MX2012009678A - Agentes y mecanismos para tratar la hipercolesterolemia. - Google Patents

Abstract

Un método para tratar la hipercolesterolemia en mamíferos, al administrar una cantidad efectiva de un producto de fermentación microbiana y al regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteína. Un método para regular los niveles de colesterol en un paciente al administrar una cantidad efectiva de una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ, análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ y al regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteína. Un método para tratar los altos niveles de colesterol en un individuo al administrar una cantidad efectiva de un producto de fermentación microbiana, al regular hacia arriba la expresión de por lo menos uno de los genes que codifican ABCA1, ApoA1 y SRB1 y al regular hacia abajo el gen que codifica CETP. Un método para prevenir el inicio de altos niveles de colesterol y/o un perfil de lipoproteína nocivo en un individuo.

Description

AGENTES Y MECANISMOS PARA TRATAR LA HIPERCOLESTEROLEMIA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona a extracciones de algas. En particular, la presente invención se relaciona a extracciones de algas que disminuyen el colesterol y extracciones que tienen la habilidad para desplazar favorablemente el perfil de HDL/LDL en mamíferos. 2. TÉCNICA ANTECEDENTE El colesterol es una sustancia similar a la grasa, cerosa hecha en el hígado y encontrada en ciertos alimentos, tal como alimento procedente de animales, similares a producto lácteos, huevos y carne. El cuerpo necesita algo de colesterol con el fin de funcionar apropiadamente: las membranas celulares, necesitan colesterol con el fin de producir hormonas, tal como estrógeno y vitamina D, y los ácidos biliares que ayudan a digerir la grasa y excretar ciertos productos de desecho. Sin embargo, cuando está presente demasiado colesterol, ya sea debido al consumo dietético excesivo, producción excesiva o una habilidad disminuida para eliminar las cantidades excesivas, pueden desarrollarse problemas de la salud tal como la enfermedad cardiaca.

Cuando está presente demasiado colesterol, la placa (un depósito duro, grueso) puede formarse en las arterias del cuerpo reduciendo el espacio para que fluya la sangre al corazón, cerebro y otros tejidos. A través del tiempo, esta acumulación causa aterosclerosis (endurecimiento de las arterias) , que puede conducir a enfermedades cardiovasculares. Cuando poca sangre portadora de oxigeno alcanza el corazón, puede resultar dolor de pecho, por ejemplo angina. Si el suministro de sangre a una porción del corazón se corta completamente por el bloqueo total de una arteria coronaria, esto da por resultado el daño y muerte de las células cardiacas, un evento comúnmente llamado un ataque cardiaco. Esto es usualmente debido a un cierre repentino por un coagulo sanguíneo que se forma en la parte superior de un reducimiento previo.

El metabolismo de lipoproteína tiene una función clave en la aterogénesis , que es la acumulación de placa aterosclerótica . El metabolismo de lipoproteína es un grupo complejo e interconectado de procesos que involucran los receptores para lipoproteinas, una familia de proteínas de núcleo (llamadas apolipoprotexnas) alrededor de las cuales los lípidos se ensamblan para formar lipoproteinas, así como el transporte de lipidos, particularmente colesterol y triglicéridos, y su intercambio entre diferentes clases de lipoproteína en la sangre. El intestino absorbe la grasa dietética y la empaqueta en quilomicrones (lipoproteinas ricas en triglicérido grandes) que se transportan a los tejidos periféricos a través de la sangre. En los tejidos musculares y adiposos, la enzima lipoproteina lipasa descompone los quilomicrones, y los ácidos grasos entran a estos tejidos. Los remantes de quilomicrones subsecuentemente son captados por el hígado. El hígado carga lípidos sobre ApoB y secreta lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLs) , que se someten a lipólisis mediante la lipoproteina lipasa para formar lipoproteínas de baja densidad (LDLs) . Las LDLs luego son captadas por el hígado a través del enlace al receptor LDL (LDLR) , así como a través de otras rutas. En contraste, las lipoproteínas de alta densidad (HDLs) se generan por el intestino y el hígado a través de la secreción de ApoAl libre de lípido. ApoAl luego recluta el colesterol de estos órganos a través de las acciones del transportador ABCA1, formando HDLs nacientes, y esto protege a la ApoAl de ser rápidamente degradada en los ríñones. En los tejidos periféricos, las HDLs nacientes promueven la afluencia de colesterol desde los tejidos, incluyendo de los macrófagos, a través de las acciones de ABCA1. Las HDLs maduras también promueven esta afluencia pero a través de las acciones de ABCG1. (En los macrófagos, el receptor nuclear LXR regula hacia arriba la producción de tanto ABCA1 y ABCG1, esto se considera fuera de contexto aquí) . El colesterol libre (no esterificado) en las HDLs nacientes es esterificado a ésteres colesterílieos por la enzima lecitina colesterol aciltransferasa (LCAT) , creando HDLs maduras. El colesterol en las HDLs se regresa al hígado tanto directamente, a través de la captación por el receptor SR-BI, como indirectamente, por la transferencia a las LDLs y VLDLs a través de la proteína de transferencia de éster colesterílico (CETP) . El contenido de lípido de las HDLs se altera por las enzimas lipasa hepática y lipasa endotelial y por las proteínas de transferencia CETP y la proteína de transferencia de fosfolípido (PLTP) , afectando el catabolismo de HDL.

Las LDLs pueden causar acumulación de placa sobre las paredes de las arterias, y su presencia en grandes cantidades indica un riesgo para enfermedad del corazón. Las HDLs en contraste, ayudan al cuerpo a eliminar la LDLs y así reducen la enfermedad del corazón. Un bajo nivel de HDL también pone el cuerpo en riego para enfermedades cardiovasculares, ya que se reduce el- mecanismo natural de eliminación de LDL. Varios factores pueden afectar la cantidad de LDLs y HDLs que están presentes, tal como la dieta, peso, ejercicio, edad, género, diabetes, herencia y otras condiciones médicas.

Las estatinas son muy comúnmente utilizadas para tratar individuos con alto colesterol. Las estatinas son inhibidores de la enzima hidroximetilglutaril-coenzimaA reductasa (HMG-CoA Reductasa) . A través de la inhibición de la HMGCo Reductasa, las estatinas disminuyen las síntesis de colesterol, y activan las proteínas de enlace del elemento regulador de esterol (SREBPs) . La SREBP se enlaza con los elementos de respuesta de esterol (SREs) . Eso regula hacia arriba la transcripción del gen LDL-R, proporcionando una expresión incrementada de receptores de LDL en la membrana hepatocelular y una captación celular incrementada de moléculas LDL. Hay varios efectos secundarios reportados con el uso de estatinas, incluyendo miopatía, rabdomiolisis inflamación incrementada, colapso muscular y sobrecarga renal. Algunas estatinas, por ejemplo lipitol y crestor, aparecen también para exhibir el efecto benéfico adicional de inhibir la función de CETP.

Varios de otros tratamientos se han desarrollado para combatir el alto colesterol, especialmente en suplementos alimenticios. Los ácidos grasos omega-3 son efectivos pero faltan fuentes ambientalmente sostenibles abundantes. El Resveratrol es un tratamiento muy popular y se produce naturalmente por las plantas. El acai berry también se utiliza; sin embargo, efectos secundarios están ahora mostrándose. El lingonberry (arándano rojo) y otros extractos están siendo probados en estudios clínicos. La curcumina e isoflavónidos también están ganado popularidad. La prioridad de cada de uno de estos suplementos es mejorar los factores de riesgo cardiovasculares, regulación del colesterol, función mental y pérdida de peso.

Aún permanece una necesidad por un tratamiento para reducir de manera segura y efectiva los niveles de colesterol circulantes y que maneje la relación, de HDL/LDL sin el incurrimiento de efectos secundarios. Además hay una necesidad de alternativas para la terapia de estatina actual que ya sea que tengan menos efectos secundarios nocivos y/o funcionen por un mecanismo diferente, tal como la regulación del colesterol y/o metabolismo de lipoproteina al nivel genético.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para tratar la hipercolesterolemia en un paciente, al administrar una cantidad efectiva de un producto de fermentación microbiana, y al regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteina.

La presente invención proporciona un método para regular los niveles de colesterol en un paciente al administrar una cantidad efectiva de una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ, análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ, y al regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteina.

La presente invención también proporciona un método para tratar los altos niveles de colesterol en un paciente al administrar una cantidad efectiva de un producto de fermentación microbiana, al regular hacia arriba la expresión de por lo menos uno de los genes que codifican ABCAl, ApoAl y SR-B1, y al regular hacia abajo el gen que codifica CETP.

La presente invención además proporciona un método para prevenir el inicio de alto colesterol al administrar una cantidad efectiva de una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ, análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ, al regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteína, y al prevenir el inicio de alto colesterol.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Otras ventajas de la presente invención se aprecian fácilmente ya que la misma llega a ser mejor entendida por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considera en relación con los dibujos acompañantes en donde: La FIGURA 1 es un diagrama de flujo que resume los estudios en animales realizados en un modelo experimental preventivo in vivo en hámsters en el cual se utilizó una dieta alta en grasa para producir niveles de colesterol elevados y el efecto de PAZ y fracciones derivados del mismo basado en propiedades químicas diferenciales se evaluaron para su habilidad para alterar el metabolismo de colesterol; La FIGURA 2 es una gráfica del consumo dietético promedio de alimento alto en grasa en gramos para hámsters provistos con agua y hámsters provistos con agua que contiene PAZ o fracciones aisladas del mismo (ver la FIGURA 1 para leyenda) ; La FIGURA 3 es una gráfica del peso corporal promedio (gramos) durante el curso del estudio (semana) para hámsters provistos con agua y hámsters provistos con agua que contiene PAZ o fracciones aisladas de mismo (ver la FIGURA 1 para leyenda) ; La FIGURA 4 es una gráfica del consumo de fluido promedio (mL) durante el curso del estudio para hámsters provistos con agua y hámsters provistos con agua que contiene PAZ o fracciones aisladas del mismo (ver la FIGURA 1 para leyenda) ; La FIGURA 5 es una gráfica de los efectos de PAZ y fracciones aisladas del mismo comparados con el agua sin cualquiera de los aditivos sobre los niveles de colesterol totales (mg/dL) de hámsters alimentados con una dieta alta en grasa; La FIGURA 6 es una gráfica de los efectos de PAZ y fracciones aisladas del mismo comparados con el agua sin cualquiera de los aditivos en los niveles de colesterol de HDL (mg/dL) de hámsters alimentados con una dieta alta en grasa; La FIGURA 7 es una gráfica de los efectos de PAZ y facciones aisladas del mismo comparados con el agua sin cualquiera de los aditivos en la relación de los niveles de colesterol totales y HDL de hámsters alimentados con una dieta alta en grasa; La FIGURA 8 es una gráfica de los efectos de PAZ y fracciones aisladas del mismo comparados con el agua sin cualquiera de los aditivos sobre los niveles de colesterol no de HDL (LDL) (mg/dL) de hámsters alimentados con una dieta alta en grasa; La FIGURA 9 es una gráfica de los efectos de PAZ y fracciones aisladas del mismo comparados con el agua sin cualquiera de los aditivos en los niveles de triglicérido del plasma (mg/dL) de hámsters alimentados con una dieta alta en grasa ; La FIGURA 10 es una gráfica de los efectos de PAZ fracciones aisladas del mismo comparados con el agua sin cualquiera de los aditivos en el perfil de lipoproteina de hámsters alimentados con una dieta alta en grasa; La FIGURA 11 es una representación gráfica del desplazamiento en la composición de lipoproteina para hámsters alimentados con una dieta alta en grasa más PAZ y fracciones aisladas del mismo comparada con los hámsters alimentados con una dieta alta en grasa más agua sin cualquiera de los aditivos; La FIGURA 12 es una representación gráfica del desplazamiento en la composición de lipoproteina para hámsters alimentados con una dieta alta en grasa más la fracción PF3 de PAZ comparada con los hámsters alimentados con una dieta alta en grasa más agua sin cualquiera de los aditivos ; La FIGURA 13 es una representación gráfica de los resultados obtenidos para ensayos de la actividad de CETP en el suero sanguíneo al cual se adicionaron ya sea agua o PF4 no diluido; La FIGURA 14 es una presentación gráfica de los resultados obtenidos para los ensayos de la actividad de PLTP en el suero sanguíneo al cual se adicionaron ya sea agua o PF4 no diluido; La FIGURA 15 es una representación gráfica de los resultados obtenidos para los ensayos de la actividad de CETP en el suero sanguíneo al cual se adicionaron agua o PF3 (en una dilución de 1:10); La FIGURA 16 es una representación gráfica de los resultados obtenidos para los ensayos de actividad de PLTP en el suero sanguíneo al cual se adicionaron agua o PF3 (en una dilución de 1:10); La FIGURA 17 es una representación gráfica de un ensayo cinético que comparar el efecto sobre la actividad de HMGCoA Reductasa de una estatina (prevastatina ) vs. contra la fracción PF4 derivada de PAZ; La FIGURA 18 en una representación de la función de varias proteínas y lipoproteínas en el transporte de colesterol La FIGURA 19 es una representación gráfica de los resultados obtenidos en experimentos de PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) para determinar los niveles relativos de expresión de genes que codifican proteínas claves involucradas en la regulación de colesterol y metabolismo de HDL en el hígado de hámsters (modelo preventivo de 4 semanas) alimentados ya sea con una dieta alta en grasa más PAZ (PP) , una dieta alta en grasa más una fracción que se aisló de PAZ por una serie de etapas cromatográfica (identificada como PF4), o una dieta alta en grasa más agua (PW) como es comparado con el grupo de control en una dieta regular (baja en grasa) y agua (CW) ; La FIGURA 20 es una representación gráfica diferente de los resultaos obtenidos en los experimentos de PCR de tiempo real cuantitativa para determinar los niveles relativos de expresión de genes que codifican proteínas claves involucradas en la regulación de colesterol y metabolismo de HDL en el hígado de hámsters (modelo preventivo de 4 semanas) alimentados ya sea con una dieta alta en grasa más PAZ completo (PP) o fracción PF4 como es comparado con el grupo de control que se mantuvo en una dieta alta en grasa y agua sin cualquiera de los aditivos (PW); La FIGURA 21 es una representación gráfica de los resultados obtenidos en los experimentos de PCR de tiempo real cuantitativa para determinar los niveles relativos de expresión de gen que codifica CETP en la linea celular HEPG2 humana cultivada en el medio que contiene una alícuota pequeña de dos diferentes lotes de PAZ completo como es comparado con las células de control cultivadas sin cualquiera de los aditivos; La FIGURA 22 es una representación gráfica de los resultados obtenidos en los experimentos de PCR de tiempo real cuantitativa para determinar los niveles relativos de expresión del gen que codifica CETP en la línea celular HEPG2 humana cultivada en el medio que contiene varias diluciones de PAZ completo como es comparado con las células de control cultivadas sin cualquiera de los aditivos; La FIGURA 23 es una gráfica del efecto de PAZ y la fracción PF3 derivada del mismo comparado con el agua sin cualquiera de los aditivos sobre los niveles de colesterol totales (mg/dL) , los niveles de colesterol de HDL (mg/dL) y los niveles de triglicéridos (TG) (mg/dL) de hámsters en un modelo experimental terapéutico in vivo en el cual los hámsters primero se alimentaron con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego se trataron durante 21 días adicionales con la dieta alta en grasa más PAZ completo (Grupo 1, Gl) o Fracción PF3 (Grupo.2, G2) derivada del mismo; La FIGURA 24 es una gráfica del efecto de PAZ y la fracción PF3 derivada del mismo comparado con el agua sin cualquiera de los aditivos en la relación de los niveles de colesterol totales al colesterol de HDL en el plasma de hámsters en un modelo experimental terapéutico in vivo en el cual los hámsters primero se alimentaron con un dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego se trataron durante 21 días adicionales con una dieta alta en grasa más el PAZ (Grupo 1, Gl) o Fracción PF3 (Grupo 2, G2 ) derivada del mismo; La FIGURA 25 es una gráfica del efecto de PAZ y la fracción PF3 derivada del mismo comparado con el agua sin cualquiera de los aditivos sobre la expresión, utilizando qPCR, de genes que codifican las proteínas APOAl y CETP en el hígado de hámsters en un modelo experimental terapéutico in vivo en el cual los hámsters primero se alimentaron con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego se trataron durante 21 días adicionales con la dieta alta en grasa más ya sea PAZ completo (Grpl), Fracción PF3 (Grp2) derivada del mismo o agua sin cualquiera de los aditivos (W, control) ; La FIGURA 26 es una gráfica del efecto de las fracciones PF3, PF4 de PAZ, así como PF4 después de varios tratamientos comparado con el agua sin cualquiera de los aditivos en la expresión, utilizando qPCR, de genes que codifican las proteínas APOAl y CETP en el hígado de hámsters en un modelo experimental terapéutico in vivo en el cual los hámsters primero se alimentaron con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego se trataron durante 7 días adicionales con la dieta alta en grasa más las fracciones PF3, PF4 especificadas, la fracción PF4 después de los tratamientos especificados o el agua sin cualquiera de los aditivos; La FIGURA 27 es un diagrama de flujo que resume los estudios en animales realizados en un modelo experimental terapéutico in vivo en hámsters en los cuales se utilizó una dieta alta en grasa para producir niveles de colesterol elevados y el efecto de la fracción PF4 de PAZ se evaluó por su habilidad para alterar el metabolismo de colesterol; La FIGURA 28 es un gráfica de los efectos de la fracción PF4 de PAZ comparados con el agua sin cualquiera de los aditivos en los niveles de colesterol totales en el plasma (mg/dL) en diferentes puntos de tiempo en hámsters alimentados con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego tratados durante 21 dias adicionales con la dieta alta en grasa más ya sea la fracción PF4 de PAZ o agua (control) sin cualquiera de los aditivos ; La FIGURA 29 en una gráfica de los efectos de la fracción PF4 de PAZ sobre los niveles de HDLc en el plasma (mg/dL) en diferentes puntos de tiempo en hámsters alimentados con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia , y luego tratados durante 21 días adicionales con la dieta alta en grasa más ya sea la fracción PF4 de PAZ o agua (control) sin cualquiera de los aditivos ; La FIGURA 30 es una gráfica de los efectos de la fracción PF4 de PAZ sobre los niveles de triglicérido en el plasma (mg/dL) en diferentes puntos de tiempo en hámsters alimentados con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego tratados durante 21 días adicionales con la dieta alta en grasa más ya sea la fracción PF4 de PAZ o agua (control) sin cualquiera de los aditivos; La FIGURA 31 es una gráfica que compara el cambio de varios parámetros de lípido en el plasma (TC, colesterol total; HDL; TG, triglicéridos ; no-HDL) en diferentes puntos de tiempo en hámsters alimentados con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego tratados durante 21 días adicionales con la dieta alta en grasa más ya sea la fracción PF4 de PAZ o agua (control) sin cualquiera de los aditivos; La FIGURA 32 es una gráfica del efecto de la fracción PF4 de PAZ comparada con agua sin cualquiera de los aditivos sobre la expresión, utilizando qPCR, de genes que codifican las proteínas AP0A1 y CETP en el hígado de hámsters en un modelo experimental terapéutico in vivo en el cual los hámsters primero se alimentaron con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego se trataron durante 21 días adicionales con la dieta alta en grasa más ya sea la fracción PF4 de PAZ o agua (control) sin cualquiera de los aditivos. Los grupos de hámsters se evaluaron en diferentes puntos de tiempo durante el periodo de tratamiento de 21 días (3 días, 7 días, 10 días, 14 días y 21 días) ; y La FIGURA 33 es una tabla que resume los resultados de los diferentes estudios de los efectos de la fracción PF4 de PAZ sobre varios parámetros de lípido en el plasma. PF4 lote 1/30 y PF4n lote 3/30 representan los resultados obtenidos en un modelo experimental preventivo en el cual los hámsters se alimentaron en una dieta alta en grasa más la fracción PF4 de diferentes lotes de PAZ (los resultados de control de agua representativos se encuentran en la columna PW1) . T21/PF4 lote 3 representa los resultados obtenidos de un modelo experimental terapéutico en el cual los hámsters se alimentaron con una dieta alta en grasa durante 4 semanas para inducir la hipercolesterolemia, y luego se trataron durante 21 días adicionales con la dieta alta en grasa más ya sea la fracción PF4 de PAZ o agua (PW2) sin cualquiera de los aditivos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona generalmente un método para tratar a un individuo (es decir un paciente humano o animal) que tiene altos o anormales niveles de colesterol, es decir hipercolesterolemia, a través del uso de un producto de fermentación microbiana complejo. Más específicamente, la presente invención proporciona mecanismos de acción mediante los cuales ciertos . componentes del producto de fermentación microbiana complejo influyen en la ruta de metabolismo de colesterol y regulan los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteína .

"ProAlgaZyme™" (también referido como PAZ) es un producto de fermentación novedoso de un ecosistema de algas de agua dulce que se ha utilizado como un suplemento dietético por arriba de 3 décadas. PAZ primero se comercializó en los Estados Unidos como Lebenszeit™, que significa "Tiempo de Vida" en Alemán, en los años de 1980 por Ponce de León Medical Development Corp., en referencia a la fuente de juventud legendaria. El producto llegó a ser lo que es ahora conocido como ProAlgaZyme® (PAZ) en 2003. La infusión es un producto de fermentación acuoso de una mezcla patentada de organismos de agua dulce descubierta hace aproximadamente 30 años dentro de una fuente natural, y por consiguiente se ha cultivado bajo condiciones controladas. Un depósito de un cultivo que da por resultado el extracto acuoso de ProAlgaZyme o PAZ de la presente invención se ha Colocado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, de Manassas, VA., como Depósito # PTA-5863. El suplemento dietético liquido oral de ProAlgaZyme, un filtrado consumible del proceso de fermentación, típicamente tiene menor que 100 ppm de sólidos disueltos totales que consisten de aproximadamente 90% de sales (libres de metales pesados en un límite de detección de <0.1 ppm) y una mezcla única de constituyentes orgánicos. PAZ también se ha referido previamente como fito-percolato .

Los componentes de PAZ se pueden aislar del medio de fermentación algal de ProAlgaZyme descrito enseguida o se pueden producir mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica. Los métodos adecuados para producir el PAZ y derivados incluyen, por ejemplo, expresar recombinantemente o naturalmente la proteína (s) utilizando un microorganismo, que produce sintéticamente un derivado (es decir, síntesis química (libre de células)), o al extraer el derivado o compuestos activos del medio de cultivo o contenidos celulares de una o más de las especies presentes en el Depósito de ATCC #PTA-5863. Cuando el PAZ y sus derivados se producen utilizando un microorganismo, se puede utilizar cualquier microorganismo que ocurre naturalmente o recombinante . El PAZ y sus derivados se producen utilizando especies que ocurren naturalmente presentes en el Depósito de ATCC #PTA-5863, o una variante recombinante del mismo.

También se divulga un método para hacer el PAZ inventivo. El PAZ se prepara al primero cultivar una mezcla de organismos acuáticos encontrados dentro del Depósito de ATCC # PTA-5863 que se aumenta por una mezcla de nutrientes especifica que forma un cultivo algal y bacteriano fortificado. Se adiciona a este cultivo fortificado agua dulce purificada que se ha purificado mediante osmosis inversa, destilación, deionización u otros medios. El cultivo se incuba con el agua dulce purificada y la mezcla de nutrientes durante un tiempo predeterminado para formar un extracto que es de naturaleza biológicamente activa. El extracto se decanta del cultivo algal y bacteriano fortificado y se procesa. Los métodos adecuados de procesamiento del extracto incluyen filtración, centrifugación, liofilización, diálisis, purificación, evaporación, concentración, dilución, formulación y otros métodos. El procesamiento del extracto decantado en un método particular es mediante micro-filtración donde la micro-filtración remueve las partículas más grandes que aproximadamente 0.22pm.

En la Solicitud de Patente Norteamericana No. 11/587,266, incorporada en la presente, los cultivos de fuente de PAZ se hacen de aproximadamente 100-200 mi o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 500 g o más peso fresco de células algales, de moho, fúngales y bacterianas densas encontradas dentro del Depósito de ATCC # PTA-5863 en aproximadamente 10 litros (aproximadamente 2.5 galones) de agua filtrada desionizada. En este método, los cultivos se hacen crecer bajo luces fluorescentes o de espectro completo en un ciclo de luz/obscuridad de 12:12 horas aproximado entre aproximadamente 15°C y 37°C, de manera particular aproximadamente 25°C. Los cultivos se hacer crecer en recipientes de tipo pecera en forma de cilindro de vidrio claro que tiene un volumen aproximado de aproximadamente 10 litros (2.5 galones) con tapas semitransparentes que permiten el intercambio de gas ambiental. Los cultivos se alimentan con extracto liquido de levadura activa viva, o levadura de Baker, Saccharomyces cerevisiae, que se ha preparado de 1.0 g de levadura activa seca adicionada a 50 mi de agua desionizada estéril caliente, entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 43°C. La mezcla de levadura se agita y se deja incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-30 minutos, o hasta que se forma espuma ligeramente. Cada cultivo se alimenta aproximadamente con 1 mi de la mezcla de levadura preparada aproximadamente una o más veces entre los tiempos en que el cultivo es rellenado y cosechado, como es definido enseguida. Se contempla dentro del alcance de la invención que se pueden utilizar otros cultivos de levadura y métodos. Además se contempla que otras condiciones de cultivo, materiales y métodos conocidos en la técnica se pueden utilizar si ellos sustentan la producción de PAZ, sus componentes, compuestos activos y derivados, incluyendo el cultivo de multiespecies o monocultivo, sistemas de cultivo por lotes, semicontinuos, continuos u otros sistemas de cultivo, biorreactores , fotorreactores u otra tecnología de fermentación, o a través del uso de otras fuentes, sustratos o portadores apropiados.

El fluido de cultivo o PAZ se puede cosechar periódicamente al retirar la porción superior del fluido de cada cultivo. Este proceso es referido como "cosecha" y el líquido resultante es referido como "PAZ", "ProAlgaZyme" o "extracto acuoso" y se puede someter a procesamiento adicional. Aquí, la mayoría de las células algales que forman el cultivo permanecen en el fondo del recipiente de cultivo sustancialmente no alterado mientras que PAZ se decanta de cada cultivo. Varios materiales y métodos conocidos en la técnica se pueden utilizar para cosechar y hacer en lotes el PAZ decantado después de la cosecha, antes o después de la filtración o el procesamiento adicional. Después de la cosecha, el PAZ luego se filtra y se consume como sea deseado. Esto se ha encontrado que tiene actividad biológica y es seguro para el consumo. El volumen de liquido del recipiente de crecimiento luego se puede regresar al volumen original utilizando agua filtrada, purificada por osmosis inversa o desionizada a aproximadamente la temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) . Se contempla que otros métodos o sistemas de cosecha, extracción, procesamiento, purificación o aislamiento del compuesto se pueden utilizar para la producción del PAZ y sus derivados, si es apropiado, incluyendo la usencia de procesamiento. Además se contempla que el PAZ puede ser embotellado, concentrado, diluido, secado o formulado con otros ingredientes, por ejemplo, o de otra manera tratado o empleado.

Los compuestos activos individuales aislados de PAZ o sus equivalentes sintéticos que son efectivos para disminuir el nivel de colesterol de un paciente se pueden utilizar independientemente, o se pueden combinar para disminuir el colesterol asi como funcionar para tratar otras enfermedades como es descrito en la presente. De preferencia, el tratamiento puede ser restringido a una o más sustancias aisladas y caracterizadas en PAZ, que se sintetizan químicamente y se administran en la ausencia de componentes inactivos .

"Cantidad terapéuticamente efectiva", como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de la composición de la presente invención que aliviará los síntomas de un estado de enfermedad o condición médica, de preferencia altos niveles de LDL o de colesterol totales y bajos niveles de colesterol de HDL. Los regímenes de dosificación adicionales se pueden encontrar en los ejemplos enseguida. De preferencia, PAZ se administra como un suplemento oral liquido, pero la dosificación de compuestos sintéticos que son identificados que son responsables para las actividades observadas es probable que esté en la forma de cápsulas que se administran oralmente con concentración (es) en el intervalo de mg o g diariamente. Por ejemplo, aproximadamente 1 o más onzas por día en sujetos generalmente no sintomáticos se pueden administrar y aproximadamente 3 o más onzas por día en sujetos enfermos se pueden administrar. Los regímenes de dosificación adicionales se pueden encontrar en los siguientes ejemplos enseguida.

La presente invención proporciona un método para tratar la hipercolesterolemia en un paciente, al administrar una cantidad efectiva de un producto de fermentación microbiana, y al regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteina. Al administrar el producto de fermentación microbiana, en decir, PAZ, sus componentes aislados o análogos químicamente sintetizados del mismo, uno o más de los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteina y/o colesterol pueden ser ya sea regulados hacia arriba- o hacia abajo. Este método es descrito en más detalle enseguida .

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para regular los niveles de colesterol en un paciente al administrar una cantidad efectiva de una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ, y análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ, y al regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteína . De preferencia, la composición está en la forma de un suplemento oral líquido, sin embargo también se pueden utilizar otras formas descritas en la presente. La composición también puede estar en la forma de un nutracéutico, y además puede ser un aditivo alimenticio. De preferencia, la administración de la composición es diaria, sin embargo se pueden utilizar otros perfiles de administración como son descritos en la presente.

Varios genes son regulados hacia arriba y regulados hacia abajo al administrar la composición. La transcripción de los genes ApoAl y SRBl es regulada hacia arriba, mientras que la transcripción del gen que codifica CETP es regulada hacia abajo. Por lo tanto, más generalmente, el alto LDL y colesterol total (TC) y el colesterol de bajo HDL se puede tratar al regular hacia arriba por lo menos uno de los genes que codifican ABCAl, ApoAl y SRBl, y/o al regular hacia abajo el gen que codifica CETP. Más específicamente, los niveles de TC pueden ser disminuidos, los niveles de LDL puede ser disminuidos y los niveles de HDL pueden ser elevados al administrar PAZ. La regulación hacia arriba y la regulación hacia abajo de estos genes se pueden confirmar al realizar un ensayo, tal como al tomar una muestra de plasma o de sangre del paciente y al analizar para TC, HDL y LDL, o al utilizar un método comúnmente disponible.

La presente invención también proporciona un método para tratar los altos niveles de colesterol en un paciente al administrar una cantidad efectiva del producto de fermentación microbiana, al regular hacia arriba la expresión de por lo menos uno de los genes que codifican ABCA1, ApoAl y SRB1, y/o al regular hacia abajo el gen que codifica CETP. El producto de fermentación microbiana es una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ, y análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ como es descrito en lo anterior. El producto de fermentación microbiana puede ser suplemento oral líquido, y se pueden utilizar otras formas de dosificación y perfiles de administración con este método como es descrito en la presente. Un ensayo se puede realizar para confirmar que las etapas de regulación hacia arriba y regulación hacia abajo se han realizado como es descrito previamente en lo anterior.

La presente invención además proporciona un método para prevenir el inicio de alto colesterol al administrar una cantidad efectiva de una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ, y análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ, al regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteína, y al prevenir el inicio de alto colesterol. Este es un método profiláctico en el cual los individuos quienes están en riesgo de desarrollar alto colesterol pueden tomar medidas para protegerse a sí mismos. Una vez que un individuo se confirma que está en riesgo de desarrollar alto colesterol, ellos pueden comenzar a tomar la composición. La composición se puede administrar diariamente. La composición puede estar en la forma de un suplemento oral líquido como un nutracéutico, o aditivo alimenticio. Se puede utilizar cualquier otra forma de dosificación o régimen de administración .

En los Ejemplos enseguida, varias pruebas se han realizado con PAZ y fracciones del mismo para determinar la regulación del gen y los niveles de colesterol. Un patrón similar de regulación del gen se observa para animales tratados con ciertas fracciones cromatográficamente purificadas (por ejemplo, fracción PF3 y PF4) que contienen relativamente pocos componentes como es comparado con PAZ mismo. Sin embargo, la expresión del gen que codifica ApoAl es más notablemente aumentada por PAZ que por PF3 o PF4 solo, indicando la presencia en PAZ de componente ( s ) adicional con efectos benéficos en el metabolismo de colesterol, o efectos sinergísticos de. los componentes en estas dos fracciones. Por lo tanto, más generalmente, los altos niveles de colesterol se pueden tratar benéficamente utilizando PAZ o compuestos contenidos en el mismo para regular hacia arriba ApoAl y/o SRBl y/o regular hacia abajo CETP.

PAZ y PF4 se han probado para los efectos directos sobre la actividad funcional de las proteínas CETP y HMGCoA reductasa, y encontraron que no tienen efecto. Estos datos además sustentan el mecanismo que está al nivel transcripcional (ver el Ejemplo 2) .

En contraste a la habilidad demostrada de PAZ y los componentes de PF3 y PF4 para alterar favorablemente la expresión de uno o más de estos tres genes in vivo, cuando se prueba por su habilidad para influenciar la expresión de genes involucrados en el metabolismo de colesterol en células del hígado humanas cultivadas (HepG2), solamente se observó cambio significante en la expresión del gen que codifica CETP. Cuando se probó in vitro sobre células epiteliales vasculares (HUVEC) , los resultados obtenidos fueron erráticos e inconsistentes con el efecto benéfico observado sobre el metabolismo de colesterol in vivo. Por consiguiente la actividad observada es no obvia en que, cuando se procede utilizando los métodos empleados en la investigación farmacéutica moderna, específicamente la clasificación primero in vitro sobre líneas de células, PAZ sería excluido de la consideración adicional como una composición de disminución de colesterol (ver el Ejemplo 3) .

El efecto total de PAZ, como se muestra en el Ejemplo 1, es que disminuye el colesterol de plasma total (TC) asi como el LDL. PAZ también incrementa significantemente HDL, que produce una relación de TC/HDL mejorada. El cambio en el colesterol del plasma también está acompañado por un desplazamiento en las partículas de lipoproteína . Cada uno de estos efectos se produce por la regulación hacia arriba y/o la regulación hacia abajo de la expresión de genes específicos como es descrito en lo anterior.

Mientras que los experimentos se realizaron en hámsters con los compuestos de la presente invención, los resultados son predictivos de aquellos esperados en humanos. Los hámsters son un modelo preferido para el uso en predecir la eficacia de fármacos candidatos sobre el metabolismo de colesterol en humanos.

PAZ, o preparaciones o compuestos derivados del mismo, se pueden administrar diariamente, o de acuerdo con un régimen de dosificación considerado apropiado por un profesional. Este tratamiento puede ser proporcionado como un régimen terapéutico a un paciente quien se ha diagnosticado con niveles de colesterol no saludables con el fin de llevar su colesterol a niveles más deseables. Alternativamente, el tratamiento puede ser proporcionado como régimen preventivo a un paciente quien tiene una propensión a desarrollar altos niveles de colesterol total y LDL y bajos niveles de colesterol HDL debido a una variedad de factores, y en este caso PAZ se puede administrar como un tratamiento profiláctico.

PAZ también se puede administrar como un nutracéutico o un aditivo alimenticio en varias bebidas u otras sustancias alimenticias.

El PAZ , fracciones derivadas del mismo, o compuestos sintetizados que son equivalente o análogos de los componentes activos de PAZ, que son los temas de la presente invención se administran y se dosifican de acuerdo con una buena práctica médica, tomando en cuenta la condición clínica del paciente individual, el sitio y método de administración, la programación de administración, edad del paciente, sexo, peso corporal y otros factores conocidos para los profesionales médicos. La "cantidad efectiva" farmacéuticamente para propósitos en la presente asi es determinada por tales consideraciones como son conocidas en la técnica. La cantidad debe ser efectiva para lograr el mejoramiento incluyendo pero no limitado a la tasa de supervivencia mejorada o recuperación más rápida, o mejoramiento o eliminación de los síntomas y otros indicadores como son seleccionados como medidas apropiadas por aquellos expertos en la técnica.

En el método de la presente invención, los compuestos de la presente invención se pueden administrar de varias maneras. Se deben observar que se puede administrar como el compuesto y se puede administrar solo o como un ingrediente activo en combinación con portadores, diluyentes adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables. Los compuestos se pueden administrar oralmente, subcutáneamente o parenteralmente incluyendo la administración intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitonealmente, intratonsilar e intranasal así como técnicas intratecales y de infusión. También son útiles implantes de los compuestos. El paciente que es tratado es un animal de sangre caliente y, en particular, mamíferos incluyendo el hombre. Los portadores, diluentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables así como portadores de implante generalmente se refieren a rellenadores inertes, no tóxicos sólidos o líquidos, diluyentes o material encapsulante que no reacciona con los ingredientes activos de la invención.

Las dosis pueden ser dosis individuales o dosis múltiples durante un período de varios días. El tratamiento generalmente tiene una duración proporcional a la duración del proceso de enfermedad y la efectividad del fármaco y la especie de paciente que es tratado.

Cuando se administran los compuestos de la presente invención parenteralmente, este generalmente se formula en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión) . Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas, estériles y polvos estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. El portador puede ser un solvente o medio dispersante que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , polietilenglicol liquido y los similares) , mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes . Los vehículos no acuosos tales como aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de olivo, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de girasol o aceite de cacahuate y ésteres, tal como miristato de isopropilo, también se puede utilizar como sistemas de solventes para las composiciones de compuesto. Adicionalmente, varios aditivos que aumentan la estabilidad, esterilidad e isotonicidad de las composiciones, incluyendo conservadores antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y soluciones reguladoras, se pueden adicionar. La prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar por varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y los similares. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azucares, cloruro de sodio y los similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede originar mediante el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. De acuerdo con la presente invención, sin embargo, cualquier vehículo, diluyente o aditivo utilizado tendría que ser compatible con los compuestos.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar los compuestos utilizados en la práctica de la presente invención en la cantidad requerida del solvente apropiado con varios de los otros ingredientes, como sea deseado.

Una formulación farmacológica de la presente invención se puede administrar al paciente en una formulación inyectable que contiene cualquier portador compatible, tales como varios vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes; o los compuestos utilizados en la presente invención se pueden administrar parenteralmente al paciente en la . forma de implantes subcutáneos de liberación lenta o sistemas de suministro dirigidos tales como anticuerpos monoclonales, suministro vectorizado, iontoforético, matrices poliméricas, liposomas y microesferas . Ejemplos de sistemas de suministro útiles en la presente invención incluyen: 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196 y 4,475,196. Muchos de otros de tales implantes, sistemas de suministro y módulos son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica .

La invención es además descrita en detalle por referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan para propósito de ilustración solamente, y no se proponen para ser limitantes a menos que se especifique de otra manera. Asi, la invención de ninguna manera debe ser considerada como que es limitada a los siguientes ejemplos, sino más bien, debe ser considerada que abarca cualquiera y todas las variaciones que llegan a ser evidentes como un resultado de la enseñanza proporcionada en la presente.

EJEMPLO 1 El objetivo específico de este experimento fue emplear las técnicas cromatográficas para separar el filtrado de cultivo de PAZ completo en fracciones basado en las propiedades químicas y físicas de sus componentes con el fin de (a) determinar si la- actividad biológica requirió la mezcla compleja completa o fue debido a uno o unos cuantos de sus componentes, (b) evaluar la actividad biológica de cada una de las fracciones PF derivadas mediante este proceso en sistemas de modelos experimentales tanto in vitro (cultivo de células) como in vivo (hámster) .

Materiales y Métodos Los siguientes equipos de ensayo se utilizaron para el análisis de colesterol en el plasma: De Pointe Scientific: Líquido de Colesterol (C7510 - para colesterol total en el plasma) Conjunto de Reactivo Líquido GPO de Triglicérido (T7531 - para TG en el plasma) HDL/Colesterol Mg/Dex (H7507 - para HDL en el plasma mediante precipitación con Magnesio) De Waco: Colesterol Libre E (435-35801) Fosfolípidos C (433-36201) El ProAlgaZyme™ se separó en subfracciones .

Fl : intercambio aniónico débil para capturar la mayoría de proteínas F2 : intercambio aniónico fuerte para capturar moléculas que contienen grupos carboxilo y otras funcionalidades negativamente cargadas, así como iones negativamente cargados F3 : intercambio catiónico fuerte para capturar moléculas que contienen grupos amino y otras funcionalidades positivamente cargadas, así como iones positivamente cargados Columna 4: una columna derivada C18 que enlaza moléculas orgánicas no polares F4. El liquido que fluye a través (no se enlaza) de cualquiera de las series de resinas empleadas (intercambio aniónico débil, columna de intercambio aniónico fuerte, intercambio catiónico fuerte, y columna C18). Esta fracción "de flujo pasante" es llamada PF4, contiene relativamente pocas moléculas, que deben incluir moléculas orgánicas polares pero no cargadas, asi como moléculas de baja polaridad que fueron no capturadas por la columna 4 y también se evaluó para la función biológica.

El Diseño de Estudio se muestra en la FIGURA 1: HF: Dieta Alta en Grasa (30% de calorías de la grasa; principalmente aceite de coco que contiene ácidos grasos saturados + 1% de aceite de soja) PAZ: ProAlgaZyme™ (solución completa) PF1, PF2, PF3 y PF4 son Fracciones cromatográficamente separadas de PAZ Los animales de control se alimentaron con una dieta de hámster regular.

P: se refiere a la dieta alta en grasa (30% de calorías del aceite de coco) PW: Dieta Alta en Grasa + Agua PP: Dieta Alta en Grasa + por ProAlgaZyme™ completo (diluido 20ml en 100ml) PF1 : Dieta Alta en Grasa + fracción 1 de ProAlgaZyme™ (diluido 5ml en 100ml) PF2 : Dieta Alta en Grasa + fracción 2 de ProAlgaZyme™ (diluido 5ml en 100ml) PF3: Dieta Alta en Grasa + fracción 3 de ProAlgaZyme™ (diluido 5ml en 100ml) PF : Dieta Alta en Grasa + fracción 4 de ProAlgaZyme™ (diluido 20ml en 100ml) Valor p = significado estadístico con respecto a PW. (ANOVA de Una vía, STATPLUS) ; n=10/grupo p<0.05 implica que el valor medio del parámetro (por ejemplo, TC) entre los dos grupos que son comparados son estadísticamente diferentes. Entre menor es el valor p, más alto es el significado estadístico.

En las gráficas, las columnas que son estadísticamente diferentes como es comparado con PW se han indicado por * (p<0.05) o ** (p<0.01) Resumen: Efecto Preventivo del PAZ sobre Lípidos en el Plasma en un Sistema de Modelo Preventivo de Colesterolemia de Hámster PAZ proporciona una disminución estadísticamente significante en el colesterol en el plasma total (TC) y no HDL (LDL) durante el estudio preventivo de 28 días. PAZ proporciona un incremento estadísticamente significante en HDL, conduciendo a una mejora notable en la relación de TC/HDL. El cambio en el colesterol en el plasma está acompañado con un desplazamiento en las partículas de lipoproteína . Los resultados se muestran en las FIGURAS 2-12.

Como se muestra en la FIGURA 2, el consumo de dieta promedio generalmente disminuyó durante las cuatro semanas. Como se muestra en la FIGURA 3, el peso corporal promedio se incrementó durante las cuatro semanas. La FIGURA 4 muestra que el consumo de agua promedio disminuyó durante las cuatro semanas. La FIGURA 5 muestra que la TC media fue significantemente menor para los animales alimentados con PF3 que para los animales que se les dio agua (P ) . La FIGURA 6 muestra que el colesterol HDL medio fue significantemente más alto para PP, PF3 y PF4 como es comparado con el grupo alimentado con agua (PW) . La FIGURA 7 muestra que la relación de TC/HDL media fue significantemente menor para PF3 y PF4 como es comparado con PW. La FIGURA 8 muestra que el colesterol LDL medio fue significantemente reducido para PP, PF3 y PF4 como es comparado con PW. La FIGURA 9 muestra que la reducción de los niveles de triglicéridos no alcanzó significado estadístico. La FIGURA 10 muestra el perfil de lipoproteína de cada grupo, y cada composición de PAZ produjo un desplazamiento del perfil. La FIGURA 11 muestra que hubo un desplazamiento . en la composición de lipoproteína de las partículas de densidad menor a más alta entre los hámsters alimentados con agua (PW) y aquellos alimentados con ProAlgaZyme™ (PP) . La FIGURA 12 muestra que hubo un desplazamiento en la composición de lipoproteína de las partículas de densidad menor a más alta en el agua contra los hámsters alimentados con PF3.

Los objetivos de los experimentos descritos en el Ejemplo 2 fueron (a) probar la actividad de PAZ y sus fracciones para su habilidad para alterar la función de las proteínas claves involucradas en el metabolismo de colesterol, y, si tal mecanismo (que es por ejemplo el caso para estatina) fue identificado, (b) emplear tal ensayo (s) para facilitar el fraccionamiento adicional del extracto de PAZ y la caracterización final del componente ( s ) activo.

EJEMPLO 2 Este ejemplo detalla el análisis cualitativo de los efectos de los filtrados de PAZ, PF4 y PF3 que tienen sobre la actividad de enzima de las enzimas que metabolizan el colesterol, proteína de transferencia de éster Colesterílico (CETP) , proteína de transferencia de Fosfolípido (PLTP) y HMG-CoA Reductasa (HMGR) .

Procedimiento : Ensayos de CETP y PLTP: El Equipo de Clasificación de Fármaco Inhibidor de CETP (Catalogo #K602-100) y el Equipo de Clasificación de Fármaco Inhibidor de PLTP (Catalogo #K602-100) se obtuvieron de BioVision Research Products (Mountain View, CA) . Los ensayos con enzimas se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 160 µ? de agua desionizada (DI), PF4 (no diluido) o PF3 (diluido 1:10 en agua DI) se suministró en cavidades de una placa de microtitulo de 96 cavidades negra. Volúmenes variantes de suero de conejo de control (fuente de CETP y PLTP) luego se adicionaron a las cavidades. Algunas cavidades no recibieron suero y sirvieron como controles de fluorescencia de fondo (blanco) . Una Mezcla Maestra que consiste de una parte de solución de Molécula Aceptora, una parte de solución de Molécula Donadora y dos partes de solución Reguladora de Ensayo lOx por cavidad se preparó y se escaló al número de cavidades utilizadas en cada ensayo. Cuarenta µ? de la Mezcla Maestra se adicionó a cada cavidad, la placa se selló y se incubó a 3 °C en una cámara humidificada durante 45 minutos. La intensidad de fluorescencia de cada cavidad se midió utilizando un fluorómetro Labsystems Fluoroskan Ascent FL con un par de filtros de excitación de 485 nm y de emisión de 527 nm. Cada condición se realizó por duplicado con los promedios reportados (las barras de error de desviación estándar se aplican a cada promedio) .

Ensayo de HMGR: el Equipo de Ensayo de HMG-CoA Reductasa (HMGR) se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . El ensayo con enzimas se llevó a cabo de acuerdo con la instrucción del fabricante. Brevemente, tubos de microcentrifuga de 1.5 mi tuvieron los siguientes reactivos adicionados a estos en este orden: solución reguladora de Ensayo lx, inhibidor (ya sea el inhibidor de Pravastatina suministrado, PF4 (15 µ?) o PF3 (15 µ? de una dilución de 1:10) al control de inhibidor y las muestras de control), NADPH, Solución de Substrato de H G-CoA y HMGR. Un tubo no tuvo HMGR adicionado y se utilizó como el blanco. La muestra de control positiva contuvo HMGR pero nada de inhibidor. Todas las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 1 mi. Los tubos se sometieron a vórtice brevemente después de la adición de HMGR para mezclar antes de transferir las soluciones de reacción a probetas Visibles de UV. Las lecturas de absorbencia a 340 nm se tomaron cada 15 segundos durante 5-7 minutos en un espectrofotómetro Visible de UV Shimadzu UV-1601. Las lecturas de absorbencia en 340 nm disminuirán en las muestras con actividad enzimática (por ejemplo, la muestra de control positivo) debido a la disminución en la concentración de NADPH.

Resultados : Ensayos de CETP y PLTP: No hubo efecto significante sobre la actividad de enzima de CETP (FIGURA 13) o PLTP (FIGURA 14) mediante PF4 cuando se comparó con la actividad de estas enzimas en agua DI en los volúmenes de suero utilizados .

Un ligero aumento en la actividad de CETP se observa en la presencia de PF3 (diluido 1:10) en cantidades más altas de suero (FIGURA 15) (ver las Conclusiones) . PF3 apareció para tener un efecto negativo, o inhibidor, sobre la actividad de PLTP comparado con el agua DI (FIGURA 16) .

Ensayo de HMGR: Sin cualquier inhibidor presente, la actividad de la enzima de HMGR produce una pendiente hacia abajo (negativa) apreciable (FIGURA 17, línea de tendencia rosa sólida) . Como es esperado, la actividad de HMGR en la presencia del inhibidor pravastatina se redujo significantemente (FIGURA 17, comparar la línea de tendencia rosa sólida (HMGR) con la línea de tendencia naranja sólida (HMGR+pravastatina ) ) . Una disminución en la actividad de HMGR no se detectó cuando PF4 estuvo presente en el ensayo (FIGURA 17, comparar la línea de tendencia rosa sólida (HMGR) con la línea de tendencia azul clara sólida (HMGR+PF4) ) . Sin embargo, PF3 se observó que tiene un -efecto similar al inhibidor sobre la actividad de HMGR en este ensayo (FIGURA 17, comparar la línea de tendencia rosa sólida (HMGR) con la línea de tendencia púrpura (HMGR+PF3) ) .

Conclusiones: Ensayos de CETP y PLTP: Los incrementos en veces en los valores de fluorescencia de control (mediciones de ensayo obtenidas utilizando agua DI con o sin suero de control) estuvieron dentro del intervalo anticipado como es reportado en las instrucciones del fabricante indicando que el ensayo se realizó como es esperado.

La fracción de PAZ, PF4 no apareció para tener algún efecto sobre la actividad de ya sea CETP o PLTP utilizando estos equipos de ensayo. La fracción de PAZ, PF3 (diluida 1:10) apareció para tener un efecto sobre la actividad de CETP y PLTP. Sin embargo, el efecto es contrario a lo que esperó en base al mecanismo de acción de estas dos enzimas y el reporte del potencial de disminución de colesterol del PF3 en un modelo de hipercolesterolemia in vivo. La precaución con la interpretación de estos datos, especialmente para PF3, es así garantizada. Aunque PF3 se diluyó 10 veces en agua DI en estos ensayos, hay todavía una cantidad dignificante de sal presente comparada con el agua DI sola o PF4. Esto podría tener un efecto adverso sobre la actividad de las enzimas probadas o el lípido fluorescentemente marcado utilizado en los ensayos. Además, el pH de la PF3 diluida no se examinó antes del uso en estos ensayos, que también puede contribuir a los mismos efectos adversos. Otro aspecto importante de este estudio es mostrar que PAZ no actúa directamente sobre las lipoproteínas y por lo tanto no tiene el mismo mecanismo de acción como las estatinas que son actualmente utilizadas para tratar el alto colesterol .

Ensayo de HMGR: En este ensayo de actividad, una disminución en la absorbencia en 340 nm durante el tiempo indica la actividad de HMGR conforme la concentración de NADPH disminuye debido a su conversión a NADP mediante HMGR. La fracción de PAZ, PF4 no apareció para inhibir la actividad de HMGR en este ensayo. Sin embargo, hubo una inhibición observable observada para el filtrado de PAZ, PF3. Nuevamente, la precaución debe ser tomada cuando se interpretan estos resultados por las mismas razones como se dan para los efectos observados de PF3 sobre la actividad de CETP y PLTP.

Se divulgó previamente que las fracciones de PAZ serian evaluadas para su efecto sobre cuatro enzimas involucradas en el metabolismo de colesterol. Los ensayos se realizaron y los datos preliminares se obtuvieron para CETP, PLTP y HMG-CoA Reductasa como es detallado en lo anterior. La cuarta enzima, lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT; un determinante mayor de la concentración de HDL del plasma) no podría ser evaluada. Basado en los datos anteriores, se concluyó que no hay descubrimiento significantes que consideran los efectos directos de PF4 y PF3 sobre las actividades de las proteínas CETP, PLTP y HMGR.

Aunque estas proteínas, junto con LCAT, son frecuentemente los objetivos prominentes evaluados cuando se prueban los efectos de los candidatos farmacéuticos sobre los niveles de colesterol de HDL, otros mecanismos están involucrados en la ruta de transporte de colesterol inversa que conducen a incrementar los niveles de colesterol de HDL y también deben ser considerados para la evaluación en este momento. Por ejemplo, ApoAl constituye 70% del componente de proteina de las partículas de HDL y está presente en casi todas las partículas de HDL. Muchos investigadores creen que la mejor manera para elevar los niveles de colesterol de HDL es producir más ApoAl, que es el precursor del nuevo colesterol HDL. Por esta razón la regulación hacia arriba de la expresión de la proteína apoA-1 endógena se considera uno de los procedimientos más prometedores para el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas al colesterol HDL. Mecanismos adicionales que deben ser considerados son la regulación de las proteínas de membrana, clase B de receptor depurador, tipo 1 (SR-B1) y el cásete 1 de enlace de ATP (ABC1) (el primero como un receptor de buena fe para HDL y el segundo como un transportador de lípidos) ya que ambos se han implicado fuertemente como que son importantes en la afluencia de colesterol. La regulación, y así la disponibilidad, de la expresión del receptor de LDL y el reciclado también es un mecanismo mediante el cual los niveles de colesterol se ajustan fisiológicamente y deben ser evaluados .

Los datos revelan pocos, si los hay, descubrimientos significantes que consideran los efectos de las fracciones PF4 y PF3 sobre la actividad de CETP, PLTP y HMGR. Sin embargo, las mismas fracciones de PAZ utilizadas en los ensayos de enzima in vitro por ser una habilidad para elevar los niveles de colesterol HDL en un modelo de hipercolesterolemia de animal in vivo. Estos resultados aparentemente en conflicto podría ser debido a (a) el mecanismo involucrado en la disminución de niveles de colesterol in vivo que no involucra las enzimas específicas que los inventores han probado in vitro, (b) un mecanismo alternativo tal como la alteración de la expresión o cambio de una o más de esta proteínas, y/o (c) un requerimiento para una ruta de conversión prebiótica in vivo que actúa sobre los constituyentes en PAZ para generar un metabolito activo. Este proceso de bioactivación puede . ocurrir ya sea dentro del tracto gastrointestinal o la corriente sanguínea de humanos y animales o en la microflora bacteriana que persiste en el intestino de humanos y animales.

Los objetivos de los experimentos descritos en los Ejemplos 3 y 4 fueron (a) evaluar PAZ y sus fracciones para su habilidad para alterar la expresión de genes que codifican proteínas claves involucradas en el metabolismo de colesterol y, si tal mecanismo se identificó, (b) emplear tal ensayo (s) para facilitar el f accionamiento adicional del extracto de PAZ y la caracterización final del componente ( s ) activo.

EJEMPLO 3 Un objetivo específico fue explicar el perfil de lípido del plasma más benéfico (TC menor, HDL más altos) efectuado por la alimentación del PAZ completo (PP) y la fracción 4 de PAZ (PF4) a hámsters al mismo tiempo como una dieta alta en grasa (es decir, modelo preventivo) . La evaluación por lo tanto se realizó de los niveles de expresión de los genes involucrados en el metabolismo de HDL del ApoAl, ABCAl, SR-Bl y CETP en tejidos recolectados de hígado de hámsters que se recolectaron después de 4 semanas del protocolo preventivo empleado en el Ejemplo 1. Otro objetivo específico fue evaluar el efecto de PAZ y sus fracciones sobre la regulación del gen de HDL empleando in vitro ya sea sistemas de células HepG2 y HUVEC (datos no mostrados) . En este ejemplo, los datos se muestran de cinco animales/grupos con tres replicas por animal.

La FIGURA 13 ilustra los componentes mayores de la ruta de transporte de colesterol inversa y otros sitios de acción de HDL sobre la patogénesis de factores de ateroesclerosis . ApoAl esta involucrada en la producción de partículas HDL nacientes. ABCAl transporta los lípidos de los tejidos periféricos a HDL naciente para formar partículas de HDL más grandes. Las partículas de HDL grandes se remueven por la vía del receptor SR-Bl sobre el hígado en la bilis, la evacuación del plasma ocurre y Apol se recicla. CETP transfiere los lípidos de HDL a las partículas no de HDL (similares a LDL) . La disminución de esta transferencia es benéfica .

Cultivo de células, tratamiento, aislamiento de RNA Células Hep-G2 se cultivaron en DMEM (+10% FBS, +5% PenStrep, +5% L-glutamina) mientras que las células HUVEC se cultivaron en el Medio 199 (+25mg de Factor de Crecimiento Endotelial, +50mg Heparina, +20% FBS, +5% PenStrep, +5% L-glutamina) . 3xl05 células se colocaron en una placa de 6 cavidades. Veinticuatro horas después de la colocación en placa, la células se trataron (control, Paz 1:100, Paz 1-20, Paz 1-10, Nueva Fracción-4 1:100, Nueva Fracción-4 1:20, Nueva Fracción-4 1-10, Fracción Vieja-4 1:100, Fracción Vieja-4 1:20, Fracción Vieja-4 1:10). Las células se trataron durante 16h después de lo cual se aisló el RNA total utilizando el Mini Equipo Qiagen RNeasy y Qiagen QIAshredder, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante.

RNA a cDNA El RNA se convirtió en cDNA utilizando la Mezcla Maestra de R A-CD A de Alta Capacidad (Applied Biosystems) , siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante iniciando con 1 yg de RNA total.

RT-PCR Cuatro cebadores se obtuvieron de Applied Biosystems: 1) Proteina de transferencia de éster colesterilico (CETP) de Homo sapiens: secuencia de cebador delantero ACCTTCTCGCCCACACTGCT (SEQ ID NO: 1), secuencia de cebador trasero TGAAGCCCCAGGTCTCCAGC (SEQ ID NO: 2) ; 2) cásete de enlace de ATP, sub familia A (ABCA1) de Homo sapiens: secuencia de cebador delantero AAGACCCTGGCTTCGGGACC (SEQ ID NO: 3) , secuencia de cebador trasero ATGGTCTGGGGAACTGGGGC (SEQ ID NO: 4); 3) Clase B del receptor depurador, miembro 1 (SR-B1) de Homo sapiens: secuencia de cebador delantero AAGAACGTGCGCATCGACCC (SEQ ID NO: 5), secuencia de cebador trasero TCATGAAGGCACGTTCGCCG (SEQ ID NO: 6); 4) AP0A1: secuencia de cebador delantero CATTTCTGGCAGCAAGATGA (SEQ ID NO: 7), secuencia de cebador trasero GCCTTCAAACTGGGACACAT (SEQ ID NO: 8) . La concentración final de los cebadores fue 5µ?. Las PCRs en tiempo real se llevaron a cabo en un total de 25µL de la mezcla de reacción (2 L de cDNA, 12.5 L de la Mezcla Maestra 2x SYBR Green PCR de Applied Biosystems, 1.0 de cada 5 mol/L de cebadores delantero y trasero, y 10yL de H20 destilada) . El programa de PCR se inició en 10 minutos a 95°C antes de 50 ciclos térmicos cada uno de 30 s a 95°C y 1 min a 60°C. Los datos se analizaron de acuerdo con el método Ct comparativo y se normalizaron a la expresión de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa en cada muestra (Invitrogen) : secuencia de cebador delantero ACCCAGAAGACTGTGGATGG (SEQ ID NO: 9) , secuencia de cebador trasero CAGTGAGCTTCCCGTTCAG (SEQ ID NO: 10) .

HAMSTERS 1. ABCA1 F: 5' -ATAGCAGGCTCCAACCCTGAC-3' (SEQ ID NO: 11) R: 5' -GGTACTGAAGCATGTTTCGATGTT-3' (SEQ ID NO: 12) 2. CETP F: F : 5 ' -AAGGGTGTCGTGGTCAGTTCT—3 ' (SEQ ID NO: 13) R: F: 5-ACTGATGATCTCGGGGTTGA —3' (SEQ ID NO: 14) 3. apo A-I F: 5'- ACC-GTTCAG- GAT-GAA-AAC-TGT-AG-3 ' (SEQ ID NO: 15) R: 5'- GTGACT- CAG-GAG-TTC-TGG-GAT-AAC-3 ' (SEQ ID NO: 16) 4. S -BI F: 5' -AAG-CCT-GCA-GGT-CTA-TGA-AGC-3' (SEQ ID NO: : 17) R: 5' -AGA-AAC-CTT-CAT-TGG-GTG-GGT-A-3' (SEQ ID NO: 18) HUMANOS CETP F: ACCTTCTCGCCCACACTGCT (SEQ ID NO: 19) R: TGAAGCCCCAGGTCTCCAGC ( SEQ ID NO: 20) Secuencia (5'->3') ABCA1 F: AAGACCCTGGCTTCGGGACC (SEQ ID NO: 21) R: ATGGTCTGGGGAACTGGGGC¦ (SEQ ID NO: 22) Secuencia (5'->3') SRB1 F: AAGAACGTGCGCATCGACCC (SEQ ID NO: 23) R: TCATGAAGGCACGTTCGCCG (SEQ ID NO: 24) APO-A1 F: CATTTCTGGCAGCAAGATGA (SEQ ID NO: 25) R: GCCTTCAAACTGGGACACAT (SEQ ID NO: 26) EJEMPLO 4 Un procedimiento alternativo se empleó para explorar el mecanismo responsable para lo más benéfico en el perfil de lipido del plasma (menor TC, más alto en HDL) logrado por la administración del PAZ completo (PP) y la fracción 4 de PAZ (PF4) a hámsters alimentados con una dieta alta en grasa (modelo preventivo) . La RT-PCR cuantitativa se utilizó para evaluar los niveles relativos de transcripción de los genes específicos involucrados en el metabolismo de HDL, es decir ApoAl, ABCA1, SR-Bl y CETP. En este ejemplo, los datos se muestran de cinco animales/grupo con tres replicas por animal.

La FIGURA 19 muestra una gráfica de los niveles relativos de transcripción de los genes especificados en animales alimentados con una dieta alta en grasa más el PAZ completo (PP) o fracción 4 (PF4) o agua (PW) como es comparado con el grupo de control en una dieta regular (baja en grasa) y agua (CW) . Los animales alimentados con una dieta alta en grasa y agua mostraron un incremento en la expresión de CETP, que explica el LDLc y TC en el plasma más alto comparado con los grupos CW y PP/PF4. También mostraron una disminución en la expresión de ApoAl, que se correlaciona con la producción reducida de HDLc. También mostraron una disminución en la expresión de SR-Bl, que se correlaciona con la evacuación deprimida de colesterol por la vía de la ruta de transporte de colesterol inversa.

La FIGURA 20 muestra una gráfica del nivel relativo de transcripción de los genes especificados en animales alimentados con una dieta alta en grasa más PAZ completo (PP) o fracción 4 (PF4) como son comparados con el grupo de control en dieta alta en grasa y agua (PW) . Los niveles de expresión de ABCA1 y CETP en PP y PF4 fueron similares. La expresión de ApoAl fue altamente elevada en PP como es comparado con PF4, que se correlaciona con una producción mucho más grande de partículas de HDL nacientes. Esto puede ser verificado mediante el manchado de Western y tamaño/densidad de partícula de HDL. El nivel de expresión de SR-B1 es más alto en el grupo PF4, que se correlaciona con un incremento en la evacuación. Esto se correlaciona con la disminución significante en TC.

En resumen, los análisis de qPCR de la regulación del gen utilizando mRNA de muestras de hígado de hámsters corrobora los cambios en el perfil del plasma de lípido observado en el estudio del Ejemplo 1, y sustenta la regulación de la expresión de genes que codifican proteínas claves en el metabolismo de lipoproteína con un mecanismo de acción para PAZ o sus componentes.

EJEMPLO 5 El fraccionamiento de los componentes activos de PAZ se ha dificultado significantemente por el uso primario de métodos in vivo a largo plazo aunque, en contraste a los métodos de clasificación de alto rendimiento típicamente empleados por la investigación farmacéutica moderna que f ecuentemente no logran predecir los efectos in vivo finales (tanto positivos como negativos) ellos proporcionan una prueba de ácido para la actividad in vivo. Sin embargo, dados los resultados iniciales que indican que los ensayos in vitro que emplean células HEPG2 para monitorear la expresión del gen CETP pueden proporcionar un punto final suplente para la clasificación, los efectos de PAZ sobre la expresión de CETP en células HEPG2 cultivadas además se examinaron.

La FIGURA 21 ilustra que varios lotes de producción de PAZ tienen potente actividad en la reducción de la expresión de CETP en células HEPG2.

La FIGURA 22 presenta los resultados de un estudio de dosis-respuesta en el cual diluciones incrementadas de PAZ en el medio de cultivo se correlacionaron con la represión incrementada de la expresión de CETP. Estos datos muestran que (a) PAZ es extremadamente potente y solamente se requieren bajas dosis para lograr un efecto benéfico, y/o (b) puede haber otros componentes de PAZ que, en ciertos niveles, reducen los efectos benéficos del PAZ.

EJEMPLO 6 Los cambios benéficos significantes en los niveles de colesterol y HDL, y en el nivel de expresión de ciertos genes claves involucrados en el metabolismo de lipoproteina se observaron en el sistema de modelo preventivo in vivo. Sin embargo, dada la necesidad por agentes novedosos para tratar individuos con hipercolesterolemia, fue importante valorar la habilidad del PAZ y reacciones derivadas del mismo para mejorar el perfil de colesterol y lipoproteina en un modelo terapéutico. El modelo experimental de hámsters terapéutico se empleó en el cual los animales (tres grupos de 8 animales cada uno) primero se administraron con una dieta alta en grasa durante 28 días, y luego se co-administraron con una dieta alta en grasa más PAZ o fracciones derivados del mismo durante 21 días adicionales antes del sacrificio. Los resultados obtenidos se presentan en las FIGURAS 23 - 25.

La FIGURA 23 presenta los efectos del PAZ o fracción 3 derivada del mismo en los niveles de colesterol total (TC) , HDL y triglicéridos en el plasma de hámsters tratados con este protocolo.

La FIGURA 24 ilustra la reducción en la relación del colesterol a HDL afectada por el tratamiento terapéutico de hámsters con la Fracción 3 de PAZ.

La FIGURA 25 ilustra la elevación significante de la expresión del gen que codifica ApoAl en los hígados de animales sometidos al tratamiento terapéutico de PAZ para la hipercolesterolemia .

EJEMPLO 7 Dado que la administración oral a largo plazo de PAZ y fracciones derivadas de PAZ son efectivos en los sistemas de modelo tanto preventivo como terapéutico, se observan cambios benéficos significantes en la expresión de genes asociados con el metabolismo de lipoproteina, y que los agentes directamente modulan la expresión del gen son probables que causen tales cambios de manera relativa rápidamente (aunque el cambio de lipoproteina y cambios resultantes en el perfil de lipoproteina pueden requerir sustancialmente más tiempo) , la habilidad de las fracciones de PAZ para alterar la expresión de los genes APOAl y CETP se evaluó en un modelo terapéutico a corto plazo en el cual los animales se pre-trataron durante 28 días con una dieta alta en grasa, y luego PF3, PF4 (con o sin varios tratamientos para concentrar sus componentes) se administraron durante 7 días (tres animales/grupo) antes del sacrificio y la extracción de mRNA y qPCR.

La FIGURA 26 presenta los resultados de estos estudios. De manera sorprendente, ni PF4 ni los derivados del mismo produjeron aumento significante de la expresión de ApoAl. Sin embargo, consistente con los resultados obtenidos en estudios terapéuticos y preventivos más largos, la fracción PF3 significantemente aumentó la expresión de ApoAl en un modelo experimental terapéutico a corto plazo, sugiriendo el potencial de los componentes en PF3 para activar directamente la expresión de este gen. Aunque estos datos muestran que los cambios benéficos en la expresión del gen observados para PF3, los cambios benéficos en la expresión del gen no se observaron para PF4 en este estudio terapéutico a corto plazo. Sin embargo, dados los cambios benéficos reproductibles en la expresión del gen obtenido en estudios terapéuticos y preventivos más largos, estos datos sustentan un mecanismo posiblemente indirecto, más complejo para la regulación genética por los componentes de PAZ en la fracción PF4.

EJEMPLO 8 Un estudio de tiempo se realizó para evaluar los efectos de la Fracción PF4 derivada de PAZ sobre el metabolismo de colesterol y lipoproteina in vivo bajo condiciones terapéuticas, es decir, empleando un modelo de animal en el cual se indujo la hipercolesterolemia antes de la administración de PF . La FIGURA 27 muestra el diseño de estudio que incluye el análisis de lipidos en el plasma y la expresión de mRNA del hígado. PF4 es la Fracción 4 derivada del PAZ utilizando el método cromatográfico descrito en el Ejemplo 1. Los resultados obtenidos se presentan en las FIGURAS 27- 32. La FIGURA 28 muestra el colesterol total en el plasma, la FIGURA 29 muestra el HDL-c en el plasma, y la FIGURA 30 muestra los triglicéridos en el plasma en diferentes puntos de tiempo. La FIGURA 31 muestra el cambio en los parámetros de lipido en el plasma (TC, HDL, TG) en el tratamiento con PF4 en diferentes puntos de tiempo. La FIGURA 32 muestra la regulación del gen de ApoAl y CETP en diferentes puntos de tiempo.

La FIGURA 33 es una comparación de los resultados obtenidos en múltiples estudios de los efectos de la fracción de PAZ, PF4 sobre los parámetros del metabolismo de lipoproteina en un modelo experimental un vivo. Este estudio de tiempo utilizó el procedimiento terapéutico (4 semanas en dieta HF, seguido por el tratamiento con PF4). PF4 (lote 3) aquí en el día 21 muestra un perfil de lipido muy similar a PF4 (lote 1) después de 28 días en un procedimiento de prevención (4 semanas de intervención simultánea de HF y PF4). La expresión de tanto ApoAl como de CETP se incrementó en el día 21 en el estudio de tiempo terapéutico (PF4/lote 3) . ApoAl se incrementó mientras que CETP disminuyó utilizando PF4/lote 1 en el Ejemplo 4 (ver la FIGURA 20) . Es posible que la diferencia en la expresión de CETP que se observó entre estos estudios refleje los efectos de la alimentación de HF a largo plazo sin algún agente que contrarreste su efecto en el sistema de modelo terapéutico.

Por toda esta solicitud, varias publicaciones, incluyendo Patentes Norteamericanas, son referenciadas por autor y año, y las patentes por número. Las citas completas para las publicaciones se listan enseguida. La descripción de estas publicaciones y patentes en sus totalidades se incorporan en la presente por referencia en esta solicitud con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

La invención se ha descrito en una manera ilustrativa, y se va a entender que la terminología, que se ha utilizado se propone para ser de la naturaleza de palabras de descripción antes que de limitación.

Obviamente, muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles en vista de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, se va a entender que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención se puede practicar de otra manera que como es descrita específicamente.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar la hipercolesterolemia en un paciente, caracterizado porque incluye las etapas de: administrar una cantidad efectiva de un producto de fermentación microbiana, y regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteina .

2. Un método para regular los niveles de colesterol en un paciente, caracterizado porque incluye las etapas de: administrar una cantidad efectiva de una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ, y/o análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ, y regular la expresión de genes involucrados en el metabolismo de lipoproteina.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la composición es un suplemento oral líquido.

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la composición es un nutracéutico .

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la composición es un aditivo alimenticio .

6. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la etapa de administración además se define como la administración de la composición diariamente.

7. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la etapa de regulación además de define como la disminución de los niveles de colesterol en el plasma totales (TC) , disminución de los niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) y elevación de los niveles de lipoproteína de alta densidad (HDL) .

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la etapa de regulación demás se define como la regulación hacia arriba de la expresión de por lo menos uno de los genes que codifican ABCAl, ApoAl y SR-Bl.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además incluye la etapa de regular hacia abajo el gen que codifica CETP.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además incluye la etapa de realizar un ensayo para confirmar que se han realizado las etapas de regulación hacia arriba y regulación hacia abajo.

11. Un método para tratar los altos niveles de colesterol en un individuo, caracterizado porque incluye las etapas de: administrar una cantidad efectiva de un producto de fermentación microbiana, regular hacia arriba la expresión de por lo menos uno de los genes que codifican ABCAl, ApoAl y SR-Bl, y regular hacia abajo el gen que codifica CETP.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el producto de fermentación microbiana es una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ y análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el producto de fermentación microbiana es un suplemento oral líquido.

14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además incluye la etapa de realizar un ensayo para confirmar que se han realizado las etapas de regulación hacia arriba y regulación hacia abajo.

15. Un método para prevenir el inicio de alto colesterol, caracterizado porque incluye las etapas de: administrar una cantidad efectiva de una composición elegida del grupo que consiste de PAZ, componentes específicos aislados de PAZ y análogos químicamente sintetizados de los componentes de PAZ, regular los genes involucrados en el metabolismo de lipoproteína, y prevenir el inicio del alto colesterol.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la composición es un suplemento oral líquido .

17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la composición en un nutraceútico .

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la composición es un aditivo alimenticio .

19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la composición se administra diariamente .

20. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la etapa de regulación además se define como la regulación hacia arriba de la expresión de por lo menos uno de los genes que codifican ABCAl, ApoAl y SR-B1.

21. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque además incluye la etapa de regular hacia abajo el gen que codifica CETP.