[go: up one dir, main page]

MX2011010264A - Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso. - Google Patents

Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso.

Info

Publication number
MX2011010264A
MX2011010264A MX2011010264A MX2011010264A MX2011010264A MX 2011010264 A MX2011010264 A MX 2011010264A MX 2011010264 A MX2011010264 A MX 2011010264A MX 2011010264 A MX2011010264 A MX 2011010264A MX 2011010264 A MX2011010264 A MX 2011010264A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
antibody
fcrh5
seq
cell
sequence
Prior art date
Application number
MX2011010264A
Other languages
English (en)
Inventor
Jo-Anne Hongo
Yan Wu
Kristi Elkins
Andrew Polson
Bing Zheng
Allen Ebens
Camelia Adams
Jagath R Junutula
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42358044&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2011010264(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of MX2011010264A publication Critical patent/MX2011010264A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A61K31/568—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A61K31/568—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone
    • A61K31/5685—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone having an oxo group in position 17, e.g. androsterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G01N33/575—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/804—Blood cells [leukemia, lymphoma]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

La presente invención está dirigida a anticuerpos específicos para FcRH5, a composiciones que comprenden tales anticuerpos útiles para el tratamiento de tumores hematopoyéticos y a métodos para utilizar tales composiciones para ese propósito.

Description

ANTICUERPOS ANTI-FcRH5 E INMUNOCONJUGADOS Y METODOS DE USO Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones del tema útiles para el tratamiento del tumor hematopoyético en mamíferos y a los métodos de usar estas composiciones del tema para lo mismo.
Antecedentes de la Invención Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, después de la enfermedad cardíaca (Boring y otros., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)) . El cáncer se caracteriza por el aumento de células anormales o neoplásicas derivadas de un tejido normal que prolifera para formar una masa tumoral, la invasión de los tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas y la generación de células malignas que finalmente se diseminan por medio de la sangre o el sistema linfático a los ganglios linfáticos y a sitios distantes por un proceso llamado metástasis. En un estado cancerígeno, una célula prolifera bajo condiciones en que las células normales no pueden crecer. El cáncer se manifiesta en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y agresividad.
Los cánceres que involucran células generadas durante la hematopoyesis, un proceso por el que se generan Ref. 223893 los elementos celulares de la sangre, tales como linfocitos, leucocitos, plaquetas, eritrocitos y células citolíticas naturales se denominan cánceres hematopoyéticos . Los linfocitos que se pueden hallar en la sangre y el tejido linfático y son críticos para la respuesta inmunitaria se categorizan en dos clases principales de linfocitos: linfocitos B (células B) y linfocitos T (células T) , que median la inmunidad humoral y mediada por células, respectivamente .
Las células B maduran dentro de la médula ósea y dejan la médula expresando un anticuerpo de unión al antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B inactiva se encuentra primero con el antígeno para el que su anticuerpo unido a membrana es específico, la célula comienza a dividirse rápidamente y su progenie se diferencia en células B de memoria y células efectoras llamadas "células plasmáticas" . Las células B de memoria tienen una vida más larga y continúan expresando el anticuerpo unido a membrana con la misma especificidad que la célula progenitora original Las células plasmáticas no producen anticuerpo unido a membrana pero en cambio producen el anticuerpo en una forma que se puede secretar. Los anticuerpos secretados son la principal molécula efectora de la inmunidad humoral .
Las células T maduran en el timo que provee un ambiente para la proliferación y diferenciación de las células T inmaduras. Durante la maduración de las células T, las células T experimentan reordenamientos génicos que producen el receptor de las células T y la selección positiva y negativa que ayuda a determinar el fenotipo de superficie celular de las células T maduras . Los marcadores de superficie celular característicos de las células T maduras son el complejo del receptor CD3: células T y uno de los correceptores, CD4 o CD8.
En los intentos de descubrir los objetivos celulares efectivos para la terapia del cáncer, los investigadores han tratado de identificar polipéptidos de transmembrana o asociados de otro modo a membrana que se expresan específicamente en la superficie de uno o más tipos particulares de células cancerígenas en comparación con una o más células no cancerígenas no normales. Con frecuencia, los polipéptidos asociados a membrana están expresados más abundantemente en la superficie de las células cancerígenas en comparación con la superficie de las células no cancerígenas. La identificación de los polipéptidos del antígeno de superficie celular asociados al tumor ha originado la capacidad de las células cancerígenas de dirigirse específicamente para la destrucción por medio de terapias basadas en el anticuerpo. En este aspecto, se advierte que la terapia basada en anticuerpos ha demostrado ser muy efectiva en el tratamiento de ciertos cánceres. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, California) son anticuerpos que se han usado exitosamente para tratar cáncer de mama y linfoma no de Hodgkin, respectivamente. Más específicamente, HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del proto-oncogén del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). La sobreexpresión de proteínas de HER2 se observa en 25-30% de cánceres de mama primarios. RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal quimérico murino/humano manipulado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20 que se halla en la superficie de los linfocitos B normales y malignos. Estos anticuerpos se producen en forma recombinante en las células CHO.
En otros intentos para descubrir objetivos celulares efectivos para la terapia de cáncer, los investigadores han buscado identificar (1) polipéptidos no asociados a membrana que se han producido específicamente por uno o más tipos particulares de células cancerígenas en comparación con uno o más tipos particulares de células normales no cancerígenas, (2) polipéptidos que son producidos por células cancerígenas con un nivel de expresión que es significativamente superior que el de una o más células no cancerígenas normales, o (3) polipéptidos cuya expresión es específicamente limitado a solo un tipo de tejido único (o muy limitado número de diferentes) en estado cancerígeno y no cancerígeno (por ejemplo, tejido de próstata normal y tumor de próstata) . Tales polipéptidos pueden permanecer ubicados en forma intracelular o pueden ser secretados por la célula cancerígena. Además, los polipéptidos pueden no estar expresados por la célula cancerígena misma, sino más bien por las células que producen y/o secretan polipéptidos que tienen un efecto potenciador o mejorador del crecimiento sobre las células cancerígenas. Tales polipéptidos secretados a menudo son proteínas que proporcionan células cancerígenas con una ventaja de crecimiento respecto de las células normales e incluyen cosas tales como, por ejemplo, factores angiogénicos , factores de adhesión celular, factores de crecimiento, y similares. Se esperaría que la identificación de los antagonistas de los polipéptidos no asociados a membrana permita obtener agentes terapéuticos efectivos para el tratamiento de los cánceres. Por otra parte, la identificación del patrón de expresión de los polipéptidos puede ser de utilidad para el diagnóstico de cánceres particulares en mamíferos.
A pesar de los avances anteriormente identificados en la terapia del cáncer de mamíferos, existe una gran necesidad de agentes terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de tumor en un mamífero y para inhibir efectivamente el crecimiento de células neoplásicas, respectivamente. Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención identificar polipéptidos , polipéptidos asociados a la membrana celular, secretados o intracelulares cuya expresión está limitada específicamente a solo un tipo de tejido único (o muy limitado número de diferentes), tejidos hematopoyéticos , tanto en estado cancerígeno como no cancerígeno y al uso de estos polipéptidos, y sus ácidos nucleicos codificadores, para producir composiciones del tema útiles en el tratamiento terapéutico y/o detección del cáncer hematopoyético en los mamíferos.
Las anormalidades del cromosoma lq21 son comunes en las neoplasias de células B, que incluyen linfoma de células B y mieloma, pero los genes dirigidos por estas aberraciones son muy conocidos. Las anormalidades cromosómicas que involucran la banda Iq2l-q23 están entre las lesiones genéticas más frecuentes en linfoma no de Hodgkin de células B y el mieloma múltiple. Entre los subtipos de linfoma no de Hodgkin, se han informado los puntos de ruptura de la translocación en Iq21-q23, que incluyen translocaciones y duplicaciones, con frecuencia como anormalidad cromosómica única en el linfoma de células B folicular y difuso de células grandes (DLCL, por sus siglas en inglés) en el linfoma de células B de zona marginal y en el linfoma de Burkitt . Por clonación de los puntos de ruptura de una translocación cromosómica t(l:14) (q21:q32) en una línea celular de mieloma, se identificaron dos genes, denominados receptores de translocación asociados de la superfamilia de inmunoglobulina (IRTA) 1 e IRTA2. IRTA2 es idéntico a las secuencias identificadas como BXMAS1 (Nakayama y otros., Biochm. Biophys. Res. Commun. 285:830-7, 2001) y FcRH5 (Davis y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:9772-7, 2001). Tanto IRTA1 como IRTA2 son miembros de una familia de genes relacionados, la IRTA.
FcRH5 (o IRTA2) es un receptor de superficie celular con homologías con las familias del receptor de Fe. Se expresa normalmente en las células B maduras, y tiene una distribución diferente en los órganos linfoides periféricos que FcRH4 (IRTA1) . IRTA1 se expresa en las células B de la zona marginal, mientras que IRTA2 también se expresa en los centrocitos del centro germinal y en los inmunoblastos . La expresión de IRTA2 está desregulada en el mieloma múltiple y las líneas celulares del linfoma de Burkitt con anormalidades de lq21 (ver Miller y otros., Blood 99:2662-2669, 2002). La alta frecuencia de la participación de los reordenamientos estructurales de lq21 en las neoplasias de células B sugiere que IRTA1 e IRTA2 son críticos para la patogénesis de estas enfermedades (ver solicitud publicada de PCT No. WO 01/38490; solicitud de patente publicada U.S. No. 20080292632, cuyos contenidos están incorporados por referencia en la presente) (ver también Polson, y otros. Int Immunol . 2006 Sep; 18 (9) : 1363-73) .
Dada la expresión de FcRH5, es beneficioso producir anticuerpos terapéuticos para este antígeno de FcRH5 que crean antigenicidad mínima o ninguna cuando se administran a los pacientes, en especial para el tratamiento crónico. La presente invención satisface estas y otras necesidades. La presente invención proporciona anticuerpos anti-FcRH5 que superan las limitaciones de las composiciones terapéuticas actuales así como ofrece ventajas que serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
El uso de conjugados del anticuerpo-fármaco (ADC) , es decir, inmunoconjugados , para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos , es decir, fármacos para destruir o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinión in Pharmacology 5:543-549; Wu y otros (2005) Nature Biotechnology 23(9) :1137-1146; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212,- Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; US 4975278) permite la administración dirigida del residuo de fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular en ella, donde la administración sistémica de estos agentes farmacológicos no conjugados pueden producir niveles inaceptables de toxicidad a las células normales así como se eliminan las células tumorales buscadas (Baldwin y otros (1986) Lancet p. (Mar. 15, 1986) :603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Citotoxic agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monoclonal Anticuerpos ' 84 : Biological And Clinical Applications, A. Pinchera y otros (ed.s), p . 475-506) . Los esfuerzos para mejorar el índice terapéutico, es decir, la máxima eficacia y mínima toxicidad de ADC se han centrado en la selectividad de los anticuerpos policlonales (Rowland y otros (1986) Cáncer Immunol . Immunother. , 21:183-87) y monoclonales (mAb) así como las propiedades un unión al fármaco y liberación del fármaco (Lambert, J. (2005) Curr. Opinión in Pharmacology 5:543-549) . Los residuos de fármacos usados en los conjugados de anticuerpo y fármaco incluyen toxinas de proteínas bacterianas tales como toxina de la difteria, toxinas de proteínas vegetales tales como ricina, moléculas pequeñas tales como auristatinas , geldanamicina (Mandler y otros (2000) J. of the Nat . Cáncer Inst . 92 (19) : 1573-1581 ,- Mandler y otros (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler y otros (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu y otros (1996) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 93:8618-8623), calicheamicina (Lode y otros (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman y otros (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342), daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, y vindesina (Rowland y otros (1986) supjra) . Los residuos del fármaco pueden afectar los mecanismos citotóxicos y citostáticos que incluyen unión a tubulina, unión al ADN o inhibición de topoisomerasa . Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a anticuerpos grandes o ligandos del receptor de proteínas.
Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de la dolastatina ( O 02/088172), se han conjugado como residuos de fármacos a: (i) anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) ; (ii) cAClO que es específico para CD30 en neoplasias hematológicas (Klussman, y otros (2004), Bioconjugate Chemistry 15 (4 ): 765-773 ; Doronina y otros (2003) Nature Biotechnology 21 ( 7 ): 778-784 ; Francisco y otros (2003) Blood 102 (4) : 1458-1465 ; US 2004/0018194; (iii) anticuerpos anti-CD20 tales como rituxan (WO 04/032828) para el tratamiento de los cánceres que expresan CD20 y trastornos inmunitarios ; (iv) anticuerpo anti-EphB2R 2H9 para el tratamiento de cáncer colorectal (Mao y otros (2004) Cáncer Research 64 (3) : 781-788) ; (v) anticuerpo de E-selectina (Bhaskar y otros (2003) Cáncer Res. 63:6387-6394); (vi) trastuzumab (HERCEPTIN®, US 2005/0238649) , y (vi) anticuerpos anti-CD30 (WO 03/043583) . Las variantes de auristatina E se describen en US 5767237 y US 6124431. La monometil auristatina E conjugada a los anticuerpos monoclonales se describe en Senter y otros, Proceedings of the American Association for Cáncer Research, Volumen 45, Número de Resumen 623, presentada el 28 de marzo de 2004. Los análogos de auristatina MMAE y MMAF se han conjugado a varios anticuerpos (US 2005/0238649) .
Los medios convencionales de unión, es decir, enlace mediante enlaces covalentes, de un residuo de fármaco a un anticuerpo generalmente produce una mezcla heterogénea de moléculas donde los residuos del fármaco se fijan a numerosos sitios del anticuerpo. Por ejemplo, los fármacos citotóxicos normalmente se han conjugado a un anticuerpo a través de residuos de lisina menos frecuentes dé un anticuerpo, lo que genera una mezcla heterogénea del conjugado de anticuerpo y fármaco. De acuerdo con las condiciones de reacción, la mezcla heterogénea normalmente contiene una distribución de anticuerpos de 0 a aproximadamente 8, o más, residuos fármacos unidos. Además, dentro de cada subgrupo de conjugados con una relación entera particular de residuos de fármaco al anticuerpo, es una mezcla potencialmente heterogénea donde el residuo de fármaco se une a varios sitios del anticuerpo. Los métodos analíticos y preparativos pueden ser inadecuados para separar y caracterizar el conjugado de las moléculas de especie anticuerpo y fármaco dentro de la mezcla heterogénea resultante de una reacción de conjugación. Los anticuerpos son biomoléculas grandes, complejas y estructuralmente diversas, a menudo con muchos grupos funcionales reactivos.
Su reactividad con los reactivos enlazadores y el intermediario fármaco-enlazador depende de factores tales como pH, concentración, concentración de sal y cosolventes . Además, el proceso de conjugación de etapas múltiples puede ser no reproducible debido a las dificultades para controlar las condiciones de reacción y caracterización de reactantes e intermediarios .
Los tioles de la cisteína son reactivos a pH neutro, a diferencia de la mayoría de las aminas que están protonados y menos nucleófilos cerca del pH 7. Debido a que los grupos tiol libres (RSH, sulfhidrilo) son relativamente reactivos, las proteínas con residuos de cisteína a menudo existen en su forma oxidada como oligómeros unidos por disulfuro o tienen grupos disulfuro con puentes internos. Las proteínas extracelulares generalmente no tienen tioles libres (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres, en página 55) . Los grupos tiol de la cisteína del anticuerpo generalmente son más reactivos, es decir, más nucleófilos, hacia los reactivos de conjugación electrófilos que los grupos amino o hidroxilo del anticuerpo. Los residuos de cisteína se han introducido en las proteínas por técnicas de ingeniería genética para formar uniones covalentes a los ligandos o para formar nuevos enlaces de disulfuro intramoleculares (Better y otros (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard y otros (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood y otros (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu y otros (1999) Proc . Nati. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno y otros (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura y otros (2001) Proc. Nat . Acad. Sci. USA 98 (15) : 8480-8484 ; US 6248564). Sin embargo, la manipulación genética de los grupos tiol de la cisteína por la mutación de varios residuos de aminoácidos de una proteína a aminoácidos de cisteína es potencialmente problemática, particularmente en el caso de residuos no apareados (Cys libre) o los que son relativamente accesibles para la reacción u oxidación. En las soluciones concentradas de la proteína, si en el periplasma de E. coli, los sobrenadantes del cultivo, o la proteína purificada en forma parcial o completa, los residuos de Cys no apareados en la superficie de la proteína se pueden aparear y oxidar para formar disulfuros intermoleculares, y en consecuencia dímeros o multímeros de proteína. La formación de dímeros de disulfuro produce una nueva Cys no reactiva para la conjugación a un fármaco, ligando u otra marca. Además, si la proteína forma por oxidación un enlace de disulfuro intramolecular entre la Cys recién manipulada genéticamente y un residuo de Cys existente, ambos grupos tiol de la Cys no están disponibles para la participación y las interacciones en el sitio activo. Por otra parte, la proteína se puede volver inactiva o no específica, por mal plegado o pérdida de la estructura terciaria (Zhang y otros (2002) Anal. Biochem. 311:1-9).
Los anticuerpos manipulados genéticamente en la cisteína se han diseñado como fragmentos de anticuerpo FAB (tioFab) y se expresan como anticuerpos monoclonales IgG de longitud completa (tioMab) (Junutula, J. . y otros. (2008) J Immunol Methods 332:41-52; US 2007/0092940, cuyo contenido se incorporan por referencia) . Los anticuerpos TioFab y TioMab se han conjugado mediante enlazadores en los tioles de la cisteína recién introducidos con agentes enlazadores reactivos con tiol y enlazadores reactivos con el fármaco para preparar conjugados de anticuerpo y fármaco (Tio ADC) .
Todas las referencias mencionadas en la presente, que incluyen solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan por referencia en su totalidad.
Breve Descripción de la Invención La invención proporciona anticuerpos anti-FcRH5 o fragmentos funcionales de éstos, y sus métodos de uso en el tratamiento de los tumores hematopoyéticos .
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une, con preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos anteriores o que se describen a continuación. Opcionalmente , el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, que incluye Fab, Fab ' , F(ab')2, y fragmento de Fv, diacuerpo, anticuerpo de dominio único, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena simple o anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de un polipéptido del anticuerpo anti-FcRH5 a su epítopo antigénico respectivo. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente se pueden conjugar a un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, que incluye, por ejemplo, una auristatina, un maitansinoide , un derivado de dolostatina o una calicheamicina , un antibiótico, un isótopo radiactivo, una enzima nucleolítica , o similares. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente se pueden producir en las células CHO o células bacterianas y con preferencia inducen la muerte de una célula a la que se unen. Para los fines de detección, los anticuerpos de la presente invención se puede marcar en forma detectable, unir a un soporte sólido, o similares.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad monovalente (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como fragmento Fab al FcRH5) o afinidad en su forma bivalente del anticuerpo al FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como un fragmento de IgG al FcRH5) es sustancialmente igual, menor o mayor que la afinidad monovalente o la afinidad en su forma bivalente, respectivamente, de un anticuerpo humano (por ejemplo afinidad del anticuerpo humano como fragmento Fab o como fragmento de IgG al FcRH5) o un anticuerpo quimérico (por ejemplo afinidad del anticuerpo quimérico como un fragmento Fab o como un fragmento de IgG al FcRH5) , que comprende, consiste o consiste esencialmente en una cadena ligera y dominio variable de la secuencia de cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 19) y la Figura 10 (SEC ID NO:21) .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como IgG al FcRH5) es 0.4 nM, 0.2 nM o 0.5 nM .
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une al FcRH5 , en donde el anticuerpo comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas del grupo que consiste en: (i) HVR-L1 que comprende la secuencia KASQDVSTAVA (SEC ID NO: 26) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia SASYRYT (SEC ID NO: 27) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia QQHFSSPRT (SEC ID NO: 28) (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia GFTFSSYAVS (SEC ID NO: 35) (v) HVR-H2 que comprende la secuencia ATISSGGSLTFILDSVR (SEC ID NO: 36); y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia PIPDYYALDY (SEC ID NO: 37) . En otra modalidad, la HVR-H2 tiene la secuencia de la SEC ID NO: 36. En otra modalidad, el anticuerpo comprende secuencia estructural de consenso del subgrupo 1 ? humana. En otra modalidad, el anticuerpo comprende la secuencia estructural de consenso de la cadena pesada del subgrupo III. En otra modalidad, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 19.
En una modalidad, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 21. En otra modalidad, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 19.
En otra modalidad, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 21. En una modalidad, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende uno, dos, tres o cuatro secuencias de aminoácidos estructurales seleccionadas de las SEC ID NOs: 31, 32, 33 y 34. En otras modalidades, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende uno, dos, tres o cuatro secuencias de aminoácidos estructurales seleccionadas de las SEC ID NOs : 22, 23, 24 y 25. En otra modalidad, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende uno, dos, tres o cuatro secuencias de aminoácidos estructurales que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un aminoácido seleccionado de las SEC ID NOs : 31, 32, 33 y 34. En otras modalidades, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende uno, dos, tres o cuatro secuencias de aminoácidos estructurales que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un aminoácido seleccionado de las SEC ID NOs: 22, 23, 24 y 25.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une al FcRH5, en donde el anticuerpo comprende al menos una variante de HVR en donde la secuencia de la variante de HVR comprende la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en las SEC ID NOs: 26, 27, 28, 35, 36 ó 37. En otra modalidad, la modificación es sustitución, inserción o eliminación.
En otra modalidad, al menos una porción de la secuencia estructural es una secuencia estructural de consenso humana.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad monovalente del anticuerpo al FcRH5 humano es sustancialmente la misma que la afinidad monovalente -de un anticuerpo humano que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 19) y la Figura 10 (SEC ID NO: 21) .
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad monovalente del anticuerpo al FcRH5 humano es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces mayor que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino o quimérico que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 19) y la Figura 10 (SEC ID NO: 21) .
En un aspecto diferente, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad monovalente del anticuerpo al FcRH5 humano es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 veces menor que afinidad monovalente de un anticuerpo murino o quimérico que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es sustancialmente la misma que la afinidad de un anticuerpo humano en su forma bivalente y que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces mayor que la afinidad de un anticuerpo murino o quimérico en su forma bivalente y que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 veces menor que la afinidad de un anticuerpo murino o quimérico en su forma bivalente que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En un aspecto diferente, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.4 nM.
En una modalidad, la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.4 nM +/- ,04.
En un aspecto diferente, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.2 nM.
En una modalidad, la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.2 nM +/- ,02.
En un aspecto diferente, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.5 nM.
En una modalidad, la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.5 nM +/- ,01.
En todos los aspectos, la afinidad de unión se expresa como un valor de Kd. En otro aspecto, la afinidad de unión se mide por Biacore o radioinmunoensayo.
En un aspecto diferente, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde el anticuerpo humanizado cuando se conjuga a un agente citotóxico inhibe el crecimiento de las células tumorales .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde el anticuerpo humanizado cuando se conjuga a un agente citotóxico inhibe el crecimiento de las células tumorales.
En una modalidad, el anticuerpo humanizado y el anticuerpo quimérico son monovalentes o bivalentes. En otra modalidad, el anticuerpo humanizado y el anticuerpo quimérico comprenden una región de Fab única enlazada a una región de Fe .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, HVR2-HC y/o HVR3-HC que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NOs : 35-37) . En una modalidad, el dominio variable comprende la secuencia de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y/o FR4-HC que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NOs : 31-34) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende la secuencia de CH1 y/o Fe que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NO: 38 y/o 39) .
En un aspecto diferente, la invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de HVR1-LC, HVR2-LC y/o HVR3-LC que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NOs : 26-28) . En una modalidad, el dominio variable comprende la secuencia de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y/o FR4-LC que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NOs : 22-25) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende la secuíncia de CL1 que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NO: 29) .
En un aspecto, la invención proporciona a polipéptido que comprende la secuencia que se ilustra en la Figura 10 (SEC ID NO: 21) . En otro aspecto, la invención proporciona a polipéptido que comprende la secuencia que se ilustra en la Figura 9 (SEC ID NO: 19) .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo obtenido por el proceso de (a) cultivar una célula que expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada descrita en la presente y un dominio variable de la cadena ligera descrita en la presente; y (b) aislar el anticuerpo de la célula cultivada.
En un aspecto diferente, la invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada descrita en la presente y un dominio variable de la cadena ligera descrita en la presente. En una modalidad, el anticuerpo es monovalente y comprende una región de Fe.
En un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en la presente. En una modalidad, la invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido. En otra modalidad, la invención proporciona una célula hospedera que comprende el vector .
En un aspecto, la invención incluye un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína que comprende uno o más aminoácidos de cisteína libre y una secuencia seleccionada de las SEC ID NOs : 251-298. El anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína se puede unir un polipéptido de FcRH5. El anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína se puede preparar por un proceso que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácidos de un anticuerpo anti-FcRH5 original por cisteína.
En un aspecto, la invención incluye un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína que comprende uno o más aminoácidos de cisteína libre en donde el anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína se une a un polipéptido de FcRH5 y se prepara por un proceso que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácidos de un anticuerpo anti-FcRH5 original por cisteína en donde el anticuerpo original comprende al menos una secuencia de HVR seleccionada de: (i) HVR-L1 que comprende la secuencia KASQDVSTAVA (SEC ID NO: 26) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia SASYRYT (SEC ID NO: 27) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia QQHFSSPRT (SEC ID NO: 28) \ (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia GFTFSSYAVS (SEC ID NO: 35) (v) HVR-H2 que comprende la secuencia ATISSGGSLTFILDSVR (SEC ID NO: 36); y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia PIPDYYALDY (SEC ID NO: 37) .
El anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína puede ser un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena simple o anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de un polipéptido del anticuerpo anti-FcRH5 a su respectivo epítopo antigénico. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente se pueden conjugar a un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tales como una toxina, que incluye, por ejemplo, una auristatina o maitansinoide . Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente se pueden producir en células CHO o células bacterianas y con preferencia inhiben el crecimiento o la proliferación o induce la muerte de una célula a la que se unen. Para fine diagnósticos, los anticuerpos de lao presente invención se pueden marcar en forma detectable, unir a un soporte sólido, o similares.
En un aspecto, la invención proporciona los métodos para obtener un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método de obtener un anticuerpo de FcRH5 (que, como se define en la presente incluye longitud completa y fragmentos de éste) , el método que comprende expresar en una célula hospedera adecuada un vector recombinante de la invención que codifica el anticuerpo (o fragmento de éste), y recuperar el anticuerpo.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a una primera célula que expresa FcRH5 y a una segunda célula que expresa un antígeno objetivo de la superficie celular. En una modalidad, la segunda célula es una célula T. En una modalidad, el antígeno objetivo de la superficie celular es CD3. En ciertas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de protuberancia dentro de la cavidad. En una modalidad, el anticuerpo biespecífico es aglicosilado . En una modalidad, el anticuerpo biespecífico se produce en una célula hospedera de Escherichia coli. En una modalidad, el anticuerpo biespecífico carece de una o más funciones efectoras de Fe. En una modalidad, el anticuerpo biespecífico carece de actividad ADCC.
En un aspecto, la invención es una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención o un el conjugado de anticuerpo y fármaco de la invención, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la invención proporciona un artículo de manufactura que comprende un recipiente; y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición comprende uno o más anticuerpos FcRH5 de la invención.
En un aspecto, la invención proporciona un kit que comprende un primer recipiente que comprende una composición que comprende uno o más anticuerpos FcRH5 de la invención; y un segundo recipiente que comprende un regulador de pH.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo de FcRH5 de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como a cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un artículo de manufactura de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un kit de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular.
En un aspecto, la invención proporciona un método de inhibir el crecimiento de una célula que expresa FcRH5 , el método que comprende poner en contacto las células con un anticuerpo de la invención de este modo causa una inhibición del crecimiento de la célula. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método de tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor cancerígeno que comprende una célula que expresa FcRH5 , el método que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención, de este modo se trata efectivamente al mamífero. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular asociado con aumento de expresión de FcRH5 , el método que comprende administrar a un sujeto que necesita el tratamiento una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, de este modo se trata o previene efectivamente el trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el trastorno proliferativo es cáncer. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de la célula es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de FcRH5, el método que comprende poner en contacto la células con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, de este modo se inhibe el crecimiento de la célula. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento .
En un aspecto, la invención proporciona un método de tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de FcRH5 , el método que comprende poner en contacto la células con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, de este modo se trata efectivamente el tumor. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método de tratar cáncer que comprende administrar a un paciente la formulación farmacéutica que comprende un inmunoconjugado descrito en la presente, y un diluyente, portador o excipiente aceptable.
En un aspecto, la invención proporciona un método de inhibir la proli eración de las células B que comprende exponer una célula a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención en condiciones permisivas para la unión del inmunoconjugado a FcRH5.
Los métodos de la presente invención además pueden comprender etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una modalidad, un método que además comprende una etapa en donde una célula y/o tejido específico (por ejemplo, una célula cancerígena) se expone a un tratamiento de radiación o a un agente quimioterapéutica» .
En un aspecto, la invención proporciona métodos que comprenden la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FcRH5 en combinación con una cantidad efectiva de otro agente terapéutico (tal como un agente antiangiogénesis , otro anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna del cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento) . Por ejemplo, los anticuerpos anti-FcRH5 o inmunoconjugados se usan en combinaciones con un agente anticancerígeno o un agente antiangiogénico para tratar varias afecciones neoplásicas o no neoplásicas. En ejemplos particulares, los anticuerpos anti-FcRH5 se usan en combinación con Velcade® (bortezomib) , Revlimid® (lenalidomida) , tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecano, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, bevacizumab, vincristina, cisplatina, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatina, paclitaxel, docetaxel, pemetrexed, 5-fluorouracilo, doxorrubicina , bortezomib, lenalidomida, dexametasona, melfaliña, prednisona, vincristina, talidomida.
Dependiendo de la indicación de cáncer específico tratado, la terapia de combinación de la invención se puede combinar con agentes terapéuticos adicionales, tales como agentes quimioterapéuticos , o terapias adicionales tales como radioterapia o cirugía. Se pueden usar muchos agentes quimioterapéuticos en la terapia de combinación de la invención. Con preferencia se usarán los agentes quimioterapéuticos que son estándares para el tratamiento de las indicaciones específicas. La dosificación o frecuencia de cada agente terapéutico que se usa en la combinación con preferencia igual, o menor que la dosificación o frecuencia del agente correspondiente cuando se usa sin los otros agentes.
En otro aspecto, la invención proporciona alguno de los anticuerpos anti-FcRH5 descritos en la presente, en donde el anticuerpo anti-FcRH5 comprende una marca detectable.
En un aspecto, la invención proporciona un método de determinar la presencia de FcRH5 en una muestra que se sospecha que contiene FcRH5 , el método que comprende exponer la muestra a un anticuerpo de la invención, y determinar la unión de el anticuerpo a FcRH5 en la muestra en donde la unión de el anticuerpo a FcRH5 en la muestra es indicativo de la presencia de la proteína en la muestra.
En un aspecto, la invención proporciona un método de diagnosticar un trastorno proliferativo celular asociado con un aumento de las células, tales como células B, que expresan FcRH5 , el método que comprende poner en contacto las células de ensayo en una muestra biológica con cualquiera de los anticuerpos anteriores; determinar el nivel de anticuerpo unido a las células de ensayo en la muestra por la detección de la unión del anticuerpo a FcRH5; y comparar el nivel de anticuerpo unido a las células en una muestra control, en donde el nivel de anticuerpo unido se normaliza a la cantidad de células que expresan FcRH5 en las muestras de ensayo y control, y en donde un nivel superior de anticuerpo unido en la muestra de ensayo en comparación con la muestra de control indica la presencia de un trastorno proliferativo celular asociado con células que expresan FcRH5.
En un aspecto, la invención proporciona un método de detectar FcRH5 soluble en sangre o suero, el método que comprende poner en contacto una muestra de ensayo de sangre o suero de un mamífero que se sospecha que experimenta un trastorno proliferativo de las células B con un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención y detectar un aumento de FcRH5 soluble en la muestra de ensayo con respecto a una muestra control de sangre o suero de un mamífero normal.
En un aspecto, la invención proporciona un método de unir un anticuerpo de la invención a una célula que expresa FcRH5 , el método que comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo de la invención. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
Breve Descripción de las Figuras i La Figura 1 representa la cadena ligera de FcRH5 7D11 anti-humano quimérico (ADN) .
La Figura 2 representa la cadena ligera de FcRH5 7D11 anti-humano quimérico (aminoácido) .
La Figura 3 representa la cadena pesada de FcRH5 7D11 anti-humano quimérico (ADN) .
La Figura 4 representa la cadena pesada de FcRH5 7D11 anti-humano quimérico (aminoácido) .
La Figura 5 representa la cadena ligera de FcRH5 (mAblOA8) anti-humano quimérico.
La Figura 6 representa la cadena ligera de FcRH5 (mAblOA8) anti-humano quimérico.
La Figura 7 representa la cadena pesada de FcRH5 (mAblOA8) anti-humano quimérico.
La Figura 8 representa la cadena pesada de FcRH5 (mAblOA8) anti-humano quimérico.
La Figura 9 muestra el alineamiento de las cadenas ligeras variables para 10A8 murino = SEC ID. NO: 18 y 10A8vl humanizado = SEC ID NO: 19 con dominio de VL kappa de consenso humana (huKI) (SEC ID NO: 64) .
La Figura 10 muestra el alineamiento de las cadenas pesadas variables para 10A8 murino = SEC ID NO: 20 y 10A8vl humanizado = SEC ID NO: 21 con dominio de VH del subgrupo de consenso humano (huIII) (SEC ID NO: 65) .
La Figura 11 muestra las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo de la invención (HulOA8 vi) Las Figuras 12A a 12B muestran las secuencias de aminoácidos de cadenas del polipéptido manipulado genéticamente en cisteína de un tio-Mab de la invención.
Las Figuras 13A a 13B muestran las secuencias de aminoácidos de cadenas del polipéptido manipulado genéticamente en cisteína de un tio-Mab de la invención.
La Figura 14 muestra la reactividad cruzada 100205 FcRH de los anticuerpos FcRH5. Células SVT2. MSCV . gD . huFcRHl x Abs Mu y Ch FcRH5. Detectada con conjugado anti-mulgG2 o mulgG2a+b de rata o PE mu anti -humano.
La Figura 15 muestra la reactividad cruzada 112105 FcRH de los anticuerpos FcRH5. Células SVT2. MSCV. gD . huFcRHl -6 x Sobrenadantes Abs Mu FcRH5. Detectada con conjugado PE anti -mulgGl .
La Figura 16 muestra la reactividad cruzada de6Hl 13G9 de murino con cynoFcRH5.
La Figura 17 muestra el análisis de FACS de los anticuerpos FcRH5.
La Figura 18 muestra la titulación del anticuerpo 012207 FcRH5. BJAB . FcRH5. DIO y SVT2. cyFcRH5 x Todos los muAbs FcrH5 detectados con conjugados PE anti-msIgGl o msIgG2a+b de rata .
La Figura 19 muestra la titulación del anticuerpo 012207 FcRH5. BJAB . FcRH5. DIO y SVT2. cyFcRH5 x Todos los muAbs FcrH5 detectados con conjugados PE anti-msIgGl o msIgG2a+b de rata .
La Figura 20 muestra el análisis de FACS que indica la unión del conjugado de fármaco Tio Anti-FcRH5.chlOA8.HC.A118C.MC ve PAB MMAE (ADC) de la invención unido a FcRH5 expresado en la superficie de células OPM-2 transíectadas con FcHR5. La detección fue con IgGl-PE ánti-ratón de rata.
La Figura 21 muestra el análisis de FACS que indica la unión por titulación de anti-FcRH5- 10AB HC.Á118C humanizado con tio desnudo y anti-FcRH5.10AB CL.V205C humanizado tio para células 0PM2 transíectadas con células huFcRH5 y SVT2 transíectadas con cynoFcRH5.
La Figura 22 muestra el análisis de FACS que indica la unión del conjugado de fármaco Tio Anti-FcRH5. chlOA8.HC.A118C.MC ve PAB MMAE (ADC) de la invención unido a FcRH5 expresado en la superficie de células OPM-2 transíectadas con FcRH5. La detección fue con IgGl-PE antihumano de rata .
La Figura 23 muestra el análisis de FACS que indica la unión del conjugado de fármaco Tio Hu Anti-FcRH5. 10A8.HC.V205C.MC ve PAB MMAE (ADC) de la invención unido a FcRH5 expresado en la superficie de células OPM-2 transíectadas con FcRH5 humano. La detección fue con IgGl-PE anti -humano de rata.
La Figura 24 muestra el análisis de FACS que indica la unión del conjugado de fármaco Ch Anti-FcRH5.10AB SODB DM4 (ADC) de la invención unido a FcRH5 expresado en la superficie de células OPM-2 transíectadas con FcRH5 humano. La detección fue con IgGl-PE anti-humano de rata.
La Figura 25 muestra el análisis de FACS que indica la unión del conjugado de fármaco Hu Anti -FcRH5.1OAB SODB DM4 (ADC) de la invención unido a FcRH5 expresado en la superficie de células OPM-2 transíectadas con FcRH5 humano. La detección fue con IgGl-PE anti-humano de rata.
La Figura 26 muestra el efecto de los anticuerpos de la invención sobre el volumen tumoral medio.
La Figura 27 muestra el efecto de los anticuerpos de la invención sobre el peso corporal medio.
La Figura 28 muestra el efecto de los anticuerpos de la invención sobre el volumen tumoral medio. Tio-HC-anti-FcRH5 (10A8) - CvcPAB-MMAE, tio-LC-anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MCvcPAB-MMAE, y anti-FcRH5 ( 10A8) -spdb-dm4 vs . un xenoinjerto 0PM2-FcRH5 de Mieloma Múltiple en Ratones Scid CB17. Protocolo #08-1184 La Figura 29 muestra el efecto de los anticuerpos de la invención sobre el peso corporal medio. Tio-HC-anti-FcRH5 (10A8) - CvcPAB-MMAE , tio-LC-anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MCvcPAB-MMAE, y anti-FcRH5 ( 10A8 ) -spdb-dm4 vs . un xenoinjerto OPM2- FcRH5 de Mieloma Múltiple en Ratones Scid CB17. Protocolo #08-118 .
La Figura 30A muestra el efecto de los conjugados del anticuerpo de la invención sobre el volumen tumoral medio. Modelo Anti-FcRH5-SPDB-DM4 en OPM-2-FcRH5.
La Figura 30B muestra el efecto de los conjugados del anticuerpo de . la invención sobre el peso corporal medio. Modelo Anti-FcRH5-SPDB-DM4 en 0PM-2-FcRH5. Estudio de intervalos de dosis de anti-FcRH5 (10A8) -spdb-dm4 vs . un xenoinjerto OPM2-FcR5 de Mieloma Múltiple en Ratones Scid CB17. Protocolo #08-1184 D.
La Figura 31 muestra un análisis de dosis respuesta del compuesto único en OMP-2.FcRH5.
La Figura 32 muestra un análisis de dosis respuesta del compuesto único en OMP-2.FcRH5.
La Figura 33 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 58) de un ADNc de PRO820, en donde SEC ID NO: 58 es un clon denominado en la presente como "ADN56041-1416" (también denominado aquí como "FcRH5") . La secuencia de nucleótidos codifica para FcRH5 los codones de inicio y detención se muestran en negrita y subrayados. (Ver Goddard y otros. Patente U.S. No. 7491529) .
La Figura 34 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 59) derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 59 que se muestra en la Figura 33. (Ver Goddard y otros. Patente U.S. No. 7491529) .
Las Figuras 35A-35B muestran una secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 602) de un ADNc de PR052387, en donde la SEC ID NO: 60 es un clon denominado en la presente como "ADN257845" (también denominado aquí como "FcRH5" ) . La secuencia de nucleótidos codifica para FcRH5 los codones de inicio y detención se muestran en negrita y subrayados (Ver Chang y otros. Solicitud de patente publicada U.S. No. 20060251662) .
La Figura 36 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 61) derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 61 que se muestra en la Figura 36 (Ver Chang y otros. Solicitud de patente publicada U.S. No. 20060251662).
La Figura 37 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO:62) de un ADNc de PR0314992, en donde la SEC ID NO: 62 es un clon denominado en la presente como "ADN676969" de mono cynomologous (también denominado en la presente como "cyno FcRH5" ) .
La Figura 38 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 63) derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 63 que se muestra en la Figura 37.
La Figura 39 muestra el efecto de una administración combinada de un anticuerpo inmunoconjugado y al menos un agente quimioterapéutico sobre el volumen tumoral medio en ratones .
La Figura 40 muestra el porcentaje de cambio de peso corporal para los animales en cada grupo de dosis.
La Figura 41 muestra el efecto de una administración combinada de un anticuerpo inmunoconjugado y al menos un agente quimioterapéutico sobre el volumen tumoral medio en ratones .
La Figura 42 muestra el porcentaje de cambio de peso corporal para los animales en cada grupo de dosis.
La Figura 43 muestra el efecto de una administración combinada de un anticuerpo inmunoconjugado y al menos un agente quimioterapéutico sobre el volumen tumoral medio en ratones .
La Figura 44 muestra el porcentaje de cambio de peso corporal para los animales en cada grupo de dosis.
La Figura 45 muestra el efecto de los conjugados , del anticuerpo de la invención sobre el volumen tumoral medio La Figura 46 muestra el efecto de los conjugados del anticuerpo de la invención sobre el peso corporal medio.
La Figura 47 muestra el efecto de los conjugados del anticuerpo de la invención sobre el volumen tumoral medio La Figura 48 muestra el efecto de los conjugados del anticuerpo de la invención sobre el peso corporal medio.
Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona métodos, composiciones, kits y artículos de manufactura para identificar composiciones útiles para el tratamiento de tumor hematopoyético en mamíferos y un método de uso de estas composiciones para lo mismo.
En la presente se proporcionan detalles de estos métodos, composiciones, kits y artículos de manufactura.
I . Técnicas generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas de biología molecular convencionales (que incluye, técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican por completo en la bibliografía, tales como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook y otros., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed. , 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel y otros., eds . , 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" , (Mullís y otros., ed. , 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas y otros., 2001).
II . Definiciones Para los fines de interpretar esta especificación, se aplicarán las siguientes definiciones y cuando fuera apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de cualquier definición expuesta discrepe con algún documento incorporado en la presente por referencia, regirá la definición que se expone a continuación.
Un "marcador de superficie de célula B" o "antígeno de superficie de célula B" en la presente es un antígeno expresado en la superficie de una célula B que puede ser localizado selectivamente con un antagonista que se une a éste, que incluye pero sin limitación, anticuerpos para un antígeno de superficie de células B o una forma soluble de un antígeno de superficie de células B capaz de antagonizar la unión de un ligando al antígeno de la célula B natural. Los ejemplos de marcadores de superficie de células B incluyen los marcadores de superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86 (para descripciones, ver The Leukocyte Antigen Facts Book, 2a Edición. 1997, ed. Barclay y otros. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York) . Otros marcadores de superficie de células B incluyen RP105, FcRH2 , células B CR2 , CCR6 , P2X5 , HLA-DOB, CXCR5 , FCER2 , BR3 , BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHl, IRTA2, AT D578, FcRH3 , IRTA1, FcRH6, BCMA, y 239287. El marcador de superficie de células B de particular interés se expresa con preferencia en las células B en comparación con otros tejidos de células no B de un mamífero y se puede expresar en las células B precursoras y las células B.
El término "FcRH5", como se usa en la presente, se refiere a cualquier FcRH5 nativo de cualquier fuente de vertebrados, que incluye mamíferos tales como primates (por ejemplo seres humanos, mono cynomologus (cyno) ) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , a menos que se indique de otro modo. FcRH5 humano también se denomina en la presente como "FcRH518" o "PR085143" (SEC ID NO : 2) y está codificado por la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 1) también denominada en la presente como "ADN340394" . FcRH5 de cynomologus también se denomina en la presente como "FcRH5 de cyno" . El término "FcRH5" abarca FcRH5 no procesado, "de longitud completa" así como cualquier forma de FcRH5 que proviene del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes naturales de FcRH5 , por ejemplo, variantes de empalme, variantes alélicas e isoformas. Los polipéptidos de FcRH5 descritos en la presente se pueden aislar de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente o prepararse por métodos recombinantes o sintéticos. Una "polipéptido de FcRH5 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido de FcRH5 derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos de FcRH5 de secuencia nativa se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido de FcRH5 de secuencia nativa" específicamente abarca formas truncadas o secretadas naturales del polipéptido de FcRH5 específico (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular) , formas de variantes naturales {por ejemplo, formas empalmadas alternativas) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos de FcRH5 de secuencia nativa que se describen en la presente son polipéptidos de secuencia nativa maduros o de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa que se muestran en las figuras anexas . Los codones de inicio y detención (si se indican) se muestran en negrita y subrayados en las figuras. Los residuos de ácido nucleico indicados como "N" en las figuras anexas son cualquier residuo de ácido nucleico. Sin embargo, si bien los polipéptidos de FcRH5 descritos en las figuras anexas se muestran iniciando con los residuos de metionina designados en la presente como la posición de aminoácido 1 en las figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina ubicados dirección 5' o dirección 3' de la posición de aminoácido 1 en las figuras se puede emplear como residuo de aminoácido inicial para los polipéptidos de FcRH5. "mulOA8" o "MA10A8" o "anticuerpo FcRH5 (10A8) murino" o "anticuerpo anti-FcRH5 ( 10A8 ) murino" se usa en la presente para referirse específicamente al anticuerpo anti-FcRH5 monoclonal murino en donde el anticuerpo anti-FcRH5 monoclonal murino comprende el dominio variable de la cadena ligera de la SEC ID NO: 18 (Figura 9) y el dominio variable de la cadena pesada de la SEC ID NO: 20 (Figura 10) . El anticuerpo anti-FcRH5 monoclonal murino se puede adquirir en fuentes comerciales. "chlOA8" o "chMAFcRH5 (10A8)" o "chFcRH5 (10A8)" o "anticuerpo MAFcRH5 (10A8) quimérico" se usa en la presente para referirse específicamente al anticuerpo FcRH5 antihumano quimérico en donde el anticuerpo anti-FcRH5 quimérico comprende la cadena ligera de la SEC ID NO: 15 (Figura 6) . La cadena ligera de la SEC ID NO: 15 además comprende un dominio variable que se muestra en la Figura 9 y el dominio constante de la cadena ligera de IgGl humana. El anticuerpo anti-FcRH5 (10A8) quimérico que además comprende la cadena pesada de la SEC ID NO: 17 (Figura 8) . La cadena pesada de la SEC ID NO: 17 que además comprende un dominio variable que se muestra en la Figura 10 y el dominio constante de la cadena pesada de IgGl humana . "ch7Dll" o "chMAFcRH5 (7D11)" o "chFcRH5 (7D11)" o "anticuerpo MAFcRH5 (7D11) quimérico" se usa en la presente para referirse específicamente al anticuerpo FcRH5 antihumano quimérico en donde el anticuerpo anti-FcRH5 quimérico comprende la cadena ligera de la SEC ID NO: 11 (Figura 2) , que comprende el dominio constante de la cadena ligera de la IgGl humana. El anticuerpo anti-FcRH5 (7D11) quimérico que además comprende la cadena pesada de la SEC ID NO: 13 (Figura 4) , que comprende el dominio constante de la cadena pesada de IgGl humana . "anti-cynoFcRH5" o "anti-FcRH5 de cyno" se usa en la presente para referirse a los anticuerpos que une al FcRH5 de cyno. "injerto de 10A8" o "anticuerpo 'humanizado' injertado con 10A8" o "injerto hulOA8" se usa en la presente para referirse específicamente al injerto generado por el injerto de las regiones hipervariables del anticuerpo anti-FcRH5 10A8 murino (mulOA8) en la VL kappa I de consenso humana aceptora (huKI) y VH de consenso subgrupo III humano (huIII) (Cárter y otros., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992)) (Ver Ejemplo 1 y Figura 9 (SEC ID NO: 19) y 10 (SEC ID NO: 21)). "hulOA8" o "hulOA8 vi" se usa en la presente para referirse específicamente al anticuerpo 10A8 humanizado.
Una "modificación" de un residuo de aminoácido/posición, como se usa en la presente, se refiere a un cambio de una secuencia de aminoácidos primaria en comparación con una secuencia de aminoácidos inicial, en donde el cambio resulta de una alteración de secuencia que involucra el residuo de aminoácido/posiciones. Por ejemplo, las modificaciones típicas incluyen la sustitución del residuo (o en la posición) con otro aminoácido (por ejemplo, una sustitución conservadora o no conservadora) , inserción de uno o más (generalmente menos de 5 ó 3) aminoácidos adyacentes a el residuo/posición, y la eliminación del residuo/posición. Una "sustitución de aminoácidos", o variación de éste, se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada (inicial) con un residuo de aminoácido diferente. Generalmente y con preferencia, la modificación origina la alteración en al menos una actividad físicobioquímica de la variante del polipéptido en comparación con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos inicial (o "tipo silvestre"). Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, una actividad físicobioquímica que se altera puede ser afinidad de unión, capacidad de unión y/o efecto de unión sobre una molécula objetivo.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales anti-FcRH5 únicos (que incluye agonista, antagonista, anticuerpos neutralizantes, longitud completa o anticuerpos monoclonales intactos) , composiciones de anticuerpo ánti-FcRH5 con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales , anticuerpos multivalentes , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos siempre que estos exhiben la actividad biológica deseada) , formado a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos anti-FcRH5 de cadena única, y fragmentos de anticuerpos anti-FcRH5 (ver más adelante) que incluye los fragmentos de Fab, Fab' , F(ab' )2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos de dominio único (sdAbs) , siempre que estos exhiban la actividad biológica o inmunológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa en forma indistinta con el anticuerpo en la presente. Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o de afinidad madura.
El término "anticuerpo anti-FcRH5" o "un anticuerpo que se une al FcRH5" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a FcRH5 con afinidad suficiente de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a FcRH5. Con preferencia, el grado de unión de un anticuerpo anti-FcRH5 a una no proteína de FcRH5 no relacionada es menos de aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a FcRH5 medido, por ejemplo, por un radioinmunoensayo (RIA) . En ciertas modalidades, un anticuerpo que se une al FcRH5 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 µ?, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, o < 0.1 nM. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-FcRH5 se une a un epítopo de FcRH5 que está conservado entre FcRH5 de especies diferentes.
Un "anticuerpo aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos terapéuticos del anticuerpo y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso del anticuerpo determinado por el método de Lowry y la máxima preferencia en más del 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencias de aminoácidos N-terminales o internos por el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul Comassie o, con preferencia, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en las células recombinantes ya que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Comúnmente, sin embargo el anticuerpo aislado se preparará por lo menos por un paso de purificación.
La unidad del anticuerpo de 4 cadenas básicas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) . (un anticuerpo IgM consiste de 5 de la unidad heterotetramérica básica junto el polipéptido adicional llamado cadena J, y en consecuencia contiene 10 sitios de unión al antígeno, mientras que los anticuerpos de IgA secretados se pueden polimerizar para formar ensamblajes polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades de 4 cadenas básicas junto con la cadena J) . En el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas básicas es generalmente de aproximadamente 150,000 dalton. Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se unen entre sí por uno o más enlaces disulfuro que dependen del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracatenarios separados por espacios regulares. Cada cadena H tiene en el N-terminal, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas y ? y cuatro dominios CH para los isotipos p e e. Cada cadena L tiene en el N-terminal, un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL se alinea con el VH y el CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CHi) - Se consideran que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El apareamiento de VH y VL juntos forma un sitio de unión antígeno único. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8th edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y Capítulo 6.
La cadena L de algunas especies de vertebrados se puede asignar a uno de dos tipos evidentemente distintos, llamados kappa y lambda, sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. De acuerdo con la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las clases ? y a también se dividieron en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia y función de CH, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgGl , IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl , e IgA2.
La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede denominar como "VH" . El dominio variable de la cadena ligera se puede denominar como "VL" . Estos dominios son en general las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión al antígeno.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren mucho en la secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la unión del antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. No obstante, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en extensiones relativamente constantes llamadas regiones estructurales (FR) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema llamada "regiones hipervariables" que son de 9-12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan ampliamente una configuración de hoja ß, conectadas por tres regiones HVR que forman bucles conectores y, en algunos casos, forman parte de la misma estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas muy próximas a las regiones FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat y otros . , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no intervienen directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .
Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión al antígeno así como un CL y al menos los dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de la secuencia nativa humana) o sus variantes de secuencia de aminoácidos. Con preferencia, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.
Un "anticuerpo desnudo" para los fines de la presente es un anticuerpo que no está conjugado con un resto o radiomarca citotóxica.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, con preferencia que comprende su región de unión al antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab ' , F(ab')2; y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver patente U.S. No. 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata y otros., Protein Eng. 8(10): 1057-1062
[1995] ) ; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados de los fragmentos de anticuerpo. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo intacto y de este modo retiene la capacidad de unirse al antígeno .
La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" y un fragmento residual "Fe" , una denominación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en la cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (VH) , y el primer dominio constante de una cadena pesada (CHi) . Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión del antígeno, es decir, tiene un solo sitio de unión al antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un fragmento F(ab')2 grande único que corresponde aproximadamente a los fragmentos Fab unidos por dos disulfuros que tienen actividad de unión al antígeno divalente y es aún capaz de reticularse con el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en que tienen pocos residuos adicionales en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente de Fab1 en la que los residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos del anticuerpo F(ab' )2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos del anticuerpo también son conocidos.
El fragmento de Fe comprende las porciones carboxi-terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos están determinadas por las secuencias de la región Fe, la región también es la parte reconocida por los receptores Fe (FcR) hallados en ciertos tipos de las células.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento del antígeno y de unión completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de la región variable de una cadena pesada y una cadena ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie de Fv de cadena única (scFv) , un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera se pueden unir covalentemente por un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie Fv de cadena doble. A partir del plegamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (3 bucles de cada cadena H y L) que aportan los residuos de aminoácidos para la unión al antígeno y confieren la especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unir el antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.
"Fv de cadena simple" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una cadena de polipéptido única. Con preferencia, el polipéptido de sFv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Anticuerpos, vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
El término "diacuerpos" se refiere a los fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno, estos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena del polipéptido (VH-VL) . El pequeño fragmento se prepara por la construcción de fragmentos Fv (ver párrafo precedente) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL de modo que se obtiene el apareamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, lo que origina un fragmento a bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecífieos . Los diacuerpos biespecífieos son heterodímeros de dos fragmentos Fv "cruzados" en los que los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en cadenas de polipéptidos diferentes. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en, por ejemplo, EP 404,097; O 93/11161; Hudson y otros., Wat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Los tricuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson y otros., Nat. Med. 9:129-134 (2003) .
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, anticuerpos individuales que comprenden poblaciones idénticas excepto en las posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, se dirigen contra un sitio antigénico único. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que ellos se pueden sintetizar por el cultivo de hibridoma sin contaminarse con otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una oblación de anticuerpos sustancialmente homogéneos, no se interpreta como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden preparar por la metodología del hibridoma descrito primero por Kohler y otros., Nature , 256:495 (1975), o se pueden obtener usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, eucariotas, animales o vegetales (ver, por ejemplo, patente U.S. No. 4,816,567) . Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpo del fago usando las técnicas descritas, por ejemplo en Clackson y otros., Nature , 352:624-628 (1991) y Marks y otros., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991) .
Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa con las correspondientes secuencias de los anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena (s) es idéntica u homologa con las correspondientes secuencias de los anticuerpos derivados de otra especie particular o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de los anticuerpos, siempre que estos muestren la actividad biológica deseada (ver Patente U.S. No. 4,816,567; y Morrison y otros., Proc . Nati. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)) . Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión al antígeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo mono del viejo mundo, simio, etc.) , y la secuencia de la región constante humana .
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humana (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una región hipervariable del receptor están reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especies no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobuli a humana están reemplazados con los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se pueden realizar para retinar adicionalmente desempeño del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en que el total o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los una inmunoglobulina no humana, y total o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobuli a (Fe) , normalmente de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones y otros., Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann y otros., Nature 332:323-329 (1988) ; y Presta, Curr. Op. Estruct . Biol. 2:593-596 (1992) . Ver también los siguientes artículos de revisión y referencias allí citadas: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol . , 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transacciones, 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. , 5:428-433 (1994) .
"TÍO" cuando se usa en la presente se refiere a un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína mientras "hu" cuando se usa en la presente se refiere a un anticuerpo humanizado.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde al de un anticuerpo producido por un ser humano y/o ha sido obtenido usando cualquiera de las técnicas para obtener anticuerpos humanos como se describe en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando varias técnicas conocidas en la materia, que incluyen bibliotecas de despliegue de fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991) ; Marks y otros., J. Mol. Biol., 222:581 (1991) . También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos que se describen en Colé y otros., Monoclonal Anticuerpos y Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ; Boerner y otros., J.
Im unol., 147(1) :86-95 (1991). Ver también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol . , 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos se pueden preparar por la administración del antígeno a un animal transgénico que sido modificado para producir los anticuerpos como respuesta al estímulo antigénico, pero cuyos locus han sido desarmados, por ejemplo, xenoratones inmunizados (ver, por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 6,075,181 y 6,150,584 respecto de la tecnología XENOMOUSE™). Ver también, por ejemplo, Li y otros., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 103:3557-3562 (2006) respecto de anticuerpos humanos generados por medio de una tecnología de hibridoma de células B.
El término "región hipervariable" , "HVR" , o "HV" , cuando se usa en la presente se refieren a las regiones de un dominio variable del anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente . En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en la VH (Hl, H2 , H3) y tres de la VL (Ll, L2 , L3) . Numerosos diseños de HVR son de utilidad y están abarcadas en la presente. Las regiones determinantes de complementariedad de Kabat (CDR) se basan en la variabilidad de secuencia y son las más comúnmente usadas (Kabat y otros., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD . (1991)). Chothia se refiere en cambio a la ubicación los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . El fin del bucle CDR-H1 de Chothia cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 de acuerdo con la longitud del bucle (esto es porque el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B está presente, los extremos del bucle en 32; si solo 35A está presente, los extremos del bucle a 33; si ambos 35A y 35B están presentes, los extremos del bucle en 34) . Las regiones hipervariables AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan en el programa de computación del modelo de anticuerpos Oxford Molecular' s AbM. Las regiones hipervariables "contacto" se basan en el análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se indican a continuación Bucle Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32. , 34 H30-H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101 Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables extendidas siguientes: 24-36 ó 24-34 (Ll) , 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL y 26-35B (Hl) , 50-65, 47-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en la VH. Los residuos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat y otros., supra, para cada una de estas definiciones.
"Estructura" o residuos de "FR" son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable definidos en la presente.
La expresión "numeración del residuo del dominio variable tal como en Kabat" o "numeración de la posición de aminoácido tal como en Kabat", y sus variaciones se refieren al sistema de numeración usadas para el dominio variable de cadena pesadas o dominio variable de cadena ligeras de la compilación de anticuerpos en Kabat y otros., supra., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD . (1991) . Mediante este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener pocos o adicionales aminoácidos correspondientes a un acortamiento, o inserción de una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir un inserto de aminoácido único (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo residuos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la cadena pesada de FR. La numeración de Kabat de residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineamiento en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar" .
El sistema de numeración Kabat generalmente se usa cuando se denomina a un residuo del dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat y otros., Sequences of Immunological Interest . 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . El "sistema de numeración de EU" o "índice de EU" se usa generalmente cuando se refiere a un residuo de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU informado en Kabat y otros., supra) . El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU de IgGl humana. A menos que se indique de otro modo en la presente, las referencias a los números de residuos de los dominios variables del anticuerpo significa la numeración de residuos por el sistema de numeración de Kabat. A menos que se indique de otro modo en la presente, las referencias a los números de residuos de los dominios constantes del anticuerpo significa la numeración de residuos por el sistema de numeración EU (por ejemplo, ver Solicitud de patente provisional estadounidense No. 60/640,323, describe la numeración de EU) .
Un anticuerpo de "afinidad madura" es uno con una o más alteraciones en una o más de sus HVR que producen una mejora de la afinidad del anticuerpo para el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee estas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madura preferidos tienen afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos de afinidad madura se producen usando ciertos procedimientos conocidos en la técnica. arks y otros., Bio/'Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración de afinidad por la transposición del dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de la HVR y/o los residuos estructurales se describe en: Barbas y otros. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier y otros. Gene 169:147-155 (1995); Yelton y otros. J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson y otros., J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins y otros, J. Mol. Biol . 226:889-896 (1992).
Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben en forma sustancial o completa la actividad biológica del antígeno .
Un "anticuerpo agonista" como se usa en la presente, es un anticuerpo que simula en forma total o parcial al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés .
Un "anticuerpo dependiente de la especie", por ejemplo, un anticuerpo de IgE anti-humana de mamífero, es un anticuerpo que tiene mayor afinidad de unión por un antígeno de una primera especie de mamífero que la que tiene por un homólogo de ese antígeno proveniente de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie "se une específicamente" a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de constante de afinidad (¾) de no más de aproximadamente 1 x 10~7 , con preferencia no más de aproximadamente 1 x 10"8 M y con máxima preferencia no más de aproximadamente 1 x 10"9 M) , pero tiene una afinidad de unión por un homólogo del antígeno proveniente de una segunda especie mamífera no humana que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que se afinidad de unión por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser cualquier de los diversos tipos de anticuerpos definidos anteriormente, pero con preferencia es un anticuerpo humanizado o humano.
"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno) . A menos que se indique de otro modo, como se usa en la presente, la "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) .La afinidad de una molécula X por su pareja Y en general se puede representar con una constante de disociación (Kd) . La afinidad se puede medir por métodos comunes en la técnica, que incluyen los que se describen en la presente. Anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen lentamente al antígeno y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen rápidamente al antígeno y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de métodos de medir la afinidad de unión son conocidos en la técnica, alguno de cuales se pueden usar para los fines de la presente invención. Las modalidades ilustrativas y específicas se describen a continuación. "0 mejor" cuando se usa en la presente se refiere a la afinidad de unión se refiere a la unión más fuerte entre una molécula y su compañero de unión. "0 mejor" cuando se usa en la presente se refiere a la afinidad de unión se refiere a la unión más fuerte, representada por un valor de Kd numérico menor. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una afinidad por un antígeno de ",6 nM o mejor", la afinidad del anticuerpo por el antígeno es <,6 nM, es decir ,59 nM, ,58 nM, ,57 nM etc., o cualquier valor menor de ,6 nM.
En una modalidad, la "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención se mide por un ensayo de unión al antígeno radiomarcado (RIA) se realiza con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno se describe con el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en solución de los Fab para el antígeno se mide al equilibrar el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, luego se captura el antígeno unido en una placa cubierta de anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen y otros., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas multicavidad (Dyner) se recubren toda la noche con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9,6), y posteriormente se bloquea con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , 100 pM o 26 pM de antígeno [125I] se mezclan con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, compatible con la evaluación del anticuerpo anti-FcRH5, Fab-12, en Presta y otros., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés posteriormente se incuba toda la noche, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Luego, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Luego la solución se elimina la solución y la placa se lava ocho veces con 0.1% de TWEEN-20™ en PBS . Cuando las placas se han secado, se agregan 150 µ?/cavidad de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma (Packard) durante diez minutos. Se seleccionan las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual a 20% de la unión máxima para usar en los ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra modalidad, la Kd o el valor de Kd se mide por el uso de ensayos de resonancia del plasmón superficial usando un BIAcore™-2000 o a BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips de antígeno inmovilizado de CM5 a -10 unidades de respuesta (RU) . En breves palabras, los chips del biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-iV- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8 , a 5 yg/ml (-0.2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones de cinética, se inyectan dos diluciones seriadas dos veces de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con 0.05% de tensioactivo T EEN-20™ (PBST) a 25°C con una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las tasas de asociación (kactivado) y disociación (kdeSactivado) se calculan usando un modelo de Langmuir simple uno a uno (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) con ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación kdesactivado/kactivado- Ver, por ejemplo, Chen y otros., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la tasa de asociación excede 106 M"1 s"1 por el ensayo de resonancia del plasmón superficial anterior, entonces la tasa de asociación se puede determinar por el uso de una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nra, 16 nm de paso de banda) a 25°C de 20 nM de anticuerpo anti -antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medido en espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja agitada.
Una "tasa de asociación" "velocidad de asociación" , "tasa de asociación" o "kactivado" de acuerdo con esta invención también se puede determinar con la misma técnica de resonancia del plasmón superficial que se describió anteriormente usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) como se describió anteriormente .
La frase "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual" como se usa en la presente, indica un grado suficientemente alto de semejanza entre dos valores numéricos (generalmente, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador), de modo que los expertos en la técnica consideren que la diferencia entre los dos valores es de poca o ninguna significación biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores de Kd) . La diferencia entre dos de estos valores es, por ejemplo, menor de aproximadamente 50%, menor de aproximadamente 40%, menor de aproximadamente 30%, menor de aproximadamente 20%, y con preferencia menos de aproximadamente 10% en función de un valor de referencia/comparador.
La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en la presente, indica un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparadora) , de modo que los expertos en la técnica consideren que la diferencia entre los dos valores tiene significación estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores de Kd, respuesta a HAMA) . La diferencia entre dos de estos valores es, por ejemplo, mayor de aproximadamente 10%, mayor de aproximadamente 20%, mayor de aproximadamente 30%, mayor de aproximadamente 40%, y con preferencia mayor de aproximadamente 50% en función de un valor de la molécula de referencia/comparador .
Un "antígeno" es un antígeno predeterminado al que se puede unir un anticuerpo en forma selectiva. El antígeno objetivo puede ser polipéptido, carbohidrato, ácido nucleico, lípido, hapteno u otro compuesto natural o sintético. Con preferencia, el antígeno objetivo es un polipéptido.
Una "estructura humana aceptora" para los fines de la presente es una estructura que comprende la secuencia de aminoácidos de una estructura de VL o VH derivada de una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana. Una estructura humana aceptora "derivada de" una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana puede comprender la misma secuencia de ' aminoácidos de esta, o puede contener cambios de la secuencia de aminoácidos preexistente. Cuando los cambios de aminoácidos preexistentes están presentes, con preferencia no más de 5 y con preferencia 4 o menos o 3 o menos, cambios de aminoácidos preexistentes están presentes. Cuando están presentes los cambios de aminoácidos preexistentes en una VH, con preferencia estos cambios se producen en solo tres, dos o una de las posiciones de 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácidos de las posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una modalidad, la estructura humana aceptora VL es idéntica en secuencia a la estructura de la secuencia de inmunoglobulina humana aceptora o secuencia de la estructura de consenso humana.
Una "estructura de consenso humana" es una estructura que representa los residuos de aminoácidos naturales más comunes en una selección de secuencias estructurales VL o VH de l inmunoglobulina humana. En general, la selección las secuencias estructurales VL o VH de la inmunoglobulina humana es de un subgrupo de las secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de las secuencias es un subgrupo de Kabat y otros., supra. En una modalidad, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I de Kabat y otros., supra. En una modalidad, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III de Kabat y otros.
Un "estructura de consenso de VH subgrupo III" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos de la región variable pesada del subgrupo III de Kabat y otros. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la estructura de consenso VH del subgrupo III comprende al menos una porción o el total de cada una de las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEC ID NO: 49) -Hl-WVRQAPGKGLEWV (SEC ID NO: 50)-H2- RF ISRDNSKNTLILQMNSLRAEDTAVYYC (SEC ID NO: 51 ) -H3-WGQGTLVTVSS (SEC ID NO: 52) .
Una "estructura de consenso de VL del subgrupo I" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos de la región variable ligera kappa subgrupo I de Kabat y otros. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la estructura de consenso VH del subgrupo I comprende al menos una porción o el total de cada una de las siguientes secuencias: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEC ID NO: 45) -Ll-WYQQKPGKAPKLLIY (SEC ID NO: 46)-L2- GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEC ID NO: 47)-L3-FGQGTKVEIKR (SEC ID NO : 48) .
Una "estructura humana no modificada" es una estructura humana que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la estructura humana aceptora, por ejemplo que carece de la sustitución de aminoácido humano a no humano en la estructura humana aceptora.
Una "región hipervariable alterada" para los fines de la presente es una región hipervariable que comprende una o más (por ejemplo uno a aproximadamente 16) sustitución de aminoácidos (s) en ella.
Una "región hipervariable no modificada" para los fines de la presente es una región hipervariable que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo no humano de la que derivó, es decir, uno que carece de una o más sustituciones de aminoácido en ella.
Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo un objetivo antigénico del polipéptido asociado al tumor, es uno que se une al antígeno con afinidad suficiente de modo que el anticuerpo es útil como agente terapéutico para dirigirse a una célula o tejido que exprese el antígeno, y no reacciona significativamente en forma cruzada con otras proteínas. En estas modalidades, el grado de unión del anticuerpo a una proteína "no objetivo" será de menos de aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a su proteína objetivo particular determinado por el análisis de separación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA, por sus siglas en inglés) . Con respecto a la unión de un anticuerpo a una molécula objetivo, el término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo de un polipéptido particular significa la unión es apreciablemente diferente de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, por la determinación de la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar por competición con una molécula control que es similar al objetivo, por ejemplo, un exceso de objetivo no marcado. En este caso, la unión específica se indica si la unión del objetivo marcado a una sonda es inhibida competitivamente por el exceso de objetivo no marcado. El término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específica para" un polipéptido particular o un epítopo en un objetivo de polipéptido particular como se usa en la presente puede ser exhibida, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kd para el objetivo de al menos aproximadamente io-4 M, alternativamente al menos aproximadamente lO"5 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"6 M, alternativamente al menos aproximadamente lO"7 M, alternativamente al menos aproximadamente 10'8 M, alternativamente al menos aproximadamente lO"9 M, alternativamente al menos aproximadamente lO"10 M, alternativamente al menos aproximadamente lO"11 M, alternativamente al menos aproximadamente 1012 M, o mayor . En una modalidad, el término "unión específica" se refiere a la unión en que una molécula que se une a un polipéptido particular o epítopo de un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido .
Un anticuerpo que "inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan un polipéptido de FcRH5" o un anticuerpo "inhibidor del crecimiento" es uno que produce una inhibición del crecimiento medible de las células cancerígenas que expresan o sobreexpresan el polipéptido de FcRH5 apropiado. El polipéptido de FcRH5 puede ser un polipéptido de transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerígena o puede ser un polipéptido que es producido y secretado por una célula cancerígena. Los anticuerpos anti-FcRH5 inhibidores del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de las células tumorales que expresan FcRH5 en más de 20%, con preferencia de aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, y aun con más preferencia, en más de 50% (por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) en comparación con el control apropiado, el control normalmente es las células tumorales no tratadas con el anticuerpo analizado. En una modalidad, la inhibición del crecimiento se puede medir a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.1 a 30 g/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en un cultivo celular, cuando la inhibición del crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo se puede determinar de varios modos tal como se describe en la siguiente sección de Ejemplos experimentales. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-FcRH5 a aproximadamente 1 vg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal produce la reducción del tamaño tumoral o proliferación de las células tumorales dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, con preferencia dentro de aproximadamente 5 a 30 días.
Un anticuerpo que "induce apoptosis" es uno que induce muerte celular programada determinada por la unión de anexina V, fragmentación del ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular, y/o formación de vesículas membranosas (llamados cuerpos apoptóticos) . La célula usualmente es una que sobreexpresa un polipéptido de FcRH5. Con preferencia la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula hematopoyética , tales como una célula B, célula T, basófilo, eosinófilo, neutrófilo, monocito, plaqueta o eritrocito. Varios métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) se puede medir por la unión de anexina, la fragmentación de ADN se puede evaluar mediante la fragmentación en escalera del ADN; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación del ADN se puede evaluar por cualquier aumento de las células hipodiploides . Con preferencia, el anticuerpo que induce apoptosis es que uno que produce aproximadamente 2 a 50 veces, con preferencia aproximadamente 5 a 50 veces, y con máxima preferencia aproximadamente 10 a 50 veces, la inducción de unión a anexina con respecto a las células no tratadas en un ensayo de unión a anexina .
Un anticuerpo que "induce muerte celular" es uno que produce que una célula viable se convierte en inviable . La célula es una que expresa o sobreexpresa un polipéptido de FcRH5 y es de tipo de célula que expresa o sobreexpresa específ camente un polipéptido de FcRH5. La célula pueden ser células cancerígenas o normales del tipo celular particular. El polipéptido de FcRH5 puede ser un polipéptido de transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerígena o puede ser un polipéptido que es producido o secretado por una célula cancerígena. La célula puede ser una célula cancerígena, por ejemplo, una célula B o célula T. La muerte celular in vi ro se puede determinar en la ausencia de complemento y células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad mediada por complemento (CDC) . En consecuencia, el ensayo para muerte celular se puede realizar usando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir muerte celular, se puede evaluar la pérdida de la integridad de membrana evaluada por la captación de yoduro de propidio (PI) , azul de tripano (ver Moore y otros. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) o 7AAD respecto de las células no tratadas. Los anticuerpos inductores de muerte celular preferidos son los que inducen la captación de PI en el ensayo de captación de PI en las células BT474.
Las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de la secuencia nativa o región Fe de la variante de la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de las funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad mediada por complemento; unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B) ; y activación de células B.
El término "región Fe" de la presente se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de la inmunoglobulina, que incluye regiones Fe de la secuencia nativa y regiones Fe de la variante. Si bien los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podría variar, la región Fe de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana usualmente definida se extiende desde un residuo de aminoácido de la posición Cys226, o desde Pro230, a su extremo carboxilo terminal. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fe se puede eliminar, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o por manipulación genética recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpo con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 eliminados, y poblaciones de anticuerpo que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin residuos K447.
Una "región Fe funcional" posee una "función efectora" de una región Fe de la secuencia nativa. Los ejemplos de "funciones efectoras" incluyen la unión a Clq CDC; unión al receptor Fe; ADCC; fagocitosis; regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR) , etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y se puede evaluar usando varios ensayos que se describen por ejemplo, en las definiciones de la presente.
Una "región Fe de la secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe hallada en la naturaleza. Las regiones Fe de la secuencia nativa incluyen una región FC de la secuencia nativa de IgGl humana (alotipos no A y A) ; región FC de la secuencia nativa de IgG2 humana; región FC de la secuencia nativa de IgG3 y región FC de la secuencia nativa de IgG4 , así como sus variantes naturales.
Una "variante de la región Fe" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la una región Fe de la secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, con preferencia una o más sustituciones de aminoácidos. Con preferencia, la variante de la región Fe tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fe de la secuencia nativa o a la región Fe de un polipéptido original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y con preferencia de aproximadamente uno a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fe de la secuencia nativa o en la región Fe del presente polipéptido. La variante de la región Fe de la presente con preferencia poseerá al menos aproximadamente 80% de homología con una región Fe de la secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido original, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 90% de homología con ella, con más preferencia al menos aproximadamente 95% de homología con ella.
"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida al receptor de las Fe (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula objetivo portadora de antígeno y posteriormente destruyan la célula objetivo con las citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son necesarios para destruir de la célula objetivo por este mecanismo. Las principales células para mediar la ADCC, las células NK expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI , FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se sintetiza en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev . Immunol . 9:457-92 (1991) . Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal como se describe en la patente estadounidense No. 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para los ensayos incluyen células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) y células citolíticas naturales (NK) . En forma alternativa o adicional, se puede evaluar la actividad de ADCC in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como en que se describe en Clynes y otros. (USA) 95:652-656 (1998).
"Receptor de Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une con un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcYRII y FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y alternativamente formas empalmadas de estos receptores. Los receptores FC7RII incluyen FcT IIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tiene secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor activador FcTRIIA contiene un motivo de activación basado en la tirosina del inmuno-receptor (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor inhibidor FcYRIIB contiene un motivo de inhibición basado en la tirosina del inmuno-receptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Ver revisión de M. en Daéron, Annu . Rev . Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu . Rev . Immunol . 9:457-492 (1991); Capel y otros., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas y otros., J . Lab . Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, que incluyen los que identifiquen en el futuro, estás comprendidos por el término "FcR" de la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y otros., J . Immunol . 117:587 (1976) y Kim y otros. , J . Immunol . 24 :249 (1994) ) .
La unión al FcRn humano in vivo y la vida media sérica de los polipéptidos que se unen con alta afinidad al FcRn humano, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transíectadas que expresan FcRn humana, o en primates en los que se administran los polipéptidos con una variante de la región Fe. WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con aumento o disminución de la unión a las FcR. Ver también, por ejemplo, Shields y otros. , J. Biol. Chem. 9 (2 ): 6591-6604 (2001).
"Células efectoras humanas" son los leucocitos que expresan una o más FcR y realizan funciones efectoras. Con preferencia, las células expresan al menos FcTRIII y realizan funciones efectoras de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células citolíticas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, se prefieren los PBMC y las células NK. . Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia del complemento. La activación de la vía del complemento clásico se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) para los anticuerpos (de la subclase apropiada), que se unen a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y otros., J. Immunol . Methods 202:163 (1996). Se describen variantes de polipéptidos con las secuencias de aminoácidos de la región Fe alteradas (polipéptidos con una variante de la región Fe) y aumento o disminución de la capacidad de unión de Clq, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 6,194,551 Bl y O 1999/51642. Ver también, por ejemplo, Idusogie y otros., J". Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
El término "anticuerpo que comprende región Fe" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fe. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fe se puede eliminar, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o por manipulación genética recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Por consiguiente, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región Fe de acuerdo con esta invención puede comprender un anticuerpo con K447, con todo el K447 eliminado o una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.
El "dominio extracelular" o "ECD" del polipéptido de FcRH5 se refiere a una forma del polipéptido de FcRH5 que está esencialmente libre de los dominios de transmembrana y citoplásmico . Comúnmente, un ECD del polipéptido de FcRH5 tendrá menos de 1% de los dominios de transmembrana y/o citoplásmico y con preferencia, tendrá menos de 0.5% de los dominios . Se entenderá que cualquiera de los dominios de transmembrana identificados por los polipéptidos de FcRH5 de la presente invención se identifica según los criterios empleados de rutina en la técnica para identificar el tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio de transmembrana pueden variar pero más probablemente no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada extremo del dominio inicialmente identificado en la presente. Opcionalmente , por lo tanto, un dominio extracelular de un polipép ido de FcRH5 puede contener de aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquier lado del límite del dominio de transmembrana/dominio extracelular identificado en los Ejemplos o especificación y los polipéptidos, con o sin el péptido señal asociado, y los ácidos nucleicos que los codifican, están contempladas por la presente invención.
La ubicación aproximada de los "péptidos señal" del polipéptido de FcRH5 descrito en la presente se puede mostrar en la presente especificación y/o las figuras anexas. Se advierte, sin embargo, que el límite C-terminal de un péptido señal puede variar, pero más probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier lado del límite C-terminal de un péptido señal identificado inicialmente en la presente, en donde el límite C-terminal del péptido señal se puede identificar según los criterios empleados de rutina en la técnica para identificar el tipo de elementos de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen y otros., Prot . Eng . 10:1-6 (1997) y von Heinje y otros., Nucí. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Más aún, también se reconoce que, en algunos casos, la escisión de una secuencia señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, lo que produce más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, en que el péptido señal se escinde dentro de no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado del límite C-terminal del péptido señal identificado en la presente, y los polinucleótidos que los codifican, están contempladas por la presente invención.
"Variante del polipéptido de FcRH5" significa un polipéptido de FcRH5 , con preferencia un polipéptido activo de FcRH5 , como se define en la presente que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de polipéptidos de FcRH5 que carece del péptido señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de FcRH5 , con o sin el péptido señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de longitud completa como se describe en la presente (tales como las codificadas por un ácido nucleico que representa solo una porción de la secuencia codificadora completa para un polipéptido de FcRH5 de longitud completa) . Tales variantes del polipéptido de FcRH5 incluyen, por ejemplo, polipéptidos de FcRH5 en donde se añaden, o suprimen uno o más residuos de aminoácidos en el N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Comúnmente, una variante del polipéptido de FcRH5 tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, con una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de polipéptidos de FcRH5 que carece del péptido señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de FcRH5 , con o sin el péptido señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de longitud completa como se describe en la presente. Comúnmente, Los polipéptidos de la variante de FcRH5 son al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud, o más. Opcionalmente, Los polipéptidos de la variante de FcRH5 tendrán no más de una sustitución conservadora de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa de los polipéptidos de FcRH5, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa de los polipéptidos de FcRH5.
Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de péptidos o polipéptidos, es decir, secuencias de polipéptidos de FcRH5 identificadas en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos de la secuencia de péptidos o polipéptidos específicos, es decir, secuencias de polipéptidos de FcRH5, después de alinear las secuencias e introducir la brechas, si es necesario, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede obtener de varias maneras que están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo, usando un programa de computación disponible al público tal como el programa de computación BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, que incluyen algunos algoritmos necesarios para obtener el alineamiento máximo respecto de la longitud completa de las secuencias comparadas. Para los fines de la presente, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la siguiente Tabla 1. El programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2 creado por Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente ha sido presentado con la documentación del usuario en U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde se registra bajo U.S. Copyright Registro No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar del código fuente provisto en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 se podría compilar para usar en un sistema operativo UNIX, con preferencia UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen para el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones en que se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de las secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que se puede expresar alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, en donde X es el número de residuos de aminoácidos clasificados como coincidencias exactas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 es este alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos de B . Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no equivaldrá al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A.
"Polinucleótido de la variante de FcRH5" o "secuencia de ácidos nucleicos de la variante de FcRH5" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de FcRH5, con preferencia un polipéptido activo de FcRH5 , como se define en la presente y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de FcRH5 , con o sin el péptido señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de longitud completa como se describe en la presente (tales como los codificados por un ácido nucleico que representa solo una porción de la secuencia codificadora completa para un polipéptido de FcRH5 de longitud completa) . Comúnmente, un polinucleótido de la variante de FcRH5 tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente, una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido de FcRH5 , con o sin la secuencia señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos de FcRH5 de longitud completa como se describe en la presente.
Las variantes no abarcan la secuencia de nucleótidos nativa.
Comúnmente, los polinucleótidos de la variante de FcRH5 son al menos aproximadamente de' 5 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470., 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 1160, 1170, 1180, 1190, 1200, 1210, 1220, 1230, 1240, 1250, 1260, 1270, 1280, 1290, o 1300 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos de referencia más o menos 10% de la longitud de referencia .
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a Secuencias de ácidos nucleicos que codifican FcRH5 identificadas en la presente se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos de la secuencias de ácidos nucleicos de FcRH5 de interés, después de alinear las secuencias e introducir la brechas, si es necesario, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se puede obtener de varias maneras que están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo, usando un programa de computación disponible al público tal como el programa de computación BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Para los fines de la presente, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se generan usando el programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la siguiente Tabla 1. El programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2 creado por Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente ha sido presentado con la documentación del usuario en U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde se registra bajo U.S. Copyright Registro No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar del código fuente provisto en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 se podría compilar para usar en un sistema operativo UNIX, con preferencia UNIX V4. OD digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen para el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de la secuencia de ácidos nucleicos, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos dada C a, con o frente a una secuencia de ácidos nucleicos D dada (que alternativamente se puede expresar como una secuencia de ácidos nucleicos C dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos para, con o frente a una secuencia de ácidos nucleicos D dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción W/Z, en donde X es el número nucleótidos clasificados como coincidencias exactas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 es este alineamiento del programa de C y D, y donde Z es el número total de residuos de nucleótidos de D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D a C. A menos que indique específicamente de lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos usados en la presente se obtienen como se describió en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa de computación ALIGN-2.
En otras modalidades, los polinucleótidos de la variante de FcRH5 son moléculas de ácido nucleicos que codifican un polipéptido de FcRH5 y que son capaces de hibridación, con preferencia en condiciones de hibridación y lavado rigurosas, a las secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido de FcRH5 de longitud completa como se describe en la presente. Los polipéptidos de la variante de FcRH5 pueden ser los que están codificados por un polinucleótido de la variante de FcRH5.
El término "región codificadora de longitud completa" cuando se usa en referencia a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de FcRH5 se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de FcRH5 de longitud completa de la invención (que a menudo se muestra entre los codones de inicio y detención, inclusive en estos, en las figuras anexas) . El término "región codificadora de longitud completa" cuando se usa en referencia a un ácido nucleico depositado en ATCC se refiere a la porción del ADNc que codifica el polipéptido de FcRH5 que se inserta en el vector depositado con el ATCC (que a menudo se muestra entre los codones de inicio y detención, inclusive en estos, en las figuras anexas (los codones de inicio y detención están en negrita y subrayados en las figuras) .
"Aislado" cuando se usa para describir los diversos polipéptidos de FcRH5 descritos en la presente, significa el polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente- de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrán interferir con investigación, diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por el uso de, por ejemplo, un secuenciador de copa rotatoria, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, azul de Coomassie o con preferencia tinción de plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido de FcRH5 no estará presente. Normalmente, sin embargo, se preparará el polipéptido aislado por al menos una etapa de purificación Un polipéptido de ácido nucleico que codifica FcRH5 u otro ácido nucleico que codifica el polipéptido "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está comúnmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislada es diferente de la forma o configuración en la que se halla en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido aisladas en consecuencia se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido específica ya que está existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislada incluye moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido contenidas en las células que expresan comúnmente el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de las células naturales La expresión "secuencias de control" se refiere las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unida operativamente en un organismo hospedero particular. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores .
El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o líder secretora está unida operativamente al ADN para un polipéptido si este se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificadora si esta afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificadora si esta se ubica de modo de facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN unidas están contiguas, y, en el caso de un líder secretora, en forma contigua y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no deben estar contiguos. La unión se obtiene por el ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si los sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos se usan de acuerdo con la práctica convencional.
La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación puede ser determinada con facilidad por los expertos en la técnica y en general es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas superiores para el apareamiento apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas menores. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para aparearse de nuevo cuando están presentes las cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. A mayor grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se deduce que las mayores temperaturas relativas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas inferiores lo harían menos. Para detalles adicionales y la explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel y otros., Current Protocols in Molecular Biology, iley Interscience Publishers, (1995) .
"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se define en la presente, se pueden identificar por las siguientes: (1) emplean fuerza iónica baja y alta temperatura para lavado, por ejemplo 0.015 M de cloruro de sodio/0.0015 M de citrato de sodio/0.1% de dodecilsulfato de sodio a 50°C; (2) emplea durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, 50% (v/v) de formamida con 0.1% de albúmina sérica bovina/0.1% de Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/50 mM de regulador de pH de fosfato de sodio a pH 6.5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42°C; o (3) hibridación toda la noche en una solución que emplea 50% de formamida, 5 x SSC (0.75 M de NaCl, 0.075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt , ADN de esperma de salmón sonicado (50 µ9/p?1) , 0.1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C, con un lavado de 10 minutos a 42 °C en 0.2 x de SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55°C seguido por un lavado de rigurosidad alta de 10 minutos que consiste en 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C Las "condiciones de rigurosidad moderada" se pueden identificarse en Sambrook y otros., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las que se describieron anteriormente. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderada es incubación toda la noche la incubación a 37°C en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico) , 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6) , 5 x de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de de esperma e salmón fragmentado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. Los profesionales expertos reconocerán cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptar los factores tales como la longitud de la sonda y similares.
El término "epítopo marcado" cuando se usa en la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de FcRH5 o anticuerpo anti-FcRH5 fusionado a un "polipéptido con marca" . El polipéptido con marca tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que se puede obtener un anticuerpo, incluso es suficientemente corto de modo de no interferir en la actividad del polipéptido al que se fusiona. El polipéptido con marca con preferencia también es relativamente único de modo que el anticuerpo sustancialmente no reacciona en forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos con marca adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (con preferencia, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos) .
"Activo" o "actividad" para los fines de la presente se refieren a las formas de un polipéptido de FcRH5 que retienen una actividad biológica y/o inmunológica de FcRH5 nativo o natural, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (sea inhibidora o estimuladora) causada por FcRH5 nativo o natural que la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por un FcRH5 nativo o natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por un FcRH5 nativo o natural .
El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza en forma parcial o completa una actividad biológica de un polipéptido de FcRH5 nativo. De manera similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido de FcRH5 nativo. Las moléculas agonistas o antagonistas incluyen específicamente los anticuerpos o fragmento de anticuerpos agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de FcRH5 nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido de FcRH5 , pueden comprender poner en contacto un polipéptido de FcRH5, con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable de una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido de FcRH5.
"Purificado" significa que una molécula está presente en una muestra a una concentración de al menos 95% en peso, o al menos 98% en peso de la muestra en que está contenida .
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se separa de al menos otra molécula de ácido nucleico con la que está comúnmente asociada, por ejemplo, en su ambiente natural. Una molécula de ácido nucleico aislada además incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que comúnmente expresan la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente en forma extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural .
El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular al que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de la replicación autónoma en una célula hospedera en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episómicos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episómicos) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera después de la introducción en la célula hospedera, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedero. Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que se unen en forma operativa. Tales vectores se denominan en la presente como "vectores de expresión recombinante" o simplemente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos . En la presente especificación, plásmido" y "vector" se pueden usar en forma indistinta el plásmido como la forma más comúnmente usada de vector .
"Polinucleótido" , o "ácido nucleico" , usados en forma indistinta en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y A N. Los nucleótidos pueden ser desoxiribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se puede incorporar en un polímero por acción de ADN o ARN polimerasa o por una reacción de síntesis. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación en la estructura del nucleótido se puede impartir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por los componentes no nucleótido. Un polinucleótido puede comprender modificaciones realizadas después de la síntesis, tal como la conjugación a una marca. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, sustitución de "capuchones" de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótido tales como, por ejemplo, las que tienen uniones no cargadas (por ejemplo, metilfosfonatos , fosfotriésteres , fosfoamidatos , carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etc.), los que contienen residuos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas de los polinucleótidos . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares se puede reemplazar, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándares, o activados para preparar uniones adicionales a nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal se puede fosforilar o sustituir con aminas o residuos de grupos capuchón orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivar de grupos protectores estándares. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de ribosa o desoxiribosa que en general son conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, 2'-0- metil-, 2'-0-alil-, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares oí-anoméricos , azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas , análogos acíclicos y análogos de nucleótidos básico tales como metil ribósido. Una o más uniones fosfodiéster se pueden reemplazar con grupos enlazadores alternativos. Estos grupos enlazadores alternativos incluyen pero sin limitación, modalidades en donde el fosfato se reemplaza con P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato") , (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0', CO, o CH2 ( "formacetal" ) , en el que cada R o R' es de modo independiente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que opcionalmente contiene una unión éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todas las uniones de un polinucleótido deben ser idénticas. La precedente descripción se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en la presente, que incluyen ARN y ADN.
"Oligonucleótido" como se usa en la presente, en general se refiere a polinucleótidos cortos, en general monocatenarios , en general sintéticos que son en general, pero no necesariamente, menor de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para los polinucleótidos aplicable en forma equivalente y completa a los oligonucleótidos .
Los términos "cáncer" y "cancerígeno" se refieren o describen la condición patológica fisiológica que normalmente se caracteriza por el crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero sin limitación, cánceres hematopoyéticos o cánceres relacionados con la sangre, tales como linfoma, leucemia, mieloma o neoplasias linfoides, pero también a los cánceres del bazo y de los ganglios linfáticos y también carcinoma, blastoma y sarcoma. Los ejemplos de cáncer más particulares incluyen cánceres asociados a células B, que incluyen por ejemplo, lin ornas de grado alto, intermedio y bajo (que incluye linfornas de células B tales como, por ejemplo, linfornas de células B del tejido linfoide asociado a mucosa y linfoma no de Hodgkin (NHL) , linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma difuso de células grandes, linfoma folicular, y linfoma de Hodgkin y linfoma de células T) y leucemias (que incluye leucemia secundaria, leucemia linfocítica crónica (CLL) , tales como leucemia de células B (linfocitos CD5+ B) , leucemia mieloide, tales como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoide, tales como leucemia linfoblástica aguda (ALL) y mielodisplasia) , y otros cánceres hematológicos y/o asociados a células B o células T. También se incluyen cánceres de células hematopoyéticas adicionales, que incluye leucocitos polimorfonucleares , tales como basófilos, eosinófilos, neutrófilos y monocitos, células dendríticas, plaquetas, eritrocitos y células citolíticas naturales. También se incluyen los trastorno proliferativo de las células B cancerígenas seleccionados de los siguientes: linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto. Los orígenes de los cánceres de las células B incluyen los siguientes: orígenes de linfoma de células B de zona marginal en las células B de memoria en la zona marginal, el linfoma folicular y linfoma difuso de células B grandes se originan en la zona clara de los centros germinales, la leucemia linfocítica crónica y la leucemia linfocítica pequeña se origina en las células Bl (CD5+) , el linfoma de células del manto se origina en las células B inactivas en la zona del manto y el linfoma de Burkitt se originan en los centroblastos de la zona oscura de los centros germinales. Los tejidos que incluyen células hematopoyéticas denominadas en la presente como "tejidos de células hematopoyéticas" incluyen timo y médula ósea y tejidos linfoides periféricos, tales como bazo, ganglios linfáticos, tejidos linfoides asociados con mucosa, tales como tejidos linfoides asociados con intestino, amígdalas, parches de Peyer y apéndice y tejidos linfoides asociados con otra mucosa, por ejemplo, los revestimientos bronquiales. Otros ejemplos particulares de los cánceres incluye cáncer de células escamosas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.
Una "neoplasia de células B" de la presente incluye linfoma no de Hodgkin (NHL) , que incluyen NHL folicular/grado bajo, NHL linfocítico pequeña (SL) , NHL folicular/grado intermedio, NHL de grado intermedio difuso, NHL inmunoblástico de grado alto, NHL linfobástica de grado alto, NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado, NHL masivo, linfoma de células del manto, linfoma relacionado con SIDA y macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma no de Hodgkin (NHL) , enfermedad de Hodgkin con predominio de ( leucocitos (LPHD) , linfoma linfocítico pequeño (SLL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , NHL indolente que incluye NHL indolente reincidente y NHL indolente refractario a rituximab, leucemia, que incluyen leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica; linforna de células del manto; y otras neoplasias hematológicas . Tales neoplasias se pueden tratar con anticuerpos dirigidos contra los marcadores de superficie de las células B, tales como FcRH5. Tales enfermedades están contempladas en la presente para tratarse con la administración de un anticuerpo dirigido contra un marcador de superficie de las células B, tal como FcRH5 , e incluye la administración de un anticuerpo no conjugado ("desnudo") o un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico que se describe en la presente. Tales enfermedades también están contempladas en la presente para tratarse con terapia combinada que incluye un anticuerpo anti-FcRH5 o conjugado del anticuerpo anti-FcRH5 fármaco de la invención en combinación con otro anticuerpo o conjugado de anticuerpo y fármaco, otro agente citotóxico, radiación u otro tratamiento administrado en forma simultánea o en series. En el ejemplo método de tratamiento de la invención, se administra un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención en combinación con un anticuerpo anti-CD20, inmunoglobulina o fragmento de unión, ya sea en conjunto o secuencial . El anticuerpo anti-CD20 puede ser un anticuerpo desnudo o un conjugado de anticuerpo y fármaco. En una modalidad de la terapia combinada, el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo de la presente invención y el anticuerpo anti-CD20 es Rituxan® (rituximab) .
El término "linfoma no de Hodgkin" o "NHL", como se usa en la presente, se refiere a un cáncer del sistema linfático diferente de los linfomas de Hodgkin. Los linfomas de Hodgkin en general se pueden distinguir del linfoma no de Hodgkin por la presencia de las células de Reed-Sternberg en el linfoma de Hodgkin y la ausencia de las células en los linfomas no de Hodgkin. Los ejemplos de linfomas no de Hodgkin comprendidos en el término como se usa en la presente incluyen cualquiera que se pueda ser identificado como tal por los expertos en la técnica (por ejemplo, un oncólogo o patólogo) de acuerdo con los esquemas de clasificación conocidos en la técnica, tal como el esquema de linfoma americano-europeo revisado (REAL) como se describe en Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edición) , A. Víctor Hoffbrand y John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000). Ver, en particular, las listas de las Figuras 11,57, 11,58 y 11,59. Los ejemplos más específicos incluyen, pero sin limitación, NHL con recaída o refractario, NHL de bajo grado línea frontal, NHL estadio III/IV, NHL resistente a quimioterapia, leucemia y/o linfoma linfoblásticos de precursor B, linfoma linfocítico pequeño, leucemia de células B linfocítica crónica y/o leucemia prolinfocítica y/o linfoma linfocítico pequeño, linfoma prolinfocítica de células B, inmunocitoma y/o leucemia linfoplasmacítica , linfoma linfoplasmacítica , linfoma de célula B de zona marginal, linfoma de zona marginal esplénica, linfoma extranodal de zona marginal - MALT, linfoma nodal de zona marginal, leucemia de células pilosas, plasmacitoma y/o mieloma de células plasmáticas, linfoma folicular de bajo grado, NHL folicular/ grado intermedio, linfoma de células del manto, linfoma del central folicular (folicular) , NHL difuso de grado intermedio, linfoma difuso de células B grandes, NHL agresivo (que incluye NHL de línea frontal agresivo y NHLagresivo reincidente) , NHL reincidente posteriores o refractario al trasplante antologo de células madres, linfoma primario de células B grandes del mediastino, linfoma de efusión primaria, NHL inmunoblástica de alto grado, NHL linfoblástica de alto grado, NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado, NHL masiva, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica granular grande precursor (periférica) , micosis fungoidea y/o síndrome de Sezary, linfornas de piel (cutáneo), linfoma de células grandes anaplásicas, linfoma angiocéntrico .
Los trastornos de células plasmáticas resultan de la división o multiplicación descontrolada de un clon de células plasmáticas. Las células plasmáticas se originan de linfocitos B activados (es decir, células B) . Cada célula B produce un receptor único, conocido como receptor de célula B, dispuesto en su superficie celular que es específica para una sustancia extraña, es decir, antígeno. Cuando un receptor de célula B se une a su antígeno cognado, la célula que expresa el receptor se activa para reingresar al ciclo celular, que produce muchas copias de sí misma. Los clones maduran en las células plasmáticas que residen principalmente en la médula ósea y que se especializan en producir copias del receptor de la célula B que se liberan en la corriente sanguínea como anticuerpos. En un trastorno de las células plasmáticas, la célula plasmática o la célula B progenitora sufre daño genético que produce eliminación o insensibilidad a las limitaciones normales sobre la división y/o actividad celular. Las células plasmáticas hijas derivadas de las células son malignas ya que ellas se pueden dividir sin restricciones y/o generar exceso de la misma inmunoglobulina (anticuerpo) . A menudo la inmunoglobulina producida es incompleta o tiene una conformación incorrecta que puede producir la acumulación de la proteína (también denominada como proteína monoclonal, proteína M, paraproteína o proteína amiloidea, dependiente del trastorno específico) en el suero, tejidos u órganos (en especial los ríñones), lo que lleva a la disfunción y/o insuficiencia orgánica. Los trastornos de las células plasmáticas incluyen gamopatías monoclonales de significación indeterminada (MGUS) , mieloma múltiple (MM) , macroglobulinemia , enfermedades de la cadena pesada, y amiloidosis de cadena ligera sistémica (AL) , que se diferencian sobre la base de la naturaleza proliferativa del clon, el grado de compromiso medular y el tipo de proteína M expresada. Los trastornos de las células plasmáticas adicionales son plasmocitoma solitario, plasmocitoma extramedular, plasmocitomas solitarios múltiples, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de aldenstrom, linfomas no de Hodgkin, no células B, leucemia linfocítica crónica de células B. Si bien las nuevas inmunoterapias tales como rituximab y alemtuzumab han mejorado la supervivencia libre de enfermedad y global en algunas neoplasias de las células B, las terapias no han demostrado ser efectivas en el tratamiento de los trastornos de las células plasmáticas en parte debido a que los antígenos objetivo, CD20 y CD52, respectivamente, no son expresados suficientemente por las células plasmáticas de clones malignos. En consecuencia, se necesita para la identificación y el desarrollo de la terapia mejorada de los trastornos de las células plasmáticas. (Ver Solicitudes publicada U.S. Nos. 20080166742 y 20080317745, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) .
La expresión de FcRH5 (IRTA2) sobre las células B, células plasmáticas y células del mieloma múltiple (que incluyen las células de las muestras de los pacientes MM) se ha mostrado previamente (ver Solicitud publicada U.S. No. 20060251662, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . Por consiguiente, a la luz del patrón de expresión de FcRH5 en las muestras de mieloma múltiple, la molécula es un excelente objetivo para la terapia de tumores en mamíferos, que incluyen trastornos de las células plasmáticas, tales como los que se describen en la presente (es decir, mieloma múltiple) y enfermedades asociadas con la secreción de anticuerpos, tales como alergia o enfermedades autoinmunes .
Un "trastorno" es cualquier enfermedad que se beneficiaría por el tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Este incluye trastornos o enfermedades agudos o crónicos que incluyen estas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de los trastornos tratados en la presente incluyen condiciones cancerígenas tales como tumores malignos y benignos; neoplasias no leucemias y linfoides; neuronal, glial, astrocital, hipotalámica y otras glándulas, trastornos de macrófagos, epitelial, estromal y blastocélico ; y trastornos inflamatorios, inmunológicos y otros relacionados con angiogénesis . Los trastornos también incluye condiciones cancerígenas tales como trastornos proliferativos de células B y/o tumores de células B, por ejemplo, linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivoÍ=NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación de células anormales. En una modalidad, el trastorno de células proliferativas es cánce .
"Tumor", como se usa en la presente, se refiere al total del crecimiento y proliferación de células neoplásicas, sea maligno o benigno, y todas las células y tejidos precancerígenos y cancerígenos .
Una "enfermedad autoinmunitaria" en la presente memoria es una enfermedad o trastorno que surgen y dirigido contra tejidos u órganos propios del individuo o un co-segregado o manifestación del mismo o afección resultante del mismo. En muchos de estos trastornos autoinmunes e inflamatorios, varios marcadores clínicos y de laboratorio pueden existir, que incluyen, pero sin limitación a, hipergammaglobulinemia, altos niveles de autoanticuerpos , depósitos del complejo antígeno-anticuerpo de los tejidos, beneficios de los tratamientos de corticoesteroides o inmunosupresores y agregados de células linfoideas en los tejidos afectados. Sin estar limitado por ninguna teoría respecto de la enfermedad autoinmunitaria mediada por células B, se considera que las células B demuestran un efecto patogénico en las enfermedades autoinmunes a través de una multitud de vías mecánicas, que incluyes la producción de autoanticuerpos , formación de complejos inmunes, activación dendrítica y activación de células T, síntesis de citocina, liberación de quimiocina directa, y proporciona un nido para la neo-linfogénesis ectópica. Cada una de estas vías puede participar en diferentes grados de la patología de las enfermedades autoinmunes.
"Enfermedad autoinmunitaria" puede ser una enfermedad específica del órgano (es decir, la respuesta inmunitaria se dirige específicamente contra un sistema orgánico tal como el sistema endocrino, el sistema hematopoyético, la piel, el sistema cardiopulmonar, los sistemas gastrointestinal y hepático, el sistema renal, la tiroides, los oídos, el sistema neuromuscular, el sistema nervioso central, etc.) o una enfermedad sistémica que puede afectar múltiples sistemas orgánicos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis reumatoide (RA) , polimiositis , etc.). Las enfermedades preferidas incluyen trastornos reumatológicas autoinmunes (tal como, por ejemplo, RA, síndrome de Sjógren, escleroderma , lupus tal como SLE y nefritis lúpica, polimiositis-dermatomiositis , crioglobulinemia, síndrome de anticuerpo antifosfolípido , y artritis psoriática) , trastornos gastrointestinales y hepáticos autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedades intestinales inflamatorias (por ejemplo, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn) , gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, y enfermedad celíaca) , vasculitis (tal como, por ejemplo, vasculitis negativa a ANCA y vasculitis asociada a ANCA, que incluye vasculitis de Churg-Strauss , granulomatosis de Wegener y poliangiitis microscópica) , trastornos neurológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, esclerosis múltiple, síndrome de opsoclonus mioclonus, miastenia grave, neuromielitis óptica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y polineuropatías autoinmunes) , trastornos renales (tales como, por ejemplo, glomerulonefritis , síndrome de Goodpasture y enfermedad de Berger) , trastornos dermatológicos autoinmunes (tal como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, urticaria, pénfigo vulgar, penfigoide hulloso, y lupus eritematoso cutáneo) , trastornos hematológicos (tal como, por ejemplo, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura postransfusión y anemia hemolítica autoinmunitaria), aterosclerosis , uveítis, enfermedades de audición autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedad del oído interno y pérdida de audición) , enfermedad de Behcet, síndrome de Raynaud, trasplante de órganos y trastornos endocrinos autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes relacionadas con la diabetes como diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) , enfermedad de Addison y enfermedad de tiroides autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedad de Graves y tiroiditis) ) . Las enfermedades más preferidas incluyen, por ejemplo, RA, colitis ulcerativa, vasculitis asociada con ANCA, lupus, esclerosis múltiples, síndrome de Sjógren, enfermedad de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tiroiditis, y glomerulonefritis .
Los ejemplos específicos de otras enfermedades autoinmunitaria definidas en la presente, que en algunos casos abarcan los enumerados antes, incluyen, pero sin limitación, artritis (aguda y crónica, artritis reumatoide que incluye artritis reumatoide de comienzo juvenil y etapas tales como sinovitis reumatoide, gota o artritis gotosa, artritis inmunológica aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis inducida por colágeno tipo II, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa , artritis psoriática, enfermedad de Still, artritis vertebral, osteoartri is , artritis crónica progresiva, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, artritis menopáusica, artritis por reducción de estrógenos y espondilitis anquilosante/espondilitis reumatoide) , enfermedad linfoproliferativa autoinmunitaria, enfermedades de la piel hiperproliferativa inflamatoria, psoriasis tales como psoriasis en placa, psoriasis guttata, psoriasis pustulosa y psoriasis de las uñas, atopia que incluye enfermedades atópicas tales como fiebre de heno y síndrome de Job, dermatitis que incluye dermatitis por contacto, dermatitis por contacto crónica, dermatitis exfoliante, dermatitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, urticaria, dermatitis herpetiforme , dermatitis numular, dermatitis seborreica, dermatitis no específica, dermatitis por contacto irritante primaria y dermatitis atópica, síndrome de hiper-IgM enlazada a x, enfermedades intraoculares alérgicas, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiomática crónica, que incluye urticaria autoinmunitaria crónica, miositis, polimiositis/dermatomiositis , dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma (que incluye escleroderma sistémica) , esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (MS) tal como MS espino-óptico, MS progresiva primaria (PPMS) , y MS remitente-reincidente (RRMS) , esclerosis progresiva sistémica, aterosclerosis , arteriosclerosis , esclerosis diseminada, esclerosis atáxica, neuromielitis óptica (NMO) , enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinal mediadas autoinmmunitarias , colitis tales como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necronizante y colitis transmural y enfermedades intestinal inflamatoria autoinmunitaria) , inflamación del intestino, pioderma gangrenosa, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, síndrome de estrés respiratorio, que incluye síndrome de estrés respiratorio adulto o agudo (ARDS) , meningitis, inflamación de todas o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico autoinmunitaria, enfermedad trasplante versus hospedero, angioedema tal como angioedema hereditario, lesión nervioso craneano como en la meningitis, herpes gestationis, gestationis penfigoide, pruritos escrotal, insuficiencia ovárica prematura autoinmunitaria, pérdida de oído súbita debida a una afección autoinmunitaria, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxis y rinits alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbico y/o tronco del encéfalo, uveítis, tal como anterior uveítis, uveítis anterior agudas, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénico, uveítis posterior, o uveítis autoinmunitaria, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis aguda o crónica tal como GN primaria, GN inmunomediada , GN membranosa (neuropatía membranosa) , GN membranosa idiopática, GN proliterativa de membrana o membranosa (MPGN) , que incluye Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva (RPGN) , nefritis proliferativa , insuficiencia endocrina poliglandular autoinmunitaria, balanitis que incluye balanitis circunscripta plasmocelular, balanopostitis , eritema anular centrifugo, eritema discrómico perstans, eritema multiforme, granuloma anular, liquen nítido, liquen escleroso y atrófico, liquen simple crónico, liquen espinuloso, liquen plano, ictiosis laminar, hiperqueratosis epidermolítico, queratosis premaligna, pioderma gangrenosa, afecciones y respuestas alérgicas, alergias alimenticias, alergias a fármacos, alergias a insectos, trastornos alérgicos raros tales como mastocitosis , reacción alérgica, eczema que incluye eczema alérgico o atópico, eczema esteatótico, eczema dishidrótico y eczema palmoplantar vesicular, asma tal como asma bronquial, asma autoinmunitaria, asma alérgico y asma pediátrico, afecciones que incluyen infiltración de las células T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunes contra antígenos extraños tales como grupos sanguíneos A-B-0 fetales durante la gestación, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión leucocitaria , lupus, que incluye lupus nefritis, lupus cerebritis, lupus pediátrico, lupus no renal, lupus extra-renal, lupus discoidea y lupus eritematoso discoidea, lupus con alopecia, SLE, tal como SLE cutáneo o SLE cutáneo subaguda, síndrome de lupus neonatal (NLE) , y lupus eritematoso diseminado, diabetes mellitus de comienzo juvenil (Tipo I) , que incluye IDDM pediátrico, diabetes mellitus de comienzo adultos (diabetes Tipo II), diabetes autoinmunitaria , diabetes insípida idiopática, retinopatía diabética, neuropatía diabética, colitis diabética, trastorno diabético de grandes arterias, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad agua y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis que incluye granulomatosis linfomatosa, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis , vasculitis, que incluye a vasculitis, vasculitis de grandes vasos (que incluye polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (Takayasu) , vasculitis de vasos medianos (que incluye la enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa/periarteritis nodosa) , poliarteritis microscópica, inmunovasculitis , vasculitis del SNC, vasculitis cutánea, vasculitis hepersensible , vasculitis necronizante tal como vasculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociada con ANCA, tal como vasculitis de Churg-Strauss o síndrome (CSS) y vasculitis de pequeños vasos asociados con ANCA, arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmunitaria, anemia positiva a Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune que incluye anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA) , anemia perniciosa (anemia perniciosa) , enfermedad de Addison, anemia o aplasia de hematíes pura (PRCA), deficiencia del Factor VIII, hemofilia A, neutropenia (s) autoinmunes, citopenias tal como pancitopenia, leucopenia, enfermedades que involucran diapédesis de leucocitos, enfermedades inflamatorias del SNC, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de lesión orgánica múltiple tal como los secundarios a septicemia, trauma o hemorragia, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal anti-glomerular, síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos , motoneuritis , neuritis alérgica, enfermedad/síndrome de Behget, síndrome de Castlemán, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjógren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide bulloso y penfigoide de la piel, pénfigos (que incluye pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo mucus-menmbranoso penfigoide y pénfigo eritematoso) , poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, lesión térmica debida a una afección autoinmunitaria, preeclampsia , un trastorno por complejo inmune tal como nefritis por complejo inmune, nefritis mediada por anticuerpo, trastornos neuro-inflamatorios , polineuropatías , neuropatía crónica tal como polineuropatía IgM o neuropatías mediadas por IgM, trombocitopenia (como la que se desarrolla en pacientes como infarto de miocardio, por ejemplo) , que incluye púrpura trombocitopenia trombótica (TTP) , púrpura pos-transfusión (PTP) , trombocitopenia inducida por heparina y trombocitopenia autoinmunitaria o inmunomediada que incluye, por ejemplo púrpura trombocitopenia idiopática (ITP) que incluye ITP crónica o aguda, escleritis tal como queratoescleritis idiopática, episcleritis , enfermedad autoinmunitaria de los testículos y ovario que incluye orquitis y ooforitis autoinmunitaria, hipotiroidismo primario, hipoparatirpodismo, enfermedades endocrinas autoinmunitaria que incluyen tiroiditis tal como tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) , tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares autoinmunes por ejemplo tipo I (o síndromes de endocrinopatías autoinmunes), síndromes paraneoplásicos , que incluyen síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como síndrome de Lambert -Eaton miasténico o síndrome de Eaton-Lambert , síndrome del hombre rígido o síndrome de la rígida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y experimental (EAE) , miastenia grave tal como miastenia grave asociada a timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonía, opsoclonus o síndrome opsoclonus mioclonus (OMS) , y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan , hepatitis autoinmunitaria, hepatitis crónica, hepatitis lupoidea, hepatitis de células gigantes, hepatitis crónica activa o hepatitis crónica activa autoinmunitaria, neumonitis tales como neumonitis intersticial linfoide (LIP) , bronquiolitis obliterante (no-trasplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía IgA) , neuropatía por IgA idiopática, dermatosis IgA lineal, dermatosis neutrofílica febril aguda, dermatosis pustular subcorneana, dermatosis acantolítica transitoria, cirrosis tal como cirrosis biliar primaria y pneumonocirrosis , síndrome de enteropatía autoinmunitaria, enfermedad celíaca o enfermedad de Coeliaca, sprue celíaco (enteropatía de gluten) , sprue refractoria, sprue idiopático, crioglobulinemia tal como crioglobulinemia mixta, esclerosis lateral amilotrófica (ALS, enfermedad de Lou Gehrig) , enfermedad arteriocoronaria , enfermedad del oído autoinmunitaria tal como enfermedad del oído interno autoinmunitaria (AIED) , pérdida de audición autoinmunitaria, policondritis tal como policondritis refractaria o reincidente, proteinosis alveolar pulmonar, síndrome de Cogan/queratitis intersticial no sifilítica, parálisis de Bell, enfermedad/síndrome de Sweet, rosácea autoinmunitaria, dolor asociado con zoster, amiloidosis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de células B monoclonales (por ejemplo, gamopatía monoclonal benigna y gamopatía monoclonal de significación no determinada, MGUS) , neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmias, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomerulosclerosis focal o segmentaria o focal segmentaria (FSGS) , oftalmopatía endocrina, uveorretinitis , coriorretinitis , trastorno hepatológico autoinmunitaria, fibromialgia, falla endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielizantes tales como enfermedades desmielizantes autoinmunes y polineuropatías desmielizante inflamatoria crónica, síndrome de Dressler, alopecia areata, alopecia totalis, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia) , infertilidad masculina y femenina autoinmunitaria, por ejemplo, debido a los anticuerpos antiespermatozoides, enfermedades del tejido conectivo mixto, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome pos-cardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de criadores de aves, angitis granulomatosa alérgica, angitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitos fiibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a transfusión, lepra, malaria, enfermedades parasitarias tal como leishmaniasis , kipanosomiasis , esquistomiasis , ascariasis, aspergilosis , síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis intersticial del pulmón, mediastinitos fibrosante, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis , eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetal, faciitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como cielitos crónica, ciclitis heterocónica, iridociclitis (aguda o crónica) , o cielitos de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , SCID, síndrome de deficiencia adquirida inmune (SIDA) , infección con echovirus, septicemia (síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) ) , endotoxemia, pancreatitis, tiroxicosis, infección con parvovirus, infección con virus de rubéola, síndromes pos-vacunación, infección estreptocócica , tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis , tabes dorsal, corioiditis, infección por rubéola congénita, infección con virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, falla gonadal autoinmunitaria , corea de Sydenham, nefritis polimialgia de células gigantes, neumonitis hipersensible crónica, conjuntivitis, tal como catarro primaveral, queratoconjuntivitis sicca, y queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, neuropatía de cambios mínimos, lesión por reperfusión- isquemia benigna familiar y repercusión del órgano trasplantado, autoinmunidad retiniana, inflamación de articulaciones, bronquitis, enfermedad de vías aérea/pulmonar obstructivo crónica, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos (insuficiencia vascular cerebral) tal como encefalopatía arteriosclerótica y retinopatía, aspermiogenesia , hemolisis autoinmunitaria, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia , contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nudoso debido a lepra, parálisis idiomática, parálisis facial, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida auditiva sensoneural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileítis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversa, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, poliradiculitis agua, pioderma gangrenosa, tiroiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, timoma no maligno, timitis linfofolicular, vitíligo, síndrome de choque tóxico, intoxicación con alimentos, afecciones que incluyen infiltración de las células T, deficiencia de adhesión leucocitaria , respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que involucran diapédesis de leucocitos, síndrome de falla multiorgánica, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmunitaria, oftalmía simpatía, enfermedades reumáticas, enfermedad del tejido conectivo, síndrome nefrótico, insulitis, falla poliendocrina, síndromes poliglandulares autoinmunes, que incluye síndrome poliglandular tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de comienzo adulto (AOIH) , cardiomiopatía tal como cardiomiopatía dilatada, epidermolisis bullosa adquirida (EBA) , hemocromatosis , miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoidea, frontal, maxilar o esfenoide, sinusitis alérgica, un trastorno relacionado con eosinófilo tales como eosinofilia, eosinofilia con infiltración pulmonar, síndrome eosinofilia-mialgia , síndrome de Loffler, neumonía eosinofilia crónica, eosinofilia pulmonar tropical aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma, o granulomas que contienen eósinófilos, anafilaxis, espondiloartropatías , espondiloartritis seronegativa, enfermedad poliendocrina autoinmunitaria, colangitis esclerosante, esclera, episclera, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de iskott-Aldrich, síndrome de telangiectasia ataxia, angiectasia, trastornos autoinmunes asociados con enfermedad del colágeno, reumatismo tal como artroreumatismo crónico, linfadenitis, reducción de la respuesta de la presión arterial, disfunción vascular, lesión del tejido, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral y enfermedad que acompaña la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis , lesión de repercusión trastornos de reperfusión isquémica del tejido miocárdico u otros tejidos, traqueobronquitis linfomatoso, dermatosis inflamatoria, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, falla multiorgánica , enfermedades bullosas, necrosis cortical renal, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios ocular y orbital, síndromes asociados a la transfusión de granulocitos , toxicidad inducida por citocina, narcolepsia, inflamación grave aguda, inflamación intratable crónica, pielitis, hiperplasia endoarterial , úlcera péptica, valvulitis, y endometriosis . Tales enfermedades están contempladas en la presente tratadas por la administración de un anticuerpo que se une a un marcador de superficie de células B, tales como FcRH5, e incluye la administración de un anticuerpo no conjugado ("desnudo") o un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico como se describe en la presente. Tales enfermedades también están contempladas en la presente tratadas por la terapia de combinación que incluye un anticuerpo anti-FcRH5 o el conjugado del anticuerpo anti-FcRH5 y fármaco de la invención en combinación con otro anticuerpo o conjugado de anticuerpo y fármaco, otro agente citotóxico, radiación u otro tratamiento administrado en forma simultánea o en serie.
"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refiere al tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas, en donde el objetivo es prevenir o lentificar (reducir) la condición o trastorno patológico específico. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno así como los predispuestos a tener el trastorno o a aquellos en que se puede prevenir el trastorno. Un sujeto o mamífero "tratado" con éxito por un cáncer que expresa un polipéptido de FcRH5, si después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo anti-FcRH5 de acuerdo con los métodos de la presente invención, el paciente muestra una reducción observable y/o medible o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción de la cantidad de células cancerígenas o ausencia de de células cancerígenas; reducción del tamaño del tumor; inhibición (es decir, retardar en alguna medida y con preferencia detener) de la infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos que incluye la propagación del cáncer en tejidos blandos y óseos; inhibición (es decir, retardar en alguna medida y con preferencia detener) de la metástasis tumoral ; inhibición, retardar en alguna medida, o el crecimiento tumoral y/o alivio en alguna medida, de uno o más síntoma asociados con el cáncer especifico; reducción de la morbilidad y mortalidad y mejora de los temas de calidad de la vida. En la medida que el anticuerpo anti-FcRH5 pueda evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerígenas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La reducción de estos signos o síntomas también puede ser notada por el paciente.
Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora de la enfermedad se pueden medir fácilmente con procedimientos de rutina familiares para un médico. Para la terapia de cáncer, se puede medir la eficacia, por ejemplo, por la evaluación del tiempo a la progresión de la enfermedad (TTP) y/o la determinación de la tasa de respuesta (RR) . La metástasis se puede determinar por pruebas de clasificación en estadios y por exploraciones del hueso y pruebas para nivel de calcio y otras enzimas para determinar la propagación al hueso. También se pueden realizar barridos de CT para buscar propagación a los ganglios de pelvis y linfáticos del área. Las radiografías de tórax y la medición de niveles de enzimas hepáticas por métodos conocidos se usan para buscar metástasis en los pulmones e hígado, respectivamente. Otros métodos de rutina para controlar la enfermedad incluyen ultrasonografía trans-rectal (TRUS) y biopsia con aguja trans-rectal (TR B) .
Para el cáncer de vejiga, que es un cáncer más localizado, los métodos para determinar el progreso de la enfermedad incluyen evaluación citológica urinaria por cistoscopia, monitoreo de la presencia de sangre en orina, visualización del tracto urotelial por ecografía o un pielograma intravenoso, tomografía computada (CT) e imagen de resonancia magnética (MRI) . La presencia de metástasis distantes se puede evaluar por CT del abdomen, rayos x de tórax o imágenes de radionúclidos del esqueleto.
Administración "crónica" se refiere a la administración del agente (s) en un modo continuo en contraste con un modo agudo, de modo de mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un período de tiempo extendido. Administración "intermitente" es el tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, sino que más bien es de naturaleza cíclica.
Un "individuo" es un vertebrado. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja tales como vacas), animales de deporte, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y rata. En ciertas modalidades, un mamífero es un ser humano.
"Mamífero" para los fines del tratamiento, alivio de los síntomas de un cáncer se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye seres humanos, animales domésticos y animales de granja y animales de zoo, deportes o mascotas, tales como perros, gatos, ganado bovino, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Con preferencia, el mamífero es un ser humano.
Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
"Portadores" como se usan en la presente incluyen portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para la célula o mamífero que se exponen a estos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el portador fisiológicamente aceptable es una solución amortiguadora de pH acuosa. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen regulador de pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como T EEN®, polietilenglicol (PEG) , y PLURONICS® .
Por "fase sólida" o "soporte sólido" se entiende una matriz no acuosa en la que se puede adherir o unir un anticuerpo, oligopéptido de unión a FcRH5 o molécula orgánica de unión a FcRH5 de la presente invención. Los ejemplos de fase sólida abarcados en la presente incluyen las que se forman parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , poliacrilamidas , poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas modalidades, de acuerdo con el contexto, la fase sólida puede comprender el cavidad de una placa de ensayo; en otros es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las que se describen en la patente U.S.
No. 4,275,149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que es útil para la administración de un fármaco (tal como un anticuerpo de FcRH5) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas.
Una molécula "pequeña" o molécula orgánica "pequeña" se define en la presente por tener un peso molecular inferior a aproximadamente 500 Dalton, Un "individuo" "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen pero sin limitación, animales de granja (tales como vacas) , animales de deporte, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En ciertas modalidades, un mamífero es un ser humano.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se debe administrar la formulación. Tales formulaciones pueden ser estériles.
Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todo microorganismo vivo y sus esporas.
Una "cantidad efectiva" de un anticuerpo como se describe en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad efectiva" se puede determinar en forma empírica y de manera rutinaria, en relación con el propósito establecido.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo u otro fármaco efectivo para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerígenas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, retardar en alguna medida y con preferencia detener) la infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos; inhibir (es decir, retardar en alguna medida y con preferencia detener) la metástasis tumoral ; inhibir, en alguna medida, el crecimiento del tumor y/o aliviar en alguna medida uno o más síntomas asociados con el cáncer. Ver la definición en la presente de "tratamiento" . En la medida que el fármaco pueda evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerígenas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en las dosis y durante períodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero necesariamente, ya que se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva debe ser menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anticuerpo anti-FcRH5 es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumor, por ejemplo, células cancerígenas, in vitro o in vivo. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anticuerpo anti-FcRH5 para los fines de inhibir el crecimiento de células neoplásicas se puede determinar en forma empírica y de rutina.
Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-FcRH5 es una cantidad capaz de causar la destrucción de de una célula, especialmente tumor, por ejemplo, células cancerígenas, in vi tro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo a anti-FcRH5 para los fines de inhibir el crecimiento de células neoplásicas se puede determinar forma empírica y de rutina.
Una "célula que expresa FcRH5" es una célula que expresa un polipéptido endógeno o transfectado de FcRH5 tanto en la superficie celular como en forma secretada. Un "cáncer que expresa FcRH5" es un cáncer que comprende células que tienen un polipéptido de FcRH5 presente en la superficie celular o que produce y secreta un polipéptido de FcRH5. Un "cáncer que expresa FcRH5" opcionalmente produce niveles suficientes de polipéptido de FcRH5 en la superficie de sus células, de modo que un anticuerpo anti-FcRH5 se puede unir a estos y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. En otra modalidad, un "cáncer que expresa FcRH5" opcionalmente produce niveles suficientes de polipéptido de FcRH5, de modo que un anticuerpo anti-FcRH5, oligopéptido u otra molécula orgánica antagonista pueda unirse a estos y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Con respecto a este último, el antagonista puede ser un oligonucleótido antisentido que reduce, inhibe o evita la producción y secreción del polipéptido de FcRH5 secretado por las células tumorales . Un cáncer que "sobreexpresa" un polipéptido de FcRH5 es uno que tiene niveles significativamente superiores de polipéptido de FcRH5 en su superficie celular o lo produce y secreta, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresión puede ser producida por la amplificación del gen o por aumento de la transcripción o traducción. La sobreexpresión del polipéptido de FcRH5 se puede determinar en un ensayo de detección o pronóstico por la evaluación de los niveles aumentados de la proteína de FcRH5 presente en la superficie de una célula, o secretado por la célula (por ejemplo, por medio de un ensayo inmunohistoquímico usando anticuerpos anti-FcRH5 preparados contra un polipéptido de FcRH5 aislado que se puede preparar usando tecnología de ADN recombinante a partir de un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de FcRH5 ; análisis FACS etc.) . En forma alternativa, o adicional, se puede medir los niveles de ácido nucleico que codifica un polipéptido de FcRH5 o AR m en la célula, por ejemplo, por medio de un hibridación in situ fluorescente usando una sonda basada en ácido nucleico que corresponde a un ácido nucleico que codifica FcRH5 o su complemento; (FISH; ver W098/45479 publicado en octubre de 1998) , técnicas de Southern Blot, Northern Blot o reacción en cadena de polimerasa (PCR) , tal como PCR cuantitativa de tiempo real (RT-PCR) . También se puede estudiar la sobreexpresión del polipéptido de FcRH5 por la medición de antígeno circulante en un fluido biológico tal como suero, por ejemplo, usando ensayos basados en anticuerpo (ver también, por ejemplo, patente U.S. No. 4,933,294 presentada el 12 de junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; patente U.S. 5,401,638 presentada el 28 de marzo de 1995; y Sias y otros., J. Immunol . ethods 132:73-80 (1990)). Aparte de los ensayos anteriores, varios ensayos in vivo están disponibles para el profesional experto. Por ejemplo, se puede exponer las células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con una marca detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo, y se puede evaluar la unión del anticuerpo a las células del paciente, por ejemplo, por barrido externo para determinar radiactividad o por el análisis de una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo.
Como se usa en la presente, el término "imunoadhesina" , denomina moléculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heterologa (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de la inmunoglobulina . Desde el punto de vista estructural, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente de la del reconocimiento del antígeno y del sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga" ) , y una secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina . La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina normalmente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina de la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos de IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (que incluyen IgA-1 y IgA-2) , IgE, IgD o IgM.
La palabra "marca" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica de modo de generar un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "marcada" . La marca puede ser detectable por sí misma (por ejemplo marcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.
El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa la destrucción de las células. Se considera que el término incluye isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos por ejemplo metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y sus fragmentos tales como enzimas nucleolíticas , antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de estos, y varios agentes antitumorales o anticancerígeno que se describen a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida causa destrucción de células tumorales .
Una "toxina" es cualquier sustancia capaz de tener un efecto perjudicial en el crecimiento o proliferación de una célula.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer, independientemente del mecanismo de acción. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen un compuesto químico útil para el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclosfosfamida ; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina , trietilenfosforamida, trietiientiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; una camptotecina (que incluye los análogos sintéticos de topotecano) ; briostatina; calistatina ; CC-1065 (que incluye sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina ; duocarmicina (que incluye los análogos sintéticos, · KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina ; pancratistatina una sarcodictiína ; espongistatina ; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina , ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina , trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina , fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina ; antibióticos tales como los antibióticos de enedíina (por ejemplo, calicheamicina , en especial calicheamicina gammall, calicheamicina omegall (ver, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos , tales como clodronato; una esperamicina ; así como cromóforo de neocarzinostatina y antibióticos cromóforos de enedíina relacionados con la cromoproteína) , aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas , cactinomicina, carabicina, carminoraicina, carzinofilina , cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorubicina (que incluye morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina , tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina , trimetrexato ; análogos de purina tales como fludarabina, 6 -mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina ; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactono; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico ; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo ; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina ; diaziquona elfornitina acetato de eliptinio; un epotilón; etóglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina ; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona ; mopidanmol; nitraerina; pentostatina ; fenamet ; pirarubicina ; losoxantrona; ácido podofílinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, O); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio ; ácido tenuazónico; triaziquona ; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina, mannomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ libre de Cremofor, formulaciones de nanoparticulas manipuladas genéticamente en albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; GEMZAR® gemcitabina ; 6-tioguanina ; mercaptopurina ; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino ; vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicin ; aminopterina ; xeloda; ibandronato; irinotecano (Camptosar, CPT-11) (que incluye el régimen de tratamiento de irinotecano con 5-FU y leucovorina) ; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina ; combretastatina; VELCADE; Revlimid® ( lenalidomida) ; leucovorina (LV) ,- oxaliplatino, que incluye el régimen de tratamiento con oxaliplatino (FOLFOX) ; inhibidores de P C-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™) ) y FcRH5-A que reducen la proliferación celular y y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de los anteriores.
También se incluyen en la definición de "agente quimioterapéutico" : (i) agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas en los tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM) , que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno o (que incluye NOLVADEX® tamoxifeno) , raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTO · torremifeno; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo 4 ( 5 ) -imidazoles , aminoglutetimida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® exemestano, formestano, fadrozol, RIVISOR® vorozol , FEMARA® letrozol, y ARIMIDEX® anastrozol; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida , leuprolida, y goserelina; así como troxacitabina (un análogo nucleosídico de citosina 1,3- dioxolano) ; oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes de las vías se señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras ; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de FcRH5 (por ejemplo, ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2 ; vacunas tales como vacunas de terapias génicas, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECA ® ; ABARÉLIX® rmRH; Vinorelbina y Esperamicinas (ver patente U.S. No. 4.675.187), y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de los anteriores.
También se incluyen en la definición de "agente quimioterapéutico" los anticuerpos terapéuticos tales como alemtuzumab (Campath) , bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) ; cetuximab (ERBITUX®, Imclone) ; panitumumab (VECTIBIX®, Amgen) , rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idee) , pertuzumab (OMNITARG™ , 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech) , , tositumomab (Bexxar, Corixia) , y el conjugado de anticuerpo y fármaco, gemtuzumab ozogamicina (MILOTARG®, Wyeth) .
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerígenas que expresa FcRH5, sea in vitro o in vivo. En consecuencia, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de las células que expresan FcRH5 de la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar diferente de la fase S) , tales como los agentes que inducen la detención de Gl y la detención de fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos ye inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina , epirubicina, daunorubicina , etopósido y bleomicina. Estos agentes que detienen Gl también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina , cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional se puede hallar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds . , Chapter 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami y otros. (WB Saunders : Filadelfia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerígenos derivados del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de los microtúbulos a partir de los dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al impedir la despolimerización, que produce la inhibición de la mitosis de las células.
"Doxorubicina" es un antibiótico de antraciclina . El nombre químico completo de doxorubicina es (8S-cis) -10-[ (3 -amino-2 , 3 , 6 -trideoxi -a-L-lixo-hexapiranosil ) oxi] - 7,8,9, 10-tetrahidro-6 , 8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -1-metoxi -5 , 12 -naftaceoediona .
El término "Citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población de células que actúan con otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de las citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Se incluyen dentro de las citocinas las hormonas de crecimiento tales como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana N-metionilada, y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteícas tales como hormona foliculoestimulante (FSH) , hormona estimulante tiroidea (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral OÍ y -ß; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformante (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; factor de crecimiento tipo insulina I y -II; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductores ; interferones tales como interferón a, ß, y Y; factores estimulantes de colonia (CSF) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito CSF (G-CSF) ; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL- la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y kit del ligando (KL) . Como se usa en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de los productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o precauciones respecto del uso de los productos terapéuticos.
El término "metabolito intracelular" se refiere a un compuesto que proviene de un proceso o reacción metabólica dentro de una célula en un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) . El proceso o reacción metabólica puede ser un proceso enzimático, tal como la escisión proteolítica de un péptido enlazador de ADC, o hidrólisis de un grupo funcional tal como una hidrazona, éster, o amida. Los metabolitos intracelulares incluyen, pero sin limitación, anticuerpos y fármaco libre que han experimentado la escisión intracelular después de la entrada, difusión, absorción o transporte en una célula.
Los términos "escindido en forma intracelular" y "escisión intracelular" se refiere a un proceso o reacción metabólica dentro de una célula en un conjugado de anticuerpo- fármaco (ADC) en donde la unión covalente, es decir, el enlazador, entre el residuo del fármaco (D) y el anticuerpo (Ab) está rota, lo que produce que el fármaco se disocie del anticuerpo dentro de la célula. Los residuos escindidos de la ADC en consecuencia son metabolitos intracelulares .
El término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, niveles de sangre/plasma) de una cantidad dada de fármaco administrado a un paciente. La biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medición del tiempo (tasa) y la cantidad total (grado) de fármaco que alcanza la circulación general de una forma de dosis administrada.
El término "actividad citotóxica" se refiere a un efecto destructor de células, citostático o inhibidor del crecimiento de un ADC o un metabolito intracelular de un ADC. La actividad citotóxica se puede expresar como el valor de IC50, que es la concentración (molar o masa) por volumen unitario en el que sobreviven la mitad de las células.
El término "alquilo" como se usa en la presente se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente de cadena lineal o ramificada saturada de uno a doce átomos de carbono (C!-C12) , en donde el radical alquilo opcionalmente puede estar sustituido de modo independiente con uno o más sustituyentes que se describen a continuación. En otra modalidad, un radical alquilo tiene uno a ocho átomos de carbono (Ci-C8) , o uno a seis átomos de carbono (0?-06) . Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero sin limitación, metilo (Me, -CH3) , etilo (Et, -CH2CH3) , 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3) , 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2) , 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3) , 2-metil-l-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH (CH3) 2) , 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3) , 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3) , 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3 ) , 2-pentilo (-CH(CH3) CH2CH2CH3) , 3-pentilo (-CH (CH2CH3) 2) , 2-metil-2-butilo (-C (CH3) 2CH2CH3) , 3-metil-2-butilo ( -CH ( CH3 ) CH ( CH3 ) 2 ) , 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH (CH3) 2) , 2-metil-l-butilo (-CH2CH (CH3) CH2CH3) , 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-hexilo (-CH (CH3) CH2CH2CH2CH3) , 3-hexilo (-CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3) ) , 2-met il-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3) , 3-metil-2-pentilo ( -CH ( CH3 ) CH ( H3 ) CH2CH3 ) , 4-metil-2-pentilo (-CH (CH3) CH2CH (CH3) 2) , 3-metil-3-pentilo (-C(CH3) (CH2CH3)2) , 2-metil-3-pentilo (-CH (CH2CH3) CH (CH3) 2) , 2, 3-dimetil-2-butilo (-C (CH3) 2CH (CH3) 2) , 3 , 3-dimetil-2-butilo (-CH (CH3) C (CH3) 3 , 1-heptilo, 1-octilo, y similares.
El término "alquenilo" se refiere a radical hidrocarbonado monovalente de cadena lineal o ramificada de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace doble carbono-carbono, sp2, en donde el radical alquenilo puede estar opcionalmente sustituido de modo independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente, e incluye radicales que tienen orientaciones "cis" y "trans", o alternativamente, orientaciones "E" y "Z" . Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, etilenilo o vinilo (-CH=CH2) , alilo (-CH2CH=CH2) , y similares.
El término "alquinilo" se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente lineal o ramificado de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace triple carbono-carbono, sp, en donde el radical alquinilo puede estar opcionalmente sustituido de modo independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, etinilo (-C=CH) , propinilo (propargilo, -CH2C=CH) , y similares.
El términos "carbociclo" , "carbociclilo" , "anillo carbocíclico" y "cicloalquilo" se refieren a un anillo monovalente no aromático, saturado o parcialmente insaturado que tiene 3 a 12 átomos de carbono (C3-Ci2) como anillo monocíclico o 7 a 12 átomos de carbono como anillo bicíclico. Los carbociclos bicíclicos que tienen 7 a 12 átomos se pueden disponer, por ejemplo, como un sistema de biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], y los carbociclos bicíclicos que tienen 9 ó 10 átomos anulares se pueden disponer como sistema de biciclo [5,6] o [6,6] o como sistemas de puente tales como biciclo [2 , 2 , 1] heptano, biciclo [2 , 2 , 2] octano y biciclo [3 , 2 , 2] nonano . Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, l-ciclohex-2-enilo, l-ciclohex-3-enilo, ciclohexadienilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo, ciclododecilo, y similares.
"Arilo" significa un radical hidrocarbonado aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C20) derivado por la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono único de un sistema anula aromático original. Algunos grupos arilo están representados en los ejemplos de estructuras como "Ar" . Arilo incluye los radicales bicíclicos que comprenden anillo aromático fusionado a un anillo carbocíclico saturado, parcialmente insaturado o aromático. Los grupos arilo típicos incluyen, pero sin limitación, radicales derivados de benceno (fenilo) , benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo, indenilo, indanilo, 1,2-dihidronaftaleno, 1 , 2 , 3 , 4-tetrahidronaftilo, y similares. Los grupos arilo están opcionalmente sustituidos de modo independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente.
El términos "heterociclo" "heterociclilo" y "anillo heterocíclico" se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a un radical carbocíclico saturado o parcialmente insaturado (es decir, que tiene uno o más enlaces dobles y/o triples dentro del anillo) de 3 a 20 átomos anulares en que al menos un átomo anular es un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre, los restantes átomos anulares son C, donde uno o más átomos anulares está opcionalmente sustituido de modo independiente con uno o más sustituyentes que se describen a continuación. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros del anillo (2 a 6 átomos de carbono y 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, 0, P, y S) o un biciclo que tiene 7 a 10 miembros del anillo (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 6 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5] , [5,5], [5,6], o [6,6]. Los heterociclos se describen en Paquette, Leo A. ; "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamín, New York, 1968) , particularmente Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John iley & Sons, New York, 1950 al presente), en particular Volúmenes 13, 14, 16, 19, y ,28; y J. Am. Chem. Soc . (1960) 82:5566. "Heterociclilo" también incluye radicales donde los radicales heterociclo están fusionados con un anillo saturado, parcialmente insaturado, o carbocíclico aromático o anillo heterocíclico . Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen, pero sin limitación, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1 , 3-dioxolanilo , pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo , dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabicico [3,1,0] hexanilo, 3-azabiciclo [4,1,0] hepta ilo, azabiciclo [2 , 2 , 2] hexanilo, 3H-indolilquinolizinil y N-piridil ureas. Los restos espiro también se incluyen dentro del alcance de esta definición. Los ejemplos de un grupo heterocíclico en donde 2 átomos de carbono del anillo están sustituidos con restos oxo (=0) son pirimidinonilo y 1,1-dioxo-tiomorfolinilo . Los grupos heterociclo de la presente están opcionalmente sustituidos de modo independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente.
El término "heteroarilo" se refiere a un radical aromático monovalente de 5-, 6-, o 7 miembros de anillo e incluye sistemas anulares fusionados (al menos uno de los cuales es aromático) de 5-20 átomos, que contienen uno o más heteroátomos seleccionados de modo independiente de nitrógeno, oxígeno, y azufre. Los ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo (que incluye, por ejemplo, 2-hidroxipiridinilo) , imidazolilo, imidazopiridinilo, pirimidinilo (que incluye, por ejemplo, 4-hidroxipirimidinilo) , pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinolinilo, indazolilo, indolicinilo , ftalacinilo, piridacinilo, triacinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo , benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, y furopiridinilo . Los grupos heteroarilo están opcionalmente sustituidos de modo independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente.
Los grupos heterociclo o heteroarilo pueden estar unidos a carbono (ligados a carbono) , o nitrógeno (ligado a nitrógeno) cuando esto es posible. A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos o heteroarilos unidos a carbono en la posición 2, 3, 4, 5, o 6 de una piridina, posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5, o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4, o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol, posición 2 ó 3 de una aziridina, posición 2, 3, o 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 de una isoquinolina .
A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos o heteroarilos unidos a nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina , 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina , piperidina, piperazina, indol, indolina, lH-indazol, posición 2 de un isoindol, o isoindolina, posición 4 de una morfolina y posición 9 de un carbazol, o ß-carbolina.
"Alquileno" se refiere a un radical hidrocarbonado saturado de cadena ramificada o lineal o cíclica de 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alcano original. Los radicales alquileno típicos incluyen, pero sin limitación: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-) , 1,3-propilo ( -CH2CH2CH2- ) , 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-) , y similares .
Un "alquileno C1-C10 " es un grupo hidrocarbonado saturado de cadena lineal de la fórmula - (CH2) 1-10- · Los ejemplos de un alquileno Ci-C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
"Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarbonado insaturado, de cadena ramificada o lineal o cíclica de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alqueno original. Los radicales de alquenileno típicos incluyen, pero sin limitación: 1,2-etileno (-CH=CH-) .
"Alquinileno" se refiere a un radical hidrocarbonado insaturado, de cadena ramificada o lineal o cíclica de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alquino original. Los radicales alquinileno típicos incluyen, pero sin limitación: acetileno (-C=C-) , propargilo (-CH2C=C-) , y 4-pentinilo ( -CH2CH2CH2C=C-) .
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y pueden estar en orto, meta, o para configuraciones que se muestran en las siguientes estructuras : en que el grupo fenilo pueden estar no sustituidos o sustituidos con hasta cuatro grupos que incluyen, pero sin limitación, alquilo de Ci-C8, -0- (alquilo de Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2 , -NH(R') , -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de modo independiente de H, alquilo de Ci-C8 y arilo.
"Arilalquilo" se refiere un radical alquilo acíclico en que uno de los átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3, está reemplazado con un radical arilo. Los grupos arilalquilo incluyen, pero sin limitación, bencilo, 2-feniletan-l-ilo, 2-fenileten-l-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-l-ilo, 2-naftileten-l-ilo , naftobencilo, 2-naftofeniletan-l-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo el resto alquilo, que incluye los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo es 1 a 6 átomos de carbono y el resto arilo es 5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en que uno de los átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3 se remplaza con un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen, pero sin limitación, 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo, y similares. El grupo heteroarilalquilo comprende 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo el resto alquilo, que incluye grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo es 1 a 6 átomos de carbono y el resto heteroarilo es 5 a 14 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, 0, P, y S. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros del anillo (2 a 6 átomos de carbono o un biciclo que tiene 7 a 10 miembros del anillo (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, 0, P, y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5] , [5,6] , o [6,6] .
El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a una forma precursora o derivada dé una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco original y es capaz de activar enzimáticamente o convertir en la forma original más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transacions, 14, pp . 375-382, 615°. Meeting Belfast (1986) y Stella y otros., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" , Directed Drug Delivery, Borchardt y otros., (ed.), pp . 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero sin limitación, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos que contienen D aminoácidos modificados, profármacos glicosilados , profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitocina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos se pueden derivar en una forma de profármaco para uso en esta invención incluyen, pero sin limitación, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Por "terapia de radiación" se entiende el uso de los rayos gamma o rayos beta dirigidos para inducir suficiente daño a un célula para limitar su capacidad de funcionar normalmente o destruir la célula totalmente. Se apreciará que existirán muchas maneras de conocidas en la técnica para determinar la dosis y la duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se dan en forma de administración de una vez por día y las dosis típicas varían de 10 a 200 unidades (Gray) por día.
Un "metabolito" es un producto generado mediante el metabolismo en el cuerpo de un compuesto especificado o una sal de este. Los metabolitos de un compuesto se pueden identificar usando técnicas de rutina conocidas en la materia y sus actividades determinadas usando pruebas tales como las descritas en la presente. Tales productos pueden provenir por ejemplo de la oxidación, reducción, hidrólisis, amidación, desamidación, esterificación, desesterificación, escisión enzimática, y similares, del compuesto administrado. Por consiguiente, la invención incluye los metabolitos de los compuestos de la invención, que incluyen compuestos producidos por un proceso que comprende poner en contacto un compuesto de esta invención con un mamífero durante un período de tiempo suficiente para producir un producto metabólico de este.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es de utilidad para la administración de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.
"Enlazador" se refiere a un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une en forma covalente un anticuerpo a un residuo de fármaco. En varias modalidades, los enlazadores incluyen un radical divalente tales como un alquildiílo, un arildiílo, un heteroarildiílo, restos tales como: - (CR2) n0 (CR2) n-/ unidades repetidas de alquiloxi (por ejemplo polietilenoxi , PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (por ejemplo polietilenamino, Jeffamine™) ; y éster diácido y amidas que incluyen succinato, succinamida, diglicolato, malonato, y caproamida.
El término "quiral" se refiere a las moléculas que tienen la propiedad de no superponerse al compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que se pueden superponer en su compañero de imagen especular .
El término "estereoisómeros" se refiere a los compuestos que tienen constitución química idéntica, pero difiere con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio. ¿ "Diaestereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diaestereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diaestereómeros se pueden separar con procedimientos analíticos de alta resolución tales como electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en la presente generalmente siguen S. P. Parker, Ed. , McGraw-Hill Dictionary oí Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemis ry of Organic Compounds (1994) John iley & Sons, Inc., New York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada. Para describir un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se usan para indicar la configuración absoluta de la molécula acerca de su centro quiral. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación del plano de la luz polarizada por el compuesto con (-) o 1 que significa que el compuesto es levogiratorio . Un compuesto con prefijo (+) o d es dextrogiratorio . Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto que estos son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico también se puede denominar como un enantiómero y una mezcla de los isómeros a menudo se llama una mezcla enantiomérica . Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina como una mezcla racémica o un racemato, que puede ocurrir cuando no ha habido estereoselección o estereospeci icidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantiornéricas , desprovistas de actividad óptica.
El término "tautómero" o "forma tautomérica" se refiere isómeros estructurales de diferentes energías que son interconvertibles por medio de una barrera de energía baja. Por ejemplo, los tautómeros protónicos (también conocidos como tautómeros prototrópicos) incluyen las interconversiones por medio de la migración de un protón, tales como las isomerizaciones ceto-enol e imina-enamina . Los tautómeros de valencia incluyen las interconversiones por la reorganización de algunos de los electrones de enlace.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la invención. Los ejemplos de sales incluyen, pero sin limitación sales sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metansulfonato "mesilato", etansulfonato, bencensulfonato, p-toluensulfonato, y pamoato (es decir, 1 , 1 ' -metilen-bis (2-hidroxi-3-naftoato) ) . Una sal farmacéuticamente aceptable puede involucrar la inclusión de otra molécula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraión. El contraión puede ser un resto orgánico o inorgánico que estabiliza la carga en el compuesto original. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los casos en que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener contrapones múltiples. En consecuencia, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones .
Si el compuesto de la invención es una base, la sal farmacéuticamente aceptable deseada se puede preparar por cualquier método disponible en la técnica, por ejemplo, el tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metansulfónico, ácido fosfórico y similares, o con un ácido orgánico tal como ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido masónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, ácido piranosidílico tales como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un alfahidroxi ácido tal como ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático tal como ácido benzoico o ácido cinámico, un ácido sulfónico tal como ácido p-toluensulfónico o ácido etansulfónico o similares.
Si el compuesto de la invención es un ácido la sal farmacéuticamente aceptable deseada se puede preparar por cualquier método disponible en la técnica, por ejemplo, el tratamiento del ácido libre con una base inorgánica u orgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria) , un hidróxido de metal alcalino o un hidróxido de metal alcalinotérreo, o similares. Los ejemplos ilustrativos de sales adecuadas incluyen, pero sin limitación, sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoníaco, aminas primarias, secundarias y terciarias, y aminas cíclicas tales como piperidina, morfolina y piperazina, y sales inorgánicas derivadas de sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio.
La frase "farmacéuticamente aceptable" indica que la sustancia o composición deber compatible desde el punto de vista químico y/o toxicológico con los otros ingredientes que comprenden una formulación, y/o el mamífero tratado con ellas Un "solvato" se refiere a una asociación o complejo de una o más moléculas de solvente y un compuesto de la invención. Los ejemplos de solventes que forman solvatos incluyen, pero sin limitación, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético y etanolamina. El término "hidrato" se refiere al complejo en que la molécula de solvente es agua.
El término "grupo protector" se refiere a un sustituyentes que se emplea comúnmente para bloquear o proteger un grupo funcional particular mientras que reaccionan otros grupos funcionales del compuesto. Por ejemplo, un "grupo protector de amino" es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege el grupo funcional amino del compuesto. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC) , benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc) . De modo similar, un "grupo protector de hidroxi" se refiere a un sustituyente de un grupo hidroxi que bloquea o protege el grupo funcional hidroxi. Los grupos protectores adecuados incluyen acetilo y sililo. Un "grupo protector de carboxi" se refiere a un sustituyente del grupo carboxi que bloquea o protege el grupo funcional carboxi. Los grupos protectores de carboxi comunes incluyen fenilsulfoniletilo, cianoetilo, 2- (trimetilsilil ) etilo, 2- (trimetilsilil) etoximetilo, 2-(p-toluensulfonil ) etilo, 2- (p-nitrofenilsulfenil) etilo, 2- (difenilfosfino) -etilo, nitroetilo y similares. Para una descripción general de grupos protectores y sus uso, ver T. . Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que se puede sustituir con otro grupo funcional. Ciertos grupos salientes son bien conocidos en la técnica y los ejemplos incluyen, pero sin limitación, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro) , metansulfonilo (mesilo) , p-toluensulfonilo (tosilo) , trifluorometilsulfonilo (triflato) , y trifluorometilsulfonato .
Abreviaturas COMPONENTES DEL ENLAZADOR: MC = 6-maleimidocaproílo Val-Cit o "ve" = valina-citrulina (un ejemplo de dipéptido en un enlazador escindible con proteasa) Citrulina = ácido 2-amino-5-ureido pentanoico PAB = p-aminobenciloxicarbonilo (un ejemplo de un componente enlazador "auto inmolado") Me-Val-Cit = N-metil-valina-citrulina (en donde el enlace del péptido enlazador ha sido modificado para evitar su escisión por catepsina B) MC(PEG)6-0H = maleimidocaproil- polietilenglicol (puede ser unido a las cisteínas del anticuerpo) .
FARMACOS CITOTOXICOS: MMAE = mono-metil auristatina E (MW 718) MMAF = variante de auristatina E (MMAE) con una fenilalanina en el C-terminal del fármaco (MW 731,5) MMAF-DMAEA = MMAF con DMAEA (dimetilaminetilamina) en una unión amida al C-terminal de fenilalanina (MW 801,5) MMAF-TEG = MMAF con tetraetilenglicol esterificado a la fenilalanina MMAF-NtBu = N-t-butilo, unido como amida al C-terminal de MMAF DM1 = N(21 ) -desacetil-N(21 ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina DM3 = (2 ' ) -desacetÍ1-N2- (4-mercapto-l-oxopentil) -maitansina DM4 = (21 ) -desacetÍ1-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina Otras abreviaturas son las siguientes: AE es auristatina E, Boc es N- ( t-butoxicarbonil) , cit es citrulina, dap es dolaproina, DCC es 1 , 3-diciclohexilcarbodiimida, DCM es diclorometano, DEA es dietilamina, DEAD es dietilazodicarboxilato, DEPC es dietilfosforilcianidato, DIAD es diisopropilazodicarboxilato, DIEA es N,N-diisopropiletilamina, dil es dolaisoleucina , DMA es dimetilacetamida , DMAP es 4-dimetilaminopiridina , DMÉ es etilenglicol dimetil éter (o 1 , 2-dimetoxietano) , DMF es N,N-dimetilformamida, DMSO es dimetilsulfóxido, doe es dolafenina, ov es N, N-dimetilvalina , DTNB es 5 , 5 ' -ditiobes (ácido 2-nitrobenzoico) , DTPA es ácido dietilentriaminopentaacético, DTT es ditiotreitol , EDCI es clorhidrato de l-d3-dimetilaminopropil ) -3-etilcarbodiimida, EEDQ es 2-etoxi-l-etoxicarbonil-1, 2-dihidroquinolina, ES-MS es espectrometría de masa por electroaspersión, EtOAc es acetato de etilo, Fmoc es N- (9-fluorenilmetoxicarbonilo) , gly es glicina, HATU es hexafluorofosfato 0- (7-azabenzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?'-tetrametiluronio, HOBt es 1-hidroxibenzotriazol , HPLC es cromatografía líquida de alta presión, ile es isoleucina, lys es lisina, MeCN (CH3CN) es acetonitrilo, MeOH es metanol, Mtr es 4-anesildifenilmetilo (o 4-metoxitritilo) , ñor es (1S, 2R) - (+) -norefedrina, PBS es solución salina regulada en pH con fosfato (pH 7.4), PEG es polietilenglicol , Ph es fenilo, Pnp es p-nitrofenilo, MC es 6-maleimidocaproilo, phe es L-fenilalanina, PyBrop es hexafluorofosfato bromo 3-pirrolidino fosfonio, SEC es cromatografía por exclusión de tamaño, Su es succinimida, TFA es ácido trifluoroacético, TLC es cromatografía en capa delgada, UV es ultravioleta, y val es valina .
Un "aminoácido de cisteína libre" se refiere a un residuo de aminoácido de cisteína que ha sido manipulado genéticamente en un anticuerpo original, tiene un grupo funcional tiol (-SH) , y no está apareado como un puente disulfuro intramolecular o intermolecular.
El término "valor de reactividad de tiol" es una caracterización cuantitativa de la reactividad de los aminoácidos de cisteína libres. El valor de reactividad de tiol es el porcentaje de un aminoácido de cisteína libre en un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína que reacciona con un agente reactivo con tiol, y se convierte a un valor máximo de 1. Por ejemplo, un aminoácido de cisteína libre en un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína que reacciona con 100% de rendimiento con un agente reactivo con tiol, tal como un reactivo de biotina-maleimida, para formar un anticuerpo marcado con biotina tiene un valor de reactividad de tiol de 1.0. Otro aminoácido de cisteína manipulado genéticamente en el mismo o diferente anticuerpo original que reacciona con 80% de rendimiento con un agente reactivo con tiol tiene un valor de reactividad de tiol de 0.8. Otro aminoácido de cisteína manipulado genéticamente en el mismo o diferente anticuerpo original que falla totalmente en reaccionar con un agente reactivo con tiol tiene un valor de reactividad de tiol de 0. La determinación del valor de reactividad de tiol de una cisteína particular se puede realizar por ensayo ELISA, espectrometría de masa, cromatografía líquida, auto-radiografía u otros ensayos analíticos cuantitativos.
Un "anticuerpo original" es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la que uno o más residuos de aminoácidos están reemplazados por uno o más residuos de cisteína. El anticuerpo original puede comprender una secuencia nativa o tipo silvestre. El anticuerpo original puede tener modificaciones de la secuencia de aminoácidos preexistentes (tales como adiciones, supresiones y/o sustituciones) respecto de otras formas nativas, tipo silvestre, o modificadas de un anticuerpo. Un anticuerpo original se puede dirigir contra un antígeno objetivo de interés, por ejemplo un polipéptido biológicamente importante. También se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipéptidos (tales como antígenos de glicolípidos asociados al tumor; ver US 5091178) .
Tabla 1 /* * * C-C increased from 12 to 15 * Z is average of EQ * B is average of ND * match with stop is _M; stop-stop = 0; J (joker) match = 0 */ #defíne _M -8 /* valué of a match with a stop */ int _day[26][26] = { /* A B C D E F G H I J L M N O P Q R S T U V W X Y Z*/ /* A*/ 2, 0,-2, 0, 0,-4, 1 ,- 1 ,- 1 , 0,- 1 ,-2,- 1 , 0,_M, 1 , 0,-2, 1 , 1 , 0, 0,-6, 0,-3 , 0}, /*B*/ 0, 3,-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 0, 0, 0,-2,-5, 0,-3, 1], /*C */ [-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2, 0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8, 0, 0,-5}, /*D*/ 0, 3,-5, 4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0-4,-3, 2,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2}, /*E*/ 0, 2,-5, 3, 4,-5, 0, 1 ,-2, 0, 0.-3,-2, 1 ,_M,-1 , 2,-1 , 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 3}, /* p */ .4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1, 0,-5, 2, 0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1, 0, 0, 7,-5}, l*Q*¡ 1, 0,-3, 1, 0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0,_M,-l,-l,-3, 1,0, 0,-1,-7, 0,-5, 0}, I * H */ -1, 1,-3, 1, 1,-2,-2, 6,-2, 0, 0,-2,-2, 2,_M, 0, 3, 2,-1,-1.0,-2,-3, 0, 0, 2}, 1*1*1 -1,-2,-2,-2,-2, 1,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-2,-2,-2,-l, 0, 0, ,-5, 0,-1,-2}, 1*1*1 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /*K*I [-1, 0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1,_M,-1, 1,3,0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0}, /*L*/ (-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-l, 0, 2,-2, 0,-1,-2}, /*M*/ (-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6,-2,_M,-2,-l, 0,-2,-1, 0, 2,-4, 0,-2,-1}, /*N*/ 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 1, 0, 0,-2,-4, 0,-2, 1}, 1*0*1 _M,_M,_M,_ ,_M,_M,_ ,_M,_M,_M^ I* p */ 1,-1,-3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-1, -3,-2,- 1,_M, 6, 0, 0, 1, 0, 0,-1,-6, 0,-5, 0}, /*Q */ 0, 1,-5,2, 2,-5,-1,3,-2, 0, 1,-2,-1, 1,_ , 0,4, 1,-1,-1,0,-2,-5,0,-4,3}, /*R*/ -2, 0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0,_M, 0, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0}, /*S */ 1,0, 0,0, 0,-3, 1,-1,-1,0, 0,-3,-2, 1,_M, 1,-1,0, 2, 1,0,-1,-2, 0,-3,0}, /* f */ 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1,-1, 0,_M, 0,-1,-1, 1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0}, /*u*/ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* Y */ 0,-2,-2,-2,-2,-1 ,-1 ,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-l ,-2,-2,-1 , 0, 0, 4,-6, 0,-2,-2}, /* W*/ -6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4 ,_M,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6}, l*X*l 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* Y */ -3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0,-4,-1, -2,-2,_ ,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0, 0,10,-4}, /* Z */ 0, 1 ,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,- 1 , 1 ,_M, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4} Tabla 1 (cont.) /* */ #include <stdio.h> #include <ctype.h> #define MAXJ P 16 /* max jumps in a diag */ #define MAXGAP 24 /* don't continué to penalize gaps larger than this */ #define JMPS 1024 /* max jmps in an path */ #define MX 4 /* save if there's at least MX-1 bases since last jmp */ #define DMAT 3 /* valué of matching bases */ #defíne DMIS 0 /* penalty for mismatched bases */ #define DINSO 8 /* penalty for a gap */ #defíne D1NS1 1 /* penalty per base */ #define PINSO 8 /* penalty for a gap */ #defíne P1NS1 4 /* penalty per residue */ struct jmp { short n[MAXJMP]; /* size of jmp (neg for dely) */ unsigned short x[MAXJMP]; /* base no. of jmp in seq x */ }; /* limits seq to 2A16 -l */ struct diag { int score; /* score at last jmp */ long offset; /* offset of prev block */ short ijmp; /* current jmp index */ struct jmp jp; /* list of jmps */ ); struct path { int spc; /' * number of leading spaces */ short n[JMPS];/* size of jmp (gap) */ int x[JMPS];/* loc of jmp (last elem before gap) */ }; char *ofile; /* output file ñame */ char *namex[2]; /* seq ñames: getseqs() */ char *prog; /* prog ñame for err msgs */ char *seqx[2]; /* seqs: getseqsfj */ int dmax; /* best diag: nw() */ int dmaxO; /* final diag */ int dna; /* set if dna: main() */ int endgaps; /* set if penalizing end gaps */ int gapx, gapy; /* total gaps in seqs */ int lenO, lenl ; /* seq lens */ int ngapx, ngapy; /* total size of gaps */ int smax; /* max score: nw() */ int *xbm; /* bitmap for matching */ long offset; /* current offset in jmp file */ struct diag *dx; /* holds diagonals */ struct path PP[¾; /* holds path for seqs */ char *calloc(), *malloc(), *¡ndex(), *strcpy(); char *getseq(), *g_calloc(); Tabla 1 (cont.) /* Needleman-Wunsch alignment program * * usage: progs filel file2 * where filel and file2 are two dna or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity * Any lines beginning with ';', '>' or '<' are ignored * Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct) * A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA * Output is in the file "align.out" * * The program may créate a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
* Original versión developed under BSD 4.3 on a vax 8650 */ #include "nw.h" #include "day.h" static _dbval[26] = { 1 ,14,2, 13,0,0,4,1 1 ,0,0, 12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0 }; static _pbval[26] = { 1 , 2|(1«(,D'-'A'))|(1«('N,-,A'))> 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1 «10, 1«1 1 , 1«12, 1«13, 1«14, 1 «15, 1«16, 1«17, 1 «18, 1«19, 1«20, 1«21 , 1«22, 1«23, 1«24, 1«25|(1«('E,-'A'))|(1«('Q'-'A')) main(ac, av) ITl in int ac; char *av[]; { prog = av[0]; if (ac != 3) { fprintf(stderr,"usage: s filel file2\n", prog); fprintf(stderr,"where filel and file2 are two dna or two protein seqiiencesAn"); fprintf(stderr,"The sequences can be in upper- or lower-case\n"); fprintf(stderr,"Any lines beginning with ';' or '<' are ignored\n"); fprintf(stderr,"Output is in the file \"align.out\"\n"); exit(l); } namex[0] = av[l]; namex[l] = av[2]; seqx[0] = getseq(namex[0], &len0); seqx[l] = getseq(namex[ l], &lenl); xbm = (dna)? .dbval : _pbval; endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps */ ofile = "align.out"; /* output file */ nw(); /* fill in the matrix, get the possible jmps */ readjmps(); /* get the actual jmps */ printO; /* print stats, alignment */ cleanup(O); /* unlink any tmp files */} Tabla 1 (cont.) /* do the alignment, return best score: main() * dna: valúes in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: PAM 250 valúes * When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer * a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y. */ nw() nw { char *px, *py; /* seqs and ptrs */ int *ndely, *dely; /* keep track of dely */ ¡nt ndelx, delx; /* keep track of delx */ int *tmp; /* for swapping rowO, rowl */ ¡nt mis; /* score for each type */ int insO, insl ; /* insertion pcnalties */ register id; /* diagonal index */ register ij; /* jmp index */ register *col0, *coll ; /* score for curr, last row */ register xx, yy; /* index into seqs */ dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags", lenO+lenl+1 , sizeof(struct diag)); ndely = (int *)g_calloc("to get ndely", lenl+1, sizeof(int)); dely = (int *)g_calloc("to get dely", lenl+1 , sizeof(int)); colO = (int *)g_calloc("to get colO", lenl+1 , sizeof(int)); coll = (int *)g_calloc("to get col 1 ", len l+1 , sizeof(int)); insO = (dna)? DINSO : PINSO; insl = (dna)? DINS 1 : PINS1 ; smax = -10000; if (endgaps) { for (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1 ; yy <= lenl ; yy++) { col0[yy] = dely[yy] = col0[yy-l] - insl ; ndely[yy] = yy; } col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ I else for (yy = 1 ; yy <= len 1 ; yy++) delyfyy] = -insO; /* fill in match matrix */ for (px = seqx[0], xx = 1 ; xx <= lenO; px++, xx++) { /* initialize first entry in col */ if (endgaps) { if (xx == 1) col l [0] = delx = -(insO+insl); else col 1 [0] = delx = col0[0] - insl ; ndelx = xx; else { col l [0] = 0; delx = -insO; ndelx = 0; ...n seqx[l], yy = 1 ; yy <= lenl ; py++, yy++) { mis = col0[yy-l]; if (dna) mis += (xbm[*px-'A'](&xbm[*py-'A'])? DMAT : D IS; else mis += _dayt*px-'A'][*py-'A']; /* update penalty for del in x seq; * favor new del over ongong del * ignore MAXGAP if weighting endgaps */ if (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) { if (col0[yy] - insO >= delyfyy]) { delyfyy] = col0[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1 ; } else { delyfyy] -= insl ; ndely[yy]++; } } else { if (col0[yy] - (insO+insl) >= dely[yy]) { delyfyy] = colO[yy] - (insO+insl); ndelyfyy] = 1 ; } else ndely[yy]++; } /* update penalty for del in y seq; * favor new del over ongong del */ if (endgaps || ndelx < AXGAP) { if (col 1 [yy- 1 ] - insO >= delx) { delx = col 1 [yy- 1 ] - (insO+ins 1 ); ndelx = 1 ; } else { delx -= insl ; ndelx++; } } else { if (coll [yy-l] - (insO+insl) >= delx) { delx = col l [yy-l ] - (insO+insl ); ndelx = 1 ; } else ndelx++; } /* pick the máximum score; we're favoring * mis over any del and delx over dely */ id = xx - yy + len l - 1 ; if (mis >= delx && mis >= delyfyy]) col l fyy] = mis; 25 a 1 (cont.) else if (delx >= dely[yy]) { collfyy] = delx; ij = dx[id].ijmp; if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) { dx[id].ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id]. offset = offset; offset += sizeof(struct jmp) + sizeof (offset); } } dx[id].jp.n[ij] = ndelx; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id].score = delx; ) else { col l [yy] = dely[yy]; ij = dx[id].ijmp; if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndely[yy] >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DlNSO)) { dx[id].ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id], offset = offset; offset += sizeof (struct jmp) + sizeof(offset); dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy]; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id].score = delyfyy]; } if (xx == lenO && yy < lenl) { /* last col */ if (endgaps) coll[yy] -= insO+insl *(lenl-yy); if (col 1 [yy] > smax) { smax = coll [yy]; dmax = id; } } } if (endgaps && xx < lenO) col l [yy-l ] -= insO+insl*(!enO-xx); if (col 1 [yy- 1 ] > smax) { smax = col l [yy-l]; dmax = id; } tmp = colO; colO = col 1 ; col 1 = tmp; } (void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); (void) free((char *)col0); (void) free((char *)col l); } Tabla 1 (cont.) * printO - only routine visible outside this module * * static: * getmat()— trace back best path, count matches: print() * pr_align()— print alignment of described in array p[]: print() * dumpblockO -- dump a block of lines with numbers, stars: pr_align() * nums() -- put out a number line: dumpblockO * putline() - put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblockO * starsO - -put a line of stars: dumpblockO * stripnameO ~ strip any path and prefix from a seqname */ #include "nw.h" #define SPC 3 #define P_L1NE 256 /* máximum output line */ #define P_SPC 3 /* space between name or num and seq */ extern _day[26][26]; ¡nt olen; /* set output line length */ FILE *fx; /* output file */ primo print { int lx, ly, firstgap, lastgap; /* overlap */ if ((fx = fopen(ofile, "w")) == 0) { fprintf(stderr,"%s: can't write %s\n", prog, ofile); cleanup(l); } fprintf(fx, "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[0], lenO); fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = d)\n", namex[ l], lenl); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl ; firstgap = lastgap = 0; if (dmax < lenl - 1) { /* leading gap in x */ pp[0].spc = firstgap = lenl - dmax - 1 ; ly -= pp[0].spc; 1 else if (dmax > lenl - 1) { /* leading gap in y */ pp[l].spc = firstgap = dmax - (lenl - 1); lx -= pp[l ].spc; ) if (dmaxO < lenO - I) { /* trailing gap in x */ lastgap = lenO - dmaxO - 1 ; lx -= lastgap; else if (dmaxO > lenO - 1) { /* trailing gap in y */ lastgap = dmaxO - (lenO - 1); ly -= lastgap; } getmatQx, ly, firstgap, lastgap); pr_align(); } Tabla 1 (cont . ) /* * trace back the best path, count matches */ static getmat(lx, ly, firstgap, lastgap) int lx, ly; /* "core" (minus endgaps) */ int firstgap, lastgap; /* leading trailing overlap */ { int nm, ¡0, il , sizO, sizl ; char outx[32]; double pct; register ??, n 1 ; register char *p0, *pl ; /* get total matches, score */ iO = il = sizO = sizl = 0; pO = seqx[0] + pp[l].spc; pl = seqx[l] + pp[0].spc; nO = pp[l].spc + 1 ; ni = pp[0].spc + 1 ; nm = 0; while ( *pO && *pl ) { if (sizO) { pl ++; nl++; sizO-; } else if (sizl) { p0++ n0++ sizl- } else if (xbm[*pO-'A']&xbm[*pl-'A']) nm++; if (n0++ == pp[0].x[iO]) sizO = pp[0].n[iO++]; if (nl++ = pp[l].x[i l]) sizl = pp[l].n[i l++]; p0++; pl++; /* pct homology: * if penalizing endgaps, base is the shorter seq * else, knock off overhangs and take shorter core */ if (endgaps) lx = (lenO < lenl )? lenO : lenl ; else lx = (lx < ly)? lx : ly; pct = 100.*(double)nm/(double)lx; fprinlf(fx, "\n"); fprintf(fx, "< d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarityVi nm, (nm— 1)? "" : "es", lx, pct); Tabla 1 (cont.) fprintf(fx, "<gaps in first sequence: %d", gapx); ..getmat if (gapx) { (void) sprintf(outx, " (%d %s%s)", ngapx, (dna)? "base":"residue", (ngapx == 1)? "":"s"); fprintf(fx,"%s", outx); fprintf(fx, ", gaps in second sequence: d", gapy); if (gapy) { (void) sprintf(outx, " (%d %s%s)", ngapy, (dna)? "base":"residue", (ngapy == 1 )? "":"s"); fprintf(fx," s", outx); if (dna) fprintf(fx, "\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base)\n", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS 1); clsc fprintf(fx, "\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = d + %d per residue)\n", smax, PINSO, P1NS 1); if (endgaps) fprintf(fx, "<endgaps penalized. left endgap: %d %s s, right endgap: %d %s%s\n", firstgap, (dna)? "base" : "residue", (firstgap == 1)? "" : "s", lastgap, (dna)? "base" : "residue", (lastgap == 1)? "" : "s"); else fprintf(fx, "<endgaps not penalized\n"); static nm; /* matches in core— for checking */ static lmax; /* lengths of stripped file ñames */ static ij[2]; /* jmp índex for a path */ static nc[2J; /* number at start of current line */ static ni[2]; /* current elem number— for gapping */ static siz[2]; static char *ps[2]; /* ptr to current element */ static char *po[2]; /* ptr to next output char slot */ static char out[2][P_LINE]; /* output line */ static char star[P_LINE]; /* set by stars() */ /* * print alignment of described in struct path pp[] */ static pr_align() pr_align { int nn; /* char count */ int more; register i; for (i = 0, lmax = 0; i < 2; i++) { nn = stripname(namex[i]); if (nn > lmax) lmax = nn; nc[i] = 1 ; ni[i] = l ; siz[i] = ij[i] - 0; ps[i] = seqx[i]; po[i] = out[i]; Tabla 1 (cont.) for (nn = nm = 0, more = 1 ; more; ) { ...pr_align for (i = more = 0; i < 2; i++) { /* * do we have more of this sequence? */ ¡f (!*ps[i]) continué; more++; if (pp[i].spc) { /* leading space */ *po[i]++ = ' '; pp[i].spc--; } else if (siz[i]) { /* in a gap */ *po[i]++ = siz[i]~; } else { /* we're putting a seq element */ *po[i] = *ps[i]; if (islower(*ps[i])) *ps[i] = toupper(*ps[i]); po[i]++; ps[i]++; /* * are we at next gap for this seq? */ if (ni[i] = pp[i].x[ij[i]]) { /* * we need to merge all gaps * at this location */ siz[i] = pp[i].n[ij[i]++]; while (ni[i] == pp[i].x[¡j[i]]) siz[¡] += pp[i].n[ij[i]++]; ) ni[i]++; if (++nn == olen || !more && nn) { dumpblock(); for (i = 0; i < 2; i++) po[i] = out[i]; nn = 0; } /* * dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align() */ static dumpbiocko dumpblock { register i; for (i = 0; i < 2; i++) *po[i]-- = '\0'; Tabla 1 (cont.) ...dumpblock (void) putcCXn', fx); for (i = 0; i < 2; i++) { if (*out[i] && (*out[i] != " II *(po[i]) != ' ')) { if(i==0) nums(i); if(i = 0&& *out[l]) stars(); putline(i); if(¡ = 0&& *out[l]) fprintf(fx, star); ¡f(i==l) nums(i); /* * put out a number line: dumpblock() */ static nums(ix) ¡nt ix; /* index in out[] holding seq line */ { char nline[P_LINE]; register register char *pn, *px, *py; for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++) *pn = ' '; for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++, pn++) { if (*py == · · *py == '-') *pn = ' '; else { if (i%10 = 0||(¡ = 1 &&nc[ix] != 1)) { j = (i<0)?-i : i; for (px = pn; j; j /= 10, px-) *px=j%10 + '0'; if(i<0) *px = '-'; else *pn : } *pn = '\0'; nc[ix] = i; for (pn = nline; *pn; pn++) (void) putc(*pn, fx); (void) putean', fx); } /* * put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblock() */ static putline(ix) putline int ix; { Tabla 1 (cont.) ...putline int i; register char *px; for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px != ':'; px++, i++) (void) putc(*px, fx); for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc(' ', fx); /* these count from 1 : * ni[] is current element (from 1) * nc[] is number at start of current line */ for (px = out[ix]; *px; px++) (void) putc(*px&0x7F, fx); (void) putean', fx); } /* * put a line of stars (seqs always in out[0], out[l]): dumpblockO */ static stars() stars { int i; register char *p0, *pl , ex, *px; if (!*out[0] II (*out[0] == " && *(po[0]) == ' ') II !*out[ l ] II (*out[l ] == " && *(po[l]) == ' ')) return; px = star; for (i = lmax+P_SPC; i; i--) *px++ = ' '; for (p0 = out[0], p l = out[ l]; *p0 && *pl ; p0++, pl++) { if (isalpha(*pO) && isalpha(*pl)) { if (xbm[*pO-'A']&xbm[*pl-'A']) { ex = '*'; nm++; } else if (!dna && _day[*pO-'A'][*pl-'A'] > 0) ex = '.'; else ex = ' '; } else ex = "; *px++ = ex; Tabla 1 (cont.) /* * strip path or prefix from pn, return len: pr_align() */ static stripname(pn) stripname char *pn; /* file ñame (may be path) */ { register char *px, *py; py = 0; for (px = pn; *px; px++) if (*px == '/') py = px + 1 ; if (py) (void) strcpy(pn, py); return(strlen(pn)); /* * cleanupO— cleanup any tmp file * getseqO— read ¡n seq, set dna, len, maxlen * g_calloc() - callocO ith error checkin * readjmpsO - get the good jmps, from tmp file ¡f necessary * writejmpsO -- write a filled array of jmps to a tmp file: nw() */ #include "nw.h" #include <sys/file.h> char *jname = "/tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps */ FILE *fj; int cleanupO; /* cleanup tmp file */ long IseekQ; /* * remove any tmp file if we blow */ cleanup(i) cleanup int i; if (fj) (void) unlink(jname); exit(i); } /* * read, return ptr to seq, set dna, len, maxlen * skip lines starting with ';', '<', or '>' * seq in upper or lower case */ char * getseq(file, len) getseq char *file; /* file ñame */ int *len; /* seq len */ char line
[1024], *pseq; register char *px, *py; int natgc, tlen; FILE *fp; Tabla 1 (cont.) if ((fp = fopen(file,"r")) = 0) { fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file); exit(l); } tlen = natgc = 0; while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line == ';' || *line == '<' || *line = '>') continué; for (px = line; *px != '\?'; px++) if (isupper(*px) || islower(*px)) tlen++; } if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) == 0) { fprintf(stderr,"%s: malloc() failed to get d bytes for %s\n", prog, tlen+6, file); exit(l); 1 pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = '\0'; .getseq py = pseq + 4; *len = tlen; rewind(fp); while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line == ';' || *line == '<' || *line = '>') continué; for (px = line; *px != '\?'; px++) { if (isupper(*px)) *py++ = *px; else if (islower(*px)) *py++ = toupper(*px); if (index("ATGCU",*(py-l))) natgc++; *py++ = '\0'; *py = '\0'; (void) fclose(fp); dna = natgc > (tlen/3); return(pseq+4); char * g_calloc(msg, nx, sz) g_calloc char *msg; /* program, calling routine */ int nx, sz; /* number and size of elements */ char *px, *calloc(); if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) == 0) { if (*msg) { fprintf(stderr, "%s: g_calloc() failed %s (n=%d, sz= d)\n", prog, msg, nx, sz); exit(l); return(px); : get final jmps from dx[] or tmp file, set pp[], reset dmax: main() */ Tabla 1 (cont.) readjmpsO readjmps { int fd = -l ; int siz. i0. i l ; register i, j, xx; if (fj) { " (vnid) fclose(fj); if ((fd = open(jname, 0_RDONLY, 0)) < 0) { fprintf(stderr, "%s: can't open() %s\n", prog, jname); cleanup(l); } } for (i = iO = i 1 = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO; ; i++) { while (l) { for j = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] >= xx; j--) ...readjmps if 0 < 0 && dx[dmax].offset && fj) { I Q (void) lseek(fd, dx[dmax], offset, 0); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax].jp, sizeof(struct jmp)); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax]. offset, sizeof(dx[dmax]. offset)); dx[dmax].ijmp = MAXJMP-l ; } else break; } if (i >= JMPS) { fprintf(stderr, "%s: too many gaps in alignmentVi", prog); cleanup(l); \ if (j >= 0) { siz = dx[dmax].jp.n[j]; xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax += siz; if (siz < 0) { /* gap in second seq */ pp[l].n[il] = -siz; xx += siz; /* id = xx - yy + lenl - 1 */ pp[l ].x[i l] = xx - dmax + lenl - 1 ; gapy++; ngapy -= siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz : MAXGAP; il ++; í 20 else if (siz > 0) { /* gap in fírst seq */ pp[0].n[i0] = siz; pp[0].x[i0] = xx; gapx++; ngapx += siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? siz : MAXGAP; i0++; else break; 25 > Tabla 1 (cont.) /* reverse the order of jmps */ for (j = 0, i0--; j < iO; j++, iO--) { i = PP[0].n[j]; pp[0].n[j] = pp[0].n[i0]; pp[0].n[iO] = i > = PP[0].x[j]; pp[0].x(j] = pp[0].x[iO]; pp[0].x[iO] = i } for Q = 0, i l-; j < il ; j++, il--) { i = pp[l].n[j]; pp[l].n[j] = pp[l].n[il]; pp[l].n[il] = i i = PP[l].x[j]; pp[l] xü] = pp[l].x[il]; PPDl.xfil] = i } if (fd >= 0) (void) close(fd); if (fj) { (void) unlink(jname); f) = 0; offset = 0; } /* * write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw() */ writejmps(ix) WritejlTipS int ix; { char *mktemp(); if (!fj) { if (mktemp(jname) < 0) { fprintf(stdcrr, "%s: can't mktemp() s\n", prog, jname); cleanup(l); } if ((fj = fopen(jname, "w")) == 0) { fprintf(stderr, "%s: can't write %s\n", prog, jname); exit(l); } (void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1 , fj); (void) fwrite((char *)&dx[ix] .offset, sizeof(dx[ix] .offset), 1 , fj); III. Composiciones y métodos de la invención La invención proporciona anticuerpos anti-FcRH5 o fragmentos funcionales de estos, y su método de uso en el tratamiento de tumores hematopoyét icos .
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une, con preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o a continuación.
Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, que incluye Fab, Fab ' , F (ab 1 ) 2 y fragmento de Fv, diacuerpo, anticuerpo de dominio único, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena simple o anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de un polipéptido del anticuerpo anti-FcRH5 a su epítopo antigénico respectivo. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente se pueden conjugar a un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, que incluye, por ejemplo, una auristatina, un maitansinoide , un derivado de dolostatina o una cal i cheami c ina , un antibiótico, un isótopo radiactivo, una enzima nuc leol í t ica , o similares. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente se pueden producir en las células CHO o células bacterianas y con preferencia inducen la muerte de una célula a la que se unen. Para los fines de detección, los anticuerpos de la presente invención se pueden marcar en forma detectable, unir a un soporte sólido, o similares.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad monovalente del anticuerpo a FcRH5 (por ejemplo afinidad del anticuerpo como fragmento Fab a FcRH5) es sus t anc ialment e la misma que la afinidad monovalente de un anticuerpo humano (por ejemplo afinidad del anticuerpo humano como fragmento Fab a FcRH5) o un anticuerpo quimérico (por ejemplo afinidad del anticuerpo quimérico como fragmento Fab a FcRH5) , que comprende, consiste o consiste esencialmente en una cadena ligera y un dominio variable de la secuencia de cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad monovalente del anticuerpo a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como fragmento Fab a FcRH5) es menor, por ejemplo al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 veces menor, que la afinidad monovalente de un anticuerpo humano (por ejemplo, afinidad del anticuerpo humano como fragmento Fab a FcRH5) o un anticuerpo quimérico (por ejemplo, afinidad del anticuerpo quimérico como fragmento Fab a FcRH5) , que comprende, consiste o consiste esencialmente en una cadena ligera y dominio variable de la secuencia de cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad monovalente del anticuerpo a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como fragmento Fab a FcRH5) es mayor, por ejemplo al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces mayor, que la afinidad monovalente de un anticuerpo humano (por ejemplo, afinidad del anticuerpo humano como fragmento Fab a FcRH5) o un anticuerpo quimérico (por ejemplo afinidad del anticuerpo quimérico como fragmento Fab a FcRH5) , que comprende, consiste o consiste esencialmente en una cadena ligera y dominio variable de la secuencia de cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO : 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es sustancialmente igual a la afinidad de un anticuerpo humano (por ejemplo afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) o un anticuerpo quimérico (por ejemplo afinidad del anticuerpo quimérico como fragmento Fab a FcRH5) en su forma bivalente, que comprende, consiste o consiste esencialmente en una cadena ligera y dominio variable de la secuencia de cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es menor, por ejemplo al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 veces menor, que la afinidad de un anticuerpo humano (por ejemplo afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) o un anticuerpo quimérico (por ejemplo afinidad del anticuerpo quimérico como un fragmento de IgG a FcRH5) en su forma bivalente, que comprende, consiste o consiste esencialmente en una cadena ligera y dominio variable de la secuencia de cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es mayor, por ejemplo al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Ó 10 veces mayor, que la afinidad de un anticuerpo humano (por ejemplo afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) o un anticuerpo quimérico (por ejemplo afinidad del anticuerpo quimérico como un fragmento de IgG a FcRH5) en su forma bivalente, que comprende, consiste o consiste esencialmente en una cadena ligera y dominio variable de la secuencia de cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.4 Nm. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.4 nM +/- 0.04.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.3 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.32 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.36 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.4 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.44 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.48 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.5 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.3 nM y 0.5 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0,32 nM y 0.48 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.36 nM y O .44 nM.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.2 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.2 nM +/- 0.02.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.1 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.12 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.14 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.16 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Fc H5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.18 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.2 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.22 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.24 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.26 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.28 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0,30 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.1 nM y 0.3 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.12 nM y 0.28 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.14 nM y 0.26 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.16 nM y 0.24 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.18 nM y 0.22 nM .
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.5 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.5 nM +/- 0.1.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su. forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.4 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.5 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.6 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) es 0.7 nM o mejor. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.3 nM y 0.7 nM . En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.4 nM y 0.6 nM. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado en donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a FcRH5 (por ejemplo, afinidad del anticuerpo como una IgG a FcRH5) está entre 0.5 nM y 0.55 nM.
En un aspecto, la afinidad monovalente del anticuerpo humano a FcRH5 es sustancialmente igual a la afinidad de unión de un fragmento Fab que comprende secuencias del dominio variable de la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
Como está bien establecido en la técnica, la afinidad de unión de un ligando a su receptor se puede determinar usando alguno de una variedad de ensayos, y expresar en términos de una variedad de valores cuantitativos. Por consiguiente, en una modalidad, la afinidad de unión se expresa como valores Kd y refleja la afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados) . En general y con preferencia, la afinidad de unión se mide in vi tro, sea un escenario libre de células o asociado a células.
Como se describe en mayor detalle en la presente, la diferencia de veces en la afinidad de unión se puede cuantificar en términos de la relación del valor de afinidad de unión monovalente de un anticuerpo humanizado (por ejemplo, en forma de Fab) y el valor de afinidad de unión monovalente de un anticuerpo de referencia/comparador (por ejemplo, en la forma de Fab) (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene secuencias de la región hipervariable dadora) , en donde los valores de afinidad de unión se determinan en condiciones de ensayo similares. En consecuencia, en una modalidad, la diferencia de veces en la afinidad de unión se determina como la relación de los valores de Kd del anticuerpo humanizado en forma de Fab y el anticuerpo Fab referencia/comparador. Por ejemplo, en una modalidad, si un anticuerpo de la invención (A) tiene una afinidad que es "3 veces menor" que la afinidad de un anticuerpo de referencia (M) , entonces si el valor de Kd para A es 3x, el valor de Kd de M debe ser lx, y la relación de Kd de A a Kd de M debe ser 3:1. A la inversa, en una modalidad, si un anticuerpo de la invención (C) tiene una afinidad que es "3 veces mayor" que la afinidad de un anticuerpo de referencia (R) , entonces si el valor de Kd para C es lx, el valor de Kd de R debe ser 3x, y la relación de Kd de C a Kd de R debe ser 1:3. Numerosos ensayos conocidos en la técnica, que incluye los descritos en la presente, se pueden usar para obtener las mediciones de la afinidad de unión, que incluye, por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA) y ELISA.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une al FcRH5, en donde el anticuerpo comprende: (a) al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas del grupo que consiste en: (i) HVR-L1 que comprende la secuencia ASQDVSTAVA (SEC ID NO : 26) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia SASYRYT (SEC ID NO: 27) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia QQHFSSPRT (SEC ID NO: 28) (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia GFTFSSYAVS (SEC ID NO: 35) (v) HVR-H2 que comprende la secuencia ATISSGGSLTFILDSVR (SEC ID NO: 36) y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia PIPDYYALDY (SEC ID NO : 37) .
En una modalidad, la HVR-L1 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 26. En una modalidad, la HVR-L2 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 27. En una modalidad, la HVR-L3 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 28. En una modalidad, la HVR-H1 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 35. En una modalidad, la HVR-H2 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 36. En una modalidad, la HVR-H3 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37. En una modalidad, un anticuerpo de la invención que comprende estas secuencias (en combinación como se describe en la presente) es humanizado o humano.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une al FcRH5, en donde el anticuerpo comprende: (a) al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas del grupo que consiste en: (i) HVR-L1 que comprende la secuencia KASQDVSTAVA (SEC ID NO: 26) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia SASYRYT (SEC ID NO: 27) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia QQHFSSPRT (SEC ID NO: 28) (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia GFTFSSYAVS (SEC ID NO : 35) (v) HVR-H2 que comprende la secuencia ATISSGGSLTFILDSVR (SEC ID NO : 36) y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia PIPDYYALDY (SEC ID NO: 37); y (b) al menos una variante de HVR en donde la secuencia de la variante de HVR comprende la modificación de al menos un residuo de la secuencia representada en la SEC ID NOs: 26, 27, 28, 35, 36 ó 37. En una modalidad, la HVR-L1 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 26. En una modalidad, la HVR-L2 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 27. En una modalidad, la HVR-L3 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 28. En una modalidad, la HVR-H1 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 35. En una modalidad, la HVR-H2 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 36. En una modalidad, la HVR-H3 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de la SEC ID NO: 37. En una modalidad, un anticuerpo de la invención que comprende estas secuencias (en combinación como se describe en la presente) es humanizado o humano.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR, en donde cada HVR comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 26, 27, 28, 35, 36 ó 37, y en donde la SEC ID NO: 26 corresponde a una HVR-L1, SEC ID NO: 27 corresponde a HVR-L2 , SEC ID NO: 28 corresponde a una HVR-L3 , SEC ID NO: 35 corresponde a una HVR-H1, SEC ID NO: 36 corresponde a una HVR-H2 , y SEC ID NO: 37 corresponde a una HVR-H3. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende HVR-L1, la HVR-L2 , la HVR-L3 , la HVR-H1 , la HVR-H2 , y HVR-H3 , en donde cada una, en orden, comprende las SEC ID NO: 26, 27, 28, 35, 36 y 37.
Las variantes de HVR de un anticuerpo de la invención pueden tener modificaciones de uno o más residuos dentro de la HVR.
Un agente terapéutico para usar en un sujeto hospedero con preferencia induce poca a ninguna respuesta inmunogénica contra el agente en el sujeto. En una modalidad, la invención proporciona el agente. Por ejemplo, en una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que induce y/o se espera que induzca una respuesta al anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) a un nivel sustancialmente reducido en- comparación con un anticuerpo que comprende la secuencia de la SEC ID NO : 18 & 20 en un sujeto hospedero. En otro ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que induce y/o se espera que induzca respuesta mínima o ninguna al anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) . En un ejemplo, un anticuerpo de la invención induce una respuesta al anticuerpo anti-ratón que está en un nivel clínicamente aceptable o menor.
Un anticuerpo humanizado de la invención puede comprender una o más secuencias de la región no hipervariable humana y/o de consenso (por ejemplo, estructural) su dominio variable de la cadena pesada y/o ligera. En algunas modalidades, están una o más modificaciones adicionales dentro de las secuencias de la región no hipervariable humanas y/o de consenso humanas. En una modalidad, el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo de la invención comprende una secuencia estructural de consenso humana, que en una modalidad es la secuencia estructural de consenso del subgrupo III. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una variante de la secuencia estructural de consenso del subgrupo III modificada al menos en una posición de aminoácido. En una modalidad, el dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo de la invención comprende una secuencia estructural de consenso humana, que en una modalidad es la secuencia estructural de consenso ? . En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una variante de la secuencia estructural de consenso ? modificada en menos una posición de aminoácido.
Como es sabido en la técnica, y como se describe con mayor detalle en la presente a continuación, el diseño de la posición/límite de aminoácido de una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, de acuerdo con el contexto y las diversas definiciones conocidas en la técnica (como se describe a continuación) . Algunas posiciones de un dominio variable se pueden considerar como posiciones hipervariables híbridas ya que se estima que estas posiciones están dentro de la región hipervariable bajo un conjunto de criterios mientras que se estima que está fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones se pueden hallar en regiones hipervariables extendidas (como se describen adicionalmente más adelante) . La invención proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones es estas posiciones hipervariables híbridas. En una modalidad, estas posiciones hipervariables incluyen una o más posiciones 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 y 101-102 en un dominio variable de la cadena pesada. En una modalidad, estas posiciones hipervariables híbridas incluyen una o más posiciones 24-29, 35-36, 46-49, 56 y 97 en un dominio variable de la cadena ligera. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una una variante humana de la secuencia estructural de consenso del subgrupo humano modificada en una o más posiciones hipervariables híbridas.
En un aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una variante de la secuencia estructural de consenso del subgrupo III humano modificada en una o más de las posiciones 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 y 101.
En un aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende una variante de la secuencia estructural de consenso del subgrupo I kappa humano modificada en una o más de las posiciones 24, 27-29, 56 y 97.
En un aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende a variante de la secuencia estructural de consenso del subgrupo III humano modificada en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o todas las posiciones 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 y 101.
En un aspecto, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende una variante de la secuencia estructural de consenso del subgrupo I kappa humano modificada en 1 , 2, 3, 4, 5 o todas las posiciones 24, 27-29, 56 y 97.
Un anticuerpo de la invención puede comprender cualquiera de las secuencias estructurales de cadena ligera humana o de consenso humana, con la condición de que el anticuerpo exhiba las características biológicas deseadas (por ejemplo, una afinidad de unión deseada) . En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende al menos una porción (o el total) de la secuencia estructural de cadena ligera ? humana. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende al menos una porción (o el total) de secuencia de consenso estructural del subgrupo I ? humana.
En un aspecto, un anticuerpo de la invención comprende a dominio variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende secuencia estructural descrita en las Figuras 9-11.
En un aspecto, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado conjugado a un agente citotóxico. En un aspecto, el anticuerpo anti-FcRH5 humanizado conjugado a un agente citotóxico inhibe la progresión del tumor en xenoinjertos .
En un aspecto, el anticuerpo humanizado y el anticuerpo quimérico son monovalentes. En una modalidad, el anticuerpo humanizado y quimérico comprende una región de Fab única unida a una región de Fe. En una modalidad, el anticuerpo de referencia quimérico comprende las secuencias del dominio variable que se ilustran en la Figura 2 (SEC ID NO: 11) y la Figura 4 (SEC ID NO: 13) ligadas a una región de Fe humana. En una modalidad, la región de Fe humana es la de una IgG (por ejemplo, IgGl, 2, 3 ó 4) .
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, la HVR2-HC y/o HVR3-HC que se ilustra en las Figuras 9-11. En una modalidad, el dominio variable comprende la secuencia de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y/o FR4-HC que se ilustra en la Figuras 9-11. En una modalidad, el anticuerpo comprende la secuencia de CH1 y/o Fe que se ilustra en la Figura 11. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, la HVR2-HC y/o HVR3-HC Las Figuras 10-11, y la secuencia de FR1- HC, FR2-HC, FR3-HC y/o FR4-HC en las Figuras 10-11. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, la HVR2-HC y/o HVR3-HC de las Figuras 10-11, y la secuencia de CH1 y/o Fe que se ilustra en la Figura 11. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de HVR1-HC, la HVR2-HC y/o HVR3-HC en las Figuras 10-11, y la secuencia de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y/o FR4-HC en las Figuras 10-11, y la CH1 y/o Fe (Figura 11) .
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de HVR1-LC, la HVR2-LC y/o HVR3-LC que se ilustra en las Figuras 9 y 11. En una modalidad, el dominio variable comprende la secuencia de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y/o FR4-LC que se ilustra en las Figuras 9 y 11. En una modalidad, el anticuerpo comprende la secuencia de CL1 que sé ilustra en la Figura 11. En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de HVR1-LC, la HVR2-LC y/o HVR3-LC, y la secuencia de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y/o FR4-LC que se ilustra en las Figuras 9 y 11. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de HVR1-LC, la HVR2-LC y/o HVR3-LC, y la secuencia de CL1 que se ilustra en las Figuras 9 y 11. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de HVR1-LC, la HVR2-LC y/o HVR3-LC, y la secuencia de FRl-LC, FR2-LC, FR3-LC y/o FR4-LC que se ilustra en las Figuras 9 y 11, y la secuencia de CL1 que se ilustra en las Figura 11.
En un aspecto, los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína donde uno o más aminoácidos de un anticuerpo original ase reemplazan con un aminoácido de cisteína libre como se describe en WO2006/034488 ; US 2007/0092940 (que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . Cualquier forma de anticuerpo anti-FcRH5 también se puede manipular genéticamente, es decir, mutar. Por ejemplo, un fragmento Fab del anticuerpo original se puede manipular genéticamente para formar un Fab manipulado genéticamente en cisteína, denominado en la presente como "TioFab" . De modo similar, un anticuerpo monoclonal original se puede manipular genéticamente para formar un "TioMab." Cabe mencionar que una mutación de un solo sitio produce un solo residuo de cisteína manipulado genéticamente en un TioFab, a la vez que un solo sitio de mutación produce dos residuos de cisteína manipulados genéticamente en un TioMab, debido a la naturaleza dimérica del anticuerpo IgG . Los anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína de la invención incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos, y fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos, polipéptidos de fusión y análogos que unen con preferencia polipéptidos de FcRH5 asociados a células. Un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína alternativamente puede comprender un anticuerpo que comprende una cisteína en una posición descrita en la presente en el anticuerpo o el Fab, que provenga del diseño de la secuencia y/o la selección del anticuerpo, sin alterar necesariamente un anticuerpo original, tal como por diseño y selección de anticuerpo por despliegue en fago o a través del diseño de novo de las secuencias estructurales y regiones contantes de cadena ligera y/o cadena pesada. Un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína comprende uno o más aminoácidos de cisteína libre que tiene un valor de reactividad de tiol en los intervalos de 0.6 a 1.0; 0.7 a 1.0 ó 0.8 a 1.0. Un aminoácido de cisteína libre es un residuo de cisteína que ha sido manipulado genéticamente en el anticuerpo original y no es parte de un puente disulfuro. Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína son útiles para la unión de compuesto citotóxicos y/o de imágenes en el sitio de la cisteína manipulada genéticamente a través de, por ejemplo, una maleimida o haloacetilo. La reactividad nucleofílica del grupo funcional tiol de un residuo de Cys a un grupo maleimida es aproximadamente 1000 veces superior en comparación con cualquier otro grupo funcional de aminoácido de una proteína, tal como el grupo amino de los residuos de lisina o el grupo amino N-terminal. La funcionalidad específica del tiol en los reactivos de yodoacetilo y maleimida puede reaccionar con los grupos aminos, pero se requieren mayor pH (>9.0) y tiempos de reacción más largos (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres) .
En un aspecto, un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína de la invención comprende una cisteína manipulada genéticamente en una posición adecuada, donde la posición se numera de acuerdo con Kabat y otros, en la cadena ligera (ver Kabat y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) y de acuerdo con la numeración de EU en la cadena pesada (que incluye la región de Fe) (ver Kabat y otros. (1991), supra) .
En un aspecto, la invención incluye un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína comprende uno o más aminoácidos de cisteína libre en donde el anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína se une a un polipéptido de FcRH5 y se prepara para un proceso que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácidos de un anticuerpo anti-FcRH5 origina por cisteína en donde el anticuerpo original comprende al menos una secuencia de HVR descrita en la presente.
En un determinado aspecto, la invención trata de un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de aminoácidos, con un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, o un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína secuencia de aminoácidos que carece del péptido señal como se describe en la presente.
En otro aspecto más, la invención trata de un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que se híbrida con el complemento de una molécula de ADN que codifica (a) un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína que tiene a secuencia de aminoácidos de longitud completa como se describe en la presente, (b) a anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína secuencia de aminoácidos que carece del péptido señal como se describe en la presente, (c) un dominio extracelular de una proteína de transmembrana del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína, con o sin el péptido señal, como se describe en la presente, (d) una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente o (e) cualquier otro fragmento específicamente definido de un secuencia de aminoácidos del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de longitud completa como se describe en la presente.
En un aspecto específico, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína aislado sin la secuencia señal N-terminal y/o sin la metionina inicial y está codificada por una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos como se describe en la presente. Los procesos para producirlos también se describen en la presente, en donde estos procesos comprenden cultivar una célula hospedera que comprende un vector que comprende molécula de ácido nucleico codificadora apropiada en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína y recuperar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína del cultivo celular.
Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína aislado que tienen eliminado el dominio de transmembrana o inactivado el dominio de transmembrana. Los procesos para producirlos también se describen en la presente, en donde estos procesos comprenden cultivar una célula hospedera que comprende un vector que comprende molécula de ácido nucleico codificadora apropiada en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína y recuperar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína del cultivo celular.
En otros aspectos, la invención proporciona anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína quiméricos y aislados que comprenden cualquiera de los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína descritos en la presente fusionados a un polipéptido heterologo (no FcRH5) . Los ejemplos de las moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína fusionados a un polipéptido heterologo tal como, por ejemplo, una secuencia de la marca del epítopo o una región de Fe de una inmunoglobulina .
El anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína puede ser un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena simple o anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de un polipéptido del anticuerpo anti-FcRH5 a su respectivo epítopo antigénico. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente se pueden conjugar a un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tales como una toxina, que incluye, por ejemplo, una auristatina, un maitansinoide , un derivado de dolostatina o una calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radiactivo, una enzima nucleolítica , o similares. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente se pueden producir en células CHO o células bacterianas y con preferencia inhiben el crecimiento o proliferación o inducen la muerte de una célula a la que se unen. Para fines diagnósticos, los anticuerpos de la presente invención se puede marcar en forma detectable, unir a un soporte sólido, o similares.
En otros aspectos de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-FcRH5 y anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína descritos en la presente. También se proporcionan células hospederas que comprenden cualquiera de estos vectores . A modo de ejemplo, las células hospederas pueden ser células CHO, células de E. coli, o células de levaduras. También se un proceso para producir cualquiera los polipéptidos descritos en la presente y comprende cultivar células hospederas en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular.
Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer e incluyen anticuerpos específicos para receptores de la superficie celular y receptores de transmembrana, y antígenos asociados al tumor (TAA) . Tales anticuerpos se pueden usar como anticuerpos desnudos (no conjugados a un fármaco o residuo de marca) o como conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) . Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína de la invención se pueden acoplarse al sitio en forma específica y eficiente con un agente reactivo con tiol. El agente reactivo con tiol puede ser un reactivo enlazador multifuncional , un reactivo de marca de captura, un reactivo fluoróforo, o un intermediario fármaco-enlazador . El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína se puede marcar con una marca detectable, inmovilizar en un soporte de fase sólida y/o conjugar con un residuo de fármaco. La reactividad tiol se puede generalizar en cualquier anticuerpo donde la sustitución de aminoácidos con aminoácidos de cisteína reactivos se puede realizar dentro de los intervalos de la cadena ligera seleccionados de los intervalos de aminoácido: L10-L20, L105-L115, L109-L119, L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200-L210; y dentro de los intervalos en la cadena pesada seleccionados de los intervalos de aminoácido: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119, H111-H121, y en la región de Fe dentro de los intervalos seleccionados de H270-H280, H366-H376, H391-401, donde la numeración de las posiciones de aminoácido comienza en la posición 1 del sistema de numeración de Kabat (Kabat y otros. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) y continúa sucesivamente de aquí en adelante como se describe en WO2006034488 ; US 2007/0092940. La reactividad tiol también se puede generalizar a ciertos dominios de un anticuerpo, tales como el dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los reemplazos de cisteína que originan valores de reactividad de tiol de 0,6 y superiores se pueden realizar en los dominios constantes de la cadena pesada a, d, e, ?, y µ de los anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, respectivamente, que incluye las subclases de IgG: IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Tales anticuerpos y sus usos se describen en WO2006/034488 ; US 2007/0092940.
Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína de la invención con preferencia retienen la capacidad de unión al antígeno de sus contrapartes del anticuerpo original, de tipo silvestre. En consecuencia, los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína son capaces de unirse, con preferencia específicamente, a antígenos. Tales antígenos incluyen, por ejemplo, antígenos asociados a tumores (TAA) , proteínas del receptor de superficie celular y otras moléculas de superficie celular, proteínas de transmembrana, proteínas de señalización, factores reguladores de la supervivencia celular, factores reguladores de la proliferación celular, moléculas asociadas con el desarrollo o diferenciación de tejido (por ejemplo, conocidas o sospechadas de contribuir funcionalmente) , lifocinas, citocinas, moléculas involucradas en la regulación del ciclo celular, moléculas involucradas en la vasculogénesis y moléculas asociadas con la angiogénesis (por ejemplo, conocidas o sospechadas de contribuir funcionalmente) . El antígeno asociado al tumor puede ser un factor de diferenciación del grupo (es decir, una proteína de CD, que incluye pero sin. limitación FcRH5) . Los anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína de la invención retienen la capacidad de unión al antígeno de sus contrapartes del anticuerpo anti-FcRH5 original. En consecuencia, los anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína de la invención son capaces de unir, con preferencia específicamente, a los antígenos de FcRH5 que incluyen las isoformas beta y/o alfa humanas de anti-FcRH5, que incluye cuando estos antígenos se expresan en la superficie de las células, que incluyen, sin limitación, las células B.
En un aspecto, los anticuerpos de la invención se puede conjugar con cualquier residuo de marca que puede estar unida covalentemente al anticuerpo a través de un residuo del reactivo, un residuo activado o un grupos de tiol de la cisteína reactivo (Singh y otros (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. y lañe, D. (1999) Utilizando Anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2a. ed. CRC Press, Boca Ratón, FL) . La marca unida puede actuar para: (i) proveer una marca detectable; (ii) interactuar con una segunda marca para modificar la señal detectable provista por la primera o segunda marca, por ejemplo para dar FRET (transferencia de energía de resonancia por fluorescencia) ; (iii) estabilizar interacciones o aumentar la eficacia de unión con el antígeno o ligando; (iv) afectar la movilidad, por ejemplo, movilidad electroforética o permeabilidad celular, por carga, hidrofobicidad, marca u otros parámetros físicos, o (v) proporcionar una residuo de captura, para modular la afinidad al ligando, unión del anticuerpo/antígeno o formación de complejos iónicos.
Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína marcados pueden ser útiles en ensayos diagnósticos, por ejemplo, para detectar la expresión de un antígeno de interés en células, tejidos específicos o suero. Para las aplicaciones diagnósticas, el anticuerpo se marcará normalmente con un residuo detectable. Numerosas marcas que están disponibles se pueden agrupar generalmente en las siguientes categorías: Los radioisótopos (radionúclidos) tales como 3H, 1:LC, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, inIn, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, o 213Bi . Los anticuerpos marcados con radioisótopos son útiles en los experimentos de imágenes dirigidos al receptor. El anticuerpo se puede marcar con reactivos de ligando que se une, quela o forma complejo de otro modo con un metal radioisótopo donde el agente es reactive con el tiol de la cisteína manipulado genéticamente del anticuerpo, usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen y otros, Ed. Wiley-Interscience , New York, NY, Pubs . (1991). Los ligandos quelantes que pueden formar complejo con un ion metálico incluyen DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA y TETA (Macrocyclics, Dallas, TX) . Los radionúclidos se pueden dirigir por medio de la formación de complejos con los conjugados de anticuerpo y fármaco de la invención (Wu y otros (2005) Nature Biotechnology 23(9) : 1137-1146) .
Los reactivos enlazadores tales como DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobencil-DOTA) se puede preparar por la reacción de aminobencil-DOTA con ácido 4-maleimidobutírico (Fluka) activado con isopropilcloroformato (Aldrich) , después del procedimiento de Axworthy y otros (2000) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 97 (4) : 1802-1807) . Los reactivos de DOTA-maleimida reaccionan con los aminoácidos de cisteína libre de los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína y proveen un ligando que forma complejo con el metal sobre el anticuerpo (Lewis y otros (1998) Bioconj . Chem. 9:72-86). Los reactivos de marcación de enlazadores quelantes tales como DOTA-NHS (mono (N-hidroxisuccinimida éster del ácido 1 , 4 , 7 , 10-tetraazaciclododecano-l , 4 , 7 , 10-tetraacético) están disponibles en el comercio (Macrocyclies , Dallas, TX) . Las imágenes del direccionamiento al receptor con anticuerpos marcados con radionúclidos pueden proporcionar un marcador de activación de la vía para la detección y la cuantificación de la acumulación progresiva de anticuerpos en el tejido tumoral (Albert y otros (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett . 8:1207-1210). Los radiometales conjugados pueden permanecer intracelulares después de la degradación lisosómica.
Los complejos de metal-quelato adecuados como marcas de anticuerpo para los experimentos de imágenes se describen: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich y otros (1983) J. Immunol . Methods 65:147-157; Meares y otros (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh y otros (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares y otros (1990) J. Cáncerl990, Suppl . 10:21-26; Izard y otros (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula y otros (1995) Nucí. Med Biol . 22:387-90; Camera y otros (1993) Nucí. Med. Biol . 20:955-62; Kukis y otros (1998) J. Nucí. Med. 39:2105-2110; Verel y otros (2003) J. Nucí. Med. 44:1663-1670; Camera y otros (1994) J. Nucí. Med. 21:640-646; Ruegg y otros (1990) Cáncer Res. 50:4221-4226; Verel y otros (2003) J. Nucí. Med. 44:1663-1670; Lee y otros (2001) Cáncer Res. 61:4474-4482; Mitchell, y otros (2003) J. Nucí. Med. 44:1105-1112; Kobayashi y otros (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer y otros (2004) J. Nucí. Med. 45:129-137; DeNardo y otros (1998) Clinical Cáncer Research 4:2483-90; Blend y otros (2003) Cáncer Bioterapia & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula y otros (1999) J. Nucí. Med. 40:166-76; Kobayashi y otros (1998) J. Nucí. Med. 39:829-36; Mardirossian y otros (1993) Nucí. Med. Biol . 20:65-74; Roselli y otros (1999) Cáncer Bioterapia & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
Las marcas fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) , tipo fluoresceínas que incluye FITC, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxi fluoresceína ; tipo rodaminas que incluye TAMRA; dansilo; Lissamina; cianinas; ficoetritrinas ; rojo de Texas y sus análogos. La marcas fluorescentes se pueden conjugar a los anticuerpos usando las técnicas descritas, por ejemplo en Current Protocols in Immunology, supra. Los reactivos colorantes fluorescentes y marcas fluorescentes incluyen los disponibles en el comercio en Invitrogen/Molecular Probes (Eugeno, O) y Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL) .
Varias marcas de enzima-sustrato están disponibles o descritas (US 4275149) . La enzima generalmente cataliza una alteración química de un sustrato cromogénico que se puede medir usando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente . Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio de fluorescencia se describió anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y luego puede emitir luz que se puede medir (usando, por ejemplo un quimioluminómetro) o dona energía a un aceptor de fluorescencia. Los ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; US 4737456) , luciferina, 2 , 3-dihidroftalazinodionas , malato deshidrogenasa , ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRP) , fosfatasa alcalina (AP) , ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) , heterocíclico oxidasas (tales como uricasa y xantino oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa , y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a los anticuerpos se describen en O'Sullivan y otros (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay" , en Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic Press, New York, 73:147-166.
Ejemplos combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRP) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en donde la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-ß-?-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-ß-D-galactosidasa .
Otras numerosas combinaciones de enzima-sustrato están disponibles para los expertos en la técnica. Para una revisión general, ver US 4275149 y US 4318980.
Una marca se puede conjugar indirectamente con una cadena lateral de aminoácido, una cadena lateral de aminoácido activada, una anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína, y similares. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres categorías generales de marcas mencionadas anteriormente se puede conjugar con avidina o estreptavidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a estreptavidina y en consecuencia, la marca se puede conjugar con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la marca con la variante del polipéptido, la variante del polipéptido se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcas mencionados anteriormente se conjuga con una variante del polipéptido anti -hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina) . En consecuencia, se puede lograr la conjugación indirecta de la marca con la variante del polipéptido (Hermanson, G. (1996) en Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego) .
El anticuerpo de la presente invención se puede emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ELISA, ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, (1987) Monoclonal Anticuerpos: A Manual of Techniques, pp . 147-158, CRC Press, Inc.).
Una marca de detección puede ser útil para localizar, visualizar, y cuantificar un evento de unión o reconocimiento. Los anticuerpos de la invención marcados pueden detectar receptores' en la superficie celular. Otro uso de anticuerpos marcados en forma detectable es un método de inmunocaptura basado en microesferas que comprende conjugar una microesfera con un anticuerpo marcado con fluorescencia y detectar una señal de fluorescencia después de la unión de un ligando. Las metodologías de detección de unión similares utilizan el efecto de resonancia del plasmón superficial (SP ) para medir y detectar las interacciones anticuerpo-antígeno .
Las marcas de detección tales como colorantes fluorescentes y colorantes quimioluminiscentes (Briggs y otros (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines y Amino Acids" , J. Chem. Soc . , Perkin-Trans . 1:1051-1058) proporcionan una señal detectable y en general son aplicables para marcar anticuerpos, con preferencia con las siguientes propiedades: (i) el anticuerpo marcado debe producir una señal muy alta con umbral bajo de modo que se puedan detectar en forma sensible pequeñas cantidades de anticuerpos en los ensayos libres de células y basados en células; y (ii) el anticuerpo marcado debe ser fotoestable de modo que la señal fluorescente se pueda observar, monitorear y registrar sin fotoblanqueamiento significativo. Para aplicaciones que involucran la unión a la superficie celular del anticuerpo marcado a las membranas o superficies celulares, en especial células vivas, las marcas con preferencia (iii) tienen buena solubilidad en agua para obtener la concentración del conjugado y la sensibilidad efectivas y (iv) son no tóxicas para las células vivas de modo que no alteran los procesos metabólicos normales de las células o causan muerte celular prematura.
La cuantificación de la intensidad de fluorescencia celular y la enumeración de eventos marcados con fluorescencia, por ejemplo, la unión de los conjugados de péptido-colorante a la superficie celular se puede realizar en un sistema (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) que automatiza ensayos no radiactivos de mezcla y lectura con células vivas o microesferas (Miraglia, "Homogeneous cell- y bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology" , (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). Los usos de anticuerpos marcados también incluye ensayos de unión al receptor de la superficie celular, ensayos de inmunocaptura , ensayos inmunoabsorbentes ligados a fluorescencia (FLISA) , escisión de caspasa (Zheng, "Caspase-3 controls both citoplasmic y nuclear events asociated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907), apoptosis (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow citometric detection of fosfatidilserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol . Methods 184:39-51) y ensayos de citotoxicidad . La tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico se puede usar para identificar la regulación por aumento o disminución por una molécula que se dirige a la superficie celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal.
Biochem. 271:143-51) .
Los anticuerpos de la invención marcados son útiles como biomarcadores y sondas de imágenes por diversos métodos y técnicas de imágenes biomédicas y moleculares tales como: (i) MRI (imagen de resonancia magnética) ; (ii) MicroCT (tomografía computada) ; (iii) SPECT (tomografía computada de emisión de fotón único); (iv) PET (tomografía de emisión de positrones) Chen y otros (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) bioluminescencia ; (vi) fluorescencia; y (vii) ultrasonido La inmunocintigrafía es un procedimiento de imágenes en el que los anticuerpos marcados con sustancias radiactivas se administran a un paciente animal o humano y se toma una foto de sitios del cuerpo donde se localiza el anticuerpo (US 6528624). Los biomarcadores de imágenes se pueden medir objetivamente y evaluar como indicadores de procesos biológicos normales, procesos patogénicos, o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. Los biomarcadores pueden ser de varios tipos: Tipo 0 son marcadores de la historia natural de una enfermedad y se correlacionan en forma longitudinal con índices clínicos conocidos, por ejemplo evaluación de MRI de la inflamación sinovial en artritis reumatoide; los marcadores Tipo I capturan el efecto de una intervención de acuerdo con un mecanismo de acción, aun cuando el mecanismo puede no estar asociado con la evolución clínica; los marcadores Tipo II actúan como puntos finales sustitutos donde el cambio, o forma de señal del biomarcador predice un beneficio clínico para "validar" la respuesta específica, tal como erosión ósea medida en artritis reumatoide por CT. Los biomarcadores de imágenes en consecuencia pueden proveer información terapéutica farmacodinámica (PD) acerca de: (i) expresión de una proteína objetivo, (ii) unión de un agente terapéutico a la proteína objetivo, es decir selectividad y (iii) datos farmacocinéticas de depuración y vida media. Las ventajas de los biomarcadores de imágenes in vivo respecto de los biomarcadores de laboratorio incluyen: tratamiento no invasivo, cuantificable , evaluación del cuerpo completo, dosificación y evaluación repetida, es decir, puntos de tiempo múltiples y efectos potencialmente transíeribles de los resultados preclínicos (animales pequeños) a clínicos (seres humanos) , En algunas aplicaciones, el análisis de bioimágenes suplanta o minimiza la cantidad de experimentos en animales en los estudios preclínicos.
Los métodos de marcación de péptidos son bien conocidos. Ver Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer y otros (1975) Chemical Modification of Proteins . Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds . ) American Elsevier Publishing Co . , New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I y II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins" , Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlín and New York; y Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Ratón, Fia.); De Leon-Rodriguez y otros (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis y otros (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li y otros (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier y otros (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.
Los péptidos y proteínas marcadas con dos residuos, un indicador fluorescente e inactivador en suficiente proximidad experimentan transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) . Los grupos indicadores son normalmente colorantes fluorescentes que se excitan por la luz a una determinada longitud de onda y transfieren energía a un grupo aceptor o inactivador, con el desplazamiento de Stokes apropiado para la emisión a máxima brillo. Los colorantes fluorescentes incluyen moléculas con aromaticidad extendida, tal como fluoresceína y rodamina, y sus derivados. El indicador fluorescente puede ser inactivado en forma parcial o significativa por el residuo inactivador en un péptido intacto. Después de la escisión del péptido por una peptidasa o proteasa, se puede medir un aumento detectable de fluorescencia (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes" , Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34).
Los anticuerpos de la invención marcados también se pueden usar como agente de purificación de afinidad. En este proceso, el anticuerpo marcado se inmoviliza en una fase sólida tal como resina de Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el antígeno por purificar, y a partir de aquí el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra excepto el antígeno que se purifica, que está unido a la variante del polipéptido inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, tal como regulador de pH de glicina, pH 5.0, que liberará el antígeno de la variante del polipéptido.
Los reactivos de marcación normalmente portan grupos funcionales reactivos que pueden reaccionar (i) directamente con un tiol de la cisteína de un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína para formar un anticuerpo marcado, (ii) con un reactivo enlazador para formar un intermediario enlazador-marca o (iii) con un anticuerpo enlazador para formar un anticuerpo marcado. Los grupos funcionales reactivos de los reactivos de marcación incluyen: maleimida, haloacetilo, succinimidil éster de yodoacetamida (por ejemplo NHS, N-hidroxisuccinimida) , isotiocianato, cloruro de sulfonilo, 2 , 6-diclorotriacinilo, éster pentafluorofenílico y fosforamidita, si bien también se pueden usar otros grupos funcionales.
Un ejemplo de grupo funcional es éster N-hidroxisuccinimidílico (NHS) de un sustituyente grupo carboxilo de una marca detectable, por ejemplo biotina o un colorante fluorescente. El éster NHS de una marca se puede preformar, aislar, purificar y/o caracterizar, o se puede formar in situ y reaccionar con un grupo nucleófilo de un anticuerpo. Normalmente, la forma carboxilo de la marca se activa por la reacción con alguna combinación de un reactivo carbodiímida, por ejemplo diciclohexilcarbodiímida, diisopropilcarbodiímida, o un reactivo de uronio, por ejemplo TSTU (tetrafluoroborato de 0- (N-Succinimidil ) -N, N, ' ,?'-tetrametiluronio, HBTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il) -?,?,?' ,?' -tetrametiluronio) , o HATU (hexafluorofosfato de O- (7-azabenzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' -tetrametiluronio) , un activador, tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) , y N-hidroxisuccinimida para dar el éster NHS de una marca. En algunos casos, la marca y los anticuerpos se pueden acoplar por activación in situ de la marca y la reacción con el anticuerpo para formar el conjugado de marca-anticuerpo en una etapa. Otros reactivos de activación y acoplamiento incluyen TBTU (hexafluorofosfato de 2- ( lH-benzotriazo-l-il ) -1-1 , 3 , 3-tetrametiluronio) , TFFH (2-fluoro-hexafluorofosfato de ?,?' ,?" ,?' "-tetrametiluronio) , PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio, EEDQ (2-etoxi-l-etoxicarbonil-1 , 2-dihidro-quinolina) , DCC (diciclohexilcarbodiímida) ; DIPCDI (diisopropilcarbodiímida) , MSNT (1- (mesitilen-2-sulfonil) -3-nitro-lH-l , 2 , 4-triazol , y haluros de arilsulfonilo, por ejemplo cloruro de triisopropilbencensulfonilo .
Péptido de unión al compuesto aluminio-Fab de la invención : En un aspecto, el anticuerpo de la invención se fusiona a una proteína de unión a albúmina. La unión de proteína-plana puede ser un medio efectivo de mejorar las propiedades farmacocinéticas de moléculas de vida corta. La albúmina es la proteína más abundante en plasma. Los péptidos de unión al aluminio (ABP) del suero pueden alterar la farmacodinámica de las proteínas del dominio activo fusionado, que incluye la alteración de la absorción, penetración, y difusión en el tejido. Estos parámetros farmacodinámicos se puede modular por la selección específica de la secuencia de péptido de unión al aluminio apropiada (US 20040001827) . Se identificó una serie de péptidos de unión al aluminio por prueba de despliegue en fago (Dennis y otros. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; O 01/45746) . Los compuestos de la invención incluyen la secuencias ABP descritas por: (i) Dennis y otros (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 en las Tablas III y IV, página 35038; (ii) US 20040001827 a
[0076] SEC ID NOS: 9-22; y (iii) WO 01/45746 en las páginas 12-13, las cuales se incorporan en la presente por referencia. Los (ABP) -Fab de unión a albúmina están manipulados genéticamente por la fusión de un péptido de unión al aluminio al C-terminal de la cadena pesada del Fab en una relación estequiométrica 1:1 (1 ABP / 1 Fab) . Se demostró que la asociación de estos ABP-Fabs con albúmina aumentó la vida media del anticuerpo en más de 25 veces en conejos y ratones. Los residuos de Cys reactivos descritos anteriormente en consecuencia se pueden introducir en estos ABP-Fab y se usan para la conjugación específica de sitio con fármacos citotóxicos seguido por los estudios en animales in vivo.
Los ejemplos de secuencias del péptido de unión a albúmina incluyen, pero sin limitación las secuencias aminoácidos listadas en las SEC ID NOS: 53-57: CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEC ID NO: 53 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEC ID NO: 54 QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEC ID NO: 55 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEC ID NO: 56 DICLPRWGCLW SEC ID NO: 57 Conjugados de anticuerpo y fármaco En otro aspecto, la invención proporciona inmunoconjugados , o conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) , que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de esta) , o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado) . En otro aspecto, la invención además proporciona métodos de usar los inmunoconjugados . En un aspecto, un inmunoconjugado comprende cualquiera de los anteriores anticuerpos anti-FcRH5 unidos covalentemente a un agente citotóxico o un agente detectable.
En un aspecto, un anticuerpo de FcRH5 de la invención se une al mismo epítopo de FcRH5 unido por otro anticuerpo de FcRH5.
En otro aspecto, a anticuerpo de FcRH5 de la invención se une a un epítopo de FcRH5 distinto del epítopo unido por otro anticuerpo de FcRH5.
En un aspecto, un anticuerpo de la invención se une específicamente a FcRH5 de una primera especie animal, y no se une específicamente a FcRH5 de una segunda especie animal. En una modalidad, la primera especie animal es humana y/o primate (por ejemplo, mono cynomolgus) , y la segunda especie animal es murina (por ejemplo, ratón) y/o canina. En una modalidad, la primera especie animal es humana. En una modalidad, la primera especie animal es primate, por ejemplo mono cinomolgus. En una modalidad, la segunda especie animal es murina, por ejemplo ratón. En una modalidad, la segunda especie animal es canina.
En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprende uno o más los anticuerpos de la invención y un portador. En una modalidad, el portador es farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de FcRH5 de la invención .
En un aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención.
En un aspecto, la invención proporciona células hospederas que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo un vector recombinante tal como un vector de expresión. Se puede usar cualquiera de una variedad de células hospederas. En una modalidad, una célula hospedera es una célula procariótica, por ejemplo, E. coli. En una modalidad, una célula hospedera es una célula eucariótica, por ejemplo una célula de mamífero tal como célula de ovario de hámster chino (CHO) .
En un aspecto, la invención proporciona métodos para obtener un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método de obtener un anticuerpo de FcRH5 (que, como se definir en la presente incluye longitud completa y fragmentos de este) , el método que comprende expresar en una célula hospedera adecuada un vector recombinante de la invención que codifica el anticuerpo (o fragmento de éste), y recuperar el anticuerpo.
En un aspecto, la invención proporciona un artículo de manufactura que comprende un recipiente; y una composición contenida en el recipiente, en donde la composición comprende uno o más anticuerpos FcRH5 de la invención. En una modalidad, la composición comprende un ácido nucleico de la invención. En una modalidad, una composición que comprende un anticuerpo también comprende un portador, que en algunas modalidades es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, un artículo de manufactura de la invención además comprende instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el anticuerpo) a un sujeto.
En un aspecto, la invención proporciona un kit que comprende un primer recipiente que comprende una composición que comprende uno o más anticuerpos FcRH5 de la invención; y un segundo recipiente que comprende u regulador de pH. En una modalidad, el regulador de pH es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, una composición que comprende un anticuerpo antagonista además comprende un portador, que en algunas modalidades es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, un kit además comprende instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el anticuerpo) a un sujeto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo de FcRH5 de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tales como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno proliferativo celular se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto .
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tales como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno proliferativo celular se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno proliferativo celular se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL), y linfoma de células del manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de una célula hospedera de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tales como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno proliferativo celular se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un artículo de manufactura de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tales como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno proliferativo celular se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un kit de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tales como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno proliferativo celular se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
En un aspecto, la invención proporciona un método de inhibir el crecimiento de una célula que expresa FcRH5 , el método que comprende poner en contacto las células con un anticuerpo de la invención de este modo causa una inhibición del crecimiento de la célula. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método de tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor cancerígeno qué comprende una célula que expresa FcRH5 , el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención, de este modo se trata efectivamente al mamífero. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular asociado con aumento de expresión de FcRH5, el método comprende administrar a un sujeto que necesita el tratamiento una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, de este modo se puede tratar o prevenir efectivamente el trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el trastorno proliferativo es cáncer. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento .
En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de la célula es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de FcRH5 , el método que comprende poner en contacto la células con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, de este modo inhibir el crecimiento de la célula. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento .
En un aspecto, la invención proporciona un método de tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de FcRH5 , el método que comprende poner en contacto la células con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, de este modo se trata efectivamente el tumor. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método de tratar cáncer que comprende administrar a un paciente la formulación farmacéutica que comprende un inmunoconjugado descrita en la presente, diluyente, portador o excipiente aceptable. En una modalidad, el cáncer se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células del manto. En una modalidad, se administra al paciente un agente citotóxico en combinación con el compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco.
En un aspecto, la invención proporciona un método de inhibir la proliferación de las células B que comprende exponer una célula a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención en condiciones permisivas para la unión del inmunoconjugado a FcRH5. En una modalidad, la proliferación de las células B se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células del manto. En una modalidad, la célula B es un xenoinjerto. En una modalidad, la exposición tiene lugar in vitro. En una modalidad, la exposición tiene lugar in vivo.
En un aspecto, la invención proporciona un método de determinar la presencia de FcRH5 en una muestra que se sospecha que contiene FcRH5, el método que comprende exponer la muestra a un anticuerpo de la invención, y determinar la unión de el anticuerpo a FcRH5 en la muestra en donde la unión de el anticuerpo a FcRH5 en la muestra es indicativo de la presencia de la proteína en la muestra. En una modalidad, la muestra es una muestra biológica. En una modalidad adicional, la muestra biológica comprende las células B. En una modalidad, la muestra biológica es un mamífero que experimenta o se sospecha que experimenta un trastorno de las células B y/o un trastorno proliferativo de las células B que incluye, pero sin limitación, linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células del manto .
En un aspecto, se proporciona un método de diagnosticar un trastorno proliferativo celular asociado con un aumento de las células, tales como las células B, que expresa FcRH5 , el método que comprende poner en contacto las células de ensayo en una muestra biológica con cualquiera de los anticuerpos anteriores; determinar el nivel de anticuerpo unido a las células de ensayo en la muestra por la detección de la unión del anticuerpo a FcRH5; y comparar el nivel de anticuerpo unido a las células en una muestra control, en donde el nivel de anticuerpo unido se normaliza a la cantidad de células que expresan FcRH5 en las muestras de ensayo y control, y en donde un nivel superior de anticuerpo unido en la muestra de ensayo en comparación con la muestra control indica la presencia de un trastorno proliferativo celular asociado con células que expresan FcRH5.
En un aspecto, un método de detectar FcRH5 soluble en sangre o suero, el método que comprende poner en contacto una muestra de ensayo de sangre o suero de un mamífero que se sospecha que experimenta un trastorno proliferativo de las células B con un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención y detectar un aumento de FcRH5 soluble en la muestra de ensayo con respecto a una muestra control de sangre o suero de un mamífero normal. En una modalidad, el método de detectar es útil como método de diagnosticar un trastorno proliferativo de las células B asociado con un incremento de FcRH5 soluble en sangre o suero de un mamífero.
En un aspecto, un método de unir un anticuerpo de la invención a una célula que expresa FcRH5 , el método que comprende poner en contacto la células con un anticuerpo de la invención. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
Los métodos de la invención se pueden usar para afectar cualquier estado patológico adecuado, por ejemplo, células y/o tejidos asociados con la expresión de FcRH5. En una modalidad, una célula a la que se dirige un método de invención es una célula hematopoyética . Por ejemplo, una célula hematopoyética puede ser una que se selecciona del grupo que consiste en linfocito, leucocito, plaqueta, eritrocito y célula citolítica natural. En una modalidad, una célula a la que se dirige un método de invención es una célula B o célula T. En una modalidad, una célula a la que se dirige un método de invención es una célula cancerígena. Por ejemplo, una célula cancerígena puede ser una seleccionada del grupo que consiste en una célula de linfoma, célula de leucemia, o célula de mieloma.
Los métodos de la invención también pueden comprender etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una modalidad, un método además comprende una etapa en donde una célula y/o tejido localizada selectivamente (por ejemplo, una célula cancerígena) se expone el tratamiento de radiación o un agente quimioterapéutico .
Como se describe en la presente, se ha observado que la expresión de FcRH5 (o IRTA2) está desregulada en líneas celulares de mieloma múltiple y linfoma de Burkitt . Por consiguiente, en una modalidad de los métodos de la invención, una célula que es localizada selectivamente (por ejemplo, una célula cancerígena) es una en que Fc H5 se expresa en comparación con una célula que no expresa FcRH5. En una modalidad adicional, la célula localizada selectivamente es una célula cancerígena en la que la expresión de FcRH5 está aumentada en comparación con una célula no cancerosa normal del mismo tipo de tejido. En una modalidad, un método de la invención causa la muerte de una célula localizada selectivamente.
En otros aspectos de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. También se proporciona una célula hospedera que comprende el vector. A modo de ejemplo, las células hospederas puede ser células CHO, células de E. coli, o células de levaduras. También se proporciona un proceso para producir cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente y comprende cultivar células hospederas en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo deseado y recuperar el anticuerpo deseado del cultivo celular.
En otro aspecto adicional, la invención trata de una composición de materia que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 descrito en la presente, en combinación con un portador. Opcionalmente , el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente invención se dirige al uso de un polipéptido del anticuerpo anti-FcRH5 que se describe en la presente, para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de una afección que responde al polipéptido del anticuerpo anti-FcRH5.
Otro aspecto de la invención es una composición que comprende una mezcla de los compuestos de anticuerpo-fármaco de Fórmula I donde la carga de fármaco promedio para el anticuerpo es aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o aproximadamente 3 a aproximadamente 4.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que incluye un compuesto ADC de Fórmula I, una mezcla de compuestos ADC de Fórmula I, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de estos, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto proporciona una combinación farmacéutica que comprende un compuesto ADC de Fórmula I y un segundo compuesto que tiene propiedades anticancerígeno u otros efectos terapéuticos.
Otro aspecto es un método para destruir o inhibir la proliferación de células tumorales o células cancerígenas que comprende tratar células con una cantidad de un conjugado de anticuerpo y fármaco de Fórmula I, o sal o solvato farmacéuticamente aceptable de esto, que son efectivos para destruir o inhibir la proliferación de las células tumorales o células cancerígenas.
Otro aspecto es un método de tratar cáncer que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de a composición farmacéutica que incluye un ADC de Fórmula I .
Otro aspecto incluye artículos de manufactura, es decir kits, que comprenden el conjugado de anticuerpo y fármaco, un recipiente, y un prospecto o rótulo que indica un tratamiento .
Un aspecto de la invención es un método para obtener un compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco de Fórmula I que comprende las etapas de: (a) reacción de un grupo de cisteína manipulado genéticamente del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con un reactivo enlazador para formar el intermediario anticuerpo-enlazador Ab-L; y (b) reacción de Ab-L con un residuo de fármaco activado D; por la cual se forma el conjugado de anticuerpo y fármaco; o que comprende las etapas de: (c) reacción de un grupo nucleófilo de un residuo de fármaco con un reactivo enlazador para formar un intermediario fármaco-enlazador D-L; y (d) reacción de D-L con un grupo de cisteína manipulado genéticamente del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína; por la cual se forma el conjugado de anticuerpo y fármaco .
Un aspecto de la invención es un ensayo para detectar células cancerígenas que comprende: (a) exponer las células a un conjugado del anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína y fármaco; y (b) determinar el grado de unión del conjugado del anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína y fármaco a las células.
A. Anticuerpos anti-FcRH5 En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos anti-FcRH5 que se pueden utilizar en la presente como agentes terapéuticos. Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales , monoclonales , humanizados, biespecíficos y heteroconjugados . 1. Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se originan con preferencia en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser de utilidad conjugar el antígeno relevante para una proteína que es inmunogénica en las especies inmunizadas. Por ejemplo, el antígeno se puede conjugar a hemocianina de lapa californiana (KH) , albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya usando un agente bifuncional o derivatizante , por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación mediante residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (mediante residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0CI2, o RxN=C=NR, donde R y Rx son independientemente grupos alquilo inferior.
Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados por la combinación, por ejemplo, de 100 ug o 5 ig de la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante de Freund completo y la inyección de la solución en forma intradérmica en múltiples sitios. Un mes después a los animales se les aplica un refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en el adyuvante de Freund completo por la inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 después se extrae sangre a los animales y se analiza el suero para determinar el título de anticuerpos. Se aplica refuerzo a los animales hasta que el título llega a la meseta. Los conjugados también se obtienen en un cultivo de células recombinantes como fusiones de proteína. Asimismo, los agentes de agregación tales como alúmina son adecuados para mejorar la respuesta inmunitaria. 2. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el método del hibridoma descrito primero por Kohler y otros., Nature, 256:495 (1975), o se puede preparar por métodos de ADN recombinante (patente US No 4,816,567) .
En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente en la presente para estimular linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. En forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y luego se fusionan con una línea de células de mieloma mediante un agente de fusión adecuada, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, onoclonal Anticuerpos: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células del hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que con preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras no fusionadas (también denominadas como compañero de fusión) . Por ejemplo si las células de mieloma progenitoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirán hipoxantina, aminopterina y timidinata (medio HAT) , tales sustancias impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma asociadas de fusión preferidas son las que se fusionan en forma eficiente, sostienen la producción de alto nivel de anticuerpos estable por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio selectivo que selecciona contra las células progenitoras no fusionadas. Las líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murinas, tal como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif . USA, y las células SP-2 y sus derivados, por ejemplo, X63-Ag8-653, disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984) ; Brodeur y otros., Monoclonal Antibody Product ion Techniques and Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)) .
El medio de cultivo en el cual crecen las células del hibridoma se ensaya para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Con preferencia, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vi tro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) .
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar por ejemplo, por el análisis de Scatchard descrito en Munson y otros., Anal . Biochem . , 107:220 (1980) .
Una vez que se identifican las células del hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución límite y cultivar por métodos estándares (Goding, Monoclonal Anticuerpos: Principies y Practice, pp, 59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células del hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores como tumores ascíticos en un animal, por ejemplo, por inyección i.p. de las células en ratones.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando proteína A o proteína G-Sefarosa) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, por medio de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos) . Las células del hibridoma sirven como una fuente preferida del ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en los vectores de expresión, que luego se transfectan en las células hospederas tales como células de E. coli, células de simio COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes . La revisión de artículos sobre la expresión recombinante en las bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y otros., Curr. Opinión in Immunol . , 5_:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . 130 : 151-188 (1992) .
En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmento de anticuerpos se pueden aislar de las bibliotecas de fagos generadas mediante las técnicas descritas en McCafferty y otros., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson y otros., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y otros., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por transposición génica (Marks y otros., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y otros., Nuc . Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)).
En consecuencia, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas del hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicional para el aislamiento de anticuerpos monoclonales El ADN que codifica el anticuerpo se puede modificar, para producir polipéptidos quiméricos o de fusión, por ejemplo, por sustitución de las secuencias del dominio constante (CH y CL) de las cadenas pesadas y/o ligeras para las secuencias murinas homologas (patente US No. 4,816,567; Morrison, y otros., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984) ) , o por la fusión de la secuencia codificadora de inmunoglobulina con total o parte de la secuencia codificadora del polipéptido no inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptidos no inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo, o ellos están sustituidos en los dominios variables de un sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación del antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación del antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente . 3. Anticuerpos humanos y humanizados Los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención también pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos {por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o sus fragmentos (tal como Fv, Fab, Fab' , F(ab' )2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan con residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados que no se hallan en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos una y típicamente dos dominios variables, en el cual todos o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de no inmunoglobulina y todos o sustancialmente todos las regiones FR son los de la secuencia de inmunoglobulina de consenso humana. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá por lo menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Jones y otros., Nature 321 : 522-525 (1986) ; Riechmann y otros., Nature 332 : 323-329 (1988) y Presta, Curr . Opin. Struct . Biol . 2: 593-596 (1992) .
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en este proveniente de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan como residuos de "importación", que normalmente se toman de un dominio variable de "importación" . La humanización se pueden realizar esencialmente siguiendo el método de inter y colaboradores, Jones y otros., ¿Vature 321 : 522-525 (1986) ; Riechmann y otros., Nature 332:323-327 (1988) ; Verhoeyen y otros., Science 239 : 1534-1536 (1988), por la sustitución de las CDR o secuencias de CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que se sustituyen algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR con residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedores La elección de los dominios variables humanos, tanto pesado como liviano, que se usan para obtener los anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad y respuesta de HAMA (anticuerpos anti-ratón humano) cuando el anticuerpo está destinado a uso terapéutico humano. La reducción o eliminación de una respuesta HAMA es un aspecto significativo del desarrollo clínico de agentes terapéuticos adecuados. Ver, por ejemplo, Khaxzaeli y otros., J. Nati. Cáncer Inst . (1988), 80:937; Jaffers y otros., Transplantation (1986), 41:572; Shawler y otros., J. Immunol . (1985), 135:1530; Sears y otros., J. Biol . Response Mod. (1984), 3:138; Miller y otros., Blood (1983), 62:988; Hakimi y otros., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann y otros., Nature (1988), 332:323; Junghans y otros., Cáncer Res. (1990), 50:1495. Como se describe en la presente, la invención proporciona anticuerpos que son humanizados de modo tal que reduzcan o eliminen la respuesta HAMA. Las variantes de estos anticuerpos se pueden obtener usando métodos de rutina conocidos en la técnica, algunos de los cuales también se describen a continuación. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza frente a la biblioteca completa de las secuencias conocidas del dominio variable humano. Se identifica la secuencia del dominio V humano que está más próxima a la de roedor y la región estructural humana (FR) dentro de esta aceptada por el anticuerpo humanizado. Sims y otros. (1993) J. I munol . 151:2296; Chothia y otros. (1987) J". Mol. Biol . 196:901. Otro método usa una región estructural particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadena ligera o pesada particular. La misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes. Cárter y otros. (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta y otros. (1993) J. Immunol . , 151:2623) .
Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo que se describe en la presente puede servir como secuencia inicial (original) para la diversificación de las secuencias estructurales y/o hipervariables . Una secuencia estructural seleccionada a la que se une una secuencia hipervariable inicial se denomina en la presente como una estructura humana aceptora. Si bien las estructuras humanas aceptoras pueden ser de o derivadas de una inmunoglobulina humana (las regiones VL y/o VH de esta) , con preferencia las estructuras humanas aceptoras son o derivan de una secuencia estructural de consenso humana ya que tales estructuras han demostrado tener una inmunogenicidad mínima o ninguna en los pacientes humanos .
Cuando el aceptor deriva de una inmunoglobulina humana, opcionalmente se puede seleccionar una secuencia estructural humana que se selecciona sobre la base de su homología con la secuencia estructural dadora por el alineamiento de la secuencia estructural dadora con varias secuencias estructurales humanas en una colección de secuencias estructurales humanas, y seleccionar la secuencia estructural más homologa que la aceptora.
En una modalidad, estructuras de consenso humanas en la presente son o derivan de secuencias estructurales de consenso del subgrupo III de VH y/o subgrupo I de VL kappa.
Si bien la aceptora puede ser idéntica en secuencia a la secuencia estructural humana seleccionada, sea que provenga de una inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana, la presente invención contempla que la secuencia aceptora puede comprender sustituciones de aminoácidos preexistentes respecto de la secuencia de la inmunoglobul na humana o secuencia estructural de consenso humana. Esta sustituciones preexistentes con preferencia son mínimas; usualmente solo cuatro, tres, dos o una diferencias de aminoácidos respecto de la secuencia de la inmunoglobulina humana o secuencia estructural de consenso.
Los residuos de la región hipervariable del anticuerpo no humano se incorporan en las estructuras humanas aceptoras VL y/o VH. Por ejemplo, se pueden incorporar residuos correspondientes a los residuos de CDR de Kabat, los residuos del bucle hipervariable de Chlotia, los residuos Abm y/o los residuos por contacto. Opcionalmente , se incorporan siguientes residuos de la región hipervariable extendida: 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3), 26-35B (Hl) , 50-65, 47-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) .
Si bien la "incorporación" de los residuos de la región hipervariable se describe en la presente, se apreciará que esto se puede obtener de varias maneras, por ejemplo, se puede generar un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos deseada por mutación del ácido nucleico que codifica la secuencia del dominio variable de ratón de modo que los residuos estructurales de este se cambiar por los residuos de la estructura humana aceptora, o por mutación del ácido nucleico que codifica la secuencia del dominio variable humano de modo que los residuos del dominio hipervariable se cambian por residuos no humanos, o por la síntesis de ácido nucleico que codifica la secuencia deseada, etc.
En los ejemplos en la presente, las variantes injertadas con región hipervariable se generaron por mutagénesis de Kunkel del ácido nucleico que codifica las secuencias aceptoras humanas, usando un oligonucleótido separado para cada región hipervariable. Kunkel y otros., Methods Enzymol . 154 : 367-382 (1987). Se pueden introducir cambios apropiados dentro de la estructura y/o región hipervariable usando técnicas de rutina, para corregir y restablecer las interacciones región hipervariable-antígeno apropiadas .
El despliegue en fago/fagémido (también mencionado en la presente como despliegue en fagos en algunos contextos) se puede usar como un método conveniente y rápido para generar e identificar muchas variantes de anticuerpos potenciales diferentes en una biblioteca generada por aleatorización de secuencias. No obstante, los expertos en el arte disponen de otros métodos para obtener y detectar anticuerpos alterados.
La tecnología de despliegue en fago/fagémido ha provisto una herramienta poderosa para generar y seleccionar nuevas proteínas que se unen a un ligando, tal como un antígeno. El uso de las técnicas de despliegue en fago/fagémido permite la generación de bibliotecas grandes de variantes de proteína que se pueden clasificar rápidamente en las secuencias que se unen a una molécula objetivo con afinidad alta. Los ácidos nucleicos que codifican variantes de polipéptidos se fusionan generalmente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de la cubierta viral, tal como la proteína del gen III o la proteína del gen VIII. Se han desarrollado sistemas de despliegue en fagémido monovalente donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína o polipéptido se fusiona a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una porción la proteína del gen III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman y Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)).
En un sistema de despliegue en fagémido monovalente, la fusión del gen se expresa a niveles bajos y las proteínas del gen tipo silvestre III también se expresa de modo que se retiene la inefectividad de las partículas. Los métodos de generar bibliotecas de péptidos y seleccionar estas bibliotecas se han descrito en muchas patentes (por ejemplo patente US No. 5,723,286, patente US No. 5,432,018, patente US No. 5,580,717, patente US No. 5,427,908 y patente US No. 5,498, 530) .
Las bibliotecas de anticuerpos o polipéptidos de unión al antígeno se han preparado de numerosas maneras que incluyen alterar un gen único por la inserción de secuencias de ADN aleatorias o por la clonación de una familia de genes relacionados . Los métodos para desplegar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno usando el despliegue en fago/fagémido se han descrito en las patentes US Nos. 5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717, y 5,658,727. La biblioteca luego se analiza para detectar la expresión de anticuerpos o proteínas de unión al antígeno con las características deseadas.
Los métodos de sustituir un aminoácido de elección en una plantilla de ácido nucleico están bien establecidos en la técnica, algunos de los cuales se describen en la presente. Por ejemplo, los residuos de la región hipervariable se pueden sustituir usando el método de Kunkel. Ver, por ejemplo, Kunkel y otros., Methods Enzymol . 154:367-382 (1987).
La secuencia de oligonucleótidos incluye una o más de los conjuntos de codones diseñados para los residuos de la región hipervariable que serán alterados. Un conjunto codónico es un conjunto de diferentes secuencias de tripletes de nucleótidos usados para codificar las variantes de aminoácidos deseadas. Los conjuntos codónicos se pueden representar usando símbolos para designar los nucleótidos particulares o las mezclas equimolares de nucleótidos como se muestra a continuación de acuerdo con el código IUB.
CODIGOS IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A o G) Y (C o T) M (A o C) K (G o T) S (C o G) W (A o T) H (A o C o T) B (c o G o T) V (A o C o G) D (A o G o T) H N (A O C O G O T) Por ejemplo, en el conjunto codónico DVK, D puede ser los nucleótidos A o G o T; V puede ser A o G o C; y K puede ser G o T. Este conjunto codónico puede presentar 18 codones diferentes y pueden codificar aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gli, y Cys .
Los conjuntos de oligonucleótidos o iniciadores se pueden sintetizar usando métodos estándares. Un conjunto de oligonucleótidos se puede sintetizar, por ejemplo, por la síntesis en fase sólida, que contiene secuencias que representan todas las combinaciones posibles de tripletes de nucleótidos provistos por el conjunto codónico y que codificará el grupo de aminoácidos deseados. La síntesis de oligonucleótidos con "degeneración" de los nucleótidos seleccionados en ciertas posiciones es bien conocida en la técnica. Tales conjuntos de nucleótidos que tienen determinados conjuntos codónicos se pueden sintetizar usando sintetizadores de ácido nucleico comerciales (disponible en por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA) , o se puede obtener en el comercio (por ejemplo, en Life Technologies, Rockville, MD) . En consecuencia, un conjunto de oligonucleótidos sintetizados que tiene un conjunto codónico particular normalmente incluirá una pluralidad de oligonucleótidos con secuencias diferentes, las diferencias establecidas por el conjunto codónico dentro de la secuencia total. Los oligonucleótidos, que se usan de acuerdo con la invención, tienen secuencias que permiten la hibridación a una plantilla del ácido nucleico del dominio variable y también pueden incluir sitios de enzima de restricción para fines de clonación.
En un método, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de aminoácidos se pueden crear por mutagénesis mediada por oligonucleótidos. Esta técnica es bien conocida en el arte como se describe en Zoller y otros. Nucleic acids Res. 10:6487-6504(1987). En breves palabras, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican variantes de aminoácidos se crean por la hibridación de un conjunto de oligonucleótidos que codifica los conjuntos codónicos con una plantilla de ADN, donde el plantilla es la forma monocatenaria del plásmido que contiene una secuencia de la plantilla del ácido nucleico de la región variable. Después de la hibridación, se usa ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria de la plantilla así se incorporará al iniciador de de oligonucleótido, y contendrá los conjuntos codónicos provistos por el conjunto de oligonucleótidos .
Generalmente, se usan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios a la plantilla en cualquier lado de los nucleótidos que codifican las mutaciones. Esto asegura que el oligonucleótido se hibridará apropiadamente con la molécula de la plantilla de ADN monocatenario . Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente usando técnicas conocidas en el arte tal como se describe en Crea y otros., Proc. Nat ? . Acad. Sci. USA, 75 :5765 (1978) .
La plantilla de ADN se genera con los vectores que derivan tanto de los vectores del bacteriófago M13 (los vectores M13mpl8 y M13mpl9 disponibles en el comercio son adecuados) , como de los vectores que contienen un origen de replicación de fago monocatenario que se describe en Viera y otros., et . Enzymol . , 153:3 (1987). En consecuencia, el ADN que se muta se puede insertar en uno de estos vectores a fin de generar una plantilla monocatenaria . La producción de la plantilla monocatenaria se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook y otros., más arriba.
Para alterar la secuencia de ADN nativa, el oligonucleótido se híbrida a la plantilla monocatenaria en condiciones de hibridación adecuadas. Una enzima de polimerización de ADN, usualmente ADN polimerasa T7 o los fragmentos de Klenow de ADN polimerasa I, luego se añade para sintetizar la cadena complementaria de la plantilla usando el oligonucleótido como un iniciador de la síntesis. Así se forma una molécula heteroduplex de modo que una cadena del ADN codifica la forma mutada del gen 1, y la otra cadena (el plantilla original) codifica la secuencia nativa, no alterada del gen 1. Esta molécula heteroduplex luego se transforma en una célula hospedera adecuada, usualmente una procariota tal como E. coli JM101. Después de cultivar las células, se incuban en placas de agarosa y se analizan usando el iniciador de oligonucleótido radiomarcado con 32-fosfato para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado .
El método descrito inmediatamente antes se puede modificar de modo de crear una molécula homoduplex donde ambas cadenas del plásmido contienen la mutación. Las modificaciones son las siguientes: El oligonucleótido monocatenario se aparea a la plantilla monocatenaria como se describió anteriormente. Una mezcla de tres desoxiribonucleótidos , desoxiriboadenosina (dATP) , desoxiriboguanosina (dGTP) , y desoxiribotimidina (dTT) , se combina con una tiodesoxiribocitosina modificada llamada dCTP- (aS) (que se puede obtener en Amersham) . Esta mezcla se añade al complejo plantilla-oligonucleótido . Después de la adición de la ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADN idéntica a la plantilla excepto por las bases mutadas . Además, esta nueva cadena de ADN contendrá dCTP- (aS) en vez de dCTP, que sirve para protegerlo de la digestión con endonucleasa de restricción. Después de que la cadena de la plantilla del heteroduplex bicatenario se corta con una enzima de restricción apropiada, la cadena de la plantilla se puede digerir con ExoIII nucleasa u otra nucleasa apropiada para cortar una región diferente de la que contiene el sitio mutagen zado . La reacción luego se detiene para dejar una molécula que sea solo parcialmente monocatenaria . Un homoduplex de ADN bicatenario completo se forma luego usando ADN polimerasa en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxiribonucleótido, ATP, y ADN ligasa. Esta molécula homoduplex luego se puede transformar en una célula hospedera adecuada.
Como se indicó previamente, la secuencia del conjunto de oligonucleótidos es de longitud suficiente para hibridarse a la plantilla de ácido nucleico y también puede, pero no necesariamente, contener sitios de restricción. El plantilla de ADN se puede generar con los vectores que derivan tanto de los vectores del bacteriófago M13, como de los vectores que contienen un origen de replicación de fago monocatenario que se describe en Viera y otros. Met . Enzymol . , 153:3 (1987) . En consecuencia, el ADN que se muta se puede insertar en uno de estos vectores a fin de generar una plantilla monocatenaria. La producción de la plantilla monocatenaria se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook y otros., supra.
De acuerdo con otro método, la unión al antígeno se puede restaurar durante la humanización de los anticuerpos mediante la selección de las regiones hipervariables reparadas (Ver Solicitud No. 11/061,841, presentada el 18 de febrero de 2005) . El método incluye incorporar las regiones hipervariables no humanas en la estructura aceptora y además introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones hipervariables sin modificar la secuencia estructural aceptora. Alternativamente, la introducción de uno o más sustituciones de aminoácidos se puede acompañar con las modificaciones de la secuencia estructural aceptora.
De acuerdo con otro método, una biblioteca se puede generar por la provisión de conjuntos de oligonucleotidos dirección 5' y dirección 3', cada conjunto que tiene una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, las diferentes secuencias establecidas por los conjuntos codónicos provistos dentro de las secuencias de los oligonucleótidos. Los conjuntos de oligonucleótidos dirección 5' y dirección 3', junto con una secuencia de ácidos nucleicos del dominio variable de la plantilla, se pueden usar en una reacción en cadena de polimerasa para generar una "biblioteca" de productos de PCR. Los productos de PGR se pueden denominar como "casetes de ácido nucleico" , ya que ellos se fusionan con otras secuencias de ácidos nucleicos relacionadas o no relacionadas, por ejemplo, proteínas de cubierta viral y dominios de dimerización, usando técnicas de biología molecular establecidas.
La secuencia de los iniciadores de PCR incluye uno o más de los conjuntos codónicos diseñados para las posiciones accesibles al solvente y altamente diversas de una región hipervariable . Como se describió antes, un conjunto codónico es un conjunto de secuencias de tripletes de nucleótidos diferentes usados para codificar variantes de aminoácidos deseadas.
Los selectores de anticuerpos que cumplen los criterios deseados, seleccionados mediante etapas de detección/selección apropiadas se pueden aislar y clonar usando técnicas recombinantes estándares .
Además en general es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de nmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Se dispone de programas de computación que ilustran y despliegan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis de semejanza de roles de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De este modo, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir del receptor e importar las secuencias de modo de obtener las características del anticuerpo deseado, tal como aumento de afinidad para los antígenos objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente involucrados para influir en la unión al antígeno .
Varias formas de anticuerpo anti-FcRH5 humanizados están contempladas. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como una Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmunoconjugado . En forma alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto.
Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de la inmunización de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal produce una inhibición completa de la producción de anticuerpos monoclonales . La transferencia de la matriz del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en los ratones mutantes de línea germinal originará la producción de anticuerpos humanos tras el estímulo con el antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits y otros, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y otros., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y otros., Year in Immuno. , 7:33 (1993); patente US Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; y O 97/17852.
En forma alternativa, la tecnología de despliegue en fagos (McCafferty y otros., Nature 348:552-553
[1990]) se puede usar para producir anticuerpos y fragmento de anticuerpos humanos in vitro, a partir de repertorios del gen del dominio variable (V) de la inmunoglobulina a partir de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco en un gen de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se despliegan como fragmentos funcionales de anticuerpos en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también producen la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe estas propiedades. En consecuencia, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. El despliegue en fagos se puede realizar en una variedad de formatos, revisados en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. , Curr. Opin Struct . Biol . 3:564-571 (1993) Varias fuentes de segmentos del gen V se pueden usar para el despliegue en fagos. Clackson y otros., Nature 352:624-628 (1991) aislaron una matriz diversa de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados y pueden aislar los anticuerpos en una matriz diversa de antígenos (que incluyen autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks y otros., J . Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith y otros., EMBO J . 12:725-734 (1993). Ver también, patente US. Nos. 5,565,332 y 5, 573, 905.
Como se describió anteriormente, los anticuerpos humanos también se pueden generar por in vitro por las células B activadas (ver patente US Nos 5.567.610 y 5.229.275) . 4. Fragmentos de anticuerpos En ciertas circunstancias es ventajoso usar los fragmentos de anticuerpos, más que los anticuerpos completos. Los fragmentos de menor tamaño permiten una depuración rápida, y pueden llevar a un mejor acceso a los tumores sólidos.
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivaban por medio de la digestión proteolítica de los anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto y otros., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992), y Brennan y otros., Science, 229:81 (1985)) . Sin embargo estos fragmentos en la actualidad se pueden producir directamente por células hospederas recombinante . Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv se pueden expresar y secretar a partir de E. coli, de este modo permite la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter y otros., Bio/Technology 10:163-167 (1992)).) . De acuerdo con otro método, los fragmentos F(ab' )2 se pueden aislar directamente de un cultivo de la célula hospedera recombinante. Fab y F(ab' )2 con aumento de la vida media El fragmento Fab y F(ab')2 con aumento de la vida media in vivo que comprende los residuos del epítopo de unión al receptor de reciclaje se describen en la patente estadounidense No. 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena única (scFv) . Ver WO 93/16185; patente US No. 5,571,894 y patente US No. 5,587,458. Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; de este modo, estos pueden ser adecuados para reducir la unión no específica durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión a scFv se pueden construir para producir la fusión de una proteína efectora en los extremos amino o carboxi terminal de un scFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra . El fragmento del anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe, por ejemplo en la patente US No. 5,641,870. Tales anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . 5. Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de una proteína de FcRH5 descrita en la presente. Otros de estos anticuerpos pueden combinar un sitio de unión FcRH5 con un sitio de unión para otra proteína. En forma alternativa, una rama anti-FcRH5 se puede con una rama que se una a una molécula desencadenante en un leucocito tal como una molécula del receptor de las células T (por ejemplo, CD3), o receptores de Fe para IgG (FcyR) tal como FCYRI (CD64) , FCYRII (CD32) y FcyRIII (CD16) , para centrar y localizar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa FcRH5. Los anticuerpos biespecífieos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos en las células que expresan el FcRH5. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión al FcRH5.y un brazo que se une a un agente citotóxico, (por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, alcaloides de vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno con isótopo radiactivo) . Los anticuerpos biespecífieos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos F(ab' )2) .
O 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRIII y la Patente U.S. No. 5,837,234 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/an i-FcyRI . Un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fca se f muestra en O98/02463. La Patente U.S. No. 5,821,337 y 6,407,213 describen anticuerpos biespecífieos anti-ErbB2/anti-CD3. También se han descrito anticuerpos biespecífieos adicionales que unen un epítopo del antígeno CD3 y un segundo antígeno. Ver, por ejemplo, Patente U.S. Nos. 5,078,998 (antígeno anti-CD3/célula tumoral) ; 5,601,819 (anti-CD3/lL-2R; anti-CD3/CD28; anti-CD3/CD45) ; 6,129,914 (anti-CD3/antígeno de célula B maligna); 7,112,324 (anti-CD3/CD19) ; 6,723,538 (anti-CD3/CCR5) ; 7,235,641 (antÍ-CD3 /EpCAM) ; 7.262.276 (anti-CD3/antígeno de tumor ovárico) ; y 5,731,168 (anti-CD3/CD4IgG) .
Los métodos para obtener anticuerpos biespecífieos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada -cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)) . Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza con etapas de cromatografía de afinidad, es más bien engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Se describen procedimientos similares en WO 93/08829 y en Traunecker y otros., EMBO J., ^0:3655-3659 (1991).
De acuerdo con un método diferente, los dominios variables del anticuerpo se fusionan la especificidad de unión deseada (sitio de combinación del anticuerpo-antígeno) a las secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. Con preferencia, la fusión, por ejemplo, es con un dominio constante de la cadena pesada de la Ig, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) , que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, esté presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina se insertan en los vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo hospedero adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las modalidades cuando se usan relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos en la construcción proveen rendimientos óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales produce altos rendimientos o cuando las relaciones no son de significación particular.
En una modalidad preferida de este método, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en una rama y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida que proporciona una segunda especificidad de unión) en la otra rama. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado proveniente de las combinaciones no deseadas de cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de la inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Este método se describe en O 94/04690. Para mayores detalles de la generación de anticuerpos biespecífieos ver, por ejemplo, Suresh y otros., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo con otro método descrito en la Patente U.S 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpos se puede manipular genéticamente para maximizar el porcentaje de los heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante . La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar para las cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácidos mayores con las más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero respecto de otros productos finales no deseados tales como homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos producido de acuerdo con este método se denominan en la presente como anticuerpos "protuberancia dentro de la cavidad" .
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar con avidina, el otro a biotina. Se han propuesto los anticuerpos, por ejemplo, para dirigirse a las células del sistema inmune a las células no deseadas (Patente U.S: No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección con VIH (WO 91/00360, WO 92/00373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden obtener usando cualquier medio de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente U.S 4,676,980, junto con numerosas técnicas de reticulación.
También se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar usando ligamiento químico. Brennan y otros., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2- Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinos e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos de Fab ' generados luego se convierten a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab 1 -TNB luego se reconvierte a Fab 1 -tiol por la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas".
El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos de Fab'-SH de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby y otros., J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) describe la producción de la molécula de F(ab' )2 del anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó en forma separada de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unir las células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los blancos del tumor de mama humano .
También se han descrito varias técnicas para obtener y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo celular recombinante . Por ejemplo, se han producido heterodímeros bivalentes usando cierres de leucina. Kostelny y otros., J. Im unol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos de cierre de leucina provenientes de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab 1 de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego se reoxidan para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también se puede utilizar para la producción de los homodímeros del anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger y otros., Proc . Nati. Acad Sci. U.S.A, 90:6444-6448 (1993) ha provisto un mecanismo alternativo para obtener fragmentos de anticuerpos biespecífieos . Los fragmentos comprenden dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, de este modo se forman dos sitios de unión al antígeno. También se ha informado otra estrategia para obtener fragmentos de anticuerpos biespecíficos/bivalentes por el uso de dímeros de cadena única Fv (sFv) . Ver Gruber y otros., J. Immunol . , 152:5368 (1994) .
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecífieos .
Tutt y otros., J. Immunol . 147:60 (1991). 6. Anticuerpos heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos en forma covalente. Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar con avidina, el otro a biotina. Se han propuesto los anticuerpos, por ejemplo, para dirigirse a las células del sistema inmune a las células no deseadas (U.S.P. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección con VIH (WO 91/00360, WO 92/00373, y EP 03089) . Está contemplado que los anticuerpos se pueden preparar in vi tro usando métodos conocidos en química de síntesis de proteínas, que incluyen los que involucran agentes de reticulaciones. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o por la formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4 -mercaptobutirimidato y los que se describen, por ejemplo, en la patente US No. 4,676,980. 7. Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente se puede incorporar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de los de la clase IgM) con tres o más sitios de unión de antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , que se pueden producir fácilmente por la expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerizacion y tres o más sitios de unión al antígeno. El dominio de dimerizacion preferido comprende (o consiste) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión al amino- terminal del antígeno a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido de la presente comprende (o consiste) tres a aproximadamente ocho, pero con preferencia cuatro sitios de unión al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptídica (y con preferencia dos cadenas polipeptídicas) , en donde la cadena polipeptídica (s) comprende dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena polipeptídica puede comprender VDl-(Xl)n -VD2-(X2)n -Fe, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena polipeptídica de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena polipeptídica (s) puede comprender: cadena de Fe de la región VH-CHl-enlazador VH-CHl-flexible; o la cadena Fe de la región VH-CH1-VH-CH1. El anticuerpo multivalente de la presente con preferencia además comprende al menos dos (y con preferencia cuatro) polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera, El anticuerpo multivalente de la presente, por ejemplo, puede comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera. Los polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera aquí contempladas comprende un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente , además comprenden un dominio CL. 8. Manipulación genética de la función efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora de Fe, por ejemplo, de modo de modificar (por ejemplo, aumentar o eliminar) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede obtener por introducir uno o más sustituciones de aminoácidos en una región de Fe del anticuerpo. En forma alternativa o en forma adicional, los residuos de cisteína se pueden introducir en la región de Fe, de este modo se permite la formación de enlaces disulfuro intercatenario en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener mejor capacidad de internalización y/o aumento de la destrucción celular mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Ver Carón y otros., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B.
J . Immunol . 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral aumentada también se pueden preparar usando entrecruzadores heterobifuncionales como se describe en Wolff y otros. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993) . Alternativamente, se puede manipular genéticamente un anticuerpo que tiene regiones de Fe duales y de este modo puede presentar aumento de lisis de complemento y capacidades de ADCC. Ver Stevenson y otros Anti-Cáncer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar la vida media sérica del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de reciclaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) , por ejemplo como se describe en la Patente US 5,739,277. Como se usa en la presente, el término "epítopo de unión al receptor de reciclaje" se refiere a un epítopo de la región de Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable para aumentar la vida media sérica in vivo de la molécula de IgG. 9. Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconjugados (denominados en forma indistinta "conjugados de anticuerpo-fármaco" o "ADC" ) , que comprende un anticuerpo conjugado a uno o más agentes citotóxicos tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibitorio del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina proteica, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, planta o animal o sus fragmentos) , o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado) .
En ciertas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo y un agente quimioterapéutico u otra toxina. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen en la presente (por ejemplo, con anterioridad) . Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de los mismos que se pueden usar incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos de la toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteína Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantiar, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de los anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 9°Y, y 186Re . Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se preparan por medio una variedad de agentes de acoplamiento de la proteína bifuncional tales como propionato de N-succinimidil-3 - (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCl) , ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniumbenzoil ) -etilenodiamina) , diisocianatos (tal como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta y otros., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1- isotiocianatobencil-3 -metildietilen triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para conjugación del radionucleotido al anticuerpo. Ver O94/11026.
Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de pequeñas moléculas, tales como una calicheamicin , péptidos de aurostatinas , tales como monometilauristatina (MMAE) (análogo sintético de dolastatina) , maitansinoides , tales como DM1, a tricoteceno, y CC1065, y y los derivados de estas toxinas que tiene actividad de toxina, también están contempladas en la presente.
Ejemplos de inmunoconjugados - conjugados de anticuerpo y fármaco Un inmunoconjugado (o "conjugado de anticuerpo y fármaco" ( "ADC" ) ) de la invención puede ser de la siguiente Fórmula I, en donde un anticuerpo se conjuga (es decir, se une en forma covalente) a uno o más residuos de fármaco (D) a través de un enlazador opcional (L) . 'Los ADC pueden incluir conjugados de fármaco y tioMAb ( "TDC" ) .
Ab-(L-D)p i Por consiguiente, el anticuerpo se puede conjugar al fármaco en forma directa o por medio de un enlazador. En la Fórmula I, p es el número promedio de residuos de fármaco por anticuerpo, que puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos de fármaco por anticuerpo, y en ciertas modalidades, de 1 a aproximadamente 8 residuos de fármaco por anticuerpo. La invención incluye una composición que comprende una mezcla de compuestos de ant cuerpo-fármaco de Fórmula I donde la carga de fármaco promedio por anticuerpo es aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o aproximadamente 3 a aproximadamente 4. a. Ejemplos de enlazadores Un enlazador puede estar compuesto de uno o más componentes del enlazador. Los ejemplos de los componentes del enlazador incluyen 6 -maleimidocaproílo ( "MC" ) , maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrullina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), y los que resulten de la conjugación con enlazadores del reactivo: pentanoato de N-succinimidil 4- (2-piridiltio) que forma residuo enlazador de ácido 4-mercaptopentanoico "SPP"), 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato de N- succinimidilo que forma residuo enlazador de ácido (2,5-dioxopirrolidin-l-il ) metil ) ciclohexanocarboxílico ( "SMCC" , también denominado en la presente como "MCC" ) , 4- (piridin-2-ildisulfañil) butanoato de 2 , 5-dioxopirrolidin-l-ilo que forma residuo enlazador de ácido 4-mercaptobutanoico ("SPDB"), (4-yodo-acetil) aminobenzoato de N-succinimidilo ("SIAB"), etilenoxi -CH2CH20- como una o más unidades repetidas ( "EO" o "PEO"). Los componentes adicionales del enlazador son conocidos en la técnica y algunos se describen en la presente Un enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco en la célula. Por ejemplo, se puede usar un enlazador lábil a los ácidos (por ejemplo, hidrazona) , enlazador sensible a proteasa (por ejemplo, sensible a proteasa), enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari y otros., Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente U.S. No. 5, 208, 020) .
En ciertas modalidades, un enlazador se muestra en la siguiente Fórmula II: ? W Y— II a vvw Ty en donde A es una unidad de extensión, y a es un número entero de 0 a 1; W es una unidad de aminoácido, y w es un número entero de 0 a 12 ; Y es una unidad espadadora, e y es 0, 1, o 2; y Ab, D, y p se definieron anteriormente para la Fórmula I. Los ejemplos de modalidades de los enlazadores se describen en US 2005-0238649 Al, que se incorpora expresamente en la presente por referencia.
En algunas modalidades, un componente enlazador puede comprender una "unidad de extensión" que liga un anticuerpo a otro componente enlazador o a un residuo de fármaco. Los ejemplos de unidades de extensión se muestran a continuación (en donde la línea ondulada indica sitios de unión covalente a un anticuerpo) : En algunas modalidades, un componente enlazador puede comprender una unidad de aminoácido. En una de estas modalidades, la unidad de aminoácido permite la escisión del enlazador por una proteasa, de este modo facilita la liberación del fármaco del inmunoconjugado después de la exposición a proteasas intracelulares , tales como enzimas lisosómicas Ver, por ejemplo, Doronina y otros. (2003) Nat . Biotechnol. 21:778-784. Los ejemplos de unidades de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido, y un pentapéptido . Los ejemplos de dipéptidos incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) ; fenilalanina-lisina (fk o phe-lys) ; o N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit) . Los ejemplos de 'tripéptidos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit ) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Una unidad de aminoácido puede comprender residuos de aminoácidos naturales, además de los aminoácidos menores y los análogos de aminoácidos no naturales, tales como citrulina. Las unidades de aminoácidos se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para la escisión enzimática por enzimas particulares, por ejemplo una proteasa asociada al tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
En algunas modalidades, un componente enlazador puede comprender una unidad "espadadora" que une el anticuerpo a un residuo de fármaco, en forma directa o a modo de una unidad de extensión y/o una unidad de aminoácido. Una unidad espaciadora puede ser "autodestructiva" o "no autodestructiva . " Una unidad espadadora "no autodestructiva" es una en que parte o el total de la unidad espaciadora permanece unida al residuo de fármaco después de la escisión enzimática (por ejemplo, proteolítica) del ADC. Los ejemplos de unidades espaciadores de no autodestructivo incluyen, pero sin limitación, una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora de glicina-glicina. Otras combinaciones de espaciadores peptídicos susceptible a la escisión enzimática específica de secuencia también están contempladas. Por ejemplo, la escisión enzimática de un ADC que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina por una proteasas asociada a células tumorales debería producir la liberación del residuo de fármaco de glicina-glicina del resto del ADC. En una de estas modalidades, el residuo de fármaco de glicina-glicina luego se somete a una etapa de hidrólisis separada en la célula tumoral, de este modo se escinde la unidad espaciadora de glicina-glicina del residuo de fármaco.
Una unidad espaciadora "autodestructiva" permite la liberación del residuo de fármaco sin una etapa separada de hidrólisis. En ciertas modalidades, una unidad espaciadora de un enlazador comprende una unidad de p-aminobencilo . En una de esta modalidades, un alcohol p-aminobencílico se une a una unidad de aminoácido por medio de un enlace amida, y un carbamato, metilcarbamato, o carbonato se forma entre el alcohol bencílico y un agente citotóxico. Ver, por ejemplo, Hamann y otros. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103. En una modalidad, la unidad espadadora es p-aminobenciloxicarbonilo (PAB) . En ciertas modalidades, la porción fenileno de una unidad p-aminobencilo está sustituida con Qm, en donde Q es alquilo -Ci-C8, -O- (alquilo Ci-C8) , -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0-4. Los ejemplos de las unidades espaciadoras autodestructivo también incluyen, pero sin limitación, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares a alcohol p-aminobencílico (ver, por ejemplo, US 2005/0256030 Al) , tal como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay y otros. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett . 9:2237) y orto- o para-aminobencilacetales . Se pueden usar espaciadores que experimentan la ciclación después de la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas del ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues y otros., Chemistry Biology, 1995, 2, 223); sistemas anulares biciclo [2 , 2 , 1] y biciclo [2 , 2 , 2] apropiadamente sustituidos (Storm, y otros., J. Amer. Chem. Soc . , 1972, 94, 5815); y amidas del ácido 2-aminoren ilpropiónico (Amsberry, y otros., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867) . La eliminación de los fármacos que contienen amina que están sustituidas en la a de glicina (Kingsbury, y otros., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) también son ejemplos de espaciadores autodestructivo útiles en los ADC .
En una modalidad, una unidad espaciadora es una unidad de bis (hidroximetil) estireno ramificado (BHMS) que se describe a continuación, que se puede usar para incorporar y liberar fármacos múltiples. 2 fármacos en donde Q es alquilo de Ci-C8, -O- (alquilo de Ci-C8) , -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que varía de 0-4; n es 0 ó 1; y p varía de 1 a aproximadamente 20 En otra modalidad, el enlazador L puede ser un enlazador tipo dendrítico para la unión covalente de más de un residuo de fármaco a través de un residuo enlazador de ramificación, multifuncional a un anticuerpo (Sun y otros (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun y otros (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768) . Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la relación molar del fármaco al anticuerpo, es decir, la carga, que se relaciona con la potencia del ADC. En consecuencia, cuando un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína porta solo un grupo reactivo de tiol de la cisteína, una multitud de residuos de fármaco se pueden unir a través de un enlazador dendrítico.
Los ejemplos de componentes enlazadores y sus combinaciones se muestran a continuación en el contexto de los ADC de Fórmula II: Val-Cit o VC Los componentes enlazadores que incluyen unidades de extensión, espaciadores y aminoácidos, se pueden sintetizar por métodos conocidos en la técnica, tales como los que se describen en 2005-0238649 Al. b. Ejemplos de residuos de fármaco (1) Maitansina y maitansinoides En algunas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan por inhibición de polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló primero del arbusto del este de África Maytenus serrata (Patente U.S No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tal como maitansinol y ásteres de maitansinol C-3 (Patente U.S No. 4,151,042) . Los maitansinol sintéticos y derivados y análogos del mismo se describen, por ejemplo en las Patentes U.S Nos. 4,137,230, 4,248,870, 4,256,746, 4,260,608, 4,265,814, 4,294,757, 4,307,016, 4,308,268, 4,308,269, 4,309,428, 4,313,946, 4,315,929, 4,317,821, 4,322,348, 4,331,598, 4,361,650, 4,364,866, 4,424,219, 4,450,254, 4,362,663, y 4,371,533 .
Los residuos de fármacos maitansinoides son residuos de fármacos atractivos para los conjugados de anticuerpo y fármaco porque son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivat ización de los productos de fermentación, (ii) susceptible a derivatización con grupos funcionales adecuados para la conjugación mediante los enlazadores no disulfuro a los anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) efectivo contra una variedad de líneas celulares tumorales .
Los compuestos de maitansina adecuados para usar como residuos de fármaco maitansinoide son bien conocidos en la técnica y se pueden aislar de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos o producidos usando técnicas de ingeniería genética y fermentación (US 6790952; US 2005/0170475; Yu y otros (2002) PNAS 99:7968-7973) . aitansinol y los análogos de maitansinol también se pueden preparar en forma sintética de acuerdo con método conocidos .
Los ejemplos de residuos de fármaco maitansinoide ocluyen los que tienen un anillo aromático modificado, tal como: C-19-decloro (Patente U.S. No. 4256746) (preparado por la reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patente U.S. Nos. 4361650 y 4307016) (preparado por la desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o descoloración usando LAH) ; y C-20-demetoxi , C-20-aciloxi (-OCOR), +/-decloro (Patente U.S. No. 4,294,757) (preparado por acilación usando cloruros de acilo) y los que tienen modificaciones en otras posiciones.
Los ejemplos de residuos de fármaco maitansinoide también incluyen los que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (Patente U.S. No. 4424219) (preparado por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5) ; C-14-alcoximetil ( demetoxi / CH2 0) (OS 4331598); C-14-hidroximet ilo o aciloximetilo (CH20H o CH2OAc) (Patente U.S. No. 4450254) (preparado en Nocardia) ; C-15-hidroxi/aciloxi (US 4364866) (preparado por la conversión de maitansinol por Streptomyces) ; C-15-metoxi (Patentes U.S. Nos. 4313946 y 4315929) (aislados de Trewia nudlflora) ; C-18-N-desmet ilo (Patente U.S. Nos. 4362663 y 4322348) (preparado por la desmet ilación de maitansinol por Streptomyces) ; y 4,5-desoxi (US 4371533) (preparado por la reducción con tricloruro de titanio/LAH de maitansinol) .
Se sabe que muchas posiciones de los compuestos de maitansina son útiles como posición de enlace, de acuerdo con el tipo de enlace. Por ejemplo, para formar una enlace éster, la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo son todas adecuadas (US 5208020; US RE39151; US 6913748; US 7368565; US 2006/0167245; US 2007/0037972) .
Los residuos de fármaco mai tansinoides incluyen los que tienen la estructura: unión covalente del átomo de azufre del residuo de fármaco mai tansinoide a un enlazador de un ADC . R puede ser de modo independiente H o un alquilo de Ci-C6. La cadena alquileno que une el grupo amida al átomo de azufre puede ser metanilo, etanilo, o propilo, es decir, m es 1, 2, o 3 (US 633410; US 5208020; US 7276497; Chari y otros (1992) Cáncer Res. 52:127-131; Liu y otros (1996) Proc . Nati. Acad. Sci USA 93:8618-8623) .
Todos los estereoisómeros del residuo de fármaco maitansinoide están contempladas por los compuestos de la invención, es decir, cualquier combinación de configuraciones R y S en los carbonos quirales de D. En una modalidad, el residuo de fármaco maitansinoide tendrá la siguiente estereoquímica: Los ejemplos de modalidades de residuos de fármaco maitansinoides incluyen: DM1; DM3; y DM4, que tienen las estructuras : en donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre del fármaco a un enlazador (L) del conjugado de anticuerpo y fármaco. (WO 2005/037992; US 2005/0276812 Al) .
Otros ejemplos de conjugados de anticuerpo y fármaco maitansinoide tienen las siguientes estructuras y abreviaturas, (en donde Ab es anticuerpo y p es 1 a aproximadamente 8) : Ab-SMCC-DMl En una modalidad, el conjugado de anticuerpo y fármaco se forma cuando DM4 se une a través de un enlazador SPDB a un grupo tiol del anticuerpo (ver Patentes U.S. Nos. 6913748 y 7276497, cuyos contenidos completos se incorporan por referencia en la presente) .
Los ejemplos de conjugados de anticuerpo y fármaco donde DM1 se une a través un enlazador BMPEO a un grupo tiol del anticuerpo tienen la estructura y abreviatura: donde Ab es el anticuerpo; n es 0, 1, o 2; y p es 1, 2, 3, o 4.
Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides , los métodos de obtenerlos y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en Erickson, y otros (2006) Cáncer Res. 66 (8) :4426-4433; Patentes U.S. Nos. 5,208,020, 5,416,064, US 2005/0276812 Al, y Patente europea EP 0 425 235 Bl, cuyas descripciones se incorporan expresamente por la presente como referencia. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan por unión química de un anticuerpo a la molécula maitansinoide sin disminución significativa de la actividad biológica del anticuerpo o la molécula del maitansinoide. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,208,020 (cuya descripción se incorpora expresamente en la presente como referencia) . Los maitansinoides se pueden sintetizar por técnicas conocidas o aisladas de fuentes naturales. Los maitansinoides adecuados se describen, por ejemplo en la Patente Estadounidense No. 5,208,020 y en las otras publicaciones de patentes y no patentes mencionadas anteriormente en la presente, tales como maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la moléculas de maitansinol, tal como diversos ésteres de maitansinol.
Hay grupos de unión conocidos en la técnica para la preparación de conjugados del anticuerpo-maitansinoide , que incluyen, por ejemplo a los descritos en la Patente Estadounidense No. 5,208,020 o Patente EP 0 425 235 Bl, Chari y otros., Cáncer Research 52:127-131 (1992), y US 2005/016993 Al, cuyas descripciones se incorporan expresamente en la presente como referencia. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprende el componente enlazador SMCC se puede preparar como se describe en 2005/0276812 Al. "Antibody-drug conjugates and Methods . " Los enlazadores comprenden grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos de ácidos lábiles, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa o grupos lábiles a esterasa, como se describe en las patentes identificadas anteriormente. Los grupos de unión adicionales se describen y ejemplifican en la presente.
Los conjugados del anticuerpo y maitansinoide se pueden preparan mediante una variedad de agentes de acoplamiento de una proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2 -piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HC1) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tal como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bisactivo (tales como 1 , 5 -difluoro- 2 , 4 -dinitrobenceno) . En ciertas modalidades, el agente es N- succinimidil - 3 - ( 2 -piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson y otros., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) o N- succinimidi1 -4 - (2-piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar una unión de disulfuro .
El enlazador se puede unir a la molécula maitansinoide en varias posiciones, que dependen del tipo de unión. Por ejemplo una unión éster se puede formar por la reacción con un grupo hidroxilo mediante técnicas de acoplamiento convencional . La reacción se puede producir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad, la unión se forma en la posición C-3 del maitansinol o un análogo de maitansinol. (2) Auris a inas y dolastatinas En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a dolastatinas o análogos peptídico de dolostatina y derivados, las auristatinas (Patentes U.S Nos. 5,635,483, 5,780,588) . Se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos , hidrólisis de GTP y división nuclear y celular (Woyke y otros (2001) Antimicrob. Agents y Chemother. 45(12) :3580-3584) y tienen actividad anticancerígeno (US 5.663.149) y antifúngica (Pettit y otros (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). El residuo del fármaco de dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo mediante el extremo terminal del N (amino) o C (carboxilo) del residuo del fármaco peptídico (WO 02/088172) .
Los ejemplos de las modalidades de auristatina incluyen los residuos del fármaco monometilauristatina ligado al extremo N-terminal DE y DF (US 2005/0238649, descrito en Senter y otros, Proceedings of the American Association for Cáncer Research, Volumen - 45, Número de resumen 623, presentado el 28 de marzo de 2004, cuya descripción se incorpora expresamente en la presente memoria como referencia en su totalidad) .
Un residuo de fármaco peptídico se puede seleccionar de las siguientes Fórmulas DE y DF: en donde la línea ondulada de DE y DF indica el sitio de unión covalente a un anticuerpo o componente del anticuerpo-enlazador, y se unen de modo independiente en cada ubicación: R2 se selecciona de H y alquilo de Ci-C8; R3 se selecciona de H, alquilo de Ci-C8, carbociclo de C3-C8, arilo, alquil de Ci-Cs-arilo, alquil de Cx-C8- (carbociclo de C3-C8) , heterociclo de C3-C8 y alquilo de Ci-C8- (heterociclo de C3-C8) ; R4 se selecciona de H, alquilo de Ci-C8, carbociclo de C3-C8, arilo, alquil de Ci-C8-arilo, alquil de Ci-C8- (carbociclo de C3-C8) , heterociclo de C3-C8 y alquil de Ci-C8- (heterociclo de C3-C8) ; R5 se selecciona de H y metilo; o R4 y R5 forman en conjunto un anillo carbocíclico y tiene la fórmula -(CRaRb)n- en donde Ra y Rb se seleccionan de modo independiente de H, alquilo de Ci-C8 y carbociclo de C3-C8 y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona de H y alquilo de Ci-C8; R7 se selecciona de H, alquilo de Ci-C8, carbociclo de C3-C8, arilo, alquil de Ci-C8-arilo, alquil de Ci-C8- (carbociclo de C3-C8) , heterociclo de C3-C8 y alquil de Ci-C8- (heterociclo de C3-C8) ; cada R8 se selecciona de modo independiente de H, OH, alquilo de Ci-C8, carbociclo de C3-C8 y O- (alquilo de Ci-C8) ; R9 se selecciona de H y alquilo de Ci-C8; R10 se selecciona de arilo o heterociclo de C3-C8; Z es 0, S, NH, o NR12, en donde R12 es alquilo de Ci- C8; R11 se selecciona de H, alquilo de Ci-C2o, arilo, heterociclo de C3-C8, - (R130) m-R14 , o - (R130) m-CH (R15) 2 ; m es un número entero que varía de 1-1000; R13 es alquilo de C2-C8; R14 es H o alquilo de Cx-Cs; cada aparición de R15 es de modo independiente H, C00H, -(CH2)n-N(R16) 2, -(CH2)n-S03H, o - (CH2) n-S03-alquilo de Ci-C8; cada aparición de R16 es de modo independiente H, alquilo de Ci-C8, o - (CH2) n-COOH; R18 se selecciona de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-( eterociclo de C3-C8) , y -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo de C3-C8) ; y n es un número entero que varía de 0 a 6.
En una modalidad, R3, R4 y R7 son de modo independiente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H o metilo. En un ejemplo de modalidad, R3 y R4 son isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo.
En aún otra modalidad, R2 y R6 son metilo, y R9 es - H.
En otra modalidad más, cada aparición de R8 es -OCH3. En un ejemplo de modalidad, R3 y R4 son isopropilo, R2 y R6 son metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de Rs es -0CH3, y R9 es -H.
En una modalidad, Z es -0- o -NH- .
En una modalidad, R10 es arilo.
En un ejemplo de modalidad, R10 es -fenilo. En un ejemplo de modalidad, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En una modalidad, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en donde R15 es - (CH2) n-N (R16) 2, y R16 es -alquilo de Ci-C8 o - (CH2)n-C00H.
En otra modalidad, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en donde R15 es - (CH2) n-S03H.
Un ejemplo de modalidad de auristatina de fórmula DE es MMAE, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo y fármaco : Un ejemplo de modalidad de auristatina de fórmula DF es MMAF, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) del conjugado de anticuerpo y fármaco (ver US 2005/0238649 y Doronina y otros. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124): MMAF Otros ejemplos de modalidades incluyen los compuestos de monometilvalina que tienen fenilalanina con modificaciones carboxi en el C-terminal del pentapéptido del residuo de fármaco de auristatina ( O 2007/008848) y compuestos de monometilvalina que tienen fenilalanina con modificaciones en la cadena lateral en el C-terminal del pentapéptido del residuo de fármaco de auristatina (WO 2007/008603) .
Otros residuos del fármaco incluyen los siguientes derivados de MMAF, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo y fármaco : En un aspecto, los grupos hidrófilos que incluyen pero sin limitación, ásteres de trietilenglicol (TEG) , como se mostró anteriormente, se pueden unir al residuo de fármaco en R11. Sin estar ligado a ninguna teoría particular, los grupos hidrófilos colaborar en la internalización y no aglomeración del residuo de fármaco.
Los ejemplos de modalidades de ADC de Fórmula I que comprende una auristatina/dolastatina o derivado de estas se describen en US 2005-0238649 y Doronina y otros. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124, que se incorpora expresamente en la presente por referencia. Los ejemplos de modalidades de los ADC de Fórmula I que comprenden MMAE o MMAF y varios componentes enlazadores tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en donde "Ab" es un anticuerpo; p es 1 a aproximadamente 8, "Val-Cit" o "ve" es un dipéptido de valina-citrulina; y "S" es un átomo de azufré. Se observará que en algunas de las descripciones estructurales de azufre enlazada al ADC en la presente el anticuerpo se representa como "Ab-S" solo para indicar la característica del enlace de azufre y no para indicar que un átomo de azufre particular porta múltiples residuos de enlazador-fármaco . Los paréntesis de la izquierda de las siguientes estructuras también se pueden colocar a la izquierda del átomo de azufre, entre Ab y S, que sería una descripción equivalente del ADC de la invención descrito en toda la presente.
Ab-MC-vc-PAB-MMAF Ab-MC-vc-PAB-MMAE Ab-MC-MMAE Los ejemplos de modalidades de los ADC de la Fórmula I que comprenden MMAF y varios componentes enlazadores además incluyen Ab-MC-PAB-MMAF y Ab-PAB-MMAF. De modo interesante, los inmunoconjugados que comprenden MMAF unidos a un anticuerpo por un enlazador que no es proteolíticamente escindible ha demostrado poseer actividad comparable a los inmunocon ugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un enlazador proteolíticamente escindible. Ver, Doronina y otros. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. En estos casos, se considera que la liberación del fármaco es efectuada por la degradación del anticuerpo la célula. Id Normalmente, los residuos del fármaco basados en péptidos se pueden preparar por la formación de un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos del péptido. Tales enlaces de péptidos se pueden preparar, por ejemplo de acuerdo con el métodos de síntesis en fase líquida (ver E. Schróder y K. Lübke, "The Peptide" , volumen 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Los residuos de fármaco auristatina/dolastatina se pueden preparar de acuerdo con los métodos de: 2005-0238649 Al; Patente U.S. No, 5635483; Patente U.S. No 5780588; Pettit y otros (1989) J. Am. Chem. Soc . 111:5463-5465; Pettit y otros (1998) Anti-Cáncer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., y otros. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit y otros (1996) J". Chem. Soc. Perkin Trans . 1 5:859-863; y Doronina (2003) Nat . Eiotechnol . 21 ( 7 ): 778-784.
En particular, los residuos de fármaco de auristatina/dolastatina de fórmula DF( tales como MMAF y sus derivados, se pueden preparar usando métodos descritos én US 2005-0238649 Al y Doronina y otros. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Los de fármaco de auristatina/dolastatina de fórmula DE, tales como MMAE y sus derivados, se pueden preparar usando métodos descritos en Doronina y otros. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784. Los residuos de fármaco-enlazador MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, y MC-vc-PAB-MMAE se pueden sintetizar convenientemente por métodos de rutina, por ejemplo, como se describe en Doronina y otros. (2003) Nat. Biotech. 21 : 778-784 , y publicación de solicitud de Patente No. US 2005/0238649 Al, y luego se conjuga a un anticuerpo de interés. (3) Calicheamicina En otras modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de calicheamicina de antibióticos es capaz de producir rupturas del ADN de doble cadena en concentraciones sub-picomolares . Para la preparación de conjugados de la familia de calicheamicina, ver Patentes U:S 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas de la American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de la calicheamicina que se pueden usar incluyen pero sin limitación a, ??1, 2t , a3t , N-acetil-?!1 , PSAG y ?1! (Hinman y otros., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993) , Lode y otros., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes U.S precedentes de American Cyanamid) . Otro fármaco antitumoral que se puede conjugar al anticuerpo es QFA que es un antifolato. La calicheamicina y QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesa fácilmente la membrana plasmática. Por consiguiente, la captación celular de estos agentes mediante la internalización mediada por anticuerpos mejora mucho sus efectos citotóxicos. c. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina , vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las Patentes U.S. 5,053,394, 5,770,710, además de esperamicinas (Patente U.S. 5,877,296).
Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que se pueden usar incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina difteria, cadena A de exotoxina (de la Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993.
La presente invención además contempla un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como a desoxiribonucleasa, ADNsa) .
En ciertas modalidades, un inmunoconj ugado puede comprender un átomo altamente radiactivo. . Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radiocon ugados . Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re185, Re188, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para la detección puede comprender un átomo radioactivo para estudios centellográficos , por ejemplo tc99m o I123, o y una marca del espín para imágenes de resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida imágenes de resonancia magnética, mri) , tal como yodo-123 otra vez, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro .
Las marcas radioactivas u otras se pueden incorporar en el inmunoconjugado de maneras conocidas. Por ejemplo el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar por síntesis química de aminoácidos mediante precursores de aminoácidos adecuados que involucran, por ejemplo flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las marcas tales tc99m o I123, Re186, Re168 e Inlu se pueden unir por medio de un residuo de cisteína del péptido. El itrio- 90 se puede unir por medio de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Firaker y otros (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 80: 49-57 se puede usar para incorporar yodo-123. "Monoclonal Anticuerpos in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
En ciertas modalidades, un inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo conjugado a una enzima activadora del profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, ver WO 81/01145) en un fármaco activo, tales como un fármaco anti-cáncer. Tales inmunoconjugados son útiles para una terapia de profármaco mediada por enzima dependiente del anticuerpo ("ADEPT"). Las enzimas que se puede conjugar a un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fosfatasa alcalinas, que son útiles para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasas , que son útiles para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citocina desaminasa, que es útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cancerígeno, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas , que son útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas que escinden carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa, que son útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa, que es útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa y penicilina G amidasa, que son útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de aminas con grupos fenoxicetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Las enzimas se pueden unir en forma covalente a los anticuerpos por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, Neuberger y otros., Nature 312 :604-608 (1984) . d. Carga del fármaco La carga del fármaco está representada por p, el número promedio de residuos de fármaco por anticuerpo en una molécula de Fórmula I . La carga del f rmaco puede variar de 1 a 20 residuos de fármaco (D) por anticuerpo. Los ADC de Fórmula I incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con una variedad de residuos de fármaco, de 1 a 20. El número promedio de residuos de fármaco por anticuerpo en las preparaciones del ADC a partir de las reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopia de masa, ensayo de ELISA y HPLC . También se puede determinar la distribución cuantitativa de ADC en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación, y caracterización del ADC homogéneo donde p es un valor determinado de ADC con otras cargas del fármaco se puede obtener por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis . Las formulaciones farmacéuticas de los conjugados de anticuerpo y fármaco de Fórmula I en consecuencia pueden ser una mezcla heterogénea de los conjugados con anticuerpos unidos a 1, 2, 3, 4, o más residuos de fármaco.
En algunos conjugados de anticuerpo y fármaco, p puede estar limitada por la cantidad de sitios de unión del anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión es un tiol de la cisteína, como en los ejemplos de las modalidades anteriores, un anticuerpo puede tener uno o varios grupos tiol de la cisteína, o pueden solo uno varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los que se puede unir un enlazador. En ciertas modalidades, la carga de fármaco superior, por ejemplo p >5, puede causar agregación, insolubilidad, toxicidad, o pérdida de permeabilidad celular de ciertos conjugados de anticuerpo y fármaco. En ciertas modalidades, la carga del fármaco para un ADC de la invención varía de 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 ; o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 En efecto, se ha demostrado que para ciertos ADC, la relación óptima de residuos de fármaco por anticuerpo puede ser menos de 8, y puede ser aproximadamente 2 a aproximadamente 5. Ver US 2005-0238649 Al.
En ciertas modalidades, menos del máximo teórico de los residuos de fármaco se conjugan a un anticuerpo durante una reacción de conjugación reacción. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reaccionan con el intermediario fármaco-enlazador o reactivo enlazador, como se describe a continuación. En general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de la cisteína libres y reactivos que se pueden unir a un residuo de fármaco; en efecto la mayor parte del tiol de los residuos de cisteína en los anticuerpos existe como puentes disulfuro. En ciertas modalidades, un anticuerpo se puede reducir con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP) , en condiciones reductoras parciales o totales, para generar los grupos reactivos tiol de la cisteína. En ciertas modalidades, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar grupo nucleófilos tales como lisina o cisteína.
La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC se puede controlar de diferentes modos, por ejemplo, por: (i) limitación del exceso molar del intermediario fármaco-enlazador o reactivo enlazador respecto al anticuerpo, (ii) limitación del tiempo o temperatura de la reacción de la conjugación, y (iii) condiciones reductoras parciales o limitantes para la modificación del tiol de la cisteína.
Se entiende que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un intermediario fármaco-enlazador o reactivo enlazador seguido por un reactivo del residuo de fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de los compuestos de ADC con una distribución de uno o más residuos de fármaco unidos a un anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla por un ensayo de ELISA dual, que es específico para el anticuerpo y específico para el fármaco. Las moléculas individuales de ADC se pueden identificar en la mezcla por espectroscopia de masa y separar por HPLC, por ejemplo cromatografía de interacción hidrofóbica (ver, por ejemplo, McDonagh y otros (2006) Prot . Engr. Design & Selección 19 (7) :299-307; Hamblett y otros (2004) Clin. Cáncer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., y otros. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics , and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjúgate", Abstract No. 624, American Association for Cáncer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, March 2004; Alley, S.C., y otros. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Abstract No. 627, American Association for Cáncer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, Marzo de 2004) . En ciertas modalidades, se puede aislar un ADC homogéneo con un valor de carga único a partir de la mezcla de conjugación por electroforesis o cromatografía. e. Ciertos métodos de preparar inmunoconjugados Un ADC de Fórmula I se puede preparar por varias vías que emplean reacciones, condiciones, y reactivos de química orgánica conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen: (1) reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un ligando reactivo bivalente para formar un Ab-L Ab-L, por medio de un enlace covalente, seguido por una reacción con un residuo del fármaco D, y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un residuo del fármaco con un reactivo conector bivalente para formar D-L, por medio de un enlace covalente seguido por la reacción con el grupo nucleófilo de un anticuerpo. Los ejemplos de métodos adicionales para preparar un ADC de Fórmula I por medio de una última vía se describen en US 2005-0238649 Al, que se incorpora expresamente en la presente por referencia.
Los grupos nucleófilos de los anticuerpos incluyen pero sin limitación a: (i) grupos amino N-terminales (ii) grupos amino de la cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupo tiol de la cadena lateral, por ejemplo, cisteína y (iv) grupos hidroxilo de azucares o grupos amino cuando el anticuerpo está glicosilado. Los grupos amino, tiol e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos de los residuos del conector y reactivos conectores que incluyen: (i) esteres activos tales como ésteres de NHS, ásteres de HOBt, haloformiatos y haluros ácidos, (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas , (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden ser reactivos por conjugación con reactivos enlazadores por el tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) o tricarboniletilfosfina (TCEP) , de modo que el anticuerpo sea reducido en forma total o parcial. Cada puente de cisteína de este modo formará teóricamente dos nucleófilos de tiol reactivos. Los grupos nucleófilos adicionales se pueden introducir en los anticuerpos mediante la reacción de las lisinas con 2-iminotiolano, por ejemplo, por la reacción de los residuos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) que produce la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos se pueden introducir en el anticuerpo por la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparación de anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no nativa) .
Los conjugados de anticuerpo y fármaco de la invención también se pueden producir por la reacción entre un grupo eletrofílico sobre un anticuerpo, tal como un grupo carbonilo de aldehido o cetona, con un grupo nucleófilo en un reactivo enlazador o fármaco. Los grupos nucleófilos útiles en un reactivo enlazador incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona , carboxilato de hidracina, y arilhidrazida . En una modalidad, un anticuerpo se modifica para introducir restos electrófilos que son capaces de reaccionar con los sustituyentes nucleófilos del reactivo enlazador o fármaco. En otra modalidad, los azúcares de los anticuerpos glicosilados se puede oxidar por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazadores o residuos del fármaco. Los grupos de la base de Schiff imina pueden formar un base una unión estable o se puede reducir, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar uniones amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o meta-peryodato de sodio puede producir los grupos carbonilo (aldehido y cetona) la proteína que puede reaccionar con los grupos apropiados del fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, las proteínas que contienen residuos de serina o tréonina N-terminal pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, que origina la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146, US 5.362.852) . Tal aldehido se puede hacer reaccionar con un residuo del fármaco o nucleófilo enlazador.
Los grupos nucleófilos de un residuo del fármaco incluyen pero sin limitación a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos , residuos del enlazador y reactivos conectores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros ácidos, (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas, (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida.
Los compuestos de la invención contempladas expresamente, pero sin limitación, ADC se preparan con los siguientes reactivos de reactividad cruzada: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB , sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfon) benzoato) que están disponibles en el comercio (por ejemplo, en Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, ILO., U.S. A; ver páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook y Catalog .
Los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo y un agente citotóxico también se pueden obtener usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-l-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniumbenzoil ) -etilenodiamina) , diisocianatos (tal como 2 , 6 -diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1 , 5 -difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Por ejemplo se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta y otros., Science, 238: 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026.
En forma alternativa, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico se puede preparar por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud de la molécula de ADN puede comprender regiones que codifican el anticuerpo y las porciones citotóxicas del conjugado adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
En aún otra modalidad, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en un tumor que pre-dirige al conjugado anticuerpo-receptor administrado al paciente, seguido por la eliminación del conjugado no unido de la circulación mediante un agente de depuración y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) .
Ejemplos de inmunoconjugados - Conjugados de tic— anticuerpo y fármaco a. Preparación de anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína El ADN que codifica una variante de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína y los anticuerpos anti-FcRH5 originales de la invención se preparan por una variedad de métodos que incluyen, pero sin limitación, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos naturales) , preparación mutagénesis dirigida a la sitio (o mediada por oligonucleótidos) (Cárter (1985) y otros Acids nucleic Res. 13:4431-4443; Ho y otros (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; Kunkel y otros (1987) Proc . Nati. Acad. Sci USA 82:488; Liu y otros (1998) J. Biol . Chem. 273:20252-20260) , PCR mutagénesis (Higuchi, (1990) en PCR Protocols, pp 177-183, Academic Press; Ito y otros (1991) Gene 102:67-70; Bernhard y otros (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; y Vallette y otros (1989) Nuc . Acids Res. 17:723-733), y mutagénesis por cásete (Wells y otros (1985) Gene 34:315-323) de un ADN preparado antes que codifica el polipéptido. Los protocolos, kits y reactivos de mutagénesis están disponibles en el comercio, por ejemplo QuikChange® Multi Site-Direct Mutagénesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) . Las mutaciones únicas también se generan por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos usando un ADN de plásmido bicatenario como plantilla por mutagénesis basada en PCR (Sambrook y Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edición; Zoller y otros (1983) Methods Enzymol . 100:468-500; Zoller, M.J. y Smith, M. (1982) Nucí. Acids Res. 10:6487-6500). Las variantes de anticuerpos recombinantes también se pueden construir por manipulación de fragmentos por restricción o por PCR de extensión superpuesta con oligonucleótidos sintéticos. Los iniciadores mutagénicos codifican los reemplazos codónicos de cisteína. Las técnicas de mutagénesis estándares se pueden emplear para generar ADN que codifica los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína mutantes (Sambrook y otros Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; y Ausubel y otros Current Protocols in Molecular Biología, Greene Publishing y Wiley-Interscience , New York, N. Y. , 1993) .
La tecnología de despliegue en fagos (McCafferty y otros (1990) Nature 348:552-553) se puede usar para producir anticuerpos anti-FcRH5 y fragmento de anticuerpos humanos in vifcro, a partir de repertorios del gen dominio variable (V) de la inmunoglobulina a partir de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco en un gen de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se despliegan como fragmentos funcionales de anticuerpos en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también producen la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe estas propiedades. En consecuencia, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. (Johnson y otros (1993) Current Opinión in Structural Biología 3:564-571; Clackson y otros (1991) Nature, 352:624-628; Marks y otros (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Griffith y otros (1993) EMBO J. 12:725-734; US 5565332; US 5573905; US 5567610; US 5229275) .
Los anticuerpos anti-FcRH5 se pueden sintetizar químicamente usando metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o se pueden preparar y purificar usando tecnología recombinante . La secuencia de aminoácidos apropiada, o porciones de esta se pueden producir por síntesis de péptidos directa usando técnicas de fase sólida (Stewart y otros., Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Libreman Co . , San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc . , 85:2149-2154) . La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis en fase sólida automatizada se puede lograr, por. ejemplo, empleando aminoácidos protegido t-BOC o Fmoc y usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del anticuerpo anti-FcRH5 o polipéptido de FcRH5 se pueden sintetizar químicamente en forma separada y se combinan usando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo anti-FcRH5 o polipéptido de FcRH5 deseados.
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de los fragmentos de anticuerpo. En forma tradicional, estos fragmentos se derivaron por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto y otros., Journal of Biochemical and Biofisical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan y otros., Science, 229:81 o se pueden producir directamente por células hospederas recombinantes . Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar y secretar en E. coli, en consecuencia permite la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpo descritas en la presente. En forma alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar los fragmentos F(ab')2 (Cárter y otros., Bio/Technology 10:163-167 (1992)) o se pueden aislar directamente del cultivo de célula hospedera recombinante . El anticuerpo anti-FcRH5 puede ser un fragmento de cadena única de Fv (scFv) (WO 93/16185; US 5571894; US. 5587458) . El fragmento del anticuerpo anti-FcRH5 también puede ser un "anticuerpo lineal" (US 5641870) . Tales fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecífieos o biespecíficos .
La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos anti-FcRH5 al cultivar células transformadas o transíectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FcRH5. El ADN que codifica anticuerpos anti-FcRH5 se puede obtener de una biblioteca de ADNc preparada del tejido que se considera que posee el ARNm del anticuerpo anti-FcRH5 y lo expresa en un nivel detectable. Por consiguiente, un ADN del anticuerpo anti-FcRH5 o polipéptido de FcRH5 humano se puede obtener de modo conveniente a partir de una biblioteca de ADNc preparada de tejido humano. El gen que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 también se puede obtener de una biblioteca genómica o por procedimientos de síntesis conocidos (por ejemplo, síntesis de ácido nucleico automatizada) .
El diseño, selección, y preparación de los métodos de la invención permite obtener anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína que son reactivos con grupos funcionales electrófilos . Estos métodos además permiten obtener compuestos de conjugado de anticuerpo tales como conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC) , compuestos con moléculas de fármaco en sitios designados, diseñados y selectivos. Los residuos de cisteína reactivos en la superficie del anticuerpo permiten conjugar específicamente un residuo de fármaco a través de un grupo tiol reactivo tales como maleimida o haloacetilo. La reactividad nucleofílica del grupo funcional tiol de un residuo Cys a un grupo maleimida es aproximadamente 1000 veces superior en comparación con cualquier otro grupo funcional del aminoácido en una proteína, tal como un grupo amino de los residuos de lisina o el grupo amino N-terminal . La funcionalidad específica del tiol en los reactivos de yodoacetilo y maleimida puede reaccionar con los grupos aminos , pero se requieren mayor pH (>9.0) y tiempos de reacción más largos (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres) . La cantidad de tiol libre en una proteína se puede estimar por el ensayo de Ellman estándar. La inmunoglobulina es un ejemplo de pentámero unido por disulfuro, mientras que la inmunoglobulina G es un ejemplos de proteína con puentes disulfuro internos que unen las subunidades entre sí. En las proteínas tales como esta, se requiere la reducción de los enlaces disulfuro con un reactivo tal como ditiotreitol (DTT) o selenol (Singh y otros (2002) Anal. Biochem. 304:147-156) para generar el tiol reactivo libre. Este método puede producir la pérdida de la estructura terciaria del anticuerpo y la especificidad de unión del antígeno.
El ensayo PHESELECTOR (ELISA de fago para la selección de tioles reactivos) permite la detección de grupos de cisteína reactivos en los anticuerpos en un formato de fago ELISA de este modo asistir en el diseño de anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína (Junutula, J.R. y otros. (2008) J Immunol Methods 332:41-52; WO 2006/034488; US 2007/0092940) . El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína está recubierto en las superficies del cavidad, •seguido por incubación con las partículas del fago, adición de anticuerpo secundario marcado con HRP, y detección de absorbencia. Las proteínas mutantes desplegadas en el fago se analizan de una manera rápida, robusta y de alto rendimiento. Se pueden producir bibliotecas de anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína y se someten a la selección de unión usando el mismo método para identificar sitios reactivos apropiados de incorporación de Cys libre a partir de bibliotecas de fagos de proteína aleatoria de anticuerpos u otras proteínas . Esta técnica incluye la reacción de proteínas mutantes de cisteína desplegadas en fago con un reactivo de afinidad o grupo indicador que es también reactivo al tiol.
El ensayo PHESELECTOR permite la detección de grupos tiol reactivos en los anticuerpos. La identificación de la variante A121C por este método es ej emplificativa . La molécula de Fab entera se puede buscar efectivamente para identificar más variantes de TioFab con grupos tiol reactivos.
Se empleó un parámetro, accesibilidad de superficie fraccional, para identificar y cuantificar la accesibilidad del solvente a los residuos de aminoácidos en un polipéptido. La accesibilidad de superficie se puede expresar como el área de superficie (Á2) que se puede poner en contacto con una molécula del solvente, por ejemplo agua. El espacio ocupado del agua se aproxima a una esfera de radio 1.4 Á. El programa de computación está disponible libremente o bajo licencia (Secretary to CCP4 , Daresbury laboratory, Warrington, WA4 4AD, Reino Unido, Fax: (+44) 1925 603825, o por internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/fNDICE.html) como conjunto CCP4 de programas de cristalografía que emplean algoritmos para calcular la accesibilidad de superficie de cada aminoácido de una proteína con coordenadas derivadas de cristalografía de rayos X ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst . D50 : 760-763 ) . Dos ejemplos de módulos de software que realizan los cálculos de accesibilidad de superficie son "AREAIMOL" y "SURFACE" , basados en los algoritmos de B.Lee y F.M.Richards (1971) J.Mol.Biol. 55:379-400. AREAIMOL definir la superficie accesible al solvente de una proteína como el locus del centro de una esfera de prueba (que representa una molécula de solvente) a medida que gira sobre la superficie de Van der Waals de la proteína. AREAIMOL calcula el área de superficie accesible al solvente por la generación de puntos de superficie en una esfera extendida alrededor de cada átomo (a una distancia del centro del átomo igual a la suma del átomo y el radio de prueba) , y que elimina los que residen dentro de esferas equivalentes asociados con átomos vecinos. AREAIMOL halla el área accesible al solvente de los átomos en un archivo coordenada de PDB y sintetiza el área accesible por residuo, por cadena y por una molécula completa. Las áreas accesibles (o diferencias de área) para los átomos individuales se pueden escribir en un archivo de salida pseudo-PDB. AREAIMOL asume un radio único para cada elemento y solo reconoce una cantidad limitada de elementos diferentes AREAIMOL y SURFACE informan accesibilidades absolutas, es decir, el número de Angstrom al cuadrado (Á) . La accesibilidad de superficie fraccional se calcula con referencia a un estado estándar relevante para un aminoácido dentro de un polipéptido. El estado de referencia es el tripéptido Gly-X-Gly, donde X es el aminoácido de interés, y el estado de referencia debería ser una conformación 'extendida', es decir, como las de las cadenas beta. La conformación extendida maximiza la accesibilidad de X. Un área accesible calculada se divide por el área accesible de un estado de referencia del tripéptido Gly-X-Gly y se informa el cociente, que es la accesibilidad fraccional. El por ciento de accesibilidad es la accesibilidad fraccional multiplicada por 100. Otro ejemplo de algoritmo para calcular la accesibilidad de superficie se basa en el módulo SOLV del programa xsae (Broger, C, F. Hoffman-La oche, Basel) que calcula la accesibilidad fraccional de un residuo de aminoácido a una esfera de agua basada en las coordenadas de rayos X del polipéptido. La accesibilidad fraccional de superficie para cada aminoácido en un anticuerpo se puede calcular usando la información de estructura cristalina disponible (Eigenbrot y otros. (1993) J Mol Biol . 229:969-995) .
El ADN que codifica los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, por medio de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos) . Las células del hibridoma sirven como una fuente preferida del ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en los vectores de expresión, que luego se transfectan en las células hospederas tales como células de E. coli, células de simio COS, células de ovario de hámster chino (CHO) u otras células hospederas de mamífero, tales como células de mieloma (US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310) que no producen de otro modo la proteína del anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes .
Después del diseño y selección, los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína, por ejemplo TioFab, con el residuo de Cys no apareado altamente reactivo, manipulado genéticamente, "aminoácidos de cisteína libre", se puede producir por: (i) expresión en una sistema bacteriano, por ejemplo E. coli, (Skerra y otros (1993) Curr. Opinión in Immunol . 5:256-262; Plückthun (1992) Immunol . Revs . 130:151-188) o un sistema de cultivo de célula de mamífero (WO 01/00245) , por ejemplo células de ovario de hámster chino (CHO) ; y (ii) purificación usando técnicas de purificación de proteínas comunes (Lowman y otros (1991) J. Biol . Chem. 266 (17) : 10982-10988) .
Los grupos tiol con Cys manipulada genéticamente reaccionan con los reactivos enlazadores electrófilos y los intermediarios fármaco-enlazador para formar los conjugados de anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína y fármaco y otros anticuerpos marcados manipulados genéticamente en cisteína. El residuo Cys de los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína, y presente en los anticuerpos originales, que son apareados y formar enlaces disulfuro intercatenarios e intracatenarios no tienen grupos tiol reactivos (a menos que se traten con un agente reductor) y no reaccionar con los reactivos enlazadores electrófilos o intermediarios fármaco-enlazador . El residuo de Cys recién manipulado genéticamente, puede permanecer sin aparear y puede reaccionar, es decir, conjugarse con un reactivo enlazador electrófilo o intermediario fármaco-enlazador, tales como un fármaco-male mida . Los ejemplos de intermediarios fármaco-enlazador incluyen: MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE, y MC-vc-PAB-MMAF . Las posiciones estructurales de los residuos de Cys manipulados genéticamente de las cadenas pesada y ligera se numeran de acuerdo con un sistema de numeración secuencial . Este sistema de numeración secuencial se correlaciona con el Sistema de numeración de Kabat (Kabat y otros., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) que comienza en el extremo N-terminal, difiere del esquema de numeración de Kabat (hilera inferior) por las inserciones indicadas por a,b,c. Mediante el sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener pocos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción, de una FR o CDR del dominio variable. Lo sitios de la variante de la cadena pesada con cisteína manipulada genéticamente se identifican por los esquemas de numeración secuencia y numeración de Kabat.
En una modalidad, el anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína se prepara por un proceso que comprende : (a) reemplazar uno o más residuos de aminoácidos de un anticuerpo anti-FcRH5 original por cisteína; y (b) determinar la reactividad tiol del anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína por la reacción del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con un agente reactivo con tiol.
El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína puede ser más reactivo que el anticuerpo original con el agente reactivo con tiol.
Los residuos de aminoácidos de cisteína libre se pueden ubicar en las cadenas pesada o ligera, o en los dominios constante o variable. Los fragmentos de anticuerpo, por ejemplo Fab, también se puede manipular genéticamente con uno o más aminoácidos de cisteína que reemplazan los aminoácidos del fragmento de anticuerpo, para formar los fragmentos del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína.
Otra modalidad de la invención proporciona un método de preparar (fabricar) un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína, que comprende: (a) introducir uno o más aminoácidos de cisteína en un anticuerpo anti-FcRH5 original para generar el anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína; y (b) determinar la reactividad tiol del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con un agente reactivo con tiol; en donde el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína es más reactivo que el anticuerpo original con el agente reactivo con tiol.
La etapa (a) del método de preparar un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína puede comprender: (i) mutagenizar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína; (ii) expresar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína; y (iii) aislar y purificar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína.
La etapa (b) del método de preparar un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína puede comprender expresar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína en una partícula viral seleccionada de una partícula de fago o fagémido.
La etapa (b) del método de preparar un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína también puede comprender : (i) reacción del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con un reactivo de afinidad reactivo con tiol para generar un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con marcación de afinidad y (ii) medir la unión del el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con marcación de afinidad en un medio de captura.
Otra modalidad de la invención es un método de analizar anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína con aminoácidos de cisteína no apareados, altamente reactivos para determinar reactividad tiol que comprende: (a) introducir uno o más aminoácidos de cisteína en un anticuerpo original para generar un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína; (b) hacer reaccionar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con un reactivo de afinidad reactivo con tiol para generar un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con marcación de afinidad; y (c) medir la unión del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con marcación de afinidad en un medio de captura; y (d) determinar la reactividad tiol del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con el agente reactivo con tiol .
La etapa (a) del método de detección de anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína pueden comprender: (i) mutagenizar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína; (ii) expresar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína; y (iii) aislar y purificar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína.
La etapa (b) del método de identificar anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína puede comprender expresar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína en una partícula viral seleccionada de una partícula de fago o fagémido.
La etapa (b) del método de identificar anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína también puede comprender : (i) hacer reaccionar el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con un reactivo de afinidad reactivo con tiol para generar un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con marcación de afinidad; y (ii) medir la unión del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con marcación de afinidad en un medio de captura. b. Manipulación genética de cisteína de variantes de IgG de anti-FcRH5 La cisteína fue introducida en el sitio 118 de la cadena pesada 118 (numeración de EU) (equivalente a la posición de la cadena pesada 118, numeración secuencial) en los anticuerpos monoclonales anti-FcRH5 originales quiméricos de longitud completa o en el sitio 205 de la cadena ligera (numeración de Kabat) (equivalente a la posición de la cadena ligera 209, numeración secuencial) en los anticuerpos monoclonales anti-FcRH5 originales quiméricos de longitud completa por los métodos de manipulación genética de cisteína descritos en la presente.
Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína con cisteína en la cadena pesada 118 (numeración de EU) generados fueron: (a) tio-hulOA8 vl-HC (A118C) con la secuencia de la cadena pesada (SEC ID NO: 42) y secuencia de la cadena ligera (SEC ID NO: 41) , Figuras 12A a 12B.
Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína con cisteína en la cadena ligera 205 (numeración de Kabat) generados fueron: (a) tio-hul0A8 vl-LC9 (V205C) con la secuencia de la cadena pesada (SEC ID NO: 44) y secuencia de la cadena ligera (SEC ID NO: 43) , Figuras 13A a 13B.
Estos anticuerpos monoclonales manipulados genéticamente en cisteína se expresaron en células CHO (ovario de hámster chino) por fermentación transitoria en un medio que contiene 1 m de cisteína. c. Anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína marcados Los anticuerpos anti-Fc H5 manipulados genéticamente en cisteína se pueden acoplar en forma específica de sitio y eficiente con un agente reactivo con tiol . El agente reactivo con tiol puede ser un reactivo enlazador mult ifuncional , de captura de marca, es decir, afinidad (por ejemplo un reactivo biotina-enlazador) , una marca de detección (por ejemplo un reactivo fluoróforo) , un reactivo de inmovilización de fase sólida (por ejemplo SEPHAROSE™, poliestireno o vidrio) , o un intermediario fármaco-enlazador . Un ejemplo de un agente reactivo con tiol es N-etil maleimida (NEM) . En un ejemplo de modalidad, la reacción de un TioFab con un reactivo biotina-enlazador proporciona un TioFab biotinilado por medio del cual se puede detectar y medir la presencia y reactividad del residuo de cisteína manipulado genéticamente. La reacción de un TioFab con un reactivo enlazador multifuncional proporciona un TioFab con un enlazador funcionalizado que puede reaccionar adicionalmente con un reactivo del residuo de fármaco u otra marca. La reacción de un TioFab con un intermediario fármaco-enlazador proporciona un conjugado de TioFab y fármaco.
Los ejemplos de métodos aquí descritos se pueden aplicar generalmente a la identificación y producción de anticuerpos, y más generalmente, a otras proteínas mediante la aplicación de las etapas de diseño y selección descritas en la presente.
Tal método se puede aplicar a la conjugación de otros agentes reactivos con tiol en los que el grupo reactivo es, por ejemplo, una maleimida, una yodoacetamida, un disulfuro de piridilo u otros compañeros de conjugación reactivos con tiol (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). El agente reactivo con tiol puede ser un residuo de fármaco, un fluoróforo tal como un colorante fluorescente como fluoresceína o rodamina, un agente quelante de metal para imágenes o radioterapia, una marca peptidilo o no peptidilo o rótulo de detección, o un agente modificador de la depuración tal como diversos isómeros de polietilenglicol , un peptido que se une a un tercer componente, u otro carbohidrato o agente lipofílico. d. Usos de anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína Los anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína, y sus conjugados se pueden utilizar como agentes terapéuticos y/o diagnóstico. La presente invención además proporciona métodos de prevenir, manejar, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con un Trastorno relacionado con las células B. En particular, la presente invención proporciona métodos de prevenir, manejar, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con un trastorno proliferativo celular, tales como cáncer, por ejemplo, linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto. La presente invención además proporciona métodos para diagnosticar un trastorno relacionado con FcRH5 o predisposición para desarrollar el trastorno, así como métodos para identificar anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos, que unen con preferencia célula polipéptidos de FcRH5 asociados con las células B.
Otra modalidad de la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una enfermedad que responde a un trastorno relacionado con las células B. e. Conjugados de anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína y fármaco (conjugados de tio-anticuerpo y fármaco (TDC) ) Otro aspecto de la invención es un el compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína (Ab) , y un residuo de fármaco auristatina (D) en donde el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína está unido a través de uno o más aminoácidos de cisteína libres con un residuo enlazador (L) a D; the compuesto que tiene Fórmula I: Ab-(L-D)p I en donde p es 1, 2, 3, o 4; y en donde el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína se prepara por un proceso que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácidos de un anticuerpo anti-FcRH5 original con uno o más aminoácidos de cisteína libre.
Otro aspecto de la invención es una composición que comprende una mezcla de compuestos de anticuerpo-fármaco de Fórmula I donde la carga de fármaco promedio por anticuerpo es aproximadamente 2 a aproximadamente 5 , o aproximadamente 3 a aproximadamente 4.
Las ventajas potenciales de los conjugados anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína y fármaco incluyen mejor seguridad (índices terapéuticos más grandes) , mejores parámetros PK, los enlaces disulfuro intercatenarios del anticuerpo retenidos pueden estabilizar el conjugado y retiñe su conformación de unión activa, los sitios conjugación al fármaco están definidos y la preparación de los conjugados de anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína y fármaco a partir de la conjugación de los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína a los reactivos enlazadores del fármaco generan un producto más homogéneo.
Enlazadores "Enlazador" , "unidad enlazadora" , o "unión" significa un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une de modo covalente un anticuerpo a un residuo de fármaco. En varias modalidades, un enlazador se especifica como L. Un "enlazador" (L) es un resto bifuncional o multifuncional que se puede usar para ligar uno o más residuos de fármaco (D) y una unidad de anticuerpo (Ab) para formar los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) de Fórmula I. Los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) se pueden preparar de modo conveniente usando un enlazador que tiene grupos funcionales reactivos para unir al Fármaco y al anticuerpo. Un tiol de la cisteína de un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional electrófilo de un reactivo enlazador, un residuo de fármaco o intermediario fármaco-enlazador .
En un aspecto, un enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que es reactivo con una cisteína nucleofílica presente en un anticuerpo. El tiol de la cisteína del anticuerpo es reactivo con un grupo electrófilo en un enlazador y forma un enlace covalente con un enlazador. Los grupos electrófilos útiles incluyen, pero sin limitación, grupos maleimida y haloacetamida .
Los enlazadores incluyen un radical divalente tal como un alquildiílo, un arileno, un heteroarileno, restos tales como: - (CR2) n0 (CR2) n-, unidades repetidas de alquiloxi (por ejemplo polietilenoxi , PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (por ejemplo polietilenamino, Jeffamine™) ; y éster diácido y amidas que incluyen succinato, succinamida, diglicolato, malonato, y caproamida.
Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína reaccionan con los reactivos enlazadores o intermediarios fármaco-enlazador, con los grupos funcionales electrófilos tales como maleimida o a-halo carbonilo, de acuerdo con un método de conjugación de la página 766 de Klussman, y otros (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4) :765-773.
El enlazador puede estar compuesto de uno o más componentes enlazadores. Los ejemplos de componentes enlazadores incluyen 6-maleimidocaproílo ( "MC" ) , maleimidopropanoílo ( "MP" ) , valina-citrulina ("val-cit" o "ve"), alanina-fenilalanina ("ala-phe" o "af"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), N-succinimidil 4- (2-piridiltio) entanoato ("SPP"), 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato de N-succinimidilo ("SMCC'), (4-yodo-acetil ) aminobenzoato de N-succinimidilo ("SIAB"), etilenoxi-CH2CH20- como una o más unidades repetidas ( "EO" o "PEO") . Los componentes enlazadores adicionales son conocidos en la técnica y algunos se describen en la presente.
En una modalidad, el enlazador L de un ADC tiene la fórmula : -Aa—Ww—Yy- en donde : -A- es una unidad de extensión unida covalentemente a un tiol de la cisteína del anticuerpo (Ab) ; a es 0 ó 1 ; cada -W- es de modo independiente una unidad de aminoácido; w es de modo independiente un número entero que varía de 0 a 12; -Y- es una unidad espaciadora unida covalentemente al residuo de fármaco; y y es 0 , 1 ó 2.
Unidad de extensión La unidad de extensión (-A-) , cuando está presente, es capaz de unir una unidad de anticuerpo a una unidad de aminoácido (-W-) . En este aspecto un anticuerpo (Ab) tiene un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de un extensor. Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en un anticuerpo, sea en forma natural o por medio de manipulación química incluyen, pero sin limitación, sulfhidrilo (-SH) , amino, hidroxilo, carboxi , el grupo hidroxilo anomérico de un carbohidrato y carboxilo. En un aspecto, los grupos funcionales del anticuerpo son sulfhidrilo o amino. Los grupos sulfhidrilo se pueden generar por la reducción de un enlace disulfuro intramolecular de un anticuerpo. Alternativamente, los grupos se pueden generar por la reacción de un grupo amino de un residuo de lisina de un anticuerpo usando 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otro reactivo generador de sulfhidrilo. En una modalidad, un anticuerpo (Ab) tiene un grupo tiol de la cisterna libre que puede formar un enlace con un grupo funcional electrófilo de una unidad de extensión. Los ejemplos de conjugados de las unidades de extensión de la Fórmula I están representados por las Fórmulas II y III, en donde Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y son las que se definieron antes y R17 es un radical divalente seleccionado de (CH2)r, carbociclilo C3-C8, 0-(CH2)r/ arileno, (CH2) r-arileno, -arilen- (CH2) r-, (CH2) r~ (carbociclilo C3-C8) , (carbociclilo C3-C8) - (CH2) r, heterociclilo C3-C8, (CH2) r- (heterociclilo C3-C8, -(heterociclilo C3-C8- (GH2) r-, -(CH2)rC(0)NRb(CH2)r-, -(CH2CH20)r-, - (CH2CH20) r-CH2-, -(CH2) rC(0)NR (CH2CH20) r-, — (CH2) rC (0) NRb (CH2CH20) r—CH2-, - (CH2CH20) rC (0) NR (CH2CH20) r-, - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2CH20) r-CH2-, y -(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2)r- ; donde Rb es H, alquilo de C1-C6 , fenilo, o bencilo; y r es de modo independiente un número entero que varía de 1-10.
Arileno incluye radicales hidrocarbonados aromáticos divalentes de 6-20 átomos de carbono derivados de la eliminación de dos átomos de hidrogeno del sistema de anillo aromático. Los grupos amileno típicos incluyen, pero sin limitación, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo, y similares.
Los grupos heterociclilo incluyen un sistema anular en que uno o más átomos anulares es un heteroátomo, por ejemplo nitrógeno, oxígeno, y azufre. El radical heterociclo comprende 1 a 20 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros del anillo (2 a 6 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S) o un biciclo que tiene 7 a 10 miembros del anillo (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6]. Los heterociclos se describen en Paquette, Leo A.; "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamín, New York, 1968), particularmente los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 hasta el presente), en particular Volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc . (1960) 82:5566.
Los ejemplos de heterociclos incluyen a modo de ejemplo y sin limitación piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo) , tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo , pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinílo, azocinilo, triacinilo, 6H-1,2,5-tiadiacinilo, 2H, 6H-1 , 5 , 2-ditiacinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, piracinilo, piridacinilo, indolicinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, lH-indazolilo, purinilo, 4H-quinolicinilo, ftalacinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4Ah-carbazolilo, carbazolilo, ß-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenacinilo, fenotiacinilo, furazanilo, fenoxacinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperacinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo , morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, y isatinoilo.
Los grupos carbociclilo incluyen un anillo saturado o insaturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono como monociclo o 7 a 12 átomos de carbono como biciclo. Los carbociclos monocíclicos tienen 3 a 6 átomos anulares, aún más normalmente 5 o 6 átomos anulares. Los carbociclos bicíclicos tienen 7 a 12 átomos anulares, por ejemplo dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 ó 10 átomos anulares dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6] . Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, l-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, l-ciclohex-2-enilo, l-ciclohex-3-enilo, cicloheptilo, y ciclooctilo.
Se comprende a partir de todos los ejemplos de modalidades del ADC de Fórmula I tal como II-VI, que aun cuando no se indique expresamente, de 1 a 4 residuos de fármaco se unen a un anticuerpo (p = 1-4) , según el número de residuos de cisteína manipulados genéticamente .
Una unidad de extensión de Fórmula II ilustrativa deriva de maleimido-caproílo (MC) en donde R17 es -(CH2)5-: Una unidad de extensión de Fórmula II ilustrativa deriva de maleimido-propanoilo (MP) en donde R17 es -(CH2)2-: Otra unidad de extensión de Fórmula II ilustrativa en donde R17 es - (CH2CH20) r-CH2 - y r es 2 : Otra unidad de extensión de Fórmula II ilustrativa en donde R17 es - (CH2) rC (0) NRb (CH2CH20) r-CH2- donde Rb es H y cada r es 2 : Una unidad de extensión de Fórmula III ilustrativa en donde R17 es -(CH2)5-: En otra modalidad, la unidad de extensión se une al anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína por medio de un enlace disulfuro entre átomo de azufre de la cisteína manipulada genéticamente del anticuerpo y un átomo f de azufre de la unidad de extensión. Una unidad de extensión representativa de esta modalidad se representa con la Fórmula IV, en donde R17, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definieron anteriormente.
En aún otra modalidad, el grupo reactivo del extensor contiene un grupo funcional reactivo con tiol que puede formar un enlace con un tiol de la cisteína libre de un anticuerpo. Los ejemplos de grupos funcionales de reacción con tiol incluyen, pero sin limitación, maleimida, (X-haloacetilo, ésteres activados tales como esteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, ésteres de anhídridos, cloruros ácidos, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos . Las unidades de extensión representativas de esta modalidad están representadas por las Fórmulas Va y Vb, en donde -R17-, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definieron anteriormente; Va Vb En otra modalidad, el enlazador puede ser un enlazador tipo dendrítico para la unión covalente de más de un residuo de fármaco a través de un residuo enlazador multifuncional de ramificación a un anticuerpo (Sun y otros (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun y otros (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la relación molar del fármaco al anticuerpo, es decir, la carga, que se relaciona con la potencia del ADC. En consecuencia, cuando un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína porta solo un grupo reactivo de tiol de la cisteína, una multitud de residuos de fármaco se pueden unir a través de un enlazador dendrítico .
Unidad de aminoácido El enlazador puede comprender residuos de aminoácidos. La unidad de aminoácido (-Ww-) , cuando está presente, se liga el anticuerpo (Ab) al residuo de fármaco (D) del conjugado del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína y fármaco (ADC) de la invención.
-Ww- es una unidad de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido . Los residuos de aminoácidos que comprenden la unidad de aminoácido incluyen los naturales, así como los aminoácidos menores y los análogos de aminoácidos naturales, tales como citrulina. Cada unidad -W- de modo independiente tiene la fórmula que se indica a continuación en los corchetes, y w es un número entero que varía de 0 a 12: en donde R19 es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2 , -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2) 3NHCOCH3 , (CH2)3NHCHO, - (CH2) 4NHC(=NH)NH2, - (CH2) 4NH2 , - (CH2) 4NHCOCH3 , (CH2)4NHCHO, - (CH2) 3NHCONH2, - (CH2) 4NHCONH2 , -CH2CH2CH (OH) CH2NH2 , 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil- , 4-piridilmetil- , fenilo, ciclohexilo, Cuando R19 es diferente de hidrógeno, el átomo de carbono al que se une R19 es quiral . Cada átomo de carbono al que se une R19 está de modo independiente en la configuración (S) o (R) o una mezcla racémica. Las unidades de aminoácidos en consecuencia pueden ser enantioméricamente puras, racémicas o diaestereoméricas .
Los ejemplos de unidades de aminoácidos — w— incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido . Los ejemplos de dipéptidos incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) Los ejemplos de tripéptidos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente enlazador de aminoácido incluyen los naturales, así como los aminoácidos menores y los análogos de aminoácidos naturales, tales como citrulina.
La unidad de aminoácido se puede escindir enzimáticamente con una o más enzimas, que incluye una proteasa asociada a tumor, para el residuo de fármaco (-D) , que en una modalidad se protona in vivo después de la liberación para proporcionar un Fármaco (D) . Los componentes enlazadores de aminoácidos se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para escisión enzimática enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa asociada al tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
Unidad espadadora La unidad espaciadora (—Yy—) , cuando está presente (y = 1 ó 2) , liga una unidad de aminoácido (-Ww-) al residuo de fármaco (D) cuando está presente una unidad de aminoácido (w = 1-12). En forma alternativa, la unidad espaciadora liga la unidad de extensión al residuo de fármaco cuando está ausente la unidad de aminoácido. La unidad espaciadora también liga el residuo de fármaco a la unidad del anticuerpo cuando están ausentes la unidad de aminoácido y la unidad de extensión (w, y = 0) . Las unidades espaciadoras son de dos tipos generales: autodestructivo y no autodestructivo . Una unidad espaciadora de no autodestructivo es una en la que parte o el total de la unidad espaciadora permanece unida al residuo del fármaco después de la escisión, en particular enzimática, de una unidad de aminoácido a partir del conjugado de anticuerpo y fármaco o el enlazador del residuo de fármaco. Cuando un ADC que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina o una unidad espaciadora de glicina experimenta la escisión enzimática por medio de una próteasa asociada a células tumorales, una proteasa asociada a las células cancerígenas o proteasa asociada linfocitos, un residuo glicina-glicina-fármaco o un residuo glicina-fármaco se escinde del Ab-Aa-Ww- . En una modalidad, una reacción de hidrólisis independiente tiene lugar en la célula objetivo, escinde el enlace del residuo glicina-fármaco y libera el fármaco .
En otra modalidad, _Yy_ es una unidad p-aminobencilcarbamoílo (PAB) cuya porción fenileno está sustituida con Qm en donde Q es -alquilo de Ci-C8, -O- (alquilo de Ci~Ce) , -halógeno,- nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0-4.
Los ejemplos de modalidades de una unidad espaciadora de no autodestructivo (-Y-) son: -Gly^Gly-; -Gly-; -Ala-Phe-; -Val-Cit-.
En una modalidad, un residuo enlazador de fármaco o se proporciona un ADC en que la unidad espaciadora está ausente (y=0) , o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables.
Alternativamente, un ADC que contiene una unidad espaciadora autodestructivo puede liberar -D. En una modalidad, -Y- es un grupo PAB que se liga a -Ww- por medio del átomo de nitrógeno amino del grupo PAB y se conecta directamente a -D por medio de un grupo carbonato, carbamato o éter, donde el ADC tiene el ejemplo de estructura: en donde Q es -alquilo de Ci-CB, -0- (alquilo de Ci- C8) , -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que varía de 0-4; y p varía de 1 a 4.
Otros ejemplos de espaciadores autodestructivo incluyen, pero sin limitación, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay y otros. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), análogos heterocíclicos de PAB (US 2005/0256030) , beta-glucurónido (WO 2007/011968) , y orto o para-aminobencilacetales . Se pueden usar espaciadores que experimentan la ciclación después de la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácidos 4-aminobutírico sustituidos o no sustituidos (Rodrigues y otros (1995) Chemistry Biología 2:223), sistemas anulares biciclo [2 , 2 , 1] y biciclo [2 , 2 , 2 ] ápropiadamente sustituidos (Storm, y otros., J Amer. Chem. Soc . , 1972, 94, 5815); y amidas del ácido 2- aminofenilpropiónico (Amsberry, y otros., J". Org. Chem. , 1990, 55, 5867) . La eliminación de los fármacos que contienen amina que están sustituidas en la glicina (Kingsbury, y otros., J". Med. Chem., 1984, 27, 1447) también son ejemplos de espaciadores autodestructivo útiles en los ADC Los ejemplos de unidades espadadoras (-Yy-) está representados por las Fórmulas X-XII: -HN— CH2— CO- —NHCH2C(0)-NHCH2C(0)- j XII Enlazadores dendríticos En otra modalidad, el enlazador L puede ser un enlazador de tipo dendrítico para la unión covalente de más de un residuo de fármaco a través de un residuo enlazador de ramificación, multifuncional a un anticuerpo (Sun y otros (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun y otros (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768) . Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la relación molar del fármaco al anticuerpo, es decir, la carga, que se relaciona con la potencia del ADC. En consecuencia, cuando un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína porta solo un grupo reactivo de tiol de la cisteína, una multitud de residuos de fármaco se pueden unir a través de un enlazador dendrítico. Los ejemplos de modalidades de enlazadores dendríticos ramificados incluyen unidades de dendrímeros de 2 , 6-bis (hidroximetil) -p-cresol y 2,4,6-tris (hidroximetil) -fenol ( O 2004/01993; Szalai y otros (2003) J. Amer. Chem. Soc . 125:15688-15689; Shamis y otros (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir y otros (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499) .
En una modalidad, la unidad espaciadora es un bis (hidroximetil ) estireno ramificado (BHMS) , que se puede usar para incorporar y liberar múltiples fármacos, que tienen la estructura: que comprende una unidad de dendrímero de 2- (4-aminobenciliden) ropano-1 , 3-diol (WO 2004/043493; de Groot y otros (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494) , en donde Q es -alquilo de Ci-C8, -O- (alquilo de Ci-C8) , -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que varía de 0-4; n es 0 ó 1; y p varía de 1 a 4.
Los ejemplos de modalidades de la Fórmula I de compuestos de conjugado de anticuerpo y fármaco incluyen Xllla (MC) , XHIb (val-cit) , XIIIc (MC-val-cit) , y XHId (MC- ' val-cit-PAB) : Otros ejemplos de modalidades de la Fórmula compuestos de conjugado de anticuerpo y fármaco incluyen XIVa-e : en donde X es: y R es de modo independiente H o alquilo de Ci^C6 y n es 1 a 12.
En otra modalidad, un enlazador tiene un grupo funcional reactivo que tiene un grupo nucleófilo que es reactivo con un grupo electrofilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, grupos de carbonilo de aldehido y cetona El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un enlazador puede reaccionar con un grupo electrofilo de un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Los grupos electrófilos útiles de un enlazador incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidracina, tiosemicarbazona , carboxilato de hidracina, y arilhidrazida . El grupo electrofilo de un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión a un enlazador.
Normalmente, los enlazadores tipo péptidos se pueden preparar por la formación de un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos del péptido. Tales enlaces de péptidos se pueden preparar, por ejemplo de acuerdo con el métodos de síntesis en fase líquida (ver E. Schróder y K. Lübke, "The Peptide" , volumen 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Los intermediarios del enlazador se pueden ensamblar con cualquier combinación o secuencia de reacciones que incluyes unidad espadadora, de extensión y de aminoácidos. La unidad espaciadora, de extensión y de aminoácidos pueden emplear grupos funcionales reactivos que son de naturaleza electrofílica, nucleofílica , o radicales libres. Los Reactive grupos funcionales reactivos incluyen, pero sin limitación carboxilos, hidroxilos, para-nitrofenilcarbonato, isotiocianato, y grupos salientes, tales como 0-mesilo, 0-tosilo, -Cl, -Br, -I; o maleimida.
Por ejemplo, un sustituyente cargado tal como sulfonato (-S03~) o amonio, puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo enlazador con el anticuerpo o' el residuo de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento del Ab-L (intermediario anticuerpo-enlazador) con D, o D-L (intermediario fármaco-enlazador) con Ab, según la vía de síntesis empelada para preparar la ADC.
Reactivos enlazadores Los conjugados de anticuerpo y auristatina se pueden preparar usando una variedad de reactivos enlazadores bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , ásteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniumbenzoil ) -etilenodiamina) , diisocianatos (tal como 2 , 6 -diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1 , 5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) .
Los conjugados de anticuerpo y fármaco también se pueden preparar con reactivos enlazadores: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS , MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfone) benzoato) , y que incluyen reactivos de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB , BMH, BMOE, 1,8-bis-maleimidodietilenglicol (BM (PEO) 2) , y 1,11-bis-maleimidotrietilenglicol (BM(PEO)3), que están disponible en el comercio en Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific , Rockford, ILO, y otros proveedores de reactivos. Los reactivos de bis-maleimida permiten la unión del grupo tiol de un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína, residuo de fármaco que contiene tiol, marca o intermediario enlazador, de modo secuencial o concurrente. Otros grupos funcionales además de maleimida, que son reactivos con un grupo tiol de un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína, residuo de fármaco, marca o intermediario enlazador incluyen yodoacetamida, bromoacetamida, vinilpiridina , disulfuro, disulfuro de piridilo isocianato, e isotiocianato .
BM(PEO)2 BM(PEO)3 Los reactivos enlazadores útiles también se pueden obtener por otras fuentes comerciales, tales como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) , o sintetizar de acuerdo con los procedimientos descritos en Toki y otros (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch y otros (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743 ; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
Los extensores de fórmula (Illa) se pueden introducir en un enlazador por la reacción de los siguientes reactivos enlazadores con el extremo N-terminal de una unidad de aminoácido: en donde n es un número entero que varía de 1-10 y T es -H o -S03Na; donde n es un número entero que varía de 0-3; o Las unidades de extensión se pueden introducir en un enlazador por la reacción de los siguientes reactivos bif ncionales con el extremo N-terminal de una unidad de aminoácido : donde X es Br o I .
Las unidades de extensión también se pueden introducir en un enlazador por la reacción de los siguientes reactivos bifuncionales con el extremo N-terminal de una unidad de aminoácido: Un ejemplo de reactivo enlazador dipeptídico de valina-citrulina (val-cit o ve) que tiene un extensor de maleimida y un espaciador autodestructivo de para-aminobencilcarbamoílo (PAB) tiene la estructura: Un ejemplo de reactivo enlazador dipeptídico de phe-lys(Mtr, mono-4-metoxitritilo) que tiene una unidad de extensión de maleimiada y una unidad espadadora autodestructivo de PAB se puede preparar de acuerdo con Dubowchik, y otros. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60, y tiene la estructura: Preparación de conjugados de anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína y fármaco El ADC de Fórmula I se puede preparar por varias vías, que emplean reacciones de química orgánica, condiciones, y reactivos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen: (1) reacción de un grupo de cisteína de un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con un reactivo enlazador, para formar el intermediario anticuerpo-enlazador Ab-L, por medio de un enlace covalente, seguido por la reacción con un residuo de fármaco activado D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un residuo de fármaco con un reactivo enlazador, para formar el intermediario fármaco-enlazador D-L, por medio de un enlace covalente, seguido por la reacción con un grupo de cisteína de un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína. Los métodos de conjugación (1) y (2) se pueden emplear con una variedad de anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína, residuos de fármaco, y enlazadores para preparar el conjugado de anticuerpo y fármacos de Fórmula I .
Los grupos tiol de la cisteína del anticuerpo son nucleófilo y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en reactivos enlazadores e intermediarios de fármaco-enlazador que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros ácidos, (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas , (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida, (iv) disulfuros, que incluye disulfuro de piridilo, por medio de intercambio de sulfuro. Los grupos nucleófilos de un residuo de fármaco incluyen, pero sin limitación: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, amino, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina, y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con los grupos electrófilos en los residuos del enlazador y los reactivos enlazadores .
Los anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína se pueden volver reactivos para la conjugación con reactivos enlazadores por el tratamiento con un agente reductor tal como DTT (reactivo de Cleland, ditiotreitol ) o TCEP (clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina; Getz y otros (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) , seguido por la reoxidación para reformar los enlaces disulfuro inter e intracatenarios (Ejemplo 5) . Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales manipulados genéticamente en cisteína de longitud completa (TioMabs) expresados en las células CHO se reducen con aproximadamente un exceso molar de 50 veces de TCEP durante 3 horas a 37 °C para reducir los enlaces disulfuro en los aductos de cisteína que se pueden formar entre los residuos de cisteína recién introducidos y la cisteína presente en el medio de cultivo. El TioMab reducido se diluye y carga en una columna HiTrap S de 10 mM de acetato de sodio, pH 5, y se eluye con PBS que contiene 0.3 M de cloruro de sodio. Los enlaces disulfuro se restablecieron entre los residuos de cisteína presentes en el Mab original con sulfato de cobre acuoso (CuS0 ) diluido (200 nM) a temperatura ambiente, toda la noche. Alternativamente, el ácido dehidroascórbico (DHAA) es un oxidante efectivo para restablecer los grupos disulfuro intracatenarios del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína después de la escisión reductora de los aductos de cisteína. Se pueden usar otros oxidantes, es decir, agentes oxidantes y condiciones de oxidación que son conocidas en la técnica. La oxidación al aire del ambiente también es efectiva. Esta etapa de reoxidación parcial, leve forma disulfuros intracatenarios en forma eficiente con alta fidelidad y conserva los grupos tiol de los residuos de cisteína recién introducidos. Se añadió un exceso de aproximadamente 10 veces del intermediario fármaco-enlazador, por ejemplo MC-vc-PAB-MMAE , se mezcló y se dejó decantar durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente para efectuar la conjugación y formar el conjugado de anticuerpo anti-Fc H5-fármaco . La mezcla de conjugación se filtró en gel y se cargó y se eluyó mediante una columna HiTrap S para eliminar el exceso de intermediario fármaco-enlazador y otras impurezas.
Un proceso general para preparar un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína expresado en un cultivo celular para la conjugación es el siguiente. Cuando el medio de cultivo celular contiene cisteína, los aductos de disulfuro se pueden formar entre los aminoácidos de cisteína recién introducidos y la cisteína del medio. Estos aductos de cisteína, representado como un círculo en el ejemplo de TioMab, se deben reducir para generar anticuerpos manipulados genéticamente en cisteína reactivos para la conjugación. Los aductos de cisteína, presumiblemente junto con varios enlaces disulfuro intercatenarios , se escinden por reducción para dar una forma reducida del anticuerpo con agentes reductores tales como TCEP. Los enlaces disulfuro intercatenarios entre los residuos de cisteína apareados se vuelven a formar en condiciones de oxidación parcial con sulfato de cobre, DHAA, o exposición al oxígeno del ambiente. Los residuos de cisteínas, manipulados genéticamente, y no apareados recién introducidos permanecen disponibles para la reacción con los reactivos enlazadores o intermediarios fármaco-enlazador para formar los conjugados del anticuerpo de la invención. Los TioMab expresados en las líneas celulares de mamíferos producen un aducto de Cys conjugado en forma externa con una Cys manipulada genéticamente a través de la formación de un enlace -S-S-. En consecuencia, los TioMab purificados se tratan con procedimientos de reducción y reoxidación para producir TioMab reactivos. Estos TioMab se usan para conjugarse con la maleimida que contienen los fármacos citotóxicos, fluoróforos y otras marcas. 10. Inmunoliposomas Los anticuerpos anti-FcRH5 descritos en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es útil para la administración de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparar por los métodos conocidos en la técnica, tales como los que se describen en Epstein y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y otros., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y 097/38731 publicada el 31 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado se describen en la Patente U.S. No. 5,013,556.
Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruden mediante filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas como se describe en Martin y otros., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico opcionalmente está contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon y otros., J. National Cáncer Inst. 81(19) :1484 (1989) .
B . Ciertos métodos de preparar anticuerpos 1. Selección de anticuerpos anti-FcRH5 con las propiedades deseadas Las técnicas para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos de FcRH5 se han descrito anteriormente. También se puede seleccionar anticuerpos con determinadas características biológicas, según se desee.
Los efectos inhibidores del crecimiento de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención se pueden evaluar por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando células que expresan un polipéptido de FcRH5 ya sea en forma endógena o después de la transfeccion con el gen de FcRH. Por ejemplo, las líneas de células tumorales apropiadas y las células transíectadas con FcRH5 se pueden tratar con un anticuerpo anti-FcRH5 monoclonal de la invención en varias concentraciones durante pocos días (por ejemplo, 2-7) días y se tiñe con violeta de cristal o MTT o se analiza con algún otro ensayo colorimétrico . Otro método de medir proliferación puede ser la comparación de la captación de 3H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención. Después del tratamiento, las células se recolectan y se cuantifica la cantidad de radiactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo. Los controles positivos apropiados incluyen el tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento conocido por inhibir el crecimiento de esa línea celular. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo se puede determinar por varias maneras conocidas en la técnica. La célula tumoral puede ser una que sobreexpresa un polipéptido de FcRH5. El anticuerpo anti-FcRH5 inhibirá la proliferación celular de la célula tumoral que expresa FcRH5 in vitro o in vivo en aproximadamente 25-100% en comparación con la célula tumoral no tratada, con más preferencia, en aproximadamente 30-100%, y aun con más preferencia en aproximadamente 50-100% o 70-100%, en una modalidad, con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 pg/ml. La inhibición del crecimiento se puede medir a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 pg/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en un cultivo celular, donde la inhibición del crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-FcRH5 a aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal produce la reducción del tamaño tumoral o reducción de la proliferación de las células tumorales dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, con preferencia dentro de aproximadamente 5 a 30 días.
Para seleccionar un anticuerpo anti-FcRH5 que induce muerte celular, se puede evaluar la pérdida de la integridad de la membrana, indicada por ejemplo, por captación de yoduro de propidio (PI) , azul de tripano o 7AAD respecto de un control. Se puede realizar un ensayo de captación de PI en ausencia de complemento y de células efectoras inmunes. Las células tumorales que expresan el polipéptido de FcRH5 se incuba con medio solo o medio que contiene el anticuerpo anti-FcRH5 apropiado (por ejemplo, a aproximadamente 10 µ9/??1) . Las células se incuban durante un periodo de 3 días. Después de cada tratamiento, las células se lavan y se alicuotan en tubos 12 x 75 tapados con filtro de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la eliminación de los agregados celulares. Los tubos luego reciben el PI (10 µg/ml) . Las muestras se pueden analizar usando un citómetro de flujo FACSCA ® y softwarw FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson) . Los anticuerpos anti-FcRH5 que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular determinado por la captación de PI se pueden seleccionar como anticuerpos anti-FcRH5 inductores de muerte celular.
Para identificar los anticuerpos que se unen a un epítopo de un polipéptido de FcRH5 unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el que se describe en Anticuerpos, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . Este ensayo se puede usar para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo sitio o epítopo que un anticuerpo anti-FcRH5 conocido. En forma alternativa o adicional, se puede realizar mapeo de epítopos por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo se puede mutagenizar tal como por barrido de alanina, para identificar los residuos de contacto. El anticuerpo mutante se analiza inicialmente por la unión con anticuerpos policlonales para asegurar el plegado apropiado. En un método diferente, los péptidos correspondientes a diferentes regiones de un polipéptido de FcRH5 se pueden usar en ensayos de competición con los anticuerpos de ensayo o con un anticuerpo de ensayo y un anticuerpo con un epítopo caracterizado o conocido. 2. Ciertos métodos para el análisis de bibliotecas Los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención se pueden obtener por medio de bibliotecas combinatorias para detectar clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de métodos son conocidos en la técnica para generar bibliotecas de despliegue de fagos y analizar las bibliotecas para hallar anticuerpos que posean las caracterís icas deseadas. Tales métodos se describen en general en Hoogenboom y otros. (2001) en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien y otros., ed. , Human Press, Totowa, NJ) , y en ciertas modalidades, en Lee y otros. (2004) J. Mol. Biol . 340:1073-1093.
En principio, los clones del anticuerpo sintético se seleccionan por la identificación de las bibliotecas de fagos que contienen fagos que exhiben varios fragmentos de la región variable del anticuerpo (Fv) fusionado a la proteína de cubierta del fago. Tales bibliotecas de fagos se inmunopurifican por cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Los clones que expresan los fragmentos de Fv capaces de unirse al antígeno deseado son adsorbidos al antígeno y de esta manera se separan de los clones no unidos de la genoteca. Los clones de unión luego se eluyen del antígeno y además se pueden enriquecer por ciclos adicionales adsorción/elución del antígeno. Cualquiera de los anticuerpos de la invención se pueden obtener por el diseño de un procedimiento de detección del antígeno adecuado para seleccionar el clon del fago de interés seguido por la construcción de un clon del anticuerpo anti-FcRH5 de longitud completa usando las secuencias de Fv del clon del fago de interés y las secuencias de la región constante adecuada (Fe) descrita en Kabat, y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols . 1-3.
En ciertas modalidades, el dominio de unión antígeno de un anticuerpo está formado de dos regiones variables (V) de aproximadamente 110 aminoácidos, uno de cada cadenas ligera (VL) y pesada (VH) , las que presentan tres bucles hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR) . Los dominios variables se pueden presentar en forma funcional en el fago, ya sea tanto los fragmentos de cadena simple Fv (scFv) en los cuales las VH y VL están unidos en forma covalente mediante un péptido flexible corto como fragmentos de Fab, en los cuales cada uno de ellos están fusionados a un dominio constante e interactúan en forma no covalente, como se describe en Winter y otros., Ann. Rev. Immunol . , 12: 433-455 (1994). Como se usa en la presente, los clones de fagos que codifican Fvsc y los clones de fagos que codifican Fab se menciona colectivamente como "clones de fagos de Fv" o "clones de Fv" .
Los repertorios de los genes VH y VL se pueden clonar separadamente por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que luego se pueden investigar para hallar clones de unión con el antígeno como se describe en Winter y otros., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Las bibliotecas de las fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con el inmunógeno sin el requisito de la construcción de hibridomas . Alternativamente, el repertorio inactivo se puede clonar para proporcionar una fuente única de anticuerpos humanos con una amplia variedad de antígenos no propios y propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths y otros., EMBO J, 12: 725-734 (1993) . Finalmente, las bibliotecas inactivas también se pueden también preparar sintéticamente por clonación de los segmentos génicos V no reordenados de las células madre, y mediante los iniciadores de PC que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para obtener el reordenamiento in vitro como se describe en Hoogenboom y inter, J: Mol. Biol . , 227: 381-388 (1992) .
En ciertas modalidades, el fago filamentoso se usa para desplegar fragmentos de anticuerpos por fusión con la proteína de cubierta menor pIII. Los fragmentos del anticuerpo se pueden desplegar como fragmentos de Fv de cadena simple, en el cual los dominios VH y VL están conectados en la misma cadena de polipéptidos por un polipéptido espaciador flexible, por ejemplo, como se describe en Marks y otros., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) , o como fragmentos Fab, en el cual una cadena se fusiona a pIII y la otra se secreta en el periplasma de una célula hospedera bacteriana donde el ensamblaje de la estructura de la proteína de cubierta de Fab que se despliega sobre la superficie del fago por desplazamiento de las proteínas de cubierta de tipo silvestre, por ejemplo como se describe en Hoogenboom, y otros., Nucí. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991) .
En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos génicos del anticuerpo se obtienen de células inmunes recolectadas de seres humanos o animales. Si se desea que una biblioteca tenga una tendencia a favor de los clones de anti-Fc H5, el sujeto se inmuniza con FcRH5 para generar una respuesta de anticuerpos y las células del bazo y/o células B circulantes diferentes de los linfocitos de sangre periférica (PBL) se recupera por la construcción de una biblioteca. En una forma realización preferida, una biblioteca de fragmentos génicos del anticuerpo humano con tendencia a favor de los clones de anti-FcRH5 se obtiene por la generación de una respuesta de anticuerpos anti-FcRH5 en ratones transgénicos que portan una matriz génica de inmunoglobulinas funcionales (y que carece de un sistema de producción de anticuerpos endógenos funcional) d manera que la inmunización de FcRH5 origina células B que producen anticuerpos humanos contra FcRH5. La generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos se describe a continuación .
El enriquecimiento adicional de las poblaciones de células reactivas anti-FcRH5 se pueden obtener por medio de un procedimiento de selección adecuado para aislar células B que expresan anticuerpos unidos a membrana que específicos de FcRH5, por ejemplo, por separación de células con cromatografía de afinidad por FcRH5 o adsorción de células para FcRH5 marcado con fluorocromo seguido por separación de células activadas por flujo (FÁCS) ) .
Alternativamente, el uso de las células del bazo y/o las células B u otros PBL de un donante no inmunizado proporcionan una mejor representación del repertorio de anticuerpos posible y también permite la construcción de una biblioteca de anticuerpos mediante cualquiera de las especies animales (humana o no humana) en las que FcRH5 no es un antigénico. Para las bibliotecas que incorporan la construcción del gen del anticuerpo in vitro, se recolectan células madre del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifican segmentos génicos del anticuerpo no reordenados Las células inmune de interés se pueden obtener de una variedad de especies animales, tales como especie humana, ratón, rata, lagomorfos, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina y aviar, etc.
Los ácidos nucleicos que codifican segmentos génicos variables del anticuerpo (que incluye a los segmentos VH y VL) se recuperan de las células de interés y amplifican. En el caso de las bibliotecas de VH y VL reordenadas, el ADN deseado se puede obtener por aislamiento del ADN genómico o ARNm de los linfocitos seguidos por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los iniciadores que se aparean a los extremos 5 ' y 31 de los genes de VH y VL reordenados descritos en Orlandi y otros., Proc . Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), de este modo se preparan diversos repertorios de genes V para la expresión. Los genes V se pueden amplificar del ADNc y ADN genómico, con los iniciadores posteriores en los extremos 51 del exón que codifica el dominio de V maduro y iniciadores delanteros basados en el segmento J descrito en Orlandi y otros. (1989) y en Ward y otros., Nature, 341: 544-546 (1989) . Sin embargo, para amplificar el ADNc, los iniciadores posteriores también se pueden basar en el exón líder como se describe en Jones y otros., Biotechnol . , 9: 88-89 (1991), y iniciadores delanteros de la región constante como se describe en Sastry y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar la complementariedad, la degeneración se puede incorporar en los iniciadores como se describe en Orlandi y otros. (1989) o Sastry y otros. (1989) . En ciertas modalidades, la diversidad de biblioteca se maximiza por el uso de iniciadores PCR dirigidos a cada familia del gen V para amplificar todas las disposiciones de VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácido nucleico de la célula inmune, por ejemplo, como se describe en el método de Marks y otros., J. Mol. Biol . , 222: 581-597 (1991) o como se describe en el método de Orum y otros., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, los sitios de restricción raros se pueden introducir en el iniciador de PCR como una marca en un extremo como se describe en Orlandi y otros. (1989), o también por amplificación de PCR con un iniciador marcado como se describe en Clackson y otros., Nature, 352: 624-628 (1991) .
Los repertorios de genes V reacomodados sintéticamente se pueden derivar in vitro de los segmentos de genes V. La mayoría de los segmentos génicos de VH humanos han sido v clonados y secuenciados (informado en Tomlinson y otros., J. Mol. Biol . , 227: 776-798 (1992)) , y mapeados (informado en Matsuda y otros., Nature Genet . , 3: 88-94 (1993) , estos segmentos clonados (que incluyen a todos las conformaciones principales del bucle Hl y H2) se pueden usar para generar diversos repertorios de genes de VH con iniciadores de PCR que codifican bucles de H3 de diversa -secuencia y longitud como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) . Los repertorios de VH se pueden preparar con toda la diversidad de secuencia centrada en un bucle H3 largo de una longitud única como se describe en Barbas y otros., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992) . Los segmentos de VK y ?? humanos han sido clonados y secuenciados (informados en Williams y Winter, Eur. J. Immunol . , 23: 1456-1461 (1993)) y se pueden usar para preparar repertorios de cadena ligera sintéticos. Los repertorios sintéticos del gen V basados en una variedad de pliegues de VH y VL y longitudes de L3 y H3 , codificarán anticuerpos de diversidad estructural considerable. Después de la amplificación del gen V que codifica ADN, los segmentos del gen V de la línea germinal se pueden reordenar in vitro de acuerdo con los métodos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Los repertorios de fragmentos de anticuerpos se pueden construir por combinación de los repertorios de genes VH y VL juntos de diversas maneras. Cada repertorio se puede crear en vectores diferentes, y los vectores recombinados in vitro, por ejemplo, como se describe en Hogrefe y otros., Gene, 128: 119-126 (1993), o in vivo por infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en aterhouse y otros., Nucí. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). El método de recombinación in vivo explora la naturaleza de dos cadenas de los fragmentos Fab para superar el límite del tamaño de la biblioteca impuesta por la eficiencia de la transformación en E. Coli. Los repertorios VH y VL inactivos se clonan en forma separada, uno en un fagémido y el otro en un vector fago. Las dos bibliotecas luego se combinan por infección con el fago de la bacteria que contiene un fagémido de manera tal que cada célula contenga una combinación diferente y el tamaño de la biblioteca está limitado solo por el número de células presente (aproximadamente 1012 clones) . Ambos vectores contienen in vivo señales de recombinación de manera que los genes de VH y VL se recombinen en un replicón único y se co-empaquen en viriones del fago. Estas bibliotecas enormes proporcionan cantidad es grandes de diversos anticuerpos de buena afinidad (Ka"1 de aproximadamente 10" M) .
Alternativamente, los repertorios se pueden clonar en forma secuencial en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbas y otros., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 88: 7978-7982 (1991) , o ensamblarse juntos por PCR y luego clonarse, por ejemplo, como se describe en Clackson y otros., Nature, 352: 624-628 (1991). El ensamblaje de PCR también se puede usar para unir los ADN de la VH y VL con el ADN que codifica un péptido espaciador flexible para formar repertorios de Fv de cadena simple (Fvsc) . En aún otra técnica se usa el "ensamblaje por PCR de células" para combinar los genes de VH y VL en los linfocitos por PCR y se ligan los repertorios de clones de los genes como se describe en Embleton y otros., Nucí. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).
Los anticuerpos producidos por las bibliotecas inactivas (naturales o sintética) pueden ser de afinidad moderada (Ka-1 de aproximadamente 106 a 107 M"1) , pero la maduración de afinidad también se puede mimetizar in vitro por la construcción y reselección de las bibliotecas secundarias como se describe en Winter y otros. (1994), supra. Por ejemplo la mutación se puede introducir aleatoriamente in vitro por medio de la polimerasa predispuesta a error (informada en Leung y otros., Technique, 1: 11-15 (1989)) en el método de Ha kins y otros., J". Mol. Biol . , 226: 889-896 (1992) o en el método de Gram y otros., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente , la maduración de afinidad se puede realizar por mutación aleatoria de una o más CDR, por ejemplo, usando PCR con iniciadores que portan una secuencia al azar que abarca el CDR de interés, en clones de FV individuales seleccionados y detección de clones de afinidad superior. WO 9607754 (publicada el 14 de marzo de 1996) describió un método para inducir la mutagénesis en una región determinante de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una biblioteca de genes de la cadena ligera. Otro método efectivo es recombinar los dominios de VH o VL seleccionados por el despliegue de fagos con repertorios de variantes del dominio V naturales obtenidas de donadores no inmunizados y se seleccionan por mayor afinidad en varias rondas de retransposición de cadenas como se describe en Marks y otros., Biotechnol . , 10: 779-783 (1992) . Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en el intervalo de 10"9 M o menos.
El análisis de las bibliotecas se puede obtener por varias técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, se puede usar FcRH5 para recubrir los cavidades de las placas de adsorción, expresar en las células hospederas fijadas a las placas de por adsorción o usada en la separación celular o conjugada a biotina para la capturar con microesferas recubiertas con estreptavidina o se usan en otro método conocido en la técnica para la inmunopurificación de las bibliotecas de despliegue de fagos.
Las muestras de la biblioteca del fago se ponen en contacto con FcRH5 inmovilizado en condiciones adecuadas para la unión de por lo menos una porción de las partículas del fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones que incluyen pH, fuerza iónica, temperatura y similares se seleccionan para mimetizar las condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y luego se eluyen con ácido, por ejemplo, como se describe en Barbas y otros., Proc Nati. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), o con álcali, por ejemplo, como se describe en Marks y otros., J. Mol. Biol . , 222: 581-597 (1991), o por competición con el antígeno FcRH5 , por ejemplo, en un procedimiento similar al método de competición con el antígeno de Clackson y otros. , Nature, 352: 624-628 (1991). Los fagos se pueden enriquecer de 20-1.000-veces en una ronda única de selección. Además, los fagos enriquecidos se pueden cultivar en cultivos bacterianos y posteriormente ser sujeto a selecciones.
La eficiencia de selección depende de muchos factores, que incluyen a las cinéticas de disociación durante el lavado y si múltiples fragmentos de anticuerpo en un fago único se pueden unir en forma simultánea con el antígeno. Los anticuerpos con cinética de disociación rápida (y afinidades de unión débiles) pueden ser retenidos por medio de lavados cortos, despliegue de fagos multivalente y alta densidad de recubrimiento de antígeno en la fase sólida. La alta densidad no solo estabiliza al fago mediante interacciones multivalentes , sino que favorece que el fago que ha sido disociado se vuelva a unir. La selección de los anticuerpos con cinética de disociación lenta (y buenas afinidades de unión) se pueden promover por medio de lavados prolongados y despliegue de fagos monovalente como se describe en Bass y otros., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en WO 92/09690, y una baja densidad de recubrimiento del antígeno como se describe en Marks y otros . , Biotechnol . , 10: 779-783 (1992).
Es posible seleccionar entre los anticuerpos de fago de diferentes afinidades, aun con afinidades que difieren ligeramente, para FcRH5. Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como se realiza en alguna de las técnicas de maduración de afinidad descritas anteriormente) es probable originar a muchos mutantes, la mayoría que se une al antígeno y unos pocos con alta afinidad. Con FcRH5 limitante, con poca frecuencia el fago de alta afinidad puedo ser superado. Para retener todas la mutantes de mayor afinidad, los fagos se pueden incubar con exceso de FcRH5 biotinilado, pero el FcRH5 biotinilado con una concentración de menor molaridad que la constante afinidad molar específica para FcRH5. Los fagos de alta afinidad de unión luego se pueden capturar por microesferas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina . Tal "captura en equilibrio" permite que los anticuerpos sean seleccionados de acuerdo con sus afinidades de unión, con sensibilidad que permite el aislamiento de los clones imitantes con tan poco como una afinidad dos veces superior a partir de un gran exceso de fagos con afinidad menor. Las condiciones usadas para el lavado de los fagos unidos a la fase sólida también se pueden manipular para discriminar sobre la base de la cinética de disociación.
Los clones anti-FcRH5 pueden ser de actividad selectiva. En ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos anti-FcRH5 que se unen a las células vivas que expresan naturalmente FcRH5. En una modalidad, la invención proporciona anticuerpos anti-FcRH5 que bloquean la unión entre el ligando de FcRH5 y FcRH5 , pero no bloquean la unión entre un ligando de FcRH5 y una segunda proteina. Los clones de Fv que corresponden a tales anticuerpos anti-FcRH5 se pueden seleccionar por (1) aislamiento de los clones anti-FcRH5 de una biblioteca de fagos como se describió anteriormente y opcionalmente amplificación de la población de clones del fago por crecimiento de la población en una hospedero bacteriano adecuado, (2) seleccionar FcRH5 y una segunda proteína contra la cual se espera el bloqueo y no bloqueo de la. actividad respectivamente (3) adsorber los clones del fago de anti-FcRH5 a FcRH5 inmovilizado, (4) usar un exceso de la segunda proteína para eluir cualquier de los clones no deseados que reconocen los determinantes de unión a FcRH5 que se superponen o se comparten con los determinantes de unión de la segunda proteína y (5) eluir los clones que permaneces adsorbidos después del paso (4) . Opcionalmente , los clones con las propiedades bloqueantes/no bloqueantes deseadas se pueden enriquecer adicionalmente por la repetición de los procedimientos de selección descritos en la presente memoria una o más veces.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales derivados del hibridoma o despliegue de los fagos de los clones de Fv de la invención se aisla fácilmente y se secuencia mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, por uso de los iniciadores de oligonucleótidos diseñados para amplificar específicamente las regiones codificadoras de cadena pesada y ligera de interés proveniente del hibridoma o plantilla del ADN del fago) . Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que luego son transfectados en las células hospederas tales como células de E. coli, células COS de simios, células del ovario del hámster chino (CHO) , células de mieloma que de otra manera no producen proteínas de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células hospederas recombinantes . Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias del ADN que codifica anticuerpos incluye Skerra y otros., Curr . Opinión in Im unol . , 5: 256 (1993) y Pluckthun, Inmunol . Revs, 130: 151 (1992) .
El ADN que codifica los clones de Fv de la invención se puede combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican regiones constantes de cadena pesada y/o cadena ligera (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas se pueden obtener de Kabat y otros., supra) para formar clones que codifican cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa o parcial. Se apreciará que las regiones constantes de cualquier isotipo se pueden usar para este propósito, que incluye a las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE y que tales regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie humana o animal. Un clon de Fv derivado del ADN del dominio variable de una especie animal (tal como ser humano) luego fusionado al ADN de la región constante de otra especie animal para forma las secuencia (s) codificadoras para la cadena pesada y/o ligera de longitud completa "híbrida" , está incluido en la definición de anticuerpos "quimérico" e "híbrido" usada en la presente memoria. En ciertas modalidades, un clon de Fv derivado del ADN variable humano se fusiona al ADN de la región constante humana para formar secuencia (s) codificadoras para todas las cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa o parcial humanas.
El ADN que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 derivado de un hibridoma de la invención también se puede modificar, por ejemplo por sustitución de la secuencia codificadora por las cadenas pesada y/o ligeras de los dominios constantes en lugar de las secuencias murinas homologas derivadas del clon del hibridoma (por ejemplo, como el método de Morrison y otros., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 81: 6851-6855 (1984)). El ADN que codifica un hibridoma o clon de Fv derivado del anticuerpo o fragmento se puede modificar adicionalmente por la unión en forma covalente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina total o parte de la secuencia codificadora del polipéptido no inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad del clon de Fv anticuerpo derivados del clon del hibridoma de la invención.
C . Terapia de profármacos medida por enzima dependiente del anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar en ADEPT por la conjugación del anticuerpo a una enzima activadora del profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterapéutico peptidilo, ver WO 81/01145) en un fármaco anti-cáncer activo. Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y patente U.S. No. 4,975,278.
El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de modo de convertirse en su forma citotóxica más activa.
Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero sin limitación, en fosfatasa alcalina, útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa, que son útiles para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citocina desaminasa, que es útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas , que son útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas que escinden carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa, que son útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa, que es útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa y penicilina G amidasa, que son útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de aminas con grupos fenoxicetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. En forma alternativa, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocida en el arte como "abzimas" se pueden usar para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Wature 328 : 457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo y abzima se pueden preparar como se describe en la presente para la administración de la abzima a una población de células tumorales .
Las enzimas anteriores se pueden unir en forma covalente a los anticuerpos anti-FcRH5 por las técnicas bien conocidas en el arte tal como el uso de agentes de reticulación heterobifuncional descritos anteriormente. En forma alternativa, las proteínas de fusión que comprenden al menos la unión a la región del antígeno del anticuerpo de la invención unida a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención se puede construir usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Neuberger y otros., Nature 312:604-608 (1984) .
D. Anticuerpo anti-FcRH5 Además de los anticuerpos anti-FcRH5 descritos en la presente, está contemplado que se pueden preparar las variantes del anticuerpo anti-FcRH5. Las variantes del anticuerpo anti-FcRH5 se puede preparar por la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en ADN codificador y/o por la síntesis del anticuerpo deseado o polipéptido. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traducción del anticuerpo anti-FcRH5, tales como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación o alteración de las características de anclaje en de la membrana.
Las variaciones en los anticuerpos anti-FcRH5 descritos en la presente, se pueden realizar, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y pautas para mutaciones conservadoras y no conservadoras expuestas, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo o polipéptido que originan un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo o polipéptido de secuencia nativa. Opcionalmente la variación es por sustitución de al menos un aminoácido con otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-FcRH5. La orientación para determinar qué residuo se puede insertar, sustituir o suprimir sin afectar adversamente la actividad deseada se puede hallar al comparar la secuencia del anticuerpo anti-FcRH5 con la de las moléculas de proteína y minimizar la cantidad de cambios de en la secuencia de aminoácidos realizados en las regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos conservadores de aminoácido. Las inserciones o supresiones opcionalmente pueden estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar por la realización sistemática de inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia. y analizar las variantes resultantes en cuanto a la actividad exhibida por la secuencia nativa de longitud completa o madura .
Los fragmentos del anticuerpo anti-FcRH5 se proporcionan en la presente. Tales fragmentos pueden estar truncados en el N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con un anticuerpo o proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo anti-FcRH5.
Los fragmentos de anticuerpo anti-FcRH5 se pueden preparar por alguna de las numerosas técnicas convencionales. Los fragmentos del péptido deseados se pueden sintetizar químicamente. Un método alternativo involucra generar fragmentos del anticuerpo o polipéptido por digestión enzimática, por ejemplo, por el tratamiento de la proteína con una enzima conocida por escindir proteínas en los sitios definidos por residuos de aminoácidos particulares, o por la digestión del ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislamiento del fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada involucra el aislamiento y amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado, por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los oligonucleótidos que definen los extremos terminales deseados del fragmento de ADN se emplean en los iniciadores 5' y 3' en la PCR. Con preferencia, los fragmentos de anticuerpo anti-FcRH5 comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el anticuerpo anti-FcRH5 nativo que se describe en la presente.
En modalidades particulares, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 8 bajo el título de sustituciones preferidas. Si las sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, por lo tanto se introducen cambios más sustanciales, denominados ejemplos de sustituciones en la Tabla 8, o como se describe a continuación con referencia a las clases de aminoácidos y se analizan los productos.
Tabla 8 Residuo Ejemplos de Sustituciones Original sustituciones preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg lie (I) leu; val ; met; ala; phe; orleucina leu Leu (L) norleucina; ile; val; met ; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val ; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (?) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile ; leu; met ; phe ; ala; norleucina leu Se pueden obtener modificaciones sustanciales de la función o identidad inmunológica del anticuerpo anti-FcRH5 por la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la masa de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupo basados en las propiedades comunes de sus cadenas laterales (1) hidrófobo: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilo neutro: cis, ser, thr; (3) ácido: asp, glu; (4) básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gli, pro; y (6) aromático: trp, tyr, phe .
Las sustituciones no conservadoras supondrán el intercambio un miembro de uno de estas clases por otra clase. Tales residuos sustituidos también se pueden introducir en los sitios de sustitución conservadora o, con más preferencia, en los sitios restantes (no conservados) .
Las variaciones se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagenesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio) , barrido de alanina y mutagenesis por PCR. La mutagénesis dirigida al sitio [Cárter y otros., Nucí . Acids Res . , 13:4331 (1986); Zoller y otros., Nucí. Acids Res., L0:6487 (1987)], mutagénesis por cásete [Wells y otros., Gene, 3_4:315 (1985)], mutagénesis por selección de restricción [Wells y otros., Philos. Trans . R. Soc . Londres SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas se pueden realizar en el ADN clonado para producir el ADN de la variante del anticuerpo anti-FcRH5.
También se puede emplear el análisis del barrido de aminoácido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos se hallan los aminoácidos neutros y relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. La alanina es normalmente un aminoácido de barrido preferido de este grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Normalmente también se prefiere alanina porque es el aminoácido más común. Por otra parte, con frecuencia se halla sepultado y con las posiciones expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Libreman & Co., N.Y.); Chotia, J. Mol . Biol . , 150:1 (1976)] . Si la sustitución de alanina no produce cantidades de variante adecuadas, se puede usar un aminoácido isotérico .
Cualquier residuo de cisteína no involucrado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo anti-FcRH5 también se puede sustituir, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula y evitar el reticulación aberrante. A la inversa, se pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo anti-FcRH5 para mejorar su estabilidad (en particular cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento de Fv) .
Un tipo particularmente preferido de variante por sustitución involucra sustituir una o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . En general, las variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán mejores propiedades biológicas con respecto al anticuerpo original del que se generan. Una forma conveniente para generar las variantes por sustitución involucra la maduración de afinidad usando despliegue en fago. En breves palabras, varios sitios de la región (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se despliegan en forma monovalente a partir de las partículas del fago filamentoso como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado en cada partícula. Las variantes desplegadas en el fago luego se analizan para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en la presente. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidata para la modificación, se puede realizar mutagénesis de barrido de alanina) para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen en forma significativa a la unión del antígeno. En forma alternativa o adicional, puede ser beneficioso analizar la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el polipéptido de FcRH5. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se generan las variantes, el panel de las variantes se somete a análisis usando las técnicas conocidas en la técnica, que incluyen las descritas en la presente, y se pueden seleccionar las variantes con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo posterior.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-FcRH5 se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen pero sin limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de las variantes naturales de la secuencia de aminoácidos) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigido al sitio) , mutagénesis por PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada antes o una versión no variante del anticuerpo.
E . Modificaciones de anticuerpos anti-FcRH5 Las modificaciones covalentes de los anticuerpos anti-FcRH5 se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluyen la reacción de residuos de aminoácidos de un anticuerpo anti-FcRH5 específicos con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C- terminal del anticuerpo anti-FcRH5. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para el reticulación del anticuerpo anti-FcRH5 a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para usar en el método para purificar anticuerpos anti-FcRH5, y viceversa. Los agentes de reticulación usados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1 , 1-bis (diazoacetil ) -2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ásteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobufuncionales que incluyen ésteres disuccinimidílieos tales como 3,3'-ditiobis ( succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncioanles tales como bis-N-maleimido-1 , 8-octano y agentes tales como meti1-3- [ (p-azidofenil) ditio] propioimidato .
Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, metilación del grupo -amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure y Molecular Properties , W.H. Libreman & Co . , San Francisco, pp . 79-86 (1983)] , acetilación de la amina N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal .
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-FcRH5 incluido dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del anticuerpo o polipéptido. Por "alterar el patrón de glicosilación nativo" se entiende para los fines de la presente la eliminación de uno o más residuos de carbohidrato hallados en la secuencia nativa del anticuerpo anti-FcRH5 (sea por la eliminación del sitio de glicosilación subyacente o por la eliminación de la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos) , y/o agregado de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa del anticuerpo anti-FcRH5. Además, la frase incluye los cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que involucran un cambio de la naturaleza y las proporciones de los diversos residuos de carbohidratos presentes .
La glicosilación de los anticuerpos está normalmente N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión del residuo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias del tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo la presencia de cualquiera de estas secuencias del tripéptido de un polipéptido origina un sitio de glicosilación potencial La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de los azúcares de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5 -hidroxiprolina o 5 -hidroxilisina .
La adición de los sitios de glicosilación al anticuerpo anti-FcRH5 se logra en forma conveniente por la alteración de la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias del tripéptido descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación N-ligados) . La alteración también se puede realizar por la adición, o sustitución de uno o más residuos serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original ( (para los sitios de glicosilación 0-ligados) . La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-FcRH5 opcionalmente se puede alterar a través de cambios en el nivel de ADN, en particular por la mutación del ADN que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 en bases preseleccionadas de modo que los codones que se generen se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otro medio de aumentar el número de residuos de carbohidrato en el anticuerpo anti-FcRH5 es por acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos para el polipéptido. Tales métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en O 87/05330 publicado el 11 de setiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. , p . 259-306 (1981) .
La eliminación de residuos de carbohidrato presentes en el anticuerpo anti-FcRH5 se puede lograr en forma enzimática o química o por substitución por la mutación de los codones que codifican los residuos de aminoácidos que sirven como blancos para la glicosilación . Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Hakimuddin, y otros., Arch . Biochem. Biophys . , 259:52 (1987) y por Edge y otros., Anal . Biochem. , 118 : 131 (1981). La escisión enzimática de residuos de carbohidrato en los polipéptidos se puede obtener por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas descritas por Thotakura y otros., Meth. Enzymol . , 138 : 350 (1987).
Otro tipo de de modificación covalente de los anticuerpos anti-FcRH5 comprende la unión del anticuerpo a una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , polipropilenglicol , o polioxialquileños, de la manera que se expone en las Patentes U.S. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. El anticuerpo también se puede capturar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A. , Ed. , (1980) .
El anticuerpo anti-FcRH5 de la presente invención también se puede modificar de modo de formar moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo anti-FcRH5 fusionado a otra secuencia de polipéptidos o aminoácidos heterólogos .
En una modalidad, la molécula quimérica comprende un anticuerpo anti-FcRH5 de fusión con un polipéptido marcado que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-marca. La marca del epítopo generalmente se coloca en los extremos terminales amino- o carboxilo del anticuerpo anti-FcRH5. la presencia de las formas marcadas en el epítopo del anticuerpo anti-FcRH5 se pueden detectar usando un anticuerpo contra el polipéptido con marca. Asimismo, la provisión de la marca del epítopo permite que el anticuerpo anti-FcRH5 sea purifique fácilmente por purificación de afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la marca del epítopo. Varios polipéptidos con marca y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen las marcas poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly) ; el polipéptido con marca HA flu y su anticuerpo 12CA5 [Field y otros., Mol . Cell . Biol . , 8:2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de estos [Evan y otros., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)] ; y la marca de glicoproteína D del virus Herpes Simplex (gD) y su anticuerpo [Paborsky y otros., Protein Engineering, 3J6) :547~553 (1990)] . Otros polipéptidos con marca incluyen el péptido Flag [Hopp y otros., BioTechnology, 6^1204-1210 (1988)] ; el péptido del epítopo KT3 [Martin y otros., Science, 255 : 192-194 (1992)] ; un péptido del epítopo de a-tubulina [Skinner y otros., J . Biol. Chem. , 266 : 15163-15166 (1991)] ; y la marca del péptido de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth y otros., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 87:6393-6397 (1990)] .
En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo anti-FcRH5 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada como "inmunoadhesina" ) , la fusión podría ser en la región de Fe de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig con preferencia incluyen la incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio de transmembrana suprimido o inactivado) anticuerpo anti-FcRH5 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3 , o la bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula IgGl . Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también patente US No. 5.428.130 presentada el 27 de junio de 1995.
F . Preparación of anticuerpos anti-FcRH5 La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos anti-FcRH5 por el cultivo de células transformadas o transíectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FcRH5. Obviamente, está contemplado que se pueden emplear métodos alternativos que son bien conocidos en la técnica, para preparar anticuerpos anti-FcRH5. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada, o porciones de esta se pueden producir por síntesis de péptidos directa usando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart y otros., Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Libreman Co . , San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc . , 85:2149-2154). La síntesis de proteínas in vi tro se puede realizar usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems (Foster City, CA) mediante las instrucciones del fabricante. Varias porciones del anticuerpo anti-FcRH5 se pueden sintetizar químicamente en forma separada y se combinan usando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo anti-FcRH5 deseado. 1. Aislamiento del ADN que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 El ADN que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 se puede obtener de una biblioteca de ADNc preparada del tejido que se considera que posee el ARNm del anticuerpo anti-FcRH5 y lo expresa en un nivel detectable . Por consiguiente, un ADN del anticuerpo anti-FcRH5 o polipéptido de FcRH5 humano se puede obtener de modo conveniente a partir de una biblioteca de ADNc preparada de tejido humano. El gen que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 también se puede obtener de una biblioteca genómica o por procedimientos de síntesis conocidos (por ejemplo, síntesis de ácido nucleico automatizada) .
Las bibliotecas se pueden analizar con sondas (tales como oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por este. El análisis de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada se puede realizar usando procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook y otros . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 es usar la metodología de PCR [Sambrook y otros., supra; Dieffenbach y otros., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] .
Las técnicas para analizar una biblioteca de ADNc son bien conocidas en la materia. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud suficiente y suficientemente inequívoca de modo de minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido con preferencia se marca de modo que se pueda detectar después de la hibridación al ADN en la biblioteca analizada. Los métodos de marcación son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de radiomarcas como ATP marcado con 32P, biotinilación o marcación con enzimas. Las condiciones de hibridación, que incluyen rigurosidad modarada y alta rigurosidad, se proporcionan en Sambrook y otros., supra .
Las secuencias identificadas en tales métodos de análisis de biblioteca se pueden comparar y alienar con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en las bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (a nivel del aminoácido o nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa se puede determinar usando métodos conocidos en la técnica y como se describe en la presente.
El ácido nucleico que tiene la secuencia codificadora de la proteína se puede obtener por el análisis de bibliotecas de ADNc o genómicas seleccionadas usando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente para la primera vez y, si es necesario, usando procedimientos de extensión de iniciadores convencionales como se describe en Sambrook y otros., supra , para detectar precursores y procesar los intermediarios de ARNm que no se transcribieron en forma inversa en ADNc . 2. Selección y transformación de células hospederas Las células hospederas se transfectan o transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en la presente para la producción del anticuerpo anti-FcRH5 y se cultivan en medio de nutrientes convencional modificado según corresponda para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y similares, pueden ser seleccionadas por los profesionales expertos sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares se pueden hallar en Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y otros., supra .
Los métodos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas, que significan la introducción de ADN en el hospedero de modo que el ADN sea replicable, sea como integrante extracromosómico o cromosómico, son comúnmente conocidos por los profesionales expertos, por ejemplo, CaCl2, CaP04, mediado por liposoma, polietilen-glicol/DMSO y electroporación. De acuerdo con la célula hospedera usada, la transformación se realiza usando técnicas estándares apropiadas para las células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook y otros., supra, o la electroporación se usan generalmente para los procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células de plantas, como se describe en Shaw y otros., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin paredes celulares, se puede emplear el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 5_2: 456-457 (1978) . Los aspectos generales de las transfecciones en sistemas de células hospederas de mamíferos que han descrito en la Patente U.S. No. 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo normalmente de acuerdo con el método de Van Solingen y otros., J. Bact . , 130 : 946 (1977) y Hsiao y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979) . Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir ADN en las células, tales como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas o policationes , por ejemplo, polibreno, poliornitina . Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown y otros., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour y otros., Nature, 336:348-352 (1988).
Las células hospederas adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente incluyen células procariotas, levaduras o eucariotas superiores, a. Células hospederas procariotas Las células hospederas procariotas adecuadas incluyen pero sin limitación arqueobacterias y eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos . Por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Varias cepas de E. coli están públicamente disponibles, tales como cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); cepa de E. coli 3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otra células hospederas procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurio, Serratia, por ejemplo, Serratia mareescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B . licheniformis 41P descritos en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un hospedero o hospedero progenitor particularmente preferido porque es la cepa hospedero más común para las fermentaciones del producto de ADN recombinante . Con preferencia, la célula hospedera secreta cantidad mínimas de enzima proteolítica. Por ejemplo, la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol . 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Depósito No. 27,325) se puede modificar para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas para el hospedero, los ejemplos de los hospederos incluyen cepa W3110 de E. coli 1A2 , que tiene el genotipo completo tonA ; cepa W3110 de E. coli 9E4 , que tiene el genotipo completo tonA ptr3 ; cepa W3110 de E. coli 27C7 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; cepa W3110 de E. coli 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; cepa W3110 de E. coli 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación por eliminación degP resistente a no kanamicina; cepa W3110 de E. coli 3D3 que tiene genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kanR (U.S. Pat . No. 5,639,635) y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica imitante que se describe en la Patente U.S. No. 4,946,783 presentada en agosto de 1990. Otras cepas y sus derivados, tales como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli\ 1776 (ATCC 31,537) y E. coli RV308(ATCC 31,608) también son adecuados. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Los métodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente que tienen genotipos definidos son conocidos en la técnica y descritos en, por ejemplo Bass y otros., Proteins, 8:309-314 (1990) . Generalmente es necesario seleccionar las bacterias apropiadas que toman en consideración la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo las especies de E. coli, Serratia, o Salmonella se pueden usar adecuadamente como hospedero cuando se usan plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pK 410 para suministrar el replicón. Normalmente la célula hospedera deberá secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas , y los inhibidores de proteasas adicionales se pueden incorporar en forma deseable al cultivo de células. Alternativamente, los métodos de clonación in vi tro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos son adecuados.
Los anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, y las proteínas de fusión del anticuerpo se pueden producir en las bacterias, en particular cuando no se necesitan glicosilación y función efectora de Fe, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra efectividad en la destrucción de las células tumorales . Los anticuerpos de longitud completa tiene una vida media mayor en la circulación. La producción en E. coli es más rápida y más rentable. Para la expresión de los fragmentos de anticuerpos y polipéptidos de las bacterias, ver, por ejemplo, U.S. 5,648,237 (Cárter et . al.), U.S. 5,789,199 (Joly y otros.), U.S. 5,840,523 (Simmons y otros.), que describe la región de iniciación de la traducción (TlR) y las secuencias señal para optimizar la expresión y secreción, estas patentes se incorporan en la presente por referencia. Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y se puede purificar mediante, por ejemplo, una columna de proteína A o G de acuerdo con el isotipo. La purificación final se pude llevar a cabo en forma similar al proceso para purificar anticuerpos expresados por ejemplo, en las células CHO . b. Células hospederas eucariotas Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son hospederos de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican el anticuerpo anti-FcRH5. Saccharomyces cereevisia es un microorganismo eucariota inferior. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature , 290: 140
[1981]; EP 139,383 publicado el 2 de mayo de 1985); hospederos de Jluyveromyces, (Patente U.S. No. 4.943.529; Fleer y otros., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y otros., J. Bacterio! ., 154 (2 ) : 737-742
[1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg y otros., Bio/Technology, 8:135 (1990) ) , K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna y otros., J. Basic Microbiol . , 28:265-278
[1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case y otros., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263
[1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicado 31 October 1990) ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillio, Tolypocladio ( O 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991) , y hospederos de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance y otros., Biochem. Biophys . Res. Commun., 112:284-289
[1983]; Tilburn y otros., Gene, 26:205-221
[1983]; Yelton y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474
[1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J . , 4:475-479
[1985]). Las levaduras metilotróficas son adecuadas en la presente e incluyen, pero sin limitación, levaduras capaces de crecimiento en metanol seleccionado del género que consiste en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula . Una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras se puede hallar en C. Anthony, The Biochemistry of of Methylotrophs , 269 (1982) .
Las células hospederas adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-FcRH5 glicosilado derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de insecto tales como Drosófila S2 y Spodóptera Sf9, así como las células vegetales, tales como cultivos celulares de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate, y tabaco. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales que corresponden a célula hospedera de insecto permisivas tales como Spodóptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx morí. Una variedad de cepas virales para la transfección están disponibles al público, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y los virus se pueden usar como el virus de la presente de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodóptera frugiperda .
Sin embargo el interés ha sido mayor en las células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo celular) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Los ejemplos de las líneas celulares de células hospederas de mamíferos son la línea CV1 del riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) , línea de riñon embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y otros., J. Gen Virol . 36:59 (1977)), células de riñon de hámster bebé (BH , ATCC CCL 10) , células de ovario de hámster chino/ -DHFR (CHO, Urlaub y otros., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)), células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980) ), células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70), células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) , células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) , células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) , células de hígado de rata búfalos (BRL 3A, ATCC CRL 1442) , células de pulmón humano ( 138, ATCC CCL 75), células de hígado humano (Hep G2, HB 8065), tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) , células TRI (Mather y otros., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)), células MRC 5, células FS4 y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2) .
Las células hospederas se transforman con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la producción del anticuerpo anti-FcRH5 y se cultivan en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. 3. Selección y uso de un vector replicable Vector Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, por medio de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Muchos vectores están disponibles. La elección del vector depende en parte de la célula hospedera usada. En general, se prefiere las células hospederas de origen procariota o eucariota (generalmente de mamífero) .
El vector, por ejemplo, puede estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada se puede insertar en el vector por una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio de restricción de endonucleasa apropiado usando técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligamiento que son conocidas por los profesionales expertos.
El FcRH5 se puede producir en forma recombinante no solo en directamente sino también como polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la, proteína o el polipéptido maduros. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariótica seleccionada por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o líderes de enterotoxina II termoestables . En la secreción de levaduras la secuencia señal nativa se pueden sustituir, por ejemplo, con una líder de invertasa de levaduras, líder del factor oc (líderes que incluyen el factor oc de Saccharomyces y Kluyveromyces, está última descrita en la Patente U.S. No. 5,010,182), o líder de fosfatasa ácida, líder de glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicado el 4 de abril de 1990) , o la señal descrita en WO 90/13646 publicado el 15 noviembre de 1990. En la expresión de la célula de mamífero, las secuencias señal de mamíferos se pueden usar para dirigir la expresión de la proteína, tal como las secuencias señal de los polipéptidos secretados de la misma especie o relacionadas, así como líderes secretores virales . a. Células hospederas procariotas Las secuencias de polinucleótidos que codifican los componentes polipeptídicos de los anticuerpos de la invención se pueden obtener mediante técnicas recombinantes estándares. Las secuencias de polinucleótidos deseadas se pueden aislar y secuenciar a partir de las células productoras de anticuerpos tales como las células del hibridoma. En forma alternativa, los polinucleótidos se pueden sintetizar mediante el sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar los polinucleótidos heterólogos en hospederos procariotas. Muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la técnica se pueden usar para los fines de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se insertarán en el vector y la célula hospedera particular que se transformará con el vector. Cada vector contiene varios componentes, que dependen de su función (amplificación o expresión del polinucleótido heterólogo, o ambos) y su compatibilidad con la célula hospedera particular en la que reside.
En general, los vectores plásmidos que contienen replicón y secuencias control que derivan de especies compatibles con la célula hospedera se usan en conexión con estos hospederos. Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células hospederas seleccionadas, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la selección fenotípica de las células transformadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR.322, que contiene genes que codifican la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y y de este modo proporciona un medio sencillo para la identificación de las células transformadas, es adecuado para la mayor parte de las bacterias gram negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para la levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. pBR322, sus derivados u otros plásmidos o bacteriófagos microbianos también pueden contener, o ser modificados para contener, promotores que se pueden usar con organismos microbianos para la expresión de proteínas endógenas. Los ejemplos de derivados de pBR322 usados para la expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Cárter y otros., patente US No. 5,648,237.
Además, los vectores de fagos que contienen replicón y secuencias control que son compatibles con el organismo hospedero se pueden usar como vectores de transformación en conexión con estos hospederos. Por ejemplo, se puede utilizar el bacteriófago tal como ?T??.??.-?? para preparar un vector recombinante que se puede usar para transformar células hospederas sensibles tal como E. coli LE392.
El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotor-cistrón, que codifican cada uno de los componentes del polipéptido. Un promotor es una secuencia regulatoria no traducida ubicada dirección 5' (51) de un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotas normalmente son de dos clases, inducibles y constitutivos. El promotor inducible es un promotor que induce altos niveles de transcripción del cistrón bajo su control como respuesta a cambios en las condiciones de cultivo, por ejemplo en presencia o ausencia de un nutriente o cambio de temperatura.
Se conocen numerosos promotores reconocidos por una variedad de potenciales células hospederas. El promotor seleccionado puede estar unido operativamente al ADN del cistrón que codifica la cadena ligera o pesada por la eliminación del promotor de la fuente de ADN por medio de la digestión con una enzima de restricción y la inserción de la secuencia promotora aislada en el vector de la invención. Se pueden usar tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterólogos para la amplificación y/o expresión directa de los genes objetivo. En algunas modalidades, se utilizan promotores heterólogos, ya que ellos en general permiten mayor transcripción y mayores rendimientos del gen objetivo expresado en comparación con el promotor del polipéptido objetivo.
Los promotores reconocidos por una variedad de células hospederas potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para uso con hospederos procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores ß-galactamasa y lactosa, [Chang y otros., Nature , 275:615 (1978); Goeddel y otros., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] y y promotores híbridos tales como el promotor tac (trp) [deBoer y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)] o el promotor trc. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) Unida operativamente al ADN que codifica el anticuerpo anti-FcRH5. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en las bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fago conocidos) son también adecuados. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, de este modo permiten que un profesional experto las ligue en forma operativa a los cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas objetivo (Siebenlist y otros. (1980) Cell 20: 269) empleando enlazadores o adaptadores para aportar algunos de los sitios de restricción requeridos.
En un aspecto de la invención, cada cistrón del vector recombinante comprende un componente de la secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de la membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN del polipéptido objetivo que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el propósito de esta invención deberá ser una que sea reconocida y procesada (es decir escindida por una peptidasa de señal) por la célula hospedera. Para las células hospederas procariotas que no reconocen y procesan las secuencias señal nativas en los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se sustituye con una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo del grupo que consiste en secuencias líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa , Ipp, o enterotoxina II termoestable (STII) , LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una modalidad de la invención, las secuencias señal usadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias señal STII o variantes de las misma.
En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas de acuerdo con la invención se puede producir en el citoplasma de la célula hospedera y por consiguiente no requiere la presencia de las secuencias señal de secreción en cada cistrón. En ese aspecto, las cadenas ligeras y pesadas de la inmunoglobulina se expresan, pliegan y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales en el citoplasma. Ciertas cepas hospedero (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB) proporcionan condiciones citoplásmicas que son favorables para la formación del enlace disulfuro, de este modo se permite el plegamiento apropiado y el ensamblaje de las subunidades de proteína expresadas. Proba y Pluckthun Gene, 159:203 (1995) .
La presente invención proporciona un sistema de expresión en que la relación cuantitativa de los componentes del polipéptido expresados se puede modular a fin de maximizar el rendimiento de los anticuerpos de la invención secretados y ensamblados apropiadamente. Dicha modulación se obtiene al menos en parte por la modulación simultánea de las potencias de traducción para los componentes del polipéptido.
Una técnica para la modulación de las potencias de traducción se describe en Simmons y otros., patente US No. 5,840,523. Esta utiliza las variantes de la región de iniciación de la traducción (TIR) dentro de un cistrón. Para una TIR dada, se puede crear una serie de variantes de de secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos con una variedad de potencias de traducción, de este modo se proporciona un medio conveniente por el cual se ajusta este factor para el nivel de expresión deseada de la cadena específica. Las variantes de TIR se pueden generar por técnicas de mutagénesis convencionales que producen cambios en el codón que pueden alterar la secuencia de aminoácidos, si bien se prefieren cambios silentes en la secuencia de nucleótidos. Las alteraciones de la TIR pueden incluir, por ejemplo, alteraciones en la cantidad o espaciado de las secuencias de Shine-Dalgarno, junto con las alteraciones de la secuencia señal. Un método para generar secuencias señal mutantes es la generación de un "banco de codones" en el comienzo de una secuencia codificadora que no cambia la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (es decir, los cambios son silentes) . Esto se puede obtener por el cambio de la tercera posición de nucleótido de cada codón; en forma adicional, algunos aminoácidos, tal como leucina, serina, y arginina, tienen múltiples primeras y segundas posiciones que pueden agregar complejidad a la preparación del banco. Este método de mutagénesis se describe en detalle en Yansura y otros. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol . 4:151-158.
Con preferencia, se genera un conjunto de vectores con una variedad de potencias de TIR para cada cistrón de ella. Este conjunto limitado proporciona una comparación con los niveles de expresión de cada cadena así como el rendimiento de los productos de anticuerpo deseados en varias combinaciones de potencia de TIR. Las potencias de TIR se pueden determinar por la cuantificación del nivel de expresión de un gen indicador como se describe en detalle en Simmons y otros. Patente US No. 5,840,523. Sobre la base de la comparación de la potencia de traducción, las TIR individuales deseadas se seleccionan para combinarse en los constructos del vector de expresión de la invención, b. Células hospederas eucariotas Los componentes del vector en general incluyen pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. (1) Componente de la secuencia señal Un vector para uso en una célula hospedera eucariota también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada con preferencia es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedera. En la expresión de la célula de mamífero, las secuencias señal de mamífero así como las líderes secretoras virales, por ejemplo la señal gD del herpes simplex, están disponibles.
El ADN para tal región precursora se une en el marco de lectura para el ADN que codifica el anticuerpo. (2) Origen de replicación Generalmente, el componente del origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos. Por ejemplo, el origen SV40 se puede usar normalmente solo porque contiene el promotor temprano. (3) Selección del componente génico Los vectores de expresión y clonación normalmente pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas de complemento, o (c) aporte de nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de un esquema de selección usa un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedera. Estas células que se transforman con éxito con gen heterologo producen una proteína que confiere resistencia a los fármacos y de este modo sobrevive al régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Un ejemplo de marcador seleccionable adecuado para las células de mamífero son las que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FcRH5, tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína- I y -II, con preferencia los genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc. Una célula hospedera apropiada cuando se emplea DHFR tipo silvestre es la línea celular CHO deficiente de la actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096) , preparada y propagada como se describe en Urlaub y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR primero se identifican por el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Alternativamente, se pueden seleccionar las células hospederas (particularmente los hospedero de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo, proteína DHFR tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 31 -fosfotransferasa (APH) por cultivo celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Ver patente US No. 4,965,199.
Un gen de selección para usar en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y otros., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y otros., Gene , 7:141 (1979); Tschemper y otros., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. (4) Componente del promotor Los vectores de expresión y clonación usualmente pueden contener un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 para dirigir la síntesis de AR m. Son bien conocidos los promotores reconocidos por una variedad de potenciales células hospederas.
Virtualmente todos los genes de eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases dirección 5' del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se halla de 70 a 80 bases dirección 5' del comienzo de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 31 de la mayoría de los genes eucarióticos es una secuencia AATAAA que puede ser una señal para la adición de la cola poliA del extremo 3' de la secuencia codificadora. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en los vectores de expresión eucariotas, Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar en hospederos de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman y otros., J. Biol . Chem . , 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess y otros., J . Adv . Enzy e Reg . , 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3 -fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.
Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para usar en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en EP 73.657.
La transcripción del anticuerpo anti-FcRH5 de los vectores de las células hospederas de mamíferos se controla, por ejemplo por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de viruela aviar (UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus , un retrovirus, virus de hepatitis-B y virus Simian 40 (SV40) , de los promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina de los promotores termoestables , de manera que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedera.
Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen de replicación del virus SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar el ADN en mamíferos hospedero que usan el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la Patente U.S. No. 4,419,446. Una modificaron de este sistema se describe en la Patente U.S. No. 4,601,978. Ver también Reyes y otros., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión de ADNc de interferón ß humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus herpes simplex. En forma alternativa, se puede usar la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor. (5) Componente del elemento potenciador La transcripción de ADN que codifica el anticuerpo anti-FcRH5 por eucariotas superiores con frecuencia aumenta por la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN de acción cis, usualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Muchas secuencias potenciadoras son actualmente conocidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) . Normalmente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de una célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en la parte última del origen de replicación (100-270 pb) , el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus , el potenciador del polioma en la parte última del origen de replicación y potenciadores del adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de los promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en la posición 5' o 3' de la secuencia que codifica el anticuerpo anti-FcRH5, pero con preferencia se localiza en el sitio 5' del promotor. (6) Componente de terminación de transcripción Los vectores de expresión usados en las células hospederas eucariotas (de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y la estabilización del ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3', de los ADN eucariotas o virales o los ADNc . Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados de la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo anti-FcRH5. Un componente de terminación de transcripción es la región de poliadenilación de la hormona crecimiento bovina. Ver WO94/11026 y el Vector de expresión allí descrito.
Otros métodos, vectores y células hospederas adecuadas para la adaptación a la síntesis del anticuerpo anti-FcRH5 en un cultivo celular de vertebrado recombinante se describen en Gething y otros., Nature, 293:620-625 (1981) ; Mantei y otros., Nature, 281:40-46 (1979) ; EP 117.060; y EP 117.058. 4. Cultivo de las células hospederas Las células hospederas usadas para producir el anticuerpo anti-FcRH5 de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios . a. Células hospederas procariotas Las células procariotas usadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en la técnica y son adecuados para el cultivo de las células hospederas seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo de luria (LB) más suplementos nutricionales necesarios. En algunas modalidades, el medio también contiene un agente de selección, elegido sobre la base de la construcción del vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de las células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo se agrega ampicilina al medio para el crecimiento de las células que expresan el gen resistente a ampicilina.
Cualquiera de los suplementos necesarios además de las fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico también se pueden incluir en concentraciones apropiadas introducidas solas o como una mezcla de otro suplemento o medio tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol .
Las células hospederas procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de la E. coli, por ejemplo la temperatura preferida varía de aproximadamente 20°C a aproximadamente 39°C, con más preferencia de aproximadamente 25°C a aproximadamente 37°C, aun con más preferencia a aproximadamente 30°C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo hospedero. Para la E. coli, el pH es con preferencia de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.4, y con más preferencia de aproximadamente 7.0.
Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteína se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, los promotores de PhoA se usan para controlar la transcripción de los polipéptidos . Por consiguiente, las células hospederas transformadas se cultivan en un medio limitado en fosfato para la inducción. Con preferencia, el medio limitado en fosfato es el medio C.R.A.P (ver, por ejemplo, Simmons y otros, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Se puede usar una variedad de otros inductores, de acuerdo con la construcción del vector empleado, como es conocido en el arte.
En una modalidad, los polipéptidos de la presente invención se secretan y recuperan del periplasma de la célula hospedera. La recuperación de la proteína típicamente involucra la ruptura del microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmótico, irradiación con ultrasonido o lisis. Una vez que las células se rompieron, los desechos celulares o células completas se pueden eliminar por centrifugación o filtración. Las proteínas se pueden purificar adicionalmente , por ejemplo por cromatografía de afinidad en resina. Alternativamente, las proteínas se pueden transportar en el medio de cultivo y aislar del mismo. Las células se pueden eliminar del cultivo y el sobrenadante del cultivo se filtra y concentra para la purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados se pueden aislar adicionalmente e identificar mediante métodos comúnmente conocidos tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia Western.
En un aspecto de la invención, la producción del anticuerpo se realiza en gran cantidad por un proceso de fermentación. Diversos procesos de fermentación discontinuos en gran escala están disponibles para la producción de proteínas recombinantes . Las fermentaciones a gran escala tienen por lo menos 1000 litros de capacidad, con preferencia de aproximadamente 1,000 a 100,000 litros de capacidad. Estos termentadores usan un agitador de paletas para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de carbono/energía preferida) . La fermentación en pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en un termentador que es de no más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica, y puede variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.
Durante el proceso de fermentación, la inducción de la expresión de proteínas típicamente se inicia después de que las células se han cultivado en condiciones adecuadas a una densidad deseada, por ejemplo, una DO550 de aproximadamente 180-220, en tal etapa las células están en fase estacionaria temprana. Se pueden usar una variedad de inductores, de acuerdo con la construcción del vector empleado, como se conoce en la técnica y se describió anteriormente. Las células se pueden cultivar durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen usualmente durante aproximadamente 12-50 horas, aunque se puede usar un tiempo de inducción más prolongado o más corto.
Para mejorar el rendimiento de la producción y la calidad de los polipéptidos de la invención, se pueden modificar diversas condiciones de fermentación. Por ejemplo para mejorar el ensamblaje apropiado y el plegado de los polipéptidos del anticuerpo secretado, se pueden usar vectores adicionales para sobreexpresar las proteínas chaperonas, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis, trans-isomerasa con actividad de chaperona) para co-transformar las células hospederas procariotas. Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan el plegado apropiado y la solubilidad de las proteínas heterologas producidas en las células hospederas bacterianas. Chen y otros. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou y otros., patente US No. 6,083,715; Georgiou y otros., patente US No. 6,027,888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol . Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie y otros. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.
Para minimizar la proteólisis de las proteínas heterologas expresadas (especialmente las que son sensibles a la proteólisis) , se pueden usar ciertas cepas hospedero deficientes en enzimas proteolíticas para la presente invención. Por ejemplo las cepas de la célula hospedera se pueden modificar para efectuar las mutaciones genéticas de los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y sus combinaciones. Algunas de las cepas de E. coli deficientes en proteasa están disponibles y descritas en, por ejemplo Joly y otros. (1998) , supra, Georgiou y otros., patente US No. 5,264,365, Georgiou y otros., patente US No. 5,508,192; Hará y otros., Microbial Drug Resistanee, 2:63-72 (1996).
En una modalidad, las cepas de E. coli deficientes en enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan con una o más proteínas chaperonas se usan como células hospederas en el sistema de expresión de la invención b. Células hospederas eucariotas Los medios disponibles en el mercado tal como Ham FIO (Sigma) , medio mínimo esencial ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio Eagle modificado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para el cultivo de las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y otros., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y otros., Anal. Biochem.102 :255 (1980), Patentes U.S. Nos. 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, o 5,122,469, WO 90/03430, WO 87/00195, o Patente U.S. Re. 30,985 se puede usar como medio de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios se puede suplementar cuando fuera necesario con hormonas y/ otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , regulador de pH (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como fármaco GENTAMICINA™, oligoelementos (definidos como compuestos orgánicos usualmente presentes en concentraciones finales de intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario se puede incluir también en concentraciones apropiadas que deben ser conocidas para los expertos en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son las que se usan previamente con la célula hospedera seleccionada para la expresión, y será evidente para el profesional experto. 5. Detección de la amplificación/expresión del gen La amplificación y/o expresión del gen se puede medir en una muestra en forma directa, por ejemplo, por Southern Blot convencional, Northern Blot para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, sobre la base de las secuencias provistas en la presente. Alternativamente, se pueden emplear los anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, que incluyen los dúplex de ADN, dúplex de ARN y los dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína . Los anticuerpos a su vez se puede marcar y el ensayo se puede realizar cuando el dúplex está unido a una superficie, de modo que se puede detectar la formación de dúplex en la superficie, la presencia del anticuerpo unido al dúplex.
La expresión génica se puede medir en forma alternativa por métodos inmunológicos , tales como la tinción inmunohistoquímica de las células o secciones de tejido y el ensayo del cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonal o policlonal, y se puede preparar en cualquier mamífero. En forma conveniente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido de FcRH5 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN provistas en la presente o contra una secuencia exógena fusionada al ADN de FcRH5 y que codifica un epítopo del anticuerpo específico . 6. Purificación del anticuerpo anti-FcRH5 Las formas del anticuerpo anti-FcRH5 se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisados de la célula hospedera. Si está unido a membrana se puede liberar de la membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o por escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión del anticuerpo anti-FcRH5 se pueden alterar por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclo de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o agentes de lisado celular.
Se puede desear purificar el anticuerpo anti-FcRH5 de las proteínas o polipéptidos de la célula recombinante . Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía en sílice en resina de intercambio catiónico tales como DEAE; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio, filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de sefarosa de proteína para extraer contaminantes tales como IgG; y columnas de quelantes de metales para unir formas marcadas en el epítopo del anticuerpo anti-FcRH5. Varios métodos de purificación de proteínas se pueden emplear y tales métodos son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) . La etapa de purificación seleccionada dependerá, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado el anticuerpo anti-FcRH5 particular producido.
Cuando se usan técnicas recombinantes , el anticuerpo se puede producir en forma intracelular en el espacio periplásmico o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se en forma intracelular, como un primer paso, los desechos particulados, de las células hospederas o fragmentos lisados se eliminan por ejemplo por centrifugación o ultrafiltración . Cárter y otros., Bio/ echnology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico de E. coli. En breves palabras, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fluoruro de enilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los desechos celulares se pueden eliminar por centrifugación. Cuando los anticuerpos se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero mediante un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF se puede incluir en cualquiera de los pasos precedentes para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes accidentales.
La composición del anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar mediante por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, la técnica de purificación preferida es la cromatografía de afinidad. La adecuación de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies e isotipos de cualquier dominio Fe de la inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar los anticuerpos basados en las cadenas pesadas ??, ?2 , o ?4 humanas (Lindmark y otros., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humanos (Guss y otros. , EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es con más frecuencia agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivilnil) benceno permiten los caudales de flujo más rápidos y los tiempos de procesamiento más cortos que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3m, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la para la purificación de proteína tal como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC en fase reversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™ cromatografía en una resina de intercambio aniónica o catiónica (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque , SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.
Después de los pasos de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se puede someter a una cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo mediante un regulador de pH de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, con preferencia se realiza a concentraciones de sal baja (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0.25M).
G . Formulaciones farmacéuticas El conjugado de anticuerpo y fármacos (ADC) de la invención se puede administrar por cualquier vía apropiada para la enfermedad tratada. El ^ ADC normalmente se administrará en forma parenteral, es decir, infusión, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural .
Para tratar estos cánceres, en una modalidad, el conjugado de anticuerpo y fármaco se administra por medio de infusión intravenosa. La dosis administrada por medio de infusión está en el intervalo de aproximadamente 1 ug/m2 a aproximadamente 10,000 ug/m2 por dosis, en general una dosis por semana durante un total de una, dos, tres o cuatro dosis. Alternativamente, el intervalo de dosis es de aproximadamente 1 ug/m2 a aproximadamente 1000 ug/m2, aproximadamente 1 a aproximadamente 800 ug/m2 , aproximadamente 1 µg/m2 a aproximadamente 600 Ug/m2 , aproximadamente 1 g/m2 a aproximadamente 400 g/m2, aproximadamente 10 ug/m2 a aproximadamente 500 ug/m2, aproximadamente 10 ug/m2 a aproximadamente 300 ug/m2, aproximadamente 10 ug/m2 a aproximadamente 200 ug/m2 , y aproximadamente 1 g/m2 a aproximadamente 200 µg/m2. La dosis se puede administrar una vez por día, una vez por semana, múltiples veces por semana, pero menos de una vez por día, múltiples veces por mes pero menos de una vez por día, múltiples veces por mes pero menos de una vez por semana, una vez por mes o en forma intermitente para aliviar o reducir en forma intermitente los síntomas de la enfermedad. La administración puede continuar en cualquiera de los intervalos descritos hasta la remisión del tumor o síntomas del linfoma, leucemia tratados. La administración puede continuar después de lograr que la remisión o alivio sea prolongada por la administración continuada .
La invención también proporciona un método de alivio de una enfermedad autoinmunitaria, que comprende administrar a un paciente que sufre de la enfermedad autoinmunitaria, una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de anticuerpo 10A8 humanizado-fármaco de cualquiera de las modalidades precedentes. En modalidades preferidas el anticuerpo se administra por vía intravenosa o subcutánea. El conjugado de anticuerpo y fármaco se administra por vía intravenosa a una dosis en el intervalo de aproximadamente 1 Ug/m2 a aproximadamente 100 mg/ m2 por dosis y en una modalidad específica, la dosis es 1 µg/m2 a aproximadamente 500 g/m2. La dosis se puede administrar una vez por día, una vez por semana, múltiples veces por semana, pero menos de una vez por día, múltiples veces por mes pero menos de una vez por día, múltiples veces por mes pero menos de una vez por semana, una vez por mes o en forma intermitente para aliviar o reducir en forma intermitente los síntomas de la enfermedad La administración puede continuar en cualquiera de los intervalos descritos hasta el alivio o reducción de los síntomas de la enfermedad autoinmunitaria tratada. La administración puede continuar después de lograr alivio o reducción de los síntomas de modo que tal remisión o alivio sea prolongado por la administración continuada.
La invención también proporciona un método de tratar un trastorno de las células B que comprende administrar a un paciente que sufre de un trastorno de las células B, tales como un trastorno proliferativo de las células B (que incluye sin limitación linfoma y leucemia) o una enfermedad autoinmunitaria, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo 10A8 humanizado de cualquiera de las modalidades precedentes, el anticuerpo no está conjugado a una molécula citotóxica o una molécula detectable . El anticuerpo se administrará normalmente en un intervalo de dosis de aproximadamente 1 ug/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2.
En un aspecto, la invención además proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención y/o al menos un inmunoconjugado de este y/o al menos un conjugado de anticuerpo anti-FcRH5 y fármaco de la invención. En algunas modalidades, a formulación farmacéutica comprende (1) un anticuerpo de la invención y/o un inmunoconjugado de este, y (2) a portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, a formulación farmacéutica comprende (1) un anticuerpo de la invención y/o un inmunoconjugado de este, y opcionalmente, (2) al menos un agente terapéutico adicional. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero sin limitación, los que se describen a continuación. El ADC se administrará normalmente por vía parenteral, es decir, infusión, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural .
Las formulaciones terapéuticas (por ejemplo, que comprenden un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado de FcRH5) se usa de acuerdo con la presente invención se preparar por el almacenamiento por la mezcla del ingrediente activo (por ejemplo, el anticuerpo o inmunoconjugado) , que tiene el grado de pureza deseado con opcionales portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen a los regulador de pHs tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina, conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol , 3-pentanol, y m-cresol) , polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, tal como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas , polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina, monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextriñas, agentes quelantes tales como EDTA, tonificantes trehalosa y cloruro de sodio, azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol, tensioactivo tal como polisorbato, contraiones formadores de sal tales como sodio complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteínas ) , y/o tensioactivos no iónicos tales como T EEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) .
Opcionalmente , pero con preferencia, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, con preferencia cloruro de sodio, y con preferencia en aproximadamente concentraciones fisiológicas. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades la concentración de conservante varía de 0.1 a 2.0%, normalmente v/v. Los conservantes adecuados incluyen los conocidos en la técnica farmacéutica. Los conservantes preferidos son alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparabeno, y propilparabeno . Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden incluir un tensioactivo farmacéuticamente aceptable a una concentración de 0.005 a 0.02%.
Las formulaciones farmacéuticas usadas para la administración in vivo son generalmente estériles. Esto se logra por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Las formulaciones en la presente también pueden contener más de un compuesto activo, si es necesario, para la indicación particular tratada, con preferencia aquellos con actividades complementarias no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, además de un anticuerpo anti-FcRH5, puede ser deseable incluir en una formulación, un anticuerpo adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-FcRH5 que se une a un epítopo diferente en el polipéptido de FcRH5, o un anticuerpo para algún otro objetivo tal como un factor de crecimiento que afecta el crecimiento del cáncer particular. En forma alternativa o adicional, la composición también-puede comprender un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento, agente anti-hormonal , y/o cardioprotector . Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación con cantidades que son efectivas para el propósito deseado.
Los ingredientes activos también se pueden capturar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, tales matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (2 -hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Patente U.S. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímero de ácido láctico-ácido glicólico degradable tales como LUP ON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Mientras que los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permite la administración de moléculas durante más de 100 días, ciertas proteínas de liberación de hidrogeles durante períodos más cortos. Cuando la inmunoglobulina encapsulada permanece en el cuerpo por un tiempo prolongado, se puede desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que produce una pérdida de actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad . Se pueden concebir estrategias racionales para la estabilización que depende del mecanismo involucrado. Por ejemplo si se descubre que mecanismo de agregación es la formación de enlaces intermoleculares de S-S a través del intercambio tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización por la modificación de los residuos sulfhidrilo, liofilización de las soluciones ácidas, control del contenido de humedad, mediante aditivos apropiados y desarrollo de composiciones de la matriz del polímero específico.
Un anticuerpo se puede formular en cualquier forma adecuada para la administración a una célula/tejido objetivo. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden formular como inmunoliposomas . Una "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es de utilidad para la administración de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparar por métodos conocidos en la técnica, tales como se describen en Epstein y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y otros., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); U.S. Pat . Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con aumento del tiempo de circulación se describen en la Patente U.S. No. 5,013,556.
Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) , se extruden mediante filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab1 del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas como se describe en Martin y otros., J. Biol . Chem. 257:286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico opcionalmente está contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon y otros., J. National Cáncer Inst . 81(19) : 1484 (1989) .
Las formulaciones usadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas estériles.
H . Tratamiento con anticuerpos anti-FcRH5 Para determinar la expresión de FcRH5 en el cáncer, se dispone de varios ensayos de detección. En una modalidad, la sobreexpresión del polipéptido de FcRH5 se puede analizar por inmunohistoquímica (IHC). Las secciones de tejido incluidas en parafina provenientes de una biopsia de tumor se puéden someter al ensayo de IHC y los criterios de intensidad de tinción de una proteína dé FcRH5 son los siguientes: Puntuación 0 - no se observa tinción o se observa tinción de membrana en menos de 10% de las células tumorales.
Puntuación 1+ - se detecta una tinción de membrana débil/ligeramente perceptible en más de 10% de las células tumorales . Las células solo están teñidas en parte de su membrana.
Puntuación 2+ - se observa tinción de membrana completa débil a moderadamente en más de 10% de las células tumorales .
Puntuación 3+ - se observa tinción de membrana completa moderada a intensa en más de 10% de las células tumorales .
Estos tumores con puntuaciones 0 o 1+ para el polipéptido de expresión de FcRH5 se pueden caracterizar como que no sobreexpresan FcRH5, mientras que los tumores con puntuaciones 2+ o 3+ se pueden caracterizar como que sobreexpresan FcRH5.
En forma alternativa o adicional, se pueden realizar los ensayo FISH tales como INFORM® (comercializado por Ventana, Arizona) o PATHVISION® (Vysis, Illinois) sobre tejido tumoral incluido en parafina y fijado en formalina para determinar el grado (si hubiera) de sobreexpresion de FcRH5 en el tumor.
La sobreexpresion o amplificación de FcRH5 se puede evaluar usando un ensayo de detección in vivo, por ejemplo, por la administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que une la molécula que se detecta y se marca con una marca detectable (por ejemplo, un isótopo radiactivo o una marca fluorescente) y barrido externo del paciente para la localización de la marca.
Como se describió anteriormente, los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención tienen varias aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos anti-FcRH5 de la presente invención puede ser útil para clasificar los cánceres que expresan el polipéptido de FcRH5 (por ejemplo, en radioimagen) . Los anticuerpos también son útiles para la purificación o inmunoprecipitación del polipéptido de FcRH5 de las células, para la detección y la cuantificación del polipéptido de FcRH5 in vitro, por ejemplo, en una ELISA o una transferencia Western, para destruir y eliminar células que expresan FcRH5 a partir de una población de células mixtas como una etapa de la purificación de otras células.
En la actualidad, según la etapa del cáncer, tratamiento del cáncer involucra una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para extirpar el tejido cancerígeno, terapia de radiación, y quimioterapia. La terapia del anticuerpo anti-FcRH5 puede ser especialmente deseable en pacientes de edad avanzada que no toleran bien la toxicidad y los efectos secundarios de la quimioterapia y en enfermedades metastáticas donde la terapia de radiación ha limitado la utilidad. Los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención dirigidos al tumor son útiles para aliviar los cánceres que expresan FcRH5 después del diagnóstico inicial de la enfermedad o durante la recaída. Para las aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-FcRH5 se puede usar solo, o en combinación terapia, por ejemplo, con hormonas, antiangiogénos o compuestos radiomarcados, o con cirugía, crioterapia, y/o radioterapia. El tratamiento con el anticuerpo anti-FcRH5 se puede administrar en conjunto con otras formas de terapia convencional, ya sea en forma consecutiva, pre o pos-terapia convencional. Los fármacos quimioterapéuticos como TAXOTERE® (docetaxel) , TAXOL® (palictaxel) , estramustina y mitoxantrona se usan para tratar cáncer, en particular, en pacientes con riesgo. En el presente método de la invención para tratar o aliviar el cáncer, se puede administrar al paciente con cáncer anticuerpo anti-FcRH5 en conjunto con el tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapéuticos precedentes. En particular, se contempla la terapia de combinación con paclitaxel y derivados modificados (ver, por ejemplo, EP0600517) . El anticuerpo anti-FcRH5 se administrará con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico . En otra modalidad, el anticuerpo anti-FcRH5 se administra en conjunto con la quimioterapia para aumentar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. El Physicians' Desk Reference (PDR) describe las dosis de estos agentes en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y las dosis de estos fármacos quimioterapéuticos mencionados anteriormente que son terapéuticamente efectivos dependerán del cáncer particular tratado, el grado de la enfermedad y otros factores familiares para el médico experto en la materia y pueden ser determinada por el médico.
En una modalidad particular, se administra un conjugado que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 conjugado con un agente citotóxico al paciente. Con preferencia, el inmunoconjugado unido la proteína de FcRH5 es incorporado por la célula, lo que origina aumento de la eficacia terapéutica del inmunoconjugado para destruir la célula cancerígena a la que se une. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se dirige o interfiere en el ácido nucleico de la célula cancerígena. Los ejemplos de los agentes citotóxicos se describieron anteriormente e incluyen maitansinoides , calicheamicinas , ribonucleasas y ADN endonucleasas .
Los agentes terapéuticos de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos anti-FcRH5 o sus conjugados a toxinas) se administran a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa por ejemplo, , en forma de bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal , intracerobroespinal , subcutáneas, intraarticular , intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o inhalación. Se prefiere la administración del agente terapéutico intravenosa o subcutánea .
Una estrategia ex vivo también se puede usar para las aplicaciones terapéuticas. Las estrategias ex vivo involucran transfectar o transducir las células obtenidas del sujeto con un polinucleótido que codifica un antagonista de FcRH5. Las células transfectadas o transducidas luego vuelven al sujeto. Las células pueden ser de cualquier variedad de clases que incluyen, sin limitación, células hematopoyéticas (por ejemplo, células de médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, células T, o células B) , fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales , queratinocitos , o células del músculo.
Por ejemplo, si el antagonista de FcRH5 es un anticuerpo o inmunoconjugado, el antagonista se administra por cualquier medio adecuado, que incluye parenteral, subcutáneo, intraperitoneal , intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, la administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. Además, el antagonista se administra adecuadamente por infusión por pulso, en particular con dosis decrecientes del anticuerpo. Con preferencia la dosis se administra por inyecciones, con máxima preferencia inyecciones intravenosas o subcutáneas, lo que depende en parte si la administración es breve o crónica.
En otro ejemplo, el compuesto antagonista de FcRH5 se administra en forma local, por ejemplo, por inyecciones directas, cuando el trastorno o ubicación del tumor lo permite, y las inyecciones se pueden repetir periódicamente. El antagonista de FcRH5 también se puede administrar en forma sistémica al sujeto o directa a las células tumorales, por ejemplo, a un tumor o un lecho del tumor después de la extirpación quirúrgica del tumor, a fin de prevenir o reducir la recurrencia o metástasis local.
La administración de los agentes terapéuticos en combinación normalmente se realiza durante un período de tiempo definido (usualmente minutos, horas, días o semanas según la combinación seleccionada) . La terapia de combinación abarca la administración de estos agentes terapéuticos en forma secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en tiempo diferente, así como administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, en forma sustancialmente simultánea.
El agente terapéutico se puede administrar por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo anti-FcRH o inmunoconjugado en la combinación se puede administrar por inyección intravenosa mientras que un agente quimioterapéutico de la combinación se puede administrar por vía oral. Alternativamente, por ejemplo, ambos agentes terapéuticos se puedes administrar por vía oral, o ambos agentes terapéuticos se pueden administrar por inyección intravenosa, según los agentes terapéuticos específicos. La secuencia en la que los agentes terapéuticos se administran también varía de acuerdo con los genes específicos.
De acuerdo con el tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 ug/kg a 100 mg/kg de cada agente terapéutico es una dosis de candidato inicial para la administración al paciente, sea por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, según los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, de acuerdo con la enfermedad, el tratamiento es sostenido hasta que se trata el cáncer, medido por los métodos descritos anteriormente. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles.
La presente solicitud contempla la administración del anticuerpo anti-FcRH5 por terapia génica. Ver, por ejemplo, WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996, que trata de uso de la terapia génica para generar anticuerpos intracelulares .
Otros regímenes terapéuticos se pueden combinar con la administración del anticuerpo anti-FcRH5. La administración combinada incluye coadministración, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde con preferencia hay un período de tiempo mientras ambos (o todos) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Con preferencia la terapia combinada produce un efecto terapéutico sinérgico.
También puede ser conveniente combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-FcRH5, con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno tumoral asociado con el cáncer particular.
En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéutico de la presente invención involucran la administración combinada de un anticuerpo anti-FcRH5 (o anticuerpos) , y uno o más agente quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, que incluye la coadministración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos , u otros agentes citotóxicos u otros agentes terapéuticos que también inhibe el crecimiento tumoral . Los agentes quimioterapéuticos incluyen fosfato de estramustina , prednimustina, cisplatino, 5-fluorouracilo, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea y hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina . La preparación y los esquemas de dosis para los agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o determinado en forma empírica por el profesional experto. La preparación y los esquemas de dosis para la quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El anticuerpo se puede combinar con un compuesto anti-hormonal ; por ejemplo, un compuesto antiestrógeno tal como tamoxifeno; una anti-progesterona tal como onapristona (ver, EP 616 812) ; o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosis conocidas para las moléculas. Cuando el cáncer tratado en cáncer independiente de andrógeno, el paciente pueden haberse sometido previamente a terapia anti-andrógeno y después el cáncer se vuelve independiente de andrógeno, el anticuerpo anti-FcRH5 (y opcionalmente otros agentes descritos en la presente) se pueden administrar al paciente.
Algunas veces, puede ser beneficioso coadministrar también un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfunción miocárdica asociada con la terapia) o una o más citocinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente se puede someter a la extirpación quirúrgica de las células cancerígenas y/o terapia de radiación (por ejemplo irradiación de rayos externa o terapia con un agente marcado radiactivo, tal como un anticuerpo) , antes, en forma simultánea o pos-terapia con el anticuerpo. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son los que se usan en la presente y se pueden reducir debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo anti-FcRH5.
La composición de anticuerpo de la invención se formulará, dosificará y administrará de modo compatible con la buena práctica médica. Los factores en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el esquema de administración, y otros factores conocidos por los profesionales médicos. El anticuerpo no necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados habitualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión La cantidad efectiva de otros agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores descritos anteriormente. En general estos se usan en las mismas dosis y con las vías de administración usadas en la presente con anterioridad o aproximadamente de 1 a 99% de la dosis empleada antes en la presente.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación y modo de administración serán seleccionados por el médico de acuerdo con los criterios conocidos. La dosis apropiada de un anticuerpo de la invención dependerá del tipo de enfermedad tratada, como se describió anteriormente, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, antecedentes clínicos del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico asistente. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Con preferencia, el anticuerpo se administra por infusión intravenosa o inyecciones subcutáneas . De acuerdo con el tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0.1-15 mg/kg/dosis) del anticuerpo puede ser una dosis inicial a candidata para la administración al paciente, sea, por ejemplo por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-Fc H5. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, según la afección, el tratamiento se sostiene hasta se produzca la eliminación deseada de los síntomas de la enfermedad. El progreso de esta terapia se puede controlar rápidamente por métodos y ensayos convencionales basados en los criterios conocidos por los médicos u otros expertos en la materia.
Además de la administración de la proteína del anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo por terapia génica. Dicha administración del ácido nucleico que codifica el anticuerpo está abarcada por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo". Ver, por ejemplo, WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996 respecto del uso de la terapia génica para generar anticuerpos intracelulares .
Existen dos métodos principales para obtener el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, usualmente en el sitio donde se requiere anticuerpo. En el tratamiento ex vivo, las células del paciente se extraen, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente en forma directa o por ejemplo, se encapsulan en membranas porosas que se implantan en el paciente (ver, por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en las células viables. Las técnicas varían de acuerdo con si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en la células del hospedero deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en las células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporacion, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente usado para la administración ex vivo del gen es un vector retroviral .
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus del Herpes simplex I, o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol) . Para la revisión de los protocolos de marcación del gen y terapia génica comúnmente conocidos ver Anderson y otros., Science 256:808-813 (1992). Ver también WO 93/25673 y las referencias allí citadas.
Los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención pueden estar en las diferentes formas abarcadas por la definición de "anticuerpo" en la presente. En consecuencia, los anticuerpos incluyen anticuerpo de longitud completa o intacto, fragmentos de anticuerpo, anticuerpo o variantes de aminoácido de secuencia nativa, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de estos. En los anticuerpos de fusión una secuencia de anticuerpo se fusiona a una secuencia de polipéptido heteróloga. Los anticuerpos se pueden modificar en la región de Fe para proporcionar las funciones efectoras deseadas. Como se describe con más detalle en las secciones en la presente, con las regiones de Fe apropiadas, el anticuerpo desnudo unido sobre la superficie celular puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, por medio de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o por reclutamiento del complemento en la citotoxicidad mediada por complemento, o algún otro mecanismo. Alternativamente, cuando sea conveniente eliminar o reducir la función efectora, para minimizar los efectos secundarios o complicaciones terapéuticas, se pueden usar otras regiones de Fe.
En una modalidad, el anticuerpo compite por la unión o une sustancialmente al mismo epítopo que los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos que tienen las características biológicas de los presentes anticuerpos anti-FcRH5 de la invención también están contempladas, específicamente que incluyen el direccionamiento al tumor in vivo y cualquiera de inhibición de la proliferación celular o las características citotóxicas.
Los métodos de producir los anteriores anticuerpos se describen en detalle en la presente.
Los presentes anticuerpos anti-FcRH5 son útiles para tratar un cáncer que expresa FcRH5 o aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero. Tales cáncer incluye, pero son limitación, cánceres hematopoyéticos o cánceres relacionados con la sangre, tales como linfoma, leucemia, mieloma o neoplasias linfoides, pero también los cánceres del bazo y cánceres de los ganglios linfáticos. Los ejemplos más particulares de tales cánceres asociados con las células B, incluyen por ejemplo, linfomas de grado alto, intermedio y bajo (que incluyen Linfomas de células B tales como, por ejemplo, linfoma de células B del tejido linfoide asociado a mucosa y linfoma no de Hodgkin, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma difuso de células grandes, linfoma folicular, y linfoma de Hodgkin y linfoma de células T) y leucemias (que incluye leucemia secundaria, leucemia linfocítica crónica, tales como leucemia de células B (linfocitos B CD5+) , leucemia mieloide, tales como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoide, tales como leucemia linfoblástica aguda y mielodisplasia) , y otros cánceres hematológicos y/o asociados a células B o T. Los cánceres abarcan cánceres metastáticos de cualquiera de los precedentes. El anticuerpo se puede unir a al menos una porción de las células cancerígenas que expresan el polipéptido de FcRH5 en el mamífero. En una modalidad preferida, el anticuerpo es efectivo para destruir o matar células tumorales que expresan FcRH5 o inhibir el crecimiento de las células tumorales, in vitro o in vivo, después de la unión del polipéptido de FcRH5 en la célula. Dicho anticuerpo incluye un anticuerpo anti-FcRH5 desnudo (no conjugado a ningún agente) . Los anticuerpos desnudos que tienen propiedades citotóxicas o inhibidoras del crecimiento celular se pueden utilizar adicionalmente con un agente citotóxico para volverlos aún más potentes en la destrucción de la célula tumoral . Las propiedades citotóxicas pueden ser conferidas a un anticuerpo anti-FcRH5, por ejemplo, por la conjugación del anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado como se describe en la presente. El agente citotóxico o un agente inhibidor del crecimiento con preferencia es una pequeña molécula. Se prefiere toxinas tales como calicheamicina o un maitansinoide y sus análogos o derivados .
La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención, y un portador. Para los fines de tratar el cáncer, las composiciones se pueden administrar al paciente que necesita tal tratamiento, en donde la composición puede comprender uno o más anticuerpos anti-FcRH5 presentes como inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En una modalidad adicional, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos en combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes citotóxicos o inhibidores del crecimiento, que incluyen los agentes quimioterapéuticos . La invención también proporciona formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención, y un portador. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos anti-FcRH5. Están abarcados los ácidos nucleicos que codifican las cadenas H y L, y en especial las cadenas de los residuos de la región hipervariable que codifican el anticuerpo de secuencia nativa así como las variantes, modificaciones y versiones humanizadas .
La invención también proporciona métodos útiles para tratar el cáncer que expresa un polipéptido de FcRH5 o aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-FcRH5 al mamífero. Las composiciones terapéuticas del anticuerpo se pueden administrar a corto plazo (agudo) o crónico o en forma intermitente según sea indicado por el médico. También se proporcionan métodos de inhibir el crecimiento, y destruir una célula que expresa un polipéptido de FcRH5.
La invención también proporciona kits y artículos de manufactura que comprenden al menos un anticuerpo anti-FcRH5. Los kits que contienen anticuerpos anti-FcRH5 se usan, por ejemplo, para los ensayos de destrucción de células FcRH5 , para la purificación o inmunoprecipitación del polipéptido de FcRH5 de las células. Por ejemplo, para el aislamiento y la purificación del FcRH5 , el kit puede contener un anticuerpo anti-FcRH5 acoplado a las microesferas (por ejemplo, microesferas de sefarosa) . Se pueden proveer kits que contienen los anticuerpos para la detección y la cuantificación de FcRH5 in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Dicho anticuerpo útil para la detección se puede proveer con una marca tal como marca fluorescente o radiactiva.
I . Tratamientos con conjugado anticuerpo-fármaco Está contemplado que los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) de la presente invención se pueden usar para tratar varias enfermedades o trastornos, por ejemplo caracterizados por la sobreexpresion de un antígeno tumoral .
Los ejemplos de enfermedades y trastornos proliferativos hiperproliferativos incluyen tumores benignos o malignos; leucemia y neoplasias linfoides. Otros incluyen trastornos neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicos , glandulares, de macrófagos, epiteliales, estromales, blastocélicos , inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos , que incluyen los autoinmunes .
Los compuestos de ADC que se identifican en los modelos animales y ensayos basados en células se pueden analizar posteriormente en primates superiores que portan tumores y ensayos clínicos humanos. Los ensayos clínicos humanos se pueden diseñar para analizar la eficacia del anticuerpo anti-FcRH5 monoclonal o inmunoconjugado de la invención en pacientes que experimentan un trastorno proliferativo de las células B que incluye sin limitación linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto. El ensayo clínico se puede diseñar para evaluar la eficacia de un ADC en combinaciones con regímenes terapéuticos conocidos, tales como radiación y/o quimioterapia que involucran agentes quimioterapéuticos y/o citotóxicos conocidos.
Generalmente, la enfermedad o trastorno tratados es una enfermedad hiperproliferativa tal como un trastorno proliferativo de las células B y/o un cáncer de células B. Los ejemplos del cáncer que se trata en la presente incluyen, pero sin limitación, trastorno proliferativo de las células B seleccionado de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
El cáncer puede comprender células que expresan FcRH5, de modo que el ADC de la presente invención puede unirse a las células cancerígenas. Para determinar la expresión de FcRH5 en el cáncer, se dispone de varios ensayos de diagnóstico/pronóstico. En una modalidad, la sobreexpresión de FcRH5 se puede analizar por IHC. Las secciones de tejido incluidas en parafina de una biopsia tumoral se pueden someter al ensayo de IHC y acordar un criterio de intensidad de tinción de la proteína de FcRH5 y en qué proporción de células se examina.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un ADC dependerá del tipo de enfermedad tratada, como se definió anteriormente, la gravedad y curso de la enfermedad, si la molécula se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, antecedentes clínicos del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico asistente. La molécula se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Con preferencia, el anticuerpo se administra por infusión intravenosa o inyecciones subcutáneas. De acuerdo con el tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 ug/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) de la molécula es una dosis inicial candidata para la administración al paciente, sea, por ejemplo por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 ug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. UN ejemplo de dosis de ADC administrada a un paciente está en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente.
Para las administraciones repetidas durante varios días o más, de acuerdo con la afección, el tratamiento se sostiene hasta una que se produce una eliminación deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de régimen de dosis comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg de un anticuerpo anti-ErbB2. Otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
J . Terapia de combinación Un conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC) de la invención se puede combinar en una formulación farmacéutica combinada, o régimen de dosificación en forma de terapia de combinación, con un segundo compuesto que tiene propiedades anti-cáncer. El segundo compuesto de la formulación farmacéutica combinada o régimen de dosificación con preferencia tiene actividades complementarias con el ADC de la combinación de modo que estas no se afectan adversamente entre sí.
El segundo compuesto puede ser un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento, agente anti-hormonal , y/o cardioprotector . Tales moléculas están adecuadamente presentes en la combinación en cantidades que son efectivas para el fin deseado. Una composición farmacéutica que contiene un ADC de la invención también pueden tener una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente quimioterapéutico tal como un inhibidor de formación de tubulina, un inhibidor de topoisomerasa o un ligando de ADN.
En un aspecto, el primer compuesto es un ADC de anti-FcRH5 de la invención y el segundo compuesto es un anticuerpo anti-CD20 (sea un anticuerpo desnudo o un ADC) . En una modalidad el segundo compuesto es un anticuerpo anti-CD20 rituximab (Rituxan®) o 2H7 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA) . Otros anticuerpos útiles para la inmunoterapia combinada con los ADC de anti-FcRH5 de la invención incluyen sin limitación, anti-FcRH5 (por ejemplo, Avastin®) .
Otros regímenes terapéuticos se pueden combinar con la administración de un agente anticancerígeno identificado de acuerdo con esta invención, que incluye sin limitación terapia de radiación y/o trasplantes de médula ósea y sangre periférica, y/o un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, o un agente inhibidor del crecimiento. En una de esta modalidades, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes tales como, por ejemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, adriamicina, doxorubicina, vincristina (Oncovin™) , prednisolona, CHOP, CVP, o COP, o inmunoterapéuticos tales como anti-CD20 (por ejemplo, Rituxan®) o anti-FcRH5 (por ejemplo, Avastin®) .
La terapia de combinación se puede administrar como un régimen simultáneo o secuencial . Cuando se administra secuencialmente , la combinación se puede administrar en dos o más administraciones. La administración combinada incluye la coadministración, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde con preferencia hay un período de tiempo mientras ambos (o todos) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.
En una modalidad, el tratamiento con un ADC involucra la administración combinada de un agente anticancerígeno identificado en la presente, y uno o más agente quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, que incluye la coadministración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y los esquemas de dosis para los agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o determinado en forma empírica por el profesional experto. La preparación y los esquemas de dosis para la quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) .
Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son los que se usan en la presente y se pueden reducir debido a la acción combinada (sinergia) del agente recientemente identificado y otros agentes o tratamientos quimioterapéuticos.
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y ser "sinérgica", es decir, el efecto obtenido cuando los ingredientes activos se usan juntos es mayor que la suma de los efectos que resultan de usar los compuestos en forma separada. Un efecto sinérgico se puede obtener cuando los ingredientes activos: (1) se coformulan y administran o aplican en forma simultánea en una formulación de unidad de dosis combinada; (2) se administra en forma alternada o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por algún otro régimen. Cuando se administra en terapia alternada, se puede obtener un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o aplican en forma secuencial, por ejemplo, por diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia alternada, se administra una dosis efectiva de cada ingrediente en forma secuencial, es decir, en forma seriada, mientras que en la terapia de combinación, las dosis efectivas de dos o más ingredientes se administran juntas .
La terapia de combinación de la invención además puede comprender uno o más agente quimioterapéuticos . La administración combinada incluye coadministración o administración concurrente, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde con preferencia hay un período de tiempo en que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.
El agente quimioterapéutico, si se administra, usualmente se administra a las dosis conocidas para este, u opcionalmente reducidas debido a la acción combinada dé los fármacos o efectos secundarios negativos atribuibles a la administración del agente quimioterapéutico antimetabolito . La preparación y los esquemas de dosificación para los agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o c determinado empíricamente por el profesional experto.
Varios agentes quimioterapéuticos que se pueden combinar se describen en la presente .
En algunas modalidades, los agentes quimioterapéuticos que se combinan se seleccionan del grupo que consiste en inmunomoduladores (IMid) (que incluye talidomida y Revlimid® ( lenalidomida) ) , inhibidores de proteasoma (tales como Velcade® (bortezomib) y PS342), taxoide bora (que incluye docetaxel y paclitaxel) , vinca (tales como vinorelbina o vinblastina) , compuesto de platino (tales como carboplatino o cisplatino) , inhibidor de aromatasa (tales como letrozol, anastrazol, o exemestano) , anti-estrógeno (por ejemplo fulvestrant o tamoxifeno) , etoposida, tiotepa, ciclofosfamida, pemetrexed, metotrexato, doxorubicina liposómica, doxorubicina liposómica pegilada, capecitabina, gemcitabina, meltalina, doxorubicina, vincristina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , o esteroide (por ejemplo, dexametasona y prednisona) . En algunas modalidades (por ejemplo, las modalidades que involucran el tratamiento del mieloma múltiple) , se combinan dexametasona y lenalidomida, o dexametasona, o bortezomib, o vincristina, doxorubicina y dexametasona, o talidomida y dexametasona, o doxorubicina liposómica, vincristina y dexametasona, o lenalidomida y dexametasona, o bortezomib y dexametasona, o bortezomib, doxorubicina, y dexametasona.
En algunas modalidades, los agentes quimioterapéuticos combinados se seleccionan del grupo que consiste en Revlimid® (lenalidomida) , inhibidores de proteasoma (tales como Velcade® (bortezomib) y PS342) , taxoide bora (que incluye docetaxel y paclitaxel) , vinca (tales como vinorelbina o vinblastina) , compuesto de platino (tales como carboplatino o cisplatino) , inhibidor de aromatasa (tales como letrozol, anastrazol, o exemestano) , anti-estrógeno (por ejemplo fulvestrant o tamoxifeno) , etopósido, tiotepa, ciclofosfamida, pemetrexed, metotrexato, doxorubicina liposómica, doxorubicina liposómica pegilada, capecitabina , gemcitabina, meltalina, doxorubicina, vincristina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , o esteroide (por ejemplo, dexametasona y prednisona) .
En algunas modalidades (por ejemplo, las modalidades que involucran el tratamiento del mieloma maligno) , se combinan dexametasona y lenalidomida, o dexametasona, y bortezomib.
En otra modalidad, la terapia de combinación comprende un anticuerpo o inmunoconjugado y más de un agente quimioterapéutico . Por ejemplo, el anticuerpo o inmunoconjugado se puede combinar con (i) vincristina, doxorubicina (en una formulación liposómica o no lipoGÓmica) , y dexametasona; (ii) talidomida y dexametasona; (iii) Velcade® (bortezomib) , doxorubicina, y dexametasona; (iv) Velcade® (bortezomib) , talidomida, y dexametasona; (v) melfalan y prednisona; (vi) melfalan, prednisona, y talidomida; (vii) melfalan, prednisona, y Velcade® (bortezomib) ; (viii) vincristina, doxorubicina, y dexametasona; o (ix) talidomida y dexametasona.
En una modalidad, la terapia de combinación puede comprender un anticuerpo o inmunoconjugado descritos en la presente y uno o más de (i) Velcade® (bortezomib), ( i) dexametasona, (iii) Revlimid® (lenalidomida) . En otra modalidad, la terapia de combinación comprende un anticuerpo o inmunoco jugado y dexametasona y Revlimid® (lenalidomida) o Velcade® (bortezomib) y dexametasona. En otra modalidad, la terapia de combinación comprende un anticuerpo o inmunoconjugado y uno de Velcade® (bortezomib) , dexametasona y Revlimid® (lenalidomida) .
K. Artículos de manufactura y kits Otra modalidad de la invención es un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnosis del cáncer que expresa FcRH5. El artículo de manufactura comprende un recipiente y un rótulo o prospecto inserto o asociado con el recipiente.
Los recipientes adecuado -so- incluyen, por ejemplo frascos, viales, jeringas. Los recipientes pueden estar construidos de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección de cáncer y puede tener una puerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene una un tapón perforable por una aguja inyectable hipodérmica) . Por lo menos un agente activo de la composición es un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención. El rótulo o prospecto indica que la composición se usa para tratar el cáncer. El rótulo o prospecto además comprenderá instrucciones para administrar la composición de anticuerpo al paciente de cáncer. Alternativamente o adicionalmente , el artículo de manufactura también puede comprender un segundo recipiente que comprende un regulador de pH aceptable para uso farmacéutico, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina regulador de pH con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluye otros regulador de pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
También se proporcionan kits que son útiles para varios fines, por ejemplo, para ensayos de destrucción de células que expresan FcRH5 , para purificación o inmunoprecipitación del polipeptido de FcRH5 de las células. Para el aislamiento y purificación del polipéptido de FcRH5 , el kit puede contener un anticuerpo anti-FcRH5 acoplado a microesferas (por ejemplo, microesferas de sefarosa) . Se pueden proveer kits que contienen los anticuerpos para la detección y la cuantificación del polipéptido de FcRH5 in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Como en el artículo de manufactura, el kit comprende un recipiente y un recipiente y un rótulo o prospecto inserto o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención. Se pueden incluir recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes y regulador de pHs, anticuerpos de control. El rótulo o prospecto puede proveer una descripción de la composición así como las instrucciones para el uso in vitro o de detección deseado.
L . Usos de los polipéptidos de FcRH5 Esta invención abarca método de detección de compuestos para identificar los que imitan al polipéptido de FcRH5 (agonistas) o impiden el efecto del polipéptido de FcRH5 (antagonistas) . Los ensayos de detección para los candidatos del fármaco antagonista se diseñan para identificar compuestos que se unen o complejan con los polipéptidos de FcRH5 codificados por los genes identificados en la presente, o interfieren de otro modo en la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares, que incluyen por ejemplo, inhibición de la expresión del polipéptido de FcRH5 de las células. Tales ensayos de detección incluirán ensayos susceptibles a la detección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, lo que los convierte en particularmente adecuados para identificar candidatos farmacológicos de molécula pequeña.
Los ensayos se pueden realizar en una variedad de formatos, que incluyen ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de detección bioquímicos, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica .
Todos los ensayos para antagonistas son comunes en que ellos requieren el contacto del fármaco candidato con un polipéptido de FcRH5 codificado por un ácido nucleico identificado en la presente en las condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen .
En los ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado se puede asilar o detectar en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido de FcRH5 codificado por el gen identificado en la presente o el fármaco candidato se inmoviliza en una fase sólida, por ejemplo, en una placa de microtitulación, por uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente se obtiene generalmente por el recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polipéptido de FcRH5 y desecante. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido de FcRH5 inmovilizado se puede usar para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza por el agregado de componente no inmovilizado, que puede estar marcado con una marca detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción se completa se extraen los componentes sin reaccionar, por ejemplo, por lavado, y se detectan los complejos anclados a la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado porta una marca detectable, la detección de marca inmovilizada en la superficie indica que se ha producido la formación del complejo. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no porta una marca, no se puede detectar la formación del complejo, por ejemplo, por el uso de un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo marcado.
Si el compuesto candidato interactúa pero no se une a un polipéptido particular de FcRH5 codificado por un identificado en la presente, su interacción con este polipéptido se puede analizar por métodos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen los métodos tradicionales, tales como, por ejemplo, reticulación, co-inmunoprecipitación, y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas . Además, las interacciones proteína-proteína se pueden monitorear por medio del sistema genéticos de basado en levaduras descrito por Fields y colaboradores (Fields and Song, Nature (Londres) , 340:245-246 (1989); Chien y otros., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 88:9578-9582 (1991)) como se describe en Chevray and Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muchos activadores de la transcripción, tales como GAL4 de levadura, consisten en dos dominios modulares físicamente diferenciados, uno actúa como el dominio de unión al ADN, el otro que funciona como el dominio transcripción-activación. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones precedentes (generalmente denominado como el "sistema de dos híbridos) aprovecha esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en que la proteína objetivo ese fusiona el dominio de unión del ADN de GAL4 , y otra, en que las proteínas de activación candidatas se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen indicador GALl-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 por medio de la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen los polipéptidos de interacción se detectan con un sustrato cromogénico para ß-galactosidasa . Un kit completo (MATCHINGMAKER™) para identificar las interacciones proteína- proteína entre dos proteínas específicas que usa la técnica" de dos híbridos está disponible en el comercio en Clontech. Este sistema también se puede extender para mapear los dominios de proteína involucrados en las interacciones de proteínas específicas así como los residuos de aminoácidos localizados exactamente que son críticos para estas interacciones .
Los compuestos que interfieren en la interacción de un gen que codifica un polipéptido de FcRH5 identificado en la presente y otros componentes intra- o extracelulares se pueden analizar de la siguiente manera: usualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o extracelular en condiciones y durante un tiempo que permita la interacción y la unión de los dos productos. Para analizar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se corre en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo. Además, se puede añadir un placebo a una tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. La unión (formación del complejo) entre el compuesto de ensayo y los componentes intra- o extracelulares presentes en la mezcla se controla como se describió antes en la presente. La formación de un complejo en la reacción de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo interfiere en la interacción del compuesto de ensayo y su compañero de reacción.
Para analizar los antagonistas, el polipéptido de FcRH5 se puede añadir a una célula junto con el compuesto analizada para una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido de FcRH5 indica que el compuesto es un antagonista al polipéptido de FcRH5. Alternativamente, los antagonistas se pueden detectar por combinación del polipéptido de FcRH5 y un antagonista potencial con receptores del polipéptido de FcRH5 unido a membrana o receptores recombinantes en condiciones apropiadas para ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido de FcRH5 puede estar marcado, tal como por radiactividad, de modo que se pueden usar numerosas moléculas de polipéptido de FcRH5 unidas al receptor para determinar la efectividad del antagonista potencial . El gen que codifica el receptor se puede identificar por numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, inmunopurificación de ligando y separación FACS . Coligan y otros., Current Protocols in Immun. , 1(2): Capítulo 5 (1991). Con preferencia, se emplea la clonación de expresión en donde se prepara AR poliadenilado a partir una célula receptiva al polipéptido de FcRH5 y se crea una biblioteca de ADNc de esta ARN se divide en mezclas y se usa para transfectar células COS u otras células que no son receptivas al polipéptido de FcRH5. Las células transfectadas cultivadas en portaobjetos de vidrio se exponen al polipéptido de FcRH5 marcado. El polipéptido de FcRH5 se puede marcar por una variedad de medios que incluye yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica de sitio. Después de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a los análisis autoradiográficos . Las mezclas positivas se identifican y se preparar submezclas y se re-transfectan usando un proceso de sub-mezcla y re-detección interactivos, finalmente producen un clon único que codifica el receptor putativo.
Como un método alternativo para la identificación del receptor, el polipéptido de FcRH5 marcado se puede ligar por fotoafinidad con la membrana celular o extraer preparaciones que expresan la molécula del receptor. El material entrecruzado se resuelve por PAGE y se expone a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor se puede escindir, resolver en los fragmentos de péptidos y someter a microsecuenciación . La secuencia de aminoácidos obtenida de la microsecuenciación se podría usar para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótido degeneradas para detectar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el receptor putativo.
En otro ensayo para antagonistas, las células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor se podrían incubar con el polipéptido de FcRH5 marcado en presencia del compuesto candidato. Por lo tanto se podría medir la capacidad del compuesto para aumentar o bloquear esta interacción.
Los ejemplos más específicos de potenciales antagonistas incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de la inmunoglobulina con el polipéptido de FcRH5 , y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos anti - idiotípicos , y versiones quiméricas o humanizadas de estos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido de FcRH5 que reconoce el receptor pero no imparte efecto, de este modo inhibe competitivamente la acción del polipéptido de FcRH5.
Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de FcRH5 identificado en la presente, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de detección descritos anteriormente en la presente, se pueden administrar para el tratamiento de varios trastornos, que incluyen cáncer, en forma de composiciones f rmacéuticas.
Si el polipéptido de FcRH5 es intracelular y los anticuerpos totales se usan como inhibidores, se prefieren los anticuerpos de internalización . Sin embargo, también se pueden usar lipofecciones o liposomas para administrar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, en las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína objetivo. Por ejemplo, sobre la base de las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas de péptido que retienen la capacidad de unirse a la secuencia de proteína objetivo. Tales péptidos se pueden sintetiza químicamente y/o producir por tecnología de ADN recombinante . Ver, por ejemplo, Marasco y otros., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90 : 7889-7893 (1993) .
La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular tratada, con preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. En forma alternativa o adicional, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tales como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico, o agente inhibidor de crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivos para el fin deseado M. Derivados del anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención también se pueden modificar para contener residuos no proteicos adicionales que son conocidos en la técnica y fácilmente disponibles. Con preferencia, los residuos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen pero sin limitación, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulosa , dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3 ( 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) , y dextrano o poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicol , copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol polivinílico y sus mezclas. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas para la fabricación debida a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si más de un polímero se une, estos pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o el tipo de los polímeros usados para la derivatización sobre la base de las consideraciones que incluyen pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo mejorado, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia en condiciones patológicas definidas, etc.
N . Método de prueba Aún otra modalidad de la presente invención se refiere a un método de determinar la presencia de un polipéptido de FcRH5 en una muestra que se sospecha que contiene el polipéptido de FcRH5 , en donde el método comprende exponer la muestra a un conjugado de anticuerpo y fármaco de este, que se une al polipéptido de FcRH5 y determinar la unión del conjugado de anticuerpo y fármaco de este, al polipéptido de FcRH5 de la muestra, en donde la presencia de la unión es indicativa de la presencia del polipéptido de FcRH5 en la muestra. Opcionalmente , la muestra puede contener células (que pueden ser células cancerígenas) que se sospecha que expresan el polipéptido de FcRH5. El conjugado de anticuerpo y fármaco de este, empleado én el método opcionalmente se puede marcar en forma detectable, unir a un soporte sólido, o similares.
Otra modalidad de la presente invención se refiere a un método de diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende (a) poner en contacto una muestra de ensayo que comprende células de tejido obtenidas del mamífero con un conjugado de anticuerpo y fármaco de este, que se une a un polipéptido de FcRH5 y (b) detectar la formación de un complejo entre el conjugado de anticuerpo y fármaco, y el polipéptido de FcRH5 en la muestra de ensayo, en donde la formación de un complejo es indicativo de la presencia de un tumor en el mamífero. Opcionalmente , el conjugado de anticuerpo y fármaco, se marca en forma detectable, unir a un soporte sólido, o similares, y/o la muestra de ensayo de las células del tejido de un individuo que se sospecha que tiene un tumor cancerígeno.
IV. Métodos adicionales de uso de anticuerpos anti-FcRH5 e inmunoconjugados A . Métodos de diagnóstico y métodos de detección En un aspecto, los anticuerpos anti-FcRH5 y los inmunoconjugados de la invención son útiles para detectar la presencia de FcRH5 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en la presente abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido. En ciertas modalidades, los tejidos incluyen tejidos normales y/o cancerígenos que expresan FcRH5 en niveles superiores respecto de otros tejidos, por ejemplo, las células B y/o tejidos asociados con las células B.
En un aspecto, la invención proporciona un método de detectar la presencia de FcRH5 en una muestra biológica. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-FcRH5 en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-FcRH5 a FcRH5 , y detectar si un complejo se forma entre el anticuerpo anti-FcRH5 y FcRH5.
En un aspecto, la invención proporciona un método de diagnosticar un trastorno asociado con aumento de expresión de FcRH5. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto una célula de ensayo con un anticuerpo anti-FcRH5; determinar el nivel de expresión (sea en forma cuantitativa o cualitativa) de FcRH5 por la célula de ensayo por la detección de la unión del anticuerpo anti-FcRH5 a FcRH5 ; y comparar el nivel de expresión de FcRH5 por la célula de ensayo con el nivel de expresión de FcRH5 por una célula control (por ejemplo, una célula normal del mismo origen tisular que la célula de ensayo o una célula que expresa FcRH5 a niveles comparables con la célula normal) , en donde un mayor nivel de expresión de FcRH5 por la célula de ensayo en comparación con la célula control indica la presencia de un trastorno asociado con aumento de expresión de FcRH5. En ciertas modalidades, la célula de ensayo se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado con aumento de expresión de FcRH5. En ciertas modalidades, 'el trastorno es un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer o un tumor.
El ejemplo de trastorno proliferativo celular que se puede diagnosticar usando un anticuerpo de la invención incluye un trastorno de las células B y/o un trastorno proliferativo de las células B que incluye, pero sin limitación, linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
En ciertas modalidades, un método de diagnóstico o detección, tales como los descritos anteriormente, comprende detectar la unión de un anticuerpo anti-FcRH5 al FcRH5 expresado en la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que expresa FcRH5 en su superficie. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-FcRH5 en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-FcRH5 al FcRH5 , y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-FcRH5 y FcRH5 en la superficie celular. Un ejemplo de ensayo para detectar la unión de un anticuerpo anti-FcRH5 al FcRH5 expresado en la superficie de una célula es un ensayo "FACS" .
Ciertos otros métodos se pueden usar para detectar la unión de anticuerpos anti-FcRH5 a FcRH5. Tales métodos incluyen, pero sin limitación, ensayos de unión bien conocidos en la técnica, tales como trans erencias western, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sándwich" , ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A e inmunohistoquímica (IHC)) .
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-FcRH5 están marcados. Las marcas incluyen, pero sin limitación, marcas o residuos que se detectan directamente (tales como marcas fluorescentes, cromofóricos , electrodensa, quimioluminiscente y radiactiva), así como residuos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los ejemplos de marcas incluyen pero sin limitación, los radioisótopos 32P, 14C, 125? , 3H, y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona , luceriferasas , por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense No. 4,737,456), luciferina, 2 , 3 -dihidroftalazinodionas , peroxidasa de rábano (H P) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa , glucoamilasa , lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acoplada con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colórante tal como HRP, lactoperoxidasa , o microperoxidasa, biotina/avidina, marcas de espín, marcas de bacteriófago, radicales libres estables y similares.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-FcRH5 se inmovilizan en una matriz insoluble . La inmovilización puede suponer la separación de un anticuerpo anti-FcRH5 de cualquier FcRH5 que queda libre en solución. Estos se obtiene en forma convencional por la insolubilización del anticuerpo anti-FcRH5 antes del procedimiento de ensayo, como por adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich y otros., U.S. 3,720,760), o por acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulación con glutaraldehído) , o por la insolubilización del anticuerpo anti-FcRH5 después de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-FcRH5 y FcRH5 , por ejemplo, por inmunoprecipitación .
Cualquiera de las modalidades anteriores de diagnóstico o detección se puede realizar usando un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo anti-FcRH5.
B . Métodos terapéuticos Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se puede usar, por ejemplo, en métodos terapéuticos in vitro, ex vivo, e in vivo. En un aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir crecimiento o proliferación celular, sea in vivo o in vitro, el método que comprende exponer una célula a un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado en condiciones permisivas para la unión del inmunoconjugado a FcRH5. "Inhibición del crecimiento o proliferación celular" significa reducir el crecimiento o proliferación celular en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100%, e incluye inducir la muerte celular. En ciertas modalidades, la célula es una célula tumoral . En ciertas modalidades, la célula es una célula B. En ciertas modalidades, la célula es un xenoinjerto, por ejemplo, como se ejemplifica en la presente.
En un aspecto, un anticuerpo o inmunocon ugado de la invención se usa para tratar o prevenir un trastorno proliferativo de las células B. En ciertas modalidades, el trastorno proliferativo celular se asocia con aumento de expresión y/o actividad de FcRH5. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el trastorno proliferativo de las células B se asocia con el aumento de expresión de FcRH5 en la superficie de las células B. En ciertas modalidades, el trastorno proliferativo de las células B es un tumor o un cáncer. Los ejemplos del trastorno proliferativo de las células B tratadas por los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención incluyen, pero sin limitación, linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un trastorno proliferativo de las células B que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado de este. En ciertas modalidades, un método para tratar un trastorno proliferativo de las células B comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado de anti-FcRH5 y, opcionalmente , al menos un agente terapéutico adicional, tal como los que se proporciona a con inuación. En ciertas modalidades, un método para tratar un trastorno proliferativo celular comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de una formulación farmacéutica que comprende 1) un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 y un agente citotóxico; y opcionalmente, 2) al menos una agente terapéutico adicional, tal como los que se proporcionan a continuación.
En un aspecto, al menos algunos de los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden unir FcRH5 de especies diferentes de la humana. Por consiguiente, los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención se pueden usar para unir FcRH5 , por ejemplo, en un cultivo celular que contiene FcRH5, en los seres humanos, o en otros mamíferos que tienen un FcRH5 con el que un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención reacciona en forma cruzada (por ejemplo chimpancé, chimpancé, babuino, mono tití, cynomolgus y rhesus, cerdo o ratón) . En una modalidad, un anticuerpo ant'i-FcRH5 o inmunoconjugado se puede usar para dirigirse al FcRH5 en las células B por el contacto del anticuerpo o inmunoconjugado con FcRH5 para formar un anticuerpo o complejo de inmunoconjugado-antígeno de modo que una citotoxina conjugadas del inmunoconjugado acceda al interior de la célula. En una modalidad, el FcRH5 es FcRH5 humano .
En una modalidad, un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado se puede usar en un método para la unión de FcRH5 en un individuo que sufre de un trastorno asociado con aumento de la expresión y/o actividad de FcRH5 , el método que comprende administrar al individuo el anticuerpo o inmunoconjugado de modo que FcRH5 se une en el individuo. En una modalidad, el anticuerpo o inmunoconjugado unido se incorpora en la célula B que expresa FcRH5. En una modalidad, el FcRH5 es FcRH5 humano, y el individual es un individuo humano. Alternativamente, el individuo puede un mamífero que expresa FcRH5 al que se une un anticuerpo anti-FcRH5. Aún otro individuo puede ser un mamífero en el que se ha introducido FcRH5 (por ejemplo, por la administración de FcRH5 o por la expresión de un transgén que codifica FcRH5) .
Un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado se puede administrar a un ser humano para fines terapéuticos. Más aún, un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado se puede administrar a un mamífero que expresa FcRH5 con el que el anticuerpo reacciona en forma cruzada (por ejemplo, un primate, cerdo, rata o ratón) para fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Respecto de este último, los modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención (por ejemplo, análisis de dosis y tiempos de administración) .
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención se pueden usar solos o en combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional y/o adyuvante. En ciertas modalidades, un agente terapéutico adicional es un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, o un agente inhibidor del crecimiento. En una de estas modalidades, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes tales como, por ejemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, adriamicina, doxorubicina , vincristina (Oncovin™) , prednisolona, CHOP, CVP, o COP, o inmunoterapéuticos tales como anti-CD20 (por ejemplo, Rituxan®) o anti-FcRH5 (por ejemplo, Avastin®) , en donde la terapia de combinación es útil en el tratamiento de cánceres y/o trastorno de las células B tales como trastorno proliferativo de las células B que incluye linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) ; NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
Tales terapias de combinación indicadas antes abarcan la' administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en formulaciones iguales o separadas) , y la administración separada, en tal caso, la administración del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede producirse antes, en forma simultánea y/o después de la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención también se pueden usar en combinación con la terapia de radiación.
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional o adyuvante) se puede administrar por cualquier medio adecuado, que incluye parenteral, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para el tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo o inmunoconjugado se administra adecuadamente por infusión por pulso, en particular con dosis decrecientes del anticuerpo o inmunoconjugado. La dosis puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, lo que depende en parte si la administración es breve o crónica.
Los agentes terapéuticos usados en la invención (por ejemplo, anticuerpos o inmunoconjugados de la invención) se deben formular, dosificar y administrar de un modo compatible con la buena práctica médica. Los factores en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular tratado, el mamífero particular tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el esquema de administración, y otros factores conocidos a los profesionales médicos. El anticuerpo o inmunoconjugado no necesita ser, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de los agentes diferentes depende de la cantidad del anticuerpo o inmunoconjugado presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores descritos anteriormente. Estos en general se usan en las mismas dosis y con vías de administración descritas en la presente, o aproximadamente de 1 a 99%, de las dosis descrita en la presente, o en cualquier dosis y por cualquier vía determinada en forma empírica/clínica como apropiada.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención (cuando se usan solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes adicionales, tales como agentes quimioterapéuticos) dependerá el tipo de enfermedad tratado, el tipo de anticuerpo o inmunoconjugado, la gravedad y tiempo de la enfermedad, sea el anticuerpo o inmunoconjugado administrado para los fines preventivos o terapéuticos, previa terapia, la antecedente clínico del paciente y respuesta al anticuerpo o inmunoconj ugado, y el criterio del médico asistente. El anticuerpo o inmunoconjugado se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. De acuerdo con el tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg (por ejemplo 0.1 mg/kg-20 mg/kg) del anticuerpo o inmunoconjugado puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, según la afección, el tratamiento se sostiene hasta se produzca la eliminación deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de dosis del anticuerpo o inmunoconj ugado puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En consecuencia, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de estas) del anticuerpo o inmunoconj ugado se puede administrar al paciente. Tales dosis se pueden administrar de modo intermitente por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo o inmunoconj ugado ) . Se puede administrar una dosis de carga inicial superior, seguida por uno o más dosis menores. Un ejemplos de régimen de dosificación comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales .
C . Ensayos de actividad Los anticuerpos anti-FcRH5 e inmunoconjugados de la invención se pueden caracterizar para sus propiedades físico/químicas y/o actividades biológicas por varios ensayos conocido en la técnica. 1. Ensayos de actividad En un aspecto, se proporciona ensayos para identificar anticuerpos anti-FcRH5 o los inmunoconj ugados estos que tiene actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la capacidad de inhibir el crecimiento o proliferación celular (por ejemplo, actividad de "destrucción celular"), o la capacidad de inducir muerte celular, que incluye la muerte celular programada (apoptosis) También se proporcionan anticuerpos o inmunoconjugados que tienen la actividad biológica in vivo y/o in vitro.
En ciertas modalidades, se analiza un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado de este en cuanto a su capacidad de inhibir el crecimiento o la proliferación celular in vitro Los ensayos para la inhibición del crecimiento o la proliferación celular son bien conocidos en la técnica. Ciertos ensayos de proliferación celular, ejemplificada por los ensayos de "destrucción celular" que se describen en la presente, miden viabilidad celular. Uno de estos ensayos es el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo™, que está disponible en el comercio en Promega (Madison, I) . Este ensayo determina la cantidad de células viables en el cultivo sobre la base de la cuantificación del ATP presente, que es una indicación de células metabólicamente activas. Ver Crouch y otros (1993) J. Inmunol . Meth. 160:81-88, Patente U.S. No. 6602677. El ensayo se puede realizar en un formato de 96 o 384 cavidades, lo que lo hace susceptible de la detección de alto rendimiento automatizada (HTS) . Ver Cree y otros (1995) Anticancer Drugs 6:398-404. El procedimiento de ensayo involucra añadir un solo reactivo (CellTiter-Glo1" Reagent) directamente a las células cultivadas. Esto produce lisis celular de una señal luminiscente producida por una reacción de luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, que es directamente proporcional a la cantidad de células viables presentes en el cultivo. Los datos se pueden registrar por un luminómetro o dispositivo de imágenes por cámara CCD. El resultado de luminiscencia se expresa como unidades luminosas relativas (RLU) .
Otro ensayo para la proliferación celular es el ensayo de "MTT" , un ensayo colorimétrico que mide la oxidación de bromuro de 3- (4 , 5-dimetilt iazol-2-il ) -2 , 5-difeniltetrazolio a formazan por la reductasa mitocondrial . Como el ensayo CellTiter-Glo™, este ensayo indica la cantidad de células metabólicamente activas presentes en un cultivo celular. Ver, por ejemplo, Mosmann (1983) J. I munol . Meth. 65:55-63, y Zhang y otros. (2005) Cáncer Res. 65:3877-3882.
En un aspecto, un anticuerpo anti-FcRH5 se analiza en cuando a su capacidad para inducir la muerte celular in vi tro. Los ensayos para la inducción de muerte celular son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, tales ensayos miden, por ejemplo, la pérdida de integridad de la membrana pérdida de la integridad de la membrana, indicada por ejemplo, por captación de yoduro de propidio (PI) , azul de tripano (ver Moore y otros. (1995) Citotechnology, 17:1-11), o 7AAD. En un ejemplo de ensayo de captación de PI, las células se cultivan en medio Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) : Ham 1 s F-12 (50:50) suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (Hyclone) y 2 mM de L-glutamina. En consecuencia, el ensayo se realizar en ausencia de complemento y de células efectoras inmunes . Las células se siembran a una densidad de 3 x 106 por placa en placas de 100 x 20 mm y se dejan fijar toda la noche. El medio se extrae y se reemplaza con medio fresco solo o medio que contiene varias concentraciones del anticuerpo o inmunoconjugado . Las células se incuban durante un período de 3 días. Después del tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se desprenden por tripsinización. Las células luego se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C, el granulado se resuspende en 3 mi de regulador de pH de unión de Ca2+ frío (10 mM de Hepes, pH 7.4, 140 mM de NaCl , 2.5 mM de CaCl2) y se alicuotan en tubos 12 x 75 tapados con filtro de 35 mm (3 tubos por grupo de tratamiento) para la eliminación de los agregados celulares. Los tubos luego reciben el PI (10 pg/ml) . Las muestras se pueden analizar usando un citómetro de flujo FACSCAN® y software FACSCO VERT® CellQuest (Becton Dickinson) . Los anticuerpos o inmunoconjugados que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular determinado por la captación de PI se identifican de este modo.
En un aspecto, un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado en cuando a su capacidad para inducir apoptosis (muerte celular programada) in vitro. Un ejemplo de ensayo para anticuerpos o inmunoconjugados que induce apoptosis es un ensayo de unión de anexina. En un ejemplo de ensayo de unión de anexina, las células se cultivan y siembran en las placas como se describió en el párrafo precedente. El medio se extrae y se reemplaza con medio fresco solo o medio que contiene 0.001 a 10 ug/ml del anticuerpo o inmunoconjugado . Después de un período de 3 días de incubación, las monocapas se lavan con PBS y se desprenden por tripsinización . Las células luego se centrifugan a 1200 rpm, se resuspenden en 3 regulador de pH de unión de Ca2+ y se alicuotan en tubos como se describió en el párrafo precedente. Los tubos luego reciben anexina marcada (por ejemplo anexina V-FITC) (1 ug/ml) . Las muestras se pueden analizar usando un citómetro de flujo FACSCAN® y software FACSCONVERT® CellQuest (BD Biosciences) . Los anticuerpos o inmunoconjugados que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a anexina respecto del control se identifican de este modo. Otro ejemplo de ensayo para anticuerpos o inmunoconjugados que inducen apoptosis es un ensayo colorimétrico ELISA de ADN para detectar la degradación internucleosómica del ADN genómico. Dicho ensayo se puede realizar usando, por ejemplo, el kit de detección de muerte celular por ELISA (Roche, Palo Alto, CA) .
Las células para uso en cualquiera de los anteriores ensayos in vitro incluye células o líneas celulares que expresan naturalmente FcRH5 o que han sido manipuladas genéticamente para expresar FcRH5. Tales células incluyen células tumorales que sobreexpresan FcRH5 respecto de las células normales del mismo origen tisular. Tales células también incluyen líneas celulares (que incluyen líneas tumorales celulares) que expresan FcRH5 y líneas celulares que no expresan normalmente FcRH5 pero se han transfectado con ácido nucleico que codifica FcRH5.
En un aspecto, un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado de este se analiza para determinar su capacidad de inhibir el crecimiento o la proliferación celular in vivo. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-FcRH5 o inmunoconjugado de este se analiza para determinar su capacidad de inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Un sistema de modelo in vivo, tales como los modelos de xenoinjerto, se puede usar para el análisis. En un ejemplo de sistema de xenoinjerto, las células tumorales humanas se introducen en un animal no humano adecuadamente inmunocomprometido, por ejemplo, un ratón SCID. Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se administra al animal. Se mide la capacidad del anticuerpo o inmunoconjugado para inhibir o reducir el crecimiento tumoral . En ciertas modalidades del sistema de xenoinjerto anterior, las células tumorales humanas son células tumorales de un paciente humano Tales células útiles para preparar modelos de xenoinjerto incluyen líneas celulares de leucemia y linfoma humano, que incluyen sin limitación las células BJAB-luc (una línea celular de linfoma de Burkitt negativa para EBV transfectada con el gen indicador de luciferasa) , células Ramos (ATCC, Manassas, VA, CRL-1923) , células SuDHL-4 (DSMZ, Braunschweig, Alemania, AAC 495), células DoHH2 (ver Kluin-Neilemans , H.C. y otros., Leukemia 5:221-224 (1991), y Kluin-Neilemans, H.C. y otros., Leukemia 8:1385-1391 (1994)), Granta-519 células (ver Jadíael, D.M. y otros, Leukemia ll(l):64-72 (1997)). En ciertas modalidades, las células tumorales humorales se introducen en un animal no humano adecuadamente inmunocomprome ido por inyección subcutánea o por trasplante en un sitio adecuado, tal como un panículo adiposo mamario. 2. Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, un anticuerpo anti-FcRH5 se analiza para determinar su actividad de unión al antígeno. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un anticuerpo anti-FcRH5 se analiza para determinar su capacidad para unirse al FcRH5 expresado en la superficie de una célula. Se puede usar un ensayo FACS para el análisis.
En un aspecto, se pueden usar ensayos de competición para identificar un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo murino 10A8 (mulOA8 y/o anticuerpo humanizado 10A8vl (hulOA8vl) para la unión a FcRH5. En ciertas modalidades, el anticuerpo competitivo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional ) que se une al anticuerpo murino 10A8 (mulOA8) y/o 10A8vl humanizado (hulOA8 vi) . Los ejemplos de ensayos de competición incluyen, pero sin limitación, ensayos de rutina tales como los provistos en Harlow y Lañe (1988) Antibodies : A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . Los ejemplos de métodos detallados para el mapeo de un epítopo al que se unen un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" , en Methods in Molecular Biología vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) . Se dice que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si cada uno bloquea la unión del otro en 50% o más.
En un ejemplo de ensayo de competición, FcRH5 inmovilizado se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al FcRH5 (por ejemplo, anticuerpo murino 10A8 (mulOA8) , anticuerpo quimérico 10A8 (chl0A8) y/o anticuerpo humanizado 10A8 vi (hulOA8 vi) ) y un segundo anticuerpo no marcado que se analiza para determinar su actividad para competir con el primer anticuerpo para la unión a FcRH5. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante del hibridoma. Como control, FcRH5 inmovilizado se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a FcRH5 , se elimina el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marca asociada con el FcRH5 inmovilizado. Si la cantidad de marca asociada con FcRH5 inmovilizado está sustancialmente reducida en la muestra de ensayo con respecto a la muestra control, por lo tanto esto indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo para la unión al FcRH5. En ciertas modalidades, el FcRH5 inmovilizado está presente en la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que expresa FcRH5 en su superficie .
En un aspecto, los anticuerpos anti-FcRH5 purificados se pueden caracterizar adicionalmente por una serie de ensayos que incluyen, pero sin limitación, secuenciación · N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía liquida de alta presión por exclusión de tamaño no desnaturalizante (HPLC) , espectrometría de masa, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.
En una modalidad, la invención contempla un anticuerpo alterado que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que lo convierte en un candidato deseable para muchas aplicaciones en que la vida media del anticuerpo in vivo es importante, aún cuando ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. En ciertas modalidades, se miden las actividades del Fe del anticuerpo para asegurar que solo se mantienen las propiedades deseadas. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/depleción de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión del receptor de Fe (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (en consecuencia probablemente carece de actividad de ADCC) , pero retiene la capacidad de unión a FcRn. Las células principales para mediar ADCC, células NK, solo expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI , Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se sintetiza en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Inmunol . 9:457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la Patente U.S No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK) . En forma alternativa o adicional, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como se describe en Clynes y otros . PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Los ensayos de unión de Clq también se pueden realizar para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unir Clq y en consecuencia carece de actividad CDC. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro y otros., J. Inmunol . Methods 202:163 (1996). La unión a FcRn y las determinaciones de depuración/vida media in vivo también se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos, y no tienen por objeto limitar el alcance de la presente invención de ningún modo.
Todas las patentes y referencias bibliográficas citadas en la presente especif cación se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.
EJEMPLOS Se usaron los reactivos disponibles en el comercio con referencia a los ejemplos de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otro modo. Los anticuerpos usados en los ejemplos son anticuerpos disponibles en el comercio e o anticuerpos descritos en la presente. La fuente de estas células identificadas en los siguientes ejemplos, y en toda la especificación, por los números de acceso ATCC es American Type Culture Collection, Manassas, VA.
EJEMPLO 1 : Preparación de anticuerpos que se unen a FcRH5 Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unir específicamente a FcRH5.
Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en Goding, supra . Los inmunógenos que se pueden emplear incluyen FcRH5 purificado, proteínas de fusión que contienen FcRH5, y células que expresan FcRH5 recombinante en la superficie celular. La selección del inmunógeno puede ser realizada por los profesionales expertos sin experimentación indebida .
Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno de FcRH5 emulsionado en adyuvante de Freund completo y se inyectan por vía subcutánea o intraperitoneal en una cantidad de 1-100 microgramos. En forma alternativa, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Inmunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas de la pata trasera del animal. A los ratones inmunizados luego se les administra un refuerzo 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. De aquí en adelante, durante varias semanas, a los ratones también se les puede aplicar un refuerzo con inyecciones de inmunización adicional. Las muestras de suero se pueden obtener periódicamente a partir del sangrado retroorbital para análisis en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-FcRH5.
Después de que se ha detectado un título adecuado de anticuerpos, los animales "positivos" para los anticuerpos se pueden inyectar con una inyección intravenosa final de inmunógeno. Tres a cuatro días después, los ratones se sacrifican y se recolectan las células del bazo. Las células del bazo luego se fusionan (usando 35% de polietilenglicol) a una línea celular de mieloma murino seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponible en ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden sembrar en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades que contienen medio HAT (hipoxantina , aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células .
Las células de hibridoma se analizarán en un ELISA para determinar la reactividad contra el inmunógeno. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra el inmunógeno está dentro de la experiencia en la materia.
Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar por vía intraperitoneal en ratones singeneicos Balb/c para producir ascitis que contiene los anticuerpos monoclonales anti-inmunógeno. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden cultivar en matraces de cultivo de tejido o frascos giratorios. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis se puede lograr usando precipitación con sulfato de amonio, seguida por cromatografía de exclusión por gel. En forma alternativa, se puede emplear cromatografía de afinidad sobre la base de la unión del anticuerpo a la proteína A o proteína G.
Los anticuerpos dirigidos con ciertos polipéptidos de FcRH5 que se describen en la presente se pueden producir con éxito mediante esta técnica. En forma más específica, los anticuerpos monoclonales funcionales que son capaces de reconocer y unirse a la proteína de FcRH5 , que incluye las formas humanas y de cynomologus de las proteínas de FcRH5 , (medida por ELISA estándar, análisis de selección FACS y/o análisis inmunohistoquímico) se pueden generar con éxito contra las siguientes proteínas de FcRH5 , que incluyen las formas humanas y de cynomologus de las proteínas de FcRH5 , que se describen en la presente: PRO820 (ADN56041) , PR052387 (ADN257845) .
Además de la preparación de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los polipéptidos de FcRH5 , que se describen en la presente, mucho de los anticuerpos monoclonales se pueden conjugar con éxito a una toxina celular para usar en la dirección de la toxina celular á una célula (o tejido) que expresa un polipéptido de FcRH5 de interés (in vifcro e in vivo) . Por ejemplo, la toxina (por ejemplo, DM1) derivada de los anticuerpos monoclonales se puede generar con éxito en los siguientes polipéptidos de FcRH5 , que se describen en la presente: PRO820 (ADN56041) , PR052387 (ADN257845) .
A . Generación de líneas estables de FcRH5/IRTA2 (PRO820, PR052387) Para obtener líneas celulares para la detección de los anticuerpos FcRH5, se generaron líneas celulares de fibroblastos de ratón SVT2 que expresan en forma estable FCRH5/IRTA2 marcado y no marcado. El ADNc de FcRH5/ IRTA2 se amplificó por PCR a partir de una biblioteca de células del bazo y se clonó TA (Invitrogen) en pCR4. Para obtener el constructo de expresión no marcado, se clonaron los marcos de lectura abiertos (ORF) en el vector de expresión de mamífero pCMV.PD.nbe por medio de PCR para la adición de los sitios de restricción, la digestión del producto de PCR y el ligamiento en el vector. Los constructos de expresión marcados N-terminal se obtuvieron por la amplificación de los ORF de FcRH5/lRTA2 sin la secuencia señal y el ligamiento del producto de PCR en el vector pMSCVneo (Clontech) que contiene la marca gD y la secuencia señal (M G G T A A R L G A V I L F V V I V G H G V R G K Y A L A D A S L K M A D P N R F R G K D L P V L D Q L L) (SEC ID NO : 1) . Para cada FcRH5/IRTA2, se establecieron líneas celulares estables para usar en la detección de los anticuerpos monoclonales para la reactividad específica por FACS y la reactividad cruzada entre las FcRH/IRTAs. Los vectores marcados con gD y no marcados se transfectaron en SVT2 (cultivados en células en DMEM rico en glucosa + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina) por el protocolo estándar de Lipofectamina 2000 (Invitrogen; Carlsbad, Ca) . Los transfectantes marcados con gD se colocaron en 0.5 mg/ml de selección de geneticina (Invitrogen; Carlsbad, Ca) durante una semana y luego se separaron por FACS solo las células con anticuerpo monoclonal específica con marca gD (gD:952, Genentech; South San Francisco) para obtener el clon de mayor expresión. Los transfectantes no marcados se colocaron abajo selección con 5.0 ug/ml de puromicina (Calbiochem; La Jolla, Ca) hasta que crecieron colonias visibles. El AR de cada colonia se aisló por el protocolo estándar Trizóla (Invitrogen; Carlsbad, Ca) y se corrió TaqManá (ABI; Foster City, Ca) para determinar el clon de mayor producción.
B . Generación de anticuerpos monoclonales para FcRH5/IRTA2 (PR0820, PR052387) Se prepararon anticuerpos monoclonales murinos capaces de unirse a FcRH5 humano.
La proteína para la inmunización de los ratones se generó por transfección transitoria de los vectores que expresan el dominio extracelular marcado con His (ECD) de FcRH5/IRTA2 en las células CHO. La proteína se purificó a partir de los sobrenadantes de las células transfectadas en columnas de níquel y se confirmó la identidad de la proteína por secuenciación N-terminal .
Se hiperinmunizaron diez ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Hollister, CA) con proteína recombinante marcada con polihistidina (HIS6 (SEC ID NO: 68)), en adyuvante Ribi (Ribi Inmunochem Research, Inc., Hamilton, MO) . Las células B de ratones que demuestran altos títulos anticuerpo contra el inmunógeno por ELISA directo, y unión específica a las células de fibroblasto de ratón SVT2 que expresan el FcRH de interés por FACS, se fusionaron con las células de mieloma de ratón (X63.Ag8 , 653 ; American Type Culture Collection, Rockville, MD) usando un protocolo modificado análogo al previamente descrito (Kohler y Milstein, 1975; Hongo y otros., 1995). Después de 10 a 12 días, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para la producción y unión de anticuerpos por ELISA directo y FACS. Los clones positivos, que muestran la mayor unión inmune después de la segunda ronda de subclonación por dilución limitante, se expandieron y cultivaron para la caracterización adicional, que incluye especificidad y reactividad cruzada de FcRHl, -2, -3, -4, y -5. Los sobrenadantes recogidos de cada linaje de hibridoma se purificaron por cromatografía de afinidad (cromatografía líquida de proteína rápida Farmacia (FPLC) ; Pharmacia, Uppsala, Suecia) usando un protocolo modificado análogo al que se describió previamente (Hongo y otros., 1995). Las preparaciones de anticuerpo purificado luego se filtraron en forma estéril (0.2-µp? de tamaño de poro; Nalgene, Rochester NY) y se conservaron a 4°C en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) .
Los anticuerpos monoclonales que son capaces de reconocer y unir la proteína de FcRH5 (medido por ELISA estándar, análisis de separación FACS y/o análisis inmunohistoquímico) se han generado con éxito contra PR052837 (FcRH5c/lRTA2c) y se han denominado como: anti-FcRH5-9E2 (en la presente denominado como 9E2 ó 9E2,1,1) (ATCC No. PTA-7207, depositado el 9 de noviembre de 2005) , anti-FcRH5-lH4 (en la presente denominado como 1H4 ó 1H4,1,1) (ATCC No. PTA-7208, depositado el 9 de noviembre de 2005) , anti-FcRH5-13G9 (en la presente denominado como 13G9 ó 13G9,1,1) (que se describe en las solicitudes de patentes provisionales U.S. Nos. 61/211,695 presentada el 1 de abril de 2009 y 61/166,214 presentada el 2 de abril de 2009) , anti-FcRH5-4D10 (en la presente denominado como 4D10 ó 4D10,1,1) (ATCC No. PTA-7210, depositado el 9 de noviembre de 2005) , anti-FcRH5-6Hl (en la presente denominado como 6H1 ó 6H1,1,1) (ATCC No. PTA-7211, depositado el 9 de noviembre de 2005) , anti-FcRH5-8H6 (en la presente denominado como 8H6 ó 8H6,1,1) (ATCC No. PTA-7212, depositado el 9 de noviembre de 2005) , anti-FcRH5-7Dll (en la presente denominado como 7D11 ó 7D11,1,1) (descrita en la presente) , anti-FcRH5-10A8 (en la presente denominado como 10A8 ó 10A8,1,1) (descrita en la presente) . 1. Determinación de afinidad (análisis Biacore) Se calcularon las afinidades de unión a FcRH de las IgG a partir de las constantes de asociación y disociación usando sistema resonancia de plasmón superficial con un Biacore 2000. Un chip biosensor se activó por acoplamiento covalente de IgG anti-murina (BR-1008-338) usando clorhidrato de N-etil- 1 - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BIAcore, Inc.) . En breves palabras, en cada ciclo de análisis cinético, se capturaron 5 ul de 100 nM de IgG en el chip, se inyectaron diluciones seriadas dos veces con un caudal de flujo de 20 ul/min durante 150 sec . La disociación del antígeno se controló durante 180 segundos antes de la regeneración. Se calcularon las constantes de disociación en equilibrio a 25°C por el ajuste de los datos con un modelo de unión de Langrauir de 1:1. El regulador de pH de corrida fue PBS con 0.05% de Tween -20. Los resultados se muestran en la la Tabla 9. Todos los anticuerpos se unieron al antígeno con una afinidad suficiente para ser utilizados como agentes terapéuticos .
Tabla 9 * Muy leve en la concentración de saturación C. Construcción y secuenciación de anticuerpos anti-FcRH5 humanos quiméricos 1. Anticuerpo FcRH5 anti -humano quimérico 7D11 (ch7Dll) Para la construcción de IgGl de 7D11 quimérico, se extrajo ARN total de las células de hibridoma 7D11 (obtenidas de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki y otros., Blood, 81(1) : 84-95 (1993)) usando un Qiagen RNeasy Mini Kit (Cat # 74104) y el protocolo sugerido por el fabricante. Usando las secuencias de aminoácidos N-terminal obtenidas de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo monoclonal 7D11 se diseñaron los iniciadores de PCR específicos para cada cadena. Se diseñaron iniciadores inversos para RT-PCR para aparearse con la estructura 4 de la familia del gen que corresponde a la secuencia N-terminal. Los iniciadores también se diseñaron para agregar los sitios de restricción para clonación. Para la cadena ligera, estos fueron Eco RV en el extremo N-terminal y Kpnl en el extremo 3' de la estructura 4. Para la cadena pesada, los sitios agregados eran BsiWI en el extremo N terminal, y Apal ligeramente dirección 5' de la unión de VH-CH1. Las secuencias del iniciador son las siguientes: 7D11LCF .EcoRV (iniciador progresivo de la cadena ligera de 7D11) : 5'- GATCGATATCITGCTSACMCARTGTCCAGC - 3' (SEC ID NO: 2) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T . S=G/C, H=A/T/C) C7F7LCR.KpnI (iniciador inverso de la cadena ligera de 7D11) : 5'- TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC- 3' (SEC ID NO : 3) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T . S=G/C, H=A/T/C) 1D1 (IIID-2) HCF.BsiWI (iniciador progresivo de la cadena pesada de 7D11) : 5'- GATCGACGTACGCTGARGTGCARYTGGTGGARTCTGG- 3' (SEC ID NO: 4) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T . S=G/C, H=A/T/C) C7F7HCR.ApaI (iniciador inverso de la cadena pesada de 7D1) : 5'- ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT- 3' (SEC ID NO: 5) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T . S=G/C, H=A/T/C) Las reacciones de RT-PCR para las cadenas ligeras y pesadas se llevaron a cabo usando un kit de RT-PCR un paso Qiagen (Cat # 210210) y las mezclas y condiciones de reacción sugeridas. Los vectores pRK para la expresión de IgG de las células de mamífero se han descrito previamente (Gorman y otros., ADN Prot Eng Tech 2:3-10 (1990). Los vectores se han modificado y han incorporado ciertos sitios de reconocimiento de la enzima de restricción endonucleasa para facilitar la clonación y expresión (Shields y otros., J Biol Chem 2000; 276: 6591-6604) . La VL amplificada se clonó en un vector de expresión de células de mamífero pRK que contiene el dominio constante kappa humano (pRK. LPG3. HumanaKappa) . La VH amplificada se insertó en un vector de expresión de células de mamífero pRK que codifica el dominio constante de IgGl humano de longitud completa (pRK. LPG4. LPG4. Humana) .
Se obtuvo la secuencia de ADN para la región codificadora entera de la cadena ligera (Figura 1) y pesada (Figura 3) quiméricas humanas -murinas resultantes para el anti-FcRH5 humano (ch7Dll) . El polipéptido codificado para las cadenas ligera y pesada quiméricas humanas-murinas codificadas por los ADN se muestran en las Figuras 2 y 4, respectivamente. Después de la secuenciación de ADN, se analizó la expresión de los plásmidos .
Los plásmidos se transíectaron en forma transitoria en 293 (una línea celular renal embrionaria humana transformada con adenovirus (Graham y otros., J. Gen. Virol . , 36: 59-74 (1977)). Específicamente, las células 293 se dividieron en día antes de la transfección, y se colocaron en un medio que contiene suero. En el día siguiente, se agregó ADN bicatenario preparado como precipitado de fosfato de calcio, seguido por ADN de pAdVAntage™ ADN (Promega, Madison, WI) , y las células se incubaron toda la noche a 37 °C. Las células se cultivaron en medio libre de suero y se recolectaron después de 4 días. Las proteínas del anticuerpo se purificaron a partir de los sobrenadantes de la célula transfectada en las columnas de proteína A y luego se intercambió el regulador de pH en 10 mM de succinato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 6.0, y se concentró usando un Centricon-10 (Amicon) . La identidad de las proteínas se confirmó por las secuenciacion N-terminal. Se determinaron las concentraciones de proteína por análisis de aminoácidos cuantitativo. Los anticuerpos se analizaron para determinar la unión al FcRH5 humano por FACS en las células SVT2 que se describen a continuación. 2. Anticuerpo FcRH5 anti -humano quimérico 10A8 (ch!0A8) El anticuerpo 10A8 se derivó como miembros de un panel de hibridomas de anti-FcRH5 humano. Se construyeron quimeras ratón/humano de estos anticuerpos usando RT-PCR, como se describió anteriormente, para amplificar los dominios variables de las cadenas ligera y pesada del hibridoma usando AR m total como sustrato. Los dominios variables de la cadena ligera se clonaron en el vector pRK. LPG3. HumanaKappa que contiene el dominio constante kappa humano, mientras que los dominios variables de la cadena pesada se clonaron en el vector pRK. LPG4. HumanHC que codifica los dominios constantes de IgGl humana de longitud completa. La secuencia de ADN se obtuvo para región codificadora completa de la cadena ligera (Figura 7) y pesada (Figura 6) quiméricas humanas-murinas resultantes para el anti-FcRH5 humano (chlOA8) , que permitió la identificación de las regiones estructurales y CDR de los dominios variables. El polipéptido codificado para las cadenas ligera y pesada quiméricas humanas-murinas de 10A8 codificadas por el ADN que se muestran en las Figuras 6 y 8, respectivamente .
Las secuencias de iniciadores usados para la clonación de RT-PCR de 10A8 son las siguientes: 10A8LCF . EcoRV (iniciador progresivo de la cadena ligera de 10A8) : 5'- GATCGATATCGTGATGACCCARTCTCAY AA- 3' (SEC ID NO : 6) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C) 10A8LCR.KpnI (iniciador inverso de la cadena ligera de 10A8) : 5'- TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC- 3' (SEC ID NO : 7) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T . S=G/C, H=A/T/C) 10A8HCF . Bsi I (iniciador progresivo de la cadena pesada de 10A8) : 5'- GATCGACGTACGCTGARGTGCARYTG GTGGARTCTGG- 3' (SEC ID NO: 8) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T . S=G/C, H=A/T/C) 10A8HCR (iniciador inverso de la cadena pesada de 10A8) : 5 ' -CTGGWCAGGGMTCCAGAGTTCCA - 3' (SEC ID NO : 9) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T; M=A/C, R=A/G, D=G/A/T . S=G/C, H=A/T/C) 3. Anticuerpo FcRH5 anti -humano quimérico 13G9 (ch!3G9) El anticuerpo 13G9 se derivó como miembros de un panel de hibridomas de anti-FcRH5 humano. Se construyeron quimeras ratón/humano de estos anticuerpos usando RT-PCR, como se describió anteriormente, para amplificar los dominios variables de las cadenas ligera y pesada del hibridoma usando ARNm total como sustrato. Los dominios variables de la cadena ligera se clonaron en el vector pRK . LPG3. HumanoKappa que contiene el dominio constante kappa humano, mientras que los dominios variables de la cadena pesada se clonaron en el vector pRK. LPG4. HumanoHC que codifica los dominios constantes de IgGl humana de longitud completa. La secuenciación de ADN permitió la identificación de las regiones estructurales y CDR de los dominios variables. Las versiones quiméricas y humanizadas de 13G9 se describen en las solicitudes de patentes provisionales de U.S. Nos. 61/211,695 presentada en 1 de abril de 2009 y 61/166,214 presentada el 2 de abril de 2009, que se incorporan por referencia en la presente en su totalidad .
D . Generación de anticuerpo anti-FcRH5 humano 10A8 Los números de residuos están de acuerdo con Kabat (Kabat y otros., Sequences of proteins of inmunological interest, 5a Ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) . Se usan abreviaturas de aminoácido de letra única. Las degeneraciones del ADN se representan usando el código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T) . 1. Injerto de anticuerpo anti-FcRH5 humanizado Se generaron varios anticuerpos anti-FcRH5 humanizados. Los dominios VL y VH del anticuerpo de FcRH5 murino (10A8) se alinearon con los dominios de kappa I de VL de consenso humano (huKI) y VH de consenso del subgrupo III humano VH (huIII) . El alineamiento del dominio variable de la cadena ligera de 10A8 murino con la secuencia de consenso humana kappa I es el que se muestra en la Figura 9. Las regiones hipervariables del 10A8 murino (mulOA8) se manipularon genéticamente en la estructura de consenso humana aceptora para generar un injerto de HVR directo de MA10A8 (en la presente denominado como "injerto de 10A8" o anticuerpo 'humanizado' injertado con 10A8" o "injerto de hulOA8"). Las CDR de 10A8 se manipularon genéticamente en un vector de expresión de mamífero que contiene una secuencia señal de mamífero, la secuencia de consenso para el dominio variable de kappa I V humano, y un dominio de kappa I constante humano No se transfirieron residuos murinos desde el dador mAb al plásmido aceptor. Las CDR se transfirieron usando oligonucleótidos solos que codifican cada CDR, y los ADN del plásmido aceptor, siguiendo el protocolo de mutagénesis de Kunkle . Los residuos injertados, y el dominio variable de la cadena ligera de la versión 10A8 humana resultante (hulOA8 vi) (SEC ID NO: 19), es la que se muestra en la Figura 9.
Asimismo, las CDR del dominio variable de la cadena pesada de 10A8 murino (mulOA8) se manipularon genéticamente en el vector que contiene la secuencia señal de mamífero, la secuencia de consenso del subgrupo III de cadena pesada humana y las secuencias que codifican los dominios constantes de IgGl humana de longitud completa. No se transfirieron residuos murinos desde el dador al plásmido aceptor. Los alineamientos del dominio variable de la cadena pesada de 10A8, los residuos injertados del dominio variable del subgrupo III humano y la versión 1 de 10A8 humano resultante del dominio variable de la cadena pesada (hul0A8 vi) (SEC ID NO: 21) es el que se muestra en la Figura 10.
En los estudios iniciales, la versión quimérica y humanizada 1 (hulOA8 vi) se transfirieron en forma transitoria en una línea celular de riñon embrionario humano transformado por adenovirus, 293 (Graham y otros., 1977). Para cada variante, se añadieron 10 µg de plásmidos de cadena ligera y pesada descritos anteriormente a 0.9 mi de medio DMEM que contiene 0.1 mi de FuGene . Esta mezcla fue suficiente para añadir a matraz de T250 de 75% de células 293 confluentes con 24 mi de medio, y los matraces se incubaron toda la noche a 37°C y 5% de C02. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y el medio se reemplazó con medio de expresión libre de suero con insulina y oligoelementos . Después de 5 días, se recolectó medio acondicionado y los anticuerpos se purificaron por cromatografía de afinidad en Proteína Sefarosa.
Se midieron las afinidades de unión relativas de la versión humanizada 1 (hulOA8 vi) y la quimera por FACS y análisis de Scatchard (ver a continuación) . Debido a que la afinidad de la versión humanizada 1 pareció equivalente a la quimera, no se obtuvieron versiones de 10A8 para aumentar la afinidad y los estudios posteriores se basan en esta versión y sus derivados conjugados (ver a continuación) . 2. Producción de IgG Los plásmidos se transíectaron en forma transitoria en 293 (una línea celular renal embrionaria humana transformada con adenovirus (Graham y otros., J\ Gen. Virol . , 36: 59-74 (1977)). En forma específica, las células 293 se dividieron el día antes de la transíección, y se incubaron en medio que contiene suero. En el día siguiente, se agregó ADN bicatenario preparado como precipitado de fosfato de calcio, seguido por ADN de pAdVAntage™ ADN (Promega, Madison, WI) , y las células se incubaron toda la noche a 37°C. Las células se cultivaron en medio libre de suero y se recolectaron después de 4 días. Las proteínas del anticuerpo se purificaron a partir de los sobrenadantes de la célula transfectada en las moléculas de proteína A y luego se intercambió el regulador de pH en 10 mM de succinato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 6.0, y se concentró usando un Centricon-10 (Amicon) . La identidad de las proteínas se confirmó por las secuenciación N-terminal. Se determinaron las concentraciones de proteína por análisis de aminoácidos cuantitativo. Los anticuerpos se analizaron para determinar la unión al FcRH5 humano (TAH05) por FACS en las células SVT2 como se describió anteriormente. 3. Análisis de unión (análisis FACS) Para determinar la reactividad cruzada de los anticuerpos FcRH5, se analizaron la unión de las variantes de IgG a las células SVT2 , que expresan FcRHl-6 humano usando análisis de FACS.
En breves palabras, se incubaron aproximadamente 106 células de células SVT2 que expresan en forma estable huFcRHl-6 marcado con gD en 100 µ? con 1.0 ug de Ab murino o quimérico [Mu anti-gD (control positivo) , Mu anti-FcRH5 (1H4) ("mulH4") , Mu anti-FcRH5 (4D10) ("mu4D10") , Mu anti-FcRH5 (6H1) ("mu6Hl"), Mu anti-FcRH5 (7D11) ("mu7Dll") , Ch anti-FcRH5 (7D11) ("ch7Dll") , Mu anti-FcRH5 ( 8H6 ) ("mu8H6") , Mu anti-FcRH5 (9E2) ("mu9E2") , o Mu anti-FcRH5 (13G9) ("mul3G9")] . La incubación de las células SVT2 que expresan en forma estable el vector vacío se llevó a cabo con los mismos anticuerpos y se usó como control negativo. El anti-MuIgGi de rata conjugado a PE, ant i-MuIgG2a+b de rata o Mu anti-HuIgG se usó como anticuerpo de detección secundario. Los resultados se muestran en la figura 14. Todos los anticuerpos analizados se unen específicamente a FcRH5 , experto el anti-FcRH5 Mu (6H1) , que reacciona en forma cruzada con FcRHl . Mu anti-FcRH5 (8H6) es un anticuerpo específico para FcRH5 pero débil, por análisis de FACS.
Para determinar adicionalmente la reactividad cruzada de los anticuerpos FcRH5, se analizó la unión de los sobrenadantes de las variantes de IgG a las células SVT2 , que expresan FcRHl-6 humano por análisis de FACS.
En breves palabras, aproximadamente 106 células de células SVT2 que expresan en forma estable huFcRHl-6 marcado con gD se incubaron con 1.0 ig de anticuerpo Ms anti-gD purificado o 100 µ? (concentración desconocida) de sobrenadante de hibridoma de Ab murino (Mu anti-FcRH5 (10A8) ("mul0A8"), Mu anti-FcRH5 (10F5) ("mul0F5")). La incubación de las células SVT2 que expresan en forma estable el vector vacío se llevó a cabo con los mismos anticuerpos y se usó como control negativo. Se usó anti-MuIgGl de rata conjugado a PE como el anticuerpo de detección secundario. Los resultados se muestran en la Figura 15. Los anticuerpos mulOA8 y mulOF5 unen específicamente FcRH5.
Para determinar adicionalmente la unión de los anticuerpos FcRH5 de ratón, se analizó la unión de las variantes de IgG en las células Raj i , que expresan FcRH5 humano y las células 293 que expresan FcRH5 de cynomologus, usando análisis de FACS.
En breves palabras, aproximadamente 106 células de Raji transfectadas en forma estable con FcRH5 humano y las células 293 transfectadas en forma transitoria con FcRH5 marcado con gD de cyno se incubaron con 1.0 g de de control de isotipo de ratón biotinilado, anti-gD mu biotinilado, mu6Hl biotinilado, mul3G9 biotinilado o mu7Dll biotinilado en 100 µ? de regulador de pH de FACS (PBS, 0.5% BSA, 0.05% de azida sódica) . Se usó estreptavidina conjugada con PE como el reactivo de detección secundario. Los resultados que se muestran en las Figuras 16 y 17.
Para el análisis adicional de FACS de los anticuerpos FcRH5, 1.0 ]ig, 0.1 pg o 0.01 pg de anticuerpo se titularon por un millón de células de células BJAB que expresan en forma estable huFcRH5 y células SVT2 que expresan en forma estable , FcRH5 de ciño. En breves palabras, aproximadamente 106 células en 100 µ? se incubaron con cantidades varias (1.0 ug, 0.1 ug o 0.01 ug) de ne Ab mülH , mu6Hl, mu7Dll, mu9E2 , mulOA8, mul0F5, o mul3G9 murinos por millón de células de células BJAB que expresan en forma estable huFcRH5 y células SVT2 que expresan en forma estable cinoFcRH5. La incubación con 1.0 ug/106 de células del control de isotipo de IgG Mu apropiado se usó como control negativo. anti-MuIgGi de rata conjugado a PE o anti-MuIgG2a+b de rata se usó como el anticuerpo de detección secundario. Los resultados que se muestran en las Figuras 18 y 19. mulH4, mu6Hl, mu7Dll, mu9E2, mulOA8, mulOF5, o mul3G9 reaccionan en forma cruzada con FcRH5 de cinomolgus por análisis de FACS, y se pueden usar en estudios de seguridad preclínicos que evalúan la toxicidad dependiente del objetivo.
Para el análisis de FACS de los conjugados del anticuerpo de FcRH5 y fármaco (ver Ejemplo 2), se añadieron ADC de FcRH5 en concentraciones crecientes (0.1, 1.0, y 10 µg/ml) a 106 de células OPM2 transfectadas y que expresan en forma estable FcRH5 humano o células SVT2 transfectadas y que expresan en forma estable FcRH5 de cinomolgus en un volumen de reacción de 100 µ? . Luego las muestras se incubaron 1 hora a temperatura ambiente en regulador de pH de FACS (PBS, 0.5% BSA, 0.1% de azida sódica) para inhibir la internalización . Después del lavado, las células se resuspendieron en regulador de pH de FACS y se incubaron 30 min a temperatura ambiente con 20 µ? de anticuerpo secundario IgG anti-humana de ratón conjugado a ficoeritrina (Ms anti-Humana-PE) en un volumen de reacción de 100 µ? . Después del lavado, las células se fijaron en 200 µ? de 2% paraformaldehído/PBS y se realizó citometría de flujo. Se usó el mismo procedimiento para HuIgG, sin embargo, solo en la concentración más alta (10 µg/ml) . El HuIgG se usó como control de isotipo para ajustar el valor basal de PMT para la línea celular. Se realizó citometría de flujo en BD FACSCalibur® y se registró la media geométrica de la intensidad de fluorescencia para cada muestra. Los datos registrados se analizaron usando el software FlowJo v8,4,5 (ver las Figuras 20-25) . Tio-hulOA8-HC(A118C) y tío y tio-hulOA8-LC (V205C) se unen de modo similar a variadas concentraciones de anticuerpo no conjugado a las células OPM2 que expresan en forma estable huFcRH5 y las células SVT2 que expresan en forma estable FcRH5 de cinomolgus por análisis de FACS . Tio-chlOA8-HC (A118C) -MC-vc-PAB-MMAE, tio-hulOA8-HC (A118C) -MC-vc-PAB-MMAE, tio-hul0A8-LC (V205C) -MC-vc-PAB-MMAE, chlOA8-SPDB-DM4 , y hulOA8-SPDB-DM4 se unen de modo similar a variadas concentraciones de ADC a las células OPM2 que expresan en forma estable huFcRH5 por análisis de FACS. 4. Determinación de afinidad (Análisis de Scatchard) Para determinar adicionalmente la unión de los anticuerpos FcRH5 murinos y los clones de IgG, se realizó el análisis de Scatchard de la unión de las variantes de IgG yodadas a las células 0PM2 que expresan FcRH5 humano y las células SVT2 que expresan FcRH5 de cynomolgous .
En el análisis de Scatchard, 0.5 nM de anti-FcRH5 del clon murino marcado I125 o de IgG compitió contra anti-FcRH5 murino o marcado o clon de IgG, respectivamente, que varía de 50 a 0.02 nM (etapa 12, dilución seriada 1:2) en presencia de una línea OPM2 transfectada que expresa en forma estable FcRH5 humano y una línea SVT2 transfectada que expresa en forma estable FcRH5 de cynomolgous. Después de una incubación de cuatro horas a 4°C, las células se lavaron y se leyeron las cuentas del granulado celular con un contador gamma (1470 IZA D Automatic Gamma Counter; Perkin Elmer, Walthem, MA) . Todos los puntos se realizaron por triplicado y se contaron durante 10 minutos. La CPM promedio se usó para el cálculo de Kd usando el programa New Ligand (Genentech, South San Francisco, CA) . Los resultados se muestran en la Tabla 10 ("ms" se refiere a anticuerpo humano) .
Tabla 10. Determinación de afinidad determinada por análisis de Scatchard.
Kd Error Línea celular PUR/Lot Ab (nM) est BJAB . huFcRH5 50095-16 mslOA8 0.44 0.046 SVT2. ciFcRH5 50095-16 mslOA8 2.74 0.530 OP 2. huFcRH5 PUR 15312 chlOA8 0.52 0.036 SVT2. CÍFCRH5 PUR 15312 chlOA8 0.98 0.022 0PM2. huFcRH5 PUR 16560 tio-chlÓA8. HC 0.85 0.050 SVT2. CÍFCRH5 PUR 16560 tio-chlOA8.HC 1.57 0.000 OPM2.huFcRH5 CA51434-50 hul0A8 vi 1.44 0.150 SVT2. ciFcRH5 CA51434-50 hulOA8 vi 3.04 1.340 OPM2. huFcRH5 PUR 17978 tio . hulOA8. HC 1.77 0.240 OPM2. huFcRHS PUR 17979 tio.hulOA8. LC 1.21 0.142 SVT2. ciFcRH5 PUR 17978 tio. huí0A8. HC 3.12 0.139 SVT2.ciFcRH5 PUR 17979 tio . hul0A8. LC 2.63 1032.300 BJAB . huFcRH5 50095-53 ms6Hl 0.19 0.007 SVT2. ciFcRH5 50095-93 U1S6H1 0.38 0.027 EJEMPLO 2: Generación de conjugados de anticuerpo anti-FcRH5 y fármaco (ADC) Los fármacos usados para la generación de conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) para anti-FcRH5 humano incluyeron derivados de maitansinoide DM1 y DM4 y dolastatina 10 monometillauriestatina E (MMAE) y monometillauriestatina F (MMAF) . E (MMAE). (Ver US20050276812 , presentada el 31 de mayo de 2005 y US20050238649 , presentada el 5 de noviembre de 2004,), los que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad). DM1, DM4, y MMAE son inhibidores mitóticos que son al menos 100 veces más citotóxicos que los inhibidores mitóticos del alcaloide de la vinca usados en los tratamientos quimioterapéuticos del NHL (Doronina y otros., Bioconjug. Chem. , 17:114-123 (2006); Doronina y otros., Nat. Biotechnol . , 21: 778-784 (2003); Erickson y otros., Cáncer Res., 66: 4426-4433 (2006)). )). Los enlazadores usados para la generación de los ADC fueron SMCC para DM1, SPDB para DM4 y MC para MMAF o MC-vc-PAB para MMAE. Para DM1 y DM4, los anticuerpos se ligaron a DM1 DM4a través del grupo e-amino de lisina que usa el reactivo enlazador tioester de SMCC (denominado MCC después de la conjugación) Alternativamente, para DM4, los anticuerpos se ligaron a DM4 DM4a través del grupo e-amino de lisina que usa el enlazador SPDB. DM1 unido por un enlazador SMCC es resistente a la escisión en condiciones reductoras . Además los ADC de SMCC-DM1 y SPDB-DM4 ADC inducen toxicidad celular si el ADC se internaliza y se dirige al lisosoma causando la liberación de la lisina-NE -DM1, que es un agente antimitótico efectivo en el interior de la célula, y cuando se libera de la célula, la lisina-NE -DM1 es no tóxica (Erickson y otros., Cáncer Res., 66: 4426-4433 (2006)) Para MMAE, los anticuerpos se ligaron a MMAE a través de la cisteína por maleimidocaproil-valina-citrulina (ve) -p-aminobenciloxicarbonilo (MC-vc-PAB) . El enlazador MC-vc-PAB se puede escindir por proteasas intercelulares tales como catepsina B y cuando se escinde, libera el fármaco libre (Doronina y otros., Nat . Biotechnol . , 21: 778-784 (2003)) a la vez que el enlazador MC puede ser resistente a la escisión por las proteasas intracelulares .
Los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) para anti-FcRH5 humano, usando SMCC-DM1, se generaron de modo similar al procedimiento descrito en la solicitud US No. 11/141,344, presentada el 31 de mayo de 2005, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Los anticuerpos anti-FcRH5 humano purificados se intercambiaron con el regulador de pH en una solución que contiene 50 mM de fosfato de potasio y 2 mM de EDTA, pH 7.0. SMCC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) se disolvió en dimetilacetamida (DMA) y se agregó a la solución del anticuerpo para obtener una relación molar final SMCC/Ab de 10:1. La reacción se dejó proceder durante tres horas a temperatura ambiente con mezclado. El anticuerpo modificado con SMCC posteriormente se purificó en una columna de desalinización GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada en 35 mM de citrato de sodio con 150 mM de NaCl y 2 mM de EDTA, pH 6.0. Se agregó DM1, disuelto en DMA, a la preparación de anticuerpo SMCC para dar una relación molar de DM1 al anticuerpo de 10:1. La reacción se dejó proceder durante 4-20 horas a temperatura ambiente con mezclado. La solución de anticuerpo modificado con DM1 se diafiltró con 20 volúmenes de PBS para eliminar el DM1 sin reaccionar, se filtró en forma estéril y se conservó a 4 grados C. Normalmente, se obtuvo un rendimiento de 40-60% de anticuerpo mediante este proceso. La preparación fue usualmente >95% monomérica evaluada por filtración en gel y dispersión de luz láser. Debido a que DM1 tiene un máximo de absorción a 252 nm, la cantidad de fármaco unida al anticuerpo se podría determinar por mediciones de absorción diferencial a 252 y 280 nm. Normalmente, la relación del fármaco al anticuerpo fue de 3 a 4.
Para generar el conjugado de anticuerpo y fármaco anti-FcRH5 humano SPDB DM4 con 3-4 fármacos/Ab el anticuerpo se modificó primero con SPDB [ éster del ácido 4- (2-Piridilditio) butírico de N-hidroxisuccinimida] para generar grupos ditiopiridilo . Se añadió un exceso molar de 4-6 veces de SPDB al anticuerpo y se dejó reaccionar durante 90 min a RT. La reacción se llevó a cabo en 50 mM de fosfato de potasio, pH 7 con 50 mM de NaCl , 2 mM de EDTA a una concentración de anticuerpo de 5-10 mg/ml. Después de la reacción de SPDB, se añadió etanol a una concentración final de 5% V/V y el fármaco DM4 que contiene tiol se añade en un exceso molar de 1.7 veces respecto de SPDB. La incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 16 horas. El conjugado se purifica por diafiltración, filtración en gel o cromatografía de intercambio catiónico.
Los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) para anti-FcRH5 humano, usando fármaco enlazador MC-val-cit (vc)-PAB-MMAE se generaron de modo similar al procedimiento descrito en la solicitud US No. 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. El anticuerpo anti-FcRH5 humano purificado se disolvió en 500 mM de borato de sodio y 500 mM de cloruro de sodio a pH 8.0 y se trató adicionalmente con un exceso de 100 MM de ditiotreitol (DTT) . Después de la incubación a 37 grados C durante aproximadamente 30 minutos, el regulador de pH se cambia por la elución en resina de Sefadex G25 y se eluye con PBS con 1 mM de DTPA. Se examinó el valor de tiol/Ab por la determinación de la concentración de anticuerpo reducido a partir de la absorbencia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por la reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, I) y la determinación de la absorbencia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfrió en hielo. El enlazador de fármaco, MC-val-cit (ve) -PAB-MMAE, en DMSO, se disolvió en acetonitrilo y agua, y se agregó al anticuerpo reducido enfriado en PBS. Después de una hora de incubación, se agregó un exceso de maleimida para inactivar la reacción y se tapó cualquiera de los grupos tiol del anticuerpo. La mezcla de reacción se concentró por ultrafiltración centrífuga y el conjugado de anticuerpo y fármaco se purificó y desalinizó por la elución a través de la resina G25 en PBS, se filtró a través de filtros 0.2 µ?? en condiciones estériles y se congeló para el almacenamiento.
EJEMPLO 3 ; Preparación de anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisterna La preparación de anticuerpos anti-FcRH5 manipulados genéticamente en cisteína se realizó como se describe en la presente. Los residuos de cisteína se pueden añadir a la cadena ligera, la cadena pesada o la región de Fe de un anticuerpo para permitir la conjugación a varios fármacos. En la preparación del anticuerpo anti-FcRH5 manipulado genéticamente en cisteína 10A8, se mutagenizó el ADN que codifica la cadena ligera para sustituir la cisteína por valina en la posición de Kabat 205 que se muestra en las Figuras 13A y 13B. Se mutagenizó el ADN que codifica la cadena pesada para sustituir la cisteína por alanina en la posición EU 118 en la cadena pesada (posición secuencial 118, número de Kabat 114) que se muestra en las Figuras 12A y 12B. La región de Fe de los anticuerpos anti-FcRH5 se puede mutagenizar para sustituir la cisteína por serina en la posición EU 400 en la región Fe de la cadena pesada (posición secuencial 400; número de Kabat 396).
EJEMPLO 4; ; Ensayo de destrucción de células tumorales in vivo usando conjugados de anticuerpo anti-FcRH5 muriño y fármaco A. Xenoinjertos Para ensayar la eficacia de los anticuerpos anti-FcRH5, anticuerpos anti-humanos murinos se conjugaron a DM1 y se analizó el efecto de la variante conjugada sobre los tumores .
Específicamente, se analizó la capacidad de los anticuerpos para la remisión de tumores en las células BJAB-luciferasa (línea de células de linfoma de Burkitt transfectada con FcRH5 humano) .
Después de la transfección de pRK. CMV. PD . nbe . FcRH5 en las células de BJAB-luciferasa y selección con puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) , las células sobrevivientes se autoclonaron por FACS para las que se expresan con intervalo medio con el anticuerpos anti-FcRH5 (7D11) . Después de la autoclonación, se eligió línea celular de BJAB-luciferasá que expresa FcRH5 más estrechamente parecido a la expresión de las células plasmáticas, determinado por FACS por el análisis de FACS usando anticuerpos anti-FcRH5 (7D11) . Como control negativo, se usaron células BJAB-luciferasa transfectadas , de la misma manera con el vector vacío pRK. CMV. PD . nbe .
Para el análisis de eficacia de los anticuerpos de ratón, se inocularon ratones hembra CB17 ICR SCID (6-8 semanas de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) por vía subcutánea con 2 X 107 células BJAB-luciferasa, por medio de inyección en los flancos de ratones CB17 ICR SCID y los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 128 mm3. El día 0 se refiere al día en que los tumores tenían un promedio de 100-250 mm3 y cuando se administró la primera o única dosis de tratamiento, a menos que se indique específicamente otra cosa a continuación. Se calculó el volumen tumoral sobre la base de dos dimensiones, medidas mediante calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V= 0.5a X b2, donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental se expresaron como media + DE. Grupos de 8-10 ratones se trataron con una dosis intravenoso (i.v.) semanal de 400 g de anticuerpo-fármaco ligado/m2 de ratón (correspondiente a -8-10 mg de ADC /kg de ratón) con ADC de anti-FcRH5 o "control de conjugado de anticuerpo y fármaco en el día 0 y día 71. Los tumores se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Los ratones se sacrificaron antes que los volúmenes del tumor alcanzaran 2000 mm3 o cuando los tumores mostraron signos de ulceración inminente. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Los enlazadores entre el anticuerpo y la toxina que se usaron fueron el enlazador de disulfuro tioéter SMCC para DM1. Los enlazadores adicionales pueden incluir enlazador disulfuro SPP o o el agente de reticulación de tioéter SMCC para DM1 o MC o MC-valina-citrulina (ve) -PAB o (un reactivo enlazador de dipéptido valina-citrulina (ve) ) ) que tiene un componente maleimida y un componente para-aminobencilcarbamoílo (PAB) autodestructivo para monometilauristatina E (MMAE) o monomet ilauristatina F (MMAF) . Las toxinas usadas fueron DM1. Las toxinas adicionales pueden incluir MMAE o MMAF. Los anticuerpos para este experimento incluyeron mu7Dll, descrito en Chang y otros. PCT/US2004/043514 ( O 2005/063299) , que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad, así como anti-FcRH5 descrito en la presente (ver Ejemplo IB, tales como mu7Dll, mu6Hl, mulOA8, mul3G9, y mu9E2) .
Los controles negativos incluyeron conjugados basados anti-gp-120 (SMCC-DM1) .
B. Resultados 1. Xenoinjertos de BJAB-FcRH5 En un tratamiento de 48 días, con los conjugados y dosis del fármaco mostradas de los ADC de anti-FcRH5 mu7Dll, mu6Hl, mulOA8, mul3G9, y mu9E2 , mostró inhibición del crecimiento tumoral en ratones SCID con tumores de BJAB-luciferasa en comparación con el control negativo, anti gp-120 S CC-DM1. Los ADC se administraron en dos dosis (como se indica a continuación en la Tabla 11) en el día 0 y día 7 para todos los ADC y controles. En forma específica, todos los ADC de anti-FcRH5 ADCs inhibieron significativamente el crecimiento tumoral (Figura 26) .
Además, en el mismo estudio, se determinó el porcentaje de cambio de peso corporal en los primeros 17 días en cada grupo de dosis. Los resultados (Figura 27) indicaron la administración de estos ADC anti-FcRH5 murino no causó una disminución significativa del peso corporal o pérdida de peso durante este tiempo.
Aún adicionalmente , en la Tabla 11, se indica el número de ratones respecto del número total de ensayados que muestra regresión parcial (PR, cuando el volumen del tumor en algún momento después de la administración disminuyó por debajo del 50% del volumen de tumor medido en el día 0) Remisión completa (CR, cuando en algún momento después de la administración el volumen del tumor disminuyó a 0 mm3 ) (NA = No aplicable) ; (TI = número de tumores observables al fin del estudio) .
Tabla 11.
EJEMPLO 5; Ensayo de inhibición del crecimiento bumoral in vivo por conjugados de anbi-Fc H5 TioMab y fármaco ?. Xenoinjertos Para analizar la eficacia de los conjugados de hulOA8 tioMAb y fármaco con MC-vc-PAB-MMAE y conjugados de hulOA8 y fármaco con SPDB-DM4, se analizaron los efectos de los conjugados de 10A8 tioMab y fármaco y conjugados de 10A8 y fármaco sobre los tumores en ratones.
Específicamente, se examinó la capacidad de los anticuerpos para remitir los tumores en las células OPM2 (Línea celular de mieloma múltiple) transfectadas en forma estable con FcRH5 humano.
Después de la transfección de pRK. CMV. PD . nbe . FcRH5 linearizadas en células 0PM2 y selección con puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) , se separaron las células sobrevivientes para expresar FcRH5 en las células con anti-FcRH5,7Dll marcado con biotina (Pierce Biotechnology, Rockford, II) y microesferas de anti-biotina MACS en una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) . Después de la separación la expresión de FcRH5 se confirmó por análisis de FACS usando anticuerpos anti-FcRH5 (10A8) y y una línea celular 0PM2 transfectada, de la misma manera, con el vector vacío pRK. CMV. PD . nbe como, control negativo.
Para el análisis de eficacia de los conjugados de hulOA8 tioMAb y fármaco con MC-vc-PAB-MMAE y conjugados de hulOA8 y fármaco con SPDB-DM4, se inocularon ratones hembra CB17 ICR SCID (6-8 semanas de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) por vía subcutánea con 2 X 107 células 0PM2-FcRH5, por medio de inyección en los flancos de ratones CB17 ICR SCID y los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 180 mm3. El día 0 se refiere al día en que los tumores tenían un promedio de 100-250 mm3 y cuando se administró la primera/o única dosis de tratamiento, a menos que se indique específicamente otra cosa a continuación. Se calculó el volumen tumoral sobre la base de dos dimensiones, medidas mediante calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V= 0.5a X b2, donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental se expresaron como media + SE. Grupos de 8 ratones se trataron con una dosis intravenoso única (i.v.) semanal de 2 , 4, u 8 mg ADC/ kg con anti-FcRH5 ADC o control conjugados de anticuerpo y fármaco. Los tumores se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Los pesos corporales se midieron una vez por semana a lo largo de experimento. Los ratones se sacrificaron antes que los volúmenes del tumor alcanzaran 3000 mm3 o cuando los tumores mostraron signos de ulceración inminente . Todos los protocolos de animales fueron aprobados por Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) .
Los controles negativos incluyeron conjugados basados en anti-HER2 (HERCEPTIN®) (trastuzumab) ) (SPDB-DM4 y MC-vc-PAB-MMAE) .
B. Resultados 1. Xenoinjertos de OPM2-FcRH5 En un tratamiento de 35 días con los conjugados y las dosis de fármacos que se muestran en la Tabla 12, hulOA8 conjugado con SPDB-D 4 (Hu-anti-FcRH5 ( 10A8 ) -SPDB-DM4 ) y hul0A8 tioMAbs conjugado con MC-vc-PAB-MMAE ( "tio-HC-hu-anti-FcRH5 ( 10A8) -vc-E" ) mostraron inhibición del crecimiento tumoral en ratones SCID con tumores de OPM2-FcRH5 en comparación con el control negativo, anti-HER2 humanizado conjugado con SPDB-DM4 (Hu-anti-HER2 (4D5 ) -SPDB-DM4 ) y anti-HER2 humanizado (4D5) tioMAb conjugado con MC-vc-PAB-MMAE ( "tio-hu-anti-HER2 (4D5)-vc-E). Los ADC se administraron en una dosis única (como se indica en la Tabla 12) en el día 0 para todos los ADC y controles. Específicamente, todos los ADC de anti-FcRH5 humanizado y anti-FcRH5 tioMAb humanizado ADCs inhibieron significativamente el crecimiento tumoral (Figura 28) . Los conjugados basados en anti-HER2 se usaron como controles negativos ( "Tio-hu-anti-Her2 (4D5)-vc-E" y "Anti-Her2 (4D5) -spdb-dm4" ) .
Además, en el mismo estudio, se determinó el porcentaje de cambio de peso en los primeros 14 días en cada grupo de dosis. Los resultados (Figura 29) indicaron que la administración de estos ADC de anti-FcRH5 humanizado y anti-FcRH5 tioMAb humanizado no causó reducción significativa del peso corporal o pérdida de peso durante este tiempo.
Aún adicionalmente , en la Tabla 12, se indica el número de ratones respecto del número total de ensayados que muestra regresión parcial (PR, cuando el volumen del tumor en algún momento después de la administración disminuyó por debajo del 50% del volumen de tumor medido en el día 0) , Remisión completa (CR, cuando en algún momento después de la administración el volumen del tumor disminuyó a 0 mm3) (NA = No aplicable) (TI = número de tumores observables al fin del estudio) .
Tabla 12.
* Vehículo = acetato de histidina 20 mM, pH 5.5, 240 mM de sacarosa, 0.02% de PS20 EJEMPLO 6; Ensayo para la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por los conjugados de anti-Fc H5 humanizado y fármaco A. Xenoinjertos Para analizar la eficacia de los conjugados de hulOA8 y fármaco con SPDB-DM4 ( "hu-Anti-FcRH5 (10A8)-SPDB-DM4") a diferentes dosis, se analizaron los efectos de los anticuerpos conjugados sobre los tumores en ratones.
Específicamente, se examinó la capacidad de los anticuerpos de remitir los tumores en las células 0PM2 (Línea celular de mieloma múltiple) transíectadas en forma estable con FcRH5 humano .
Después de la transfección de pRK. CMV. PD . nbe . FcRH5 linearizado en las células 0PM2 y la selección con puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) , se separaron las células sobrevivientes para expresar FcRH5 en las células con anti-FcRH5,7Dll marcado con biotina (Pierce Biotechnology, Rockford, II) y microesferas de anti-biotina MACS en una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) . Después de la separación la expresión de FcRH5 se confirmó por análisis de FACS usando anticuerpos anti-FcRH5 (10A8) y una línea celular OPM2 transíectada, de la misma manera, con el vector vacío pRK. CMV. PD . nbe como control negativo.
Para el análisis de eficacia de los conjugados de hulOA8 y fármaco con SPDB-DM4, se inocularon ratones hembra CB17 ICR SCID (6-8 semanas de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) por vía subcutánea con 2 X 107 células OPM2-FcRH5, por medio de inyección en los flancos de ratones CB17 ICR SCID y los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 180 mm3. El día 0 se refiere al día en que los tumores tenían un promedio de 100-250 mm3 y cuando se administró la primera/o única dosis de tratamiento, a menos que se indique específicamente otra cosa a continuación. Se calculó el volumen tumoral sobre la base de dos dimensiones, medidas mediante calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V= 0.5a X b2, donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental se expresaron como media + SE. Grupos de 9 ratones se trataron con una dosis intravenosa (i.v.) única que varía de 0.5 a 12 mg de ADC/kg con ADC de anti-FcRH5 o conjugados de anticuerpo y fármaco de control (ADC) . Los tumores se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Los pesos corporales se midieron una vez por semana a lo largo del experimento. Los ratones se sacrificaron antes que los volúmenes del tumor alcanzaran 3000 mm3 o cuando los tumores mostraron signos de ulceración inminente. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por Inst itutional Animal Care and Use Committee (IACUC) .
Los controles negativos incluyeron conjugados basados en anti-HER2 (HERCEPTIN® ) (trastuzumab) ) (SPDB-DM4 ) .
B. Resultados 1. Xenoinjertos de OPM2-FcRH5 En un tratamiento de 50 días con conjugados y dosis de fármacos que se muestran en la Tabla 13, anti-FcRH5 humanizado (10A8) (hulOA8) conjugado con SPDB-DM4 ("hu-anti-FcRH5 (10A8) -SPDB-DM4" ) mostró inhibición del crecimiento tumoral en ratones SCID con tumores de OPM2-FcRH5 en comparación con el control negativo, anti-HER2 humanizado conjugado con SPDB-DM4 ( Hhu-anti-HER2 (4D5) -SPDB-DM4" ) ) . Los ADC se administraron en una dosis única (como se indica en la Tabla 13) en el día 0 para todos los ADC y controles. Específicamente, 8 mg/kg y 12 mg/kg del ADC del anti-FcRH5 humanizado inhibieron significativamente crecimiento tumoral (Figura 30A) .
Además, en el mismo estudio, se determinó el porcentaje de cambio de peso en los primeros 14 días en cada grupo de dosis. Los resultados (Figura 30B) indicaron que la administración de estos ADC de anti-FcRH5 humanizado y de anti-FcRH5 tioMAb humanizado no causaron reducción significativa del peso corporal o pérdida de peso durante este tiempo.
Aún adicionalmente , en la Tabla 13, se indica el número de ratones respecto del número total de ensayados que muestra regresión parcial (PR, cuando el volumen del tumor en algún momento después de la administración disminuyó por debajo del 50% del volumen de tumor medido en el día 0) , Remisión completa (CR, cuando en algún momento después de la administración el volumen del tumor disminuyó a 0 mm3) (NA = No aplicable) ; (TI = número de tumores observables al fin del studio) .
* Vehículo = acetato de histidina 20 mM, pH 5.5, 240 mM de sacarosa, 0.02% de PS20 EJEMPLO 7 : Ensayo para la reducción de la proliferación celular in vitro con conjugados de anti-FcRH5 TioMab y fármaco Se puede medir la potencia in vitro de los conjugados de hulOA8 y hul0A8 tioMAb (HC(A118C) y fármaco (que incluyen hu anti-FcRH5 (10A8) -desnudo, tio-HC (A118C) -hu-anti-FcRH5 (10A8) -desnudo, hu anti-FcRH5 ( 10A8 ) -SPDB-DM4 , tio-HC (A118C) -hu-anti-FcRH5 (10A8) -MC-vc-PAB-MMAE) por un ensayo de proliferación celular con línea 0PM2 transfectada que expresan en forma estable FcRH5 humano (0P 2. CMV . PD . FcRH5. SP .2 ) . El ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® es un método de ensayo homogéneo disponible en el comercio (Promega Corp., Madison, WI), basado en la expresión recombinante de luciferasa de Coleóptera (US 5583024; US 5674713; US 5700670) . Este ensayo de proliferación celular determina la cantidad de células viables del cultivo sobre la base de la cuantificación del ATP presente, un indicador de células metabólicamente activas (Crouch y otros., J. Inmunol . Metho . , 160: 81-88 (1993); US 6602677) . El ensayo de CellTiter-Glo® se realiza en un formato de 96 cavidades, lo que lo hace apropiado para el análisis de alto rendimiento automatizado (HTS) (Cree y otros., AntiCáncer Drugs, 6:398-404 (1995)). El procedimiento de ensayo homogéneo incluye la adición del reactivo solo (reactivo CellTiter-Glo®) directamente a las células cultivados en medio suplementado con suero.
El formato "agregar-mezclar-medir" homogéneo produce lisis celular y generación de una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. El sustrato, luciferina de escarabajo, se descarboxila oxidativamente por luciferasa de luciérnaga recombinante en la conversión concomitante de ATP a AMP y la generación de fotones. Las células viables se reflejan en unidades de luminiscencia relativa (RLU) . Los datos se pueden registrar con luminómetro o dispositivo de imágenes de cámara CCD. El resultado de luminiscencia se presenta como RLU, medido durante el tiempo. El % de RLU es el porcentaje de RLU normalizado en comparación con un control "conjugado no fármaco" . En forma alternativa, los fotones de luminiscencia se pueden contar en un contador de centelleo en presencia de un centellador. Las unidades de luz se pueden representar luego como CPS (cuentas por segundo) .
La eficacia de los conjugados de anticuerpo humanizado-fármaco se mide por un ensayo de proliferación celular que emplea el siguiente protocolo, adaptado del ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo, Promega Corp. Technical bulletin TB288; Mendoza y otros., Cáncer Res., 62: 5485-5488 (2002)): 1. Una alícuota de 50 µ? de cultivo celular que contiene aproximadamente 75,000 células 0PM2. CMV . PD . FcRH5. SP .2 en el medio se deposita en cada cavidad de una placa de pared opaca de 96 cavidades. 2. Se añadió hulOA8 o tio-HC (A118C) -hu-anti-FcRH5 (10A8) Ab o ADC (50 ul) a los cavidades experimentales por triplicado hasta una concentración final de 10000, 3333, 1111, 370, 123, 41, 14, 4.6 ó 1.5 ng/ml , con cavidades "conjugado no fármaco" control que reciben medio solo y se incubaron durante 3 días . 3. Las placas se equilibran a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. 4. Se agrega reactivo CellTiter-Glo (100 µ?) . 5. Los contenidos se mezclan durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir lisis celular. 6. La placa se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal de luminiscencia. 7. La luminiscencia se registra e informa en gráficos como % de RLU (unidades de luminiscencia relativas) . 8. Como control, se corrió la misma línea celular en paralelo con no unión irrelevante hu-anti-Her2 , 4D5 Ab o ADC (que incluye hu-anti-Her2 , 4D5-Desnudo, hu-anti-Her2,4D5.HC.A118C-Desnudo hu anti-Her2 , 4D5-SPDB-DM4 , hu anti-Her2 , 4D5.HC.A118C-MC-VC-PAB-MMAE) .
Medio: las células 0PM2. CMV. PS . FcRH5. SP, 2 se cultivan en RPMI1640/20% de FBS/2 mM de glutamina/1.0 ug/ml de puromicina.
La eficacia de los conjugados de anticuerpo y fármaco en ratón se muestra en las Figuras 31 y 32. Los resultados de este ensayo se expresan en mg/ml como la IC50. La IC50 es la concentración del anticuerpo o ADC necesaria para un 50% de inhibición del crecimiento celular. hulOA8 no conjugado y tio-hu anti-FcRH5 (10A8) -HC (A118C) no muestran inhibición del crecimiento celular in vitro en las células 0PM2. CMV . PS . FcRH5. SP .2 con la IC50 de 10 mg/ml (el límite superior de la titulación de concentración del ensayo) . Hu anti-FcRH5 (10A8) -SPDB-DM4 y tio-hu anti-FcRH5 ( 10A8 ) -HC (A118C) -MC-vc-PAB-MMAE mostraron la inhibición del crecimiento de las células 0PM2. CMV. PS . FcRH5. SP .2 a las IC50 de 0.03 y 0.04 mg/ml, respectivamente. Por otra parte, hu anti-FcRH5 (10A8) -SPDB-DM4 causa completa inhibición del crecimiento de las células 0PM2. CMV . PS . FcRH5. SP .2 a concentraciones mayores. De los anticuerpos de control y los ADC, solo hu anti-Her2 , 4D5-SPDB DM4 muestra la inhibición del crecimiento de las células OPM2. CMV. PS . FcRH5. SP .2 con una IC50 de 1.8 mg/ml. Como SPDB DM4 es un enlazador de fármaco escindible, esta inhibición del crecimiento es más probablemente por actividad del fármaco presencial.
EJEMPLO 8: Ensayo para la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por los conjugados de anti-FcRH5 humanizado y fármaco A. Xenoinjertos Para analizar la eficacia del conjugado de (10A8) humanizado y fármaco (hu An i-FcRH5 ( 10A8 ) -MC-vc-PAB-MMAE) en combinación con Velcade® (bortezomib) , se analizaron los efectos del anticuerpo conjugado, solo y en combinación con Velcade®, sobre los tumores (xenoinjerto de OPM2-FcRH5 de mieloma múltiple) en ratones.
Específicamente, se examinó la capacidad del anticuerpo y Velcade® para remitir tumores en las células 0PM2 (línea celular de mieloma múltiple) transfectadas en forma estable con FcRH5 humano. Después de la transfeccion de pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5 linearizado en las células 0PM2 y selección con puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) , se separaron las células sobrevivientes para expresar FcRH5 en las células con anti-FcRH5 , 7D11 marcado con biotina (Pierce Biotechnology, Rockford, II) y microesferas de anti-biotina MACS en una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) . Después de la separación la expresión de FcRH5 se confirmó por análisis de FACS usando anticuerpos anti-FcRH5 (10A8) y una línea celular 0P 2 transfectada, de la misma manera, con el vector vacío pRK. CMV. PD . nbe como control negativo.
Para el análisis de eficacia de hu anti-FcRH5 10A8 conjugado con MC-vc-PAB-MMAE solo y en combinación con Velcade®, se inocularon ratones hembra CB17 ICR SCID (6-8 semanas de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) por vía subcutánea con 2 X 107 células OPM2-FcRH, por medio de inyección en los flancos de ratones CB17 ICR SCID y los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 331 mm3. El día 0 se refiere al día en que los tumores alcanzaron 172-511 mm3 y cuando se administró la primera/o única dosis de tratamiento, a menos que se indique específicamente otra cosa a continuación. Se calculó el volumen tumoral sobre la base de dos dimensiones, medidas mediante calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V= 0.5a X b2, donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental se expresaron como media + SE. Los ratones se aleatorizaron en nueve grupos de 9 ratones cada uno y se dosificaron. El grupo 1 recibió una inyección (IV) única de regulador de pH de histidina el día 0 más inyecciones IV de 0.9% de cloruro de sodio (salina) dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10 como control de portador. El grupo 2 recibió una inyección (IV) única de 10 mg/kg de Hu anti-Her2 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1135, en el día 0 como control de conjugado. El grupo 3 recibió inyecciones IV de 1 mg/kg Velcade® dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10. El grupo 4-5 recibió una inyección (IV) única de 4 o 10 mg/kg tio hu anti-FcRH5 (10A8) -HC-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1465, respectivamente, en el día 0. El grupo 6-7 recibió una inyección (IV) única de 4 o 10 mg/kg hu anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1575, respectivamente, en el día 0. El grupo 8 recibió una inyección (IV) única de 4 mg/kg de hu anti-FcRH5 (10A8) -MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1575, en el día 0 más inyecciones IV de 1 mg/kg Velcade® dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10. Los tumores se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Los pesos corporales de los ratones se midieron dos veces por semana durante las primeras tres semanas . Los ratones se sacrificaron antes que los volúmenes del tumor alcanzaran 3000 mm3 o cuando los tumores mostraron signos de ulceración inminente. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) .
Los controles negativos incluyeron conjugados basados en anti-HER2 (HERCEPTIN®) (trastuzumab) ) (MC-vc-PAB-MMAE) .
B. Resultados 1. Xenoinjertos de 0PM2-FcRH5 En un tratamiento de 45 días con el conjugado de fármaco solo y en combinación con Velcade®, hulOA8 conjugado con -MC-vc-PAB-MMAE (hu anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MC-vc-PAB-MMAE) combinado con Velcade® mostró inhibición del crecimiento tumoral en ratones SCID con tumores de OPM2-FcRH5 en comparación con el control negativo, conjugado de anti-Her2 humanizado con -MC-vc-PAB-MMAE (Hu anti-Her2 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE) (Figura 39) . Los ADC se administraron en una dosis única en el día 0 para todos los conjugados de fármacos y controles. Se administró Velcade® dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10. Adicionalmente, 4 mg/kg de Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE en combinación con 1 mg/kg de Velcade® inhibieron significativamente el crecimiento tumoral en comparación con el los grupos de agente solo dosificados con Tio Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE a 4 y 10 mg/kg, Hu anti-FcRH5 10A8-MC-VC-PAB-MMAE a 4 y 10 mg/kg, y Velcade® a 1 mg/kg (Figura 39) .
Además, en el mismo estudio, se determinó el porcentaje de cambio de peso corporal en los primeros 24 días en cada grupo de dosis (Figura 40) . Los resultados indicaron que la administración de Velcade® causó disminución del peso corporal o pérdida de peso durante el tratamiento, pero el rebote de peso después de la dosificación fue completa.
Aún adicionalmente , en la Tabla 14, se indica el número de ratones respecto del número total de ensayados que muestra regresión parcial (PR, cuando el volumen del tumor en algún momento después de la administración disminuyó por debajo del 50% del volumen de tumor medido en el día 0) , Remisión completa (CR, cuando en algún momento después de la administración el volumen del tumor disminuyó a 0 mm3) (NA = No aplicable) ; (TI = número de tumores observables al fin del estudio) .
Tabla 14.
Anticuerpo administrado TI PR CR Dosis del Dosis Relación (Tratamiento) fármaco de Ab del MMAE (mg/kg) fármaco ( g/m2) (Fármaco /Ab) Vehículo* 9/9 0 0 N/A N/A N/A Hu anti-Her2 Trastuzumab-MC-vc- 9/9 0 0 432 10 2.9 PAB-MMAE Anticuerpo administrado TI PR CR Dosis del Dosis Relación (Tratamiento) f rmaco de Ab del MMAE (mg/kg) ármaco (ug/m2) (Fármaco /Ab) Velcade® 9/9 0 0 N/A 1 N/A ÍO HU anti-FcRH5 10A8 HC-MC-VC- 9/9 0 0 112 4 1.94 PAB-MMAE TÍO HU anti-FcRH5 10A8 HC-MC-vc- 9/9 3 0 280 10 1.94 PAB-MMAE Hu anti-FcRH5 10A8-MC-VC-PAB- 9/9 0 0 198 4 3.44 MMAE Hu anti-FcRH5 10A8-MC-VC-PAB- 9/9 6 0 496 10 3.44 MMAE Hu antí-FcRH5 10A8-MC-VC-PAB- 7/8 6 3 496 4 / 1 3.44 / N/A MMAE (4 mg/kg) + Velcade® (1 mg/kg) * Vehículo = acetato de histidina 20 mM, 240 mM de sacarosa, 0.02% PS20, pH 5.5 EJEMPLO 9 ; Ensayo para la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por los conjugados de anti-÷FcRH5 humanizado y fármaco A. Xenoinjertos Para analizar la eficacia de conjugado de fármaco humanizado (10A8) (Hu Anti-FcRH5 10A8-SPDB-DM4 ) en combinación con Velcade®, se analizaron los efectos del anticuerpo conjugado, solo y en combinación con Velcade®, sobre los tumores (xenoinjerto de OPM2-FcRH5 de mieloma múltiple) en ratones.
Específicamente, se examinó la capacidad del anticuerpo y Velcade® para remitir tumores en las células 0PM2 (Línea celular de mieloma múltiple) transfectada en forma estable con FcRH5 humano. Después de la transfeccion de pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5 linearizado en las células OPM2 y la selección con puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) , se separaron las células sobrevivientes para expresar FcRH5 en las células con anti-FcRH5 , 7D11 marcado con biotina (Pierce Biotechnology, Rockford, II) y microesferas de anti-biotina MACS en una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) . Después de la separación la expresión de FcRH5 se confirmó por análisis de FACS usando anticuerpos anti-FcRH5 (10A8) y una línea celular OPM2 transfectada, de la misma manera, con el vector vacío pRK. CMV. PD . nbe como control negativo.
Para el análisis de eficacia de Hu anti-FcRH5 10A8 conjugado a -SPDB-DM4 solo y en combinación con Velcade®, se inocularon ratones hembra CB17 ICR SCID (6-8 semanas de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) por vía subcutánea con 2 X 107 células OPM2-FcRH5, por medio de inyección en los flancos de ratones CB17 ICR SCID y los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 306 mm3. El día 0 se refiere al día en que los tumores alcanzaron 197-499 mm3 y cuando se administró la primera/o única dosis de tratamiento, a menos que se indique específicamente otra cosa a continuación. Se calculó el volumen tumoral sobre la base de dos dimensiones, medidas mediante calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V= 0.5a X b2, donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental se expresaron como media + SE. Los ratones se aleatorizaron en seis grupos de 9 ratones cada uno y se dosificaron. El grupo 1 recibió inyecciones intravenosas (IV) de 1 mg/kg Velcade® dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10. El grupo 2 recibió una inyección (IV) única de regulador de pH de histidina en el día 0 plus inyecciones IV de 0,9% cloruro de sodio (salina) dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10 como control de portador. El grupo 3 recibió una inyección (IV) única de 4 mg/kg de Hu anti-Her2 Trastuzumab-SPDB-DM4, CNJ 1433, en el día 0 como control de conjugado. El grupo 4 recibió una inyección (IV) única de 4 mg/kg Hu de anti-FcRH5 10A8 SPDB-DM4 , CNJ 1503, en el día 0. El grupo 5 recibió una inyección (IV) única de 4 mg/kg de Hu anti-Her2 Trastuzumab-SPDB-D 4 , CNJ 1433, en el día 0 más inyecciones IV de 1 mg/kg Velcade® dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10. El grupo 6 recibió una inyección (IV) única de 4 mg/kg de Hu anti-FcRH5 10A8 SPDB-DM4 , CNJ 1503, en el día 0 plus inyecciones IV de 1 mg/kg Velcade® dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10. Los tumores se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Los pesos corporales de los ratones se midieron dos veces por semana durante las primeras tres semanas. Los ratones se sacrificaron antes que los volúmenes del tumor alcanzaran 3000 mm3 o cuando los tumores mostraron signos de ulceración inminente. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) .
Los controles negativos incluyeron conjugados basados en anti-HER2 (HERCEPTIN®) (trastuzumab) ) (SPDB-DM4) .
B. Resultados 1. Xenoinjertos de OPM2-FcRH5 En un tratamiento de 37 días con el conjugado de fármaco solo y en combinación con Velcade®, anti-FcRH5 humanizado (10A8) conjugado con -SPDB-DM4 (Hu anti-FcRH5 10A8-SPDB-DM4 ) combinado con Velcade® mostró inhibición del crecimiento tumoral en ratones SCID con tumores de OPM2-FcRH5 en comparación con el control negativo, conjugado de anti-Her2 humanizado con -SPDB-DM4 (Hu anti-Her2 Trastuzumab- SPDB-DM4. ) (Figura 41) Los ADC se administraron en una dosis única en el día 0 para todos los conjugados de fármacos y controles. Se administró Velcade® dos veces por semana durante dos semanas en los días 0, 3, 7, y 10. Adicionalmente , 4 mg/kg de Hu anti-FcRH5 10A8-SPDB-DM4 en combinación con 1 mg/kg de Velcade® inhibieron significativamente el crecimiento tumoral en comparación con el grupo dosificado con el agente solo con Hu anti-FcRH5 10A8-SPDB-DM4 a 4 mg/kg y Velcade® a 1 mg/kg y el grupo de combinación dosificado con Hu anti-Her2 Trastuzumab-SPDB-DM4 más Velcade® a 1 mg/kg. (Figura 41) .
Además, en el mismo estudio, se determinó el porcentaje de cambio de peso corporal en los primeros 21 días en cada grupo de dosis. (Figura 42) Los resultados indicaron que la administración del anti-FcRH5 humanizado ADC y Velcade® no causó reducción significativa del peso corporal o pérdida de peso durante este tiempo.
Aún adicionalmente, en la Tabla 15, se indica el número de ratones respecto del número total de ensayados que muestra regresión parcial (PR, cuando el volumen del tumor en algún momento después de la administración disminuyó por debajo del 50% del volumen de tumor medido en el día 0) , Remisión completa (CR, cuando en algún momento después de la administración el volumen del tumor disminuyó a 0 mm3 ) (NA = No aplicable) ; (TI = número de tumores observables al fin del estudio) .
Tabla 15.
* Vehículo = acetato de histidina 20 mM, 240 mM de sacarosa, 0.02% PS20, pH 5.5 EJEMPLO 10 ; Ensayo para la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por los conjugados de anti-FcRH5 humanizado y fármaco A. Xenoinjertos Para analizar la eficacia de conjugado de (10A8) humanizado y fármaco (Hu Anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE) en combinación con Revlimid® y Revlimid® más dexametasona, se analizaron los efectos del anticuerpo conjugado en combinación con Revlimid® y Revlimid® más dexametasona, en tumores (xenoinjerto de 0P 2-FcRH5 de mieloma múltiple) de ratones .
Específicamente, se examinó la capacidad del anticuerpo en combinación con Revlimid® y Revlimid® más dexametasona para remitir tumores en las células 0PM2 (línea celular de mieloma múltiple) transfectada en forma estable con FcRH5 humano. Después de la transfección de pRK. CMV. PD . nbe . FcRH5 linearizado en las células 0PM2 y la selección con puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) , se separaron las células sobrevivientes para expresar FcRH5 en las células con anti-FcRH5 , 7D11 marcado con biotina (Pierce Biotechnology, Rockford, II) y microesferas de anti-biotina MACS en una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca) . Después de la separación la expresión de FcRH5 se confirmó por análisis de FACS usando anticuerpos anti-FcRH5 (10A8) y una línea celular 0PM2 transfectada, de la misma manera, con el vector vacío pRK. CMV. PD . nbe como control negativo.
Para el análisis de eficacia de Hu anti-FcRH5 10A8 conjugado a -MC-vc-PAB-MMAE en combinación con Revlimid® y Revlimid® más dexametasona, se inocularon ratones hembra CB17 ICR SCID (6-8 semanas de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) por vía subcutánea con 2 X 107 células 0PM2-FcRH5, por medio de inyección en los flancos de ratones CB17 ICR SCID y los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 446 rara3. El día 0 se refiere al día en que los tumores alcanzaron 263-630 mm3 y cuando se administró la primera/o única dosis de tratamiento, a menos que se indique específicamente otra cosa a continuación. Se calculó el volumen tumoral sobre la base de dos dimensiones, medidas mediante calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V= 0.5a X b2, donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental se expresaron como media + SE. Los ratones se aleatorizaron en nueve el grupos de 8 ratones cada uno y se dosificaron. El grupo 1 recibió inyecciones intraperitoneales (IP) diarias de una mezcla de D SO y regulador de pH de MCT en los días 0-13 como control de portador. El grupo 2 recibió una inyección intravenosa (IV) única de 6 mg/kg de Hu anti-Her2 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1135, en el día 0 como control de conjugado. El grupo 3 recibió una inyección (IV) única de 6 mg/kg Hu anti-FcRH5 10A8-MC-VC-PAB-MMAE, CNJ 1672, en el día 0. El grupo 4 recibió inyecciones IP diarias de 50 mg/kg Revlimid® en los días 0-13. El grupo 5 recibió una dosis oral (PO) diaria de 3 mg/kg dexametasona durante cuatro días seguido por tres días suspendido durante dos ciclos en los días 0-3 y 7-10. El grupo 6 recibió inyecciones IP diarias de 50 mg/kg de Revlimid® en los días 0-13 más dosis PO diaria de 3 mg/kg de dexametasona durante cuatro días seguido por tres días suspendida por dos ciclos en los días 0-3 y 7-10. El grupo 7 recibió una inyección (IV) única de 6 mg/kg de Hu anti-Her2 Trastuzumab- C-vc-PAB-MMAE, CNJ 1135, en el día O más inyecciones IP diarias de 50 mg/kg de Revlimid® en los días 0-13 y dosis PO diaria de 3 mg/kg de dexametasona durante cuatro días seguido por tres días suspendido por dos ciclos en los días 0-3 y 7-10. El grupo 8 recibió una inyección (IV) única de 6 mg/kg de Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE, CNJ 1672, en el día 0 más inyecciones IP diarias de 50 mg/kg de Revlimid® en los días 0-13 y dosis PO diaria de 3 mg/kg de dexametasona durante cuatro días seguido por tres días suspendido por dos ciclos en los días 0-3 y 7-10. El grupo 9 recibió una inyección (IV) única de 6 mg/kg Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB- MAE, CNJ 1672, en el día 0 más inyecciones IP diarias de 50 mg/kg Revlimid® en los días 0-13. Los tumores se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Los pesos corporales de los ratones se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Si los ratones experimentaron una pérdida de peso corporal de más de 15% en comparación con su peso corporal en el día 0, los ratones se pesaron en forma diaria hasta recuperar peso o hasta que la pérdida de peso corporal fue mayor de 20%. Los ratones se sacrificaron cuanto tuvieron una pérdida de peso corporal mayor de 20% en comparación con su peso corporal en el día 0, antes de que los volúmenes del tumor alcanzaran 3000 mm3, o cuando los tumores mostraron signos de ulceración inminente.
Todos los protocolos de animales fueron aprobados por Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) .
Los controles negativos incluyeron conjugado basado en anti-HER2 (HERCEPTIN®) (trastuzumab) (MC-vc-PAB-MMAE) .
B. Resultados 1. Xenoinjertos de 0PM2-FcRH5 En un tratamiento de 38 días con el conjugado de fármaco en combinación con Revlimid® y Revlimid® más dexametasona, anti-FcRH5 humanizado (10A8) conjugado con -MC-vc-PAB-MMAE (Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE) combinado con Revlimid® y Revlimid® más dexametasona mostró inhibición del crecimiento tumoral en ratones SCID con tumores de OPM2-FcRH5 en comparación con el control negativo, anti-HER2 humanizado conjugado con -MC-vc-PAB-MMAE (Hu anti-Her2 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE) . (Figura 43) Los ADC se administraron en una dosis única en el día 0 para todos los conjugados de fármacos y controles. Se administró Revlimid® como inyecciones IP diarias de 50 mg/kg de Revlimid® en los días 0-13. La dexametasona se administró en forma de dosis PO diarias de dexametasona durante cuatro días seguido por tres días suspendido en dos ciclos de los días 0-3 y 7-10. Adicionalmente , 6 mg/kg de Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE en combinación con 50 mg/kg de Revlimid® y 6 mg/kg de Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE en combinación con 50 mg/kg de Revlimid® más 3 mg/kg dexametasona inhibieron significativamente el crecimiento tumoral en comparación con el grupo dosificado con el agente solo con 6 mg/kg de Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE , 50 mg/kg de Revlimid® (lenalidomida) y 3 mg/kg de dexametasona . (Figura 43).
Además, en el mismo estudio, se determinó el porcentaje de cambio de peso corporal en los primeros 17 días en cada grupo de dosis. (Figura 44) Los resultados indicaron que la administración de dexametasona y Revlimid® causó una disminución significativa del peso corporal o pérdida de peso Aún adicionalmente, en la Tabla 16, se indica el número de ratones respecto del número total de ensayados que muestra regresión parcial (PR, cuando el volumen del tumor en algún momento después de la administración disminuyó por debajo del 50% del volumen de tumor medido en el día 0) , Remisión completa (CR, cuando en algún momento después de la administración el volumen del tumor disminuyó a 0 mm3) (NA = No aplicable) (TI = número de tumores observables al fin del estudio) .
Tabla 16.
Anticuerpo administrado TI PR CR Dosis del Dosis Relación (Tratamiento) fármaco de Ab del fármaco MMAE (mg/kg) (Fármaco ( g/m2) /Ab) Vehículo (DMSO + 7/7 0 0 N/A N/A N/A regulador de pH de MCT) Anticuerpo administrado TI PR CR Dosis del DOSÍS Relación (Tratamiento) rmaco de Ab del fármaco MMAE (mg/kg) (Fármaco (ug/m2) /Ab) Hu anti-Her2 8/8 0 0 259 6 2.9 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (iv única) Hu anti-FcRH5 10A8-MC- 7/7 2 0 294 6 3.4 vc-PAB-MMAE (iv única) Revlimid (ip qdX13) 4/4 0 0 N/A 50 N/A dexametasona (po qdX4 5/5 0 0 N/A 3 N/A para 3 ciclos en un esquema 4/3/4/3/4e) Revlimid + dexametasona 5/5 3 0 N/A 50 / 3 N/A Hu anti-Her2 6/6 4 0 259 6 / 50 108 Trastuzumab-MC-vc-PAB- / 3 MMAE + Revlimid, + dexametasona Hu anti-FcRH5 10A8-MC- 4/4 8 0 294 6 / 50 3.4 vc-PAB-MMAE + Revlimid + / 3 dexametasona Hu anti-FcRH5 10A8-MC- 4/4 8 0 294 6 / 50 3.4 vc-PAB-MMAE + Revlimid La siguiente especificación se considera que suficiente para permitir al experto en la técnica practicar la invención. La presente invención no está limitada en alcance por el constructo depositado, debido a que la modalidad depositada se considera como una mera ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquiera de los constructos que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. El depósito de material de la presente no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente es inadecuada para permitir la práctica de algún aspecto de la invención, lo que incluye el mejor modo de este, ni se interpreta como una limitación del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que esta representa. En efecto, varias modificaciones de la invención además de las que se muestran y describen en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción y se incluyen en el alcance de las reivindicaciones anexas.
Ejemplo 11: Producción y caracterización de anticuerpos biespecí fieos FcRH5 Construcción y producción de anticuerpos anti- CD3/FcRH5 biespecífieos . La construcción de un anticuerpo de FcRH5 biespecífico, específicamente un anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico protuberancia dentro de la cavidad se describe a continuación.
Varios anticuerpos biespecíficos protuberancia dentro de la cavidad se han descrito anteriormente. Ver, por ejemplo, patentes U.S. Nos. 5,731,168 y 7,183,076; Ridgway y otros., Prot. Eng. 9:617-621 (1996); Atwell y otros., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997); Merchant y otros., Nat . Biotechn. 16:677-681 (1998). En ciertos casos, la interfase CH3 entre la quimera humanizada anti-CD3/CD4-IgG previamente descrita por Chamow y otros. J . Inmunol . 153:4268 (1994) fue manipulada genéticamente para maximizar el porcentaje de heteromultímeros que podrían recuperarse de las líneas celulares de mamíferos cotransfectadas con los constructos de expresión. Como se usa en la presente, "heteromultímeros" se refiere a una molécula, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, que comprende al menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido en al menos un residuo de aminoácido.
Como se describe en los documentos citados en el párrafo precedente, la estrategia usada para dirigir la formación de heteromultímeros residió en introducir una o más mutaciones de "protuberancia" en un primer polipéptido, por ejemplo, el dominio CH3 de una cadena H del anticuerpo, y también introducir una o más mutaciones de "cavidad" correspondientes en un segundo polipéptido, por ejemplo, el dominio CH3 de una segunda cadena H del anticuerpo. Una mutación en la "protuberancia" reemplazó un aminoácido pequeño con uno más grande y una mutación en la "cavidad" reemplazó un aminoácido grande con uno más pequeño. Por otra parte, además de las mutaciones en protuberancia y cavidad, se introdujeron residuos que contienen tiol libre en la interfase de dos polipéptidos , por ejemplo, dos dominios CH3 , los que demostraron aumentar la formación de heteromultímeros Se han descrito varios ejemplos de mutaciones en la protuberancia dentro de la cavidad y residuos que contiene tiol libre introducidos en las interfases del polipéptido. Ver, por ejemplo, patentes U.S. Nos. 5,731,168 y 7,183,076; Ridgway y otros., Prot . Eng. 9:617-621 (1996); Atwell y otros., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997); Merchant y otros., Nat. Biotechn. 16:677-681 (1998) .
Las siguientes etapas se llevan a cabo para producir un anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico . Se construyen plásmidos de expresión de E. coli que codifican variantes de cadena ligera (L) y pesada (H) anti-CD3 humanizadas del Ab UCHT1 monoclonal anti-CD3 murino (patentes U.S. Nos. 5.821.337 y 6.407.213; Shalaby y otros., J. Exp . Med. 175: 217
[1992] y Rodrigues y otros., Int. J. Cáncer (Suppl.) 7: 45
[1992]). Muchos plásmidos de expresión de E. coli adecuados son conocidas en la a técnica, que incluyen pAK19. Cárter y otros., Bio/Tehcnology 10:163-167 (1992) . La introducción de una mutación en una protuberancia o una cavidad del dominio CH3 (como se describió anteriormente) de la cadena H anti-CD3 humanizado, se realiza por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio. Los métodos de mutagénesis dirigidos al sitio son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel y otros., Methods Enzymol . 154:367-382 (1987). Además, se construyen los plásmidos de expresión de E. coli que codifican las cadenas ligera y pesada de anti-FcRH5 humanizado, tal como las cadenas ligeras y pesadas de anti-FcRH5 humanizado descritas en la presente. La introducción de una mutación en una cavidad correspondiente (si el dominio de CH3 anti-CD3 tiene una mutación en la protuberancia) o en una protuberancia correspondiente (si el dominio CH3 anti-CD3 tiene una mutación en la cavidad) del dominio CH3 (como se describió anteriormente) de la cadena H del anti-FcRH5 humanizado se realiza, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio.
Los anticuerpos biespecífieos anti-CD3/FcRH5 se producen por la transformación de los plásmidos de expresión de E. coli descritos anteriormente en una cepa de E. coli apropiada, por ejemplo, 33B6, usando métodos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Rodrigues y otros., Cáncer Res. 55:63-70 (1995). El anticuerpo se secreta por E. coli transformado cultivada en un termentador de 10 L como se describió previamente. Cárter y otros., Bio/Technology 10:163-167 (1992). Los anticuerpos se purifican y analizan usando procedimientos en la técnica. Ver, por ejemplo, Atwell y Otros., J. Mol. Biol . 270:26-35 (1997).
Ensayo de unión celular: para evaluar la capacidad de anticuerpos anti-CD3/FcRH5 biespecífieos para unir las células B y células T, las células blancas de sangre periférica humana se aislan de sangre entera de donadores sanos usando un gradiente de Ficoll de acuerdo con procedimientos estándares conocidos en la técnica. Aproximadamente 1 millón de células se incuban con anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico en hielo en un regulador de pH que contiene 0.5% de BSA y 2 mM de EDTA en PBS . Las células luego se lavan y tiñen con (Fab')2 de IgG anti-humana de cabra conjugada con FIT, junto con anticuerpos anti-CD8-APC y anti-CD138-PE y anti-CD38-PerCP-Ci5 siguiendo el protocolo del fabricante (BD Biosciences, San Diego, CA) . Las actividades de unión se evalúan en un ensayo basado en FACS usando citómetro de flujo FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Diego, CA) y el análisis se realiza usando un software Flowjo (TreeStar Ashland, O) .
Ensayo de destrucción celular in vitro: Las células de mieloma múltiple EJM-FcRH5. LSP .2 (células EJM, DSMZ ACC-560, transíectadas en forma estable con FcRH5 humano) se usan como células objetivo y se cocultivan con células blancas de sangre periférica humanas totales o células T CD8+. Si se usan células T CD8+, se purifican de PBMC humanos por separación negativa usando un kit de aislamiento de células T CD8+, (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) en placas de parte inferior curva de 96 cavidades. Se añaden 20.000 células EJM-FcRH5.LSP.2 por cavidad con una relación de células objetivo: efectoras = 1:10, con o sin anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico . Después de aproximadamente 19 horas, las células se tiñen con anti-CD38-marcado con FITC y anti-CD138-PE siguiendo el protocolo del fabricante (BD Biosciences, San Diego, CA) y se mezcló con microesferas YG de 6 micrones de calidad de calibración Fluoresbrite® (Polisciences, Inc., Warrington, PA) . El análisis de FACS se realiza por la activación de los dispersores frontal/lateral y la tinción con CD38-CD138. Las células muertas se excluyen usando tinción de yoduro de propidio de acuerdo con los procedimientos del protocolo. La actividad de destrucción específica del anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación: % de destrucción específica = (1- número de células vivas EJM-FCRH5.LSP.2 con tratamiento / cantidad de células EJM-FCRH5.LSP.2 vivas en el efector & EJM-FCRH5. LSP .2 sin anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico) x 100.
Eficacia in vivo: Las células de mieloma múltiple EJM-FcRH5. LSP .2 se mezclan con células mononucleares de sangre periférica y se inyectan por vía subcutánea en el flanco torácico derecho de las ratas hembra N0D.CD17-Prkdcscid/J (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) . Los ratones inoculados luego se separan aleatoriamente en grupos control y de tratamiento. A los grupos control se administra portador o anticuerpo biespecífico de control anti-CD3/Her2. A los grupos de tratamiento se administra el anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico. Los anticuerpos biespecífieos se administran en un intervalo de 0.01 a 10 mg/kg. El control o tratamiento se administra por vía intravenosa dentro de 1-2 horas después de la inoculación celular y se repite diariamente durante 5 días consecutivos. Los tumores se miden en dos dimensiones (longitud y ancho) usando calibres dos veces por semana. Los ratones se controlan clínicamente dos veces por semana. Al fin del experimento, el tamaño del tumor de los animales tratados con el control se compara con el tamaño del tumor de los animales tratados con el anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico para evaluar la eficacia del tratamiento con anticuerpo anti-CD3/FcRH5 biespecífico.
EJEMPLO 12 : Ensayo para la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por los conjugados de anti-FcRH5 humanizado y fármaco A. Xenoinjertos Para analizar la eficacia de conjugados de hul0A8 y fármaco con MC-vc-PAB-MMAE ( "hu-Anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MC-vc-PAB-MMAE" ) a diferentes dosis, se analizaron los efectos de los anticuerpos conjugados sobre los tumores en ratones.
Específicamente, se examinó la capacidad de los anticuerpos de remitir los tumores en las células EJM (línea celular de mieloma múltiple) transfectadas en forma estable con FcRH5 humano.
Las células EJM (ACC-560) son una línea celular de mieloma múltiple humano disponible en el comercio de DSMZ (Alemania) . Como las células EJM no expresan en forma endógena FcRH5 , las células EJM se transfectaron en forma estable con FcRH5 humano, lo que origina la línea celular EJM . CMV . PD . FcRH5. LSP .2.
Para el análisis de eficacia de los conjugados de hulOA8 y fármaco con MC-vc-PAB-MMAE, se inocularon ratones hembra CB17 ICR SCID (6-8 semanas de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) por vía subcutánea con 2 X 107 células EJM2-FcRH5. LSP .2 , por medio de inyección en los flancos de ratones CB17 ICR SCID y los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 134 mm3. El día 0 se refiere al día en que los tumores tenían un promedio de 100-250 mm3 y cuando se administró la primera/o única dosis de tratamiento, a menos que se indique específicamente otra cosa a continuación. Se calculó el volumen tumoral sobre la base de dos dimensiones, medidas mediante calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V= 0.5a X b2, donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental se expresaron como media + SE. Los grupos de 8 ratones se trataron con una dosis intravenosa (i.v.) única que varía de 1 a 8 mg de ADC/kg con ADC de anti-Fc H5 o conjugados de anticuerpo y fármaco control (ADC) . Los tumores se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Los pesos corporales de los ratones se midieron una vez por semana durante 2 semanas. Los ratones se sacrificaron antes que los volúmenes del tumor alcanzaran 3000 mm3 o cuando los tumores mostraron signos de ulceración inminente. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por Inst itutional Animal Care and Use Committee (IACUC) .
Los controles negativos incluyeron el conjugado basado en anti-HER2 (HERCEPTIN® ( trastuzumab) ) (MC-vc-PAB-MMAE) . 23. Resultados 1 Xenoinjertos de E¿TM-FcRH5. LSP .2 En un tratamiento de 80 días con los conjugados y las dosis de fármacos que se muestran en la Tabla 17, anti-FcRH5 humanizado (10A8) (hulOA8) conjugado con MC-vc-PAB-MMAE ( "hu-anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MC-vc-PAB-MMAE" ) mostró inhibición del crecimiento tumoral en los ratones SCID con tumores de EJM-FcRH5.LSP.2 en comparación con el control negativo, anti-HER2 humanizado conjugado con MC-vc-PAB-MMAE ( "Hu-anti-HER2 (4D5)-MC-vc-PAB-MMAE" ) . Los ADC se administraron en una dosis única en el día 0 para todos los ADC y controles. Específicamente, todos los niveles de dosis del ADC anti-FcRH5 humanizado inhibieron significativamente el crecimiento tumoral (Figura 45) .
Además, en el mismo estudio se determinó el porcentaje de cambio de peso corporal en los primeros 7 días en cada grupo de dosis. Los resultados indicaron que la administración de estos ADC de anti-FcRH5 humanizado. Los ADC no causaron reducción significativa del peso corporal o pérdida de peso durante este tiempo (Figura 46) .
Aún adicionalmente , en la Tabla 17, se indica el número de ratones respecto del número total de ensayados que muestra regresión parcial (PR, cuando el volumen del tumor en algún momento después de la administración disminuyó por debajo del 50% del volumen de tumor medido en el día 0) , Remisión completa (CR, cuando en algún momento después de la administración el volumen del tumor disminuyó a 0 mm3) (NA = No aplicable) ; (TI = número de tumores observables al fin del estudio) .
Tabla 17 Anticuerpo administrado TI PR CR Dosis del Dosis Relación (Tratamiento) fármaco - de Ab del fármaco DM1 (mg/kg) (Fármaco (pg/m2) /Ab) Vehículo* 8/8 0 0 n/a n/a n/a Hu-An i-Her2-MC-vc-PAB-MMAE 8/8 0 0 346 8 2.9 Hu-Anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MC-vc- 4/6 1 2 49 1 3.4 Anticuerpo administrado TI PR CR Dosis del Dosis Relación (Tratamiento) fármaco - de Ab del fármaco DM1 (mg/kg) (Fármaco (pg/m2) /Ab) PAB-MMAE Hu-Anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MC-vc- 3/5 2 3 98 2 3.4 PAB-MMAE Hu-Anti-FcRH5 ( 10A8 ) -MC-vc- 8/8 7 1 196 4 3.4 PAB-MMAE Hu-Anti-FCRH5 ( 10A8 ) -MC-VC- 1/5 2 6 392 8 3.4 PAB-MMAE * Vehículo = acetato de histidina 20 mM, pH 5.5, 240 mM de sacarosa, 0.02% PS20 EJEMPLO 13 : Ensayo para la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por los conjugados de anti-FcRH5 humanizado y fármaco A. Xenoinjertos Para analizar la eficacia de los conjugados de hulOA8 y fármaco con SPDB-DM4 ( "hu-Anti-FcRH5 (10A8)- SPDB-DM4") a diferentes dosis, se analizaron los efectos de los anticuerpos conjugados sobre los tumores en ratones.
Específicamente, se examinó la capacidad de los anticuerpos de remitir los tumores en las células EJM (línea celular de mieloma múltiple) transfectada en forma estable con FcRH5 humano .
Las células EJM (ACC-560) son de una línea celular de mieloma múltiple humano disponible en el comercio que se obtiene de DSMZ (Alemania) . Como las células EJM no expresan en forma endógena FcRH5, las células EJM se transíectaron en forma estable con FcRH5 humano, dando origen la línea celular EJM . CMV . PD . FcRH5. LSP .2.
Para el análisis de eficacia de los conjugados de hulOA8 y fármaco con SPDB-DM4 , se inocularon ratones hembra CB17 ICR SCID (6-8 semanas de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) por vía subcutánea con 2 X 107 células EJM2-FcRH5.LSP.2, por medio de inyección en los flancos de ratones CB17 ICR SCID y los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 134 mm3. El día 0 se refiere al día en que los tumores tenían un promedio de 100-250 mm3 y cuando se administró la primera/o única dosis de tratamiento, a menos que se indique específicamente otra cosa a continuación. Se calculó el volumen tumoral sobre la base de dos dimensiones, medidas mediante calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V= 0.5a X b2, donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental se expresaron como media +_ SE. Los grupos de 8 ratones se trataron con una dosis intravenosa (i.v.) única que varía de 2 a 8 mg de ADC/kg de ADC con anti-FcRH5 o conjugados de anticuerpo y fármaco control (ADC) . Los tumores se midieron dos veces por semana a lo largo del experimento. Los pesos corporales de los ratones se midieron una vez por semana durante 2 semanas. Los ratones se sacrificaron antes que los volúmenes del tumor alcanzaran 3000 mm3 o cuando los tumores mostraron signos de ulceración inminente. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) .
Los controles negativos incluyeron conjugados basados en anti-HER2 (HERCEPTIN® (trastuzumab) ) (SPDB-DM4 ) .
B. Resultados 1. Xenoinjertos de E M-FcRH5. LSP .2 En un tratamiento de 24 días con los conjugados y las dosis de fármacos que se muestran en la Tabla 18, anti-FcRH5 humanizado (10A8) (hulOA8) conjugado con SPDB-DM4 ( "hu-anti-FcRH5 ( 10A8 ) -SPDB-DM4" ) mostró inhibición del crecimiento tumoral en ratones SCID con tumores EJM-FcRH5.LSP.2 en comparación con el control negativo, anti-HER2 humanizado conjugado con SPDB-DM4 ( "Hu-anti-HER2 (4D5)-SPDB-DM4") . Los ADC se administraron en una dosis única en el día 0 para todos los ADC y controles. Específicamente, 8 mg/kg del ADC de anti-FcRH5 humanizado inhibieron significativamente crecimiento tumoral (Figura 47) .
Además, en el mismo estudio, se determinó el porcentaje de cambio de peso corporal en los primeros 7 días en cada grupo de dosis. Los resultados indicaron que la administración de estos ADC anti-FcRH5 humanizado no causaron reducción significativa del peso corporal o pérdida de peso durante este tiempo (Figura 48) .
Aún adicionalmente , en la Tabla 18, se indica el número de ratones respecto del número total de ensayados que muestra regresión parcial (PR, cuando el volumen del tumor en algún momento después de la administración disminuyó por debajo del 50% del volumen de tumor medido en el día 0) , Remisión completa (CR, cuando en algún momento después de la administración el volumen del tumor disminuyó a 0 mm3) (NA = No aplicable) ; (TI = número de tumores observables al fin del estudio) .
Tabla 18 * Vehículo = acetato de histidina 20 mM, pH 5.5, 240 mM de sacarosa, 0.02% PS20 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (199)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1.- Un anticuerpo anti-FcRH5 caracterizado porque comprende : (a) al menos una secuencia de HVR seleccionada del grupo que consiste en: (i) HVR-L1 que comprende la secuencia KASQDVSTAVA (SEC ID NO : 26) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia SASYRYT (SEC ID NO: 27) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia QQHFSSPRT (SEC ID NO: 28) (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia GFTFSSYAVS (SEC ID NO: 35) (v) HVR-H2 que comprende la secuencia ATISSGGSLTFILDSVR (SEC ID NO : 36) (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia PIPDYYALDY (SEC ID NO : 37) ; y (b) al menos una variante de HVR, en donde la variante de HVR comprende la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en la SEC ID NO: 26, 27, 28,
2.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una porción de la secuencia estructural es una secuencia estructural de consenso humana .
3. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación es substitución, inserción o eliminación.
4. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una HV -H2 que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 36.
5. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque la afinidad monovalente del anticuerpo al FcRH5 humano es sustancialmente igual a la afinidad monovalente de un anticuerpo murino que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
6. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque la afinidad monovalente del anticuerpo al FcRH5 humano es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Ó 10 veces mayor que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino o quimérico que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
7. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque la afinidad monovalente del anticuerpo al FcRH5 humano es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 veces menor que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino o quimérico que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
8. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es sustancialmente igual que la afinidad de un anticuerpo humano en su forma bivalente y que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
9. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado, caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces mayor que la afinidad de un anticuerpo murino o quimérico en su forma bivalente y comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
10. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 veces menor que la afinidad de un anticuerpo murino o quimérico en su forma bivalente que comprende una secuencia variable de la cadena ligera y la cadena pesada como se describe en la Figura 9 (SEC ID NO: 18) y la Figura 10 (SEC ID NO: 20) .
11. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.4 nM.
12. - El anticuerpo anti-FcRH5 humanizado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.4 nM +/- 0.04.
13. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.2 nM.
14. - El anticuerpo anti-FcRH5 humanizado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.2 nM +/- .02.
15. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.5 nM.
16.- El anticuerpo anti-FcRH5 humanizado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente al FcRH5 humano es 0.5 nM +/- 0.1.
17. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-16, caracterizado porque la afinidad de unión se expresa como un valor de Kd.
18. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-16, caracterizado porque la afinidad de unión se mide por Biacore o radioinmunoensayo .
19.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque comprende la secuencia estructural de. consenso del subgrupo 1 ? humano.
20. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia estructural de consenso de la cadena pesada del subgrupo III.
21. - Un anticuerpo anti-FcRH5 humanizado caracterizado porque el anticuerpo humanizado cuando se conjuga a un agente citotóxico inhibe el crecimiento de células tumorales .
22.- El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo humanizado y el anticuerpo quimérico son monovalentes o bivalentes.
23. - El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo humanizado y el anticuerpo quimérico comprenden una región de Fab única enlazada a una región Fe .
24. - Un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada caracterizado porque comprende la secuencia de HVR1-HC, la HVR2-HC y/o HVR3-HC que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NOs : 35-37).
25. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el dominio variable comprende la secuencia de FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y/o FR4-HC que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NOs: 31-34) .
26. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque comprende la secuencia de CH1 y/o Fe que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NO: 38 y/o 39) .
27.- Un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena ligera caracterizado porque comprende la secuencia de HVR1-LC, la HVR2-LC y/o HVR3-LC que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NOs : 26-28).
28. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el dominio variable comprende la secuencia de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y/o FR4-LC que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NOs : 22-25) .
29. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizado porque comprende la secuencia de CL1 que se ilustra en la Figura 11 (SEC ID NO: 29) .
30. - El polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia que se ilustra en la Figura 10 (SEC ID NO: 21) .
31. - El polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia que se ilustra en la Figura 9 (SEC ID NO: 19) .
32.- El anticuerpo obtenido por el proceso caracterizado porque: (a) cultivar una célula que expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-26 y un dominio variable de la cadena ligera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29; y (b) aislar el anticuerpo de la célula cultivada.
33. - Un anticuerpo caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-26 y un dominio variable de la cadena ligera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29.
34. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque es monovalente y comprende una región de Fe .
35. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 19.
36. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 21.
37. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende uno, dos, tires o cuatro secuencias de aminoácidos estructurales seleccionadas de las SEC ID NOs : 31, 32, 33 y 34.
38. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende uno, dos, tres o cuatro secuencias de aminoácidos estructurales seleccionadas de las SEC ID NOs : 22, 23, 24 y 25.
39. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende uno, dos, tres o cuatro secuencias de aminoácidos estructurales que tienen al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un aminoácido seleccionado de las SEC ID NOs : 31, 32, 33 y 34.
40. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende uno, dos, tres o cuatro secuencias de aminoácidos estructurales que tienen al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos a un aminoácido seleccionado de las SEC ID NOs : 22, 23, 24 y 25.
41. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 21.
42. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 19.
43. - Un anticuerpo que se une al FcRH5 , caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 21.
44. - Un anticuerpo que se une al FcRH5 , caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 19.
45. - Un anticuerpo que se une al FcRH5 , caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 21 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 19.
46. - Un polinucleótido caracterizado porque codifica un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, o 163.
47. - Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46.
48. - Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 47.
49.- Un método de obtener un anticuerpo anti-FcRH5, caracterizado porque comprende (a) cultivar una célula hospedera seleccionada del grupo que comprende una células eucariótica y una célula CHO en condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido que codifica el anticuerpo, y (b) aislar el anticuerpo.
50. - Un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo que el epítopo para un anticuerpo caracterizado porque comprende un polipéptido de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 21; o una secuencia de consenso o variante sobre la base de las secuencias de aminoácidos.
51. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 50 caracterizado porque se une esencialmente al mismo epítopo que el epítopo para un anticuerpo que comprende un polipéptido de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 19; o a secuencia de consenso o variante sobre la base de las secuencias de aminoácidos.
52. - Un anticuerpo que se une al FcRH5 , caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 20 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 18.
53. - Un anticuerpo que se une al FcRH5 , caracterizado porque comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 13 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID NO: 11.
54. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, 52 o 53, caracterizado porque el FcRH5 se expresa en la superficie de una célula.
55. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la célula es una célula B.
56. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la célula B se asocia con un trastorno proliferativo de las células B.
57.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el trastorno proliferativo de las células B es un cáncer.
58.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el trastorno proliferativo de las células B se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
59. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, 52 o 53, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.
60. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo seleccionado de un fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv o (Fab' ) 2 ·
61. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque es humanizado.
62. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, 52 o 53, caracterizado porque se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de la SEC ID NO: 21 y un dominio variable de la cadena ligera de la SEC ID NO: 19.
63. - Un inmunoconjugado caracterizado porque comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, 52 o 53 unido covalentemente a un agente citotóxico .
64. - El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona de una toxina, un agente quimioterapéutico, un residuo de fármaco, un antibiótico, un isótopo radiactivo y una enzima nucleolítica .
65. - El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque que tiene la fórmula Ab-(L-D)p, caracterizado porque: (a) Ab es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, 52 o 53; (b) L es un enlazador; (c) D es un residuo de fármaco.
66. - El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque L se selecciona de 6-maleimidocaproílo (MC) , maleimidopropanoílo (MP) , valina-citrulina (val-cit) , alanina-fenilalanina (ala-phe) , p-aminobenciloxicarbonilo (PAB) , N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato (SPP) , 4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1 carboxilato de N-succinimidilo (SMCC) , éster del ácido 4- (2-Piridilditio) butíco de N-hidroxisuccinimida (SPDB) , y (4-yodo-acetil) aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB) .
67. - El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque D se selecciona del grupo que consiste en un maitansinoide , una auristatina y dolostatina .
68. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 65 y un portador farmacéuticamente aceptable.
69. - Un método de inhibir el crecimiento de una célula que expresa FcRH5 , caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53, de este modo causa la inhibición del crecimiento de la célula.
70. - El método de conformidad con la reivindicación 69 caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico .
71. - El método de conformidad con la reivindicación 69 caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
72. - Un método de tratar un sujeto que tiene cáncer, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53.
73. - El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el cáncer se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfúma de células del manto.
74. - El método de conformidad con la reivindicación 72 caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico.
75. - El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
76. - Un método de tratar un trastorno proliferativo en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53.
77. - El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el trastorno proliferativo es cáncer.
78.- El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el cáncer se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
79. - El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico.
80. - El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
81. - Un método de inhibir el crecimiento de una célula, caracterizado porque el crecimiento de la célula es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de FcRH5 , el método que comprende poner en contacto con la célula con una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53, de este modo se inhibe el crecimiento de la célula.
82. - El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico .
83. - El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
84. - Un método de tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, caracterizado porque el crecimiento del tumor es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de Fc H5 , el método que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53.
85. - El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el tumor se asocia con linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
86. - El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico .
87. - El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
88. - Un método de inhibir la proliferación de las células B caracterizado porque comprende exponer una célula a un inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 66 en condiciones permisivas para la unión del inmunoconjugado a FcRH5.
89. - El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la proliferación de las células B se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
90. - El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la célula B es un xenoinjerto.
91. - El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la exposición tiene lugar in vitro .
92. - El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la exposición tiene lugar in vivo.
93. - Un método de determinar la presencia de FcRH5 en una muestra biológica de la que se sospecha que contiene FcRH5, caracterizado porque comprende exponer la muestra a un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53, y determinar la unión de el anticuerpo a FcRH5 en la muestra en donde la unión de el anticuerpo a FcRH5 en la muestra es indicativo de la presencia de la proteína en la muestra.
94. - El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la muestra biológica es de un paciente del que se sospecha que tiene un trastorno proliferativo de las células B.
95. - El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el trastorno proliferativo de las células B se selecciona de linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto .
96.- Un método de unión de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53 a una célula que expresa FcRH5 , caracterizado porque comprende poner en contracto la célula con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53.
97. - El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico .
98. - El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento.
99. - Un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína que comprende uno o más aminoácidos de cisteína libre, en donde se prepara por un proceso que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácidos de un anticuerpo original por un aminoácido de cisteína libre, caracterizado porque el anticuerpo original es un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, 52 o 53.
100. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque uno o más aminoácidos de cisteína libre tiene un valor de reactividad del tio en el intervalo de 0.6 a 1.0.
101. -El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque es más reactivo que el anticuerpo original con un agente reactivo con tio.
102. - El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque el proceso además comprende determinar la reactividad tiol del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína por la reacción del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína con un agente reactivo con tiol; en donde el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína es más reactivo que el anticuerpo original con el agente reactivo con tiol.
103.- El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque uno o más residuos de aminoácidos de cisteína libre se ubican en una cadena ligera.
104.- El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque el anticuerpo es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína unido covalentemente a un agente citotóxico.
105.- El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona de una toxina, un agente quimioterapéutico, un residuo de fármaco, un antibiótico, un isótopo radiactivo, y una enzima nucleolítica .
106.- El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque está unido covalentemente a una marca de captura, una marca de detección o un soporte sólido.
107. - El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 106 caracterizado porque está unido covalentemente a una marca de captura de biotina.
108. - El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 106 caracterizado porque está unido covalentemente a una marca de detección de colorante fluorescente.
109. - El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el colorante fluorescente se selecciona de un tipo fluoresceína, un tipo rodamina, dansilo, Lissamina, una cianina, una ficoeritrina, Texas Red, y un análogo de este.
110. - El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 106 caracterizado porque está unido covalentemente a una marca de detección de radionúclido seleccionado de 3H, 1:LC, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, "Te, mln, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, y 213Bi.
111. - El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 106 caracterizado porque está unido covalentemente a una marca de detección por una marca de detección por un ligando quelante.
112. - El anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína de conformidad con la reivindicación 111 caracterizado porque el ligando quelante se selecciona de DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA y TETA.
113. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, 52 o 53 caracterizado porque comprende un péptido de unión al aluminio.
114. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 113, caracterizado porque el péptido de unión al aluminio se selecciona de las SEC ID NOs : 246-250.
115. - Un anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína caracterizado porque comprende uno o más aminoácidos de cisteína libre en una o más posiciones de la cadena ligera de acuerdo con la convención de numeración de Kabat y en una o más posiciones de la cadena pesada de acuerdo con la convención de numeración de Kabat y en una o más posiciones de la cadena pesada de acuerdo con la convención de numeración EU de un anticuerpo original, en donde el anticuerpo original es un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 33, 41, 52 o 53.
116. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115 caracterizado porque se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, y un anticuerpo humanizado .
117. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115 caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.
118. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 117 caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.
119. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115 caracterizado porque se selecciona de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, o un anticuerpo humanizado .
120. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115 caracterizado porque se produce en las bacterias .
121. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115 caracterizado porque se produce en las células CHO.
122. - Un método de determinar la presencia de una proteína de FcRH5 en una muestra en la que se sospecha que contiene la proteína, caracterizado porque comprende exponer la muestra a un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 111 y determinar la unión de el anticuerpo a la proteína de FcRH5 en la muestra, en donde la unión del anticuerpo a la proteína es indicativa de la presencia de la proteína en la muestra.
123. - El método de conformidad con la reivindicación 122 caracterizado porque la muestra comprende una célula que se sospecha que expresa la proteína de FcRH5.
124. - El método de conformidad con la reivindicación 120 caracterizado porque la célula es una célula B.
125. - El método de conformidad con la reivindicación 122 caracterizado porque el anticuerpo está unido covalentemente a una marca seleccionada de un colorante fluorescente, un radioisótopo, biotina, o un ligando complejante de metal.
126. - Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo anti-FcRH5 de conformidad con la reivindicación 115, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
127.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115 caracterizado porque el anticuerpo está unido covalentemente a un residuo de fármaco auristatina o maitansinoide por el cual se forma un conjugado de anticuerpo y fármaco. conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 115 caracterizado porque comprende un anticuerpo (Ab) , y un residuo de fármaco auristatina o maitansinoide (D) en donde el anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína está unido a través de uno o más aminoácidos de cisteína libre con un residuo enlazador (L) a D; el compuesto que tiene la Fórmula I:
Ab-(L-D)p i en donde p es 1, 2, 3, o 4.
129. - El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 128 caracterizado porque p es 2.
130. - El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque L tiene la fórmula: en donde : A es una unidad de extensión unida covalentemente a un tiol de la cisteína del anticuerpo manipulado genéticamente en cisteína (Ab) ; a es 0 ó 1 ; cada W es de modo independiente una unidad de aminoácido; w es un número entero que varía de 0 a 12; Y es una unidad espadadora unida covalentemente al residuo del fármaco; y y es 0 , 1 ó 2.
131.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 130 caracterizado porque tiene la fórmula: en donde PAB es para-aminobencilcarbamoílo, y R es un radical divalente seleccionado de (CH2)r, carbociclilo C3-C8, 0-(CH2)r, arileno, (CH2) r-arileno, -arileno- (CH2) T-, (CH2) r- (carbociclilo C3-C8) , (carbociclil de C3-C8) - (CH2) r, heterociclilo C3-C8, (CH2) r- (heterociclilo C3-C8, -(heterociclilo C3-C8- (CH2) r-, - (CH2) rC (O) NRb (CH2) r-, -(CH2CH20)r-, -(CH2CH20) r-CH2-, - (CH2) rC (O) NRb (CHCH20) r—, - (CH2) rC (0) NRb (CH2CH20) r-CH2-, - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2CH20) r-, -(CH2CH20)rC (0)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, y — (CH2CH20) rC (0) NR (CH2) r— ; donde Rb es H, alquilo de Ci-C6, fenilo, o bencilo; y r es de modo independiente un número entero que varía de 1 a 10.
132.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque Ww es valina-citrulina.
133.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque R17 es (CH2)5 o (CH2)2.
134.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 130 caracterizado porque tiene la fórmula:
135.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado porque R17 es (CH2)s o (CH2)2.
136.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 130 caracterizado porque tiene la fórmula: o
137. - El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque L es SMCC, SPP, SPDB o BMPEO .
138. El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 128 caracterizado porque D es MMAE, que tiene la estructura: en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L.
139.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 128 caracterizado porque D es MMAF, que tiene la estructura : en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L.
140.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque D es DM1 o DM4, que tiene las estructuras : en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L.
141.- El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo b ie spec í f ico , un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, y un fragmento de anticuerpo.
142. - El compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 127 caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab .
143. - Un compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco caracterizado porque se selecciona de las estructuras : Ab-MC-vc-PAB-M AE Ab-MC-MMAF Ab-BMPEO-DMl en donde Val es valina; Cit es citrulina; p es 1, 2, 3, o 4; y Ab es un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115.
144. - El conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la auristatina es MMAE o MMAF.
145. - El conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque L es MC-val-cit-PAB o MC.
146. - Un ensayo para detectar células B caracterizado porque comprende: (a) exponer las células a un compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 127; y (b) determinar el grado de unión del compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco a las células.
147. - Un método de inhibir la proliferación celular caracterizado porque comprende tratar las células B cancerígenas de mamífero en un medio de cultivo con un compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 127, mediante el cual se inhibe la proliferación de las células B cancerígenas.
148. - Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende el conjugado de anticuerpo y fármaco de conformidad con la reivindicación 127, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
149.- Un método de tratar cáncer caracterizado porque comprende administrar a un paciente la formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 148.
150. - El método de conformidad con la reivindicación 149, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
151. - El método de conformidad con la reivindicación 149, caracterizado porque se administra al paciente un agente citotóxico en combinación con el compuesto de conjugado de anticuerpo y fármaco.
152.- Un artículo de manufactura caracterizado porque comprende la formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 148; un recipiente; y un prospecto o rótulo que indica que el compuesto se puede usar para tratar cáncer particularizado por la sobreexpresion del polipéptido de FcRH5.
153.- El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 152 caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo reincidente, NHL indolente reincidente, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células del manto.
154.- Un método de obtener un compuesto del conjugado de anticuerpo y fármaco caracterizado porque comprende un anticuerpo anti-FcRH5 (Ab) de conformidad con la reivindicación 115, y un residuo de fármaco auristatina o maitansinoide (D) en donde el anticuerpo se une mediante uno o más aminoácidos de cisteína manipulados genéticamente por residuo enlazador (L) a D; el compuesto que tiene la Fórmula I: Ab-(L-D)p I donde p es 1, 2, 3, o 4; el método que comprende las etapas de: (a) reacción de un grupo de cisteína manipulado genéticamente del anticuerpo con un reactivo enlazador para formar un intermediario anticuerpo-enlazador Ab-L; y (b) reacción de Ab-L con un residuo de fármaco activado D; mediante el cual se forma el conjugado de anticuerpo y fármaco; o que comprende las etapas de: (c) reacción de un grupo nucleófilo de un residuo de fármaco con un reactivo enlazador para formar el intermediario fármaco-enlazador D-L; y (d) reacción de D-L con un grupo de cisteína manipulado genéticamente del anticuerpo; mediante el cual se forma el conjugado de anticuerpo y fármaco.
155. - El método de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque además comprende la etapa de expresar el anticuerpo en células de ovario de hámster chino (CHO) .
156. - El método de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque además comprende la etapa de tratar el anticuerpo expresado con un agente reductor .
157. - El método de conformidad con la reivindicación 156, caracterizado porque el agente reductor se selecciona de TCEP y DTT.
158. - El método de conformidad con la reivindicación 156, caracterizado porque además comprende la etapa de tratar el anticuerpo expresado con un agente oxidante, después de tratar con el agente reductor.
159. - El método de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque el agente oxidante se selecciona de sulfato de cobre, ácido dehidroascórbico, y aire.
160. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de alguna de la SEC ID NO: 42.
161. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 41 y a secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 42.
162. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquier SEC ID NOs : 44.
163.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 43 y una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 44.
164.- A composición caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 33, 41, 52 o 53.
165. - La composición de conformidad con la reivindicación 164, caracterizada porque comprende un portador.
166. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque una cisteína está en la posición 205 de la cadena ligera.
167. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque una cisteína está en la posición 114 de la cadena pesada.
168. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque una cisteína está en la posición 400 de la cadena pesada.
169.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la célula B se asocia con un trastorno de las células plasmáticas.
170. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque el trastorno de las células plasmáticas es un cáncer.
171. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el trastorno de las células plasmáticas se selecciona de gamopatías monoclonales de significación indeterminado (MGUS) , mieloma múltiple (MM) , macroglobulinemia, enfermedad de la cadena pesada, amiloidosis de cadena ligera sistémica (AL) , plasmocitoma solitario, plasmocitoma extramedular, plasmocitomas solitarios múltiples, leucemia de células plasmáticas, Linfornas no de Hodgkin, no células B, leucemia linfocítica crónica de células B.
172. - El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque además comprende poner en contacto la células con una cantidad efectiva de otro agente terapéutico.
173.- El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque además comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de otro agente terapéutico.
174. - El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque además comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de otro agente terapéutico .
175. - El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque además comprende poner en contacto la células con una cantidad efectiva de otro agente terapéutico.
176. - El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque además comprende poner en contacto la células con una cantidad efectiva de otro agente terapéutico.
177. - El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque además comprende exponer la célula a una cantidad efectiva de otro agente terapéutico .
178.- El método de - conformidad con la reivindicación 149, caracterizado porque además comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de otro agente terapéutico .
179.- El método de conformidad con la reivindicación 172, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna del cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento .
180. - El método de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en velcade, revlimid, tamoxifenoo, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecanoo, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib, o trastuzumab, cisplatino, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatino, paclitaxel, pemetrexed, 5-fluorouracilo, doxorubicina, bortezomib, lenalidomida , melfalina, prednisona, dexametasona, o docetaxel.
181. - El método de conformidad con la reivindicación 173, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, a agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna del cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento .
182. - El método de conformidad con la reivindicación 181, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en velcade, revlimid, tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecano, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib, o trastuzumab, cisplatino, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatino, paclitaxel, pemetrexed, 5-fluorouracilo, doxorubicina , bortezomib, lenalidomida, melfalina, prednisona, dexametasona , o docetaxel .
183. - El método de conformidad con la reivindicación 174, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, a agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor , un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna del cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento.
184. - El método de conformidad con la reivindicación 183, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en velcade, revlimid, tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecano, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib, o trastuzumab, cisplatino, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatino, paclitaxel, pemetrexed, 5-fluorouracilo , doxorubicina, bortezomib, lenalidomida, melfalina, prednisona, dexametasona, o docetaxel.
185.- El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, a agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna del cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento .
186.- El método de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en velcade, revlimid, tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecano, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib, o trastuzumab, cisplatino, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatino, paclitaxel, pemetrexed, 5-fluorouracilo, doxorubicina , bortezomib, lenalidomida, melfalina, prednisona, dexaraetasona, o docetaxel .
187.- El método de conformidad con la reivindicación 176, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, a agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna del cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento .
188. - El método de conformidad con la reivindicación 187, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en velcade, revlimid, tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecano, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib, o trastuzumab, cisplatino, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatino, paclitaxel, pemetrexed, 5-fluorouracilo, doxorubicina, bortezomib, lenalidomida, melfaliña, prednisona, dexametasona, o docetaxel.
189. - El método de conformidad con la reivindicación 177, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, a agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna del cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento.
190. - El método de conformidad con la reivindicación 189, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en velcade, revlimid, tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecano, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib, o trastuzumab, cisplatino, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatino, paclitaxel, pemetrexed, 5-fluorouracilo, doxorubicina, bortezomib, lenalidomida, melfalina, prednisona, dexametasona , o docetaxel .
191. - El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un agente quimioterapéutico, a agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna del cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento .
192. - El método de conformidad con la reivindicación 191, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en velcade, revlimid, tamoxifeno, letrozol, exemestano, anastrozol, irinotecano, cetuximab, fulvestrant, vinorelbina, erlotinib, bevacizumab, vincristina, imatinib, sorafenib, lapatinib, o trastuzumab, cisplatino, gemcitabina, metotrexato, vinblastina, carboplatino, paclitaxel, pemetrexed, 5-fluorouracilo, doxorubicina, bortezomib, lenalidomida, melfaliña, prednisona, dexametasona, o docetaxel .
193.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque es un anticuerpo biespecífico .
194.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 193, caracterizado porque se une específicamente a CD3.
195. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 194, caracterizado porque es una protuberancia dentro de la cavidad.
196. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 195, caracterizado porque está aglicosilado .
197. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque se produce en una célula hospedera de Escherichia coli.
198. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque carece de una o más funciones efectoras de Fe .
199. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 198 caracterizado porque carece de actividad ADCC.
MX2011010264A 2009-04-01 2010-03-31 Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso. MX2011010264A (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21169509P 2009-04-01 2009-04-01
US16621709P 2009-04-02 2009-04-02
US26697209P 2009-12-04 2009-12-04
PCT/US2010/029516 WO2010120561A1 (en) 2009-04-01 2010-03-31 Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2011010264A true MX2011010264A (es) 2011-10-11

Family

ID=42358044

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2011010264A MX2011010264A (es) 2009-04-01 2010-03-31 Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso.

Country Status (23)

Country Link
US (3) US8466260B2 (es)
EP (1) EP2414399A1 (es)
JP (3) JP6132548B2 (es)
KR (1) KR20120057565A (es)
CN (1) CN102471380B (es)
AR (1) AR076029A1 (es)
AU (1) AU2010236787A1 (es)
BR (1) BRPI1012676A2 (es)
CA (1) CA2757382A1 (es)
CL (1) CL2011002417A1 (es)
CO (1) CO6430468A2 (es)
CR (1) CR20110558A (es)
EC (1) ECSP11011436A (es)
IL (1) IL215402A0 (es)
MA (1) MA33256B1 (es)
MX (1) MX2011010264A (es)
NZ (1) NZ595574A (es)
PE (1) PE20120878A1 (es)
RU (1) RU2587621C2 (es)
SG (1) SG174992A1 (es)
TW (1) TW201038286A (es)
WO (1) WO2010120561A1 (es)
ZA (1) ZA201106907B (es)

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2009101T3 (en) 2006-03-31 2018-01-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody modification method for purification of a bispecific antibody
RU2016110891A (ru) 2009-04-01 2018-11-27 Дженентек, Инк. Антитела к fcrh5, их иммуноконъюгаты и способы их применения
MX2011010264A (es) 2009-04-01 2011-10-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso.
CA2772929A1 (en) 2009-09-03 2011-03-11 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring rheumatoid arthritis
PT2647707T (pt) 2010-11-30 2018-11-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapêutico indutor de toxicidade
US8741298B2 (en) 2011-02-07 2014-06-03 Neotope Biosciences Limited APOE immunotherapy
US20130109586A1 (en) * 2011-10-05 2013-05-02 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Generation of antibodies to an epitope of interest that contains a phosphomimetic amino acid
KR102398736B1 (ko) 2011-10-31 2022-05-16 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
US20140079636A1 (en) * 2012-04-16 2014-03-20 Dinesh U. Chimmanamada Targeted therapeutics
CN103254304A (zh) * 2012-05-30 2013-08-21 深圳大学 免疫激动剂偶联体、其制备方法及免疫激动剂偶联体在抗肿瘤中的应用
CN103626831A (zh) * 2012-08-22 2014-03-12 中国科学院过程工程研究所 一种聚乙二醇选择性修饰蛋白c端羧基的方法
SG11201501618WA (en) * 2012-10-24 2015-04-29 Polytherics Ltd Drug-protein conjugates
US9415118B2 (en) * 2013-03-13 2016-08-16 Novartis Ag Antibody drug conjugates
US9498532B2 (en) * 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
ES2996807T3 (en) * 2013-03-15 2025-02-13 Regeneron Pharma Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
WO2014177771A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
AR096687A1 (es) * 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
HRP20240939T1 (hr) 2013-12-17 2024-10-25 Genentech, Inc. Anti-cd3 protutijela i metode uporabe
WO2015138615A2 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Irm Llc Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
AU2015244814B2 (en) 2014-04-07 2020-12-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating antigen-binding molecule
EA201692287A1 (ru) 2014-05-13 2017-06-30 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Антигенсвязывающая молекула, перенаправляющая т-клетки на клетки, обладающие иммуносупрессорной функцией
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
CN116063565A (zh) 2014-12-05 2023-05-05 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向Fc受体样5的嵌合抗原受体及其用途
MA42428B1 (fr) 2015-06-16 2023-10-31 Hoffmann La Roche Anticorps humanisés et à maturation d'affinité dirigés contre fcrh5 et méthodes d'utilisation
JP6925278B2 (ja) 2015-11-18 2021-08-25 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
NZ743124A (en) * 2015-12-04 2022-11-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies targeting fc receptor-like 5 and methods of use
CN108368166B (zh) 2015-12-28 2023-03-28 中外制药株式会社 提高含fc区多肽纯化效率的方法
TW202342540A (zh) 2016-03-14 2023-11-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
JPWO2017188346A1 (ja) * 2016-04-27 2019-02-28 国立大学法人 東京大学 マイクロファイバーを用いた血中循環細胞の捕捉及び回収用材料及び当該材料を用いる方法
US10492904B2 (en) 2016-05-27 2019-12-03 Terumo Cardiovascular Systems Corporation Equipment for preparing valve leaflet from membrane
EP3687569A1 (en) * 2017-09-29 2020-08-05 Cell Design Labs, Inc. Methods of making bispecific anti-cd307e and anti-bcma chimeric antigen receptors and uses of the same
WO2019089848A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
JP7447006B2 (ja) 2017-11-01 2024-03-11 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）に特異的なキメラ抗原受容体
SG11202003688PA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
KR20200097253A (ko) 2017-11-01 2020-08-18 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 T 세포 조성물의 생산방법
WO2019089858A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
CN111511370A (zh) 2017-11-01 2020-08-07 朱诺治疗学股份有限公司 对b细胞成熟抗原具有特异性的抗体和嵌合抗原受体
SG11202005272SA (en) 2017-12-08 2020-07-29 Juno Therapeutics Inc Process for producing a composition of engineered t cells
WO2019113556A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Serum-free media formulation for culturing cells and methods of use thereof
KR102862251B1 (ko) 2017-12-08 2025-09-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 요법을 위한 표현형 마커 및 관련 방법
AU2019205128A1 (en) * 2018-01-04 2020-07-16 Lumosa Therapeutics Co., Ltd. Single-domain antibody-cytosine deaminase fusion proteins
EP3737692A4 (en) 2018-01-09 2021-09-29 Elstar Therapeutics, Inc. CALRETICULIN AND MODIFIED T-LYMPHOCYTES BINDING CONSTRUCTIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US20210123075A1 (en) 2018-06-08 2021-04-29 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
WO2020010250A2 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
JP7538109B2 (ja) 2018-08-09 2024-08-21 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組み込まれた核酸を評価するための方法
CN110850067B (zh) * 2018-08-21 2023-08-15 上海恒润达生生物科技股份有限公司 嵌合抗原受体亲和力检测方法
AU2019372331A1 (en) 2018-11-01 2021-05-27 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen
AU2019374103A1 (en) 2018-11-01 2021-05-20 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member D (GPRC5D)
CN113271945A (zh) 2018-12-20 2021-08-17 诺华股份有限公司 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案和药物组合
MX2021009763A (es) 2019-02-15 2021-09-08 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-il)isoindolin-2-il)piperidina -2,6-diona y usos de los mismos.
MX2021009764A (es) 2019-02-15 2021-09-08 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona sustituidos y usos de los mismos.
CN109883932B (zh) * 2019-02-18 2021-08-10 武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司 流式抗体及其制备方法和滴定方法
AU2020224681A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
CN119661722A (zh) 2019-02-21 2025-03-21 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
CA3136737A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified tgfbr2 locus, related polynucleotides and methods
BR112021021200A2 (pt) 2019-05-01 2021-12-21 Juno Therapeutics Inc Células expressando um receptor quimérico de um locus cd247 modificado, polinucleotídeos relacionados e métodos
WO2021006328A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Claudin-6 binding molecules and uses thereof
JP2023507190A (ja) 2019-12-20 2023-02-21 ノバルティス アーゲー 増殖性疾患を治療するための抗ＴＧＦβ抗体及びチェックポイント阻害薬の使用
CN110987571A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 广州金域医学检验中心有限公司 一种单克隆多聚体m蛋白解聚方法
WO2021138474A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
BR112022013577A2 (pt) * 2020-01-10 2022-09-13 Rhode Island Hospital Anticorpos pfgarp para matar parasitas da malária plasmodium falciparum e proteger contra infecções e doenças severas
AU2021251265A1 (en) 2020-04-10 2022-11-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods and uses related to cell therapy engineered with a chimeric antigen receptor targeting B-cell maturation antigen
US20230178239A1 (en) 2020-05-13 2023-06-08 Juno Therapeutics, Inc. Methods of identifying features associated with clinical response and uses thereof
EP4168007A1 (en) 2020-06-23 2023-04-26 Novartis AG Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
US20240216508A1 (en) 2020-06-26 2024-07-04 Juno Therapeutics Gmbh Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CN112285361B (zh) * 2020-09-27 2023-12-05 中国人民解放军空军军医大学 排除抗-cd38单克隆抗体药物对抗人球蛋白检测干扰的试剂
EP4240756A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
CN117693508A (zh) 2021-03-03 2024-03-12 朱诺治疗学股份有限公司 T细胞疗法和dgk抑制剂的组合
CA3214628A1 (en) * 2021-04-06 2022-10-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination therapy with dexamethasone and tumor-specific t cell engaging multi-specific antibodies for treating cancer
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
GB2623199A (en) 2021-04-08 2024-04-10 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules binding to TCR and uses thereof
TW202309294A (zh) 2021-04-27 2023-03-01 瑞士商諾華公司 病毒載體生產系統
KR20240018454A (ko) 2021-05-06 2024-02-13 주노 테라퓨틱스 게엠베하 T 세포의 자극 및 형질도입 방법
EP4337330A1 (en) 2021-05-14 2024-03-20 Genentech, Inc. Methods for treatment of cd20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
US20250101379A1 (en) 2022-01-28 2025-03-27 Juno Therapeutics, Inc. Methods of manufacturing cellular compositions
KR20240158391A (ko) 2022-02-18 2024-11-04 라쿠텐 메디칼, 인크. 항-프로그래밍된 사멸-리간드 1(pd-l1) 항체 분자, 암호화 폴리뉴클레오티드 및 사용 방법
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
US20250302954A1 (en) 2022-05-11 2025-10-02 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
EP4532695A1 (en) 2022-05-25 2025-04-09 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2023230548A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
CN120152717A (zh) 2022-09-08 2025-06-13 朱诺治疗学股份有限公司 T细胞疗法和连续或间歇dgk抑制剂给药的组合
AU2023369684A1 (en) 2022-10-26 2025-04-17 Novartis Ag Lentiviral formulations
EP4615960A1 (en) 2022-11-09 2025-09-17 C3S2 GmbH Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)
WO2024124132A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Machine learning methods for predicting cell phenotype using holographic imaging
WO2024161021A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Juno Therapeutics Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
CN116789849B (zh) * 2023-04-12 2024-03-08 南京紫珑生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用

Family Cites Families (226)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US633410A (en) 1898-09-22 1899-09-19 George A Ames Ice-cutter.
US3720760A (en) 1968-09-06 1973-03-13 Pharmacia Ab Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
JPS537514B2 (es) 1972-01-13 1978-03-18
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
ATE97498T1 (de) 1984-01-30 1993-12-15 Imp Cancer Res Tech Verbesserungen an wachstumsfaktoren.
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US5078998A (en) 1985-08-02 1992-01-07 Bevan Michael J Hybrid ligand directed to activation of cytotoxic effector T lymphocytes and target associated antigen
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4946783A (en) 1987-01-30 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Periplasmic protease mutants of Escherichia coli
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
GB8724885D0 (en) 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
WO1989005859A1 (en) 1987-12-21 1989-06-29 The Upjohn Company Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
WO1990003430A1 (en) 1988-09-23 1990-04-05 Cetus Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
DE394538T1 (de) 1989-04-28 1991-04-11 Rhein Biotech Ges. Fuer Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh, 4000 Duesseldorf Hefezellen der schwanniomyces-gattung.
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
DE68926248T2 (de) 1989-09-29 1996-12-19 Oncogene Science Inc p100 "neu" menschlisches Protein and Verwendung dieses Proteins zum Nachweis von preneoplasmatischen- oder neoplasmatischen beim Menschen
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ATE269401T1 (de) 1991-04-10 2004-07-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
EP1514934B1 (en) 1992-02-06 2008-12-31 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1993024640A2 (en) 1992-06-04 1993-12-09 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
PL174494B1 (pl) 1992-11-13 1998-08-31 Idec Pharma Corp Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chłoniaka z limfocytów B i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chłoniaka z limfocytów B
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
AU690528B2 (en) 1992-12-04 1998-04-30 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
CA2109861C (en) 1992-12-04 1999-03-16 Shu-Hui Chen 6,7-modified paclitaxels
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
PT616812E (pt) 1993-03-24 2000-04-28 Berlex Biosciences Combinacao de compostos anti-hormonais e moleculas de ligacao no tratamento do cancro
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
WO1995009864A1 (en) 1993-10-01 1995-04-13 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Novel peptide derivative
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5476847A (en) 1994-06-29 1995-12-19 Schering Corporation Derivatives of phosphinic acid useful as endothelin converting enzyme inhibitors
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
JPH10511085A (ja) 1994-12-02 1998-10-27 カイロン コーポレイション 二重特異性抗体を用いる免疫応答を促進する方法
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5548237A (en) 1995-03-10 1996-08-20 International Business Machines Corporation Process tolerant delay circuit
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
US6027888A (en) 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6184105B1 (en) 1997-05-22 2001-02-06 Advanced Micro Devices Method for post transistor isolation
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
US20030083461A1 (en) * 1997-06-16 2003-05-01 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6248564B1 (en) * 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
SI2283867T1 (sl) 1999-06-25 2014-07-31 Immunogen, Inc. Metode zdravljenja z majtanzinoidom konjugiranim protitelesom anti-ErbB
US6372907B1 (en) 1999-11-03 2002-04-16 Apptera Corporation Water-soluble rhodamine dye peptide conjugates
US7105149B1 (en) * 1999-11-29 2006-09-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of five novel genes coding for new Fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/myeloma
EP2418212B1 (en) 1999-11-29 2016-06-15 The Trustees of Columbia University in the City of New York Isolation of five novel genes coding for new fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/melanoma
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
EP1240337B1 (en) 1999-12-24 2006-08-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
TWI255272B (en) * 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
AU2002250078A1 (en) 2001-02-13 2002-08-28 Children`S Hospital Research Foundation Quantitative epstein barr virus pcr rapid assay
CU23007A1 (es) * 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
ES2431929T3 (es) 2001-09-18 2013-11-28 Genentech, Inc. Composiciones y procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US20050226869A1 (en) * 2001-10-19 2005-10-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005063299A2 (en) 2003-12-24 2005-07-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7888478B2 (en) * 2002-09-11 2011-02-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7858330B2 (en) * 2001-10-19 2010-12-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
AU2002363939A1 (en) 2001-11-20 2003-06-10 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
MXPA04012725A (es) 2002-06-20 2005-09-30 Snaptrack Inc Reduccion de interferencia cruzada en un receptor de gps y sistema de comunicacion combinado.
MXPA04012475A (es) 2002-06-21 2005-09-20 Thomson Licensing Sa Aparato enrutador de transmision linealmente expansible.
EP1575514A2 (en) 2002-07-31 2005-09-21 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
ATE499116T1 (de) 2002-08-16 2011-03-15 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CA2499300A1 (en) 2002-10-31 2004-05-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
AU2003282624A1 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
WO2004065417A2 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
US7755007B2 (en) 2003-04-17 2010-07-13 K&H Manufacturing, Inc Heated pet mat
US7432088B2 (en) 2003-05-08 2008-10-07 Immunogen Inc. Methods for the production of ansamitocins
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
BR122018071808B8 (pt) * 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
EP1753463A2 (en) * 2004-06-01 2007-02-21 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
US7521541B2 (en) * 2004-09-23 2009-04-21 Genetech Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US7999077B2 (en) * 2004-09-30 2011-08-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services IRTA2 antibodies and methods of use
US7947839B2 (en) * 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US20070134243A1 (en) * 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
AU2006204709A1 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Medarex, Inc. IRTA-2 antibodies and their uses
US7301019B2 (en) 2005-01-21 2007-11-27 Immunogen, Inc. Method for the preparation of maytansinoid esters
GB0501741D0 (en) 2005-01-27 2005-03-02 Binding Site The Ltd Antibody
US8871720B2 (en) 2005-07-07 2014-10-28 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the C-terminus
EP3498289A1 (en) 2005-07-07 2019-06-19 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus
US8039273B2 (en) 2005-07-18 2011-10-18 Seattle Genetics, Inc. β-glucuronide-linker drug conjugates
AU2006280146B2 (en) 2005-08-09 2012-06-28 Immunogen, Inc. Method of acylating maytansinol with chiral amino acids
EP2073843A4 (en) 2006-09-15 2010-07-28 Sloan Kettering Inst Cancer METHOD FOR DIAGNOSING, TREATING OR PREVENTING PLASMA CELL DISEASES
WO2008109533A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Medarex, Inc. Human antibodies that bind multiple irta family proteins, and uses thereof
RU2016110891A (ru) 2009-04-01 2018-11-27 Дженентек, Инк. Антитела к fcrh5, их иммуноконъюгаты и способы их применения
MX2011010264A (es) 2009-04-01 2011-10-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso.

Also Published As

Publication number Publication date
US9360484B2 (en) 2016-06-07
RU2011144141A (ru) 2013-05-10
US20130089555A1 (en) 2013-04-11
KR20120057565A (ko) 2012-06-05
US8466260B2 (en) 2013-06-18
EP2414399A1 (en) 2012-02-08
MA33256B1 (fr) 2012-05-02
HK1171236A1 (en) 2013-03-22
RU2587621C2 (ru) 2016-06-20
ECSP11011436A (es) 2011-12-30
JP2016063812A (ja) 2016-04-28
AR076029A1 (es) 2011-05-11
WO2010120561A1 (en) 2010-10-21
JP6132548B2 (ja) 2017-05-24
AU2010236787A1 (en) 2011-11-10
CN102471380A (zh) 2012-05-23
BRPI1012676A2 (pt) 2016-04-05
JP2017160206A (ja) 2017-09-14
IL215402A0 (en) 2011-12-29
JP2012522512A (ja) 2012-09-27
PE20120878A1 (es) 2012-08-06
CL2011002417A1 (es) 2012-03-30
CN102471380B (zh) 2015-01-14
CA2757382A1 (en) 2010-10-21
NZ595574A (en) 2013-11-29
TW201038286A (en) 2010-11-01
US8617559B2 (en) 2013-12-31
US20100260748A1 (en) 2010-10-14
SG174992A1 (en) 2011-11-28
CR20110558A (es) 2011-12-07
ZA201106907B (en) 2013-01-30
CO6430468A2 (es) 2012-04-30
US20140106374A1 (en) 2014-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10981987B2 (en) Humanized anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
US8617559B2 (en) Anti-FcRH5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
US9017951B2 (en) Anti-FcRH5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
AU2008276140C1 (en) Anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
AU2009210636B2 (en) Anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
AU2019202880A1 (en) Anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
AU2012204069B2 (en) Anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration