MX2012001560A - Formulaciones de polipeptido concentradas con viscosidad reducida. - Google Patents

Abstract

La presente invención es concerniente con formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida y métodos de fabricación y uso de formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida.

Description

FORMULACIONES DE POLIPEPTIDO CONCENTRADAS CON VISCOSIDAD REDUCIDA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida y métodos de fabricación y uso de las formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La investigación de polipéptidos y el comportamiento en solución en condiciones altamente concentradas es critica para el entendimiento de la estabilidad, seguridad y eficacia de terapéuticos biológicos. Recientemente, los efectos de la concentración de polipéptido incrementada sobre la estabilidad y seguridad de terapéuticos biológicos ha ganado atención significativa de la industria de biotecnología y la Administración de Alimentos y Medicinas (FDA) . La estabilidad fisicoquímica de los terapéuticos biológicos puede ser- afectada negativamente simplemente al incrementar la concentración del polipéptido. La inestabilidad química comúnmente sigue una cinética de primer orden con respecto a la concentración; sin embargo, la inestabilidad física puede dar como resultado procesos de orden superior complejos. Se ha demostrado que la concentración incrementada de polipéptidos, tales como concentración de IgG, incrementa la auto-asociación de estas moléculas dando como resultado propiedades en solución no ideales incrementadas y afecta significativamente la viscosidad y comportamiento reológico.

La administración subcutánea de terapéuticos biológicos de alta concentración presenta un desafio notable a los científicos farmacéuticos. Para regímenes de alta dosis, la concentración requerida del polipéptido es frecuentemente mayor de 100 mg/ml dando como resultado potencialmente propiedades en solución no ideales, estabilidad disminuida y/o manufacturabilidad disminuida y administración disminuida. Un reto mayor en el desarrollo de tales formulaciones es su alta viscosidad .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN Se proveen en la presente formulaciones líquidas que comprenden (a) un polipéptido en una cantidad mayor de aproximadamente 50 mg/ml y (b) sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilacetamida (DMA) en una cantidad de entre aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% y/v de la formulación, en donde la formulación tiene viscosidad reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA.

También se proveen en la presente métodos de fabricación de formulaciones líquidas que comprenden combinar (a) un polipéptido en una cantidad mayor de aproximadamente 50 mg/ml y (b) sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilacetamida (DMA) en una cantidad de entre aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% v/v de la formulación, en donde la formulación tiene viscosidad reducida en comparación con la misma formulación en ausencia, de DMSO o DMA que comprende combinar el polipéptido y DMSO o DMA.

También se proveen en la presente artículos de manufactura- que comprenden un recipiente que contiene una formulación líquida que comprende (a) un polipéptido en una cantidad mayor de aproximadamente 50 mq/ml y (b) sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilacetamida (DMA) en una cantidad de entre aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% v/v de la formulación, en donde la formulación tiene viscosidad reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA.

Además, se proveen en la presente métodos de uso de una formulación líquida que comprende (a) un polipéptido en una cantidad mayor de aproximadamente 50 mg/ml y (b) sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilacetamida (DMA) en una cantidad de entre aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% v/v de la formulación, en donde la formulación tiene viscosidad reducida, en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA para tratar una enfermedad o alteración que comprende administrar la formulación a un sujeto en necesidad de la misma .

También se proveen en la presente métodos de administración de una formulación liquida que comprende (a) un polipéptido en una cantidad mayor de aproximadamente 50 mg/ml y (b) sulfóxido de dimetilo (D SO) o dimetilacetamida (DMA) en una cantidad de entre aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% v/v de la formulación, en donde la formulación tiene viscosidad reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar la formulación.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, el polipéptido es capaz de formar una estructura secundaria, estructura terciaria, y/o estructura cuaternaria. En algunas modalidades, la estructura secundaria es una hoja ß.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, el polipéptido es hidrofóbico.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artáculos de manufactura, el polipéptido es de aproximadamente 100 aminoácidos o mayor.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, el polipéptido tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 5, 000 Daltons.

. En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, el polipéptido es un polipéptido terapéutico.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o anticuerpo humano. En algunas modalidades, el anticuerpo- monoclonal es un anticuerpo monoclonal IgG. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de enlace de antígeno. En algunas modalidades, el fragmento de enlace de antigeno es seleccionado del grupo que consiste de un fragmento de Fab, un fragmento de Fab' , un fragmento de F(ab')2, un scFv, un Fv, y un diacuerpo.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos' y artículos de manufactura, el polipéptido incluye uno o más de estos parámetros.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, DMSO o DMA está en una cantidad de entre aproximadamente 1% a aproximadamente 10% v/v de la formulación. En algunas modalidades, DMSO o DMA está en una cantidad de entre aproximadamente 1% a aproximadamente 5% v/v de la formulación.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, la formulación comprende además histidina. En algunas modalidades, la histidina está en una cantidad de entre aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, la formulación comprende además arginina-HCl . En algunas modalidades, arginina-HCl está en una cantidad de entre aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, el polipéptido está en una cantidad de aproximadamente 100 mg/ml o mayor. En algunas modalidades, el polipéptido está en una cantidad de entre aproximadamente 100 mg/ml y aproximadamente 300 mg/ml.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, la viscosidad es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA por entre aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 cP. En algunas modalidades, la viscosidad es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA por entre aproximadamente 5 a aproximadamente 100 cP.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, la viscosidad es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA por entre aproximadamente 1.2 y aproximadamente 10 veces. En algunas modalidades, la viscosidad es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA por entre aproximadamente 1.2 y aproximadamente 5 veces .

'En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, la viscosidad es de aproximadamente 50 cP o menor. En algunas modalidades, la viscosidad es de aproximadamente 25 cP o menor.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, el pH es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8. En algunas modalidades, el pH es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6.5.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, DMSO o DMA es DMSO. En algunas modalidades, DMSO o DMA es DMA.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, la formulación es formulada para administración por inyección. En algunas modalidades, la formulación es formulada para administración mediante inyección subcutánea.

En algunas modalidades de cualquiera de las formulaciones, métodos y artículos de manufactura, el recipiente es una jeringa. En algunas modalidades, la jeringa está contenida además dentro de un dispositivo de inyección. En algunas modalidades, el dispositivo de inyección es un autoinyector .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una viscosidad de 145 mg/ml de soluciones anti-IFN o¡ en presencia de cantidades variadas de DMSO o DMA. La especie y concentración de la solución de pH regulado fue cloruro de histidina (25, 50, y 75 mM) , pH 5.4.

La Figura 2 muestra la viscosidad de anti-IFN OÍ, 140 mg/ml, soluciones de cloruro de histidina 25 mM en presencia (circuios rojos) y ausencia (cuadrados negros) de DMSO al 10% v/v como función del pH.

La Figura 3 muestra la viscosidad de anti-IFN 145 mg/ml, cloruro de histidina 25 mM, pH 5.4 en presencia y ausencia de cantidades variadas de cloruro de arginina y co-solvente .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Formulaciones y Métodos de Fabricación de las Formulaciones Se provee en la presente formulaciones liquidas que comprenden (a) un polipéptido y (b) sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilacetamida (DMA), en donde la formulación tiene viscosidad reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de (esto es, carente de) de DMSO o DMA. También se provee en la presente métodos de fabricación de la formulación de formulaciones liquidas que comprenden (a) un polipéptido y (b) sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilacetamida (DMA), en donde la formulación tiene viscosidad reducida en comparación con la misma formulación en ausencia (esto es, carente de) de DMSO o DMA que comprende combinar el polipéptido y DMSO o DMA.

DMSO es el compuesto químico de fórmula (CH3)2SO. DMSO es un líquido incoloro y un solvente aprótico polar importante que disuelve tanto compuestos polares como no polares y es miscible en un amplio intervalo de solventes orgánicos también como agua. DMA es el compuesto orgánico de fórmula CH3C (O) (CH3) 2 · DMA es incoloro, miscible en agua, de alto punto de ebullición y es miscible con la mayoría de los otros solventes, aunque es escasamente soluble en hidrocarburos alifáticos. En algunas modalidades, DMSO o DMA en la formulación de polipéptido está en una cantidad de entre aproximadamente cualquiera de 0.1% a 2.5%, 0.1% a 5%, 0.1% a 7.5%, 0.1% a 10%, 1% a 2.5%, 1% a 5%, 1% a 7.5%, 1% a 10%, 1% a 15%, 1% a 20%, 1% a 25%, 1% a 30%, 1% a 40% o 1% a 50% de la formulación. En algunas modalidades, DMSO o DMA de la formulación de polipéptido que comprende DMSO o DMA está en una cantidad de aproximadamente cualquiera de 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%. En algunas modalidades, DMSO o DMA es DMSO. En algunas modalidades, DMSO o DMA es DMA. En algunas modalidades, DMSO o DMA está una combinación de DMSO y DMA.

En algunas modalidades, la viscosidad es viscosidad cortante. La viscosidad cortante es el coeficiente de viscosidad cuando el esfuerzo . aplicado es esfuerzo cortante (válido para fluidos no Newtonianos) . Viscosidad cortante = esfuerzo cortante / velocidad de esfuerzo cortante.

En algunas modalidades, la viscosidad cortante de la formulación de polipéptido que comprende DMSO o DMA es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia (esto es, que carece) de DMSO o DMA por entre aproximadamente cualquiera de 1 cP a 1000 cP, 1 cP a 500 cP, 1 cP a 250 cP, 1 cP a 100 cP, 1 cP a 75 cP, 1 cP a 50 cP, 1 cP a 40 cP, 1 cP a 30 cP, 1 cP a 25 cP, 1 cP a 20 cP, 1 cP a 15 cP, 1 cP a 10 cP, 5 cP a 100 cP, 5 cP a 50 cP, 5 cP a 25 cP, o 5 cP a 15 cP. La viscosidad cortante de la formulación de polipéptido que comprende DMSO o DMA puede ser en algunas modalidades reducida en comparación con la misma formulación en ausencia (esto es, que carece) de DMSO o DMA por mayor de aproximadamente de cualquiera de 1 cP, 5 cP, 10 cP, 15 cP, 20 cP, 25 cP, 50 cP, 100 cP, 250 cP, 500 cP, o 1000 cP. La viscosidad cortante de la formulación de polipéptido que comprende DMSO o DMA puede ser en algunas modalidades reducida en comparación con la misma formulación en ausencia (esto es, que carece) de DMSO o DMA por aproximadamente cualquiera de 1 cP, 5 cP, 10 cPr 15 cP, 20 cP, 25 cP, 50 cP, 100 cP, 250 cP, 500 cP, o 1000 cP.

En algunas modalidades, la viscosidad de la formulación de polipéptido que comprende DMSO o DMA es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia (esto es, que carece) de DMSO o DMA por entre aproximadamente cualquiera de 1.2 veces y 5 veces, 1.2 veces y 10 veces, 1.2 veces y 20 veces, 2 veces a 5 veces, 2 veces a 10 veces, o 2 veces a 20 veces. La viscosidad de la formulación de polipéptido que comprende DMSO o DMA puede ser en algunas modalidades reducida en comparación con la misma formulación en ausencia (esto es, que carece) de DMSO o DMA por mayor de aproximadamente cualquiera de 1.2 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, o 50 veces. En algunas modalidades, la viscosidad es viscosidad cortante.

En algunas modalidades, la viscosidad cortante de lá formulación de polipéptido que comprende DMSO o DMA es aproximadamente cualquiera de 100 cP o menor, 75 cP o menor, 50 cP o menor, 25 cP o menor, 20 cP o menor, 15 cP o menor, o 10 cP o menor. La viscosidad cortante de la formulación de polipéptido que comprende DMSO o DMA puede ser en algunas modalidades de entre aproximadamente cualquiera de 5 cP a 30 cP, 10 cP a 30 cP, 10 cP a 25 cP, o 15 cP a 25 cP.

En algunas modalidades, el polipéptido en la formulación está en cualquier cantidad de aproximadamente cualquiera mayor de 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 120 mg/ml, 130 mg/ml, 140 mg/ml, 150 mg/ml, 160 mg/ml, 170 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, o 300 mg/ral. El polipéptido en la formulación puede estar en una cantidad de aproximadamente cualquiera de entre aproximadamente 50 mg/ml y 300 mg/ml, 50 mg/ml . y 200 mg/ml, 100 mg/ml y 300 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml, 120 mg/ml y 300 mg/ml, 140 mg/ml y 300 mg/ml, o 160 mg/ml y 300 mg/ml. En algunas modalidades, el polipéptido en la formulación está en una cantidad de aproximadamente cualquiera de 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 120 mg/ml, 130 mg/ml, 140 mg/ml, 150 mg/ml, 160 mg/ml, 170 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, o 300 mg/ml.

Las formulaciones de polipéptido en algunas modalidades pueden ser preparadas para almacenamiento al mezclar un polipéptido que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.

"Portadores" como se usa en la presente incluyen portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables farmacéuticamente que no son tóxicos a la célula o mamífero que es expuesto a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Frecuentemente, el portador aceptable fisiológicamente es una solución de pH regulado acuosa.

Portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes en los que se incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o alcohol bencílico; alquil parabenes tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 1G residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) .

En algunas modalidades, la formulación de polipéptido comprende además histidina. En algunas modalidades, histidina está presente en la formulación de polipéptido en una cantidad de aproximadamente cualquiera de 10 mM a 100 mM, 25 mM a 100 mM, 50 mM a 100 mM, 10 mM a 200 mM, 25 Mm a 200 mM, 50 mM a 200 mM, o 100 mM a 200 mM. En algunas modalidades, la formulación de polipéptido comprende además arginina-HCl . En algunas modalidades, la arginina-HCl está en una cantidad de aproximadamente cualquiera de 10 mM a 100 mM, 25 mM a .100 mM, 50 mM a 100 mM, 10 mM a 200 mM, 25 mM a 200 mM, 50 mM a 200 mM, o 100 mM a 200 mM.

En algunas modalidades, el pH de la formulación de polipéptido esté entre aproximadamente cualquiera de 5 y 8, 5 y 7, 5 y 6.5, 5 y 6 ó 5.5 y 6.

En algunas modalidades, el polipéptido en la formulación de polipéptido mantiene actividad funcional.

Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles .

Las formulaciones en la presente pueden también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre si. Por ejemplo, además de un polipéptido, puede ser deseable incluir en la formulación, un polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) adicional. Alternativa o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-hormonal , y/o agente cardioprotector . Tales moléculas están presentes apropiadamente en combinación en cantidades que son efectivas por el propósito planeado .

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) variaciones que están dirigidas a aquel valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "o", y "el" incluyen referencias plurales a no ser que el contexto lo defina claramente de otra manera. Se comprenderá que aspectos y variaciones de la invención descritos en la presente incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente de" aspectos y variaciones .

II. Polipéptidos Se proveen en la presente polipéptidos para uso en cualquiera de las formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida y métodos de fabricación, de formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida que son descritas en la presente .

(A) Definiciones para polipéptidos El término "polipéptido" como se usa en la presente significa una secuencia de aminoácidos mayor de 50 aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo. "Aminoácidos" como se usa en la presente incluye que se presentan naturalmente y que no se presentan naturalmente. Los aminoácidos incluyen análogos, tales como análogos pegulados, ñlipidizados y/o toxinas-conjugados.

Polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) "purificado" significa que el polipéptido ha sido incrementado en pureza, de tal manera que existe en una forma que es más pura que la que existe en su medio ambiente natural y/o cuando es sintetizado y/o amplificado bajo condiciones de laboratorio. La pureza es un término relativo y no significa necesariamente pureza absoluta.

El término "epitope marcado" cuando se usa en la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido fusionado a un "polipéptido de etiqueta". En el polipéptido de etiqueta tiene suficientes residuos para proveer un epitope contra el cual se puede hacer un anticuerpo, todavía es lo suficientemente corto de tal manera que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual es fusionado. El polipéptido de etiqueta también preferiblemente es bastante único de tal manera que el anticuerpo no reacciona sustancialmente de manera cruzada con otros epítopes.

Polipéptidos de etiqueta apropiados en general tienen por lo menos seis residuos de aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos) .

"Activo" o "actividad" para los propósitos de la presente se refiere a forma (s) de un polipéptido que retienen una actividad biológica y/o inmunológica del polipéptido natural o que ocurre naturalmente, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimuladora) provocada por un polipéptido natural o que ocurre naturalmente diferente a la habilidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epitope antigénico producido por un polipéptido natural o que ocurre naturalmente y una actividad "inmunológica" se refiere a la habilidad para inducir la producción del anticuerpo contra un epitope antigénico poseído por un polipéptido natural o que ocurre naturalmente .

El término "antagonista" es usado en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial o plenamente, inhibe o neutraliza la actividad biológica de un polipéptido natural. De manera similar, el término "agonista" es usado en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido natural. Moléculas agonistas o antagonistas apropiadas incluyen específicamente anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos naturales, etc. Métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido con una molécula de agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido.

"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la habilidad de una molécula para someter a lisis un objetivo en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento es iniciada por el enlace del primer componente al sistema del complemento (Clq) a una molécula ( por ejemplo, polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) ) acomplejada con un antígeno cognato. Para determinar la activación del complemento, se puede efectuar un análisis de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Un polipéptido "que se enlaza" a un antígeno de interés, por ejemplo, un objetivo de antígeno de polipéptido tumor-asociado, es uno que se enlaza al antígeno con suficiente afinidad, de tal manera que el polipéptido es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el apuntamiento de una célula o tejido que expresa el antígeno y no reacciona de manera cruzada significativamente con otros polipéptidos. De tales modalidades, la extensión de enlace del polipéptido a un polipéptido "no objetivo" será menor de aproximadamente 10% del enlace del polipéptido a su polipéptido objetivo particular tal como se determina mediante análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA) .

Con respecto al enlace de un polipéptido a una molécula objetivo, el término "enlace especifico" o "se enlaza específicamente a" o "es específico para" un polipéptido particular o un epítope sobre un objetivo de polipéptido particular significa enlace que es mensurablemente diferente de una interacción no específica. El enlace específico puede ser medido, por ejemplo, al determinar el enlace de una molécula en comparación con el enlace de una molécula testigo, que en general es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de enlace. Por ejemplo, el enlace específico puede ser determinado mediante competencia con una molécula testigo que es similar al objetivo, por ejemplo, un exceso de objetivo no marcado. En este caso, el enlace específico es indicado si el enlace del objetivo marcado a una sonda es inhibido competitivamente por el objetivo sin marcar en exceso.

El término "enlace específico" o "sin enlace específicamente a" o "es específico para" un polipéptido particular o un epítope sobre un objetivo de polipéptido particular, como se usa en la presente puede ser exhibida, por una molécula que tiene una Kd por el objetivo de por lo menos aproximadamente 10" ¦4 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" ¦5 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" •6 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" •7 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" ¦8 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" ¦9 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" 10 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10" •11 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10"12 M o mayor. En una modalidad, el término "enlace especifico" se refiere al enlace en donde una molécula se enlaza al polipéptido particular o epitope sobre un polipéptido particular sin enlazarse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epitope de polipéptido.

Un polipéptido que "inhibe el crecimiento de células de tumor" o un polipéptido "inhibidor de crecimiento" es uno que da como resultado inhibición de crecimiento mensurable de células de cáncer. En una modalidad, la inhibición de crecimiento puede ser medida a una concentración de polipéptido de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 µg/ml o aproximadamente 0.5 nM a aproximadamente 200 nM en cultivo celular, en donde la dimensión de crecimiento es determinada 1-10 días después de la exposición de las células de tumor al polipéptido. La inhibición del crecimiento de células de tumor in vivo puede ser determinada de varias maneras, tal como se describe en la sección de Ejemplos Experimentales a continuación. El polipéptido es inhibidor de crecimiento in vivo si la administración del polipéptido a aproximadamente 1 µ?/Kg a . aproximadamente 100 mg/Kg de peso corporal da como resultado reducción en el tamaño del tumor o proliferación de células del tumor en el transcurso de aproximadamente 5 días a aproximadamente 3 meses a partir de la primera administración del polipéptido, preferiblemente en el transcurso de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 días.

Un polipéptido que "induce apoptosis" es uno que induce muerte celular programada, tal como se determina mediante enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación de retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamados cuerpos apoptóticos) . Preferiblemente, la célula es una célula de tumor, por ejemplo, una célula de próstata, pecho, ovario, estómago, endometrial, pulmón, riñon, colon, vejiga. Varios métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidilserina (PS) puede ser medida mediante enlace de anexina; la fragmentación de ADN puede ser evaluada por medio de formación de escalera de ADN y condensación nuclear/de cromatina junto con fragmentación de ADN puede ser evaluada por cualquier incremento de células hipodiploides . Preferiblemente, el polipéptido que induce apoptosis es uno que da como resultado aproximadamente 2 a aproximadamente 50 veces, preferiblemente alrededor de 5 a alrededor de 50 veces y más preferiblemente alrededor de 10 a alrededor de 50 veces, inducción de enlaces de anexina en relación con las células sin tratar en un análisis de enlaces de anexina.

Un polipéptido que "induce muerte celular" es uno que provoca · que una célula viable se vuelva no viable. Preferiblemente, la célula es una célula de cáncer, por ejemplo, una célula de pecho, ovario, estómago, endometrial, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroides, pancreática o de vejiga. La muerte celular in vitro puede ser determinada en ausencia de complemento y las células efectoras inmunes para distinguir muerte celular inducida por citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . Así, el análisis en cuanto a muerte celular puede ser efectuado utilizando suero desactivado térmicamente (esto es, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el polipéptido es apto de inducir muerte celular, la pérdida de integridad de membrana tal como es evaluada mediante absorción de yoduro de propidio (PI), azul de tripano (véase Moore et al., Cytotechnology 17:1-11 (1995)) o 7AAD puede ser determinada en relación con las células sin tratar.

(B) Pollpéptidos Se proveen en la presente polipéptidos para uso en cualquiera de las formulaciones de polipéptido con viscosidad producida y métodos para fabricar formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida.

En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. El polipéptido terapéutico puede inhibir el crecimiento de células de tumor, inducir apoptpsis y/o inducir muerte celular. En algunas modalidades, el polipéptido es un antagonista. En algunas modalidades, el polipéptido es un agonista. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo.

En algunas modalidades, el polipéptido es mayor que aproximadamente cualquiera de 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, '500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, o 1000 aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido tiene un peso molecular mayor de cualquiera de aproximadamente 5,000 Daltons, 10,000 Daltons, 15,000 Daltons, 25,000 Daltons, 50,000 Daltons, 75,000 Daltons, 100,000 Dalton, 125,000 Daltons o 150,000 Daltons. El polipéptido puede tener un peso molecular de entre aproximadamente cualquiera de 50,000 Daltons a 200,000 Daltons o 100,000 Daltons a 200,000 Daltons. Alternativamente, el polipéptido para uso en la presente puede tener un peso molecular de aproximadamente 120,000 Daltons o aproximadamente 25,000 Daltons.

En algunas modalidades, el polipéptido es capaz de formar una estructura secundaria, estructura terciaria y/o estructura cuaternaria. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una estructura secundaria, en donde la estructura secundaria es una a-hélice. El polipéptido puede comprender •menos de aproximadamente cualquiera de 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20% o 10% de una estructura secundaria de a-hélice. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una estructura secundaria, en donde la estructura secundaria es una hoja ß. El polipéptido puede comprender mayor de aproximadamente cualquiera de 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% o 90% de una estructura secundaria de hoja ß.

En algunas modalidades, el polipéptido tiene una baja hidrofilicidad media. La hidrofilicidad es definida como en Hopp, T.P. y Woods, K.R. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78(6), 3824-382 (1981) . La hidrofilicidad es una propiedad concerniente con interacciones termodinámicas favorable con agua. Los valores de hidrofilicidad de aminoácidos individuales determinados por Hopp y Woods pueden ser usados para cuantificar la hidrofilicidad relativa. En general, valores de hidrofilicidad positivos son observados para cadenas laterales cargadas y polares y valores negativos para cadenas laterales no polares. En algunas modalidades, el polipéptido tiene una hidrofilicidad promedio de entre aproximadamente cualquiera de -3 a l, -3 a 0, -2 a 1, -2 a 0, -1 a 1 o -1 a 0. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo, en donde una o más de las regiones de CDR tiene una hidrofilicidad promedio ¦ menor que cualquiera de aproximadamente 0, -1, -2 o -3. En algunas modalidades, por lo menos aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 regiones de CDR tienen una hidrofilicidad promedio menor de aproximadamente cualquiera de 0, -1, -2 o -3. En algunas modalidades, la hidrofilicidad promedio sobre las seis CDR del anticuerpo es menor que cualquiera de aproximadamente 0, -1, -2 o -3.

En algunas modalidades, el polipéptido tiene alta hidrofobicidad. La hidrofobicidad es definida como en Kyte, J. y Doolittle, R.F., J. Mol. Bio. 157, 105-132 (1982). La hidrofobicidad es indicada cuando hay Fuertes interacciones solvent-solvente (agua) que impulsan a las moléculas a no interactuar fuertemente con el solvente de la fase de solvente. La hidrofobicidad puede ser medida al repartir los aminoácidos individuales entre una fase acuosa y una fase orgánica. Este coeficiente de divisiones definido como la fracción mol de moléculas en fase acuosa en relación con la fracción mol en la fase orgánica. En general, se observan valores de hidropatía positivos para cadenas laterales no polares e hidropatía negativos para cadenas laterales polares y cargadas. En algunas modalidades, los polipéptidos tienen un intervalo para hidrofobicidad promedio entre aproximadamente cualquiera de 2 a -1, 2 a 1, 2 a 0 o 1 a -1. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo, en donde la ene una alta hidrofobicidad promedio. En algunas modalidades, la región de CDR tiene una hidrofobicidad promedio mayor que aproximadamente cualquiera de 0, 1 o 2. En algunas modalidades, por lo menos aproximadamente cualquiera de l, 2, 3, 4, 5 o 6 regiones de CDR tienen una hidrofobicidad promedio mayor de aproximadamente cualquiera de 0, 1 o 2. En algunas modalidades, la hidrofobicidad promedio de las seis CDR del anticuerpo es mayor de aproximadamente cualquiera de 0, 1 o 2.

En algunas modalidades, el polipéptido tiene pocos grupos de cadenas laterals de aminoácidos cargados. La distribución de carga y heterogeneidad pueden ser importantes. Heterogeneidad de carga, valores de hidropatía positivos son observados para cadenas laterales no polares e nhidropatía negatova para cadenas laterales polares y cargadas. En algunas modalidades, el polipéptido tiene menos de aproximadamente cualquiera de 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% o 10% de grupos de cadena lateral de aminoácidos cargados. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo, en donde la región de CDR tiene pocos grupos de cadena lateral de aminoácidos cargados. En algunas modalidades, la región de CDR tiene menos de aproximadamente cualguiera de 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% o 10% de grupos de cadena lateral de aminoácidos cargados.

En algunas modalidades de las formulaciones, los polipéptidos incluyen uno o más de estos parámetros. En algunas modalidades, el polipéptido tiene pocas cadenas laterales de aminoácidos cargadas y una alta hidrofobicidad. En algunas modalidades, el polipéptido tiene pocas cadenas laterales de aminoácidos cargadas y una baja hidrofilicidad media. En algunas modalidades, el polipéptido tiene alta hidrofobicidad y una baja hidrofilicidad media. En algunas modalidades, el polipéptido tiene alta hidrofobicidad, una baja hidrofilicidad media y pocas cadenas laterales de aminoácidos cargadas.

Ejemplos de polipéptidos útiles en las formulaciones y métodos descritos en la presente incluyen polipéptidos mamíferos, tales como por ejemplo, hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovino; factor de liberación e hormona de crecimiento; hormona paratiroides; hormona estimuladora de tiroides; lipoproteínas ; a-1-antitripsina, cadena A de • insulina; cadena B de insulina; proinsuluna, hormona estimulante de folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tal como Factor VIIIc, factor IX, Factor de tejido y factor de von Willebrands; factores anti-coagulación, tal como proteina C; 6factor natriurético atrial; surfactante de pulmón, un activador de plasminógeno, tal como urocinasa o activador de plasminógeno tipo tejido (t-PA, por ejemplo, Activase™, TNKase™, Retevase™) ; bombazina; trombina; factores alfa y beta de tumor de necrosis; encefalinasa ; RANTES (célula T normalmente regulada en la activación expresada y secretada) ; proteina inflamatoria de macrófago humana (???-1-a) ; albúmina de suero tal como albúmina de suero humano; sustancia inhibidora muleriana; cadena de relaxina A; cadena de . relaxina B; prorelaxina; péptido gonadotropina de ratón-asociado; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores para hormonas o factores de crecimiento; una integrina; proteina A o D, factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF) ; neurotrofina 3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT , NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento de nervios tales como NGF-ß; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; factor de crecimiento de fibroblasto tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-OÍ y TGF-ß, en los que se incluyen TGF-ß? , TGF-p2, TGF-ß3, GF- 4 o TGF-ßd; factor de crecimiento -I y -II semejante a insulina (IGF-I y IGF-II); des ( 1-3 ) -IGF-I (IGF-I de cerebro); proteínas de enlace del factor de - crecimiento semejante a insulina; proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina (EPO) ; trombopoyetina (TPO) ; factores osteoinductivas ; inmunotoxinas ; una proteína morfogenética de hueso (BMP) ; un inteferón tal como interferón -OÍ, -ß y -?, factores estimulantes de colonias (CSF) , por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerante de decaimiento (DAF) ; un antígeno viral, tal como por ejemplo, una porción del envolvente de SIDA; proteína de transporte; receptores de albergamiento; adresinas; proteínas reguladoras; inmunoadhesinas ; anticuerpos y fragmentos biológicamente activos y variantes de cualquiera de los polipéptidos enlistados anteriormente.

C . Anticuerpos El polipéptido para uso en cualquiera de las formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida y métodos de fabricación de formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida en algunas modalidades, puede ser un anticuerpo.

Objetivos moleculares para anticuerpos abarcados por la presente invención incluyen proteínas CD y sus ligandos, tales como pero no limitado a: ((i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79a (CD79a) , y CD79D (CD79b) ; (ii) miembros de la familia del receptor ErbB tal como el receptor EGB, receptor HER2, HER3 o HER4 ; (iii) moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y v/3 integrina, incluyendo ya sea subunidades alfa o beta de los mismos (por ejemplo, anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb) ; (iv) factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antigenos del grupo sanguíneo; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) ; receptor de MPL; CTLA-4; proteína C, BR3, c-met, factor de tejido, etc, y (v) antígenos asociados a tumor de transmembrana y superficie celular (TAA) tales como aquellos descritos en la patente estadounidense N° 7.521.541.

Otros anticuerpos ejemplares abarcados por la presente invención incluyen aquellos seleccionados de y sin limitación, anticuerpo receptor de anti-estrógeno, anticuerpo receptor anti-progesterona, anticuerpo anti-p53, anticuerpo anti-HER-2 /neu, anticuerpos anti-EGFR, anticuerpos anti-catepsina D, anticuerpos anti-Bcl-2, anticuerpo anti-E-caderina, anticuerpo anti-CA125, anticuerpo CA15-3, anticuerpo anti-CA19-9,' anticuerpos anti-c-erbB-2 , anticuerpo anti-P-glicoproteína, anticuerpo anti-CEA, anti-anticuerpo proteína retinoblastoma, anticuerpo anti-ras oncoproteína, anticuerpo anti-Lewis X, anticuerpo anti-Ki-67, anticuerpo anti-PCNA, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD5, anticuerpo anti-CD7, anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD9/p24, anticuerpo anti-CD10, anticuerpo anti-CDllc, anticuerpo anti-CD13, anticuerpo anti-CD14, anticuerpo anti-CD15, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD23, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD31, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD34, anticuerpo anti-CD35, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo ariti-CD41, anticuerpo anti-LCA/CD45 , anticuerpo anti-CD45RO, anticuerpo anti-CD45RA, anticuerpo anti-CD39, anticuerpo anti-CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas, anticuerpo anti-CD99, anticuerpo anti-CD106, anticuerpo anti-ubiquitina, anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-c-myc, anticuerpo anti-citoqueratinas, anticuerpo anti-vimentina, anticuerpo de proteínas anti-HPV, anticuerpo de cadenas ligeras anti-kappa, anticuerpo de cadena ligeras anti-lambda, anticuerpo anti-melanosomas, anticuerpo de antígeno específico de antipróstata, anticuerpo anti-S-100, anticuerpo de antígeno anti-tau, anticuerpo anti-fibrina, anticuerpo anti-queratinas y anticuerpo anti-Tn-antígeno .

(±) Definiciones para anticuerpos El término "anticuerpo" en la presente es usado en el sentido más amplio y . cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos ) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos en tanto que exhiban la actividad biológica deseada. El término " inmunoglobulina" (Ig) es usado intercambiablemente con anticuerpo en la presente.

Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina que se presentan naturalmente que tienen estructuras variables, todas basadas en el pliegue de inmunoglobulina. Por ejemplo, anticuerpos IgG tienen dos cadenas "pesadas" y dos cadenas "ligeras" que están enlazadas por disulfuro para formar un anticuerpo funcional. Cada cadena pesada y cadena ligera en si misma comprende una región "constante" (C) y una región "variable" (V) . Las regiones V determinan la especificidad de enlace de antigeno del anticuerpo, mientras que las regiones C proveen soporte estructural y función en interacciones no antigeno-especificas con efectores inmunes. La especificidad de enlace de antigeno de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de un anticuerpo es la habilidad de un anticuerpo para enlazarse específicamente a un antigeno particular.

La especificidad de enlace a antigeno de un anticuerpo es determinada por las características estructurales de la región V. La variabilidad no está distribuida igualmente a través de todos los 110 aminoácidos de los dominios variables. En lugar de esto, las regiones V consisten de estiramientos relativamente no variantes llamados regiones de estructura (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema llamadas "regiones hipervariables" que son cada una de 9-12 aminoácidos de largo. Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cuatro FR, que adoptan extensamente una configuración de hoja ß, unidas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que unen y algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas conjuntamente en proximidad estrecha por las FR y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antigeno de anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en la enlace de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .

Cada región V comprende comúnmente tres regiones que determinan "la complementariedad ("CDR", cada una de las cuales contiene un "bucle hipervariable" ) y cuatro regiones de estructura. Un sitio de enlace de antigeno, la unidad estructural mínima requerida para enlazarse con afinidad sustancial a un antígeno deseado particular, incluirá comúnmente por consiguiente las tres CDR y por lo menos tres, preferiblemente cuatro regiones de estructura intercaladas entre las mismas para contener y presentar las CDR en la conformación apropiada. Los anticuerpos de cuatro cadenas clásicos tienen sitios de enlace de antígeno que son definidos por dominios VH y VL en cooperación. Ciertos anticuerpos, tales como anticuerpos de camello y tiburón carecen de cadenas ligeras y dependen de los sitios de enlace formados por cadenas pesadas solamente. Inmunoglobulinas diseñadas de un solo dominio pueden ser preparadas en las cuales los sitios de enlace son formados por cadenas pesadas o cadenas ligeras solas, en ausencia de cooperación entre VH y VL.

En toda la presente especificación y reivindicaciones, a no ser que se indique de otra manera, la numeración de los residuos en los dominios constantes de una cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice de EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, d. (1991), incorporada expresamente en la presente por referencia. El "índice de EU como en Kabat" se refiere a la numeración de. residuos del anticuerpo de Eu de IgGl humano. Los residuos en la región V son numerados de acuerdo con la numeración de Kabat a no ser que un sistema de numeración secuencial u otro sistema de numeración sea indicado específicamente.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usados en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadenas ligeras como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables son llamadas las regiones de estructura (FR) . Cada uno de los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales comprende cuatro FR, que adoptan extensamente una configuración de hoja ß, unidas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que unen y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena están mantenidas conjuntamente en proximidad de fecha por las FR y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antigeno de anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologícal Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables por el enlace de antigeno. La región hipervariable puede comprender residuos de aminoácido de una "región que determina la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el VL y alrededor de aproximadamente 31-35B (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.' Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91 a 96 (L3) en el VL y 26-32 (Hl), 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en el VH (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

Residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define en la presente.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la región de enlace de antigeno de la misma. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab ' , F (ab')2, y fragmentos Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de una sola cadena y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión de papaina de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antigeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de enlace de antigeno y un fragmento de "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizarse con fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento de F (ab')2 que tiene dos sitios de enlace de antigeno y es todavía apto de reticulación de antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y enlace de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación fuerte no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variables interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y enlazarse al antígeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace-.

El fragmento de Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHl) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos de Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio de CHl de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de engozne de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes llevan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F (ab')2 originalmente eran producidos como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteinas de engozne entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos son también conocidos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado puede ser asignada a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (?) y lambda (?) , basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se puede asignar a los anticuerpos a clases diferentes. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden ser divididos adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos son llamados d a, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de sub-unidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

Los fragmentos de anticuerpo de " Fv de una sola cadena" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido de Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para el enlace de antígeno. Para una revisión de scFv véase Plückthun in The Phar acology of Monoclonal Antíbodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de enlace de antigeno, tales fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) unido a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antigeno. Los diacuerpos son descritos más plenamente en, por ejemplo, EP 404,097; O 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se enlazan al mismo epitope, excepto por variantes posibles que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes en general están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes) , cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante sobre el antigeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que están sin contaminar por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se interpretará que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con los métodos provistos en la presente pueden ser fabricados por el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al; Nature 256:495 (1975), o pueden ser fabricados mediante métodos de ADN recombinantes (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden también ser aislados de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" ( inmunoglobulina ) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la (s) cadena (s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (Patente estadounidense No. 4.816.567, Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de enlace de antigeno de dominio variable derivadas de secuencias de región constante de primate no humano (por ejemplo, mono del Viejo Mundo, tal como babuinos monos rhesus o cnomolgus) y secuencias de región constante humanas (patente estadounidense No. 5.693.780).

Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Por la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunas instancias, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos' o sustancialmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por sustitución (es) de FR como se indica anteriormente. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) .

Para los propósitos en la presente, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables de cadena pesada y ligera también como una región de Fe. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humana) o una variante de secuencia de aminoácidos de los mismos.

Preferiblemente, él anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Para los propósitos en la presente, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros, también como una región de Fe. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humano) o una variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

"Anticuerpos naturales" son usualmente glicoproteinas heterotetraméricas de aproximadamente de 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas . Cada cadena pesada y ligera tiene puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable . (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio ¦ constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interface entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.

Un "anticuerpo descubierto" es un anticuerpo (como se define en la presente) que no está conjugado a una molécula heteróloga, tal como una porción citotóxica o radiomarcador .

En algunas modalidades, "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región de Fe (una región de Fe de secuencia natural o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: enlace de Clq y citotoxicidad dependiente de complemento; enlace de receptor Fe; citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular.

"Citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción moderada por la célula en la cual células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fe (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado sobre una célula objetivo y subsecuentemente causan . lisis de la célula objetivo. Las células primarias para moderar ADCC, células NK, expresan FCYRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FCYRII y FCYRIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas es resumida en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede efectuar un análisis de ADCC in vitro, tal como aquel descrito en la patente estadounidense N° 5500362 o 5821337. Células efectoras útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . Alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés pueden ser determinada in vivo, por ejemplo en un modelo animal tal como aquel revelado en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y efectúan funciones efectoras. En algunas modalidades, las células expresan por lo menos FCYRIII y llevan a cabo la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que moderan ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos ; PBMC y células NK son preferidas.

Los términos "receptor de Fe" o "FcR" son usados para describir un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades, el FcR es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcRII y FCYRIII, incluyendo variantes alélicas y alternativamente formas empalmadas de estos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor") que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene una porción de activación a base de tirosina de inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor de inhibición FcyRIIB contiene una porción de activación a base de tirosina de inmunoreceptora (ITI ) en su dominio citoplásmico. (Véase Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR son revisados en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. .126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo aquellos a ser identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994) ) . (ii) Anticuerpos policlonales En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales son criados preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antigeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antigeno relevante a un polipéptido que es inmunogeno en la especie a ser inmunizada, por ejemplo hemocianina de lapa de bocallave, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o un inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación por medio de residuos de cisteina) , N-hidroxisuccinimida (por medio de residuos de lisina) , glutaraldehido, anhídrido succínico, SOCÍ2, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogenos o derivados al combinar, por ejemplo 100 g o 5 -µ? del polipéptido o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días más tarde los animales son sangrados y el suero es analizado en cuanto a título de anticuerpo. Los animales son reforzados hasta que el título se estabiliza. En algunos animales, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a un diferente polipéptido y/o por medio de un reactivo d ! reticulación diferente. Los conjugados también pueden ser fabricados en cultivo celular recombinante como fusiones de polipéptido. También, agentes agregantes tales como alumbre son usados apropiadamente para mejorar la respuesta inmune. (iii) Anticuerpos monoclonales En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales son obtenidos de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se enlazan al mismo epitope excepto por posibles variantes que surgen durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes están en general presentes en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales .

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser elaborados utilizando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o pueden ser elaborados mediante métodos de ADN recombinante (patente estadounidense N° 4816567) .

En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describe en la presente para producir linfocitos que producen o son aptos de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente al polipéptido usado para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Luego, los linfocitos son fusionados con células de mieloma utilizando un agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) .

Las células de hibridoma así preparadas son sembradas y cultivan en un medio de cultivo apropiado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células mieloma parentales sin fusionar. Por ejemplo, si las células del mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá comúnmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio de HAT) , tales sustancias impiden el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

En algunas modalidades, las células de mieloma son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción a alto nivel estable de anticuerpo por las células que producen de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio de HAT. Entre estas, en algunas modalidades, la línea de célula de mieloma son líneas de mieloma murina, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Institute Cell Distribution Center, San Diego, California Estados Unidos de América y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Estados Unidos de América. Las lineas celulares de mieloma humano y lineas celulares heteromieloma de ratón-humano han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al.,. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio de cultivo en el -cual las células de hibridoma están creciendo es analizado en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. En algunas modalidades, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma es determinada mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de enlace in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) .

La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede por ejemplo, ser determinada mediante el análisis de Scatchard de Munson et al, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Después que células de hibridoma son identificadas que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de disolución limitantes y cultivados por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo medio de D-MEM o medio de RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como tumores de ascites en un animal .

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados apropiadamente del medio de cultivo, fluido de ascites o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, polipéptido A-Sefarosa, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es aislado fácilmente y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótidos que son aptas de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . En algunas modalidades, las células de hibridoma sirven como fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que son luego transfectados a células huésped tales como células de E. coli, células de COS de simio, células - de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen polipéptido de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en la.s células huésped recombinantes . Artículos de revisión en cuanto a la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol. 5:256-262 (1993) and Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

En una modalidad adicional, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados de bibliotecas de fagos de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and arks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y anticuerpos humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo n ) mediante entremezcla de cadena (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783- (1992)), también como infección combinatorial y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridomas de anticuerpos monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede ser modificado, por ejemplo al sustituir de la secuencia de codificación por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente estadounidense No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)) o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de - codificación para un polipéptido sin inmunoglobulina.

Comúnmente, tales polipéptidos sin inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad de un antigeno y otro sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad con un antigeno diferente. (iv) Anticuerpos humanizados En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Métodos para humanizar anticuerpos no humanos han sido descritos en el arte. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos al mismo de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son denominados frecuentemente como residuos de "importación", que son tomados comúnmente de un dominio variable "importación". La humanización puede ser efectuada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)) al sustituir secuencias de región hipervariables por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Asi, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente estadounidense No. 4.816.567) en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor .

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para ser usados en la fabricación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado métodos de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionada contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a aquella del roedor es luego aceptada como la región de estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Otro método usa una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. La mismo estructura puede ser usada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).

Es además importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, en algunas modalidades de los métodos, anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parental y humanizada. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares para aquellos experimentados en el arte. Están disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del. papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, esto es, el análisis de residuos que influencian la habilidad de la inmunoglobulina candidata para enlazarse a su antigeno. De esta manera, residuos de FR pueden ser seleccionados y combinados de las secuencias de receptor y de importación de tal manera que se obtiene la característica de anticuerpo deseada, tales como afinidad incrementada por el (los) antigeno (s) objetivo (s. En general, los residuos de región hipervariable están directa y más sustancialmente involucrados en influenciar el enlace de antigeno. (v) Anticuerpos humanos En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos humanos. Como una alternativa a la humanización, los anticuerpos humanos pueden ser generados. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son aptos, después de la inmunización, de producir un pleno repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la cancelación homociga del gen de región de unión de cadena pesada (JH) de anticuerpo en ratones quiméricos y ratones mutantes de linea germinal da como resultado inhibición completa de producción de anticuerpo endógena. La transferencia de arreglo del gen de inmunoglobulina de linea germinal humana en tales ratones mutantes de linea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del ataque de antigenos. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); y patentes estadounidenses No. 5,591,669; 5,589,369; y 5, 545, 807.

Alternativamente, se puede usar tecnología de despliegue de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores sin inmunizar. De acuerdo con esta técnica, genes de dominio V de anticuerpos son clonados en cuadro ya sea a un gen polipéptido de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd y desplegados como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. El despliegue de fago puede ser efectuado en una variedad de formatos; para su revisión, véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. and Chis ell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen V pueden ser usadas para el despliegue de fago. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) aislaron un arreglo diverso de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivados del bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos sin inmunizar puede ser construido y anticuerpos a un arreglo diverso de antigenos (incluyendo auto-antigenos) pueden ser aislados siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véase también, patentes estadounidenses Nos. 5.565.332 y 5.573.905.

Anticuerpos humanos pueden también ser generados mediante células B activadas in vitro (véase patentes estadounidenses 5,567,610 y 5,229,275). (vi) Fragmentos de anticuerpos En algunas modalidades, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos eran derivados vía digestión proteolitica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Bioche ical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden-ahora ser producidos directamente mediante las células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las bibliotecas de fago de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos de F (ab')2 (Cárter et al., Bio/'Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, fragmentos de F (ab')2 pueden ser aislados directamente de cultivo de células huésped recombinantes . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el técnico experimentado. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento de Fv de una sola cadena (scFv) . Véase WO 93/16185; patentes estadounidenses No. 5.571.894 .y No. 5.587.458. El fragmento de anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la patente estadounidense 5.641.870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecificos o biespecificos .

En algunas modalidades, se proveen fragmentos de los anticuerpos descritos en la presente. En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo son fragmentos de enlace de antigeno. (vil) Anticuerpos biespecificos En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos biespecificos . Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace por al menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecificos ejemplares se pueden enlazar a dos epítopes diferentes. Alternativamente, un brazo de enlace de anticuerpo biespecífico puede ser combinado con un brazo que se enlaza a una molécula de activación sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo CD2 o CD3) o receptores de Fe para IgG (FcyR) tales como FcyRI ( CD64 ) , FCYRI I (CD32) y FCYR I I I (CD16) para enfocar mecanismos de defensa celular a la célula. Anticuerpos biespecificos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F (ab1 ( 2 ) · Métodos para fabricar anticuerpos biespecificos son conocidos en el arte. La. producción tradicional de anticuerpos biespecificos de plena longitud está basada en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas , estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de los cuales solamente una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es más bien molesta y los rendimientos de producción son bajos. Procedimientos similares son revelados en WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con un procedimiento diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseada (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) son fusionados a secuencias de dominio constante de inmuno-globulina . En algunas modalidades, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones de engozne, CH2 y CH3. En algunas modalidades, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para enlace de cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados a vectores de expresión separados y son co-transfectados a un organismo huésped apropiado. Esto provee mayor flexibilidad para ajusfar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas . en la construcción proveen los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secüencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión, en donde la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significado particular.

En algunas modalidades de este procedimiento, los anticuerpos biespecificos son compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que provee una segunda especificidad de enlace) en el otro el brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecifico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina indeseables, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula biespecifica provee una manera de separación fácil. Este procedimiento es revelado en WO 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecificos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

De acuerdo con otro procedimiento descrito en la patente estadounidense N° 5.731.168,' la interface entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodimeros que son recuperados del cultivo de célula recombinante. En algunas modalidades, la interface comprende por lo menos parte del dominio de CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interface de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la (s) cadena (s) lateral (es) grande (s) es (son) creada (s) en la interface de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales de aminoácidos grandes con pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto provee un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales indeseables tales como homodímeros.

Anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos han sido propuestos para apuntar a células del sistema inmune a células indeseables (patente estadounidense N° 4676980) y para el tratamiento de infección de VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Anticuerpos heteroconjugados pueden ser elaborados utilizando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Agentes de reticulación apropiados son bien conocidos en el arte y son revelados en la patente estadounidense No. 4.676.980, junto con un número de técnicas de reticulación.

Técnicas para la generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpo también han sido descritas en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos pueden ser preparados utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81. (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos de F (ab' )2- Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente de acomplejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinales e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab ' generados son luego convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab'-TNB es luego reconvertido al Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente del cultivo de células recombinante también se han descritas. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión genética. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de engozne para formar monómeros y luego re-oxidado para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método puede también ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha provisto un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecificos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) unido al dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Así, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios de VL y VH complementarios de otro fragmento, formando mediante esto dos sitios de enlace de antigeno. Otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecificos mediante el uso de dimeros de Fv de una sola cadena (sFv) también se ha reportado. Véase Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, anticuerpos trispecificos pueden ser preparados. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991). (viii) Anticuerpos multivalentes En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos multivalentes. Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente mediante una célula que expresa un antigeno al cual los anticuerpos se enlazan. Los anticuerpos provistos en la presente pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de la clase IgM) con tres o más sitios de enlace de antigeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , que puede ser producidos fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antigeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región de Fe o una región de engozne. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región de Fe y tres o más sitios de enlace de antigeno amino-terminales a la región de Fe. El anticuerpo multivalente preferido en la presente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro sitios de enlace de antigeno. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena de polipéptido (y preferiblemente dos cadenas de polipéptidos ) , en donde la (s) cadena (s) de polipéptido comprende (n) dos,o más dominios variables. Por ejemplo, la (s) cadena (s) de polipéptido puede (n) comprender VD1- (XI) n-VD2- (X2) n~Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región de Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, la (s) cadena (s) de polipéptido puede (n) comprender: la cadena de región VH-CHl-enlazador flexible-VH-CHl-Fc o cadena región VH-CH1-VH-CH1-Fc . El anticuerpo multivalente en la presente comprende además preferiblemente por lo menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente puede comprender por ejemplo de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente comprenden además, un dominio de CL. (ix) Otras modificaciones de anticuerpo Puede ser deseable modificar el anticuerpo provisto en la presente con respecto a función efectora, por ejemplo, para mejorar la citotoxicidadmodulada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede obtener al introducir una o más series de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, se pueden introducir residuos de cisteina en la región de Fe, permitiendo mediante esto la formación de enlace de disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico asi generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o exterminio de célula modulada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) incrementada. Véase Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada pueden también ser preparados utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describen en Wolff et al., Cáncer .Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado que tiene regiones Fe dobles y puede mediante esto tener lisis moderada por complemento mejorada y capacidades de ADCC mejoradas. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Para incrementar la vida media del suero en el anticuerpo, se pueden hacer alteraciones de aminoácido en el anticuerpo, como se describe en US 2006/0067930, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

(D) Variantes y modificaciones de polipeptido Modificación (es) de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos , incluyen'do anticuerpos, descritos' en la presente pueden ser usadas en las formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida y métodos de fabricación de formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida. (ii) Polipéptidos variantes "Variante de polipéptido" significa un polipéptido, preferiblemente un polipéptido activo como se define en la presente que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia natural de plena longitud del polipéptido, una secuencia de polipéptido que carece de péptidos de señal, un dominio extracelular de un polipéptido con o sin polipéptido de señal. Tales variantes del polipéptido incluyen por ejemplo, polipéptidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son agregados o cancelados en el término N o término C de la secuencias de aminoácido natural de plena longitud. Ordinariamente, una variante del polipéptido TAT tendrá por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente cualquiera de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a una secuencia de polipéptido de secuencia natural de plena longitud, una secuencia de polipéptido que carece del péptido de señal, un dominio extracelular de un polipéptido con o sin el péptido de señal. Opcionalmente, polipéptidos variantes tendrán no más de una sustitución de aminoácido conservadora en comparación con la secuencia de polipéptido natural, alternativamente no más de aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácido conservadoras, en comparción con la secuencia del polipéptido natural.

El polipéptido variante puede ser truncado en el término N o el término C o puede carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se compara con un polipéptido natural de plena longitud. Ciertos polipéptidos variantes pueden carecer de residuos de aminoácido que no son esenciales para una actividad biológica deseada. Estos polipéptidos variantes con truncaciones , cancelaciones e inserciones pueden ser preparados mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Polipéptidos variantes deseados pueden ser sintetizados químicamente. Otra técnica apropiada involucra aislar y amplificar un fragmento de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido variante deseado, mediante reacción en cadena de polimerasa PCR. Oligonucleótidos que definen el término deseado del fragmento de ácido nucleico son empleados en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, polipéptidos variantres comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido natural revelado en la presente.

Inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino-terminal y/o carboxilo-terminal que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, también como inserciones de intrasecuencia de un solo o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionil N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del término N o C del anticuerpo a una enzima o un polipéptido lo que incrementa la vida media en el suero del anticuerpo.

Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del polipéptido. Variantes de secuencias de aminoácido del polipéptido son preparadas al introducir cambios apropiados de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico de anticuerpo o mediante síntesis de péptido. Tales modificaciones incluyen por ejemplo, cancelaciones de y/o inserciones a y/o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácido del polipéptido. Cualquier combinación de cancelación, inserción y sustitución se hace para llegar al constructo final, a condición de que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden- alterar procesos posttraducción del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) , tal como cambiar el número o posición de sitios de glicosilacion.

Guias para determinar cual residuo de aminoácido puede ser insertado, sustituido o cancelado sin afectar adversamente la actividad deseada se puede encontrar al comparar la secuencia del polipéptido con aquella de moléculas de polipéptido conocidas homologas y minimizar el número de cambios de secuencias de aminoácidos efectuadas en regiones de alta homología.

Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) que son sitios preferidos para mutagénésis es llamado "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente Alanina o Polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Estos sitios de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son luego revelados al producir variantes adicionales u otras variantes en o para los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo barrido de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón objetivo o región objetivo y las variantes de anticuerpo expresadas son seleccionadas en cuanto a la actividad deseada.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido de la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitucional incluyen . las regiones hipervariables, pero alteraciones de FR son también contempladas. Sustituciones conservadoras son . mostradas en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1 o como se describe además posteriormente en la presente con referencia a clases de aminoácidos pueden ser introducidos y los productos seleccionados.

Tabla 1 Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del polipéptido se llevan a cabo al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura de la cadena fundamental del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación .helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el total de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con similaridades en las propiedades' de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Biochemistry segunda edición., pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)): (1) No polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) Polares sin cargar: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y), Asn (N) , Gln (Q) (3) Ácidos: Asp (D) , Glu (E) (4) Básicos': Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos que se presentan naturalmente se pueden dividir en grupos en base a propiedades de cadenas laterales comunes: (1) Hidrofóbicos : Norleucina, et, Ala, Val, Leu, lie; (2) Hidrofilicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) Ácidos: Asp; Glu; (4) Básicos; His; Lys; Arg; (5) Residuos que influencian la orientación de cadena: Gly; Pro; (6) Aromáticos: Trp; Tyr; Phe .

Las sustituciones no conservadoras abarcarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier residuo de cisteina no involucrado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo también puede ser sustituido, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula e impedir reticulación aberrante. Inversamente, enlace (s) de cisteina puede (n) ser agregado (s) al polipéptido para mejorar su estabilidad (particularmente en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como el fragmento de Fv) .

Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo padre (por ejemplo, un anticuerpo humanizado). En general, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para desarrollo adicional tendrá (n) propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo padre del cual son generadas. Una manera conveniente para generar tales variantes sustitucionales involucra maduración por afinidad utilizando despliegues de fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones de aminoácido posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo asi generadas son desplegadas de manera monovalente de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto del gen III de 13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes fagos-desplegadas son luego seleccionadas en cuanto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) como se revela en la presente. Con el fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, se puede efectuar mutagénesis de barrido de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace del antígeno. Alternativa o adicionalmente, puede ser benéfico analizar la estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el objetivo. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes son generadas, el panel de variantes es sometido a selección como se describe en la presente y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes pueden ser seleccionados para un desarrollo adicional.

Otro tipo de variantes de aminoácido del polipéptido altera el patrón original de glicosilación del anticuerpo, el polipéptido puede comprender porciones sin aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido puede ser glicosilado. Tal glicosilación puede ocurrir naturalmente durante la expresión del polipéptido en la célula huésped u organismo huésped o puede ser una modificación deliberada que surge de intervención humana. Alteración significa cancelación de una o más porciones de carbohidrato encontradas en el polipéptido y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido .

La glicosilación del polipéptido es comúnmente ya sea N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La secuencia de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Asi, la presencia de ya sea una u otra de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina .

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido se lleva a cabo convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de tal manera que contiene una o más de las secuencias de tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración puede también hacerse por la adición de o sustitución por uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-enlazados) .

El retiro de porciones carbohidrato presentes sobre el polipéptido se pueden llevar a cabo química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican para residuos de aminoácido que sirven como objetivo para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilacion química son conocidas en el arte descritas. La escisión enzimática de porciones de carbohidrato sobre los polipéptidos se puede obtener mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas .

Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los a-amino de cadenas lateales de lisina, arginina e histidina, acetilación de la amina N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

(±±) Polipéptidos quiméricos Los polipéptidos descritos en la presente pueden ser modificados de una manera para formar moléculas quiméricas que comprenden el polipéptido fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácido. En algunas modalidades, una molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido con un polipéptido de etiqueta que provee un epitope al cual se un anticuerpo anti-etiqueta se puede enlazar selectivamente. La etiqueta del epitope es colocada, en general en el término amino- o carboxilo del polipéptido. La presencia de tales formas epitope-etiquetadas del polipéptido se puede detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de etiqueta. También, la provisión de la etiqueta de epitope permite que el polipéptido sea purificado fácilmente por purificación afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se enlaza a la etiqueta del epitope.

En una modalida alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido por una inmuno-globulina o una región particular de una inmunoglobulina . Para una forma divalente de una molécula quimérica (también denominada como una "inmunoadhesina") . Como se usa en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas semejantes a anticuerpo que combinan la espeficidad de enlace de un polipéptido heterólogo (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una porción de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente del sitio de reconocimiento de antigeno y enlace de un anticuerpo (esto es, es "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina comúnmente es una secuencia de aminoácidos continua que comprende por lo menos un sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede ser obtenida de cualquier inmunoglobulina, tal como subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM.

Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio de transmembrana cancelado o inactivado) de un polipéptido en lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de engozne, CH2 y CH3 o el engozne, CHi, CH2 y CH3 de una' molécula de IgGl. (lli) Conjugados de pollpéptldo El polipéptido para uso en las formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida y métodos de fabricación de formulaciones de polipéptido con viscosidad reducida puede ser conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, planta o animal o fragmentos del mismo) o un isótopo radioactivo (esto es, un radioconjugado) .

Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales conjugados pueden ser usados. Además, toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser usados incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de resina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-s) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictonina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de polipéptidos radioconjugados . Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re.

Conjugados del polipéptido y agente citotóxico son elaborados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteina bifuncionales tales como propionato N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilendiamina ) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolieno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de resina se puede preparar como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbón 14 es un agente quelante ejemplar para conjugación del radionucleótido al polipéptido.

Conjugados de un polipéptido y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteno y CC1065 y derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan al inhibir la polimerización de tubulina. Maitensina fue aislaa por primera vez del arbusto del sureste africano Maytenus serrata. Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides , tales como maitansinol y ésteres de C-3 maitansinol. Maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo son también contemplados. Hay muchos grupos enlazantes conocidos en el arte para elaborar conjugados de polipéptido-maitansinoide en los que se incluyen por ejemplo, aquellos revelados en la patente estadounidense No. 5,208,020. Los grupos enlazantes incluyen grupos de disulfuro, grupos de tioéter, grupos ácido lábiles, grupos fotolábiles, grupos peptidasa lábiles o grupos esterasa lábiles, como se revela en las patentes identificadas anteriormente, los grupos de disulfuro y tioéter son preferidos.

El enlazador puede ser anexado a la molécula de maitansinoide en varias posiciones dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede ser formado mediante reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La. reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C^15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace es formado en la posición de C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.

Otro cpnjugado de interés comprende un polipéptido conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es apta de producir ruptura de ADN de doble hebra a concentraciones sub-pico molares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, véanse por ejemplo, patente estadounidense No. 5,712,374. Análogos estructurales de caliqueamicina que pueden ser usados incluyen pero no están limitqados a ??1, 2?, .??1, N-acetil-??1, PSAG y T11. Otro fármaco anti-tumor al que el anticuerpo puede ser conjugado es QFA que es un antifoliáto. Tanto caliqueamicina como QFA tienen sitios de acción intracelulares y no cruzan fácilmente la membrana del plasma. Por consiguiente, la absorción celular de estos agentes por medio de internalización moderada por polipéptido (por ejemplo, anticuerpos) mejora extensamente sus efectos citotóxicos.

Otros agentes antitumor que pueden ser conjugados a los polipéptidos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288, también como esperamicinas .

En algunas modalidades, el polipéptido puede ser un conjugado entre un polipéptido y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como desoxirribonucleasa DNasa) .

En todavía otra modalidad, el polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en pre-apuntamiento del tumor, en donde el conjugado del receptor de polipéptido es administrado al paciente, seguido por la remoción del conjugado sin enlazar de la circulación utilizando un agente de despeje y luego administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) .

En algunas modalidades, el polipéptido puede ser conjugado a una . enzima de activación de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo) a un fármaco anti-cáncer activo. El componente de enzima del inmunoconjugado incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco, de tal manera para convertirlo a su forma citotóxica más activa.

Enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato a fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que tienen sulfato a fármacos libres, citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica al fármaco anti-cáncer 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido a fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas de escisión de carbohidrato tales como beta-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; beta-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con beta-lactamas en fármacos libres y penicilina amidasas tales como penicilina C amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en el arte tales como "abzimas", pueden ser usados para convertir los fármacos de la invención en fármacos activos libres. (iv) Otros Otro tipo de modificación covalente del polipéptido comprende enlaces del polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilenglicol , polipropilenglicol, polioxialguilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El polipéptido también puede ser atrapado en microcápsulas atrapadas por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetil celulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato ( , respectivamente) , en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed. , (1980).

(D) Obtención de polipéptidos para uso en las formulaciones y métodos Los polipéptidos usados en las formulaciones y métodos descritos en la presente pueden ser obtenidos utilizando métodos bien conocidos en el arte, incluyendo los métodos de recombinación. Las siguientes secciones proveen guias con respecto a estos métodos. (i) Polinucleotidos "Polinucleótido" o "ácidos nucleicos" como se usan intercambiablemente en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN.

Los polinucleotidos que codifican polipéptidos pueden ser obtenidos de cualquier fuente, incluyendo pero no limnitado a una biblioteca de cADN preparada de tejido que se cree que posee el mARN del polipéptido y expersarlo a un nivel detectable. Asi, los polinucleotidos que codifican polipéptidos pueden ser obtenidos convenientemente de una biblioteca de cADN preparada de tejido humano. El gen que codifica el polipéptido puede también ser obtenido de una biblioteca genómica o mediante procedimientos de síntesis conocidos (por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizadas).

Por ejemplo, el polinucleótido puede codificar toda una cadena de molécula de inmunoglobulina, tal como una cadena ligera- o una cadena pesada. Una cadena pesada completa incluye no solamente una región variable de cadena pesada (VH) si no también una región constante de cadena pesada (CH) , que comprenderá comúnmente tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3 y una región de "engozne". En algunas situaciones, es deseable la presencia de una región constante.

Otros polipéptidos que pueden ser codificados por el polinucleótido incluyen fragmentos de anticuerpo de enlace antigeno tales como anticuerpos de un solo dominio ("dAbs") , Fv, scFv, Fab' y F(ab' ) 2 y "minicuerpos" . Los minicuerpos son (comúnmente) fragmentos de anticuerpos bivalentes de los cuales el dominio de CH1 y CK o CL ha sido extirpado. Ya' que los minicuerpos son más pequeños que los anticuerpos convencionales deben obtener mejor penetración de tejido en uso clinico/de diagnóstico, pero al ser equivalentes deben retener afinidad de enlace más alta que los fragmentos de anticuerpo monovalentes, tales como dAb. Asi, a no ser que el contexto lo determine de otra manera, el término "anticuerpo" como se usa en la presente, abarca no solamente moléculas de anticuerpo enteras, si no también fragmentos de anticuerpo de enlace de antigeno del tipo discutido anteriormente. Preferiblemente, cada región de estructura presente en el polipéptido codificado comprenderá por lo menos una sustitución de aminoácido en relación con la estructura aceptora humana correspondiente. Asi, por ejemplo, las regiones de estructura pueden comprender en total tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácido en relación con las regiones de estructura aceptoras.

Apropiadamente, los polinucleótidos descritos en la presente pueden ser aislados y/o purificados. En algunas modalidades, los polinucleótidos son polinucleótidos aislados.

El término "polinucleótido aislado" pretende indicar que la molécula está removida o separada de su medio ambiente normal o natural o ha sido producida de tal manera que no está presente en su medio ambiente normal o natural. En algunas modalidades, los polinucleótidos son polinucleótidos purificados. El término purificado pretende indicar que por lo menos algunas moléculas o sustancias contaminantes han sido removidas.

Apropiadamente, los polinucleótidos están sustancialmente purificados, de tal manera que los polinucleótidos relevantes constituyen los polinucleótidos dominantes (esto es, más abundantes) presentes en una composición. Ácidos nucleicos recombinantes que comprenden un inserto que codifica por un dominio variable de cadena pesada y&/o por un dominio variable de cadena ligera pueden ser usados en los métodos como se describe en la presente. Por definición, tales ácidos nucleicos comprenden codificación de ácido nucleico de una sola hebra, ácidos nucleicos de doble hebra que consisten de dichos ácidos nucleicos de codificación y de ácidos nucleicos complementarios a los mismos o estos ácidos nucleicos complementarios (de una sola hebra) por si mismos.

También se pueden efectuar modificaciones al exterior del dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo. Tal ácido nucleico mutante puede ser un mutante silente, en donde uno o más nucleótidos son reemplazados por los nucleótidos con los nuevos codones que codifican por el (los) mismo (s) aminoácido (s) . Tal secuencia mutante puede ser una secuencia degenerada. Las secuencias degeneradas son degeneradas en el significado del código genético en que un número ilimitado de nucleótidos son ¦reemplazados por otros nucleótidos sin dar como resultado un cambio de la secuencia de aminoácido originalmente codificada. Tales secuencias degeneradas pueden ser útiles debido a sus diferentes sitios de restricción y/o frecuencia de codones particulares que son preferidos por el huésped especifico, particularmente células de levadura, bacterianas o mamiferas, para obtener una expresión óptima del dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera.

Secuencias que tienen un grado de identidad de secuencia u homología de secuencia con secuencia (s) de aminoácido de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente o cualquier secuencia de nucleótidos que codifica tal polipéptido (de aqui en adelante en la presente denominada como una "secuencia (s) homologa ( s )") . Aqui, el término "homólogo" significa una entidad que tiene cierta homología con las secuencias de aminoácido sujeto y la secuencia de nucleótidos sujeto. Aquí, el término "homología" puede ser igualado con "identidad".

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácido homologa y/o secuencia de nucleótidos homologa debe codificar un polipéptido que retiene la actividad funcional y/o mejora la actividad del anticuerpo. En algunas modalidades, la secuencia homologa es tomada para incluir una secuencia de aminoácido que puede ser por lo menos 75%, 85% o 90% idénticas, preferiblemente por lo menos 95 o 98% idéntica a la secuencia sujeto. Comúnmente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., como la secuencia de aminoácidos sujeto. Aunque la homología puede también ser considerada en términos de similaridad (esto es, residuos de aminoácido que tienen propiedades/funciones químicas similares). En algunas modalidades, es preferido expresar homología en términos de identidad de secuencia.

En el contexto presente, una secuencia homologa es tomada para incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser por lo menos 75, 85 o 90% idéntica, preferiblemente por lo menos 95 o 98% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en la presente (la secuencia sujeto) . Comúnmente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican con los sitios activos, etc., como la secuencia sujeto. Aunque la homología puede también ser considerada en términos de similaridad (esto es, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares) . En algunas modalidades, es preferido expresar homología en términos de identidad de secuencia.

Otros métodos incluyen pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que se presentan naturalmente) o preparación mediante mutagénesis oligonucleótido-moderada (o dirigida al sitio), mutagénesis de PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del polipéptido. (ii) Expresión de polinucleotidos La descripción a continuación es concerniente principalmente con la producción de polipéptidos al cultivar células transformadas o transfectadas con un vector que contiene polinucleotidos que codifican polipéptido. Por supuesto, se contempla que métodos operativos que son bien conocidos en el arte, pueden ser empleados para preparar polipéptidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiadas o porciones de la misma, puede ser producida mediante síntesis de péptidos directa utilizando técnicas en fase sólida (véase por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc . 85:2149-2154 (1963)) . La síntesis de proteína in vitro puede ser efectuada utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síontesis automatizada puede ser efectuada, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptido de Applied Biosystems (ciudad Foster, California) utilizando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del polipéptido pueden ser sintetizadas químicamente de manera separada y combinadas utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido deseado.

Los polinucleótidos como se describe en la presente son insertados a un (os) vector (es) de expresión para producción de los polipéptidos . El término "secuencias de control" se refieren a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operablemente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control incluyen pero no están limitadas a promotores (por ejemplo, promotores naturalmente asociados o heterólogos) , secuencias de señal, elementos de mej orador y secuencias de determinación de transcripción .

Un polinucleótido está "enlazado operablemente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, ácidos nucleicos para una pre-secuencia o líder secretorio es enlazado operablemente a ácidos nucleicos para un polipéptido si es expresado como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mej orador es enlazado operativamente a una secuencia de codificación si acepta la restricción de la secuencia o un sitio de enlace de ribosoma es enlazado operablemente a una secuencia de codificación si está colocado para facilitar la producción. En general, "enlazado operablemente" significa que las secuencias del ácido nucleico que son anexadas son contiguas y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que estar contiguos. El enlace se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótido sintético o enlazadores son usados de acuerdo con la práctica convencional.

Para anticuerpos, las cadenas pesadas y ligeras pueden ser clonadas en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ácido nucleico que codifican cadenas de inmunoglobulina son enlazados operablemente a secuencias de control en el (los) vector (es) de expresión que asegura (n) la expresión de poloipéptidos de inmunoglobulina.

Selección de componente genético - comúnmente, vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina) para permitir la detección a aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase por ejemplo, patente estadounidense No. 4,704,362). En algunas modalidades, la selección de genes que codifican proteina que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) sunministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos.

Un ejemplo de un. esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y así sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para células mamíferas son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico que codifica anticuerpos descritos en la presente, tales como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína -I y -III, preferiblemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, células transformadas con el gen de selección de DFHR son identificadas primero al cultivar todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada, cuando se emplea DHFR tipo silvestre es la linea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente de actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL- 9096) .

Alternativamente, células huésped (particularmente huéspedes tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un polipéptido descrito en la presente, proteina de DHFR tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido III fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionadas mediante cultivo celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico de aminoglicosidico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Véase patente estadounidense No. 4,965,199.

Un gen de selección apropiado para uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (-1979)). The gen trpl provee un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de habilidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics 85:12 (1977). La presencia de la lesión de trpl en el genoma de célula huésped de levadura prove luego un medio ambiente efectivo para detector la formación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. Similarmente, cepas de levadura deficiente de Leu2 (ATCC 20,622 or 38,626) son complementadas por plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2.

Además, vectores derivados del plásmido circular de 1.6 µ?? pKDl pueden ser usados para la transformación de levaduras de Kluyveromyces . Alternativamente, un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimiosina de becerro recombinante fue reportado para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology 8:135 (1990). Vectores de expression de multicopia estables para secreción de albúmina de suero humano recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces también han sido revelados. Fleer et al., Bio/Technology 9:968-975 (1991) .

Conponente de secuencias de señal - Los polipéptidos pueden ser producidos recombinantemente no solo de manera directa, sino también como un polipéptido de fusión por un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión especifico en el término N del polipéptido maduro. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (eso es, que se liga por unapeptiodasa de señal9 por la célula huésped. Una secuencia de señal puede ser sustituida con una secuencia de señal procarióntica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp 1 líder de enterotoxina II estable térmicamente. Para secreción de levadura, la secuencia de señal natural puede ser sustituida por ejemplo, por el líder de invertasa de levadura, un líder factor a (incluyendo líderes de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces -factor leaders) o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en O 90/13646. En la expression de célula mamífera, secuencias de señal mamíferas también como líderes secretores virales, por ejemplo la señal de gD de Herpes simplex están disponibles.

Las secuencias de ácido nucleico para tal reacción precursora es ligada en cuadros de lectura a las secuencias de ácido nucleico que codifica el polipéptido descrito en la presente .

Origen de replicación - Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de polipéptido que permite que el vector se replique en una o más de las células huésped seleccionadas. En general, en vectores de clonación esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomal huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Tales secuencias son bien conocidas según la variedad de bacteria, levadura y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es apropiado para levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células mamíferas. En general, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión mamíferos (el origen SV40 puede comúnmente ser usado solo si contiene el promotor prematuro) .

Componente de promotor - Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que es conocido por el organismo huésped y es enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica el polipéptido. Promotores apropiados para uso con huéspedes procariónticos incluyen promotor phoA, sistemas de promotor de ß-lactamasa y lactosa, promotor de fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son apropiados. Promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente al ADN que codifica el polipéptido.

Apropiadamente, las secuencias de control de expresión son sistemas de promotor eucariónticos en vectores aptos de transformar o transectar células eucariónticas (por ejemplo, células COS - tales como células COS 7 o células CHO) . Una vez que el vector ha sido incorporado al huésped apropiado, el huésped es mantenido bajo condiciones apropiadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y la conexión y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.

Secuencias de promotor son conocidas para eucariontes. Virtualmente todos los genes eucariónticos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en donde la transcripción es iniciada. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de transcripción de muchos genes es una región de CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariónticos se encuentra una secuencia de AATAAA que puede ser la señal para adición de la cola poly A al extremo 3' de la secuencia de codificaciones. Todas estas secuencias son insertadas apropiadamente a vectores de expresión eucariónticos.

Ejemplos de secuencias de promotor apropiadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la cinasa de 3-fosfoglicerato u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa .

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tiene la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones de promotor para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables por la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores apropiados para el uso en la expresión de levadura son descritos originalmente en EP 73,657. Los mejoradores de levadura también son usados ventajosamente con promotores de levadura .

La transcripción de los polipéptidos descritos en la presente de vectores en células huésped mamiferas es controlada por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de fowlpox, adenovirus (tal como Adenocirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y más preferiblemente Virus Simio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped.

Los promotores prematuros y tardíos del virus de SV40 son obtenidos convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor prematuro inmediato del citomegalovirus humano es obtenido convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos utilizando el virus de papiloma bovino como vector es revelado en la patente estadounidense No. 4,419,446.

Una modificación de este sistema es descrita en la patente estadounidense No. 4,601,978. Véase también Reyes et al., Na ture 297:598-601 (1982) en cuanto a la expresión de cADN de ß-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de cinasa de timidina de virus de Herpes simplex. Alternativamente, la repetición terminal y larga del virus de sarcoma de Rous puede ser usada como promotor.

Componente de elemento mejorador - La transcripción de un ADN que codifica el polipéptido de LDL anti-oxidado descrito en la presente por eucariontes superiores es frecuentemente incrementada al insertar una secuencia de mejorador al vector. Muchas secuencias de mejorador son ahora conocidas de genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina) . Comúnmente, sin embargo, se usará un mejorador de un virus de célula eucarióntica . Ejemplos incluyen el mejorador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 pb) , el mejorador de promotor prematuro de citomegalovirus, el mejorador de polioma en estado tardío del origen de replicación y mej oradores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) en cuanto a elementos mejoradores para la activación de promotores eucariónticos . El mejorador puede ser empalmado al vector en una función 5' o 3' a la secuencia de codificación del polipéptido, pero está ubicado preferiblemente en el sitio 5' del promotor.

Componente de terminación de transcripción - Vectores de expresión usados en células huésped eucariónticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para la estabilización de mARN. Tales secuencias están disponibles comúnmente de las regiones sin traducir 5' y ocasionalmente 3' de ADN eucarióntico o viral o cADN. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Véase WO94/11026 y el vector de expresión revelado en la misma.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos (por ejemplo, las secuencias de codificación de cadena pesada variable y/o cadena ligera variable y secuencias de control de expresión opcionales) pueden ser transferidas a una célula huésped mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de sodio es utilizada comúnmente para células eucariónticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, electroporación, lipofección, transfección biolística o viral puede ser usada para otros huéspedes celulares. (Véase en general Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, segunda edición, 1989) . Otros métodos usados para transíormer células mamíferas incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación y microinyección . Para producción ed animales . transgénicos , se pueden microinyectar transgenes a oocitos fertilizados o pueden ser incorporados al genoma de células madre embriónicas y los núcleos de tales células son transferidos a oocitos enucleados.

Cuando cadenas pesadas y ligeras son clonadas en vectores de expresión separados, los vectores son co-transfectados para obtener expresión y ensamble de inmunoglobulina intactas. Una vez expresados, los anticuerpos enteros, sus dimeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina pueden ser purificados de acuerdo con procedimientos estándar del arte, incluyendo purificación de sulfato · de amonio, columna de afinidad, cromatografía en columna, purificación de HPLC, electroforesis de gel y los semejantes. (Véase en general Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Inmunoglobulinas sustancialmente puras de por lo menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad son preferidas y 98 a 99% o más de homogeneidad es más preferido para usos farmacéuticos. (iii) Constractos Comúnmente, el constructo o construcción será un vector de expresión que permite la expresión en un huésped apropiado, del (los) polipéptido (s) codificado (s) por el polinucleótido . La construcción puede comprender, por ejemplo, uno o más de los siguientes: un promotor activo en el huésped; una o más secuencias reguladoras, tales como mejoradores; un origen de replicación y un marcador, preferiblemente un marcador seleccionable . El huésped puede ser un huésped eucarióntico o procarióntico, aunque los huéspedes eucariónticos (y especialmente mamíferos) pueden ser preferidos. La selección de promotores apropiados dependerá obviamente a alguna extensión de la célula huésped usada, pero puede incluir promotores de virus humanos tales como HSV, SV40, RSV y los semejantes. Numerosos promotores son conocidos para aquellos experimentados en el arte.

La construcción puede comprender un polipéptido que codifica un polipéptido que comprende tres bucles hipervariables de cadena ligera o tres bucles hipervariables de cadena pesada. Alternativamente, el polinucleótido puede codificar un polipéptido que comprende tres bucles hipervariables de cadena pesada y tres bucles hipervariables de cadena ligera unidos por un enlazador apropiadamente flexible de longitud apropiada. Otra posibilidad es que una sola conexión puede comprender un polipéptido que codifica dos polipéptidos separados - uno que comprende los bucles de cadena ligera y uno que comprende los bucles de cadena pesada. Los polipéptidos separados pueden ser expresados independientemente o pueden formar parte de un solo operón común.

La construcción puede comprender uno o más elementos reguladores, tal como un mejorador, un origen de replicación y uno o más marcadores ( seleccionables o de otra manera) . La construcción puede tomar forma de un plásmido, un cromosoma artificial de levadura, un mini-cromosoma de levadura o ser integrada a todo o parte del genoma de un virus, especialmente un virus atenuado o similar que no es patógeno para humanos.

La construccipon puede ser formulada convenientemente para administración segura a un mamífero, preferiblemente sujeto humano. Comunmente, serán provistas en una pluralidad de alícuotas, cada alícuota que contiene una construcción suficiente para la inmunización efectiva de por lo menos un sujeto humano adulto normal.

La construcción puede ser provista en forma líquida o sólida, . preferiblemente como un polvo secado por congelación que comunmente es rehidratado con un líquido acuoso estéril antes del uso.

La construcción puede . ser ' formulada con un adyuvante u otro componente que tiene el efecto de incrementar la respuesta inmune del sujeto (por ejemplo, tal como es medida por el título de anticuerpo específico) en respuesta a la administración de la construcción. (iv) Vectores El término "vector" incluye vectores de expresión y vectores de transformación y vectores de lanzadera.

El término "vector de expresión" significa una construcción apta de expresión in vivo o in vitro.

El término "vector de transformación" significa una construcción apta de ser transferida de una entidad a otra entidad - que pueden ser de la especie o puede ser de una especie diferente. Si la construcción exacta de ser transferida de una especie a otra - tal como de un plásmido de escherichia coli a una bacteria, tal como del género Bacillus, entonces el vector de transformación es llamado algunas veces un "vector de lanzadera". Puede aún ser una construcción apta de ser transferida de un plásmido de E. coli a un Agrobacterium a una planta .

Los vectores pueden ser transformados a una célula huésped apropiada como se describe a continuación para proveer la expresión de un polipéptido abarcado en la presente invención. Varios vectores están disponibles públicamente. Por ejemplo, el vector puede estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede ser insertada al vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN es insertado a un (os) sitio (s) de endonucleasa de restricción apropiado (s) utilizando técnicas conocidas en el arte. La construcción de vectores apropiados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándar que son conocidas para el experimentado en el arte.

Los vectores pueden ser por ejemplo, vectores de plásmido, virus o fago provistos con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Vectores pueden contener uno o más genes marcadores selecciónateles que son bien conocidos en el arte.

Estos vectores de expresión son comúnmente replicables en organismos huésped, ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosomal huésped. (v) Células huésped La célula huésped puede ser una célula de bacteria, una célula de levadura u otra célula fungal, célula de insecto, una célula de planta o una célula mamifera, por ejemplo.

La invención también provee un organismom huésped multicelular transgénico que ha sido manipulado genéticamente para producir un polipéptido de acuerdo con la invención. El organismo puede ser por ejemplo, un organismo mamífero transgénico (por ejemplo, una línea de cabra o ratón transgénico) .

Procariontes apropiados incluyen pero no se limitan a eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa K12 de E. coli M294 (ATCC 31, 446); X1776 de E. coli (ATCC 31, 537); cepa W3110 de E. coli (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procariónticas apropiadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia , por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus , Salmonella , por ejemplo, Salmonella typhimurium , Serratia , por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, asi como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P) , Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. La cepa 3110 es un huésped o huésped padre particularmente preferido debido a que es una cepa huésped común para fermentaciones de producto de polinucleótidos recombinantes . Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas . Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una mutación genética con los genes que codifican polipéptidos endógenos al huésped, ejemplos de tales huéspedes incluyen la cepa W3110 de E. coli 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan'; cepa 37D6 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 con una mutación de cancelación de degP no resistente a kanamicina y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante.

Alternativamente, los métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico son apropiados.

En estos huéspedes procariónticos , se pueden elaborar vectores de expresión, que contendrán comúnmente secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación) . Además, cualquier número de una variedad de promotores bien conocidos estarán presentes, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp) , un sistema promotor de ß-lactamasa o un sistema de promotor del fago ?. Los promotores comúnmente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia de operador si tienen secuencias de sitio de enlace de ribosoma y los semejantes, para iniciar y consumar la transcripción y traducción.

Microbios eucariónticos pueden ser usados para expresión. Microbos eucariónticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión apropiados para vectores que codifican polipéptidos . Daccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucarióntico inferior usado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickera ii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906),. K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis y hongos filamentosos tales como Neurospora , Penicillium , Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Levaduras metilotrópicas son apropiadas en la persente e incluyen pero no están limitadas a levadura apta de crecer en metanol seleccionadas de los géneros que consisten de Hansenula , Candida, Kloeckera , Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Saccharomyces es un huésped de levadura preferido, con vectores apropiados que tienen secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores) , un origen de replicación, secuencias de terminación y los semejantes como se desee. Promotores típicos incluyen cinasa de 3-fosfoglicerato y otras enzimas glicolíticas . Promotores de levadura inducibles incluyen entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitorcomo C y enzimas responsables por la utilización de maltosa y galactosa.

Además de microorganismos, el cultivo de célula de tejido mamífero puede también ser usado para expresar y producir los polipéptidos como se describen en la presente y en alguna instancia son preferidos (véase Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Para algunas modalidades, células eucariónticas (por ejemplo, células COS7) pueden ser preferidas debido a que un número de líneas de células huésped apropiadas aptas de secretar polipéptidos heterólogos (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas) han sido desarrolladas en el arte e incluyen líneas de células CHO, varias líneas de células de COS, células HeLa, preferiblemente líneas de células de mieloma o células B transformadas o hibridomas .

En algunas modalidades, la célula huésped es una célula huésped de vertebrado. Ejemplos de líneas de células huésped mamíferas útiles son líneas CV1 de riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónica humana (células 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión) ; células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (células CHO o línea celular CHO-DP-12); células de sertoli de ratón; células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI; células MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma humano (Hep G2 ) .

Alternativamente, secuencias de codificación de polipéptido pueden ser incorporadas a transgenes para introducción al genoma de un animal transgénico y subsecuente expresión en la leche del animal transgénico. Transgenes apropiados incluyen secuencias de codificación para cadenas ligeras y/o pesadas en enlace o plegable con un promotor y mejorador de un gen especifico de glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina .

Alternativamente, los anticuerpos descritos en la presente pueden ser producidos en plantas transgénicas (por ejemplo, tabaco, maíz, soya y alfalfa) . Vectores de "planticuerpo" mejorados (Hendy et al., J. Immunol . Methods 231:137-146 (1999)) y estrategias de purificación acoplados con un incremento en especies de cosecha transformables vuelven a tales métodos en un medio práctico y eficiente para producir inmunoglobulinas recombinantes no solamente para terapia humana y animal, sin para aplicaciones industriales también (por ejemplo, anticuerpos catalíticos) . Además, se ha demostrado que los anticuerpos producidos de plantas son seguros y efectivos y evitan el uso de materiales derivados de animales. Además, las diferencias en patrones de glicosilación de anticuerpos producidos por células de plantas y mamíferas tienen poco o ningún efecto sobre el enlace de antígeno o especificidad. Además, no se ha observado evidencia de toxicidad o HAMA en pacientes que reciben aplicación oral tópica de un anticuerpo de IgA dimérico secretorio derivado de planta (véase, Larrick et al., Res. Immunol. 149:603-608 (1998)).

Células huésped son transfectadas o transformadas con vectores de expresión o clonación descritos en la presente para producción de polipéptido y cultivados en medios nutrientes convencionales modificados como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y los semejantes, pueden ser seleccionados por el experimentado en el arte sin experimentación indebida. En general, se pueden encontrar principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) .

Métodos de transfección de células eucaritónticas y transformación de células procariónticas son conocidos para el experimentado en el arte, por ejemplo, CaCl2, CaP0 , liposoma-moderados y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación es efectuada usando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio o electroporación es usado en general para procariontes . Se usa infección con Agrobacterium turnefaciens para transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Shaw et al., Gene 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para células mamiferas sin tales paredes celulares, se puede emplear el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457 (1978) . Aspectos generales de transíecciones de sistema huésped de célula mamífera han sido descritos en la patente estadounidense No. 4,399,216. Transformaciones a levadura se llevan a cabo comúnmente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sci . (USA) 76:3829 (1979) . Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducer ADN a células, tal como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas o policationes, por ejemplo polibreno, poliornitina . Para varias técnicas para transformar células mamiferas, veáse Keown et al., Methods in Enzymology 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature 336:348-352 (1988) .

Se pueden producir polipéptidos , por ejemplo anticuerpos, en bacterias, en particular cuando no se necesitan glicolsilación y función efectora Fe, tal como cuando el anticuerpo terapéutico es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo una toxina) y el inmunoconj ugado por si mismo muestra efectividad en destrucción de célula de tumor. Los anticuerpos de plena longitud tienen mayor vida media en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más eficiente en el costo. Para expresión de polipéptidos en bacterias, véase por ejemplo, patente estadounidense No. 5,840,523 que describe la región de inicio de traducción (TIR) y secuencias de señal para optimizar la expresión y secreción, estas patentes son incorporadas en la presente por referencia. Después de la expresión, el anticuerpo es aislado de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede ser purificado por medio de por ejemplo, una columna de proteina A o G, dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo similar al proceso para purificar anticuerpo expresado por ejemplo en células CHO.

Células huésped apropiadas para la expresión de polipéptidos glicosilados descritos en la presente son derivados de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de plantas e insectos . Numerosas cepas y variantes baculovirales y células huésped de insecto permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx morí han sido identificados. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV y tales virus pueden ser usados como el virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células Spodoptera frugiperda.

Las . células huésped usadas para producir el polipéptido de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Medios disponibles comercialmente , tales como medio de Ham FIO (Sigma) , Medio Esencial Mínimo (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) y medio de Tagle Modificado por Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son apropiados para cultivar las células huésped. Cualquiera de estos medios pueden ser complementados como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, magnesio, calcio y fosfato) , antibióticos (tales como fármaco GENTAMYCIN™) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquier otros complementos necesarios pueden también ser incluidos a concentraciones apropiadas que serían conocidas para aquellos experimentados en el arte. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y los semejantes son aquellos usados previamente con la célula huésped seleccionada para expresión y serán evidentes para aquellos experimentados en el arte. (vi) Purificación de polipéptidos Cuando se usan técnicas recombinants, los polipéptidos pueden ser producidos intracelularmente en el espacio periplásmico o secretados directamente al medio.

Los polipéptidos pueden ser recuperados del medio de cultivo o de Usados de célula huésped. Si están enlazados a membrana, pueden ser liberados de la membrana usando una solución de detergente apropiada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadasa en la expresión de los polipéptidos pueden ser sometidos a disrupción -mediante varios métodos físicos o químicos, tales como ciclos de congelación - deshielo, sonicación, disrupción mecánica o agentes de lisis celular.

Puede ser deseable purificar los polipéptidos de polipéptidos de célula recombinante . Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación apropiados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración en gel usando por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteina A Sepharosa para remover contaminantes tales como IgG y columnas quelantes de metal para enlazarse a formas epítope-marcadas del polipéptido. Varios métodos de purificación de polipéptidos pueden ser usados y tales métodos son bien conocidos en el arte .

Si el polipéptido es producido intracelularmente, como una primera etapa, los desechos de partículas, ya sea uno u otro de células huésped o fragmentos sometidos a lisis, son removidos por ejemplo mediante centrifugación o ultrafiltración . Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar polipéptidos que son secretados al espacio periplásmico de E. colí. Brevemente, la pasta celular es deshelada en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los desechos celulares pueden ser removidos mediante centrifugación. En donde el polipéptido es secretado al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión son en general concentrados primero usando un filtro de concentración de polipéptidos disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede ser incluido en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de polipéptido preparada de las células puede ser purificada usando por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis y cromatografía de afinidad, cromatografía de afinidad es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede ser usada para purificar anticuerpos que son a base de cadenas pesadas ??, ?2, o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteina G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para ?3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad es anexado es más frecuentemente azarosa, pero otras matrices están disponibles. Matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos de los que pueden ser obtenidos con agarosa. En donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de polipéptidos, tales como fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía de SEPHAROSE™ sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación de sulfato de amonio están también disponibles, dependiendo del polipéptido a ser recuperado.

Enseguida de cualesquier etapa (s) de purificación preliminar (es) , la mezcla que comprende el polipéptido de interés y contaminantes puede ser sometida a cromatografía de interacción hidrofóbica a bajo pH usando una solución reguladora del pH de elusión a un pH de entre aproximadamente 2.5 - 4.5, efectuada preferiblemente a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, sal de aproximadamente 0 - 0.25 M) .

V. Métodos de uso de las formulaciones Las formulaciones provistas en la presente pueden ser usadas en métodos de administración de una formulación de polipéptido descrita en la presente a un sujeto en necesidad de la misma, que comprenden administrar la formulación a un sujeto en necesidad de la misma.

También se proveen en la presente métodos para tratar, mejorar y/o retardar el avance de una enfermedad o alteración, que comprenden administrar una formulación descrita en la presente a un sujeto en necesidad de la misma.

En algunas modalidades, la enfermedad o alteración es cáncer. En algunas modalidades, la enfermedad o alteración es una enfermedad inflamatoria. En algunas modalidades, la enfermedad o alteración es una "alteración proliferativa celular" y "alteración proliferativa" . En algunas modalidades, la enfermedad o alteración es un tumor. En algunas modalidades, la enfermedad o alteración es cáncer y el polipéptido es un anticuerpo.

En algunas modalidades, el polipéptido es administrado en una cantidad efectiva. En algunas modalidades, el polipéptido es administrado en una cantidad inhibidora del crecimiento. En algunas modalidades, el polipéptido es administrado en una cantidad citotóxica.

Como se usa en la presente, "tratar", "tratamiento" o "que trata" es un procedimiento para obtener resultados benéficos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Por propósitos de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen pero no están limitados a uno o más de los siguientes: disminución .de uno más síntomas resultantes de la enfermedad, disminuir la extensión de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (por ejemplo, impedir o retardar el empeoramiento de la enfermedad) , retardar o frenar el avance de la enfermedad, mejorar el estado de enfermedad, disminuir la dosis de una o mas de otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad y/o incrementar la calidad de vida.

Como se usa en la presente, "retardar" el avance significa diferir, impedir, frenar, retardar, estabilizar y/o postponer el desarrollo de la enfermedad. Este retardo puede ser de duraciones de tiempo variables, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o del individuo que es tratado.

En algunas modalidades, los métodos de tratamiento descritos en la presente mejoran (por ejemplo, reducen la incidencia, reducen la duración de, reducen o disminuyen la severidad de) uno o más síntomas de la enfermedad.

Un "sujeto" en la presente es un mamífero. En algunas modalidades, el mamífero es un humano.

Un "síntoma" es cualquier fenómeno mórbido · o desviación de lo normal en estructura, función o sensación, experimentado por el sujeto.

El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un polipéptido para tratar, mejorar y/o retardar el avance de una enfermedad o alteraci'ón en un sujeto. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor; inhibir (esto es, frenar a alguna extensión y preferiblemente detener) la infiltración de células de cáncer a órganos periféricos; inhibir (esto es, frenar a alguna extensión y preferiblemente detener) la metástasis del tumor; inhibir a alguna extensión el crecimiento del tumor y/o aliviar a alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. A la extensión que el fármaco puede impedir el crecimiento y/o asesinar células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico.

Una "cantidad inhibidora de crecimiento" de un polipéptido es una cantidad apta de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumor, por ejemplo célula de cáncer, ya sea in vivo o in Vitro. Una "cantidad inhibidora de crecimiento" de un polipéptido, por propósitos de inhibir crecimiento celular neoplásico puede ser determinada empíricamente y de manera sistemática.

Una "cantidad citotóxica" de un polipéptido es una cantidad apta de provocar la destrucción de una célula, especialmente tumor, por ejemplo célula de cáncer, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un polipéptido, por propósitos de inhibir crecimiento celular neoplásico, puede ser determinada empíricamente y de manera sistemática.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en un sujeto que está caracterizada comúnmente por crecimiento celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades limfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del sistema urinario, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de célula B, cáncer de cerebro, también como cáncer de cabeza y cuello y metástasis asociadas.

Los términos "alteración proliferativa celular" y "alteración proliferativa" se refiere a alteraciones que están asociadas con algún grado de proliferación celular anormal.

"Tumor", como se usa en la presente, se refiere a todo el crecimiento celular neoplásico y proliferación, ya sea maligno o benigno y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.

La formulación de polipéptido puede ser administrada a un sujeto de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo como un bolo o mediante infusión continua en un periodo de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal , subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. En algunas modalidades, la formulación de polipéptido es administrada mediante inyección subcutánea.

Para el tratamiento, mejora y/o retardo de avance de enfermedad, la dosificación y modo de administración serán escogidos por el médico de acuerdo con criterios conocidos. La dosificación apropiada del polipéptido dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se define anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, si la formulación de polipéptido es administrada previa a terapia, la historia clínica del paciente y respuesta a la formulación de polipéptido y la discreción del médico que atiende. La formulación de polipéptido es administrada apropiadamente al paciente en un tiempo o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µ?/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0.1-15 mg/ g/dosis) de polipéptido puede ser una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea por ejemplo mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 1Ó0 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que se presenta una supresión deseada de enfermedad. El avance de esta terapia puede ser monitoreado fácilmente mediante métodos y análisis convencionales y en base a criterios conocidos para el médico u otras personas de habilidad en el arte.

Otros regímenes terapéuticos pueden ser combinados con la administración de la formulación de polip.éptido, la formulación de polipéptido puede ser usada sola o en terapia de combinación con, por ejemplo, hormonas, inmunosupresores, antiangiogénicos o compuestos radiomarcados o con cirugía, crioterapia y/o radioterapia. La formulación de polipéptido puede ser administrada en conjunción con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con pre-terapia o post-terapia convencional.

Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) , consecutiva en cualquier orden y secuencialmente en cualquier orden.

La administración combinada incluye coadministración, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, administración consecutiva ya sea en un orden u otro y administración secuencial en cualquier orden, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) los ingredientes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Preferiblemente tal terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico sinergista .

VI Artículos de manufactura Las formulaciones de polipéptido descritas en la presente pueden estar contenidas en un articulo de manufactura. El articulo de manufactura puede comprender un recipiente que contiene la formulación de polipéptido. Preferiblemente, el articulo de manufactura comprende: (a) un recipiente que comprende una composición que comprende la formulación de polipéptido descrita en la presente dentro del recipiente y (b) un inserto de empaque con instrucciones para administrar la formulación a un sujeto.

El articulo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque sobre o asociado con el recipiente. Recipientes apropiados incluyen por ejemplo botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes pueden ser formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente retiene o contiene una formulación y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Por lo menos un agente activo en la composición consiste del polipéptido. La etiqueta o inserto de empaque indica el uso de la composición en un sujeto con guia especifica con respecto a cantidades e intervalos de dosificación del polipéptido y cualquier otro fármaco que es provisto. El articulo de manufactura puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otras soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. En algunas modalidades, el recipiente es una jeringa. En algunas modalidades, la jeringa está contenida ademnás dentro de un dispositivo de inyección. En algunas modalidades, el dispositivo de inyección es un autoinyector .

Un "inserto de empaque" es usada para referirse a instrucciones incluidas acostumbradamente en empaques comerciales de productos terapéuticos que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos a ser combinados con el producto empacado y/o advertencias concernientes con el uso de tales productos terapéuticos.

Detalles adicionales de la invención son ilustrados por los siguientes- ejemplos no limitantes. Las revelaciones de todas las referencias en la especificación son incorporadas expresamente en la presente por referencia.

E emplos Los ejemplos que pretenden ser puramente ejemplares de la invención y por consiguiente no deben ser considerados para limitar la invención de ninguna manera, también describen y detallas aspectos y modalidades de la invención discutida anteriormente. Los ejemplos anteriores y descripción detallada se ofrecen como ilustración y no como limitación.

Ejemplo 1 - Efectos de sulfóxido de dimetilo y dimetilacetamida sobre la viscosidad de la solución de polipéptido Para investigar los efectos de sulfóxido de dimetilo y dimetilacetamida sobre la viscosidad de la solución de polipéptido, se efectuaron los siguientes experimentos..

I . Materiales y métodos Múltiples anticuerpos monoclonales de plena longitud de IgGl que consisten de cadenas ligeras k construidas de estructuras humanas idénticas fueron usados en este estudio. Estos anticuerpos fueron clonados, expresados en lineas celulares de ovario de hámster chino y purificados en Genentech (Sur de San Francisco, CA) . Todos los reactivos fueron de grado ACS.

A no ser que se afirme de otra manera, se usó anti-IFNcc de rumba como el material de partida. Todos los polipéptidos fueron intercambiados en solución reguladora del pH a las condiciones apropiadas usando casetes de diálisis Slide-a-lyzer 10,000 M CO (Thermo Scientific Pierce) por al menos 24 horas a 2-8°C. Después de la remoción del cásete, el pH de soluciones individuales fue medido bajo condiciones ambientes usando un medidor de pH Mettler Toledo SevenMulti. Se determinó la concentración del polipéptido con muestras preparadas gravimétricamente usando un espectrofotómetro HP 8452 a 280 nm y 320 nm. La densidad fue medida usando un densitómetro Antón Paar DMA 5000 a 25.00°C.

Se prepararon alícuotas de muestra de aproximadamente 500 µ? al proyectar en el co-solvente (DMSO o DMA) dependiendo del porcentaje en volumen - volumen deseado. Se midió un testigo sin co-solvente pero que contiene cantidades iguales de respectivas soluciones reguladoras del pH de la formulación para mantener una concentración del polipéptido igual por comparación .

La viscosidad de todas las formulaciones fue medida usando un reómetro Antón Paar Physica MCR300 con un cono CP25-1 24.972 mm. La temperatura de medición fue controlada a 15°C usando una placa de Peltier. Se midieron tres muestras de 75 µ? independientes y separadas 20 veces durante intervalos de tiempo de 100 segundos con una velocidad de esfuerzo cortante de 1000/segundo . 1. Resultados y discusión La viscosidad cortante de múltiples soluciones de polipéptido fue medida en presencia y ausencia de varios sistemas reguladores del pH y solventes polares. La adición de por cientos en volumen a volumen relativamente bajos (1-10%) de DMSO y/o DMA disminuye la viscosidad de la solución a extensiones variables (figura 1). Interesantemente, el componente de solución reguladora del pH de cloruro de histidina reduce la viscosidad de la solución a alta fuerza iónica, sin embargo, se muestra que DMSO y DMA disminuyen adicionalmente la viscosidad (figura 1).

Los solventes polares DMSO y DMA disminuye la viscosidad de la solución del anticuerpo monoclonal anti-IFN-a a la mayor extensión. Sin embargo, se observó un efecto similar con otros tres Mab (tabla 2) . Los componentes de solución reguladora del pH y concentración del polipéptido varían entre diferentes polipéptidos, pero es obvio el efecto reductor de la viscosidad de DMSO y DMA sobre cada solución individual. En efecto, se observó una disminución de 2 - 3 veces de viscosidad de la solución en algunas instancias (tabla 2).

Tabla 2.

?? DMSO/DMA es el cambio en viscosidad cortante cuando se agrega DMSO o DMA .

®DMSO/DMSO son las veces de cambio en viscosidad cortante o la proporción de viscosidad de solución reguladora sin co-solvente para regular la viscosidad con co-solvente.

Para investigar adicionalmente las propiedades reductoras de viscosidad de los solventes polares DMSO y DMA , se hizo variar el pH de la solución de 5.2 a 6.5 y se midió la viscosidad cortante. La viscosidad de la solución fue reducidad por DMSO a todos los valores de pH de la solución probados (figura 2). Claramente, el efecto observado es resultado directo del DMSO aditivo polar. Por supuesto, el pH de la solución afecta espectacularmente la viscosidad de la solución en ausencia de D SO y la adición de DMSO atenúa los cambios de viscosidad dependientes del pH (figura 2).

Otro excipiente común para mejora de la solubilidad y reducción de la viscosidad de las soluciones de polipéptido es cloruro de arginina. Se investigó el efecto de DMSO y DMA en presencia de cantidades variables de cloruro de arginina para determinar si estos solventes polares exhiben efectos reductores de viscosidad, adicionales. En la presente, se demuestra que la adición de DMSO y DMA a soluciones dé polipéptido reduce adicionalmente la viscosidad de la solución en presencia de cloruro de arginina (figura 3) .

En la presente, se han explorado los efectos de sulfóxido de dimetilo y dimetil acetamida. Claramente, estos constituyentes polares disminuyen la viscosidad de la solución de terapéuticos de polipéptido de alta concentración. DMSO y DMA pueden ser usados para incrementar la posibilidad de manufactura y administración de formulaciones de polipéptido de alta concentración.

Claims (45)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación liquida que comprende: (a) un polipéptido en una cantidad mayor de aproximadamente 50 mg/ml y (b) sulfóxido de dimetilo (DM0) o dimetil acetamida (DMA) en una cantidad de entre aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% volumen/volumen de la formulación, caracterizada porque la formulación tiene viscosidad reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA.

2. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido es apto de formar una estructura secundaria, estructura terciaria y/o estructura cuaternaria.

3. La formulación de la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido es apto de formar una estructura secundaria.

4. La formulación de la reivindicación 3, caracterizada porque la estructura secundaria es una hoja ß.

5. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido es hidrofóbico.

6. La formulación de la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido es de aproximadamente 100 aminoácidos o mayor.

7. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido tiene un peso molecular mayor de aproximadamente 5,000 Daltons.

8. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido es un polipéptido terapéutico .

9. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido es un anticuerpo.

10. La formulación de la reivindicación 9, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

11. La formulación de la reivindicación 10, caracterizada porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo humano.

12. La formulación de la reivindicación 10, caracterizada porque el anticuerpo monoclonal es anticuerpo monoclonal de IgG.

13. La formulación de la reivindicación 9, caracterizada porque el anticuerpo es un fragmento de enlace de antigeno .

14. La formulación de la reivindicación 13, caracterizada porque el fragmento de enlace de antigeno es seleccionado del grupo que consiste de un fragmento de Fab, un fragmento de Fab', un fragmento de F(ab')2, un scFv, un Fv y un diacuerpo .

15. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque DMSO o DMA está en una cantidad de entre aproximadamente 1% a aproximadamente 10% v/v de la formulación.

16. La formulación de la reivindicación 15, caracterizada porque el D SO o DMA está en una cantidad de entre aproximadamente 1% a aproximadamente 5% v/v de la formulación .

17. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación comprende además histidina.

18. La formulación de la reivindicación 17, caracterizada porque histidina está en una cantidad de entre aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM.

19. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación comprende además arginina-HCl.

20. La formulación de la reivindicación 19, caracterizada porque arginina-HCl está en una cantidad de entre aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM.

21. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido está en una cantidad de aproximadamente 100 mg/ml o mayor.

22. La formulación de la reivindicación 21, caracterizada porque el polipéptido está en una cantidad de entre aproximadamente 100 mg/ml y aproximadamente 300 mg/ml.

23. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque la viscosidad es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA por entre aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 cP.

24. La formulación de la reivindicación 23, caracterizada porque la viscosidad es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA por entre aproximadamente 5 a aproximadamente 100 cP.

25. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque la viscosidad es reducida en comparación con la' misma formulación en ausencia de DMSO o DMA por entre aproximadamente 1.2 y aproximadamente 10 veces.

26. La formulación de la reivindicación 25, caracterizada porque la viscosidad es reducida en comparación con la misma formulación en ausencia de DMSO o DMA por entre aproximadamente 1.2 y aproximadamente 5 veces.

27. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque la viscosidad es de aproximadamente 50 cP o menor.

28. La formulación de la reivindicación 27, caracterizada porque la viscosidad es de aproximadamente 25 cP o menor.

29. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el pH es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8.

30. La formulación de la reivindicación 29, caracterizada porque el pH es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6.5.

31. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el DMSO o DMA es DMSO.

32. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque el DMSO o DMA es DMA.

33. La formulación de la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación es formulada- para administración mediante inyección.

34. La formulación de la reivindicación 33, caracterizada porque la formulación es formulada para administración mediante inyección subcutánea.

35. Un método de fabricación de la formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende combinar el polipéptido y DMSO o DMA.

36. Un articulo de manufactura, caracterizado porque comprende un recipiente que contiene la formulación de la reivindicación 1.

37. El articulo de manufactura de la reivindicación 36, caracterizado porque el recipiente es una jeringa.

38. El articulo de manufactura de la reivindicación 37, caracterizado porque la jeringa está contenida además dentro de un dispositivo de inyección.

39. El articulo de manufactura de la reivindicación 38, caracterizado porque el dispositivo de inyección es un auto-inyector.

40. Un método para usar la formulación de la reivindicación 8 para tratar una enfermedad o alteración, caracterizado porque comprende administrar la formulación a un sujeto en necesidad del mismo.

41. El método de la reivindicación 40, caracterizado porque la formulación es administrada mediante inyección.

42. El método de la reivindicación 41, caracterizado porque la formulación es . administrada mediante inyección subcutánea .

43. Un método para administrar la formulación de la reivindicación 1 a un sujeto en necesidad de la misma, caracterizado porque comprende administrar la formulación.

44. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque la formulación es administrada mediante inyección.

45. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque la formulación es administrada mediante inyección subcutánea.