MX2012015028A

MX2012015028A - Metodo para diagnosticar una respuesta al tratamiento en sujetos con esclerosis multiple.

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Publication number: MX2012015028A
Application number: MX2012015028A
Authority: MX
Inventors: Richard A Rudick; Richard M Ransohoff
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-06-13
Also published as: CR20130018A; MA34381B1; CA2802999A1; CO6670574A2; EP2585100A4; TN2012000607A1; WO2011159970A3; WO2011159970A2; SG186393A1; ZA201300019B; ECSP13012390A; JP2013534419A; EP2585100A2; AU2011268223A1; CL2012003571A1; EA201370003A1; DOP2012000316A; PH12012502501A1; US20130089519A1; CN103140235A

Abstract

Se provee un método para determinar la eficiencia del tratamiento con interferón beta (IFN-ß) en un sujeto con esclerosis múltiple. Un paso del método puede incluir la obtención de una muestra biológica tomada del sujeto. Después de obtener la muestra biológica, puede determinarse el nivel de expresión de al menos un gen regulado por interferón (IRG) y/o su variante. Una expresión aumentada o reducida del al menos un IRG y/o su variante en comparación con un control puede indicar que el sujeto responderá mal al tratamiento con interferón beta.

Description

MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UNA RESPUESTA AL TRATAMIENTO EN SUJETOS CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE Solicitud relacionada La presente solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisoria estadounidense con serie N.° 61/356.265, presentada el 18 de junio de 2010, cuyo contenido se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Campo técnico La presente invención se refiere, en general, a métodos para diagnosticar una respuesta al tratamiento en sujetos que sufren de esclerosis múltiple (EM) , y en forma más particular, a un método para diagnosticar una respuesta al tratamiento con interferón beta en sujetos con EM sobre la base de marcadores genéticos diferencialmente expresados.

Antecedentes de la invención La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central . Los estudios de asociación de todo el genoma han involucrado genes del sistema inmunitario en la predisposición a la enfermedad de EM, que se corresponde con la función de mecanismos inmunitarios en la patogenia de la EM. Se ha involucrado una biodisponibilidad mayor del interferón (IFN) de tipo 1 en la susceptibilidad o gravedad de diversos trastornos autoinmunes . Se ha detectado una expresión mayor de genes regulados por IFN de tipo 1 ("IRG" por sus siglas en inglés) en alrededor del 50% de los pacientes con EM sin tratar, y esto ha sido interpretado como la distinción de un subgrupo de pacientes con una inmunidad innata aumentada.

Los interferones de tipo 1 y 2 regulan grupos superpuestos de IRGs. Si bien el IFN de tipo 1 es un mediador cardinal de inmunidad innata, el IFN de tipo 2 participa tanto en la inmunidad innata como en la adquirida. Aunque los estudios clínicos de IFN gama como agente terapéutico para EM no resultaron exitosos, se continuó con los estudios clínicos del IFN de tipo 1 y se han aprobado varios productos de interferón beta recombinante para EM. En los estudios, el interferón beta redujo los índices de remisión en un 30% e inhibió la formación de lesión cerebral visualizada en imágenes por resonancia magnética. Sin embargo, las respuestas clínicas variaban de individuo a individuo y el o los mecanismos de acción no fueron demasiado conocidos.

En análisis de datos post-hoc de uno de los tres estudios en etapas, alrededor del 20% de los receptores de interferón beta fueron identificados como sujetos que respondieron mal al tratamiento o que tuvieron una respuesta pobre (RP) . En los últimos tiempos, se ha categorizado el estado de respuesta pobre como farmacológico (es decir, con relación a la producción de anticuerpos que neutralizan el interferón beta) o farmacogenómico (es decir, asociado con las variantes genéticas en receptores de interferón beta o componentes de señalización) . Estos pacientes tienen en común una biodisponibilidad reducida al interferón beta. A pesar de esta claridad mecanicista, dichos pacientes constituyen una minoría de RPs. En la tercera y más grande de las categorías, la RP al interferón beta puede estar relacionada con la naturaleza de la respuesta al interferón beta, que puede ser informativa respecto de la patogenia de la EM en un subgrupo de pacientes. Los análisis de expresión transversal sobre la base de micromatrices y los estudios de genes candidato individuales avalan este concepto.

Sin embargo, todas estas variables clínicas y radiológicas están limitadas por su capacidad de diagnosticar el desenlace clínico de la enfermedad, en especial, durante las etapas iniciales de la EM. Esta incertidumbre para predecir la consecuencia de la enfermedad significa que algunos pacientes con EM que necesitan un tratamiento intensivo no lo reciben, si bien otros reciben un tratamiento innecesario y como resultado de ello, son expuestos al riesgo de efectos secundarios sin una base lógica .

Extracto de la invención La presente invención se refiere, en general, a métodos para diagnosticar una respuesta al tratamiento en sujetos que sufren de esclerosis múltiple (EM) , y en forma más particular, a un método para diagnosticar una respuesta al tratamiento con interferón beta en sujetos con EM sobre la base de marcadores genéticos diferencialmente expresados. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se provee un método para determinar la eficiencia del tratamiento con interferón beta en un sujeto con EM. Un paso del método puede incluir la obtención de una muestra biológica tomada de un sujeto. Después de obtener la muestra biológica, puede determinarse el nivel de expresión de al menos un gen regulado por interferón (IRG) o su variante. Una expresión aumentada o reducida del al menos un IRG o su variante en comparación con un control puede indicar que el sujeto responderá mal al tratamiento con interferón beta.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para detectar un agente que pueda ser usado para el tratamiento de la EM. Un paso del método puede incluir la provisión de una población de monocitos de sangre periférica ("PBMC" por sus siglas en inglés) de un sujeto con EM que responde mal al tratamiento con interferon beta. Después, puede administrarse un agente a los PBMCs. El nivel de expresión de al menos un IRG o su variante puede luego ser determinado en uno o más de los PBMCs.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para el tratamiento de un sujeto con EM. Un paso del método puede incluir la obtención de una muestra biológica tomada de un sujeto. Después de obtener la muestra biológica, puede determinarse el nivel de expresión de al menos un IRG o su variante. Si la expresión de uno o más del al menos un IRG o su variante aumenta o disminuye en comparación con un control, el sujeto puede recibir una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente además de interferon beta.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para el tratamiento de un sujeto con EM. Un paso del método puede incluir la obtención de una muestra biológica tomada de un sujeto. Después de obtener la muestra biológica, puede determinarse el nivel de expresión de al menos un IRG o su variante. Si la expresión del al menos un IRG o su variante aumenta o disminuye en comparación con un control, el sujeto puede recibir una cantidad terapéuticamente efectiva de natalizumab.

Breve descripción de los dibuios Las características anteriores y otras características de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en el arte que tienen relación con la presente invención a partir de la lectura de la siguiente descripción con referencia a los dibujos que acompañan, donde: la Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra un método para determinar la eficiencia del tratamiento con interferón beta en un sujeto con esclerosis múltiple (EM) de acuerdo con un aspecto de la presente invención; la Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un método para detectar un agente que puede ser usado para el tratamiento de la EM de acuerdo con otro aspecto de la presente invención; la Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un método para el tratamiento de un sujeto con EM de acuerdo con otro aspecto de la presente invención; la Figura 4 es un diagrama de dispersión que muestra la relación entre los índices de inducción ("IR" por sus siglas en inglés) para OASL calculados por RCP cuantitativa en tiempo real comparado con una macromatriz (se muestra una escala de log2 para los ejes X e Y) ; la Figura 5 es un diagrama que muestra la cantidad de genes regulados por interferón (I Gs) en la primera inyección de interferón beta. Las barras representan sujetos individuales en la inyección inicial de interferón beta. La altura de las barras muestra la cantidad de IRGs con IRs > 2,0. Los pacientes que responden mal al tratamiento están sombreados; la Figura 6 muestra una serie de diagramas de dispersión para 85 pacientes con respuesta molecular de interferón beta en los valores de referencia (eje X) y a los seis meses (eje Y) . Para cada sujeto, se muestra el IR para cada uno de los 166 genes en los dos puntos temporales. La variabilidad de la respuesta molecular entre los dos puntos temporales queda indicada por la desviación de la línea diagonal en cada diagrama; la Figura 7 es una serie de diagramas de dispersión para 10 pacientes individuales que muestra una respuesta coherente durante 24 meses. Se seleccionaron en forma aleatoria 10 pacientes con EM (5 que respondían bien y 5 que respondían mal al tratamiento) con datos de macromatriz en los valores de referencia, a los 6 meses, y a los 24 meses con el fin de evaluar la coherencia de la respuesta durante 2 años. Las primeras 3 columnas corresponden a pacientes que respondieron mal al tratamiento, y las últimas 3 columnas corresponden a pacientes que respondieron bien al tratamiento. Las columnas 1 y 4 comparan respuestas en los valores de referencia y a los 6 meses. Las columnas 2 y 5 comparan respuestas a los 6 y a los 24 meses. Las columnas 3 y 6 comparan respuestas en los valores de referencia y a los 24 meses; las Figuras 8 A y B son una serie de histogramas que muestran una respuesta a IRG exagerada en pacientes que respondieron mal al tratamiento en una primera inyección de interferón beta (Figura 8A) en una inyección de ínterferón beta a los 6 meses (Figura 8B) (los histogramas representan el IR- para todos los genes en todos los pacientes en el grupo que tuvo buena respuesta al tratamiento y en todos los pacientes en el grupo que tuvo mala respuesta al tratamiento) ; y la Figura 9 es un diagrama que muestra curvas de rendimiento diagnóstico para el volumen de lesión ("LV" por sus siglas en inglés) de los valores de referencia T2 , los 25 mejores IRGs en los valores de referencia, y el volumen de lesión de los valores de referencia T2 + los 25 mejores IRGs. La curva de rendimiento diagnóstico evalúa la capacidad de los 25 IRGs, medida en los valores de referencia, para predecir una respuesta pobre medida 6 meses después, y compara la capacidad de diagnóstico con el volumen de lesión de los valores de referencia T2.

Descripción detallada Todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente solicitud tienen los significados de uso común en la técnica a menos que se lo especifique de otra manera. Las definiciones provistas en la presente tienen el propósito de facilitar la comprensión de ciertos términos empleados con frecuencia en la presente y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

En el contexto de la presente invención, las expresiones "control" o "muestra control" pueden hacer referencia a cualquier muestra de un sujeto o muestra aislada que sirva de referencia .

De la forma empleada en la presente, el término "ARNm" puede hacer referencia a transcripciones de un gen. Las transcripciones pueden incluir ARN, como ser ARNm maduro que se encuentre preparado para la traducción y/o en varias etapas del procesamiento de transcripción (por ejemplo, proceso de corte y empalme y degradación) .

De la forma usada en la presente, las expresiones "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" pueden hacer referencia a una cadena de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos ya sea monocatenaria o bicatenaria, y puede abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales que funcionan de manera similar como nucleótidos que se presentan en forma natural .

De la forma usada en la presente, los términos "polipéptido" y "proteína" pueden hacer referencia a una molécula que comprende más de una subunidad de aminoácidos. Un polipéptido puede ser una proteína entera o puede ser un fragmento de una proteína, como ser un oligopéptido o un oligopéptido (sic) . El polipéptido también puede comprender modificaciones a las subunidades de aminoácidos como ser metilación o acetilación.

De la forma empleada en la presente, el término "sonda" puede hacer referencia a un oligonucleótido capaz de unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria a través de -uno o más tipos de enlaces químicos, usualmente a través de apareamiento complementario de bases. Por ejemplo, una sonda de oligonucleotidos puede incluir bases naturales (es decir, A, G, C o T) o modificadas (por ejemplo, 7-deasaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases en una sonda de oligonucleótidos pueden estar unidas por un enlace diferente de una unión de fosfodiéster, siempre que no interfiera con la hibridación.

De la forma empleada en la presente, el término "cuantificación" al ser usado en el contexto de los niveles de transcripción de cuantificación de un gen puede hacer referencia a una cuantificación absoluta o relativa. Una cuantificación absoluta puede lograrse a través de la inclusión de una o más concentraciones conocidas de uno o más ácidos nucleicos diana (por ejemplo, ácidos nucleicos control) y hace referencia a la intensidad de hibridación de desconocidos con los ácidos nucleicos diana conocidos (por ejemplo, a través de la generación de una curva estándar) . En forma alternativa, puede lograrse una cuantificación relativa a través de la comparación de señales de hibridación entre dos o más genes, o entre dos o más tratamientos para cuantificar los cambios en intensidad de hibridación y, por consiguiente, en nivel de transcripción.

De la forma empleada en la presente, la frase "expresión de genes relativa" o "expresión relativa" con referencia a un gen, puede indicar la abundancia relativa del mismo producto de expresión de genes, por lo general, ARNm, en diferentes células o tipos de tejidos.

De la forma usada en la presente, el término "sujeto" puede hacer referencia a cualquier animal, incluso, sin que la enumeración sea taxativa, seres humanos y animales no humanos (por ejemplo, roedores, artrópodos, insectos, peces) , primates no humanos, ovinos, bovinos, rumiantes, lagomorfos, porcinos, caprinos, equinos, caninos, felinos, aves, etc.), que fueran los receptores de un diagnóstico particular y/o una aplicación terapéutica particular.

De la forma usada en la presente, la expresión "muestra biológica" puede hacer referencia a una muestra corporal obtenida de un su eto o de sus componentes. Por ejemplo, la muestra corporal puede incluir una "muestra clínica", es decir, una muestra que derive de un sujeto. Dichas muestras pueden incluir, sin que la enumeración sea taxativa: fluidos corporales periféricos, que pueden contener células o no, por ejemplo, sangre, orina, plasma, mucosidad, bilis, jugo pancreático, fluido sobrenadante, y suero; tejido o muestras de biopsia de aguja fina; y muestras de archivo con consecuencias, diagnósticos y/o tratamientos conocidos. Las muestras corporales también pueden incluir secciones de tejidos, como ser secciones congeladas tomadas con fines histológicos. La expresión "muestra biológica" también puede abarcar cualquier material que derive del procesamiento de una muestra corporal . Los materiales derivados pueden incluir, sin que la enumeración sea taxativa, células (o su progenie) aisladas de la muestra biológica, proteínas y/o moléculas de ácido nucleico extraídas de la muestra. El procesamiento de la muestra biológica puede involucrar uno o más de los siguientes: filtrado, destilación, extracción, concentración, fijación, inactivación de componentes de interferencia, agregado de reactivos y similares.

De la forma usada en la presente, las expresiones "gen regulado por interferón" o "IRG" (por sus siglas en inglés) pueden hacer referencia a cualquier gen o su variante cuya expresión aumente o disminuya respecto de un control ante su exposición a al menos un interferón como ser un interferón beta. Los ejemplos de IRGs pueden incluir los enumerados en la Tabla 1 así como también otros conocidos en la técnica (referirse, por ejemplo, a Samarajiwa, S. A. et al, Nucleic Acids Res. 37:D852-D857, enero de 2009) .

De la forma empleada en la presente, el término "variante", al ser usado con referencia a un IRG, puede referirse a cualquier alteración en la secuencia de nucleótidos de IRG e incluye variantes que se presentan en regiones d codificación y no codificación, incluso exones, intrones y secuencias no traducidas. Las variantes pueden incluir sustituciones únicas de nucleótidos, eliminaciones de uno o más nucleótidos, e inserciones de uno o más nucleótidos. Ejemplos de variantes de IRG resultan conocidos en la técnica (referirse, por ejemplo, a Vosslamber, S. et at.f "Interferón regulatory factor 5 gene variants and pharmacological and clinical outcome of Interferon-ñ therapy in múltiple sclerosis" , Genes and Immunity, publicado el 7 de abril de 2011; y a Baranzini et ai., Hum. Mol. Genet. 15:767, 2009) .

La presente invención se refiere, en general, a métodos para diagnosticar una respuesta al tratamiento en sujetos que sufren de esclerosis múltiple (EM) , y en forma más particular, a un método para diagnosticar una respuesta al tratamiento con interferon beta en sujetos con EM sobre la base de marcadores genéticos diferencialmente expresados. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la expresión de genes regulados por interferon (IRGs) difiere en forma cualitativa (es decir, la identidad de los IRGs regulados) y cuantitativa (es decir, la cantidad de IRGs regulados y el alcance de la inducción o represión) en un subgrupo de sujetos con EM. En particular, se descubrió con sorpresa que los sujetos con EM cuyas respuestas al tratamiento habían sido calificadas de malas, demostraron una respuesta molecular significativa exagerada (es decir, una expresión de genes aumentada y reducida) después de la primera inyección de interferon beta y a los seis meses. Sobre la base de este descubrimiento, la presente invención provee un método para determinar la eficiencia de un tratamiento con interferon beta en un sujeto con EM, un método para determinar si un sujeto con EM debe ser tratado con un agente terapéutico diferente de interferón beta, un método para detectar un agente que pueda ser usado para tratar la EM, y métodos para tratar un sujeto con EM.

Las propuestas mecanicistas para la patogenia de EM han hecho hincapié en la inmunidad adquirida, en particular, la respuesta inmune dirigida contra constituyentes de mielina. De acuerdo con lo mencionado con anterioridad, se ha descubierto en forma inesperada que los receptores de interferón beta que habían tenido una respuesta mala al tratamiento ya presentaban niveles más elevados de actividad de la enfermedad o carga de la enfermedad. Sin pretender quedar limitados por la teoría, se considera que una respuesta aumentada a IFN de tipo 1 acompaña los procesos inmunes innatos que conducen a una patogenia autoinmune en un subgrupo de sujetos con EM (es decir, aquellos que responden mal al tratamiento) . De esta forma, se considera que las diferencias de inmunidad innata, ya sea dentro de las vías de interferón de tipo 1 o que afectan los niveles de expresión de IRGs en forma indirecta, determinan una mayor gravedad de la enfermedad en aquellos que responden mal al tratamiento .

La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra un método 10 de acuerdo con un aspecto de la presente invención para determinar la eficiencia del tratamiento con interferón beta en un sujeto con EM. El método 10 puede incluir los siguientes pasos: obtener una muestra biológica de un sujeto con EM (paso 12) ; aislar al menos un ácido nucleico de la muestra biológica (paso 14) ; determinar el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante (paso 16) ; y analizar el nivel de expresión de genes medido para determinar si el sujeto responderá mal al tratamiento con interferón beta (paso 18) . En forma opcional, el método 10 puede incluir la administración de una dosis de interferón beta a un sujeto con EM antes de obtener la muestra biológica (paso 20) .

Las expresiones "esclerosis múltiple" o "EM" de la forma empleada en la presente pueden incluir una enfermedad donde las vainas de mielina grasa alrededor de los axones del cerebro y de la médula espinal se encuentren dañadas, lo que lleva a una desmielinización y a una formación de cicatrices. La EM puede incluir una cantidad subtipos, con cualquiera de los cuales puede verse afectado un sujeto. Entre los subtipos de EM ilustrativos se pueden incluir la EM benigna, la EM de recaída/remisión latente, la EM de recaída/remisión activa, la EM progresiva primaria y la EM progresiva secundaria. La EM de recaída/remisión puede incluir una evolución clínica de la EM que se caracteriza por ataques agudos claramente definidos con una recuperación total o parcial y sin avance de la enfermedad entre ataque y ataque. La EM progresiva primaria puede incluir una evolución clínica de la EM que presenta en un principio una forma progresiva sin remisiones. La EM progresiva secundaria puede incluir una evolución clínica de la EM que en un principio tiene recaída y remisión, y luego, avanza a una velocidad variable, posiblemente con una recaída ocasional y con una remisión menor. La EM progresiva de recaída puede incluir una evolución clínica de la EM que es progresiva desde un principio, con recaídas eventuales. De forma habitual, hay una recuperación significativa inmediatamente después de una recaída, pero entre recaída y recaída puede haber un empeoramiento gradual del avance de la enfermedad.

Con referencia a la Figura 1, puede obtenerse al menos una muestra biológica de un sujeto con EM en el paso 12. La expresión "muestra biológica" es empleada en la presente en su sentido más amplio y puede incluir cualquier muestra clínica que derive del sujeto. Entre los ejemplos de muestras biológicas se pueden incluir, sin que la enumeración sea taxativa, fluidos corporales periféricos, tejido o muestras de biopsia de aguja fina, y muestras de archivo con consecuencias, diagnósticos y/o tratamientos conocidos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos, como ser secciones congeladas tomadas con fines histológicos, así como también cualquier material o materiales que provengan del procesamiento de la muestra. En un ejemplo de la presente invención, la muestra biológica puede incluir una muestra de sangre completa obtenida usando una aguja de jeringa en una vena de un sujeto con EM.

En el paso 14, puede aislarse al menos un ácido nucleico de la muestra biológica. Los ácidos nucleicos pueden ser aislados de la muestra biológica de acuerdo con cualquiera de una cantidad de métodos conocidos. El experto en la técnica se percatará de que cuando deban detectarse alteraciones en el número de copia de un gen, puede aislarse el ADN genómico. A la inversa, cuando resulta conveniente la detección de niveles de expresión de genes, puede asilarse el ARN (es decir, el AR m) . Los métodos para aislar ácidos nucleicos tales como ARNm resultan conocidos por los expertos en la técnica. (Referirse, por ejemplo, al Capítulo 3 de Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Parte I, Theory of Nucleic Acid Preparation; P. Tijssen, editorial Elsevier, Nueva York, (1993) ) En un ejemplo de la presente invención, el ARN puede ser aislado ex vivo a partir de una muestra de sangre completa mediante el uso de un kit disponible en el mercado, como ser el kit de extracción de sangre PAXGENE RNA (PREA ALYTIX, Suiza) . En resumen, puede obtenerse al menos una muestra de sangre completa a partir de un sujeto con EM y luego puede ser colocada en un tubo de ensayo (por ejemplo, en un tubo libre de ARNasa) . La purificación puede comenzar con un paso de centrifugación en células pellet en el tubo. Las células peJlet pueden ser luego lavadas, vueltas a suspender e incubadas en tampones optimizados (junto con proteinasa K) para promover la digestión de la proteína. Puede llevarse a cabo un paso de centrifugación adicional para homogeneizar el lisado celular y retirar los restos celulares residuales. A continuación, puede transferirse el sobrenadante de la fracción de flujo continuo a un tubo de microcentrifugado en fresco. Luego, puede agregarse etanol para ajustar las condiciones de unión, seguido de la aplicación del lisado a la columna de centrifugado. Durante una breve centrifugación, el ARN puede unirse en forma selectiva a la membrana de la columna de centrifugado mientras los agentes contaminantes la atraviesan. Luego, pueden retirarse los agentes contaminantes restantes en diversos pasos de lavado eficientes. Entre el primero y el segundo pasos de lavado, por ejemplo, puede tratarse la membrana con ADNasa I para retirar las cantidades de indicios de ADN unido. Después de los pasos de lavado, el ARN puede ser eluido en un tampón de elusión y desnaturalizado con calor. Luego, puede evaluarse la calidad y la cantidad de ARN (por ejemplo, por espectroscopia) con una visualización adicional por electroforesis en gel de agarosa.

En el paso 16, el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante puede ser determinado a partir del o de los ácidos nucleicos aislados de la muestra biológica. En un ejemplo de la presente invención, el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante (por ejemplo, alrededor de 4 IRGs y/o sus variantes) que se enumera en la Tabla 1 puede ser determinado a partir del o de los ácidos nucleicos aislados de la muestra biológica. En otro ejemplo de la presente invención, el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante (por ejemplo, alrededor de 4 IRGs y/o sus variantes) que se enumera en la Tabla 3 puede ser determinado a partir del o de los ácidos nucleicos aislados de la muestra biológica. El experto en la técnica sabrá apreciar que para medir el nivel de expresión (y por ello, el nivel de transcripción) de uno o más genes, resulta conveniente proveer una muestra de ácido nucleico que comprenda una o más transcripciones de ARNm del o de los genes, o ácidos nucleicos derivados de la o las transcripciones de ARNm. De la forma empleada en la presente, un ácido nucleico derivado de una transcripción de ARNm puede incluir un ácido nucleico para cuya síntesis la transcripción de ARNm (o una de sus subsecuencias) haya servido en definitiva como modelo. De esta forma, un ADNc transcripto en forma inversa a partir de ARNm, un ARN transcripto desde ese ADNc, un ADN amplificado a partir del ADNc, un ARN transcripto desde el ADN amplificado, etc., pueden derivar de la transcripción de ARNm y la detección de dichos productos derivados puede indicar la presencia y/o abundancia de la transcripción original en la muestra.

Los métodos para detectar los niveles de expresión de genes y/o su actividad resultan conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitativos de los métodos para detectar ARN, por ejemplo, pueden incluir análisis por transferencia Northern, RT-PCR, hibridación in situ de ARN (por ejemplo, usando sondas de ADN o ARN para hibridar moléculas de ARN presentes en una muestra) , RT-PCR in situ y micromatrices de oligonucléotidos (por ejemplo, por hibridación de secuencias de polinucleótidos derivados de una muestra de oligonucléotidos unidos a un sustrato) .

En un ejemplo de la presente invención, puede usarse una macromatriz para detectar el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante. El experto en la técnica sabrá reconocer que la macromatriz puede incluir una cantidad de sondas de prueba que específicamente se hibridan en el ácido nucleico expresado que debe ser detectado y, en forma opcional, una o más sondas control. Las sondas de prueba pueden incluir oligonucleotidos que varían en tamaño (por ejemplo, entre alrededor de 5 y alrededor de 50 nucleótidos) y presentan secuencias complementarias con secuencias particulares de los genes diseñados para detectar su expresión. De esta manera, las sondas de prueba pueden ser capaces de hibridarse en * forma específica con un ácido nucleico diana. Entre los ejemplos de sondas control que pueden incluirse como parte de la macromatriz se pueden incluir los controles de normalización, los controles del nivel de expresión y los controles de incompatibilidad.

En otro ejemplo de la presente invención, puede usarse una macromatriz de acuerdo con lo descripto en el Ejemplo 2 (más abajo) para detectar el nivel de expresión de al menos alrededor de 4 de los genes enumerados en la Tabla 1. La detección del nivel de expresión de al menos alrededor de 4 genes (por ejemplo, 4 genes) puede resultar ventajosa por varias razones. Para llevar a cabo una prueba cuantitativa (por ejemplo qPCR) , por ejemplo, una selección de una cantidad limitada de genes en una matriz múltiple puede resultar útil por razones prácticas (por ejemplo, volumen y cantidad de reactivos necesarios, etc.). En forma adicional, la selección de al menos alrededor de 4 genes puede llevarse a cabo con el fin de optimizar la capacidad de discriminación (es decir, la zona cubierta por la curva de rendimiento diagnóstico) mediante el uso del modelo de bosque aleatorio de la presente invención.

Los IRGs que comprenden la macromatriz pueden ser representados por alrededor de 166 ADNc humanos. En resumen, el protocolo para manchado de ADN en la membrana de macromatriz, rotulación de sondas e hibridación puede comenzar aislando alrededor de 5 µg de ARN total ex vivo a partir de sangre completa. Las sondas de ADNc pueden luego ser generadas por transcripción inversa mediante el uso de SUPERSCRIPT II en presencia de 32PdCTP (INVITROGEN, Carlsbad, CA) . El ARN residual puede ser hidrolizado por un tratamiento alcalino a alrededor de 70 °C durante aproximadamente 20 minutos, después de lo cual el "ADNc puede ser purificado usando columnas G50 (de GE Healthcare, Buckingham-shire, Reino Unido) . Luego, las sondas pueden ser hibridadas hasta el día siguiente con la membrana de macromatriz en alrededor de 10 milímetros de tampón de hibridación, seguido del lavado con tampones de baja y alta astringencia. Después, puede exponerse la macromatriz a intensas detecciones de fósforo durante aproximadamente dos días, seguido de una exploración con STORM IMAGER (MOLECULAR DYNAMICS, Sunnyvale, CA) .

Los métodos del arte previo emplean, con frecuencia, micromatrices de oligonucleótidos de alta densidad para caracterizar genes regulados por interferón beta. Dichos métodos son útiles para identificar genes regulados por interferón beta nuevos, pero los resultados no son fácilmente cuantificados , y por lo tanto, la técnica resulta menos adecuada para analizar una regulación de IRG longitudinal diferencial. A diferencia de las micromatrices de alta densidad del arte previo, la macromatriz de la presente invención puede incluir alrededor de 166 IRGs seleccionados entre los experimentos de micromatriz anteriores (referirse, por ejemplo, a Schlaak, J.F. et. al., J. Biol . Chem. 277:49428-49437, 2002; y a Rani, M.R.S. et al, Ann. N.YAcadSci. 1182:58-68, 2009) que validaron la macromatriz para otras indicaciones de enfermedades (por ejemplo, el tratamiento con interferón alfa para el virus de la hepatitis C) y confirmaron que la micromatriz es susceptible de ser reproducida, es sensible y cuantitativa. En forma ventajosa, una cantidad relativamente pequeña de genes detectables por la macromatriz de la presente invención provee un ensayo cuantitativo y específico para evaluar la expresión de genes regulados por interferón beta.

En el paso 18, el nivel de expresión de genes medido puede ser analizado con el fin de determinar la eficiencia del tratamiento con interferón beta. Por ejemplo, el nivel medido de expresión de genes puede ser comparado con el nivel de expresión de genes de un control (por ejemplo, uno o más sujetos sin EM) . En un ejemplo de la presente invención, un nivel de expresión aumentado o reducido de al menos alrededor de 4 de los genes enumerados en la Tabla 1 y/o sus variantes en comparación con el control puede indicar que el sujeto no responderá bien al tratamiento con interferón beta. Además de exhibir un nivel aumentado o reducido de expresión de genes, aquellos que respondieron mal a un tratamiento también pueden demostrar un deterioro neurológico continuo a pesar del tratamiento. Los métodos para evaluar el deterioro neurológico en sujetos con EM resultan conocidos en el arte y pueden incluir, por ejemplo, análisis de R cuantitativo, escala ampliada del estado de discapacidad de Kurtzke ("EDSS" por sus siglas en inglés) , (por ejemplo, una calificación en dicha escala aumentada en al menos alrededor de 0,5 puede indicar un deterioro neurológico) , y la escala funcional compuesta de esclerosis múltiple.

En otro ejemplo de la presente invención, un nivel de expresión aumentado o reducido de al menos uno (por ejemplo, alrededor de 4) de los siguientes genes y/o sus variantes (en comparación con el control) puede indicar que el sujeto no responderá bien al tratamiento con interferón beta: 2-50AS; Adaptina; Akt-2; AP0L3 ; ATF 2; Bad; Bel -2; BST2; C1-1 H: Clorf29; Clr; CIS: Caspasa 1; Caspasa 7; Caspasa 9; CCR1; CD3e; CEACAM; c-myc; COMT; CREB; CXCL11 : CXCR4 ; CYB56; DDX17; Def-a3; Elastasa 2 ; Fas-L; FK506; FLJ20035; G1P3; Gadd 5; GATA 3; GBP2 ; HLADP; HLADRA; Hou; MPAST; Hsf1 : Hsp90; IDO; TFI16; 1FI-17; IFN-44; I.FI60; 1FIT1 ; IFIT2; IFIT5; IFITM2; IFITM3; IFN-17; IFNAR1; IFNAR2; IFNGR1; IFNGR2; IL15; IL18 BP; IL1RN; 112; IL2Rg; IL6; Int-6; IP-10; IRF2 ; ISG15-L; ISG20; lSGF3g; LICAM; MAP2K3; MAP2 4; MAP3K14; MAP3K3; MAP3K4; MAP3 7; MAP4K1; MAPK13 ; MAPK7 ; Met-onco; MMP-l; MMP-9; MT1H; MT1X; MT2A; MX1 : NF-IL-6; NFKB; MI; NT5e ; OASL; P4HA1 ; p53 ; p57Kip2; PAI-1; PDK1 ; PDK2 ; PI3K; PKR; plectina; PLSCR1 ; PSMB9 ; RCNI: RGS2 ; RHO GDP; RIG-1; SERPINA: SKJN; SOCS-1; STAT1; STAT2 ; STAT4; TF'EC; TGFbR2 ; TGFbR3 ; TIMP-1; TNF-a; TNFAIP6; T0R1B; TRAIL; UBE2L6; USP18; VegFC; Viperina; y WARS .

En otro ejemplo de la presente invención, un nivel de expresión aumentado o reducido de al menos uno (por ejemplo, alrededor de 4) de los siguientes genes y/o sus variantes (en comparación con el control) puede indicar que el sujeto no responderá bien al tratamiento con interferón beta: CARACTER; RIG-1; 2-50AS; STAT1; P13-cinasa; IL-15; IP-10; MMP-1; P4HA1; caspasa 7; PDK2 ; ATF-2 : TNF-a; RGS2 ; SNN; hsp90; C-myc; Al-AT; HLA-DRA; COMT; NFKB; HLA-DP; TIMP-1; CXCR4 ; e IL-2.

En otro ejemplo de la presente invención, un nivel de expresión aumentado de al menos uno (por ejemplo, alrededor de 4) de los siguientes genes y/o sus variantes (en comparación con el control) puede indicar que el sujeto no responderá bien al tratamiento con interferón beta: CARACTER; RIG-1: 2-50AS: STAT1 ; PI3-CÍnasa; IL-15; IP-10; MMP-1; P4HA1; caspasa 7; PDK2 ; ATF-2; TNF-a; y RGS2.

En otro ejemplo de la presente invención, un nivel de expresión disminuido de al menos uno (por ejemplo, alrededor de 4) de los siguientes genes y/o sus variantes (en comparación con un control) puede indicar que el sujeto no responderá bien al tratamiento con interferón beta: SNN; hsp90; c-myc; Al-AT; HLA-DRA; COMT; NFKB; HLA-DP; TIMP-1: CXCR4 ; e IL-2.

Otro aspecto de la presente invención puede incluir la determinación de si un sujeto con EM debe ser tratado o no con un agente terapéutico diferente de interferón beta. Por ejemplo, cuando un sujeto con EM tiene un nivel de expresión aumentado o disminuido de al menos un IRG y/o su variante (por ejemplo, al menos alrededor de 4 de los genes enumerados en la Tabla 1) en comparación con un control, el sujeto puede ser tratado con un agente terapéutico diferente de interferón beta. Los tratamientos para EM diferentes de interferón beta resultan conocidos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, acetato de glatiramer, mitoxantrona y natalizumab, así como también terapias alternativas (por ejemplo, vitamina D) . Otros tratamientos para EM pueden incluir aquellos que en la actualidad se encuentran en investigación clínica para el tratamiento de la EM, como ser alemtuzumab, daclizumab, inosina, BG00012, fingolimod, laquinimod, y NEUROVAX. Los métodos para tratar un sujeto con EM de acuerdo con la presente invención se encuentran descriptos en mayor detalle a continuación.

En el paso 20, el método 10 puede incluir, en forma opcional, la administración de una dosis de interferón beta a un sujeto con EM antes de obtener la muestra biológica. La dosis de interferón beta puede ser administrada como un preparado único, que puede reducir el ruido en la medición de la expresión de genes (es decir, en el paso 16) . Entre los ejemplos de dosis de interferón beta que pueden ser administrados a un sujeto con EM se incluyen: IFN-ß-? a (por ejemplo, AVONEX, REBIF) e IFNS-l b (por ejemplo, BETASERON, EXTAVIA) . La dosis de interferón beta puede ser administrada a través de cualquier vía conocida, como ser por inyección intravascular .

Después de la administración de la dosis de interferon beta al sujeto, puede obtenerse al menos una muestra biológica (de acuerdo con lo descripto con anterioridad) . La muestra biológica puede obtenerse en uno o más puntos temporales . Por ejemplo, puede obtenerse una muestra de sangre completa de un sujeto con EM alrededor de 12 horas posteriores a la administración de una dosis de interferon beta. Cabe destacar que las dosis adicionales de interferon beta pueden ser administradas a un sujeto después de una primera dosis de interferon beta. Por ejemplo, puede administrarse una primera dosis de interferon beta a un sujeto después de tomar una muestra biológica alrededor de 12 horas después de la primera dosis y luego, una segunda dosis de interferon beta a los 6 meses aproximadamente, una vez más, seguido de la toma de una muestra biológica. Después de obtener la muestra biológica, puede aislarse al menos un ácido nucleico de la muestra biológica (de acuerdo con lo descripto con anterioridad) . Tal como se lo describiera también con anterioridad, puede determinarse el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante a través del uso, por ejemplo, de una macromatriz.

Una vez determinado el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante, puede analizarse el nivel de expresión (de acuerdo con lo descripto con anterioridad) . Por ejemplo, el nivel medido de expresión de genes puede ser comparado con el nivel de expresión de genes de un control. El control puede ser aislado de uno o más sujetos sin EM, obtenido de un sujeto que no haya sido tratado con interferón beta, o tomado de un sujeto antes de ser tratado con interferón beta. Cuando el nivel de expresión de genes medido es aumentado o reducido en al menos alrededor de 4 de los genes enumerados en la Tabla 1 (en comparación con el control) , por ejemplo, el sujeto puede no responderá bien al tratamiento con interferón beta.

Aunque el tratamiento de EM con interferón beta es el de uso más común para modificar la enfermedad, sus mecanismos de acción no son lo suficientemente bien comprendidos y no existen marcadores biológicos que puedan guiar un tratamiento individualizado. Sobre la base del descubrimiento de que una respuesta molecular exagerada a las inyecciones de interferón beta en sujetos con EM sea un marcador para un subgrupo de sujetos donde respuestas inmunes innatas conducen a la patogenia, la presente invención provee de forma ventajosa un método 10 para identificar una minoría de sujetos destinados a un estado de respuesta pobre ante el tratamiento con ínterferón beta. De acuerdo a lo analizado en mayor detalle a continuación, la presente invención permite, de este modo, la adaptación del tratamiento que modifica la enfermedad para sujetos individuales con EM.

La Figura 2 ilustra otro aspecto de la presente invención que comprende un método 30 para detectar un agente que pueda ser usado para el tratamiento de la EM. El método 30 puede incluir los siguientes pasos: proveer una población de monocitos de sangre periférica (PBMCs) de un sujeto con EM (paso 32) ; administrar un agente a los PBMCs (paso 34) ; aislar al menos un ácido nucleico de los PBMCs (paso 36) ; determinar el nivel de expresión de genes de al menos un IRG y/o su variante (paso 38) ; y analizar el nivel de expresión de genes medido (paso 40) . En el paso 32, la población de PBMCs puede obtenerse a partir de un sujeto que sufra de EM y que responda mal ante el tratamiento con interferón beta. Puede llevarse a cabo una determinación de si el sujeto responde mal al tratamiento de acuerdo con el método 10 descripto con anterioridad. Por ejemplo, un sujeto con EM que tiene un nivel de expresión aumentado o disminuido de al menos un IRG y/o su variante (por ejemplo, alrededor de 4 de los genes enumerados en la Tabla 1) en comparación con un control, puede ser caracterizado como un sujeto de respuesta pobre al tratamiento. El experto en la técnica sabrá reconocer que existen varios métodos para aislar PB Cs . Por ejemplo, los PBMCs pueden ser aislados a partir de una muestra de sangre completa mediante el uso de procedimientos de centrifugado de diferente gradiente de densidad. De forma habitual, la sangre completa anticoagulada puede ser colocada sobre un medio de separación para luego centrifugarla. Al finalizar el paso de centrifugado, pueden observarse varias capas (de arriba hacia abajo) : plasma/plaquetas; PBMCs; medio de separación y eritrocitos/ granulocitos . La capa de PBMC puede ser retirada y lavada para liberarla de cualquier agente contaminante (por ejemplo, de glóbulos rojos) . Después del lavado, puede confirmarse el tipo de célula y la viabilidad de la célula a través de métodos conocidos en la técnica. Los PBMCs pueden luego ser cultivados ex vivo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes como para promover una capa celular sustancialmente confluente.

En el paso 34, puede administrarse al menos un agente a la población de PBMCs. Los agentes que pueden ser administrados a la población de PBMCs pueden incluir cualquier fracción biológica, compuesto o fármaco que pueda ser candidato para el tratamiento de EM. Entre los ejemplos de dichos agentes se pueden incluir biologías, compuestos farmacéuticos, polipéptidos , proteínas, ácidos nucleicos y moléculas pequeñas.

En el paso 36, puede aislarse al menos un ácido nucleico de la población de PBMCs . Los métodos para aislar ácidos nucleicos a partir de poblaciones de células resultan conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ARN puede ser aislado de la población de PBMCs a través del uso de una prueba de extracción de ARN conocida.

De acuerdo con lo descripto con anterioridad, el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante (por ejemplo, alrededor de 4 de los genes enumerados en la Tabla 1) puede ser determinado en el paso 38. Por ejemplo, puede usarse una macromatriz para detectar niveles de expresión de genes.

Una vez determinado el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante (por ejemplo, alrededor de 4 de los genes enumerados en la Tabla 1) , el nivel de expresión medido puede ser analizado en el paso 40 (de la forma descripta con anterioridad) . Por ejemplo, el nivel medido de expresión de genes puede ser comparado con el nivel de expresión de genes de un control . Cuando el nivel medido de expresión de genes es aumentado o disminuido (en comparación con un control) , el agente administrado puede no ser un candidato para el tratamiento de EM. A la inversa, cuando el nivel medido de expresión de genes no es aumentado o disminuido (en comparación con la muestra control) , el agente administrado puede ser un candidato para el tratamiento de EM.

La Figura 3 ilustra otro aspecto de la presente invención que comprende un método 50 para el tratamiento de un sujeto con EM. El método 50 puede incluir los siguientes pasos: obtener una muestra biológica de un sujeto con EM (paso 52) aislar al menos un ácido nucleico de la muestra biológica (paso 54) ; determinar el nivel de expresión de genes de al menos un IEG y/o su variante (paso 56) ; analizar el nivel de expresión de genes medido (paso 58) ; y administrar al menos un agente al sujeto (paso 60). En forma opcional, el método 50 puede incluir la administración de una dosis de interferón beta a un sujeto con EM antes de obtener la muestra biológica (paso 62) .

En el paso 52, puede obtenerse al menos una muestra biológica de un sujeto con EM. De acuerdo con lo descripto con anterioridad, por ejemplo, la muestra biológica puede incluir una muestra de sangre completa obtenida usando una aguja de jeringa en una vena del sujeto.

En el paso 54, puede aislarse al menos un ácido nucleico de la muestra biológica (de acuerdo con lo descripto con anterioridad) . Por ejemplo, el AR puede ser aislado a partir de una muestra de sangre completa mediante el uso de un kit de extracción de sangre PAXGENE RNA.

Después, puede determinarse el nivel de expresión de al menos un IRG o su variante en el paso 56. De acuerdo con lo descripto con anterioridad, por ejemplo, puede usarse una macromatriz hibridada para detectar los niveles de expresión de genes en al menos alrededor de 4 de los genes enumerados en la Tabla 1.

Una vez determinado el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante, puede analizarse el nivel de expresión de genes medido en el paso 58 (de acuerdo con lo descripto con anterioridad) . Por ejemplo, el nivel medido de expresión de genes puede ser comparado con el nivel de expresión de genes de un control. Cuando el nivel medido de expresión de genes es aumentado o disminuido (en comparación con un control) , el sujeto puede responder mal al tratamiento con interferón beta. A la inversa, cuando el nivel de expresión de genes no es aumentado o disminuido (en comparación con la muestra control) , el sujeto puede ser un candidato para el tratamiento con interferón beta.

En el paso 60, puede administrarse al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente. El agente particular administrado al sujeto dependerá de su forma de responder previamente determinada. Por ejemplo, si el sujeto no responde bien al tratamiento, entonces puede administrársele una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente diferente de interferón beta, como ser natalizumab. A la inversa, si el sujeto no responde bien al tratamiento, entonces puede administrársele una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente, como ser interferón beta. Cabe destacar que el tipo de tratamiento, dosis, planificación y duración del tratamiento pueden variar según la gravedad de la patología y/o del pronóstico del sujeto. Los expertos en la técnica son capaces de adaptar el tipo de tratamiento a la dosis, la planificación y la duración del tratamiento. En forma ventajosa, el método 50 provee un régimen para el tratamiento de sujetos con EM sin exponerlos a medicamentos innecesarios que, a su vez, pueden resultar altamente beneficiosos para evitar gastos innecesarios al sistema sanitario .

Asimismo, cabe destacar que el método 50 puede incluir, en forma opcional, el paso de administración de una dosis de interferón beta a un sujeto con EM antes de obtener la muestra biológica (de acuerdo con lo analizado con anterioridad) ~en el paso 62.

Además, cabe mencionar que la presente invención puede incluir, en forma alternativa, técnicas de detección y aislamiento de proteína o polipéptido como parte de los métodos 10, 30 y 50. Por ejemplo, pueden usarse otras técnicas para aislar y detectar proteínas, polipéptidos y/o sus variantes codificadas por los IRGs y/o sus variantes de la presente invención. Para ello, puede obtenerse una muestra biológica de un sujeto con EM (de acuerdo con lo descripto con anterioridad) . Después, puede someterse la muestra biológica a una técnica conocida para aislar una proteína, un polipéptido y/o su variante codificada por un IRG y/o su variante de la presente invención. Referirse, por ejemplo a Protein Purification Protocole, editorial Humana Press (1996) . Luego, pueden detectarse la proteína, el polipéptido y/o su variante que fueron aislados mediante el uso de una o una combinación de técnicas conocidas, como ser micromatriz de proteína, inmunotinción, inmunoprecipitado, electroforesis (por ejemplo bidimensional o tridimensional) , transferencia Western, espectrometría y ensayo de ácido bicinconínico . Después de la detección de la proteína, el polipéptido y/o su variante, puede analizarse el nivel de proteína, polipéptido y/o su variante. Cuando el nivel de la proteína, polipéptido y/o su variante es aumentado o disminuido (en comparación con una muestra control) , el sujeto puede responder mal al tratamiento con interferón beta.

A la inversa, cuando el nivel de la proteína, polipéptido y/o su variante no es aumentado o disminuido (en comparación con la muestra control) , el sujeto puede ser un candidato al tratamiento con interferón beta.

Estos ejemplos son dados solo simplemente a modo de ilustración y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones, que se anexan a la presente.

Ejemplo 1 Métodos Protocolo clínico El estudio recibió la aprobación del Comité Institucional de Revisión de la Clínica Cleveland (CC) . Todos los sujetos involucrados prestaron su consentimiento informado por escrito. Para participar del estudio, dichos sujetos debían presentar el síndrome clínicamente aislado (CIS, por sus siglas en inglés) o una EM de recaída-remisión, hallarse en el inicio del tratamiento con IFN beta-la intramuscular y no haber sido sometidos al tratamiento con anterioridad, en tanto que el Centro de Esclerosis Múltiple de la Clínica Cleveland debía tener a su cargo el correspondiente seguimiento. Se inscribieron noventa y nueve sujetos, a quienes se examinó al inicio del tratamiento y luego de transcurridos 6, 12 y 24 meses. Una vez transcurridos 3 y 18 meses, los pacientes fueron contactados telefónicamente a fin de evaluar el cumplimiento con el tratamiento y de establecer posibles efectos secundarios. Durante la visita al inicio, y en el curso de aquéllas que tuvieron lugar una vez transcurridos 6 y 24 meses, se tomaron muestras de sangre en una unidad de investigación clínica para análisis de los IRG inmediatamente antes de la aplicación de una inyección de IFN beta y luego de transcurridas 12 horas de dicha aplicación, en tanto que los pacientes fueron sometidos a una RM de cerebro estandarizada a fin de efectuar una evaluación cuantitativa de las lesiones y atrofia cerebral . Durante cada visita, los pacientes se sometieron a exámenes de carácter neurológico a fin de determinar la Escala Ampliada del Estado de Discapacidad de Kurtzke (Kurtzke, J.F., Neurology 33:1444-1452, 1983) , la Escala Funcional Compuesta de Esclerosis Múltiple (Rudick, R.A. et al., Mult. Scler. 8:359-365, 2002), y la existencia de antecedentes de recaídas o enfermedades intercurrentes . También recibieron un cuestionario estructurado con el objeto de caracterizar síntomas típicos de una gripe, dolor muscular, escalofríos, fatiga, dolor de cabeza y pérdida de la fuerza. Se procedió además al análisis del suero para la detección de anticuerpos neutralizantes de IFN una vez transcurridos 6 y 24 meses .

Análisis de la RM Las imágenes obtenidas a través de la RM incluyeron una imagen de recuperación de la inversión atenuada del fluido (FLAIR, por sus siglas en inglés) potenciada en T2, imágenes eco del espin rápido potenciadas en T2 y en densidad protónica logradas por eco dual, e imágenes SE potenciadas en TI obtenidas con anterioridad a la inyección de una dosis estándar de gadolinio (0,1 mmol/kg) y con posterioridad a ésta. Las imágenes se analizaron mediante el empleo de software desarrollado en planta a fin de determinar la fracción del parénquima cerebral (BPF) , el volumen de las lesiones en T2 , el volumen de las lesiones hipointensas en TI, el número y volumen de las lesiones realzadas mediante contraste con gadolinio, el número de nuevas lesiones en T2 y el número de lesiones en T2 avanzadas . La fracción del parénquima cerebral se calculó a partir de imágenes de recuperación de la inversión atenuada del fluido mediante el empleo de software de segmentación íntegramente automatizado. (Rudick, R.A. et al., J. Neuroimmunol . 93:8-14. 1999). Se han descripto con anterioridad los detalles de los métodos de análisis de las lesiones (Cohén, J.A. et al., Mult. Scler. 14:370-382, 2008). En resumen, las lesiones hiperintensas en T2 se segmentaron automáticamente en las imágenes de recuperación de la inversión atenuada del fluido y en las potenciadas en T2 y en densidad protónica, en tanto que su verificación visual se llevó a cabo mediante el empleo de software interactivo para corregir lesiones que no se han clasificado adecuadamente . Las imágenes de seguimiento obtenidas luego de transcurridos 6 meses se registraron de acuerdo con los valores de inicio, y la intensidad se normalizó. Se aplicaron máscaras para las lesiones en T2 al inicio a las imágenes corregistradas correspondientes a 6 meses a fin de identificar lesiones persistentes. Se procedió luego a sustraer las imágenes al inicio de aquéllas registradas y obtenidas una vez transcurridos 6 meses con una intensidad normalizada a fin de identificar de manera automática nuevas lesiones en T2 y lesiones avanzadas transcurridos 6 meses. La verificación visual de dichas lesiones se llevó a cabo mediante el empleo de software interactivo para generar los conteos finales .

Aislamiento del ARN Se procedió a la extracción ex vivo de ARN a partir de muestras de sangre mediante el empleo del equipo de extracción de sangre PAXGENE R A (PreAnalytiX, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y a su concentración mediante la precipitación con etanol . La cantidad y calidad del ARN se evaluaron a través de espectrofotometría (relaciones de absorbancia de 280/260 nm) y su visualización adicional se llevó a cabo a través de la electroforesis en gel de agarosa. Las muestras de ARN se conservaron a -80 °C.

Análisis de genes mediante el empleo de nacromatrices La metodología detallada para el análisis de macromatrices de ADNc se implemento tal como se describe (Schlaak, J.F. et al, J. Biol Chem. 277, 49428-49437, 2002; Rani, M.R.S. et al, Ann. N.Y Acad Sci. 1182:58-68, 2009). Los IRG en la macromatriz a medida fueron representados por 166 ADNc humanos seleccionados de la base de datos de UniGene. Una lista de los nombres de todos los genes en la macromatriz con los números de accesión de GenBank se consigna en la Tabla 1.

Tabla 1 : Nombre y número de accesión de GenBank de los 166 genes que responden al IFN de tipo 1 seleccionados para la macromatriz a medida Gen N° de Gen N° de Gen N° de Gen N° de accesión accesión accesión accesión 2-50AS NM_002534 G1 P3 NM_002038 IP-10 X02530 PDK2 NM_002611 a1-AT K01396 Gadd45 M60974 IRF4 U52682 PGK V00572 ADAM17 U69611 GATA3 X58072 IRF1 L05072 PI3K NM_006219 Adaptin AF068706 GBP2 M55543 IRF2 X15949 PIAS AF077954 Akt-1 NMJ 05163 GranB M17016 IRF7 U73036 PIAS1 AF077951 Akt-2 M77198 HLADP M83664 ISGI5-L M13755 Pig7 AF010312 APOL3 AA971543 HLADRA J00194 ISG20 N M_002201 PKR NM_002759 Gen N° de Gen N° de Gen N° de Gen N° de accesión accesión accesión accesión ATF2 X15875 HLAE X56841 ISGF3g M87503 plectin U53204 Bad U66879 Hou U32849 JUN J041 1 1 PLSCR1 AF098642 Bax L19559 HPAST AF00144 L1 CAM M74387 PSMB9 X66401 Bcl-2 M 14745 Hsfl M64673 L-Selectin M25280 Raf X03484 BST2 D28137 Hsp90 X15183 MAP2K3 NM_002756 RCNI D42073 C1-1 NH NM_000062 IDO NM_002164 MAP2K4 L36870 RGS2 NM_002923 Clorf29 KM_005951 IF116 M63838 MAP3KI1 NM_002 19 RHOGDP 120688 Clr NM 001733 IF1-17 J04164 MAP3KI4 NM_003954 Ribonuc NM_003141 C1S J04080 IFI35 U72882 MAP3K3 U78876 RIG-I AF038963 Caspasel M87507 IFI44 D28915 MAP3K4 NM_005922 SERPEN NM_000295 Caspase7 U67319 IFI-44 D28915 MAP3K7 NM_003188 Smadl U59423 Caspase9 U60521 IFI60 AF083470 MAP4KI NM_007181 SNN NM_003498 CBFA NM_004349 IFIT1 M24594 MAPK13 AF004709 SOCS-1 N91935 CCRI L09230 IFIT2 NM_001547 MAPK7 NM_002749 SOCS2 AF020590 CCR5 U54994 IFIT4 NM_001549 Met-onco NM_000245 SSAI NM_003141 GD1 4 NM_000591 IFIT5 N M _ 0 12420 MIP-1b NM_002984 STAT1 M97935 CD3e NM_012099 IFITM2 NM_006435 M P-1 M13509 STAT2 M97934 CEACAM NM_001712 IFITM3 X57352 MMP-9 NM_004994 STAT4 L78440 e-fos NM_005252 IFN-17 M 3755 MTIH NM_005951 STAT5A L41142 c-myc L00058 IFN-9/27 J04164 MTIX NM_005952 TAPI X57522 Collagen J03464 IFNAR1 J03171 MT2A NM_005953 TFEC NM_012252 COMT M58525 IFNAR2 U42243 MX1 M33882 TGFbR2 D50683 CREB NM004379 IFNGR1 J03143 MX2 M30818 TGFbR3 L07594 Gen N° de Gen N° de Gen N° de Gen N° de accesión accesión accesión accesión CXCL1 I NM_005409 IFNGR2 U05875 NF-IL-6 X52560 TIMP-1 M59906 CXCR4 AF005058 IkBa M69043 NFkB M58603 TNF-a X01394 CYB56 NM_007022 IL15 U 14407 NMI Y00664 TNFAIP6 NM_007115 Cyp19 M28420 IL18 BP ABO 19504 NT5e X55740 TOR1 B NM_014506 DDX17 U59321 ILIRN NM_000577 OASL NM_ 003733 TRAIL U37518 Def-a3 NM_005217 IL2 NM_000586 P4HA1 M24486 UBE2L6 NM_04223 Destrin S65738 IL2Rg NM_000206 p53 M 14694 USP18 N M_01 7414 Elastase2 M34379 IL6 XD4602 p57 ip2 U22398 VegFC U43142 F-act¡n U56637 IL8Rb NM_001557 p70 K M60724 Viperin AF026941 Fas-L U08137 ¡NOS U20141 PAI-1 M 16006 WARS X62570 FK506 AF038847 lnt-6 U62962 PDGF-a X06374 FLJ20035 AK000042 ¡nteg-b-6 NM_000888 PDK1 Y15056 Estos IRG que responden al IFN de Tipo 1 fueron identificados mediante el análisis de micromatrices de fibrosarcoma, líneas celulares endoteliales o epiteliales sujetas a tratamiento con IFN alfa o IFN beta (Schlaak, J.F., et al., J. Biol. Chem. 277, 49428-49437, 2002; Rani , M.R.S. et al., Ann, N.Y Acad Sci. 1182,-58-68, 2009). Todos los genes eran IRG conocidos.

Se ha descripto con anterioridad el protocolo para la detección de ADN en la membrana, y para el etiquetado e hibridación de la sondas, con las modificaciones que constan a continuación (Schlaak, J.F, et al., J. Biol. Chem. 277, 49428-49437, 2002; Rani, M.R.S. et al., Ann. N.Y Acad Sci . 1182:58-68, 2009). Un total de RNA equivalente a 5 ug aislado ex vivo a partir de sangre se utilizó para la generación de sondas de ADNc radio etiquetadas a través de la transcripción reversa con SUPERSCRIPT 11 (Invitrogen, Carlsbad, California) en presencia de 32PdCTP. El ARN residual se hidrolizó mediante tratamiento alcalino a 70 °C durante 20 minutos luego de los cuales se purificó el ADNc mediante columnas G50 (GE Healthcare, Buckingham-shire , Reino Unido) . La preparación de las macromatrices e hibridación del ADNc radioactivo se efectuó tal como ya se ha descripto (Schlaak, J.F. et al., J. Biol. Chem. 277,49428-49437, 2002; Rani, M.R.S. et al., Ann. N.Y Acad Sci, 1182:58-68, 2009). La radioactividad fijada a la membrana se cuantificó y empleó para calcular el índice de inducción de los ISG.

A fin de minimizar la variabilidad, las muestras correspondientes a cada paciente al inicio (0 meses) y a la conclusión de un período de 6 meses se procesaron en un único experimento por lotes (un total de 4 membranas) .

Las relaciones de inducción (RI) generadas a partir de la macromatriz de ADNc a medida se validaron a partir de PCF cuantitativo en tiempo real para 5 genes: OASL (número de accesión NM0O3733), TRAIL (U37518) , IPI44 (D28915) , HLADRA (J00194) , y TTMP-1 (M59906. Spearman correlation coefficients for the correlations between the rt-PCR y los datos de la macromatriz para OASL, TRAIL, IFI44, HLADRA, y TIMP-1 fueron 0,92, 0,75, 0,36, 0,72, y 0,54 respectivamente. La figura 4 muestra las RI y las correlaciones obtenidas para OASL.

Análisis estadístico Un inadecuado nivel de respuesta al tratamiento con IFN beta tiene su fundamento en el análisis cuantitativo de la RM, para el que se parte de la comparación entre aquélla practicada durante la visita efectuada luego de transcurridos 6 meses y la practicada al inicio. Dicho inadecuado nivel de respuesta se definió como la presencia de más de tres nuevas lesiones. La comparación entre las diferentes características existentes al inicio entre el grupo que respondió adecuadamente al tratamiento y aquél que no lo hizo se efectuó mediante el empleo del Test-T o la prueba exacta de Fisher, según correspondiera. La regresión de Poisson se utilizó para evaluar las diferencias existentes entre los grupos en el número de IRG con RI > 2,0 al momento de la aplicación de la inyección de inicio. Los coeficientes de correlación de Pearson de log2 transformaron las RI existentes cuando se aplicó la primera inyección comparadas con las correspondientes a 6 meses se computaron para 85 pacientes. Se computaron correlaciones de a pares al inicio, y transcurridos 6 y 24 meses, para 10 pacientes seleccionados al azar.

La media de los mínimos cuadrados ajustada por RM de inicio y por variable demográfica de las RI transformadas por log2 se computaron y compararon entre grupos de respuestas mediante ANCOVA. Las variables fueron la edad, sexo, presencia de lesiones realzadas por contraste con gadolinio, y el volumen en T2. A fin de investigar si los grupos presentaron diferencias respecto de la distribución general de la magnitud de respuesta al tratamiento con IFN beta, se generaron gráficos de densidad de la media de los mínimos cuadrados de los 166 IRG para los grupos en los que se compararon las RI al inicio y transcurridos 6 meses en cuanto a nivel de respuesta. La proporción de genes que demostraron un mayor nivel de respuesta (Media de los mínimos cuadrados: sujetos que respondieron inadecuadamente al tratamiento > sujetos que respondieron adecuadamente al tratamiento en el caso de genes sobrerreguladores, o sujetos que respondieron inadecuadamente al tratamiento < sujetos que respondieron adecuadamente al tratamiento en el caso de genes infrarreguladores) en aquellos sujetos que respondieron inadecuadamente al tratamiento se evaluó (parcialmente) a través de una prueba de proporciones binomiales sobre la base de la asunción de una hipótesis nula de proporción menor o igual a 0,5.

A fin de continuar investigando si los IRG podrían diferenciar a aquellos sujetos que responden inadecuadamente de aquellos que lo hacen adecuadamente, los IRG al inicio que mejor efectuaron dicha discriminación entre ambos grupos fueron identificados de la siguiente manera. En primer lugar, se seleccionaron los IRG diferenciales, luego se aplicó uña técnica de bosques aleatorios a fin de elegir los genes y construir un modelo de diagnosticó. Los mejores 25 IRG fueron seleccionados sobre la base de un ranking Monte-Cario sobre la base de un estimado de suma de rangos de importancia variable obtenido de 1,000 simulaciones de boques aleatorios. Las curvas de rendimiento diagnóstico estimadas basadas en estos 25 genes al clasificar a los pacientes con el fin de ubicarlos en su correspondiente grupo de respuesta se compararon con el volumen en T2 de inicio y sin éste en los modelos de diagnóstico.

Resultados Sujetos estudiados Noventa y nueve sujetos se inscribieron en el estudio longitudinal, de los cuales 85 permanecieron en el protocolo y continuaron recibiendo IFN beta-la intramuscular durante el transcurso de al menos 6 meses . De los 14 pacientes que no completaron el análisis de macromatriz de 6 meses planificado, 12 discontinuaron la aplicación de IFN beta-la, en tanto que la hibridación de muestras no resultó exitosa respecto de los dos restantes, ya sea en ocasión de la aplicación de la primera inyección o luego de transcurridos los correspondientes 6 meses. No se observaron diferencias significativas respecto de las características demográficas y relativas a la enfermedad presentes en los 85 pacientes que completaron los primeros 6 meses del estudio y aquéllos que no lo hicieron (no se consignan datos) . En cuanto a todo otro análisis, sólo se incluyó a los 85 pacientes que completaron los primeros 6 meses. De dichos 85, un 32% padecía de síndromes clínicamente aislados con múltiples lesiones detectadas a través de RM de cerebro y 68% EM de recaída -remisión. La edad media fue de 35,7 años con un promedio la duración de la enfermedad de 2,4 años. Un 65% de los pacientes eran mujeres, y el 91% de los sujetos era de raza blanca. Transcurridos los primeros 6 meses, se clasificó a 15 (18%) de los pacientes como sujetos con respuesta inadecuada sobre la base de la definición MRT. La tabla 2 consigna las características de inicio correspondientes a ambos grupos y a la totalidad de la población.

Tabla 2 : Comparación de las características de inicio presentes en los pacientes que respondieron adecuadamente al tratamiento con IFN beta y aquéllos que no lo hicieron* * Todos los valores son promedio ± SD, a menos que se indique lo contrario.

CIS = síndrome clínicamente aislado; EMRR = esclerosis múltiple de recaída - remisión; EDSS = Escala Ampliada del Estado de Discapacidad; MSFC = Escala Funcional Compuesta de Esclerosis Múltiple; BPF = fracción del parénquima cerebral.

Los dos grupos presentaron características de inicio similares, excepto por el hecho de que una proporción mayor entre aquéllos que no respondieron adecuadamente al tratamiento presentaba lesiones detectadas por contraste con gadolinio y mayores volúmenes de lesión en T2.

Respuesta de los IRG a la primara inyección y estabilidad en el tifímpo Una RI > 2,0 definió la inducción de un IRG, dado que ensayos en sujetos sanos que no se encuentran recibiendo inyecciones de IFN beta no presentaron ningún IRG que variara más de una vez y media en ensayos separados por intervalos de 12 o 24 horas. El número de IRG inducidos con la primera inyección de IFN beta varió entre los pacientes en un rango de 7 a 135 sin que exista relación entre el nivel de respuesta frente al tratamiento con IFN beta y el número de genes inducidos (P = 0,76) (Figura 5) . De manera similar, el patrón de respuesta a la inyección de IFN beta inicial varió de manera considerable entre los paciente (Rani, M.R.S. et al., Ann. N.Y AcadSci. 1182:58-68,2009).

A pesar de la considerable variabilidad de carácter interindividual en el patrón y magnitud de respuesta del IRG luego de la aplicación de la primera inyección de IFN beta- la, la respuesta fue estable con el transcurso del tiempo para los sujetos individualmente. La figura 6 muestra la RI con la primera inyección (eje x) contrastada con la RI luego de 6 meses (eje y) para los 85 pacientes. La respuesta molecular a las inyecciones de IFN beta resultó marcadamente estable en casi todos los pacientes. Existieron tres excepciones: el sujeto 7 (fila superior, séptimo desde la izquierda) y el sujeto 25 (tercera fila, primero desde la izquierda) presentó infecciones virales con la dosis de inicio y por tanto la inducción de IRG resultó escasa o nula con la primera inyección debido a elevados niveles de expresión de los IRG previos a la administración de la inyección. Ambos sujetos respondieron a la inyección de IFN beta suministrada transcurridos 6 meses. El sujeto 21 (segunda fila, noveno desde la izquierda) desarrolló elevadas concentraciones de anticuerpos neutralizantes de IFN beta detectados a los 6 meses. El sujeto 21 respondió enérgicamente a la primera inyección de IFN beta, escasamente a los 6 meses. La evaluación para la detección de anticuerpos neutralizantes en el resto de los sujetos resultó negativa a los seis meses.

Con exclusión de esos tres sujetos, las RI correspondientes a la aplicación de la primera inyección tuvieron un fuerte correlato con las RI transcurridos 6 meses en los sujetos individualmente [Coeficiente de correlación medio de Pearson (+ SD) = 0,81 ± 0,11] . El coeficiente de correlación medio para los 15 sujetos que respondieron de manera inadecuada (números 1,4, 12, 14, 18, 40, 49, 57, 62, 65, 66, 70, 87, 91, y 92 en el estudio) fue de 0,81 ± 0,10, comparado con una media de 0,81 ± 0,11 en el caso de los 67 pacientes que respondieron adecuadamente al tratamiento (con exclusión de los sujetos 7, 21, 25) .

Los análisis de IRG se repitieron transcurridos 24 meses para 10 pacientes seleccionados al azar (5 que respondieron adecuadamente y 5 que no lo hicieron) (Figura 7) . Para estos 10 sujetos, las RI tuvieron un fuerte correlato al inicio y transcurridos 6 meses (r = 0,86); entre los 6 meses y los 24 meses (r = 0.82); y entre el inicio y los 24 meses (r = 0.85) . El coeficiente de correlación fue similar para aquellos sujetos que respondieron adecuadamente y para aquéllos que no lo hicieron.

Estos resultados sugirieron que un inadecuado nivel de respuesta no puede atribuirse ni a la magnitud de la respuesta molecular al IFN beta (Figura 5) ni a la atenuación de la respuesta molecular al IFN beta con el tiempo (Figuras 6 y 7) .

.Respuesta de IRG en sujetos que responden mal comparada con los que responden bien al interferón beta Los efectos biológicos del interferón beta son responden a las actividades de los productos de proteína de IRG (Borden, E.G. et al, Nat . Rev. Drug Discov. 6:975-990, 2007). Contemplamos si las características de la respuesta molecular del interferón beta podría explicar el estado de PR, ya sea revelando una inducción de productos de genes inflamatorios nocivos (Wandinger, K.P. et al., Ann. Neurol. 50:349-357, 2001) o por una falla selectiva de expresión de genes beneficiosos (Wandinger, K.P. et ah, Lancet 361:2036-2043, 2003). En un análisis monofactorial de los 166 genes que formaron parte de muestro ensayo de macromatriz (Tabla 1) , ajustado en virtud de la edad, el sexo, la presencia de lesiones mej oradoras del gadolinio de RM, y volumen de lesión T2 de los valores de referencia, donde el IR medio indica las respuestas diferenciales entre los grupos de PR y GR para 17 genes (P < 0,05). En forma inesperada, para la totalidad de los 17 genes, la respuesta, ya sea por inducción o represión, fue mayor en los pacientes con una respuesta pobre, lo que sugiere una respuesta molecular al interferón beta exagerada en dichos pacientes. Esta hipótesis fue confirmada por un análisis de la frecuencia de IR general en los dos grupos (Figuras 8A y B) . La figura muestra la frecuencia de IR para todos los IRG para todos los pacientes en la primera inyección de interferón beta (Figura 8A) y a los seis meses (Figura 8B) . En la primera inyección, entre los 119 genes sobrerregulados , los IR de la media de los mínimos cuadrados para las PR fueron superiores a los de las GR en 89 genes. De los 47 genes reprimidos, los IRs en las PR fueron inferiores a as GRs en 34 genes. De esta forma, en 123 de 166 genes, se presentó una respuesta exagerada al interferón beta en aquellos que respondían mal al tratamiento (p < 0,001). En la inyección a los seis meses (Figura 8B) , se produjo una respuesta exagerada al interferón beta en 120 de los 166 genes (p < 0,001).

Al usar la selección de bosque aleatorio, se identificaron los IRG que estaban más asociados con una buena respuesta o con una respuesta pobre. La técnica de bosque aleatorio es un clasificador estimador no paramétrico que toma en cuenta la importancia de variables individuales cuando selecciona cada factor (en este caso, cada IRG) , y es sensible a la interacción compleja y dependencia no lineal entre las variables. Por lo tanto, optamos por usar el bosque aleatorio para seleccionar y clasificar la variable. La Tabla 3 enumera los 25 enes identificados donde el IR de los valores de referencia diagnosticaron de mejor manera el estado de las respuestas.

Tabla 3 : índices de inducción para los 25 genes que responden a interferón sobre la macromatriz usual que mejor diagnosticó el estado de las respuestas Sujetos con buena Sujetos con mala respuesta al respuesta al tratamiento tratamiento Nombre del gen Número de accesión Indice de inducción Indice de inducción Valor P TRAIL U37518 6,23 4,50 0,048 RJG-1 AF038963 5,50 4,44 0,230 2-50AS NM 002534 3,84 3,51 0,480 STAT1 M97935 3,41 3,18 0,656 PI3-kinase NM 006219 1,99 1,49 0,026 IL-15 U 14407 1,68 1,55 0,502 IP-10 X02530 1,55 1,33 0,109 MMP-! M13509 1,47 1,32 0,128 P4HA1 M24486 1,41 1,14 0,020 caspase 7 U67319 1,37 1,13 0,040 PD 2 NM 002611 1,31 1,02 0,047 ATF-2 X15875 1,20 1,08 0,296 TNF-oc X01394 1,13 1,01 0,283 RGS2 NM002923 1 ,11 1 ,05 0,603 Genes reprimidos SNN NM 003498 0,93 1 ,09 0,079 hsp90 X15183 0,93 1 ,11 0,141 c-myc L00058 0,85 0,95 0,203 AI-AT K01396 0,84 1 ,04 0,199 HLA-DRA J00194 0,78 1 ,01 0,074 CO T M58525 0,78 0,87 0,261 NFKB M58603 0,74 0,90 0,092 HLA-DP 83664 0,72 0,91 0,039 ?? ?-1 M59906 0,65 0,96 0,005 CXCR4 AF005058 0,64 0,77 0,195 IL-2 NM 000586 0,47 0,90 0,001 De los 25 IRG, 24 fueron sobrerregulados, y 11 IRG fueron reprimidos como respuesta a la primera inyección de interferón beta. Estos 25 IRG fueron combinados en un modelo de diagnóstico que fue usado para construir curvas de rendimiento diagnóstico para medir su intensidad de diagnóstico (Figura 9) . La intensidad de diagnóstico del modelo de 25 IRG en la primera inyección de interferón beta fue comparada con la intensidad de diagnóstico del volumen de lesión T2 de los valores de referencia (pretratamiento con interferón beta) . También se construyó un modelo de diagnóstico que combinó el volumen de lesión T2 de los valores de referencia y los IR para los 25 IRG. La zonda por debajo de la curva fue de 0,76 para el volumen de lesión T2 solamente, de 0,82 para el modelo de IRG, y de 0,85 para el volumen de lesión de T2 combinado con IRG, lo que indica que la inducción de IRG diferencial después de la primera inyección de interferón beta fue un fuerte elemento de diagnóstico de la forma de responder medida a los 6 meses usando RM. La curva muestra que el modelo de IRG de valores de referencia diagnosticó con mayor precisión el resultado de la RM a los 6 meses que la gamagrafía cerebral de RM en los valores de referencia.

Ejemplo 2 Manchado de las membranas de la macromatriz Limpie toda la superficie de la mesa que se utilizará para el experimento a fin de eliminar cualquier exceso de polvo que pueda interferir con el manchado. Luego, cubra el área de manchado con papel 3 MM y coloque las agujas del replicador en el recipiente Tupperware que contiene la solución de limpieza VPllO para las agujas (30 mL de solución a 120 mL de dH20) . Las agujas deben sumergirse hasta la mitad en la solución de limpieza. Mientras que las agujas se encuentran "en remojo", corte la cantidad necesaria de membranas Hybond-N+ para realizar el experimento. Por ejemplo, utilizando guantes y con ayuda de una regla, marque rectángulos de 74mm x 115mm en la capa de papel utilizada para proteger el papel Hybond. Asegúrese de no ejercer demasiada presión sobre el papel y la membrana con las manos o los codos e intente que el contacto con el papel que cubre el centro de lo que será su membrana sea el menor posible. Además, asegúrese de que la membrana no se deslice hacia los costados por debajo de la cubierta de papel y utilice una regla o escalpelo limpio o unas tijeras limpias para cortar por las líneas marcadas .

Luego, coloque cada membrana en una bandej Nalge Nunc cortando dos de las esquinas y utilizando un lápiz para marcar un pequeño número de identificación en el extremo de la membrana. La curvatura del papel debe orientarse hacia arriba al colocarlo dentro de la bandeja para que los extremos no se enrollen hacia arriba al realizar el manchado de la membrana. Si es necesario reducir los extremos de la membrana para que se ajuste al tamaño de la bandeja, se recomienda cortar la parte inferior ya que la parte superior se utilizará para alineación en el cásete del Phosphorlmager una vez finalizado el experimento.

Sumerja las agujas en la solución de limpieza de 7 a 10 veces y transfiera sobre papel secante sin pelusa VP522, dejándolas apoyadas durante 5 segundos. Sumerja las agujas en dH20 de 7 a 10 veces, vuelva a transferir y déjelas apoyadas durante 5 segundos. Repita este último paso con otro tubo de dH20 y luego sumerja las agujas en isopropanol de 7 a 10 veces, transfiera, y deje secar al aire. Retire las placas de 96 pocilios de ADN de los -20 °C para descongelarlas durante este tiempo .

Una vez que las agujas se encuentren secas y el ADN se haya descongelado por completo, coloque cada placa de 96 pocilios de ADN dentro del equipo Library Copier™ con la numeración correspondiente. Ubique las agujas en el ADN correspondiente y haga una mancha sobre el papel secante sin pelusa para "preparar" las agujas para el manchado y vuelva a colocarlas en la placa de 96 pocilios. Posicione el dispositivo de registro por encima de la parte superior de una bandeja que contenga una de las membranas y luego retire las agujas del ADN y manche la membrana insertando suavemente las agujas guía en el primer orificio de la primera hilera de orificios guía en la bandeja del replicador. Deje las agujas apoyadas sobre la membrana durante 5 segundos antes de retirarlas y volver a colocarlas en la placa de ADN.

Repita el paso anterior para los orificios 2 y 3 de la primera hilera y luego pase a la segunda bandeja de ADN y prepare las agujas. Repita los dos pasos anteriores utilizando los orificios 1 a 3 de la segunda hilera de orificios guía. Pase a la tercera bandeja de ADN y prepare las agujas. Una vez más, repita los pasos anteriores utilizando los orificios 1 a 3 de la tercera hilera de orificios guía. Ejecute los pasos anteriores con el resto de las membranas, salteando cualquier preparación de las agujas dado que ya se ha realizado. Deje secar todas las membranas al aire y luego almacénelas entre dos hojas de papel 3MM hasta su desnaturalización al día siguiente, y vuelva a lavar las agujas antes de su almacenamiento.

Rad omarcado de ARN con 32P para su uso en experimentos con macromatrices Agregue 5 pg de ARN a 10 uL de agua ultrapura MILLI-Q (10 uL de volumen final) . Luego, agregue 6 µ?, de mezcla de primers (cebadores) anclados a T23ACG (100 pmol/ L) y mezcle bien, aunque delicadamente. Para preparar la mezcla de cebadores anclados a T23ACG (por reacción) : primer (3 L) : desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP, por sus siglas en inglés) (1,5 L) ; y la desoxicitidina trifosfato (dCTP, por sus siglas en inglés) (40 µ?) (1,5 µ??) - Para el dNTP, mezcle iguales volúmenes de 10 mM de cada uno de los siguientes: desoxiadenosina trifosfato (dATP, por sus siglas en inglés) , desoxiguanosina trifosfato (dGTP,por sus siglas en inglés) , y desoxitimidina trifosfato (dTTP, por sus siglas en inglés). Luego, deje incubar por 10 minutos a 72 °C. Enfríe en hielo durante 2 minutos. Centrifugue la condensación. Mientras la preparación se está incubando, prepare la siguiente mezcla de hibridación (por reacción) : 5x transcriptasa inversa (5 µ?? ) ; dicloro difenil tricloroetano (DDT, por sus siglas en inglés) (3 µ?? ) ; inhibidor de la ribonucleasa (R Ase, por sus siglas en inglés (1 µ?) ; y 32P dCTP (2 µ?? ) .

Después de transcurridos 10 minutos y luego de haber enfriado y centrifugado la muestra, agregue 11 µ?< de mezcla de hibridación a cada reacción y deje incubar a 42 °C durante 2 minutos. Luego, agregue 1,5 µ?? de transcriptasa inversa Superscript II (200 U/ µ??) a cada reacción y mezcle suavemente. Deje incubar a 42 °C durante 2 horas. Este es un buen momento para desnaturalizar el ADN en las membranas de la macromatriz manchadas el día anterior (por ejemplo, 12 a 24 horas antes) . Vierta solución desnaturalizante (DB, por sus siglas en inglés) en un recipiente Tupperware grande. Coloque las membranas (con el lado del ADN orientado hacia arriba) en la solución, asegurándose de que queden sumergidas y no se superpongan. Deje las membranas en la DB durante 10 minutos. Luego de transcurridos 10 minutos, traslade las membranas a un baño de dH20 con los mismos recaudos descriptos anteriormente. Coloque la caja sobre el agitador elíptico a velocidad baja durante 10 minutos. Traslade las membranas a -600 mL de solución neutralizante ( B, por sus siglas en inglés) y colóquelas sobre el mismo agitador por 10 minutos más. Traslade las membranas a dH20 y agite durante 10 minutos para enjuagar la NB de las membranas. Deje secar las membranas al aire sobre papel 3MM. Una vez secas, almacene las membranas entre 2 trozos de papel 3MM hasta su hibridación.

Una vez transcurridas las 2 horas a 42 °C, agregue 15 mL de NaOH 0,1 M filtrado esterilizado y deje incubar los tubos a 70 °C durante 20 minutos para hidrolizar el ARN. Después de 20 minutos, agregue 15 de HC1 0,1 M filtrado esterilizado para neutralizar la reacción. Prepare las columnas de G50 por agitación excéntrica breve, rompiendo las partes inferiores y por rotación en la máquina centrífuga frigorífica o la microcentrífuga refrigerada Beckman de laboratorio durante 1 minuto a 3000 rpm. Coloque la columna con cuidado dentro de un tubo Eppendorf nuevo, para no agitar la resina. Agregue lentamente el cADN radiomarcado con 32P en forma directa a la resina (60 pL) .

Luego, someta la columna a rotación a 3000 rpm, durante 2 minutos en la misma máquina centrífuga y retire la columna de los tubos Eppendorf. Agite el flujo continuo para mezclarlo asegurándose de que ninguna de las muestras presente un color rosado, dado que esto indica una remoción incompleta del isótopo excedente. Si los volúmenes de muestra parecen variar significativamente o si los tubos Eppendorf no se reemplazaron antes de la elución de radioactividad, pueden utilizarse dispositivos de filtrado centrífugo MICROCON (MILLIPORE, Billerica, MA) para concentrar cuidadosamente las muestras. Esto sólo se considera necesario en el caso de una gran diferencia de volúmenes (una diferencia >100uL o según se considere adecuado) . Agregue 1 \i de cada tubo de flujo continuo a un vial de centelleo correspondiente con 2 mL de líquido de centelleo (obtenido de la repipeta por el residuo sólido radioactivo) (simplemente incorpore la punta completa con radioactividad) . Tape y agite en forma excéntrica cada vial de centelleo para mezclarlo.

Utilice la diapositiva 6 del programa de la parte inferior del lector de centelleo y ejecute (menú principal >conteo automático: seleccionar) . Compruebe la uniformidad de las lecturas de centelleo, si son aceptables; luego agregue 50 L de ADN COT-1 (1 ug/pL) y 5 µ?, de ADN Poly-A (2 pg/L) . Luego, prepare la siguiente mezcla: 4X Tampón salino de citrato de sodio (SSC, por sus siglas en inglés) (44 L de lOx SSC-filtrado) ; dd¾0 (45 L) ; y dodecilsulfato sódico (SDS, por sus siglas en inglés) al 0,1% (pL SDS-filtrado al 10%) . Agregue 90 iL de la mezcla a cada tubo, agite en forma excéntrica, centrifugue las gotas, deje incubar en un bloque de calefacción a 95 °C por 5 minutos para desnaturalizar el ADN y someta a hibridación a 65 °C durante 2 horas.

Este es un buen momento para preparar las membranas . Para hacerlo, sumerja primero la membrana en agua y enróllela con el lado del ADN hacia adentro. Agregue a la botella de hibridación precalentada correspondiente. Agregue 10 mL de tampón CHURCH a 65 °C y enrolle lentamente el tampón sobre la membrana para evitar la formación de burbujas de aire o debajo de la membrana, promoviendo así el secado de la membrana. Coloque la reacción en un horno de hibridación rotativo hasta que la mezcla de hibridación esté lista. Agregue 200 µ? de la mezcla de hibridación apropiada a cada tubo y vuelva a colocarlos de inmediato en el horno de hibridación para dejarlos incubando durante la noche..

Prepare 1L de soluciones de lavado 1 y 3 , 2L de solución de lavado 2, y precaliente a 65 °C a baño maría. Una vez que las membranas se hayan sometido a hibridación durante 16 a 24 horas, retire las botellas, de a dos por vez, del horno de hibridación, vierta la mezcla de hibridación en un gran vaso de precipitados para residuos radioactivos (este vaso de precipitados se utiliza sólo para el almacenamiento temporario de residuos dado que todos los residuos serán trasladados a bidones de seguridad para residuos radioactivos de 10L de capacidad y se registrarán como corresponde en la planilla de registro de residuos) , agregue aproximadamente 50 a 100 mLs de solución de lavado 1, vuelva a tapar la botella y agite la membrana para enjuagarla, vierta el enjuague y agregue 1/4 a 1/3 de una botella de solución de lavado 1 y vuelva a colocar las botellas tapadas herméticamente dentro del horno de hibridación y deje incubar durante 15 minutos. Luego de transcurrido este tiempo, deseche el tampón, agregue la misma cantidad de solución de lavado 2 y deje incubar durante 15 minutos, y repita el paso de lavado utilizando la solución 3.

Una vez finalizado el lavado, utilice agitación para trasladar la membrana a la parte superior del cuello de la botella. Use un fórceps para retirar la membrana, con el lado del ADN orientado hacia arriba, y colocarla en un recipiente Tupperware limpio con dH20 para enjuagar y quitar el SDS. Transfiera brevemente las membranas secas a un trozo de papel 3 M y alinee las membranas en ángulo recto de la mejor manera posible entre dos trozos de envoltorio plástico Sarán™. La utilización de un trozo de papel con líneas dibujadas en él a modo de guía resulta útil, al igual que el uso de dos pares de fórceps para disponer las membranas en su lugar. Exponga las membranas al cásete del equipo Phosphorlmager durante aproximadamente 3 días (ver abajo) . Traslade las membranas a un cásete de película y cree una copia digital de los datos para cada grupo de membranas, Captura de datos de la macrontatriz Luego de que la pantalla del cásete haya estado expuesta a las membranas durante 2 a 3 días, escanee la imagen resultante utilizando STORM Phosphorlmager y guarde el archivo .gel resultante para la carpeta MICROMAT IZ en Ransoshared. Una vez escaneada la imagen y guardado el archivo, abra el archivo en IMAGEQUATMT para capturar los datos. Comience verificando los ajustes de preferencia en el menú principal desplegable "Preferencia" La opción "Grilla por Columnas Mayores" no debe estar marcada; sólo deben seleccionarse las opciones "Nombre" y "Adición por encima del nivel de fondo" para el informe de volumen generado bajo "Ajustes de informe de volumen"; y la corrección de fondo predeterminada debe configurarse en "Mediana local".

Luego, seleccione "Ajuste de escala de grises" del menú desplegable "Ver" . Ajuste el color hasta que todas las manchas sean visibles, sin que queden demasiado expuestas—todas las manchas continúan siendo independientes de las manchas vecinas. Seleccione "Grilla" del menú desplegable "Objeto". Ingrese 24 filas y 36 columnas en la ventana que se abre. Dibuje una grilla sobre una de las membranas, asegurándose de que haya una mancha centrada por cada sección de la grilla. Pueden realizarse ajustes leves mediante la utilización de las flechas o la herramienta de rotación + la tecla Shift pueden emplearse para rotar la grilla completa en el caso de que la membrana no esté alineada de manera adecuada .

Una vez centradas todas las manchas, seleccione "Corrección de fondo" del menú desplegable "Análisis" . Seleccione "Mediana local" y cierre la ventana. En el menú "Análisis", seleccione "Ajustes de informe de volumen" y marque solamente las opciones "Nombre" y "Adición por encima del nivel de fondo" . En "Análisis", seleccione "Informe de volumen". Seleccione "Mostrar" informe. Cierre la ventana que se abre y seleccione Sí en la ventana que aparece solicitándole que abra el archivo en Microsoft Excel. Una vez abierto el programa, borre los títulos de las columnas "Nombre" y "Adición por encima del nivel de fondo" . En "Archivo" , seleccione "Guardar copia como" y guarde una copia en formato *.cvs (delimitado por coma) en la subcarpeta adecuada. Utilizando las flechas, desplace la grilla sobre la siguiente membrana. Repita los pasos anteriores para, todas las membranas restantes. Una vez capturados todos los datos, guarde una copia del archivo *.gel en formato *.tiff . Abra el archivo *.TIFF en el Photoshop Editor y guarde un archivo MPEG de cada membrana específica en el archivo *.TIFF.

A partir de la descripción anterior de la invención, los expertos en el arte percibirán mejoras, cambios y modificaciones. Dichas mejoras, cambios y modificaciones se encuentran dentro de la capacidad de los expertos en el arte y tienen por objeto estar incluidas en las reivindicaciones anexas.

Claims

Reivindicaciones

1. Un método para determinar la eficiencia del tratamiento con interferon beta (IFN-ß) en un sujeto con esclerosis múltiple (EM) , método que comprende los pasos de: obtener una muestra biológica del sujeto; y determinar el nivel de expresión de al menos un gen regulado por interferon (IRG) y/o su variante; donde una expresión aumentada o reducida del al menos un IRG y/o su variante en comparación con un control indica que el sujeto responderá mal al tratamiento con interferon beta.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la muestra biológica comprende sangre completa.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende, además, aislar el ARN de la muestra de sangre completa .

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye, además, la administración de una dosis de interferon beta a un sujeto antes de obtener la muestra biológica.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que incluye, además, obtener la muestra biológica en menos de alrededor de 12 horas después de la administración de la dosis de interferon beta.

6. Un método para detectar un agente que puede ser usado para el tratamiento de EM, método que comprende los siguientes pasos: proveer a una población de monocitos de sangre periférica (PBMCs) de un sujeto con EM que responde mal al tratamiento con interferón beta; administrar un agente a los PBMCs; y determinar el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante en uno o más de los PBMCs.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, donde una expresión aumentada o reducida del al menos un IRG y/o su variante en comparación con un control indica que el agente no es un candidato para el tratamiento de la EM.

8. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de EM, método que comprende los siguientes pasos: obtener una muestra biológica del sujeto; determinar el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante; y administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente, además de interferón beta, si la expresión de uno o más del al menos un IRG y/o su variante aumenta o disminuye en comparación con un control .

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la muestra biológica comprende sangre completa.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende, además, aislar el ARN de la muestra de sangre completa .

11. El método de acuerdo con la reivindicación 8, que incluye, además, la administración de una dosis de interferón beta al sujeto antes de obtener la muestra biológica.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, que incluye, además, obtener la muestra biológica en menos de alrededor de 12 horas después de la administración de la dosis de interferón beta.

13. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de EM, método que comprende los siguientes pasos: obtener una muestra biológica del sujeto; determinar el nivel de expresión de al menos un IRG y/o su variante; y administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de natalizumab si la expresión de al menos un IRG y/o su variante aumenta o disminuye en comparación con un control .

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde la muestra biológica comprende sangre completa.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende, además, aislar el ARN de la muestra de sangre completa .