MX2012011737A - Remocion de agregado de inmunoglobulina. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a remover componentes de peso molecular alto de polipéptidos producidos recombinantemente empleando generalmente métodos cromatográficos. Se ha encontrado que el vidrio de poro controlado no derivado (uCPG) enlaza selectivamente componentes de peso molecular alto presentes en una solución. El polipéptido purificado puede recuperarse por ejemplo, del flujo que atraviesa la columna cromatográfica que contiene uCPG como material cromatográfico. Se ha encontrado que este efecto es pronunciado a un valor de pH de alrededor de 4 hasta 6 en soluciones amortiguadoras. Con apropiximadamente 100 m2 hasta 150 m2 de superficie uCPG por g de polipéptido casi se remueve el 80% hasta 95% de los compuestos de peso molecular alto con un rendimiento de 80% hasta 90% de polipéptido.

Description

REMOCION DE AGREGADO DE INMUNOGLOBULINA Campo de la Invención En la presente se describe de un método para la separación de inmunoglobulina dimérica y oligomérica de inmunoglobulina monomérica por adsorción selectiva a vidrio de poro controlado no derivado.

Antecedentes de la Invención Las proteínas y especialmente las inmunoglobulinas desempeñan una función importante en el portafolio médico de la actualidad. Los polipéptidos para su uso en aplicaciones farmacéuticas son principalmente producidos en células de mamíferos tales como células CHO, células NSO, células Sp2/0, células COS, células HEK, células BHK, células PER.C6®, y similares.

Debido a sus propiedades físicas y químicas, tales como el peso molecular y la arquitectura de dominio que incluye modificaciones secundarias, el proceso secundario de inmunoglobulinas es muy complicado. Por ejemplo, no son sólo para fármacos formulados sino también para intermediarios en las soluciones concentradas del proceso secundario (DSP, por sus siglas en inglés) que requirieron lograr volúmenes bajos para el manejo económico y el almacenamiento de aplicación. El proceso secundario de las inmunoglobulinas biotecnológicamente producidas en general comprende tres Ref . :234492 etapas cromatográficas : una primera etapa de cromatografía de afinidad usando por ejemplo Proteína A, para remover las moléculas sin inmunoglobulina, normalmente seguida por dos etapas de cromatografía de intercambio de iones, del que la última etapa es una tan llamada etapa de pulido para remover ADN contaminantes de HCP. La inmunoglobulina purificada se obtiene en solución de concentración baja que requiere de una etapa de concentración previa a formular el anticuerpo en la formulación farmacéutica. Debido a las condiciones no naturales requeridas durante el proceso secundario normalmente la inmunoglobulina monomérica tiende a formar dímeros, oligómero y agregados de orden más alto. Estos agregados no poseen la actividad de enlace al antígeno pretendida de la inmunoglobulina monomérica y tienen que removerse.

Ghose, S., et al. (Biotechnol. Bioeng. 87 (2004) 413-423) describe de la purificación de proteína preparativa sobre sílice no derivado. Reifsnyder, D.H., et al. (J. Chrom. A 753 (1996) 73-80) describe de la captura de IGF-I de un brote de fermentación cruda y una elución específica usando una combinación de etanol y NaCl . Lifsics, M.R. and Williams, R.C.Jr (Biochem. 23 (1984) 2866-2875) describe una cromatografía de tamiz molecular en urea 8 M sobre vidrio de poro controlado para separar formas monoméricas y agregadas de una proteína de neurofilamentos bovinos. Ghose, S., et al. (Abstracts of Papers, 224th ACS National Meeting, Boston, MA, Estados unidos, Agosto 18-22, 2002 (2002), BIOT-317 Publisher: American Chemical Society, Washington, D. C.) describe del uso de gel de sílice desnudo sin derivación como una fase estacionaria preparativa para el proceso de purificación de proteínas.

En la U.S. 4,606,825 se describe de un método de separación y recuperación de inmunoglobulina G usando vidrio de poro controlado que porta funciones imina polietileno enlazadas covalentemente no reticuladas. Se describe de un método de separación de un monómero polipéptido de una mezcla que comprende dímeros y/o múltimeros usando una resina de cromatografía de intercambio de iones y una elución de gradiente en E.U.A. 2002/0010319. Mizutani, T. and Mizutani, A., J. Chrom. 168 (1979) 143-150 describe la comparación de patrones de elución de proteínas cromatografiadas sobre vidrio de poro controlado y carboximetil celulosa. El aislado y purificación de la enzima mieloperoxidasa usando una cromatografía con vidrio de poro controlado carboximetilado se describe en DE 39 07 162 Al.

Breve Descripción de la Invención Se ha encontrado que las superficies del vidrio de poro controlado no derivado (uCPG, por sus siglas en inglés) enlazan selectivamente dimérico y oligomérico, es decir agregado, inmunoglobulina de clase G (IgG) presente en una solución en un valor pH de desde pH 5 a pH 7.5. Por medio de la aplicación de desde 50 m2 a 150 m2 de superficie uCPG por gramo de total IgG, hasta 95 % de los agregados solubles están enlazados a las partículas (como lo determina SE-HPLC) . Concomitantemente, sólo cerca de 10 % a 20 % del monómero es adsorbido a la superficie. Esto puede lograrse simplemente agregando a modo de lote el uCPG a la solución que comprende monómero y agregados y después de eso removiendo las uCPG con los agregados enlazados por centrifugación o filtración. La incubación de la proteína más de 6 días con uCPG no resultó en la formación de agregados. Además, no se pudieron observar cambios detectables para la estructura de la proteína secundaria o terciaria después de la incubación con uCPG.

De este modo, un aspecto como se describe en la presente es un método para obtener un polipéptido en forma monomérica o forma agregada en donde el método comprende las siguientes etapas a) proporcionar una solución que comprende el polipéptido en forma monomérica y en forma agregada, b) incubar la solución con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4 a pH 6 , y c) recuperar el polipéptido de la solución incubada y por lo tanto obtener el polipéptido en forma monomérica, o las siguientes etapas a) proporcionar una solución que comprende el polipéptido en forma monomérica y en forma agregada, b) incubar la solución con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4 a pH 6 , c) remover el vidrio de poro controlado de la solución, d) incubar el vidrio de poro controlado removido con una solución de un valor de pH de desde pH 2 a pH 3 o de desde pH 7 a pH 8 y por lo tanto obtener el polipéptido en forma agregada .

Otro aspecto como se describe en la presente es un método para producir un polipéptido que comprende a) proporcionar una célula eucariota que comprende un ácido nucleico que codifica al polipéptido, b) cultivar la célula para expresar el polipéptido, c) recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo, d) incubar una solución que comprende el polipéptido recuperado con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4 a pH 6 , y e) recuperar el polipéptido de la solución incubada y por lo tanto producir el polipéptido.

En una modalidad el vidrio de poro controlado no derivado son perlas de vidrio de poro controlado no derivado. En una modalidad adicional se E.U.A. el vidrio de poro controlado no derivado con una superficie de 100 m2 a 150 m2 por gramo de polipéptido. En otra modalidad el polipéptido es una inmunoglobulina, o un fragmento de inmunoglobulina, o un conjugado de inmunoglobulina. También en una modalidad el valor pH se ajusta por medio de una solución amortiguadora del valor pH respectivo. En una modalidad adicional el método es un método por lotes. También en una modalidad la solución comprende una cantidad discreta de polipéptido y la solución se incuba con una cantidad discreta de vidrio de poro controlado no derivado. También en una modalidad la solución es una solución amortiguadora. En una modalidad la recuperación se hace por medio de centrifugación o filtración. En una modalidad adicional la incubación es por 1 minuto a 6 horas .

En una modalidad todos los métodos pueden comprender al menos como última etapa la etapa de - purificar el polipéptido por una o más etapas de separación de cromatografía.

También un aspecto como se describe en la presente es el uso de vidrio de poro controlado no derivado para la adsorción de polipéptidos con peso molecular alto en un valor pH de desde pH 4 a pH 6.

Un aspecto adicional como se describe en la presente es un kit de partes que comprende a) perlas de vidrio de poro controlado no derivado, b) una solución amortiguadora de un valor pH de desde pH 4 a pH 6, c) una solución amortiguadora de un valor pH de desde pH 2 a pH 3, d) una solución amortiguadora de un valor pH de desde pH 7 a pH 8.

Breve Descripción de las Figuras Figura lA(a)-lB: Una comparación de las propiedades de adsorción del vidrio de poro controlado no derivado Fig. lA(a) , agarosa reticulada (Sepharose) Fig. lA(b) y poli (metacrilato) Fig.lA(C) en valores pH de 3.0, 5.0 y 7.2. Fig. IB: Adsorción de IgG a matrices CPG en pH 3 , pH 5 , pH 7.5 Porcentaje de proteina adsorbida por metro cuadrado de superficie de perlas refiriéndose a la masa de proteínas inicialmente presentada antes de la incubación; adsorción en pH 3.0 (gris claro), en pH 5.0 (gris oscuro) y en pH 7.5 (negro); los resultados se presentan como valores de medio de tres mediciones ± SD.

Figura 2: HMWs residuales por metro cuadrado CPG superficie; porcentaje de HMWs determinado con SE-HPLC en el sobrenadante refiriéndose a la cantidad de HMWs inicialmente presentada antes de la incubación con la superficie; antes de la incubación (gris claro) , incubación sin superficie de cromatografía (gris oscuro) , e incubada con superficie de cromatografía (negro) ; los resultados se presentan como como valores medios de tres medidas + SD.

Comparación de la acumulación específica de compuestos de peso molecular alto (HMW) sobre vidrio de poro controlado no derivado dependiendo del valor pH y del compuesto de solución amortiguadora.

Adsorción de monómero IgG (plano) y HMWs (negro) sobre CPG; 20 mg IgG que contiene 6.8 % HMWs se presentaron inicialmente antes de la incubación con 0.1-10 m2 CPG; los datos experimentales se presentaron como valores medios de tres medidas ± SD. cromatogramas SE de las soluciones IgG después de la incubación con hasta 350 m2 de área de superficie de CPG por gramo de proteína; 20 mg IgG que contiene 6.8 % HMWs inicialmente se presentaron antes de la incubación con CPG (perfil negro) ; disminuyendo UV-señal incrementado la superficie CPG se indica cambiando el color de negro a gris claro.

Las isotermas de adsorción y desorción de IgG sobre partículas CPG; los estudios de adsorción (diamantes negros) se hicieron en pH 5.0, desorción (diamantes planos) en pH 3.0; los resultados se presentan como valores medios de tres medidas ± SD.

Figura 7 Adsorción de IgG sobre partículas CPG en diferentes pHs; los experimentos se llevaron a cabo en el régimen de saturación en una concentración de proteína soluble en 2 mg/ml o más alto; los resultados se presentan como valores medios de tres medidas ± SD.

Figura 8 Las curvas de valoración potencial zeta de IgG (negro) y las partículas CPG de tamaño nano (gris) ; los datos experimentales se presentaron como valores medios de tres medidas ± SD.

Descripción Detallada de la Invención Generalmente, para la separación de inmunoglobulina monomérica de inmunoglobulina agregada así como también otros compuestos de peso molecular alto se emplean comúnmente métodos de cromatografía. Ahora se ha encontrado que el vidrio de poro controlado no derivado (uCPG) enlaza selectivamente inmunoglobulinas diméricas y oligoméricas y compuestos de peso molecular amplio presentes en solución por ejemplo comparado a Sepharose™ no derivado. La inmunoglobulina monomérica puede recuperarse por ejemplo del flujo a través de la columna de cromatografía uCPG como un material de cromatografía o del sobrenadante de una incubación de una solución con uCPG. Este efecto es pronunciado en un valor pH de cerca de 5.0 en soluciones amortiguadoras. Con aproximadamente 50 m2 a 150 m2 uCPG superficie por g de inmunoglobulina hasta 95 % de la forma agregada puede removerse con una producción de 80 % a 90 % de inmunoglobulina monomérica.

La aplicación de uCPG puede usarse para remover dímeros y oligómeros de volúmenes de ingrediente farmacéuticamente activo o material formulado final previo o incluso después del almacenamiento.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unido por enlaces péptidos, ya sea producido naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos que cerca de 20 residuos de aminoácidos se refieren como "péptidos". Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptido o al menos una cadena de polipéptido de más que 100 residuos de aminoácidos. Un polipéptido también puede comprender componentes no péptidos, tales como grupos carbohidrato. Los grupos carbohidrato y otros sustituyentes no peptídicos pueden agregarse a un polipéptido por la célula en la que el polipéptido se produce, y variará con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en la presente en términos de sus estructuras de columna vertebral de aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos carbohidrato generalmente no son especificados, pero sin embargo pueden estar presentes.

El término " inmunoglobulina" se refiere a una proteína que comprende uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante diferentes así como también los genes de región variable de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab, y F(ab)2 así como también cadenas sencillas (scFv) o diacuerpos .

El término "inmunoglobulina completa" denota una inmunoglobulina que comprende dos polipéptidos de cadena de inmunoglobulina ligera (cadenas ligeras) y dos polipéptidos de cadena de inmunoglobulina pesada (cadenas pesadas) . Cada uno de los polipéptidos de inmunoglobulina de cadenas pesada y ligera contiene un dominio variable (región variable, generalmente la porción amino terminal) que comprende las regiones de enlace que son capaces de interactuar con un antígeno. Cada uno de los polipéptidos de cadena de inmunoglobulina ligera y pesada comprende una región constante (generalmente la porción terminal carboxilo) . El dominio variable de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina en turno comprende diferentes segmentos, es decir cuatro regiones de marco de trabajo (FR, por sus siglas en inglés) y tres regiones hipervariables (CDR, por sus siglas en inglés) .

El término "fragmento de inmunoglobulina" denota un polipéptido que comprende al menos un dominio seleccionado del dominio variable (VR) , el dominio CRI, la región de bisagra, el dominio CR2, el dominio CR3, o el dominio CR de una cadena pesada, o el dominio variable (VL) o el dominio CL de una cadena ligera. También adjuntos están los derivados y variantes de la misma. Por ejemplo, un dominio variable, en el que uno o más aminoácidos o regiones de aminoácidos se eliminan, puede estar presente.

El término "conjugado de inmunoglobulina" denota un polipéptido que comprende al menos un dominio de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina conjugada por medio de un enlace de péptido a un polipéptido adicional. El polipéptido adicional puede ser un péptido no de inmunoglobulina, tal como una hormona, o toxina, o receptor de crecimiento, o péptido antifusogénico, o factor de complemento, o similar.

Para la purificación de inmunoglobulinas producidas recombinantemente puede emplearse una combinación de etapas de cromatografía de columnas diferente. Generalmente una cromatografía de afinidad de proteína A es seguida por una o más etapas de separación adicionales. La etapa de purificación final es la llamada "etapa de pulido" para la remoción de las impurezas residuales y contaminantes como inmunoglobulinas agregadas, la HCP residual (proteína de célula hospedadora) , ADN (ácido nucleico de célula hospedadora) , virus, o endotoxinas . Para esta etapa de pulido puede usarse un material de intercambio de anión en modo a través del flujo.

Pueden usarse diferentes métodos para la recuperación y purificación de proteína, tal como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio de iones (por ejemplo intercambio de catión (resinas carboximetilo) , intercambio de anión (resinas etil amino) e intercambio de modo de mezcla) , adsorción triofílica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH) , interacción hidrofóbica o cromatografía de adsorción aromática (por ejemplo con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofilica, o ácido m-aminofenilboronica) , cromatografía de afinidad de quelación de metal (por ejemplo con Ni (II)- y Cu (II) -material de afinidad), cromatografía de exclusión de tamaño, y métodos electroforéticos (tales como electroforesis de gel, electroforesis capilar) .

Los términos " inmunoglobulina en forma monomérica" e " inmunoglobulina monomérica", que pueden usarse intercambiablemente, así como también equivalentes gramaticales de los mismos denotan una molécula de inmunoglobulina que no está asociada con una segunda molécula de inmunoglobulina, es decir que no está covalentemente ni no covalentemente enlazada a otra molécula de inmunoglobulina. Los términos "inmunoglobulina en forma agregada" e "inmunoglobulina agregada", que pueden usarse intercambiablemente e "inmunoglobulina dimérica" e "inmunoglobulina multimérica" así como también los equivalentes gramaticales de los mismos todos denotan una molécula de inmunoglobulina que está asociada, ya sea covalentemente o no covalentemente, con la menos una molécula de inmunoglobulina adicional, y que se eluye en un pico sencillo desde una columna de cromatografía de exclusión de tamaño. El término "en forma monomérica" y los equivalentes gramaticales del mismo como se usan en esta solicitud no necesariamente denotan que 100 % de una molécula de inmunoglobulina está presente en forma monomérica. Denota que una inmunoglobulina está esencialmente en forma monomérica, es decir al menos 90 % de la inmunoglobulina está en forma monomérica, en una modalidad al menos 95 % de la inmunoglobulina está en forma monomérica, en otra modalidad al menos 98 % de la inmunoglobulina está en forma monomérica, en una modalidad adicional al menos 99 % de la inmunoglobulina está en forma monomérica, y en una modalidad final más que 99 % de la inmunoglobulina está en forma monomérica determinada como área pico de una cromatografía de exclusión de tamaño. El término "en monomérica y en forma agregada" denota una mezcla de moléculas de inmunoglobulina no asociadas con otras moléculas de inmunoglobulina y de moléculas de inmunoglobulina asociadas con otras moléculas de inmunoglobulina. En esta mezcla ni la forma monomérica ni la forma agregada está presente exclusivamente. El término "forma de peso molecular alto (H , por sus siglas en inglés) " denota inmunoglobulina polimérica, es decir agregada, donde dicho agregado sigue siendo soluble en solución amortiguada acuosa.

El término "100 %" como se usa en esta solicitud denota que la cantidad de componentes diferente al componente especificado está debajo del límite de detección del referido al método analítico bajo las condiciones específicas.

Los términos "90 %" , "95 %", "98 %", "99 %" como se usan en esta solicitud denotan valores no exactos pero si valores dentro de la exactitud de lo referido al método analítico bajo las condiciones específicas.

Un material de cromatografía comprende un material de núcleo y adjunto al mismo grupos funcionales cromatográficos . El material de núcleo puede ser un material inorgánico, tal como sílice, zeolito, hidroxiapatita, o vidrio, un material orgánico, tal como celulosa, o agarosa, o un material polimérico sintético, tal como poli (metacrilato) .

Las soluciones empleadas en el método como se describe en la presente están en una modalidad de soluciones amortiguadoras. El término "solución amortiguadora" denota una solución en la que los cambios de pH debido a la adición de o liberación de sustancias acidas o alcalinas es nivelada por la sustancia amortiguadora disuelta. Cualquier sustancia amortiguadora con tales propiedades puede usarse. Generalmente se usan las sustancias amortiguadoras farmacéuticamente aceptables . En una modalidad la solución amortiguadora se selecciona de una solución amortiguadora de fosfato que consiste de ácido fosfórico y/o sales del mismo, o una solución amortiguadora de acetato que consiste de ácido acético y/o sales del mismo, o una solución amortiguadora de citrato que consiste de ácido cítrico y/o sales del mismo, o una solución amortiguadora de morfolina, o una solución amortiguadora 2- (N-morfolino) etansulfónica, o una solución amortiguadora de histidina, o una solución amortiguadora de glicina, o una solución amortiguadora de tris (hidroximetil) aminoetano (TRIS) . En otra modalidad la solución amortiguadora se selecciona de una solución amortiguadora de fosfato, o una solución amortiguadora de acetato, o una solución amortiguadora de citrato, o una solución amortiguadora de histidina. Opcionalmente la solución amortiguadora puede comprender una sal adicional, tal como por ejemplo cloruro de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, citrato de sodio, o citrato de potasio .

Los materiales de núcleo de cromatografía no derivados, especialmente el vidrio de poro controlado no derivado, puede usarse para adsorber selectivamente los polipéptidos , especialmente inmunoglobulinas en forma agregada, es decir moléculas de inmunoglobulina diméricas y oligoméricas .

Generalmente, las perlas CPG tienen un diámetro de partícula medio de cerca de 125 im. El área de superficie específica de las perlas CPG de la presente se determinó que es de 36 m2/g.

En la Figura 1A se mostraron las propiedades de adsorción de vidrio de poro controlado no derivado, agarosa reticulada (Sepharose™) y poli (metacrilato) . Puede verse que los polipéptidos pueden enlazar a vidrio de poro controlado no derivado por una parte y por otra puede verse una dependencia fuerte de pH de la capacidad de enlace. Como puede verse en la Figura IB el medio ultra ProSep vA muestra la adsorción más alta de IgG en pH 7.5. ProSep vA ultra es un material CPG funcionalizado en el que un ligando de afinidad de Proteína A se acopla a la superficie de vidrio. En un pH de 5.0 de adsorción de IgG a CPG se observó que era más alto que el gel de Proteína A funcionalizado .

Después de la incubación de IgG con uCPG en diferentes valores de pH 3.0, 5.0 y 7.5 el sobrenadante fue analizado por SE-HPLC. Se observó que después de la incubación con perlas CPG no derivadas en pH 5.0 y 7.5, la solución estuvo casi limpia por completo de agregados solubles (Figura 2) .

La Figura 6 muestra la cantidad de IgG adsorbida a uCPG después de 12 horas de incubación en un valor pH de pH 5.0 contra la concentración de proteína en el sobrenadante. Puede alcanzarse la saturación en concentraciones de proteína relativamente bajas y la adsorción máxima en 2.0 mg IgG por metro cuadrado de CPG. La desorción cuantitativa puede afectarse cuando la proteína cargada CPG se incuba en una solución amortiguadora en un valor pH de pH 3.0. La adsorción de proteína a superficies de sílice en general se describe es reversible bajo condiciones definidas. Los solventes químicos ásperos como cloroformo, metanol, o 2-propanol pueden usarse (ver por ejemplo Manning, J.N. , et al, Journal of Chromatography B 487 (1989) 41-50; Stankovic, C.J., et al, Anal. Biochem. 184 (1990) 100-103). Además pueden usarse las sales caotrópicas (ver por ejemplo Mees, I., et al, Arch. Virol. 81 (1984) 303-311) además de cambiar el valor de pH (ver por ejemplo Edy, V.G., et al, J. Gen. Virol. 33 (1976) 517-521) .

La adsorción máxima puede observarse en pH 5.0 (Figura 7) . Una disminución en la adsorción IgG puede observarse cuando el pH se alza arriba del punto isoeléctrico (IP, por sus siglas en inglés) del IgG (por ejemplo el IP se determinó es de 8.0 usando medidas potenciales zeta para el IgG mostrado en la Figura 8) . El potencial zeta del IgG puede determinarse dependiendo de una valoración del valor de pH.

La carga de superficie del CPG de tamaño nano también depende del valor de pH. El IP del CPG puede determinarse ser de cerca de 4. En un valor pH arriba pH 4 de la carga de la superficie de los cambios CPG de positivo a negativo.

Por ejemplo, una solución que contiene 6.8 % de HMWs se incubó con diferentes áreas de superficie uCPG de 0.1 m2 a 10 m2 en un valor pH de cerca de 5. El porcentaje residual de HMWs (componentes de peso molecular alto) en solución se determinó en el sobrenadante usando SE-HPLC. En la Figura 4 se muestra la cantidad de monómero y HMWs en porcentaje adsorbido al área de la superficie CPG por gramo de proteína, que inicialmente estuvo presente antes de la incubación. Cuando se emplean 50 m2 CPG superficie por gramo de IgG, 63 % de los HMWs inicialmente presentes en la solución pueden adsorberse. Nueve por ciento del monómero inicialmente presente en la solución está enlazado a las partículas. Con el fin de aplicar cerca de 140 m2 CPG superficie por gramo de proteína, cerca de 95 % de HMWs pueden enlazarse, mientras que sólo el 22 % de monómero es adsorbido. En cerca de 250 m2 CPG superficie por gramo de proteína casi 100 % de los HMWs puede adsorberse sobre la superficie CPG (ver Figura 5) . Entre 50 m2 y 150 m2 CPG superficie por gramo de proteína, los oligómeros pueden removerse casi por completo. El área de superficie CPG presente durante la incubación no tiene efecto sobre la cantidad de (LMWs, por sus siglas en inglés) (compuestos de peso molecular bajo) restante en la solución.

De este modo, los agregados solubles de inmunoglobulinas pueden adsorberse a CPG no derivados. El área de superficie de CPG disponible por gramo de proteína puede usarse para controlar la cantidad de agregado y especies monoméricas restantes en la solución después de la incubación. Un área de superficie entre 100 m2 a 150 m2 por gramo de proteína puede usarse para remover 60 % a 95 % de agregados solubles de una solución IgG en un valor pH de cerca de 5, teniendo concomítantemente de 80 ¾ a 90 I IgG monomérico restante en la solución.

La conformación de la proteína se investigó antes, durante y después de la adsorción a la superficie. No puede observarse pérdida de proteína debido a la formación de agregados durante los seis días de incubación. El nivel de HMWs determinado por SE-HPLC disminuyó incrementando el área de superficie CPG. Después de una incubación de un día no puede detectarse una disminución adicional en el nivel de agregados solubles si la incubación se prolonga por 5 días. No puede determinarse un incremento de HMWs en el sobrenadante. En una modalidad la incubación es por 1 min. a 24 horas . En una modalidad adicional la incubación es por 1 min. a 6 horas.

La exposición de IgG a uCPG no resultó en alteraciones conformacionales de la estructura secundaria como se determinó con espectroscopia FT-IR.

Un aspecto como se describe en la presente es un método para obtener un polipéptido que comprende la etapa de -incubar al polipéptido con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4 a pH 6.

En una modalidad el vidrio de poro controlado no derivado se usa en un valor pH de desde pH 4.5 a pH 5.5. En otra modalidad el uCPG se usa en un valor pH de cerca de pH 5. En otra modalidad la incubación está en una solución amortiguadora .

El término "cerca de" denota que el valor que sigue no es un valor exacto pero es el punto central de un intervalo que está en una modalidad +/- 10 % del valor, o en otra modalidad +/- 5 % del valor, o en una modalidad adicional +/-2 % del valor, o en una modalidad +/- 1 % del valor. Si el valor es un valor relativo dado en porcentajes el término "cerca de" también denota que el valor que sigue no es un valor exacto pero es el punto central de un intervalo que está en una modalidad +/- 10 % del valor, o en otra modalidad +/- 5 % del valor, o en una modalidad adicional +/- 2 % del valor, o en una modalidad +/- 1 % del valor, por la que el límite superior del intervalo no puede exceder un valor de 100 %.

En una modalidad el método para obtener un polipéptido, especialmente una inmunoglobulina, en forma monomérica comprende las siguientes etapas a) incubar una solución que comprende el polipéptido en forma monomérica y en forma agregada con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4 a pH 6, b) recuperar el sobrenadante y por lo tanto obtener el polipéptido en forma monomérica del sobrenadante de la etapa a) .

En otra modalidad el método para obtener un polipéptido, especialmente una inmunoglobulina, en forma agregada comprende las siguientes etapas a) incubar una solución que comprende el polipéptido en forma monomérica y en forma agregada con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4 a pH 6, b) recuperar el vidrio de poro controlado no derivado incubado, c) recuperar el polipéptido en forma agregada del vidrio de poro controlado no derivado por incubación con una solución con un valor pH diferente por al menos dos unidades pH del valor pH de la solución de la etapa a) .

En una modalidad la incubación se hace agregando una cantidad definida de vidrio de poro controlado no derivado a la solución que comprende al polipéptido. También en una modalidad la incubación se hace aplicando la solución a una columna de cromatografía que comprende el vidrio de poro controlado no derivado. En la primera modalidad el polipéptido se recupera del sobrenadante de la incubación. En la segunda modalidad el polipéptido se recupera de a través del flujo de la columna. La recuperación de los componentes de peso molecular alto se hace en ambas modalidades aplicando una solución con un valor pH diferente por al menos dos unidades pH del valor pH de la solución de incubación al vidrio de poro controlado. En una modalidad el primer método es un método de lote.

En una modalidad el método comprende las siguientes etapas purificar una solución que comprende la inmunoglobulina con una cromatografía de afinidad de Proteína A, - opcionalmente purificar la inmunoglobulina con una cromatografía de intercambio de ion, - incubar la inmunoglobulina obtenida que comprende la solución con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4 a pH 6, recuperado el sobrenadante de la etapa previa y por lo tanto obteniendo la inmunoglobulina en forma monomérica.

Otro aspecto como se describe en la presente es un método para producir un polipéptido, especialmente una inraunoglobulina, en forma monomérica que comprende a) cultivar una célula que comprende un ácido nucleico que codifica al polipéptido, b) recuperar el polipéptido de la célula o medio de cultivo, c) incubar el polipéptido con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4 a pH 6 , d) recuperar el sobrenadante de la etapa c) y por lo tanto producir el polipéptido en forma monomérica.

En una modalidad la incubación con el vidrio de poro controlado no derivado es por 1 min. a 120 min.

En la Figura 3 se muestra la acumulación de compuestos de peso molecular alto (HM , por sus siglas en inglés) sobre vidrio de poro controlado no derivado dependiendo del valor de pH y del compuesto de solución amortiguadora. Puede verse que el vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de aproximadamente pH 5 adsorbe los compuestos de peso molecular alto de una solución de inmunoglobulina independiente de la sustancia de solución amortiguadora. En una modalidad la sustancia de solución amortiguadora se selecciona de ácido acético o una sal del mismo, tal como sodio o acetato de potasio, y ácido cítrico o sal del mismo, tal como sodio o citrato de potasio.

En la Figura 4 la adsorción de compuestos de peso molecular alto (HMW) sobre vidrio de poro controlado no derivado se compara con la adsorción de inmunoglobulina monomérica. Puede verse que la cantidad adsorbida de los compuestos HMW muestra una dependencia exponencial sobre el área de superficie del vidrio de poro controlado por masa de polipéptido aplicado. La cantidad adsorbida de inmunoglobulina monomérica muestra una dependencia lineal sobre la superficie de vidrio de poro controlado por masa de polipéptido aplicado.

En la Figura 5 se muestra un cromatograma de exclusión de tamaño de soluciones tratadas diferentemente. Puede verse que por ejemplo el uso de 140 m2 CPG superficie por gramo de polipéptido resulta en una reducción de compuestos de peso molecular alto.

En la Figura 6 se muestra de la cubierta de la superficie de vidrio de poro controlado no derivado. Puede verse que la cubierta de la superficie alcanzó 2 mg/m2 superficie de vidrio de poro controlado no derivado. La adsorción es reversible cambiando el valor pH. En una modalidad los compuestos de peso molecular alto adsorbidos se recubren de vidrio de poro controlado no derivado cambiando el valor pH de pH 5 a un valor diferente por al menos dos unidades pH, en una modalidad para pH 3.0 o para pH 7.0. Por espectroscopia UV o IR de 2do derivado puede mostrarse que la adsorción no afecta la estructura secundaria o terciaria.

Debido a la adsorción selectiva de compuestos de peso molecular alto de preparaciones de inmunoglobulina el uso de vidrio de poro controlado no derivado puede ser idóneo para la purificación de ingredientes farmacéuticamente activos al final del proceso secundario para remover la inmunoglobulina restante en forma agregada. El valor pH operativo de pH 5 a pH 6 corresponde al valor pH de ingredientes farmacéuticamente activos a granel . Con el vidrio de poro controlado no derivado es posible remover las formas de inmunoglobulina oligoméricas e incluso diméricas que de otro modo es difícil en etapas tardías en el proceso secundario.

Adicionalmente un manejo en el modo por lotes puede hacerse simplemente incubando perlas de vidrio de poro controlado no derivado con la solución de proteína a granel y removiendo los agregados con la remoción de CPG por ejemplo por centrifugación o filtración.

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, el verdadero enfoque el cual se establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden hacerse modificaciones en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención .

Ejemplo 1 Materiales y métodos Anticuerpo Un granel purificado por completo de Fe (IgGl) humano quimérico/anticuerpo Fab de rata en solución amortiguadora de histidina pH 6.0 (IgG A) se tomó para los experimentos. Los alícuotas se dializaron en 100 mM solución amortiguadora de acetato pH 3.0, 100 mM solución amortiguadora de acetato pH 5.0 y 200 mM solución amortiguadora tris (hidroximetil) -aminometano pH 7.5. Estas soluciones se filtraron después usando un filtro Sterivex-GV 0.22 µp? (Millipore, Billerica, E.U.A. ) .

CPG Se usaron perlas de vidrio de poro controlado (CPG 700) de Millipore (Billerica, E.U.A.) .

Químicos Todos los otros químicos y reactivos usados fueron al menos grado analítico. El ácido se tomó de Fluka (Steinheim, Alemania) , ácido cítrico, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio y cloruro de sodio se tomaron de Merck KG (Darmstadt, Alemania) , tris (hidroximetil) -aminometan se tomó de Angus (Ibbenbueren, Alemania) . L-histidina de Ajinomoto (Raleigh, E.U.A. ) se usó.

Adsorción a las superficies La adsorción del anticuerpo monoclonal (mAb) a la superficie CPG se investigó en diferentes pHs incubando una superficie definida con una masa de proteína definida. Por lo tanto, la mezcla espesa de perla se suspendió y se mezcló con agua purificada (Milli-Q, Millipore, Billerica, E.U.A.). Las perlas se recolectaron por filtración de vacío (0.22 µp? discos de filtración celulosa, Sartorius, Goettingen, Alemania) y después se enjuagaron con agua purificada (Milli-Q, Millipore, Billerica, E.U.A.). Subsecuentemente, las perlas se secaron en 40 °C y se pesó una masa definida representando una superficie definida como lo determina la adsorción de gas (BET) . Después, las perlas se mezclaron con la solución de proteína en un pH definido y se incubaron sin espacio de domo sobre el mezclador rotatorio RM5 (Froebel, Lindau, Alemania) en 35 rpm por 12 horas a temperatura ambiente. Entonces las mezclas se centrifugaron por 10 min. en 10,000 x g para separar las perlas de la solución de proteína. La determinación de concentración de proteína y análisis SE-HPLC se realizaron con el sobrenadante de las muestras centrifugadas. Se prepararon las muestras por triplicado y los resultados se presentan como valores medios ± SD.

Los isotermas de adsorción de mAb sobre superficies de perlas diferentes se determinaron preparando mezclas que contienen 5 m2 de superficie de perlas y varias concentraciones de mAb entre 0.2 mg/ml y 6.0 mg/ml. Las muestras se incubaron más de 12 horas como se describió antes y se centrifugaron por 10 min. en 10,000 x g para separar las perlas de la solución de proteína y para determinar la concentración de proteína en el sobrenadante. La cantidad de proteína adsorbida se determinó sustrayendo la cantidad de la proteína determinada en el sobrenadante de la cantidad de proteína inicialmente presentada antes de la incubación. Se prepararon las muestras por triplicado y los resultados se presentan como valores de medio ± SD.

Con la finalidad de observar la adsorción preferencial de HMWs sobre superficies CPG el IgG en 100 mM solución amortiguadora de acetato pH 5 que contiene 6.8 % HMWs se incubó con 0.1-10 m2 superficie CPG. Las muestras se incubaron por 12 horas como se describió antes y se centrifugaron por 10 min. en 10,000 x g para separar las perlas de la solución de proteína y para determinar la concentración de proteína en el sobrenadante. Además, el sobrenadante fue analizado por SE-HPLC. La cantidad de HMWs adsorbidos y monómero respectivamente se determinó sustrayendo la cantidad de HMWs determinada en el sobrenadante de la cantidad de HMWs inicialmente presentes antes de la incubación. Se prepararon las muestras por triplicado y los resultados se presentan como valores medios ± SD.

Determinación de la concentración de proteína La concentración de proteína se determinó usando la absorbancia fotométrica en 280 nm y 320 nm después de la substracción en blanco de la solución amortiguadora (espectrofotómetro UV-Vis Evolution 500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, E.U.A.). La absorbancia en 320 nm se sustrajo de la absorbancia en 280 nm y este valor de absorbancia se usó para calcular el contenido de proteína de acuerdo a la ley de Lambert-Beer .

SE-HPLC Los experimentos de la cromatografía líquida de presión alta de exclusión de tamaño (SE-HPLC, por sus siglas en inglés) se condujeron con una columna TSK 3000 SWXL (Tosoh Bioseparation, Stuttgart, Alemania) sobre un sistema Summit HPLC (Dionex, Idstein, Alemania) . Los picos de elución se monitorearon en 280 nm por el detector de configuración de diodo UV UVD170U de Dionex (Idstein, Alemania) . La cromatografía isocrática se condujo en temperatura ambiente usando una solución amortiguadora acuosa compuesta de 200 mM fosfato de potasio y 250 mM de cloruro de potasio en pH 7.0 y una tasa de flujo de 0.5 ml/min. Cda mezcla contuvo 100 g mAb de carga por inyección. Los cromatogramas se integraron manualmente usando el software Chromeleon (Dionex, Idstein, Alemania) . El porcentaje de especies de peso molecular más alto (HMWs) incluyendo dímeros y oligómeros solubles más grandes se determinó como área relativa (mAU*min) referida al área total incluyendo el pico monómero y el pico de especies de peso molecular más bajo (LMWs) .

Espectroscopia FT-IR Los espectros FT-IR se grabaron con el Tensor 27 (Bruker Optics, Ettlingen, Alemania) aplicando la célula de reflejo total atenuado MIRacle (ATR) con un cristal de Germanio para investigar la estructura secundaria de la protelna sobre la superficie de perlas. Las perlas CPG se incubaron a temperatura ambiente por 12 horas con una solución 6 mg/ml de IgG en solución amortiguadora de acetato en H 5.0. Las soluciones mostraron un nivel de 1.5 % HMWs determinado por SE-HPLC antes de la incubación. La incubación se condujo en modo de saturación. Después de la incubación las perlas se lavaron con solución amortiguadora. La célula de transmisión AquaSpec se usó para investigar la estructura de la proteína secundaria después de la desorción de las perlas usando una solución amortiguadora tris 200 mM pH 9.0. Para cada espectro que fue grabado de 850-4000 cm"1 a interferograma de barrido 120 se recolectó en un modo de adquisición de doble lado con una resolución de 4 cm"1. El espectro de referencia de solución amortiguadora y perlas húmedas respectivamente se sustrajo para obtener el espectro de proteína. Los espectros fueron editados por una normalización vector seguido por la generación del segundo derivado y suavizado usando la función de suavizado Savitsky-Golay de 13 puntos aplicando el software OPUS 6.0 (Bruker Optics, Ettlingen, Alemania). Además, los espectros de absorción registrados en modo ATR se corrigieron en lo que se refiere a la intensidad de banda y la posición de banda para permitir la comparación con los espectros grabados en modo de transición. Por lo tanto, se usó la corrección ATR extendida del software OPUS 6.0 (Bruker Optics, Ettlingen, Alemania) de acuerdo a Fringeli (Fringeli, U.P., Chimia 46 (1992) 200-214) para convertir el número de ondas dependiente de la dispersión anómala (Goldberg, M.E., and Chaffotte, A.F., Proteína Sci . 14 (2005) 2781-2792; Grdadolnik, J. , Int. J. Vibr. Spec . 6, ed. 2 (2002).

Medidas potenciales zeta Con el fin de determinar la carga de la proteína y el CPG de tamaño nano sonicado 700 en diferentes valores pH, se determinó la movilidad electroforética de la proteína y de las perlas CPG 700 se determinó realizando la velocimetría Laser-Doppler usando el Malvern Zetasizer Nano S (Malvern Instruments, orcestershire , Reino Unido) . El potencial zeta ? se calculó de la ecuación de Henry con la suposición de distribución de carga uniforme usando el software Malvern DTS (Versión 5.0, Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) . Para preparación de muestra 5 mg/ml mAb de solución se dializaron en 50 mM solución amortiguadora de acetato pH 5.0 and y se valoraron a un pH de 2.0 posteriormente usando ácido clorhídrico 0.2 M. Las perlas CPG 700 se suspendieron en el mismo sistema de solución amortiguadora y el pH se ajustó a 2.0. Las muestras se valoraron con 0.2 M con solución de hidróxido de sodio desde pH 2 a pH 12 aplicando el valorador MPT2 (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) . El potencial zeta se determinó en 15 etapas entre pH 2 y 12 en una célula capilar plegada con temperatura controlada (Malvern Instruments, Worcestershire , Reino Unido) en 25 °C. Cada medición se repitió tres veces y se describeron los valores medios + SD.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para obtener una inmunoglobulina en forma monomérica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas a) incubar una solución que comprende la inmunoglobulina en forma monomérica y en forma agregada con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH desde pH 4.5 a pH 5.5, en donde la incubación se hace aplicando la solución a una columna de cromatografía que comprende el vidrio de poro controlado no derivado, y b) recuperar el flujo que atraviesa y por lo tanto obtener la inmunoglobulina en forma monomérica.

2. Un método para producir una inmunoglobulina, caracterizado porque comprende a) cultivar una célula eucariota que comprende un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina, b) recuperar la inmunoglobulina de la célula o el medio de cultivo, c) incubar una solución que comprende la inmunoglobulina recuperada con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4.5 a pH 5.5, y d) recuperar el sobrenadante y por lo tanto producir la inmunoglobulina, en donde la incubación se hace aplicando la solución a una columna de cromatografía que comprende el vidrio de poro controlado no derivado, y en donde la recuperación es el flujo que atraviesa la columna .

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el vidrio de poro controlado no derivado son perlas de vidrio de poro controlado no derivado.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se usa el vidrio de poro controlado no derivado con una superficie de 100m2 a 150 m2 por gramo de polipéptido.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la solución es una solución amortiguadora del valor pH respectivo.

6. El método de conformidad con la reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende como última etapa la etapa de - purificar la inmunoglobulina por una o más etapas de separación cromatográfica.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la incubación es de 1 minuto a 6 horas.

8. El uso de vidrio de gas de poro controlado no derivado para la adsorción de inmunoglobulina de peso molecular alto en un valor pH de desde pH 4.5 a pH 5.5.

9. Un kit, caracterizado porque comprende a) perlas de vidrio de poro controlado no derivado b) una solución amortiguadora de un valor pH de desde pH 4.5 a pH 5.5, c) una solución amortiguadora de un valor pH de desde pH 2 a pH 3, d) una solución amortiguadora de un valor pH de desde pH 7 a pH 8.

10. Un método para obtener una inmunoglobulina en forma agregada, caracterizado porque comprende las siguientes etapas a) incubar una solución que comprende la inmunoglobulina en forma monomérica y en forma agregada con vidrio de poro controlado no derivado en un valor pH de desde pH 4.5 a pH 5.5, en donde la incubación se hace aplicando la solución a una columna de cromatografía que comprende el vidrio de poro controlado no derivado b) incubar el vidrio de poro controlado no derivado con una segunda solución de valor pH de desde pH 2 a pH 3 o de desde pH 7 a pH 8 y por lo tanto obtener la inmunoglobulina en forma agregada.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el vidrio de poro controlado no derivado son perlas de vidrio de poro controlado no derivado.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, caracterizado porque se usa el vidrio de poro controlado no derivado con una superficie de 100m2 a 150m2 por gramo de polipéptido.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque la solución es una solución amortiguadora del valor pH respectivo.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque comprende como última etapa la etapa de - purificar la inmunoglobulina por medio de una o más etapas de separación cromatográfica.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la incubación es de 1 minuto a 6 horas.