MX2012006214A - Disposicion de camaras de interaccion y contrapresion para la microfluidizacion. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método mejorado para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende utilizar un dispositivo de microfluidización cuya cámara de interacción comprende una pluralidad de canales tipo Z corriente arriba de una cámara de contrapresión.

Description

DISPOSICION DE CAMARAS DE INTERACCION Y CONTRAPRESION PARA LA MICROFLUIDIZACION Descripción de la Invención Esta invención se encuentra en el campo de la manufactura de adyuvantes de emulsión de aceite en agua para vacunas por medio de la microfluidización.

El adyuvante de vacuna conocido como "MF59" [1-3] es una emulsión submicrométrica de aceite en agua de escualeno, polisorbato 80 (también conocido como Tween 80) y trioleato de sorbitán (también conocido como Span 85) . También puede incluir iones de citrato por ejemplo amortiguador de citrato de sodio 10 mM. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente 5% de escualeno, aproximadamente 0.5% de Tween 80 y aproximadamente 0.5% de Span 85. El adyuvante y su producción se describen con mayor detalle en el Capítulo 10 de la referencia 4, el capítulo 12 de la referencia 5 y el capítulo 19 de la referencia 6.

Como se describe en la referencia 7, el MF59 es manufacturado a escala comercial al dispersar el Span 85 en la fase de escualeno y el Tween 80 en la fase acuosa, seguido por el mezclado a alta velocidad para formar una emulsión desigual. Esta emulsión desigual luego se pasa repetidamente a través de un microfluidizador para producir una emulsión REF: 230976 que tiene un tamaño uniforme de gotitas de aceite. Como se describe en la referencia 6, la emulsión microfluidizada luego se filtra a través de una membrana de 0.22 µp? con el propósito de retirar cualquier gotita grande de aceite y el tamaño promedio de gotitas de la emulsión resultante permanece sin cambios durante por lo menos 3 años a 4°C. El contenido de escualeno de la emulsión final se puede medir como se describe en la referencia 8.

Las emulsiones de aceite en agua contienen gotitas de aceite. Las gotitas de aceite más grandes contenidas en estas emulsiones pueden actuar como sitios de nucleacion para la agregación, lo que conduce a la degradación de la emulsión durante el almacenamiento.

Un objetivo de la invención es proporcionar métodos adicionales y mejorados para la producción de emulsiones microfluidizadas de aceite en agua (tal como F59) , en particular métodos que son adecuados para el uso a escala comercial y los cuales proporcionan una microfluidización mejorada para proporcionar emulsiones con menos partículas grandes.

La invención proporciona un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende: pasar una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite a través de un dispositivo de microfluidización para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite. El dispositivo de microfluidización comprende una cámara de interacción la cual comprende una pluralidad de canales tipo Z y un módulo de procesamiento auxiliar que comprende por lo menos un canal, en donde el módulo de procesamiento auxiliar está colocado corriente abajo de la cámara de interacción.

La primera emulsión puede ser introducida en la cámara de interacción a una primera presión y la segunda emulsión puede salir del módulo de procesamiento auxiliar a una segunda presión la cual es más baja que la primera presión. En una modalidad, entre 80 y 95% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través de la cámara de interacción y de 5 a 20% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través del módulo de procesamiento auxiliar.

La presente invención también proporciona un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende el paso que consiste en pasar una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite a través de un dispositivo de microfluidización para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite. El dispositivo de microfluidización comprende una cámara de interacción que comprende una pluralidad de canales y un módulo de procesamiento auxiliar que comprende una pluralidad de canales .

La primera emulsión ya sea puede (i) ser introducida en la cámara de interacción a una primera presión y la segunda emulsión puede salir del módulo de procesamiento auxiliar a una segunda presión la cual es más baja que la primera presión; o la primera emulsión puede (ii) ser introducida en el módulo de procesamiento auxiliar a una primera presión y la segunda emulsión puede salir de la cámara de interacción a una segunda presión la cual es más baja que la primera presión. En una modalidad, entre 80 y 95% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través de la cámara de interacción y de 5 a 20% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través del módulo de procesamiento auxiliar.

Como se describe con mayor detalle posteriormente, la primera emulsión puede tener un tamaño promedio de gotitas de aceite de 5000 nm o menor por ejemplo un tamaño promedio entre 300 nm y 800 nm. El número de gotitas de aceite en la primera emulsión con un tamaño >1.2 µt? puede ser 5 x 101 /??1 o menos, como se describe posteriormente. Las gotitas de aceite con un tamaño >1.2 µp? son desventajosas ya que pueden causar la inestabilidad de la emulsión debido a la aglomeración y coalescencia de las gotitas [14] .

Después de la formación, la primera emulsión entonces puede sujetarse a por lo menos una pasada de microfluidización para formar la segunda emulsión que tiene un tamaño promedio de gotitas de aceite reducido. Como se describe posteriormente, el tamaño promedio de gotitas de aceite de la segunda emulsión es 500 nm o menos. El número de gotitas de aceite en la segunda emulsión que tienen un tamaño >1.2 µp? puede ser 5 x 1010/ml o menos, como se describe posteriormente. Para lograr estas características puede ser necesario pasar los componentes de la emulsión a través del dispositivo de microfluidización una pluralidad de veces, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7 veces.

La segunda emulsión entonces puede ser filtrada, por ejemplo a través de una membrana hidrófila de polietersulfona, para proporcionar una emulsión de aceite en agua que puede ser adecuada para el uso como un adyuvante de vacuna. El tamaño promedio de gotitas de aceite de la emulsión de aceite en agua producida después de la filtración puede ser de 220 nm o menos, por ejemplo entre 135-175 nm, entre 145-165 nm o aproximadamente 155 nm. El número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp? presentes en la emulsión de aceite en agua producida después de la filtración puede ser 5 x 108/ml o menos, por ejemplo 5 x 107/ral o menos, 5 x 106/ml o menos, 2 x 106/ml o menos o 5 x 105/ml o menos.

La emulsión final de aceite en agua que se forma después de la filtración puede tener por lo menos 102 veces menos gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µ?? en comparación con la primera emulsión e idealmente por lo menos 103 veces menos (por ejemplo, 104 veces menos) .

En algunas modalidades, se utiliza más de un ciclo de pasos (i) y (ii) antes del paso (iii) . Similarmente, se pueden utilizar múltiples repeticiones de los pasos individuales (i) y (ii) .

En general, el método se lleva a cabo entre 20-60°C e idealmente a 40+5 °C. Aunque el primer componente y el segundo componente de la emulsión pueden ser relativamente estables incluso a temperaturas más altas, aún puede ocurrir la descomposición térmica de algunos componentes y de esta manera se prefieren temperaturas más bajas.

Componentes de la emulsión El tamaño promedio de gotitas de aceite (es decir el diámetro promedio en número de las gotitas de aceite de la emulsión) se puede medir utilizando una técnica de dispersión de luz dinámica, como se describe en la referencia 13. Un ejemplo de una máquina de medición por dispersión de luz dinámica es el Analizador del Tamaño de Partícula Submicrométrico Nicomp 380MR (de Particle Sizing Systems) .

El número de partículas que tienen un tamaño >1.2 µ?? se puede medir utilizando un contador de partículas tal como el dispositivo Accusizer 770MR (de Particle Sizing Systems) .

Los métodos de la invención se utilizan para la manufactura de emulsiones de aceite en agua. Estas emulsiones incluyen tres ingredientes fundamentales: un aceite; un componente acuoso; y un tensioactivo .

Debido a que las emulsiones están proyectadas para el uso farmacéutico entonces el aceite será típicamente biodegradable (metabolizable) y biocompatible .

El aceite utilizado puede comprender escualeno, un aceite de hígado de tiburón el cual es un terpenoide insaturado, ramificado (C3oHso; [ (CH3) 2C [=CHCH2CH2C (CH3) ] 2=CHCH2-] 2 ; 2 , 6, 10, 15 , 19, 23-hexametil-2 , 6, 10 , 14, 18 , 22-tetracosahexaeno; CAS R 7683-64-9) . El escualeno se prefiere particularmente para el uso en la presente invención.

El aceite de la presente invención puede comprender una mezcla (o combinación) de aceites que comprenden por ejemplo escualeno y por lo menos un aceite adicional.

En lugar de (o además de) utilizar escualeno, una emulsión puede comprender aceite (s) que incluye (n) aquellos de, por ejemplo, un fuente animal (tal como un pescado) o una fuente vegetal. Las fuentes para aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuate, el aceite de soya, el aceite de coco y el aceite de olivo, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nueces. Se puede utilizar aceite de jojoba por ejemplo obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de ajonjolí y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede utilizar el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, tritical y similares. Los ásteres de ácidos grasos de 6-10 átomos de carbono de glicerol y 1 , 2 -propanodiol , mientras que no se encuentran naturalmente en los aceites de semillas, se pueden preparar por medio de la hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados iniciando a partir de los aceites de nueces y semillas. Las grasas y los aceites de leche de mamífero se metabolizan y de esta manera se pueden utilizar. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales son bien conocidos en el campo.

La mayoría de pescados contienen aceites metabolizables los cuales se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, el aceite de hígado de tiburón y el aceite de ballena tal como el esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de pescado los cuales se pueden utilizar en el presente documento. Una variedad de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 átomos de carbono y son referidos generalmente como terpenoides. El escualano, el análogo saturado para el escualeno, también se puede utilizar. Los aceites de pescado, inclusive el escualeno y el escualano, están disponibles fácilmente de fuentes comerciales o se pueden obtener por medio de métodos conocidos en el campo.

Otros aceites útiles son los tocoferoles, particularmente en combinación con escualeno. Donde la fase oleosa de una emulsión incluye un tocoferol, se puede utilizar cualquiera de los a, ß, ?, d, e o ? tocoferoles, pero se prefieren los a-tocoferóles . El D-a-tocoferol y el DL-a-tocoferol se pueden utilizar ambos. Un a-tocoferol preferido es el DL-a-tocoferol . El tocoferol puede tomar varias formas por ejemplo diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etcétera. Si se debe utilizar una sal de este tocoferol, la sal preferida es el succinato. Se puede utilizar una combinación de aceites que comprende escualeno y un tocoferol {por ejemplo DL-a-tocoferol) .

El componente acuoso puede ser agua simple (por ejemplo agua para inyección) o puede incluir componentes adicionales por ejemplo solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un amortiguador por ejemplo sales de citrato o fosfato, tales como sales de sodio. Los amortiguadores típicos incluyen: un amortiguador de fosfate-amortiguador de Tris; amortiguador de borato; amortiguador de succinato; amortiguador de histidina; o amortiguador de citrato. Los amortiguadores se incluirán típicamente en el intervalo de 5-20 mM.

El tensioactivo es preferiblemente biodegradable (metabolizable) y biocompatible . Los tensioactivos pueden clasificarse por su "HLB" (balance de hidrófilos/lipófilos) , donde un HLB en el intervalo de 1-10 significa generalmente que el tensioactivo es más soluble en aceite que en agua y un HLB en el intervalo de 10-20 significa que es más soluble en agua que en aceite. Las emulsiones comprenden preferiblemente por lo menos un tensioactivo que tiene un HLB de por lo menos 10 por ejemplo por lo menos 15 o preferiblemente por lo menos 16.

La invención se puede utilizar con tensioactivos que incluyen, pero no están limitados a: los tensioactivos de ésteres de polioxietilen-sorbitán (referidos comúnmente como los Tweens) , especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolimeros de óxido de etileno (EO) , óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO) , vendidos bajo la marca comercial DOWFAXR, tal como los copolimeros de bloque lineales de EO/PO; octoxinoles, los cuales pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1, 2-etanodiilo) que se repiten, en donde el octoxinol-9 (Tritón X-100 o t-octilfenoxipolietoxietanol ) es de interés particular; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina) ; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílieos, cetílicos, estearílicos y oleílieos (conocidos como tensioactivos Brij ) , tal como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30) ; éter polioxietilen-9-laurílico; y ésteres de sorbitán (conocidos comúnmente como los SPA s) , tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Los tensioactivos preferidos para incluir en la emulsión son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietilen-sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Tritón X-100.

En la emulsión se pueden incluir mezclas de tensioactivos por ejemplo mezclas de Tween 80/Span 85 o mezclas de Tween 80/Tritón-X100. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilen-sorbitán tal como el monooleato de polioxietilen-sorbitán (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxi-polietoxietanol (Tritón X-100) . Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilen-sorbitán y/o un octoxinol. Las mezclas útiles pueden comprender un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 10-20 {por ejemplo Tween 80, con un HLB de 15.0) y un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 1-10 (por ejemplo Span 85, con un HLB de 1.8) .

Formación de la primera emulsión Antes del paso de microfluidización, los componentes de la emulsión se pueden mezclar para formar una primera emulsión.

Las gotitas de aceite en la primera emulsión pueden tener un tamaño promedio de 5000 nm o menos, por ejemplo 4000 nm o menos, 3000 nm o menos, 2000 nm o menos, 1200 nm o menos, 1000 nm o menos, por ejemplo un tamaño promedio entre 800 y 1200 nm o entre 300 nm y 800 nm.

En la primera emulsión, el número de gotitas de aceite con un tamaño >1.2 µp? puede ser 5 x 10i:L/ml o menos, por ejemplo 5 x 1010/ml o menos o 5 x 109/ml o menos.

La primera emulsión entonces puede ser microfluidizada para formar una segunda emulsión que tiene un tamaño promedio de gotitas de aceite más bajo que la primera emulsión y/o menos gotitas de aceite con un tamaño >1.2 µp?.

El tamaño promedio de gotitas de aceite de la primera emulsión se puede lograr al mezclar los componentes de la primera emulsión en un homogenizador . Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1, se pueden combinar en un recipiente de mezclado (12) y luego los componentes combinados se pueden introducir (13) en un homogenizador mecánico, tal como un homogenizador de rotor-estator (1) .

Los homogenizadores pueden operar de una manera vertical y/u horizontal. Por conveniencia en un entorno comercial, se prefieren los homogenizadores en línea.

Los componentes se introducen en un homogenizador de rotor-estator y encuentran un rotor que gira rápidamente que contiene ranuras o agujeros. Los componentes son lanzados de manera centrífuga hacia afuera de una forma similar a una bomba y pasan a través de las ranuras/aguj eros . En algunas modalidades, el homogenizador incluye múltiples combinaciones de rotores y estatores, por ejemplo una disposición concéntrica de anillos de dientes de peine, como se muestra por las características (3) y (4) ; (5) y (6) y (7) y (8) en la Figura 1 y por la Figura 2. Los rotores en homogenizadores a gran escala, útiles pueden tener anillos de dientes de peine en el borde de un impulsor de múltiples paletas orientado horizontalmente (por ejemplo la característica (9) en la Figura 1) alineado en tolerancia restringida para el apareamiento de dientes en un forro estático. La primera emulsión se forma por vía de una combinación de turbulencia, cavitación y cizallamiento mecánico que ocurren dentro de la abertura entre el rotor y el estator. Los componentes se introducen convenientemente en una dirección paralela al eje del rotor.

Un parámetro de desempeño importante en los homogenizadores de rotor-estator es la velocidad de extremo del rotor (velocidad periférica) . Este parámetro es una función tanto de la velocidad de rotación como del diámetro del rotor. Es útil una velocidad de extremo de por lo menos 10 ms"1 e idealmente más rápida por ejemplo >20 ms"1, >30 ms"1, =40 ms"1, etcétera. Una velocidad de extremo de 40 ms"1 se puede lograr fácilmente a 10,000 rpm con un homogenizador pequeño o a velocidades de rotación más bajas (por ejemplo 2,000 rpm) con un homogenizador más grande. Los homogenizadores de alto esfuerzo de cizallamiento adecuados están disponibles comercialmente .

Para la manufactura a escala comercial, el homogenizador debe tener idealmente un caudal de por lo menos 300 L/hr por ejemplo >400 L/hr, >500 L/hr, >600 L/hr, >700 L/hr, >800 L/hr, >900 L/hr, >1000 L/hr, >2000 L/hr, >5000 L/hr o incluso >10000 L/hr. Los homogenizadores de alta capacidad adecuados están disponibles comercialmente.

Un homogenizador preferido proporciona una velocidad de cizallamiento entre 3xl05 y lxlO6 s"1, por ejemplo entre 3xl05 y 7xl05 s"1, entre 4xl05 y 6xl05 s"1, por ejemplo aproximadamente 5xl05 s"1.

Aunque los homogenizadores de rotor-estator generan relativamente poco calor durante la operación, el homogenizador puede ser enfriado durante el uso. Idealmente, la temperatura de la primera emulsión se mantiene debajo de 60 °C durante la homogenización, por ejemplo debajo de 45 °C.

En algunas modalidades, los componentes de la primera emulsión se pueden homogenizar múltiples veces (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o más veces) . Para evitar la necesidad de una larga serie de envases y homogenizadores , en su lugar los componentes de emulsión pueden hacerse circular (por ejemplo como se muestra por la característica (11) en la Figura 1) . En particular, la primera emulsión se puede formar al hacer circular los componentes de la primera emulsión a través de un homogenizador una pluralidad de veces (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 veces, etcétera) . Sin embargo, pueden ser indeseables demasiados ciclos ya que pueden producir una re-coalescencia como se describe en la referencia 14. De esta manera, el tamaño de las gotitas de aceite se puede supervisar si la circulación del homog'enizador se utiliza para verificar que se alcance un tamaño de gotita deseado y/o que no esté ocurriendo una re-coalescencia.

La circulación a través del homogenizador es ventajosa debido a que puede reducir el tamaño promedio de las gotitas de aceite en la primera emulsión. La circulación también es ventajosa debido a que puede reducir el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µ?? en la primera emulsión. Estas reducciones en el tamaño promedio de las gotitas y el número de gotitas >1.2 µt? en la primera emulsión pueden proporcionar ventajas en el (los) proceso (s) corriente abajo. En particular, la circulación de los componentes de la primera emulsión a través del homogenizador puede conducir a un proceso de microfluidización mejorado el cual entonces puede dar por resultado un número reducido de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp? en la segunda emulsión, es decir después de la microfluidización . Este mejoramiento en los parámetros de la segunda emulsión puede proporcionar un desempeño de filtración mejorado. El desempeño de filtración mejorado puede conducir a menos pérdidas de contenido durante la filtración, por ejemplo pérdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85 cuando la emulsión de aceite en agua es MF59.

Dos tipos particulares de circulación son referidos en este documento como "tipo I"" y "tipo II". La circulación tipo I se ilustra en la Figura 5, mientras que la circulación tipo II se ilustra en la Figura 6.

La circulación de los componentes de la primera emulsión puede comprender una circulación tipo I de transferencia de los componentes de la primera emulsión entre un primer envase de premezclado y un homogenizador. El primer envase de premezclado puede tener un tamaño de 50 a 500 L por ejemplo de 100 a 400 L, de 100 a 300 L, de 200 a 300 L, de 250 L o 280 L. El primer envase de premezclado se puede manufacturar de acero inoxidable. La circulación tipo I se puede continuar durante 10 a 60 minutos, por ejemplo durante 10 a 40 minutos o 20 minutos.

La circulación de los componentes de la primera emulsión puede comprender una circulación tipo II de transferencia de los componentes de la primera emulsión desde un primer envase de premezclado, a través de un primer homogenizador hasta un segundo envase de premezclado (que tiene opcionalmente las mismas propiedades que el primer envase de premezclado) y luego a través de un segundo homogenizador. El segundo homogenizador será usualmente el mismo que el primer homogenizador, pero en algunas disposiciones el primer homogenizador y el segundo homogenizador son diferentes. Después de la pasada de los componentes de la primera emulsión a través del segundo homogenizador, los componentes de la primera emulsión pueden ser transferidos nuevamente al primer envase de premezclado, por ejemplo si el proceso de circulación tipo II se debe repetir. De esta manera, los componentes de la emulsión pueden viajar en una figura de ruta en forma de ocho entre el primer envase de premezclado y el segundo envase de premezclado por vía de un homogenizador individual (véase la Figura 6) . La circulación tipo II se puede llevar a cabo una sola vez o una pluralidad de veces, por ejemplo 2, 3, 4, 5 veces, etcétera.

La circulación tipo II es ventajosa, en comparación con la circulación tipo I, debido a que puede ayudar a asegurar que todos los componentes de la primera emulsión pasen a través del homogenizador. La evacuación del primer envase de premezclado significa que el contenido completo de la emulsión ha pasado a través del homogenizador, dentro del segundo envase de premezclado. Similarmente, el contenido del segundo envase de premezclado puede ser evacuado, asegurando nuevamente que todo pase a través del homogenizador. De esta manera, la disposición tipo II puede asegurar convenientemente que todos los componentes de la emulsión sean homogenizados por lo menos dos veces, lo cual puede reducir tanto el tamaño promedio de las gotitas de aceite como el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp? en la primera emulsión. Una circulación tipo II ideal involucra de esta manera la evacuación del primer envase de premezclado y el paso sustancialmente de todo su contenido a través del homogenizador dentro del segundo envase de premezclado, seguido por la evacuación del segundo envase de premezclado y el paso de nuevo de sustancialmente todo su contenido a través del homogenizador nuevamente dentro del primer envase de premezclado (evacuado) . De esta manera, todas las partículas pasan a través del homogenizador por lo menos dos veces, mientras que es difícil lograr esto con la circulación tipo I.

En algunas modalidades, se utiliza una combinación de circulaciones tipo I y tipo II, y esta combinación puede proporcionar una primera emulsión con buenas características. En particular, esta combinación puede reducir en gran medida el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µ?? en la primera emulsión. Esta combinación puede comprender cualquier orden de circulación tipo I y II, por ejemplo, tipo I seguido por tipo II, tipo II seguido por tipo I, tipo I seguido por tipo II seguido por tipo I nuevamente, etcétera. En una modalidad, la combinación comprende 20 minutos de circulación tipo I seguida por una circulación individual tipo II, es decir la transferencia de los componentes circulados de la primera emulsión desde un primer envase de premezclado, a través de un primer homogenizador hasta un segundo envase de premezclado y luego a través de un segundo homogenizador una vez.

El primer envase de premezclado y el segundo envase de premezclado pueden mantenerse bajo un gas inerte, por ejemplo nitrógeno, por ejemplo hasta 0.5 bares. Esto puede impedir que los componentes de la emulsión se oxiden, lo cual es particularmente ventajoso si uno de los componentes de la emulsión es escualeno. Esto puede proporcionar un incremento en la estabilidad de la emulsión.

Como se mencionara anteriormente, la entrada inicial para el homogenizador puede ser una mezcla no homogenizada de los componentes de la primera emulsión. Esta mezcla se puede preparar al mezclar los componentes individuales de la primera emulsión por separado pero, en algunas modalidades, se pueden combinar múltiples componentes antes de este mezclado. Por ejemplo, si la emulsión incluye un tensioactivo con un HLB inferior a 10, entonces este tensioactivo se puede combinar con un aceite antes del mezclado. Similarmente, si la emulsión incluye un tensioactivo con un HLB superior a 10, entonces este tensioactivo se puede combinar con un componente acuoso antes del mezclado. Las sales amortiguadoras se pueden combinar con un componente acuoso antes del mezclado o se pueden agregar por separado.

Los métodos de la invención se pueden utilizar a gran escala. De esta manera, un método puede involucrar la preparación de una primera emulsión cuyo volumen es mayor que 1 litro por ejemplo >5 litros, >10 litros, >20 litros, >50 litros, >100 litros, >250 litros, etcétera.

Después de su formación, la primera emulsión puede ser microfluidizada o se puede almacenar para esperar la microfluidización.

En algunas modalidades, en particular aquellas donde se utilizan múltiples ciclos de los pasos (i) y (ii) , la entrada para el homogenizador será la salida de un microfluidizador, de tal manera que la primera emulsión es microfluidizada y luego se sujeta nuevamente a la homogenización.

Microfluidizacid? Después de su formación, la primera emulsión es microfluidizada con el propósito de reducir su tamaño promedio de gotitas de aceite y/o de reducir el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp?.

Los instrumentos de microfluidización reducen el tamaño promedio de gotitas de aceite al impulsar corrientes de componentes de entrada a través de canales geométricamente fijos a alta presión y alta velocidad. La presión en la entrada a la cámara de interacción (también llamada la "primera presión") puede ser sustancialmente constante (es decir ±15%; por ejemplo ±10%, ±5%, ±2%) durante por lo menos 85% del tiempo durante el cual los componentes son alimentados dentro del microfluidizador, por ejemplo por lo menos 87%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% o 100% del tiempo durante el cual la emulsión es alimentada dentro del microfluidizador .

En una modalidad, la primera presión es 1300 bares + 15% (18 kPSI ± 15%) , es decir entre 1100 bares y 1500 bares (entre 15 kPSI y 21 kPSI) durante 85% del tiempo durante el cual la emulsión es alimentada dentro del microfluidizador . Dos perfiles de presión adecuados se muestran en la Figura 3A-3B. En la Figura 3A, la presión es sustancialmente constante durante por lo menos 85% del tiempo, mientras que en la Figura 3B la presión permanece sin interrupción sustancialraente constante.

Un aparato de microfluidización comprende típicamente por lo menos una bomba intensificadora (preferiblemente dos bombas, las cuales pueden ser sincrónicas) y una cámara de interacción. La bomba intensificadora, la cual es impulsada idealmente de manera eléctrica-hidráulica, proporciona una alta presión (es decir la primera presión) para forzar una emulsión dentro y a través de la cámara de interacción. El carácter sincrónico de las bombas intensificadoras puede utilizarse para proporcionar la presión sustancialmente constante de la emulsión planteada anteriormente, lo cual significa que todas las gotitas de la emulsión son expuestas a sustancialmente el mismo nivel de esfuerzos de cizallamiento durante la microfluidización.

Una ventaja del uso de una presión sustancialmente constante es que puede reducir las fallas por fatiga en el dispositivo de microfluidización, lo cual puede conducir a una vida más prolongada del dispositivo. Una ventaja adicional del uso de una presión sustancialmente constante es que los parámetros de la segunda emulsión se pueden mejorar. En particular, el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µ?a presentes en la segunda emulsión se puede reducir. Adicionalmente , el tamaño promedio de gotitas de aceite de la segunda emulsión se puede reducir cuando se utiliza una presión sustancialraente constante. La reducción en el tamaño promedio de gotitas de aceite y en el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp? en la segunda emulsión puede proporcionar un desempeño de filtración mejorado. El desempeño de filtración mejorado puede conducir a menos pérdidas de contenido durante la filtración, por ejemplo pérdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85 cuando la emulsión es MF59.

La cámara de interacción puede contener una pluralidad, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etcétera, de canales de geometría fija dentro de los cuales pasa la emulsión. La emulsión entra a la cámara de interacción a través de una línea de entrada la cual puede tener un diámetro entre 200 y 250 µp? La emulsión se divide en corrientes conforme entra a la cámara de interacción y, bajo alta presión, acelera a una alta velocidad. Conforme pasa a través de los canales, las fuerzas producidas por la alta presión pueden actuar para reducir el tamaño de las gotitas de aceite de la emulsión y para reducir el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp?. Estas fuerzas pueden incluir: esfuerzos de cizallamiento, a través de la deformación de la corriente de emulsión que ocurre a partir del contacto con las paredes de los canales; fuerzas de impacto, a través de colisiones que ocurren cuando las corrientes de emulsión a alta velocidad colisionan entre sí; y fuerzas de cavitación, a través de la formación y el colapso de cavidades dentro de la corriente . La cámara de interacción no incluye usualmente partes móviles. Puede incluir superficies de canales de cerámica (por ejemplo alúmina) o diamante (por ejemplo diamante policristalino) . Otras superficies se pueden hacer de acero inoxidable.

La geometría fija de la pluralidad de canales en la cámara de interacción puede ser una geometría tipo "Y" o una geometría tipo "Z" .

En una cámara de interacción de geometría tipo Y, una corriente de emulsión de entrada individual se divide en una primera corriente de emulsión y una segunda corriente de emulsión, las cuales luego se combinan de nuevo en una corriente de emulsión de salida individual. Antes de la combinación de nuevo, cada una de la primera corriente de emulsión y la segunda corriente de emulsión pueden dividirse independientemente en una primera pluralidad y una segunda pluralidad (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etcétera) de sub-corrientes . Cuando las corrientes de emulsión se combinan de nuevo, la primera corriente de emulsión y la segunda corriente de emulsión (o sus sub-corrientes) están fluyendo idealmente en direcciones sustancialmente opuestas (por ejemplo la primera corriente de emulsión y la segunda corriente de emulsión, o sus sub-corrientes, están fluyendo en sustancialmente el mismo plano (± 20°) y la dirección de flujo de la primera corriente de emulsión es 180 ± 20° diferente de la dirección de flujo de la segunda corriente de emulsión) . Las fuerzas producidas cuando las corrientes de emulsión se combinan de nuevo pueden actuar para reducir el tamaño de las gotitas de aceite de la emulsión y para reducir el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µt?.

En una cámara de interacción de geometría tipo Z, la corriente de emulsión pasa alrededor de una pluralidad (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etcétera) de esquinas de ángulo sustancialmente recto (es decir 90 ± 20°) . La figura 4 ilustra una cámara de interacción con una geometría tipo Z y dos esquinas de ángulo recto en la dirección de flujo. Durante su paso alrededor de las esquinas, una corriente de emulsión de entrada puede dividirse en una pluralidad (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etcétera) de sub-corrientes y luego pueden combinarse de nuevo en una corriente de emulsión de salida individual (por ejemplo como se muestra en la Figura 4, con cuatro sub-corrientes (32) ) . La división y luego la combinación de nuevo (31) pueden ocurrir en cualquier punto entre la entrada y la salida. Las fuerzas producidas cuando la emulsión hace contacto con las paredes de los canales conforme pasa alrededor de las esquinas pueden actuar para reducir el tamaño de las gotitas de aceite de la emulsión y para reducir el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp?.

Un ejemplo de una cámara de interacción tipo Z es la cámara de interacción E230Z de icrofluidics .

En una modalidad, la corriente de emulsión pasa alrededor de dos esquinas de ángulo sustancialmente recto. En el punto cuando la corriente de emulsión de entrada pasa alrededor de la primera esquina de ángulo sustancialmente recto, se divide en cinco sub-corrientes . En el punto cuando las sub-corrientes pasan alrededor de la segunda esquina de ángulo sustancialmente recto, se combinan de nuevo en una corriente de emulsión de salida individual.

En la técnica anterior, ha sido usual utilizar cámaras de interacción tipo Y para emulsiones de aceite en agua como aquellas de la presente invención. Sin embargo, se ha descubierto que es ventajoso utilizar una cámara de interacción de geometría de canales tipo Z para emulsiones de aceite en agua debido a que esto puede conducir a una mayor reducción en el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp? presentes en la segunda emulsión en comparación con una cámara de interacción de geometría tipo Y. La reducción en el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µt? en la segunda emulsión puede proporcionar un desempeño de filtración mejorado. El desempeño de filtración mejorado puede conducir a menos pérdidas de contenido durante la filtración, por ejemplo pérdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85 cuando la emulsión es MF59.

Un aparato de microfluidización preferido opera a una presión entre 170 bares y 2750 bares (de aproximadamente 2500 psi a 40000 psi) por ejemplo a aproximadamente 345 bares, aproximadamente 690 bares, aproximadamente 1380 bares, aproximadamente 2070 bares, etcétera.

Un aparato de microfluidización preferido opera a un caudal de hasta 20 L/minuto por ejemplo hasta 14 L/minuto, hasta 7 L/minuto, hasta 3.5 L/minuto, etcétera.

Un aparato de microfluidización preferido tiene una cámara de interacción que proporciona una velocidad de cizallamiento en exceso de lxl06s"1 por ejemplo >2.5xl06s"1, >5xl06s"1, >l07s"1/ etcétera.

Un aparato de microfluidización puede incluir múltiples cámaras de interacción que se utilizan en paralelo por ejemplo 2, 3, 4, 5 o más, pero es más útil incluir una cámara de interacción individual.

El dispositivo de microfluidización puede comprender un módulo de procesamiento auxiliar (APM, por sus siglas en inglés; también conocido en los microfluidizadores como una cámara de contrapresión - estos términos se utilizan de manera intercambiable en este documento) que comprende por lo menos un canal. El APM contribuye a la reducción en el tamaño promedio de las gotitas de aceite en la emulsión que son pasadas a través del dispositivo de microfluidización, aunque la mayor parte de la reducción ocurre en la cámara de interacción. Como se mencionara anteriormente, los componentes de la emulsión son introducidos a la cámara de interacción por la(s) bomba (s) intensificadora (s) bajo una primera presión. Los componentes de la emulsión salen generalmente del APM a una segunda presión la cual es más baja que la primera presión (por ejemplo a presión atmosférica) . En general, entre 80 y 95% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través de la cámara de interacción (por ejemplo de Pi a P2 en la Figura 4) y de 5 a 20% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través del módulo de procesamiento auxiliar, por ejemplo la cámara de interacción puede proporcionar aproximadamente 90% de la disminución de presión mientras que el APM puede proporcionar aproximadamente 10% de la disminución de presión. Si la presión disminuida a través de la cámara de interacción y la presión disminuida a través del módulo de procesamiento auxiliar no constituyen la totalidad de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión, esto puede ser debido a una disminución de presión limitada a través de los conectores entre la cámara de interacción y el módulo de procesamiento auxiliar.

El APM no incluye usualmente partes móviles. Puede incluir superficies de canales de cerámica (por ejemplo alúmina) o diamante (por ejemplo diamante policristalino) .

Otras superficies se pueden hacer de acero inoxidable.

El APM se coloca generalmente corriente abajo de la cámara de interacción y también se puede colocar de manera secuencial a la cámara de interacción. En la técnica anterior, los APMs se colocan generalmente corriente abajo de las cámaras de interacción que comprenden canales tipo Y para suprimir la cavitación e incrementar de ese modo el caudal en la cámara tipo Y por hasta 30%. Adicionalmente, en la técnica anterior los APMs se colocan generalmente corriente arriba de las cámaras de interacción que comprenden canales tipo Z para reducir el tamaño de los aglomerados grandes. En este último caso, el APM solo disminuye el caudal en las cámaras tipo Z por hasta 3%. Sin embargo, se ha descubierto que la colocación del APM corriente abajo de una cámara de interacción que comprende una pluralidad de canales tipo Z es ventajosa en la presente invención debido a que puede conducir a una mayor reducción en el tamaño promedio de gotitas de aceite y una reducción más grande en el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp? presentes en la segunda emulsión. Como se planteara anteriormente, la reducción en el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp? en la segunda emulsión puede proporcionar un desempeño de filtración mejorado. El desempeño de filtración mejorado puede conducir a menos pérdidas de contenido durante la filtración, por ejemplo pérdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85 cuando la emulsión de aceite en agua es MF59. Una ventaja adicional de esta colocación de una cámara de interacción tipo Z y un APM corriente abajo es que puede conducir a una disminución de presión más lenta después de la cámara de interacción. La disminución de presión más lenta puede conducir a un incremento en la estabilidad del producto debido a que hay menos gas encerrado en la emulsión.

Un APM contiene por lo menos un canal de geometría fija en el cual pasa la emulsión. El APM puede contener una pluralidad por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etcétera, de canales de geometría fija en los cuales pasa la emulsión. El canal o los canales del APM pueden ser lineales o no lineales. Los canales no lineales adecuados son de geometría tipo "Z" o de geometría tipo "Y" , las cuales son las mismas que aquellas descritas anteriormente para la cámara de interacción. En una modalidad, el canal, o los canales, del APM son de geometría tipo Z. Una pluralidad de canales tipo Z divide la emulsión en corrientes conforme entra al APM.

En contraste a las recomendaciones del fabricante, el uso de un APM que comprende una pluralidad de canales de geometría fija es ventajoso en comparación con un APM de canales de geometría fija individual debido a que puede conducir a una reducción mayor en el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µ?? presentes en la segunda emulsión. Como se planteara anteriormente, la reducción en el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µ?? en la segunda emulsión puede proporcionar un desempeño de filtración mejorado. El desempeño de filtración mejorado puede conducir a menos pérdidas de contenido durante la filtración, por ejemplo pérdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85 cuando la emulsión de aceite en agua es MF59.

Un aparato de microfluidización genera calor durante la operación, lo cual puede elevar la temperatura de una emulsión por 15-20 °C en relación con la primera emulsión. Ventajosamente, por lo tanto, la emulsión microfluidizada se enfría tan pronto como sea posible. La temperatura de la segunda emulsión puede mantenerse debajo de 60°C, por ejemplo debajo de 45°C. De esta manera, una salida de la cámara de interacción y/o una salida de APM pueden alimentar dentro de un mecanismo de enfriamiento, tal como un intercambiador de calor o un serpentín de enfriamiento. La distancia entre la salida y el mecanismo de enfriamiento debe mantenerse tan corta como sea posible para acortar el tiempo total al reducir los retardos de enfriamiento. En una modalidad, la distancia entre la salida del microfluidizador y el mecanismo de enfriamiento es entre 20-30 cm. Un mecanismo de enfriamiento es particularmente útil cuando una emulsión se sujeta a múltiples pasos de microfluidización, para impedir el sobrecalentamiento de la emulsión.

El resultado de la microfluidización es una emulsión de aceite en agua, la segunda emulsión, en la cual el tamaño promedio de las gotitas de aceite es 500 nm o menos. El tamaño promedio es particularmente útil ya que facilita la esterilización de la emulsión a través de un filtro. Las emulsiones en las cuales por lo menos 80% en número de las gotitas de aceite tienen un tamaño promedio de 500 nm o menos, por ejemplo 400 nm o menos, 300 nm o menos, 200 nm o menos o 165 nm o menos, son particularmente útiles. Adicionalmente , el número de gotitas de aceite en la segunda emulsión que tienen un tamaño >1.2 µ?? es 5 x 1010/ml o menos, por ejemplo 5 x 109/ml o menos, 5 x 108/ml o menos o 2 x 108/ml o menos.

La entrada inicial para la microfluidización puede ser la primera emulsión. En algunas modalidades, sin embargo, la emulsión microfluidizada se sujeta nuevamente a una microfluidización, de tal manera que ocurren múltiples corridas de microfluidización . En particular, la segunda emulsión se puede formar al hacer circular los componentes de la segunda emulsión a través de un dispositivo de microfluidización una pluralidad de veces, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces, etcétera. La segunda emulsión se puede formar al hacer circular los componentes de la segunda emulsión a través de un dispositivo de microfluidización de 4 a 7 veces.

La circulación de los componentes de la segunda emulsión puede comprender una circulación tipo I de transferencia de los componentes de la segunda emulsión entre un primer envase de emulsión (que tiene opcionalmente las mismas propiedades que el primer envase de premezclado) y el dispositivo de microfluidización.

La circulación de los componentes de la segunda emulsión segundo puede comprender una circulación tipo II de transferencia de los componentes de la segunda emulsión desde un primer envase de emulsión, a través de un primer dispositivo de microfluidización hasta un segundo envase de emulsión (que tiene opcionalmente las mismas propiedades que el primer envase de premezclado) y luego a través de un segundo dispositivo de microfluidización.

El segundo dispositivo de microfluidización puede ser el mismo que el primer dispositivo de microfluidización. Alternativamente, el segundo dispositivo de microfluidización puede ser diferente del primer dispositivo de microfluidización.

El primer envase de emulsión puede ser el mismo que el primer envase de premezclado. Alternativamente, el primer envase de emulsión puede ser el mismo que el segundo envase de premezclado.

El segundo envase de emulsión puede ser el mismo que el primer envase de premezclado. Alternativamente, el segundo envase de emulsión puede ser el mismo que el segundo envase de premezclado.

El primer envase de emulsión puede ser el mismo que el primer envase de premezclado y el segundo envase de emulsión puede ser el mismo que el segundo envase de premezclado. Alternativamente, el primer envase de emulsión puede ser el mismo que el segundo envase de premezclado y el segundo envase de emulsión puede ser el mismo que el primer envase de premezclado.

Como una alternativa, el primer envase de emulsión y el segundo envase de emulsión pueden ser diferentes del primer envase de premezclado y el segundo envase de premezclado .

Después de la pasada de los componentes de la segunda emulsión a través del segundo dispositivo de microfluidización, los componentes de la segunda emulsión pueden ser transferidos nuevamente al primer envase de emulsión, por ejemplo si se debe repetir el proceso de circulación tipo II. La circulación tipo II se puede llevar a cabo una sola vez o una pluralidad de veces, por ejemplo 2, 3, 4, 5 veces, etcétera.

La circulación tipo II es ventajosa ya que asegura que todos los componentes de la segunda emulsión hayan pasado a través del dispositivo de microfluidización por lo menos 2 veces, lo cual reduce el tamaño promedio de las gotitas de aceite y el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µt? en la segunda emulsión.

Una combinación de la circulación tipo I y la circulación tipo II se puede utilizar durante la microfluidización . Esta combinación puede comprender cualquier orden de circulación tipo I y II, por ejemplo tipo I seguido por tipo II, tipo II seguido por tipo I, tipo I seguido por tipo II seguido por tipo I nuevamente, etcétera.

El primer envase de emulsión y el segundo envase de emulsión pueden mantenerse bajo un gas inerte, por ejemplo hasta 0.5 bareses de nitrógeno. Esto impide que los componentes de la emulsión se oxiden, lo cual es particularmente ventajoso si uno de los componentes de la emulsión es escualeno. Esto conduce a un incremento en la estabilidad de la emulsión.

Los métodos de la invención se pueden utilizar a gran escala. De esta manera, un método puede involucrar la microfluidización de un volumen mayor que 1 litro por ejemplo >5 litros, >10 litros, >20 litros, >50 litros, >100 litros, >250 litros, etcétera.

Filtración Después de la microfluidización, la segunda emulsión se filtra. Esta filtración retira cualquier gotita de aceite grande que haya sobrevivido a los procedimientos de homogenización y microfluidización . Aunque pequeñas en términos numéricos, estas gotitas de aceite pueden ser grandes en términos volumétricos y pueden actuar como sitios de nucleación para la agregación, lo que conduce a la degradación de la emulsión durante el almacenamiento. Por otra parte, este paso de filtración puede lograr la esterilización con filtro.

La membrana de filtración particular que es adecuada para la esterilización con filtro depende de las características del fluido de la segunda emulsión y el grado de filtración requerido. Las características de un filtro pueden afectar su idoneidad para la filtración de la emulsión microfluidizada. Por ejemplo, su tamaño de poro y características de la superficie pueden ser importantes, particularmente cuando se filtra una emulsión basada en escualeno .

El tamaño de poro de las membranas utilizadas con la invención debe permitir el paso de las gotitas deseadas mientras que retiene las gotitas indeseadas . Por ejemplo, debe retener gotitas que tienen un tamaño >1 µ?t? mientras que permite el paso de gotitas <200 nm. Un filtro de 0.2 µp? o 0.22 µ?t? es ideal y también puede lograr la esterilización con filtro.

La emulsión puede ser filtrada previamente por ejemplo a través de un filtro de 0.45 µt?. La filtración previa y la filtración se pueden lograr en un paso por medio del uso de filtros de doble capa conocidos que incluyen una primera capa de membrana con poros más grandes y una segunda capa de membrana con poros más pequeños. Los filtros de doble capa son particularmente útiles con la invención. La primera capa tiene idealmente un tamaño de poro >0.3 µp?, tal como entre 0.3-2 µp? o entre 0.3-1 µp?, o entre 0.4-0.8 µp, o entre 0.5-0.7 µt?. Se prefiere un tamaño de poro de <0.75 µp? en la primera capa. De esta manera, la primera capa puede tener un tamaño de poro de 0.6 µ?? o 0.45 µp?, por ejemplo. La segunda capa tiene idealmente un tamaño de poro el cual es menor que 75% de (e idealmente menos de la mitad de) el tamaño de poro de la primera capa, tal como entre 25-70% o entre 25-49% del tamaño de poro de la primera capa por ejemplo entre 30-45%, tal como 1/3 o 4/9, del tamaño de poro de la primera capa. De esta manera, la segunda capa puede tener un tamaño de poro <0.3 µp?, tal como entre 0.15-0.28 µ?t? o entre 0.18-0.24 µp? por ejemplo una segunda capa con un tamaño de poro de 0.2 µp? o 0.22 µt?. En un ejemplo, la primera capa de membrana con poros más grandes proporciona un filtro de 0.45 µp?, mientras que la segunda capa de membrana con poros más pequeños proporciona un filtro de 0.22 µp?.

La membrana de filtración y/o la membrana de filtración previa pueden ser asimétricas. Una membrana asimétrica es una en la cual el tamaño de poro varia de un lado de la membrana al otro lado por ejemplo en el cual el tamaño de poro es más grande en la cara de entrada que en la cara de salida. Un lado de la membrana asimétrica puede ser referido como la "superficie con poros gruesos", mientras que el otro lado de la membrana asimétrica puede ser referido como la "superficie con poros finos" . En un filtro de doble capa, una o (idealmente) ambas capas pueden ser asimétricas.

La membrana de filtración puede ser porosa u homogénea. Una membrana homogénea es usualmente una película densa que varía de 10 a 200 µp?. Una membrana porosa tiene una estructura porosa. En una modalidad, la membrana de filtración es porosa. En un filtro de doble capa, ambas capas pueden ser porosas, ambas capas pueden ser homogéneas o puede haber una capa porosa y una capa homogénea. Un filtro de doble capa preferido es uno en el cual ambas capas son porosas .

En una modalidad, la segunda emulsión se filtra previamente a través de una membrana porosa, hidrófila, asimétrica y luego se filtra a través de otra membrana porosa, hidrófila, asimétrica que tiene poros más pequeños que la membrana de filtración previa. Esto puede utilizar un filtro de doble capa.

La(s) membrana (s) de filtro puede (n) ser tratada (s) en autoclave antes del uso para asegurar que esté (n) estéril (es ) .

Las membranas de filtración se hacen típicamente de materiales de soporte poliméricos tales como PTFE (poli-tetra- fluoro-etileno) , PES (polietersulfona) , PVP (polivinilpirrolidona) , PVDF (fluoruro de polivinilideno) , nailons (poliamidas) , PP (polipropileno) , celulosas (inclusive esteres de celulosa) , PEEK (polieteretercetona) , nitrocelulosa, etcétera. Estos tienen características variantes, en donde algunos soportes son intrínsecamente hidrófobos (por ejemplo PTFE) y otros son intrínsecamente hidrófilos (por ejemplo acetatos de celulosa) . Sin embargo, estas características intrínsecas pueden modificarse por medio del tratamiento de la superficie de la membrana. Por ejemplo, se sabe preparar membranas hidrofilizadas o hidrofobizadas al tratarlas con otros materiales (tal como otros polímeros, grafito, silicón, etcétera) para revestir la superficie de la membrana por ejemplo véase la sección 2.1 de la referencia 15. En un filtro de doble capa, las dos membranas se pueden hacer de diferentes materiales o (idealmente) del mismo material.

Un filtro ideal para el uso con la invención tiene una superficie hidrófila, en contraste a la enseñanza de las referencias 9-12 en las cuales se deben utilizar filtros hidrófobos (polisulfona) . Los filtros con superficies hidrófilas se pueden formar a partir de materiales hidrófilos o por medio de la hidrofilización de materiales hidrófobos y un filtro preferido para el uso con la invención es una membrana hidrófila de polietersulfona. Se conocen varios métodos diferentes para transformar membranas hidrófobas de PES en membranas hidrófilas de PES. Se logra frecuentemente al revestir la membrana con un polímero hidrófilo. Para proporcionar una unión permanente del polímero hidrófilo al PES, una capa hidrófila de recubrimiento se sujeta usualmente ya sea a una reacción de reticulación o al injerto. La referencia 15 da a conocer un proceso para modificar las propiedades de la superficie de un polímero hidrófilo que tiene extremos de cadena funcionalizables , que comprende poner en contacto el polímero con una solución de una porción conectora para formar una conexión covalente y luego poner en contacto el polímero hidrófobo hecho reaccionar con una solución de un agente modificador. La referencia 16 da a conocer un método de hidrofilización de membranas de PES por medio del recubrimiento directo de las membranas, que involucra humedecer previamente con alcohol y luego remojar en una solución acuosa que contiene un monómero hidrófilo, un monómero polifuncional (reticulador) y un iniciador de polimerización. El monómero y el reticulador luego se polimerizan utilizando una polimerización iniciada térmicamente o con luz UV para formar un recubrimiento de polímero hidrófilo, reticulado sobre la superficie de la membrana. Similarmente , las referencias 17 y 18 dan a conocer el recubrimiento de una membrana de PES al remojarla en una solución acuosa de polímero hidrófilo (óxido de polialquileno) y por lo menos un monómero polifuncional (reticulador) y luego polimerizar un monómero para proporcionar un recubrimiento hidrófilo no extraíble. La referencia 19 describe la hidrofilización de una membrana de PES por medio de una reacción de injerto en la cual una membrana de PES se sujeta a un tratamiento de plasma de helio a baja temperatura seguido por el injerto del monómero hidrófilo N-vinil-2-pirrolidona ( VP) sobre la superficie de la membrana. Además, estos procesos se dan a conocer en las referencias 20 a 26.

En los métodos que no dependen del recubrimiento, la PES se puede disolver en un solvente, se puede combinar con un aditivo hidrófilo soluble y luego la solución combinada se utiliza para moldear una membrana hidrófila por ejemplo por medio de la precipitación o al iniciar la co-polimerización . Estos métodos se dan a conocer en las referencias 27 a 33. Por ejemplo, la referencia 33 da a conocer un método para preparar una membrana hidrófila modificada por cargas que tiene bajos materiales extraíbles de la membrana y permite una rápida recuperación de resistividad de agua ultrapura, que tiene una estructura de red polimérica inter-penetrante reticulada que se forma al hacer una solución polimérica de una combinación de PES, PVP, polietilenimina y éter diglicidílico alifático, formar una película delgada de la solución y precipitar la película como una membrana. Un proceso similar se da a conocer en la referencia 34.

Se pueden utilizar planteamientos híbridos, en los cuales los aditivos hidrófilos están presentes durante la formación de la membrana y también se agregan posteriormente como un recubrimiento por ejemplo véase la referencia 35.

La hidrofilización de la membrana de PES también se puede lograr por medio del tratamiento con plasmas a baja temperatura. La referencia 36 describe la modificación hidrófila de una membrana de PES por medio del tratamiento con plasma de C02 a baja temperatura.

La hidrofilización de una membrana de PES también se puede lograr por medio de la oxidación, como se describe en la referencia 37. Este método involucra el humedecimiento previo de una membrana hidrófoba de PES en un líquido que tiene una baja tensión superficial, la exposición de la membrana húmeda de PES a una solución acuosa de oxidante y luego el calentamiento.

La inversión de fases también se puede utilizar, como se describe en la referencia 38.

Una membrana hidrófila de PES ideal se puede obtener por medio del tratamiento de PES (hidrófoba) con PVP (hidrófila) . Se ha descubierto que el tratamiento con PEG (hidrófilo) en lugar de PVP proporciona una membrana hidrofilizada de PES que se contamina fácilmente (particularmente cuando se utiliza una emulsión que contiene escualeno) y también libera desventajosamente formaldehído durante el tratamiento en autoclave.

Un filtro de doble capa preferido tiene una primera membrana hidrófila de PES y una segunda membrana hidrófila de PES.

Las membranas hidrófilas conocidas incluyen BioassureMR (de Cuno) ; polietersulfona EverLUXMR; polietersulfona STyLUXMR (ambas de Meissner) ; membranas Millex GVMR, Millex HPMR, Millipak 60MR, Millipak 200MR y Durapore CVGL01TP3 (de Millipore) ; Membrana Fluorodyne EX EDFMR, Supor EAVMR; Supor EBV"1, Supor EKVMR (todos de Pall) ; SartoporeR (de Sartorius) ; membrana hidrófila de PES de Sterlitech; y membrana de PES FPESMR de olftechnik.

Durante la filtración, la emulsión se puede mantener a una temperatura de 40 °C o menos, por ejemplo 30 °C o menos, para facilitar la filtración estéril exitosa. Algunas emulsiones no pueden pasar a través de un filtro estéril cuando están a una temperatura mayor que 40°C.

Es ventajoso llevar a cabo el paso de filtración dentro de 24 horas, por ejemplo dentro de 18 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 2 horas, dentro de 30 minutos, para producir la segunda emulsión debido a que después de este tiempo no puede ser posible que la segunda emulsión pase a través del filtro estéril sin obstruir el filtro, como se plantea en la referencia 39.

Los métodos de la invención se pueden utilizar a gran escala. De esta manera, un método puede involucrar la filtración de un volumen mayor que 1 litro por ejemplo >5 litros, >10 litros, >20 litros, >50 litros, >100 litros, >250 litros, etcétera.

La emulsión final El resultado de la microfluidización y la filtración es una emulsión de aceite en agua en la cual el tamaño promedio de las gotitas de aceite puede ser menor que 220 nm, por ejemplo 155 ± 20 nm, 155 + 10 nm o 155 + 5 nm, y en la cual el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µp? puede ser 5 x 108/ml o menos, por ejemplo 5 x 107/ml o menos, 5 x 106/ml o menos, 2 x 106/ml o menos o 5 x 105/ml o menos.

El tamaño promedio de las gotitas de aceite de las emulsiones descritas en este documento (incluyendo la primera emulsión y la segunda emulsión) no es generalmente menor que 50 nm.

Los métodos de la invención se pueden utilizar a gran escala. De esta manera, un método puede involucrar la preparación de una emulsión final con un volumen mayor que 1 litro por ejemplo >5 litros, >10 litros, >20 litros, >50 litros, >100 litros, >250 litros, etcétera.

Una vez que se ha formado la emulsión de aceite en agua, se puede transferir dentro de botellas estériles de vidrio. Las botellas de vidrio pueden tener un tamaño de 5 L, 8 L o 10 L. Alternativamente, la emulsión de aceite en agua puede transferirse dentro de una bolsa flexible, estéril (bolsa flexible) . La bolsa flexible puede tener un tamaño de 50 L, 100 L o 250 L. Además, la bolsa flexible puede estar equipada con uno o más conectores estériles para la conexión de la bolsa flexible al sistema. El uso de una bolsa flexible con conectores estériles es ventajoso en comparación con las botellas de vidrio debido a que la bolsa flexible es más grande que las botellas de vidrio lo que significa que puede no ser necesario cambiar la bolsa flexible para almacenar toda la emulsión manufacturada en un lote individual. Esto puede proporcionar un sistema cerrado, estéril para la manufactura de la emulsión el cual puede reducir la probabilidad de que estén presentes impurezas en la emulsión final. Esto puede ser particularmente importante si la emulsión final se utiliza para propósitos farmacéuticos, por ejemplo si la emulsión final es el adyuvante MF59.

Las cantidades preferidas de aceite (% en volumen) en la emulsión final están entre 2-20% por ejemplo aproximadamente 10%. Un contenido de escualeno de aproximadamente 5% o aproximadamente 10% es particularmente útil. Un contenido de escualeno (p/v) de entre 30-50 mg/ml es útil por ejemplo entre 35-45 mg/ml, 36-42 mg/ml, 38-40 mg/ml, etcétera.

Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) en la emulsión final son: ésteres de polioxietilen-sorbitán (tal como Tween 80) de 0.02 a 2%, en particular aproximadamente 0.5% o aproximadamente 1%; ésteres de sorbitán (tal como Span 85) de 0.02 a 2%, en particular aproximadamente 0.5% o aproximadamente 1%; octil- o nonilfenoxi-polioxietanoles (tal como Tritón X-100) de 0.001 a 0.1%, en particular de 0.005 a 0.02%; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) de 0.1 a 20%, preferiblemente de 0.1 a 10% y en particular de 0.1 a 1% o aproximadamente 0.5%. Un contenido de polisorbato 80 (p/v) de entre 4-6 mg/ml es útil por ejemplo entre 4.1-5.3 mg/ml. Un contenido de trioleato de sorbitán (p/v) de entre 4-6 mg/ml es útil por ejemplo entre 4.1-5.3 mg/ml.

El proceso es particularmente útil para preparar cualquiera de las siguientes emulsiones de aceite en agua: • Una emulsión que comprende escualeno, polisorbato 80 (Tween 80) y trioleato de sorbitán (Span 85) . La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente 5% de escualeno, aproximadamente 0.5% de polisorbato 80 y aproximadamente 0.5% de trioleato de sorbitán. En términos de peso, estas cantidades se vuelven 4.3% de escualeno, 0.5% de polisorbato 80 y 0.48% de trioleato de sorbitán. Este adyuvante se conoce como «MF59" . La emulsión de MF59 incluye ventajosamente iones de citrato por ejemplo un amortiguador de citrato de sodio 10 mM.

Emulsiones que comprenden escualeno, un a-tocoferol (idealmente DL-a-tocoferol) y polisorbato 80. Estas emulsiones pueden tener (en peso) de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10% de a-tocoferol y de 0.3 a 3% de polisorbato 80, por ejemplo 4.3% de escualeno, 4.7% de a-tocoferol, 1.9% de polisorbato 80. La relación en peso de escualeno : tocoferol es preferiblemente <1 (por ejemplo 0.90) ya que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y el polisorbato 80 pueden estar presentes en una relación en volumen de aproximadamente 5:2 o en una relación en peso de aproximadamente 11:5. Una emulsión de este tipo se puede hacer al disolver polisorbato 80 en PBS para proporcionar una solución al 2%, luego mezclar 90 mi de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 mi de escualeno) , luego microfluidizar la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotitas de aceite submicrométricas por ejemplo con un tamaño entre 100 y 250 nm, preferiblemente de aproximadamente 180 nm.

Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente de Tritón (por ejemplo Tritón X-100) . La emulsión también puede incluir un lípido A de monofosforilo 3 -O-desacilado ("3d-MPL") . La emulsión puede contener un amortiguador de fosfato .

Una emulsión que comprende escualeno, un polisorbato (por ejemplo polisorbato 80) , un detergente de Tritón (por ejemplo Tritón X-100) y un tocoferol (por ejemplo un succinato de a-tocoferol) . La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación en masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo 750 µg/ml de polisorbato 80, 110 µg/ml de Tritón X-100 y 100 µg/ml de succinato de a-tocoferol) y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes de antígenos. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL. La emulsión también puede incluir una saponina, tal como QS21. La fase acuosa puede contener un amortiguador de fosfato .

Una emulsión que comprende escualeno, un solvente acuoso, un tensioactivo no iónico, hidrófilo de éter alquílico de polioxietileno (por ejemplo éter cetoestearílico de polioxietileno (12) ) y un tensioactivo no iónico, hidrófobo (por ejemplo, un éster de sorbitán o éster de manida, tal como monooleato de sorbitán o "Span 80") . La emulsión es preferiblemente termorreversible y/o tiene por lo menos 90% de las gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño menor que 200 nm [40] . La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltosida y/o sacarosa) ; y/o un alquilpoliglicósido . También puede incluir un agonista de TLR4 , tal como uno cuya estructura química no incluye un anillo de azúcar [41] . Estas emulsiones pueden ser liofilizadas.

Las composiciones de estas emulsiones, expresadas anteriormente en términos de porcentaje, se pueden modificar por medio de la dilución o concentración (por ejemplo, por un número entero, tal como 2 o 3 o por una fracción, tal como 2/3 o 3/4) en las cuales sus relaciones permanecen siendo las mismas. Por ejemplo, un MF59 concentrado 2 veces tendría aproximadamente 10% de escualeno, aproximadamente 1% de polisorbato 80 y aproximadamente 1% de trioleato de sorbitán. Las formas concentradas se pueden diluir (por ejemplo con una solución de antígeno) para proporcionar una concentración final, deseada de la emulsión.

Las emulsiones de la invención se almacenan idealmente entre 2°C y 8°C. No se deben congelar. Se deben mantener idealmente fuera de la luz directa. En particular, las emulsiones y vacunas que contienen escualeno de la invención se deben proteger para evitar la descomposición fotoquímica del escualeno. Si las emulsiones de la invención se almacenan, entonces esto se realiza preferiblemente en una atmósfera inerte, por ejemplo N2 o argón.

Vacunas Aunque es posible administrar adyuvantes de emulsión de aceite en agua por sí mismos a los pacientes (por ejemplo para proporcionar un efecto adyuvante para un antígeno que ha sido administrado por separado al paciente) , es más usual mezclar el adyuvante con un antígeno antes de la administración, para formar una composición inmunógena por ejemplo una vacuna. El mezclado de la emulsión y el antígeno puede tener lugar de manera extemporánea, al momento del uso o puede tener lugar durante la manufactura de la vacuna, antes del llenado. Los métodos de la invención se pueden aplicar en ambas situaciones.

De esta manera, un método de la invención puede incluir un paso de proceso adicional que consiste en mezclar la emulsión con un componente de antígeno. Como una alternativa, puede incluir un paso adicional que consiste en empacar el adyuvante en un kit como un componente de kit junto con un componente de antígeno.

En conjunto, por lo tanto, la invención se puede utilizar cuando se preparan vacunas mezcladas o cuando se preparan kits que incluyen un antígeno y un adyuvante listos para el mezclado. Donde el mezclado tiene lugar durante la manufactura, entonces los volúmenes de antígeno y emulsión a granel que se mezclan serán típicamente mayores que 1 litro por ejemplo >5 litros, >10 litros, >20 litros, >50 litros, >100 litros, >250 litros, etcétera. Donde el mezclado tiene lugar en el punto de uso entonces los volúmenes que se mezclan serán típicamente más pequeños que 1 mililitro por ejemplo <0.6ml, <0.5ml, <0.4ml, <0.3ml, <0.2ml, etcétera. En ambos casos, es usual que volúmenes sustancialmente iguales de emulsión y una solución de antígeno sean mezclados es decir sustancialmente 1:1 {por ejemplo entre 1.1:1 and 1:1.1, preferiblemente entre 1.05:1 y 1:1.05, y más preferiblemente entre 1.025:1 y 1:1.025). En algunas modalidades, sin embargo, se puede utilizar un exceso de emulsión o un exceso de antígeno [42] . Donde se utiliza un volumen en exceso de un componente, el exceso será generalmente por lo menos 1.5:1 por ejemplo >2:1, >2.5:1, >3:1, >4:1, >5:1, etcétera.

Donde el antígeno y el adyuvante se presentan como componentes separados dentro de un kit, se separan físicamente entre sí dentro del kit y esta separación se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, los componentes pueden estar en envases separados, tales como viales. El contenido de los dos viales entonces se puede mezclar cuando se necesario por ejemplo al retirar el contenido de un vial y agregarlo al otro vial o al retirar por separado el contenido de ambos viales y mezclarlo en un tercer envase.

En otra disposición, uno de los componentes del kit está en una jeringa y el otro está en un envase tal como un vial. La jeringa se puede utilizar (por ejemplo con una aguja) para insertar su contenido en el vial para el mezclado y la mezcla entonces se puede retirar dentro de la jeringa. El contenido mezclado de la jeringa entonces se puede administrar a un paciente, típicamente a través de una aguja estéril, nueva. El empaque de un componente en una jeringa elimina la necesidad de utilizar una jeringa separada para la administración al paciente.

En otra disposición preferida, los dos componentes del kit se mantienen juntos pero por separado en la misma jeringa por ejemplo una jeringa de doble cámara, tal como aquellas dadas a conocer en las referencias 43-50 etcétera. Cuando la jeringa se acciona (por ejemplo durante la administración a un paciente) entonces el contenido de las dos cámaras se mezcla. Esta disposición evita la necesidad de un paso separado de mezclado al momento del uso.

Todo el contenido de los diversos componentes del kit estará generalmente en forma líquida. En algunas disposiciones, un componente (típicamente el componente de antígeno en lugar del componente de emulsión) está en forma seca (por ejemplo en una forma liofilizada) , en donde el otro componente está en forma líquida. Los dos componentes se pueden mezclar con el propósito de reactivar el componente seco y proporcionar una composición líquida para la administración a un paciente. Un componente liofilizado estará localizado típicamente dentro de un vial en lugar de una jeringa. Los componentes secos pueden incluir estabilizadores tales como lactosa, sacarosa o manitol, así como también mezclas de los mismos, por ejemplo mezclas de lactosa/sacarosa, mezclas de sacarosa/manitol, etcétera. Una posible disposición utiliza un componente de emulsión líquido en una jeringa llenada previamente y un componente de antígeno liofilizado en un vial.

Si las vacunas contienen componentes además de una emulsión y un antígeno, entonces estos componentes adicionales se pueden incluir en uno de estos dos componentes del kit o pueden ser parte de un tercer componente del kit.

Los envases adecuados para las vacunas mezcladas de la invención, o para componentes individuales del kit, incluyen viales y jeringas desechables . Estos envases deben ser estériles.

Donde una composición/componente se localiza en un vial, el vial se hace preferiblemente de un material de vidrio o plástico. El vial se esteriliza preferiblemente antes de que se agregue la composición al mismo. Para evitar problemas con los pacientes sensibles al látex, los viales se sellan preferiblemente con un tapón libre de látex y se prefiere la ausencia de látex en todo el material de empaque. En una modalidad, un vial tiene un tapón de caucho de butilo. El vial puede incluir una dosis individual de vacuna/componente o puede incluir más de una dosis (un vial "multidosis") por ejemplo 10 dosis. En una modalidad, un vial incluye dosis de 10 x 0.25 mi de emulsión. Los viales preferidos se hacen de vidrio incoloro.

Un vial puede tener una tapa (por ejemplo un cierre tipo Luer) adaptada de tal manera que una jeringa llenada previamente se puede insertar en la tapa, el contenido de la jeringa puede ser expulsado dentro del vial (por ejemplo para reconstituir el material liofilizado en el mismo) y el contenido del vial puede ser retirado nuevamente dentro de la jeringa. Después de la remoción de la jeringa del vial, entonces se puede unir una aguja y la composición se puede administrar a un paciente. La tapa está localizada preferiblemente dentro de un sello o cubierta, de tal manera que el sello o cubierta tiene que ser retirado antes de que se pueda tener acceso a la tapa.

Donde una composición/componente se empaca en una jeringa, la jeringa no tendrá normalmente una aguja unida a la misma, aunque se puede suministrar una aguja separada con la jeringa para el ensamblaje y uso. Se prefieren agujas de seguridad. Las agujas calibre 23 de 2.54 centímetros (1 pulgada), calibre 25 de 2.54 centímetros (1 pulgada) y calibre 25 de 1.58 cm (5/8 pulgada) son típicas. Las jeringas pueden estar provistas con etiquetas desprendibles en las cuales se puede imprimir el número de lote, estación de influenza y fecha de caducidad del contenido, para facilitar la gestión de registros. El émbolo en la jeringa tiene preferiblemente un tapón para impedir que el émbolo sea retirado accidentalmente durante la aspiración. Las jeringas pueden tener una tapa y/o émbolo de caucho de látex. Las jeringas desechables contienen una dosis individual de vacuna. La jeringa tendrá generalmente una tapa para la punta para sellar la punta antes de la unión de la aguja y la tapa para la punta se hace preferiblemente de un caucho de butilo. Si la jeringa y la aguja son empacadas por separado, entonces la aguja está equipada preferiblemente con una cubierta de caucho de butilo.

La emulsión se puede diluir con un amortiguador antes del empaque en un vial o una jeringa. Los amortiguadores típicos incluyen: un amortiguador de fosfato; amortiguador de Tris; amortiguador de borato; amortiguador de succinato; amortiguador de histidina; o amortiguador de citrato. La dilución puede reducir la concentración de los componentes del adyuvante mientras que retiene sus proporciones relativas por ejemplo para proporcionar un adyuvante "de media concentración" .

Los envases pueden estar marcados para mostrar un volumen de media dosis por ejemplo para facilitar el suministro a niños. Por ejemplo, una jeringa que contiene una dosis de 0.5 mi puede tener una marca que muestra un volumen de 0.25 mi.

Donde se utiliza un envase de vidrio (por ejemplo una jeringa o un vial) , entonces se prefiere utilizar un envase hecho a partir de vidrio de borosilicato preferiblemente que a partir de un vidrio de sosa-cal.

Varios antígenos se pueden utilizar con las emulsiones de aceite en agua, que incluyen pero no están limitados a: antígenos virales, tales como proteínas de la superficie viral; antígenos bacterianos, tales como antígenos de proteínas y/o sacáridos ; antígenos fúngales; antígenos de parásitos; y antígenos de tumores. La invención es particularmente útil para vacunas contra el virus de la influenza, VIH, anquilostoma, virus de hepatitis B, virus de herpes simple, rabia, virus sincitial respiratorio, citomegalovirus, Staphylococcus aureus, clamidia, coronavirus SARS, virus de varicela zóster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, virus de Epstein Barr, virus de papiloma humano, etcétera. Por ejemplo: • Antígenos de virus de la influenza. Estos pueden tener la forma de un virus vivo o un virus inactivado. Donde se utiliza un virus inactivado, la vacuna puede comprender un virión completo, un virión dividido o antígenos de superficie purificados (que incluyen hemaglutinina y, usualmente, que también incluyen neuraminidasa) . Los antígenos de la influenza también se pueden presentar en la forma de virosomas . Los antígenos pueden tener cualquier subtipo de hemaglutinina, seleccionado de Hl, H2, H3, H4, H5, H6 , H7 , H8 , H9, H10, Hll, H12, H13, H14 , H15 y/o H16. La vacuna puede incluir antígeno(s) de uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4 o más) cepas del virus de la influenza, inclusive virus de la influenza A y/o virus de la influenza B, por ejemplo una vacuna para A/H5N1 o A/H1N1 monovalente o una vacuna para A/H1N1 + A/H3N2 + B trivalente. El virus de la influenza puede ser una cepa reordenada y pueden haber sido obtenida por medio de técnicas de genética inversa [por ejemplo 51-55] . De esta manera, el virus puede incluir uno o más segmentos de ARN de un virus A/PR/8/34 (típicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, en donde los segmentos HA y N son de una cepa de vacuna, es decir una reordenación 6:2). Los virus utilizados como la fuente de los antígenos pueden desarrollarse ya sea en huevos (por ejemplo huevos de gallina embrionados) o en cultivos de células. Donde se utiliza un cultivo de células, el substrato de células será típicamente una línea de células de mamífero, tal como MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etcétera. Las líneas de células de mamífero preferidas para el desarrollo de virus de la influenza incluyen: células MDCK [56-59] , derivadas de riñon canino Madin Darby; células Vero [60-62] , derivadas de riñon de mono verde africano; o células PER.C6 [63], derivadas de retinoblastos erabriónicos humanos. Donde el virus ha sido desarrollado en una línea de células de mamífero, entonces la composición estará ventajosamente libre de proteínas de huevo (por ejemplo ovalbúmina y ovomucoide) y de ADN de pollo, reduciendo de ese modo la alergenicidad. Las dosis unitarias de vacuna son estandarizadas típicamente por referencia al contenido de hemaglutinina (HA) , medido típicamente por medio de SRID. Las vacunas existentes contienen típicamente de aproximadamente 15 µ de HA por cepa, aunque se pueden utilizar dosis más bajas, particularmente cuando se utiliza un adyuvante. Las dosis fraccionarias tales como 1/2 (es decir 7.5 µg de HA por cepa), 1/4 y e han sido utilizadas [64,65], como también han sido utilizadas dosis más altas (por ejemplo dosis 3x o 9x [66,67]) . De esta manera, las vacunas pueden incluir entre 0.1 y 150 µg de HA por cepa de influenza, preferiblemente entre 0.1 y 50 µ por ejemplo 0.1-20 µg, 0.1-15 µ<3, 0.1-10 µg, 0.1-7.5 µ?, 0.5-5 µg, etcétera. Las dosis particulares incluyen por ejemplo aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7.5, aproximadamente 5, aproximadamente 3.8, aproximadamente 3.75, aproximadamente 1.9, aproximadamente 1.5, etcétera por cepa.

Virus de inmunodeficiencia humana, que incluye VIH-1 y VIH-2. El antígeno será típicamente un antígeno de envoltura .

Antígenos de superficie de virus de Hepatitis B. Este antígeno se obtiene preferiblemente por medio de métodos de ADN recombinante, por ejemplo después de la expresión en una levadura de Saccharomyces cerevisiae . A diferencia del HBsAg viral nativo, el antígeno expresado en levadura recombinante no es glicosilado. Puede estar en la forma de partículas sustancialmente esféricas (diámetro promedio de aproximadamente 20 nm) , que incluyen una matriz lipídica que comprende fosfolípidos . A diferencia de las partículas de HBsAg nativo, las partículas expresadas en levadura pueden incluir fosfatidilinositol . El HBsAg puede ser de cualquier subtipo aywl, ayw2 , ayw3 , ayw4 , ayr, adw2 , adw4 , adrq- y adrq+ .

Anquilostoma, particularmente como se observa en caninos (Ancylosto/na caninum) . Este antígeno puede ser Ac-MTP-1 recombinante (metaloproteasa similar a astacina) y/o una hemoglobinasa arpártica (Ac-APR-l) , la cual puede ser expresada en un sistema de baculovirus/células de insecto como una proteína secretada [68,69] .

Antigenos de virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) . Un antígeno de HSV preferido para el uso con la invención es la glicoproteína de membrana gD. Se prefiere utilizar la gD de una cepa de HSV-2 (antígeno "gD2"). La composición puede utilizar una forma de gD en la cual la región de ancla de membrana C-terminal ha sido suprimida [70] por ejemplo una gD truncada que comprende los aminoácidos 1-306 de la proteína natural con la adición de asparagina y glutamina en la C-terminal. Esta forma de la proteína incluye el péptido de señal el cual es escindido para producir una proteína madura de 283 aminoácidos. La supresión del ancla permite que la proteína se prepare en forma soluble.

Antígenos de virus de papiloma humano (HPV, por sus siglas en inglés) . Los antígenos de HPV preferidos para el uso con la invención son proteínas de cápside Ll, las cuales se pueden ensamblar para formar estructuras conocidas como partículas similares a virus (VLPs , por sus siglas en inglés) . Las VLPs se puede producir por medio de la expresión recombinante de Ll en células de levadura (por ejemplo en S. cerevisiae) o en células de insecto (por ejemplo en células de Spodoptera, tal como S. frugiperda, o en células de Drosophila) . Para las células de levadura, los vectores plasmídicos pueden llevar el (los) gen(es) Ll; para las células de insecto, los vectores de baculovirus pueden llevar el (los) gen (es) Ll . Más preferiblemente, la composición incluye VLPs de Ll de las cepas tanto HPV- 16 como HPV-18. Se ha mostrado que esta combinación bivalente es sumamente efectiva [71] . Además de las cepas HPV- 16 y HPV-18, también es posible incluir VLPs de Ll de las cepas HPV-6 y HPV-11. También es posible el uso de cepas oncogénicas de HPV. Una vacuna puede incluir entre 20-60 µg/ml (por ejemplo aproximadamente 40 µg/ml) de Ll por cepa de HPV.

Antígenos de ántrax. El ántrax es causado por Bacillus anthracis. Los antígenos de B.anthracis adecuados incluyen los componentes A (factor letal (LF, por sus siglas en inglés) y factor de edema (EF, por sus siglas en inglés) ) , los cuales pueden compartir ambos un componente B común conocido como un antígeno protector (PA, por sus siglas en inglés) . Los antígenos pueden ser desintoxicados opcionalmente . Los detalles adicionales se pueden encontrar en las referencias [72 a 74] .

Antigenos de .S.aureus. Se conoce una variedad de antígenos de S.aureus. Los antígenos adecuados incluyen sacáridos capsulares (por ejemplo de una cepa tipo 5 y/o tipo 8) y proteínas (por ejemplo IsdB, Hla, etcétera) . Los antígenos de sacáridos capsulares se conjugan idealmente con una proteína portadora.

Antígenos de S.pneumoniae . Se conoce una variedad de antígenos de S.pneumoniae. Los antígenos adecuados incluyen sacáridos capsulares (por ejemplo de uno o más de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y/o 23F) y proteínas (por ejemplo neumolisina, neumolisina desintoxicada, proteína D de la tríada de polihistidina (P tD) , etcétera) . Los antígenos de sacáridos capsulares se conjugan idealmente con una proteína portadora.

• Antigenos de cáncer. Se conoce una variedad de antígenos específicos para tumores. La invención se puede utilizar con antígenos que provocan una respuesta inmunoterapéutica contra el cáncer pulmonar, melanoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, etcétera.

Una solución del antígeno se mezclará normalmente con la emulsión por ejemplo en una relación en volumen de 1:1. Este mezclado puede ser realizado ya sea por un fabricante de vacunas, antes del llenado, o puede ser realizado en el punto de uso, por un profesional sanitario. Composiciones farmacéuticas Las composiciones hechas utilizando los métodos de la invención son farmacéuticamente aceptables. Estas pueden incluir componentes además de la emulsión y el antígeno opcional .

La composición puede incluir un conservador tal como tiomersal o 2-fenoxietanol . Sin embargo, se prefiere que la vacuna deba estar sustancialmente libre de (es decir menos de 5 µg/ml) material mercurial por ejemplo libre de tiomersal [75,76] . Son más preferidas las vacunas y componentes que no contienen mercurio.

El pH de una composición estará generalmente entre 5.0 y 8.1, y más típicamente entre 6.0 y 8.0 por ejemplo entre 6.5 y 7.5. Por lo tanto, un proceso de la invención puede incluir un paso de ajuste del pH de la vacuna antes del empaquetamiento .

La composición es preferiblemente estéril. La composición no es preferiblemente pirogénica por ejemplo que contiene <1 EU (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis y preferiblemente <0.1 EU por dosis. La composición está preferiblemente libre de gluten.

La composición puede incluir material para una inmunización individual o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir un kit "multidosis"). La inclusión de un conservador se prefiere en las disposiciones multidosis .

Las vacunas se administran típicamente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0.5 mi, aunque media dosis (es decir, aproximadamente 0.25 mi) se puede administrar a niños .

Métodos de tratamiento y administración de la vacuna La invención proporciona kits y composiciones preparados utilizando los métodos de la invención. Las composiciones preparadas de acuerdo con los métodos de la invención son adecuadas para la administración a pacientes humanos y la invención proporciona un método para provocar una respuesta inmune en un paciente, que comprende el paso que consiste en administrar esta composición al paciente.

La invención también proporciona estos kits y composiciones para el uso como medicamentos.

La invención también proporciona el uso de: (i) una preparación acuosa de un antígeno; y (ii) una emulsión de aceite en agua preparada de acuerdo con la invención, en la manufactura de un medicamento para provocar una respuesta inmune en un paciente.

La respuesta inmune provocada por estos métodos y usos incluirá generalmente una respuesta de anticuerpo, preferiblemente una respuesta de anticuerpo protectora.

Las composiciones se pueden administrar de varias maneras. La ruta de inmunización más preferida es por medio de una inyección intramuscular (por ejemplo, en el brazo o la pierna) , pero otras rutas disponibles incluyen la inyección subcutánea, intranasal [77-79] , oral [80] , intradérmica [81,82], transcutánea, transdérmica [83], etcétera.

Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención se pueden utilizar para tratar tanto a niños como a adultos. El paciente puede ser menor de 1 año de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad o por lo menos 55 años de edad. El paciente puede ser de edad avanzada (por ejemplo >50 años de edad, preferiblemente >65 años) , joven (por ejemplo <5 años de edad), pacientes hospitalizados, profesionales sanitarios, personal del servicio armado y militar, mujeres embarazadas, pacientes inmunodeficientes crónicamente enfermos y personas que viajan al extranjero. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y se pueden utilizar más generalmente en una población.

Las vacunas de la invención se pueden administrar a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario) otras vacunas.

Procesos intermedios La invención también proporciona un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, que comprende la microfluidización de una primera emulsión para formar una segunda emulsión y luego la filtración de la segunda emulsión. La primera emulsión tiene las características descritas anteriormente.

La invención también proporciona un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, que comprende la filtración de una segunda emulsión, es decir una emulsión microfluidizada . La emulsión microf luidizada tiene las características descritas anteriormente.

La invención también proporciona un método para la manufactura de una vacuna, que comprende combinar una emulsión con un antígeno, donde la emulsión tiene las características descritas anteriormente.

Modalidades específicas Las modalidades específicas de la presente invención incluyen: • Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, que comprende los pasos que consisten en (i) la formación de una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite; (ii) la microfluidización de la primera emulsión para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite; y (iii) la filtración de la segunda emulsión utilizando una membrana hidrófila.

• Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, que comprende los pasos que consisten en (i) la formación de una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite de 5000 nm o menor; (ii) la microfluidización de la primera emulsión para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite; y (iii) la filtración de la segunda emulsión utilizando una membrana hidrófila.

• Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, que comprende los pasos que consisten en (i) la formación de una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite; (ii) la microfluidización de la primera emulsión para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite; y (iii) la filtración de la segunda emulsión utilizando una membrana hidrófila de polietersulfon .

Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, el método comprende el paso que consiste en (i) la formación de una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite utilizando un homogenizador , en donde la primera emulsión se forma al hacer circular los componentes de la primera emulsión a través de un homogenizador una pluralidad de veces.

Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno, el método comprende el paso que consiste en (b) la microfluidización de una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite, en donde la segunda emulsión se forma al hacer circular los componentes de la segunda emulsión al transferir los componentes de la segunda emulsión desde un primer envase de emulsión, a través de un primer dispositivo de microfluidización a un segundo envase de emulsión y luego a través de un segundo dispositivo de microfluidización, en donde el primer dispositivo de microfluidización y el segundo dispositivo de microfluidización son los mismos.

Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende: pasar una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite a través de un dispositivo de microfluidización para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite; en donde el dispositivo de microfluidización comprende una cámara de interacción la cual comprende una pluralidad de canales tipo Z y un módulo de procesamiento auxiliar que comprende por lo menos un canal; en donde el módulo de procesamiento auxiliar se coloca corriente abajo de la cámara de interacción.

Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende el paso que consiste en pasar una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite a través de un dispositivo de microfluidización para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite; en donde el dispositivo de microfluidización comprende una cámara de interacción y un módulo de procesamiento auxiliar que comprende una pluralidad de canales .

Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua que comprende el paso que consiste en pasar una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite a través de un dispositivo de microfluidización para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite, en donde el dispositivo de microfluidización comprende una cámara de interacción y en donde la presión de los componentes de la emulsión en la entrada a la cámara de interacción es sustancialmente constante durante por lo menos 85% del tiempo durante el cual la emulsión es alimentada dentro del microfluidizador .

Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, que comprende el paso de formación de una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite, en donde la formación de la primera emulsión se lleva a cabo bajo un gas inerte, por ejemplo nitrógeno, por ejemplo a una presión de hasta 0.5 bares. • Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, que comprende el paso que consiste en pasar una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite a través de un dispositivo de microfluidización para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite, en donde la formación de la segunda emulsión se lleva a cabo bajo un gas inerte, por ejemplo nitrógeno, por ejemplo a una presión de hasta 0.5 bares.

• Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, que comprende los pasos que consisten en (i) la formación de una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite; (ii) la microfluidización de la primera emulsión para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite; (iii) la filtración de la segunda emulsión (iv) la transferencia de la emulsión de aceite en agua dentro de una bolsa flexible, estéril.

General El término "que comprende" engloba "que incluye" así como también "que consiste de" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando es necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención .

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x±10%.

A menos que se establezca específicamente, un proceso que comprende un paso que consiste en mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezclado. De esta manera, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Donde existen tres componentes, entonces dos componentes se pueden combinar entre sí y luego la combinación se puede conjuntar con el tercer componente, etcétera .

Donde materiales de origen animal (y particularmente de origen bovino) se utilizan en el cultivo de células, se deben obtener de fuentes que están libres de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs, por sus siglas en inglés) y en particular están libres de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en inglés) . En conjunto, se prefiere cultivar células en ausencia total de materiales derivados de animales .

La Figura 1 muestra un ejemplo específico de un homogenizador que se puede utilizar para formar una primera emulsión.

La Figura 2 muestra detalles de un rotor y un estator que se pueden utilizar en este homogenizador.

Las Figuras 3A-3B muestran dos perfiles de presión para un modo de bomba intensificadora, sincrónica.

La Figura 4 muestra una cámara de interacción de canales tipo Z.

La Figura 5 muestra una circulación tipo I, mientras que la Figura 6 muestra una circulación tipo II. Los envases están etiquetados como "C" mientras que un homogenizador está etiquetado como "H" . Se muestra la dirección y el orden de los movimientos de los fluidos. En la Figura 6, el homogenizador tiene dos flechas de entrada y dos flechas de salida pero en realidad el homogenizador tiene un canal de entrada individual y un canal de salida individual.

Una primera emulsión que comprende escualeno, polisorbato 80, trioleato de sorbitán y amortiguador de citrato de sodio se preparó por medio de la homogenización . La primera emulsión se homogenizó hasta que tuvo un tamaño promedio de gotitas de aceite de 1200 nm o menos y un número de gotitas de aceite que tenían un tamaño >1.2 µ?? de 5 x 109/ml o menos.

La primera emulsión luego se sujetó a la microf luidización para formar una segunda emulsión. El dispositivo de microf luidización comprendió dos bombas intensif icadoras , sincrónicas que proporcionaban una presión sustancialmente constante de aproximadamente 700 bares (es decir aproximadamente 10000 psi) . La emulsión se pasó a través del dispositivo de microfluidización cinco veces. La emulsión se mantuvo a una temperatura de 40 ± 5°C durante la microfluidización a través del uso de un mecanismo de enfriamiento.

Se llevaron a cabo cuatro corridas de prueba. En el primer par de corridas de prueba, un módulo de procesamiento auxiliar de canal individual (APM) se colocó corriente arriba de una cámara de interacción tipo Z de 8 canales (IXC), como fue recomendado por el fabricante, y el caudal de la emulsión en el dispositivo microfluidizador fue 10.2 L/minuto. En el segundo par de corridas de prueba, un APM multicanales se colocó corriente abajo de una IXC tipo Z de 8 canales y el caudal de la emulsión en el dispositivo microfluidizador fue 11.6 L/minuto. Ambas corridas se condujeron a gran escala (250 litros) . Los resultados de las cuatro corridas de prueba se muestran en la Tabla 1: Tabla i Como se muestra en la Tabla 1, las corridas de prueba en las cuales el APM se colocó corriente abajo de la IXC produjeron emulsiones con un tamaño de partícula promedio más pequeño y menos partículas con un tamaño > 1.2 µ??. Por otra parte, el orden de IXC-APM alcanzó un diámetro de partícula de <200 nm después de 1 pasada mientras que este tamaño no había sido alcanzado incluso después de 4 pasadas con el orden de APM-IXC. Por lo tanto, se mostró que la colocación del APM corriente debajo de la IXC tipo Z es ventajosa para la manufactura a gran escala.

Se entenderá que la invención ha sido descrita a manera de ejemplo únicamente y que se pueden hacer modificaciones mientras que permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, caracterizado porque comprende : pasar una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite a través de un dispositivo de microfluidización para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite; en donde el dispositivo de microfluidización comprende una cámara de interacción la cual comprende una pluralidad de canales tipo Z y una cámara de contrapresión que comprende por lo menos un canal; y en donde la cámara de contrapresión está colocada corriente abajo de la cámara de interacción.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera emulsión se introduce en la cámara de interacción a una primera presión y la segunda emulsión sale de la cámara de contrapresión a una segunda presión la cual es más baja que la primera presión; y en donde entre 80 y 95% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través de la cámara de interacción y de 5 a 20% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través de la cámara de contrapresión.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cámara de contrapresión comprende una pluralidad de canales .

4. Un método para la manufactura de una emulsión de aceite en agua, caracterizado porque comprende el paso que consiste en pasar una primera emulsión que tiene un primer tamaño promedio de gotitas de aceite a través de un dispositivo de microfluidización para formar una segunda emulsión que tiene un segundo tamaño promedio de gotitas de aceite el cual es menor que el primer tamaño promedio de gotitas de aceite; en donde el dispositivo de microfluidización comprende una cámara de interacción que comprende una pluralidad de canales y una cámara de contrapresión que comprende una pluralidad de canales.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la primera emulsión ya sea: se introduce en la cámara de interacción a una primera presión y la segunda emulsión sale de la cámara de contrapresión a una segunda presión la cual es más baja que la primera presión; o (ii) se introduce en la cámara de contrapresión a una primera presión y la segunda emulsión sale de la cámara de interacción a una segunda presión la cual es más baja que la primera presión; y en donde entre 80 y 95% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través de la cámara de interacción y de 5 a 20% de la diferencia de presión entre la primera presión y la segunda presión se disminuye a través de la cámara de contrapresión .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el canal o canales de la cámara de contrapresión son canales tipo Z.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende la filtración de la segunda emulsión.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende el paso de formación de la primera emulsión utilizando un homogenizador .

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el primer tamaño promedio de gotitas de aceite es 5000 nm o menor .

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño > 1.2 µp? en la primera emulsión es 5 x 1011/ml o menor.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el segundo tamaño promedio de gotitas de aceite es 500 nm o menor .

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño > 1.2 µ?t? en la segunda emulsión es 5 x 1010/ml o menor.

13. Un método para preparar una composición para vacuna, caracterizado porque comprende preparar una emulsión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y combinar la emulsión con un antígeno .

14. Un método para preparar un kit para vacuna, caracterizado porque comprende preparar una emulsión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y empacar la emulsión en un kit como un componente de kit junto con un componente de antígeno.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque los componentes de kit están en viales separados.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los viales se hacen de vidrio de borosilicato .

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque el adyuvante es un adyuvante a granel y el método comprende extraer dosis unitarias del adyuvante a granel para empacarse como componentes de kit .

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque el antígeno es un antígeno de virus de la influenza.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la combinación de la emulsión y el antígeno forma una composición para vacuna y en donde la composición para vacuna incluye aproximadamente 15 µg, aproximadamente 10 µg, aproximadamente 7.5 µg, aproximadamente 5 µg, aproximadamente 3.8 µg, aproximadamente 1.9 µg, aproximadamente 1.5 µg de hemaglutinina por cepa de virus de la influenza.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque la combinación de la emulsión y el antígeno forma una composición para vacuna y en donde la composición para vacuna incluye un conservador tiomersal o 2 - fenoxietanol .

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque: la cámara de interacción tiene una pluralidad de canales de geometría fija dentro de los cuales pasa la emulsión y en los cuales se acelera la emulsión bajo presión para reducir el tamaño de gotitas de aceite de la emulsión y para reducir el número de gotitas de aceite que tienen un tamaño >1.2 µ??; en donde los canales en la cámara de interacción incluyen una pluralidad de esquinas de ángulo sustancialmente recto; y en donde la cámara de contrapresión tiene por lo menos un canal de geometría fija dentro del cual pasa la emulsión.