MX2012008765A

MX2012008765A - Proteinas de enlace a cd127.

Info

Publication number: MX2012008765A
Application number: MX2012008765A
Authority: MX
Inventors: Ian Kirby; Alexander H Taylor; Thomas Matthew Webb; Yu Xue
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2010-01-28
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2012-09-07
Also published as: PE20121702A1; EA201290589A1; CL2012002081A1; MY160590A; AU2011209713A1; IL220899A; KR20130028055A; EP2528947A4; UA104663C2; PE20170687A1; MA34004B1; SG182590A1; CR20120404A; US8940303B2; MX339083B; TWI489996B; UY33202A; CA2787070A1; ZA201205624B; CN102812046A

Abstract

Se proporcionan proteínas de enlace a antígeno que se enlazan al receptor de lL-7 humano (CD127). Las proteínas de enlace a antígeno típicamente son anticuerpos, y son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en seres humanos, particularmente enfermedades autoinmunes, tales como la esclerosis múltiple.

Description

PROTEÍNAS DE ENLACE A CD127 Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteínas de enlace a antígeno, en particular inmunoglobulinas, que se enlazan específicamente a la cadena a del receptor de IL-7 humano (CD127). La invención también se refiere a procedimientos de tratamiento de enfermedades o trastornos con dichas proteínas, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas y a procedimientos para su elaboración. Otros aspectos de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción siguiente.

Antecedentes de la Invención La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica desmielinizante que afecta al sistema nervioso central. En la esclerosis múltiple (EM), se cree que están implicadas células inmunes inflamatorias infiltrantes en la destrucción de oligodendrocitos, que son las células responsables de crear y mantener una capa grasa, conocida como vaina de mielina. La esclerosis múltiple (EM) da como resultado el adelgazamiento o la pérdida completa de la mielina. Cuando se pierde la mielina, las neuronas ya no pueden conducir eficazmente sus señales eléctricas, conduciendo a numerosas disfunciones neurológicas. Los individuos con esclerosis múltiple (EM) producen linfocitos T autorreactivos que participan en la formación de lesiones inflamatorias a lo largo de la vaina de mielina de las fibras nerviosas. El líquido cefalorraquídeo de pacientes con esclerosis múltiple (EM) activa contiene linfocitos T activados q ue i nfi ltran el tej ido cerebral y causan lesiones inflamatorias características , destruyendo la mieli na. Aunque los s íntomas de esclerosis múltiple y el transcu rso de la enfermedad pueden variar de una persona a otra, existen tres formas de la enfermedad — esclerosis múltiple (EM ) recidivante-remitente, esclerosis múltiple progresiva secundaria y esclerosis múltiple (EM) progresiva primaria.

En las fases tempranas de la esclerosis múltiple (EM) , se producen ataques inflamatorios a lo largo de intervalos cortos de actividad patológica intensamente aumentada. Estos episodios van seguidos de periodos de recuperación y remisión . Durante el periodo de remisión, la hi nchazón local en la lesión del sistema nervioso se resuelve , las cél ulas inmunes se vuelven menos activas o inactivas , y las cél ulas productoras de mielina remielinizan los axones. La señalización nerviosa mejora y la discapacidad causada por la inflamación se vuelve menos grave o desaparece en su totalidad . Esta fase de la enfermedad se denomina esclerosis múltiple (EM ) recidivante-remitente (EM R R) . Si n embargo, las lesiones no cicatrizan completamente. Algunas permanecen como lesiones "crónicas", que habitualmente tienen una región de núcleo desmiel inizada q ue carece de células inmunes . Con el tiempo, las células en el centro de dichas lesiones mueren en su mayoría , aunque la inflamación continúa con frecuencia en sus bordes. El cerebro puede adaptarse bien a la pérdida de algunas neuronas y la discapacidad permanente puede no aparecer du rante muchos años. Sin embargo, más del 50 por ciento de los pacientes con esclerosis múltiple (EM) entran finalmente en una fase de deterioro progresivo denomi nada esclerosis múltiple progresiva secundaria ( EM PS) . En esta fase , la enfermedad ya no responde bien a fármacos modificadores de enfermedad y las discapacidades del paciente empeoran a un ritmo constante . La destrucción de neuronas desde temprano en el transcurso natural de la esclerosis múltiple (EM) sugie re que las discapacidades progresivas de la EM PS pod rían ser el resultado de una pérdida neuronal acumulada que fi nal mente supe ra las capacidades compensatorias del cerebro. La esclerosis múltiple progresiva primaria es un tipo de esclerosis múltiple en la que no hay recaídas, pero du rante un periodo de años, existe una pérdida gradual de funciones f ísicas y cognitivas .

El objetivo del tratamiento en pacientes con esclerosis múltiple recidivante-remitente es reduci r la frecuencia y gravedad de las recaídas (y por lo tanto, evitar exacerbaciones) así como evitar o pospone r el i nicio de la fase progresiva de la enfermedad. Para consegui r este objetivo, especialmente en el pasado, se han usados fármacos i nmunomoduladores o in munosupresores, pero nunca han encontrado una aceptación generalizada debido a su eficacia li mitada y a su considerable toxicidad . Por ejemplo, se han realizado grandes ensayos controlados aleatorizados con éxito con interferón beta- 1 a, interferón beta-1 b y acetato de glati rámero .

Tanto las respuestas alteradas de linfocitos T autoinmunes como la disfunción de la red reguladora del sistema inmune desempeñan un papel importante en patologías autoinmunes humanas, tales como la esclerosis múltiple (EM) y la artritis reumatoide (Kuchroo y colaboradores, (2002) Annu. Rev. Immunol. 20: 101-123; Sospedra y Martin (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 683-747; Ton y Miossec (2007) Curr. Opin. Rheumatol. 19: 284-288).

Aunque la etiología y la patogénesis de la esclerosis múltiple (EM) continúan siendo desconocidas, generalmente se considera una patología autoinmune en la que se cree que los linfocitos T autorreactivos de potencial patógeno, tales como los linfocitos TH1 y TH17, desempeñan un papel importante. Existen pruebas de que estos linfocitos T efectores se activan in vivo durante el proceso patológico y son atribuibles a la inflamación del sistema nervioso central (SNC). También existen pruebas de que estos linfocitos T median la destrucción de células que expresan mielina en lesiones de EAE y esclerosis múltiple (EM) durante la fase activa de la enfermedad. Por otro lado, los linfocitos T reguladores (Treg) que normalmente mantienen los linfocitos TH1 y TH17 patógenos bajo control, son deficientes en pacientes con esclerosis múltiple (EM), inclinando adicionalmente el sistema inmune hacia un estado proinflamatorio.

Tres grupos separados han descrito recientemente los resultados de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en todo el genoma explorando un total de 17.947 donantes con o sin esclerosis múltiple (EM). Después de explorar 334.923 SNP, encontraron una asociación altamente significativa (P global = 2,9 x 107) de un SNP codificante no sinónimo en la cadena alfa del receptor de IL-7 humano (IL-7Ra) con susceptibilidad a esclerosis múltiple (EM). El SNP corresponde a un cambio de T a C en el exón 6 de CD127 (también conocido como IL-7Ra). Este cambio aumenta la posibilidad de saltarse el exón 6 durante el corte y empalme de ARN, dando como resultado una forma soluble de CD127. Además, las expresiones de ARN de CD127 e IL-7 en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con esclerosis múltiple (EM) son significativamente superiores respecto a LCR de pacientes con otros trastornos neurológicos.

Se sabe que la IL-7 y el receptor de IL-7 (IL-7R) desempeñan un papel importante en el desarrollo de linfocitos T y linfocitos B y en la homeostasis, principalmente en el entorno del timo. De hecho, las células estromales tímicas, el timo fetal y la médula ósea son sitios de producción de IL-7. El receptor de IL-7 constituido por dos subunidades, CD127 y una cadena común (cadena gama o ye) que está compartida por los receptores de IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 e IL-21.

El CD127 también se conoce como receptor alfa de IL-7 (IL-7Ra) y p90 IL-7R. El CD127 humano (número de referencia SwissProt P16871) tiene un total de 459 aminoácidos (20 de secuencia de señal). Comprende una región extracelular de 219 aminoácidos, una región transmembrana de 25 aminoácidos y una región intracelular de 195 aminoácidos. La numeración de los residuos dentro del CD127, como se usa en el presente documento (por ejemplo, para la descripción de epítopos de anticuerpos) se basa en la proteína de longitud completa, incluyendo los residuos de secuencia de señal. El CD127 puede existir en cuatro isoformas, la isoforma H20 (número de referencia SwissProt P16871-1) tiene la secuencia de aminoácidos siguiente (incluyendo la secuencia de señal): TI LGTTFGM VFSLLQVVSG ESGYAQNGDL EDAELDDYSF SCYSQLEVNG SQHSLTCAFE DPDVNTTNLE FEICGALVEV KCLNFRKLQE I YFI ETKKFL LIGKSNICVK VGEKSLTCKK IDLTTIVKPE APFDLSVIYR EGANDF VTF NTSHLQKKYV KVLMHDVAYR QEKDENKWTH VNLSSTKLTL LQRKLQPAAM YEIKVRSIPD HYFKGFWSEW SPSYYFRTPE INNSSGEMDP ILLTISILSF FSVALLVILA CVLWKKRIKP IVWPSLPDHK KTLEHLCKKP RKNLNVSFNP ESFLDCQIHR VDDIQARDEV EGFLQDTFPQ QLEESEKQRL GGDVQSPNCP SEDVVVTPES FGRDSSLTCL AGNVSACDAP ILSSSRSLDC RESGKNGPHV YQDLLLSLGT TNSTLPPPFS LQSGILTLNP VAQGQPILTS LGSNQEEAYV TMSSFYQNQ (SEQ ID N°: 1) El CD127 también se encuentra en el receptor de linfopoyetina derivada del estroma tímico (TSLP). El receptor de TLSP es un heterodímero de CD127 y factor 2 tipo receptor de citoquina (CRLF2).

La enlace de IL-7 al IL-7R activa múltiples rutas de señalización incluyendo la activación de las JAK cinasas 1 y 3, que conduce a la fosforilación y activación de Stat5. Esta ruta es crucial para la supervivencia de precursores de linfocitos T que se desarrollan en el timo, debido a que la activación de Stat5 es necesaria para la inducción de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 y la prevención de la entrada de la proteína pro-apoptótica Bax en la mitocondria. Otra ruta mediada por IL-7R es la activación de la PI3 cinasa, que da como resultado la fosforilación de la proteína pro-apoptótica Bad y su retención en el citoplasma. El CD127 se expresa en linfocitos T de memoria y en reposo periféricos. El mecanismo de la regulación por IL-7 de la supervivencia de linfocitos T y la homeostasis y la fuente de IL-7 en la periferia no se entiende completamente. Además, su papel potencial en la diferenciación y función de linfocitos T patógenos en enfermedades autoinmunes se ha estudiado poco y en gran medida se desconoce. Existen unos pocos informes que sugieren que la IL-7 puede contribuir a la patogénesis de enfermedades autoinmunes.

Recientemente, Liu y colaboradores (Liu y colaboradores (2010) Nature Medicine 16: 191-197) han descrito el papel de IL-7 en la supervivencia y expansión de TH17. Se han descrito anticuerpos anti-CD127 murinos (incluyendo los anticuerpos anti-CD127 1 A 11 y 6A3) y su papel en el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM) y otras enfermedades autoinmunes en la solicitud PCT número PCT/US2009/053136, cuyo contenido se incorpora expresamente y en su totalidad en el presente documento por referencia.

Es deseable aislar y desarrollar anticuerpos monoclonales adicionales que se enlacen a y/o inhiban el efecto biológico del CD127 humano. Es probable que dichos anticuerpos sean terapéuticamente útiles en el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM) y otras enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunes, particularmente aquellos en los que se han implicado linfocitos TH17 patógenos.

Breve Descripción de la Invención La invención proporciona proteínas de enlace a antígeno que se enlazan específicamente a CD127. Las proteínas de enlace a antígeno pueden usarse en procedimientos terapéuticos, en particular, en el tratamiento o la prevención de enfermedades en las que están implicados linfocitos TH1 patógenos. Las proteínas de enlace a antígeno pueden enlazarse a CD127 e inhibir, por ejemplo, neutralizar, la función biológica de CD127.

En un primer aspecto, la invención proporciona proteínas de enlace a antígeno, tales como anticuerpos, que comprenden de una a seis de las regiones determinantes de complementariedad siguientes, o variantes de las mismas: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 (iii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o en cualquiera de las SEQ ID N°: 133-SEQ ID N°: 138, (iv) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 (v) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 (vi) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 En otro aspecto, la invención proporciona proteínas de enlace a antígeno, tales como anticuerpos, que comprenden de una a seis de las regiones determinantes de complementariedad siguientes, o variantes de las mismas: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 39 (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 40 (iii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 41 (iv) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 42 (v) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 43 (vi) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 44 En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno es un anticuerpo, opcionalmente un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. El anticuerpo puede comprender una o más CDR (de SEQ ID N°: 2-7 ó 39-44 de un anticuerpo donador) en un marco de anticuerpo aceptor. La región de marco del anticuerpo aceptor puede ser un anticuerpo humano.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 (Mi) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o en cualquiera de la SEQ ID N°: 132-SEQ ID N°: 137, en donde además el anticuerpo comprende cuando menos uno de: un residuo de lisina en la posición 66, un residuo de fenilalanina, metionina, isoleucina, leucina o valina en la posición 69 y un residuo de valina, arginina, alanina o leucina en la posición 71 de la región variable de la cadena pesada (numeración de acuerdo con Kabat).

En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una leucina en posición 69. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una valina en posición 71. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una leucina en posición 69 y una valina en posición 71. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una lisina en posición 66, una leucina en posición 69 y una valina en posición 71. Con la excepción de las mutaciones de los puntos anteriormente mencionados, la región variable de cadena pesada puede tener una secuencia de marco de una región variable de línea germinal humana. Por ejemplo, en una modalidad, la región variable de cadena pesada se deriva a partir del marco humano de IGHV1_2 (SEQ ID N°: 116).

P°r consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende uno o dos de las regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 (iii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o en cualquiera de la SEQ ID N°: 132-SEQ ID N°: 137, En un marco VH en donde el marco VH se deriva a partir de un marco VH de línea germinal humana, y comprende cuando menos uno de: un residuo de lisina en la posición 66, un residuo de fenilalanina, metionina, isoleucina, leucina o valina en la posición 69 y un residuo de valina, arginina, alanina o leucina en la posición 71 de la región variable de la cadena pesada (numeración de acuerdo con Kabat). En una modalidad, el marco VH humano es el marco humano de IGHV1_2 (SEQ ID N°: 116).

El anticuerpo de la invención puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 (SEQ ID N°: 2) y CDRH3 (SEQ ID N°: 4); CDRH2 (SEQ ID N°: 3) y CDRH3 (SEQ ID N°: 4); CDRH1 (SEQ ID N°: 2) y CDRH2 (SEQ ID N°: 3); o CDRH1 (SEQ ID N°: 2), CDRH2 (SEQ ID N°: 3) y CDRH3 (SEQ ID N°: 4). El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID N°:10-17 (1A11.H0 VH a 1A11.H7 VH). En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID N°: 13 (1A11.H3 VH). En cualquiera de estas modalidades, la CDRH3 de la SEQ ID N°: 4 puede sustituirse con la CDRH3 como se expone en cualquiera de las SEQ ID N°: 132-SEQ ID N°: 137. Como alternativa, la región variable de cadena pesada de la SEQ ID N°: 13 puede comprender una o más sustituciones seleccionadas de N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bl y F100bV (Kabat). En otra modalidad, la región variable de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID N°: 121, 123, 125, 127 129 ó 131. En una modalidad, la región variable de cadena pesada se empareja con una región variable de cadena ligera de SEQ ID N°: 16.

La invención también proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 (ii) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 (iii) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 en donde además el anticuerpo comprende cuando menos uno de: un residuo de lisina en la posición 45, un residuo de prolina en posición 46, un residuo de triptófano en posición 47, un residuo de valina en posición 58, un residuo de valina en posición 60, un residuo de serina en posición 70 y un residuo de tirosina o fenilalanina en la posición 71 de la región variable de la cadena ligera (numeración de acuerdo con Kabat).

En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende un residuo de prolina en la posición 46. En una modalidad, el anticuerpo comprende un residuo de tirosina en posición 71. En una modalidad, el anticuerpo comprende un residuo de prolina en posición 46 y un residuo de tirosina en posición 71.

El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende CDRL1 (SEQ ID N°: 5) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7); CDRL2 (SEQ ID N°: 6) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7); CDRL1 (SEQ ID N°: 5) y CDRL2 (SEQ ID N°: 6); o CDRL1 (SEQ ID N°: 5), CDRL2 (SEQ ID N°: 6) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7). El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera de cualquiera de las SEQ ID N°: 18-27 (1 A11.L0 VK a 1 A11.L9 VK). En una modalidad, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera de la SEQ ID N°: 22 (1 A11.L4 VK).

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende, una, dos o las tres regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 (iii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o en cualquiera de las SEQ ID N°: 132-SEQ ID N°: 137, en donde además el anticuerpo comprende cuando menos uno de: un residuo de lisina en posición 66, un residuo de fenilalanina, metionina, isoleucina, leucina o valina en posición 69 y una valina, arginina, alanina o leucina en la posición 71 de la región variable de la cadena pesada (numeración de acuerdo con Kabat); y una región variable de cadena ligera que comprende una, dos o las tres regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 (ii) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 (iii) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 en donde además el anticuerpo comprende cuando menos uno de: un residuo de Usina en posición 45, un residuo de prolina en posición 46, un residuo de triptófano en posición 47, un residuo de valina en posición 58, un residuo de valina en posición 60, un residuo de serina en posición 70 y un residuo de tirosina o fenilalanina en la posición 71 de la región variable de la cadena ligera (numeración de acuerdo con Kabat).

El anticuerpo puede comprender cualquier combinación de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3, incluyendo de una CDR de cadena pesada y una CDR de cadena ligera a las seis de dichas CDR (es decir, las 3 CDR de cadena pesada y las 3 CDR de cadena ligera). En una modalidad, el anticuerpo comprende las seis CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1 , CDRL2 y CDRL3.

En una modalidad, el anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada que comprende las regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 (iii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o en cualquiera de las SEQ ID N°: 133-SEQ ID N°: 138, y una región variable de cadena ligera que comprende las regiones determinantes de complementariedad siguientes: (iv) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 (v) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 (vi) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 en donde además el anticuerpo comprende un residuo de leucina en la posición 69 de la región variable de la cadena pesada y un residuo de prolina en la posición 46 de la región variable de la cadena ligera.

En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 13 (1A11.H3 VH) o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 13, o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID N°: 121 , 123, 125, 127, 129 ó 131 , y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 22 (1A11.L4 VK), O una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 22.

En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 114 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 144 o de la SEQ ID N°: 118. En modalidades particulares, la cadena pesada comprende una o más sustituciones seleccionadas de N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bl y F100bV (Kabat). En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 115 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 115. En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 114 ó 118, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 144 ó 118 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 115 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 115. Una modalidad particular comprende una proteína de enlace a antígeno que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID N°: 118 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID N°: 115.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de enlace a antígeno que comprende una o más de: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 o una CDR variante de la misma (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 o una CDR variante de la misma (iii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o una CDR variante de la misma, o una CDRH3 como se expone en cualquiera de las SEQ ID N°: 132-SEQ ID N°: 137, (¡v) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 o una CDR variante de la misma, (v) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 o una CDR variante de la misma, (vi) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 o una CDR variante de la misma, comprende además un marco de cadena pesada que tiene cuando menos uno de los residuos siguientes: (a) Val, Me o Gly en la posición 2 (b) Leu o Val en la posición 4 (c) Leu, Me, Met o Val en la posición 20 (d) Cys en la posición 22 (e) Thr, Ala, Val, Gly o Ser en la posición 24 (f) Gly en la posición 26 (g) Trp o Tyr en la posición 47 (h) Me, Met, Val o Leu en la posición 48 (i) lie, Leu, Phe, Met o Val en la posición 69 (j) Arg, Val, Ala o Leu en la posición 71 (k) Ala, Leu, Val, Tyr o Phe en la posición 78 (I) Leu o Met en la posición 80 (m) Tyr o Phe en la, posición 90 (n) Cys en la posición 92 (o) Arg, Lys, Gly, Ser, His o Asn en la posición 94, y/o un marco de cadena ligera que tiene cuando menos uno de los residuos siguientes: (P) Me en la posición 2 (q) Leu en la posición 4 (r) Cys en la posición 23 (s) Trp en la posición 35 (t) Tyr en la posición 36 (u) Tyr o Phe en la posición 71 (v) Cys en la posición 88 (w) Phe en la posición 98, en donde la proteína de enlace a antígeno es capaz de enlazarse a CD127.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender cualquier combinación de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3, incluyendo de una CDR a las seis de dichas CDR (SEQ ID N°: 2-7). En una modalidad, la proteína de enlace de antígeno comprende las seis de dichas CDR (SEQ ID N°: 2-7).

En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende tanto la región de marco de cadena pesada como las regiones de marco de cadena ligera que se han descrito anteriormente.

En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno es un anticuerpo, opcionalmente un anticuerpo humanizado o humano, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo.

Una o más CDR variantes de este aspecto de la invención pueden comprender: (a) una variante de CDRH1 (SEQ ID N°: 2), en la que: i. el residuo de tirosina en la posición 32 se sustituye por isoleucina, histidina, fenilalanina, treonina, asparagina, cisteína, ácido glutámico o ácido aspártico; ii. el residuo de treonina en la posición 33 se sustituye por una tirosina, alanina, triptófano, glicina, leucina o valina, iii. el residuo de metionina en la posición 34 se sustituye por isoleucina, valina o triptófano; y/o iv. el residuo de asparagina en la posición 35 se sustituye por histidina, ácido glutámico, glutamina, serina, tirosina o treonina; (b) una variante de CDRH2 (SEQ ID N°: 3), en la que: i. el residuo de leucina en la posición 50 se sustituye por arginina, ácido glutámico, triptófano, tirosina, glicina, glutamina, valina, asparagina, lisina o alanina; ii. el residuo de isoleucina en la posición 51 se sustituye por leucina, valina, treonina, serina o asparagina; iii. el residuo de asparagina en la posición 52 se sustituye por asparagina, leucina, serina o tirosina; iv. el residuo de tirosina en la posición 53 se sustituye por alanina, glicina, serina, Usina, treonina o asparagina; v. la asparagina en la posición 54 se sustituye por serina, treonina, lisina, asparagina o glicina; vi. la valina en la posición 56 se sustituye por tirosina, arginina, ácido glutámico, ácido aspártico, glicina, serina o alanina; y/o vii. la serina en la posición 58 se sustituye por lisina, asparagina, treonina, arginina, glicina, fenilalanina o tirosina; (c) una variante de CDRH3 (SEQ ID N°: 4) en la que valina en posición 102 se sustituye por tirosina, histidina, isoleucina, serina, ácido aspártico o glicina; (d) una variante de CDRL1 (SEQ ID N°: 5) en la que: i. la serina en la posición 29 se sustituye por una valina; y/o; ii. la metionina en la posición 33 se sustituye por una leucina, y/o; (e) una variante de CDRL3 (SEQ ID N°: 7) que comprende una o más de las sustituciones siguientes: i. la glutamina en posición 89 se sustituye por leucina; ii. el ácido glutámico en posición 90 se sustituye por glutamina; ¡ü. el triptófano en posición 91 se sustituye por tirosina; y/o iv. la tirosina en posición 93 se sustituye por serina o arginina.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender una región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID N°:10-17 (1A11.H0 VH a 1A11.H7 VH) o una región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID N°: 121, 123, 125, 127, 129 ó 131. En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 13 (1A11.H3 VH). La proteína de enlace a antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera de cualquiera de las SEQ ID N°: 18-27 (1A11.L0 VK a 1A11.L9 V ). En una modalidad, la proteína de enlace de antígeno comprende una región variable de cadena ligera de la SEQ ID N°: 22 (1 A11.L4 VK).

En una modalidad particular, la proteína de enlace a antígeno comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 13 (1A11.H3 VH), y una región variable de cadena ligera de SEQ ID N°: 22 (1A11.L4 VK). En otra modalidad, la proteína de enlace de antígeno comprende una cadena pesada de SEQ ID N°: 114 o SEQ ID N°: 118, particularmente la SEQ ID N°: 118, y una cadena ligera de SEQ ID N°: 115. La cadena pesada puede comprender además cualquiera de las sustituciones siguientes: N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bl y F100bV (Kabat).

En otra modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende una o más mutaciones puntuales dentro de la CDRH3, y la proteína de enlace de antígeno tiene una afinidad de enlace superior por IL-7R que la proteína de enlace a antígeno que carece de dicha mutación. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende una CDRH3 como se expone en las SEQ ID N°: 132-137. En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende una región variable de cadena pesada como se expone en las SEQ ID N°: 121, 123, 125, 127, 129 ó 131.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de enlace a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada como se expone en la: (a) SEQ ID N°: 11 (b) SEQ ID N°: 12 (c) SEQ ID N°: 13 (d) SEQ ID N°: 14 (e) SEQ ID N°: 15 (f) SEQ ID N°: 16 (g) SEQ ID N°: 17 (h) SEQ ID N°: 121 (¡) SEQ ID N°: 123 (j) SEQ ID N°: 125 (k) SEQ ID N°: 127 (I) SEQ ID N°: 129 (m) SEQ ID N°: 131 o un dominio variable de cadena pesada que tiene una identidad del 70 por ciento o más con una de las SEQ ID N°: 11 a 17, siendo la proteína de enlace a antígeno capaz de enlazarse a CD127.

En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con una de las SEQ ID N°: 11 a 17.

En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID N°: 13, o un dominio variable de cadena pesada que tiene una identidad del 70 por ciento o superior, del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la SEQ ID N°: 13.

En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno tiene una cadena pesada que tiene una identidad del 70 por ciento o superior, del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la SEQ ID N°: 115 o SEQ ID N°: 118.

En una modalidad, la cadena pesada, o el dominio variable de cadena de pesada, es una variante de una de las SEQ ID N°: 11 a 17, 121, 123, 125, 127, 129, 131, y en la que el grado de variación constituido por uno o más de: i. Val, He o Gly en la posición 2 ii. Leu o Val en la posición 4 iii. Leu, Me, Met o Val en la posición 20 iv. Thr, Ala, Val, Gly o Ser en la posición 24 v. Trp o Tyr en la posición 47 vi. Me, Met, Val o Leu en la posición 48 vii. Me, Leu, Phe, Met o Val en la posición 69 viii. Arg, Val, Ala o Leu en la posición 71 ix. Ala, Leu, Val, Tyr o Phe en la posición 78 x. Leu o Met en la posición 80 xi. Tyr o Phe en la posición 90; y xii. Arg, Lys, Gly, Ser, His o Asn en la posición 94.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de enlace a antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera como se expone en la: (a) SEQ ID N°: 19 (b) SEQ ID N°: 20 (c) SEQ ID N°: 21 (d) SEQ ID N°: 22 (e) SEQ ID N°: 23 (f) SEQ ID N°: 24 (g) SEQ ID N°: 25 (h) SEQ ID N°: 26 (¡) SEQ ID N°: 27 o un dominio variable de cadena ligera que tiene una identidad del 70 por ciento o más con una de las S EQ I D N°: 1 9 a 27, en donde la proteína de enlace a antígeno es capaz de enlazarse a C D 1 27.

En una modalidad , la proteína de enlace a antígeno comprende un domi nio variable de cadena l igera como se expone en la SEQ I D N°: 22 , o un dominio variable de cadena ligera que tiene una identidad del 70 por ciento o más con la S EQ I D N°: 22.

En una modalidad , el dominio variable de cadena ligera tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con una de las S EQ I D N°: 1 9 a 1 7.

En una modalidad , la proteína de enlace a antígeno tiene una cadena ligera que tiene una identidad del 70 por ciento o superior, del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la S EQ I D N°: 1 1 5.

La invención contempla cualquier emparejamiento de los dominios variables de cadena pesada y ligera descritos . En una modalidad , por lo tanto, la invención también proporciona una prote ína de enlace a antígeno que comprende una cualquiera de las combinaciones de dominios variables de cadena pesada y ligera siguientes: un domi nio variable de cadena pesada de SEQ I D N°: 1 1 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento p superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID NT: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 12 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 13 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 14 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 15 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 16 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 17 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 121 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 123 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 125 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 127 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 129 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27); o un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 131 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 26 o SEQ ID N°: 27).

En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 13, y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la secuencia expuesta en la SEQ ID N°: 22.

En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID N°: 13 y un dominio variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID N°: 22.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de enlace a antígeno que comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 o una CDR variante de la misma (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 o una CDR variante de la misma (¡ii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o una CDR variante de la misma, o una CDRH3 como se expone en cualquiera de las SEQ ID N°: 132-SEQ ID N°: 137, (iv) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 o una CDR variante de la misma (v) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 o una CDR variante de la misma (vi) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 o una CDR variante de la misma en donde cuando menos una de dichas CDR es una CDR variante, y en donde dicha proteína de enlace a antígeno es capaz de enlazarse a CD127.

En una modalidad, la proteína de enlace de antígeno comprende cuando menos la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6, o una variante de la misma. En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno comprende cuando menos la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4, o una CDR variante de la misma. La CDR variante de este aspecto de la invención puede comprender: (f) una variante de CDRH1 (SEQ ID N°: 2), en la que: i. el residuo de tirosina en la posición 32 se sustituye por isoleucina, histidina, fenilalanina, treonina, asparagina, cisteína, ácido glutámico o ácido aspártico; ii. el residuo de treonina en la posición 33 se sustituye por una tirosina, alanina, triptófano, glicina, leucina o valina, iii. el residuo de metionina en la posición 34 se sustituye por isoleucina, valina o triptófano; y/o iv. el residuo de asparagina en la posición 35 se sustituye por histidina, ácido glutámico, glutamina, serina, tirosina o treonina; (g) una variante de CDRH2 (SEQ ID N°: 3) en la que: i. el residuo de leucina en la posición 50 se sustituye por arginina, ácido glutámico, triptófano, tirosina, glicina, glutamina, valina, asparagina, lisina o alanina; ii. el residuo de isoleucina en la posición 51 se sustituye por leucina, valina, treonina, serina o asparagina; iii. el residuo de asparagina en la posición 52 se sustituye por asparagina, leucina, serina o tirosina; iv. el residuo de tirosina en la posición 53 se sustituye por alanina, glicina, serina, lisina, treonina o asparagina; v. la asparagina en posición 54 se sustituye por serina, treonina, lisina, asparagina o glicina; vi. la valina en posición 56 se sustituye por tirosina, arginina, ácido glutámico, ácido aspártico, glicina, serina o alanina; y/o vii. la serina en posición 58 se sustituye por lisina, asparagina, treonina, arginina, glicina, fenilalanina o tirosina; (h) una variante de CDRH3 (SEQ ID N°: 4) en la que la valina en posición 102 se sustituye por tirosina, histidina, isoleucina, serina, ácido aspártico o glicina; (i) una variante de CDRL1 (SEQ ID N°: 5) en la que: i. la serina en posición 29 se sustituye por una valina; y/o; ii. la metionina en posición 33 se sustituye por una leucina, y/o; (j) una variante de CDRL3 (SEQ ID N°: 7), que comprende una o más de las sustituciones siguientes: i. la glutamina en posición 89 se sustituye por leucina; ¡i. el ácido glutámico en posición 90 se sustituye por glutamina; iii. el triptófano en posición 91 se sustituye por tirosina; y/o iv. la tirosina en posición 93 se sustituye por serina o arginina.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de enlace a antígeno que comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 o una CDR variante de la misma (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 o una CDR variante de la misma (iii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o una CDR variante de la misma, o una CDRH3 como se expone en cualquiera de las SEQ ID N°: 132-SEQ ID N°: 137, en un marco de dominio variable de cadena pesada que comprende cuando menos uno de: (a) Val, Me o Gly en la posición 2 (b) Leu o Val en la posición 4 (c) Leu, He, Met o Val en la posición 20 (d) Cys en la posición 22 (e) Thr, Ala, Val, Gly o Ser en la posición 24 (f) Gly en la posición 26 (g) Trp o Tyr en la posición 47 (h) lie, Met, Val o Leu en la posición 48 (i) Me, Leu, Phe, Met o Val en la posición 69 (j) Arg, Val, Ala o Leu en la posición 71 (k) Ala, Leu, Val, Tyr o Phe en la posición 78 (I) Leu o Met en la posición 80 (m) Tyr o Phe en la posición 90 (n) Cys en la posición 92 (o) Arg, Lys, Gly, Ser, His o Asn en la posición 94, y un dominio variable de cadena ligera que comprende: (iv) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 o una CDR variante de la misma (v) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 o una CDR variante de la misma (vi) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 o una CDR variante de la misma, en un marco de dominio variable de cadena ligera que comprende cuando menos uno de: (a) Me en la posición 2 (b) Leu en la posición 4 (c) Cys en la posición 23 (c) Trp en la posición 35 (e) Tyr en la posición 36 (0 Tyr o Phe en la posición 71 (g) Cys en la posición 88 (h) Phe en la posición 98, siendo la proteína de enlace a antígeno capaz de enlazarse a CD127.

La CDR variante de este aspecto de la invención puede comprender: (a) una variante de CDRH1 (SEQ ID N°: 2), en la que: i. el residuo de tirosina en la posición 32 se sustituye por isoleucina, histidina, fenilalanina, treonina, asparagina, cisteína, ácido glutámico o ácido aspártico; ii. el residuo de treonina en la posición 33 se sustituye por una tirosina, alanina, triptófano, glicina, leucina o valina, iii. el residuo de metionina en la posición 34 se sustituye por isoleucina, valina o triptófano; y/o iv. el residuo de asparagina en la posición 35 se sustituye por histidina, ácido glutámico, glutamina, serina, tirosina o treonina; (b) una variante de CDRH2 (SEQ ID N°: 3), en la que: i. el residuo de leucina en posición 50 se sustituye por arginina, ácido glutámico, triptófano, tirosina, glicina, glutamina, valina, asparagina, Usina o alanina; ii. el residuo de isoleucina en posición 51 se sustituye por leucina, valina, treonina, serina o asparagina; iii. el residuo de asparagina en posición 52 se sustituye por asparagina, leucina, serina o tirosina; iv. el residuo de tirosina en posición 53 se sustituye por alanina, glicina, serina, lisina, treonina o asparagina; v. la asparagina en posición 54 se sustituye por serina, treonina, lisina, asparagina o glicina; vi. la valina en posición 56 se sustituye por tirosina, arginina, ácido glutámico, ácido aspártico, glicina, serina o alanina; y/o vii. la serina en posición 58 se sustituye por lisina, asparagina, treonina, arginina, glicina, fenilalanina o tirosina; (c) una variante de CDRH3 (SEQ ID N°: 4) en la que la valina en posición 102 se sustituye por tirosina, histidina, isoleucina, serina, ácido aspártico o glicina; (d) una variante de CDRL1 (SEQ ID N°: 5), en la que: i. la serina en posición 29 se sustituye por una valina; y/o; ii. la metionina en posición 33 se sustituye por una leucina, y/o; (e) una variante de CDRL3 (SEQ ID N°: 7) comprende una o más de las sustituciones siguientes: i. la glutamina en posición 89 se sustituye por leucina; ii. el ácido glutámico en posición 90 se sustituye por glutamina; ¡ii. el triptófano en posición 91 se sustituye por tirosina; y/o ¡v. la tirosina en posición 93 se sustituye por serina o arginina.

En una modalidad, la proteína de enlace de antígeno es un anticuerpo, opcionalmente un anticuerpo humanizado o humano, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende, una, dos o las tres regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 39 (ii) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 40 (¡ii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 41 en donde el anticuerpo además comprende cuando menos uno de: una valina en posición 24, una tirosina en posición 27, una serina en posición 28, una isoleucina en posición 29, una treonina en posición 30, una metionina en posición 48, una glicina en posición 49, una isoleucina en posición 67, una serina en posición 68, una arginina en posición 71, una treonina en posición 73 y una fenilalanina en la posición 78 de la reglón variable de la cadena pesada (numeración de acuerdo con Kabat).

En una modalidad, el anticuerpo comprende cuando menos uno, dos, tres, cuatro o los cinco de una tirosina en posición 27, una treonina en posición 30, una metionina en posición 48, una isoleucina en posición 67 y una arginina en posición 71.

El anticuerpo humanizado puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 (SEQ ID N°: 39) y CDRH3 (SEQ ID N°: 41); CDRH2 (SEQ ID N°: 40) y CDRH3 (SEQ ID N°: 41); CDRH1 (SEQ ID N°: 39) y CDRH2 (SEQ ID N°: 40); o CDRH1 (SEQ ID N°: 39), CDRH2 (SEQ ID N°: 40) y CDRH3 (SEQ ID N°: 41). El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID N°: 48-56 (6A3IGHV4_61.H 1 VH a 6A3IGHV4_61.H9) o las SEQ ID N°: 58-68 (6A3IGHV3-33.H1 VH a 6A3 IGHV3-33.H11 ).

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una, dos o las tres regiones determinantes de complementariedad siguientes: (iv) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 42 (v) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 43 (vi) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 44 comprendiendo el anticuerpo además: (a) uno o ambos de un residuo de glutamina en la posición 45 y un residuo de lisina en la posición 70 de la región variable de la cadena ligera, o (b) uno o más de una leucina en posición 4, una tirosina en posición 31, una metionina en posición 70, una treonina en posición 85, una tirosina en posición 94, una glicina en posición 100 y una valina en posición 104 (numeración de acuerdo con Kabat).

En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende tanto un residuo de glutamina en posición 45 como un residuo de lisina en posición 70. En otra modalidad, el anticuerpo comprende cada uno de una leucina en posición 4, una tirosina en posición 31, una metionina en posición 70, una treonina en posición 85, una tirosina en posición 94, una glicina en posición 100 y una valina en posición 104.

El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende la CDRL1 (SEQ ID N°: 42) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44); CDRL2 (SEQ ID N°: 43) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44); o CDRL1 (SEQ ID N°: 42) y CDRL2 (SEQ ID N°: 43); o CDRL1 (SEQ ID N°: 42), CDRL2 (SEQ ID N°: 43) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44). El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera de cualquiera de las SEQ ID N°: 70-72 y 138 (6A3.L1 VK, 6A3.L2 VK, 6A3.L3 VK y 6A3.L27 VK).

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una, dos o las tres regiones determinantes de complementariedad siguientes: (iv) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 39 (v) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 40 (vi) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 41 comprendiendo el anticuerpo además cuando menos uno de: una valina en posición 24, una tirosina en posición 27, una serina en posición 28, una isoleucina en posición 29, una treonina en posición 30, una metionina en posición 48, una glicina en posición 49, una isoleucina en posición 67, una serina en posición 68, una arginina en posición 71, una treonina en posición 73 y una fenilalanina en la posición 78 de la región variable de la cadena pesada, y una región variable de cadena ligera que comprende una, dos o las tres regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 42 (ii) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 43 (¡ii) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 44 comprendiendo el anticuerpo además: (a) uno o ambos de un residuo de glutamina en posición 45 y un residuo de lisina en posición 70 de la región variable de la cadena ligera; o (b) uno o más de una leucina en posición 4, una tirosina en posición 31, una metionina en posición 70, una treonina en posición 85, una tirosina en posición 94, una glicina en posición 100 y una valina en posición 104 (numeración de acuerdo con Kabat).

El anticuerpo puede comprender cualquier combinación de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1 , CDRL2 y CDRL3, incluyendo de una CDR de cadena pesada y una de cadena ligera a las seis de dichas CDR.

En una modalidad, el anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada que comprende las regiones determinantes de complementariedad siguientes: (i) la CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 39 (¡i) la CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 40 (iii) la CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 41 (iv) la CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 42 (v) la CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 43 (vi) la CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 44 comprendiendo el anticuerpo además cuando menos uno de: (a) una valina en posición 24, una tirosina en posición 27, una serina en posición 28, una isoleucina en posición 29, una treonina en posición 30, una metionina en posición 48, una glicina en posición 49, una isoleucina en posición 67, una serina en posición 68, una arginina en posición 71, una treonina en posición 73 y una fenilalanina en la posición 78 de la región variable de la cadena pesada; y/o (b) a. cuando menos uno de un residuo de glutamina en la posición 45 y un residuo de lisina en la posición 70 de la región variable de la cadena ligera, o b. uno o más de una leucina en posición 4, una tirosina en posición 31, una metionina en posición 70, una treonina en posición 85, una tirosina en posición 94, una glicina en posición 100 y una valina en posición 104 (numeración de acuerdo con Kabat).

La invención contempla cualquier emparejamiento de los dominios variables de cadena pesada y ligera descritos. En una modalidad, por lo tanto, la invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que comprende una cualquiera de las combinaciones de dominio variable de cadena ligera y pesada siguientes: un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 47 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 48 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 49 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 73 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 73 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 50 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 51 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 52 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 O SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 53 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 54 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 55 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 56 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 O SEQ ID N°: 38); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 57 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 58 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 59 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 38 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 60 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 61 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 62 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 64 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 65 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 66 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 67 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138); y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID N°: 68 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, del 99 por ciento o superior con la misma), con un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138 (o una secuencia que tiene una identidad del 75 por ciento o superior, del 80 por ciento o superior, del 85 por ciento o superior, del 90 por ciento o superior, del 95 por ciento o superior, del 98 por ciento o superior, o del 99 por ciento o superior con cualquiera de las SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72 o SEQ ID N°: 138).

En una modalidad particular, se proporciona una proteína de enlace a antígeno que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en una de las SEQ ID N°: 53, 54, 55 ó 56, y una región variable de cadena ligera que tiene un secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID N°: 138.

La proteína de enlace puede ser un anticuerpo, en particular, un anticuerpo humanizado o humano, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo quimérico, que comprende un dominio de cadena pesada variable de SEQ ID N°: 28 y un dominio de cadena ligera variable de SEQ ID N°: 29, o un dominio de cadena pesada variable de SEQ ID N°: 73 y un dominio de cadena ligera variable de SEQ ID N°: 74.

La proteína de enlace a antígeno de la invención puede no inhibir la señalización de TSLP. En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno no inhibe la señalización de TSLP.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de enlace a antígeno de la presente invención. En una modalidad, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico de las SEQ ID N°: 30-38, SEQ ID N°: 75-113, SEQ ID N°: 119-120 y SEQ ID N°: 122, 124, 126, 128 y 130. La invención también proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en el presente documento, y una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión como se define en el presente documento. El vector de expresión puede comprender una molécula de ácido nucleico de una o más de cualquiera de las SEQ ID N°: 30-38, SEQ ID N°: 75-113 y SEQ ID N°: 119-120, y SEQ ID N°: 122, 124, 126, 128 y 130. En una modalidad, el vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de enlace a antígeno como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En otra modalidad, la invención proporciona una célula huésped que comprende un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En una modalidad adicional, la invención proporciona un anticuerpo expresado por una célula huésped como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

La invención también proporciona un procedimiento para la producción de una proteína de enlace a antígeno de la presente invención, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de cultivar una célula huésped como se ha definido anteriormente y recuperar la proteína de enlace a antígeno.

La invención también proporciona un anticuerpo o prote ína de enlace a antígeno de acuerdo con la invención que se expresa por una célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico o una secuencia que codifica un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno de acuerdo con la i nvención .

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una prote ína de enlace a antígeno de la presente invención y un veh ículo o excipiente farmacéuticamente aceptable .

La i nvención también proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto aquejado con una enfermedad autoinmune o inflamatoria, comprendiendo dicho procedi miento la etapa de admi nistrar al sujeto una prote ína de enlace a antígeno de la presente invención .

La invención también proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto aquejado de una enfermedad en la que están i mpl icados l i nfocitos TH 1 7 patógenos , comprendiendo dicho procedimiento la etapa de admi nistrar al sujeto una proteína de enlace a antígeno de la presente invención.

La i nvención también proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto aq uejado con una enfermedad asociada con la expresión regulada por incremento de I L-1 7 , comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar al sujeto una proteína de enlace a antígeno de la presente i nvención .

En particular, la enfermedad inflamatoria o autoinm une , la enfermedad en la que están implicados linfocitos TH 1 7 patógenos, o la enfermedad asociada con una expresión regulada positivamente de I L1 7 puede ser esclerosis múltiple (EM) , LES , artritis reumatoide , enfermedad de Behcet o asma. En una modalidad , la prote ína de enlace a antígeno de la invención será úti l en un procedimiento de tratamiento de la esclerosis múlti ple. Otras enfermedades que pueden tratarse mediante la administración de las proteínas de enlace a antígeno de la invención se describen en el presente documento.

La invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno como se describe en el presente documento, para su uso en el tratamiento de un sujeto aquejado de una enfermedad autoi nmune o inflamatoria; una enfermedad en la que están i mplicados l i nfocitos TH 1 7 patógenos; o una enfermedad asociada con una expresión regulada positivamente de I L1 7.

La invención proporciona el uso de una proteína de enlace a antígeno como se describe en el presente documento, en la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento de un sujeto aquejado de una enfermedad i nflamatoria o autoinmune; u na enfermedad en la que están implicados linfocitos TH 1 7 patógenos; o una enfermedad asociada con una expresión regulada por i ncremento de I L1 7.

Otros aspectos y modalidades de la invención serán evidentes a parti r de la descripción detallada siguiente .

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la citotoxicidad dependiente de complemento del mAb anti-IL7R 1A11 H3L4 en células HEK293 que expresan hll_-7R.

La Figura 2 muestra la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo del mAb anti-IL7R humanizado 1 A 11 H3L4 y el mAb anti-IL7R con Fe inactivado ( 1 Al 1 H3L4Fc) en células HEK293 que expresan ML-7R, en presencia de células mononucleares de sangre periférica.

Las Figuras 3A y 3B muestran la inhibición de fosforilación de STAT5 inducida por IL-7 mediante 1A11 H3L4 en células mononucleares de sangre periférica humanas proporcionadas por dos donantes separados.

Las Figuras 4A a 4D muestran la inhibición de la producción de IL-17 inducida por IL-7 en linfocitos Th17 humanos diferenciados mediante 1A11 H3L4 (en cuatro donantes diferentes).

Las Figuras 5A a 5E muestran que 1A11 H3L4 no influye en la inducción por TSLP de TARC (quimiocina de timo y regulada por activación).

Descripción Detallada de la Invención La señalización de IL-7/IL-7R se requiere de forma crítica para la supervivencia y expansión de células TH17 comprometidas en sistemas tanto de ratón como de seres humanos, aunque su papel en la diferenciación de TH17 no es esencial en comparación con el de IL-6 (Liu y col, (2010) Nature Medicine 16: 191-197). De forma sorprendente, el efecto in vivo sobre el sistema inmune mediante el antagonismo de IL-7R es altamente selectivo en EAE, un modelo animal para esclerosis múltiple, que afecta a los linfocitos TH17 y, en menor medida, los linfocitos TH1 predominantemente del fenotipo de memoria y linfocitos Treg moderadores. Esta selectividad parece jugar un papel importante en reequilibrar la relación de linfocitos TH17 patógenos y linfocitos Treg mediante antagonismo de IL-7R en EAE y puede atribuirse a la eficacia del tratamiento.

El papel de la señalización de IL-7/IL-7R en la supervivencia de linfocitos TH17 y su expansión apoya la eficacia del tratamiento de antagonismo de IL-7R en enfermedades autoinmunes humanas, tales como esclerosis múltiple. La neutralización de IL-7 o antagonismo de IL-7R probablemente tiene ventajas terapéuticas únicas. Por un lado, el tratamiento ofrece la selectividad que distingue linfocitos TH1 y TH17 patógenos de linfocitos ?GT9 y células inmunes no relacionadas. Por otro lado, las ventajas terapéuticas adicionales del antagonismo de IL-7R implican su efecto selectivo en la supervivencia y expansión de TH17 diferenciadas a diferencia de la diferenciación de TH17. Es concebible que la dirección a mantenimiento in vivo de TH17 comprometidas frente a diferenciación de TH17 sea más eficaz en un contexto terapéutico. La inhibición de la señalización mediada por receptor de IL-7 proporciona por lo tanto una intervención terapéutica prometedora para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o inflamatorias.

La expresión señalización mediada por IL-7R, como se usa en el presente documento, significa el efecto biológico inducido por el complejo de receptor de IL-7 cuando se enlaza a su ligando, IL-7. La señalización por IL-7R incluye por lo tanto, sin limitación necesaria, uno o más, o todos, de fosforilación inducida por IL-7 de STAT-5, expansión inducida por IL-7 de células TH17 y supervivencia inducida por IL-7 de células TH17.

Los anticuerpos murinos 1 A 11 y 6A3 se describen en la solicitud de patente número PCT/US2009/053136 (WO2010/017468). Estos anticuerpos se enlazan específicamente a la cadena alfa del receptor de IL-7 humano, CD127 (SEQ ID N°: 1). Los dominios variables de estos anticuerpos se describen en SEQ ID N°: 8 y 9 (VH, VK 1A11, respectivamente) y SEQ ID N°: 45 y 46 (VH, VK 6A3, respectivamente).

La presente invención proporciona proteínas de enlace a antígeno que comprenden una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de 1 A 11 o 6A3 y variantes de las mismas. Las proteínas de enlace a antígeno pueden enlazarse y neutralizar la señalización de IL-7R. En una modalidad, la invención proporciona anticuerpos humanizados, que comprenden de una a seis de las CDR de los anticuerpos murinos 1 A 11 o 6A3 (el anticuerpo donador) en un anticuerpo aceptor humano.

La expresión "proteína de enlace a antígeno" como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otras construcciones de proteínas, tales como dominios, que son capaces de enlazarse a CD127. En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno es un anticuerpo.

El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio para referirse a moléculas con un dominio de tipo inmunoglobulina e incluye anticuerpos monoclonales, recombinantes, policlonales, quiméricos, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados; un dominio variable sencillo, un anticuerpo de dominio, fragmentos de enlace a antígeno, fragmentos inmunológicamente eficaces, Fv de cadena sencilla, diacuerpos, TanAcdsMR, etc. (para un sumario de formatos de "anticuerpos" alternativos véase Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Volumen 23, N° 9, 1126-1136).

La frase "domino variable sencillo" se refiere a un dominio variable de proteína de enlace a antígeno (por ejemplo, VH, VHH> VL) que se enlaza específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región variable o dominio diferente.

Un "anticuerpo de dominio" o "Acd" puede considerarse igual que un "dominio variable sencillo" que es capaz de enlazarse a un antígeno. Un dominio variable sencillo puede ser un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables de anticuerpo sencillos de otras especies tales como Acd de VHH de roedores (por ejemplo, como se desvela en el documento WO 00/29004), tiburón nodriza y Camélido. Los VHH de Camélido son polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina que derivan de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de cadenas ligeras. Dichos dominios VHH pueden humanizarse de acuerdo con técnicas convencionales disponibles en la materia y se considera que dichos dominios son "anticuerpos de dominio". Como se usa en el presente documento VH incluye dominios VHH de camélido.

Como se usa en el presente documento el término "dominio" se refiere a una estructura proteica plegada que tiene estructura terciaria independiente del residuo de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades funcionales discretas de las proteínas y en muchos casos pueden añadirse, retirarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del residuo de la proteína y/o del domino. Un "domino variable sencillo" es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpo. Incluye por lo tanto dominios variables de anticuerpo completo y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que se han reemplazado uno o más bucles con secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo o dominios variables de anticuerpo que se han truncado o comprenden prolongaciones C terminales o N terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan cuando menos la actividad de enlace y especificidad del dominio de longitud completa. Un domino puede enlazarse a un antígeno o un epítopo independientemente de un dominio o región variable diferente.

Puede proporcionarse un fragmento de enlace a antígeno por medio de la disposición de una o más CDR en armazones proteicos no de anticuerpo tales como un dominio. Un armazón o domino proteico no de anticuerpo es uno que se ha sometido a ingeniería de proteínas para obtener un enlace a un ligando distinto de su ligando natural, por ejemplo, un dominio que es un derivado de un armazón seleccionado de: CTLA-4 (Evicuerpo); lipocalina; moléculas derivadas de Proteína A tales como dominio Z de Proteína A (Aficuerpo, SpA), dominio A (Avímero/Maxicuerpo); proteínas de choque término tales como GroEl y GroES; transferrina (transcuerpo); proteína con repeticiones de anquirina (DARPin); aptámero peptídico; dominio de lectina de tipo C (Tetranectina); ?-cristalina humana y ubiquitina humana (afilinas); dominios PDZ; toxina de escorpión; dominios de tipo kunitz de inhibidores de proteasa humanos; y fibronectina (adnectina); que se han sometido a ingeniería de proteínas para obtener enlace a un ligando distinto de su ligando natural.

CTLA-4 (Antígeno asociado con Linfocito T Citotóxico 4) es un receptor de la familia de CD28 expresado principalmente en células T CD4+. Su dominio extracelular tiene un pliegue Ig de tipo domino variable. Los bucles que corresponden a las CDR de anticuerpos pueden sustituirse con una secuencia heteróloga para conferir diferentes propiedades de enlace. Las moléculas de CTLA-4 modificadas por ingeniería genética para tener diferentes especificidades de enlace también se conocen como Evicuerpos. Para detalles adicionales véase Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).

Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que transportan moléculas hidrófobas pequeñas tales como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Tienen una estructura secundaria de lámina ß rígida con varios bucles en el extremo abierto de la estructura canónica que puede modificarse por ingeniería genética para enlazarse a diferentes antígenos diana. Las anticalinas tienen un tamaño entre 160 y 180 aminoácidos y derivan de lipocalinas. Para detalles adicionales véase Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), los documentos US7250297B1 y US20070224633.

Un aficuerpo es un derivado de armazón de Proteína A de Staphylococcus aureus que puede modificarse por ingeniería genética para enlazarse a un antígeno. El dominio constituido por un conjunto de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado bibliotecas por selección aleatoria de residuos superficiales. Para detalles adicionales véase Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) y la Patente Europea Número EP1641818A1.

Los avímeros son proteínas multidominio derivadas de la familia del armazón de dominio A. Los dominios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura enlazada por disulfuro definida. Se genera diversidad mediante la redistribución de la variación natural mostrada por la familia de los dominios A. Para detalles adicionales véase Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) y Expert Opinión on I nvestigational Drugs 16(6), 909-917 (junio de 2007).

Una transferrina es una glucoproteína de transporte en suero monomérica. Las transferrinas pueden modificarse por ingeniería genética para enlazarse a diferentes antígenos diana por inserción de secuencias peptídicas, tal como una o más CDR, en un bucle de superficie permisiva. Los ejemplos de armazones de transferrina obtenidos por ingeniería genética incluyen los Transcuerpos. Para detalles adicionales véase J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).

Las Proteínas con Repeticiones de Anquirina Diseñadas (DARPin) derivan de Anquirina, que es una familia de proteínas que media en la enlace de proteínas de membrana integrales con el citoesqueleto. Una única repetición de anquirina es un motivo de 33 residuos que constituido por dos hélices a y un giro ß. Pueden modificarse por ingeniería genética para enlazarse a diferentes antígenos diana mediante: selección aleatoria de residuos en la primera hélice a y un giro ß de cada repetición; o inserción de secuencias peptídicas, tales como una o más CDR. Su interfaz de enlace puede aumentarse aumentando el número de módulos (un procedimiento de maduración por afinidad). Para detalles adicionales véase J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) y J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y la Patente de los Estados Unidos Número US20040132028A1.

La fibronectina es un armazón que puede modificarse por ingeniería genética para enlazarse a antígeno. Las adnectinas consisten en una cadena principal de la secuencia de aminoácidos natural del 10° dominio de las 15 unidades repetidas de fibronectina humana tipo III (FN3). Tres bucles en un extremo del sándwich ß pueden modificarse por ingeniería genética para permitir que una Adnecti na reconozca específicamente una diana terapéutica de i nte rés . Para detalles adicionales véase Protein Eng . Des . Sel . 1 8 , 435-444 (2005) , documentos US200801 39791 , WO2005056764 y U S681 841 8B 1 .

Los aptámeros peptídicos son moléculas de reconocimiento combinatorias que consisten en una proteína de armazón constante , típicamente tiorredoxi na (TrxA) que contiene un bucle peptídico variable limitado insertado en el sitio activo. Para detalles adicionales véase Expert Opin . Biol . Ther. 5 , 783-797 (2005) .

Los microcuerpos derivan de microproteínas de origen natu ral de 25- 50 ami noácidos de longitud que contienen 3-4 puentes de ciste ína; los ejemplos de microprote ínas incluyen KalataBI y conotoxi na y knotinas. Las microproteínas tienen un bucle que puede modificarse por ingeniería genética para inclui r hasta 25 aminoácidos sin afectar al pliegue global de la microprote ína. Para detalles adicionales de dominios de knotina modificados por ingeniería genética, véase el documento WO2008098796.

Otros dominios de enlace incluyen proteínas que se han usado como un armazón para modificar por ingeniería genética diferentes propiedades de enlace a antígeno diana que incluyen ?-cristalina humana y ubiquitina humana (afilinas) , dominios tipo kunitz de los inhibidores de proteasa humana, dominios PDZ de la proteína de enlace a Ras AF-6, toxinas de escorpión (caribdotoxina) , dominio de lectina tipo C (tetranectinas) se revisan en el Cap ítulo 7- Non- Antibody Scaffolds de Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, editado por Stefan Dubel) y Protein Science 15: 14-27 (2006). Los dominios de enlace de la presente invención pueden derivar de cualquiera de estos dominios de proteínas alternativos y cualquier combinación de las CDR de la presente invención insertadas en el dominio.

Un fragmento de enlace a antígeno o un fragmento inmunológicamente eficaz puede comprender secuencias variables de cadena pesada o ligera parciales. Los fragmentos tienen cuando menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud. Como alternativa los fragmentos tienen cuando menos 15, cuando menos 20, cuando menos 50, cuando menos 75 o cuando menos 100 aminoácidos de longitud.

La expresión "se enlaza específicamente" como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva en relación con las proteínas de enlace a antígeno significa que la proteína de enlace a antígeno se enlaza a CD127 sin enlace o con enlace insignificante a otras proteínas (por ejemplo, sin relación). La expresión, sin embargo, no excluye el hecho de que las proteínas de enlace a antígeno también pueden reaccionar de forma cruzada con CD127 de otras especies, tales como CD127 murino, CD127 de mono cinomolgo (Macaca fascicularis) o tití. En una modalidad, la proteína de enlace a antígeno se enlaza a CD127 tanto de mono cinomolgo como de tití. Las propiedades de enlace a antígeno descritas en el presente documento pueden enlazarse a CD127 humano con una afinidad cuando menos 2, 5, 10, 50, 100 ó 1000 veces mayor que con la que se enlazan a CD127 de otras especies.

La afinidad de enlace o la constante disociación en equilibrio (KD) de la interacción de proteína de enlace a antígeno-CD127 puede ser de 100 nM o menos, 10 nM o menos, 2 nM o menos o 1 nM o menos. Como alternativa la KD puede estar entre 5 y 10 nM o entre 1 y 2 nM. La KD puede estar entre 1 pM y 500 pM o entre 500 pM y 1 nM. La afinidad de enlace de la proteína de enlace a antígeno se determina mediante la constante de velocidad de asociación (ka) y la constante de velocidad de disociación (kd) (KD = kd/ka). La afinidad de enlace puede medirse mediante BIAcore™, por ejemplo, mediante captura de antígeno con CD127 acoplado a una microplaca CM5 mediante acoplamiento de amina primara y captura de anticuerpos en esta superficie. El procedimiento de BIAcore™ descrito en el Ejemplo 4 puede usarse para medir la afinidad de enlace. Como alternativa, la afinidad de enlace puede medirse mediante FORTEbio, por ejemplo, mediante captura de antígeno con CD127 acoplado en una aguja CM5 mediante acoplamiento de amina primaria y captura de anticuerpos en esta superficie.

La kd puede ser 1x10'3 s"1 o menos, 1x10"4 s'1 o menos, o 1x10" 5 s'1 o menos. La kd puede estar entre 1x10"5 s" y 1x10"4 s"1 o entre 1x10"4 s" y 1X10"3 s'1. Una kd lenta puede dar como resultado una disociación lenta del complejo de proteína de enlace a antígeno-ligando y neutralización mejorada del ligando.

Resultará evidente para los expertos en la materia que se pretende que el término "derivado" defina no solamente la fuente en el sentido de ser el origen f ísico del material sino también que defina material que es estructuralmente idéntico al material pero que no se origi na desde la fuente de referencia. De este modo los "residuos hallados en el anticuerpo donador" no tienen necesariamente que haberse pu rificado del anticuerpo donador.

Por aislado se entiende que la molécu la, tal como una proteína de enlace a antígeno, se retira del ambiente en el que puede encontrarse la naturaleza. Por ejemplo, la molécula puede separarse por pu rificación de sustancias con las que normalmente existi ría en la naturaleza. Por ejemplo, la prote ína de enlace a antígeno puede purificarse hasta el menos el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento , el 98 por ciento o el 99 por ciento, o más con respecto a un medio de cultivo que contiene la proteína de enlace a antígeno. Las prote ínas de enlace a antígeno y los anticuerpos de la presente invención pueden aislar las prote ínas de enlace a antígeno y los anticuerpos.

U n "anticuerpo qui mérico" se refiere a un tipo de anticuerpo desarrollado por ingeniería genética que contiene una región variable de origen natural (cadena ligera y cadenas pesadas) derivado de un anticuerpo donador junto con regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor.

Un "anticue rpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo desarrollado por ingeniería genética que tiene una o más de sus CDR derivadas de una inmunoglobulina donadora no human , derivando el residuo de las partes derivadas de inmunoglobulina de la molécula de una o más inmunoglobulinas humanas . Además , los residuos de soporte de armazón pueden alterarse para conservar la afinidad de enlace (véase, por ejemplo, Queen y colaboradores, Proc. Nati Acad Sci USA, 86: 1 0029- 1 0032 ( 1 989) , Hodgson y colaboradores, Bio/Technology, 9 : 421 ( 1 991 )) . Un anticuerpo aceptor humano adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional , por ejemplo, la base de datos KABAT®, base de datos de Los Álamos, base de datos de Swiss Protein , por homología con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del anticuerpo donador. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones de marco del anticuerpo donador (en una base de aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de cadena pesada y/o un marco variable de cadena pesada para la inserción de las CD R donadoras . Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones de marco variables o constantes de cadena ligera puede seleccionarse de una manera similar. Debería observarse que no se requiere que las cadenas pesada y ligera del anticuerpo aceptor se originen del mismo anticuerpo aceptor. La técnica anterior describe varios modos para produci r dichos anticuerpos humanizados, véase por ejemplo, los documentos E P-A-0239400 y E P-A-054951 .

La expresión "anticuerpo donador" se refiere a un anticuerpo que contribuye a las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, u na o más CDR u otros fragmentos o análogos funcionales de los mismos a un primer compañero de inmunoglobuli na. El donador por lo tanto proporciona la región codificante de inmunoglobulina alterada y el anticuerpo alterado expresado resultante con la especificidad antigénica y actividad neutraiizadora característica del anticuerpo donador.

La expresión "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo que es heterólogo del anticuerpo donador, que contribuye con todas (o cualquier parte de) las secuencias de aminoácidos q ue codifican sus regiones de marco de cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera al primer compañero de i nmunoglobul i na. Un anticuerpo humano puede ser el anticuerpo aceptor.

Los términos "VH" y "VL" se usan en el presente documento para referi rse a la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera respectivamente de una proteína de enlace a antígeno. VK también se usa para referirse al dominio de cadena ligera variable .

"C DR" se defi nen como las secuencias de aminoácidos de regiones determi nantes de complementariedad de una prote ína de enlace a antígeno. Estas son las regiones hi pervariables de las cadenas pesada y l igera de inmunoglobuli na. Existen tres CD R (o regiones CDR) de cadena pesada y tres de cadena lige ra en la parte variable de una inmunoglobulina . De este modo , "CDR" como se usa en el presente documento se refiere a las tres C DR de cadena pesada, las tres CD R cadena ligera, todas las CD R de cadena pesada y ligera o cuando menos dos CDR.

A lo largo de esta memoria descriptiva, los residuos de aminoácidos en las secuencias de dominio variable y secuencias de anticuerpo de longitud completa se numeran de acuerdo con la convención de numeración de Kabat, a no ser que se especifique de otro modo. De forma similar, los términos "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1 ", "CDRH2", "CDRH3" usados en los Ejemplos sigue la convención de numeración de Kabat. Para información adicional, véase Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Edición, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).

Resultará evidente para los expertos en la materia que existen convenciones de numeración alternativas para residuos de aminoácidos en secuencias de dominio variable y secuencias de anticuerpos de longitud completa. Existen también convenciones de numeración alternativas para secuencias CDR, por ejemplo, las expuestas en Chothia y colaboradores (1989) Nature 342: 877-883. La estructura y plegamiento proteico del anticuerpo puede implicar que otros residuos se consideren parte de la secuencia CDR y se entendería que es así por un experto. Por lo tanto, la expresión "CDR correspondiente" se usa en el presente documento para referirse a una secuencia CDR que usa cualquier combinación de numeración, por ejemplo, las expuestas en la Tabla 1.

Otras convenciones de numeración para secuencias de CDR disponibles para un experto incluyen los procedimientos de "AbM" (Universidad de Bath) y de "contacto" (Escuela Universitaria de Londres). La región solapante mínima que usa cuando menos dos de los procedimientos de Kabat, Chothia, AbM y contacto se puede determinar que proporciona la "unidad de enlace mínima". La unidad de enlace mínima puede ser una subparte de una CDR.

La Tabla 1 a continuación representa una definición que utiliza cada convención de numeración para cada CDR o unidad de enlace. Se usa el esquema de numeración de Kabat en la Tabla 1 para numerar la secuencia de aminoácidos de dominio variable. Debería observarse que algunas de las definiciones de CDR pueden variar dependiendo de la publicación individual usada.

TABLA 1: Como se usa en el presente documento, el térmi no "sitio de enlace a antígeno" se refiere a un sitio en una proteína de enlace a antígeno que es capaz de enlazarse específicamente a un antígeno. Este puede ser un dominio sencillo (por ejemplo , un dominio de enlace a epítopo) o un domi nio de Fv de cadena sencilla (ScFv) o pueden ser dominios emparejados VH/VL como se pueden encontrar en u n anticuerpo convencional .

El término "ep ítopo" como se usa en el presente documento se refiere a la parte del antígeno que entra en contacto con un dominio de enlace particular de la prote ína de enlace a antígeno. Un epítopo puede ser lineal , comprendiendo esencialmente una secuencia de aminoácidos lineal . Como alternativa, un epítopo puede ser conformacional o disconti nuo. Por ejemplo, un ep ítopo conformacional comprende residuos de aminoácidos que requieren de un elemento de restricción estructural . U n ep ítopo discontinuo comprende residuos de aminoácidos que están separados por otras secuencias , es decir no en una secuencia contin ua en la secuencia primaria del antígeno. En el contexto de la estructura terciaria y cuaternaria del antígeno, los residuos de un epítopo discontinuo están lo suficientemente cerca entre sí para enlazarse mediante una prote ína de enlace a antígeno.

Para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, la expresión "idéntico" o "identidad de secuencia" indica el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o dos secuencias de ami noácidos y, si se requiere, cuando se alinean de forma óptima y en comparación con inserciones o supresiones apropiadas.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias está en f u nción del n úmero de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es deci r, por ciento de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones por 1 00) , teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que necesitan introduci rse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de porcentaje de identidad entre dos secuencias puede consegui rse usando un algoritmo matemático, como se describe posteriormente .

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG , usando una matriz NWSgapdna.CM P y un peso de hueco de 40 , 50 , 60 , 70 u 80 y un peso de longitud de 1 , 2 , 3 , 4 , 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de ami noácidos también puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de pesos de residuos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol.48: 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.

En un método, una secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a una secuencia polinucleotídica de referencia como se describe en el presente documento (véase por ejemplo, SEQ ID N°: 30-39, SEQ ID N°: 76-105) que es idéntica al 100 por ciento o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia, tal como cuando menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 Ó 99 por ciento idénticas. Dichas alteraciones se seleccionan de supresión, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de cuando menos un nucleótido y pudiendo producirse dichas alteraciones en las posiciones 5' ó 3' terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier punto entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleotidos en la secuencia polinucleotídica de referencia como se describe en el presente documento (véase por ejemplo, SEQ ID N°: 30-39, SEQ ID N°: 76-105), por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 100) y restando ese producto de dicho número total de nucleotidos en la secuencia polinucleotídica de referencia como se describe en el presente documento (véase por ejemplo, SEQ ID N°: 30-39, SEQ ID N°: 76-105), o: nn < xn - (xn · y), en la que nn es el número de alteraciones de nucleotidos, xn es el número total de nucleotidos en la secuencia polinucleotídica de referencia como se describe en el presente documento (véase por ejemplo, SEQ ID N°: 30-39, SEQ ID N°: 76-105) e y es 0.50 para el 50 por ciento, 0.60 para el 60 por ciento, 0.70 para el 70 por ciento, 0.75 para el 75 por ciento, 0.80 para el 80 por ciento, 0.85 para el 85 por ciento, 0.90 para el 90 por ciento, 0.95 para el 95 por ciento, 0.98 para el 98 por ciento, 0.99 para el 99 por ciento o 1,00 para el 100 por ciento, · es el símbolo para el operador de multiplicación y en la que cualquier producto no entero de x„ e y se redondea hacia abajo al entero más cercano antes de restarlo de xn.

De forma similar una secuencia polipeptídica puede ser idéntica a una secuencia de referencia polipeptídica como se describe en el presente documento (véase por ejemplo, SEQ ID N°: 1 -29 , SEQ I D N°: 40-75) que es idéntica al 1 00 por ciento o puede i ncl ui r hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el porcentaje de identidad es menor del 1 00 por ciento, tal como cuando menos 50, 60, 70, 75, 80 , 85, 90 , 95 , 98 ó 99 por ciento idéntica . Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que constituido por supresión , sustitución , incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de cuando menos un ami noácido y pudiendo producirse dichas alteraciones en las posiciones ami no o carboxi terminal de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier punto entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el núme ro total de ami noácidos en la secuencia polipeptídica codificada por la secuencia de referencia polipeptídica como se describe en el presente docu mento (véase por ejemplo, S EQ I D N°: 1 -29, S EQ I D N°: 40-75) por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 1 00) y restando después ese producto de dicho número total de aminoácidos en la secuencia de referencia polipeptídica como se describe en el presente documento (véase por ejemplo, S EQ I D N°: 1 -29, S EQ I D N°: 40-75) , o: na < xa - (xa · y), en la que na es el número de alteraciones de ami noácidos , xa es el número total de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia como se describe en el presente documento (véase por ejemplo, S EQ I D N°: 1 -29 , S EQ I D N°: 40-75) e y es 0.50 para el 50 por ciento, 0.60 para el 60 por ciento , 0.70 para el 70 por ciento, 0.75 para el 75 por ciento , 0.80 para el 80 por ciento, 0.85 para el 85 por ciento, 0.90 para el 90 por ciento, 0.95 para el 95 por ciento, 0.98 para el 98 por ciento, 0.99 para el 99 por ciento o 1 ,00 para el 1 00 por ciento, · es el símbolo para el operador de multiplicación y en la que cualquier producto no entero de xa e y se redondea hacia abajo al entero más cercano antes de restarlo de xa.

El por ciento de identidad puede determinarse a lo largo de la longitud completa de la secuencia, o cualquier fragmento de la misma; y con o sin cualquier i nserción o supresión .

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se refiere cada u no a una molécula que comprende dos o más residuos de aminoácidos. Un péptido puede ser monomérico o poli mérico.

Se reconoce bien en la técnica que ciertas sustituciones de aminoácidos se consideran "conservativas". Los aminoácidos se dividen en grupos basándose en propiedades de cadenas laterales comunes y las sustituciones dentro de grupos que mantienen toda o sustancialmente toda la afinidad de enlace de la proteína de enlace a antígeno se consideran sustituciones conservativas , véase la Tabla 2 a continuación : TABLA 2 La presente invención proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende CDRH3 de SEQ ID N°: 4; una variante de CDRH3 de la misma o una CDRH3 de SEQ ID N°: 132 a SEQ ID N°: 137. La proteína de enlace a antígeno a CD127 puede ser específica y también puede neutralizar la actividad de IL-7R.

La presente invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende CDRH2 de SEQ ID N°: 3; o una variante de CDRH2 de la misma. La proteína de enlace a antígeno a CD127 también puede neutralizar la actividad de IL-7R.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender adicionalmente además de las secuencias de CDRH3 o CDRH2 descritas anteriormente, una o más CDR, o todas las CDR, en cualquier combinación, seleccionadas de: CDRH1 (SEQ ID N°: 2), CDRH2 (SEQ ID N°: 3), CDRH3 (SEQ ID N°: 4, o cualquiera de SEQ ID N°: 132 a SEQ ID N°: 137), CDRL1 (SEQ ID N°: 5), CDRL2 (SEQ ID N°: 6) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7); o una variante de cualquiera de dichas CDR.

Por ejemplo, la proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 4) y CDRH1 (SEQ ID N°: 2), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 4) y CDRH2 (SEQ ID N°: 3) o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH1 (SEQ ID N°: 2) y CDRH2 (SEQ ID N°: 3) y CDRH3 (SEQ ID N°: 4) o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRL1 (SEQ ID N°: 5) y CDRL2 (SEQ ID N°: 6), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRL2 (SEQ ID N°: 6) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRL1 (SEQ ID N°: 5), CDRL2 (SEQ ID N°: 6) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7), o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 4) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 4), CDRH2 (SEQ ID N°: 3) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 4), CDRH2 (SEQ ID N°: 3), CDRL2 (SEQ ID N°: 6) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7), o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH1 (SEQ ID N°: 2), CDRH2 (SEQ ID N°: 3), CDRH3 (SEQ ID N°: 4), CDRL1 (SEQ ID N°: 5), CDRL2 (SEQ ID N°: 6) y CDRL3 (SEQ ID N°: 7) . Como alternativa, pueden estar presentes variantes de CDR, o el CDRH3 de la SEQ ID N°: 4 se pueden remplazar con cualquiera de los CDR de la SEQ ID N°: 132-137.

La presente invención proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende CDRH3 de SEQ ID N°: 41 o una variante de CDRH3 de la misma. La proteína de enlace a antígeno puede también neutralizar la actividad de IL-7R.

La presente invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende CDRH2 de SEQ ID N°: 41 o una variante de CDRH2 de la misma. La proteína de enlace a antígeno también puede neutralizar la actividad de IL-7R.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender adicionalmente además de las secuencias de CDRH3 o CDRH2 descritas anteriormente, una o más CDR, o todas las CDR, en cualquier combinación, seleccionadas de: CDRH1 (SEQ ID N°: 39), CDRH2 (SEQ ID N°: 40), CDRH3 (SEQ ID N°: 41), CDRL1 (SEQ ID N°: 42), CDRL2 (SEQ ID N°: 43) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44) o una variante de cualquiera de dichas CDR.

Por ejemplo, la proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 41) y CDRH1 (SEQ ID N°: 40), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 41) y CDRH2 (SEQ ID N°: 40), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH1 (SEQ ID N°: 39) y CDRH2 (SEQ ID N°: 40), y CDRH3 (SEQ ID N°: 41), o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRL1 (SEQ ID N°: 42) y CDRL2 (SEQ ID N°: 43), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRL2 (SEQ ID N°: 43) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRL1 (SEQ ID N°: 42), CDRL2 (SEQ ID N°: 43) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44), o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 41) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 41), CDRH2 (SEQ ID N°: 40) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44), o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH3 (SEQ ID N°: 41), CDRH2 (SEQ ID N°: 40), CDRL2 (SEQ ID N°: 43) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44), o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender CDRH1 (SEQ ID N°: 39), CDRH2 (SEQ ID N°: 40), CDRH3 (SEQ ID N°: 41), CDRL1 (SEQ ID N°: 42), CDRL2 (SEQ ID N°: 43) y CDRL3 (SEQ ID N°: 44). Como alternativa, puede estar presente variantes de CDR.

La presente invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende la CDRH3 correspondiente de la secuencia de dominio variable de SEQ ID N°: 8, o una variante de CDRH3 de la misma, en un armazón aceptor humano. La proteína de enlace a antígeno puede neutralizar la actividad de CD127. La proteína de enlace a antígeno puede ser un anticuerpo humano, quimérico o humanizado.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender adicionalmente una o más, o todas las CDR correspondientes seleccionadas de la secuencia de dominio variable de SEQ ID N°: 8 y/o SEQ ID N°: 9 o una variante de CDR de las mismas.

La presente invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende la CDRH3 correspondiente de la secuencia de dominio variable de SEQ ID N°: 45, o una variante de CDRH3 de la misma, en un armazón aceptor humano. La proteína de enlace a antígeno puede neutralizar la actividad de CD127. La proteína de enlace a antígeno puede ser un anticuerpo humano, quimérico o humanizado.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender adicionalmente una o más, o todas las CDR correspondientes seleccionadas de la secuencia de dominio variable de SEQ ID N°: 45 y/o SEQ ID N°: 46, o una variante de CDR de las mismas.

Por ejemplo, la proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRH3 correspondiente y la CDRH1 correspondiente, o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRH3 correspondiente y la CDRH2 correspondiente, o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRH1 correspondiente, la CDRH2 correspondiente y la CDRH3 correspondiente, o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRL1 correspondiente y la CDRL2 correspondiente o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRL2 correspondiente o la CDRL3 correspondiente o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRL1 correspondiente, la CDRL2 correspondiente y la CDRL3 correspondiente, o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRH3 correspondiente y la CDRL3 correspondiente, o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRH3 correspondiente, la CDRH2 correspondiente y la CDRL3 correspondiente, o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRH3 correspondiente, la CDRH2 correspondiente, la CDRL2 correspondiente y la CDRL3 correspondiente, o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender la CDRH1 correspondiente, la CDRH2 correspondiente, la CDRH3 correspondiente, la CDRL1 correspondiente, la CDRL2 correspondiente y la CDRL3 correspondiente, o variantes de las mismas.

La CDR correspondiente puede definirse por referencia a los procedimientos de Kabat (1987), Chothia (1989), AbM o de contacto. Una definición de cada uno de los métodos puede encontrarse en la Tabla 1 y puede aplicarse al domino variable de cadena pesada de referencia (SEQ ID N°: 8 o SEQ ID N°: 45) y el dominio variable de cadena ligera de referencia (SEQ ID N°: 9 y SEQ ID N°: 46) para determinar la CDR correspondiente.

La presente invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende una unidad de enlace H3 que comprende los residuos de Kabat 95-101 de SEQ ID N°: 8 o una variante de H3. La proteína de enlace a antígeno puede ser una proteína de enlace a antígeno humana, humanizada o quimérica, tal como un anticuerpo.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender adicionalmente una o más o todas las unidades de enlace seleccionadas de: H1 que comprende los residuos de Kabat 31-32 de SEQ ID N°: 8, H2 que comprende los residuos de Kabat 52-56 de SEQ ID N°: 8, L1 que comprende los residuos de Kabat 30-34 de SEQ ID N°: 9, L2 que comprende los residuos de Kabat 50-55 de SEQ ID N°: 9 y L3 que comprende los residuos de Kabat 89-96 de SEQ ID N°: 9; o una variante de unidad de enlace.

La presente invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127, y comprende una unidad de enlace H3 que comprende los residuos de Kabat 95-101 de SEQ ID N°: 45, o una variante de H3. La proteína de enlace a antígeno puede ser una proteína de enlace a antígeno humana, h umanizada o quimérica, tal como un anticuerpo.

La prote ína de enlace a antígeno puede comprender adicionalmente una o más, o todas las unidades de enlace seleccionadas de: H 1 que comprende los residuos de Kabat 31 -32 de SEQ I D N°: 45, H2 que comprende los residuos de Kabat 52-56 de S EQ ID N°: 46, L1 que comprende los residuos de Kabat 30-34 de S EQ I D N°: 46 , L2 que comprende los residuos de Kabat 50-55 de S EQ I D N°: 46 y L3 que comprende los residuos de Kabat 89-96 de S EQ I D N°: 46; o u na u nidad de enlace variante.

Por ejemplo, la prote ína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace H3 y una unidad de en lace H 1 , o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace H3 y una unidad de enlace H2 , o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace H 1 , una unidad de enlace H2 y una unidad de enlace H3, o variantes de las mismas.

La prote ína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace L1 y una unidad de enlace L2 , o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace L2 y una unidad de enlace L3, o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender u na unidad de enlace L1 , una unidad de enlace L2 y una unidad de enlace L3, o variantes de las mismas.

La prote ína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace H3 y una unidad de enlace L3, o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace H3, una unidad de enlace H2 y una unidad de enlace L3 ; o variantes de las mismas. La proteína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace H3, una unidad de enlace H2 , una unidad de enlace L2 y una unidad de enlace L3; o variantes de las mismas.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender una unidad de enlace H 1 , una unidad de enlace H2 , una unidad de enlace H3, una unidad de enlace L1 , una unidad de enlace L2 y una unidad de enlace L3, o variantes de las mismas.

Una variante de C DR o unidad de enlace variante incluye una secuencia de aminoácidos modificada en cuando menos un ami noácido, pudiendo ser dicha modificación qu ímica o una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, en no más de 1 0 aminoácidos) , permitiendo dicha modificación que la variante conserve las características biológicas de la secuencia no modificada. Por ejemplo, la variante es una variante funcional que se enlaza a CD 1 27. Una alteración parcial de la secuencia de ami noácidos de CDR puede ser mediante supresión o sustitución de uno a varios aminoácidos o por adición o inserción de uno o varios ami noácidos , o por una combinación de las mismas (por ejemplo, en no más de 1 0 aminoácidos). La CDR variante o variante de unidad de enlace puede contener 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 sustituciones , adiciones o supresiones de aminoácidos , en cualquier combinación , en la secuencia de aminoácidos. La variante de CDR o variante de unidad de enlace puede contener 1 , 2 ó 3 sustituciones , adiciones o supresiones de aminoácidos, en cualquier combinación , en la secuencia de aminoácidos . Las sustituciones en los residuos de aminoácidos pueden ser sustituciones conservativas , por ejemplo , que sustituyen un aminoácido hidrófobo con un aminoácido hidrófobo alternativo. Por ejemplo, la leucina puede sustituirse con valina o isoleucina.

Las CDR L1 , L2 , L3, H 1 , H2 y H3 tienden a mostrar estructuralmente una de un número finito de conformaciones de cadena pri ncipal (canónicas). La clase de estructu ra canónica particular de una CDR se define por la longitud de la CDR y el empaquetamiento del bucle, determi nados por los residuos localizados en posiciones claves en las CDR y las regiones de marco (residuos estructuralmente determinantes o S DR) . Martin y Thornton ( 1 996; J Mol Biol 263: 800-81 5) ha generado un procedimiento automático para defini r las plantillas canónicas de "residuo clave". Se usa análisis de grupo para definir las clases canónicas de conjuntos de C DR y las plantillas canónicas se identifican después mediante el análisis de residuos hidrófobos internados enlazados con hidrógeno y glicinas y proli nas conservadas . Las CD R de las secuencias de anticuerpos pueden asignarse a clases canónicas por comparación de las secuencias con las plantillas de residuo clave y puntuando cada plantilla usando matrices de identidad o similitud .

Basándose en la clase canónica del anticuerpo 1 A1 1 H3L4 (SEQ ID N°: 13 (1A11.H3 VH) o SEQ ID N°: 22 (1A11.L4 VK)), puede predecirse que la enlace de anticuerpo funcional se mantendría en presencia de las siguientes sustituciones de CDR, en las que el aminoácido antes del número de Kabat es la secuencia de aminoácidos original y la secuencia de aminoácidos al final del número de Kabat es el aminoácido sustituido: Sustituciones de CDRH1.

Y32I, Y32H, Y32F, Y32T, Y32N, Y32C, Y32E, Y32D T33Y, T33A, T33W, T33G, T33L, T33V 34I, M34V, M34W N35E, N35H, N35Q, N35S, N35Y, N35T Sustituciones de CDRH2: L50R, L50E, L50W, L50Y, L50G, L50Q, L50V, L50N, L50K, N50A 151 L, 151 V, I51T, 151 S, I51N N52D, N52L, N52S, N52Y Y53A, Y53G, Y53S, Y53K, Y53T, Y53N N54S, N54T, N54K, N54D, N54G V56Y, V56R, V56E, V56D, V56G, V56S, V56A S58K, S58N, S58T, S58D, S58R, S58G, S58F, S58Y Sustituciones de CDRH3: V102Y, V102H, V102I, V102S, V102D, V102G Sustituciones de CDRL1 : S29V M33L Sustituciones de CDRL3: Q89L E90Q W91 Y Y93S, Y93R De este modo, la proteína de enlace a antígeno puede tener o no cualquiera de las sustituciones anteriores dentro de las posiciones de CDR. Pueden existir múltiples sustituciones por variante de CDR, por CDR correspondiente, por unidad de enlace, por región variable de cadena pesada o ligera, por cadena pesada o ligera y por proteína de enlace a antígeno y por lo tanto puede estar presente cualquier combinación de sustituciones en la proteína de enlace a antígeno de la invención, siempre que la estructura canónica de la CDR se mantenga.

Para evitar dudas, las sustituciones anteriormente descritas no deberían interpretarse como limitantes de las posibles sustituciones de CDR que pueden realizarse manteniendo aún un anticuerpo funcional anti-CD127.

La proteína de enlace a antígeno que comprende las CDR, CDR correspondientes, variantes de CDR, unidades de enlace o variantes de unidades de enlace descritas, pueden presentar una potencia para la enlace a CD127, como se demuestra mediante CE50, dentro de 10 veces, o dentro de 5 veces la potencia demostrada por 1A11c (quimera, VH - SEQ ID N°: 28, VK - SEQ ID N°: 29) o 6A3c (quimera, VH - SEQ ID N°: 74, VK - SEQ ID N°: 75).

La potencia para la enlace a CD127 puede demostrarse por diversos procedimientos, tales como afinidad de enlace (por ejemplo, mediante BIAcore) o CE50 (por ejemplo, mediante un ensayo de ELISA).

Como se ha analizado anteriormente, la clase de estructura canónica particular de una CDR se define por la longitud de la CDR y por el empaquetamiento de bucle, determinados por los residuos localizados en posiciones clave en las CDR y las regiones de marco conservados. Por lo tanto además de las CDR enumeradas en SEQ ID N°: 2-6, variantes de CDR, CDR correspondientes, unidades de enlace o variantes de las mismas, pueden realizarse sustituciones en los residuos de marco de una proteína de enlace a antígeno de la invención, basándose en la clase canónica, manteniendo aún un anticuerpo funcional. Estas pueden incluir (usando numeración de Kabat): Cadena pesada: V, I o G en la posición 2; L o V en la posición 4; L, I, o V en la posición 20; C en la posición 22; T, A, V, G o S en la posición 24; G en la posición 26; I, F, L o S en la posición 29; W en la posición 36; W o Y en la posición 47; I, M, V o L en la posición 48; I, L, F, M o V en la posición 69; V, A, R o L en la posición 71; A, L, V, Y o F en la posición 78; L o M en la posición 80; Y o F en la posición 90; C en la posición 92; y/o R, K, G, S, H o N en la posición 94; y/o Cadena ligera: I, L o V en la posición 2; V, Q, L o E en la posición 3; M o L en la posición 4; C en la posición 23; W en la posición 35; Y, L o F en la posición 36; S, L, R o V en la posición 46; Y, H, F o K en la posición 49 ; Y o F en la posición 71 ; C en la posición 88; y/o F en la posición 98.

Una cualquiera, cualquier combinación , o todas las posiciones de marco descritas anteriormente pueden estar presentes en la prote ína de enlace a antígeno de la invención . Pueden existir múltiples posiciones de marco canónicas variantes por región variable de cadena pesada o ligera, por cadena pesada o l igera y por proteína de enlace a antígeno y por lo tanto puede estar presente cualquier combi nación en la proteína de enlace a antígeno de la invención , siempre que la estructura canónica del armazón se mantenga.

Por ejemplo, el armazón variable de cadena pesada puede comprender V en la posición 2 , L en la posición 4, V en la posición 20 , C en la posición 22, A en la posición 24, G en la posición 26, F en la posición 29 , W en la posición 36, W en la posición 47, M en la posición 48, L en la posición 69, R en la posición 71 , A en la posición 78, M en la posición 80, Y en la posición 90 , C en la posición 92 y R en la posición 94 y por ejemplo, el armazón variable de cadena ligera puede comprender I en la posición 2 , L en la posición 4 , C en la posición 23, W en la posición 35 , Y en la posición 36, F en la posición 71 , C en la posición 88 , E en la posición 90 e Y en la posición 93.

Una o más de las CDR , CDR correspondientes , variantes de C D R o unidades de enlace descritas en el presente documento pueden estar presentes en el contexto de un armazón humano, por ejemplo, como un domino variable humanizado o quimérico.

El dominio variable de cadena pesada humanizado puede comprender las CDR numeradas en la SEQ ID N°: 2-4 o SEQ ID N°: 39-41; variantes de CDR de las mismas; CDR correspondientes; unidades de enlace; o variantes de las mismas, dentro de un armazón del anticuerpo aceptor que tiene el 75 por ciento o más, el 80 por ciento o más, el 85 por ciento o más, el 90 por ciento o más, el 95 por ciento o más, el 98 por ciento o más, el 99 por ciento o más o el 100 por ciento de identidad en las regiones de marco con la secuencia de dominio variable de aceptor humano en la SEQ ID N°: 116.

El dominio variable de cadena ligera humanizado puede comprender las CDR numeradas en SEQ ID N°: 5-7 o SEQ ID N°: 42-44; variantes de CDR de las mismas; CDR correspondientes; unidades de enlace; o variantes de las mismas, dentro de un armazón del anticuerpo aceptor que tiene el 75 por ciento o más, el 80 por ciento o más, el 85 por ciento o más, el 90 por ciento o más, el 95 por ciento o más, el 98 por ciento o más, el 99 por ciento o más o el 100 por ciento de identidad en las regiones de marco con la secuencia de dominio variable de aceptor humano en la SEQ ID N°: 117.

La invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende una región variable de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID N°: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 7, 121, 123, 125, 127, 129 y 131. La proteína de enlace a antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID N°: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27. Cualquiera de las regiones variables de cadena pesada puede combinarse con cualquiera de las regiones variables de cadena ligera. La proteína de enlace a antígeno también puede neutralizar CD127.

La invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende una región variable de cadena pesada seleccionada de una cualquiera de SEQ ID N°: 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 ó 69. La proteína de enlace a antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera seleccionada de una cualquiera de SEQ ID N°: 70, 71, 72, 73 ó 138. Cualquiera de las regiones variables de cadena pesada puede combinarse con cualquiera de las regiones variables de cadena ligera. La proteína de enlace a antígeno también puede neutralizar CD127.

La región variable de cadena pesada del anticuerpo puede tener el 75 por ciento o más, el 80 por ciento o más, el 85 por ciento o más, el 90 por ciento o más, el 95 por ciento o más, el 98 por ciento o más, el 99 por ciento o más o el 100 por ciento de identidad con una cualquiera de las SEQ ID N°: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129, ó 131; o SEQ ID N°: 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 ó 69.

La región variable de cadena ligera del anticuerpo puede tener el 75 por ciento o más, el 80 por ciento o más, el 85 por ciento o más, el 90 por ciento o más, el 95 por ciento o más, el 98 por ciento 0 más, el 99 por ciento o más o el 100 por ciento de identidad con una cualquiera de las SEQ ID N°: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27; o SEQ ID N°: 70, 71, 72, 73 ó 138.

El porcentaje de identidad de las variantes de SEQ ID N°: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 121, 123, 125, 127, 129, ó 131 puede determinarse a lo largo de la longitud completa de la secuencia.

La región variable de cadena pesada del anticuerpo puede ser una variante de una cualquiera de SEQ ID N°: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129, ó 131 que contiene 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos.

La región variable en cadena ligera del anticuerpo puede ser una variante de una cualquiera de SEQ ID N°: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27 que contiene 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos.

Por ejemplo, las CDR canónicas y las sustituciones de residuos de marco canónicas descritas anteriormente también pueden estar presentes en las variantes de regiones variables de cadena pesada o ligera como secuencias variantes que son cuando menos el 75 por ciento idénticas o que contienen hasta 30 sustituciones de aminoácidos.

En otra modalidad, la región variable de cadena pesada del anticuerpo puede ser una variante de una cualquiera de SEQ ID N°: 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 ó 69 que contiene 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos. La región variable de cadena ligera del anticuerpo puede ser una variante de una cualquiera de SEQ ID N°: 70, 71, 72 ó 73 que contiene 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos.

Cualquiera de las regiones variables de cadena pesada de la invención puede combinarse con una región constante humana adecuada. Cualquiera de las regiones variables de cadena ligera de la invención puede combinarse con una región constante adecuada.

La invención también proporciona una proteína de enlace a antígeno que se enlaza a CD127 y comprende cualquiera de las siguientes combinaciones de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera: 1A11.H3.L4 (SEQ ID N°: 13 y SEQ ID N°: 22) o una proteína de enlace a antígeno que tiene un domino variable de cadena pesada que tiene cuando menos el 75 por ciento de identidad con SEQ ID N°: 13 y un dominio variable de cadena ligera que tiene cuando menos el 75 por ciento de identidad con SEQ ID N°: 22. La proteína de enlace a antígeno también puede neutralizar CD127.

Las proteínas de enlace a antígeno como se han descrito anteriormente, por ejemplo, variantes con una alteración parcial de la secuencia por modificación química y/o inserción, supresión o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos, o las que tienen el 75 por ciento o más, el 80 por ciento o más, el 85 por ciento o más, el 90 por ciento o más, el 95 por ciento o más, el 98 por ciento o más o el 99 por ciento o más identidad con cualquiera de las secuencias descritas anteriormente, puede presentar una potencia de enlace a CD127, como se demuestra mediante CE50 o BIAcore, dentro de 10 veces o dentro de 5 veces la potencia demostrada por 1A11 o 6A3. La potencia de enlace con CD127, puede demostrarse por CE50, llevarse a cabo mediante un ensayo ELISA o, por afinidad de enlace, llevarse a cabo mediante BIAcore.

Los presentes inventores también han determinado experimentalmente que ciertas posiciones dentro de CDRH3 pueden sustituirse dando como resultado una afinidad de enlace reducida (es decir, enlace más fuerte). Dichos análogos de CDRH3 se exponen en la Tabla 4. Se vio que las sustituciones en las posiciones N98 y F100b (numeración de Kabat) eran particularmente eficaces en el aumento de afinidad. Las sustituciones particulares incluyen N98D, N98E, F100bE, F100bl y F100bV. Las secuencias de CDRH3 que representan estas sustituciones son SEQ ID N°: 132, 133, 134, 135, 136, y 137, respectivamente.

La presente invención contempla la incorporación de dichas sustituciones en cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento.

En una modal idad , el anticuerpo de la invención comprende retención de W (Trp) en la posición 1 00.

Puede ser deseable modificar la función efectora del fragmento de enlace a antígeno, por ejemplo, para potenciar ADCC o CDC , semivida, etc .

En una modalidad, las proteínas de enlace a antígeno de la invención pueden tener Fe inactivado. Una forma de consegui r la i nactivación de Fe comprende las sustituciones de los residuos de alanina en las posiciones 235 y 237 (numeración del índice de U E) de la región constante de cadena pesada. Como alternativa, la proteína de enlace a antígeno puede tener Fe activado y no comprender las sustituciones de alanina en las posiciones 235 y 237.

La prote ína de enlace a antígeno puede tener una semivida de cuando menos 6 horas, cuando menos 1 d ía, , cuando menos 2 días , cuando menos 3 d ías, cuando menos 4 d ías , cuando menos 5 días , cuando menos 7 d ías o cuando menos 9 días ¡n vivo en seres humanos o en un modelo animal murino.

La prote ína de enlace a antígeno puede derivar de rata, ratón , primate (por ejemplo, cinomolgo, mono del Viejo Mundo o Gran Simio) o ser humano. La proteína de enlace a antígeno puede se r un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. La proteína de enlace a antígeno puede comprender una región constante , que puede ser de cualquier isótopo o subclase. La región constante puede se r del isótopo de I gG, por ejemplo, lgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4 o variantes de los mismos. La región constante de la prote ína de enlace a antígeno puede ser I gG 1 .

Pueden usarse cambios mutacionales de la parte efectora de Fe del anticuerpo para cambiar la afinidad de la i nteracción entre Fc Rn y el anticuerpo para modular la renovación de anticuerpo. La semivida del anticuerpo puede prolongarse in vivo. Esto pod ría ser beneficioso para poblaciones de pacientes puesto que podrían conseguirse cantidades de dosis máxi ma y frecuencias de dosificación máximas como resultado de mantener la C I 50 in vivo durante periodos de tiempo más largos. La función efectora de Fe del anticuerpo puede el i minarse , en su totalidad o en parte, puesto que puede no ser deseable matar estas células que expresan CD 1 27. Esta eli mi nación puede dar como resultado un perfil de segu ridad aumentado.

La proteína de enlace a antígeno que comprende una región constante puede tener ADCC reducida y/o activación de complemento o funcionalidad efectora. El domino constante puede comprender una región constante inactivada de forma natural del isotipo lgG2 o lgG4 o un dominio constante de lgG 1 mutado. Se describen ejemplos de modificaciones adecuadas en el documento E P0307434. Una forma de consegui r la inactivación de Fe comprende las sustituciones de residuos de alani na en las posiciones 235 y 237 (numeración de índice de UE) de la región constante de cadena pesada.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender una o más modificaciones seleccionadas de un dominio constante mutado de modo que el anticuerpo tiene funciones efectoras/ ADCC y/o activación de complemento mejorados. Se describen ejemplos de modificaciones adecuadas en Shields y colaboradores, J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604, Lazar y colaboradores, PNAS (2006) 103: 4005-4010 y los documentos US6737056, WO2004063351 y WO2004029207.

La proteína de enlace a antígeno puede comprender un domino constante con un perfil de glucosilación alterado de modo que la proteína de enlace a antígeno tiene funciones efectoras/ ADCC y/o activación de complemento potenciados. Se describen ejemplos de metodologías adecuadas para producir una proteína de un antígeno con un perfil de glucosilación alterado en los documentos WO2003/011878, WO2006/014679 y EP1229125.

El polipéptido CD127 al que se enlaza la proteína de enlace a antígeno puede ser un polipéptido recombinante y puede comprender el dominio extracelular (ECD), opcionalmente fusionado con otra proteína, tal como un dominio Fe o puede comprender la proteína CD127 de longitud completa. CD127 puede estar en solución o estar unida a una superficie sólida. Por ejemplo, CD127 puede estar unida a perlas tales como perlas magnéticas. CD127 puede estar biotinilada. La molécula de biotina conjugada con CD127 puede usarse para i nmovi l izar CD 1 27 en una superficie sólida mediante el acoplamiento de biotina estreptavidina en la superficie sólida.

La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una prote ína de enlace a antígeno como se describe en el presente documento. La molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia que codifica (i) una o más C D RH , la secuencia variable de cadena pesada o la secuencia de cadena pesada de longitud completa; y (ii) una o más CD RL, la secuencia variable de cadena ligera o la secuencia de cadena ligera de longitud completa, con (i ) y (ii) en la misma molécula de ácido nucleico. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico que codifica una prote ína de enlace a antígeno descrita en el presente documento puede comprender secuencias que codifican (a) una o más CDRH , la secuencia variable de cadena pesada o la secuencia de cadena pesada de longitud completa; o (b) u na o más CD RL, la secuencia variable de cadena ligera o la secuencia de cadena ligera de longitud completa, con (a) y (b) en moléculas de ácido nucleico separadas.

La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de cadena pesada puede comprender S EQ I D N°: 30-36. La molécula de ácido n ucleico que codifica el dominio variable de cadena ligera puede comprender S EQ I D N°: 1 0- 1 1 3.

La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de cadena pesada puede comprender S EQ I D N°: 75-96. La molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de cadena ligera puede comprender S EQ I D N°: 97- 1 00.

La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento . También se proporciona una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión como se describe en el presente documento.

La proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento puede producirse en una célula huésped adecuada. Un procedimiento para la producción de la proteína de enlace a antígeno como se describe en el presente documento puede comprender la etapa de cultivar una célula huésped como se describe en el presente documento y recuperar la proteína de enlace a antígeno. U na célula huésped recombi nante transformada, transfectada o transducida puede comprender cuando menos un cásete de expresión , por lo cual dicho cásete de expresión comprende un pol i nucleótido que codifica una cadena pesada de la proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento y comprende adicional mente un polinucleótido que codifica una cadena ligera de la proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento. Como alternativa, una célula huésped recombinante transformada, transfectada o transducida puede comprender cuando menos un cásete de expresión , por lo cual un primer cásete de expresión comprende un poli nucleótido que codifica una cadena pesada de la proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento y comprende adicionalmente un segundo cásete que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera de la proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento. Una célula huésped transformada de forma estable puede comprende r u n vector que comprende uno o más casetes de expresión que codifican una cadena pesada y/o una cadena ligera de la prote ína de enlace a antígeno descrita en el presente documento. Por ejemplo, dichas células huésped pueden comprender un primer vector que codifica la cadena l igera y un segundo vector que codifica la cadena pesada.

La célula huésped puede ser eucariota, por ejemplo, de mam ífero. Los ejemplos de dichas l íneas cel ulares incluyen CHO o NSO . La célula huésped puede ser una célula huésped no humana. La célula h uésped puede ser una célula huésped no embrionaria. La célula huésped puede cultivarse en un medio de cultivo, por ejemplo, un medio de cultivo sin suero. La proteína de enlace a antígeno puede ser secretada por la célula huésped hacia el medio de cultivo. La prote ína de enlace a antígeno puede pu rificarse hasta cuando menos el 95 por ciento o más (por ejemplo , el 98 por ciento o más) con respecto a dicho medio de cultivo que contiene la proteína de enlace a antígeno.

Una composición farmacéutica que comprende la proteína de enlace a antígeno y un veh ículo farmacéuticamente aceptable también se proporciona mediante la presente i nvención . U n kit de partes que comprende la composición farmacéutica junto con i nstrucciones para su uso se proporciona adicionalmente. Por conveniencia, el kit de partes puede comprender los reactivos en las cantidades previamente determinadas con i nstrucciones para su uso.

Estructuras de Anticuerpos Anticuerpos Intactos Las cadenas ligeras de anticuerpos de la mayoría de las especies de ve rtebrados pueden asignarse a uno de dos tipos llamados Kappa y Lambda, basándose en la secuencia de aminoácidos de la región constante. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas , los anticuerpos humanos pueden asignarse a cinco clases diferentes , I gA, I gD , I gE , I gG e IgM . IgG e IgA pueden subdividi rse adicionalmente en las subclases, IgG 1 , l gG2 , lgG3 e lgG4; e lgA 1 e l gA2. Existen variantes de especies teniendo ratón y rata cuando menos lgG2a, lgG2b .

Las partes más conservadas de la región variable se denominan como regiones de marco (FR) . Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera intactas comprenden cada uno cuatro FR conectadas por tres C DR . Las C D R en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha por las regiones FR y contribuyendo las CD R de la otra cadena a la formación del sitio de enlace a antígeno de los anticuerpos.

Las regiones constantes no están implicadas di rectamente en la enlace del anticuerpo al antígeno sino que muestran diversas funciones efectoras tales como participación en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) , fagocitosis mediante enlace al receptor Fcy, semivida/tasa de aclaramiento mediante el receptor de Fe neonatal (Fc Rn) y citotoxicidad dependiente del complemento mediante el componente C 1 q de la cascada de complementos.

Se ha publicado que la región constante de lgG2 humana carece esencialmente de la capacidad para activar el complemento por la ruta clásica o para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Se ha publ icado q ue la región constante de l gG4 carece de la capacidad para activar el complemento por la vía clásica y media en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de forma débil solamente . Los anticuerpos que esencialmente carecen de esas funciones efectoras pueden denomi narse anticuerpos "no Uticos". Puede ser deseable reducir la función efectora del anticuerpo de acuerdo con la invención , opcionalmente hasta el g rado en el que el anticuerpo esencialmente no tenga función efectora. En una modalidad , el anticuerpo de acuerdo con la i nvención es no l ítico. En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la invención esencialmente no tiene función efectora. El anticuerpo puede, o no, estar conjugado con otra molécula, por ejemplo, una molécula dirigida a modificar la función efectora, tal como un residuo citotóxico o un residuo radiactivo. En una modal idad , el anticuerpo no está conjugado con otra molécula, tal como un radiomarcador o una molécula citotóxica. En esta modalidad , el anticuerpo consigue su efecto funcional bloqueando una interacción biológica natural , en lugar de hacerlo mediante un efecto de m uerte celular di recta.

Anticuerpos humanos Pueden producirse anticuerpos humanos mediante varios procedimientos conocidos para los expertos en la materia. Pueden prepararse anticuerpos humanos mediante el procedimiento del hibridoma usando líneas celulares de mieloma humano o de heteromieloma de ratón-humano véase Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001, y Brodeurj. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Los procedimientos alternativos incluyen el uso de bibliotecas de fagos o ratones transgénicos, en donde ambos utilizan repertorios de regiones variables humanas (véase Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23).

Varias razas de ratones transgénicos están disponibles ahora en las que sus loci de inmunoglobulina de ratón se ha reemplazado con segmentos génicos de inmunoglobulina humana (véase Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727; Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14: 845-851; Méndez (1997) Nature Genetics, 15: 146-156). Tras la presentación de antígeno tales ratones son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos de los que se pueden seleccionar anticuerpos de interés.

Puede usarse tecnología de presentación de fagos para producir proteínas de enlace a antígeno humanas (y fragmentos de las mismas), véase McCafferty (1990) Nature 348: 552-553 y Griffiths y col. (1994) EMBO 13: 3245-3260.

La técnica de maduración de afinidad (Marks Bio/technol ( 1 992) 1 0: 779-783) puede usarse para mejorar la afinidad de enlace mejorándose la afinidad del anticuerpo humano primario por el reemplazo secuencial de las regiones variables de cadena H y L con variantes de origen natural y seleccionando basándose en afinidades de enlace mejoradas. También están ahora disponibles variantes de esta técnica tales como "impronta de epítopos" , véase por ejemplo, el documento WO 93/0621 3; Waterhouse ( 1 993) Nucí . Acids Res . 21 : 2265-2266.

Anticuerpos Quiméricos y Humanizados Los anticuerpos qui méricos típicamente se producen usando procedimientos de ADN recombinante . El ADN que codifica los anticuerpos (por ejemplo, ADNc) se aisla y secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplos mediante el uso de sondas ol igonucleotídicas que son capaces de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas H y L del anticuerpo. Las células de hibridoma si rven como una fuente típica de dicho ADN . Una vez aislado, el ADN se sitúa en vectores de expresión que se transfectan después a células huésped tales como E. coli, células COS , células C HO o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina para obtener s íntesis del anticuerpo. El ADN puede modificarse sustituyendo con la secuencia codificante para las cadenas L y H las regiones constantes H y L no humanas correspondientes (por ejemplo, muri nas) , véase por ejemplo, Morrison ( 1 984) PNAS 81 : 6851 .

Puede conseguirse una gran disminución en la inmunogenicidad mediante el injerto solamente de las CDR de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) (anticuerpos "donadores") en armazón humano ("armazón aceptor") y las regiones constantes para generar anticuerpos humanizados (véase Jones y col. (1986) Nature 321: 522-525; y Verhoeyen y col. (1988) Science 239: 1534-1536). Sin embargo, el injerto de CDR por sí mismo puede no dar como resultado la conservación completa de las propiedades de enlace a antígeno y se descubre con frecuencia que algunos residuos de marco (denominados a veces "retromutaciones") del anticuerpo donador necesitan conservarse en la molécula humanizada si se quiere recuperar afinidad de enlace a antígeno significativa (véase Queen y col. (1989) PNAS 86: 10.029-10.033: Co y col. (1991) Nature 351: 501-502). En este caso, las regiones variables humanas que muestran la mayor homología de secuencia con el anticuerpo donador no humano se seleccionan de una base de datos para proporcionar el marco conservado humano (FR). La selección de FR humanos puede realizarse a partir de anticuerpos consenso humanos o anticuerpos humanos individuales. Cuando sea necesario, pueden sustituirse residuos clave del anticuerpo donador en el armazón aceptor humano para conservar las conformaciones de CDR. La creación de modelos informáticos del anticuerpo puede usarse para ayudar a identificar tales residuos estructuralmente importante, véase el documento WO 99/48523.

Como alternativa, la humanización puede conseguirse mediante un proceso de "recubrimiento". Un análisis estadístico de regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana y murina únicas reveló que los patrones precisos de los residuos expuestos son diferentes en anticuerpos humanos y murinos y la mayoría de las posiciones de superficie individuales tienen una fuerte preferencia por un pequeño números de residuos diferentes (véase Padlan y col. (1991) Mol. Immunol.28: 489-498; y Pedersen y col. (1994) J. Mol. Biol.235: 959-973). Por lo tanto es posible reducir la inmunogenicidad de un Fv no humano reemplazando los residuos expuestos en sus regiones marco conservadas que difieren de los hallados habitualmente en anticuerpos humanos. Debido a que puede correlacionarse la antigenicidad proteica con la accesibilidad a superficie, el reemplazo de los residuos de superficie puede ser suficiente para hacer a la región variable de ratón "invisible" para el sistema inmune humano (véase también Mark y col. (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134). Este procedimiento de humanización se denomina "recubrimiento" porque sólo se altera la superficie del anticuerpo, los residuos de soporte no se ven alterados. Los enfoques alternativos adicionales incluyen el expuesto en el documento WO04/006955 y el procedimiento de Humaneering™ (Kalobios) que utiliza sistemas de expresión bacteriana y produce anticuerpos que son cercanos a la línea germinal humana en secuencia (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics enero 2007, San Diego, California).

Proteínas de enlace a antígenos biespecíficas Una proteína de enlace a antígeno biespecífica es una prote ína de enlace a antígeno que tiene especificidades de enlace para cuando menos dos epítopos diferentes. Los procedimientos para preparar dichas proteínas de enlace a antígeno se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de las proteínas de enlace a antígeno biespecíficas se basa en la coexp resión de dos pares de cadena H-cadena L de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas H tienen diferentes especificidades de enlace , véase Millstein y col . ( 1 983) Nature 305: 537-539 ; documento WO 93/08829 ; y Traunecker y col . (1 991 ) EM BO 1 0 : 3655-3659. Debido a la mezcla aleatoria de cadenas H y L, se produce una mezcla potencial de diez estructuras de anticuerpos diferentes de las cuales sólo una tiene la especificidad de enlace deseada. Un enfoque alternativo implica fusionar los dominios variables con las especificidades de enlace deseadas a la región constante de cadena pesada que comprende cuando menos parte de la región bisagra, regiones CH2 y CH3. La región CH 1 que contiene el sitio necesario para la enlace de cadena ligera puede estar presente en cuando menos una de las fusiones. El ADN que codifica estas fusiones, y si se desea la cadena L, se insertan en vectores de expresión separados y después se cotransfectan en u n organismo huésped adecuado . Es posible, sin embargo, i nsertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas en un vector de expresión.

En un enfoque, el anticuerpo biespecífico se compone de una cadena H con una primera especificidad de enlace en una rama y un par de cadenas H-L, que proporcionan una segunda especificidad de enlace en la otra rama, véase el documento WO 94/04690. Véase también Suresh y col. (1986) Methods in Enzymology 121: 210.

Fragmentos de enlace a Antígeno Los fragmentos que carecen de la región constante carecen de la capacidad para activar el complemento por la vía clásica o mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Tradicionalmente dichos fragmentos se producen por la digestión proteolítica de anticuerpos intactos mediante, por ejemplo, digestión con papaína (véase por ejemplo, el documento WO 94/29348) pero pueden producirse directamente a partir de células huésped transformadas de forma recombinante. Para la producción de ScFv, véase Bird y col. (1988) Science 242: 423-426. Además, pueden producirse fragmentos de enlace a antígeno usando una diversidad de técnicas de ingeniería genética como se describe posteriormente.

Parece que los fragmentos de Fv tienen una menor energía de interacción de sus dos cadenas que los fragmentos de Fab. Para estabilizar la asociación de los dominios VH y VL, estos se han enlazado con péptidos (Bird y col. (1988) Science 242: 423-426; Huston y col. (1988) PNAS 85(16): 5879-5883), puentes disulfuro (Glockshuber y col. (1990) Biochemistry 29: 1362-1367) y mutaciones "bultos en huecos" (Zhu y col. (1997) Protein Sci., 6: 781-788). Pueden producirse fragmentos de ScFv por procedimientos bien conocidos para los expertos en la materia, véase Whitlow y col. (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2: 97-105 y Huston y col. (1993) Int. Rev. Immunol 10: 195-217. Pueden producirse ScFv en células bacterianas tales como E. coli o en células eucariotas. Una desventaja de ScFv es la monovalencia del producto, que impide una avidez aumentada debido a la enlace polivalente y su corta semivida. Los intentos de solucionar estos problemas incluyen (ScFv')2 bivalente producido de ScFv que contiene una cisteína C terminal adicional por acoplamiento químico (Adams y col. (1993) Can. Res 53: 4026-4034; y McCartney y col. (1995) Protein Eng. 8: 301-314) o por dimerización específica de sitio espontánea de ScFv que contiene un residuo de cisteína C terminal no emparejado (véase Kipriyanov y col. (1995) Cell. Biophys 26: 187-204). Como alternativa, puede obligarse al ScFv a formar multímeros acortando engarce peptídico de 3 a 12 residuos para formar "diacuerpos", véase Holliger y col. (1993) PNAS 90: 6444-6448. Reducir el engarce aún más puede dar como resultado trímeros de ScFv ("triacuerpos", véase Kortt y col. (1997) Protein Eng 10: 423-433) y tetrámeros ("tetracuerpos", véase Le Gall y col. (1999) FEBS Lett, 453: 164-168). La construcción de moléculas de ScFv bivalentes también puede conseguirse por fusión genética con motivos de dimerización de proteínas para formar "minianticuerpos" (véase Pack y col. (1992) Biochemistry 31: 1579-1584) y "minicuerpos" (véase Hu y col. (1996) Cáncer Res.56: 3055-3061). También pueden producirse tándems de ScFv-Sc-Fv ((ScFv)2) mediante el enlace de dos unidades de ScFv por un tercer engarce peptídico, véase Kurucz y col. (1995) J. Immol. 154: 4576-4582. Pueden producirse diacuerpos biespecíficos a través de la asociación no covalente de dos productos de fusión de cadena sencilla que consisten en un dominio VH de un anticuerpo conectado por un engarce corto al dominio VL de otro anticuerpo, véase Kipriyanov y col. (1998) Int. J. Can 77: 763-772. La estabilidad de dichos diacuerpos biespecíficos puede mejorarse mediante la introducción de puente disulfuro o mutaciones "bultos en huecos" como se ha descrito anteriormente o mediante la formación de diacuerpos de cadena sencilla (ScDb) en los que se conectan dos fragmentos híbridos de ScFv a través de un engarce peptídico, véase Kontermann y col. (1999) J. Immunol. Methods 226:179-188. Están disponibles moléculas biespecíficas tetravalentes por ejemplo, mediante fusión de un fragmento de ScFv con el domino CH3 de una molécula IgG o con un fragmento de Fab a través de la región bisagra, véase Coloma y col. (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163. Como alternativa, se han creado moléculas biespecíficas tetravalentes mediante la fusión de diacuerpos de cadena sencilla biespecíficos (véase Alt y col. (1999) FEBS Lett 454: 90-94. También pueden formarse moléculas biespecíficas tetravalentes más pequeñas mediante la dimerización de tándems ScFv-ScFv con un engarce que contiene un motivo de hélice-bucle-hélice (minianticuerpos DiBi, véase Muller y col. (1998) FEBS Lett 432: 45-49) o una molécula de cadena sencilla que comprende cuatro dominios variables de anticuerpo (VH y VL) en una orientación que evita el emparejamiento intramolecular (diacuerpo en tándem, véase Kipriyanov y col. (1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56). Pueden crearse fragmentos biespecíficos F(ab')2 mediante acoplamiento químico de fragmentos de Fab' o por heterodimerización a través de cremalleras de leucina (véase Shalaby y col. (1992) J. Exp. Med. 175: 217-225; y Kostelny y col. (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553). También están disponibles dominios VH y VL aislados (Domantis pie), véase los documentos US 6.248.516; US 6.291.158 y US 6.172.197.

Anticuerpos heteroconiugados Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente formados usando cualquier procedimiento de entrecruzamiento conveniente. Véase, por ejemplo, el documento US 4.676.980.

Otras Modificaciones Las proteínas de enlace a antígeno de la presente invención pueden comprender otras modificaciones para mejorar o cambiar sus funciones efectoras. La expresión "función efectora" como se usa en el presente documento pretende referirse a una o más de actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), respuestas mediadas por actividad citotóxica dependiente de complemento (CDC), fagocitosis mediada por Fe y reciclaje de anticuerpo mediante el receptor de FcRn. Para anticuerpos IgG, las funcionalidades efectoras incluyendo ADCC y ADCP están mediadas por la interacción de la región constante de cadena pesada con una fami l ia de receptores FCY presentes en la superficie de células i nmunes . En seres humanos estos incluyen FcyRI (CD64) , FcyRI l (CD32) y FcyRI 11 (CD 1 6) . La interacción entre la proteína de enlace a antígeno unida a antígeno y la formación del complejo Fc/Fcy i nduce una serie de efectos que incluyen citotoxicidad, activación de célula inmune, fagocitosis y liberación de citoquinas inflamatorias.

Se cree que la interacción entre la región constante de una proteína de enlace a antígeno y diversos receptores de Fe (Fc R) i nterviene en las funciones efectoras de la proteína de enlace a antígeno. Los efectos biológicos significativos pueden ser una consecuencia de la funcionalidad efectora, en particular, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) , fijación de complemento (citotoxicidad dependiente de complemento o CDC) , y semivida/aclaramiento de la proteína de enlace a antígeno. Habitual mente , la capacidad para mediar en la función efectora requiere la enlace de la proteína de enlace a antígeno con un antígeno y no todas las prote ínas de enlace a antígeno mediarán en cada función efectora.

Puede medirse la función efectora de varias maneras, incluyendo, por ejemplo, mediante enlace de la FcyRI I I con linfocitos citol íticos naturales o mediante FcyR I con monocitos/macrófagos para medir la función efectora de ADCC . Por ejemplo , una p rote ína de enlace a antígeno de la presente invención puede evaluarse con respecto a función efectora de ADCC en un ensayo de li nfocitos citol íticos naturales. Los ejemplos de dichos ensayos pueden encontrarse en Shields y col, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p 6591-6604; Chappel y col, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p 25124-25131; Lazar y col, 2006 PNAS, 103; 4005-4010.

Los ejemplos de ensayo para determinar la función CDC incluyen el descrito en 1995 J Imm Meth 184: 29-38.

Algunos isotipos de regiones constantes humanas, en particular isotipos lgG4 e lgG2, esencialmente carecen de las funciones de a) activación de complemento por la vía clásica y b) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Pueden llevarse a cabo diversas modificaciones a la región constante de cadena pesada de proteínas de enlace a antígeno dependiendo de la propiedad efectora deseada. Se ha descrito que regiones constantes de I gG 1 que contienen mutaciones específicas reducen la enlace a receptores de Fe y por lo tanto reducen ADCC y CDC (Duncan y col. Nature 1988, 332; 563-564; Lund y col. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel y col. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton y Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84; Morgan y colaboradores, Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh y colaboradores, J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168).

Pueden llevarse a cabo diversas modificaciones de la región Fe de anticuerpos dependiendo de la propiedad deseada. Por ejemplo, mutaciones específicas en la región Fe para hacer a un anticuerpo que de otro modo sería lítico, no lítico se detallan en los documentos EP 0629 240 y EP 0307 434 o una puede incorporar un epítopo de enlace a receptor de recuperación en el anticuerpo para aumentar la semivida en suero, véase el documento US 5.739.277. Los receptores de Fcy humanos incluyen FcyR (I), FcYRIIa, FcyRIIb, FCYR I lia y FcRn neonatal. Shields y col. (2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604 demostraron que un conjunto habitual de residuos de IgG 1 está implicado en la enlace de todos los FcyRs, mientras que FCYRII y FcyR 111 utilizan distintos sitios fuera de este conjunto común. Un grupo de residuos de lgG1 redujeron la enlace con todos los FcyR cuando se cambió a alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 y Pro-239. Todos están en el dominio CH2 de IgG y se agrupan cerca de la bisagra que une CH1 y CH2. Aunque FcyRI utiliza sólo el conjunto común de residuos de lgG1 para el enlace, FCYRII y FcyRIII interaccionan con residuos distintos además del conjunto común. La alteración de algunos residuos redujo la enlace solamente a FcyRII (por ejemplo, Arg-292) o FcyR 111 (por ejemplo, Glu-293). Algunas variantes mostraron enlace mejorada a FCYRII O FcyR 111 pero no influyen en la enlace al otro receptor (por ejemplo, Ser-267Ala mejoró la enlace a FCYRII pero la enlace a FCYRIII no se vio afectada). Otras variantes mostraron un enlace mejorada a FCYRII o FCYRIII con reducción en la enlace al otro receptor (por ejemplo, Ser-298Ala mejoró la enlace a FCYRIII y redujo la enlace a FCYRII). Para FcyRIIIa, las mejores variantes de lgG1 de enlace tenían sustituciones de alanina combinadas en Ser-298, Glu-333 y Lys-334. Se cree que el receptor FcRn neonatal está implicado en el aclaramiento de anticuerpo y la transcitosis a través de tejido (véase Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57; y Ghetie y col. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766). Los residuos de lgG1 humana que se determina que interaccionan directamente con FcRn humano incluyen Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435. Las sustituciones en cualquiera de las posiciones descritas en esta sección pueden permitir una semivida en suero aumentada y/o propiedades efectoras alteradas de los anticuerpos.

Otras modificaciones incluyen variantes de glucosilación de los anticuerpos. Se sabe que la glucosilación de anticuerpos en posiciones conservadas en sus regiones constantes tiene un efecto importante en la función de anticuerpo, particularmente funciones efectoras tales como las descritas anteriormente, véase, por ejemplo, Boyd y col. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318. Las variantes de glucosilación de los anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos en las se añaden, sustituyen, suprimen o modifican uno o más residuos de carbohidrato están contempladas. La introducción de un motivo de asparagina-X-serina o asparagina-X-treonina crea un sitio potencial de enlace enzimática de residuos de carbohidrato y puede por lo tanto usarse para manipular la glucosilación de un anticuerpo. En Raju y col. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876 la sialilación terminal de una inmunoadhesina de TNFR-lgG se aumentó a través de un procedimiento de regalactosilación y/o resialilación usando beta-1 ,4-galactosil-transferasa y/o alfa, 2, 3 sialil-transferasa. El aumento de la sialilación terminal se cree que aumenta la semivida de la inmunoglobulina. Los anticuerpos, en común con la mayoría de las glucoproteínas, típicamente se producen como una mezcla de glucoformas. Esta mezcla es particularmente evidente cuando se producen anticuerpos en células eucariotas, particularmente de mamíferos. Se ha desarrollado una diversidad de procedimientos para elaborar glucoformas definidas, véase Zhang y col. (2004) Science 303: 371: Sears y col. (2001) Science 291: 2344; Wacker y col. (2002) Science 298: 1790; Davis y col. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang y col. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727. Los anticuerpos (por ejemplo, del isotipo de IgG, por ejemplo, I gG 1 ) como se describen en el presente documento pueden comprender un número definido (por ejemplo, 7 o menos, por ejemplo, 5 o menos, tales como dos o una sencilla) de glucoformas.

Los anticuerpos pueden estar o no acoplados a un polímero no proteínico tal como polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquileno. La conjugación de proteínas con PEG es una técnica establecida para aumentar la semivida de proteínas, así como reducir la antigenicidad e inmunogenicidad de proteínas. El uso de PEGilación con diferentes pesos y estilos moleculares (lineales o ramificados) se ha investigado con anticuerpos intactos así como fragmentos de Fab', véase Koumenis y col. (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95.

Procedimientos de Producción Pueden producirse proteínas de enlace a antígeno en organismos transgénicos tales como cabras (véase Pollock y col. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157), pollos (véase Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55), ratones (véase Pollock y col.) o plantas (véase Doran (2000) Curr. Opinión Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med.4: 601-606; Baez y col. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger y col. (2000) Plant Mol. Biol.42: 583-590).

También pueden producirse proteínas de enlace a antígeno mediante síntesis química. Sin embargo, las proteínas de enlace a antígeno se producen típicamente usando tecnología de cultivo celular recombinante bien conocida para los expertos en la materia. Un polinucleótido que codifica la proteína de enlace a antígeno se aisla e inserta en un vector replicable, tal como un plásmido, para su clonación (amplificación) o expresión adicional. Un sistema de expresión es un sistema de glutamato sintetasa (tal como el comercializado por Lonza Biologics), particularmente cuando la célula huésped es CHO o NS0. El polinucleótido que codifica la proteína de enlace a antígeno se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, sondas oligonucleotídicas). Los vectores que pueden usarse incluyen plásmido, virus, fago, transposones, minicromosomas de los que se usan típicamente los plásmidos. Generalmente dichos vectores incluyen adicionalmente una secuencia de señal, origen de replicación, uno o más genes indicadores, un elemento potenciador, un promotor y secuencias de terminación de la transcripción unidas operativamente al polinucleótido de la proteína de enlace a antígeno para facilitar la expresión . El polinucleótido que codifica las cadenas ligera y pesada puede insertarse en vectores separados e introduci rse (por ejemplo , por transformación , transfección , electroporación o transducción) en la misma célula huésped simultáneamente o secuencialmente o, si se desea, la cadena ligera y la cadena pesada pueden insertarse ambas en el mismo vector antes de dicha i ntroducción .

La optimización de codones puede usarse con la intención de que el nivel de proteína total producida por la célula huésped sea mayor cuando se transfecta con codón optimizado en comparación con el nivel cuando se transfecta con la secuencia natural . Se han publicado varios procedi mientos (Nakamu ra y col . ( 1 996) Nucleic Acids Research 24: 21 4-21 5 ; documento W098/34640; documento W097/1 1 086) . Debido a la redundancia del código genético, polinucleótidos alternativos a los desvelados en el presente documento (particularmente los que tienen el codón optimizado para la expresión en una célula huésped dada) también pueden codificar las proteínas de enlace a antígeno descritas en el presente documento. El uso del codón de la proteína de enlace a antígeno de la presente i nvención de los mismos puede modificarse para alojar preferencia codónica de la célula h uésped tal como para aumentar la producción de transcrito y/o producto (por ejemplo, Hoekema y col Mol Cell Biol 1 987 7(8) : 291 4-24) . La selección de codones puede basarse en compatibi lidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión .

Secuencias de señales Pueden producirse proteínas de enlace a antígeno como una proteína de fusión con una secuencia de señal heteróloga que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N terminal de la proteína madura. La secuencia de señal debería reconocerse y procesarse por la célula huésped. Para las células huésped procariotas, la secuencia de señal puede ser por ejemplo, líderes de una fosfata alcalina, penicilinasa, o enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levaduras las secuencias de señales pueden ser por ejemplo, una líder de invertasa de levadura, líder de factor a o líderes de fosfatasa ácida, véase por ejemplo, el documento WO90/13646. En sistemas celulares de mamíferos, las secuencias líderes secretoras virales tales como señal gD de herpes simple y una secuencia de señal de inmunoglobulina nativa pueden ser adecuadas. Típicamente, la secuencia de señal está ligada en fase de lectura con el ADN que codifica la proteína de enlace a antígeno.

Origen de replicación Los orígenes de replicación son bien conocidos en la técnica, siendo pBR322 adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas, el plásmido 2µ para la mayoría de las levaduras y diversos orígenes virales tales como SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV para la mayoría de las células de mamífero. En general, el componente de origen replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero, sino que puede usarse SV40 ya que contiene el promotor temprano.

Marcador de selección Los genes de selección típicos codifican prote ínas q ue (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampici l i na, neomici na, metotrexato o tetraciclina o (b) complementan deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes no disponibles en el medio complejo o (c) combinaciones de los dos. El esquema de selección puede implicar detener el crecimiento de la célula huésped. Las células que se han transformado satisfactoriamente con los genes que codifican la proteína de enlace a antígeno sobreviven debido, por ejemplo, a la resistencia a un fármaco confe rida por el marcador de selección co-suministrado. Un ejemplo es el marcador de selección DH FR en el que los transformantes se cultivan en presencia de metotrexato. Las células pueden cultivarse en presencia de cantidades crecientes de metotrexato para amplificar el número de copias del gen exógeno de i nterés . Las células CHO son una l ínea cel ular particularmente úti l para la selección con DH FR . Un ejemplo adicional es el sistema de expresión de glutamato si ntetasa (Lonza Biologics). Un ejemplo de un gen de selección para uso en levadu ras es el gen trp1 , véase Stinchcomb y col . ( 1 979) Nature 282 : 38.

Promotores Los promotores adecuados para expresar prote ínas de enlace a antígeno se enlazan operativamente al ADN/polinucleótido que codifica la proteína de enlace a antígeno. Los promotores para huéspedes procariotas incluyen el promotor de phoA, los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa, promotores de fosfatasa alcalina, triptófano e híbridos, tales como Tac. Los promotores adecuados para la expresión en células de levadura incluyen 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicol íticas , por ejemplo, enolasa, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxílasa, fosfofructocinasa, glucosa 6 fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa y glucocinasa. Los promotores de levadura inducibles incluyen alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, metalotioneína y enzimas responsables del metabolismo del nitrógeno o la utilización de maltosa/galactosa.

Los promotores para la expresión en sistemas de células de mamífero incluyen promotores virales tales como polioma, viruela aviar y adenovirus (por ejemplo, adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (en particular, el promotor del gen temprano inmediato), retrovirus, virus de la hepatitis B, actina, promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y el virus de los simios 40 temprano o tardío. Por supuesto, la elección del promotor se basa en la compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión. Un primer plásmido puede comprender el promotor de RSV y/o SV40 y/o CMV, ADN que codifica la región variable de cadena ligera (VL), la región KC junto con marcadores de selección de resistencia a neomicína y ampicilina y un segundo plásmido que comprende un promotor de RSV o SV40, ADN que codifica la región variable de cadena pesada (VH), ADN que codifica la región constante ?1, DHFR y marcadores de resistencia a ampicilina .

Elemento potenciador Cuando es apropiado, por ejemplo, para la expresión en eucariotas superiores , puede usarse un elemento potenciador unido operativamente al elemento promotor en un vector. Las secuencias potenciadoras de mam ífero incl uyen elementos potenciadores de globina, elastasa, albúmina, fetoproteína e insulina. Como alternativa, se puede usar un elemento potenciador de un vi rus de células eucariotas tal como el potenciador de SV40 (en pb 1 00-270) , el potenciador del promotor temprano de citomegalovi rus , el potenciador de pol ioma, el potenciador de baculovi rus o el locus l gG2a m u ri n o (véase el documento WO04/009823) . El potenciador puede localizarse en el vector en un sitio cadena arriba del promotor. Como alternativa, el potenciador puede localizarse en cualquier sitio, por ejemplo, dentro de la región no traducida o cadena abajo de la señal de pol iadenilación . La elección y colocación del potenciador puede basarse en una compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.

Poliadenilación/ter mi nación En sistemas eucariotas , las señales de poliadenilación se enlazan operativamente a un ADN/polinucleótido que codifica la proteína de enlace a antígeno. Dichas señales típicamente se ponen en posición 3' de la fase de lectu ra abierta. En sistemas de mam ífero, los ejemplos no li mitantes incluyen señales derivadas de hormonas de crecimiento, el factor de elongación- 1 alfa y genes virales (por ejemplo, SV40) o repeticiones terminales largas retrovirales. En sistemas de levadura, los ejemplos no limitantes de señales de poliadenilacion/terminación incluyen las derivadas de los genes de fosfoglicerato cinasa (PGK) y alcohol deshidrogenasa 1 (ADH). En sistemas procariotas, las señales de poliadenilación típicamente no son necesarias y en su lugar es habitual emplear secuencias terminadoras más cortas y más definidas. La elección de las secuencias de poliadenilación/terminación puede basarse en una compatibilidad adecuada con la célula huésped usada para la expresión.

Otros procedimientos/elementos para obtener rendimientos mejorados Además de lo anterior, otras características que pueden emplearse para mejorar los rendimientos incluyen elementos de remodelación de cromatina, intrones y modificación de codones específicos de la célula huésped.

Células huésped Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican proteínas de enlace a antígenos son células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Las células procariotas adecuadas incluyen eubacterias, por ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia por ejemplo, E. coli (por ejemplo, ATCC 31446, 31537, 27325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos tales como B. subtiüs y B. licheniformis (véase el documento DD 266 710), Pseudomonas, tales como P. aeruginosa y Streptomyces. De las células huésped de levadura, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo, ATCC 16.045, 12.424, 24178, 56.500), yarrowia (documento EP402.226), Pichia pasto s (documento EP 183 070, véase también Peng y col. (2004) J. Biotechnol 108: 185-192), Candida, Trichoderma reesia (documento EP 244 234), penicilina, Tolypocladium y también se contemplan hospedadores Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped eucariotas superiores incluyen células de mamífero tales como COS-1 (ATCC N° CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), la línea de riñon embrionario humano 293, células de riñon de cría de hámster (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC N°: CRL 10314), 293 (ATCC N° CRL 1573), células de ovario de hámster chino CHO (por ejemplo, CHO-K1, ATCC N°: CCL 61, la línea celular DHFR-CHO tal como DG44 (véase Urlaub y col. (1986) Somatic Cell Mol.12: 555-556), particularmente las líneas de células CHO adaptadas para el cultivo en suspensión, células de sertoli de ratón, células de riñon de mono, células de riñon de mono verde africano (ATCC CRL-1587), células HELA, células de riñon canino (ATCC CCL 34), células de pulmón humano (ATCC CCL 75), Hep G2 y células de mieloma o linfoma, por ejemplo, NS0 (véase el documento US 5.807.715), Sp2/0, YO.

Dichas células huésped también pueden modificarse adicionalmente por ingeniería genética o adaptarse para modificar la calidad, función y/o rendimiento de la proteína de enlace a antígeno. Los ejemplos no limitantes incluyen la expresión de enzimas modificadoras específicas (por ejemplo, glicosilación) y chaperonas de plegamiento de proteínas.

Procedimientos de Cultivo Celular Las células huésped transformadas con vectores que codifican proteínas de enlace a antígeno pueden cultivarse por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia. Las células huésped pueden cultivarse en matraces de agitación, frascos cilindricos o sistemas de fibras huecas, pero para la producción a gran escala se usan particularmente reactores de depósito agitado para cultivos en suspensión. Los depósitos agitados pueden adaptarse para aireación usando, por ejemplo, rociadores, tabiques deflectores o impulsores de baja cizalla. Para las columnas de burbujas y reactores airlift (de agitación neumática), puede usarse la aireación directa con burbujas de aire u oxígeno. Cuando las células huésped se cultivan en un medio de cultivo sin suero, el medio se suplementa con un agente protector de los linfocitos Tal como Pluronic F-68 para ayudar a prevenir lesiones celulares como resultado del proceso de aireación. Dependiendo de las características de la célula huésped, pueden usarse microsoportes como sustratos de crecimiento para líneas celulares dependientes de anclaje o las células pueden adaptarse al cultivo en suspensión (lo cual es típico). El cultivo de las células huésped, particularmente células huésped de invertebrados, puede utilizar una diversidad de modos de operación tales como procesamiento semicontinuo, procesamiento en lotes repetidos (véase Drapeau y col. (1994) Cytotechnology 15: 103-109), un proceso en lotes prolongado o cultivo de perfusión. Aunque las células huésped de mamífero transformadas de forma recombinante pueden cultivarse en medios que contienen suero tales como suero bovino fetal (FCS), por ejemplo, dichas células huésped se cultivan en medios sin suero sintéticos tales como los descritos en Keen y col. (1995) Cytotechnology 17: 153-163, o medios disponibles en el mercado tales como ProCHO-CD o UltraCHO R (Cambrex NJ, USA), suplementados cuando sea necesario con una fuente de energía tal como glucosa y factores de crecimiento sintéticos tales como insulina recombinante. El cultivo sin suero de las células huésped puede requerir que esas células se adapten al crecimiento en condiciones sin suero. Un enfoque de adaptación es cultivar dichas células huésped en medio que contiene suero y cambiar repetidamente el 80 por ciento del medio de cultivo por el medio sin suero de forma que las células huésped aprendan a adaptarse a las condiciones sin suero (véase, por ejemplo, Scharfenberg y col. (1995) en Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery y col. eds, 619-623, Kluwer Academic Publishers).

Las proteínas de enlace a antígeno secretadas al medio pueden recuperarse y purificarse usando una diversidad de técnicas para proporcionar un grado de purificación adecuado para el uso deseado. Por ejemplo, el uso de prote ínas de enlace a antígeno para el tratamiento de pacientes humanos típicamente exige una pureza de cuando menos el 95 por ciento, más típicamente una pureza del 98 por ciento o del 99 por ciento o mayor (en comparación con el medio de cultivo bruto) . El desecho celular del medio de cultivo típicamente se reti ra usando centrifugación seguida de una etapa de clarificación del sobrenadante usando, por ejemplo, microfi ltración , ultrafiltración y/o filtración profunda. Se dispone de una diversidad de técnicas disti ntas tales como diálisis y electroforesis en gel y técnicas cromatográficas tales como hidroxiapatita (HA) , cromatografía de afi nidad (que opcionalmente implica un sistema de mareaje de afinidad tal como poli histidina) y/o cromatografía de interacción hidrófoba (H IC, véase el documento US 5.429.746) . Los anticuerpos, después de diversas etapas de clarificación , pueden capturarse usando cromatograf ía de afinidad de prote ína A o G . Después pueden realizarse etapas de cromatograf ía adicionales tales como cromatograf ía de intercambio iónico y/o cromatog raf ía HA, intercambio aniónico o catiónico, cromatog raf ía de excl usión molecular y precipitación con sulfato amónico. También pueden emplearse diversas etapas de elimi nación de vi rus (por ejemplo, nanofiltración usando, por ejemplo, un filtro DV-20) . Después de estas diversas etapas, se proporciona una preparación purificada (por ejemplo, monoclonal) que comprende cuando menos 75 mi ligramos/mililitro o más , o 1 00 miligramos/mililitro o más, de la proteína de enlace a antígeno. Dichas preparaciones carecen sustancialmente de formas agregadas de proteínas de enlace a antígeno.

Pueden usarse sistemas bacterianos para la expresión de fragmentos de enlace a antígeno. Dichos fragmentos pueden localizarse intracelularmente, dentro del periplasma o secretarse extracelularmente. Las proteínas insolubles pueden extraerse y replegarse para formar proteínas activas de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia, véase Sánchez y col. (1999) J. Biotechnol. 72: 13-20, y Cupit y col. (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277.

Composiciones Farmacéuticas Los términos enfermedades, trastornos y afecciones se usan indistintamente. Las preparaciones purificadas de una proteína de enlace a antígeno como se describe en el presente documento pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de las enfermedades humanas descritas en el presente documento. La composición farmacéutica puede usarse en el tratamiento de enfermedades en las que la IL-7 contribuye a la enfermedad o en las que será beneficiosa la inhibición/neutralización de la señalización mediada por IL-7R. La composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento.

La preparación farmacéutica puede comprender una proteína de enlace a antígeno en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La proteína de enlace a antígeno puede admi nistrarse sola, o como parte de una composición farmacéutica.

Típicamente , dichas composiciones comprenden un veh ículo farmacéuticamente aceptable como se conoce y exige la práctica farmacéutica aceptable , véase, por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 1 6a edición ( 1 980) Mack Publishing Co. Los ejemplos de dichos vehículos incluyen vehículos esterilizados tales como sol ución salina, solución de Ri nger o solución de dextrosa , opcional mente tamponada con tampones adecuados a un pH dentro de un intervalo de 5 a 8.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inyección o i nfusión continua (por ejemplo, i ntravenosa, ¡ntraperitoneal , i ntradérmica, subcutánea, i ntramuscular o i ntraportal) . Dichas composiciones convenientemente carecen de materia visible en forma de partículas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender entre 1 miligramo y 1 0 gramos de prote ína de enlace a antígeno, por ejemplo, entre 5 miligramos y 1 gramo de proteína de enlace a antígeno. Como alternativa, la composición puede comprender entre 5 miligramos y 500 miligramos, por ejemplo , entre 5 miligramos y 50 miligramos.

Los procedimientos para la preparación de dichas composiciones farmacéuticas son bien conocidos para los expertos en la materia. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender entre 1 miligramo y 1 0 gramos de prote ína de enlace a antígeno en forma de dosificación unitaria, opcionalmente junto con instrucciones para el uso. Las composiciones farmacéuticas pueden liofilizarse (secarse por congelación) para la reconstitución antes de la administración de acuerdo con procedimientos bien conocidos o evidentes para los expertos en la materia. Cuando los anticuerpos tienen un isotipo lgG 1 , puede añadirse un quelante de cobre, tal como citrato (por ejemplo, citrato sódico) o EDTA o histidi na a la composición farmacéutica para reduci r el g rado de degradación mediada por cobre de anticuerpos de este isotipo, véase el documento EP061 2251 . Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender un solubilizante tal como una base de arginina, u n agente dete rgente/anti-agregación tal como polisorbato 80 , y u n gas inerte tal como nitrógeno para reemplazar el oxígeno del espacio superior del vial .

Las dosis eficaces y las pautas de tratamiento para administrar la prote ína de enlace a antígeno generalmente se determinan empíricamente y pueden depender de factores tales como la edad, peso y estado de salud del paciente y la enfermedad o trastorno a tratar. Dichos factores están dentro del ámbito del médico a cargo del caso. Puede encontrarse una di rectriz en la selección de las dosis apropiadas , por ejemplo, en Smith y col ( 1 977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York. De esta manera , la proteína de enlace a antígeno de la invención puede admi nistrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz.

La dosificación de proteína de enlace a antígeno administrada a un sujeto generalmente está comprendida entre 1 microgramo/ kilogramo y 150 microgramos/kilogramo, entre 0.1 miligramos/ kilogramo y 100 miligramos/kilogramo, entre 0.5 miligramos/ kilogramo y 50 miligramos/kilogramo, entre 1 y 25 miligramos/ kilogramo o entre 1 y 10 miligramos/kilogramo del peso corporal del sujeto. Por ejemplo, la dosis puede ser de 10 miligramos/kilogramo, 30 miligramos/kilogramo o 60 miligramos/kilogramo. La proteína de enlace a antígeno puede administrarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, intravenosa o intramuscular.

Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición terapéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados, opcionalmente en formas de dosificación unitarias. Por ejemplo, la dosis puede administrarse por vía subcutánea, una vez cada 14 o 28 días en forma de múltiples subdosis cada día de administración.

La administración de una dosis puede ser por infusión intravenosa, típicamente durante un período de 15 minutos a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas, o de 2 a 6 horas. Esto puede dar como resultado menos efectos secundarios tóxicos.

La administración de una dosis puede repetirse una o más veces cuando sea necesario, por ejemplo, tres veces al día, una vez al día, una vez cada 2 días, una vez por semana, una vez cada quince días, una vez al mes, una vez cada 3 meses, una vez cada 6 meses o una vez cada 12 meses. Las proteínas de enlace a antígeno pueden administrarse por una terapia de mantenimiento, por ejemplo, una vez por semana durante un período de 6 meses o más. Las proteínas de enlace a antígeno pueden administrarse por una terapia i ntermitente, por ejemplo, se administra durante un período de 3 a 6 meses y después deja de administrarse la dosis durante 3 a 6 meses , seguido de la administración de proteínas de enlace a antígeno de nuevo durante 3 a 6 meses, y así sucesivamente en un ciclo.

La dosificación puede determinarse o ajustarse midiendo la cantidad de I L- 1 7 en una muestra biológica. Pueden utilizarse otros medios para determ i nar o ajustar la dosificación , incluyendo pero sin li mitación marcadores biológicos ("biomarcadores") de farmacolog ía, mediciones de la masa m uscular y/o función , segu ridad , tolerancia y respuesta terapéutica. La proteína de enlace a antígeno puede admi nistrarse en una cantidad y durante un periodo eficaz para regular negativamente la actividad señalización mediada por I L-7 en el sujeto.

La prote ína de enlace a antígeno puede administrarse al sujeto de tal forma que la terapia se di rija a un sitio particular. Por ejemplo, la proteína de enlace a antígeno puede inyectarse localmente en el músculo, por ejemplo, el músculo esquelético.

La prote ína de enlace a antígeno puede usarse en combinación con uno o más agentes terapéuticamente activos distintos, por ejemplo: inmunomoduladores tales como el interferón beta (? ??ß- a o ? ??ß- l b) y acetato de glatirámero, inmunosupresores tales como ciclofosfamida, metotrexato, azatioprina, cladribina, ciclosporina y mitoxantrona, otras terapias inmunes tales como globulina inmune i ntravenosa ( I V I g ) , reemplazo de plasma y sulfasalazina. El producto terapéutico adicional puede admi nistrarse de una manera (dosificación , programa de tiempo, mecanismo) prescrita por un médico. En una modalidad , el agente terapéutico adicional puede administrarse de forma simultánea o secuencial o separada de la proteína de enlace a antígeno de la presente invención . En una modalidad , el agente terapéutico adicional y la proteína de enlace a antígeno se administran de tal forma que solapan sus efectos farmacológicos en el paciente; en otras palabras , ejercen sus efectos biológicos sobre el paciente al mismo tiempo.

Cuando la prote ína de enlace a antígeno se usa en combi nación con otros agentes terapéuticamente activos, los componentes individuales pueden admi nistrarse conjunta o separadamente , secuencial o simultáneamente, o en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas, por cualquier vía apropiada. Si se administran por separado o secuencialmente, la prote ína de enlace a antígeno y el agente o agentes terapéuticamente activos pueden admi nistrarse en cualquier orden .

Las combinaciones mencionadas anteriormente pueden presentarse para uso en forma de una sola formulación farmacéutica que comprende una combinación como se ha definido anteriormente opcional mente junto con un veh ículo o excipiente farmacéuticamente aceptable .

Cuando se combinan en la misma formulación , se apreciará que los componentes tienen que ser estables y compatibles entre sí y con los demás componentes de la formulación y pueden formularse para administración. Cuando se formulan por separado, pueden proporcionarse en cualquier formulación conveniente , por ejemplo , de una manera conocida para las proteínas de enlace a antígeno en la técnica.

Cuando está en combinación con un segundo agente terapéutico activo contra la misma enfermedad , la dosis de cada componente puede diferi r de la utilizada cuando la proteína de enlace a antígeno se usa sola. Las dosis apropiadas se apreciarán fácilmente por los expertos en la materia.

La proteína de enlace a antígeno y el agente o agentes terapéuticamente activos pueden actuar sinérgicamente . En otras palabras , la admi nistración de la proteína de enlace a antígeno y el agente o agentes terapéuticamente activos en combinación puede tener un mayor efecto sobre la enfermedad , trastorno o afección descrita en el presente documento q ue la suma de los efectos de cada uno individual mente.

La composición farmacéutica puede comprender un kit de partes de la proteína de enlace a antígeno junto con otros medicamentos, opcionalmente con instrucciones para el uso. Por conveniencia, el kit puede comprender los reactivos en cantidades previamente determinadas con instrucciones para el uso.

Los términos "individuo " , "sujeto" y "paciente" se usan en el presente docu mento i ndistintamente . El sujeto típicamente es un ser humano. El sujeto también puede ser un mam ífero, tal como un ratón , rata o primate (por ejemplo , un tití o mono) . El sujeto puede ser un animal no humano. Las proteínas de enlace a antígeno también pueden tener uso veterinario. El sujeto a tratar puede ser un animal de granja, por ejemplo, una vaca o toro , oveja, cerdo, buey, cabra o cabal lo, o puede ser un animal doméstico tal como un perro o gato. El animal puede ser de cualquier edad , o un animal adulto madu ro.

El tratamiento puede ser terapéutico, profiláctico o preventivo . El sujeto puede ser uno que lo necesite . Los que necesitan tratamiento pueden incluir individuos que ya padecen una enfermedad médica particular además de los que pueden desarrollar la enfermedad en el futuro.

De esta manera, la prote ína de enlace a antígeno descrita en el presente documento puede usarse para el tratamiento profiláctico o preventivo. En este caso, la proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento se administra a un individuo para prevenir o retrasar el inicio de uno o más aspectos o s íntomas de la enfe rmedad . El sujeto puede ser asintomático. El sujeto puede tener una predisposición genética a la enfermedad . Una cantidad profi lácticamente eficaz de la proteína de enlace a antígeno se administra a dicho individuo. Una cantidad profilácticamente eficaz es una cantidad que previene o retrasa el inicio de uno o más aspectos o s íntomas de una enfermedad descrita en el presente documento .

La proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento también puede usarse en procedimientos de terapia. El térmi no "terapia" incluye el alivio, reducción o prevención de cuando menos un aspecto o s íntoma de una enfermedad. Por ejemplo, la prote ína de enlace a antígeno descrita en el presente documento puede usarse para mejorar o reducir uno o más aspectos o s íntomas de una enfermedad descrita en el presente documento.

La proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento se usa en una cantidad eficaz para el tratamiento terapéutico , profi láctico o preventivo . Una cantidad terapéuticamente eficaz de la prote ína de enlace a antígeno descrita en el presente documento es una cantidad eficaz para mejorar o reduci r uno o más aspectos o s íntomas de la enfermedad . La proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento también puede usarse para tratar, preveni r o curar la enfermedad descrita en el presente documento.

La proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento puede tener un efecto generalmente beneficioso sobre la salud del sujeto, por ejemplo, puede aumentar la longevidad esperada del sujeto.

No es necesario que la proteína de enlace a antígeno descrita en el presente documento consiga una cura completa, o erradique todos los síntomas o manifestaciones de la enfermedad para constitui r un tratamiento terapéutico viable . Como se reconoce en el campo pertinente , los fármacos empleados como agentes terapéuticos pueden reduci r la gravedad de un estado de enfermedad dado, pero no es necesario que eliminen cada manifestación de la enfermedad para considerarse agentes terapéuticos útiles. De forma similar, un tratamiento administrado profilácticamente no necesita ser completamente eficaz para prevenir el inicio de una enfermedad para constituir un agente profiláctico viable. Simplemente es suficiente reducir el impacto de una enfermedad (por ejemplo, reduciendo el número o gravedad de sus síntomas, o aumentando la eficacia de otro tratamiento, o produciendo otro efecto beneficioso), o reducir la probabilidad de que se produzca la enfermedad (por ejemplo, retrasando el inicio de la enfermedad) o el empeoramiento de un sujeto.

Las proteínas de enlace a antígeno de la presente invención pueden usarse en la terapia de la esclerosis múltiple y en otras enfermedades autoinmunes o inflamatorias, particularmente aquellas en las que están implicados linfocitos TH17 patógenos. Dichas enfermedades están asociadas con altos niveles de expresión de IL-17. Se han notificado niveles elevados de IL-17 en suero y LCR de pacientes con esclerosis múltiple (EM) (Matusevicius D., y col, Mult. Scler. 5, 101-104; 1999) y en el líquido sinovial obtenido de pacientes con artritis reumatoide. La IL-17 también se ha implicado en la psoriasis (Homey y col.; J. Immunol 164 (12):6621 -32; 2000), mientras que Hamzaoui y col notificaron altos niveles de IL-17 en la enfermedad de Behcet (Scand. J. Rheumatol;. 31:4, 205-210, 2002). También se han observado niveles elevados de IL-17 en lupus eritematoso sistémico (LES) (Wong y col.; Lupus 9 (8):589-93; 2000).

La inhibición de la señalización mediada por el receptor de IL-7 también puede ser útil en el tratamiento de enfermedades inflamatorias (no autoinmunes) en las que se ha implicado un nivel elevado de IL-17, tales como asma.

Por consiguiente, las enfermedades inflamatorias y/o autoinmunes de la invención incluyen enfermedades inflamatorias de la piel que incluyen psoriasis y dermatitis atópica; esclerodermia sistémica y esclerosis; enfermedad inflamatoria del intestino (Ell), enfermedad de Crohn; colitis ulcerosa; trastornos de isquemia-reperfusión que incluyen lesión de reperfusión de tejido quirúrgico, afecciones isquémicas del miocardio tales como infarto de miocardio, paro cardiaco, reperfusión después de una cirugía cardiaca y constricción después de angioplastía coronaria transluminal percutánea, ictus y aneurismas aórticos abdominales, edema cerebral secundario a ictus; traumatismo craneal, choque hipovolémico; asfixia; síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto; lesión pulmonar aguda; enfermedad de Behcet; dermatomiositis; polimiositis; esclerosis múltiple (EM); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; osteoartritis; lupus, nefritis; enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide (RA), síndrome de Sjorgen, vasculitis; enfermedades que implican diapédesis de leucocitos; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC), síndrome de lesión multiorgánica secundaria a septicemia o traumatismo; hepatitis alcohólica; neumonía bacteriana; enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo incluyendo glomerulonefritis; septicemia; sarcoidosis; respuestas inmunopatológicas a trasplantes de tejidos/órganos; inflamaciones del pulmón, incluyendo pleuritis, alveolitis, vasculitis, neumonía, bronquitis crónica, bronquiectasia, panbronquiolitis difusa, neumonitis de hipersensibilidad, fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y fibrosis quística; artritis psoriásica; neuromielitis óptica, síndrome de Guillain-Barre (GBS), COPD, diabetes tipo 1, etc.

En particular, los antagonistas de la presente invención pueden ser útiles en la terapia de esclerosis múltiple, en todas sus formas, incluyendo neuromielitis óptica. Se predice que el tratamiento con un antagonista de la presente invención es el más eficaz cuando se administra en el contexto de una enfermedad inflamatoria activa, es decir, cuando se usa en el tratamiento de un síndrome aislado clínicamente o formas recurrentes de E . Estos estados de enfermedad pueden definirse clínicamente y/o por criterios de formación de imágenes tales como potenciación con gadolinio u otras técnicas más sensibles, y/u otros biomarcadores de enfermedad activa aún no definidos. Particularmente, los antagonistas de la invención pueden usarse para tratar EMRR (mediante administración intravenosa, subcutánea, oral o intramuscular) cuando los pacientes están empezando o están en recaída. En una modalidad, el antagonista de la invención se administra al paciente al inicio de la recaída, o cuando han transcurrido 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días o 10 días desde el inicio de la recaída.

Las proteínas de enlace a antígeno de la invención pueden enlazarse a CD127. En una modalidad, las proteínas de enlace a antígeno de la invención pueden antagonizar el efecto biológico del receptor de IL-7. En una modalidad, las proteínas de enlace a antígeno son capaces de antagonizar cuando menos uno de: la expansión de TH17 mediada por el receptor de IL-7 y la supervivencia de TH17 mediada por el receptor de IL-7.

Los términos inhibir, antagonizar y neutralizar se usan en el presente documento como sinónimos. Ningún término pretende sugerir la necesidad de una neutralización total; también se contempla la neutralización parcial - que corresponde a una reducción pero no una eliminación completa del efecto biológico.

La expansión y/o supervivencia de TH17 mediada por el receptor de IL-7 puede observarse a un nivel celular por un aumento o mantenimiento del número de linfocitos TH17, o por un aumento en la relación del número de linfocitos TH17 en comparación con el número de otros linfocitos T CD4+, o más específicamente por un aumento en la relación de linfocitos TH17:TH1, la relación de linfocitos TH17:Treg, la relación de linfocitos (TH17 más TH1):Treg y/o la relación de linfocitos TH17:(TH1 más Treg).

A nivel molecular, puede observarse la expansión y/o supervivencia de TH17 por un aumento en la producción de IL-17 por una población de linfocitos T CD4+ (o por una población de linfocitos TH17). En una modalidad, por lo tanto, las proteínas de enlace a antígeno de la invención reducen la producción de IL-17 por una población de linfocitos T CD4+. La expansión y supervivencia de TH17 mediada por el receptor de IL-7 también puede observarse por un aumento en la producción de IFN-? por una población de linfocitos T CD4+ (o por una población de linfocitos TH17). De esta manera, en una modalidad, las proteínas de enlace a antígeno de la invención antagonizan (reducen) la producción de IFN-? por una población de linfocitos T CD4+. A nivel molecular, las proteínas de enlace a antígeno de la invención pueden inhibir la fosforilación de STAT-5 mediada por el receptor de IL-7.

A nivel molecular, se puede observar y medir el efecto bloqueante de las proteínas de enlace a antígeno de la invención mediante ensayos tales como P-STAT5 o Bcl-2 inducido por IL-7. A nivel celular, se puede observar y medir el efecto bloqueante mediante ensayos tales como la secreción por Th17 de IL-17 o IFNy. Se describen ensayos de ejemplo en la solicitud PCT N° PCT/US2009/053 36 (WO2010/017468).

En un ensayo PSTAT-5 de ejemplo, se estimulan células mononucleares de sangre periférica con IL-7 en presencia y ausencia de un agente de ensayo. Las células posteriormente se evalúan cuantitativamente con respecto al nivel de PSTAT-5, por ejemplo, por tinción para PSTAT-5 (por ejemplo, con un anticuerpo anti-PSTAT-5 marcado, tal como Anti-Stat5 de ratón Alexa Fluor®647 (pY694, BD [N° 612599])) seguido de separación celular activada por fluorescencia. Los niveles de STAT-5 fosforilado también podrían determinarse por ELISA. Los agentes que reducen el nivel de STAT-5 fosforilado pueden ser candidatos terapéuticos potenciales para enfermedades autoinmunes.

El antagonista puede ser capaz de reducir los niveles de STAT- 5 fosforilado cuando menos en un 20 por ciento, 50 por ciento, 75 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento o 100 por ciento en comparación con los niveles de STAT-5 en ausencia del antagonista, o en comparación con un control negativo, o con células no tratadas. El antagonista puede tener un valor de Cl50 de 50 microgramos/mililitro, 25 microgramos/mililitro o menos, 10 microgramos/mililitro o menos, 5 microgramos/mililitro o menos o 2 microgramos/mililitro o menos. En una modalidad, el antagonista tiene un valor de Cl50 menor o igual a 1 microgramo/mililitro, menor o igual a 0.75 microgramos/mililitro, menor o igual a 0.5 microgramos/ mililitro, menor o igual a 0.25 microgramos/mililitro o menor o igual a 0.1 microgramos/mililitro.

Los antagonistas de la invención son particularmente eficaces para inhibir la expansión de linfocitos TH17. La expansión de linfocitos TH17 puede determinarse en un ensayo de expansión de TH17, que comprende estimular la expansión de una población de linfocitos T vírgenes en presencia y ausencia de un agente de ensayo, seguido de la estimulación de las células para producir IL-17 y la evaluación del nivel de IL-17 producido por las células en presencia y en ausencia del agente de ensayo.

En un ensayo de ejemplo, los linfocitos T CD4+ humanos se diferencian en TH17 por estimulación con activación del receptor de linfocitos T en presencia de IL-1, IL-6 e IL-23. Después de 5 días de diferenciación, las células CCR6+ se clasifican para producir una población de TH17 enriquecida. Esta población después se estimula con IL-7 humana y se determina el aumento en IL-17 e IFN-? en el sobrenadante. Puede determinarse la capacidad para un agente de ensayo, tal como un fragmento de enlace a antígeno de la presente invención, para bloquear la interacción entre la IL-7 y CD127, ya que la presencia de un antagonista de esta interacción durante el período de incubación prevendría la expansión de los linfocitos TH17 llevando a la reducción de la producción de IL-17 e IFN-?.

Las proteínas de enlace a antígeno de la invención pueden tener una inhibición del 20 por ciento o mayor de la secreción de IL-17 en dicho ensayo, frente a un control negativo. Más típicamente, la proteína de enlace a antígeno puede conseguir una inhibición del 50 por ciento, del 75 por ciento, del 85 por ciento o del 90 por ciento o mayor de la secreción de IL-17 frente al control. El fragmento de enlace a antígeno, en algunas modalidades, puede presentar un valor de Cl50 menor o igual a 50 microgramos/mililitro en el ensayo. En otras modalidades, el valor de Cl50 puede ser menor o igual a 20 microgramos/mililitro, 10 microgramos/mililitro o 5 microgramos/ mililitro.

De esta manera, en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune o trastorno inflamatorio, que comprende administrar a un paciente una proteína de enlace a antígeno de la invención en una cantidad suficiente para reducir el número de linfocitos TH17 en el paciente.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un ser humano, que comprende administrar al sujeto una proteína de enlace a antígeno en una cantidad suficiente para reducir la fosforilación de STAT-5 mediada por el receptor de IL-7.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar la esclerosis múltiple en un paciente, que comprende administrar una proteína de enlace a antígeno de la invención al paciente, en el que el paciente padece esclerosis múltiple recidivante remitente.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una proteína de enlace a antígeno de la invención al paciente en una cantidad eficaz para reducir la relación de linfocitos TH17 con respecto a linfocitos TH1.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad autoinmune o inflamatoria en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una proteína de enlace a antígeno de la invención al paciente en una cantidad eficaz para reducir la relación de linfocitos TH con respecto a células Treg (Foxp3+).

Procedimientos diagnósticos de uso Las proteínas de enlace a antígeno descritas en el presente documento pueden usarse para detectar CD127 en una muestra biológica in vitro o in vivo con fines de diagnóstico. Por ejemplo, las proteínas de enlace a antígeno anti-CD127 pueden usarse para detectar CD127 en células cultivadas, en un tejido o en suero. El tejido puede haberse extraído primero (por ejemplo, de una biopsia) del cuerpo de un ser humano o un animal. Pueden emplearse ¡nmunoensayos convencionales, incluyendo ELISA, transferencia de Western, inmunohistoquímica o inmunoprecipitación.

Las proteínas de enlace a antígeno pueden proporcionarse en un kit de diagnóstico que comprende una o más proteínas de enlace a antígeno, un marcador detectable e instrucciones para uso del kit. Por conveniencia, el kit puede comprender los reactivos en cantidades previamente determinadas con instrucciones para el uso.

Terapia pénica Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de enlace a antígeno descritas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto que lo necesita. La molécula de ácido nucleico puede expresar las CDR en un armazón o dominio apropiado, el dominio variable, o el anticuerpo de longitud completa. La molécula de ácido nucleico puede estar comprendida en un vector que permite la expresión en una célula humana o animal. La molécula de ácido nucleico o el vector pueden formularse para administración con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o uno o más agentes terapéuticamente activos como se ha analizado anteriormente.

Ejemplos 1.0 Humanización de 1 A 1 1.1 Clonación de A 1 de las regiones variables de hibridoma Se preparó ARN total a partir de un sedimento de células de los hibridomas 1A11 y se realizó una RT-PCR para generar ADNc de las regiones variables. Las regiones variables amplificadas para la cadena pesada y ligera de cada hibridoma se clonaron en un vector de clonación pCR2.1. Se obtuvo la secuencia para las regiones variables pesada y ligera de cada hibridoma. El análisis de la secuencia predijo las secuencias peptídicas siguientes (con las regiones determinantes de complementariedad destacadas): A) 1A11 VH EVQLQQSGPELLKPGASMKISCKASGYSFTGYT NWVKQSHGKNLEW IGLINPYNGVTSYNQ FKGKATLTVAKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC ARGDGNYWYFDVWGAGTTVTVSS B) 1A11 VL EIVLTQSPAITAASLGQ VTITCSASSSVTY HWYQQKSGTSPKPWIYEI SKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYCQEWNYPYTFGG GTKLEIK Se elaboró una forma quimérica recombinante del anticuerpo fusionando las regiones variables pesada y ligera con regiones constantes humanas de IgGIFc y kappa respectivamente. 1.2 Estrategia de Humanización de Cadena Pesada de 1A11 Después de un análisis BLAST de las bases de datos de línea germinal de gen V humano, se seleccionó la línea germinal humana IGHV1_2 que tenía una identidad del 64 por ciento (incluyendo las CDR) con la secuencia de cadena pesada variable de 1A11 de ratón como región de marco aceptora preferida para la humanización. La región V de línea germinal se combinó por simulación con ordenador con una FR4 adecuada, en este caso el minigen JH6 (Kabat Vol. II) basándose en la similitud de secuencias. Los primeros seis residuos del minigen JH6 que preceden al motivo WGQG están dentro de la región CDR3 que se reemplaza por la CDR entrante del anticuerpo donador. Se generaron ocho variantes de cadena pesada humanizadas basándose en la comparación de secuencias y el posible impacto sobre la función del anticuerpo. La construcción H0 era un injerto directo de CDR de ratón de 1A11 (usando la definición de Kabat) en el marco aceptor humano seleccionado anteriormente. Las construcciones H1 a H3 se basan en H0; cada una incorpora una mutación marco adicional que era diferente en cada construcción; posiciones 71, 66 y 69 respectivamente. Las construcciones H4 a H7 incorporaran dos, tres, cuatro o cinco de las retromutaciones anteriores. 1 .3 Fundamento de la Humanización de Cadena Pesada de 1 A1 1 oara I G HV 1 -2 de marco conservado 1 11 21 CDR1 39 48 EVQLQQSGPE LLKPGASMKI SCKASGYSFT GYTM..1VWVK QSHGKNLEWI QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYYM.. HWVR QAPGQGLE M QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM.. NWVR QAPGQGLEWM QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..iWVR QAPGQGLEWM QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..JWJVR QAPGQGLEWM QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..2VWVR QAPGQGLEWM QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..1VWVR QAPGQGLEWM QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM.. JíWVR QAPGQGLEWM QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM.. NWVR QAPGQGLEWM QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM.. iVWVR QAPGQGLEWM 49 CDR2 66 76 83 92 GLINPY..NG VTSYNQKFKG KATLTVAKSS STAYMELLSL TSEDSAVYYC GWINPN..SG GTNYAQKFQG RVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC GLINPY..NG VTSYNQKFKG RVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC GLINPY..NG VTSYNQKFKG RVTMTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC GLINPY.. NG VTSYNQKFKG KVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC GLINPY..NG VTSYNQKFKG RVTLTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC GLINPY..NG VTSYNQKFKG KVTMTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC GLINPY.. NG VTSYNQKFKG KVTLTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC 1A11H6 GLINPY..NG VTSYNQKFKG KVTLTVDKSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC 1A11H7 GLINPY..NG VTSYNQKFKG KVTLTVAKSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC 93 CDR3 104 VH1A11 ARGDGNY... ... WYFDVWG AGTTVTVSS JH6 WG QGTTVTVSS 1A11H0 ARGDGNY... ... WYFDVWG QGTTVTVSS 1.4 Estrategia de Humanización de Cadena Ligera de 1A11 Después de un análisis BLAST de las bases de datos de línea germinal de gen V humano, se seleccionó la línea germinal humana IGKV3_11 que tenía una identidad del 53 por ciento (incluyendo las CDR) con la secuencia de cadena ligera variable de A 11 de ratón como región de marco aceptora preferida para la humanización. La región V de línea germinal se combinó por simulación por ordenador con una FR4 adecuada, en este caso el minigen kappa 4 de región J (Kabat Vol. II) basándose en la similitud de secuencias. Los tres primeros residuos del minigen JK-4 caen dentro de la región CDR3 que se reemplaza por la CDR entrante del anticuerpo donador. Se generaron diez variantes de cadena ligera humanizada basándose en la comparación de secuencias y el posible impacto sobre la función del anticuerpo. La construcción LO era un injerto directo de CDR de ratón de 1A11 (usando la definición de Kabat) en el marco aceptor humano seleccionado anteriormente. Las construcciones L1, L2 y L4 se basan en LO, y cada una incorpora una mutación de marco adicional que era diferente en cada construcción ; posiciones 47, 71 y 46 respectivamente. La construcción L3 incorporara las dos retromutaciones anteriores 47 y 71 . La construcción L5 incorpora tres de las retromutaciones anteriores 47 y 71 y 46. La construcción L6 a L9 se basan en L5, y cada una incorpora una, dos, tres y cuatro mutaciones de marco adicionales que eran diferentes en cada construcción ; posiciones 58 , 45 , 70 y 60 respectivamente . 1 .5 Fundamento de H umanización de Cadena Ligera de 1 A 1 1 para I G KV3- 1 1 de marco conservado 1 CDR1 44 VklAll EIVLTQSPAI TAASLGQKVT ITCSASS SVTYMH YQQKSGTSP Vk3-ll EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQ SV3SYLA WYQQKPGQAP 1A11L0 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASS SVTYMH WYQQKPGQAP 1A11L1-L9 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASS SVTYMH WYQQKPGQAP 45 CDR2 CDR3 94 VklAll KPWIYEISJO. ASGVPVRFSG SGSGTSYSLT ISSMEAEDAA IYYCQEWNY Vk3-ll RLLIYDASNR ATCIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYC 1A11L0 RLLIYEISKL ASGIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L1 RLWLYEISKL ASGIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L2 RLLIYEISKL ASGIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L3 RLW1YEISKL ASGIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L4 RPLIYEISKL ASGIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L5 RPVSIYEISKL ASGIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L6 RPWIYEISXL ASGVPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L7 KPWIYEISfCL ASGVPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L8 KPWIYEJSJCL ASGVPARFSG SGSGTSYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 1A11L9 KPWIYSISJL ASGVPVRFSG SGSGTSYTLT ISSLEPEDFA VYYCQEWNY 95 Vk VklAll . PYTFGGGT KLEIK 1A11L0 . PYTFGGGT KVEIK hJkl Q-- -V---hJk2 Y---Q--hJk3 F---P-- -VD--hJk4 L G-- -V hJk5 I---Q-- R 2.0 Humanización de 6A3 2.1 Estrategia de Humanización de Cadena Pesada de 6A3 Después de un anál isis BLAST de las bases de datos de l ínea germinal de gen V humano, se seleccionaron la l ínea germinal humana I G HV4_61 que ten ía una identidad del 71 por ciento (incluyendo las C D R) con la secuencia de cadena pesada variable de 6A3 de ratón y la l ínea germinal humana I G HV3_33 que ten ía una identidad del 51 por ciento (que previamente se ha demostrado que se expresa bien con I G KV 1 _39) como regiones de marco aceptoras preferidas para la humanización. La región V de l ínea germinal se combinó por simulación por ordenador con una FR4 adecuada, en este caso el minigen JH6 (Kabat Vol. II) basándose en la similitud de secuencias. Los dos primeros residuos del minigen JH6 que preceden al motivo WGQG caen dentro de la región CDR3 que se reemplaza por la CDR entrante del anticuerpo donador. Se generaron diez variantes de cadena pesada humanizada con IGHV4_61 de marco y doce variantes de cadena pesada humanizada con IGHV3_33 de marco basándose en la comparación de secuencias y el posible impacto sobre la función del anticuerpo. La construcción HO era un injerto directo de CDR de ratón de 6A3 (usando la definición de Kabat) en la región de marco aceptora humana seleccionada anteriormente. Las construcciones H1 a H5 con IGHV4_61 de marco se basan en HO, cada una incorpora una mutación de marco adicional que era diferente en cada construcción; posiciones 71, 27, 30, 67 y 48 respectivamente. Las construcciones H6 a H9 incorporan dos, tres, cuatro o cinco de las retromutaciones anteriores. Las construcciones H1 a H11 con IGHV3-33 de marco se basan en HO, cada una incorpora una mutación de marco adicional que era diferente en cada construcción; posiciones 27, 30, 28, 29, 67, 73, 78, 49, 68, 24 y 48 respectivamente. 2.2 Fundamento de Humanización de Cadena Pesada de 6A3 para IGHV4 61 de marco conservado 1 11 21 CDR1 39 48 VH6A3 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT TDYAW.NWIR QFPGNKLEWM IGHV4_61 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGGYYWSVI IR QPPGKGLE I 6A3-H0 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW. miR QPPGKGLE I 6A3-H1 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW. miR QPPGKGLEWI 6A3-H2 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVS TDYAW. miR QPPGKGLEWI 6A3-H3 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVT TDYAW. miR QPPGKGLEWI 6A3-H4 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW. miR QPPGKGLEWI 6A3-H5 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW. miR QPPGKGLEWM 6A3-H6 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVS TDYAW. miR QPPGKGLEWI 6A3-H7 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVT TDYAW. miR QPPGKGLEWI 6A3-H8 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVT TDYAW. miR QPPGKGLEWI 6A3-H9 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVT TDYAW. miR QPPGKGLEWM 49 CDR2 66 76 83 92 VH6A3 GYIFY... SG STTYTPSLKS RISITRDTSK NQFFLQLNSV TTEDTATYYC IGHV4_61 GYIYY...SG STNYNPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H0 GYIFY... SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H1 GYIFY... SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H2 GYIFY... SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H3 GYIFY... SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H4 GYIFY... SG STTYTPSLKS RITISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H5 GYIFY... SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H6 GYIFY... SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H7 GYIFY... SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H8 GYIFY... SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 6A3-H9 GYIFY... SG STTYTPSLKS RITISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC 93 CDR3 104 VH6A3 ARGGYDVNYF PYW GQGTTLTVSS IGHV4_61 AR 6A3 H0-H9 ARGGYDVNYF DYW GQGTTVTVSS Marco 4 93 CDR3 104 VH6A3 AGGLAGTL . .DYW GQGTTLTVSS IGHV4 AR hJHl FQH- LV hJH2 FDL- -R--LV hJH3 FDV- MV hJH4 LV hJH5 FDS- LV hJH6 MDV- V 6A3H0 AGGLAGTL. . DYW GQGTTVTVSS 2.3 Fundamento de H umanización de Cadena Pesada de 6A3 para IG HV3 33 de marco conservado 1 11 21 CDR1 39 48 VH6A3 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT TDYAW.miR QFPGNKLEWM IGHV3_33 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMH.. VR QAPGKGLEWV 6A3-H0 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H1 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGYTFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H2 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFT TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H3 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFSFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H4 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTIS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H5 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H6 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H7 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H8 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H9 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H10 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAVSGFTFS TDYAW. WWVR QAPGKGLEWV 6A3-H11 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW. NWVR QAPGKGLEWM 49 CDR2 66 76 83 92 VH6A3 GYIFY... SG STTYTPSLKS RIJ3ITRDTSK NQFFLQLNSV TTEDTATYYC IGHV3_33 AVIWY... DGSNKYYADSVKG RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H0 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H1 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H2 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H3 AYIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H4 AYIFY... SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H5 AYIFY... SG STTYTPSLKS RITISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H6 AYIFY... SG STTYTPSLKS RFTISRDTSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H7 AYIFY... SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTFYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H8 GYIFY... SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 6A3-H9 AYIFY... SG STTYTPSLKS RFSISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC 93 CDR3 104 VH6A3 ARGGYDVNYF DYW GQGTTLTVSS IGHV3_33 AR 6A3 H0-H9 ARGGYDVNYF DYW GQGTTVTVSS Marco 4 93 CDR3 104 VH6A3 AGGLAGTL . •DYW GQGTTLTVSS IGHV3 AR hJHl FQH- LV hJH2 FDL- -R--LV hJH3 FDV- MV hJH4 LV hJH5 FDS- LV hJH6 DV- V 6A3H0 AGGLAGTL. .DYW GQGTTVTVSS 2.4 Estrategia de Humanización de Cadena Ligera de 6A3 Después de un análisis BLAST de las bases de datos de l ínea germinal del gen V humano, se seleccionó la l ínea germi nal humana IG KV 1 _39 que ten ía una identidad del 72 por ciento (incluyendo las CD R) con la secuencia de cadena ligera variable de 6A3 de ratón como región de marco aceptora preferida para la humanización. La región V de línea germinal se combinó por simulación por ordenador con una FR4 adecuada, en este caso el minigen kappa 2 de región J (Kabat Vol. II) basándose en la similitud de secuencias. Los dos primeros residuos del minigen JK-2 caen dentro de la región CDR3 y son idénticos a los últimos dos residuos en la CDR3 de la cadena ligera de 6A3 de ratón. Se generaron cinco variantes de cadena ligera humanizadas basándose en la comparación de secuencias y el posible impacto sobre la función del anticuerpo. La construcción LO era un injerto directo de CDR de ratón de 6A3 (usando la definición Kabat) en la región de marco aceptora humana seleccionada anteriormente. Las construcciones L1, L2 se basan en LO, cada una incorpora una mutación de marco adicional que era diferente en cada construcción; posiciones 45, 70 respectivamente. La construcción L3 incorpora las dos retromutaciones anteriores.

Fundamento de Humanización de Cadena Ligera de 6A3 para IGKV1 39 de marco i CDRl 44 DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITCLASQ . TIGA LA WYQQKPG SP DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ . TIGAWLA WYQQKPGKAP DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ .TIGAWLA WYQQKPGKAP DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ . TIGAWLA WYQQKPGKAP DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ . TIGAWLA WYQQKPGKAP DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ .TIGAWLA WYQQKPGKAP 45 CDR2 CDR3 94 Vk 6A3 QLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTKFSFK ISSLQAEDFV SYYCQQFFST IGKV1_39 KLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCQQFFST 6A3 LO KLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST 6A3 Ll QLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST 6A3 L2 KLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTKFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST 6A3 L3 QLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTKFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST 95 Vk 6A3 P .. WTFGGGT KLEIKR 6A3 L0-L3 P..WTFGQGT KLEIKR Marco 4 hJk2 FGQGT KLEIKR Se gene raron cinco variantes de cadena ligera humanizada basándose en la comparación de secuencias y el posible impacto sobre la función del anticuerpo. La construcción LO era un injerto di recto de CD R de ratón de 6A3 (usando la definición de Kabat) en la región de marco aceptora humana seleccionada anteriormente. Las construcciones L 1 , L2 se basan en LO , cada una incorpora una mutación de marco adicional q ue era diferente en cada construcción ; posiciones 45, 70 respectivamente. La construcción L3 incorpora las dos retrom utaciones anteriores ; la construcción L27 incorpora más mutaciones e incluye T4L, A31 Y, D70M , V85T, T94Y, Q 1 00G , L 1 04V (SEQ ID N°: 138).

TABLA 3: Variantes humanizadas de cadena ligera variable de 6A3 2.5 Construcción de Cadena Pesada Variable con Fe Inactivado Se realizaron dos sustituciones de aminoácidos, L237A y G239A, en la construcción 1A11 H3. Estas modificaciones hacen que la molécula sea menos capaz de reclutar células efectoras inmunes o el complemento. La construcción de VH resultante se identifica como 1 A 11 VH3-Fc-DA, y tiene una secuencia como la mostrada en la SEQ ID N°: 119. El anticuerpo que comprendía 1 A11 VH3-Fc-DA y la cadena ligera de 1A11.H4 (1A11 H3L4Fc) se analizó adicionaimente como se describe en el Ejemplo 4 proporcionado a continuación. 2.6 Maduración de Afinidad de 1A1 H3L4 2.6.1 Construcción de variantes anti-IL7R 1A11 H3L4 CDRH3 recombinantes Se produjeron varias variantes del anticuerpo monoclonal anti-IL7R humanizado 1A11 H3L4. Todos ellos diferían únicamente en una sustitución de aminoácido en la región CDRH3 de la cadena pesada del anticuerpo que tenía la secuencia de aminoácidos de cadena pesada expuesta en la SEQ ID N°: 115 (H3) y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera expuesta en la SEQ ID N°: 116 (L4).

Se generaron variantes de CDRH3 humanizadas de 1A11 H3L4 dentro del vector de expresión mamíferos pLEFD usando mutagénesis dirigida al sitio. 2.6.2 Expresión de anticuerpo a pequeña escala en células HEK 293 6E Se introdujeron de forma transitoria por co-transfección plásmidos pLEFN y pLEFD que codificaban las cadenas ligera y pesada de 1A11 H3L4 y variantes de CDRH3 respectivamente en células HEK 293 6E a una escala de 96 pocilios (volumen de expresión de 500 µ?) usando 293fectin (Invitrogen, 12347019). Los sobrenadantes se recogieron por centrifugación durante 10 minutos a 1500 rpm. Los sobrenadantes que contenían anticuerpo después se filtraron usando una placa de filtración de 0.45 µ?t?. Los anticuerpos se evaluaron directamente en el sobrenadante de cultivo de tejidos. 2.6.3 Análisis Proteon de variantes de CDRH3 anti-IL7R 1A11 H3L4 La exploración inicial para determinar la afinidad de enlace de las variantes de anticuerpo de CDRH3 (que procedían de expresiones de anticuerpo a pequeña escala en las células HEK 293 6E y evaluadas directamente en el sobrenadante de cultivo de tejidos, como se describe en el Ejemplo 2.6.2) se realizó en el Proteon XPR36 (Biorad). El procedimiento fue el siguiente; se inmovilizó proteína A en la microplaca de GLC por acoplamiento de amina primaria, después se capturaron anticuerpos mutantes de CDRH3 en esta superficie y se pasó IL7R por encima a 256, 64, 16, 4 y 1 nM, usándose una inyección 0 nM (es decir, tampón solo) para obtener una doble referencia para las curvas de enlace. Se usó NaOH 50 mM para regenerar la superficie de captura, retirando los anticuerpos mutantes de CDRH3 unidos y dejando lista la superficie para otro ciclo de captura e inyección de analito. Los datos se ajustaron al modelo 1:1 usando el software de análisis intrínseco en la máquina. El análisis de enlace para los anticuerpos mutantes se realizó directamente a partir de los sobrenadantes de cultivo de tejidos.

La exploración identificó varios anticuerpos que parecían tener mejores perfiles cinéticos que la molécula parental (1A11 H3L4). Los datos obtenidos a partir de este análisis se muestran en 4.2.3, demostrando que varias mutaciones de CDRH3 en los residuos N98 y F100b parecían mejorar la afinidad de enlace a IL7R. A partir de esta serie de datos, se seleccionaron seis moléculas para un análisis adicional (Ejemplo 2.6.4). 2.6.4 Expresión de anticuerpos a mayor escala en células HEK 293 6E Los datos destacaron que varias mutaciones de CDRH3 en los residuos N98 y F100b parecían mejorar la afinidad de enlace a IL7R (datos mostrados en 4.4.3). Por lo tanto, se produjo anticuerpo purificado para estas seis variantes de CDRH3. Se subclonaron construcciones que codificaban la cadena pesada y ligera de variantes de CDRH3 1A11 H3L4 a partir de los plásmidos pLEFD y pLEFN en el vector pTT para una expresión óptima a gran escala en HEK 293 6E. Los plásmidos se introdujeron por co-transfección transitoriamente en 50-100 mililitros de HEK 2936E (los detalles de los plásmidos se resumen en la Tabla 7) usando 293fectin (Invitrogen, 12347019). Se añadió alimentación con triptona al cultivo celular después de 24 horas y las células se recogieron después de 72 horas más. Después, el anticuerpo se purificó por afinidad usando columnas con Proteína A inmovilizada y se cuantificó leyendo la absorbancia a 280 nanómetros. 3.0 Construcción de vectores humanizados Las secuencias de ADN de las regiones variables humanizadas se secuenciaron de forma optimizada usando el software LETO 1.0 (Entelechon GmbH) y se sintetizaron de novo por construcción de oligonucleótidos solapantes y amplificación por PCR. Los cebadores incluían sitios de restricción para clonación en vectores de expresión de mamífero y secuencias de señales de inmunoglobulina humana para la secreción. Las regiones pesadas variables humanizadas se clonaron en vectores de expresión de mamífero que contenían la región constante gamma 1 humana usando Age1/Kas1. En paralelo, las regiones ligeras variables humanizadas se clonaron en vectores de expresión de mamífero que contenían la región constante kappa humana usando Hindlll y BsiWI. 4.0 Caracterización de anticuerpos humanizados 4.1 Determinación de cinética de enlace de construcciones 1A11 y 6A3: BIAcore R3000 La cinética de enlace de los anticuerpos anti-CD127 para CD127 ECD humano se evaluó usando un dispositivo BIAcore 3000 (GE Healthcare). Las construcciones 6A3 o 1A11 humanizadas se capturaron en una microplaca biosensora CM5 que ya tenía un anticuerpo monoclonal anti-lgG humana (específico de Fe) BIAcore inmovilizado (GE Healthcare N° de cat BR-1008-39) usando el tampón de acoplamiento suministrado. Se inyectó una serie de concentraciones de CD127 ECD humana (512, 256, 128, 64, 32, 16 nM) durante 240 segundos a un caudal de 30 microlitros/minuto. 1) Captura del MAb de interés 2) Asociación de analito a MAb capturado 3) Disociación de analito (tampón) 4) Regeneración con tampón optimizado para BIAcore. Retirada de todos excepto el Ac anti-H acoplado covalentemente. Ciclos de proceso cinético de BIAcore: tampón, 512, 256, 128, 64, 32, 16 nM.

IL7R ECD; ciclo de tampón usado para obtener una doble referencia.

Las superficies de anticuerpo se regeneraron con gCI2 3 M. Las cinéticas se determinaron por ajuste global de los datos al modelo Langmuir 1:1 usando el software Bl Aevaluation. Los resultados se muestran en el Ejemplo 4.2.1 (1A11) y 4.2.2 (6A3). 4.1.1 Determinación de cinética de enlace de variantes de CDRH3 1 A 11 H3L4 seleccionadas Se usó el análisis BIAcoreMR para determinar la afinidad de enlace de los anticuerpos mutantes de CDRH3 purificados (que se obtuvieron a partir de expresiones de anticuerpo a mayor escala en las células HEK 2936E, como se describe en el Ejemplo 2.6.4). 4.1.1.1 Procedimiento 1: BIAcoreMR T100 Se inmovilizó una IgG anti-humana (GE Healthcare/BI AcoreMR BR-1008-39) en una microplaca CM3 por acoplamiento de amina primaria a un nivel de aproximadamente 1.300 unidades de resonancia (UR), después se capturaron anticuerpos mutantes de CDRH3 en dicha placa, todos los anticuerpos se capturaron a un nivel similar (44-56 UR) y se pasó IL-7R por encima a 256, 64, 16, 4, 1 nM, usándose una inyección 0 nM (es decir tampón solo) para obtener una doble referencia para las curvas de enlace, y la regeneración de esta superficie se consiguió usando MgCI23 M. Los datos de enlace se ajustaron al modelo 1:1 intrínseco al software de análisis BIAcore R T100. El ensayo se realizó usando HBS-EP como tampón de procesamiento y se realizó a 25°C en el BIAcore T100. Los resultados se muestran en 4.2.4. 4.1.1.2: Procedimiento 2: BIAcoreMR 3000 Se inmovilizó una IgG anti-humana (GE Healthcare/BI AcoreMR BR-1008-39) en una microplaca CM5 por acoplamiento de amina primaria a un nivel de ~ 5.400 unidades de resonancia (UR), después se capturaron anticuerpos mutantes de CDRH3 en esta superficie, todos los anticuerpos se capturaron a un nivel similar (175-205 UR) y se pasó IL-7R por encima a 64, 16, 4, 1 nM, usándose una inyección 0 nM (es decir tampón solo) para obtener una doble referencia para las curvas de enlace, y la regeneración de esta superficie se consiguió usando MgCI2 3 M. Los datos de enlace se ajustaron al modelo 1:1 intrínseco al software de análisis BIAcoreMR 3000. El ensayo se realizó usando HBS-EP como tampón de procesamiento y se realizó a 25°C en el BIAcoreMR 3000. Los resultados se muestran en 4.2.5. 4.1.2 Determinación de reactividad cruzada de especies A 11 H3L4 en mono cinomolqo y tití Se evaluó la cinética de enlace de 1A11H3L4 para CD127 ECD de mono cinomolgo y tití usando un Biacore 3000. Se capturó 1A11H3L4 en una microplaca biosensora CM5 que ya tenía anticuerpo monoclonal anti-lgG humana (específico de Fe) BIAcore (GE Healthcare N° cat BR-1008-39) inmovilizado. Las superficies de anticuerpo se regeneraron con MgCI2 3 M. La cinética se determinó por ajuste global de los datos al modelo Langmuir 1:1 usando el software Bl Aevaluation. Los resultados se muestran en el apartado 4.3. 4.1.3 Ensayo de inhibición del receptor de IL7 También se usó el análisis BIAcoreMR para demostrar que los anticuerpos mutantes de CDRH3 purificados (que procedían de expresiones de anticuerpo a mayor escala en células HEK 293 6E, como se describe en el Ejemplo 2.6.4) podían inhibir la interacción entre IL7 e IL7R.

Se inmovilizó IL7 (R&D Systems) en una microplaca CM5 por acoplamiento de amina primaria; la superficie se acondicionó con glicina 10 mM, pH 3,0 para proporcionar una superficie estable para el ensayo de neutralización. Se incubó IL7R a 64 nM con los anticuerpos de ensayo a concentraciones de 256 nM, 128 nM, 64 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 2 nM y 1 nM en el ensayo 1 y de 256 nM, 128 nM, 64 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM y 0.25 nM en el ensayo 2. Después, las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas antes de procesarse sobre la microplaca IL7/CM5, y se usó glicina 10 mM, pH 3,0, para regenerar la superficie para la siguiente interacción. Los valores de Cl50 se calcularon usando Robosage, con lo que las señales de enlace se convirtieron en valores en porcentaje basándose en la señal máxima conseguida usando IL7R a 64 nM con anticuerpo 0 nM. Los resultados se muestran en el apartado 4.7. 4.2 Resultados de cinética de enlace 4.2.1 1A11 TABLA 4: Cinética de enlace para construcciones de 1 A 11 4.2.26A3 TABLA 5: Cinética de enlace para construcciones de 6A3 4.2.3 Selección de diversas variantes de CDRH3 anti-IL7R 1A11 H3L4 de 1A11 H3L4 por análisis BIAcore' TABLA 6 - Análisis Proteon de variantes de CDRH3 anti-IL-7R 1A11 H3L4 (kD, en nM) Variantes de CDRH3 con mejor afinidad de enlace para IL7R No presente Valor de KD Representativo para 1 A11 H3L4 = 0.166 nM TABLA 7: mAb variantes de CDR H3 seleccionados construidos y expresados 4.2.4 Análisis BIAcoreMR T100 de variantes de CDRH3 1A11 H3L4 seleccionadas La Tabla 8 muestra los datos obtenidos a partir del estudio 4.1.1.1, que muestra que todas las mutaciones de CDRH3 parecían tener mejores afinidades que las moléculas parentales, pareciendo ser la mejor construcción BPC4398 (Anti-IL7R 1A11 H3L4 N98D).

TABLA 8: 4.2.5 Análisis BIAcoreMH 3000 de variantes de CDHR3 1A11 H3L4 seleccionadas La Tabla 9 muestra los datos obtenidos a partir del estudio 4.1.1.2 y muestra que todas las mutaciones de CDRH3 parecían tener mejores afinidades que las moléculas parentales, pareciendo ser las mejores construcciones BPC4398 (1A11 H3L4 N98D) y BPC4399 (1A11 H3L4 N98E).

TABLA 9: Se observaron diferencias en las afinidades globales calculadas entre los dos procedimientos. Probablemente esto se debe al hecho de que I L7R es un homodímero y por lo tanto la cantidad de avidez y entrecruzamiento de los anticuerpos con el antígeno puede aumentar o disminuir dependiendo de las diferentes densidades de I L7R inmovilizado por las diferentes superficies de captu ra usadas en los dos ensayos. A pesar de las diferentes afinidades observadas entre los dos ensayos, la clasificación en los dos experimentos muestra que BPC4398 ( 1 A1 1 H3L4 N98D) ten ía mejor afinidad que la molécula parental 1 A1 1 H3L4. 4.3 Reactividad cruzada de especies Se observó que 1A11 H3L4 (natural) reaccionaba de forma cruzada con IL-7R de tití y de mono cinomolgo ensayado a un nivel comparable por el sistema Biacore (Tabla 10).

TABLA 10: Comparación de 1A11 H3L4 con IL7R Humano, IL7R de Ratón e IL7R de Mono Cinomolgo 4.4 Enlace a epítopo mediante cristalografía de rayos X Usando un Fab 1A11 H3L4, se usó cristalografía de rayos X acoplada con modelado por simulación con ordenador para predecir las interfaces de enlace para los mAb para ayudar a proporcionar una perspectiva mecánica sobre la neutralización funcional observada, y para realizar elecciones racionales para la maduración de anticuerpos.

Se estableció una estructura de alta resolución (2.08A) de complejo de Fab 1 A11 H3L4/receptor de IL7 humano. El dominio extracelular del receptor de IL7 humano y 1A11H3L4 se expresaron en células CHO lee y se purificaron por cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión molecular. El fragmento Fab de 1A11H3L4 se generó por escisión con papaína. El complejo Fab1 A11 H3L4/IL7R ECD se generó mezclando una relación molar 1:1,2 de Fab1A11H3L4 con el receptor de IL7 ECD. Las proteínas se concentraron y cristalizaron usando el procedimiento de difusión de vapor por gota colgante. Los datos de difracción de rayos X se recogieron en el Advanced Photon Source en el Laboratorio Nacional Argonne. Los datos de difracción se indexaron y se aumentaron de escala usando el software HKL2000. La estructura se determinó por reemplazo molecular en el programa X-PLOR. La solución de reemplazo molecular inicial se sometió a múltiples vueltas de refinamiento por dinamismo molecular en CNX y reconstrucción con el programa WinCoot.

Basándose en la estructura cristalina 2.08A de alta resolución, se predice que 1A11H3L4 se enlaza al receptor de IL7 en 4 de los bucles extracelulares de IL-7R, bloqueando de esta manera la enlace al ligando IL7: Bucle 2: 55Gly 56Ala 57Leu 58Val 59Glu 60Val 61Lys Bucle 3: 80Leu 81Leu 82lle 83Gly 84Lys 100Lys Bucle 4: 138Lys 139Tyr 142Val Bucle 5: 192Tyr 193Phe Estos descubrimientos son coherentes con la competición observada para la enlace a hlL7 que se observó entre 1A11 y 6A3. 4.5 Análisis de funciones efectoras 4.5.1 1 A 11 H3L4 carece de citotoxicidad mediada por el complemento Un total de seis experimentos distintos mostraron que 1A11 H3L4 (tipo silvestre) no tenía ninguna citotoxicidad mediada por el complemento medible. Estos experimentos se realizaron con una línea celular HEK 293 MSR II transducida con hlL-7r Bac am, usada como diana. Estas células se transdujeron (mdi 75) durante ~ 21 horas a 37°C, con un 5 por ciento de C02 en matraces de cultivo T175. Después, las células adherentes se retiraron de los matraces usando TrypLE y se lavaron varias veces antes del cultivo en placas a 1x105 células/50 microlitros/pocillo en una placa de 96 pocilios. Se añadieron 25 microlitros de anticuerpo durante 30 minutos a 37°C con un 5 por ciento de C02. Después de esta incubación, se añadieron 20 microlitros de complemento de conejo a la placa y después se devolvió al incubador durante 2 horas. Se realizó una evaluación de la viabilidad celular añadiendo 100 microlitros de CellTiter-Glo a cada pocilio con mezcla suave usando una pipeta multicanal. Después, la placa se leyó con respecto a la señal de luminiscencia en un lector de placas Victor V (las células viables tienen mayor señal). En la Figura 1 se muestra un ejemplo de uno de estos experimentos.

El anticuerpo de control positivo (Grits 32092) usado en el experimento anterior era específico hacia un receptor de la superficie celular para HER3 que se co-expresaba en la misma célula diana que expresaba el hll_-7Ra. Este anticuerpo de control se usó a la misma concentración que 1A11 H3L4 (10 microgramos/mililitro) y se combinó con las mismas dos fuentes de complemento de conejo (Calbiochem e Invitrogen). Estos resultados demostraron que tanto las células diana como el complemento que se usaron en el ensayo podían inducir la citotoxicidad dependiente del complemento. 4.5.2 1A11 H3L4Fc ha reducido la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) Se perfilaron células mononucleares de sangre periférica purificadas procedentes de siete donantes humanos como células efectoras en un ensayo de ADCC. Estos experimentos se realizaron con una línea celular HEK 293 MSR II transducida con hlL-7r BacMam, usada como célula diana. Estas células se transdujeron (mdi 75) durante ~ 21 horas a 37°C, con un 5 por ciento de C02 en matraces de cultivo T175. Estas células adherentes después se retiraron de los matraces usando Tryple y se lavaron varias veces antes de "cargar" con europio. Estas células cargadas se combinaron en una placa de 96 pocilios (2x104 células/25 microlitros/pocillo) que contenía anticuerpo anti-IL-7R durante 30 minutos a 37°C, con un 5 por ciento de C02. Después de la incubación, se añadieron células efectoras a relaciones de 200, 100, 50 y 25:1 (100 µ?/pocillo) y se volvieron a poner a 37°C con un 5 por ciento de C02 durante 2 horas.

Después de esta incubación, se retiraron 25 microlitros de sobrenadante y se añadieron a una placa de 96 pocilios que contenía 100 µ?/pocillo de solución de potenciación Delfia. La placa después se incubó en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 5 minutos y después se leyó en un lector de placas Víctor V. Todo el europio liberado por las células Usadas en el sobrenadante circundante (citotoxicidad celular) se midió como unidades fluorescentes.

Estos ensayos compararon la capacidad para 1A11 H3L4 de "tipo silvestre" y la molécula con Fe inactivado 1A11 H3L4Fc de enlazarse a células efectoras humanas a través de sus receptores de Fe y destruir las células diana positivas para el receptor de IL-7. Los resultados globales de estos experimentos mostraron que el 1A11 H3L4Fc de Fe inactivado era cuando menos 2 veces menos potente para iniciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos que 1A11 H3L4 "natural". Estos resultados también mostraron que en seis de siete donantes, el anticuerpo inactivado podía inducir algún nivel de actividad ADCC (un donante mostró poca actividad con 1A11 H3L4 de tipo silvestre e inactivado). Los resultados se muestran en la Figura 2. 4.5.3 Enlace al receptor de Fe Se evaluaron 1A11 H3L4 y 1A11 H3L4Fc con respecto a su capacidad para enlazarse a múltiples receptores de efectores de Fe (Fe Gamma I, lia y Illa) y FcRn de numerosas especies y se compararon con anticuerpos con Fe inactivado y de tipo silvestre de control. El trabajo se realizó en la máquina de resonancia de plasmón de superficie Proteon XPR36 (BioRad). Los anticuerpos a ensayar se acoplaron a una microplaca biosensora GLM por acoplamiento de amina primaria. Los diversos receptores Fcy se usaron como analitos a 2048 nM, 512 n , 128 nM, 32 nM y 8 nM usando HBS-EP (pH 7,4) como tampón de procesamiento. Para la enlace al receptor FcRn se usaron FcRn humano, de cinomolgo, de ratón y de rata como analito a 2048 nM, 512 nM, 128 nM, 32 nM y 8 nM, realizándose el ensayo a pH 6,0 y pH 7,4. Todos los sensogramas de enlace tuvieron una doble referencia con una inyección 0 nM (es decir, tampón solo). Los datos se ajustaron al modelo de equilibrio intrínseco para el software de análisis de ProteOn.

La Tabla 11 muestra las afinidades generadas por la enlace del anticuerpo a los diversos receptores de Fe evaluados en este estudio, y muestra que 1A11 H3L4 y 1A11 H3L4Fc se comportaban de una manera comparable a sus homólogos de anticuerpos de control. Los anticuerpos con Fe inactivado (1A11 H3L4Fc) no mostraron enlace o mostraron un enlace muy reducida para receptores de Fcy y, por lo tanto, no pudo realizarse un análisis preciso. Los datos para la enlace a FcRn mostraron que los anticuerpos con Fe inactivado y Fe de tipo silvestre tenían afinidades similares para todas las especies ensayadas, los datos de la tabla son para el ensayo a pH 6,0, la enlace estaba ausente o estaba muy reducida a pH 7,4 como era de esperar.

Tabla 11 : Afinidades de enlace de 1A11 H3L4 (Fe inactivado y Fe de tipo silvestre) a receptores de Fe (nM) 4.6 Ensayos de potencia in vitro 4.6.1 Inhibición de la fosforilación de STAT5 estimulada por IL-7 por 1A11 y 1A11 H3L4 Para explorar el anticuerpo funcional contra IL-7Ra, se incubaron medio de cultivo de hibridoma, anticuerpo de control positivo o muestras de sobrenadante de ensayo con células mononucleares de sangre periférica durante 30 minutos antes de estimular con IL-7. Las células no tratadas se analizaron como señal de fondo, mientras que las células tratadas con IL-7 se establecieron como control negativo. Después de 30 minutos de incubación con los controles o muestras de ensayo, las células se estimularon con IL-7 durante 15 minutos a 37°C. Después, las células se fijaron con un 1,6 por ciento de paraformaldeh ído/PBS durante 10 minutos a 37°C y se permeabilizaron en metanol al 100 por ciento durante 20-30 min. Las células después se lavaron dos veces en tampón de tinción (BSA al 1 por ciento en PBS) y se tiñeron con anticuerpo anti-pStat5 marcado con Alexa-647 (BD Biosciences Inc N° 612599) durante 1 hora. Las muestras se analizaron en un instrumento BD LSR II FACS.

El anticuerpo monoclonal 1A11 parental bloquea la inducción por IL-7 de la fosforilación de STAT5 en células mononucleares de sangre periférica humanas con un valor de CI50 de 0.088 microgramos/mililitro (datos no mostrados). 1A11 H3L4 se ensayó en el mismo ensayo usando células mononucleares de sangre periférica de dos donantes a dos concentraciones de IL-7 humanas (0,1 nanogramo/mililitro y 1 nanogramo/mililitro). 1A11 H3L4 demostró un valor de CI50 muy similar (media = 0.087 microgramos/mililitro) en comparación con 1A11, indicando que el proceso de humanización no afectaba a la capacidad del anticuerpo de inhibir pSTAT5 inducido por IL-7 (Figuras 3A y 3B). 4.6.2 Inhibición de la producción de IL-17 inducida por IL-7 por 1A11 H3L4 Se ensayó 1A11 H3L4 de acuerdo con el siguiente protocolo, para determinar su capacidad para inhibir la expansión de Th17. Se aislaron células CD4+ de acuerdo con el manual (N° 130-091-155, Miltenyi). Se mezclaron aproximadamente 1x106/mililitro de las células CD4+ en 100 microlitros con un volumen igual de una concentración 2x de medio de diferenciación Th17 (anti-CD28 2 microgramos/mililitro + anti-IFN-? 10 microgramos/mililitro + anti-IL-4 10 microgramos/mililitro + I L- 1 ß 12,5 nanogramos/mililitro + IL-2320 nanogramos/mililitro + IL-650 nanogramos/mililitro) y se cultivaron a 37°C con un 5 por ciento de C02 durante 5 días. El tratamiento por las diversas citoquinas y factores de crecimiento en el medio de Th17 preferentemente diferenció las células CD4+ en linfocitos Th17. Las células CCR6+ de las células cultivadas diferenciadas en el día 5 se clasificaron usando BD FACS SORP Aria II. Las células CCR6+ después se ajustaron a 2 x 106/milil¡tro para el ensayo de producción de IL-17.

Para medir el nivel de IL-17 e IFN-?, se preincubaron 100 microlitros de células CCR6+ con anticuerpo de ensayo durante 1 hora a 37°C y después se mezclaron con 100 microlitros de IL-7 10 nanogramos/mililitro. Las células se cultivaron durante 24-40 horas a 37°C con un suplemento de un 5 por ciento de C02. Los niveles de IFN-? e IL-17 en 100 microlitros de sobrenadante de cultivo se midieron por FlowCytomix (Bender MedSystems) a 24 horas y 40 horas respectivamente. 1A11 H3L4 se ensayó en el ensayo de expansión de Th17 en un total de cuatro muestras de células CD4+ humanas (Figuras 4A-D). El anticuerpo humanizado demostró una inhibición significativa de la producción de IL-17 en dos muestras y tendencias de inhibición en las otras dos muestras. Dada la variación de donante a donante en este ensayo, se concluye que 1 A 11 H3L4 puede bloquear la expansión de linfocitos Th17 mediada por IL-7. 4.6.3 Efectos sobre la señalización de TSLP La subunidad de IL-7Ra se comparte tanto por el IL-7R como por el complejo de receptor TSLP (TSLPR). El efecto de 1A11 H3L4 sobre la señalización de TSLP se ensayó en un ensayo in vitro basado en la inducción por TSLP de la producción de TARC por monocitos de sangre humana. Se usó un anticuerpo anti-IL-7Ra comercial, R34.34, como control positivo para bloquear la inducción por TSLP de TARC. Además, también se usó como control negativo una lgG1 humanizada con Fe inactivado (HulgGI; GRITS39633). Se usaron monocitos de 5 donantes, usándose TSLP a 1 nanogramo/ mililitro, 1A11 H3L4 y HulgGI se usaron a dosis de 0.001-30 microgramos/mililitro y R34.34 se usó a 0.4, 2, y 10 microgramos/mililitro. También se evaluó la supervivencia celular por recuento de células. 1A11 H3L4 no afectaba a la inducción por TSLP de TARC como se muestra en las Figuras 5A-E, mientras que para los mismos 5 donantes, R34.34 inhibía sustancialmente la producción de TARC. El anticuerpo de control negativo humanizado no tuvo ningún efecto sobre la producción de TARC. Esta serie de datos demuestra que 1A11 H3L4 no neutraliza la señalización por TSLP en monocitos humanos. Por lo tanto, se prevé que 1A11 H3L4 sea específico para la neutralización de la señalización de IL-7 a través de IL-7R y no afecte a la señalización por TSLP a través de TSLPR. 4.7 Ensayo de inhibición del receptor de IL7 La Tabla 12A muestra los valores de Cl50 obtenidos en el ensayo 1 y muestra que todas las construcciones tenían mejores valores de Cl50 que el mejor valor obtenido para la molécula de 1A11 H3L4 parental y que las dos moléculas superiores eran BPC4401 (anti-IL7R 1A11 H3L4 FIOObH) y BPC4398 (1A11 VH3 N98D L4). La Tabla 12B muestra los valores de Cl50 obtenidos en el ensayo 2, y también muestra que las dos construcciones, BPC4401 (anti-IL7R 1A11 H3L4 FIOObH) y BPC4398 (1A11 VH3 N98D L4) tenían mejores valores de Cl50 que el mejor valor obtenido para molécula de 1A11 H3L4 parental. Los ensayos 1 y 2 se realizaron en superficies de IL7R/CM5 separadas.

TABLA 12A: Valores de CI50 de ensayo de inhibición de receptor (Ensayo 1) TABLA 12B: CI50 de ensayo de inhibición de receptor (Ensayo 2) 4.8 Ensayo de enlace al polimorfo IL-7R IL-7R existe como dos formas polimórficas, variante 1: Thr66-lle 128, variante 2: Ile66-Thr128. Se ensayó el enlace de 1A11H3L4 a ambas formas polimórficas. Una IgG anti-humano (GE Healthcare/ BIAcore™ BR-1008-39) se inmovilizó sobre un chip CM5 mediante acoplamiento de amina primaria hasta un nivel de aproximadamente 9,000 unidades de resonancia (RU); entonces el 1A11H3L4 se capturó sobre esta superficie, y la IL7R se pasó por encima a 512 nM, 256 nM, 128 nM, 64 nM, 32 nM, y 16 nM, con una inyección 0 nM (es decir, con tampón solo), utilizada para referenciar doblemente las curvas de enlace, y se logró la regeneración de esta superficie utilizando MgCI2 3M. Los datos de enlace se ajustaron al modelo de 1:1 inherente al software de análisis BIAcore™ 3000. La ejecución se llevó a cabo utilizando HBS-EP como el tampón de ejecución, y se llevó a cabo a 25°C sobre el BIAcore™ 3000. La Tabla 13 muestra los datos obtenidos, y mostró que 1A11 H3L4 tenía la misma o similar afinidad de enlace a ambas variantes polimórficas (es decir, se enlaza a ambos polimorfos).

TABLA 13: Enlace al polimorfo IL-7R Dentro de esta memoria descriptiva se ha descrio la invención con referencia a las modalidades, de una manera que hace posible que se escriba una memoria descriptiva clara y concisa. Se pretende y se debe apreciar que las modalidades se pueden combinar de diversas formas o se pueden separar sin apartarse de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una, dos o tres de las siguientes regiones determinantes de complementariedad: (i) CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 (ii) CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 (iii) CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o una CDRH3 como se expone en cualquiera de las SEQ ID N°: 132-137 comprendiendo el anticuerpo además cuando menos uno de un residuo de Usina en la posición 66, un residuo de leucina en la posición 69, o una valina en la posición 71 de la región variable de cadena pesada (numeración de acuerdo con Kabat).

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende un residuo de leucina en la posición 69 de la región variable de cadena pesada.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, el cual comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2, CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 y CDRH3 como se muestra en la SEQ ID N°: 4.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, el cual comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2, CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3, y CDRH3 con una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID N°: 132, 133, 134, 135, 136, Ó 137.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1 , el cual comprende una región variable de cadena pesada con una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 29 o 131.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, el cual comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID N°: 13 (1A11.H3 VH).

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID N°: 114 o SEQ ID N°: 118.

8. El anticuerpo de cualquiera de la reivindicación 5, el cual comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID N°: 121 o SEQ ID N°: 123.

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una, dos o tres de las siguientes regiones determinantes de complementariedad: (iv) CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 (v) CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 (vi) CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7.

10. El anticuerpo de la reivindicación 9, en donde la región variable de cadena ligera comprende además cuando menos un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste en: un residuo de lisina en la posición 45, un residuo de prolina en la posición 46, un residuo de triptófano en la posición 47, un residuo de valina en la posición 58, un residuo de valina en la posición 60, un residuo de serina en la posición 70, y un residuo de tirosina en la posición 71 de la cadena ligera de la región variable (numeración de acuerdo con Kabat).

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende las siguientes regiones determinantes de complementariedad: (i) CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 (ii) CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 (iii) CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4, o una CDRH3 como se expone en cualquiera de las SEQ ID N°:132-137 y un dominio variable de cadena ligera que comprende las siguientes regiones determinantes de complementariedad: (iv) CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 (v) CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 (vi) CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 en donde el anticuerpo comprende además un residuo de leucina en la posición 69 de la región variable de cadena pesada, y un residuo de prolina en la posición 46 de la región variable de cadena ligera.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende una región variable de cadena ligera de la SEQ ID N°: 22.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, el cual comprende una cadena ligera de la SEQ ID N°: 115.

14. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde este anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID N°: 13, y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID N°: 22.

15. Una proteína de enlace a antígeno que comprende una o más de las siguientes regiones determinantes de com pie mentari edad: (i) CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 o una CDR variante de la misma (ii) CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 o una CDR variante de la misma (iii) CDRH3 como se expone en la SEQ ID N°: 4 o una CDR variante de la misma, o una CDRH3 como se expone en cualquiera de las SEQ ID N°: 132-137 (iv) CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 o una CDR variante de la misma (v) CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 o una CDR variante la misma (vi) CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7 o una CDR variante la misma en donde cuando menos una de dichas CDRs es una CDR variante, o en donde CDRH3 tiene una secuencia como se expone en las SEQ ID N°:132-137, y en donde dicha proteína de enlace a antígeno es capaz de enlazarse a CD127.

16. La proteína de enlace a antígeno de la reivindicación 15, la cual comprende las siguientes regiones determinantes de complementariedad: (i) CDRH1 como se expone en la SEQ ID N°: 2 (ii) CDRH2 como se expone en la SEQ ID N°: 3 (iii) CDRH3 como se expone en cualquiera de las SEQ ID N°: 132-137 (¡v) CDRL1 como se expone en la SEQ ID N°: 5 (v) CDRL2 como se expone en la SEQ ID N°: 6 (vi) CDRL3 como se expone en la SEQ ID N°: 7.

17. La proteína de enlace a antígeno de la reivindicación 15 o 16, la cual comprende una región variable de cadena ligera de la SEQ ID N°: 22.

18. La proteína de enlace a antígeno de la reivindicación 15, 16 o 17, la cual comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID N°: 13, con una o más de las sustituciones en la cadena pesada, siendo estas sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste en: N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bl y F100bV.

19. La proteína de enlace a antígeno de acuerdo con la reivindicación 15, 16 o 17, la cual comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID N°: 121, 123, 125, 127, 129 o 131.

20. Una proteína de enlace a antígeno, la cual comprende una región de variable de cadena pesada como se expone en la SEQ I D N°: 1 3, y una región variable de cadena ligera como se expone en la S EQ I D N°: 22.

21 . Una proteína de enlace a antígeno de acuerdo con la reivindicación 20, la cual comprende una cadena pesada como se expone en la S EQ I D N°: 1 1 4 o en la S EQ I D N°: 1 1 8 ; y una cadena l igera como se expone en la S EQ I D N°: 1 1 5.

22. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o proteína de enlace a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

23. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 22.

24. U na célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 23.

25. U n anticuerpo o proteína de enlace a antígeno expresada por una cél ula huésped de acuerdo con la reivindicación 24.

26. Un procedimiento para la producción de una prote ína de enlace a antígeno, el cual comprende la etapa de cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 24 en un medio para produci r la proteína de enlace a antígeno, y aislar o purificar la prote ína de enlace a antígeno a parti r del mismo.

27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, en donde dicha etapa de cultivo se realiza en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo o de la proteína de enlace a antígeno en la célula huésped , y la secreción del anticuerpo desde la célula.

28. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de enlace a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, y un veh ículo o excipiente farmacéuticamente aceptable .

29. Un procedimiento para tratar a un sujeto q ue padece una enfermedad autoin mune o inflamatoria, el cual comprende la etapa de admi nistrar al sujeto, una proteína de enlace a antígeno de acue rdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

30. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la enfermedad autoinmune o inflamatoria es esclerosis múltiple .