MX2012005087A

MX2012005087A - Células madre multipotenciales del árbol biliar extrahepático y métodos de aislamiento de las mismas.

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Publication number: MX2012005087A
Application number: MX2012005087A
Authority: MX
Inventors: Lola M Reid; Yunfang Wang; Vincenzo Cardinale; Eugenio Gaudio; Guido Carpino; Domenico Alvaro; Cai-Bin Cui
Original assignee: Sapienza Uni Di Roma
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2012-09-28
Also published as: SG10201407102QA; TWI740180B; ES2819028T3; EP2494033A4; KR20180055931A; NZ724435A; JP2013509187A; RU2756584C2; KR20190065476A; CN105456292B; JP5936547B2; AU2010313386A1; AU2016210783A1; PH12012500845A1; TW201122108A; RU2016104823A3; KR20200146043A; AU2016210783B2; CN102918145B; US20110135610A1

Abstract

La presente invención se refiere a una célula madre, a poblaciones de células madre y a una población enriquecida de células madre multipotentes, cada una de las cuales se encuentra en el tejido de árboles biliares fetales, neonatales, pediátricos y adultos, y hasta 72 horas posteriores la muerte (aunque preferentemente, dentro de las diez horas posteriores la muerte), y es capaz de madurar formando múltiples tejidos endodérmicos que incluyen los tejidos hepáticos, biliares y pancreáticos; la célula madre/progenitora y las poblaciones de células se encuentran en las glándulas peribiliares, y las progenitoras que descienden de las mismas están presentes en todo el árbol biliar, incluso en la vesícula biliar; muchas de las glándulas peribiliares se encuentran en los sitios de ramificación del árbol biliar, tales como el hilio, el conducto hepático común, el conducto cístico, el conducto común, el conducto hepato-pancreático común y la vesícula biliar; las células multipotentes, las poblaciones de células multipotentes y sus progenitoras descendientes relacionadas se encuentran en todo el árbol biliar, incluyendo la vejiga biliar, la cual no tiene glándulas peribiliares; se proveen también composiciones que comprenden las mismas, métodos para identificar y aislar las mismas, mantener las mismas en cultivo, expandir las mismas en cultivo y diferenciar o restringir en cuanto a linaje las mismas in vitro o in vivo a los resultados esperados hepáticos, biliares o pancreáticos (por ejemplo como hepatocitos, colangiocitos y/o células de islotes pancreáticos); se proveen también métodos para usar las células multipotentes y/o las poblaciones de células multipotentes.

Description

CELULAS MADRE MULTIPOTENCIALES DEL ARBOL BILIAR EXTRAHEPÁTICO Y MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE LAS MISMAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. 61/256,846, presentada el 30 de octubre de 2009, incorporada aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a células progenitoras multipotenciales, incluyendo células madre multipotenciales, y poblaciones de células que comprenden dichas células progenitoras o madre, en el árbol biliar, hígado y páncreas. Muy particularmente, la presente invención se refiere a células progenitoras o madre multipotenciales y poblaciones de células que comprenden dichas células progenitoras o madre derivadas de porciones del árbol biliar extrahepático. Incluye composiciones que comprenden los mismos y métodos de identificación, aislamiento, mantenimiento, expansión y diferenciación de dichas células y poblaciones de células in vi tro e in vivo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Células muertas, moribundas o disfuncionales son la causa de muchas enfermedades conocidas, incluyendo diabetes y enfermedad de Alzheimer. Un método de tratamiento de estos padecimientos se ha enfocado en trasplante de órganos enteros o partes de los mismos de donadores para reemplazar algunas o todas las funciones de las células "enfermas". Aunque a menudo ha sido exitoso en detener o retardar el curso de algunas enfermedades, el trasplante de órganos va acompañado de morbidez/mortalidad considerable, como son todas las intervenciones quirúrgicas mayores, y la supervivencia del trasplante es dependiente de la administración crónica de inmunosupresores potentes, sintéticos, que a menudo dan por resultado efectos colaterales no deseables. No importa el éxito de estos enfoques, sin embargo, están inherentemente limitados por la disponibilidad de los donadores.

Un enfoque alternativo en "medicina regenerativa" es el uso de células madre y progenitores para repoblar órganos enteros, partes de los mismos, o por lo menos sus funciones. De hecho, las células madre pueden ser inyectadas o implantadas con procedimientos quirúrgicos relativamente menores, a menudo con la aparición insignificante de eventos adversos. Puesto que las células madre no son inmunogénicas (o son mínimamente inmunogénicas), requieren relativamente pocos, si acaso, inmunosupresores para la siembra inicial de las células.

Las células madre son células raras que requieren tecnologías precisas para aislar y condiciones bien definidas para propagarse in vivo e in vitro. Por lo tanto, existe una urgente necesidad de establecer fuentes alternativas y complementarias de células madre y células progenitoras y tejido funcionales, trasplantares, para uso clínico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con una modalidad de la presente invención, se provee una composición que comprende células madre/progen ¡toras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos (v.gr., linaje hepático, un linaje biliar, un linaje pancreático, o una combinación de los mismos), en donde las células se obtienen de tejido del árbol biliar (v.gr., cualquier porción del árbol biliar, incluyendo el hilio, conducto hepático común, conducto cístico, conducto común, conducto hepatopancreático común, vesícula biliar y glándulas peribiliares o células progenitoras o células madre derivadas de las glándulas peribiliares) de un mamífero, incluyendo un mamífero humano, feto, neonato, niño (pediátrico), adulto, o una persona fallecida hasta 72 horas post mortem. También se proveen composiciones que comprenden una población de células que comprende dichas células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero y/o una población de células de mamífero enriquecidas para dichas células madre/progenitoras multipotenciales.

Las células madre/progenitoras multipotenciales pueden expresar: (i) por lo menos un marcador indicativo de linajes de células de hígado de etapa temprana (v.gr., HNF6, HES1 , CK19, albúmina, o AFP); (ii) por lo menos un marcador indicativo de linajes de células pancreáticas de etapa temprana (v.gr., PDX1 , PROX1 , NGN3, o insulina); y por lo menos un marcador seleccionado de aquellos en las categorías (a)— (c): (a) por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progenitoras (v.gr., CDI 33 (prominina), CD44H (receptor de hialuronano), N-CAM, CXCR4 o EpCAM); (b) por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas (v.gr., SOX9, SOX17, o FOXA2), y (c) expresión débil a moderada de un gen de pluripotencia (v.gr., SOX2, NANOG, KLF4, OCT4A o OCT4). En algunos casos, las células madre/progenitoras multipotenciales pueden expresar un marcador de cada una de las categorías (i), (¡i) y (a)— (c). La expresión se puede determinar por prueba de punto final y de RT-PCR cuantitativa y/o por inmunohistoquímica de tejido ¡n vivo, de células recién aisladas, o de células cultivadas.

Las células multipotenciales también pueden expresar por lo menos uno de los siguientes: (i) expresión nuclear de proteína telomerasa; (ii) niveles de expresión bajos a moderados de genes de pluripotencia; (iii) expresión nuclear o perinuclear de factores endodérmicos clásicos de transcripción (v.gr., SOX17, SOX 9, FOXA2, HES1 , HNF6, PROX1 , HNF3B (factor nuclear de hepatocitos-3B, FOXA2, SALL4 (proteína de tipo sal 4), PDX1 , NGN3, o combinaciones de los mismos); (iv) expresión de marcadores de superficie de células madre/progenitoras endodérmicas; (v) falta de expresión o expresión de niveles bajos y variables de marcadores de linaje de hígado maduro (P450-3A4, transferrina, tirosina aminotransferasa (TAT) y niveles altos de albúmina; marcadores de linaje para conducto biliar maduro comprenden AE2, CFTR, receptor de secretina, acuaporinas, o combinaciones de los mismos), conducto biliar maduro, o páncreas endocrino maduro (v.gr., insulina, glucagón, somatostatina, amilasa o combinaciones de los mismos); (vi) falta de expresión de marcadores para células mesenquimáticas, células endoteliales o células hematopoyéticas.

En otra modalidad de la invención, se provee un método de obtención, aislamiento y/o identificación de células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células se obtienen de tejido del árbol biliar (v.gr., el tejido del árbol biliar comprende hilio, conducto hepático común, conducto cístico, conducto común, conducto hepatopancreático común y vesícula biliar, o combinaciones de los mismos) de un mamífero, el método comprendiendo obtener tejido del árbol biliar, y secuencialmente, y en cualquier orden, o sustancialmente en forma simultánea obteniendo células que son positivas para: (i) por lo menos un marcador indicativo de etapas tempranas de linaje de células de hígado (v.gr., HNF6, HESI, CK19, albúmina, o AFP); (ii) por lo menos un marcador indicativo de etapas tempranas de linaje de células pancreáticas (v.gr., PDX1 , PROX1 , NGN3, o insulina); y opcionalmente, por lo menos un marcador seleccionado de (a)— (c): (a) por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progenitoras (v.gr., CD1 33 (prominina), CD44H (receptor de hialuronano), N-CAM, CXCR4, o EpCAM); (b) por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas (v.gr., SOX 9, SOX17, o FOXA2), y (c) expresión débil a moderada de un gen de pluripotencia (v.gr., SOX2, NANOG, KLF4, OCT4A o OCT4). También se provee un método de identificación y aislamiento de una población de células multipotenciales de mamífero enriquecidas para las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero.

De conformidad con el método, el medio basal puede ser cualquier medio basal rico en nutrientes y sin cobre y con bajo contenido de calcio (por debajo de 0.5 mM), preferiblemente complementado con insulina, transferrina/Fe, selenio, zinc, ácidos grasos libres unidos a albúmina de suero y, opcionalmente, lipoproteína de alta densidad. Un ejemplo de un medio basal es RPMI 1640. Las células opcionalmente se pueden cultivar en plástico solo o plástico revestido con colágeno IV, colágeno III, laminina, hialuronanos, otros componentes de matriz de tejidos embrionario, fetal, neonatal o combinaciones de los mismos. Las células se cultivan por lo menos durante 24 horas y preferiblemente 7-21 días. De conformidad con el método, las células aisladas son 80%, 90%, 95%, 95%, preferiblemente 100% enriquecidas para las células madre de la presente invención. El aislamiento se puede llevar a cabo mediante tecnología de inmunoselección (v.gr., reconocimiento y selección, selección de cuentas magnéticas, citometría de flujo, o combinaciones de los mismos) y/o condiciones de cultivo selectivas.

En otra modalidad adicional de la presente invención, un método de propagación y/o expansión de las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero nuevas, o una población que comprende dichas células o enriquecida para dichas células o una célula pareja de la misma (v.gr., células mesenquimáticas, angioblastos y precursores de células estrelladas), que comprende: cultivar las células en plástico o hialuronanos, u opcionalmente en plástico revestido con colágeno de tipo III o IV o hialuronano u otro componente de matriz derivado de tejido fetal, neonatal o embrionario y en un medio basal que no contiene cobre, con bajo contenido de calcio (<0.5 mM), insulina, transferrina/Fe, una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina de suero y, opcionalmente, lipoproteína de alta densidad.

En otra modalidad adicional de la invención, se provee un método de linaje que restringe las células madre/progenitoras multipotenciales nuevas a destinos de célula de hígado adultas. El método comprende (a) obtener una suspensión de células que comprende células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células se obtienen de tejido del árbol biliar de un mamífero; (b) embeber la suspensión de células en un hidrogel que comprende hialuronano o hialuronano combinado con otros componentes de matriz (v.gr., colágeno de tipo IV, laminina, o ambos); y (c) cultivar la suspensión de células en medio basal complementado con cobre, calcio (.=0.5 mM), insulina, transferrina/Fe, bFGF, hidrocortisona, glucagón, galactosa, tri-yodotiroxina (T3), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), lipoproteína de alta densidad, y una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina, durante un tiempo suficiente para permitir su diferenciación en células de hígado.

En otra modalidad más de la invención, se provee un método de linaje que restringe las células madre/progenitoras multipotenciales nuevas a destinos de células pancreáticas adultas. El método comprende (a) obtener una suspensión de células que comprende las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células se obtienen de tejido del árbol biliar de un mamífero; (b) embeber la suspensión de células en un hidrogel que comprende híaluronanos o hialuronanos combinados con otros componentes de matriz; y (c) cultivar las células en un medio basal complementado con cobre, calcio (>0.5 mM) , B27, ácido ascórbico, insulina, transferrina/Fe, bFGF, ciclopamína, ácido retinoico, exendína 4, lipoproteína de alta densidad, y una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina; y que carece de hidrocortisona durante un tiempo suficiente para permitir su diferenciación en células pancreáticas.

En otra modalidad más de la invención, se provee un método de linaje que restringe las células madre/progenitoras multipotenciales nuevas a destinos de células biliares adultas. El método comprende (a) obtener una suspensión de células que comprende las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células se obtienen de tejido del árbol biliar de un mamífero; (b) embeber la suspensión de células en un hidrogel que comprende hialuronanos o hialuronanos en combinación con otros componentes de matriz (v.gr., colágeno de tipo I); y (c) cultivar las células en un medio basal complementado con cobre, calcio ( >0.5 mM), insulina, transferrina/Fe, hidrocortisona, bFGF, factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), lipoproteína de alta densidad, y una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina, durante un tiempo suficiente para su diferenciación en colangiocitos.

En otra modalidad más de la invención, se provee un método de diferenciación de células in vivo, que comprende trasplantar las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero, o poblaciones que comprende dichas células o enriquecidas para dichas células, in vivo como suspensiones de células o como implantes o injertos, con o sin restricción de linaje previa bajo condiciones de cultivo apropiadas, en el hígado en donde se diferencian a tejido del hígado.

En otra modalidad más de la invención, se provee un método de diferenciación de células in vivo, que comprende trasplantar las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero de la reivindicación 1 , o poblaciones que comprenden dichas células o enriquecidas para dichas células, in vivo como suspensiones de células o como implantes o injertos, con o sin restricción de linaje previa bajo condiciones de cultivo apropiadas, en el conducto biliar en donde se diferencian a tejido del árbol biliar.

En otra modalidad más de la invención, se provee un método de diferenciación de células in vivo, que comprende trasplantar las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero de la reivindicación 1 , o poblaciones que comprenden dichas células o enriquecidas para dichas células, in vivo como suspensiones de células o como implantes o injertos, con o sin restricción de linaje previa bajo condiciones de cultivo apropiadas, en el páncreas, bajo la cápsula del riñon o en las almohadillas de grasa epididímicas, en donde se diferencian a tejido pancreático funcional.

A este respecto, antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención con detalle, cabe entender que la invención no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y a las disposiciones de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención puede tener modalidades además de aquellas descritas y ponerse en práctica y llevarse a cabo de varias formas. También, cabe entender que la fraseología y terminología utilizadas aquí, así como el resumen, son para el propósito de descripción y no deben considerarse como limitantes.

Como tal, los expertos en la técnica apreciarán que el concepto en el cual se basa esta descripción se puede utilizar fácilmente como una base para el diseño de otras estructuras, métodos y sistemas para llevar a cabo los diversos propósitos de la presente invención. Es importante, por lo tanto, que las reivindicaciones se consideren como que incluyen dichas construcciones equivalentes siempre que no se aparten de la esencia y alcance de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra una célula madre biliar multipotencial de la presente invención que tiene la capacidad para diferenciarse en varios tipos de tejidos endodérmicos. Todas las células expresan factores de transcripción "endodérmicos" (E) (v.gr. SOX 9, SOX 17, FOXA2) y otros marcadores de poblaciones de células madre/progenitoras (antígenos de superficie tales como CD133, CD44H, EpCAM, CXCR4, NCAM). La restricción de linaje da como resultado varios destinos adultos incluyendo hígado, páncreas y árbol biliar.

La figura 2 es un diagrama esquemático del árbol biliar que muestra sus conexiones con hígado, páncreas y duodeno. Los sitios a los cuales grandes números de glándulas peribiliares, los nichos de células madre del árbol biliar, se pueden encontrar se indican con una estrella.

Las figuras 3A y 3B son una combinación de imágenes de histología e inmunohistoquímica de diferentes regiones del árbol biliar y que se usan para identificar marcadores y también los números y tamaños de glándulas peribiliares a lo largo del árbol biliar. (Figura 3A) Distribución y caracterización de glándulas peribiliares (PBGs) en el árbol biliar extrahepático. PBGs están presentes en las paredes del conducto del árbol biliar y son sitios para células madre/progenitoras del árbol biliar. Se realizó un estudio (n= 5 árboles biliares humanos examinados) de los números y tamaños de las glándulas peribiliares en sitios variables dentro del árbol biliar, de perfiles marcadores de los PBGs. La densidad de PBGs, expresada como superficie ocupada por acinos/área total de PBGs como se evaluó por análisis de imagen; el número y circunferencia se analizaron histológicamente en los diferentes sitios del árbol biliar extrahepático humano. La ampolla hepato-pancreática mostró la densidad y número de PBGs más altos; números aproximadamente iguales se encontraron en el conducto cístico e hilio; menos se encontraron en el conducto biliar; y ninguno en la vesícula biliar. *p< 0.01. Amplificación original x10. (Figura 3B) Inmunohistoquímica de PBGs in situ. Las PBGs son positivas para CK7, CK19, NCAM, CD 133, insulina, EpCAM, SOX9, SOX 17 y PDX1 pero negativas (o niveles muy bajos) para albúmina. La variación en estos marcadores de linaje tempranos (v.gr., albúmina) se ven entre varias glándulas peribiliares (véase figura 7 para evidencia con respecto a albúmina). Amplificación original x 40.

La figura 4 muestra que las células madre están localizadas principalmente dentro de las glándulas peribiliares (PBGs). Nótese que hay variabilidad dentro de una sola glándula peribiliar en la expresión de los marcadores de células madre, que en este caso es PDX1. Las flechas rojas indican los núcleos de células que expresan el factor de transcripción; las flechas negras indican unas que no lo expresan.

Las figuras 5A y 5B muestran 50X 7 (Figura 5A) y PDX1 (Figura 5B) junto con EpCAM (verde) y los núcleos teñidos de azul con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en glándulas peribiliares del conducto cístico.

La figura 6 provee datos inmunohistoquímicos sobre tejido biliar humano y que muestra expresión de EpCAM, SOX 9, y SOX17 en glándulas peribiliares en conducto cístico e hilio.

La figura 7 provee un resumen de las propiedades clave de las células madre del árbol biliar multipotencial. Éstos incluyen marcadores de superficie de células madre/progenitoras; factores de transcripción típicos de progenitores endodérmicos; expresión variable de marcadores de etapa temprana de linaje de hígado, árbol biliar y páncreas; y en la figura 8 la expresión débil a moderada de genes de pluripotencia. Pruebas de RT-PCR representativas para hilio hepático indican un amplio repertorio de factores de transcripción endodérmicos (SOX 9, SOX 17, FOXA2, PDX1 , NGN3, etc.) y marcadores de superficie clásicos de células madre/progenitoras (v.gr. EpCAM, NCAM, CXCR4, CD 133).

La figura 8 muestra datos de RT-PCR que indican expresión de genes de pluripotencia por conducto cístico y tejido de hilio. Su expresión débil a moderada provee evidencia adicional para la capacidad de las células madre del árbol biliar para auto-replicarse. Los genes de pluripotencia son aquellos encontrados expresados en células madre embrionarias (ES) y aquellas capaces de producir células madre pluripotenciales inducidas (iPS) en combinaciones variables de estos genes son transfectadas en células somáticas. Por lo menos 5 genes han sido identificados: OCT 4, SOX2, NANOG, KLF4 y c-MYC. Niveles de expresión débiles a moderados ocurren en tejido del árbol biliar y en células madre del árbol biliar aisladas para OCT 4, SOX2, NANOG, KLF4, pero no para c-MYC.

La figura 9 muestra la vesícula biliar no contiene glándulas peribiliares (como se muestra también en las figuras 3A y 3B). Sin embargo, las células que expresan algunos de los factores de transcripción y marcadores de superficie de células madre/progenitoras están presentes en las células de la vesícula biliar. Nótese que la mancha pardusca indicativa de expresión del marcador probado (EpCAM o PDX1) está presente en las células en la superficie de la vesícula biliar.

Las figuras 10A-10D muestran datos ¡nmunohistoquímicos sobre el tejido de la vesícula biliar que no tiene glándulas peribiliares. (Figuras 10A, 10C, 10D). Las células son positivas para EpCAM (verde) y tienen tinción perinuclear para factores de transcripción endodérmicos (se muestra SOX 17-rojo). (Figura 10B) las células también expresan PDX1 (rosa) y son marcadamente proliferativas como indicadas por tinción con Ki67 (verde).

Las figuras 1 1A-11 E muestran colonias de células madre/progenitoras de tejido del árbol biliar. Las células se aislaron y cultivaron en medio de Kubota libre de suero y en plástico de cultivo. Tres tipos distintos de colonias, tipos 1-3, se observaron bajo estas condiciones que no son permisivas para células maduras sino más bien selectas para s células madre/progenitoras endodérmicas. La tinción inmunohistoquímica indica la expresión para genes específicos indicados por texto en el color indicado para el marcador. Todas las secciones se tiñen con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) proveyendo un color azul que indica núcleos. Tipo de colonia (Figura 1 1A) agregados de células que expresan fuertemente EpCAM, NCAM, y ASBT. Las células crecieron lentamente (con divisiones cada 3-4 días o más). Tipo de colonia 2 células (Figura 11 B) son un fenotipo estrechamente similar al de hHpSCs y con 100% de las células que expresan EpCAM, NCAM pero ninguno que expresa AFP (con divisiones cada 36-40 horas). Tipo de colonia 3 (Figura 11 C) está compuesto de células ondulantes, en remolino con expresión de EpCAM en los bordes pero no en los interiores de las colonias y con altos niveles de expresión de SOX 17, PDX1 o SOX 9 en las células interiores (con divisiones cada 36-40 horas). La amplificación para todas las imágenes es 20X. Las imágenes son representativas de hallazgos de más de 10 experimentos en los cuales las colonias se monitorearon durante 4-8 semanas.

La evidencia de una relación entre células de tipos de colonia 2 y 3 se muestra en una imagen de magnificación baja (4X) (Figura 1 1 D). Se desconoce si uno es precursor del otro. Las pruebas de RT-PCR (Figura 1 1 E) indican la expresión de diversos genes en las colonias del conducto cístico versus de la vesícula biliar. Las pruebas de RT-PCR de los dos tejidos son muy similares, pero las del conducto cístico tienen expresión débil de albúmina e insulina, dos genes no expresados por células progenitoras que se obtuvieron de la vesícula biliar y que crecieron en medio de Kubota libre de suero y en plástico.

La figura 12 muestra las células madre del árbol biliar, especialmente las colonias del tipo 2 y 3, se expanden constantemente durante meses dando como resultado colonias de células con expresión estable de marcadores de células madre/progenitoras. Esta es evidencia parcial para auro-replicación de las células; evidencia adicional se provee por la expresión de genes de pluripotencia (figura 8). Aquí se muestra una colonia de tipo 3 después de un mes en cultivo con mantenimiento de expresión de PDX1 (anaranjado/rojo) en las células que están en el centro de la colonia y con EpCAM (verde) expresado sólo en los bordes de la colonia, sitios en los cuales hay diferenciación ligera. La tinción de DAPI (azul) indica los núcleos de las células.

Las figuras 13-13E muestran la micrografía de fase de una colonia de células madre del árbol en cultivo por más de 8 semanas en plástico de cultivo y en medio de Kubota libre de suero. La colonia fue iniciada de 1-2 células derivadas de tejido del árbol biliar humano adulto. Para estimar el número de células dentro de la colonia, se prepararon imágenes amplificadas de múltiples regiones de la colonia (las representativas son indicadas en las áreas rectangulares demarcadas por líneas de color) y estas áreas son formadas en imagen con software Metamorph y usadas para obtener números de células. El muestreo de regiones dio como resultado estimado de más de 500,000 células en la colonia. A partir del fetal tejido del árbol biliar, los inventores de la presente observaron rutinariamente >50 de dichas colonias; a partir del conducto cístico y tejido e hilio de adultos, rutinariamente obtuvieron >100 de dichas colonias.

La figura 14 muestra la localización de factores de transcripción (o de proteína telomerasa) en tejido (in situ) o en cultivos de células madre del árbol biliar. La inmunohistoquímica reveló que los factores de transcripción y proteína telomerasa estaban presentes intranuclearmente en algunas células y perinuclearmente o citoplásmicamente en otras. La importancia de esto se desconoce, aunque los inventores de la presente formularon la hipótesis de que la localización nuclear implica un factor activo y la localización perinuclear o citoplásmica podría ser una forma de almacenamiento. En estas imágenes, SOX 17 se expresa dentro del núcleo de algunas, pero no todas, las células de una glándula peribiliar in vivo (datos in situ) y se expresa dentro del núcleo de todas las células madre del árbol biliar en cultivo sobre plástico y en medio de Kubota. En las imágenes de los cultivos, los núcleos son azules con la tinción de DAPI; algunas de las células expresan EpCAM (verde); pero todas tienen localización intranuclear de SOX 17 (rojo). Cuando las imágenes se fusionan, los núcleos aparecen de color rosa (colores azul y rojo fusionados).

La figura 15 muestra la colonia de tipo 3 de células madre del árbol biliar que demuestran tanto localización nuclear como perinuclear del factor de transcripción, SOX 17 (rojo/rosa). Las células en el perímetro de la colonia son positivas para EpCAM (verde). Los núcleos se tiñen de azul con DAPI.

La figura 16 muestra la tinción in situ de células de la vesícula biliar que demuestran sólo tinción perinuclear y citoplásmica de SOX 17 (rojo/anaranjada). Las membranas celulares son positivas para EpCAM (verde), y los núcleos se tiñen de azul con DAPI.

Las figuras 17A y 17B muestran multipotencialidad de las células madre del árbol biliar. Efectos de medio hormonalmente definido (HD ) solo sobre la diferenciación a un destino hepatocítico o colangiocítico. Las células madre permanecen indefinidamente como células madre/progen ¡toras si se cultivan en plástico y en medio de Kubota. Se diferenciarán hacia un destino adulto si el medio es cambiado a un medio hormonalmente definido (HDM) ajustado para un destino adulto. Se diferenciarán más rápidamente y más eficientemente a un destino adulto si el HDM se usa en combinación con la colocación en placas de las células o embebiéndolas en formas de matriz extracelular (figuras 20A-22). En estos estudios se muestran datos representativos que indican el efecto de un HDM específico sobre la diferenciación del células madre/progenitoras del árbol biliar hacia un destino hepatocítico (HDM-L) versus colangiocítico (HDM-C).

Las células madre/progenitoras del árbol biliar de colonias mantenidas bajo condiciones de auto-replicación (plástico de cultivo y medio de Kubota libre de suero o su equivalente) fueron transferidas ya sea en HDM ajustado ya sea para hepatocitos (HDM-L), la hilera superior de imágenes, o para colangiocitos (HDM-C), el panel inferior de imágenes. Efectos de HDM-L: Inmunofluorescencia (Figura 17A) después de 7 días. Las células fueron difusamente positivas para CK18 (rojo) y/o albúmina (azul-verde). Amplificación: 20X. Datos semi-cuantitativos (Cuadro A) que comparan los números de hepatocitos (CK18+/albúmina+ células) bajo condiciones de auto-replicación (puntuación: 0) versus en HDM-L (puntuación: 2.2 ± 0.8), hallazgos que se traducen a >20% de las células que tienen linaje restringido a un destino hepatocítico. Efectos de HDM-C:. Inmunofluorescencia (Figura 17B) después de 7 días. Las células fueron difusamente positivas para CK7, receptor de secretina (SR), y CFTR. Co-expresaron CK7/SR y CK7/CFTR. Las amplificaciones originales son 20X excepto para c4 y c5 que son 40X. Estimado semi-cuantitativo (Cuadro A) de % de células SR+/CFTR+ en las condiciones para auto-replicación (0.2 ± 0.4;<5% de las células) versus en el HDM-C (3 ± 0.7 que es igual a aproximadamente 30 % de la restricción de linaje de células a colangiocitos.

Las figuras 18A-18G muestran multipotencialidad de las células madre del árbol biliar. Efectos de medio hormonalmente definido ajustado a páncreas (HDM-P) solo sobre la diferenciación a un destino pancreático. Efectos de HDM-P: Inmunofluorescencia para marcadores pancreáticos después de 7 días de cultivo en HDM-P. En la periferia de las colonias, la agregación y condensación celular ocurrió para formar estructuras similares a islotes (a-d) que contenían péptido c (Figuras 18A.18B), PDX-1 (Figura 18C) e insulina (Figura 18D). Células indiferenciadas (células EpCAM+) se encontraron dentro de los centros de la colonia (Figura 18E). Amplificaciones originales: 20X. El número de estructuras similares a islotes (cuadro B) encontradas en las condiciones para auto-replicación (1 ±0.7; <10% de las células) fue mucho más bajo que en el HDM-P (3.8 ±1.3; ~40% de las células). Los niveles de péptido C (Figura 18F) en ng^g de proteína bajo concentraciones de glucosa encontradas en todas las formulaciones de RPMI 1640 (1 1.1 mM) para una incubación de dos horas en las condiciones para auto-replicación fue 4.5 ± 2.25 versus 12.3 ± 1.9 ng^g en el HDM-P. Los datos se expresan como Media ± Error Estándar, N=4; *p < 0.05. (Figura 18G) La secreción de péptido c estimulada por glucosa se observó en los controles de HDM-P con los niveles del péptido c en el medio, en cg/l, a 1.10 ± 0.32 µ9 ? a niveles bajos de glucosa (5.5 mM) a 1.92 ± 0.43 µ9/? en glucosa alta (22 mM) n=7; *p <0.01.

La figura 19 muestra multipotencialidad de las células madre del árbol biliar. Análisis cuantitativos de (q)-RT-PCR para efectos de medio solo. Las pruebas se hicieron en cultivos de células madre del árbol biliar mantenidas bajo condiciones de auto-replicación (plástico de cultivo y medio de Kubota) versus en un medio hormonalmente definido libre de suero (HDM — L o HDM-C o HDM-P) solo ajustado para hepatocitos, colangiocitos versus células pancreáticas. Los niveles de expresión relativos de ARNm se calcularon categorizando los valores de Ct Anormalizados contra la media geométrica de los tres genes de mantenimiento más estables. Los datos se indican más o menos (±) desviación estándar. Los niveles de significancia para cada uno de éstos fue *p<0.05 n= el número de experimento hecho.

Las figuras 20A-20I muestran multipotencialidad de las células madre del árbol biliar. Efectos tanto de HDM como componentes de matriz extracelulares sobre la diferenciación de las células madre del árbol biliar. Las células madre biliares se cultivaron en plástico y en medio de Kubota o su equivalente (condiciones de auto-replicación) durante aproximadamente un mes dando por resultado colonias tales como una en (Figura 20A). Dicha colonia representativa se dispersó, y las células fueron transferidas a una de 3 condiciones de diferenciación, presentadas en un formato 3-dimensional (3-D) y compuestas de HDM + componentes de matriz ajustadas para el destino adulto deseado: una para colangiocitos (Figura 20B), hepatocitos (Figura 20C), o para células ppancreáticas (Figura 20D) Se mantuvieron hasta por 9 días en cultivo y después se probaron para destinos específicos de tejido que indicaron que estas células madre del árbol biliar pueden restringir el linaje a múltiples destinos adultos (aquí se proveen ejemplos de colangiocitos, hepatocitos o células ppancreáticas) dependiendo de las condiciones de cultivo. Hilera 3= tinción de ditizona (DTZ). (indicación de células ß pancreáticas c). D=días en cultivo; Glu=glucagón; C-P= péptido C, indicativo de secreción de insulina.

Las figuras 21A-21 D muestran microscopía electrónica de transmisión de células madre del árbol biliar bajo condiciones de auto-replicación (Figuras 21A-21 B) vs aquellas en condiciones de diferenciación 3-D para dar células de hígado maduras (Figuras 21 C-21 D). Células poligonales grandes estaban presentes y los núcleos celulares despliegan uno o más nucléolos. (Figura 21 C) Células adyacentes forman canículas biliares bien diferenciadas (flechas). Las canículas biliares son cerradas por complejos de unión (cabezas de flecha). Pocas microvellosidades están presentes en el lumen. (Figura 21 D). Por lo tanto, las células pudieron madurar a hepatocitos adultos y colangiocitos intrahepáticos. ?3GG3=2µ??.

La figura 22 muestra la prueba de multipotencialidad del células madre/progenitoras del árbol biliar como se da por análisis cuantitativo de (q)-RT-PCR en cultivos bajo auto-replicación versus condiciones de diferenciación 3-D . a. Las células madre/progenitoras del árbol biliar se cultivaron en medio de Kubota y en plástico durante 2 meses (condiciones de auto-replicación). Las colonias se mantuvieron en esas condiciones y por lo tanto produjeron células madre/progenitoras biliares (BP) o fueron transferidas a las condiciones de 3-D diferenciación para hepatocitos (B-L), colangiocitos (B- C) o islotes pancreáticos (B-P), y todas fueron cultivadas por 2 semanas adicionales. Los cultivos después se prepararon para análisis qRT-PCR de genes pertinentes a cada uno de los destinos adultos. Los datos se prepararon como histogramas en los cuales a los niveles de expresión de los genes en las condiciones de auto-replicación (BP) se les dio el valor de 1 .0, y el valor de cada gen en las células después de la diferenciación a un destino adulto se dio como el número de veces de cambio relativo al de BPs. El asterisco en algunos de los histogramas indica aquellos de significancia estadística (p<0.01 o p<0.001 ). N=2, cada experimento con muestras triplicadas. BP = células madre/progenitoras biliares; B-C=linaje de células restringido a conducto biliar (colangiocitos); B-L = linaje de células restringido a hepatocitos del hígado ); B-P = linaje de células restringido a páncreas (islotes). Los genes probados fueron GGT1 = gamma glutamiltranspeptidasa-1 ; AE2 = intercambiador de aniones 2; CFTR = regulador de conductancia de transmembrana de fibrosis quística; HNF4a = factor nuclear de hepatocitos 4A; AFP = alfa-fetoproteína; ALB= albúmina; TF= transferrina; TAT = tirosina aminotransferasa; CYP3A4 = citocromo P450 3A4; pdxl= Homeocaja pancreática y duodenal 1 ; ISL- = Homeocaja ISL LIM 1 ; NGN3 = neurogenina 3; INS insulina; GCG = glucagón.

La figura 23 muestra multipotencialidad de las células madre del árbol biliar como se indica por estudios in vivo: Destino hepático. Las células madre del árbol biliar se mantuvieron en cultivo bajo condiciones de auto-replicación (medio de Kubota o su equivalente y plástico de cultivo) y después se inyectaron en los hígados de ratones adultos inmunocomprometidos con hígados quiescentes (es decir, sin lesión de hígado inducida). Secciones de hígado preparadas de los ratones después fueron analizadas por inmunohistoquimica para marcadores específicos de humano indicativos de hepatocitos. En esta imagen, la sección se tiñó para Hepar- 1 anti-humana de Dako. Las secciones revelaron que uno puede identificar 6.52 ± 2.5% del área total ocupada por hepatocitos humanos positivos para Hepar-1 humana, un marcador de hepatocitos clásico.

La figura 24 muestra multipotencialidad de células madre del árbol biliar como se indica por trasplante in vivo: Destino de árbol biliar. Células madre del árbol biliar se mantuvieron en cultivo bajo condiciones de auto-replicación (medio de Kubota o su equivalente y plástico de cultivo) y después se inyectaron en los hígados de ratones adultos inmunocomprometidos con hígados quiescentes (es decir, sin lesión de hígado inducida). Secciones de hígado preparadas de los ratones después fueron analizadas por inmunohistoquímica para marcadores específicos de humano indicativos de colangiocitos. CK7 anti-humana de Dako, un marcador de colangiocitos, fue encontrado en un promedio de 12.7 ± 5.5% de todos los colangiocitos. Al comparar la evidencia para colangiocitos humanos en conductos biliares pequeños versus grandes, se encontró que 14.92 ± 5.9% de las células en los conductos biliares grandes y 5.02 ± 1.95% de las células en conductos biliares pequeños fueron positivas para CK7 humana.

La figura 25 muestra multipotencialidad de células madre del árbol biliar como se indica por trasplante in vivo: Destino pancreático. Células madre del árbol biliar se mantuvieron en cultivo bajo condiciones de auto-replicación (medio de Kubota o su equivalente y plástico de cultivo) y después se inyectaron en las almohadillas de grasa epididímicas (EFP) de ratones machos Balb/C Rag2_/" l^rg'7'. A cada ratón se inyectó 200-400 neoislotes, agregados celulares de linaje de células madre del árbol biliar restringido durante 7-14 días hacia un destino de islote pancreático en las condiciones de diferenciación 3-D de un HDM-P más un hidrogel que contenía hialuronano, colágeno de tipo IV y laminina. Cada neoislote estaba compuesto por más de 1000 células. A los ratones de control se les trasplantó Matrigel sin células. Los ratones fueron monitoreados diariamente para niveles de glucosa y fueron hiperglicémicos (600- 750 mg/dl) por aproximadamente 3 meses. Por 3 meses, los niveles de glucosa en los ratones trasplantados habían caído a niveles que eran menores que la mitad de los controles. Pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron postoperatoriamente los días 68 y 91 y mostraron niveles en la sangre significativos de péptido C humano en ratones experimentales, y estos niveles fueron regulados por glucosa.

CUADRO A CUADRO B ESTRUCTURAS EN FORMA DE ISLOTE (pep-c+) CONTROLES DE CÉLUAS MADRE 1 +0.7 CONTROLES DE HDM-P 3.8+1.3* DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se desprende del descubrimiento inesperado anterior de una célula madre o progenitora multipotencial, y poblaciones de células que comprenden dichas células madre o progenitoras multipotenciales, encontradas dentro del árbol biliar y que tienen la capacidad de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, incluyendo hígado, páncreas y árbol biliar (figura 1). En el interés de claridad para esta solicitud, el término "célula madre del árbol biliar" se usará aquí para referirse a la célula madre o progenitora multipotencial de mamífero de la invención, poblaciones de células que comprenden dichas células, y poblaciones de células enriquecidas para las células de la invención.

Las células madre multipotenciales del árbol biliar novedosas se pueden aislar de cualquier porción del tejido del árbol biliar pero se encuentran especialmente en números altos en las glándulas peribiliares y los puntos de ramificación del árbol, que están indicados por estrellas en la imagen esquemática de la figura 2. Las estrellas encontradas en las terminales ramificantes más pequeñas dentro del hígado se refieren a los canales de Hering, el nicho de células madre para células madre hepáticas intrahepáticas. Las células madre del árbol biliar son precursores para las células madre hepáticas intrahepáticas.

Fuente de células-Árbol biliar El árbol biliar o sistema extrahepático del árbol biliar está compuesto de una serie de conductos que conectan el duodeno al hígado y al páncreas y que incluyen la vesícula biliar (véase esquema en la figura 2). En todo el árbol biliar, dentro de las paredes del conducto, están glándulas peribiliares (figuras 3A-11 E), que se pueden encontrar particularmente en números altos en los sitios de ramificación tales como el hilio, conducto hepático común, conducto cístico, conducto común, conducto hepato-pancreático común y vesícula biliar. Fluidos del hígado o del páncreas ventral se vacían en el duodeno a través de la papila de Vater. Este grupo completo de estructuras, incluyendo la vesícula biliar, se refiere aquí como el árbol biliar.

Todo el árbol biliar (v.gr., el hilio, conducto hepático común, conducto cístico, conducto común, conducto hepatopancreático común y vesícula biliar) tienen paredes compuestas de tejido conectivo fibroso, denso, y un lumen revestido por una capa de epitelio biliar altamente columnar soportado por una membrana basal convencional. Las células del músculo liso se dispersan a lo largo de los conductos, particularmente cerca de la papila de Vater. Los vasos sanguíneos, fibras nerviosas y algunas células linfoide se encuentran ocasionalmente en las paredes del conducto. Las glándulas peribiliares se encuentran a lo largo de la longitud entera del árbol biliar y especialmente en números altos en el conducto hepato-pancreático común y el hilio, conducto hepático común, conducto cístico, conducto común y vesícula biliar. Figuras 3A-7.

La vesícula biliar tiene diferente características (figuras 9-10D). El lumen está revestido por epitelio columnar, una capa de músculo apropiada y tejido conectivo subseroso. No hay glándulas peribiliares presentes en la vesícula biliar (figuras 3A-9). Sin embargo, la vesícula biliar tiene células con fenotipos traslapables a los de poblaciones de células madre del árbol biliar encontradas dentro de las glándulas peribiliares son células amplificadoras de tránsito y/o progenitores triturados.

Las células de la presente invención pueden ser aisladas del tejido del árbol biliar de cualquier etapa del desarrollo. Por lo tanto, la presente invención se puede poner en práctica con tejido fetal, neonatal, pediátrico o de adulto, incluyendo tejido de individuos recién fallecidos (preferiblemente, dentro de 10 horas, pero las células de la invención permanecen viables para aislamiento de hasta 72 horas post mortem). De hecho, el tejido del árbol biliar es único en que ya está disponible de donadores fetales, pediátricos y adultos. Además, la presente invención se puede poner en práctica con tejido de los órganos hígado y páncreas obtenidos para, pero entonces rechazados para, trasplante, o de tejido de biopsia, de tejido de resección.

También, aquí las enseñanzas no se limitan o son aplicables a cualquier especie de mamífero. De hecho, cabe entender que los ejemplos provistos aquí son simplemente ilustrativos y no deben considerarse como limitantes. La presente invención, de esta manera, no está limitada por su fuente de mamífero para tejido del árbol biliar. Mamíferos de los cuales se pueden derivar las células madre del árbol biliar incluyen, pero no se limitan a, humanos, roedores (v.gr., ratas, ratones, hámsters), conejos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, perros y gatos. Preferiblemente, las células madre del árbol biliar se derivan de humanos para usarse en humanos.

Como se señaló, la clase nueva de células madre del árbol biliar de la invención se puede diferenciar en múltiples destinos endodérmicos. De hecho, las células madre del árbol biliar de la presente invención se pueden inducir para diferenciar en tipos de células madre de varios linajes endodérmicos incluyendo hígado, árbol biliar y páncreas. Figuras 17A-25, cuadro A y cuadro B.

Muestras de tejido del árbol biliar se pueden disecar quirúrgicamente de hígados o páncreas obtenidos para y entonces rechazados para trasplante por razones tales como esteatosis; anormalidad anatómica, o enfermedad vascular mayor; o se pueden obtener de material de extirpación. Pueden ser de vesículas biliares removidas por varias razones. El tejido del árbol biliar puede ser removido del tejido conectivo del abdomen. Entonces el tejido se divide en segmentos y es posteriormente procesado. Los segmentos que son especialmente ricos en células madre del árbol biliar incluyen: el hilio, conducto hepático común, conducto cístico, conducto común, conducto hepato-pancreático común y vesícula biliar. Cada parte puede ser disecada en piezas que se cortan a lo largo del diámetro longitudinal.

Se ha mostrado que las células madre del árbol biliar dan origen a múltiples destinos endodérmicos incluyendo células del hígado, árbol biliar y páncreas (figuras 17A-25, cuadro A y cuadro B). Las células madre del árbol biliar expresan proteína telomerasa; niveles bajos a moderados de genes de pluripotencia (Nanog, SOX2, KLF4 y OCT4— figura 8); factores de transcripción endodérmicos clásicos (v.gr., SOX1 7, SOX 9, FOXA2, HNF6, PROXI, HNF3B (factor nuclear de hepatocitos-3B (a.k.a. FOXA2), SALL4 (proteína de tipo sal 4), PDX1 y NGN3); marcadores de superficie endodérmicos (v.gr., CD326/molécula de adhesión de células epiteliales o EpCAM; CD56/molécula de adhesión de células neuronales o NCAM); CXCR4; y varios genes de células madre/progenitoras (v.gr., CD44H— receptores de hialuronano, y CD 133, también llamada prominina). Figuras 7, 8, 9, 13-13E.

Además, ostensiblemente debido a su multipotencialidad, las células madre del árbol biliar expresan niveles bajos y variables de marcadores de linaje tempranos del hígado (v.gr., HNF6, HES1 , FOXA2, y variablemente albúmina), conducto biliar (v.gr., citoqueratina 19), y páncreas endocrino (v.gr., PDX1 , NGN3, SALL4, insulina). Figura 7, figura 22.

Notablemente, las células madre del árbol biliar expresan los factores de transcripción PDX1 y NGN3 (figuras 3A-3B, 4, 7, 11A-1 1 E), conocidos como esenciales para el desarrollo del páncreas y el páncreas endocrino, respectivamente. Sin embargo, las células madre del árbol biliar no expresan o expresan sólo débilmente marcadores maduros de colangiocitos (v.gr., receptor de secretina, acuaporinas), hepatocitos (v.gr., albúmina, tirosina aminotransferasa o TAT, transferrina, P450s tardíos tales como P450-3A4) o células del islote (v.gr., glucagón, somatostatina, amilasa o altos niveles de insulina) (figuras 3A y 3B, 7, 13-13E). No expresan en todos los marcadores para células mesenquimáticas (v.gr., CD 146, desmina), células endoteliales (v.gr., receptor de VEGF, CD31 , factor de Van Willebrand ) o células hematopoyéticas (v.gr., CD45). El patrón de expresión de los antígenos es estable a lo largo de la vida de los cultivos siempre que sean mantenidos bajo condiciones de auto-replicación que consisten de medio de Kubota o su equivalente y con un sustrato de plástico de cultivo o hialuronanos.

Estos patrones de expresión se pueden determinar usando pruebas de (q)-RT- PCR de punto final y cuantitativas y por inmunohistoquímica de tejido in vivo, de células recién aisladas, o de células cultivadas. La co-expresión en células dentro de la misma glándula peribiliar de múltiples marcadores de células madre/progenitoras endodérmicas (v.gr., SOX 9, SOX17, PDX1 , NGN3, FOXA2) es una característica única y sorprendente que es distintiva de los hallazgos con respecto a células madre embrionarias (ES) que sufren restricción de linaje a páncreas y en las cuales estos factores de transcripción se observan secuencialmente, pero no todos al mismo tiempo. Además, la expresión de estos factores de transcripción está ausente en células biliares maduras en la superficie del lumen de los conductos biliares.

Las células madre del árbol biliar de la presente invención, como se explicó antes, son progenitores para tejidos endodérmicos maduros y comparten marcadores con células de los múltiples tejidos a los cuales pueden dar origen incluyendo el hígado, árbol biliar y páncreas.

Además de sus niveles de expresión relativos, la localización celular de telomerasa y de los factores de transcripción (v.gr., SOX 17, PDX1 ) expresados dentro de las células madre del árbol biliar cambia de una localización nuclear a una localización perinuclear/citoplásmica durante la maduración (véase figura 7 y también figuras 14-16). Dentro de una sola glándula peribiliar, se observan algunas células son localización nuclear y algunas células con localización perinuclear o sin expresión del marcador dado (figuras 4, 6, 7, 14). Sin estar limitados o restringidos por la teoría, la localización intranuclear está asociada con células más primitivas que aquellas con localización perinuclear del factor(es) de transcripción. Se supone que las últimas células están en transición a una etapa de linaje posterior. Alternativamente, la localización perinuclear podría indicar que el factor(es) está en una forma de almacenamiento inactiva que puede ser translocada al núcleo bajo demandas regenerativas apropiadas.

La presente invención provee técnicas para el aislamiento y propagación de células madre del árbol biliar. Las poblaciones de células madre de tejido del árbol biliar humano fueron identificadas por tecnologías de selección de cultivo pero pueden ser aisladas también por tecnologías de inmunoselección (v.gr., citometría de flujo, reconocimiento y selección, aislamiento de cuentas magnéticas). Alternativamente, o además de inmunoselección, las células madre del árbol biliar de la presente invención se pueden aislar en virtud de condiciones de cultivo de tejido. Por ejemplo, las suspensiones de células preparadas a partir del tejido del árbol biliar se pueden poner en placas sobre plástico o hialuronanos. En otras modalidades, el plástico es revestido opcionalmente con colágeno IV, colágeno III, laminina, hialuronanos, otros componentes de matriz encontrados en tejidos embrionarios/fetales, o combinaciones de los mismos.

El medio usado para selección de cultivo, medio de Kubota libre de suero o su equivalente, es fuertemente selectivo para la supervivencia y proliferación de las células madre del árbol biliar y las células mesenquimáticas asociadas, angioblastos y precursores de células estrelladas, pero es no selectivo para células del árbol biliar maduras. La esencia de este medio es que es cualquier medio basal que no contiene cobre, bajo en calcio (<0.5mM), insulina, transfenina/Fe, ácidos grasos libres unidos a albúmina purificada y, opcionalmente, también lipoproteína de alta densidad.

El medio de Kubota o su equivalente es libre de suero y contiene únicamente mezcla purificada y definida de hormonas, factores de crecimiento y nutrientes. De manera más específica, el medio está compuesto de un medio basal libre de suero (v.gr., RPMI 1640) que no contiene cobre, bajo en calcio (<0.5 mM) y complementado con insulina (5 µg/rnl), transferrina/Fe ^g/ml), lipoproteína de alta densidad (10 µg/ml), selenio (10"1° M), zinc (10"12 M), nicotinamida (5 µg/ml), y una mezcla de ácidos grasos libres unidos a una forma de albúmina purificada. Los métodos detallados para la preparación de estos medios se han publicado en otra parte, v.gr., Kubota H, Reíd LM, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 2000; 97:12132-12137, cuya descripción es incorporada aquí por referencia en su totalidad.

Estas condiciones producen colonias de células madre del árbol biliar que crecen rápidamente durante semanas (más de 8 semanas), con tasas de proliferación estimadas a una división cada 36-40 horas. Figuras 1 1A-13E. Estos cultivos son capaces de permanecer establemente como células madre/progenitoras por más de 8 semanas (figuras 13-13E), evidencia de que están sufriendo auto-replicación. Esta evidencia para auto-replicación además es soportada por el hallazgo de niveles de expresión débiles a moderados de genes de pluripotencia. Figura 8. El número de colonias obtenidas es el más alto en cultivos de las porciones de los árboles biliares que tienen grandes números de glándulas peribiliares e intermedios en aquellas de sitios distintos de los puntos de ramificación del árbol biliar o de la vesícula biliar sin glándulas peribiliares.

Restricción de linaje y diferenciación a destinos adultos Consistente con la multipotencia de las células madre del árbol biliar, si una colonia es mantenida durante semanas (v.gr., durante un mes en cultivo) bajo condiciones de auto-replicación y después el medio es cambiado a un medio hormonalmente definido(HDM), libre de suero, ajustado para un tipo de células adultas específicas, las células se diferenciarán parcialmente hacia el tipo de célula adulta designado (figuras 17A-19, cuadro A y cuadro B). En un HDM para hígado (HDM-L), el 20-30% las células adquirió expresión de citoqueratina 8 y 18 y albúmina, mientras que en un HDM para colangiocitos (HDM-C), aproximadamente la mitad de ellas maduraron a células que expresaron receptor de secretina y CFTR. Figuras 17A y 17B y cuadro A. El nivel de expresión de albúmina humana en los cultivos en HDM-L y la expresión de receptor de secretina en aquellos en HDM-C fueron significativamente más altos que aquellos en medio de Kubota o su equivalente (condiciones de auto-replicación) en pruebas usando RT-PCR cuantitativa (Figura 19).

La restricción de linaje parcial de las células hacia un destino de islote pancreático ocurría si las células madre del árbol biliar eran cultivadas en un HDM para páncreas (HDM-P). Figuras 18A-18G y cuadro B. La diferenciación ocurrió principalmente en los bordes de las colonias, sitios en los cuales agregados de células se formaron y dentro de los cuales el péptido C, PDX1 , y la insulina se encontraron. Más de la mitad de las colonias de células adquirieron la capacidad para producir péptido C humano (figuras 18G y 18F), indicativo de síntesis de insulina humana, y esta síntesis de péptido C fue regulado por los niveles de glucosa (figura 18G). El nivel de insulina humana producida fue significativamente más alto en los cultivos en HDM-P en comparación con aquellos que permanecen como células madre bajo condiciones de auto-replicación. (Figura 19).

El grado de multipotencialidad se demostró de manera más drástica si las células eran colocadas en condiciones de diferenciación 3-D distintas compuestas del HDM específico (HDM-L, HDM-C, HDM-P) en combinación con embebimiento de las células en hidrogeles que contenían componentes de matriz extracelulares específicos ajustados para el tipo de célula adulta de interés (figuras 20A-20I). Las células rápidamente se diferencian (v.gr., 7-10 días) a tipos de células adultas específicos — produciendo cuerdas de células hígado en HDM-L en combinación con hidrogeles de hialuronanos que contienen colágeno de tipo IV y laminina; conductos biliares de ramificación, es decir, árbol biliar, en HDM-C en combinación con hidrogeles de hialuronanos que contienen colágeno de tipo I; o neoislotes pancreáticos (páncreas endocrino) si en HDM-P y en hidrogeles que contienen colágeno de tipo IV y laminina.

Evidencia adicional para la diferenciación bajo las condiciones de cultivo 3-D se encontró para células madre del árbol biliar bajo condiciones de auto-replicación (figuras 21A y 21 B) versus condiciones ajustadas para hepatocitos (figuras 21 C y 21 D) y después caracterizada por microscopía electrónica de transmisión. La microscopía electrónica de transmisión de células madre del árbol biliar bajo condiciones de auto-replicación (a-b) vs hepatocitos (c-d). Bajo condiciones de diferenciación, células grandes y poligonales estaban presentes, y los núcleos de las células desplegaron uno o más nucléolos. Las células adyacentes forman canículas biliares bien definidas (flechas). Las canículas biliares son cerradas por complejos de unión (cabezas de flecha). Pocas microvellosidades están presentes en el lumen. La barra en las figuras es igual a 2 m.

Prueba de que las condiciones de diferenciación produjeron células adultas funcionales se provee en la figura 22 que contiene datos de RT-PCR cuantitativa de cultivos ya sea bajo condiciones de auto-replicación que producen células madre/progenitoras biliares (BP) versus bajo las condiciones 3-D para hígado (B-L), árbol biliar/colangiocitos (B-C), o páncreas (B-P). La hilera superior indica el incremento drástico en expresión de genes de hígado clásicos— HNF4, AFP, albúmina, tirosina amínotransferasa (TAT), transferrina (TF), y P450-3A4— en los cultivos bajo condiciones para hígado pero no bajo aquellos para las células madre/progenitoras o para árbol biliar o páncreas. Por el contrario, aquellas puestas bajo condiciones para páncreas (segunda hilera) mostraron incrementos muy drásticos en expresión de gen para PDX- 1 , ISL- I, NGN3, insulina, glucagón (GCG) bajo las condiciones para páncreas (B-P) pero no aquellas para células madre/progenitoras o hígado o árbol biliar. Aquellas puestas bajo condiciones para árbol biliar demostraron incrementos para expresión de GGT1 , AE2, CFTR. Los cultivos de células madre del árbol biliar transferidos nuevamente bajo las condiciones de auto-replicación mantuvieron niveles altos de EpCAM y niveles bajos de todos los genes específicos de adulto.

Esta multipotencialidad también se demuestra cuando las células son trasplantadas in vivo (figuras 23-25). Las células madre del árbol biliar humanas fueron trasplantadas en ratones inmunocomprometidos y después los tejidos se evaluaron posteriormente para la presencia de células humanas maduras injertadas. Incluso en ratones con hígados quiescentes, es decir, no sometidos a lesiones de hígado, las células fueron capaces de ser injertadas y madurar en números significativos de hepatocitos (figura 23) y colangiocitos (figura 24). Más aún, los ratones a los que se trasplantaron las células dirigidas al destino pancreático fueron sometidos a fármacos que los hicieron diabéticos, y las células trasplantadas pudieron rescatarlos de la condición diabética, y estas células probaron responder a niveles de glucosa en términos de producción de péptido C humano (figura 25).

Aunque múltiples precursores han sido identificados y se a mostrado que se diferencian en células de hígado maduras, las células madre del árbol biliar identificadas en la presente solicitud, y presentes en tejidos fetal, neonatal, pediátrico y adulto son las primeras células madre y poblaciones de células identificadas hasta la fecha que se pueden aislar de tejidos adultos y han probado ser capaces de diferenciarse en tipos de células pancreáticas maduras. Estas células también son las primeras identificadas que se pueden usar inmediatamente en programas clínicos para diabetes debido a su capacidad demostrada para poder diferenciarse en células del islote pancreático, su falta de potencial tumorigénico (como existe para células ES o células que son transfectadas con genes críticos para diferenciación a páncreas), y falta de inmunogenicidad.

Las células madre del árbol biliar son los precursores naturales a páncreas y pueden diferenciarse fácilmente y rápidamente (dentro de unos pocos días en cultivos) a destinos pancreáticos simplemente usando condiciones microambientales específicas. Más aún, la transición a la clínica es también facilitada por el hecho de que las condiciones microambientales necesarias están disponibles en formas GMP y ahora son parte de terapias clínicas existentes. Por lo tanto, por lo menos una aplicación clínica es el uso de las células madre del árbol biliar descritas aquí para la repoblación completa o parcial, rescate, soporte, reparación, reemplazo o introducción de células tipo beta pancreáticas para el tratamiento de diabetes (figura 25), o para formas de falla de hígado, insuficiencia, o degeneración (figuras 23 y 24).

Sería evidente para un experto en la técnica en vista de la descripción en la presente que las células madre del árbol biliar tienen numerosas aplicaciones en terapia clínica y tratamiento. La adquisición de las células madre del árbol biliar pueden ser un procedimiento relativamente no invasivo y relativamente inocuo para el paciente. La capacidad para propagar estas células madre biliares in vitro facilita la capacidad para obtener suficientes células para programas clínicos (v.gr., 106-109 células). La cantidad de células madre necesarias para programas de terapia de células es fácilmente generada dentro de unas cuantas semanas después de que las células son obtenidas, procesadas y cultivadas como se indica en las figuras 13-13E.

Las células madre del árbol biliar provistas para terapia pueden ser preparadas de un donador y después regresar a la misma persona, lo que constituye la terapia autóloga sin problemas inmunológicos en términos de rechazo de células, ya que las células y el receptor preferiblemente son genéticamente idénticos. Alternativamente, las células madre del árbol biliar o poblaciones de células provistas para terapia se pueden preparar a partir de un donador dado y después dar a otra persona, constituyendo la terapia alogeneica ya que las células madre del árbol biliar son no inmunogénicas o mínimamente inmunogénicas. Finalmente, las células madre del árbol biliar de conformidad con la invención deben ser relativamente libres de riesgo en experimentación animal y en cultivos con respecto a potencial oncogénico. En todos los estudios in vivo hasta la fecha, no ha habido evidencia en absoluto de potencial tumorigénico.

En otra modalidad de la invención, las células madre del árbol biliar o poblaciones de células se usan para la producción in vitro de células endodérmicas objetivo y tejido endodérmico objetivo (v.gr., páncreas, hígado, conducto biliar). Por consiguiente, la invención provee y abarca métodos para producir las células "objetivo" y tejidos de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células, dichos métodos comprenden el aislamiento de células madre del árbol biliar, su incubación bajo condiciones que derivan en su diferenciación en el tejido o células objetivos de ese tejido, y la introducción de las células en un paciente que necesita las mismas. Por lo tanto, las células de tejido diferenciado, que se obtienen por diferenciación de las células madre del árbol biliar de conformidad con la invención, también son el tema de la presente invención.

Como se indicó anteriormente y como se demuestra en las figuras 14-16, para diferenciación parcial de las células madre del árbol biliar hacia un destino adulto específico, de conformidad con la invención, se puede usar un medio definido (también denominado medio hormonalmente definido o HDM) que contiene una mezcla específica de nutrientes, hormonas y factores de crecimiento, idealmente siendo libres de suero, y ajustadas para dirigir las células al destino adulto de interés. HDM representativo para hepatocitos, colangiocitos versus islotes pancreáticos se dan a continuación. El HDM por si solo produce alguna restricción de linaje hacia el destino adulto deseado pero no produce diferenciación completa. La diferenciación completa ocurre después del trasplante in vivo o, si las células son ex vivo, además requiere el uso de un HDM específico en combinación con una mezcla de componentes de matriz extracelulares, la composición exacta de la mezcla que es única para el tipo de célula adulta deseada, y las células deben ser establecidas en un formato tridimensional como se describe aquí. Figuras 17A-19, cuadro A y cuadro B.

Formas de aplicación particularmente preferibles para diferenciación in vivo de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células de conformidad con la invención son inyección, infusión o implantación por método de injerto de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células en un área del cuerpo, para permitir que las células madre del árbol biliar se diferencien ahí, por contacto directo con células del linaje objetivo o infusión de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células para permitir que las células madre del árbol biliar o poblaciones de células alcancen el tejido objetivo.. Para inyección o infusión, las células madre del árbol biliar se pueden administrar en un medio con el cual son compatibles, tal como medio de Kubota (o equivalente) o uno del HDM, o en un injerto o implante bajo condiciones compuestas de componentes de matriz con los cuales son compatibles.

Aplicaciones terapéuticas Para el uso terapéutico de las células objetivo obtenibles de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células, de conformidad con la invención, un número de conceptos están disponibles (véase Science 287: 1442-1446, 2000), que son abarcados por la presente invención. Ejemplos de indicaciones relevantes en esta conexión son: errores congénitos del metabolismo, insuficiencia del hígado, cirrosis del hígado, insuficiencia pancreática, y diabetes.

Las células madre del árbol biliar o poblaciones de células pueden ser introducidas directamente dentro o sobre el órgano que ha de ser reconstituido, renovado o reparado. La introducción se puede llevar a cabo como suspensiones de células, como injertos compuestos de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células incorporadas en una mezcla de componentes de matriz extracelular junto con el HDM o como otros tipos de armazones proteínicos (v.gr., microportadores, poliláctidos) o como infusiones. Los armazones proteínicos son preferiblemente biodegradables, por lo que "desaparecen" del cuerpo, mientras que las células o poblaciones de células recién introducidas crecen junto con las células existentes. Las células que pueden ser reconstituidas, rescatadas, soportadas, reparadas, reemplazadas o introducidas de esta manera, preferiblemente por trasplante autólogo, incluyen células de islote u otras células del páncreas, hepatocitos u otras células del hígado, y colangiocitos u otras células árbol biliar. La reconstitución, rescate, reparación, suporte, reemplazo o introducción pueden seguir extirpación quirúrgica parcial de un órgano para reparación después del trauma o para uso de soporte, por ejemplo, en el caso de falta o insuficiencia de la función de órganos.

Las células madre del árbol biliar o poblaciones de células de conformidad con la invención y células objetivo obtenidas de las mismas además se pueden unir a materiales implantables, a fin de incrementar la biocompatibilidad. Por lo tanto, también los materiales implantables, cuando son revestidos con las células madre del árbol biliar, son tema de la invención. Los materiales implantables también pueden ser portador o materiales de soporte artificiales y/o biológicos, que contienen las células madre del árbol biliar o poblaciones de células y/o células objetivo derivadas de las mismas. A este respecto, los materiales portadores o materiales de soporte pueden ser microportadores, suportes, contenedores o cámaras para inserción o implantación en el cuerpo humano.

En dicha modalidad de la invención, un contenedor con células del islote derivadas de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células se usa para la producción de una construcción farmacéutica para usarse como una cámara de puerto de células del islote artificial para suministrar insulina in vivo. En otra modalidad de la invención, una infusión o injerto de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células se usa para reconstituir, rescatar, reparar, suportar, reemplazar o introducir islotes o células de islote in vivo. Construcciones similares se pueden hacer con hepatocitos o colangiocitos derivados de las células madre del árbol biliar de conformidad con la invención.

Las células objetivo o poblaciones de células obtenidas de las células madre del árbol biliar de conformidad con la invención además se pueden usar como cultivos de células en biorreactores (v.gr., externos al cuerpo), por ejemplo para llevar a cabo reacciones de desintoxificación o para producir sustancias generadas normalmente in vivo por las células o tejidos objetivos. Esta forma de uso es particularmente relevante en el caso de condiciones agudas, por ejemplo, en el caso de falla aguda del hígado como un hígado bioartificial o para diabetes severa como un páncreas endocrino bioartificial.

Finalmente, las células madre del árbol biliar multipotenciales o i poblaciones de células de conformidad con la invención pueden ser ampliamente aplicadas en modificación y terapia transgénícas. De conformidad con una modalidad de la invención, las células madre del árbol biliar, o células o tejido diferenciado a partir de ellas, son transfectadas con uno o más genes. De esta forma, uno o más genes, que se requieren para mantener el metabolismo de ciertos órganos, tales como por ejemplo hígado o páncreas, son restaurados y/o suportados o reintroducidos. Por ejemplo, células madre o hepatocitos pueden ser transfectados con el gen de FAH (fumaroilacetoacetato hidrolasa). En un ratón deficiente en FAH, la inyección intraesplénica de 1000 hepatocitos de donador FAH-positivo es suficiente para reconstituir completamente el hígado y completamente compensar el defecto metabólico que conduce a cirrosis del hígado. Overturf, K., M. Al-Dhalimy, C- N. Ou, M. Finegold, y M. Grompe. American Journal of Pathology 151 :1273- 1280 (1997). Alternativamente, las células madre del árbol biliar o poblaciones de células se pueden preparar de un donador dado y suministrar a otra persona, constituyendo terapia alogeneica, para restaurar, suportar o introducir en el receptor uno o más genes requeridos para mantener el metabolismo de ciertos órganos, tales como, por ejemplo, el hígado o páncreas.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención, pero la invención por ningún medio se limita a estos ejemplos específicos. Un experto en la técnica encontrará en estos ejemplos un medio para implementar la presente invención. Además, mientras que los presentes ejemplos se han presentado en el contexto de no humanos para conveniencia experimental, los métodos y reactivos descritos aquí pueden ser fácilmente traducidos a aplicación(es) humana(s) por un experto en la técnica a partir de las enseñanzas descritas a continuación.

EJEMPLOS EJEMPLO I Preparación de células La disociación enzimática se puede llevar a cabo en presencia de proteasa(s), tal como colagenasa(s), y/o nucleasa(s), tal como ADNasa. Los métodos de disociación enzimática de células del hígado se describen y se ponen en práctica en la técnica. A manera de ejemplo, los métodos para el aislamiento e identificación de los progenitores hepáticos se han descrito, por ejemplo, en USP No. 6,069,005 y solicitudes de USP Nos. 09/487,318; 10/135,700; y 10/387,547, cuyas descripciones son incorporadas aquí por referencia en su totalidad. De hecho, existen varios procedimientos para la preparación de suspensiones de células. Cabe entender, por lo tanto, que el alcance de la presente invención no se ha de limitar a un método específico para obtener tejido entero o preparar suspensiones de células del mismo.

EJEMPLO II CONDICIONES DE CULTIVO 3D Geles 3-dimensionales (3-D) se pueden formar mezclando los componentes de matriz, las hormonas, citocinas, factores de crecimiento, nutrientes y el medio basal en hialuronanos que son líquidos cuando no son entrelazados y se gelifican cuando son entrelazados. Los detalles de la preparación de éstos se publican en otra parte, v.gr., W. S. Turner, E. Schmelzer, R. McClelland et al., J Biomed Mater Res B Appl Biomater 82B (1 ), 56 (2006); y W. S. Turner, C. Seagle, J. A. Galanko et al., Stem Cells 26 (6), 1547 (2008), cuyas descripciones son incorporadas aquí en su totalidad. Los cultivos son mantenidos típicamente durante 2-4 semanas o más y después analizados por histología, pruebas de expresión de gen tales como RT-PCR de punto final y cuantitativa, inmunofluorescencia y pruebas de expresión de proteína tales como Western blots, y huellas metabolómicas.

Los componentes mayores de los complejos de gel son formas de hialuronanos químicamente modificados. Carbylan-S (o, CMHA- 5) es un derivado de hialuronano carboximetilado que ha sido modificado con múltiples tioles para entrelazamiento. Todos los materiales están comercialmente disponibles de, por lo menos, Glycosan Biosciences (Salt Lake City, Utah).

En resumen, en una modalidad, las matrices de hialuronano se preparan disolviendo hialuronano como un reactivo seco en un medio de Kubota para dar una solución al 2.0% (peso/volumen). La laminina (Sigma, St. Louis, Mo) entonces se puede añadir a una concentración de 1.5 mg/ml y colágeno de tipo IV (Becton Dickenson, Bedford, Ma) a una concentración de 6 mg/ml. El entrelazamiento ocurre dentro de horas a temperatura ambiente y con exposición a oxígeno en el aire o dentro de minutos si se expone a un reactivo de entrelazamiento, v.gr., PEGDA (diacrilato de polietienglicol). Por lo tanto, la solución se debe mantener enfriada a 4 °C y se debe evitar el contacto con oxígeno y/o con PEGDA , si no se desea entrelazamiento.

Al completarse los experimentos, las células pueden ser recuperadas al digerir los hidrogeles primero con una mezcla de hialuronidasa (1 mg/ml), ADNasa (0.5 mg/ml), y ditiotreitol (40 mg/ml) preparada en un medio de Kubota (sin transferrina), seguido por Liberasa (0.5 mg/ml) preparada en un medio de Kubota sin insulina y transferrina. Las células que se obtienen de esta manera son adecuadas para caracterización por citometría de flujo, RT-PCR, o inmunohistoquímica.

EJEMPLO III Evidencia de multipotencia Después de 7-30 días o más de cultivo de células madre del árbol biliar o poblaciones de células bajo condiciones de auto-replicación (medio de Kubota, o equivalente, en combinación con plástico de cultivo o hialuronanos), cultivos de monocapa de las células restantes (es decir, células madre del árbol biliar) son transferidos a un medio de diferenciación, en donde las células madre sufren cambios agudos rápidos y cambios en la expresión de gen dentro de 48 horas. Todos los medios de diferenciación consisten de modificaciones al medio usado para auto-replicación (v.gr., medio de Kubota o equivalente) de tal manera que el medio hormonalmente definido contendrá los componentes en el medio de auto- replicación más complementación con calcio (=5 mM), cobre, bFGF; éste se refiere como "medio modificado". Para lograr un tipo de célula adulta específico, se requiere lo siguiente: Hígado: La restricción de linaje a destinos de hígado (v.gr., hepatocitos) se puede lograr embebiendo las células madre del árbol biliar en hidrogeles de hialuronanos en los cuales se mezcla colágeno de tipo IV y laminina y con el "medio modificado" complementado además con glucagón, galactosa, triyodotiroxina, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). En una modalidad, la cantidad de ingredientes es como sigue: MKM complementado con 7 g/L de glucagón, 2 g/L de galactosa, 10"9 M de triyodotiroxina 3, 10 ng/ml de EGF y 20 ng/ml de HGF.

Tejido pancreático: La restricción de linaje a destinos pancreáticos (v.gr., islotes) se puede lograr embebiendo las células madre del árbol biliar en un hidrogel de hialuronanos que contienen colágeno de tipo IV y laminina y con el "medio modificado" cambiado además para remover hidrocortisona y para contener B27, ácido ascórbico, ciclopamina, ácido retinoico y exendina 4. En una modalidad, la cantidad de ingredientes es como sigue: MKM modificado para remover hidrocortisona y contiene 2% de B27, 0.1 mM de ácido ascórbico, 0.25 µ? de ciclopamina, 0.5µ? de ácido retinoico y 50 ng/ml de exendina 4. Árbol biliar/Colangiocitos: De manera similar, las células madre del árbol biliar pueden ser restringidas en linaje a destinos biliares (v.gr., colangiocitos) embebiendo las células madre en hialuronanos mezclados con colágeno de tipo I y en el "medio modificado" complementado además con factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEOF) 165 y HGF. En una modalidad, la cantidad de ingredientes es como sigue: MKM complementado adicionalmente con 20 ng/ml de factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF) 165 y 10 ng/ml de HGF.

EJEMPLO IV Trasplante El trasplante de células de órganos sólidos por protocolos de injerto son preferibles sobre la inyección o infusión para muchas aplicaciones, aunque cualquier modo de suministro es factible. Se ha encontrado que los cultivos de hidrogel descritos anteriormente proveen buenas condiciones para injerto. Las células pueden ser suspendidas en los hialuronanos no entrelazados, mezclados con otros componentes de matriz en un medio que comprende medio basal más hormonas, factores de crecimiento y otras señales solubles ajustadas para expansión y/o diferenciación.

Las poblaciones de células usadas para el trasplante preferiblemente comprende células madre del árbol biliar o poblaciones de células que son trasplantadas junto con (o sin) sus células mesenquimáticas asociadas nativas (v.gr., angioblastos, células estrelladas), derivadas del tejido objetivo (u otra fuente) para el trasplante, y a relaciones paralelas a aquellas encontradas in vivo. Sin estar limitados o restringidos por la teoría, se cree que esta combinación de las células madre y las células mesenquimáticas asociadas proveen el microambiente apropiado para maduración completa de tejidos que son vascularizados y capaces de funcionar fisiológicamente.

En una modalidad, para injertos pancreáticos, implantes o inyecciones, los componentes celulares de los injertos puede consistir de las células madre del árbol biliar o poblaciones de células co- sembradas en el injerto con angioblastos derivados de tejido fetal o neonatal humano (VEGFR, células CD117) y células estrelladas (células CD146) a una relación estimada de esas poblaciones de células encontradas in vivo en el tejido. Las poblaciones de células madre se pueden obtener a partir de células expansibles en cultivo como se describe aquí. Los angioblastos y células estrelladas pueden ser inmunoseleccionadas con el sistema de distribución de células magnéticamente activadas (MACS) o tipos de citometría de flujo a partir de suspensiones de células recién preparadas de tejido de páncreas fetal o neonatal humano.

Todas las poblaciones de célula madre del árbol biliar pueden ser inmunoseleccionadas para células positivas para un marcador de superficie celular común a la células madre/progenitoras (v.gr., CDI 33, CD44H, EpCAM, NCAM). En una modalidad, las células son incubadas a 4°C durante 20 minutos a una concentración de 50 I para 50 x 106 células en total en 500 I de solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) que contienen 0.5% de albúmina de suero de bovino y 2 mM de EDTA con anticuerpos primarios conjugados con FITC. Las células marcadas de esta manera se hacen reaccionar con cuentas magnéticas usando anticuerpos anti-FITC y después fueron seleccionadas por columnas Midi- o MiniMACS y unidades de separación. Todos los pasos de incubación y selección se deben realizar sobre hielo con la adición de 10% de ACCUTASE (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) para evitar agregación de células.

Alternativamente, las células se pueden marcar con un anticuerpo marcado con sonda fluorescente y las células inmunoseleccionadas usando citometría de flujo.

EJEMPLO V Medio Todos los medios se filtraron en forma estéril (filtro de 0.22-nm) y se mantuvieron en la oscuridad a 4°C antes de usarse. El medio de Kubota (KM) consiste de cualquier medio basal (v.gr., RPMI 1640) sin cobre, bajo en calcio (<0.5 m ), 10'9 M de selenio, 4.5 mM de nicotinamida, 0.1 nM de sulfato de zinc , 10"8- M de idrocortisona, 5 µ?/ml de transferrina/Fe, 5 µ9/??? de insulina, una mezcla de ácidos grasos libres que se añaden unidos a albúmina de suero (0.1 %) y, opcionalmente, 10 µg/ \ de lipoproteína de alta densidad.

EJEMPLO VI Condiciones de diferenciación Cultivos tridimensionales se establecieron después con hidrogeles que contenían hialuronanos, otras moléculas de matriz , hormonas, factores de crecimiento, citocinas, todos preparados en un medio. Todos los hidrogeles se hicieron usando medio de Kubota modificado (o equivalente) que fue complementado con calcio para lograr una concentración de 0.6 mM , 10"12 M de cobre, y 10 µ?? de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (referido como KM modificado o MKM): Células del hígado: MKM-L con 7 µg/L de glucagón, 2 g/L de galactosa, 10"9 M de triyodotiroxina 3, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y 20 ng/ml de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Los armazones proteínicos de matriz consistieron de 60% de colágeno de tipo IV y laminina y 40% de hialuronanos. Árbol biliar/Colangiocitos: MKM-C complementado con 20 ng/ml de factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF) 165 y 10 ng/ml de HGF. Los armazones proteínicos de matriz consistieron de 60% de colágeno de tipo I y 40% de hialuronanos.

Páncreas, islotes: MKM-P (sin hidrocortisona) complementado adicionalmente con 2% de B27, 0.1 mM de ácido ascórbico, 0.25 µ? de ciclopamina, 0.5µ? de RA y 50 ng/ml de exendina-4. Los armazones proteínicos de matriz consistieron de 60% de colágeno de tipo IV y laminina y 40% de hialuronanos.

EJEMPLO VII Aislamiento de células y fenotipificación Los tejidos biliares humanos se obtuvieron de hígados y páncreas obtenidos para y después rechazados para trasplante en un paciente. Las suspensiones de células de tejidos biliares humanos fueron procesados usando RPMI 1640 complementado con 0.1 % de albúmina de suero de bovino, 1 nM de selenio y antibióticos. Regulador de pH de procesamiento enzimático contenía 300 U/ml de colagenasa de tipo IV y 0.3 mg/ml de desoxirribonucleasa a 32°C con agitación frecuente durante 15-20 min. Las suspensiones enriquecidas fueron prensadas a través de una malla de calibre 75 y agitadas a 1200 RPM durante 5 minutos antes de volverse a suspender. La viabilidad de células estimada por exclusión con azul de tripano fue rutinariamente más alta que 95%.

Aproximadamente 3x105 células fueron colocadas en una caja de cultivo de tejido de 10 cm y en un medio de Kubota libre de suero, que fue reemplazado cada 3 días. Las colonias se formaron dentro de 5-7 días y se observaron hasta por 3 meses. Las colonias fueron recolectadas manualmente en tiempos variables usando un microscopio invertido.

Las células madre del árbol biliar multipotenciales también fueron aisladas por inmunoselección de suspensiones de células recién preparadas basadas en expresión positiva de uno o más marcadores de superficie celular comunes a las células madre/progenitoras (CD133, CD44H, NCAM, EpCAM- CD326) usando tecnologías de inmunoselección de cuentas magnéticas con el sistema Miltenyi Biotech MACS (Bergisch Gladbach, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, las células disociadas fueron incubadas con anticuerpo EpCAM unido a microcuentas magnéticas durante 30 min a 4°C, y fueron separadas usando el sistema de separación de columna magnética de Miltenyi siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. El medio fue reemplazado diariamente y el medio recolectado se almacenó a -20 °C para análisis posterior.

Para la tinción fluorescente, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 mm a temperatura ambiente, se enjuagaron con HBSS, se bloquearon con 10% de suero de cabra en HBSS durante 2 hr, y se enjuagaron. Las células fijadas se incubaron con anticuerpos primarios a 4°C durante la noche, se lavaron, se incubaron durante 1 hr con anticuerpos secundarios isotipo-específicos marcados, se lavaron, se contratiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualización de núcleos celulares.

Para inmunohistoquímica, los tejidos se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche, se almacenaron en 70% de etanol, y posteriormente se embebieron en parafina y se cortaron en secciones de 5 µ?t? . Las secciones fueron desparafinizadas, y los antígenos se recuperaron. Las peroxidasas endógenas fueron bloqueadas por incubación durante 30 min en solución de H2O2 al 0.3%. Después de bloquear con 10% de suero de caballo, se aplicó anticuerpo primario a 4°C durante la noche; el anticuerpo secundario y tinción con ABC se realizaron usando el kit RTU Vectastain Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). De usó Vector Nova RED como sustrato. Las secciones se deshidrataron, se fijaron y se embebieron en medio Eukitt ounting Media (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), y se analizaron usando un microscopio invertido.

Para el análisis de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) cuantitativa, tejidos del árbol biliar o células de cultivo fueron lisadas y el ARN total se extrajo usando el kit RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen GmbH, Valencia CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo transcripción inversa con el SuperScript First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). El kit HotStarTaq Master Mix Kit (Qiagen) se usó para PCR.

Las células se analizaron y se clasificaron por medio de un clasificador de células FACStar Plus (BD Biosciences) equipado con láseres Coherent 1-90 dobles. Los anticuerpos conjugados con fluorescencia fueron excitados a 488 nm, y su emisión de fluorescencia fue detectada por filtros estándares.

Aunque la invención se ha descrito en conexión con modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y se pretende que esta solicitud cubra cualesquiera variaciones, usos o alteraciones de la invención siguiendo dichas variaciones en las concentraciones precisas de componentes de matriz o factores de crecimiento u hormonas, para producir respuestas precisas de las células. En general, los principios de la invención, e incluyendo dichas desviaciones de la presente descripción que caen dentro de la práctica conocida o acostumbrada dentro de la técnica a la cual pertenece la invención, se pueden aplicar a las características esenciales expuestas anteriormente y como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexas.

Abreviaturas: AE2, intercambíador de aniones 2; AFP, a-fetoproteína; ALB, albúmina; ASMA, alfa-actina de músculo liso; ASBT, transposrtador apical de ácido biliar dependiente de sodio; bFGF, factor de crecimiento de fibroblastos básico; CD, determinante común; CD133, prominina; CD146, Mel-CAM; CD31 , PECAM; CD44H, receptor de hialuronano; CD45, antígeno de leucocitos común; CFTR, regulador de conductancia de transmembrana de fibrosis cística; CK, citoqueratina; CXCR4, receptor de CXC-quimiocina 4; CYP450, Citocromo P450; EGF, factor de crecimiento epidérmico; EpCAM, molécula de adhesión de células epiteliales; FOXa2, caja con cabeza de horquilla a2; GGT, gamma glutamil transpeptidasa; HDM, medio hormonalmente definido, uno ajustado para un tipo de célula específico; HDM-L, medio hormonalmente definido para hígado; HDM-C, medio hormonalmente definido para colangiocitos (árbol biliar); HDM-P, medio hormonalmente definido para páncreas; HGF, factor de crecimiento de hepatocitos; HNF, factor nuclear de hepatocitos; KM, medio de Kubota, un medio libre de suero diseñado para células madre/progenitoras; NCAM, molécula de adhesión de células neurales; NGN3, neurogenina 3; PDX1 , homeocaja 1 pancreática y duodenal; PROX1 , proteína de homeocaja 1 Prospero; SALL4, proteína de tipo sal 4; SOX, caja de HMG relacionada Sry; SR, receptor de secretina; EGF, crecimiento endotelial vascular.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 .- Una composición que comprende células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células fueron obtenidas de tejido del árbol biliar de un mamífero.

2. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la célula madre/progenitora multipotencial es una célula madre multipotencial.

3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el linaje endodérmico es un linaje hepático, un linaje biliar, un linaje pancreático o una combinación de los mismos.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el tejido del árbol biliar es cualquier porción del árbol biliar, incluyendo el hilio, conducto hepático común, conducto cístico, conducto común, conducto hepatopancreático común y vesícula biliar.

5. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el mamífero es un humano.

6. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el mamífero humano es un feto, neonato, niño (pediátrico), adulto, o una persona fallecida de hasta 72 horas post mortem.

7. - La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el mamífero es una persona fallecida dentro de 10 horas post mortem.

8. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el tejido del árbol biliar contiene glándulas peribiliares o células progenitoras o células madre derivadas de las glándulas peribiliares.

9. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el tejido del árbol biliar comprende ubicaciones en las cuales el árbol biliar se ramifica.

10. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las células multipotenciales expresan: (i) por lo menos un marcador indicativo de linajes de células de hígado de etapa temprana; (ii) por lo menos un marcador indicativo de linajes de células pancreáticas de etapa temprana; y por lo menos un marcador seleccionado de aquellos en las categorías (a) — (c): (a) por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progenitoras; (b) por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas, y (c) expresión débil a moderada de un gen de pluripotencia.

1 1.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el por lo menos un marcador indicativo de linajes de células de hígado de etapa temprana es HNF6, HES1 , CK19, albúmina o AFP.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el por lo menos un marcador indicativo de linajes de células pancreáticas de etapa temprana es PDX1 , PROX1 , NGN3 o insulina.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progen ¡toras es CD 133 (prominina), CD44H (receptor de hialuronano), N-CAM, CXCR4 o EpCA .

14. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas es SOX 9, S0X17 o FOXA2.

15. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el gen de pluripotencia es SOX2, NANOG, KLF4, OCT4A o OCT4.

16. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las células multipotenciales expresan: (i) por lo menos un marcador indicativo de linajes de células de hígado de etapa temprana; (ii) por lo menos un marcador indicativo de linajes de células pancreáticas de etapa temprana; (iii) por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progenitoras; (iv) por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas; y (v) expresión débil a moderada de un gen de pluripotencia.

17. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las células multipotenciales expresan por lo menos uno de los siguientes: (i) expresión nuclear de proteína telomerasa; (ii) niveles de expresión de genes de pluripotencia bajos a moderados; (iii) expresión nuclear o perinuclear de factores de transcripción endodérmicos clásicos; (iv) expresión de marcadores de superficie de células madre/progenitoras endodérmicas; (v) falta de expresión o expresión de niveles bajos a moderados de marcadores de linaje de hígado maduro, conducto biliar maduro o páncreas endocrino maduro; (vi) falta de expresión de marcadores para células mesenquimáticas, células endoteliales o células hematopoyéticas.

18. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque los marcadores de superficie de células madre/progenitoras endodérmicas comprenden molécula de adhesión de células CD326/epiteliales (EpCAM), CD56/molécula de adhesión de células neuronales (NCAM), CD133 (prominina), CD44H (receptor de hialuronano), CXCR4, o combinaciones de los mismos.

19. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque los factores de transcripción endodérmicos clásicos comprenden SOX17, SOX 9, FOXA2, HES1 , HNF6, PROX1 , HNF3B (factor nuclear de hepatocitos-3B, FOXA2, SALL4 (proteína de tipo sal 4), PDX1 , NGN3, o combinaciones de los mismos.

20. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque los marcadores de linaje de hígado maduro comprenden P450-3A4, transferrina, tirosina aminotransferasa (TAT) y los niveles altos de albúmina; marcadores de linaje para conducto biliar maduro comprenden AE2, CFTR, receptor de secretina, acuaporinas o combinaciones de los mismos; y los marcadores de linaje para páncreas maduro comprenden niveles altos de insulina, glucagón, somatostatina, amilasa o combinaciones de los mismos.

21.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque los marcadores para células mesenquimáticas comprenden CD 146, desmina, alfa-actina de músculo liso (ASMA) , o combinaciones de los mismos; los marcadores para células endoteliales comprenden receptor de VEGF, CD31 , factor de Van Willebrand, o combinaciones de los mismos; y un marcador genérico para células hematopoyéticas es CD45.

22.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la expresión es determinada por prueba de RT-PCR de punto final y cuantitativa y/o por inmunohistoquímica de tejido in vivo, de células recién aisladas, o de células cultivadas.

23.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el tejido del árbol biliar comprende conducto cístico, hilio, conducto hepático común, conducto hepatopancreático común, vesícula biliar, y cualesquiera porciones del árbol biliar que conectan con ellos o combinaciones de los mismos.

24. - La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el tejido del árbol biliar comprende ubicaciones en donde el árbol biliar se ramifica.

25. - Una composición que comprende una población de células que comprenden células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero de la reivindicación 1.

26. - Una composición que comprende una población de células de mamífero enriquecida para células madre/progenitoras multipotenciales de la reivindicación 1.

27.- Un método in vitro para obtener células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células fueron obtenidas de tejido del árbol biliar de un mamífero, el método comprende proporcionar tejido del árbol biliar, y secuencialmente, y en cualquier orden, o sustancialmente en forma simultánea aislar células que son positivas para: (i) por lo menos un marcador indicativo de etapas tempranas de linaje de células de hígado; (ii) por lo menos un marcador indicativo de etapas tempranas de linaje de células pancreáticas; y opcionalmente, por lo menos un marcador seleccionado de (a) — (c): (a) por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progenitoras; (b) por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas, y (c) expresión débil a moderada de un gen de pluripotencia.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el aislamiento es mediante tecnología de inmunoselección y/o condiciones de cultivo selectivas.

29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la tecnología de inmunoselección comprende reconocimiento y selección de cuentas magnéticas, citometría de flujo o combinaciones de los mismos.

30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la tecnología de inmunoselección es citometría de flujo.

31 .- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la condición de cultivo selectiva comprende colocar las células sobre plástico, sobre hialuronanos o sobre plástico opcionalmente revestido con colágeno IV, colágeno III, laminina, hialuronanos, otros componentes de matriz de tejidos embrionario, fetal, neonatal o combinaciones de los mismos.

32. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque comprende adicionalmente incubar las células en medio libre de suero que comprende un medio basal bajo en calcio, sin cobre y complementado con insulina, transferrina/Fe, setenio, zinc, ácidos grasos libres unidos a albúmina de suero y, opcionalmente, lipoproteína de alta densidad.

33. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el medio basal comprende RPMI 1640.

34. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el medio basal comprende menos de 0.5 mM de calcio.

35. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque las células son cultivadas durante 7-21 días o más.

36. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el tejido del árbol biliar comprende hilio, conducto hepático común, conducto cístico, conducto común, conducto hepatopancreático común y vesícula biliar o combinaciones de los mismos.

37. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el tejido del árbol biliar se deriva de sitios en los cuales el árbol biliar se ramifica o contiene números altos de glándulas peribiliares.

38.- Un método in vitro de identificación y aislamiento de una población de células multipotenciales de mamífero que comprende células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células fueron obtenidas de tejido del árbol biliar de un mamífero, el método comprende proporcionar tejido del árbol biliar y después secuencialmente, en cualquier orden, o sustancialmente en forma simultánea aislar células positivas para: (i) por lo menos un marcador indicativo de etapas tempranas de linaje de células de hígado; (ii) por lo menos un marcador indicativo de etapas tempranas de linaje de células pancreáticas; y por lo menos un marcador seleccionado de uno o más de aquellos en las categorías (a)-(c): (a) por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progenitoras; (b) por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas; y (c) expresión débil a moderada de un gen de pluripotencia.

39. - Un método in vitro de identificación y aislamiento de una población de células multipotenciales de mamífero enriquecidas para las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero de la reivindicación 1 , que comprende proporcionar tejido del árbol biliar y después secuencialmente, en cualquier orden, o sustancialmente en forma simultánea aislar células positivas para: (i) por lo menos un marcador indicativo de etapas tempranas de linaje de células de hígado; (ii) por lo menos un marcador indicativo de etapas tempranas de linaje de células pancreáticas; y por lo menos un marcador seleccionado de uno o más de aquellos en las categorías (a)-(c): (a) por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progenitoras; (b) por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas; y (c) expresión débil a moderada de un gen de pluripotencia.

40. - El método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, caracterizado además porque el por lo menos un marcador indicativo de linajes de células de hígado de etapa temprana es HNF6, HES1 , CK19, albúmina o AFP.

41. - El método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, caracterizado además porque el por lo menos un marcador indicativo de linajes de células pancreáticas de etapa temprana es PDX, PROX1 , NGN3 o insulina.

42. - El método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, caracterizado además porque por lo menos un marcador de superficie encontrado en células madre/progenitoras es CD 133 (prominina), CD44H (receptor de hialuronano), N-CAM, CXCR4 o EpCAM.

43. - El método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, caracterizado además porque por lo menos un factor de transcripción indicativo de células madre/progenitoras endodérmicas es SOX 9, SOX17 o FOXA2.

44. - El método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, caracterizado además porque el gen de pluripotencia es SOX2, NANOG, KLF4, OCT4A o OCT4.

45.- Un método in vitro de propagación y/o expansión de la célula madre/progenitora multipotencial de mamífero de conformidad con la reivindicación 1 , o una población que comprende dichas células o enriquecida para dichas células, que comprende: cultivar las células en plástico o hialuronanos, u opcionalmente en plástico revestido con colágeno de tipo III o IV o hialuronano u otro componente de matriz derivado de tejido fetal, neonatal o embrionario y en un medio basal que no contiene cobre, bajo en calcio (<0.5 mM), insulina, transferrina/Fe, una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina de suero, y opcionalmente, lipoproteína de alta densidad.

46. - Un método in vitro de propagación y/o expansión de células asociadas de las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende: cultivar las células en plástico o hialuronanos, u opcionalmente sobre plástico revestido con colágeno de tipo III o IV o hialuronano u otro componente de matriz derivado de tejido fetal, neonatal o embrionario y en un medio basal que no contiene cobre, bajo en calcio (<0.5 mM), insulina, transferrina/Fe, una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina de suero, y opcionalmente, lipoproteína de alta densidad, en donde dichas células asociadas comprenden células mesenquimáticas, angioblastos y células estrelladas o precursores.

47. - Un método in vitro de restricción de linaje de células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, y/o poblaciones de células multipotenciales que comprenden o están enriquecidos para dichas células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero, a células de hígado, el método comprendiendo: (a) embeber una suspensión de células que comprende células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células fueron obtenidas de tejido del árbol biliar de un mamífero en un hidrogel que comprende hialuronano o hialuronano combinado con otros componentes de matriz; y (b) cultivar la suspensión de células en un medio basal complementado con cobre, calcio (=0.5 mM), insulina, transferrina/Fe, bFGF, hidrocortisona, glucagón, galactose, triyodotiroxina (T3), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), lipoproteína de alta densidad, y una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina, durante un tiempo suficiente para permitir su diferenciación en células de hígado.

48. - El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque los otros componentes de matriz comprenden colágeno de tipo IV, laminina, o ambos.

49. - El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque el cultivo es durante 7-14 días.

50. - Un método in vitro de restricción de linaje de células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, y/o poblaciones de células multipotenciales que comprenden o están enriquecidas para dichas células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero, a células de páncreas, el método comprendiendo: (a) embeber una suspensión de células que comprende las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células fueron obtenidas de tejido del árbol biliar de un mamífero en un hidrogel que comprende hialuronanos o hialuronanos combinados con otros componentes de matriz; y (b) cultivar las células en un medio basal complementado con cobre, calcio (=0.5 mM) , B27, ácido ascórbico, insulina, transferrina/Fe, bFGF, ciclopamina, ácido retinoico, exendina 4, lipoproteína de alta densidad, y una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina; y que carecen de hidrocortisona durante un tiempo suficiente para permitir su diferenciación en células pancreáticas.

51.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque los otros componentes de matriz comprenden colágeno de tipo IV, laminina, o ambos.

52.- Un método in vitro de restricción de linaje de células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, y/o poblaciones de células multipotenciales que comprende o está enriquecido para dichas células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero, a células de árbol biliar, que comprende: (a) embeber una suspensión de células que comprende las células madre/progenitoras multipotenciales de mamífero capaces de diferenciarse en múltiples linajes endodérmicos, en donde las células fueron obtenidas de tejido del árbol biliar de un mamífero en un hidrogel que comprende hialuronanos o hialuronanos en combinación con otros componentes de matriz; y (b) cultivar las células en un medio basal complementado con cobre, calcio (=0.5 mM), insulina, transferrina/Fe, hidrocortisona, bFGF, factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , lipoproteína de alta densidad, y una mezcla de ácidos grasos libres unidos a albúmina, durante un tiempo suficiente para su diferenciación en colangiocitos.

53.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque las células del árbol biliar comprenden colangiocitos.

54.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque los otros componentes de matriz comprenden colágeno de tipo I.