MX2012011649A - Ensayo para detectar derivados de clorofila libres de fitol. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para detectar un derivado de clorofila libre de fitol en una muestra; el método comprende una etapa de detección de una señal fluorescente asociada con el derivado de clorofila libre de fitol, en donde se extingue una señal fluorescente asociada con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol en la muestra. El método podría usarse para cuantificar la actividad de clorofilasas y las enzimas relacionadas en una muestra sin fraccionamiento con solventes de sustrato y producto.

Description

ENSAYO PARA DETECTAR DERIVADOS DE CLOROFILA LIBRES DE FITOL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para detectar derivados de clorofila en una muestra. El método es útil en un ensayo para determinar la actividad de la clorifilasa o enzimas relacionadas en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La clorofila es un pigmento de color verde que se encuentra ampliamente en el reino vegetal. La clorofila es esencial para la fotosíntesis y es uno de los compuestos metálicos orgánicos más abundantes de la tierra. Así, muchos productos derivados de plantas, que incluyen alimentos y piensos, contienen cantidades significativas de clorofila.

En las plantas, se cree que la clorofilasa (clasa) está involucrada en la degradación de la clorofila y que cataliza la hidrólisis de un enlace éster en la clorofila para proporcionar clorofilasa y fitol. La clorofila puede degradarse, alternativamente, por la pérdida del ión de magnesio del anillo de porfirina (clorina) para formar el derivado conocido como feofitina (véase la Figura 5) . Bajo ciertas condiciones, algunas clorofilasas son capaces, además, de hidrolizar feofitina para proporcionar feofórbido y fitol. El feofórbido puede producirse, además, por la pérdida de un ión de magnesio de clorofílido, es decir, REF: 234318 después de la hidrólisis de clorofila (véase la Figura 5) .

La feofitina podría degradarse más aún en pirofeofitina. Un mecanismo posible es la hidrólisis enzimática del enlace de metil éster del anillo isocíclico de feofitina seguido por la conversión no enzimática del producto intermedio inestable en pirofeofitina. Una enzima de 28-29 kDa de Chenopodium álbum denominada feoforbidasa es capaz, según se informa, de catalizar una reacción análoga en feofórbido para producir un derivado libre de fitol de pirofeofitina conocido como pirofeofórbido (véase la Figura 5) . La pirofeofitina podría ser hidrolizada, además, por ciertas enzimas para formar pirofeofórbido y fitol.

Se han desarrollado varios ensayos a fin de determinar la actividad de la clorofilasa en una muestra (véase, por ejemplo, Khamessan et al. (1994) , Journal of Chemical Technology & Biotechnology, vol . 60 (1), páginas 73-81). El método usado más ampliamente para la determinación de la actividad de la clorofilasa se describe en Klein y Vishniac, J. Biol. Chem. 1961 236: 2544-2547. Este método incluye determinar la actividad enzimática en un sistema regulador acuoso que contiene acetona. La acetona se adiciona para asegurar la solubilidad del sustrato (clorofila) . Después de que se llevó a cabo la reacción enzimática, el sustrato residual se extrae en hexano. El producto de reacción clorofílido es más hidrofílico que la clorofila debido a la pérdida de la cadena de fitol. Así, el clorofílido permanece en la fase de agua/acetona y puede cuantificarse por medición con un espectrofotómetro . Aunque se han descrito varias modificaciones de este método, todos los métodos publicados incluyen una etapa de fraccionamiento con hexano de los productos de reacción. Esta etapa es necesaria porque resulta difícil distinguir entre clorofila y clorofílido mediante el uso de técnicas espectroscópicas . Después de la extracción con hexano, el sustrato y el producto de reacción se encuentran en fases diferentes y, así, puede usarse la medición de cada uno para determinar la actividad enzimática.

Sin embargo, el fraccionamiento con hexano es inconveniente, trabajoso y no se adapta bien para usarse en un método de exploración de alta productividad (HTS, por sus siglas en inglés) en busca de actividad de clorofilasa. Se informó un intento de superar los problemas con la extracción con hexano en HTS de clorofilasa en Analytical Biochemistry 353 (2006) 93-98 de Arkus et al. En vez de usar clorofila como sustrato, este ensayo emplea éster de p-nitrofenilo como un sustrato artificial en HTS de clorofilasa. Desafortunadamente, este método no es muy confiable porque algunas clorofilasas tienen una actividad algo inferior en éster de p-nitrofenilo, en vez de tener actividad alta en clorofila, lo cual podría dar resultados falso negativos. Además, las clorofilasas microbianas se expresan, frecuentemente, con otras esterasas, las cuales pueden actuar en éster de p-nitrofenilo, pero no en clorofila, por lo que dan resultados falsos positivos.

Así, persiste la necesidad de proporcionar un ensayo mejorado para detectar clorofilasa y enzimas relacionadas. Particularmente, existe la necesidad de proporcionar un método que evitar las desventajas de la extracción de solventes, que sea confiable, preciso y adecuado para la exploración de alta productividad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En consecuencia, la presente invención proporciona un método para detectar un derivado de clorofila libre de fitol en una muestra; el método comprende una etapa de detección de una señal fluorescente asociada con el derivado de clorofila libre de fitol, en donde una señal fluorescente asociada con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol en la muestra se extingue.

En una modalidad, la señal fluorescente asociada con clorofila o derivado de clorofila que contiene fitol se extingue por dimerización de la clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol. Preferentemente, bajo las condiciones usadas en la etapa de detección, la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol se dimeriza preferencialmente comparado con el derivado de clorofila libre de fitol.

En una modalidad, el derivado de clorofila libre de fitol comprende clorofilido, feofórbido o pirofeofórbido . En una modalidad, la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol comprende clorofila, feofitina o pirofeofitina .

La etapa de detección podría llevarse a cabo en una solución de detección que comprende un tensioactivo, un alcohol y un álcali. Preferentemente, el alcohol comprende isopropanol, con mayor preferencia, 12 a 20 % en peso de alcohol.

En una modalidad, el tensioactivo se encuentra presente a 0.01 a 0.03 % en peso, sobre la base del peso total de la solución de detección y, preferentemente, comprende 4- (1,1,3, 3 -tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol .

En una modalidad, la etapa de detección se lleva a cabo a 20 a 25 °C y, preferentemente, a un pH mayor que 10.0. La señal fluorescente podría detectarse a, por ejemplo, aproximadamente 670 nm.

En una modalidad, la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol se encuentra presente en la forma de una solución acuosa de dímeros y/o multímeros no coloidales .

En una modalidad, la etapa de detección se lleva a cabo en ausencia de liposomas.

En una modalidad, el tensioactivo comprende 4- (1,1,3,3-tetrametilbut.il) fenil-polietilenglicol, el alcohol comprende isopropanol y el álcali comprende hidróxido de sodio.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de ensayo para cuantificar la actividad enzimática en una muestra, en donde la enzima es capaz de hidrolizar clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol; el método de ensayo comprende: a) poner en contacto la muestra con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol; y b) detectar la producción de un derivado de clorofila libre de fitol mediante un método como se describió anteriormente.

En una modalidad, la etapa (a) comprende incubar la muestra con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol en una solución de reacción que comprende un tensioactivo, acetona y/o un regulador. Preferentemente, después de la etapa (a) y antes de la etapa (b) , la actividad enzimática se termina al adicionar la solución de reacción a una solución de detección como se definió anteriormente.

En una modalidad, la enzima está activa durante la etapa (a) y la enzima está inactiva durante la etapa (b) .

En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para cuantificar la actividad enzimática en una muestra, en donde la enzima es capaz de hidrolizar clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol; el kit comprende: a) una solución de reacción en la cual la enzima está activa; b) un sustrato que comprende clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol; y c) una solución de detección en la cual el sustrato se dimeriza preferencialmente comparado con un derivado de clorofila libre de fitol producido por la enzima.

En una modalidad, la solución de reacción comprende un tensioactivo, acetona y un regulador. Preferentemente, el sustrato comprende clorofila, feofitina o pirofeofitina . La solución de detección podría ser una solución de detección, como se describió anteriormente. Preferentemente, la enzima está inactiva en la solución de detección.

En una modalidad, el kit comprende, además, una o más soluciones estándar, cada una de las cuales comprende una concentración conocida de derivado de clorofila libre de fitol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la formación de un dímero a partir de dos moléculas de feofitina. La dimerización ocurre mediante el anillo de porfirina (clorina) y lleva a la extinción de la fluorescencia a 670 nm.

La Figura 2 muestra una curva estándar (calibración) de la fluorescencia relativa (RFU) contra la concentración de pirofeofórbido (µ ) .

La Figura 3 muestra una curva estándar (calibración) de la fluorescencia relativa (RFU, por sus siglas en inglés) contra la concentración de feofórbido (µ ) .

La Figura 4 muestra la hidrólisis de feofitina que resulta en la producción de feofórbido y fitol, catalizada por feofitinasa.

La Figura 5 muestra reacciones que incluyen clorofila y derivados, y actividades enzimáticas que podrían detectarse mediante el uso de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método para detectar un derivado de clorofila libre de fitol en una muestra. Al extinguir una señal fluorescente derivada de clorofila o derivados de clorofila que contienen fitol en la muestra, el derivado de clorofila libre de fitol puede detectarse directamente. El método puede ser cuantitativo, es decir, el método puede usarse para determinar un nivel o una concentración del derivado de clorofila libre de fitol en la muestra. Por lo tanto, el método es particularmente útil para determinar actividad de clorofilasa o de una enzima relacionada en una muestra, ya que permite que el producto se distinga del sustrato sin separación física (es decir, sin que se requiera la separación con hexano u otro fraccionamiento con solventes de sustrato y producto) .

Clorofila y derivados de clorofila Por "derivado de clorofila que contiene fitol" se entiende, típicamente, compuestos que comprenden un anillo de porfirina (clorina) y un grupo fitol (cola) , que incluyen derivados que contienen fitol libres de magnesio, tales como feofitina y pirofeofitina. La clorofila y los derivados de clorofila que contienen fitol son, típicamente, de un color verdusco, como resultado del anillo de porfirina (clorina) presente en la molécula. Preferentemente, la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol es clorofila, feofitina o pirofeofitina, con mayor preferencia, feofitina o pirofeofitina . La clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol se usa, típicamente, como en sustrato en un método de ensayo como se describe en la presente descripción.

Por "derivado de clorofila libre de fitol" se entiende, típicamente, el producto de la hidrólisis enzimática de un derivado de clorofila que contiene fitol. La clorofilasa o enzimas relacionadas podrían hidrolizar clorofila y derivados de clorofila que contienen fitol para escindir la cola de fitol del anillo de clorina. Estos compuestos aún contienen el anillo de porfirina que aporta color; el clorofílido es verde, y el feofórbido y el pirofeofórbido son color café rojizo. Preferentemente, el derivado de clorofila libre de fitol es clorofílido, feofórbido o pirofeofórbido, con mayor preferencia, feofórbido o pirofeofórbido. Un derivado de clorofila libre de fitol es, típicamente, el producto de reacción en un método de ensayo, como se describe en la presente descripción.

La clorofila o el derivado de clorofila podría ser, por ejemplo, las formas a, b o d. Así, como se usa en la presente descripción, el término "clorofila" incluye clorofila a, clorofila b y clorofila d. De una forma similar, las formas a, b y d están cubiertas cuando se refiere a feofitina, pirofeofitina, clorofílido, feofórbido y pirofeofórbido .

El método de detección como se describe en la presente descripción permite, típicamente, la discriminación de clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol de su correspondiente derivado de clorofila libre de fitol. Por ejemplo, el método podría permitir que se distingan entre sí un sustrato y un producto de reacción de una clorofilasa o enzima relacionada. En modalidades particulares, los pares sustrato/producto (que contiene fitol/libre de fitol) podrían ser (a) clorofina y clorofílido; (b) feofitina y feofórbido; o (c) pirofeofitina y pirofeofórbido .

Muestra El presente método podría usarse para detectar un derivado de clorofila libre de fitol en una muestra. La muestra podría comprender, por ejemplo, una preparación derivada de una planta, una preparación derivada de un alga o una preparación derivada de una bacteria, derivada de cualquier tipo de planta, alga o bacteria (por ejemplo, cianobacteria) . En una modalidad, la muestra comprende un material vegetal, un aceite vegetal o un extracto vegetal. Por ejemplo, la muestra podría comprender un aceite vegetal, que incluye aceites procesados de semillas oleaginosas o frutos oleaginosos (por ejemplo, aceites de semillas, tales como aceite de cañóla (semilla de colza) y aceites de frutos, tales como palma) .

Como se describe en la presente descripción, en algunas modalidades el método se usa para realizar ensayos en busca de actividad enzimática (por ejemplo, clorofilasa, feofitinasa y/o pirofeofitinasa) en una muestra. En tales modalidades, la muestra podría comprender cualquier preparación sospechada de contener la actividad enzimática relevante. La muestra podría comprender, por ejemplo, una preparación o un extracto derivado de una planta, un alga o una bacteria, o podría comprender una proteína purificada o recombinante que se vaya a probar en busca de clorofilasa o una actividad enzimática relacionada. En estas modalidades, los derivados de clorofila libres de fitol podrían estar ausentes de la muestra antes de la etapa de contacto del método de ensayo, es decir, los derivados libres de fitol podrían producirse después de la adición de un sustrato adecuado para la enzima.

Detección de una señal fluorescente En modalidades de la presente invención, se detecta una señal fluorescente asociada con un derivado de clorofila libre de fitol. Por ejemplo, una señal fluorescente derivada de, o emitida por, el derivado libre de fitol podría detectarse, medirse o cuantificarse, preferentemente, en ausencia de una señal fluorescente derivada de clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol.

Los métodos para detectar señales fluorescentes son muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, la señal fluorescente derivada del derivado de clorofila libre de fitol podría detectarse mediante cualquier detector adecuado, por ejemplo, un espectrofotómetro fluorescente, un espectrofluorómetro o un lector de placa fluorescente. El detector incluye, típicamente, una fuente de luz que produce luz a una longitud de onda adecuada para activar el material fluorescente, así como ópticas para dirigir la fuente de luz a través de una ventana de detección al material contenido en el canal o la cámara. Podrían usarse distintas fuentes de luz como fuentes de excitación, que incluyen láser, fotodiodos y lámparas de xenón o vapor de mercurio. La luz podría pasarse a través de un filtro (por ejemplo, una rejilla de difracción) o monocromador a fin de seleccionar una longitud de onda fija antes de que atraviese la muestra. La luz emitida podría pasarse a través de un filtro o un monocromador y podría detectarse una longitud de onda específica mediante un fotodetector, típicamente, a 90 grados en relación con la luz de excitación. El fotodetector podría comprender, por ejemplo, un tubo fotomultiplicador, fotodiodo o detector de dispositivo acoplado de carga (CCD, por sus siglas en inglés) . El fotodetector proporciona, típicamente, un valor para la intensidad de la señal fluorescente. La señal puede procesarse como una salida digital o análoga.

En modalidades de la presente invención, se seleccionan las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas para la detección fluorescente de los derivados de clorofila, por ejemplo, excitación a aproximadamente 410 nm y emisión a aproximadamente 670 nm. Típicamente, la intensidad de la señal fluorescente detectada es proporcional a la concentración del derivado de clorofila libre de fitol en la muestra .

Extinción de una señal fluorescente de clorofila o derivados de clorofila que contienen fitol.

En modalidades de la presente invención, se extingue una señal fluorescente asociada con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol en la muestra. Por "extinguir" se entiende que la intensidad de una señal fluorescente derivada de clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol en una muestra se disminuye, inhibe o suprime. En una modalidad preferida, la señal fluorescente asociada con clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol se extingue por dimerización. Por "dimerización" se entiende que al menos dos moléculas del derivado de clorofila que contiene fitol se asocian para formar un dímero. Así, "dimerización", como se usa en la presente descripción, incluye la formación de estructuras de orden superior que comprenden tres o más moléculas del derivado de clorofila que contiene fitol, tal como trímeros, tetrámeros u otros multímeros, siempre que la señal fluorescente de tales estructuras se extinga y siempre que los dímeros u otros multímeros permanezcan en solución (por ejemplo, que los dímeros o multímeros sean solutos en una solución acuosa) . Esto significa que, típicamente, la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol no forma partículas sólidas en la solución de detección, por ejemplo, la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol no precipita o no forma agregados coloidales sólidos en la solución de detección. Así, los términos "dimerización" y "multímerización" podrían usarse indistintamente y "dimeriza", "dimerizado" , "dimerizar" y "formación de dímeros" deberán interpretarse en consecuencia.

Se conoce a partir del análisis de HPLC (Food Research International 38(8-9): 1067-1072 (2005)) que los compuestos que contienen fitol, tal como clorofila, feofitina y pirofeofitina dan una señal fluorescente muy fuerte mediante excitación a 410 nm y emisión a 667 nm. Bajo ciertas condiciones, el anillo de porfirina, feofitina y pirofeofitina es capaz de formar un dímero, el cual extingue fuertemente la señal fluorescente (véase J. Photochem. Photobiol . B: Biol. 54 (2000) 194-200). Los derivados de clorofila libres de fitol, tal como clorofílido, feofórbido y pirofeofórbido son capaces de dimerizarse mediante el anillo de porfirina, lo que resulta en una disminución similar en la intensidad de fluorescencia. Sin embargo, las condiciones bajo las cuales los derivados de clorofila que contienen fitol se dimerizan podrían diferir. En modalidades de la presente invención, esta diferencia podría aprovecharse a fin de seleccionar condiciones bajo las cuales se detecta fluorescencia exclusivamente de derivados libres de fitol.

Así, en una modalidad, la etapa de detección se lleva a cabo bajo condiciones en las cuales la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol se dimeriza preferencialmente en comparación con el derivado de clorofila libre de fitol. Por "se dimeriza preferencialmente" se entiende que la proporción de clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol que se dimeriza es mayor que la proporción del derivado de clorofila libre de fitol que se dimeriza bajo esas condiciones.

En algunas modalidades, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 90 % o al menos 95 % de la señal fluorescente derivada de clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol se extingue, preferentemente, por dimerización. Esto significa que bajo las condiciones de detección usadas, la intensidad de la señal fluorescente derivada de clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol se reduce en la proporción especificada comparada con una señal fluorescente derivada de clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol bajo condiciones testigo en las cuales no hay extinción, por ejemplo, bajo condiciones donde no hay dimerización significativa de clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol. Por ejemplo, las condiciones de no extinción podrían comprender una concentración alta (por ejemplo, >0.1 %) de tensioactivo .

Preferentemente, la señal fluorescente derivada del derivado de clorofila libre de fitol no se extingue significativamente o se extingue a un grado inferior que la señal fluorescente derivada de clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol. Por ejemplo, en algunas modalidades, una cantidad menor que 50 %, menor que 25 % o menor que 10 % de la señal fluorescente derivada del derivado de clorofila libre de fitol se extingue comparada con una señal fluorescente derivada del derivado de clorofila libre de fitol bajo condiciones testigo en las cuales no hay extinción, por ejemplo, bajo condiciones donde no hay dimerización significativa del derivado de clorofila libre de fitol.

Condiciones de detección La etapa de detección de la presente invención podría llevarse a cabo bajo condiciones en las cuales se extinga una señal fluorescente asociada con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol en la muestra, preferentemente, por dimerización. Al variar la composición de una solución en la cual se detecta la señal, una persona con experiencia en la técnica puede seleccionar las condiciones adecuadas a fin de extinguir la señal fluorescente, por ejemplo, condiciones bajo las cuales la clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol se dimeriza predominantemente, pero el derivado de clorofila libre de fitol no se dimeriza.

Típicamente, la etapa de detección se lleva a cabo en una solución acuosa. La solución en la cual se lleva a cabo la etapa de detección se denomina en la presente descripción "solución de detección" . Se ha descubierto que la composición de la solución de detección puede variarse a fin de influenciar la dimerización de los derivados de clorofila y la extinción de la señal fluorescente. Particularmente, la concentración de tensioactivo, la temperatura, el pH y el tipo y la concentración de solvente en la solución de detección podrían influenciar la dimerización y pueden variarse a fin de seleccionar condiciones adecuadas para la etapa de detección. Preferentemente, la solución de detección comprende un tensioactivo, un solvente y/o un álcali.

El solvente es, típicamente, un solvente prótico polar, tal como un alcohol, preferentemente, un alcohol inferior (por ejemplo, Ci-C5 o C!-C3) , con mayor preferencia, un alcohol monohídrico alif tico. En modalidades particulares, el alcohol comprende metanol, etanol, propanol, isopropanol o butanol, con mayor preferencia, etanol o isopropanol, con la máxima preferencia, isopropanol. La solución de detección podría comprender 5 a 25 % en peso de alcohol, por ejemplo, . 5 a 20 %, 5 a 15 %, 10 a 20 %, 12 a 20 %, 13 a 17 % o aproximadamente 15 % en peso de alcohol, por ejemplo, etanol o isopropanol.

Podría seleccionarse una concentración adecuada del solvente (por ejemplo, alcohol) sobre la base del alcohol específico y las otras condiciones, es decir, concentración de tensioactivo, pH, temperatura, etc. Si otras condiciones de reacción se mantienen constantes, aumentar la concentración de solvente reduce, típicamente, la dimerización y, por lo tanto, reduce la extinción de la señal fluorescente. En algunas modalidades, la concentración de solvente podría titularse (por ejemplo, aumentarse progresivamente mientras se mantienen las otras condiciones constantes) hasta que se alcanza una concentración a la cual el derivado de clorofila libre de fitol ya no se dimeriza, pero a la cual la clorofila o el derivado que contiene fitol permanece en un estado dimerizado. En este punto, la señal fluorescente de la clorofila o del derivado que contiene fitol permanece extinta, pero la señal del derivado libre de fitol no se extingue. Esta concentración del solvente podría usarse, después, en la etapa de detección.

La naturaleza del tensioactivo no está particularmente limitada. En modalidades particulares, el tensioactivo podría ser, por ejemplo, un tensioactivo aniónico, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo zwitteriónico o un tensioactivo no iónico.

Los tensioactivos aniónicos adecuados incluyen, por ejemplo, carboxilatos , tales como jabones y polialcoxicarboxilatos ; sulfonatos, tales como alquilbencensulfonatos , alquilarensulfonatos , naftalensulfonatos , a-olefinsulfonatos , sulfonatos con éster, amida, o enlaces éter que incluyen amidosulfonatos , 2-sulfoetil ásteres de ácidos grasos, y sulfonatos de éster de ácido graso; sulfatos, tales como sulfatos de alcohol, alcoholes sulfatados y etoxilados, alquilfenoles sulfatados y etoxilados, ácidos sulfatados, amidas sulfatadas, ésteres sulfatados, y grasas y aceites naturales sulfatados; ésteres de fosfato, tales como fosfato de butilo, fosfato de hexilo, fosfato de 2-etilhexilo, fosfato de octilo, fosfato de decilo, fosfato de oxtidecilo, alquilfosfato mezclado, polifosfato de hexilo, polifosfato de octilo, monoéster de glicerol de ácidos grasos mezclados (fosfatado) , alcohol de dodecilo (etoxilado y fosfatado) , alcohol de tridecilo (ramificado) , alcohol de 9-octadecenilo (etoxilado y fosfatado) , alcoholes polihídricos (etoxilados y fosfatados) , fenol (etoxilado y fosfatado) , octilfenol (etoxilado y fosfatado) , nonilfenol (etoxilado y fosfatado) , dodecilfenol (etoxilado y fosfatado) y dinonilfenol (etoxilado y fosfatado) ; y ésteres de fosfonato.

Los tensioactivos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, aminas, tales como aminas libres de oxígeno que incluyen mono-, di- y poliaminas, aminas que contienen oxígeno que incluyen óxidos de amina, alquilaminas etoxiladas, 1- (2-hidroxietil) -2-imidazolinas y alcoxilatos de etilendiamina, alcoxilatos de etilendiamina y aminas con enlaces amida; y sales de amonio cuaternario, tales como sales de dialquildimetilamonio, cloruros de alquilbencildimetilamonio, sales de alquiltrimetilamonio, haluros de alquilpiridinio y ésteres de amonio cuaternario.

Los ejemplos de tensioactivos zwitteriónicos incluyen alquilbetaínas, amidopropilbetaínas , alquildimetilaminas, derivados de imidazolinio, y aminoácidos y sus derivados.

Los tensioactivos no iónicos que podrían usarse incluyen ésteres de ácido carboxílico, tales como ésteres de glicerol y ésteres de polioxietileno; ésteres de anhidrosorbitol; tensioactivos de polioxietileno, tales como etoxilatos de alcohol y etoxilatos de alquilfenol; grasas etoxiladas naturales, aceites y ceras; glicol ésteres de ácidos grasos; alquil poliglicósidos ; amidas carboxílicas , tales como condensados de dietanolamina, condensados de monoalcanolamina que incluyen monoetanolamidas y monoisopropanolamidas de coco, láuricas, oleicas y esteáricas, amidas de ácido graso de polioxietileno,- glucamidas de ácido graso; y copolímeros de bloque de polioxialquileno .

Muchos tensioactivos adecuados se encuentran disponibles comercialmente e incluyen: copolímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno de la familia Pluronic®; aceites de ricino hidrogenados con polietilenglicol disponibles bajo el nombre comercial Cremophor®, por ejemplo, Cremophor® RH 40; productos disponibles bajo la marca comercial Nikkol® (por ejemplo, Nikkol® HCO-40 y HCO-60) ; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno glicerol disponibles bajo el nombre Tagat® (por ejemplo, Tagat® RH 40; y Tagat® TO) ; ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitán, por ejemplo, mono y tri lauril, palmitil, estearil y oleil ésteres del tipo disponible comercialmente bajo el nombre comercial Tween® (por ejemplo, Tween® 20, Tween® 40 o Tween® 80) ; fosfolípidos , particularmente, lecitinas tales como lecitinas de frijoles de soja; ésteres de ácidos grasos de sorbitán comercialmente disponibles bajo la marca comercial Span®, por ejemplo, Span® 20 (monolaurato de sorbitán) o Span® 80 (monooleato de sorbitán) .

En una modalidad, el tensioactivo es un tensioactivo de polioxietileno, preferentemente, con un número de polimerización de la porción de polioxietileno de aproximadamente 5 a aproximadamente 50, por ejemplo, 8 a 12.

Con mayor preferencia, el tensioactivo comprende un etoxilato de alquilo, tal como un etoxilato de alquilfenol, por ejemplo, octilfenol polimerizado con óxido de etileno. En una modalidad, el tensioactivo comprende polietoxilato de 4-octilfenol (4- (1, 1, 3, 3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol) , por ejemplo, disponible bajo el nombre comercial Tritón X-100 de Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO.

Preferentemente, la solución de detección comprende 0.01 a 0.1 % en peso, por ejemplo, 0.01 a 0.05 %, 0.01 a 0.04 %, 0.01 a 0.03 % o 0.01 a 0.02 % en peso del tensioactivo. Una concentración adecuada del tensioactivo podría seleccionarse sobre la base del tensioactivo específico y las otras condiciones, es decir, concentración de solvente, pH, temperatura, etc. Si se mantienen constantes otras condiciones de reacción, aumentar la concentración del tensioactivo, típicamente, reduce la dimerización y, por lo tanto, lleva a un aumento en la señal fluorescente. En algunas modalidades, la concentración de tensioactivo podría titularse (por ejemplo, aumentarse progresivamente mientras se mantienen las otras condiciones constantes) hasta que se alcanza una concentración a la cual el derivado de clorofila libre de fitol ya no se dimeriza, pero a las cuales la clorofila o el derivado que contiene fitol permanece en un estado dimerizado. Esta concentración del tensioactivo podría usarse, después, en la etapa de detección.

La etapa de detección podría llevarse a cabo a cualquier temperatura adecuada. Sin embargo, si se mantienen constantes otras condiciones de reacción, aumentar la temperatura, típicamente, reduce la dimerización y, por lo tanto, reduce la extinción de la señal fluorescente. Así, la temperatura de reacción podría seleccionarse de manera que bajo las otras condiciones usadas (por ejemplo, concentración de solvente y tensioactivo, pH, etc.), la clorofila o el derivado que contiene fitol se dimeriza preferencialmente comparado con el derivado de clorofila libre de fitol. En modalidades particulares, la etapa de detección podría llevarse a cabo a 10 a 50 °C, 15 a 40 °C, 15 a 30 °C o, preferentemente, a temperatura ambiente, por ejemplo, 20 a 25 °C.

La etapa de detección podría llevarse a cabo a cualquier pH. Preferentemente, la etapa de detección se lleva a cabo a un pH alcalino, es decir, a un pH mayor que 7, preferentemente, 8.0 o superior, 9.0 o superior, 10.0 o superior, u 11.0 o superior. Podría alcanzarse un pH deseado al adicionar una cantidad adecuada de un álcali, por ejemplo, hidróxido de sodio, a la solución de detección.

En una modalidad, la solución de detección no comprende liposomas. Ventajosamente, el método de detección de la presente invención podría llevarse a cabo sin necesidad de que los liposomas aumenten la fluorescencia del derivado de clorofila libre de fitol.

Cuantificación de los niveles de derivado de clorofila libre de fitol en la muestra Dado que la fluorescencia de clorofila o los derivados de clorofila que contienen fitol se extingue en la etapa de detección, los valores de intensidad de fluorescencia pueden equipararse con un nivel o una concentración particular de derivados de clorofila libre de fitol en la muestra. Típicamente, se produce una curva estándar (calibración) al adicionar una concentración conocida de un derivado de clorofila libre de fitol (por ejemplo, clorofílido, feofórbido o pirofeofórbido) y al obtener valores de fluorescencia. Los valores de fluorescencia de las muestras que contienen cantidades desconocidas del derivado de clorofila libre de fitol pueden compararse, después, con la curva estándar para proporcionar un valor para la concentración del derivado de clorofila libre de fitol en la muestra.

Método de ensayo En un aspecto de la presente invención, el método de detección descrito anteriormente podría usarse en un método de ensayo para cuantificar la actividad enzimática en una muestra. Particularmente, el método podría usarse para medir la hidrólisis enzimática de clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol, al monitorear la producción de derivados de clorofila libres de fitol.

Cualquier enzima capaz de hidrolizar clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol podría ensayarse mediante el uso de este método. Típicamente, "hidrolizar clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol" significa hidrolizar un enlace éster en clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol, por ejemplo, para escindir un grupo fitol del anillo de clorina en la clorofila o el derivado de clorofila. Así, la enzima tiene, típicamente, una actividad de esterasa o hidrolasa. La enzima podría ser, por ejemplo, una clorofilasa, feofitinasa o pirofeofitinasa .

Típicamente, el método de ensayo comprende una etapa de poner en contacto la muestra con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol. Así, la muestra podría ponerse en contacto con un sustrato para la actividad enzimática que se desea eliminar. Por ejemplo, en modalidades específicas, la muestra podría ponerse en contacto con los siguientes sustratos: clorofila (a fin de detectar actividad de clorofilasa) , feofitina (a fin de detectar actividad de feofitinasa) o pirofeofitina (a fin de detectar actividad de pirofeofitinasa) . El método podría usarse, además, para detectar cualquier combinación de las actividades mencionadas anteriormente al adicionar más de un sustrato.

La etapa de contacto podría llevarse a cabo al incubar la muestra con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol en una solución de reacción. Por "solución de reacción" se entiende cualquier solución en la cual la enzima en la muestra se deja actuar sobre el sustrato, es decir, antes de la etapa de detección. La muestra podría adicionarse directamente a la solución de reacción y al sustrato, seguido por la incubación durante un período predeterminado de tiempo, en el cual ocurre la actividad enzimática.

La etapa de contacto podría llevarse a cabo bajo cualquier condición en la cual la enzima tiene actividad hidrolítica. Las condiciones bajo las cuales las clorofilasas y las enzimas relacionadas están activas se describen con referencia a métodos de ensayo conocidos, por ejemplo, Khamessan et al. (1994), Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 60(1), páginas 73-81; Khamessan et al. (1996), Journal of Biotechnology, 45(3) páginas 253-264; Klein y Vishniac (1961), J. Biol . Chem. 236: 2544-2547; McFeeters et al., Plant Physiology 47:609-618 (1971); y McFeeters et al., Plant Physiology 55:377-381 (1975).

Preferentemente, la solución de reacción comprende un tensioactivo, un solvente y/o un regulador. El tensioactivo y el solvente contribuyen a solubilizar el sustrato (por ejemplo, clorofila, feofitina o pirofeofitina) en la solución. El tensioactivo podría ser cualquier tensioactivo, como se describió anteriormente en relación con la solución de detección, por ejemplo, un tensioactivo de polioxietileno, tal como Tritón X-100. Sin embargo, la solución de reacción comprende, típicamente, una concentración más alta de tensioactivo que la que se encuentra presente en la solución de detección. Por ejemplo, la solución de reacción podría comprender 0.05 a 0.5 %, 0.1 a 0.5 % o 0.1 a 0.3 % en peso del tensioactivo.

La solución de reacción podría comprender un solvente orgánico, tal como acetona, etanol, propanol, butanol o similares. La actividad de clorofilasas en varios solventes orgánicos se describe, por ejemplo, en Khamessan et al. (1995) Process Biochemistry 30(2), páginas 159-168. Preferentemente, la solución de reacción comprende acetona como solvente. En algunas modalidades, la solución de reacción comprende 1 a 10 %, por ejemplo, 3 a 7 % o aproximadamente 5 % en peso de acetona.

La solución de reacción podría comprender cualquier regulador adecuado. Los reguladores que podrían usarse incluyen, por ejemplo, amortiguadores de fosfato o HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-l-piperazinetanosulfónico) . Preferentemente, la solución de reacción tiene un pH en el intervalo de 6.0 a 8.0, por ejemplo, 6.5 a 7.5 o aproximadamente 7, y una persona con experiencia en la técnica puede seleccionar fácilmente un regulador adecuado para el pH deseado. La solución de reacción podría comprender una o más sales adicionales, tales como cloruro de potasio.

La muestra podría incubarse con el sustrato y la solución de reacción durante un período de tiempo adecuado a fin de permitir la hidrólisis de una cantidad detectable de producto. Los tiempos de incubación típicos incluyen, por ejemplo, 10 segundos a 120 minutos, por ejemplo, 1 a 60 minutos, 1 a 30 minutos o 5 a 20 minutos. La etapa de incubación podría llevarse a cabo a cualquier temperatura a la cual la enzima está activa, por ejemplo, a 10 a 50 °C, 15 a 45 °C, 20 a 25 °C o 35 a 45 °C, preferentemente, aproximadamente 40 °C.

Después de la etapa de contacto, la actividad enzimática se termina, típicamente, antes de que se detecte la señal fluorescente. La actividad enzimática podría terminarse, por ejemplo, al aumentar el pH de la solución, preferentemente, a al menos pH 10 o al menos pH 11. En una modalidad, se adiciona un álcali (por ejemplo, hidróxido de sodio) después de la etapa de incubación a fin de detener la reacción enzimática. Convenientemente, la actividad enzimática podría terminarse al adicionar la solución de reacción a una solución de detección como se describió anteriormente, por ejemplo, en donde la solución de detección comprende un álcali, tal como hidróxido de sodio. Típicamente, la solución de reacción se diluye a al menos 5 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces en la solución de detección.

Después de la reacción enzimática, el método de ensayo comprende una etapa de detección de la producción de un derivado de clorofila libre de fitol mediante un método como se describió anteriormente. Típicamente, se determina la concentración del derivado de clorofila libre de fitol en la solución de detección. De esta forma, puede determinarse una velocidad de hidrólisis del sustrato por unidad de tiempo (en la etapa de contacto) , la cual proporciona una medida de la actividad enzimática en la muestra. Una unidad de actividad enzimática podría definirse como la cantidad de enzima que hidroliza un micromol de sustrato (por ejemplo, clorofila, feofitina o pirofeofitina) por minuto a 40 °C, por ejemplo, en un método de ensayo como se describió anteriormente. Dado que el sustrato y el · producto son equimolares, una unidad podría definirse, alternativamente, como la cantidad de enzima que produce un micromol de producto (por ejemplo, clorofílido, feofórbido o pirofeofórbido) por minuto a 40 °C.

Ventajosamente, como se describió anteriormente, el método de ensayo de la presente invención comprende dos etapas distintas, una etapa de reacción en la cual la enzima está activa y una etapa de detección en la cual la enzima está inactiva. Dado que las etapas de reacción y detección ocurren por separado, pueden llevarse a cabo en distintas soluciones y bajo diferentes condiciones. Esto permite optimizar las condiciones para cada etapa. Así, en una modalidad, la enzima está activa en la solución de reacción, pero está inactiva en la solución de detección. Por ejemplo, la etapa de reacción podría llevarse a cabo mediante el uso de cualquier condición en la cual la enzima está activa, por ejemplo, a pH 4 a 8. Por el contrario, la etapa de detección podría llevarse a cabo mediante el uso de condiciones optimizadas para favorecer la dimerización selectiva de clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol, pero bajo las cuales la enzima está inactiva, por ejemplo, a pH 10 o superior.

Kits En otro aspecto, la presente invención proporciona kits adecuados para llevar a cabo un método o método de ensayo como se describe en la presente descripción. Los kits podrían comprender reactivos como se describen en la presente descripción para usarse en los métodos, particularmente, soluciones de reacción, soluciones de detección y sustratos como se describen en la presente descripción. Cada componente podría estar en frascos adecuados o en otros recipientes junto con envasados y/o instrucciones adecuados para llevar a cabo el método.

La solución de reacción es, típicamente, cualquier solución en la cual la enzima está activa. La solución de reacción podría comprender un tensioactivo, un solvente y un regulador, o podría ser cualquier otra solución de reacción descrita en la presente descripción en relación con el método de ensayo.

Preferentemente, el sustrato comprende clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol, tal como clorofila, feofitina o pirofeofitina . En el kit, podrían proporcionarse uno, dos o más sustratos, en recipientes separados o en conjunto. Por ejemplo, en algunas modalidades, dos o más sustratos podrían estar presentes en el mismo recipiente, por ejemplo, en donde se desea ensayar dos o más actividades enzimáticas. Típicamente, el sustrato se proporciona en la forma de una solución acuosa. En algunas modalidades, la solución de reacción y el sustrato podrían proporcionarse en una sola solución.

El kit podría comprender cualquier solución de detección como se describe en la presente descripción. Preferentemente, la fluorescencia de clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol se extingue en la solución de detección, mientras que la fluorescencia del derivado de clorofila libre de fitol no se extingue, por ejemplo, la solución de detección se selecciona de manera que el sustrato se dimerice preferencialmente comparado con el producto de la hidrólisis enzimática. En una modalidad, la solución de detección comprende un tensioactivo, un alcohol (por ejemplo, isopropanol) y un álcali (por ejemplo, hidróxido de sodio) . Típicamente, la enzima está inactiva en la solución de detección.

En una modalidad preferida, el kit comprende, además, uno o más estándares, por ejemplo, para construir una curva estándar (calibración) para usarse en el método de ensayo. Típicamente, los estándares se encuentran en la forma de recipientes, cada uno de los cuales contiene una concentración conocida del producto, es decir, un derivado de clorofila libre de fitol. Podrían proporcionarse dos o más estándares que contengan distintos productos (por ejemplo, clorofílido, feofórbido o pirofeofórbido) y/o distintas concentraciones de cada producto.

Ahora, la invención se ilustrará más aun con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS En estos ejemplos, se desarrolló un método de ensayo para la medición de la actividad de clorofilasa, feofitinasa y pirofeofitinasa . En la primera etapa del ensayo se preparó un sustrato compuesto de clorofila, feofitina o pirofeofitina en un regulador. Este sustrato se adicionó a una solución de enzima y se hizo reaccionar durante 10 minutos a 40 °C. Después de un tiempo de reacción de 10 minutos, parte de la muestra se transfirió a un regulador de detección. La medición de la actividad enziraática depende del hecho de que la clorofila, feofitina o pirofeofitina en el regulador de detección forme un dímero (véase la Figura 1) . La formación . del dímero extingue la señal de fluorescencia de la clorofila, feofitina o pirofeofitina . El regulador de detección se formula de manera que el clorofílido, feofórbido o pirofeofórbido producido no forme un dímero y, así, pueda detectarse por espectroscopia de fluorescencia.

Ejemplo 1. Desarrollo de un ensayo para detectar la actividad de pirofeofitinasa Se preparó un regulador de fosfato de 100 mM, pH 7, que contiene 50 mM de KCl , 0.2 % de Tritón X-100 y 5.17 % de acetona para usarse como el amortiguador de reacción. Se prepararon las siguientes soluciones que comprenden pirofeofitina, pirofeofórbido o una mezcla de estos, y se adicionaron al regulador de detección. 1) Solución de pirofeofitina : 500 µ? de regulador de reacción + 50 µ? de agua + 30 µ? de pirofeofitina (1 mg/ml en acetona) 2) Solución de pirofeofórbido : 500 µ? de regulador de reacción + 50 µ? de agua + 15 µ? de pirofeofórbido (2 mg/ml en acetona) + 15 µ? de acetona. 3) Pirofeofitina : solución 1:1 de pirofeofórbido : 500 µ? de regulador de reacción + 50 µ? de agua + 15 µ? de pirofeofitina (1 mg/ml en acetona) + 7.5 µ? de pirofeofórbido (2 mg/ml en acetona) + 7.5 µ? de acetona .

Se prepararon varias soluciones de detección (A-G) que comprenden distintas concentraciones de Tritón X-100 (tensioactivo) y etanol o isopropanol (solvente) como se muestra en las Tablas 1 y 2, abajo. Se adicionaron 10 µ? de solución 1, 2 o 3 a 1000 µ? de cada solución de detección A-G, se mezcló en un mezclador Whirley y se transfirieron 200 µ? a una placa de microtitulación Black. 10 minutos después del mezclado, se midió la señal de fluorescencia (410 nm de excitación, 670 nm de emisión) a temperatura ambiente .

Se analizaron las mediciones a fin de determinar las condiciones bajo las cuales se extinguió la fluorescencia del sustrato (clorofila, feofitina o pirofeofitina) , pero la fluorescencia del producto de reacción (clorofílido, feofórbido o pirofeofórbido) no se extinguió y pudo medirse por medición de fluorescencia.

Inicialmente , se probaron combinaciones de etanol, Tritón X-100 y 50 mM de NaOH como la solución de detección. Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuación: Tabla 1 Los valores de la Tabla 1 son valores relativos de fluorescencia (RFU) , 410 nm de excitación y 670 nm de emisión, para cada solución de detección A-D en conjunto con cada una de las soluciones 1, 2 y 3.

Los resultados de la Tabla 1 indican que la concentración del tensioactivo (Tritón X-100) es muy importante para la señal. En la solución de detección B, la señal de fluorescencia de pirof eof itina está casi eliminada porque la pirofeofitina forma un dímero, el cual lleva a la extinción de la fluorescencia. La señal para pirofeofórbido, sin embargo, también se extingue fuertemente. La señal en las soluciones de detección C y D se extingue menos para pirofeofitina y pirofeofórbido y, por lo tanto, las soluciones de detección C y D tampoco son adecuadas para la discriminación de la señal de pirofeofitina y pirofeofórbido .

Después, se usó isopropanol (IPA) en vez de etanol . Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Las cifras son valores de RFU, 410 nm/670 nm Los resultados de la Tabla 2 indican una extinción mucho más fuerte de pirofeofitina en presencia de isopropanol, pero el pirofeof rbido proporciona una señal de fluorescencia muy alta. La mezcla de pirofeofitina y pirofeofórbido (3) proporciona casi la mitad de señal de pirofeofórbido, lo que confirma que es posible discriminar estos dos componentes.

Sobre la base de los resultados que figuran arriba, se decidió usar la solución de detección E en un ensayo para detectar la actividad de pirofeofitinasa . A fin de analizar la cantidad de pirofeofórbido producida por una reacción enzimática, se construyó una curva de calibración al adicionar distintas cantidades de pirofeofórbido a la solución de detección E y al medir la fluorescencia como se describió anteriormente . La curva de calibración se ilustra en la Figura 2.

Ejemplo 2. Desarrollo de un ensayo para detectar la actividad de feofitinasa Sobre la base de los resultados del Ejemplo 1, se desarrolló un ensayo para detectar la actividad de feofitinasa. Cuando se adicionó a la solución de detección E (0.015 % de Tritón X-100; 15 % de IPA; 0.05 M de NaOH) , la fluorescencia de la feofitina se extinguió ampliamente (como para la pirofeofitina) , pero el feofórbido proporcionó una señal de fluorescencia alta a temperatura ambiente. En consecuencia, se construyó una curva de calibración para el feofórbido (véase la Figura 3) .

Ejemplo 3. Desarrollo de un ensayo para detectar la actividad de clorofilasa Sobre la base de los resultados del Ejemplo 1, se desarrolló un ensayo para detectar la actividad de clorofilasa.

Mediante el uso de una solución de reacción como se describió en el Ejemplo 1, se preparó la siguiente solución: ) Solución de clorofila: 500 µ? de regulador de reacción + 50 µ? de agua + 30 µ? de clorofila (1 mg/ml en acetona) . Se prepararon las soluciones de detección A, B y E como se describió en el Ejemplo 1. Se adicionaron 10 µ? de solución de clorofila 4 a 1000 µ? de cada solución de detección A, B y E, se mezcló y se midió la fluorescencia a temperatura ambiente como se describió en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación: Tabla 3 Las cifras son valores de RFU, 410 nm/670 nm La Tabla 3 muestra que la clorofila proporciona una señal de fluorescencia alta en el regulador de reacción (solución de detección A) , pero la señal se extingue cuando se diluye en las soluciones de detección E y B.

Por el contrario, el clorofílido mostró una señal de fluorescencia alta en la solución de detección E.

Sobre la base de las observaciones realizadas anteriormente, se seleccionó la solución de detección E (0.015 % de Tritón X-100; 15 % de isopropanol ; 0.05 M de NaOH) para usarse en ensayos para detectar la actividad de clorofilasa, feofitinasa y pirofeofitinasa. En la solución de detección E, el clorofílido, el feofórbido y el pirofeofórbido generan, cada uno, señales de fluorescencia altas, mientras que las señales de la clorofila, la feofitina y la pirofeofitina se extinguen.

Ejemplo 4. Ensayo de pirofeofitinasa Se usa un regulador de fosfato de 100 mM, pH 7, que contiene 50 mM de KC1, 0.2 % de Tritón X-100 y 5.17 % de acetona como regulador de reacción. El sustrato (pirofeofitina) se adiciona al regulador de reacción a una concentración de 56 mM. 130 µ? del regulador de reacción que comprende sustrato se transfieren a un tubo Eppendorf y se colocan en una incubadora a 40 °C durante 5 minutos. 10 µ? de una muestra de prueba sospechada de contener actividad de pirofeofitinasa se adicionan al tubo que contiene el regulador de reacción y el sustrato. El tubo se incuba a 40 °C durante 10 minutos con agitación a 900 rpm.

Después de 10 minutos de incubación, se transfieren 10 µ? de la mezcla de muestra /regulador de reacción/sustrato a otro tubo Eppendorf que contiene 1 mi de una solución de detección que comprende 0.015 % de Tritón X-100, 15 % de isopropanol y 0.05 M de NaOH. Inmediatamente, se cierra el tubo y se mezcla en un mezclador Whirley durante 5 segundos. Se transfieren 2 alícuotas, cada una de 200 µ?, de la muestra diluida a una placa de microtitulación negra. 10 minutos después de tomar la última muestra, las muestras se miden en un lector de placa de fluorescencia a 410 nm de excitación y 670 nm de emisión a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C).

Podría construirse una curva estándar como se describió en el Ejemplo 1 y usarse para determinar las concentraciones de pirofeofórbido en cada muestra después de 10 minutos de incubación a 40 °C. Por ejemplo, la pendiente de la curva estándar es la fluorescencia relativa (RFU) como una función de la concentración de pirofeofórbido en µ?. Por lo tanto, para una muestra particular, [piropfeofórbido] (µ?) = RFU/pendiente de curva estándar. La actividad de pirofeofitinasa en la muestra de prueba podría calcularse como el número de ymoles de pirofeofórbido producido por minuto de incubación a 40 °C, tomando en cuenta la dilución de la muestra en el ensayo.

Ejemplo 5. Ensayo de feofitinasa Se repite el Ejemplo 6 al reemplazar pirofeofitina como sustrato con feofitina (a una concentración de 56 mM) . Podría construirse una curva estándar como se describió en el Ejemplo 2. La actividad de feofitinasa en la muestra de prueba podría calcularse como el número de moles de feofórbido producido por minuto de incubación a 40 °C; se toma en cuenta la dilución de la muestra en el ensayo.

Ejemplo 6. Ensayo de clorofilasa Se repite el Ejemplo 6 al reemplazar pirofeofitina como sustrato con clorofila (a una concentración de 56 mM) . Podría construirse una curva estándar mediante el uso de concentraciones distintas de clorofílido. La actividad de clorofilasa en la muestra de prueba podría calcularse como el número de moles de clorofílido producido por minuto de incubación a 40 °C, tomando en cuenta la dilución de la muestra en el ensayo.

Todas las publicaciones mencionadas en la descripción anteriormente se incorporan en la presente descripción como referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistema de la presente invención descritos resultarán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la presente invención. Aunque la presente invención se ha descrito en relación con modalidades preferidas específicas, debe comprenderse que la invención tal como se reivindica no debe limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la presente invención que son obvias para los expertos en bioquímica o campos relacionados pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para detectar un derivado de clorofila libre de fitol en una muestra; el cual comprende una etapa de detección de una señal fluorescente asociada con el derivado de clorofila libre de fitol, caracterizado porque una señal fluorescente asociada con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol en la muestra se extingue, y en donde la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol se encuentra presente en la forma de una solución acuosa de dímeros y/u otros multímeros no coloidales.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la señal fluorescente asociada con clorofila o derivado de clorofila que contiene fitol se extingue por dimerización de la clorofila o del derivado de clorofila que contiene fitol.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la clorofila o el derivado de clorofila que contiene fitol se dimeriza preferencialmente comparado con el derivado de clorofila libre de fitol.

4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el derivado de clorofila libre de fitol comprende feofórbido o pirofeofórbido, y/o el derivado de clorofila que contiene fitol comprende feofitina o pirofeofitina .

5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo en una solución de detección que comprende un tensioactivo, un alcohol y/o un álcali.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque (i) el alcohol comprende isopropanol o etanol y/o (ii) la solución de detección comprende 12 a 20 % en peso de alcohol .

7. Un método de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque (i) el tensioactivo comprende 4-(1, 1, 3 , 3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol y/o (ii) la solución de detección comprende 0.01 a 0.03 % en peso de tensioactivo .

8. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque (i) la etapa de detección se lleva a cabo a 20 a 25 °C y/o (ii) la etapa de detección se lleva a cabo a un pH mayor que 10.0.

9. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se detecta una señal fluorescente con una longitud de onda de aproximadamente 670 nm.

10. Un método de ensayo para cuantificar la actividad enzimática en una muestra, caracterizado porque la enzima es capaz de hidrolizar clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol; el método de ensayo comprende: a) poner en contacto la muestra con clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol; y b) detectar la producción de un derivado de clorofila libre de fitol mediante un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Un kit para cuantificar la actividad enzimática en una muestra, caracterizado porque la enzima es capaz de hidrolizar clorofila o un derivado de clorofila que contiene fitol; el kit comprende: a) una solución de reacción en la cual la enzima está activa; b) un sustrato que comprende clorofila o un derivado de clorofila que comprende fitol; y c) una solución de detección en la cual el sustrato se dimeriza preferencialmente comparado con un derivado de clorofila libre de fitol producido por la enzima, y en la cual el sustrato se encuentra presente en la forma de una solución acuosa de dímeros y/u otros multímeros no coloidales .

12. Un kit de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque (i) la solución de reacción comprende un tensioactivo, acetona y un regulador y/o (ii) el sustrato comprende feofitina o pirofeofitina .

13. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la etapa de detección se lleva a cabo en la ausencia de liposomas.

14. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizado porque el tensioactivo comprende 4 - (1,1,3 , 3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol, el alcohol comprende isopropanol y el álcali comprende hidróxido de sodio.

15. Un método de ensayo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la enzima está activa durante la etapa (a) y la enzima está inactiva durante la etapa (b) .