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.'

17. La. mezcla desconformidad con la: reivindicación 14, caracterizada porque . uno de al menos dos compuestos enriquecidos con deuterio tiene la estructura: o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

18. La composición farmacéutica caracterizada porque comprende la mezcla .de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 14-17, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

19. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una mezcla dé: a) laquinimod enriquecido con deuterio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; b) al menos un portador farmacéuticamente aceptable; y c) un. compuesto que tiene la estructura: presente . en una cantidad que es menos del; 0.1% con base en el peso combinado del compuesto y laquinimo.d , enriquecido con deuterio.

20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19., caracterizada porque el compuesto está presente en una cantidad de menos de 3 ppm con base, en el peso combinado del compuesto y laquinimod enriquecido con deuterio .

21. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el compuesto está presente en una cantidad de menos de 2 ppm con base en el peso combinado del compuesto y laquinimod enriquecido con deuterio.

22. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de una. de las reivindicaciones 19-21, caracterizada porque el laquinimod enriquecido- con deuterio tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente. ? o D, y al menos uno de R1-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del.mismo.

23. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque en el laquinimod enriquecido con deuterio, cada uno de R1-R5 es D y cada uno de R6-R10 es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

24. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque en el laquinimod enriquecido con deuterio, cada uno de R1-R5 es; H y cada uno de R6-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo .

25. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque en el laquinimod enriquecido con deuterio, cada uno de R1-R10 es D, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

26. La composición farmacéutica de conformidad, con cualquiera de unas de las reivindicaciones 18-25 caracterizada porque está en la forma de un comprimido.

27. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 18-26, caracterizada porque cuando se ingiere por un sujeto humano, proporciona un nivel reducido de 5-clóro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida. . opcionalmente deuterada formada en el sujeto humano, con relación al nivel de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida formada cuando una cantidad molar equivalente de laquinimod no enriquecido con deuterio se ingiere por el sujeto humano.

28. El proceso para preparar la composición . farmacéutica de conformidad con cualquiera de unas de las reivindicaciones 18-27, caracterizado porque comprende: a) obtener un lote de laquinimod enriquecido con deuterio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; b) determinar por un aparato la cantidad total de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada presente en el lote .de laquinimod enriquecido con deuterio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y c) preparar la composición farmacéutica usando el lote sólo si el lote se determina que tiene menos del 0.1% en peso de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1/ -dihidroquinolin-3-carboxamida Opcionalmente deuterada.

29. El proceso para producir un lote validado de la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 18-27 para distribución caracterizado porque comprende: a) obtener un lote de la composición farmacéutica; ¦ b) determinar por un aparato la cantidad total de 5-cloro-4-hidroxi-l-meti1-2-oxo-N-fenil-1 , 2-dihidroqüinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada en una muestra del lote; c) . validar el lote para distribución, sólo si la muestra del lote se determina que contiene menos del. 0.1% en peso de 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-l, 2-dihidroquinolin-3-carboxamida opcionalmente deuterada con relación al peso combinado de laquinimod y 5-cloro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-N-fenil-1, 2-dihidroquinolin-.3-carboxamida opcionalmente deuterada.

30. Un compuesto enriquecido con deuterio que tiene la estructura: en donde cada uno de R1-R10 es independientemente H o :D, y al menos uno d . R1-R10 es D, o .una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en. una cantidad de 0.2 mg . - 2 mg por día en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto humano .