MX2012007293A - Proceso y composicion de biodegradacion. - Google Patents

Abstract

Se describen nuevas composiciones microbianas y los procesos de biodegradación para tratar animales marinos o subproductos de animales marinos para producir fracciones de sólido, líquido y de lípido que contienen compuestos útiles.

Description

PROCESO Y COMPOSICION DE BIODEGRADACION Campo de la Invención Se describen nuevas composiciones microbianas y procesos microbianos para tratar subproductos de animal marino y, en algunos casos, el animal marino entero para producir fracciones de sólidos, líquidos y lípidos que contienen compuestos útiles.

Antecedentes de la Invención El procesamiento de peces y artrópodos marinos, tales como camarón, cangrejo y cangrejo de río, produce grandes cantidades de subproductos marinos. La mayoría se usan en productos de bajo costo, tales como fertilizantes, ensilaje de pescado o alimentos para mascotas, pero los subproductos que no se usan representan una carga económica para las ¦ industrias de procesamiento de productos marinos, debido a la necesidad de eliminar tales residuos de una manera ambientalmente acertada. Según algunas estimaciones, los subproductos de este tipo representan el 25% de la producción total capturada mediante las pesquerías.

Por ejemplo, durante el procesamiento del camarón para su posterior congelación y comercialización, se genera una gran cantidad de restos ya que el 35% del animal no es comestible y se debe desechar. Estos restos o subproductos se componen del cefalotórax y exoesqueleto del camarón. Sin Ref.:231006 embargo, estos subproductos del camarón son ricos en sustancias de alto valor, tales como quitina, proteína, lípidos, pigmentos carotenoides (astaxantina) y minerales. La mayoría de los subproductos no comestibles se disponen en vertederos o se arrojan de nuevo al océano, provocando de este modo graves problemas medioambientales y considerables pérdidas a la industria de procesamiento del camarón. En la actualidad, sólo una pequeña cantidad de estos subproductos se usa como un suplemento como un alimento animal.

La técnica más común para la utilización del subproducto de camarón es el secado solar. Esta técnica tiene poco control higiénico y los productos se usan principalmente para la alimentación animal. Otros métodos emplean los ácidos y álcalis químicas a diferentes concentraciones, temperaturas y tiempos para la extracción de quitina y recuperación de hidrolizados de proteínas. Sin embargo, estos métodos producen una despol'imerización y desacetilación parcial de quitina. Además, estos métodos complican la recuperación de otros productos, tales como proteína y pigmento.

Se desarrollaron métodos enzimáticos para la extracción de quitina, hidrolizados de líquidos y pigmentos. Los métodos de este tipo usan extractos enzimáticos o aislados de enzima. Otros estudios reportaron el uso de enzimas microbianas, tal como alcalasa comercial, para la extracción de proteínas a partir de subproductos del camarón y animal marino. La combinación de alcalasa y pancreatina se reportó para la extracción de quitina, proteína hidrolizada y lípidos pigmentados .

Los procesos de fermentación láctica se usaron como un sustituto para los procesos químicos y enzimáticos anteriores. La fermentación representa una técnica rentable que estabiliza y conserva la calidad nutricional de los subproductos. Las condiciones óptimas para la fermentación dependen de varios factores, que incluyen la selección y concentración de carbohidratos, pH, temperatura, tiempo, y la selección de las condiciones aeróbicas o anaeróbicas . Otro factor importante es la selección del microorganismo y concentración inicial del inoculo. Para facilitar el proceso de fermentación de los subproductos del camarón, se usaron cultivos puros de la bacteria de ácido láctico (LAB) . Tales LAB incluyen Lactobacillus plantarum (Rao, M.S., Stevens, W.F., 2006, "Fermentation of shrimp biowaste under different salt concentrations with amylolytic and non-amylolitic Lactobacillus strains for chitin production, " Food Technology and Biotechnology 44, 8'3-87; Rao, M.S., Muñoz, J. , Stevens, .F., 2000, "Critical factors in chitin production by fermentation of shrimp biowaste," Applied Microbiology and Biotechnology 54, 808-813; Bhaskar, N. , Suresh, P.V., Sakhare, P.Z., Sachindra, N.M., 2007, "Shrimp biowaste fermentation with Pediococcus acidolactici CFR2182: optimization of fermentation conditions by response surface methodology and effect of optimized conditions on deproteination/demineralization and carotenoid recovery," Enzyme and Microbial Technology 40, 1427-1434), Lactobacillus sp. B2 (Cira, L.A. , Huerta, S., Hal, G.M. , Shirai , K. , 2002, "Pilot scale lactic acid fermentation of shrimp waste for chitin recovery," Process Bioche istry 37, 1359-1366; Shirai, K. , Guerrero, I., Huerta, S., Saucedo, G. , Castillo, A., González, R.O., Hall, G.M., 2001, "Effect of initial glucose concentration and inoculation level of lactic acid bacteria in shrimp waste ensilation," Enzyme and Microbial Technology 28, 446-452), Lactobacillus casei (Shirai 2001), Lactobacillus paracasei (Jung, W.J., Jo, G.H., Kuk, J.H., Kim, Y.J., Oh, K.T., Park, R.D., 2007, "Production of chitin from red crab shell waste by successive fermentation with Lactobacillus paracasei KCTC-3074 and Serratia marcescens FS-3," Carjo ydrate Polymers 68, 746-750), Lactobacillus pentosus (Bautista, J., Jover, M . , Gutiérrez, J.F., Corpas, R. , Cremades, O., Fontiveros, E., Iglesias, F., Vega, J., 2001, "Preparation of crayfish chitin by in situ lactic acid production," Process Biochemistry 37, 229-234; Shirai 2001), Lactobacillus acidophilus B4495 y Lactobacillus lactis (Bhaskar 2007), Lactobacillus salvarus (Beaney 2005), Enteroccus faciu (Beaney 2005) , Pedioccoccus acidilactici (Bhaskar 2007) y Pedioccoccus sp. Ll/2 (Choorit, W., Patthanamanee , W., anurakchinakorn, S., 2008, "Use of response surface method for the determination of demineralization efficiency in fermented shrimp shells," Biores. Technol. 99, 6168-6173). Además, se ha usado una mezcla de cuatro LAB (Bhaskar 2007) y existen reportes del uso de Lactobacillus en combinación con Serratia marcescens FS-3 (Jung 2007) o Staphylococcus carnosus (Shirai 2001) . Sin embargo, la industrialización de tales procesos de fermentación no ha sido exitosa debido al pobre rendimiento de los inoculantes comerciales.

La fermentación láctica de subproductos del camarón produce hidrolizados de proteínas, quitina, minerales y lípidos. La quitina y sus subproductos desacetilados tienen muchas aplicaciones en la agricultura, biomedicina, alimentación y la industria del papel, mientras que el hidrolizado de líquido es una excelente fuente de aminoácidos esenciales que se pueden ser usar para el consumo humano o animal. La pasta de lípidos contiene esteróles, vitamina A y E, y pigmentos carotenoides tal como astaxantina que se puede usar en la alimentación de salmónidos o como un colorante natural en la industria alimentaria.

La quitina es un polisacárido natural que se encuentra particularmente en el exoesqueleto de los crustáceos, las cutículas de insectos, y las paredes celulares de los hongos. Debido a que la quitina es uno de los biopolímeros más abundantes, se ha prestado mucho interés en sus aplicaciones biomédicas, biotecnológicas e industriales. Las quitosanas son compuestos de la poli- (ß-1-4) -N-acetil-D-glucosamina que se producen por la desacetilación de la quitina (ß-1-4)-?-acetil-D-glucosamina. La glucosamina es un monosacárido amino que se obtiene por la despolimerización de la quitosana. Participa en la constitución de los glicosaminoglicanos , una clase importante de polisacáridos extracelulares complejos. El sulfato de glucosamina, hidrocloruro de glucosamina y N-acetil-glucosamina normalmente se usan solos o como parte de una mezcla.

En general, el hidrolizado de líquido tiene un alto contenido de aminoácidos esenciales, indicando un alto valor nutritivo que justifica su uso como un suplemento para la nutrición animal y de la acuicultura o como una fuente de nitrógeno en los medios de crecimiento para los microorganismos. Además, estos hidrolizados son una fuente de aminoácidos libres y se pueden usar como un bioestimulante para la nutrición en las plantas .

La astaxantina (3 , 3 ' -dihidroxi-ß, p-caroteno-4 , 41 -diona) , un cetocarotenoide oxidado del ß-caroteno, se presenta naturalmente en una amplia variedad de organismos marinos y acuáticos. Debido a su atractivo color rosa, sus funciones biológicas como un precursor de la vitamina A, y actividad antioxidante, la astaxantina se puede usar como un colorante en alimentos y en medicina. En la estructura de la astaxantina, se encuentran dos átomos de carbono idénticos asimétricos en C3 y C3 ' . Sin embargo la trans-astaxantina es el carotenoide cuantitativamente más frecuente en las especies de crustáceos.

Las referencias que describen estos y otros productos de de la fermentación láctica incluyen: Sánchez-Machado y otros, "Quantification of organic acids in fermented shrimp waste by HPLC" Food Technology and Biotechnology, volumen 46, 456 (2008) ; Sánchez-Machado y otros "High-performance liquid chromatography with fluorescence detection for quantitation of tryptophan and tyrosine in a shrimp waste protein concéntrate", Journal of Chromatography B, volumen 863, 88 (2008) ,· López-Cervantes y otros, "Quantitation of glucosámine from shrimp waste using HPLC" Journal of Chromatographic Science, volumen 45, 1 (2007); López-Cervantes y otros, "Quantification of astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by HPLC" Biomedical Chromatography, volumen 20, 981 (2006); López-Cervantes y otros, "High-performance liquid chromatography method for.the simultaneous quantification of retinol, alpha-tocopherol, and cholesterol in shrimp waste hydrolysate" Journal of Chromatography A, volumen 1105, 1-2 (2006); López -Cervantes y otros, "Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by ' high-performance liquid chromatography", Journal of Chromatography A, volumen 1105, 1 (2006) .

Breve Descripción de la Invención Se describen composiciones microbianas y procesos de biodegradación.

Una composición microbiana comprende (a) una o más bacterias de ácido láctico (LAB) y (b) uno o más o dos o más microorganismos seleccionados del grupo del género que consiste en Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces, Micrococcus, Nitrobacter y Proteus . En modalidades preferidas, al menos uno de los Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces, Micrococcus, Nitrobacter y Proteus es una cepa quitinolítica que produce una quitinasa (por ejemplo, endoquitinasa y/o exoquitinasa) . En algunas composicionesmicrobianas la LAB se selecciona del género que consiste en Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, y Streptococcus . Cuando . la LAB es Lactobacillus, se prefiere que la LAB sea Lactobacillus acidophilus y/o Lactobacillus casei, con mayor preferencia Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) .

El Bacillus en esta composición se selecciona preferentemente del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis y Bacillus thuringiensis, con mayor preferencia Bacillus subtilis ('SILoSil'" BSJ , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus. licheniformis (Bioderpac, 2008) y cepas HD-1 y HD-73 deBacillus thuringiensis (SILoSil's BT) .

El Azotobacter en esta composición es preferentemente Azotobacter vinelandii, con mayor preferencia Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) .

El Trichoderma en esta composición es preferentemente Trichoderma harzianum, con mayor preferencia Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) El Rhizobium en esta composición es preferentemente Rhizobium japonicum, con mayor preferencia Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) .

El Clostridium en esta composición es preferentemente Clostridium pasteurianu, con mayor preferencia Clostridium pasteurianu (Bioderpac, 2008) .

Las Pseudomonas en esta composición es preferentemente Pseudomonas fluorescens , con mayor preferencia Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) .

Otra composición microbiana comprende uno o más o dos o más microorganismos seleccionados del grupo que consiste enBacillus subtilis (SILoSil0 BS) , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) , Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) , Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) , Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus lichenifor is (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), cepas HD-1 y HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil* BT) , Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) and Proteus (Bioderpac, 2008) .

Otra modalidad de de una composición microbiana comprende Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y/o Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) .

Una composición microbiana particularmente preferida comprende Bacillus subtilis (SILoSil0 BS) , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008) , Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008) , AzotOjacter vinelandii (Bioderpac, 2008) , Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) , Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) , Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) , Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008) , Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) , Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) , Bacillus thuringiensis cepas HD-1 y HD-73, Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008) .

Una composición microbiana preferida es HQE . HQE se depositó en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC, por sus siglas en inglés) Manassas, VA, Estados Unidos el 27 de abril de 2010 y se le dio la designación de depósito de patente PTA- 10861.

Además, se describen microorganismos aislados seleccionados del grupo que consiste en Bacillus subtilis (SILoSil* BSJ , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008) , Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008) , Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophílus (Bioderpac, 2008) , Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) , Trichoderma harzianu (TRICHOSIL) , Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) , Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008) , Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) , Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) , cepas HD-1 y HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil8 BT) , Streptomyces (Bioderpac, 2008) , Micrococcus (Bioderpac, 2008) , Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008) .

El proceso de biodegradación comprende mezclar un animal marino o subproducto de animal marino con cualquiera de las composiciones microbianas antes mencionadas para formar una mezcla; fermentar la mezcla, y separar la mezcla en fracciones de sólidos, líquidos y lípidos. A diferencia de los procesos de biodegradación de la técnica anterior, el proceso de biodegradación que se describe produce quitosana y glucosamina que se pueden encontrar en la fracción acuosa. El animal marino es, de preferencia, un artrópodo marino, tales como camarón, cangrejo de rio, cangrejo o camarón antartico. En algunas modalidades, el animal marino es el pescado o un subproducto de pescado, tales como piel, músculo, u órgano del pescado.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra esquemáticamente un proceso de degradación preferido para los subproductos del camarón.

La Figura 2 describe el pH y acidez titulable total durante la fermentación láctica de los subproductos del camarón .

Descripción Detallada de la Invención Como se usa en este documento, el término "animal marino" se refiere a cualquier animal que vive en océanos, mares o agua dulce. Los animales marinos incluyen pescado y artrópodos marinos .

Como se usa en este documento el término "artrópodo marino" se refiere a un animal marino invertebrado que tiene un exoesqueleto, que vive en océanos, mares o agua dulce. Por lo general los artrópodos marinos tienen un cuerpo segmentado, y apéndices articulados. Los artrópodos marinos son miembros del subfilo Crustácea. Las clases preferidas de Crustácea incluyen Eranchiopoda (por ejemplo, camarón de mar, Cladócero y Triops) , Cephalocardia (por ejemplo, camarón de herradura), Maxillopoda (por ejemplo, percebes y copépodos ( zooplancton) ) , Ostracoda (por ejemplo, ostrácodos) y Malacostraca (por ejemplo, cangrejos, langostas, camarón, camarón antartico etc.).

Como se usa en este documento, el término "subproducto" se refiere a cualquier parte de un animal marino. En algunas modalidades', el subproducto se produce mediante el procesamiento comercial del animal marino. Por ejemplo, en la industria camaronera, el cefalotórax y exoesqueleto son subproductos del camarón. En la industria de procesamiento del cangrejo y langosta el exoesqueleto (caparazón) es un subproducto .

En algunas modalidades, el artrópodo entero se puede usar en el proceso de biodegradacion. Por ejemplo, muchos camarones antárticos tienen aproximadamente 1-2 centímetros (0.4-0.8 pulgadas) de largo como los adultos, pero algunas especies crecen a tamaños en el orden de 6-15 centímetros (2.4-5.9 pulgadas) . El aceite de camarón antartico contiene al menos tres componentes: (1) ácidos grasos omega-3 similares a aquellos del aceite de pescado, (2) ácidos grasos omega-3 conjugados con fosfolípidos y (3) la astaxantina antioxidante. Además, el exoesqueleto contiene fluoruro. Como consecuencia, estos componentes se pueden separar en el proceso de biodegradacion con los componentes del aceite que se aislan en la fracción de lípido y el fluoruro en la fracción líquida.

Como se usa en este documento el término "composición microbiana" se 'refiere a un medio líquido, sólido o gelatinoso que contiene o soporta físicamente uno o más 4 microorganismos, de preferencia dos o más. Las composiciones microbianas incluyen, pero no se limitan a, caldos de fermentación que contienen uno o más microorganismo (s) e inóculos que se usan por lo general para iniciar un caldo de fermentación y que contienen una concentración de microorganismos superior a la que está presente en el caldo de fermentación. Las composiciones microbianas que contienen especies/cepas se denominan a veces como "composiciones microbianas Bioderpac" que se refiere a una composición que contiene uno o más de los microorganismos o una combinación de uno o. más microorganismos con otros microorganismos.

Como se usa en este documento el término "microorganismo aislado" se refiere a un medio líquido, sólido o gelatinoso que contiene o soporta físicamente un microorganismo.

Las composiciones microbianas descritas o microorganismos aislados se pueden combinar con otros microorganismos para formar una nueva composición microbiana que se puede usar para procesos distintos de aquellos descritos específicamente en este documento. La selección del (de los) microorganismo (s) descrito (s) dependerá de sus propiedades biológicas (por ejemplo, producción de proteína o carbohidrato o enzimas que degradan quitina) , los otros microorganismos seleccionados y el proceso en cual la combinación se va a usar. La selección de componentes y procesos de este tipo será evidente para el experto en la técnica siguiendo la descripción en este documento.

Una composición microbiana comprende (a) una o más bacteria de ácido láctico (LAB, por sus siglas en inglés) y (b) uno o más o dos o más microorganismos seleccionados del grupo de género que consiste en Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces . , Micrococcus, Nitrobacter y Proteus. En modalidades preferidas, al menos uno o más, dos o más o tres o más de los Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces. , Micrococcus, Nitrobacter y Proteuses una cepa quitinolítica que produce una quitinasa (por ejemplo, endoquitinasa y/o exoquitinasa) En algunas composicionesmicrobianas la LAB se selecciona del género que consiste en Lactobacillus, Pedíococcus , Lactococcus, y Streptococcus . Cuando la LAB es Lactobacillus, se prefiere que la LAB sea Lactobacillus acidophilus y/oLactobacillus casei, con mayor preferencia Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) .

El Bacillus en esta composición es preferentemente seleccionado del grupo que consiste enBacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus lichenifor is y Bacillus thuringiensis, con mayor preferencia Bacillus subtilis (SILoSil"5 BS) , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) y cepas HD-1 y HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil0 BT) .

El Azotobacter en esta composición es preferentemente Azotobacter vinelandii, con mayor preferencia Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) .

El Trichoderma en esta composición es preferentemente Trichoderma harzianum, con mayor preferencia Trichoder a harzianum (TRICHOSIL) .

El Rhizobium en esta composición es preferentemente Rhizobium japonicum, con mayor preferencia Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) .

El Clostridium en esta composición es preferentemente Clostridiu pasteurianu, con mayor preferencia Clostridium pasteurianu (Bioderpac, 2008) .

La Pseudomonas en esta composición es preferentemente Pseudomonas fluorescens , con mayor preferencia Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) .

Otra composición microbiana comprende uno o más o dos o más microorganismos seleccionados del grupo que consiste en Bacillus subtilis ( (SILoSil° BS) , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) , Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) , Clostridium pasteurianum (Bioderpac , 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), cepas HD-1 y HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil0 BT) , Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008) .

Otra modalidad de una composición microbiana comprende Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y/o Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) .

Una composición microbiana particularmente preferida comprende Bacillus subtilis ( (SILoSil* BS) , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megateriu (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) , Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) , Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) , Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) , Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008) , Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), cepas HD-1 y HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil BT) ,.

Streptomyces (Bioderpac, 2008) , Micrococcus (Bioderpac, 2008) , Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus (Bioderpac, 2008) .

La composición microbiana preferida para usar en el proceso de biodegradación es HQE . HQE se depositó en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) Manassas, VA, Estados Unidos el 27 de abril de 2010 y se le dio la designación de depósito de patente PTA-10861. HQE es un consorcio microbiano formado por microorganismos derivados de los suelos fértiles y microorganismos de fuentes comerciales . Los microorganismos de fuentes comerciales incluyen Bacillus subtilis (SILoSil,s . BS), cepas ND-1 y HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil® BT) y Trichoderma harzianum cada uno obtenido de Biotecnología Agroindustrial S.A. DE C.V. , Morelia, Michoacan, México. Los microorganismos que se pueden derivar de HQE se denominaron "Bioderpac 2008" por cepa o especie y cepa. Sin embargo, se pueden usar también los subconjuntos de los microorganismos en HQE. Los microorganismos Bacillus subtilis (SILoSil31 BS) , Bacillus thuringiensis (SILoSil® BT) y Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) producen enzimas quitinolíticas que son especialmente importantes en el comienzo de lá biodegradación Las enzimas quitinolíticas ayudan a degradar la quitina que contienen los sólidos que pueden constituir una barrera para la digestión adicional. Estos organismos producen también proteasas, lipasas y otras enzimas que facilitan la descomposición de proteínas, lípidos y carbohidratos.

Como se usa en este documento, el término "HYTb" se refiere a la fracción acuosa que se obtiene del proceso de biodegradación. HYTb típicamente contiene aminoácidos (de aproximadamente 3% en peso a 12% en peso, por lo general aproximadamente 12% en peso) , · quitosana (aproximadamente 1.2% en peso) , glucosamina (aproximadamente 1% en peso) y oligoelementos (aproximadamente de 6% en peso) incluyendo calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro y manganeso. La cantidad de quitosana puede estar en el intervalo entre aproximadamente 0.5 % en peso y 1.5 % en peso, con mayor preferencia entre aproximadamente 1.0 % en peso y 1.5 % en peso. La cantidad de glucosamina puede estar en el intervalo entre aproximadamente 0.5 % en peso y 1.5 % en peso, con mayor preferencia entre aproximadamente 1.0 % en peso y 1.5 % en peso. El total de quitosana y glucosamina es aproximadamente 2.0 a 2.5 % en peso. HYTb contiene también enzimas tales como enzimas lácticas, proteasas, lipasas, quitinasas, ácido láctico, polipéptidos y otros carbohidratos. La gravedad específica de HYTb típicamente es de aproximadamente 1.050-1.054. El contenido promedio de aminoácidos en HYTb para ciertos aminoácidos se indican en la Tabla 1.

TABLA 1 Perfil de aminoácido de hidrolizados en polvo seco (mg por g peso seco) Aminoácido Hidrolizados en polvo seco Ácido aspártico 38 Ácido glutámico 39 Serina 16 Aminoácido Hidrolizados en polvo seco Histidina* 9 Glicina 28 Treonina* 14 Alanina 36.1 Prolina 25.8 Tirosina* 70 Arginina 22.2 Valina* 20 Metionina* 16.4 Isoleucina* 18.3 Triptofano* 3.1 Leucina* 23 Fenilalanina* 39 Lisina* 13 Total 431 *Aminoácidos 226 esenciales El HYTb típicamente se produce por la centrifugación del producto de fermentación formado por . el producto de biodegradacion. A medida que avanza el proceso de biodegradacion, los nutrientes que se usan para los microorganismos en el proceso de biodegradacion, por ejemplo HQE, se . agotan y el pH desciende debido al ácido producido durante la fermentación. Esto provoca que los microorganismos en el producto de fermentación mueran o se conviertan en inactivos . En dependencia de la fuerza g y el tiempo de la centrifugación del producto de fermentación, los microorganismos de este tipo se pueden encontrar en HYTb . Como consecuencia, HYTb puede incluir cualquiera de uno o más de los componentes identificados anteriormente, por ejemplo, quitosana y glucosamina, en combinación con todo o parte del componente microbiano del proceso de fermentación que está presente cuando se detiene. Como alternativa, la centrifugación podría avanzar a un punto en el que sustancialmente todo el componente microbiano se agota de HYTb. En tales casos, el componente microbiano se puede centrifugar en la fracción HYTc . Como alternativa, HYTc se puede separar de HYTb por centrifugación a baja gravedad. La HYTb se puede centrifugar entonces para formar un precipitado de microorganismos y un microorganismo libre de solución acuosa HYTb.

Como se usa en este documento, el término "HYTc" se refiere a la fracción sólida que se obtiene del proceso de biodegradación . El componente principal de HYTc es la quitina. Típicamente tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2300 daltons y constituye aproximadamente 64% en peso de la composición. Aproximadamente 6% de HYTc contiene minerales incluyendo el calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro y manganeso, aproximadamente 24% en peso de proteína y 6% de agua. Tiene una gravedad específica de aproximadamente 272 Kg/m3. La quitina en HYTc típicamente tiene microorganismos del producto de fermentación asociado con ésta. Los microorganismos quitinolíticos tienen una propensión a asociarse con la quitina sólida. Esto se basa en la afinidad de los microorganismos quitinolíticos por el sustrato quitina. En consecuencia, HYTc puede contener también microorganismos quitinolíticos a menos que se realicen etapas para eliminarlos. En el caso de HQE, los microorganismos quitinolíticos de este tipo incluyen uno o más de los microorganismos que producen quitinasa y/o exoquitinasa discutidos en este documento. Tales microorganismos incluyen pero no se limitan a Bacillus subtilis (SILoSil55 BS) cepas HD-1 y HD-73 de Bacillus thuringiensis (SILoSil0 BT) , y Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) . Los microorganismos quitinolíticos se pueden eliminar de la quitina sólida por esterilización, pasteurización o lavando la quitina con compuestos antimicrobianos tales como jabones o cloro. La HYTc puede contener también microorganismos adicionales presentes al final del proceso de biodegradación debido a la presencia de producto residual de fermentación o la centrifugación de HYTb.

Consorcio HQE Los siguientes son los microorganismos de HQE y sus propiedades conocidas que se creen estar involucrados en el proceso de biodegradación . En algunos casos, la cepa se identifica como "Bioderpac, 2008". Cuando la especie es desconocida, la especie y la cepa se identifican como "Bioderpac, 2008".

HQE se depositó en la ATCC el 27 de abril de 2010 y dio la designación de depósito de patentes PTA-10861.

Bacillus subtilís ( (SILoSil0 BS) es una bacteria Grampositiva que es mesófila y crece a una temperatura óptima entre 25 y 35 °C. Es aeróbico y puede crecer en condiciones anaeróbicas y utiliza una amplia variedad de fuentes de carbono. Contiene dos nitrato reductasas, una de las cuales se utiliza para la asimilación de nitrógeno. Es capaz de secretar amilasa, proteasas, pululanasas, quitinasas, xilanasas y lipasas.

Bacillus thuringiensis (cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil8 BT) ) son bacterias Gram positivas anaerobias facultativas, en forma de un flagélo peritrico. Las cepas HD-1 y HD-73 durante el período de esporas sintetizan cristales con diversas formas geométricas de actividad proteica e insecticida. Las cepas HD-1 y HD-73 secretan exoquitinasas en un medio cuando contiene quitina y se puede utilizar para la degradación de los residuos de crustáceos durante la producción de quito-oligosacáridos .

Bacillus cereus (Bioderpac, 2008) es una bacteria aeróbica facultativa, gram positiva, y que forma esporas. Es mesófila y crece a una temperatura óptima entre 20 y 40°C. Produce los antibióticos zwittermicina A y kanosamina.

Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) es una bacteria Grampositiva, móvil, que forma esporas y anaerobia facultativa. Produce bacitracina, alfa amilasas, lactamasas, proteasas y fosfatasas alcalinas. Este es un microorganismo no patógeno que se asocia con plantas o materiales vegetales.

Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008) es una bacteria aeróbica Grampositiva. Se considera una saprofita. Produce glucosa deshidrogenasa, penicilina amidasa, beta-amidasa y proteasas neutrales.

Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) es un miembro de una de las ocho especies de bacterias del ácido láctico. Es Gram positiva, no esporulante y produce ácido láctico durante la fermentación que utiliza la lactosa como una fuente principal de carbono para producir energía. Crece con o sin la presencia de oxígeno en un medio ácido (pH 4-5) . Produce las bacteriocinas , denominadas lactacina B, ácidos orgánicos, diacetilos y peróxido de hidrógeno. .

Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) es un mesófilo, anaerobio facultativo, ques es Gram positiva y que no forma esporas. Tiene la capacidad de adaptarse a las temperaturas frías. El pH óptimo para su crecimiento es 5.5. Fermenta galactosa, glucosa, fructosa, mañosa, manitol, y acetilglucosamina . Esta especie se puede cultivar en un amplio intervalo de pH y temperatura. Produce enzimas amilasa. Inhibe el crecimiento de la bacteria patogénica tal como H. pylori reduciendo el pH a través de la producción de (1) ácidos orgánicos tales como ácido acético, propiónico o láctico o (2) de peróxido de hidrógeno. Este microorganismo secreta bacteriocinas .

Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) es una bacteria con flagelo múltiple, aeróbica estricta y su temperatura óptima de crecimiento es entre 25 y 35 °C. Produce lipasas y proteasas termoestables . Es antagonista de un gran número de cepas de hongos del suelo. Produce metabolitos secundarios tales como antibióticos, quelatos de hierro, y cianuros. Produce la endoquitinasa y celulasa en medios con diferentes concentraciones de glucosa.

Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) es un hongo saprofito. Presenta acción antibiótica y competencia biológica y por esta razón tiene propiedades de control biológico. Produce enzimas que degradan las paredes celulares, o una combinación de las actividades. Produce glucanasas , quitinasas, lipasas y proteasas extracelulares cuando interactúa con algunos hongos patogénicos, como Fusarium.

Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) ) es una bacteria fijadora de nitrógeno. Sintetiza un sistema hidrogenasa que participa en el reciclaje de hidrógeno para evitar su pérdida durante la fijación de nitrógeno.

Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) es una bacteria aeróbica. Produce nitrogenasa y es capaz de fijar el nitrógeno .

Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008) es una bacteria gram positiva, anaeróbica estricta. Produce ferroxina (una proteína transportadora de electrones) que actúa como un donador de electrones directo en la reducción de la proteína de hierro.

Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008) es una bacteria Grampositiva, anaeróbica, facultativa, que crece a temperaturas cercanas a 23 °C. Degrada proteolíticamente las proteínas a aminoácidos libres con las enzimas que produce.

Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008) es una bacteria Grampositiva del suelo. Produce múltiples enzimas que metabolizan diversos nutrientes. Puede sobrevivir a cambios significativos de fuentes de temperatura, humedad y nutrientes. Las enzimas extracelulares que se producen por estas bacterias utilizan quitina y quitosana como sustratos a un pH de 4.5 a 6.5 y a 60 °C. Estas son las condiciones generadas en las etapas iniciales y finales de la ' fermentación láctica en el proceso de biodegradacion.

Nitrobacter sp. (Bioderpac, 2008) es una bacteria Gram negativa, aeróbica, que convierte los nitritos en nitratos. Crece a un pH entre 6 y 9 y a temperaturas entre .10 a 34 °C. La bacteria degrada polímeros orgánicos tales como quitina en compuestos que se usan por otros organismos, tales como Pseudomonas fluorescens O y Rhizobium japonicum (Bioderpac2008 ) .

Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008) es una bacteria Gram positiva esférica. Este microorganismo en asociación con Streptomyces sp () es capaz de degradar derivados coloidales de quitina.

Grupos y actividad enzimática de los microorganismos en el HQE La biodegradación de los componentes de los animales o subproductos marinos requiere enzimas hidrolíticas tales como proteasas, lipasas, y quitinasas. Las composiciones microbianas descrxtas contienen una o más de las enzimas de este tipo.

El grupo primario de microorganismos en HQE son Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008) , Bacillus subtilis (SILoSil8 BS) , Pseudomonas fluorescens (Biodepac 2008) , Bacillus licheniformis (Biodepac 2008) y Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) . Estos microorganismos son capaces de biodegradar artrópodos o subproductos de artrópodos . Uno o más de los miembros de este grupo principal tienen también una acción sinérgica cuando se combinan con otros microorganismos de HQE .

El primer grupo de microorganismos incluye los microorganismos que causan la reducción del pH y que estabilizan la fermentación debido a la producción de ácidos orgánicos y peróxido de hidrógeno. Este grupo incluye Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008) y Lactobacillus casei (Biodepac 2008) . Su actividad es importante en el inicio de la fermentación y durante las etapas finales de la fermentación para producir el pH óptimo para las enzimas hidrolíticas . Su actividad crea también un ambiente de cultivo que evita el crecimiento de microorganismos no deseados y favorece la desmineralización de los residuos de quitina. Lactobacillus acidophilus (Biodepac 2008) es un miembro del grupo primario.

El segundo grupo de microorganismos incluye los microorganismos que producen enzimas extracelulares . Este segundo grupo incluyeBacillus subtilis (SILoSil8 BS) , Bacillus cereus (Biodepac 2008) , Trichoder a harzianum (Biodepac 2008), Rhizobium japonicum (Biodepac 2008) y Azotobacter vinelandii (Biodepac 2008) . Las cadenas de quitina en artrópodos o subproductos de artrópodo se asocian con las moléculas de proteína. La separación de polímeros de este tipo requiere la acción hidrolítica que se obtiene a partir de las enzimas quitinolíticas y proteolíticas producidas por estos microorganismos. Ambos tipos de enzimas rompen las cadenas en la región interna del polímero para producir oligómeros de diversos tamaños. La acción de estas enzimas se produce de manera sucesiva dentro de las fases intermedias y final del proceso de fermentación cuando se alcanzan las condiciones de pH adecuadas. Los microorganismos en este grupo y las condiciones ambientales que producen facilitar la liberación de los pigmentos y la fracción de lípido adherida a estos residuos. Bacillus subtilis (SILoSil* BS) y Trichoderma harzianum (Biodepac 2008) son miembros del grupo primario .

El tercer grupo de microorganismos incluye los microorganismos Bacillus licheniformis (Biodepac 2008) , Pseudomonas flourescens (Biodepac 2008), Sptreptomyces , (Biodepac ' 2008) and Clostridium (Biodepac 2008) . Estos microorganismos hidrolizan los oligómeros (quito-oligosacáridos y péptidos) para producir quitobiosas, glucosamina, y aminoácidos libres. Bacillus licheniformis (Biodepac 2008) y Pseudomonas flourescens (Biodepac 2008) son miembros del grupo primario.

En modalidades preferidas, uno o dos de los grupos primero, segundo y tercero de microorganismos se pueden combinar. Como alternativa, todos los grupos primero, segundo y tercero se pueden combinar.

Un cuarto grupo de microorganismos incluye Bacillus thuringiensis (cepas HD-1 y/o HD-73) , Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) y Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008) . El cuarto grupo de microorganismos se puede combinar con (1) el grupo principal de microorganismos (2) cualquiera de los grupos primero, segundo y tercero de microorganismos (3) la combinación de uno o dos de los grupos primero, segundo y tercero de microorganismos o (4) la combinación de todos los grupos primero, segundo y tercero. La adición de este cuarto grupo da lugar a un efecto sinérgico que mejora el proceso de biodegradación .

Cada uno de estos grupos, incluyendo el grupo principal, es útil por separado y se pueden combinar con las composiciones microbianas de la técnica anterior para mejorar su rendimiento. En este sentido, el cuarto grupo se prefiere en particular.

La Tabla 2 expone algunas de las combinaciones anteriormente mencionadas. La columna 1 es una lista de los microorganismos conocidos en el HQE que se cree sean activos en el proceso de biodegradación. La columna 2 enumera los microorganismos de la columna 1, sin los microorganismos del cuarto grupo de microorganismos . La columna 3 muestra la combinación de los microorganismos principales mientras que las columnas 4, 5 y 6 identifican la combinación de microorganismos de los grupos primero, segundo y tercero. La columna 4 es la combinación de los grupos 1 y 2 ; columna 5 de los grupos 1 y 3 y columna 6 de los grupos 2 y 3. Otras combinaciones útiles se exponen en las columnas 7-10.

Tabla 2 Composición del cultivo La actividad de los extractos enzimáticos producidos por los microorganismos dentro HQE es compleja, pero ha permitido la degradación de los residuos quitinosos de artrópodos tal como crustáceos. Los microorganismos en HQE se activan de manera sucesiva de acuerdo con el ambiente generado por los organismos usados.

Métodos para la identificación y aislamiento de microbios en el HQE Es importante para obtener aislamientos puros antes del intento para caracterizar o identificar una especie. Algunas bacterias son morfológicamente únicas y se pueden identificar sin aislamiento, pero casi todas requieren el aislamiento. Lo siguiente describe el aislamiento de cultivos puros de una mezcla de especies contenidas en el HQE para Bacillus subtilis (SILoSil* BS) , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008) , Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) , Bacillus megateriu (Bioderpac, 2008) , Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) , Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) , Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) , Trichoderma harzianum (cepas HD-1 y HD-73) , Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) , Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) , Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008) , Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008) , Bacillus thuringiensis (SILoSil5 BT) , Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008) , Ni trobacter sp. (Bioderpac, 2008) y Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008) .

Las primeras etapas incluyen: (1) Dilución de la siembra por estrías e incubaciones diferenciales (2) Identificación y separación de tipos de colonias (3) Reducir la colección, y (4) Determinar las características iniciales de las colonias específicas y la preservación de los aislamientos.

Dilución de la siembra por estrías e incubaciones diferenciales Una vez que un espécimen se elimina de la muestra HQE se debería cultivar inmediatamente. Cualquier muestra líquida se debe agitar cuidadosamente antes de la preparación de las placas debido a que la bacteria inmóvil podría depositarse en el fondo de una muestra si se asocian con materia particulada. Desafortunadamente, la bacteria no se segrega homogéneamente y las réplicas de muestras de la misma mezcla pueden contener cantidades diferentes de bacteria. El propósito de la agitación con cuidado y subsiguiente dilución de la siembra por estrías es expandir las UFC individuales (Unidades Formadoras de Colonias) para obtener colonias discretas que se pueden sub-cultivar .

Todos los microorganismos mencionados se pueden someter por separado a los siguientes procedimientos para la identificación y aislamiento, con la excepción de Nitrobacter sp. que se explicará por separado.

Un lazo completo de la muestra de HQE cuidadosamente agitada se obtiene asépticamente y se aplica en un borde de la superficie del agar. Con movimientos hacia atrás y adelante aproximadamente una cuarta parte de la superficie se debe estriar mientras que se atrae el lazo hacia el centro de la placa. La siembra por estrías no debe romper la superficie del agar, y debe haber (20 o más) líneas de estrías producidas. Para diluir o expandir la muestra, el lazo se debe flamear para destruir todo el material viable, contactar con una parte limpia del agar para enfriarlo, se hacen entonces las estrías perpendiculares al inoculo inicial, superponiendo aquella parte de la placa una vez o dos veces. La segunda sección debe cubrir una mitad de la superficie estéril restante. Esta se expande una pequeña parte del inoculo inicial posiblemente diluyéndola suficiente como para dar lugar a la aparición de colonias individuales después de la incubación. Una tercera sección es entonces, estriar perpendicular a la segunda sección, flameando y enfriando el lazo y superponiéndose a la sección anterior, como antes, para diluir más el inoculo.

En la preparación de los aislados de cada lote de producto, la siguiente fase es la de preparar la replicación de las placas estriadas e incubar bajo condiciones diferentes en una posición invertida, para maximizar las oportunidades de diferenciar los tipos de colonias de Bacillus subtilis (SILoSil* BS) , Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) , Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) , Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) , Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) , Trichoderma harzianu (TRICHOSIL) , Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) , Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) , Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Proteus vulgaris (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis (cepas HD-1 y HD-73, SILoSil* BT) , Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008) , y Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008) . La temperatura de incubación es diversa (típicamente 25, 30 y 37°C) y se incuba tanto bajo condiciones aeróbicas como anaeróbicas . Este enfoque aumenta las posibilidades de separar las especies individuales, ya que diferentes especies/bacteria tienen intervalos óptimos de temperatura diferentes para el crecimiento y diferentes necesidades de oxígeno. Los organismos aeróbicos deben comprobarse después de un día de incubación, ya que algunas de las bacterias que de las que se prueban crecen muy rápido y desplazan las otras .

Enfoques para la identificación y separación de los tipos de colonia Un microscopio de disección con un transiluminador se puede usar para distinguir las colonias individuales. Las placas deben permanecer invertidas durante el examen. Las colonias se distinguen por tamaño, forma, opacidad y textura con respecto a los microorganismos anteriormente mencionados. Durante el examen, es mejor indicar las colonias que se muestrean poniendo una pequeña marca junto a ellas en el fondo de la placa. Será necesario voltear la tapa de la placa para recoger el material de colonia. Se debe tener cuidado para insertar cuidadosamente el lazo estéril sólo por el tiempo que lleva obtener un inoculo.

Por las características de color, superficie y perfil (en relieve, planas, etc.), es necesario examinar las colonias con la luz directa, a través de la tapa transparente. Las tapas se deberían dejar, de lo contrario las placas se contaminarán. Antes de voltear la placa extraiga la tapa e invierta la tapa para eliminar la humedad. La tapa vieja se debería sustituir con una nueva para su visualización.

En el caso que dos colonias se superpongan y se puedan distinguir todavía, entonces al menos dos colonias están presentes . Las colonias tienen por lo general una textura bastante sencilla, uniforme. Si un área se asemeja a un mosaico, es probable que existan al menos dos especies. Cada tipo único de colonia se debería muestrear tomando un inoculo con la aguja y realizando en una placa fresca una dilución de la estría en tres sentidos . Se debería tener cuidado al sólo muestrear la colonia de interés. Incubar cada nueva placa estriada bajo condiciones aeróbicas a la temperatura que se incubó la placa original .

Las especies que se indican con un crecimiento más rápido y/o colonias más grandes a temperaturas más cercanas a lo ideal, presentarán la óptima temperatura. Cualquier colonia que se muestrea a partir de una placa incubada anaeróbicamente será probablemente un anaerobio facultativo.

Reducción de la colección Los duplicados de la misma especie y cepa es probable que se aislen a partir de placas de estrías diferentes. Muchas especies diferentes y cepas diferentes de la misma especie producen tipos de colonias muy similares. Para reducir el número de aislamientos de especies/cepas únicas, se sospechó del cultivo con aislamientos duplicados de la misma placa. Sobre dos tercios de la superficie se realiza dos "mini -diluciones " para obtener colonias individuales para cada cultivo, y en el tercio restante una tercera mezcla de éstos. Después de la incubación, si los dos aislamientos crecen en la misma 3 placa y/o el inoculo mezclado . produce dos tipos .de colonias distinguibles, se han identificado dos aislamientos únicos.

Caracterización inicial de las colonias y conservación de los aislamientos La mayoría de las características de los organismos en estudio se deberían determinar usando luz directa, no de trasmisión.

Una vez que un aislamiento se obtiene y establece la pureza tanto por examen de colonia como examen microscópico, un tubo inclinado de agar debe inocularse e incubarse a una temperatura apropiada con la tapa suelta para permitir el intercambio de gas. Después que el crecimiento aparece, el cultivo se debería describir, apretar la tapa, y mantener el tubo a temperatura ambiente como una fuente de cultivo puro para los ensayos .

Además de la gran caracterización descriptiva, un cultivo joven (<18 h) se debe teñir de gram, y registrar los resultados incluyendo la forma celular y el tamaño, tabiques o cápsulas si es evidente, y cualquier evidencia de esporas o estructuras similares. La relación con el oxígeno es la etapa siguiente con la cual reducir las categorías posibles. Después de eso, es esta en particular de resultados de la tinción de Gram tipo de células, y relación con el oxígeno que determina la serie de etapas siguientes hacia la caracterización del aislamiento.

La supresión y conteo de La población de Nitrobacter sp. en el producto Ha habido varios estudios sobre el metabolismo, supervivencia y crecimiento de los oxidantes de nitritos en los cultivos puros y en su actividad nitrificante en diversos ambientes, pero pocos estudios han tratado con la población natural de Nitrobacter. A pesar de que la conversión biológica de nitrito a nitrato es un proceso bien conocido, los estudios y procedimientos de la población Nitrobacter en la actualidad están obstaculizados por métodos inadecuados de detección y conteo .

Este fallo se debe en parte a las características fisiológicas desfavorables de esta bacteria, denominada de crecimiento lento, biomasa pequeña, y susceptibilidad de los cultivos a la contaminación. Existe una manera de contar la población dé Nitrobacter en el suelo, pero es consumidora de tiempo y selectiva.

Descripción detallada del proceso de crecimiento Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacíllus megaterium (Bioderpac, 2008) , Bacillus subtilis (SILoSil* BS) y Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008) Ingrediente del medio: agua purificada y medio en placa de agar nutriente .

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar una serie de la placa duplicada con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es agar nutriente, (4) incubar las placas a 37°C durante 24-48 horas, (5) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 mi de producto.

Pseudomonas fluorescens y Proteus vulgaris Ingrediente del medio: agua purificada y medio en placa de agar nutriente.

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar una serie de la placa duplicada con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es agar nutriente, (4) incubar las placas a 37 °C durante 24-48 horas, (5) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 mi de producto.

Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus case! El agar M.R.S. se desarrolló por Man, Rogosa y Sharpe para proporcionar medios que podrían demostrar un buen crecimiento de lactobacilos y otras bacterias de ácido láctico. El medio de cultivo permite un desarrollo abundante de todas las especies de lactobacilo. La peptona y glucosa constituyen la fuente de nitrógeno, carbono y de otros elementos necesarios para el crecimiento bacteriano. El monoleato de sorbitán, magnesio, manganeso y acetato, contribuyen cofactores y puede inhibir el desarrollo de algunos microorganismos. El citrato de amonio actúa como un agente inhibidor del crecimiento de bacterias Gram negativas. Ver Tabla 3.

TABLA 3 Ingrediente de los medios: agua purificada y sustrato en placa de medio agar nutriente M.R.S.

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar en cámara aeróbica con 5-10% de C02 una placa duplicada de la serie con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es agar M.R.S. , (4) incubar las placas a 33-37°C durante 72 horas o 30°C durante 5 días, (5) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 mi de producto.

Resultados. Las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 mi de producto.

Características de las colonias: por lo general pequeña, blanco-grisácea, lisa o rugosa.

Características del medio: El medio preparado es amarillo.

Identificación de Lactobacillus : TABLA 4 Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008) Ingrediente del medio: agua purificada y sustrato en placa de medio agar nutriente con (de Burk, Asbhy, Jensen) .

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) incubar esta solución a 25°C durante 48 horas, (3) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (4) incubar una placa duplicada, con sustrato de agar nutriente, de la serie con 1 mi de intervalo de dilución, el medio de la placa es agar nutriente (5) incubar las placas a 25°C durante 48-72 horas, (6) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 ral de producto .

Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008) Ingrediente de los medios: amortiguador fosfato acuoso y métodos estándares para sustrato en placa de medio agar (TYG) .

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de amortiguador fosfato acuoso, (2) preparar diluciones en serie apropiadas (3) sembrar la alícuota apropiada para la dilución deseada en placas de Petri, (4) adicionar el agar atemperado por métodos estándares y mezclar en la placa, (5) colocar las placas secas invertidas en la cámara anaeróbica, (6) incubar las placas a 35-37°C durante 48-72 horas, (7) después del periodo de incubación, retirar las placas de la cámara anaeróbica y contar las placas, registrar las diluciones usadas y el número total de colonias contadas por cada dilución, (8) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 mi de producto.

La identificación de esta especie de Clostridium usa una morfología microscópica típica de una colonia que permite una identificación rápida y presuntiva de algunas especies de Clostridium aisladas con frecuencia. Además, junto con el uso de pruebas bioquímicas simples tales como el estudio de la producción de lecitinasa y lipasa en agar yema de huevo, la hidrólisis de la gelatina y urea y la producción de indol a través del método rápido (p-dimetil-amino- cinamaldehído) , constituyen un método fácil y barato para la identificación, incluso definitiva, para algunos de ellos.

Micrococcus sp. (Bioderpac, 2008) Ingrediente del medio: agua purificada y medio en placa de agar nutriente .

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar una serie de la placa duplicada con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es agar nutriente, (4) incubar las placas a 37°C durante 24 horas, (5) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 mi de producto.

Si se encuentran cocos Grampositivos , realizar las pruebas de sensibilidad a los antibióticos. Micrococcus es sensible a la bacitracina y resistente a la furazolidona.

Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) Ingrediente de los medios: agua purificada y medio en placa de ALM (agar extracto de levadura manitol) .

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar una serie de la placa duplicada con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es ALM (agar extracto de levadura manitol) (4) incubar las placas a 28°C durante 96 horas, (5) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 mi de producto .

Para confirmar a Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), la colonia aislada se usa para infectar una leguminosa de forma aséptica para provocar la formación de nodulos.

Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) Ingrediente de los medios: agua purificada y sustrato del medio agar extracto de malta (2% peso/volumen) suplementado con cloranfenicol , sulfato de estreptomicina, y nistatina.

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar una serie de la placa duplicada con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es agar de extracto de malta (4) incubar las placas a 25 °C por 4 días, (5) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 ml.de producto.

Bacillus th ringiensis (cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil8 BT) ) Ingrediente del medio: agua purificada y sustrato en placa de medio agar Superbroth suplementado con 2 g/ litro de D-glucosa y 50 µg/ml de eritromicina .

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar una serie de la placa duplicada con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es agar de Superbroth (4) incubar las placas a 28°C por 10-14 días, (5) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000,000 por 1 mi de producto.

Streptomyces sp. (Bioderpac, 2008) Ingrediente de medios: agua purificada y placa de medio agar para aislamiento de actinomicetos .

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar una serie de la placa duplicada con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es agar para aislamiento de actinomicetos (4) incubar las placas a 28 °C por 2-3 días, (5) las unidades formadoras de colonias deben ser 1,000, 000 por 1 mi de producto. iVitrabacter sp. (Bioderpac, 2008) Ingrediente del medio: agua purificada y sustrato en placa de medio agar nutriente .

Procedimiento: (1) colocar 0.1 mi de muestra líquida HQE en 9.9 mi de agua purificada, (2) comenzar una dilución en serie en un intervalo hasta 1-10, (3) incubar una serie de la placa duplicada con 1 mi del intervalo de dilución, el medio de la placa es sustrato en placa de agar nutriente, (4) incubar las placas a 30 °C por 10-14 días.

Proceso de biodegradación En una modalidad preferida, el artrópodo marino es un crustáceo y el crustáceo preferido es el camarón. El subproducto de camarón comprende cefalotórax y/o exoesqueleto de camarón.

En el proceso de biodegradación, se prefiere que la fermentación sea fermentación aeróbica facultativa. Se prefiere también que la fermentación se lleve a cabo a una temperatura de aproximadamente 30°C a 40°C. El pH de preferencia es menor que aproximadamente 6, con mayor preferencia menos de aproximadamente 5.5. Sin embargo, el pH debería mantenerse por encima de aproximadamente 4.3. La fermentación se lleva a cabo durante aproximadamente 24-96 horas. En algunas modalidades, la fermentación se lleva a cabo durante aproximadamente 24-48 horas y con mayor preferencia 24-36 horas. Estos tiempos de fermentación son mucho más cortos que los tiempos de fermentación típicos de la técnica anterior de 10 a 15 días para alcanzar sustancialmente la misma cantidad de digestión, aunque sin formación detectable de quitosana y la glucosamina.

La separación de la mezcla es de preferencia por centrifugación (por ejemplo, aproximadamente 920 g) . La separación por gravedad se puede usar también, pero no se prefiere debido al tiempo requerido para conseguir la separación.

La mezcla se separa en tres fracciones: sólida, acuosa y de lípido. La fracción sólida comprende quitina y se denomina HYTc. La fracción acuosa comprende hidrolizado de proteínas, aminoácidos, quitosana y glucosamina y se denomina HYTb. La fracción de lípido comprende esteróles, vitamina A y E y pigmentos carotenoides tal como astaxantina.

Cualquiera de las composiciones microbianas identificadas en este documento se puede usar en el proceso de biodegradacion. En algunas modalidades, se prefiere que se use HQE en el proceso de biodegradacion. En otras modalidades, se prefiere que se adicione HYTb a HQE o al caldo de fermentación. Como se describió anteriormente, HYTb contiene aminoácidos, quitosana, glucosamina y oligoelementos que incluyen calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro y manganeso. HYTb contiene también enzimas tales como enzimas lácticas, proteasas, lipasas, quitinasas, ácido láctico, polipéptidos y otros carbohidratos. HYTb puede contener también microorganismos latentes de un proceso de biodegradacion anterior. Los microorganismos, de este tipo se pueden convertir en reactivos y, en combinación con HQE, contribuir a un proceso de biodegradacion más robusto en comparación a cuando se usa contrario como se describió en este documento el HQE por si solo Más particularmente, el proceso incluye las etapas siguientes : a. Activación de las células microbianas en una solución de base con azúcar para mejorar su crecimiento y la formación de la biomasa. b. Molido de subproductos del camarón (cefalotórax y exosqueleto) para preparar una pasta homogénea. c. Mezcla homogénea de la pasta de subproductos del camarón con al menos 10% del inoculo activado. d. Ajuste en la mezcla del valor de pH a menos de 6.0 usando una solución de ácido cítrico para inhibir el crecimiento de miero-organismos y promover el desarrollo de células microbianas que constituyen el inoculo. e. Fermentación de la mezcla en un sistema de agitación discontinuo a temperaturas dentro de un intervalo al menos de 30 a 40°C durante al menos 96 horas manteniendo el pH a menos de 5.0. El pH se monitorea periódicamente . Si el pH se eleva por encima de 5.0, se adiciona un amortiguador de ácido cítrico en una cantidad para mantener el pH por debajo de 5.0. f. Centrifugación del fermento para separar las tres fracciones principales: quitina, hidrolizado de líquido y pasta pigmentada.

Lavado del crudo de quitina y recolección de agua de lavado para recuperar los sólidos finos o minerales .

Secado de la quitina y almacenamiento.

El secado y el almacenamiento del hidrolizado de líquido .

La pasta pigmentada (fracción de lípidos) se almacena en recipientes cerrados para su conservación.

El proceso y los fundamentos operativos se entienden mejor en referencia con la Figura 1 y la siguiente descripción detallada.

Activación de las células microbianas Una composición microbiana como se describió en este documento se. usa como inoculo. El inoculo de HQE tiene una concentración de microbios de aproximadamente 2.5 a 3.0% (p/v) . HQE se activa por dilución al 5% en solución de azúcar de caña (3.75% de concentración final de azúcar de caña), e incuba a 37°C durante 5 días. HYTb (10 mi por litro de cultivo) se adiciona de preferencia para proporcionar una fuente de minerales y aminoácidos de origen natural . El crecimiento celular de los microorganismos se estimó por la densidad óptica medida a 540 nm. La activación se completa a una densidad óptica de aproximadamente 1.7. La concentración de microbios después de la activación es aproximadamente 1.9 a 3.0% (p/v) .

Preparación de las muestras Las muestras de camarón y de subproductos se obtuvieron de las plantas de procesamiento de camarón. Las muestras derivadas del camarón se obtienen a partir de mente descongelado y picado (1500 g por lote) se mezcla con 99 gramos de azúcar de caña (concentración final 6.6% en peso) y 85.5 mi de HQE activado al 5% (v/p) (densidad óptica de célula = 1.7) . Después se ajusta el pH a 5.5 usando 2 de ácido cítrico.

Control de la fermentación La mezcla se incuba a 36 °C con una agitación discontinua durante 96 horas. Durante el proceso de fermentación, el pH se monitoreá mediante el uso de un potenciómetro, y la acidez titulable total (TTA, %) se determinó por la valoración con NaOH 0.1 N hasta que se obtiene un pH de 8.5. La TTA se expresa como un porcentaje de ácido láctico.

Condiciones de separación El producto de fermentación es un ensilaje viscoso que tiene un color naranja intenso, debido a la presencia astaxantina. El ensilado se centrifuga (5°C) a 1250 rpm (930g) durante 15 minutos para obtener la quitina, los hidrolizados líquidos, y la pasta de pigmento. La fase superior (pasta de pigmento) se separa manualmente. Los hidrolizados líquidos se separan por decantación, y el sedimento que constituye la quitina cruda se lava con agua destilada para separar los sólidos finos. El líquido resultante . se recoge y seca. La quitina cruda, los hidrolizados líquidos y sólidos finos se secan a 60 °C. Todas las fracciones se almacenan para protegerlas de la luz .

El protocolo anterior se llevó a cabo con HQE en tres lotes de fermentación por duplicado como se muestra en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Control de la fermentación mediante la medición de pH y acidez titulable total ( TTA, % ) Los valores iniciales promedios de pH y TTA fueron 7.31 ± 0.10 y 0.53 ± 0.09, respectivamente. Como se muestra en la Figura 2, el pH se redujo inicialmente a 6.5 mediante la adición de 2 M de ácido cítrico. Después, debido a la proteolisis y liberación de amonio, el pH aumentó de nuevo a 7.11 ± 0.08 durante las primeras 2 h, y más tarde, el pH disminuyó en un 28% (hasta 5.28 ± 0.01) durante las 12 horas de fermentación. En aproximadamente 24 horas de fermentación, el pH final fue de 4.57 + 0.15. En paralelo a la disminución en el pH se observó un comportamiento similar en los valores promedios de la TTA. Durante las 2 primeras horas los valores promedios de TTA fueron de 1%, y después estos valores aumentaron gradualmente hasta un valor promedio de 3.33 ± 0.23 a las 24 horas, como se muestra en la Figura 2.

Ejemplo 2 Productos de la fermentación y composición química Después del proceso de fermentación, el ensila e se centrifuga para separar los tres productos principales (quitina, hidrolizado de líquido y pasta de pigmento) . El otro producto, los sólidos finos se mantuvieron con el lavado de la quitina cruda. La Tabla 5 muestra la proporción recuperada en cada fracción. En peso seco, la fracción más grande correspondió al hidrolizado de líquido (55%) , después los sólidos finos (29%) , quitina cruda (10%) y pasta de pigmento (5%) . En el lote fermentado, el valor promedio de peso seco fue de 32% (481.1 ± 5.6 g) .

La Tabla 6 muestra la caracterización química de cada uno de los cuatro productos principales que se obtuvieron a través de la fermentación. El producto quitinoso (quitina) muestra una desmineralización parcial reflejada como cenizas. También revela el alto contenido de proteínas (42.34%) que se cuantificó en los hidrolizados líquidos. Esto facilita la recuperación de una pasta de pigmento, principalmente que consiste en lípidos totales (42.67%), y produjo una fracción abundante en cenizas (16.72%) en los sólidos finos.

Tabla 5 Productos separados de la fermentación Materia Qui ina Hidrolizado Pasta de Sólidos seca cruda (g) líquido 1ípidos finos (9) (9) (9) (g) 480.0 48.0 264.4 22.9 141.2 487.5 50.2 268.8 24.0 140.8 475.7 51.0 265.7 23. 7 131.7 481.1 ± 49.5 ± 266.3 ± 4.6 23. 3 ± 0.5 141.9 ± 5.6 2.4 5.5 Tabla 6 Composición química (peso seco) de los productos de fermentación Productos % Proteina % Ceniza % Total de lípidos Quitina cruda 18.12 ± 0.15 4.36 ± 0. 26 2.02 ± 0.46 Hidrolizado 42.34 + 0.03 7.96 + 0. 16 4.28 ± 0.28 líquido Pasta de 30.80 ± 0.25 5.11 ± 0. 16 42.67 ± 0.63 lípido Sólidos finos 31.62 ± 0.10 16.72 ± 0 .37 ND Ejemplo 3 Perfil de aminoácidos en los hidrolizados en polvo El contenido de aminoácidos del hidrolizado seco se determinó como se describió por López -Cervantes y otros, "Analysis of free amino acids in fermented shritnp waste by high-performance liquid chromatography" , Journal of Chromatography A, volumen 1105, 1 (2006) . La Tabla 6 muestra el perfil total de aminoácidos de los hidrolizados en polvo. La proporción de aminoácidos esenciales fue de 52.5% para los hidrolizados en polvo.

Tabla 7 Perfil de aminoácido de hidrolizados en polvo seco (mg por g peso seco) Aminoácido Hidrolizados en polvo seco Ácido aspártico 38 Ácido gl támico 39 Serina 16 Histidina* 9 Glicina 28 Treonina* 14 .

Alaniña 30 Prolina 8 Tirosina* 70 Arginina 18 Valina* 20 Metionina* 4 Isoleucina* 15 Leucina* 23 Fenilalanina* 39 Lisina* 13 TOTAL 394 ?Aminoácidos 207 esenciales Ejemplo 4 Cuantificacion de la glucosamina en quitina cruda En la quitina, el contenido de glucosamina se cuantificó como un índice de pureza. Los contenidos de glucosamina en la quitina fueron 516, 619 y 640 mg por g (peso seco) , estos valores se corresponden con los resultados de tres lotes de fermentación llevados a cabo por duplicado. Por lo tanto, la cantidad promedio de la glucosamina en este estudio fue 591 mg por g de peso seco de la quitina. El método para la cuantificación de glucosamina fue reportado por López-Cervantes y otros, "Quantitation of glucosamine from shrimp waste using HPLC" Journal of Chromatographic Science, volume 45, 1 (2007) . Ejemplo 5 Contenidos de astaxantina y perfil de ácidos grasos en la pasta de pigmento La astaxantina es el principal pigmento en la pasta de lípido obtenida a partir del residuo de camarón fermentado. El contenido de astaxantina se encontró en el intervalo de 1.98 a 2.25 mg g"1 de pasta de lípido seca, y el promedio es de 2.11 mg g"1 de pasta de lípido seca. La astaxantina se determinó mediante una variante del método de López-Cervantes y otros, "Quantification of astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by HPLC" Biomedical Chromatography, volumen 20, 981 (2006) .

En la pasta de pigmento, se identificaron catorce ácidos grasos. El ácido palmítico (C16:0), y el ácido oleico (C18:ln9) se encontraron en cantidad superior.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (30)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición microbiana caracterizada porque comprende la designación de depósito de patente ATCC PTA-10861

2. Una composición microbiana caracterizada porque comprende (a) una o más bacterias de ácido láctico (LAB) , (b) _Bacillus subtilis (SILoSil® BS) , y (c) uno o más microorganismos seleccionados del grupo del género que consiste en Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudo onas, Streptomyces, Micrococcus, Nitrobacter y Proteus.

3. Una composición microbiana caracterizada porque comprende (a) una o más bacterias de ácido láctico (LAB) , (b) Bacillus thuringiensis (Cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® BT) ) y (c) uno o más microorganismos seleccionados del grupo del género que consiste en Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces, Micrococcus, Nitrobacter y Proteus

4. Una composición microbiana caracterizada porque comprende (a) una o más bacterias de ácido láctico (LAB) , (b) Trichoderma harzianum, y (c) uno o más microorganismos seleccionados del grupo que consiste en Bacillus, Azotobacter, Rhizobium, Clostridi m, Pseudomonas, Streptomyces, Micrococcus,. Nitrobacter y Proteus.

5. La composición microbiana de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el Trichoderma harzianum es Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) .

6. Una composición microbiana caracterizada porque comprende (a) una o más bacterias de ácido láctico (LAB) , (b) Bacillus subtilis fSILoSil® BS) , (c) Bacillus thuringiensis (cepas HD-1 y HD-73 (SILoSil® BT) ) , (d) Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) y (e) uno o más microorganismos seleccionados del grupo que consiste en Bacillus, Azotobacter, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces, Micrococcus, Nitrobacter y Proteus.

7. La composición microbiana de conformidad con las reivindicaciones 2-6, caracterizada porque la LAB se selecciona del género que consiste en LactOjbacillus, Pedicoccus, Lactococcus, y Streptococcus .

8. La composición microbiana de conformidad con las reivindicaciones 2-6, caracterizada porque la LAB se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei.

9. La composición microbiana de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la LAB se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008) y Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008) .

10. La composición microbiana de conformidad con las reivindicaciones 2-6, caracterizada porque el Bacillus se selecciona del grupo que consiste en Bacillus subtilis , Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus lichenifor is y Bacillus thuringiensis, el Azotoj acter es Azotobacter vinelandii, la Trichoderma es Trichoderma harzianu , el Rhizobium es Rhizobium japonicum, el Clostridium es Clostridium pasteurianu y la Pseudomonas es Pseudomonas fluorescens .

11. La composición microbiana de conformidad con las reivindicaciones 2-6, caracterizada porque el Bacillus se selecciona del grupo que consiste en Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), y Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), el Azotobacter es Azotobacter vinelandii (Biodeprac, 2008), el Rhizobium es Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008) , el Clostridium es Clostridium pasteurianu (Biodeparc, 2008) y la Pseudomonas es Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008) .

12. La composición microbiana de conformidad con las reivindicaciones 2-6, caracterizada porque al menos uno de el Bacillus, Azotobacter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces, Micrococcus, Nitrobacter y Proteus es una cepa quitinolítica .

13. Un proceso de biodegradacion caracterizado porque comprende : mezclar un animal marino o subproducto de animal marino con la composición microbiana de conformidad con cualquiera de las de la reivindicaciones 1 a 12, para formar una mezcla; fermentar la mezcla; y separar la mezcla en fracciones de sólidos, líquidos y lípidos .

14. Un proceso de biodegradación caracterizado porque comprende : mezclar un animal marino o subproducto de animal marino con la composición microbiana para formar una mezcla, donde la composición mirobiana comprende (a) una o más bacterias de ácido láctico (LAB) , (b) uno o más Bacilli y (c) uno o más microorganismos seleccionados del género que consiste en Azoto£>acter, Trichoderma, Rhizobium, Clostridium, Pseudomonas, Streptomyces, Micrococcus, Nitrobacter y Proteus; fermentar la mezcla; y separar la mezcla en fracciones de sólidos, líquidos y lípidos

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque el animal marino es un artrópodo marino .

16. El proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el artrópodo marino se selecciona del grupo que consiste en camarón, cangrejo y camarón antártico.

17. El proceso de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque el animal marino es pescado.

18. El proceso de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque la composición microbiana comprende la designación de depósito de patente ATCC PTA-10861.

19. El proceso de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque la fermentación es por fermentación aeróbica facultativa.

20. El proceso de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque la separación es por centrifugación .

21. El proceso de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque la fermentación es a una temperatura de aproximadamente 30°C a 40°C.

22. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo a un pH entre aproximadamente 4.3 y 5.0

23. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo por aproximadamente 24-96 horas.

24. El proceso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la fracción acuosa comprende aminoácidos, quitosana y glucosamina

25. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la fracción acuosa comprende además elementos de traza.

26. La fracción acuosa caracterizada porque es preparada de conformidad con las reivindicaciones 24 ó 25.

27. El proceso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la fracción sólida comprende quitina.

28. La fracción sólida caracterizada porque es preparada de conformidad con la reivindicación 27.

29. Una composición caracterizada porque comprende HYTb .

30. Una composición caracterizada porque comprende HYTC .