MX2012012149A

MX2012012149A - Biomasa y extractivos lignocelulosicos digeribles y metodos para producir los mismos.

Info

Publication number: MX2012012149A
Application number: MX2012012149A
Authority: MX
Inventors: Shishir Chundawat; Leonardo Sousa; Albert M Cheh; Venkatesh Balan; Bruce Dale
Original assignee: Univ Michigan State
Priority date: 2010-04-19
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2012-11-21
Also published as: EP2561084A4; US20130217073A1; BR112012026710B8; BR112012026710B1; BR112012026710A2; AU2011242896C1; AU2011242896B2; CA2797193C; CN102939388B; US9650657B2; EP2561084A2; AU2011242896A1; CN102939388A; WO2011133571A2; MX341792B; CA2797193A1; WO2011133571A3

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para tratar biomasa lignocelulósica para obtener productos útiles a partir de esta.

Description

BIOMASA Y EXTRACTIVOS LIGNOCELULOSICOS DIGERIBLES Y METODOS PARA PRODUCIR LOS MISMOS Antecedentes de la Invención La biomasa celulósica puede ser usada para la producción de varios productos. Sin embargo, muchos métodos convencionales son muy costosos, requiriendo altos costos de capital, tal como para reactores de alta presión y grandes cantidades de aditivos.

Breve Descripción de la Invención La invención en general se refiere a métodos para mejorar la digestibilidad de biomasa lignocelulósica por enzimas para permitir a productos útiles ser elaborados más eficientemente a partir de estos.

Un aspecto de la invención es un método para producir un producto de biomasa lignocelulósica que comprende convertir la celulosa nativa Ip a celulosa lili penetrando la biomasa lignocelulósica con amoníaco líquido para generar una biomasa pretratada, y producir un producto de esta. El amoníaco liquido puede ser amoníaco anhidro. En otras modalidades, el amoníaco líquido es 80%-99% de amoníaco en un solvente. Por ejemplo, el solvente puede ser agua o un solvente orgánico. Ejemplos de solventes que pueden ser usados incluyen agua, acetona, etanol, metanol, isopropanol, diclorometano, acetato de metilo, acetato de etilo, REF.: 236471 cloroformo y combinaciones de los mismos.

En modalidades adicionales, el amoníaco líquido es combinado con acetona para pretratamiento. Como se ilustra en la presente, acetona : amoníaco conduce a formación eficiente de celulosa III a partir de celulosa I. En algunas modalidades, la relación volumen: volumen de amoníaco líquido a acetona puede variar desde 10:90 a 99:1.

La biomasa lignocelulósica puede ser pretratada con amoníaco líquido por aproximadamente 1 minuto hasta 3 horas. Las temperaturas útiles para el tratamiento de la biomasa lignocelulósica con amoníaco líquido (con o sin solvente) incluyen temperaturas que varían desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 140° C, o desde aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 160° C. En algunas modalidades, pueden ser usadas otras temperaturas.

La relación en peso de amoníaco líquido a biomasa lignocelulósica puede ser aproximadamente 8:1 a 2:1.

En algunas modalidades, el pretratamiento también puede incluir extraer componentes de la pared celular de la planta tales como lignina, hemicelulosa, arabinano, y combinaciones y productos de degradación de los mismos . Tal extracción puede ser realizada simultáneamente con pretratamiento con amoníaco líquido anhidro, o la extracción se realiza después del pretratamiento con amoníaco líquido anhidro. Después de la extracción el glucano y/o xilano son sustancialmente retenidos con la biomasa pretratada. La lignina y/o biomasa extraída puede ser convertida a resinas, polímeros, biocombustibles , bioquímicos, calor y/o electricidad .

Sin embargo, en algunas modalidades, el pretratamiento de biomasa lignocelulósica proporciona celulosa III que es fácilmente digerida y/o fermentada aún a pesar de que los componentes de la pared celular de la planta no son extraídos .

Después del pretratamiento la biomasa pretratada puede ser digerida con una combinación de enzimas. Por ejemplo, las enzimas de combinación pueden incluir al menos una exocelulasa y al menos una endocelulasa. De este modo, la combinación de enzimas puede incluir Cel7A (Celobiohidrolasa I), Cel6A (Celobiohidrolasa II) y Cel7B (EG I), de Trichoderma reesei. La combinación de enzimas también puede incluir Cel5A_tr, de Trichoderma reesei, Cel5A_ac es de Acidot ermus cellulolyticum, o una combinación del mismo. En algunas modalidades, la combinación de enzimas puede incluir además celulasa Cell2A, Cel61A, Cel61B de Trichoderma reesei, o una combinación del mismo.

Sin embargo, como se ilustra en la presente, la conversión significante de glucano y xilano a azúcares y/u oligosacáridos es fácilmente lograda debido a una alta relación de biomasa pretratada a enzima total. Por ejemplo, la hidrólisis enzimática de la biomasa pretratada puede proceder a una relación que es al menos 1.5 veces más rápida que la biomasa que no ha sido pretratada con los procedimientos de pretratamiento con amoníaco líquido descritos en la presente.

En algunas modalidades, el amoníaco y/o el solvente usado para pretratamiento son reciclados. En otras modalidades, el amoníaco líquido y/o el solvente son reutilizados para pretratar otro lote de biomasa lignocelulósica. Tal reciclaje y/o re-utilización del amoníaco líquido y/o solvente puede ser realizada en forma de lotes o en forma de semi- lotes o continuamente.

El producto finalmente generado después de realizar los métodos de pretratamiento descritos en la presente puede ser un biocombustible .

Otros aspectos y modalidades de la invención son además descritos abajo.

Breve Descripción de las Figuras La FIG. 1A es un diagrama de flujo de proceso que muestra la conversión bioquímica de biomasa lignocelulósica. La FIG. IB muestra un diagrama de proceso para pretratamiento a base de amoníaco líquido extractivo llevado a cabo en biomasa lignocelulósica. El proceso involucra el uso de: 1) una célula de pretratamiento de amoníaco y 2) una célula de separaciones/colección extractivas.

Las FIGS . 2A y 2B son imágenes de microscopio de electrón de alta resolución que muestra el tipo de tejido y pared celular sin tratar (Fig. 2A) y amoníaco bajo (0.5:1 amoníaco a biomasa 0.6:1 carga de agua a biomasa) Explosión/Expansión de Fibra de Amoníaco (AFEX) tratada (Fig. 2B) con rastrojo de maíz. Las letras M, P, SI, S2 y S3 significan lámina media, pared celular primaria y capas de pared celular secundaria 1-3, respectivamente.

Las FIGS. 3A y 3B proporcionan (Fig. 3A) un esquema para convertir celulosa I a otra celulosa alomorfa usando diferentes químicos y (FIG. 3B) espectro de difracción de rayos-X en polvo obtenido para diferentes alomorfos de celulosa .

La FIG. 4A muestra el espectro de difracción de rayos-X en polvo de celulosa (Celulosa I) tratada con amoníaco líquido (Celulosa III; 0.5 hr, 10 °C, 7:1 carga de amoníaco biomasa líquida, 0.05:1 carga de agua a biomasa seca) , hidróxido de sodio (Celulosa II) , 28% de hidróxido de amonio (1 hr, 4 C, 10:1 carga líquida a biomasa seca) y ácido fosfórico concentrado (celulosa amorfa) en modalidades de la presente invención. El avicel fue el sustrato celulósico en todos los casos. El eje-Y y el eje-X representan conteos de intensidad y ángulos dos-theta, respectivamente.

La FIG. 4B muestra espectro de difracción de rayos-x en polvo de celulosa sin tratar (Celulosa I) y tratada con amoníaco líquido (Celulosa III; 0.5 hr, 10 °C, 7:1 carga de amoniaco a biomasa seca, 0.05:1 carga de agua a biomasa seca) en modalidades de la presente invención. Avicel, borras de algodón y algodón nativo fueron los sustratos celulósicos usados. Los ejes-Y y ejes-X representan conteos de intensidad y ángulos dos theta, respectivamente.

La FIG. 5 muestra el porcentaje de conversión de glucano de diferentes alomorfos de celulosa (véase FIG. 4A para detalles en condiciones de preparación de muestra) cuando se somete a hidrólisis enzimática por 6 y 24 horas por SPEZYME CP y NOVOZYME 188 a 50°C en modalidades de la presente invención.

La FIG. 6 muestra el efecto de temperatura de tratamiento de amoníaco líquido en la digestibilidad enzimática de celulosa III en modalidades de la presente invención. La celulosa III se derivó de Avicel. La digestibilidad enzimática de la celulosa III, a 5 diferentes regímenes de temperatura, se condujo por 24 horas usando 1.5 FPU/g de glucano de Spezyme CP ( suplementado con Novo 188; FPU = unidades en papel filtro de la enzima) . A temperaturas arriba de 373 K (99.85°C), la degradación de celulosa vía reacciones Maillard muestra abajo resultados en reducir el rendimiento de hidrólisis, indicando que temperaturas inferiores podrían ser benéficas para minimizar la formación de productos de descomposición a base de glucano.

La FIG. 7 muestra la digestibilidad enzimática de celulosas sin tratar (Celulosa I) y tratadas con amoníaco líquido (Celulosa III) en modalidades de la presente invención (véase FIG. 4B para detalles en condiciones de preparación de muestra) . Fibras de borlas de algodón y algodón nativo fueron los sustratos celulósicos y la carga de enzima fue 1.5 ó 15 FPU/g de glucano de Spezyme CP (suplementada con Novo 188) . El eje Y representa el porcentaje de conversión de glucano después de 6 ó 24 horas de hidrólisis.

La FIG. 8A ilustra el cambio relativo en la cantidad de alomorfos cristalinos presentes en Avicel (AV) , con o sin tratamiento de amoníaco + agua (N = carga de amoníaco y W = carga de agua, por unidad de biomasa en peso seco) con base en intensidades pico espectrales de Raman (número de onda I) a números de onda respectivos (por ejemplo, 380 y 350; cm"1) . Las condiciones de pretratamiento se muestran en la leyenda de la figura. La relación de las alturas del pico de Raman 380 y 350 cm"1 se usaron como una medida de la cantidad de celulosa I que permanece en la muestra después del tratamiento, donde Pfc(380/350) = l-(I380l35o); y %? (380/350) =100n^(380/350)] AV.„o /[Fjt(380/350)]Av-i .

La FIG. 8B ilustra la digestibilidad enzimática (15 FPU Spezyme CP celulasa/g de glucano) de rastrojo de maíz sin tratar (CS) , CS tratado con AFEX convencional (AFCS, formado a 130° C por 15 min. usando 1;1 carga de amoníaco a biomasa seca, 0.6:1 carga de agua a biomasa seca) y rastrojo de maíz tratado con amoníaco líquido (rico en celulosa III) . No se formó celulosa III durante el AFEX convencional. La celulosa III en rastrojo de maíz tratado con amoníaco se produjo tratando AFCS con amoníaco líquido anhidro (7:1 carga de amoníaco a biomasa seca, 0.05:1 carga de agua a biomasa seca) a 25 °C por 2 hrs .

La FIG. 9 ilustra el efecto de la relación en peso de carga de amoníaco a biomasa seca en la formación de celulosa III durante el pretratamiento con amoníaco líquido como se detecta por difracción de rayos-X. Las relaciones en peso de amoníaco a Avicel tratadas fueron: 6:1, 3:1, 2:1 y 1:1 de amoníaco :Avicel (p:p) . El pretratamiento fue por 10 minutos, excepto para la muestra de 6:1 de amoníaco : vicel 0 min. que se muestreó inmediatamente después de contraer la muestra con amoníaco líquido. El Avicel sin tratar fue un control .

La FIG. 10A muestra una correlación de resultados de difracción de rayos-X y espectroscopio Raman para detectar formación de celulosa III dentro de rastrojo de maíz durante el pretratamiento a base de amoníaco líquido. Las condiciones de pretratamiento fueron idénticas a aquellas descritas anteriormente para la FIG. 8B para rastrojo de maíz tratado con amoníaco líquido (rico en celulosa III) .

La FIG. 10B muestra una correlación entre la extensión de formación de celulosa III dentro del rastrojo de maíz y AVICEL para las mismas condiciones de pretratamiento líquido con amoníaco usada como en la FIG. 10A, indicando que la celulosa I puede ser convertida a celulosa III en ambos de estos sustratos usando condiciones de pretratamiento con amoníaco similares.

La FIG. 11 ilustra gráficamente la correlación entre la pérdida de lignina y % de conversión de glucano. En general, la remoción incrementada de lignina se correlaciona con la conversión incrementada de glucano. La lignina se removió de la biomasa usando un proceso a base de amoníaco extractivo que permite la producción de celulosa III usando amoníaco líquido junto con extracción de componentes de la pared celular.

La FIG. 12 muestra la composición de rastrojo de maíz después del pretratamiento por AFEX convencional o pretratamiento líquido con amoníaco extractivo (véase tabla 3 para detalles en condiciones de pretratamiento) . El porcentaje en peso de los varios componentes extraídos por la combinación del pretratamiento del procedimiento extractivo con amoníaco líquido con respecto al control sin tratar se muestra abajo en el eje-X. De este modo, el procedimiento de pretratamiento líquido con amoníaco extractivo extrajo 73% del Arabinano en el rastrojo de maíz y 34.3% de la lignina insoluble en ácido (la lignina soluble en ácido no se midió) . Sin embargo, el pretratamiento con amoníaco líquido-extractivo extrajo solamente 6.3% de glucano, dejando el resto en la biomasa pre-tratada.

La FIG. 13 ilustra gráficamente el % de conversión de glucano observado después de la digestión enzimática por 12, 24 y 72 horas para los siguientes sustratos: rastrojo de maíz tratado con AFEX convencional, rastrojo de maíz tratado con amoníaco líquido extractivo, Avicel sin tratar (celulosa I) y Avicel pretratado con amoníaco líquido para generar celulosa III. La enzima empleada fue 15 mg de celulasa Accelerasa 1500 (Genencor-Danisco) por gramo de glucano y los sustratos celulósicos se incubaron a 50°C con agitación a 250 RMP por los tiempos indicados.

Las FIGS . 14A-14D ilustran la conversión de glucano y xilano para rastrojo de maíz pretratado rico en celulosa I (Figs. 14A, 14C) y rico en celulosa III (Figs. 14B, 14D) a alta carga de sólidos para carga de celulasa baja (15 mg/g de glucano) y alta (30 mg/g de glucano) después de 168 h de hidrólisis. El rastrojo de maíz pretratado rico en celulosa-I se obtuvo después del pretratamiento convencional con AFEX (130 °C, 1:1 carga de amoníaco a biomasa seca, 0.6:1 carga de agua a biomasa seca, tiempo de reacción 15 min) . El rastrojo de maíz pretratado rico en celulosa-III se obtuvo después del pretratamiento con amoníaco líquido (100 °C, 7:1 carga de amoníaco a biomasa seca, 0.05:1 carga de agua a biomasa seca, 2 hr de tiempo de reacción) sin extracción.

La FIG. 15 ilustra el efecto de mezclar enzimas para lograr la digestión óptima de rastrojo de maíz no extraído que se pretrató con amoníaco líquido (100 °C, 7:1 carga de amoníaco a biomasa seca, 0.05:1 carga de agua a biomasa seca, tiempo de reacción 2 hr) para generar celulosa III. Se observó la digestión de tanto glucano como xilano. La cantidad total de enzima empleada fue 30 mg y la digestión se dejó proceder por 24 horas. Las mezclas se identificaron por los números a lo largo del eje-X. Las enzimas 1, 2 y 3 fueron Acelerasa 1500 (A) , xilanosa Multifect (X) y pectinasa Multifect (P) , respectivamente. Las mezclas de enzima 4, 5 y 6 fueron 50% A y 50% X, 50% A y 50% P, y 50% P y 50% X, respectivamente. La mezcla 7 tiene cantidades iguales de A, X y P. Las mezclas 8, 9 y 10 tienen 67% A-16% X-17%P, 67% X-16% A-17%P y 67% P-16% A-17%X, respectivamente.

Las FIGS . 16A-16F ilustran la digestibilidad enzimática de celulosa como una función de su estado cristalino y las celulasas empleadas. El curso del tiempo de hidrólisis se muestra para celulosa I (símbolos de rectángulo) y III (símbolos de cuadrado) derivada de Avicel (Fig.l6A), borlas de algodón (Fig. 16C) y fibras de algodón (Fig. 16E) . El espectro de difracción de rayos-X para sustratos respectivos se muestra arriba de la gráfica de porcentaje de rendimiento de glucosa contra tiempo. El Avicel se hidrolizó por 1.5 FPU Spezyme CP de celulasa/g de glucano, mientras los sustratos derivados de algodón se hidrolizaron por 15 FPU Spezyme CP de celulasa/g de glucano. La digestibilidad enzimática se muestra para celulosa I (barras abiertas) y III (barras sombreadas) derivadas de Avicel (Fig. 16B) , borlas de algodón (Fig. 16D) y fibras de algodón (Fig. 16F) para varias combinaciones de exocelulasas (Cel7A, Cel6A) y endocelulasas (Cel7B, Cel5A) de Trichoderma reesei. Las cargas de enzima equivalente agregadas para cada ensayo fueron 2.5 mg de cada una de celulasa/g de Avicel ó 10 mg de cada una de celulasa/g de sustratos derivados de algodón. Además, se agregaron 10% de beta-glucosidasa de celulasa total a cada mezcla de ensayo para prevenir la acumulación de celubiosa. En todos los casos, la celulosa III se preparó a 95° C, 7 : 1 de carga de amoníaco a biomasa seca, 0.05:1 carga de agua a biomasa seca, con tiempo de reacción de 30 min.

La FIG. 17 ilustra que las endocelulasas incrementan el grado de efecto sinergístico (DSE) sobre aquel observado para exocelulasas (Cel7A + Cel6A) durante la hidrólisis de celulosa cristalina I (barras sombreadas) y III (barras abiertas) . Las endonucleasas Cel7B o Cel5A_tr (ambas de Trichoderma reesei) y Cel5A_ac (de Acido ermus cellulolyticu ) se combinaron con exocelulasas Cel7A + Cel6A como se indica a lo largo del eje-x de la gráfica. Los sustratos probados fueron celulosa I y celulosa III derivada de Avicel . Los sustratos se incubaron con 2.5 mg de las enzimas purificadas indicadas. Se agregó beta-glucosidasa (10% de celulasa total agregada) a cada ensayo para prevenir la inhibición de celobiosa. El eje-y muestra el grado de sinergia para las diferentes combinaciones de enzimas, donde un valor más grande indica digestión sinergística incrementada del sustrato.

La FIG. 18 muestra que agregar acetona como un co-solvente durante el pretratamiento con amoníaco líquido conduce a conversión eficiente de celulosa I a celulosa III. Se trató Avicel con amoníaco líquido que contiene acetona a 25 °C por diferentes tiempos (2.5, 7.5, 10 y 60 min.) . Como se ilustra, sustancialmente toda la celulosa I se convirtió a celulosa III dentro de 2.5 min de incubación en la mezcla de amoníaco líquido/acetona.

Las FIGS. 19A-19D muestran la fermentabilidad microbiana de rastrojo de maíz pretratado rico con celulosa III al 6% de hidrolizado de carga de glucano (véase FIGS. 14A-14D para detalles en cómo se prepara este hidrolizado) que se obtiene después del tratamiento con amoníaco líquido (100 °C, 7:1 carga de amoníaco a biomasa seca, 0.05:1 carga de agua a biomasa seca, tiempo de reacción 2 hr) sin extracción. La levadura diseñada por ingeniería (Saccharomyces cerevisiae 424A) fue capaz de crecer a altas densidades celulares (FIG. 19A) y fácilmente fermenta la glucosa (FIG. 19B) y xilosa (FIG. 19C) en el hidrolizado para producir al menos 40 g/L de etanol (FIG. 19D) en el periodo dado de fermentación sin adición de algunos nutrientes exógenos o destoxificación de biomasa pretratada.

Descripción Detallada de la Invención La invención en general se refiere a pretratamiento de biomasa lignocelulósica para generar una biomasa pretratada que es más fácilmente digerida a azúcares útiles, disacáridos y oligosacáridos . Como se sabe para uno de habilidad en la técnica, los procesos de liberación de productos útiles a partir de biomasa lignocelulósica son más complicados y típicamente involucran más etapas que procesos para liberar productos de celulosa sustancialmente pura.

En la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas, se hace referencia a los dibujos acompañantes, los cuales forman una parte de estos, y en los cuales se muestran por medio de ilustración modalidades preferidas específicas en las cuales la invención puede ser practicada. Estas modalidades son descritas en detalle suficiente para permitir a aquellos expertos en la técnica practicar la invención, y se entiende que otras modalidades pueden ser utilizadas y que los cambios químicos, de procedimiento y otros pueden hacerse sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. La siguiente descripción detallada está, por lo tanto, no siendo tomada en un sentido limitante, y el alcance de la presente invención es definido solamente por las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de equivalentes a las cuales tales reivindicaciones están tituladas.

Definiciones El término pretratamiento de "Explosión de Fibra de Amoníaco" o "Expansión de Fibra de Amoníaco" (AFEX, por sus siglas en inglés) como se usa en la presente, se refiere a un proceso para pretratar biomasa con hidróxido de amonio para solubilidad lignina/hemicelulosa y redepositarla de entre las paredes celulares de la planta a las superficies externas de la pared celular de la planta de la biomasa. El AFEX involucra típicamente tratamiento de biomasa con hidróxido de amonio y las concentraciones de hidróxido de amonio comúnmente usadas durante el intervalo convencional de AFEX entre 55-65%. Las condiciones convencionales de AFEX también involucran típicamente aproximadamente 1:1 de carga de hidróxido de amonio a biomasa, 0.6:1 agua a biomasa, 130 °C, y tiempo de reacción 15 minutos. Debido a la adición de cantidades significantes de agua en el proceso convencional de AFEX, el estado de celulosa cristalina III no se produce del estado cristalino de celulosa nativa I. Sin embargo, un pretratamiento de AFEX altera la matriz de lignocelulósica, de este modo modificando la estructura de lignina, parcialmente hidrolizando hemicelulosa, e incrementando la accesibilidad de celulosa y la hemicelulosa restante a degradación enzimática subsecuente. La lignina es el impedimento primario a la hidrólisis enzimática de biomasa nativa, y la remoción o transformación de lignina es un mecanismo sospechoso de varias de las tecnologías de pretratamiento conducente, incluyendo AFEX. Sin embargo contrario a muchos otros pretratamientos , las temperaturas inferiores y condiciones no acídicas del proceso AFEX previenen a la lignina y/o hemicelulosa de ser convertida en furfural, hidroximetil furfural, fenólicos y ácidos orgánicos que podrían afectar negativamente la actividad microbiana/enzimática . El proceso además expande e hincha las fibras de celulosa y además rompe la hemicelulosa amorfa en biomasa lignocelulósica. Estos cambios estructurales abren la estructura de la pared celular de la planta permitiendo conversión más eficiente y completa de biomasa lignocelulósica a productos de valor agregado mientras se preservan el valor nutriente y composición del material.

Véanse, por ejemplo, los métodos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,106, 888, 7187,176, 5,037,663, y 4,600,590, todas las cuales están de este modo incorporadas por referencia en su totalidad como si se expusieron completamente en la presente.

El término "biomasa" como se usa en la presente, se refiere en general a materia orgánica cosechada o recolectada de un recurso biológico renovable como una fuente de energía. El recurso biológico renovable puede incluir materiales vegetales, materiales animales yo materiales producidos biológicamente. El término "biomasa" no está considerado para incluir combustibles fósiles, los cuales no son renovables.

El término "biomasa vegetal" o "biomasa lignocelulósica" o "biomasa celulósica" como se usa en la presente, está propuesto para referirse virtualmente a cualquier materia orgánica derivada de la planta (leñosa o no leñosa) disponible para energía en una base sostenible. Las biomasas vegetales pueden incluir, pero no se limitan a, desechos y residuos de cultivos agrícolas tales como rastrojo de maíz, paja de trigo, paja de arroz, bagazo de caña de azúcar y similares. La biomasa vegetal además incluye, pero no se limita a, cultivos leñosos energéticos, desechos leñosos y residuos tales como árboles, que incluyen árboles frutales, tales como árboles que llevan frutos, (por ejemplo, árboles de manzana, árboles de naranja y similares) , aclareos de bosques de coniferas, residuos de cortezas, aserrín, flujos residuales de la industria del papel y pulpa, fibra de madera, y similares. Adicionalmente cultivos de pastos, tales como varios pastos de praderas, que incluyen pastos como borrazas, césped de pradera, pasto elefante, pitilla grande, pitilla pequeña, pasto banderita, y similares, tienen potencial para ser producidos a gran escala como fuentes de biomasa vegetal adiciona. Para áreas urbanas, las materias primas de biomasa vegetal potenciales incluyen residuos de jardinería (por ejemplo, recortes de pasto, hojas, recortes de árboles, arbustos, etc.) y residuos de procesamiento de vegetales. La biomasa vegetal se conoce por ser la forma más prevalente de carbohidrato disponible en la naturaleza y el rastrojo de almidón es actualmente la fuente más grande de biomasa vegetal fácilmente disponible en los Estados Unidos.

El término "biocombustible" como se usa en la presente, se refiere a cualquier combustible sólido, líquido o gaseoso renovable producido biológicamente, por ejemplo, aquellos derivados de biomasa. La mayoría de los biocombustibies son originalmente derivados de procesos biológicos tales como los procesos de fotosíntesis y pueden por lo tanto, ser considerados como una fuente de energía química o solar. Otros biocombustibles , tales como polímeros naturales (por ejemplo, quitina o ciertas fuentes de celulosa microbiana), no son sintetizados durante la fotosíntesis, pero pueden no obstante, ser considerados un biocombustible debido a que son biodegradables . Son en general considerados por ser tres tipos de biocombustibles derivados de biomasa sintetizada durante la fotosíntesis, es decir, biocombustibles agrícolas (definidos abajo) , biocombustibles de residuos municipales (basura o desperdicios comerciales ligeros y residenciales, con la mayoría de los materiales reciclables tales como vidrio y metal removido) y biocombustibles forestales (por ejemplo, árboles, residuos o flujos de subproductos de productos de madera, fibra de madera, industrias del papel y pulpa) . Los biocombustibles producidos de biomasa no sintetizada durante la fotosíntesis incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de quitina, los cuales son una forma químicamente modificada de celulosa conocida como un polímero de N-acetil glucosamina. La quitina es un componente significante del residuo producido por la industria de acuacultura debido a que comprende las conchas de mariscos.

El término "biocombustible agrícola" , como se usa en la presente, se refiere a un biocombustible derivado de cultivos agrícolas (por ejemplo, granos, tales como maíz), residuos de cosechas, residuos de instalaciones de procesamiento de granos (por ejemplo, cáscaras de trigo/avena, partículas finas de maíz/frijol, materiales fuera de la especificación, etc.), residuos de instalación de producción ganadera (por ejemplo, estiércol, canales, etc.), residuos de instalación de procesamiento de ganado (por ejemplo, partes indeseables, corrientes de limpieza, materiales contaminados, etc.), residuos de instalación de procesamiento de alimentos (por ejemplo, flujos de residuos separados tales como manteca, grasa, tallos, cáscaras, residuos de procesos intermediarios, corrientes de limpieza/enjuague, etc.), subproductos de instalaciones agrícolas de valor agregado (por ejemplo, grano húmedo de destilerías (DWG, por sus siglas en inglés) y jarabe de instalaciones de producción de etanol, etc.), y similares. Ejemplos de industrias ganaderas incluyen, pero no se limitan a instalaciones de, carne de res, cerdo, pavo, pollo, huevo y lácteos. Ejemplos de cultivos agrícolas incluyen pero no se limitan a, cualquier tipo de plantas no leñosas (por ejemplo, algodón), granos tales como maíz, trigo, soja, sorgo, cebada, avena, centeno y similares, herbáceas (por ejemplo, manís), cultivos herbáceos de rotación corta tales como césped de pradera, alfalfa, y así sucesivamente.

La celulosa es un polisacárido de la fórmula (C6Hio05)n, en donde n es un número entero desde 100 - 200 , 000 . De este modo, en general, la celulosa consiste de una cadena lineal de varios cientos a más de diez mil unidades de D-glucosa ligadas ß ( 1?4 ) . El enlace ß ( 1?4 ) es distinto de los enlaces OÍ ( 1?4 ) -glicosídicos presentes en almidón, glicógeno, y otros carbohidratos. Distinto del almidón, la celulosa es un polímero de cadena recta sin enrollar y ramificación. Preferentemente, la celulosa tiene una conformación como varilla extendida y sustancialmente rígida, donde los grupos hidroxilo en la glucosa de una cadena forman enlaces de hidrógeno con moléculas de oxígeno en las mismas o en cadenas vecinas, reteniendo las cadenas firmemente en conjunto lado a lado formando microfibrilos .

Existen varias diferentes estructuras cristalinas de celulosa, las cuales corresponden típicamente a la ubicación de enlaces de hidrógeno entre y dentro de las hebras. La celulosa natural es celulosa I, con estructuras la y ? ß . La celulosa producida por bacterias y algas es enriquecida en Ia (Iaifa) mientras la celulosa de plantas superiores consiste principalmente de Ip ( Ibeta) · La celulosa I es irreversiblemente convertida a celulosa II por tratamiento con NaoH acuoso. La celulosa lili puede ser generada de celulosa I por tratamiento con amoníaco (por ejemplo, usando métodos descritos en la presente) , mientras la celulosa IIIu es generada de celulosa II. Como se refiere en la presente, la celulosa III es celulosa 11^ . La celulosa IV es en general hecha por calentamiento de celulosa III en un solvente apropiado (por ejemplo, glicerol) . Los ángulos 2 T de difracción de rayos-X para las diferentes estructuras cristalinas de celulosa se muestran en la Tabla I.

Tabla 1 El término "contenido de humedad" como se usa en la presente, se refiere a porcentaje de humedad de biomasa (por ejemplo, la biomasa lignocelulósica) . El contenido de humedad se calcula como gramos de agua por gramo de 100% veces biomasa húmeda (materia seca de biomasa más agua) . En algunas modalidades, la biomasa (biomasa lignocelulósica) tiene un contenido de humedad de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 25%. En otras modalidades, la biomasa (biomasa lignocelulósica) tiene un contenido de humedad de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 20%. En modalidades adicionales, la biomasa (biomasa lignocelulósica) tiene un contenido de humedad de aproximadamente 10% hasta aproximadamente 20%. En todavía modalidades adicionales, la biomasa (biomasa lignocelulósica) tiene un contenido de humedad de aproximadamente 15% hasta aproximadamente 20%.

El término "etapa de pretratamiento" como se usa en la presente, se refiere a cualquier etapa propuesta para alterar la biomasa nativa de manera que puede ser más eficientemente y económicamente convertida a compuestos químicos intermediarios reactivos tales como azúcares, ácidos orgánicos, etc., los cuales pueden entonces ser procesados además a una variedad de productos de valor agregado tales como un químico de valor agregado, tal como etanol. El pretratamiento puede influenciar el grado de cristalinidad de un sustrato polimérico, reducir la interferencia de lignina con conversión de biomasa y prehidrolizar algo de los carbohidratos estructurales, de este modo incrementando su digestibilidad enzimática y acelerando la degradación de biomasa a productos útiles. Los métodos de pretratamiento pueden utilizar ácidos de concentraciones variantes (que incluyen ácidos sulfúricos, ácidos clorhídricos, ácidos orgánicos, etc.) y/u otros componentes ales como amoníaco, hidróxido de amonio, cal y similares. Los métodos de pretratamiento pueden adicionalmente o alternativamente utilizar tratamientos hidrotérmicos que incluyen, agua, calor, vapor o vapor presurizado. El pretratamiento puede ocurrir o ser desplegado en varios tipos de contenedores, reactores, pipas, flujo a través de celdas y similares. La mayoría de los métodos de tratamiento causarán la solubilización y/o desestabilización completa o parcial de lignina y/o hidrólisis de hemicelulosa a monómeros u oligómeros de azúcar de pentosa. Una etapa de pretratamiento o proceso único que involucra el uso de amoníaco líquido y/o extracción de componentes de la pared vegetal se describe en más detalle en la presente.

Estructuras de Celulosa La celulosa existe en varios estados polimórficos II, III, y IV) . Los alomorfos de celulosa están compuestos de láminas estratificadas las cuales contienen enlace de hidrógeno intra-cadena e inter-cadena y, en algunos casos; estas láminas pueden interactuar vía unión de hidrógeno (Davis et al., en Agricultural Biomass, Biobased Products, and Biofuels . Chicago, Illinois (2007)). Algunos de los alomorfos de celulosa (I y su relativo inter-convertible Ivi) carecen de enlaces de hidrógeno ínter-lámina y se piensan despliegan empaque de lámina paralelo, mientras los otros (I, II y III) contienen enlaces de hidrógeno ínter-láminas . El paquete de cadena cristalina juega un papel importante en la cinética de la hidrólisis enzimática. Las relaciones relativas de digestión de los diferentes alomorofos de celulosa digerida usando bacteria ruminal se encuentran variando en el siguiente orden: amorfa > lili > IVi > lili > I > II. Por ejemplo, en un estudio, la producción de celobiosa de celulosa lili fue cinco veces superior que la producida de celulosa I cuando la enzima celobiohidrolasa I (Cel7A) se usó (Igarashi et al, FEBS Journal 274 (7) : 1785-1792 (2007)). Cuando se produce usando ciertas condiciones, la celulosa III puede también ser convertida nuevamente a celulosa I ya sea por reacción con glicerol o agua a altas temperaturas.

Los diferentes alomorfos de celulosa pueden ser preparados usando una variedad de métodos y los alomorfos pueden ser distinguidos con base en su perfil de rayos-X o por el uso de espectroscopio Raman. La FIG. 3A muestra un esquema para convertir celulosa I a otros alomorfos usando diferentes químicos. La FIG. 3B muestra el espectro de difracción en polvo de rayos-X de diferentes alomorfos de celulosa. Véase también, Weimer et al., Appl Environ Microbiol. 5 (11) .3101-3106 (1991).

El tratamiento de celulosa I con ácido fosfórico concentrado (>81% p/p; 4o, 1 hr) resulta en completa disolución del sólido, el cual se recuperó como un sólido de baja densidad, esponjoso, por adición de exceso de agua a la solución (Zhang et al., Biotechnology and Bioengineering 97(2), 214-223 (2007); T ang et al., Biomacromolecules 7(2), 644-648 (2006); Swatloski et al., Journal of the American Chemical Society 124 (18), 4974-4975 (2002)). La disolución de celulosa en ácido fosfórico ha sido conocida por alterar completamente la arquitectura súper-molecular de la estructura de celulosa, resultando en su transformación del estado cristalino a amorfo sin cambio en el grado de polimerización. El patrón de difracción de rayos-X para la celulosa amorfa generada representa un espectro relativamente plano sin picos de distinción indicando una pérdida casi completa de crxstalinidad.

El AVICEL (97-99% de contenido de glucano) puede ser tratado con diferentes químicos para obtener varios polimorfos de celulosa para comparar sus patrones de difracción de rayos-X (FIG. 3B) y digestibilidad enzimática bajo cargas de enzima comparable. El AVICEL tratado con hidróxido de sodio (25%, p/p) a 4°C por 1 hora da origen al patrón distinto de celulosa II, con un decremento relativo en el pico de difracción de rayos-X a 2 grados dos-theta (2T) acompañado por un incremento en los picos a 20 y 12 grados 2T.

El tratamiento de celulosa I (AVICEL) con hidróxido de amonio (28-30%, p/p) a 4°C por 1 hora resultó en modificación no significante de la estructura cristalina. Este resultado no es completamente sorprendente, debido a que el hidróxido de sodio es una base más fuerte, y requiere concentraciones mayores de 10-15% para romper la red del enlace de hidrógeno en celulosa nativa I y generar celulosa II .

La formación de celulosa puede ser detectada de su patrón de difracción de rayos-X distinto por desaparición del pico a 22 grados 2T acompañado por formación de un pico prominente a 20 y 12 grados 2T. Tal como un patrón de difracción de rayos-X es comparable con aquel que se ha reportado en la literatura para celulosa III de algodón. El tratamiento de celulosa III con hidróxido de amonio (de concentraciones variantes) también se ha reportado por causar reversión a celulosa I.

Un aspecto de esta solicitud es describir el efecto de la estructura cristalina de celulosa en la digestibilidad de celulosa. Se emplearon varios sustratos celulósicos (por ejemplo, AVICEL, borlas, algodón y rastrojo de algodón) en estos estudios. En una modalidad, la celulosa nativa ?ß puede ser transformada a celulosa lili tratando los sustratos con amoníaco líquido anhidro o soluciones que contienen 80% o más amoníaco. Contrario a ciertos reportes, no existe sustancialmente formación de celulosa III después del tratamiento de celulosa ?ß con hidróxido de amonio. En efecto, la presencia de cantidades sustanciales de agua durante el tratamiento de celulosa ?ß con amoníaco por procedimientos convencionales sustancialmente inhibe la formación de celulosa III.

Pretratamiento con Amoníaco Líquido Un aspecto de la invención es un método para producir un producto de biomasa lignocelulósica que comprende convertir la celulosa nativa Ip al alomorfo de celulosa III altamente digestible tratando la biomasa lignocelulósica con amoníaco líquido. El amoníaco líquido puede ser amoníaco anhidro o una solución de 80%-99% de amoníaco en un solvente. En general, las condiciones de pretratamiento descritas en la presente son de severidad reducida (temperatura, presión, tiempo de residencia y carga química por cantidad de biomasa) y por lo tanto mejoran la viabilidad económica de la biorefinería . En una modalidad, los métodos también involucran extraer un componente de la pared vegetal, tal como lignina de la biomasa lignocelulósica, lo cual se puede hacer durante o después del pretratamiento .

Los métodos descritos en la presente en general permiten la reducción de la carga enzimática por peso de biomasa, lo cual puede además mejorar la viabilidad económica de la biorefinería . El pretratamiento y enzimas en conjunto en general constituyen aproximadamente 27% del costo de operación total en una biorefinería convencional, lo cual es típicamente considerado por ser el segundo factor más importante después del costo de la materia prima (33%) . Es deseable reducir el costo de desconstrucción de biomasa en azúcares fermentables para mejorar la viabilidad económica del proceso de biorefinería.

El efecto de parámetros de pretratamiento (carga de amoníaco/agua, tiempo de residencia, temperatura) en la conversión de celulosa I a III se cuantificó por estudios de espectroscopia Raman y difracción de rayos-X. El grado al cual los glucanos dentro de una muestra de celulosa pretratada llegan a ser accesible para hidrólisis enzimática también se valoró por digestión de las muestras con enzimas seleccionadas. Como se describe en la presente, ciertas combinaciones de enzimas son particularmente efectivas para digestión de precelulosas tratadas, mientras otras combinaciones son menos efectivas.

Las cinéticas de hidrólisis de enzima diferencial para celulosa depende de su forma cristalina, donde el orden de las formas más fácilmente digeridas a menos fácilmente digeridas de celulosa son: Celulosa amorfa > Celulosa lili > Celulosa II > Celulosa I . La velocidad de la hidrólisis enzimática de celulosa lili fue al menos dos veces mayor que la de celulosa nativa I. Como se describe en la presente, el mejoramiento significante en la velocidad de la hidrólisis para celulosa III se puede lograr por el uso de endoglucanasas . Sin embargo, las relaciones óptimas de hidrólisis se obtienen usando combinaciones de exocelulasas y endocelulasas seleccionadas. Las diferencias en el empaque de cadena glucano (vía modificación del enlace de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas) para celulosa III contra la celulosa nativa son probablemente responsables del incremento sustancial en la velocidad de la hidrólisis.

La completa interrupción de los enlaces de hidrógeno intermolecular con celulosa cristalina, usando ya sea ácidos concentrados o líquidos iónicos para solvatar la celulosa seguida por su precipitación con agua, produce principalmente celulosa amorfa. Tal tratamiento puede ayudar a mejorar la velocidad hidrolítica enzimática. No existen actualmente estudios que expliquen por qué la completa interrupción de la red de enlace de hidrógeno de intra lámina e intra lámina de celulosa mejora la actividad de celulasa. Sin embargo, aún aunque la celulosa amorfa es en general más fácilmente digerida, la producción a escala industrial de celulosa amorfa dentro de una biorefinería celulósica es energéticamente costosa y ambientalmente insostenible. Por lo tanto, procesos para generar azúcares útiles y glucanos de otras formas de celulosa son el enfoque de esta solicitud.

Los métodos descritos en la presente permiten a la red de enlace de hidrógeno de celulosa ser alterada de su forma cristalina que se origina naturalmente, llamada celulosa I, a una forma activada llamada celulosa III, la cual es más fácilmente digerida que la celulosa I. Tal conversión de celulosa I a celulosa III es eficientemente realizada haciendo reaccionar la celulosa I con amoníaco líquido anhidro o soluciones que contienen 80% o más amoníaco. La interacción entre cristales de celulosa I y amoníaco líquido conduce a un cambio en el patrón de enlace de hidrógeno intra-cadena e intra-lámina y a la formación de nuevos enlaces de hidrógeno ínter- lámina. En la conversión de celulosa I a III, las moléculas de amoníaco penetran el cristal de celulosa I y forman un complejo cristalino llamado amoníaco-celulosa I donde cada molécula de amoníaco se sienta en una caja distorsionada definida por los bordes de cuatro cadenas de glucano vecinas. Los estudios de difracción de neutrón y rayos-X han mostrado que las moléculas de amoníaco dentro del cristal interactúan con las cadenas vecinas vía enlaces de hidrógeno múltiples. Después de la evaporación de amoníaco, la celulosa no se revierte a su forma cristalina inicial (celulosa I) pero adopta la nueva forma de celulosa III. Las FIGs. 3 y 4 muestran que el espectro de difracción de rayos-X de celulosa I y celulosa III difiere. Los inventores han encontrado que esta alteración estructural adecuada dentro de la red de enlace de hidrógeno de celulosa III mejora su rendimiento total de hidrólisis enzimática por hasta cinco veces comparado con la celulosa nativa I.

Sin embargo, debido a que cantidades reducidas de agua se usan, el costo para recuperación de amoníaco de corrientes de amoníaco acuoso-agua se reduce.

El efecto de los parámetros de pretratamiento de AFEX convencional (Expansión de Fibra de Amoníaco) en la extensión de formación de celulosa III, derivada de Avicel, se estudió usando espectroscopio Raman. La extensión de transformación de celulosa I a III se estimó por la intensidad relativa de picos Raman a 380 y 350 cm"1, con respecto a la muestra estándar de 100% celulosa III que presenta un 85% de decremento en la relación de pico con relación a la celulosa I. Cuando la celulosa I se sometió a AFEX en la presencia de agua (16% o más de agua en NH40H) , hubo solamente una reducción marginal en la relación (3-6%) .

Sin embargo, cuando la celulosa I se trató con amoníaco sustancialmente sin agregar agua (<5% de agua en el amoníaco) hubo una reducción en relación del 31-39%, indicando que una transformación significante de celulosa I ha tomado lugar para formar la celulosa III.

Los resultados obtenidos indican que es factible mejorar simultáneamente la accesibilidad de celulosa (vía remoción de lignina-hemicelulosa que incrusta los fibrilos de celulosa) y alterar la estructura cristalina de celulosa a partir de celulosa I a celulosa III ajustando las condiciones de pretratamiento. En general, el uso de amoníaco líquido anhidro o soluciones que contienen 80% - 85% o más amoníaco permiten la transformación completa de celulosa I a III. La ausencia de agua significante también puede prevenir la reversión de celulosa III nuevamente a celulosa I. Previamente, 40-100% de reversión de celulosa III a celulosa I se observó en la presencia de agua y/o calentamiento excesivo (Lewin & Roldan, J. Polym. Sci. Part C-Polym. Sympos. 36:213-229 (1971)).

Sin embargo, la temperatura de pretratamiento con amoníaco es significante. Por ejemplo, se trató Avicel (celulosa I sustancialmente pura) con amoníaco líquido (7:1 amoníaco :Avicel) por temperaturas variantes (5-130 °C) por 30 min. para estudiar la influencia de temperatura durante el tratamiento de amoníaco en la digestibilidad enzimática. Como se muestra en la FIG. 6, mientras la celulosa I se convirtió a celulosa III bajo todas estas condiciones de reacción, hubo una caída significante en la actividad enzimática de celulasas en la celulosa pretratada a temperaturas arriba de 100°C y el producto a menudo se oscureció a estas temperaturas superiores. Tal oscurecimiento y pobre digestión fue debido a la formación de productos de degradación Maillard los cuales los inventores han observado se forman durante pretratamientos a base de amoníaco a alta temperatura.

El Avicel es celulosa Ip sustancialmente pura. Cuando la biomasa lignocelulósica es pretratada se pueden usar algunas temperaturas superiores . Tales temperaturas superiores pueden ayudar a liberar la lignina y otros componentes de la pared vegetal.

De este modo, mientras las temperaturas inferiores fueron en general suficientes para convertir la mayoría de la celulosa I a celulosa III en muestras celulósicas sustancialmente puras, algunas temperaturas superiores pueden ser usadas para el pretratamiento de biomasa lignocelulósica. Las temperaturas útiles para el pretratamiento de biomasa lignocelulósica con amoníaco líquido incluyen temperaturas que varían desde aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 180 °C. En algunas modalidades, las temperaturas para pretratamiento con amoníaco líquido incluyen temperaturas que varían desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 150 °C. En otras modalidades, las temperaturas para pretratamiento con amoníaco líquido incluyen temperaturas que varían desde aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 140 "C. En modalidades adicionales, las temperaturas para pretratamiento con amoníaco líquido incluyen temperaturas que varían desde aproximadamente 80 °C hasta aproximadamente 120 °C. El amoníaco líquido empleado puede ser amoníaco anhidro o una solución que contiene 80% o más amoníaco.

La biomasa lignocelulósica es en general pretratada con el amoníaco líquido seleccionado por aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, el pretratamiento es por aproximadamente 2 minutos hasta aproximadamente 24 horas. En modalidades adicionales, el pretratamiento es por aproximadamente 3 minutos hasta aproximadamente 6 horas. En otras modalidades, el pretratamiento es por aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 2 horas .

La relación de amoníaco a biomasa puede variar. En particular, la relación en peso de amoníaco a biomasa puede variar de un intervalo de 2:1 a 8:1 de carga de amoníaco a biomasa .

En una modalidad, la biomasa lignocelulósica molida/secada es sometida a un pretratamiento con amoníaco líquido por un tiempo de residencia adecuado, tal como al menos aproximadamente 15 minutos o más, tal como hasta aproximadamente 30, 60, 90, 129, 150, 180, 210 ó 240 minutos, y cualquier intervalo aquí entre, a una temperatura adecuada, tal como al menos aproximadamente cero (0) °C o más, tal como hasta aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 °C, y cualquier intervalo o temperatura específica entre estos. Puesto que la biomasa molida/secada es completamente remojada en el amoníaco líquido, la transferencia de masa será mejorada comparada con un tratamiento de AFEX convencional.

El amoníaco líquido empleado puede ser amoníaco líquido anhidro o una solución de 80%- 99% de amoníaco en un 'solvente. En particular, el amoníaco líquido usado para pretratamiento puede ser cualquier porcentaje de amoníaco desde aproximadamente 80% hasta aproximadamente 99% de amoníaco. En algunas modalidades, el amoníaco líquido es una solución de 82%- 98% de amoníaco en un solvente. En otras modalidades, el amoníaco líquido es una solución de 85%-95% de amoníaco en un solvente. En modalidades adicionales, el amoníaco líquido es una solución de 80%-90% de amoníaco en un solvente. En todavía modalidades adicionales, el amoníaco líquido es una solución de 87%-98% de amoníaco en un solvente. El solvente puede ser agua. Alternativamente, el solvente puede ser un solvente orgánico tal como acetona, etanol, metanol, isopropanol, diclorometano, acetato de metilo, acetato de etilo, cloroformo y combinaciones de los mismos. El reemplazo de agua con solventes volátiles también puede mejorar la extracción de los componentes de la pared vegetal (por ejemplo, lignina) usando los procedimientos de extracción descritos en la presente (véase Ejemplo 4) . En adición, el reemplazo de agua con solventes volátiles puede reducir la energía de entrada para recuperación de amoníaco durante el proceso.

También como se ilustra en la presente, la celulosa III puede ser elaborada de materiales que contienen celulosa I usando amoníaco líquido en la presencia de un solvente orgánico (por ejemplo, acetona). En algunas modalidades, el solvente es agua o acetona, o una combinación del mismo. Como se ilustra en la presente, el uso de acetona con amoníaco durante el pretratamiento para convertir celulosa I a celulosa III es una manera altamente eficiente. En efecto, cantidades sustanciales de acetona pueden ser usadas de manera efectiva. De este modo, la relación volumen: volumen de amoníaco líquido a acetona puede variar desde 10:90 a 99:1, o cualquier relación entre 10:90 y 99:1. En algunas modalidades, la relación volumen: volumen de amoníaco líquido a acetona varía desde 10:90 a 80:10. En otras modalidades, la relación volumen : volumen de amoníaco líquido a acetona puede variar desde 20:90 a 80:10. En modalidades adicionales, la relación volumen : olumen de amoníaco líquido a acetona puede variar desde 30:90 a 70:10.

Se observa que la biomasa lignocelulósica típicamente contiene agua. Sin embargo, la cantidad de agua en la biomasa lignocelulósica puede variar, por ejemplo, desde aproximadamente 3% hasta 20% agua. En algunas modalidades, la biomasa es molida y secada a un nivel de humedad adecuado previo al tratamiento de amoníaco. Por ejemplo, los niveles de humedad pueden ser reducidos a menos de aproximadamente 15% de humedad en base al peso seco (dwb) para producir biomasa molida/secada. Cuando se describe el porcentaje o concentración de amoníaco empleado para pretratamiento, la cantidad de agua en la biomasa lignocelulósica es en general no considerada. De este modo, cuando se refiere a pretratamiento usando amoníaco anhidro, o una solución de 80%-99% de amoníaco en un solvente, el amoníaco anhidro o la solución de 80-99% de amoníaco es el líquido de pretratamiento actual agregado a la biomasa lignocelulósica.

El pretratamiento con amoníaco líquido puede ser realizado en cualquier ubicación adecuada. En una modalidad, el pretratamiento líquido se realiza en una biorefinería celulósica centralizada usando materias primas pretratadas con amoníaco convencional suministrada de centros de procesamiento de biomasa regional (Carolan et al., J Agri Food ind org 5, 10 (2007)) .

Los métodos descritos en la presente que usan altos niveles de amoníaco líquido convierten efectivamente la celulosa I en celulosa III dentro de la biomasa lignocelulósica. Esto es contrario a los métodos que utilizan métodos de pretratamiento de AFEX convencional que requieren cantidades superiores de agua y el uso de reactores de alta presión para mantener el amoníaco en la fase líquida. En general, se forma poca o ninguna celulosa III dentro de la biomasa lignocelulósica que es sometida a pretratamiento de AFEX convencional.

Sin embargo, en otra modalidad, los nuevos métodos descritos en la presente son usados después que la biomasa lignocelulósica ha sido sometida a un pretratamiento convencional tal como AFEX, percolación de reciclaje de amoníaco (ARP, por sus siglas en inglés), o similares. Tales pretratamientos convencionales no forman celulosa III, de manera que la celulosa I en estas muestras de biomasa tratada es convertida a celulosa III usando exceso de amoníaco líquido como se describe en la presente. Sin embargo, el pretratamiento con amoníaco líquido puede ser realizado a bajas temperaturas (<25°C) y/o bajas presiones. Por ejemplo las temperaturas pueden ser de aproximadamente 10° hasta aproximadamente 50°C, y el pretratamiento con amoníaco líquido puede ser realizado por un tiempo de residencia adecuado de aproximadamente 0.5 hrs hasta aproximadamente dos (2) hrs a presión atmosférica. Como un resultado, la biomasa es exitosamente pretratada sin la necesidad de calor extensivo y el uso de reactores de alta presión. Contrario a métodos de pretratamiento de AFEX de alta humedad convencional, la celulosa III formada de soluciones concentradas de amoníaco (o amoníaco anhidro) no se revierte a celulosa I.

Sin embargo, algunos estudios muestran que el pretratamiento de AFEX incrementa la porosidad de la biomasa, aún a pesar de que pueda ocurrir poca conversión de celulosa I a celulosa III. Por ejemplo, las FIGs . 2A y 2B muestran el tejido vegetal y pared celular de rastrojo de maíz sin tratar (A) y tratado con AFEX (B) , respectivamente, como se detecta por microscopio de electrón de alta resolución (Chundawat, S., 2009. Chemical Engineering & Materials Science. Ph.D. Dissertation. Michigan State University, East Lansing) . De este modo, tal tratamiento de AFEX puede hacer a la biomasa más accesible para tratamiento enzimático.

En una modalidad, se produce materia prima tratada con AFEX convencional en centros de procesamiento regional para co-utilización como forraje animal. En una modalidad, la materia prima tratada con AFEX es embarcada a biorefinerías para pretratamiento adicional usando amoníaco líquido. De esta forma, la celulosa I es transformada a celulosa III a bajas temperaturas, de este modo minimizando la necesidad de un reactor de alta presión y permitiendo la recuperación de corrientes de lignina y hemicelulosa de manera separada, de este modo permitiendo la producción de otros combustibles por catálisis química. Esto podría también ayudar a minimizar la inversión en reactores de clasificación de alta presión para hacer la celulosa III, mientras el AFEX convencional de bajo costo ayuda a romper los enlaces éster de LCC para mejorar la accesibilidad enzimática.

En una modalidad, el tratamiento con amoníaco líquido a bajas temperaturas también previene la coalescencia de lignina (debido a una temperatura de transición vitrea > 130°C) en glóbulos inhibidores enzimáticos de paredes celulares secundarias (Chundawat, S., 2009. Ultrastructural and physicochemical modifications within ammonia treated lignocellulosic cell walls and their influence on enzymatic digestibility Chemical Engineering & Materials Science. Ph.D. Dissertation . Michigan State University, East Lansing) .

En una modalidad, los enlaces de éster del complejo de lignina-carbohidrato (LCC, por sus siglas en inglés) son desdoblados durante el pretratamiento , el cual mejora la accesibilidad enzimática. La amonólisis de enlaces éster es facilitada a temperaturas superiores (>50 °C) o tiempos de residencia largos (hrs a días). Chundawat, S., 2009. Ultrastructural and physicochemical modifications within ammonia treated lignocellulosic cell walls and their influence on enzymatic digestibility Chemical Engineering & Materials Science. Ph.D. Dissertation . Michigan State University, East Lansing.

De manera sorprendente, estudios realizados por los inventores indican que la cantidad total de enzima absorbida sobre el alomorfo de celulosa I puede ser mayor que la cantidad absorbida en el alomorfo de celulosa III. Sin embargo, el enlace enzimático al alomorfo de celulosa III es típicamente más productivo, especialmente cuando ciertas combinaciones de enzimas son usadas. De este modo, mientras las enzimas pueden unirse al alomorfo de celulosa I vía interacciones hidrofóbicas y otras, tal enlace menos frecuentemente da origen a desdoblamiento de la cadena celulósica. Contrario a lo que ocurre con celulosa I, el enlace enzimático al alomorfo de celulosa III tiende a tener mayor capacidad de procesamiento y las enzimas pueden ser capaces de penetrar la masa de celulosa III mejor debido a la mayor vibración térmica de las cadenas de glucano e hidrofobicidad reducida de la superficie de fibrilo de celulosa III.

La carga enzimática se reduce comparada con métodos de pretratamiento convencionales y se incrementa la hidrólisis enzimática comparada con métodos de pretratamiento convencional. En una modalidad, una relación de hidrólisis enzimática de celulosa lili es al menos de dos veces mayor que la celulosa nativa Ip.

El alomorfo de celulosa III que se forma de la celulosa nativa I durante el pretratamiento con amoníaco líquido tiene al menos una relación de dos veces, hasta una relación de 2.5 veces (o superior) de la hidrólisis enzimática. De manera sorprendente, la cantidad de enzima total (que incluye celulasa) absorbida en el alomorfo de celulosa I puede ser mayor que la cantidad absorbida en el alomorfo de celulosa III. Sin embargo, el enlace enzimático al alomorfo de celulosa III es típicamente más productivo, especialmente cuando se usan ciertas combinaciones de enzimas. De este modo, mientras las enzimas se unen al alomorfo de celulosa I vía interacciones hidrofóbicas y otras, tales enlaces dan origen al desdoblamiento de la cadena celulósica menos frecuentemente que lo hace cuando las enzimas se unen al alomorfo de celulosa III. Contrario a lo que ocurre con celulosa I, la unión enzimática al alomorfo de celulosa III tiende a tener mayor capacidad de procesamiento. En adición, las enzimas pueden ser capaces de penetrar la masa de celulosa III mejor que la masa de celulosa I más cristalina, debido a mayor vibración térmica de las cadenas de glucano de celulosa III e hidrofobicidad reducida de la superficie de fibrilo de celulosa III.

De conformidad con la invención, ciertas enzimas y combinaciones de enzimas son particularmente efectivas en la digestión del alomorfo de celulosa III. Tanto celulasas fúngicas secretadas como paradigmas de celulosoma bacteriano en complejos han sido explorados como rutas potenciales para desconstruir la lignocelulosa para aplicaciones de biocombustible . Sin embargo, las enzimas fúngicas secretadas de Trichoderma reesei son en general de mayor interés comercial debido a sus altos tituladores de proteína y actividad hidrolítica significante. Es probable que el tiempo de alomorfo de celulosa pueda también impactar la extensión en la cual una celulasa fúngica puede extraer efectivamente o descristalizar las unidades de celobiosilo de la superficie cristalina del alomorfo previo a la formación de un complejo catalíticamente activo en el sustrato que puede efectivamente hidrolizar enlaces glicosídicos (véase, Chundawat et al., Deconstruction of Lignocellulosic Biomass to Fuels and Chemicals, Annu. Rev. Chem. Biomol. 2 (2011), la cual es específicamente incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . La flexibilidad incrementada de las cadenas de glucano dentro de la celulosa III es dependiente de su estructura cristalina y resulta en rendimientos de hidrólisis total mejorada.

Sin embargo, no todos los mejoramientos observados pueden ser atribuidos a la reestructuración de la estructura de celulosa, ya que una ganancia significante en la eficiencia de digestión es vista solamente para ciertas mezclas de exocelulasas y endocelulasas. Como se ilustra en la presente, la adición de endoglucanasas acelera significantemente la despolarización de celulosa III comparada con el uso de exocelulasas solas.

Las mezclas de celulasas fúngicas crudas están típicamente compuestas de 50-80% de exocelulasas (40-60% de Cel7A, 10-20% de Cel6A) y 10-25% de endocelulasas (5-10% de Cel7B, 1-10% de Cel5A, 1-5% de Cell2A, <1% Cel61A) (Rosgaard et al., Biotechnol. Prog. 23 (6) : 1270-76 (2007)).

Pero, como se ilustra en la presente tales mezclas no incluyen cantidades significantes de las combinaciones más efectivas de celulasas. De este modo, los inventores han encontrado que Cel7B fue la enzima de degradación más efectiva para celulosa, seguida por Cel5A, Cell2A, y Cel61A. Las endocelulasas crean cortes endo aleatoriamente a lo largo de cadenas de polímero glucano para cristales de celulosa que resultan en actividad de exocelulasa sinergísticamente mejorada. La actividad sinergística de endocelulasas y exocelulasas permite conversiones de glucano a glucosa casi teóricas a cargas de enzima bajas industrialmente relevantes para celulosa III. Por el contrario, procedimientos previamente reportados emplean 10-20 veces cantidades superiores de Cel7A sin adición de endocelulasa pero logran significantemente menos conversión teórica de glucano (Igarashi et al., FEBS Journal 274 (7) : 1785-92 (2007)). Cuando sustratos de celulosa III derivados de cristalinidad vegetal inferior son hidrolizados a cargas enzimáticas bajas que son relevantes para procesamiento industrial (<10 mg de carga de enzima total/g de glucano) , los inventores han encontrado que solamente cuando Cel7A es combinada con endoglucanasas adecuadas hubo algún mejoramiento significante en la conversión total de glucano.

Por ejemplo, enzimas que pueden ser empleadas incluyen, por ejemplo, una enzima celulolítica, por ejemplo, celulasa, endoglucanasa, celobiohidrolasa, y beta-glucosidasa. En otra modalidad, la enzima puede ser una hemicelulasa, esterasa, proteasa, lacasa, peroxidasa, o una mezcla de las mismas. Ejemplos adicionales de enzimas que pueden ser usadas para digerir el alomorfo de celulosa III incluyen una celobiohidrolasa y/o una endocelulasa . Ejemplos de tales celobiohidrolasa y/o endocelulasa incluyen Cel7A, Cel6A, Cel7B, Cel5A-tr, Cel61A, Cel61B, Cel5A-ac, y Cell2A (véase sitio de red en www.cazy.org) .

En algunas modalidades, puede ser usada una combinación de enzimas que incluye a Cel7B. Tal combinación puede incluir dos o más enzimas. En otras modalidades, una combinación de tres o más de tales enzimas que pueden ser empleadas. Los datos proporcionados en la presente muestran que una combinación de las siguientes enzimas es altamente efectiva para digerir el alomorfo de celulosa III:Cel7A y Cel7B. Los datos adicionales proporcionados en la presente muestran que una combinación de las siguientes enzimas es altamente efectiva para digerir el alomorfo de celulosa III:Cel7A, Cel6A y Cel7B. Además los datos proporcionados en la presente muestran que una combinación de las siguientes enzimas es altamente efectiva para digerir el alomorfo de celulosa III:Cel7A, Cel6A y Cel5A_tr y/o Cel7A, Cel6A y Cel5A_ac. En algunas modalidades, el alomorfo de celulosa III es digerido a una extensión mayor por tal combinación de enzimas que es celulosa I.

Tales enzimas se pueden obtener de una variedad de fuentes, que incluyen Trichoderma reesei.

Extracción de Componentes de la Pared Vegetal Casi todas las formas de biomasa lignocelulósica, es decir, biomasa de plantas, tales como monocotiledóneas , comprenden tres fracciones químicas primarias :hemicelulosa, celulosa, y lignina. La hemicelulosa es un polímero de cadenas cortas, altamente ramificadas de la mayoría de azúcares de pentosa de cinco carbonos (xilosa y arabinosa) , y a una extensión menor azúcares de hexosa de seis carbonos (galactosa, glucosa y mañosa) . Las dicotiledóneas, por otro lado, tienen un alto contenido de pectado y/o pectina, el cual es un polímero de ácido glucurónico alfa-ligado. El pectato puede ser "decorado" con azúcares mañosa o ramnosa, también. Estos azúcares son altamente sustituidos con ácido acético .

Los intervalos típicos de concentraciones de hemicelulosa, celulosa, y lignina en plantas se muestran en el sitio de red wwwl.eere.energy.gov/biomass/feedstock_databases.html. La celulosa típicamente hace hasta 30 a 50% de residuos de fuentes agrícolas, municipales y forestales. La celulosa es más difícil de hidrolizar que la hemicelulosa, pero, una vez hidrolizada, se convierte más eficientemente en etanol con fermentación de glucosa que la hemicelulosa. Debido a su estructura ramificada, la hemicelulosa es amorfa y relativamente fácil de hidrolizar (romper o desdoblar) a sus constituyentes de azúcar individuales por la enzima o tratamiento de ácido diluto. Por el contrario, los polímeros de azúcar de hemicelulosa son relativamente fáciles de hidrolizar, pero no se convierten tan eficientemente como la celulosa usando cepas microbianas de fermentación estándar (las cuales producen etanol de glucosa) . Aunque los azúcares de hemicelulosa representan el fruto "colgante bajo" para conversión a etanol, el contenido sustancialmente superior de celulosa representa el mayor potencial para maximizar el rendimiento de alcohol, tal como etanol, en una base por tonelada de biomasa vegetal.

Como se describe anteriormente, la celulosa es un polímero lineal de azúcares de glucosa, como el almidón, el cual es la estructura primaria del grano de maíz en plantas de etanol molidas en húmedo y grano seco. Sin embargo, distinto del almidón, los azúcares de glucosa de celulosa son encadenados juntos por enlaces ß-glicosídicos , los cuales permiten a la celulosa formar cadenas lineales estrechamente asociadas . Debido al alto grado de enlace de hidrógeno que puede ocurrir entre las cadenas de celulosa, la celulosa forma una estructura cristalina rígida que es altamente estable y mucho más resistente a la hidrólisis por ataque enzimático o químico que los polímeros de almidón o hemicelulosa . Específicamente, la cristalinidad de la celulosa, enlaces éster de complejo de lignina-carbonato (LCC) y enlace enzimático no específico a componentes de la pared celular (tales como lignina) son conocidos por ser etapas principales limitantes de la relación para desconstrucción eficiente de la pared celular.

La lignina, la cual es un polímero de moléculas fenólicas, proporciona integridad estructural a las plantas, y permanece como material residual después que los azúcares en la biomasa de la planta han sido fermentados a etanol. La lignina es un subproducto de producción de alcohol y se considera un combustible sólido de primera calidad debido a su bajo contenido de azufre y valor de calentamiento, el cual es cercano a aquel de carbono sub-bituminoso .

Sin embargo, las enzimas y microtubos usados para digerir materiales celulósicos y azúcares útiles fermentados son inhibidos debido a la interacción con lignina. Otros materiales de la pared vegetal y productos de descomposición producidos por pretratamiento pueden inhibir estas enzimas y microbios también (Pan, J. Biobased Mater. Bioenergy 2 (1) , 25-32 (2008); Klinke et al., Applied Microbiology and Biotechnology 66 (1), 10-26 (2004)) . La extensión de estas inhibiciones depende de las condiciones de pretratamiento y como la pared vegetal es modificada durante el pretratamiento.

Los métodos de pretratamiento de biomasa descritos en la presente que emplean amoníaco líquido y que resultan en la formación de alomorfo de celulosa III altamente digestible pueden ser adaptados para incluir extracción de componentes de la pared celular biológicamente inhibidores (por ejemplo, lingina, productos de descomposición de lignina, xilo-oligosacáridos , amidas). Los componentes de la pared celular pueden ser extraídos de la biomasa lignocelulósica durante o después del pretratamiento con amoníaco líquido. Estabilizando la celulosa III usando el proceso de pretratamiento descrito en la presente, y extrayendo compuestos de degradación de lignina/lignina recalcitrante, la carga de enzima puede ser reducida, y la velocidad de hidrólisis enzimática puede ser incrementada.

La remoción de lignina y hemicelulosa mejora la accesibilidad de las enzimas a celulosa incrementando su relación de área de superficie expuesta a volumen con las enzimas. Avances recientes muestran que el pretratamiento de AFEX incrementa la porosidad de la biomasa, aún a pesar de que puede ocurrir poca conversión de celulosa I a celulosa III. Por ejemplo, las FIGs. 2A y 2B muestran el tejido vegetal y pared celular de rastrojo de maíz sin tratar (A) y tratado con AFEX (B) , respectivamente, como se detecta por microscopio de electrón de alta resolución (Chundawat, S., 2009. Chemical Engineering & Materials Science. Ph.D. Dissertation . Michigan State University, East Lansing) . De este modo, el tratamiento de AFEX, por ejemplo, antes del pretratamiento con amoníaco líquido puede hacer a la biomasa más accesible a tratamiento enzimático.

Como se indicó anteriormente, la lignina en general inhibe la fermentación de biomasa tratada/digestión enzimática y microbiana. Por lo tanto, otro aspecto de la invención involucra métodos para remoción de lignina, que incluyen lignina degradada y otros productos de descomposición de la pared celular, para reducir la carga enzimática y mejorar la fermentabilidad del hidrolizado. Tales métodos pueden mejorar la viabilidad económica de una biorefinería celulósica.

Modalidades de la invención permiten la recuperación de dos fracciones, es decir, una corriente rica en celulosa y una corriente rica en hemicelulosa-lignina, por ejemplo, durante o después del pretratamiento con amoníaco. Como se ilustra en la presente, la lignina es movilizada por pretratamiento con amoníaco y cantidades significantes pueden ser removidas por extracción de conformidad con tal pretratamiento con amoníaco.

De este modo, por ejemplo, un reactor capaz de realizar la extracción del componente de pared vegetal puede ser empleado que tiene dos partes principales: 1) una célula de pretratamiento de amoníaco y 2) una célula de colección de extractivos (FIG. IB) . El pretratamiento con amoníaco puede ser realizado en la célula de pretratamiento con amoníaco. Tal pretratamiento solubiliza los extractivos que serán liberados de la biomasa. Una vez que el tiempo de reacción seleccionado ha transpirado, la célula de colección de extractivos se ajusta a la misma presión como la célula de pretratamiento con amoníaco usando nitrógeno presurizado y la válvula entre estas dos células es abierta. La sobre presión de nitrógeno puede ser aplicada para prevenir la vaporización de amoníaco en el pretratamiento con la célula de amoníaco y conducir la fase líquida a flujo descendente a la célula de colección de extractivos. Un filtro presente en el fondo de la célula de pretratamiento con amoníaco previene a los sólidos de fluir hacia abajo en el colector de extractivos, pero el filtro tiene poros de suficiente porosidad para permitir los líquidos y componentes de la pared vegetal solubilizados pasar a través de este. Por ejemplo, el filtro puede ser un filtro de 50 mieras, 80 mieras ó 100 mieras. Una válvula puede ser usada para ventilar el colector extractivo para a la cámara de escape manera que el vapor de nitrógeno/amoníaco puede fluir en la cámara de escapa y este flujo puede ser regulado para prevenir la rápida evaporación de amoníaco en la célula de extracción. Después que los extractivos son removidos de la célula de pretratamiento con amoníaco, la válvula de sobrepresión de nitrógeno es parada y el gas en la célula de colección de extractivos es liberada lentamente a la cámara de escape hasta que el sistema alcanza la presión atmosférica. En este punto, la biomasa pretratada y los extractivos respectivos pueden ser removidos del sistema para análisis adicional.

En una modalidad, después del tiempo de residencia definido, la fracción líquida (es decir, amoníaco líquido junto con productos de descomposición soluble, lignina y xilo-oligosacáridos) se separa de los sólidos (los cuales serán ricos en celulosa III después de esta etapa) . El amoníaco puede entonces ser evaporado adicionalmente de la fracción líquida, para producir extractivos de la pared celular y amoníaco recuperado. En una modalidad, el amoníaco recuperado es reutilizado o reciclado en el proceso de pretratamiento con amoníaco. La cantidad de amoníaco consumida durante el pretratamiento (es decir, reacciones de amonólisis con esteres de la pared celular) también puede ser repuesto o suplementado en esta etapa. En otras modalidades, el amoníaco líquido con los extractivos puede ser usado en una manera continua para pretratatar el siguiente lote de biomasa sin tratar antes de recuperar el amoníaco de los extractivos. De este modo, los nuevos métodos descritos en la presente pueden ser realizados en un modo continuo o como una operación por lotes.

En una modalidad, la fracción de sólidos ricos en celulosa es usada para producir biocombustibles (después de hidrólisis enzimática y fermentación) . La fracción de sólidos ricos en celulosa puede ser separada de hemicelulosa y lignina. La hemicelulosa y lignina pueden también ser separadas. La hemicelulosa usada para otras aplicaciones, que incluyen, pero no se limitan a, como inductores solubles para microbios para producir hemicelulasas , combustibles y/o otros productos usando, por ejemplo, catálisis química y similares. La lignina aislada es también útil en varias aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a, combustión para producir electricidad, síntesis química a través de catálisis y/o como resina/aglutinantes en la producción de biomateriales y similares .

Los combustibles líquidos y químicos pueden ser producidos de biomasa lignocelulósica utilizando métodos basados en la "plataforma de azúcar" . En este proceso la biomasa lignocelulósica es pretratada e hidrolizada usando enzimas para producir azúcares fermentables como se describe anteriormente. Estos azúcares pueden entonces ser ya sea usados como una fuente de carbón para microorganismos fermentativos para producir combustibles/químicos y/o usados directamente en síntesis química a través de procesos catalíticos como se muestra en las FIGS . 1A-1B. Con este proceso, el pretratamiento e hidrólisis enzimática constituye la base para desconstruir la pared celular vegetal en azúcares fermentables, los cuales pueden ser usados para producir productos comercialmente útiles, tales como varios químicos vía síntesis química y/o biocombustibles vía fermentación.

Parámetros Convencionales Varios métodos de pretratamiento se conocen en la técnica. Tales tratamientos incluyen, por ejemplo, pretratamiento de hidrólisis de ácido concentrado y pretratamientos de hidrólisis de ácido de dos etapas . Otros pretratamientos incluyen pretratamientos hidrotérmicos o químicos, seguido por una hidrólisis enzimática (es decir, hidrólisis catalizada por enzima) o hidrólisis enzimática simultánea y sacarificación. Aún otros métodos de pretratamiento pueden incluir hidrólisis de ácido diluto (Schell et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 105(1-3) :p. 69-85 (2003); Wyman et al . ein AIChE Annual Meeting. San Francisco, California (2006) ; Wyman, Integration of Leading Biomass Pretreatment Technologies with Enzymatic Digestión and Hydrolyzate Fermentation, Department of Energy, p. 1-10 (2005); Mohagheghi et al., Appl Biochem Biotechnol . 33:67-81 (1992) ; Eggeman & Elander, Process and economic analysis of pretreatment technologies . Bioresource Technology 96 (18) : 2019-2025 (2005); Varga et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 114 ( 1-3 ) : 509 -523 (2004)). En adición, algunos pretratamientos involucran métodos a base de agua caliente a alta presión, es decir, tratamientos hidrotérmicos tales como explosión de vapor (Playne, Biotechnology y Bioengineering 26(5) :p. 426-433 (1984); Mackie et al., Journal of Wood Chemistry and Technology 5(3):405-425 (1985); Ballesteros et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 130 (1-3) :496-508 (2006); Hongzhang & Liying, Bioresource Technology 98 (3 ): 666-676 (2007)). Otros pretratamientos involucran extracción de agua caliente acuosa, sistemas reactores (por ejemplo, lote, flujo continuo, contra flujo, a través del flujo y similares) , AFEX, percolación reciclada con amoníaco (ARP) , tratamiento con cal y un tratamiento a base de pH.

Los pretratamientos a base de amoníaco promueven la hidrólisis de enlaces éster debido a la presencia de iones de hidroxilo e hidrólisis que forma amoníaco (por ejemplo, ácidos) y productos de degradación de araonólisis (por ejemplo, amidas), respectivamente. Para procesos donde el amoníaco es altamente concentrado, las reacciones de amonólisis son predominantes, reduciendo la toxicidad de los hidrolizados . Similar a otros pretratamientos álcalis (NaoH, CaoH) , el rompimiento de enlaces LCC durante AFEX promueve la relocalización de lignina y hemicelulosas lejos de la celulosa (Chundawat, S., 2009. Chemical Engineering & Materials Science. Ph.D. Dissertation . Michigan State University, East Lansing) ; Balan et al., Biotechnology Progress 25 (2) : 365-375 (2009); Yoon et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 51-52 (1) : 5-19 (1995); Kim & Lee, Bioresource Technology 96 (18) : 2007-2013 (2005); Kim et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 133(1) :41-57 (2006) .

Las temperaturas en estos procedimientos pueden variar desde aproximadamente 50 a aproximadamente 290°C. Las tecnologías de percolación reciclada con amoníaco (ARP) y de hidróxido de amonio diluto, por ejemplo, utilizan temperaturas de aproximadamente 150 a aproximadamente 180°C, tienen tiempos de residencia de aproximadamente 30 a 120 min, utilizan un reciclaje líquido a alta presión, y tienen una carga de agua de aproximadamente tres (3) hasta 20 g de agua por gm de biomasa en peso seco. Con estos métodos, la biomasa es separada en fracciones sólidas y líquidas por separación de hemicelulosa y lignina de celulosa en fracción líquida (típicamente resultando en una carga baja en sólidos) , seguida por neutralización y/o amoníaco recuperado de procesamientos corriente abajo. Sin embargo, ni el ARP ni los tratamientos a base de hidróxido de amonio convencional producen celulosa III significante (la cual es más digerible que la celulosa nativa I) .

En adición, la hidrólisis de pretratamiento de biomasa vegetal de conformidad con métodos convencionales, tal como aquellos referenciados anteriormente, a menudo resultan en la creación y liberación de otros químicos que inhiben la fermentación microbiana. Estos inhibidores (por ejemplo, furfural) son ampliamente los productos de degradación de azúcar, y métodos para remover estos inhibidores o para reducir su formación son necesarios. Alternativamente, las cepas microbianas resistentes a los inhibidores son necesarias.

Varios de estos métodos generan hidrólisis casi completa de la fracción de hemicelulosa para recuperar eficientemente altos rendimientos de los azúcares de pentosa solubles. Sin embargo, la solubilización química de hemicelulosa también produce productos tóxicos, tales como derivados de furano, los cuales pueden inhibir reacciones microbianas corriente abajo (por ejemplo, fermentación) . A pesar de todo, la hidrólisis de hemicelulosa facilita la remoción física de la hemicelulosa y lignina circundante, de este modo exponiendo la celulosa a procesamiento posterior. Sin embargo, la mayoría, sino todos, los procedimientos de pretratamiento convencional no hidrolizan significantemente la fracción de celulosa de biomasa.

Contrario a los pretratamientos convencionales descritos anteriormente, la conversión de celulosa I a celulosa amorfa o celulosa lili durante el pretratamiento como se describe en la presente resulta en biomasa altamente digerible. En una modalidad, la biomasa usada para este proceso es biomasa lignocelulósica de plantas.

La conversión de biomasa a alcohol también posee consideraciones de fermentación únicas. Las cepas de levadura de Saccharomyces cerevisiae usadas en plantas de etanol de maíz convencional, por ejemplo, pueden fermentar glucosa, pero no pueden fermentar azúcares de pentosa tal como xilosa. Adicionalmente , no existen actualmente microorganismos que se originan naturalmente que puedan convertir efectivamente todas las azúcares principales presentes en la biomasa de planta a etanol. Por lo tanto, bacterias o levaduras diseñadas por ingeniería genética, las cuales puede, en teoría, fermentar tanto glucosa como xilosa a alcohol, están siendo usadas para procesos de biomasa a alcohol. Sin embargo, en la práctica, la co- fermentación es ineficiente y la fermentación de glucosa es todavía la reacción principal para la producción de etanol. Además, cepas recombinantes genéticamente mejoradas de microorganismos fermentativos, que incluyen cepas recombinantes de levadura, bacterias y hongos, así como también ácidos nucleicos transgénicos (ADN, ARN) derivados de tales componentes, pueden poseer disposición ambiental y permitir problemas .

La invención será además descrita por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales son ofrecidos para ilustrar además varias modalidades de la presente invención. Se debe entender, sin embargo, que muchas variaciones y modificaciones se pueden hacer mientras permanecen dentro del alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1: Tratamiento con Amoníaco a Baja Temperatura Este ejemplo describe algunas de las propiedades de diferentes polimorfos de celulosa y discute si la fuente de celulosa afecta la conversión de celulosa a formas que son más óptimamente digeridas por enzimas .

La información cuantitativa con respecto a un cambio en estructura después del tratamiento de varios sustratos celulósicos se obtuvo observando el cambio relativo en intensidad pico para varios picos espectrales de difracción de rayos-X de celulosa (2T = 12°, 20°, 22°). En general, la altura del pico 2T a 18° es una medida de la cantidad de fase amorfa de celulosa mientras el pico 2T a 22° es una medida de la cantidad de celulosa cristalina I. La relación pico 18/22 es comúnmente conocida como índice de cristalinidad (CrI) que es calculado para el cambio relativo en intensidad para el pico a 22°.

Se trató la celulosa (AVICEL) en una variedad de formas y se determinó el índice de cristalinidad del producto. El Avicel es celulosa I esencialmente pura. La celulosa III se generó de Avicel por el tratamiento de Avicel con 7:1 de amoníaco :biomasa (peso:peso) por 2 hr a 95°C (y a 10 °C en algunas modalidades) , donde el Avicel algunas veces tiene humedad residual de 0.05 de agua g gramos de Avicel. El hidróxido de amonio tratado con Avicel involucra el uso de una relación 10:1 de 28-30% de amoníaco a Avicel (peso:peso) por 60 min. a 4o C.

El AVICEL sin tratar se determinó por tener un índice de cristalinidad de aproximadamente 0.65, mientras aquél de AVICEL tratado con hidróxido de amonio fue aproximadamente tres por ciento (+3%) superior, indicando un sustrato ligeramente más cristalino. El índice de cristalinidad ligeramente superior de AVICEL tratado con hidróxido de amonio puede ser debido a extracción/remoción de fracciones amorfas residuales de AVICEL nativo. Por el contrario, el tratamiento de AVICEL con hidróxido de sodio resultó en un 18% de decremento en el índice de cristalinidad (con base en el pico a 22°) acompañado por un 66% de incremento en el pico a 20°, lo cual fue una característica típica de polimorfos de celulosa II.

El tratamiento de AVICEL con amoníaco líquido resultó en una reducción del 75% en el índice de cristalinidad, acompañado por un 72% de incremento en el pico a 20°. Hubo una reducción similar en el índice de cristalinidad (por 70%) para celulosa amorfa, pero no hubo correspondiente incremento en la intensidad relativa del pico a 20°, lo cual es probablemente debido a la carencia de alguna cristalinidad significante en la celulosa amorfa pretratada con ácido fosfórico.

Para estudiar el efecto de la fuente de celulosa en la extensión de transformación de la celulosa nativa I a III, se obtuvieron tres tipos de biomasa de celulosa nativa I:AVICEL (celulosa microcristalina procesada), borla de algodón (fibras sedosas, finas, las cuales se adhieren a las semillas de una planta de algodón después del desmotado del algodón) y algodón. La borla de algodón es la fibra corta de la bola de algodón que crece entre las semillas de algodón y las fibras del algodón de cápsula larga. El grado de polimerización (DP, por sus siglas en inglés) de AVICEL, borla y algodón se ha reportado por estar en el intervalo de 150-250, 750-1000 y 5000-10,000, respectivamente.

El tratamiento con amoníaco líquido involucra 7:1 de amoníaco : borlas o fibras de algodón (peso ¡peso) por 0.5 hr a 10°C (o a 95 °C en algunas modalidades) , donde la biomasa algunas veces tiene humedad residual de 0.05 de agua g gramo de biomasa.

El espectro de difracción de rayos-X representativo para biomasa de celulosa sometida a varias condiciones de tratamiento, que incluyen tratamiento de amoníaco, se muestra en la FIG. 4. Los espectros para AVICEL, borla de algodón y celulosas de algodón sin tratar son independientes de las fuentes de celulosa y son típicos de un polimorfo cristalino de celulosa Ip. El tratamiento con amoníaco líquido resultó en una modificación similar del espectro de difracción de rayos-X para las tres celulosas, como se representa por la apariencia del pico 2T a 12° y desaparición del pico 2T a 22°. El índice de cristalinidad (o Pk 18/22) reduce por 78-83% después del tratamiento con amoníaco líquido de la borla de algodón y celulosa de algodón, acompañado por un incremento correspondiente de 48-60% para Pk 18/20.

La FIG. 4A muestra el espectro de difracción de rayos-X en polvo de celulosa (Celulosa I) tratada con amoníaco líquido (para formar Celulosa III) , hidróxido de sodio (para formar Celulosa II) , hidróxido de amonio y ácido fosfórico concentrado (Celulosa amorfa) donde AVICEL (celulosa microcristalina procesada) fue el sustrato celulósico. Los ejes-Y y ejes-X representan conteos de intensidad y ángulos dos theta, respectivamente.

La FIG. 4B muestra el espectro de difracción de rayos-X en polvo de celulosas no tratadas (Celulosa I) y tratadas con amoníaco líquido (Celulosa III) donde AVICEL, borlas de algodón y algodón nativo fueron los sustratos celulósicos usados. Los ejes-Y y ejes-X representan conteos de intensidad y ángulos dos theta, respectivamente. Estos resultados muestran que la cristalinidad de celulosa es un factor principal limitante de la velocidad durante la hidrólisis, el cual puede ser atendido ya sea usando amoníaco barato (a condiciones de pretratamiento apropiadas) o usando pretratamientos a base de ácido fosfórico o líquido iónico caro .

Adicionalmente, se determinó que el hidróxido de amonio acuoso (por ejemplo, como se usa durante ciertos pretratamientos con amoníaco como ARP y otros) no incrementa la degradabilidad de la celulosa, debido a que no conduce a formación de celulosa III. De este modo, el tratamiento de biomasa celulósica con 1:1 de amoníaco a biomasa (peso: peso) con 0.6:1 de agua: biomasa (peso: peso) por 15 min. a 130° C, no fue efectivo como el pretratamiento con amoníaco líquido.

En otro estudio, se determinó el rendimiento de hidrólisis enzimática en dos puntos de tiempo para la celulosa nativa I (AVICEL) después del pretratamiento con amoníaco líquido o después del pretratamiento con hidróxido de amonio acuoso (30%) , hidróxido de sodio acuoso, o ácido 4 fosfórico concentrado. La celulasa a 1.5 FPU por gramo de glucano se usó para hidrólisis enzimática. Para pretratamiento a base de amoníaco líquido anhidro (ALAP, por sus siglas en inglés) , 5:1 de amoníaco líquido a AVICEL de biomasa seca (p/p) se incubó a 10°C por 30 minutos seguido por secado bajo la noche en campana. El producto seco entonces se analizó por análisis de difracción de rayos-X (XRD) . Tal tratamiento conduce a la formación de celulosa III que tiene un incremento de 2-2.5 veces en la degradabilidad de celulosa en la planta después de 24 horas de hidrólisis usando 3 mg/g de glucano de una relación 3:5 de SPEZYME CP y NOVOZYME 188 (carga de enzima total de 6 mg/g de glucano) . La FIG. 5 muestra la conversión de glucano del alomorfo de celulosa formado por los diferentes pretratamientos (hidróxido de amonio, hidróxido de sodio, amoníaco líquido anhidro y ácido fosfórico) cuando se someten subsecuentemente a hidrólisis enzimática por 6 y 24 horas por SPEZYME CP y NOVOZYME 188 a 50°C.

El efecto de temperatura (es decir, 10, 25, 60, y 95 °C) en la formación de amoníaco líquido de celulosa III y velocidad de hidrólisis enzimática se examinó para celulosa AVICEL. La celulosa III se generó de Avicel por el tratamiento de Avicel 7:1 amoníaco :Avicel (peso: peso) por 0.5 hr a temperaturas variantes, donde el Avicel puede tener humedad residual de 0.05 g de agua de gramo de Avicel.

La carga de enzima fue 1.5 FPU/g de glucano de SPEZYME CP (suplementada con NOVOZYME 188) . La FIG. 6 muestra el efecto de temperatura de tratamiento de amoníaco líquido en la digestibilidad enzimática del polimorfo de celulosa III. El eje-Y representa la conversión total de glucano después de 24 horas de hidrólisis. En todos los casos, hubo un incremento de aproximadamente dos veces en el rendimiento de glucano comparado con celulosa sin tratar I. Sin embargo, la digestibilidad enzimática de celulosa no varía significantemente cuando se realizó el pretratamiento con amoníaco líquido a una variedad de temperaturas de 10-95 °C. Esto podría sugerir que la formación de celulosa III es ampliamente independiente de la temperatura y que el factor principal es que la cantidad de amoníaco líquido debe ser suficiente para hinchar completamente los fibrilos de celulosa.

Se debe notar, sin embargo, que el incremento de la temperatura arriba de 100 °C resultó en conversión de glucano reducido (FIG. 6) . La digestibilidad enzimática de las muestras de celulosa después del tratamiento con amoníaco líquido a temperaturas arriba de 100 °C resultó en rendimiento de hidrólisis enzimática significantemente inferior que la celulosa III preparada a temperaturas por debajo de 100°C. En muchos casos, los rendimientos de hidrólisis fueron comparables a, o significantemente inferiores que la celulosa nativa I.

El tratamiento con amoníaco líquido a temperaturas arriba de 100 °C también conduce a oscurecimiento considerable de las muestras tratadas. El oscurecimiento de celulosa a temperaturas arriba de 100 °C puede ser debido a reacciones a base de Maillard, las cuales son reacciones químicas entre un amoníaco y un azúcar reductor (ilustrado abajo) .

Tales reacciones a base de Maillard se conocen por ser promovidas por altas temperaturas, baja humedad y alta alcalinidad. Los productos de reacción Maillard (y productos de reacción de desprendimiento inducido por álcali) se conocen por inhibir las celulasas así como también otras enzimas .

Los estudios con amoníaco líquido anhidro y celulosas (usando AVICEL y Borlas) indican que un tiempo de activación de 30 min fue más que suficiente cuando se usa exceso de amoníaco líquido para remojar completamente el sustrato. Por lo tanto, de conformidad con la invención no son necesarias altas temperaturas para acelerar la formación de celulosa III. Tales altas temperaturas pueden aún ser perjudiciales para la liberación de azúcares útiles y oligosacáridos de celulosa.

El mejoramiento del rendimiento de hidrólisis después del tratamiento con amoníaco líquido anhidro (10 °C por 30 min) se exploró además para comparar los sustratos celulósicos de borlas de algodón y algodón nativo con los resultados obtenidos para AVICEL. Después del tratamiento con amoníaco líquido anhidro, los sustratos celulósicos se hidrolizaron por dos diferentes cantidades (6 y 60 mg/g de glucano) de un complejo de celulasa cruda (SPEZYME CP suplementada con NOVOZYME 188) por 6-24 horas. Las dos cantidades de cargas de enzima corresponden a 1.5 y 15 FPU de carga de celulasa/g de glucano.

La FIG. 7 muestra la digestibilidad enzimática de borlas de algodón sin tratar (Celulosa I) y tratadas con amoníaco líquido (Celulosa III) y celulosas de algodón después de 6 ó 24 horas de hidrólisis. Para generar celulosa III en estos materiales de biomasa de celulosa, la biomasa se trató con 7:1 amoníaco : biomasa (peso:peso) por 0.5 hr a 10°C.

La extensión de digestión de enzima de borlas de algodón y fibras sin tratar fue significantemente inferior que la observada para las muestras tratadas con amoníaco. Sin embargo, un incremento de 2-2.5 veces en el rendimiento total para 6 mg/g de carga de enzima de glucano después de 6 y 24 horas de hidrólisis se observó para tanto borlas como fibras de algodón tratadas con amoníaco líquido comparada con sus contrapartes sin tratar. El incremento relativo en la digestibilidad del glucano después del tratamiento con amoníaco líquido de borlas de algodón y fibras de algodón es ligeramente superior comparado con AVICEL a la misma carga de proteína. Esto puede ser debido a que las fibras de algodón y borlas están compuestas de un grado superior de celulosa de polimerización (DP) que puede beneficiarse más de la transformación de celulosa I a III, con ello conduciendo a incremento proporcionadamente más grande en la actividad de celulasa.

EJEMPLO 2 : Condiciones de Retratamiento Anhidro Este Ejemplo ilustra que el pretratamiento con amoníaco anhidro de materiales celulósicos es más efectivo que el tratamiento con AFEX convencional.

Se realizaron pruebas preliminares para evaluar que condiciones afectan la cantidad y tipo de alomorfos de celulosa cristalina formados de celulosa I (AVICEL) . En particular, el efecto de parámetros de pretratamiento a ase de expansión de fibra con amoníaco convencional (AFEX) (carga de amoníaco, carga de agua, tiempo de residencia) se estudió para cuantificar la extensión de conversión de celulosa I a celulosa III usando espectroscopio Raman para detectar los alomorfos de celulosa. Para este estudio inicial, se usó AVICEL como el sustrato celulósico. Se exploraron cuatro condiciones; a. (a) (1-NH3, 0.6-W) 1 gm de amoníaco y 0.6 gm de carga de agua por gm de sustrato a 100°C por 15 min, b. (b) (3-NH3, 0.6-W), 3 gm de amoníaco y 0.6 gm de carga de agua por gm de sustrato a 100°C por 45 min, c. (c) (1-NH3, 0.05- ) 1 gm de amoníaco y 0.05 gm de carga de agua por gm de sustrato a 100°C por 15 min, y d. (d) (3-NH3, 0.05-W) 3 gm de amoníaco y 0.05 gm de carga de agua por gm de sustrato a 100 °C por 45 min.

El AVICEL tratado con amoníaco líquido (10°C, 30 min) fue el control, donde la carga de amoníaco empleada varía entre 5-7 gm de amoníaco por gm de sustrato que contiene 0.05 gm de agua/gm de sustrato.

La extensión de transformación de celulosa Ip a lili se estimó por la intensidad relativa de picos a 380 y 350 cm"1, con respecto a una muestra estándar 100% celulosa III, la cual presenta una reducción en 82% en la relación pico relativa .

Como se muestra en la FIG. 8A, ninguna de las cuatro condiciones dio completa conversión de AVICEL a celulosa III. Sin embargo, la extensión de conversión de AVICEL a celulosa III fue dependiente de las condiciones empleadas y tal conversión parcial proporciona una idea en los factores que impactan la formación de celulosa III. Las condiciones que contienen humedad significante (1NH3-0.6W y 3NH3-0.6W) tienen poco efecto en la celulosa I, con solamente una conversión de 3 y 6% a celulosa III. En efecto, solamente cuando el pretratamiento se llevó a cabo en la ausencia de cantidades sustanciales de agua y en la presencia de suficiente amoníaco para remojar completamente el sustrato (3NH3-0.05W) hubo ahí una conversión significante a celulosa III (de 39%) (FIG. 8A) . Estos datos indican que la presencia de agua durante el pretratamiento con amoníaco tiende a inhibir la formación de celulosa III a partir de celulosa I.

La presencia de amoníaco líquido anhidro también fue útil para la transformación completa de celulosa I a III en rastrojo de maíz (FIG. 8B) . De este modo, no se formó celulosa III durante el AFEX convencional, que involucra tratamiento con 62% de NH40H a 130 °C por 15 minutos. Aún aunque el AFEX convencional típicamente emplea temperaturas superiores, la conversión a celulosa III es mínima o no existente. En efecto la celulosa III fue solamente formada de rastrojo de maíz tratado con AFEX (AFEX CS, que contiene 0.05% de agua por gramo de biomasa) cuando fue además sometida a amoníaco líquido anhidro (7:1 de amoníaco : biomasa) a 25 °C por 2 hrs . Después de tal tratamiento con amoníaco líquido anhidro, la celulosa fue altamente digestible y se obtuvieron altos niveles de conversión de glucano del rastrojo de maíz pretratado (FIG. 8B) .

Estos datos indican que la ausencia de agua durante el tratamiento con amoníaco permite la formación estable de celulosa III, lo cual no ocurre cuando se trata la celulosa I durante el AFEX convencional. De este modo, remojando el sustrato completamente en amoníaco líquido bajo condiciones sustancialmente anhidras permite la terminación de la transformación de celulosa I a III.

EJEMPLO 3: Relación de Amoníaco a Biomasa Este ejemplo examina el efecto de relaciones de carga de amoníaco a biomasa en la formación de celulosa III.

El Avicel se usó como biomasa. La relación peso: eso de amoníaco a biomasa se varió durante el pretratamiento . En particular, las relaciones de amoníaco a biomasa (peso: peso) tratadas fueron 6:1, 3:1, 2:1 y 1:1. Todos los tratamientos se llevaron a cabo a 25° C. La cantidad de celulosa III formada después de ya sea 0 ó 10 minutos se detectó por análisis de difracción de rayos-X, donde 0 min indica que las muestras fueron inmediatamente removidas después de la inmersión en amoníaco líquido anhidro .

Como se muestra en la FIG. 9, cuando la carga de amoníaco : biomasa fue 1:1, no se formó celulosa III dentro de 10 minutos. Sin embargo, cuando la carga de amoníaco a biomasa se incrementó a 2:1, se observó una conversión significante de celulosa I a III. En particular, cuando se usó la relación 2:1 de amoníaco a biomasa, se observó aproximadamente 50-60% de conversión de celulosa I a celulosa III. Sin embargo, cuando la carga de amoníaco a biomasa excede 3 : 1 hubo completa conversión de celulosa I a celulosa III .

Sin embargo, en otros experimentos que involucran AFEX extractivo donde se emplea una carga de amoníaco a biomasa 7:1, se observó la completa conversión de celulosa I a celulosa III .

EJEMPLO 4 : Pretratamiento Extractivo de Amoniaco Anhidro Este ejemplo describe condiciones para optimizar las condiciones de pretratamiento para formar celulosa III usando una materia prima lignocelulósica realista tal como rastrojo de maíz.

Los inventores han mostrado que el pretratamiento de AFEX convencional mejora la velocidad de sacarificación de la pared celular vegetal por deslocalización de lignina/hemicelulosa e incrementa el acceso de celulasa a fibrilos de celulosa cristalina incrustados. Sin embargo, no existe descristalización de celulosa significante de celulosa l o aún formación significante de cantidades detectables de celulosa III durante el AFEX convencional de paredes celulares vegetales .

Pero la formación de celulosa III es importante para optimizar la digestibilidad de enzima del material celulósico. De este modo, los inventores han observado que existe un incremento de 80% en la digestibilidad de glucano dentro de 6 horas de hidrólisis enzimática por rastrojo de maíz de AFEX rico en celulosa III comparado con rastrojo de maíz de AFEX rico en celulosa I, indicando que la formación de celulosa III dentro de la biomasa lignocelulósica real puede sin embargo, mejorar el rendimiento total de hidrólisis .

Los estudios de los inventores indican que los procedimientos con AFEX pueden ser adaptados para producir porcentajes sustanciales de celulosa III y recuperar amoníaco. Usar altos niveles de amoníaco líquido (por ejemplo, preferentemente amoniaco acuoso más diluto o NaOH) puede minimizar el empleo de agua en la biorefinería y es probable que sea menos ambientalmente problemático que otros procedimientos (por ejemplo, uso de NaOH) . El diseño de pretratamientos económicos que maximizan el área de superficie de celulosa accesible para ataque enzimático mientras minimizan el costo termodinámico para descristalización de cadena de glucano expuesta al solvente por celulasas tiende a mejorar las velocidades de hidrólisis de la biomasa y mejorar biorefinerías celulósicas más redituables .

Los beneficios de la deslignificación en la digestibilidad de la pared celular vegetal por enzimas hidrolíticas han sido descritos en la literatura.

Recientemente, los investigadores también encontraron beneficios adicionales modificando la estructura cristalina de la celulosa nativa (celulosa I) a celulosa III. Después de esta modificación, fue posible mejorar significantemente la velocidad de la hidrólisis enzimática de celulosa por hasta cinco veces (Igarashi et . al., 2007). Sin embargo, este incremento se observó para celulosa purificada de algas (Celulosa la) , la cual tiene una configuración cristalina diferente de la celulosa a partir de plantas (Celulosa Ip) . Sin embargo, no es evidente que la celulosa dentro de la biomasa de plantas lignocelulósicas puede así ser fácilmente convertida a celulosa III o así fácilmente procesada para permitir la digestión enzimática eficiente debido a que la lignina complica la conversión de celulosa I a celulosa III y reduce la digestibilidad enzimática del material. De este modo, el mismo tipo de beneficios observados para celulosa purificada no puede ser observado para la biomasa de plantas lignocelulósicas a menos que se desarrollen nuevos procesos.

Por lo tanto este Ejemplo explora los beneficios de conversión de celulosa III bajo condiciones no anhidras, usando rastrojo de maíz como una fuente de biomasa lignocelulósica, y acoplando esta modificación con extracción de lignina en un proceso de etapas múltiples. Estos beneficios fueron comparables con un método de pretratamiento a base de amoníaco no extractivo.

Aparato AFEX Extractivo Un reactor capaz de realizar extracción de lignina a altas temperaturas y presiones se diseñó y construyó (FIG. IB) . Este reactor consiste de dos partes principales: 1) celda de extracción y 2) colector/separador de extractivos. La celda de extracción es usada para hacer reaccionar biomasa con amoníaco y solubilizar los extractivos que serán liberados de la biomasa. Estos extractivos en general consisten de lignina, componentes de hemicelulosa, azúcares libres, fitoquímicos, proteínas, etc., cuyas composiciones dependen de los solventes de pretratamiento usados. Una vez que el tiempo de la reacción se termina, el colector de extractivos se ajusta a la misma presión como la celda de extracción usando nitrógeno presu izado y la válvula entre estos dos recipientes se abre. La sobre presión de nitrógeno se aplica para prevenir la vaporización de amoniaco en la celda de extracción y conducir la fase líquida a flujo descendente al colector de extractivos. Un filtro de 80 mieras colocado en el fondo de la celda de extracción previene a los sólidos de fluir descendentemente al colector de extractivos. La válvula que conecta el colector extractivo a la cámara de escape se abre y el flujo de vapor de nitrógeno/amoníaco es controlado para prevenir la rápida evaporación de amoníaco en la celda de extracción. Después que los extractivos son todos removidos, la válvula de sobre expresión de nitrógeno se para y el gas es lentamente liberado a la cámara de escape hasta que el sistema alcanza la presión atmosférica. En este punto, la biomasa pretratada y los extractivos respectivos pueden ser removidos del sistema para análisis adicional.

Medición de Conversión de Celulosa I a Celulosa III en Materiales Lignocelulósicos Mientras es relativamente fácil medir la cantidad de celulosa III formada de muestras de celulosa (por ejemplo, AVICEL) que no tiene lignina usando análisis de difracción de rayos-X, no es cierto para la biomasa lignocelulósica debido a que la lignina interfiere con la detección de picos específicos para celulosa. De este modo, para medir la cantidad de celulosa III formada de la biomasa lignocelulósica se debe desentrelazar el espectro de difracción de rayos-X o usar un procedimiento de detección diferente. Sin embargo, tanto la celulosa I como celulosa III tienen picos espectrales únicos cuando se miden por espectroscopio Raman que son distintos de los picos de espectroscopio Raman de lignina. De este modo, la conversión de celulosa I en biomasa de rastrojo de maíz a celulosa III puede ser medida por espectroscopio Raman. Sin embargo, la cantidad de celulosa III formada como se detecta por espectroscopio Raman puede ser correlacionada con la cantidad detectada desentrelazando los datos de difracción de rayos-X (véase FIG. 10A) . Estos resultados indican que la extensión de conversión de celulosa III formada con rastrojo de maíz puede ser exactamente determinada por ya sea difracción de rayos-X o espectroscopio Raman.

La FIG. 10B muestra una fuerte correlación entre la extensión de formación de celulosa III dentro del rastrojo de maíz y AVICEL para pretratamiento similar con condiciones de amoníaco líquido. Las condiciones de pretratamiento involucran el tratamiento de Avicel o rastrojo de maíz (es decir, la biomasa) con 7:1 de amoníaco :biomasa (peso:peso) por 2 hr a 25°C. Como se muestra en la FIG. 10B, la celulosa III se forma cuando niveles altos de amoníaco líquido son usados para el rastrojo de maíz. Tal formación de celulosa III en el sustrato de rastrojo de maíz también resultó en hidrólisis enzimática de celulosa mejorada.

Variables que Afectan la Formación de Glucano en Materiales Lignocelulósicos Para verificar los parámetros de reacción de pretratamiento que contribuyen significantemente al incremento en la conversión de glucano dentro del rastrojo de maíz, así como también los parámetros que contribuyen a pérdida de xilano, arabinano y lignina durante la extracción, se creó un diseño factorial de experimentos usando software MINITAB® (Minitab, Inc) . Se probaron un total de 18 condiciones diferentes. Los factores variables considerados en este estudio incluyen temperatura, tiempo, relación líquido a sólido (L/S, por sus siglas en inglés) y relación amoníaco a agua (A/ , por sus siglas en inglés) durante el pretratamiento extractivo. Las variables dependientes en este estudio fueron conversión de glucano (conversión G) , pérdida de xilano, % de pérdida de arabinano y pérdida de lignina. No todas las condiciones probadas convierten celulosa I a celulosa III, sin embargo, los inventores desean determinar los beneficios de extracción de lignina usando soluciones de amoníaco-agua acopladas con conversión de celulosa III sobre la digestibilidad enzimática total .

Las variables dependientes determinadas de los resultados experimentales fueron además usadas para ajustar una ecuación de segunda orden por software MINITAB®. Los trazos residuales para cada variable dependiente muestran que el modelo se ajusta razonablemente bien a los datos experimentales y que existe mínimo error de propagación. La tabla ANOVA que resulta de este modelo muestra los parámetros estadísticamente relevantes que influencian el rendimiento de cada variable dependiente (Tablas 2A-2D) .

Tabla 2A: Efectos Estimados y Coeficientes para Conversión de Glucano Término Efecto Coef Coef SE T P Constante 40.9501 0.5601 73.11 0.000 Temperatura 21.3785 10.6892 0.5601 19.08 0.0001 Tiempo 1.6513 0.8257 0.5601 1.47 0.191 A/W 3.1873 1.5936 0.5601 2.85 0.029 Temperatura* tiempo L/S 2.5629 1.2814 0.5601 2.29 0.062 2.5352 1 .2676 0.5601 2.26 0.064 Temperatura* A/W 5.9555 2.9777 0.5601 5.32 0.002 Temperatura*L/S 3.6161 1.8080 0.5601 3.23 0.018 Tabla 2A: Efectors Estimados y Coeficientes Conversión de Glucano. Continuación tiempo*A/W 0.0434 0.0217 0.5601 0.04 0.970 tiempo*L/S 2.5787 1.2893 0.5601 2.30 0.061 A/W*L/S 1.5845 0.7922 0.5601 1.41 0.207 Ct Pt 2.4119 1.6804 1.44 0.201 S = 2.24050 PRESS = 301.288 R-Sq = 98.63% R-Sq(pred) = 86.32% R-Sq(adj) = 96.13% Tabla 2B: Efectos Estimados y Coeficientes para de Pérdida de Liqnina Término Efecto Coef Coef SE T P Constante 0.198649 0.008553 23.23 0.000 Temperatura 0.184388 0.092194 0.008553 10.78 0.000 Tiempo 0.040675 0.020337 0.008553 2.38 0.055 A/W 0.035146 0.017573 0.008553 2.05 0.086 Temperatura* tiempo L/S 0.090097 0.045048 0.008553 5.27 0.002 0.047026 0.023513 0.008553 2.75 0.033 Temperatura*A/W 0.000929 0.000465 0.008553 0.05 0.958 Temperatura*L/S 0.049594 0.024797 0.008553 2.90 0.027 tiempo* A/W 0.002886 0.001443 0.008553 0.17 0.872 tiempo*L/S -0.002641 0.008553 -0.15 0.882 0.001321 A/W*L/S 0.043870 0.021935 0.008553 2.56 0.043 Ct Pt 0.031540 0.025659 1.23 0.265 S = 0.0342119 PRESS = 0.0536059 R-Sq = 96.74% R-Sq(pred) = 75.10% R-Sq(adj) = 90.76% Tabla 2C : Efectos Estimados y Coef icientes para Pérdida de Arabinan Término Efecto Coef Coef SE T P Constante 0.81381 0.008178 99.52 0.000 Temperatura -0.04959 -0.02480 0.008178 -3.03 0.023 Tiempo 0.00956 0.00478 0.008178 0.58 0.580 A/W -0.01333 -0.00667 0.008178 -0.82 0.446 US -0.12461 -0.06231 0.008178 -7.62 0.000 Temperatura*tiempo -0.01916 -0.00958 0.008178 -1.17 0.286 Temperatura* AAV 0.00911 0.00455 0.008178 0.56 0.598 Temperatura*L/S -0.05361 -0.02680 0.008178 -3.28 0.017 tiempo* AAV -0.01654 -0.00827 0.008178 -1.01 0.351 tiempo*L/S -0.00364 -0.00182 0.008178 -0.22 0.831 A/W*US -0.02747 -0.01373 0.008178 -1.68 0.144 Ct Pt -0.02964 0.024534 -1.21 0.272 S = 0.0327118 PRESS = 0.0486379 R-Sq = 93.48% R-Sq(pred) = 50.61% R-Sq(adj) = 81.53% Tabla 2D : Efectos Estimados y Coef icientes para Pérdida de Xilano Término Effect Coef SE Coef T P Constante 0.013193 0.005247 2.51 0.046 Temperatura 0.026880 0.013440 0.005247 2.56 0.043 Tiempo 0.014470 0.007235 0.005247 1.38 0.217 AAV -0.014698 -0.007349 0.005247 -1.40 0.211 US 0.058936 0.029468 0.005247 5.62 0.001 Temperatura* tiempo 0.046825 0.023413 0.005247 4.46 0.004 Temperatura* A/W 0.006350 0.003175 0.005247 0.61 0.567 Temperatura*L/S 0.027901 0.013951 0.005247 2.66 0.038 Tabla 2D: Efectos Estimados y Coeficientes para % de Pérdida de Xilano. Continuación tiempo*A/W -0.009929 -0.004965 0.005247 -0.95 0.381 tiempo*L/S -0.016327 -0.008164 0.005247 -1.56 0.171 A/W*L/S -0.011007 -0.005503 0.005247 -1.05 0.335 Ct Pt -0.004370 0.015742 -0.28 0.791 S = 0.0209896 PRESS = 0.0267071 R-Sq = 92.48% R-Sq(pred) = 24.03% R-Sq(adj) = 78.69 Estos resultados muestran que la temperatura es un parámetro estadísticamente relevante para todas las variables dependientes probadas. La relación líquido a sólido (L/S) es también una variable relevante para maximizar la extracción de Lignina, Arabinano y Xilano. El tiempo variable no fue altamente relevancia a cualquiera de las variables dependientes donde el intervalo de tiempos analizados fue entre 20 y 45 minutos. Los datos indican que el pretratamiento puede ser probablemente realizado a tiempos de residencia inferiores sin comprometer algunos de los resultados de variables dependientes . Los datos además indican que la variable amoníaco : agua (AAV, por sus siglas en inglés) puede ser importante para lograr buena conversión de glucano .

Como se muestra por la FIG. 11, la remoción de lignina mejora significantemente la conversión de celulosa a glucanos utilizables. En general, la conversión de glucano incrementa como se incrementa la cantidad lignina perdida de la biomasa (FIG. 11) . Sin embargo, la pérdida de lignina no fue el único factor que contribuye a recalcitrancia de la biomasa. De este modo, el valor R2 para pérdida de lignina y conversión de glucano fue solamente 0.7489.

En una de las condiciones probadas, el amoníaco líquido se puso en contacto con biomasa sin agregar cualquier humedad. En este caso, solamente está presente humedad residual de la biomasa durante el pretratamiento (cerca del 6.5% de humedad) (Tabla 3).

Tabla 3 : Condiciones de Tratamiento de Amoníaco Extractivo y AFEX Estudios indican que es más probable que se forma celulosa III usando las condiciones de Amoníaco Extractivo listadas en la Tabla 3. Por lo tanto, se analizó la muestra de Amoníaco Extractivo en más detalle y se comparó con AFEX no extractivo regular.

La Figura 12 muestra que se removió aproximadamente el 73% de la Arabinano por el procedimiento de extracción realizado durante Amoníaco Extractivo. Mientras solamente 1.8% de xilano total se extrajo con amoníaco, aproximadamente 34.3% de lignina insoluble en ácido se removió usando el pretratamiento de Amoníaco Extractivo. Se nota que solamente la lignina insoluble en ácido se midió para este estudio, y que la lignina soluble en ácido no se determinó. Si la lignina soluble en ácido también ha sido determinada, una pérdida de lignina total mayor probablemente habría sido detectada en el extracto. Así, el procedimiento de extracción fue muy efectivo para remover Arabinano y bastante efectivo para remover lignina. Pero la mayoría del glucano restante en el residuo de biomasa no fue extraído. Como se muestra en la Figura 12, solamente 6.3% del glucano se extrajo, indicando que sobre el 93% del glucano permanece en el residuo. Estos datos indican que el amoníaco es selectivo en la extracción de solamente ciertos componentes de pared celular vegetal.

La digestibilidad del rastrojo de maíz pretratado con amoníaco extractivo se comparó con el tratamiento AFEX convencional de rastrojo de maíz, rastrojo de maíz tratado con extracción de amoníaco líquido, Avicel (Celulosa I) , y Avicel (Celulosa III) . Las condiciones AFEX convencionales empleadas son: 1:1 amoníaco a biomasa (peso/peso) con 0.1:1 agua:biomasa (peso:peso) por 15 minutos a 130°C. Avicel (Celulosa I) fue Avicel sin tratar. Para el tratamiento de amoníaco líquido, se trató rastrojo de maíz con 7.5:1 amoníaco : biomasa (peso/peso) por 45 minutos a 100°C. El rastrojo de maíz tratado con amoníaco líquido también se extrajo como se describe anteriormente. Avicel (Celulosa III) se preparó por Avicel tratado con 7 : 1 amoníaco a biomasa cargado a 25 °C por 30 minutos. Para estos estudios, se incubó 15 mg de celulasa Accelerasa 1500 (Genencor-Danisco) por gramo de glucano con los materiales de celulosa diversamente tratados a 50 °C con agitación a 250 RPM por 12, 24 y 72 horas.

La Figura 13 muestra que después de 24 horas de digestión, la biomasa tratada con pretratamiento de amoníaco extractivo tiene 1.7 veces mayor velocidad de hidrólisis enzimática que la biomasa tratada con AFEX convencional. El rastrojo de maíz pretratado con amoníaco extractivo también muestra mayor conversión de glucano que la celulosa I purificada (Avicel) . La inclusión de xilanasas y otras hemicelulasas accesorio en el coctel enzimático se espera además que incremente la conversión de glucano de forma que la conversión de glucano de biomasa (por ejemplo, rastrojo de maíz) después del pretratamiento de amoníaco extractivo genera aún mayores conversiones (similar a aquellas observadas con tratamiento de amoníaco de Avicel) .

Sorprendentemente, el pretratamiento de amoníaco extractivo efectivamente continúa aún cuando está presente agua significante durante el tratamiento con amoníaco (Tabla 4) .

Tabla 4 : Condiciones de Pretratamiento para altas conversiones de glucano en rastrojo de maíz A/W = amoníaco : gua; L/S = líquido : sólido .

Como se muestra en la Tabla 4, la Condición #1 tiene una relación amoníaco : agua bajo pero aún muestra alta conversión de glucano y mayor remoción de lignina. Así algo de agua puede estar presente en el tratamiento de amoníaco líquido. Nótese que la condición #2 corresponde a las mismas condiciones usadas para producir celulosa III que las mostradas en la Tabla 3.

En la condición #1, se usa aproximadamente el 80% de amoníaco en agua, con una proporción 8:1 Líquido-Sólido, y la biomasa se incuba en esta solución a 120 °C por 45 minutos. Bajo estas condiciones, se observa una conversión de glucano del 65.8% después de 72 horas. En contraste, las mismas condiciones usadas con Avicel (celulosa I) dieron lugar a solamente 55% de conversión de glucano. Así, la celulosa I en rastrojo de maíz se convirtió a cantidades significantes de celulosa III usando 80% de amoníaco por el procedimiento de pretratamiento con Amoníaco Extractivo. Esto es sorprendente porque datos significantes indican que solamente el amoníaco anhidro es capaz de convertir celulosa I a celulosa III.

Sin embargo, el pretratamiento con Amoníaco Extractivo remueve cantidades significantes de lignina, lo cual puede contribuir a la alta conversión de celulosa I de rastrojo de maíz a celulosa III control.

Se realizaron experimentos de hidrólisis enzimática a base de alta carga de sólido usando rastrojo de maíz pretratado rico en celulosa I y rico en celulosa III en dos diferentes cargas de celulasa. La biomasa fue rastrojo de maíz. El rastrojo de maíz rico en celulosa I fue generado por tratamiento de rastrojo de maíz con 1:1 de amoníaco a biomasa (peso: peso) con 0.6:1 de agua: biomasa (peso/peso) por 15 minutos a 130°C. El rastrojo de maíz rico en celulosa III fue generado por tratamiento de rastrojo de maíz con 7:1 de amoníaco : biomasa (peso: peso) por 2 horas a 100 °C, en donde la biomasa tiene humedad residual de 0.05 g de agua a gramo de biomasa. Como se muestra en las Figuras 14A-14D, es posible lograr alta conversión de glucano a baja carga de celulasa total con sólidos industrialmente relevantes de sustratos ricos en celulosa III. Este estudio indica que las conversiones equivalentes se pueden lograr para celulosa III a cargas de celulasa 3 veces inferior que se necesitan para celulasa I, aún cuando están presentes altas cargas industrialmente relevantes. También, los inventores encontraron que las conversiones de glucano y xilano para rastrojo de maíz pretratado rico en celulosa III no están influenciadas por carga de sólidos como para rastrojo de maíz pretratado rico en celulosa I con referencia a ventajas adicionales durante la hidrólisis enzimática bajo condiciones de alta carga de sólidos industrialmente relevantes.

El rastrojo de maíz pretratado rico en celulasa III se generó por tratamiento con 7:1 de amoníaco : biomasa (peso/peso) por 2 horas a 100°C, en donde la biomasa tiene humedad residual de 0.05 g de agua por gramo de biomasa. No se realizó la extracción componentes de pared vegetal. Se evalúo la necesidad que la mezcla enzimática convierta óptimamente este rastrojo de maíz AFEX rico en celulosa III variando la cantidad y tipos de enzimas empleadas para digestión enzimática como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5: Mezclas Enzimáticas para Hidrólisis de rastrojo de maíz AFEX rico en celulosa III En cada caso, se usó 30 mg de enzima total con hidrólisis por 24 horas.

Los resultados se muestran en la Figura 15. En general, los altos niveles de glucano y xilano a partir del rastrojo de maíz AFEX rico en celulosa III no extraída se obtienen cuando se usan . las combinaciones de enzimas. Así, cuando se usan cantidades equivalentes de Acelerasa 1500, xilasa Multifect y pectinasa Multifect (mezcla enzimática 7) , se liberan altos niveles tanto de glucano como de xilano a partir del sustrato de rastrojo de maíz.

EJEMPLO 3 : La Digestión de Celulosa III Aumenta la Endocelulasas Este ejemplo describe los resultados experimentales que ilustran los tipos de enzimas que óptimamente digieren alomorfos de celulosa.

Se usaron dos exocelulasas , Cel7A (celobiohidrolasa I o CBH I) y Cel6A (CBH II) y una endocelulasa, Cel7B (EG I) , de Trichoderma reeseis en combinaciones variadas para hidrolizar celulosa I y III, derivada de Avicel, fibras y borlas de Algodón. La celulosa I es celulosa pura sin tratar (Avicel, Borlas o fibras de algodón) . Para generar celulosa I en estos materiales de biomasa de celulosa, la biomasa se trató con 7:1 de amoníaco : biomasa (peso/peso) por 30 minutos a 95°C.

Se usaron celulasas purificadas para hidrolizar estas celulosas por 24 horas y se registró el rendimiento de glucanos solubles hidrolizados (por ejemplo, glucosa) . Cada enzima purificada se cargó a 2.5 mg/cada una y se suplementaron con beta-glucosidasa adicional (10% de celulasa total agregada) en cada ensayo para prevenir la inhibición por celobiosa. Las desviaciones estándar están dentro de ±20% de los valores medios reportados. Sin embargo, no se observó mejoramiento significante en la actividad específica para cualquiera de las celulasas cuando se agregó solo a celulosa III derivada de Avicel, o borlas o fibras de algodón (Fig. 16) . De manera interesante, el mejoramiento más significante es el rendimiento de hidrólisis para celulosa III contra celulosa I ocurrido cuando se emplearon las combinaciones de exocelulasas y endocelulasas . Así, la combinación de Cel7A + Cel6A + Cel7B fue particularmente efectiva (Figs. 16A-16F) .

Se probaron otras enzimas, incluyendo combinaciones de Cel7A, Cel6A, Cel7B, Cel5A_ac, Cel5A_tr, Cell2A, Cel61A y Cel61B. Las celulasas Cel5A_tr, Cell2A, Cel61A y Cel61B son de T. reesei y Cel5A_ac es de Acidothermus cellulolytlcum.

El grado de efecto sinergístico (DSE, por sus siglas en inglés) para combinaciones enzimáticas se notó, en donde el grado de efecto sinergístico (DSE) es definido como sigue Grado Sinergístico (?ß??) en donde : (i-mezc es la prolongación de conversión de glucano lograda por una mezcla de proteínas; ?? es la prolongación de conversión de glucano lograda por el componente de proteína sola iprim.

Como se muestra en la Tabla 6 debajo, una enzima sola ocasionalmente tiene ligeramente mejor actividad en celulosa I que en celulosa III pero las combinaciones de enzimas típicamente digieren significantemente más celulosa III que celulosa I. Así, existe un margen disminuido en rendimiento hidrolítico notado para exocelulasas individuales (Cel7A, Cel6A) en celulosa III comparado a celulosa I. Sin embargo, en general, se observaron conversiones de glucano bastante similares para los dos sustratos cuando se emplea una enzima sola. Para mezclas de exocelulasa binaria, conversiones de glucano para sustratos de celulosa I y III raramente excede 10%. Sin embargo, se observan conversiones de glucano algo mejoradas cuando se emplean ciertas combinaciones de exocelulasa + endocelulasa .

Tabla 6 Sin embargo, para combinaciones de celulasa ternarias la mayoría de las mezclas resultan en conversiones de glucano que varía entre 10-30% y 15-17% para celulasa I y III, respectivamente. Las endocelulasas de familia 5 y 7 GH generalmente resultan en conversiones significantemente mayor para celulasa III (>25% incrementada en rendimiento de hidrólisis con respecto al control) comparadas a otras familias de endocelulasas (por ejemplo, GH 12, 61). Así, como se indica por la Tabla 6 arriba, la mayor conversión de glucano se observa para una combinación de equimasa ternaria de Cel7A/Cel6A/Cel7B . Estudios adicionales indicaron que la relación óptima de Cel7A/Cel6A/Cel7B (15 mg/g de carga enzimática total de glucano) para maximizar el rendimiento de las 24 horas de celulasa I y III derivada de Avicel hidrolizado que tiene un porcentaje marginalmente elevado de Cel7B (35% en peso de Cel7B contra 32% en peso de las otras proteínas de celulasa; datos de optimización de mezcla no mostrados) .

La influencia del tipo de endocelulasa en el grado de efecto sinergístico (DSE) con exocelulasas Cel7A + Cel6A también se estudió durante la hidrólisis de celulosa cristalina I y III. La celulosa es celulosa pura sin tratar (Avicel, borlas o fibras de algodón) . Para generar celulosa III en estos materiales de biomasa de celulosa, la biomasa se trató con 7:1 de amoníaco : biomasa (peso:peso) por 30 min a 95°C.

Las endocelulasas de las familias de glicosil hidrolasa (GH) homologas y distintas que se probaron en combinación con Cel7A y Cel6A incluyen Cel5A_ac de Acidother us cellulolyticum, Cel5A_tr de T. reesei y Cel7B (EG I) de Trichoderma reesei. Los sustratos de celulosa I y III se derivaron de Avicel . En general, la celulosa III se digirió a una extensión mayor que la celulosa I cuando combinaciones de exocelulasas y endocelulasas se emplearon. De este modo, el DSE binario para Cel7A/Cel6A y Cel7A/Cel7B fue 1.7 y 2.5 en celulosa I comparado con 3.4 y 4.4 observado en celulosa III, respectivamente. Sin embargo, como se indica por la FIG. 17, hubo un incremento de 3-100% y 40-370% en los DSEs de celulosa I y celulosa III, respectivamente, cuando las endocelulasas fueron usadas con las dos exocelulasas Cel7A + Cel6A.

Cel7A, CelSA y Cel7B son las celulasas de T. reesei más abundantes y proporcionan hidrólisis de celulosa eficiente como se indica anteriormente. De este modo, estas enzimas son candidatos ideales para estudios de enlace enzimático detallado. La afinidad de enlace del sustrato enzimático fue experimentalmente determinada ajustando el modelo de adsorción de sitio único de Langmuir a las isotermas de enlace de Cel7A, Cel6A y Cel7B de T. reesei para celulosa I y III derivada de Avicel. Las celulosa I y celulosa III se examinaron con 50 mg de enzima de celulosa por gramo de glucano e incubaron a 4 °C para equilibrio de adsorción. Las enzimas de celulosa probadas fueron Cel7A (Celobiohidrolasa I o CBH I) , Cel6A (CBH II) , y endocelulasa Cel7B (EG I) .

De manera sorprendente, las tres celulasas mostraron una afinidad de enlace máximo total reducido para celulosa III comparado con la celulosa nativa (con base en el coeficiente de afinidad de enlace máximo; mg de proteína/g de sustrato) . Como se indica en la Tabla 7 abajo, el enlace a celulosa III fue aproximadamente 50-70% menos que a celulosa I.

Tabla 7: % Aproximado de Enzima unida a Celulosa Esto es contrario a lo que se ha reportado en la literatura previamente. En particular, estudios previos indican que la velocidad de hidrólisis enzimática es directamente correlacionada con la extensión de la enzima adsorbida a celulosa (Hall et al., FEBS Journal 277 1571-82 (2010); Carrard et al, PNAS 97: 10342-47 (2000)). En efecto, los datos de afinidad de enlace de sustrato enzimático obtenidos por los inventores indican que existe un enlace de celulasa reducido al alomorfo de celulosa III más fácilmente digestible. Las tres celulasas principales de Trichoderma presentan capacidades de enlace similares para cada uno de los alomorfos de celulosa analizados en el estudio (Cel7A\Cel7B>Cel6A) , y sus capacidades de enlace total fueron 2-3 veces mayor para celulosa I que para celulosa III. La capacidad máxima de celulasa unida a la superficie para celulosa III fue 50-70% inferior comparada con la celulosa nativa I .

De este modo, la actividad hidrolítica mejorada en el sustrato de celulosa III que se observó cómo se describe anteriormente (por ejemplo, en la Tabla 6 Figs. 16-17) no puede ser explicada en términos de las capacidades de enlace de celulasas para celulosa I y celulosa III. Estudios previos han mostrado que las celulasas T. reesei preferencialmente se unen a la superficie cristalina de celulosa I axial a través de van der Waals e interacciones de polarización de anillo aromático que involucran los residuos aromáticos de los módulos de enlace de celulosa (CBMs, por sus siglas en inglés) y los anillos de piranosa (Lehtio et al., Proc . Nat ' 1 Acad. Sci. USA 100(2): 484-489 (2003)). La mayoría de las celulasas de T. reesei están comprendidas de la familias 1 altamente homologas de CBM, las cuales en general tienen afinidades de enlace similares para cada alomorfo de celulosa. Estudios de simulación dinámica molecular (MD, por sus siglas en inglés) recientes han mostrado que la familia 1 de moléculas de enlace a celulosa tienen mayor afinidad para la cara hidrofóbica de celulosa I comparado con sus superficies relativamente más hidrofílicas (Yui et al., J. Phys . Chem. B114 (1) : 49-58 (2009)). Algunos reportes indican que el enlace de celulasas a celulosa nativa es accionado vía la interacción de residuos planares aromáticos encontrados en la familia 1 de CBM, pero la capacidad de procesamiento de celulasas puede ser accionada vía enlace de hidrógeno (Beckham et al., J. Phys. Chem. 114: 1447-53 (2010)).

Los inventores han conducido análisis estructurales dinámicos moleculares de celulosa I y celulosa III, y han observado que la celulosa III sufre mayor fluctuación térmica intra-lámina que lo que sufre la celulosa I. De este modo, la celulosa III también tiene un radio mayor de giro (Rg2) que la celulosa I .

Tabla 8: Fluctuaciones Térmicas de Fibra Cristalina De este modo, la tendencia para la estructura cristalina de celulosa III para permitir los enlaces de hidrógeno con moléculas de agua para cadenas de glucano expuestas a la superficie puede facilitar la interacción enzimática y capacidad de procesamiento enzimático (y por lo tanto incrementar la eficiencia de celulasa) debido a la capacidad de enlace de celulosa total reducida.

Además de las propiedades estructurales y moleculares de moléculas de enlace de celulosa y celulosa III, la interacción del dominio catalítico de una enzima a través de su hendidura de sitio activo también juega un papel. Los inventores han encontrado que el grado de actividad sinergística (DSE) en celulosa III para una mezcla de endocelulasa-exocelulasa comprendida de Cel7B fue al menos dos veces mayor que las mezclas que comprenden endocelulasas de la familia 5 de glicosil hidrolasa (Cel5A_ac y Cel5A_tr) . La comparación de las hendiduras de sitio activo de estas enzimas revela que Cel7B tiene una hendidura de sitio activo larga y relativamente no restringida comparada con aquella de Cel5a. Esta hendidura de sitio activo abierto de Cel7B juega un papel significante en proporcionar una plataforma fácilmente accesible para enlace productivo y catálisis eficiente. Por consiguiente, la Cel61A no tiene hendidura de sitio activo abierta discernible y muestra mejoramiento mínimo en DSE en celulosa III. Con base en las estructuras de la proteína y ensayos de actividad, parece que una celulasa tal como Cel7B con una hendidura de sitio activo no restringido y más abierto puede además acelerar la degradación de celulasa III comparada con otras endocelulasas . Además, es probable que la barrera energética a descristalización de celulosa por endocelulasas sea superior que exocelulasas debido a que el roscado por enzimas de procesamiento debe contribuir adicionalmente a reducción de la barrera termodinámica a descristalización. Esto enfatiza además la importancia de alterar la estructura cristalina de la celulosa (de I a III) , para reducir la barrera de descristalización y mejorar la cinética de hidrólisis de celulosa.

EJEMPLO 5 : Pretratamiento Extractivo con Amoniaco y Acetona Este ejemplo describe el impacto de usar acetona como solvente en la formación de celulosa III durante el pretratamiento de biomasa con amoníaco. La reversión de celulosa III a celulosa I ocurre si el agua se usa como un solvente en altas concentraciones. De este modo, tal reversión puede ser evitada empleando otros tipos de solventes .

Se realizó pretratamiento con amoníaco líquido anhidro como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la acetona sustancial se agregó para valorar si tal acetona afecta la deformación de celulosa III. En particular, 0.2-0.3 g de biomasa se trató con 11 mg de 1:10 de amoníaco a acetona (vol:vol) por periodos de tiempo variantes a 25°C. El tiempo de pretratamiento para las muestras fue 2.5, 7.5, 10 y 60 minutos. La formación de celulosa III se monitoreó por análisis de difracción de rayos-X.

La acetona no afecta adversamente la formación de celulosa III. En efecto, como se muestra en la FIG. 18, la conversión sustancialmente completa de celulosa I a celulosa III fue observada después de solo 2.5 minutos de pretratamiento de Avicel con la mezcla de amoníaco líquido anhidro : acetona .

Estos resultados indican que la acetona puede ser usada como un co-solvente durante el tratamiento de amoníaco líquido para expedir la formación de celulosa III y la extracción de lignina de la biomasa lignocelulósica en una manera selectiva.

EJEMPLO 6: Fermentación de Rastrojo de Maíz Rico en Celulosa III Este ejemplo muestra que el rastrojo de maíz rico en celulosa III es fácilmente fermentado para generar cantidades significantes de etanol .

La biomasa empleada fue rastrojo de maíz. El rastrojo de maíz rico en celulosa III fue generado por tratamiento de rastrojo de maíz con 7:1 de amoníaco :biomasa (peso:peso) por 2 hr a 100°C, donde la biomasa tiene humedad residual de 0.1 g de agua de gramo de biomasa.

La hidrólisis enzimática se realizó en las muestras de rastrojo de maíz tratadas como se describe en el Ejemplo 4 (véase datos mostrados en la FIG. 14) . El rastrojo de maíz pretratado fue enzimáticamente hidrolizado usando cargas altas en sólidos a dos niveles de enzimas: carga de celulasa baja (15 mg/g de glucano) y alta (30 mg/g de glucano) . La hidrólisis se llevó a cabo por 168 hrs.

La fermentación se llevó a cabo a 30°C, pH 5.5, usando 0.2 de densidad óptica celular inicial (OD) con agitación a 150 rpm. Se agregaron nutrientes no exógenos para soportar el crecimiento celar distinto del sustrato: 6% de carga de glucano con base en el hidrolizado de rastrojo de maíz rico en celulosa III. No se extrajeron componentes de la pared vegetal de este sustrato. Se usaron dos cargas de enzimas para llevar a cabo la hidrólisis: 15 mg por g de glucano (símbolo cuadrado) y 30 mg por g de glucano (símbolos de rombos) . La fermentación fue por 120 hrs.

Como se muestra en las FIGS . 19A-19D, se produjo cerca de 40 g/1 de etanol, la cual es una concentración de etanol apropiada de destilación a escala industrial del producto final. Sin embargo, la fermentación del rastrojo de maíz rico en celulosa III fue sola tan eficiente cuando se realizó la digestión enzimática con 15 mg por g de glucano como con 30 mg por g de glucano. Por el contrario, la digestión enzimática de rastrojo de maíz de AFEX que contiene celulosa I fue menos eficiente (FIGS. 14A-14B) . De este modo, puede ser usada menos enzima para digerir eficientemente la biomasa rica en celulosa III y permitir niveles significantes de etanol ser producidos durante la fermentación.

Referencias Todas las publicaciones, patentes y documentos de patente están incorporados por referencia en la presente, cada uno en su totalidad, como si individualmente se incorporaran por referencia. En el caso de algunas inconsistencias, la presente descripción, que incluye algunas definiciones aquí, prevalecerá. 1. Zhang, Y.-H.P. et al, Fractionating recalcitrant lignocellulose at modest reaction conditions . Biotechnology and Bioengineering 97 (2) , 214-223 (2007) . 2. Zhang, Y.H.P., Cui, J. , Lynd, L.R., & Kuang, L.R., A Transition from Cellulose Swelling to Cellulose Dissolution by o-Phosphoric Acid: Evidence from Enzymatic Hydrolysis and Supramolecular Structure. Biomacromolecules 7 (2) , 644-648 (2006) . 3. Swatloski, R.P., Spear, S.K., Holbrey, J.D., & Rogers, R.D., Dissolution of cellulose with ionic liquids. Journal of the American Chemical Society 124 (18) , 4974-4975 (2002) . 4. Chundawat, S., 2009. Ultrastructural and physicochemical modifications within ammonia treated lignocellulosic cell walls and their influence on enzymatic digestibility Chemical Engineering & Materials Science. Ph.D.

Dissertation. Michigan State University, East Lansing. 5. Pan, X.J., Role of functional groups in lignin inhibition of enzymatic hydrolysis of cellulose to glucose. J. Biobased Mater. Bioenergy 2 (1) , 25-32 (2008) . 6. Klinke, H.B., Thomsen, A.B., & Ahring, B.K., Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Applied Microbiology and Biotechnology 66 (1), 10-26 (2004) . 7. Lau, M. . & Dale, B.E., Cellulosic ethanol production from AFEX-treated corn stover using Saccharomyces cerevisiae 424A (LNH-ST) . Proceedings of the National Academy of Sciences 106 (5) , 1368-1373 (2009) . 8. Chundawat, S.P.S., Vismeh, R. , Sharma, L., Humpula, J. , Sousa, L., Chambliss, C.K., Jones, A.D., Balan, V., Dale, B.E., 2010. Multifaceted characterization of cell wall decomposition products formed during ammonia fiber expansión (AFEX) and dilute-acid based pretreatments . Biores Technol, 101, 8429-8438. 9. Carolan, J. , Joshi, S., & Dale, B., Technical and Financial Feasibility Analysis of Distributed Bioprocessing Using Regional Biomass Pre-Processing Centers . J. Agri Food Ind Org 5, 10 (2007). 10. Aden, A., et al., Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, in Technical Report . 2002, National Renewable Energy Laboratory (NREL) : Golden, p. 1-154. 11. Schell, D.J., et al., Dilute-sulfuric acid pretreatment of corn stover in pilot-scale reactor: Investigation of yields, kinetics, and enzymatic digestibilities of solids. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2003. 105(1-3): p. 69-85. 12. Wyraan, C, et al. Compar tive Data for Enzymatic Digestión of Corn Stover and Poplar Wood after Pretreatment by Leading Technologies, in AIChE Annual Meeting. 2006. San Francisco, California. 13. Wyraan, CE., Integration of Leading Biomass Pretreatment Technologies with Enzymatic Digestión and Hydrolyzate Fermentation. 2005, Department of Energy, p. 1-10. 14. Mohagheghi, A., et al., High Solids Si ultaneous Saccharification and Fermentation of Pretreated Wheat Straw to Ethanol. Appl Biochem Biotechnol, 1992. 33: p. 67-81. 15. Eggeman, T. and R.T. Elander, Process and economic analysis of pretreatment technologies. Bioresource Technology, 2005. 96(18): p. 2019-2025. 16. Varga, E. , K. Reczey, and G. Zacchi, Opti ization of steam pretreatment of corn stover to enhance enzy atic digestibility. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2004. 114(1-3): p. 509-523. 17. Playne, M.J., Increased digestibility of bagasses by pretreatment with alkalis and steam explosión. Biotechnology and Bioengineering, 1984. 26(5): p. 426-433. 18. Mackie, K.L., et al., Effect of Sulfur Dioxide and Sulfuric Acid on Steam Explosión of Aspenwood. Journal of Wood Chemistry and Technology, 1985. 5(3): p. 405-425. 19. Ballesteros, I., et al., Ethanol production from steam-explosión pretreated wheat straw. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2006. 130(1-3): p. 496-508. 20. Hongzhang, C. and L. Liying, Unpolluted fractionation of wheat straw by steam explosión and ethanol extraction. Bioresource Technology, 2007. 98(3): p. 666- 676. 21. Balan, V., et al . , Enzymatic digestibility and pretreatment degradation products of AFEX-treated hardwoods (<I>Populus nigra</l>) . Biotechnology Progress, 2009. 25(2) : p. 365-375. 22. Yoon, H.H., Z.W. Wu, and Y. Y. Lee, A monia-Recycled Percolation Process for Pretreatment of Biomass Feedstock. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995. 51-52 (1) : p. 5-19. 23. Kim, T.H. and Y. Y. Lee, Pretreatment and fractionation of corn stover by ammonia recycle percolation process. Bioresource Technology, 2005. 96(18): p. 2007-2013. 24. Kim, T.H., et al., Pretreatment of corn stover by low-liquid a monia recycle percolation process . Applied Biochemistry and Biotechnology, 2006. 133(1): p. 41-57. 25. Ishizawa, C, et al., Porosity and Its Effect on the Digestibility of Dilute Sulfuric Acid Pretreated Corn Stover. J Agrie Food Chera 2007. 55: p. 2575-2581. 26. Davis, M.F., et al., Chemical and Physical Properties of P retreated Biomass that Affect Enzyme Accessibility and Digestibility, in Agricultural Biomass, Biobased Products, and Biofuels. 2007: Chicago, Illinois. 27. Igarashi, K., M. Wada, and M. Samejima, Activatíon of crystalline cellulose to cellulose III results in efficient hydrolysis by cellobiohydrolase . FEBS Journal, 2007. 274 (7): p. 1735-1792. 28. Weimer PJ, French AD, Calamari TA. Differential Fermentation of Cellulose Allomorphs by Ruminal Cellulolytic Bacteria. Appl Environ Microbiol . 1991 57 (11) : 3101-3106. 29. Sendich, E., et al., Recent process improvements for the ammonia fiber expansión (AFEX) process and resulting reductions in mínimum ethanol selling price. Bioresource Technology, 2008. 99(17): p. 8429-8435. 30. da Costa Sousa, L. , et al., ' Cradle- to-grave ' assessment of existing lignocellulose pretreatment technologies . Current Opinión in Biotechnology, 2009. 20(3): p. 339-347. 31. Igarashi K, Wada M, Samejima M. 2007. Activation of crystalline cellulose to cellulose III results in efficient hydrolysis by cellobiohydrolase . FEBS Journal 274 (7) : 1785-1792. 32. Chundawat S. 2009. Ultrastructural and physicochemical modifications within ammonia treated lignocellulosic cell walls and their influence on enzymatic digestibility . East Lansing: Michigan State University (Ph.D. Dissertation; AAT 3417644) . 33. Chundawat SPS, Bellesia G, Uppugundla N, Sousa L, Gao D, Cheh A, Agarwal U, Bianchetti C, Phillips G, Langan P, Balan V, Gnanakaran S, Dale BE. Restructuring crystalline cellulose hydrogen bond network enhances its depolymerization rate . Manuscript under review (2011) . 34. Wada M, Chanzy H, Nishiyama Y, Langan P. 2004.

Cellulose IIII crystal structure and hydrogen bonding by synchrotron X-ray and neutrón fiber diffraction. Macromolecules 37 (23) : 8548-8555. 35. Barry AJ, Peterson FC, King AJ. 1936. X-Ray Studies of Reactions of Cellulose in Non- Aqueous Systems. I.

Interaction of Cellulose and Liquid Ammonia. Journal of the American Chemical Society 58 (2) : 333-337. 36. Lewin M, Roldan LG. 1971. The Effect of Liquid Anhydrous Ammonia in the Structure and Morphology of Cotton Cellulose. Journal of Polymer Science Part C-Polymer Symposium(36) :213-229.

Todas las patentes y publicaciones referenciadas o mencionadas en la presente son indicativas de los niveles de habilidad de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención, y cada una de tales patentes o publicaciones referenciadas están de este modo específicamente incorporadas por referencia en la misma extensión como han sido incorporadas por referencia en su totalidad individualmente o expuestas en la presente en su totalidad. Los solicitantes se reservan el derecho para incorporar físicamente en esta especificación cualquiera y todos los materiales e información de cualquiera de tales patentes o publicaciones citadas .

Los métodos y composiciones descritos en la presente son representativos de modalidades preferidas y son ejemplares y no están propuestos como limitaciones en el alcance de la invención. Otros objetos, aspectos y modalidades ocurrirán para aquellos expertos en la técnica después de la consideración de esta especificación, y están abarcados dentro del espíritu de la invención como se define por el alcance de las reivindicaciones. Será fácilmente aparente para un experto en la técnica que sustituciones y modificaciones variantes pueden hacerse a la invención descrita aquí sin apartarse del alcance y espíritu de la invención.

La invención descrita ilustrativamente en la presente, puede ser practicada adecuadamente en la ausencia de cualquier elemento o elementos, o limitación o limitaciones, los cuales no son específicamente descritos en la presente como esenciales. Los métodos y procesos descritos ilustrativamente en la presente pueden ser practicados adecuadamente en diferentes órdenes de etapas, y que no están necesariamente restringidos a los órdenes de etapas indicadas en la presente o en las reivindicaciones. Como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo. De este modo, por ejemplo, una referencia a "un microorganismo" incluye una pluralidad (por ejemplo, un cultivo o población) de tales microorganismos. Bajo ninguna circunstancia puede la patente ser interpretada por ser limitada a los ejemplos específicos o modalidades o métodos específicamente descritos en la presente. Bajo ninguna circunstancia puede la patente ser interpretada por ser limitada por cualquier declaración hecha por cualquier Examinación o cualquier otro oficial o empleado de la Patente y Oficina de Marcas a menos que tal declaración sea específicamente y sin calificación o reservación expresamente adoptada en una respuesta escrita por los Solicitantes.

Los términos y expresiones que han sido empleados son usados como términos de la descripción y no de limitación y no existe intento en el uso de tales términos y expresiones para excluir algún equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención como se reivindica. De este modo, se entenderá que aunque la presente invención ha sido específicamente descrita por modalidades preferidas y características opcionales, modificaciones y variaciones de los conceptos aquí descritos pueden ser recurridas por aquellos expertos en la técnica, y que tales modificaciones y variaciones son consideradas por estar dentro del alcance de esta invención como se define por las reivindicaciones adjuntas .

La invención ha sido descrita ampliamente y genéricamente en la presente. Cada una de las especies más estrechas y agrupamientos subgenéricos que caen dentro de la descripción genérica también forman parte de la invención. Estas incluyen la descripción genérica de la invención con una provisión o limitación negativa eliminando cualquier materia objeto del género, con respecto a si o no el material escindido es específicamente mencionado en la presente. Además, la frase "que consiste esencialmente de" o "que consiste de" puede ser usada en lugar del término "que comprende" dentro de las reivindicaciones. Donde las características o aspectos de la invención son descritos en términos de grupos Markush, aquellos expertos en la técnica reconocerán que la invención es también de este modo descrita en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para producir un producto de biomasa lignocelulósica caracterizado porque comprende convertir la celulosa nativa Ip a celulosa lili penetrando la biomasa lignocelulósica con amoníaco líquido para generar una biomasa pretratada, y producir un producto de esta.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amoníaco líquido es amoníaco anhidro .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amoníaco líquido es 80%-99% de amoníaco en un solvente.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el solvente es agua.

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el solvente es un solvente orgánico.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el solvente es acetona, etanol, metanol, isopropanol, diclorometano, acetato de metilo, acetato de etilo, cloroformo y combinaciones de los mismos.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque menos de 20% de humedad está presente en la biomasa lignocelulósica.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa lignocelulósica es pretratada con amoníaco líquido por 1 minuto a 3 horas.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa lignocelulósica es pretratada con amoníaco líquido a una temperatura de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 140° C.

10. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque la relación en peso de amoníaco líquido a biomasa lignocelulósica es 8:1 a 2:1.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque además comprende extraer componentes de la pared celular de la planta.

12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque los componentes de la pared celular vegetal se seleccionan del grupo que consiste de lignina, hemicelulosa, arabinano, y combinaciones y productos de degradación de los mismos.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque glucano y xilano son sustancialmente retenidos con la biomasa pretratada.

1 . El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la extracción es realizada simultáneamente con pretratamiento con amoníaco líquido anhidro .

15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la extracción se realiza después del pretratamiento con amoníaco líquido anhidro.

16. Los métodos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque los componentes de la pared celular vegetal no son extraídos .

17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende digerir la biomasa pretratada con una combinación de enzimas.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las enzimas de combinación comprenden al menos una exocelulasa y al menos una endocelulasa .

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la combinación de enzimas comprende Cel7A (Celobiohidrolasa I) , Cel6A (Celobiohidrolasa II) y Cel7B (EG I), de Trichoderma reesei .

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la combinación de enzimas comprende además Cel5A_tr, de Trichoderma reesei, Cel5A_ac es de Acidothermus cellulolyticum, o una combinación de las mismas.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la combinación de enzimas comprende además celulasa de Trichoderma reesei Cell2A, Cel61A, Cel61B, o una combinación de las mismas.

22. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la conversión significante de glucano y xilano a azúcares y/u oligosacáridos se logra debido a una alta relación de biomasa pretratada a enzima total .

23. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la hidrólisis enzimática de la biomasa pretratada procede a una velocidad que es al menos 1.5 veces más rápida que la biomasa que no ha sido pretratada con amoníaco líquido.

24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además reciclar el amoníaco .

25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además reutilizar el amoníaco líquido para pretratar otro lote de biomasa 1ignocelulosica.

26. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende además reciclar el solvente .

27. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende además reutilizar el solvente para pretratar otro lote de biomasa lignocelulósica .

28. El método de conformidad con la reivindicación 24 ó 26, caracterizado porque el reciclaje se realiza por lotes, o en un modo de semi-lotes o continuamente.

29. El método de conformidad con la reivindicación 25 o 27, caracterizado porque la reutilización se realiza por lotes, o en un modo de semi-lotes o continuamente.

30. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el producto es un biocombustible .

31. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la lignina y/o hemicelulosa extraída es convertida a resinas, polímeros, biocombustibles , bioquímicos, calor y/o electricidad.

32. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amoníaco líquido es combinado con acetona.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la relación de volumen: volumen de amoníaco líquido a acetona varía desde 10:90 a 99:1.