MX2012010014A - Anticuerpos contra csf-1r humano y sus usos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos contra CSF-1R humano (anticuerpo CSF-1R), métodos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, y sus usos.

Description

ANTICUERPOS CONTRA CSF-1R HUMANO Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos contra CSF-1R humano (anticuerpo CSF-1R) , a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos y sus usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El receptor CSF-1 (CSF-1R; sinónimos: M-CSF receptor; Receptor de factor de estimulo de colonia de macrófagos 1, EC 2.7.10.1, Fms proto-oncogén, c-fms, Swiss Prot P07333, CD115) se conoce desde 1986 (Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280) . CSF-1R es un factor de crecimiento y codificado por el c-fms proto-oncogén (revisado por ejemplo en Roth, P., and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67) .

CSF-1R es el receptor para el factor de estimulo de colonia de macrófagos (M-CSF = Macrophage Colony Stimulating Factor) , también denominado CSF-1) y media los efectos biológicos de esta citoquina (Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676) . La clonación del receptor de factor de estimulo de colonia-1 (también denominado c-fms) se describió por primera vez por Roussel, .F., et al., Nature 325 (1987) 549-552. En ésta publicación, se mostró que CSF-1R tuvo potencial de transformación dependiendo de cambios en la cola C-terminal de la proteina incluyendo la pérdida de la fosforilación de tirosina 969 inhibitoria que liga a Cbl y de esta manera se encarga de la regulación a la baja de receptor (Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628) .

CSF-1R es un receptor de transmembrana tirosina quinasa (RTK = Receptor Tyrosine Kinase) de una sola cadena y un miembro de la familia de motivo de inmunoglobulina (Ig) que contiene RTKs, caracterizado por dominios Ig repetidos en la porción extracelular del receptor. El dominio de proteina intracelular tirosina quinasa se interrumpe por un dominio de inserción único que también está presente en los otros miembros de familia clase III RTK relacionados que incluyen los receptores de factor de crecimiento derivados de plaquetas (PDGFR = Platelet Derived Growth Factor Receptors) , receptor de factor de crecimiento de células madre (c-Kit) y receptor de citoquina tipo fins (FLT3) . A pesar de la homología estructural entre esta familia de receptores de factor de crecimiento, tienen distintas funciones específicas de tejido. CSF-1R primordialmente se expresa en células del linaje monocítico, y en el tracto reproductivo y placenta femenina. Además la expresión de CSF-1R se ha reportado en células Langerhans en la piel, un subconjunto de células de músculo liso (Inaba, . . , et al., J. Biol . Chem. 267 (1992) 5693-5699) células B (Baker, A.H., et al., Oncogene 8 (1993) 371-378) y microglia (Swada, ., et al., Brain Res. 509 (1990) 119-124) .

Los efectos biológicos principales de señalización de CSF-1R y la diferenciación, proliferación, migración y supervivencia de células precursoras hematopoyéticas al linaje de macrófagos (incluyendo osteoclastos) . La activación de CSF-1R esta mediada por su ligando, M-CSF. El enlace de - CSF a CSF-1R induce la formación de homodimeros y activación de la quinasa por fosforilación de tirosina (Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 4-10). Mayor señalización está mediada por la subunidad p85 de PI3K y Grb2 que conectan a las rutas PI3K/AKT y Ras/MAPK, respectivamente. Estas dos rutas de señalización importantes pueden regular la proliferación, supervivencia y apoptosis. Otras moléculas de señalización que ligan a dominio intracelular fosforilado de CSF-1R incluyen STAT1, STAT3, PLCy, y Cbl (Bourette, R.P., Rohrschneider, L.R., Growth Factors 17 (2000) 155-166) .

La señalización de CSF-1R tiene un papel fisiológico en respuestas inmune, en remodelado de huesos y en el sistema reproductivo. Los animales con genes inoperativos ya sean para M-CSF- G (Pollard, J. ., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 54-61) o CSF-1R (Dai, X.M., et al., Blood 99 (2002) 111-120) han mostrado que tienen fenotipos osteopetróticos, hematopoyéticos, macrófago de tejido y reproductivos consistentes con un papel para CSF-1R en los tipos de células respectivos.

Sherr, C.J., et al., Blood 73 (1989) 1786-1793 se refiere a algunos anticuerpos contra CSF-1R que inhiben la actividad CSF-1 (ver Sherr, C.J., et al., Blood 73 (1989) 1786-1793) . Ashmun, R.A., et al., Blood 73 (1989) 827-837 se refiere a anticuerpos CSF-1R. Lenda, D. , et al., Journal of immunology 170 (2003) 3254-3262 se refiere a reducido reclutamiento, proliferación y activación de macrófagos en ratones deficientes en CSF-1 resulta en apoptosis tubular reducida durante inflamación renal. Kitaura, H., ' et al., Journal of Dental Research 87 (2008) 396-400 se refiere a un anticuerpo anti-CSF-1 que inhibe movimiento de dientes ortodóncico. WO 2001/030381 menciona inhibidores de actividad de CF-1 incluyendo nucleótidos y anticuerpos antisentido mientras que sólo describe nucleótidos antisentido CSF-1. WO 2004/045532 se refiere a metástasis y prevención de pérdida de huesos y tratamiento de cáncer metastásico por un antagonista M-CSF que se describen como anticuerpos anti-CSF-1 antagonistas solamente. WO 2005/046657 se refiere al tratamiento de la enfermedad intestinal inflamatoria por anticuerpos anti-CSF-1. US 20.02/0141994 se refiere a inhibidores de factores de estimulo de colonia.

WO 2006/096489 se refiere al tratamiento de artritis reumatoide por anticuerpos anti-CSF-1.

WO 2009/026303 y WO 2009/112245 se refieren a anticuerpos anti-CSF-lR.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención comprende un anticuerpo que liga a CSF-1R humano, caracterizado porque el enlace al mismo epitopo que el anticuerpo depositado DSM ACC2922.

En una modalidad, el anticuerpo se caracteriza porque comprende como la región CDR3 de dominio variable de cadena pesada una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 17.

En una modalidad, el anticuerpo se caracteriza porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 3, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 6, b) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 9, una región CDR2 de SEQ ID NO: 10, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 12, una región CDR2 de SEQ ID NO: 13, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 14; o c) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO:' 17, una región CDR2 de SEQ ID NO: 18, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 19, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 20, una región CDR2 de SEQ ID NO: 21, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 22; o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de injerto CDR, humanizado o de célula T de los anticuerpos de a) , b) o c) .

En una modalidad, el anticuerpo se caracteriza porque comprende a) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO: 8, o b) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 15, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO: 16, o c) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 23, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO:24 o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de célula T, humanizado o injertado en CDR, de los anticuerpos de a) , b) o c) .

En una modalidad, el anticuerpo enlaza a CSF-1R humano y se caracteriza por las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas y fragmentos de secuencia de aminoácidos son de la subclase IgGl humana o de la subclase IgG4 humana.

Una modalidad adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo adecuado con la invención.

La invención además comprende una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo que liga a CSF-1R humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por . las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados.

La invención además comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende al anticuerpo que liga a CSF-1R humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionados o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para la fabricación de una composición farmacéutica.

La invención además comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de enfermedades mediadas por CSF-1R.

La invención además comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos o fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de cáncer.

La invención además comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en -forma alterna por las secuencias de aminoácidos o fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de pérdida de huesos.

La invención además comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos o fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para la prevención o tratamiento de metástasis.

La invención además comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos o fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Un aspecto de la invención es un anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano, caracterizado porque comprende como región CDR3 de dominio variable de cadena pesada una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 17.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo que liga a CSF-1R humano, caracterizado porque a) el dominio variablé de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, una región' CDR2 de SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 3, y un dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 6, o b) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 9, una región CDR2 de SEQ ID NO: 10, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 11, y un dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 12, una región CDR2 de SEQ ID NO: 13, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 14; o c) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 17, una región CDR2 de SEQ ID' NO: 18, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 19, y un dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO:20, una región CDR2 de SEQ ID NO: 21, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 22; o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de célula T o humanizada, o injertada con CDR de los anticuerpos de a) , b) o c) .

En una modalidad el anticuerpo se caracteriza porque comprende a) la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO: 8, o b) la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 15, y la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO:16, o c) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 23, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO:24, o d) una variante de anticuerpo agotada de epitopo de célula T, humanizada o injertado con CDR, de los anticuerpos de a) , b) o c) .

En un aspecto de la invención, los anticuerpos de acuerdo con la invención ligan a CSF-1R humano con una afinidad de al menos 10"8 mol/1 a 10"12 mol/1.

En un aspecto de la invención, los anticuerpos de acuerdo con la invención son un anticuerpo humanizado.

Una modalidad adicional de la invención es un ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo de. acuerdo con la invención. De preferencia, el ácido nucleico codifica una cadena pesada de un anticuerpo que liga a CSF-1R humano, caracterizado porque comprende como región CDR3 de cadena pesada una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 17.

Una modalidad adicional de la invención es un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invención caracterizado porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 3, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 6, o b) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 9, una región CDR2 de SEQ ID NO: 10, y una región CDR1- de SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 12, una región CDR2 de SEQ ID NO: 13, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 14; o c) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 17, una región CDR2 de SEQ ID NO: 18, y una región CDR1 de SEQ ID NO:' 19, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 20, una región CDR2 de SEQ ID NO: 21, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 22; o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de célula T, humanizado o injertado en CDR, de los anticuerpos de a) , b) o c) .

La invención además. proporciona vectores de expresión que contienen ácido nucleico de acuerdo con la invención capaces de expresar el ácido nucleico en una célula hospedera procariotica o eucariótica y células hospederas que contienen estos vectores para la producción recombinante de ese anticuerpo.

La invención además comprende una célula hospedera procariotica o eucariótica que comprende un vector de acuerdo con la invención.

La invención además comprende un método para la producción de un anticuerpo recombinante humano o humanizado de acuerdo con la invención, caracterizado por la expresión de un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula hospedera procariotica o eucariótica y recupera el anticuerpo de la célula o el sobrenadante de cultivo celular. La invención además comprende el anticuerpo que se obtiene por este método recombinante .

Anticuerpos de acuerdo con la invención muestran beneficios para pacientes que requieren una terapia que hace blanco en CSF-1R. Los anticuerpos de acuerdo con la invención tienen propiedades nuevas e inventivas que provocan beneficio para un paciente que sufre de una enfermedad de tumor, en especial que sufre de cáncer.

La invención además proporciona un método para tratar a un paciente que sufre de cáncer, que comprende administrar a un paciente con diagnóstico de esta enfermedad (y por lo tanto tiene necesidad de esta terapia) , una cantidad efectiva de un anticuerpo que liga a CSF-1R humano de acuerdo con la invención. El anticuerpo se administra de preferencia en una composición farmacéutica.

Una modalidad adicional de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, caracterizado por administrar al paciente un anticuerpo de acuerdo con la invención.

La invención además comprende el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer y para la fabricación de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Además, la invención comprende un método para la fabricación de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

La invención además comprende una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención, opcionalmente junto con un amortiguador y/o un adyuvante útil para la formulación de anticuerpos para propósitos farmacéuticos.

La invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de acuerdo con la invención en un portador farmacéutico aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica puede incluirse en un articulo de manufactura o equipo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra inhibición de crecimiento de células de tumor Be o en cultivo 3D bajo tratamiento con diferentes anticuerpos monoclonales anti-CSF-lR a una concentración de lC^g/ml.

Eje X: unidades de luz relativa (RLU = Relative Light Units) de viabilidad promedio¦ correspondiente al contenido de ATP de las células (ensayo CellTiterGlo) .

Eje Y: sondas probadas: Medio Mínimo (FBS al 0.5%), IgGl de ratón (mlgGl, ??µ?/p??) , IgG2a de ratón (mIgG2a 10 pg/ml) , CSF-1 solo, <CSF-1R>7H5.2G10, <CSF-1R>10A .1G11 , y SC-02, clon 2-4A5.

Se observó más alta inhibición de crecimiento inducido CSF-1 con los anticuerpos anti-CSF-lR de acuerdo con la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES DE LA INVENCIÓN I . Definiciones El término "anticuerpo" abarca las diversas formas de anticuerpos incluyendo pero no limitadas a anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos agotados en epitopo de célula T y adicionales anticuerpos de ingeniería genética siempre que se retengan las propiedades características de acuerdo con la invención.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud íntegra, de preferencia su dominio variable, o al menos su sitio de enlace de antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Anticuerpos scFv son por ejemplo descritos en Houston, J.S., ethods in Enzymol. 203 (1991) 46-88). Además, fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos de cadena sencilla que tienen las características de un dominio VH que enlaza a CSF-IR, es decir son capaces de ensamblar junto con un dominio VL o de un dominio VL que enlaza a CSF-IR, es decir son capaces de ensamblar junto con un dominio VH a un sitio de enlace de antígeno funcional y de esta manera proporcionar la propiedad.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se emplean aquí, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición de un solo aminoácido.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable, es decir región de enlace, de ratón y al menos una porción de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, usualmente preparada por técnicas de ADN recombinante . Anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable de ratón y una región constante humana se prefieren especialmente. Estos anticuerpos quiméricos de rata/humano son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden fragmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina de rata y regiones constantes de inmunoglobulina humana que codifican segmentos de ADN. Otras formas de "anticuerpos quiméricos" abarcados por la presente invención son aquellos en donde la clase o subclase se ha modificado o cambiado de la del anticuerpo original. Estos anticuerpos "quiméricos" también se refieren como "anticuerpos conmutados de clase". Métodos para producir anticuerpos quiméricos involucran técnicas de transcripción de genes y ADN recombinante convencionales ahora bien conocidas en la especialidad. Ver por ejemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes de los E.U.A. Números 5,202,238° y 5,204,244.

La expresión "variante injertada de CDR" como, se emplea aquí con la actual solicitud, denota un dominio variable de un anticuerpo que comprende regiones de determinación de complementaridad (CDRs o regiones hipervariables ) de una fuente o especie y regiones marco (FRs = Framework Regions) de una fuente o especie diferente, usualmente preparada por técnicas de ADN recombinante, variantes injertadas CDR de dominios variables que comprenden CDRs murinos y FRs humanas se prefieren.

La expresión "variante agotada y de epitopo de célula T" como se emplea dentro de la presente invención, denota un dominio variable de un anticuerpo que se modificó para retirar o reducir inmunogenicidad al retirar epítopos de célula T humanos (secuencias péptido dentro de dominios variables con la capacidad para ligar a moléculas MHC Clase II). Por este método, interacciones entre cadenas laterales aminoácido del dominio variable y cavidades de enlace especificas con la ranura de enlace MHC Clase II se identifican. Las regiones inmunogénicas identificadas se mutan para eliminar inmunogenicidad. Estos métodos se describen en general en WO 98/52976.

La expresión "variante humanizada" como se emplea dentro de la presente solicitud denota un dominio variable de un anticuerpo, que se reconstituye a partir de las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de origen o humano, por ejemplo de una especie no humana, y de regiones marco (FRs) de origen humano, y que además se ha modificado a fin de también reconstituir o mejorar la afinidad y especificidad de enlace del dominio variable no humano original. Estas variantes humanizadas usualmente se preparan por técnicas de ADN recombinante . La reconstitución de la afinidad y especificidad del dominio variable no humano precursor es la etapa critica, para la cual actualmente se emplean diferentes métodos. En un método se determina si es benéfico introducir mutaciones asi denominadas retromutaciones , en las CDRs no humanas así como en los FRs humanos. Las posiciones adecuadas para estas retromutaciones pueden ser identificadas, por ejemplo por análisis de homología o secuencia, al seleccionar el marco humano (enfoque de marcos fijos; correspondencia de homología o mejor ajuste) , al utilizar secuencias consenso, al seleccionar FRs de diferentes mAbs humanos diversos, o al remplazar residuos no humanos en la superficie tridimensional con los residuos más comunes que se encuentran en mAbs humanos ("cubrimiento" o "restauración") .

Los anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen, además, los anticuerpos que tienen "modificaciones de secuencia conservadoras", modificaciones de secuencia de aminoácidos y nucleótidos que no, afectan o alteran las características anteriormente mencionadas del anticuerpo de acuerdo con la invención. Pueden introducirse modificaciones por técnicas estándar conocidas en la especialidad, tales como mutagénesis dirigida de sitio y mutagénesis mediada por PCR. Sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las que el residuo aminoácido se remplaza con un residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la especialidad. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales de ramificación beta (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . De esta manera, un residuo aminoácido no esencial pronosticado en un anticuerpo anti-CSF-lR humano puede de preferencia ser remplazado con otro residuo aminoácido de la misma familia de cadena lateral.

Sustituciones de aminoácidos pueden realizarse por mutagénesis basada en modelado molecular como se describe por Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 y Queen, C, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033.

La expresión "CSF-1R" como se emplea aquí se refiere a CSF-1R humano (SEQ ID No: 31) CSF-1R (sinónimos: receptor CSF-1 receptor M-CSF; Receptor de factor de estímulo de colonia de macrofagos 1, EC 2.7.10.1, Fms proto-oncogén, c-fms, Swiss Prot P07333, CD115, ) se conoce desde 1986 (Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280) . CSF-1R es un factor de crecimiento y codificado por el c-fms proto-oncogén (revisado, por ejemplo en Roth, P. and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67) .

CSF-1R es el receptor para M-CSF (factor de estímulo de colonias de macrofagos, también denominado CSF-1) y media los efectos biológicos de esta citoquina (Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676). La clonación del receptor de factor de estímulo de colonias-1 (también denominado c-fms) se describió por primera vez en Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552. En esta publicación, se mostró que CSF-1R tiene potencial de transformación dependiendo de cambios en la colá C-terminal de la proteína incluyendo la pérdida de la fosforilación de tirosina 969 inhibitoria que liga a Cbl y de esta manera la regulación a la baja del receptor (Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628) .

CSF-1R es una tirosina quinasa de receptor de tránsmembrana (RTK) de una sola cadena y miembro de la familia de motivo de inmunoglobulina (Ig) que contienen RTKs caracterizado por repetidos dominios Ig en la porción extracelular del receptor. El dominio de la proteina tirosina quinasa intracelular se interrumpe por un dominio de inserto único que también está presente en los otros miembros de familia RTK clase III relacionados que incluyen los receptores de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR = Platelet Derived Growth Factor Receptors) , receptor de factor de crecimiento de células madre (c-Kit) y receptor de citoquina tipo fins (FLT3) . A pesar de la homología estructural entre esta familia de receptores de factor de crecimiento, tienen distintas funciones específicas de tejido. CSF-1R primordialmente se expresa en células de linaje monocítico y en la placenta y tracto reproductivo femeninos. Además la expresión de CSF-1R se ha reportado en células de Langerhans en la piel, un sub-conjunto de células de músculo liso (Inaba, T., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 5693-5699), células B (Baker, A.H., et al., Oncogene 8 (1993) 371-378) y . microglia (Sawada, M., et al., Brain Res. 509 (1990) 119-124) .

Como se emplea aquí, la expresión "enlaza a CSF-1R humano" o "que liga a CSF-1R humano o anti-CSF-lR" se emplean en forma intercambiable y se refieren a un anticuerpo que liga específicamente al antígeno CSF-1R humano. La afinidad de enlace es de valor KD de 1.0 x 10"8 mol/1 o menor a 35 °C, de preferencia un valor KD de 1.0 xlO"9 mol/1 o menor a 35°C.

La afinidad de enlace se determina con un ensayo de enlace estándar a 35°C, tal como técnica de resonancia plasmón de superficie (Biacore®) (ver Ejemplo 4.) .

El término "epítopo" denota una proteina determinante capaz de ligar específicamente a un anticuerpo.

Epitopos usualmente consisten de agrupamientos de superficie activa químicamente de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales azúcar y usualmente . epitopos tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Epitopos de conformación y sin conformación se distinguen porque el enlace a los primeros pero no a los últimos se pierde en la presencia de solventes de desnaturalización. De preferencia, un anticuerpo de acuerdo con la invención liga específicamente a CSF-1R nativo pero no al desnaturalizado.

El término "el enlace al mismo epítopo que el anticuerpo depositado DSM ACC2922" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo anti-CSF-lR de la invención que liga al mismo epítopo que CSF-1R al cual el anticuerpo <CSF-1R>7H5.2G10 (número de depósito DSM ACC2922) se liga. La propiedad de enlace de epítopo de un anticuerpo anti-CSF-lR de la presente invención puede determinarse utilizando técnicas conocidas en la especialidad. El anticuerpo CSF-1R se mide por Resonancia Plasmón de Superficie (SPR = Surface Plasmón Resonance) a 25°C en un ensayo de inhibición de enlace competitivo in vitro para determinar la capacidad del anticuerpo de prueba para inhibir enlace del anticuerpo <CSF-1R>7H5.2G10 (número de depósito DSM ACC2922) a CSF-1R. Esto puede ser investigado por un ensayo BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) tal como en el Ejemplo 5. En el Ejemplo 5, el por ciento (%) de respuesta de enlace esperada del anticuerpo CSF-1R de la invención que compite con el enlace del anticuerpo <CSF-1R>7H5.2G10 (número de depósito DSM ACC2922) se calcula por "100 * relativeResponse (general_stability_early) / rMax", en donde rMax se calcula por "relativeResponse (general_stability_late) * peso molecular de anticuerpo / peso molecular de antigeno" como se describe en las instrucciones de cartografía de epítopo de ensayo BIAcore. Una respuesta de enlace mínimo también se calcula a partir de los pares de anticuerpos idénticos 1 y 2 (ver Ejemplo 5) . Por lo tanto, el valor máximo obtenido + 50% se ajusta como umbral para competencia significante y de esta manera enlace significante al mismo epítopo (ver Ejemplo 5 para anticuerpo <CSF-1R>7H5.2G10 umbral calculado es 7+3.5= 10.5) . De esta manera, un enlace de anticuerpo a CSF-lR humano, caracterizado por "enlace al mismo epítopo que <CSF-1R>7H5.2G10 (número de depósito DSM ACC2922)" tiene un porcentaje (%) de respuesta de enlace esperada menor a 10.5 (% de respuesta de enlace esperado < 10.5) .

En un aspecto, los anticuerpos de acuerdo con la invención compiten con el anticuerpo depositado DSM ACC2922 para ligar a CSF-1R humano. Esta competencia de enlace puede ser determinada utilizando técnicas conocidas en la especialidad. El anticuerpo CSF-1R se mide a 25°C por Resonancia Plasmón de Superficie (SPR = Surface Plasmon Resonance) en un ensayo de inhibición de enlace competitivo in vitro para determinar la capacidad del anticuerpo de prueba para inhibir enlace del anticuerpo <CSF-1R>7H5.2G10 (depósito número DSM ACC2922) a CSF-1R humano. Esto puede ser investigado por un ensayo BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) como en el Ejemplo 5.

El "dominio variable"- (dominio variable de . una cadena ligera (VL) , dominio variable de una cadena pesada (VH) ) como se emplea aquí, denota cada uno del par de dominios de cadena ligera y variable que están involucrados directamente en el enlace del anticuerpo al antigeno. Los dominios variables de cadena ligera y pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias se conservan ampliamente, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones de determinación de complementariedad, CDRs) . Las regiones marco adoptan una conformación de hoja ß y las CDRs pueden formar bucles que conectan la estructura de hoja ß. Las CDRs en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional por las regiones marco y forman en conjunto con CDRs de la otra cadena el sitio de enlace de antigeno. Las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo juegan un papel importante particularmente en la especificidad/afinidad de enlace de los anticuerpos de acuerdo con la invención y por lo tanto proporcionan un objeto adicional de la invención.

El término "porción de enlace de antigeno de . un anticuerpo", cuando se emplea aqui, se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables por el enlace de antigeno. La porción de enlace de antigeno de un anticuerpo comprende residuos aminoácidos de las "regiones de determinación de complementariedad" o. "CDRs". Regiones "marco" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como aqui se define. Por lo tanto, los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo comprenden del extremo N a C los dominios FR1 , CDR1, FR2, CDR2 , FR3, CDR3, y FR . Especialmente, CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más al enlace de antigeno y define las propiedades del anticuerpo. Regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat, E., A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable".

Las expresiones "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico", como se emplean aquí, se pretende que incluyen moléculas de A.DN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o doble hebra, pero de preferencia es ADN de doble hebra.

El término "aminoácido" como se emplea aquí dentro de esta solicitud, denota el grupo de carboxi a-aminoácidos de origen natural que comprende alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R) , asparagina (asn, N) , ácido aspártico (asp, D) , cisteina (cys, C) , glutamina (gln, Q) , ácido glutámico (glu, E) , glicina (gly, G) , histidina (his, H) , isoleucina (ile, I), leucina (leu, L) , lisina (lys, K) , metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F) , prolina (pro, P) , serina (ser, S) , treonina (thr, T) , triptófano (trp, W) , tirosina (tyr, Y) , y valina (val, V) .

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero no limitado a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Mamíferos incluyen pero no están limitados a animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos) , conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En ciertas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha separado de un componente de su ambiente natural. En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica a más de 95% o 99% de pureza como se determina por ejemplo en forma electroforática (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoqué isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatográfico (por ejemplo, HPLC de fase inversa o intercambio de iones). Para revisar métodos de evaluación de pureza de anticuerpos, ver, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Cualquier ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente en forma extracromosomal o en una ubicación cromosomal que es diferente de su ubicación cromosomal natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un ' anticuerpo anti-CSF-lR" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o sus fragmentos) , incluyendo estas moléculas de ácido nucleico en un solo vector o vectores separados, y ésta o estas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedera.

"Anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con estructuras variantes. Por ejemplo, anticuerpos IgG nativos son glicoproteinas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas gue se enlazan a disulfuro. Del extremo N a C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) , también denominada un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguidos por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). Similarmente del extremo N a C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL) , también denominada un dominio ligero variable o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo puede ser asignada a uno de dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?) , con base en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

La expresión "inserto de empague" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos, que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia y combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos.

"Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el por ciento de residuos aminoácidos en una secuencia candidato que son idénticos a los residuos aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario para lograr el por ciento de identidad de secuencia máximo y no considerando ningunas substituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar por ciento de identidad de secuencias de aminoácidos puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la técnica, por ejemplo utilizando un programa de computadora disponible al público tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos con destreza en la especialidad pueden determinar parámetros apropiados para alineación de secuencias, incluyendo cualesquiera algoritmos requeridos para lograr máximo alineamiento sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los presentes propósitos, sin embargo valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2 tuvo como autor Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A., Washington D.C., 20559, en donde está registrado bajo el Registro de Derechos de Autor de los E.U.A. Número TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede ser compilado del código fuente. El programa ALIGN-2 deberá ser compilado para utilizar en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a, con o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que en forma alterna puede redactarse como una secuencia de aminoácidos A determinada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos aminoácidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia ALIGN-2 en ese alineamiento de programa de A y B, y en . donde Y es el número total de residuos aminoácido en B. Se apreciará que cuando la longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencias de aminoácidos de B a A. a menos que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de % de identidad de secuencias de aminoácidos aquí se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2.

II. Composiciones y Métodos En un aspecto, la invención se basa en parte en el mismo epítopo que el anticuerpo depositado DSM ACC2922. Anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo para el diagnóstico o tratamiento de cáncer, de enfermedades inflamatorias o de pérdida de huesos; o para la prevención o tratamiento de metástasis.

Anticuerpos Anti-CSF-1R Ejemplares En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que ligan a CSF-1R humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CSF-lR se caracteriza por ligar al mismo epítopo que el anticuerpo depositado DSM ACC2922.

Otro aspecto de la invención es un enlace de anticuerpo a CSF-1R humano, caracterizado porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 3, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 6, o b) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 9, una región CDR2 de SEQ ID NO: 10, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 12, una región CDR2 de SEQ ID NO: 13, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 14; o c) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 17, una región CDR2 de SEQ ID NO: 18, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 19, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 20, una región CDR2 de SEQ ID NO: 21, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 22; o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de célula T o humanizado, o injertado de CDR de los anticuerpos de a) , b) o c) .

Otro aspecto de la invención es un enlace de anticuerpo a CSF-1R humano, caracterizado porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de' SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 3, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 6, o b) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de · SEQ ID NO: 9, una región CDR2 de SEQ ID NO: 10, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 12, una región CDR2 de SEQ ID NO: 13, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 14; o c) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 17, una región CDR2 de SEQ ID NO: 18, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 19, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 20, una región CDR2 de SEQ ID NO: 21, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 22; o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de célula T o humanizado, injertado con CDR de los anticuerpos a) , b) o c) ; y que tiene una o más de las siguientes propiedades (determinado en ensayos como se describe en los Ejemplos 2, 3, 4, 6, 7 y 8) : - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe enlace CSF-1 a CSF-1R con una IC50 de 75 ng/ml o menor en una modalidad con una IC50.de 50 ng/ml o menor; - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe fosforilación CSF-1R inducida por CSF-1 (en células recombinantes NIH3T3- CSF-1R) con una IC50 de 100 ng/ml o menor, en una modalidad con una IC50 de 50 ng/ml o menor; - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe el crecimiento de células NIH3T3 recombinantes que expresan CSF-1R humano (SEQ ID No: 15) en 80% o más (en comparación con la ausencia de anticuerpo), de preferencia en 90% o más; - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe el crecimiento de células del tumor. BeWo (ATCC CCL-98) en 70% o más (a una concentración de anticuerpo de 10 g/ml; y como se compara con la ausencia de anticuerpo), de preferencia 80% o más; - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe diferenciación de macrófagos. (En una modalidad el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe la supervivencia de monocitos con una IC50 de 1.5 nM o menor, de preferencia con una IC50 de 1.0 nM o menor); o - el anticuerpo anti-CSF-lR liga a CSF-1R humano con una afinidad de enlace de KD = 2.0 x 10"9 mol/1 o menor a 35°C.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-CSF-lR de acuerdo con la invención comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) a) una CDR1H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica. a, o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuo aminoácido respecto a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 19, b) un CDR2H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuo aminoácidos respecto a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 18, y c) una CDR3H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuo aminoácidos respecto a SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:17.

En ciertas modalidades, una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) comprende a) una CDR1H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 19, b) una CDR2H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:10 o SEQ ID N0:18, y c) una CDR3H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 17, contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-CSF-lR que comprende esa secuencia retiene la capacidad para ligar a CSF-1R.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-CSF-lR de acuerdo con la invención comprende la secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) a) una CDR1L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 22, b) una CDR2L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 21, y c) una CDR3L QUE tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:12 o SEQ ID NO:20.

En ciertas modalidades, una secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende a) una CDR1L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 22, b) una CDR2L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID N0:21, y c) una CDR3L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: , SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO:20, contienen sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) , inserciones o deleciones respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-CSF-lR que comprende esta secuencia retiene la capacidad por ligar a CSF-1R.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-CSF-lR de acuerdo con la invención - comprende en la secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) a) una CDR1H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 3, b) una CDR2H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 2, y c) una CDR3H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID N0:1, y comprende en la secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) d) una CDR1L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 6, e) una CDR2L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 5, y f) una CDR3L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: ; o - comprende en la secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) a) una CDR1H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuo de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 11, b) una CDR2H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 10, y c) una CDR3H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 9, y comprende en la secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) d) una CDR1L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID N0:14, e) una CDR2L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 13, y f) una CDR3L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 12; o - comprende en la secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) a) una CDR1H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 19, b) una CDR2H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 18, y c) una CDR3H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos- respecto a SEQ ID NO: 17, y comprende en la secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) d) una CDR1L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de. residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 22, e) una CDR2L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 21, y f) una CDR3L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO:20.

- En otro aspecto, un anticuerpo anti-CSF-lR de acuerdo con la invención - comprende en la secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) a) una CDR1H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 3, b) una CDR2H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 2, y c) una CDR3H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO:l, y comprende en la secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) d) una CDR1L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2 , o 3 sustituciones de residuos aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 6, e) una CDR2L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 5, y f) una CDR3L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: ; o - comprende la secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) a) una CDR1H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos aminoácidos respecto a SEQ ID NO:ll, b) una CDR2H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 10, y c) una CDR3H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 9, y que comprende la secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) d) una CDR1L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de. aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 14, e) una CDR2L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 13, y f) una CDR3L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 12; o - comprende la · secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) a) una CDR1H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 19, b) una CDR2H tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 18, y c) una CDR3H que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácido respecto a SEQ ID NO: 17, y que comprende la secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) d) una CDR1L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 22, e) una CDR2L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 .sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 21, y f) una CDR3L que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1, 2, o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos respecto a SEQ ID NO: 20; y que el anticuerpo anti-CSF-lR tiene una o más de las siguientes propiedades (determinarse los ensayos como se describe en los Ejemplos 2, 3, 4, 6, 7 y 8) : - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe enlace de CSF-1 a CSF-1R con una IC50 de 75 ng/ml o menor, en una modalidad con una IC50 de 50 ng/ml o menor; - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe fosforilación CSF-1R inducida por CSF-1 (en células recombinantes NIH3T3-CSF-1R) con una IC50 de 100 ng/ml o menor, en una modalidad con una IC50 de 50 ng/ml o menor; - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe el crecimiento de células NIH3T3 recombinantes que expresan CSF-1R humano (SEQ ID No: 15) en 80% o más (en comparación con la ausencia de anticuerpo), de preferencia en 90% o más; - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe el crecimiento de células de tumor Be o (ATCC CCL-98) en 70% o más (a una concentración de anticuerpo de 10 pg/ml; cómo se compara a la ausencia de anticuerpo), de preferencia en 80% o más; - el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe diferenciación de macrófagos. (En una modalidad, el anticuerpo anti-CSF-lR inhibe la supervivencia de monocitos con una IC50 de 1.5 nM o menor, de preferencia con una IC50 de 1.0 nM o menor); o - el anticuerpo anti-CSF-lR liga a CSF-1R humano con una afinidad de enlace de KD = 2.0 x 10"9 mol/1 o menor a 35°C.

Métodos y Composiciones Recombinantes Los anticuerpos de acuerdo con la invención de preferencia se producen por medios recombinantes. Estos métodos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y comprenden expresión de proteínas en células procarióticas y eucarióticas con aislamiento subsecuente del polipéptido de anticuerpo y usualmente purificación a una pureza farmacéutica aceptable. Para la expresión de proteínas ácidos nucleicos que codifican cadenas ligeras y pesadas o sus fragmentos se insertan en vectores de expresión por métodos estándar. La expresión se realiza en células hospederas procarióticas o eucarióticas apropiadas, tales como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, levadura o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (del sobrenadante o después de la lisis celular) .

Producción recombinante de anticuerpos es bien conocida en el estado de la técnica y descrita por ejemplo en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, s., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Los anticuerpos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. La purificación se realiza a fin de eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, por técnicas estándar incluyendo tratamiento alcalino/SDS , bandeo o formación de bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Ver Ausubel, F. , et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Inter'science, New York (1987).

La expresión en células NS0 se describe por, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Expresión transitoria se describe por, e.g. , Durocher, Y., et al., Nucí. Acids. Res. 30 (2002) E9. Clonación de dominios variables se describe por Orlandi, R., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Cárter, P., et al., Proc. Nati. Acad.. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK 293) se describe por Schlaeger, E.-J., Christensen, K., en Cytotechnology 30 (1999) 71-83, y por Schlaeger, E.-J., in J. Immunol . Methods 194 (1996) 191-199.

Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de enlace de ribosomas. Células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, me oradores y señales de poliadenilación .. Ácido nucleico se "enlaza operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para un líder secretorio o presecuencia se enlaza operativamente con ADN para un polipéptido si se expresa , como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace ribosoma se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si se ubica para facilitar traducción. En general "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en cuadro de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los enlazadores o adaptadores oligonucleótidos sintéticos se emplean de acuerdo con la práctica convencional.

Anticuerpos monoclonales se preparan convenientemente a partir del medio de cultivo por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como por ejemplo proteina A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.. ADN y ARN que codifican los anticuerpos monoclonales se aislan y secuencian fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como una fuente de estose ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospederas, tales como células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células hospederas.

Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpo anti-CSF-lR se preparan por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. Estos métodos incluyen pero no están limitados a aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida de sitio) , mutagénesis PCR y mutagénesis de cásete de una variante previamente preparada o una versión no variante de anticuerpo anti-CSF-lR humanizado.

Los dominios variables de cadena pesada y ligera de acuerdo con la invención se combinan con secuencias de promotor, inicio de traducción, región constante, región sin traducción 3', poliadenilación y terminación de transcripción para formar construcciones de vector de expresión. Las construcciones de expresión de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un solo vector, co-transfectarse, transíectarse en serie o transfectarse por separado en células hospederas que después se fusionan para formar una sola célula hospedera que expresa ambas cadenas.

Como se emplea aquí, las expresiones "célula", "linea celular", y "cultivo ' celular" se emplean en forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen progenie. De esta manera, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objetivo primaria y cultivos de ahí derivados sin consideración al número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o accidentales. Se incluye progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica como se criba en la célula originalmente transformada.

La "parte Fe" de un anticuerpo no está involucrada directamente en enlace de un anticuerpo al antigeno, pero exhibe diversas funciones efectoras. Una "parte Fe de un anticuerpo" es un término bien conocido por las personas con destreza y se define en base a la disociación de papaina de anticuerpos. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varios de estos además pueden dividirse en subclases (isotipos) , por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, y IgG4, IgAl, y IgA2. De acuerdo con las regiones constantes de cadena pesada, las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan , d, e, ?, y µ, respectivamente. La parte Fe de un anticuerpo se involucra directamente en citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC = Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC = Complement-Dependent Cytotoxicity) con base en activación del complemento, enlace Clq y enlace de receptor Fe. Activación de complemento (CDC) se inicia al ligar el factor de complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de las subclases de anticuerpo IgG. Mientras que la influencia de un anticuerpo en el sistema de complemento depende de ciertas condiciones, el enlace de Clq se provoca por sitios de enlaces definidos en la parte Fe. Éstos sitios de enlaces se conocen en el estado de la técnica y se describen por ejemplo por Boakle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R. , Cenbra, J. , J. , Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol . 37 (200.0) 995-1004, Idusogie, E.E., et al., J. Immunol .164 (2000) 4178-4184, Hezareh, . , et al . , J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0307434. Estos sitios de enlaces son e.g. L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat, E.A., ver a continuación) . Anticuerpos de subclases IgGl, IgG2 y IgG3 usualmente muestran activación del complemento y enlace Clq y C3, mientras que IgG4 no activa el sistema de complemento y no liga a Clq y C3.

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende una parte Fe derivada de origen humano y de preferencia todas las otras partes de las regiones constantes humanas. Como se emplea aquí, el término "parte Fe derivada de origen humano" denota una parte Fe que ya es una parte Fe de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4, de preferencia una parte Fe de la subclase IgGl humana, una parte Fe mutada de la subclase IgGl humana (de preferencia con una mutación en L234A + L235A) , una parte Fe de la subclase IgG4 humana o una parte Fe mutada de la subclase IgG4 humana (de preferencia con una mutación en S228P) . Más se prefieren las regiones constantes de cadena pesada humana de SEQ ID NO: 27 (subclase IgGl humana), SEQ ID NO: 28 (subclase IgGl humana con mutaciones L234A y L235A) , SEQ ID NO:29 subclase IgG4 humana), o SEQ ID NO:30 (subclase IgG4 humana con mutación S228P) .

En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la invención se caracteriza porque las cadenas constantes son de origen humano. Estas- cadenas constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y por ejemplo se describen Kabat, E.A., (ver por ejemplo Johnson, G., Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Por ejemplo, una región constante de cadena pesada humana útil comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana útil comprende una secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa de SEQ ID NO: 26. Además se prefiere que el anticuerpo sea de origen de ratón y comprende el cuadro o marco de secuencia variable de anticuerpo de un anticuerpo de ratón de acuerdo con Kabat.

Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconj ugados que comprenden un anticuerpo anti-CSF-lR aquí conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterapéuticos ó fármacos, agentes inhibidores de crecimiento, toxinas (por ejemplo, proteina toxinas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, o sus fragmentos), o isótopos radioactivos.

En una modalidad, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC = Antibody-Drug Conjúgate) en donde un anticuerpo se conjuga con uno o más fármacos, incluyendo pero no limitados a un maitansinoide (ver las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 Bl) ; una auristatina tal como porciones de fármacos monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (ver Patente de los E.U.A. Nos. 5,635,483 y 5,780,588, y 7,498,298); una dolastatina ; una calicheamicina o su derivado (ver Patente de los E.U.A. Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, y 5,877,296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorubicina (ver Kratz et al., Current ed. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16': 358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj . Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la Patente de los E.U.A. No. 6,630,579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe aquí, conjugado con una toxina enzimáticamente activa o su fragmento, que incluye pero no está limitado a cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos .

En otra modalidad, un inmunoconj ugado comprende un anticuerpo como se describe aquí, conjugado a un átomo radioactivo para formar un radio conjugado. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de radio conjugados. Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el radio conjugado se emplea para detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gamma gráficos, por ejemplo tc99m o 1123, o una etiqueta espín para formación de imagen por resonancia magnética nuclear (RMN (N R = Nuclear Magnetic Resonance) ) (también conocidas como formación de imagen por resonancia magnética, mri = Magnetic Resonance Imaging) , tales como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Conjugados de un anticuerpo y agente cito tóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteina bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (S CC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HC1) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, -dinitrobenzeno) . Por ejemplo, una inmunotoxina resina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminapentaacético etiquetado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radio nucleótido al anticuerpo. Ver WO 94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador disociable" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede emplearse. un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); Patente de los E.U.A. No. 5,208,020) .

Los inmunocon ugados o ADCs aquí contemplan están expresamente, pero no limitados a estos conjugados preparados con reactivos entrelazadores , incluyendo pero no limitados a BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SLA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS , sulfo- MBS , sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S. A) .

Composiciones y Métodos Terapéuticos La invención comprende un método para el tratamiento de un paciente que requiere terapia, caracterizado por administrar al .paciente una cantidad terapéutica efectiva de un anticuerpo de acuerdo con la invención .

La invención comprende el uso para terapia de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Una modalidad preferida de la invención son los anticuerpos CSF-1R de la presente invención para utilizar en el tratamiento de "enfermedades mediadas por CSF-1R" o los anticuerpos CSF-1R de la presente invención para utilizar en la fabricación de un medicamento en el tratamiento de "enfermedades mediadas por CSF-1R", que puede describirse como sigue: Hay 3 mecanismos distintos con los cuales la señalización CSF-1R probablemente está involucrada en crecimiento de tumor en metástasis. Lo primero es que la expresión de ligando CSF y el receptor se ha encontrado en células de tumor que se originan en el sistema reproductivo femenino (mamas, ovarios, endometrio, cervical) (Scholl, S.M., et al., J. Nati. Cáncer Inst. 86 (1994) 120-126; Kacinski, B.M., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 71-74; Ngan, H.Y., et al., Eur. J. Cáncer 35 (1999) 1546-1550; Kirma, N . , et al., Cáncer Res 67 (2007) 1918-1926) y la expresión se ha asociado con crecimiento de xenoinjerto de cáncer de mama asi como un pronóstico pobre en pacientes con cáncer de mama. Dos mutaciones punto se vieron en pacientes de CSF-1R en aproximadamente 10-20% de leucemia mielocitica aguda, leucemia mielocitica crónica y mielodisplasia probados en un estudio, y una de las mutaciones se encontró que interrumpe el recambio o renovación de receptor (Ridge, S.A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 87 (1990) 1377-1380). Sin embargo, la incidencia de la mutación no puede ser confirmada en estudios posteriores (Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470). También se encontraron mutaciones en algunos casos de cáncer hepatocelular (Yang, D.H., et al., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3 (2004) 86-89) y mielo fibrosis idiopática (Abu-Duhier, F. , M. , et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470).

Sinovitis Vilonodular Pigmentada (PVNS = Pigmented villonodular synovitis) y Tumores de Células Gigantes Tenosinoviales (TGCT = Tenosynovial Giant Cell Tumors) pueden ocurrir como resultado de una translocación que fusiona el gen M-CSF a un gen colágeno COL6A3 y resulta en sobreexpresión de M-CSF (West, R.B., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103 (2006) 690-695). Un efecto.de paisaje se propone para ser responsable por la masa de tumor resultante que consiste de células monociticas atraídas por células que expresan M-CSF. TGCTs son tumores más pequeños que pueden ser retirados en forma relativamente fácil de los dedos en donde primordialmente ocurren. PVNS es más agresivo ya qué puede recurrir en grandes articulaciones y no se controla fácilmente en forma quirúrgica.

El segundo mecanismo se basa en bloquear señalización a través de M-CSF/CSF-1R en sitios metastásicos en hueso, que induce osteoclastogenesis, resorción de huesos y lesiones de huesos osteolíticas . Cánceres de mama, mieloma múltiple y pulmonares son ejemplos de cánceres que se han encontrado someten a metástasis al hueso y provocan enfermedad de huesos osteolítica resultando en complicaciones esqueléticas. M-CSF libera células de tumor y estroma induce la diferenciación de progenitores de monocitos mieloides hematopoyéticos para madurar osteoclastos en colaboración con activador de receptor de factor nuclear kappa-ligando B-RANKL. Durante este proceso, M-CSF actúa como un factor permisivo al enviar la señal de supervivencia a los osteoclastos (Tanata, S., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 257-263) . Inhibición de la actividad CSF-1R durante diferenciación y maduración de osteoclastos con un anticuerpo anti-CSF-lR probablemente evitará actividad desbalanceada de osteoclastos que provocan enfermedad osteolitica y los eventos relacionados esqueléticos asociados en enfermedad metastásica. Mientras que el cáncer de mama, pulmonar y de mieloma múltiple, típicamente resulta en lesiones osteoliticas , metástasis al hueso en cáncer de próstata inicialmente tienen una apariencia osteoblástica en donde la actividad formadora de huesos incrementada resulta en "hueso tejido" que es diferente de la estructura laminar típica de hueso normal. Durante el progreso de la enfermedad las lesiones de huesos exhiben un componente osteolítico significante así como altos niveles en suero de resorción de huesos y sugiere que puede ser útil terapia de antiresorción. Bisfosfonatos se han mostrado que inhiben la formación de lesiones osteoliticas y reduce el número de eventos relacionados al esqueleto solo en hombres con cáncer de próstata metastásica refractaria de hormona pero en este punto su efecto en lesiones osteoblásticas es controversial y los bisfosfonatos no han sido benéficos para evitar metástasis de huesos o cáncer de próstata en respuesta a hormonas hasta la fecha. El efecto de agentes anti-resorción en cáncer de próstata osteolitico/osteoblástico mixto todavía se estudia en la clínica (Choueiri, M.B., et al., Cáncer Metástasis Rev. 25 (2006) 601-609; Vessella, R.L. and Corey, E . , Clin. Cáncer Res. 12 (20 Pt 2) (2006) 6285s-6290s) .

El tercer mecanismo se basa en la reciente observación de que macrófagos asociados con tumor (TAM = Tumor Associated Macrophages) que se encuentran en tumores sólidos de cánceres de mama, próstata, ovarios y cervicales se correlacionan con un pronóstico pobre (Bingle, L. , et al . , J. Pathol. 196 (2002) 254-265; Pollard, J.W., Nat . Rev. Cáncer 4 (2004) 71-78). Macrófagos son reclutados al tumor por M-CSF y otras quimiocinas. Los macrófagos pueden entonces contribuir a progreso de tumor a través de la secreción de factores angiogénicos , proteasas y otros factores de crecimiento y citoquinas y pueden ser bloqueados por inhibición de señalización de CSF-1R. Recientemente, se ha mostrado por Zins, K., et al., Cáncer Res. 67 (2007) 1038-1045) que la expresión de siRNA del factor de necrosis de Tumor alfa (TNF alfa) , M-CSF o la combinación de ambos reducirá crecimiento de tumor en un modelo de xenoinjerto entre 34% y 50% después de inyección intratumoral del respectivo siRNA. Hacer blanco de SiRNA al TNF alfa secretado por células S 620 humanas reduce niveles de M-CSF en ratón, y lleva a la reducción de raacrofagos en el tumor. Además del tratamiento de xenoinjertos de tumor MCF7 con un fragmento de enlace de antigeno dirigido contra M-CSF resulta en 40% de inhibición de crecimiento de tumor, invierte la resistencia a agentes guimioterapéuticos y mejora la supervivencia de los ratones cuando se da en combinación con agentes guimioterapéuticos (Paulus, P., et al., Cáncer Res. 66 (2006) 4349-4356) .

TAMs son solo un ejemplo de un enlace emergente entre inflamación crónica y cáncer. Hay evidencia adicional por un enlace entre inflamación y cáncer ya que muchas enfermedades crónicas están asociadas con riesgo incrementado de cáncer, cánceres surgen en sitios de inflamación crónica, mediadores químicos de inflamación se encuentran en muchos cánceres; deleción de los mediadores celulares o químicos de la inflamación inhibe desarrollo de' cánceres experimentales y uso a largo plazo de agentes anti-inflamatorios reduce el riesgo de algunos cánceres. Un enlace con cáncer existe por una cantidad de condiciones inflamatorias entre aquellas gastritis inducida por H.pylori para cánceres gástricos, Esquistosomiasis para cáncer de vejiga, HHVX para sarcoma de Kaposi, endometriosis para cáncer de ovarios y prostatitis para cáncer de próstata (Balkwill, F., et al., Cáncer Cell 7 (2005) 211-217) . Macrófagos son células clave en- inflamación crónica y responden en forma diferencial a su microambiente .

Hay dos tipos de macrófagos que se consideran extremos en un continuo de estados funcionales: macrófagos MI están involucrados en reacciones Tipo 1. Estas reacciones involucran la activación de productos microbianos y consecuente exterminio de microorganismos patogénicos que resulta en intermediarios de oxigeno reactivo. En la otra parte del extremo están macrófagos M2 involucrados en reacciones Tipo 2 que promueven proliferación celular, ajuste de inflamación e inmunidad adaptiva y promueven remodelación de tejido, angiogénesis y reparación (Mantovani, A., et al., Trends Immunol. 25 (2004) 677-686). Inflamación crónica que resulta en neoplasia establecida, usualmente se asocia con macrófagos M2. Una citoquina pivotal que media reacciones inflamatorias es TNF alfa que por su nombre puede estimular inmunidad anti-tumor y necrosis hemorrágica con altas dosis pero también recientemente se ha encontrado que se expresa por células de tumor y actúa como un promotor de tumor (Zins, . , et al., Cáncer Res'. 67 (2007) 1038-1045; Balkwill, F. , Cáncer Metástasis Rev. 25 (2006) 409-416) . El papel especifico de los macrófagos respecto al tumor todavía requiere ser mejor comprendido incluyendo la dependencia temporal y espacial potencial en su función y la relevancia a tipos de tumores específicos.

De esta manera una modalidad de la invención son los anticuerpos CSF-IR de la presente invención para utilizar en tratamiento de cáncer. El término "cáncer" como se emplea aquí, puede ser por ejemplo cáncer pulmonar, cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCL = Non Small Cell Lung) , cáncer pulmonar de células bronquioloalveolares, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer del estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de la cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides , cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido suave, cáncer de uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis rénal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasmas del sistema nervioso central SNC (CNS = Central Nervous System) , tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas , meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario, linfoma, leucemia linfocitica, incluyendo versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. De preferencia, este cáncer es un cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer cervical, cáncer pulmonar o cáncer de próstata. De preferencia, estos cánceres además se caracterizan por expresión o sobreexpresión de CSF-1 o CSF-IR. Una modalidad adicional de la invención son los anticuerpos CSF-IR de la presente invención para utilizar en el tratamiento simultáneo de tumores primarios y nuevas metástasis.

De esta manera, otra modalidad de la invención son los anticuerpos CSF-IR de la presente invención para utilizar en el tratamiento de periodontitis , histiocitosis X, osteoporosis , enfermedad de huesos de Paget¦ (PDB = Paget ' s Disease of Bone) , pérdida de huesos debido a terapia de cáncer, osteolisis periprostética, osteoporosis inducida por glucocorticoides, artritis reumatoide, artritis psirática, osteoartritis , artritis inflamatorias, e inflamación.

Rabello, D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 347 (2006) 791-796 ha demostrado que SNPs en el gen CSF1 exhibe una asociación positiva con periodontitis agresiva: una enfermedad inflamatoria de los tejidos periodontales que provoca pérdida de dientes debido a la resorción del hueso alveolar.

Histiocitosis X (también denominada histiocitosis de célula de Langerhans, LCH = Langerhans Cell Histiocytosis) es una enfermedad proliferativa de células dendríticas de Langerhans que parecen diferenciar en osteoclastos en hueso y lesiones LCH extraóseas. Las células de Langerhans se derivan de monocitos en circulación. Se encontró que los niveles incrementados de M-CSF que se han medido en suero y lesiones se correlacionan con la severidad de la enfermedad (da Costa, CE., et al., J. Exp. Med. 201 (2005) 687-693). La enfermedad ocurre primordialmente en una población de pacientes pediátricos y debe tratarse con quimioterapia cuando la enfermedad se vuelve sistémica o recurrente.

La patofisiologia de osteoporosis está mediada por pérdida de huesos formando osteoblastos e incrementada resorción de huesos dependiente de osteoclastos. Datos, de soporte se han descrito por Cenci et al mostrando que una inyección de anticuerpo anti-M-CSF conserva la densidad de huesos e inhibe resorción de huesos en ratones ovariectomizados (Cenci, S., et al., J. Clin. Invest.- 105 (2000) 1279-1287). Recientemente, un enlace potencial entre pérdida de huesos postmenopáusica debido a deficiencia de estrógenos se identificó y encontró que la presencia de TNF alfa produce metabolismo de huesos afectado por células T (Roggia, C, et al., Minerva Med. 95 (2004) 125-132). Un mecanismo posible puede ser inducción de M-CSF por TNF alfa in vivo. Un papel importante para M-CSF en osteoclastogenesis inducida por TNF-alfa se confirma por el efecto de un anticuerpo dirigido contra M-CSF que bloquea osteólisis inducida por TNF alfa en ratones y de esta manera haciendo inhibidores de señalización CSF-1R blancos potenciales para artritis inflamatoria (Kitaura, H., · et al., J. Clin. Invest. 115 (2005) 3418-3427).

La enfermedad de huesos de Paget (PDB) es el segundo desorden más común del metabolismo de huesos (después de osteoporosis , en donde anormalidades focales de incrementado recambio de huesos lleva a complicaciones tales como dolor de huesos, deformidad, fracturas patológicas y sordera) . Mutaciones en cuatro genes se han identificado que regulan función de osteoclastos normal y predisponen a individuos a PDB y desórdenes relacionados: mutaciones de inserción en TNFRSF11A, que codifica activador de receptor de factor nuclear (NF = Nuclear Factor) kappaB (RANK) - un regulador critico de función de osteoclastos, inactivando mutaciones de TNFRSF11B que codifican osteoprotegerina (un receptor señuelo para ligando RANK) , mutaciones del gen sequestosoma 1 (SQSTM1), que codifica una proteina andamio importante en la ruta NFkappaB y mutaciones en el gen proteína que contiene valosina (VCP = Valosin-Containing Protein) . Este gen codifica VCP, que tiene un papel en diana del inhibidor de NFkappaB para degradación por el proteasoma (Daroszewska, A., Ralston, S.H., Nat . Clin. Pract . Rheumatol . 2 (2006) 270-277) . Inhibidores CSF-1R dirigidos proporcionan una oportunidad para bloquear la desregulación de señalización RANKL indirectamente y agregar una opción de tratamiento adicional a los bisfosfonatos actualmente empleados .

Pérdida de huesos inducida por terapia de cáncer especialmente en pacientes de cáncer de mama y próstata es una indicación adicional en donde un inhibidor CSF-1R dirigido puede evitar pérdida de huesos (Lester, J.E., et al., Br. J. Cáncer 94 (2006) 30-35). Con pronóstico mejorado para cáncer de mama temprano, las consecuencias de largo plazo de las terapias adyuvantes se vuelven más importantes ya que algunas dé las terapias incluyendo quimioterapia, irradiación, inhibidores de aromatasa y ablación de ovarios afectan el metabolismo de huesos al disminuir la densidad de minerales en huesos, resultando en riesgo incrementado de osteoporosis y fracturas asociadas (Lester, J.E., et al., Br. J. Cáncer 94 (2006) 30-35) . El equivalente a terapia de inhibidor de aromatasa adyuvante en cáncer de mama es terapia de ablación de andrógenos en cáncer de próstata lo que lleva a pérdida de densidad de minerales en huesos e incrementa significativamente el riesgo de fracturas relacionadas a osteoporosis (Stoch, S.A., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001) 2787-2791).

Inhibición dirigida de señalización CSF-1R probablemente será benéfica en otras indicaciones al igual que cuando tipos de células dirigidos incluyen osteoclastos y macrófagos, por ejemplo tratamiento de complicaciones específicas en respuesta a reemplazo de articulaciones como consecuencia de artritis reumatoide. Falla de implante debido a pérdida de huesos periprostética y consecuente pérdida de prótesis es una complicación mayor de reemplazo de articulaciones y requiere cirugía repetida con altas cargas socioeconómicas para el paciente individual y el sistema de cuidado de salud. Hasta la fecha, no hay terapia de fármacos aprobada para evitar o inhibir osteólisis periprostética (Drees, P., et al., Nat . Clin. Pract. Rheumatol. 3 (2007) 165-171) .

Osteoporosis inducida por glucocorticoides (GIOP = Glucocorticoid-Induced Osteoporosis) es otra indicación en donde un inhibidor CSF-1R puede evitar pérdida de huesos después de uso de glucocorticosteroides a largo plazo que se da como resultado de diversas condiciones entre aquellas de enfermedad obstructiva crónica, asma y artritis reumatoide (Guzman-Clark, J.R., et al., Arthritis Rheum. 57 (2007) 140-146; Feldstein, A.C., et al., Osteoporos. Int. 16 (2005) 2168-2174) .

Artritis reumatoide, artritis psoriásica y artritis inflamatorias por sí mismos son indicaciones potenciales para inhibidores de señalización CSF-1R ya que consisten de un componente macrófago y en un grado variante de destrucción de huesos (Ritchlin, C.T., et al., J. Clin. Invest. 111 (2003) 821-831) . Osteoartritis y artritis reumatoide son enfermedades autoinmunes inflamatorias provocadas por la acumulación de macrofagos en el tejido conectivo e infiltración de macrofagos en el fluido sinovial, que al menos está mediada parcialmente por M-CSF. Campbell, I.K., et al., J. Leukoc. Biol. 68 (2000) 144-150, demuestra que M-CSF se produce por células de tejido de articulación humana (condrocitos, fibroblastos sinoviales) in vitro y se encuentra en fluido sinovial de pacientes' con artritis reumatoide, sugiriendo que contribuye a proliferación de tejido sinovial e infiltración de macrofagos asociada con la patogénesis de la enfermedad. Inhibición de señalización CSF-1R probablemente controla el número de macrofagos en la articulación y alivia el dolor de la destrucción de huesos asociada. A fin de reducir al mínimo efectos adversos y comprender adicionalmente el impacto de señalización CSF-1R en estas indicaciones, un método es inhibir específicamente CSF-1R sin hacer blanco en una miríada de otras quinasas tales como Raf quinasa.

Recientes reportes en la literatura correlacionan incrementada circulación de M-CSF con pronóstico deficiente y progreso de arterioesclerosis en enfermedad de arteria coronaria crónica (Saitoh, T., et al., J. Am. Coll. Cardiol. 35 (2000) 655-665; Ikonomidis, I., et al., Eur . Heart. J. 26 (2005) 1618-1624); M-CSF influencia el proceso de aterosclerosis al ayudar la formación de células de espuma (macrófagos con LDL oxidado ingerido) que expresa CSF-1R y representa la placa inicial (Murayama, T., et al., Circulation 99 (1999) 1740-1746).

Expresión y señalización de M-CSF y CSF-1R se encuentra en microglia activadas. Microglia, que son macrófagos residentes del sistema nervioso central puede activarse por diversos insultos, incluyendo infección y lesión traumática. M-CSF se considera un regulador clave de respuestas inflamatorias en el cerebro y aumento en nivel de M-CSF en HIV-1, encefalitis, enfermedad de Alzheimer (AD = Alzheimer's Disease) · y tumores del cerebro. Microgliosis como consecuencia de señalización autócrina por M-CSF/CSF-1R resulta en inducción de citoquinas inflamatorias y óxidos nítricos liberados como se demuestra por ejemplo utilizando un modelo de daño neuronal experimental (Hao, A.J., et al., Neuroscience 112 (2002) 889-900; Murphy, G.M., Jr., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 20967-20971). Microglia que tiene expresión incrementada de CSF-1R se encuentra que circundan placas en AD y la proteína precursora amiloide V717F del modelo de ratón transgénico de AD (Murphy, G.M., Jr. , et al., Am. J. Pathol. 157 (2000) 895-904). Por otra parte, ratones op/op con menos microglia en el cerebro, resultan en deposición fibrilar de A-beta y pérdida neuronal en comparación con control normal sugiriendo que microglia tienen una función neuroprotectora en el desarrollo de AD que carece en el ratón op/op (Kaku, ., et al., Brain Res. Brain Res. Protoc. 12 (2003) 104-108).

Expresión y señalización de M-CSF y CSF-lR se asocian con enfermedad intestinal inflamatoria (IBD = Inflammatory Bowel Disease) (WO 2005/046657) . La expresión "enfermedad intestinal inflamatoria" se refiere a desórdenes serios, crónicos del tracto intestinal caracterizados por inflamación crónica en varios sitios en el tracto gastrointestinal e incluyen específicamente colitis ulcerativa (UC = Ulcerative Colitis) y enfermedad de Crohn.

La invención se caracteriza porque comprende el enlace de anticuerpo con CSF-lR humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epítopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de cáncer.

La invención se caracteriza porque comprende el enlace de anticuerpo con CSF-lR humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epítopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de pérdida de huesos .

La invención se caracteriza porque comprende el enlace de anticuerpo con CSF-IR humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas para la prevención o tratamiento de metástasis.

La invención se caracteriza porque comprende el enlace de anticuerpo con CSF-IR humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias .

La invención se caracteriza porque comprende el enlace de anticuerpo con CSF-IR humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de cáncer o en forma alterna para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

La invención se caracteriza porque comprende el enlace de anticuerpo con CSF-IR humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por la secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas para el tratamiento de pérdida de huesos y en forma alterna para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pérdida de huesos.

La invención comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-IR humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por la secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para la prevención o tratamiento de metástasis o en forma alterna para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de metástasis.

La invención se* caracteriza porque comprende el enlace de anticuerpo con CSF-IR humano que se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por la secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias .

La invención que comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-IR humano se caracteriza por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas para el tratamiento de cáncer o en forma alterna para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

La invención comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano caracterizado por enlace de epitopo anteriormente mencionado o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas para el tratamiento de pérdida de huesos y en forma alterna para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pérdida de hueso.

La invención comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano caracterizado por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionado o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas para la prevención o tratamiento de metástasis o en forma alterna para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de metástasis.

La invención comprende el uso de un anticuerpo caracterizado porque comprende el anticuerpo que enlaza a CSF-1R humano caracterizado por las propiedades de enlace de epitopo anteriormente mencionadas o en forma alterna por las secuencias de aminoácidos y fragmentos de secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias o en forma alterna para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. En una modalidad, los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben el enlace de CSF-1 a CSF-1R con una IC50 de 75 ng/ml o menor, en una modalidad, con una IC50 de 50 ng/ml o menor. La IC50 de inhibición de CSF-1 que liga a CSF-1R puede determinarse como se muestra en el Ejemplo 2.

En una modalidad, los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben fosforilación CSF-1R inducida por CSF-1 (en células recombinantes NIH3T3-CSF-1R) con una IC50 de 150 ng/ml o menor, en una modalidad, con una IC50 de 100 ng/ml o menor, en una modalidad, con una IC50 de 50 ng/ml o menor, en una modalidad, con una IC50 de 25 ng/ml o menor. La IC50 de fosforilación CFS-1R inducida por CSF-1 puede determinarse como se muestra en el Ejemplo 3.

En una modalidad los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben el crecimiento de células NIH3T3 recombinantes que expresan CSF-1R humano (SEQ ID No: 15) por 80% o más (en comparación con la ausencia de anticuerpo) , de preferencia por 90 % o más. El % de inhibición de crecimiento se determina como se muestra en el Ejemplo 6 en donde el % de supervivencia se mide. Para el % de supervivencia el % de inhibición de crecimiento se calcula como sigue: % de inhibición de crecimiento = 100-% supervivencia. Por ejemplo <CSF-1R>7G5.3B6 muestra una inhibición de crecimiento de células NIH3T3 que expresan CSF-1R humano en peso de 100-2 = 98%.

En una modalidad, los anticuerpos de acuerdo con la invención estimulan el crecimiento de células NIH3T3 recombinantes que expresan mutante humano CSF-1R L301S Y969F (SEQ ID No: 16) en 5% o más (en comparación a la ausencia de anticuerpo), en una modalidad en 20% o más. El % de estimulo de crecimiento se determina como se muestra en el Ejemplo 6 en donde el % de supervivencia se mide. Del % de supervivencia, el % de estimulo de„ crecimiento se calcula como sigue: % de estimulo de crecimiento = - (100-% supervivencia). Por ejemplo <CSF-1R>7G5.3B6 muestra un estimulo de crecimiento de células NIH3T3 que expresan CSF-1R humanos mutantes de -(100-0) = -(100-112)% = +12%.

En una modalidad, los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben el crecimiento de células de tumor BeWo (ATCC CCL-98) en 70 % o más (a una -concentración de anticuerpo de 10 g/ml; y en comparación con la ausencia de anticuerpo), de preferencia en 80% o más. El % de inhibición de crecimiento se determina como se muestra en el Ejemplo 7. Por ejemplo <CSF-1R>7G5.3B6 muestra una inhibición de crecimiento de células de tumor BeWo de 89%.

En una modalidad, los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben diferenciación de macrófagos. En una modalidad, los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben la supervivencia de monocitos con una IC50 de 1.5 n o menor, de preferencia con una IC50 de 1.0 nM o menor. La inhibición de supervivencia de monocitos se determina como se muestra en el Ejemplo 8.

Una modalidad adicional de la invención es un método para la producción de un anticuerpo contra CSF-1R caracterizado porque la secuencia de un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo clase IgGl humano que liga a CSF-1R humano de acuerdo con la invención, el ácido nucleico modificado y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo se insertan en un vector de expresión, el vector se inserta en una célula hospedera eucariótica, la proteina codificada se expresa y recupera de la célula hospedera o del sobrenadante.

Formulaciones Farmacéuticas El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permita la actividad biológica del ingrediente activo ahí contenido sea efectiva y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual se administrará la formulación.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales , o su porción de enlace antigeno, de la presente invención, formulada junto con un portador farmacéutico aceptable.

Un "portador farmacéutico aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente a un ingrediente activo, que no es tóxico a un sujeto. Un portador farmacéutico aceptable incluye pero no está limitado a un amortiguador, excipiente, estabilizante o conservador. Como se emplea aqui, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medio de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y de retraso de absorción/resorción, y semejantes que son fisiológicamente compatibles. De preferencia, el portador es adecuado para inyección o infusión.

Una composición de la presente invención puede administrarse por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. Como se apreciará por una persona con destreza, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

Portadores farmacéuticos aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas , estériles y polvos estériles para la preparación de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de estos medios y agentes para substancias farmacéuticas activas se conoce en la técnica. Además de agua, el portador puede por ejemplo ser una solución de salino amortiguado isotónico.

Independientemente de la ruta de administración selecta, los compuestos de la presente invención, que pueden emplearse en una forma hidratada conveniente y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosis farmacéuticas aceptables por métodos convencionales que se conocen por aquellos con destreza en la especialidad.

Niveles de dosis actuales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden variarse para' obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un particular paciente, composición y modo de administración, sin ser tóxica al paciente (cantidad efectiva) . El nivel de dosis selecto dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, su sal o amida, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplea otros fármacos, compuestos y/o materiales empleados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que se trata y factores semejantes bien conocidos en las técnicas médicas.

La invención comprende el uso de los anticuerpos de acuerdo con la invención para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, especialmente de colon, pulmón o cáncer de páncreas.

La invención comprende también un método para el tratamiento de un paciente que sufre de esta enfermedad.

La invención además proporciona un método para la fabricación de una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo de acuerdo con la invención, junto con un portador farmacéutico aceptable y el uso del anticuerpo de acuerdo con la invención para este método .

La invención además proporciona el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva para la fabricación de un agente farmacéutico, de preferencia junto con un portador farmacéutico aceptable, para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer.

La invención también proporciona el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva para la fabricación de un agente farmacéutico, de preferencia junto con un portador farmacéutico aceptable, para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer.

Artículos de Manufactura En otro aspecto de la invención, se proporciona un articulo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los desórdenes descritos anteriormente. El articulo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el recipiente. Recipientes convenientes incluyen, por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente mantiene una composición que por si mismo o en combinación con otra composición es efectiva para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de la condición y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o una ampolleta que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición se emplea para tratar la condición de selección. Aún más, el articulo de manufactura puede comprender (a) un primer recipiente con una composición ahi contenida, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición ahi contenida, en donde la composición comprende un agente adicional citotóxico o de otra forma terapéutico. El articulo de manufactura en esta modalidad de la invención además puede comprender un inserto de empaque que indica que las composiciones pueden emplearse para tratar una condición particular. En forma alterna o adicional, el articulo de manufactura puede además comprender un segundo (tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéutico aceptable, tal como agua bacteriostática por inyección (BWFI = Bacteriostatic Water ' For Injection) , amortiguado con fosfato salino, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo, otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Además se entiende que cualquiera de los artículos de manufactura anteriores puede incluir un inmunoconj ugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-CSF-1R.

Los siguientes ejemplos y listados de secuencia se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que modificaciones pueden realizarse a los procesos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención.

Depósito de Anticuerpos Descripción de las Secuencias Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se establece en las reivindicaciones anexas. Se entenderá qué modificaciones pueden realizarse en los procedimientos establecidos, sin apartarse del espíritu de la invención.

Ejemplo 1 Generación de una linea celular de hibridoma que produce anticuerpos anti-CSF-lR Procedimiento de Inmunización de ratones NMRI Se inmunizaron ratones NMRI con un vector de expresión pDisplay™ (Invitrogen, USA) que codifica el dominio extracelular de huCSF-lR al utilizar electroporación . Todo ratón fue inmunizado 4 veces con 100 µ g de DNA. Cuando los títulos de suero de anti-huCSF-lR se encontraron suficientes, se reforzaron adicionalmente los ratones una vez con 50 µ g de una mezcla 1:1 de huCSF-lR ECD/huCSF-lR ECDhuFc quimera en 200 µ 1 de PBS intravenosamente (i.v.) 4 y 3 días antes de fusión.

ELISA Especifica de Antigeno Títulos anti-CSF-lR en sueros de ratones inmunizados se determinaron por ELISA específica de antígeno. 0.3 /g/ml de quimera huCSF-lR-huFc (dominio extracelular soluble) se capturó en una placa estreptavidina (MaxiSorb; MicroCoat, DE, Cat.No. 11974998/MC1099) con 0.1 mg/ml de anti-Fcy biotinilado (Jackson ImmunoResearch . , Cat.No. 109-066-098) y peroxidasa de rábano picante IgG anti ratón F(ab')2 conjugado con (HRP) (GE Healthcare, UK, Cat.No.NA9310V) diluido 1/800 en PBS/0.05% Tween20/0.5% BSA se agregan. Sueros de todas las tomas o derivaciones se diluyeron 1/40 en PBS/0.05% Tween20/0.5% BSA y diluyeron en serie hasta 1/1638400. Sueros diluidos se agregaron a los pozos. Suero pre-derivación se emplea como control negativo. Una serie de dilución de CSF-IR Mab3291 anti-humano ratón (R&D Systems, UK) de 500 ng/ml a 0,25 ng/ml se empleó como control positivo. Todos los componentes se incubaron juntos por 1,5 horas, los pozos se lavaron 6 veces con PBST (PBS/0.2 % Tween20) y se desarrollaron ensayos con solución ABTS® recientemente preparada (1 mg/ml) (ABTS: ácido 2,2'-azino bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) por 10 minutos a RT. Se midió absorbancia a 405 nm.

Generación de Hibridoma Los linfocitos de ratón pueden aislarse y fusionarse con una linea celular de mieloma de ratón utilizando protocolos estándar basados en PEG para generar hibridomas. Los hibridomas resultantes después se criban por la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones de una sola célula de linfocitos de derivación esplénica de ratones inmunizados se fusionan a Ag8 células de mieloma de ratón no secretantes P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL-1580) con 50% de PEG. Células se revisten a aproximadamente 104 en placas de micro titulación de 96 pozos de fondo plano, seguido por aproximadamente incubación por dos semanas en medio selectivo. Pozos individuales después se criban por ELISA para anticuerpos Ig e IgG monoclonales anti-CSF-lR humanos. Una vez que ocurre crecimiento de hibridoma extenso, los hibridomas que secretan anticuerpos se revisten de nuevo, criban de nuevo, y si todavía es positivo para IgG humano, anticuerpos monoclonales anti-CSF-lR, pueden ser subclonados por FACS. Los subclones estables después se cultivan in vitro para producir anticuerpos en medio de cultivo de tejido para caracterización.

Cultivo de hibridomas Hibridomas muMAb generados se cultivaron en RPMI 1640 (PAN - Catalogo No. (Cat. No.) PO4-17500) suplementado con L-glutamina 2 mM (GIBCO - Cat. No .35050-038 ) , Na-Piruvato 1 mM (GIBCO - Cat. No .11360-039) , lx NEAA (GIBCO - Cat. No.11140-035) , 10% FCS ( PAA - Cat. No.A15-649), lx Pen Strep (Roche - Cat. No.1074440), lx Nutridoma CS (Roche - Cát . No.1363743), 50 µ? Mercaptoetanol (GIBCO - Cat. No .31350-010 ) y de 50 U/ml IL 6 de ratón (Roche - Cat. No.l 444 581) a 37°C y 5% C02.

Ejemplo 2 Inhibición de enlace CSF-1 a CSF-1R (ELISA) La prueba se realizó en placas de micro titulación de 384 pozos (MicroCoat, DE, Cat. o. 464718) a RT. Después de cada etapa de incubación se lavaron las placas 3 veces con PBST.

Al inicio, se revistieron placas con 0.5 mg/ml anti-Fcy biotinilado F(ab' )2 de cabra (Jackson ImmunoResearch. , Cat . No .109-006-170 ) por 1 hora (h) .

Posteriormente, los pozos se bloquearon con PBS suplementado con 0.2% Tween -20 y 2% BSA (Roche Diagnostics GmbH, DE) por 0.5 h. 75 ng/ml de quimera huCSF-lR-huFc (dominio extracelular soluble) se inmoviliza en placa por 1 h. Después diluciones de los anticuerpos purificados en PBS/0.05% Tween20/0.5% BSA se incubaron por 1 h. Después se agregaron una mezcla de 3 ng/ml CSF-1 (Biomol, DE, Cat .No.60530) , 50 ng/ml BAF216 clon anti CSF-1 biotinilado (R&D Systems, UK) y 1:5000 HRP estreptavidina diluido (Roche Diagnostics GmbH, DE, Cat . o .11089153001 ) por 1 h, las placas se lavaron 6 veces con PBST. Anti-CSF-IR SC-02, clon 2-4A5 (Santa Cruz Biotechnology, US) , que inhibe la interacción de receptor-ligando, se utiliza como control positivo. Las placas se revelaron con solución de substrato BM blue® POD recientemente preparada (BM blue : 3, 3' -5,5'- Tetrametilbenzidina, Roche Diagnostics GmbH, DE, Cat. o. 11484281001) por 30 minutos a RT. La absorbancia se midió- a 370 nm. Todos los anticuerpos anti-CSF-lR mostraron inhibición significante del enlace CSF-1 que liga a CSF-1R (ver Tabla 1) . Anti CSF-IR SC-02, clon 2-4A5 (Santa Cruz Biotechnology, US) , que inhibe la interacción de receptor-ligando se empleó como un control de referencia.

Tabla 1 : Valores IC50 calculados para la inhibición de la interacción CSF-l/CSF-lR Ejemplo 3 Inhibición de fosforilación CSF-1-inducida por CSF-IR en células recom inantes NIH3T3-CSF-1R 4.5xl03 células NIH 3T3, infectadas retroviralmente con un vector de expresión para CSF-IR de longitud integra, se cultivaron en DMEM (PAA Cat . No.E15-011), L-glutamina 2 mM (Sigma, Cat . No . G7513, Piruvato de sodio 2 mM, aminoácidos no esenciales lx, FKS al 10% (PAA, Cat. No. A15-649) y 100 ug/ml PenStrep (Sigma, Cat. No. P4333 [10 mg/ml] ) hasta que alcanzaron confluencia. Posteriormente, las células se lavaron con medio DMEM libre de suero (PAA Cat. No. E15-011) suplementado con selenita de sodio [5 ng/ml] (Sigma, Cat. No. S9133), transferina [10 g/ml] (Sigma, Cat. No. T8158), BSA [400 ug/ml] (Roche Diagnostics GmbH, Cat. No. 10735078), L-glutamina 4 mM (Sigma, Cat. No. G7513) , piruvato de sodio 2 mM (Gibco, Cat. No. 11360), aminoácidos no esenciales lx (Gibco, Cat: 11140-035), 2-mercaptoetanol [0,05 mM] (Merck, Cat. No. M7522), 100 pg/ml y PenStrep (Sigma, Cat. No. P4333) e incubaron en 30 µ? del mismo medio por 16 horas para permitir regulación por incremento del receptor. 10 µ? de anticuerpos anti-CSR-lR diluidos se agregaron a las células por 1.5 h. Después se estimularon células con 10 µ? de 100 ng/ml huM-CSF-1 (Biomol Cat. · No. 60530) por 5 minutos. Después de incubación, se retiró' sobrenadante, las células se lavaron dos veces con 80 µ? de PBS enfriado por hielo y 50 µ? de amortiguador de lisis enfriado con y preparado (150 mM NaCl/ 20 mM Tris pH 7.5 / 1 mM EDTA/ 1 mM EGTA/ 1% Tritón X-100 /l tableta de inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics GmbH Cat. No. 1 836 170) por 10 mi de amortiguador/10 µ?/ml de Cóctel inhibidor de fosfatasa 1 (Sigma Cat. No. P-2850, ???? de materia prima) /10 µ?/ml inhibidor de proteasa 1 (Sigma Cat. No. P-5726, lOOx de materia prima) /10 µ?/ml 1 M NaF) se agregaron. Después de 30 minutos en hielo, las placas se agitaron vigorosamente en un agitador de placas por 3 minutos y después centrifugaron 10 minutos a 2200 rpm (Heraeus Megafuge 10) .

La presencia de receptor CSF-1 fosforilado y total en el lisado celular se analizó con Elisa. Para detección del receptor fosforilado el equipo de R&D Systems (Cat. No. DYC3268-2) se empleó de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Para detección de CSF-IR total de 10 µ? de lisado se inmovilizaron en placa por uso del anticuerpo de captura contenida en el equipo. Posteriormente se agregó anticuerpo anti CSF-1R biotinilado diluido 1:750 BAF329 (R&D Systems) y conjugado estreptavidina HRP diluido 1:1000. Después de 60 minutos las placas se revelaron con solución ABTS® recientemente preparada y se detectó la absorbancia. Datos se calcularon como % de control positivo sin anticuerpo y se expresó el valor de proporción fosfo/total de receptor. El control negativo se definió sin adición de M-CSF-1. Anti CSF-1R SC-02, clon 2-4A5 (Santa Cruz Biotechnology, US, ver también Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676), que inhibe la interacción de receptor-ligando, se emplea como control de referencia.

Tabla 2 : Valores IC50 calculados para la inhibición de fosforilación de receptor CSF-1.

Ejemplo 4 Determinación de la afinidad de anticuerpos anti-CSF-1R con CSF-1R Instrumento: BIACORE® A100 Chip: CM5 (Biacore BR-1006-68) Acoplamiento : acoplamiento amina Amortiguador: PBS (Biacore BR-1006-72), pH 7.4, 35°C Para mediciones de afinidad, 36 µg/ml de anticuerpos Fcy anti ratón (de cabra, Jackson Immuno Reasearch JIR115-005-071 ) se han acoplado a la superficie de chip para capturar los anticuerpos contra CSF-IR. CSF-IR ECD (R&D-Systems 329-MR o pCMV-presS-HisAvitag-hCSF-lR-ECD subclonado en-casa se agregaron en diversas concentraciones en solución. La asociación se midió por una inyección CSF-IR- de 1.5 minutos a 35 °C; disociación se midió al lavar la superficie · de chip con amortiguador por 10 minutos a 35 °C. Anti CSF-IR SC-02, clon 2-4A5 (Santa Cruz Biotechnology, US; ver también Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676), que inhibe la interacción de ligando-receptor, se empleó como control de referencia.

Para cálculo de parámetros cinéticos, se empleó el modelo Langmuir 1:1.

Tabla 3 : Datos de afinidad medidos por SPR (BIACORE® A100) a 35°C Ejemplo 5 Cartografía de Epitopo de anticuerpos monoclonales anti-CSF-lR con base en competencia cruzada al utilizar SPR Instrumento: BIACORE® A100 Chip: CM5 (Biacore BR-1006-68) Acoplamiento: acoplamiento amina Amortiguador: PBS PBS (Biacore BR-1006-72), pH 7.4, 25 °C Para ensayos de cartografía de epitopo mediante competencia cruzada, 36 ]iq/ml de anticuerpos Fcy anti ratón o anticuerpos Fcy anti rata (de cabra, Jackson Immuno Research Cat .No.115-005-071 y Cat . No.112-005-071) se han acoplado a la superficie del chip sensor para presentación del anticuerpo contra CSF-1R. Después de captura de 5 g/ml de anticuerpos monoclonales anti-CSF-lR capacidades de enlace libre de anticuerpos de captura se han bloqueado con 250 pg/ml de inmunoglobulinas de ratón o rata (Pierce Cat. No. 31202 y Pierce Cat. No. 31233), seguido por inyección de 12.5 yg/ml CSF-1R (R&D-Systems Cat. No. 329-MR) por 2 min. Enlace de segundo anticuerpo anti-CSF-lR se han analizado por inyección por 2 min, disociación se midió al lavar con amortiguador por 5 minutos. El ensayo y las mediciones se realizaron a 25°C-. El enlace especifico del segundo anticuerpo anti-CSF-lR se ha referido contra punto con la misma configuración en chip pero solo sin inyección de CSF-IR. Los datos de competencia cruzada se han calculado en porcentaje (%) de respuesta de enlace esperada del segundo anticuerpo anti-CSF-lR. El item "porcentaje (%) de respuesta de enlace esperada" para ligar del segundo anticuerpo se calcula por "100 * relativeResponse (general_stability_early) / rMax", en donde rMax se calcula por "relativeResponse (general_stability_late) * peso molecular anticuerpo / peso molecular de antigeno" como se describe en las instrucciones de equipo de epitopo Biacore (para BIACORE® A100 instument) .s.

La respuesta de enlace mínima también se calculó a partir de los pares de anticuerpo 1 y 2 idénticos. Por lo tanto, el valor máximo obtenido + 50% se ajusta como umbral para competencia de enlace significante (ver tabla X por ejemplo para anticuerpo <CSF-1R>7H5.2G10 umbral calculado es 7+3.5= 10.5) . De esta manera, "un enlace de anticuerpo anti-CSF-1R al mismo epitopo que <CSF-1R>7H5.2G10" tiene un porcentaje (%) de respuesta de enlace esperada > 10.5.

El clon 2-4A5 anti-CSF-lR SC-02, (Santa Cruz Biotechnology, US, ver también Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676), que inhibe la interacción de ligando-receptor, se empleó como control de referencia.

Tabla 4 : Cartografía de epitopo mediante datos competencia cruzada de anticuerpos anti- CSF-1R Los resultados indican que los anticuerpos <CSF-1R>7H5.2G10, <CSF-1R>10A4.1G11 , todos ligan al mismo epitopo, mientras que SC-2-4A5 liga a otro epitopo y no reacciona en forma cruzada (competencia cruzada para enlace) con los anticuerpos de acuerdo con la invención.

Ejemplo 6 Inhibición de crecimiento de células recoinbinantes NIH3T3-CSF-1R en cultivo de 3D bajo tratamiento con anticuerpos monoclonales de anti-CSF-lR (Ensayo CellTiterGlo) Células NIH 3T3, infectadas en forma retroviral ya sea con un vector de expresión para CSF-1R de tipo silvestre de longitud integra (SEQ ID No: 31) o CSF-1R L301S Y969F mutante (SEQ ID No: 32), se cultivaron en medio de DMEM de alta glucosa (PAA, Pasching, Austria) suplementado con L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 2 m y aminoácidos no esenciales y suero bovino fetal al 10% (Sigma, Taufkirchen, Alemania) en platos revestidos con poli-HEMA (poli (2-hidroxietilmetacrilato) ) (Polysciences, Warrington, PA, USA) ) para evitar adherencia a la superficie del plástico.. Las células se siembran en suero de reemplazo de medio con 5 ng/ml de selenita de sodio, 10 mg/ml de transferina, 400 g/ml BSA y 2-mercaptoetanol 0.05 mM. Cuando se tratan con 100 ng/ml huCSF-1 (Biomol, Hamburgo, Alemania) células que expresan wtCSF-lR forman densos esferoides que crecen tiri-dimensionalmente, una propiedad que se denomina independencia de anclaje. Estos esferoides semejan cercanamente la arquitectura tridimensional y organización de. tumores sólidos in situ. Células recombinantes CSF-1R mutantes son capaces de formar esferoides independientes del ligando CSF-1. Cultivos esferoides se incubaron por 3 días en la presencia de 10 µs/ml de anticuerpo. El ensayo CellTiterGlo se empleó para detectar viabilidad celular al medir el contenido ATP de las células.

Tabla 5: ** promedio de 15 diferentes experimentos, *** promedio de 6 diferentes experimentos Ejemplo 7 Inhibición de crecimiento de células de tumor BeWo en cultivo 3D bajo tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-CSF-lR (ensayo CellTiterGlo) Células de coriocarcinoma BeWo (ATCC CCL-98) se cultivaron en medio F12K (Sigma, Steinheim, Alemania) suplementadas con FBS al 10% (Sigma) y L-glutamina 2 mM. 5xl04 células/pozos se sembraron en placas revestidas de poly-HEMA de 96 pozos (poli (2-hidroxietilmetacrilato) ) que contienen medio F12K suplementado con FBS al 0.5% y BSA al 5%. De manera concomitante, 200 ng/ml de huCSF-1 y 10 g/ml de anticuerpos monoclonales anti-CSF-lR diferentes se agregaron e incubaron por 6 días. El ensayo CellTiterGlo se empleó para detectar viabilidad celular al medir el contenido de ATP de las células en unidades de luz relativas (RLU = Relative Light Units) . Cuando cultivos esferoides When Be o se trataron con diferentes anticuerpos anti-CSF-lR (10 pg/ml) la inhibición de crecimiento inducido por CSF-1 se observó. Para calcular inhibición mediada por anticuerpo, el valor RLU promedio de células BeWo no estimuladas se restó de todas las muestras. Valor RLU promedio de células estimuladas con CSF- 1 se ajustó arbitrariamente a 100%. Valores RLU promedio de células estimuladas con CSF-1 y tratadas con anticuerpos anti-CSF-lR se calcularon en % de RLUs estimuladas con CSF-1. La Tabla 6 muestra los datos calculados; la Figura 1 ilustra valores RLU promedio. Cada valor promedio se derivó de triplicados.

Tabla 6: Ejemplo 8 Inhibición de supervivencia de monocitos/-diferenciación de macrófago bajo tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-CSF-lR (ensayo CellTiterGlo) Monocitos aislados de sangre periférica utilizando el Cóctel para enriquecimiento de Monocitos Humanos RosetteSep™ Human Monocyte Enrichment Cocktail (StemCell Tech. - Cat . No. 15028). Poblaciones de monocitos enriquecidas se sembraron en placas de micro titulación de 96 pozos (2.5xl04 células/pozo) en 100 µ? de RPMI 1640 (Gibco -Cat. No. 31870) suplementadas con 10 FCS (GIBCO - Cat. No. 011-090014M) , L-glutamina 4 mM (GIBCO - Cat. No. 25030) y lx PenStrep (Roche Cat. No. 1074 440) a 37°C y 5% de C02. Cuando 150 ng/ml de huCSF-1 se agregan al medio, pudo observarse una clara diferenciación en macrófagos adherentes. Esta diferenciación pudo inhibirse por. adición de anticuerpos anti-CSF-lR. De manera concomitante, la supervivencia de monocitos se afecta y puede ser analizada por análisis CellTiterGlo (CTG) . De la inhibición dependiente de concentración de la supervivencia de los monocitos por tratamiento con anticuerpo se calculó una IC50 (ver Tabla Tabla 7:

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que liga a CSF-1R humano, caracterizado porque liga al mismo epitopo que el anticuerpo depositado DSM ACC2922.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende como región CDR3 de dominio variable de cadena pesada, una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 17.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 'de SEQ ID NO: 3, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 6, b) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 9, una región CDR2 de SEQ ID NO: 10, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 12, una región CDR2 de SEQ ID NO: 13, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 14; o c) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 17, una región CDR2 de SEQ ID NO: 18, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 19, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 20, una región CDR2 de SEQ ID NO: 21, y una región CDRl de SEQ ID NO: 22; o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de injerto CDR, humanizado o de célula T de los anticuerpos de a) , b) o c) .

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende a) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO: 8, o b) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 15, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO:16, o c) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 23, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO: 24 o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de célula T, humanizado o injertado en CDR, de los anticuerpos de a) , b) o c) .

5. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones l a 4, caracterizado porque el anticuerpo es de la subclase IgG4 humana o es de la subclase IgGl humana.

6. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5.

7. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado para el tratamiento de cáncer .

8. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado para el tratamiento de pérdida de huesos.

9. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado para la prevención o tratamiento de metástasis.

10. El anticuerpo de conformidad con las' reivindicaciones 1 a 5, caracterizado para el tratamiento'' de enfermedades inflamatorias. i

11. Ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo que liga a CSF-1R, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de acuerdo con las reivindicaciones 2, 3 ó 4.

12. Vectores de expresión caracterizados porque comprenden un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11, para la expresión de un anticuerpo que liga a CSF-1R en una célula hospedera procariótica o eucariótica .

13. Célula hospedera procariótica o eucariótica que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 12.

14. Método para la producción de un anticuerpo recombinante de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por expresar ' un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11 en una célula hospedera procariótica o eucariótica y recuperar el anticuerpo de la célula o sobrenadante de cultivo celular.

15. Un anticuerpo que liga a CSF-1R humano, caracterizado porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 3, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 6, b) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 9, una región CDR2 de SEQ ID NO: 10, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 12, una región CDR2 de SEQ ID NO: 13, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 14; o c) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 17, una región CDR2 de SEQ ID NO: 18, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 19, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEQ ID NO: 20, una región CDR2 de SEQ ID NO: 21, y una región CDR1 de SEQ ID NO: 22; o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de injerto CDR, humanizado o de célula T de los anticuerpos de a) , b) o c) .

16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende a) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO: 8, o b) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 15, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO:16, o c) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es SEQ ID NO: 23, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es SEQ ID NO: 24 o d) una variante de anticuerpo agotada en epitopo de célula T, humanizado o injertado en CDR, de los anticuerpos de a) , b) o c) .