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MX2011007039A - Metodo para la preparacion de dioles. - Google Patents

Metodo para la preparacion de dioles.

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MX2011007039A
MX2011007039A MX2011007039A MX2011007039A MX2011007039A MX 2011007039 A MX2011007039 A MX 2011007039A MX 2011007039 A MX2011007039 A MX 2011007039A MX 2011007039 A MX2011007039 A MX 2011007039A MX 2011007039 A MX2011007039 A MX 2011007039A
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MX
Mexico
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microorganism
region
gene
hydroxy
keto
Prior art date
Application number
MX2011007039A
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English (en)
Inventor
Cedric Boisart
Philippe Soucaille
Original Assignee
Metabolic Explorer Sa
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo método para la preparación biológica de un diol que comprende cultivar un microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de un diol alifático, en donde el microorganismo comprende una vía metabólica para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático con una enzima que tiene una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa, el producto obtenido a partir de dicho paso de descarboxilación es reducido aún más en el diol alifático correspondiente, y en donde el microorganismo es genéticamente modificado para la producción mejorada de dicho metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático; la invención se refiere también a un microorganismo modificado para la producción de un diol alifático.

Description

MÉTODO PARA LA PREPARACIÓN DE DIOLES La presente invención se refiere a un nuevo método para la preparación biológica de un diol que comprende cultivar un microorganismo genéticamente modificado para la bioproduccion de un diol alifático, en donde el microorganismo comprende una vía metabólica para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático con dos enzimas: una enzima que tiene una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa y una enzima que tiene una actividad hidroxi aldehido reductasa. La invención se refiere también a un microorganismo modificado para la producción de un diol alifático.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La producción fermentativa de dioles cultivando microorganismos que producen dichos dioles es conocida en la técnica, incluyendo producción fermentativa con microorganismos genéticamente modificados para una producción mejorada de los dioles. La producción de dichos dioles se describe, entre otros, en los siguientes documentos: W01996/035796, WO2001/012833, WO2004/033646, US7267972. En particular, la producción de 1 ,3-propanodiol ya ha sido descrita, que involucra enzimas dependientes de la vitamina B12, haciendo asi el procedimiento de producción muy costoso.
Existe una necesidad continua de soluciones alternativas de microorganismos modificados, ya sea para producir dioles a partir de fuentes renovables de carbono o tener una mejora potencial en la producción de los dioles, particularmente con vías independientes de vitamina B12, o ambos. Estas mejoras técnicas pueden ser en el rendimiento total del producto que se produce con base en la energía necesaria para dicha producción y con el tiempo, el nivel de impurezas y subproductos a controlar específicamente para aislamiento del producto y su comercialización y uso adicional.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un microorganismo genéticamente modificado para la bioproduccion de un diol alifático, en donde el microorganismo comprende una vía metabólíca para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto alifático con una enzima que tiene una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa, el producto obtenido a partir de dicho paso de descarboxilación es reducido aún más en la enzima diol alifático correspondiente que tiene una actividad hidroxi aldehido reductasa, y en donde el microorganismo es genéticamente modificado para la producción mejorada de dicho metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático.
El microorganismo de la invención se selecciona generalmente de entre el grupo que consiste de una bacteria, levadura o un hongo. De preferencia, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.
De acuerdo con una primera modalidad el microorganismo comprende un gen endógeno que codifica para una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa. De preferencia se selecciona de entre Saccharomyces cerevisiae (Pdc1 , Pdc5, Pdc6, Aro10, Thi3); Lactococcus lactis (Kivd); Clostridium acetobutylicum (Pdc); Arabidopsis thaliana (Pdc2, Pdc3)¡ Pichia stipitis (Pdc1 , Pdc2, Aro10)¡ Zymomonas mobilis (Pdc); Mycobacterium tuberculosis. Este microorganismo que tiene actividad ácido 2-ceto descarboxilasa endógeno se puede modificar aún más para aumentar la expresión del gen endógeno que codifica para el ácido 2-ceto descarboxilasa.
De acuerdo con otra modalidad de la invención, el microorganismo no comprende un gen endógeno que codifica para un ácido 2-ceto descarboxilasa. Dicho microorganismo que carece de ácido 2-ceto descarboxilasa endógeno se selecciona de preferencia de entre Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum o Bacillus subtilis. Para tales microorganismos, el microorganismo de la invención comprende un gen heterólogo que codifica para un ácido 2-ceto descarboxilasa.
De acuerdo con otra modalidad el microorganismo comprende un gen endógeno que codifica para una actividad hidroxi aldehido reductasa. De preferencia se selecciona de entre Escherichia coli (yqhD, fucO, dkgA, dkgB); Saccharomyces cerevisiae (ADH1 , ADH2, ...); y todos los organismos que tienen al menos una enzima que tiene actividad aldehido reductasa o actividad alcohol deshidrogenasa. Este microorganismo que tiene actividad hidroxi aldehido reductasa endógena se puede modificar aún más para aumentar la expresión del gen endógeno que codifica para la hidroxi aldehido reductasa.
El diol alifático producido con los microorganismos de la invención es un diol alifático que tiene una cadena de alquilo lineal o ramificada que comprende de 2 a 6 átomos de carbono, de preferencia 2, 3 o 4 átomos de carbono En una modalidad preferida, el diol alifático es etilenglicol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto alifático es hidroxipiruvato.
En otra modalidad preferida, el diol alifático es 1 ,3-propanodiol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto alifático es 4-hidroxi-2-cetobutirato.
En otra modalidad preferida, el diol alifático es 1 ,4-butanodiol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático es 5-hidroxi-2-cetopentanoato.
La presente invención se refiere también a un método para la bioproducción de un diol alifático, que comprende los pasos de: - cultivar un microorganismo de la invención como se describe antes y más adelante en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y - recuperar el diol alifático del medio de cultivo.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el diol es purificado aún más.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Microorganismos El microorganismo de la invención es un microorganismo que es genéticamente modificado o manipulado genéticamente. Esto significa, de acuerdo con el significado usual de estos términos, que el microorganismo de la invención no se encuentra en la naturaleza y es modificado ya sea por introducción o deleción de nuevos elementos genéticos. Asimismo puede ser transformado forzando el desarrollo y evolución de nuevas vías metabólicas al combinar mutagénesis dirigida y evolución bajo presión de selección específica (ver por ejemplo, WO 2004/076659).
De acuerdo con la invención, el término "microorganismo" designa una bacteria, levadura o un hongo. De preferencia, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteríaceae. Con mayor preferencia, el microorganismo es una especie de Escherichia, Clostridium, Bacillus, Klebsiella, Pantoea, Salmonella o Corynebacterium. Aún con mayor preferencia el microorganismo es ya sea la especie Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum o Clostridium acetobutylicum o Bacillus subtilis.
Un microorganismo puede expresar genes exógenos si estos genes son introducidos en el microorganismo con todos los elementos que permiten su expresión en el microorganismo hospedero. Transformar microorganismos con ADN exógeno es una tarea de rutina para el experto en la técnica.
Genes exógenos pueden ser integrados en el genoma del hospedero, o ser expresados extracromosómicamente por plásmidos o vectores. Diferentes tipos de plásmidos son conocidos por el experto en la técnica, que difieren con respeto a su origen de replicación y su número de copias en la célula.
Elementos importantes para controlar la expresión de genes son los promotores. En una modalidad preferida de la invención, genes pueden ser expresados usando promotores con diferente fuerza, que puede ser inducible. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. El experto en la técnica sabe cómo elegir los promotores más convenientes, por ejemplo, promotores Ptrc, Ptac, P/ac o el promotor lambda el son ampliamente usados.
En modalidades específicas, genes endógenos pueden ser también modificados para modular su expresión y/o actividad, introduciendo ya sea mutaciones en la secuencia de codificación para modificar el producto de gen o introduciendo secuencias heterólogas además de o en reemplazo de los elementos reguladores endógenos. La modulación de un gen endógeno puede ser de dos maneras: sobrerregular y/o aumentar la actividad del producto de gen por una parte, o subregular y/o reducir la actividad del producto de gen endógeno por otra parte.
El término "atenuación de un gen" de acuerdo con la invención denota la supresión parcial o completa de la expresión de un gen, que se dice después que es "atenuado". Esta supresión de expresión puede ser ya sea una inhibición de la expresión del gen, una deleción de toda o parte de la región promotora necesaria para la expresión de genes, una deleción en la región de codificación del gen, o el reemplazo del promotor tipo silvestre por un promotor natural o sintético más débil. De preferencia, la atenuación de un gen es esencialmente la deleción completa de ese gen, que puede ser reemplazado por un gen marcador de selección que facilita la identificación, aislamiento y purificación de las cepas de acuerdo con la invención. Un gen es inactivado de preferencia por la técnica de recombinación homologa (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645).
En otras modalidades de la invención, secuencias endógenas pueden ser también inactivadas o eliminadas, para favorecer la nueva vía metabólica.
Todas las técnicas para transformar los microorganismos, y elementos reguladores usados para aumentar la producción de la proteina de la invención son bien conocidos en la técnica y se encuentran disponibles en la literatura, incluyendo las solicitudes de patente de la solicitante sobre la modificación de vías de biosíntesis en diversos microorganismos, incluyendo WO 2008/052973, WO 2008/052595, WO 2008/040387, WO 2007/144346, WO 2007/141316, WO 2007/077041 , WO 2007/017710, WO 2006/082254, WO 2006/082252, WO 2005/1 11202, WO 2005/073364, WO 2005/047498, WO 2004/076659, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia.
Genes y actividades enzimáticas En la descripción de la presente invención, actividades enzimáticas son también designadas por referencia a los genes que codifican para las enzimas que tienen tal actividad. Excepto que se mencione otra cosa, los genes y proteínas son generalmente identificados usando las denominaciones de genes de Escheríchia coli. Sin embargo, el uso de estas denominaciones tiene un significado más general de acuerdo con la invención y cubre todos los genes y proteínas correspondientes en otros organismos, más en particular microorganismos, homólogos funcionales, variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos genes y proteínas.
Los genes que son identificados en la presente solicitud se listan en el Cuadro A con su número de acceso.
CUADRO A Gen Organismo Número de acceso Arabidopsis NC 003076 REGION.
Pdc2 thaliana complemento(22327913 .22329987) Arabidopsis NC_003076 REGION: Pdc3 thaliana complemento( 132318..134861 ) Clostridium Pdc acetobutylicum NC 001988 REGION: 24954 .26618 NC 000913 REGION: a ce A Escheríchia coli 4215132..4216436 NC 000913 REGION: aceB Escherichia coli 4213501..4215102 NC 000913 REGION: aceK Escheríchia coli 4216619 .4218355 NC_000913 REGION: arcA Escherichia coli complemento(4637613..4638329) NC_000913 REGION: asd Escherichia coli complemento(3571798..3572901 ) NC_000913 REGION: cysE Escherichia coli complemento(3779764 .3780585) NC_000913 REGION: dapA Escherichia coli complemento(2596904..2597782) NC 000913 REGION: dkgA Escherichia coli 3154645..3155472 dkgB Escherichia coli NC 000913 REGION: 229167..229970 NC_000913 REGION: fucO Escherichia coli complemento(2929887..2931038) NC 000913 REGION: galP Escherichia coli 3086306..3087700 NC 000913 REGION: gdhA Escherichia coli 1840395..1841738 NC_000913 REGION: gitA Escherichia coli complemento(752408..753691) NC 000913 REGION: gltB Escherichia coli 3352654..3357207 NC_000913 REGION: glyA Escherichia coli complemento(2682276..2683529) NC 000913 REGION: gpmA Escherichia coli complemento(786066..786818) NC 000913 REGION: gpmB Escherichia coli 4631820..4632467 Usando las referencias de la Nomenclatura de enzimas IUB B para actividades enzimáticas conocidas, los expertos en la técnica pueden determinar las mismas actividades enzimáticas en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, etc. Este trabajo de rutina se hace de manera favorable usando secuencias consenso que se pueden determinar llevando a cabo alineamientos de secuencia con proteínas derivadas de otros microorganismos.
Métodos para la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias de proteínas son conocidos a partir del experto en la técnica. Por ejemplo, se puede hacer después de alineamiento de las secuencias usando el software CLUSTALW disponible en el sitio web http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ con los parámetros predeterminados indicados en el sitio web. A partir del alineamiento, el cálculo del porcentaje de identidad se puede hacer fácilmente registrando el número de residuos idénticos en la misma posición en comparación con el número total de residuos. De manera alternativa, el cálculo automático se puede hacer usando, por ejemplo, los programas BI-AST disponibles en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros predeterminados indicados en el sitio web.
PFAM (base de datos de familias de proteínas de alineamientos y modelos de Markov ocultos; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa una gran colección de alineamientos de secuencias de proteínas. Cada PFAM hace posible visualizar múltiples alineamientos, ver dominios de proteínas, evaluar la distribución entre organismos, obtener acceso a otras bases de datos y visualizar estructuras de proteínas conocidas.
COGs (conjuntos de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ se obtienen comparando secuencias de proteínas a partir de 66 genomas completamente secuenciados que representan 30 líneas filogénicas principales. Cada COG se define a partir de al menos tres líneas, lo que permite la identificación de dominios conservados anteriores.
Una proteína que comparte homología con la proteína mencionada se puede obtener a partir de otros microorganismos o puede ser una variante o un fragmento funcional de una proteína natural.
El término "variante funcional o fragmento funcional" significa que la secuencia de aminoácidos del polipéptido puede no estar estrictamente limitada a la secuencia observada en la naturaleza, sino que puede contener aminoácidos adicionales. El término "fragmento funcional" significa que la secuencia del polipéptido puede incluir menos aminoácido que la secuencia original pero aún suficientes aminoácidos para conferir la actividad enzimática de la secuencia original de referencia. Es bien conocido en la técnica que un polipéptido puede ser modificado por sustitución, inserción, deleción y/o adición de uno o más aminoácidos mientras retiene su actividad enzimática. Por ejemplo, la sustitución de un aminoácido en una posición dada por un aminoácido químicamente equivalente que no afecta las propiedades funcionales de una proteína es común. Para el propósito de la presente invención, las sustituciones se definen como intercambios dentro de uno de los siguientes grupos: ¦ residuos alifátícos, no polares o ligeramente polares pequeños: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly ¦ residuos polares con carga negativa y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln ¦ residuos polares con carga positiva: His, Arg, Lys ¦ residuos alifáticos, no polares grandes: Met, Leu, lie, Val, Cys ¦ residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.
Se puede esperar que cambios que dan por resultado la sustitución de un residuo con carga negativa por otro (tal como ácido glutámico por ácido aspártico) o un residuo con carga positiva por otro (tal como lisina por arginina) formen un producto funcionalmente equivalente.
Las posiciones donde los aminoácidos son modificados y el número de aminoácidos sujetos a modificación en la secuencia de aminoácidos no están limitados particularmente. El experto en la técnica es capaz de reconocer las modificaciones que pueden ser introducidas sin afectar la actividad de la proteína. Por ejemplo, se puede esperar que modificaciones en la porción N- o C-terminal de una proteina no alteren la actividad de una proteina bajo ciertas circunstancias.
El término "variante" se refiere a polipéptidos sometidos a modificaciones tal como se define anteriormente mientras aún retienen la actividad enzimática original.
El término "codificar" se refiere al proceso mediante el cual un polinucleótido, a través de los mecanismos de transcripción y traducción, produce una secuencia de aminoácidos. Este proceso es permitido por el código genético, el cual es la relación entre la secuencia de bases en el ADN y la secuencia de aminoácidos en las proteínas. Una característica principal del código genético es que es degenerado, lo que significa que un aminoácido puede ser codificado por más de un triplete de bases (un "codón"). La consecuencia directa es que la misma secuencia de aminoácidos puede ser codificado por diferentes polinucleótidos. Es bien sabido a partir del experto en la técnica que el uso de codones puede variar de acuerdo con los organismos. Entre los codones que codifican para el mismo aminoácido, algunos pueden ser usados de preferencia por un microorganismo dado. Por ende, puede ser de interés diseñar un polinucleótido adaptado al uso de codones de un microorganismo particular a fin de optimizar la expresión de la proteína correspondiente en este organismo.
En algunos casos, genes o enzimas pueden ser designados por el nombre de la actividad. En algunos otros casos, la designación por "actividad" puede significar una combinación de dos o más enzimas que tienen en combinación la actividad deseada. En dicho caso, cada enzima en la combinación puede ser codificada por distintos genes bajo control de diferentes elementos reguladores o una combinación de genes bajo control del mismo operón.
Genes que codifican para una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa son bien conocidos en la técnica, incluyendo genes Pdc de diversas especies, y más en particular los genes Pdc1 , Pdc5, Pdc6, Arol O y Thi3 de Saccharomyces cerevisiae, el gen kivD de Lactococcus lactis; el gen pdc de Clostridium acetobutylicum, los genes Pdc2 y Pdc3 de Arabidopsis thaliana; los genes Pdc1 , Pdc2 y Aro10 de Pichia stipitis; el gen pdc de Zymomonas mobilis. La primera subunidad del complejo 2-cetoglutarato descarboxilasa, codificado por el gen sucA de Escheríchia coli, posee también actividad ácido 2-ceto descarboxilasa, así como la enzima codificada por el gen dxs de Escheríchia coli. Homólogos funcionales, variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos genes y proteínas están incluidos por la definición.
Genes que codifican para una actividad hidroxi aldehido reductasa son también bien conocidos en la técnica, incluyendo los genes yqhD, fucO, dkgA, dkgB de Escheríchia coli y los genes ADH1 y ADH2 de Saccharomyces cerevisiae. Homólogos funcionales, variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos genes y proteínas están incluidos por la definición.
Producción fermentativa La presente invención se refiere además a la producción fermentativa de un diol alifático, que comprende los pasos de: - cultivar un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y - recuperar el diol alifático del medio de cultivo.
La fermentación generalmente se lleva a cabo en fermentadores con un medio de cultivo apropiado adaptado al microorganismo usado, que contiene al menos una fuente de carbono simple, y si es necesario cosustratos.
Un 'medio de cultivo apropiado' designa un medio (por ejemplo, medios estériles, líquidos) que comprende nutrientes esenciales o benéficos para el mantenimiento y/o crecimiento de la célula tal como fuentes de carbono o sustrato de carbono, fuentes de nitrógeno, por ejemplo, peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo, fosfato de monopotasio o fosfato de dipotasio; elementos traza (por ejemplo, sales de metal), por ejemplo, sales de magnesio, sales de cobalto y/o sales de manganeso; asi como factores de crecimiento tales como aminoácidos, vitaminas, promotores de crecimiento y similares.
Como un ejemplo de medios de cultivo conocidos para E. coli, el medio de cultivo puede ser de composición idéntica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 32:120-128), un medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) o un medio tal como es definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).
Como otro ejemplo de un medio de cultivo para C. glutamicum, el medio de cultivo puede ser de composición idéntica o similar al medio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) o a un medio tal como es descrito por Riedel et al. (2001 , J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3. 573-583).
El término 'fuente de carbono' o 'sustrato de carbono' o 'fuente de carbono' de acuerdo con la presente invención denota cualquier fuente de carbono que puede ser usada por los expertos en la técnica para soportar el crecimiento normal de un microorganismo, incluyendo hexosas (tales como glucosa, galactosa o lactosa), pentosas, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos (tales como sacarosa, celobiosa o maltosa), melaza, almidón o sus derivados, hemicelulosas, glicerol y combinaciones de los mismos. Una fuente de carbono simple especialmente preferida es la glucosa. Otra fuente de carbono simple preferida es sacarosa.
En algunas modalidades de la invención, el medio de cultivo comprende una fuente de carbono que es un subproducto de otro proceso usando biomasa como material de partida, o eventualmente, el producto de degradación mecánica y/o química y/o enzimática, y en tal caso in vitro o in vivo, de biomasa, tal como degradación de celulosa.
El microorganismo de la invención es elegido y/o modificado de manera favorable para usar la fuente de carbono como fuente única de carbono para crecer en el medio de cultivo.
Los microorganismos seleccionados para crecer en una fuente de carbono específica son conocidos en la técnica, así como las modificaciones a introducir en un microorganismo para permitirle crecer en dicha fuente de carbono específica.
Los expertos en la técnica pueden definir las condiciones de cultivo para los microorganismos de acuerdo con la invención. En particular las bacterias son fermentadas a una temperatura entre 20°C y 55°C, de preferencia entre 25°C y 40°C, y más específicamente aproximadamente 30°C para C. glutamicum y aproximadamente 37°C para E. coli.
Recuperar el diol aliíático del medio de cultivo es una tarea de rutina para un experto en la técnica.
En un aspecto de la invención, el diol aliíático recuperado es purificado aún más.
Métodos para recuperar un diol de un medio de cultivo y su purificación son conocidos en la técnica y se describen, entre otros, en los siguientes documentos: PCT/EP2008/063287 presentado el 3 de octubre de 2008 y PCT7EP2007/063068 presentado el 30 de noviembre de 2007.
Modalidades especificas Otras modalidades de la invención se describirán más adelante. Los microorganismos son modificados para favorecer tanto la producción del metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático como la transformación en el diol aliíático correspondiente del producto obtenido del paso de descarboxilación del mismo metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático.
La descripción a continuación se hace con referencia a E. coli, el cual carece de actividad ácido 2-ceto descarboxilasa endógeno. Por lo tanto, un gen heterólogo que codifica para dicha actividad es introducido en el microorganismo.
Modificaciones del microorganismo para optimizar la vía para producir el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático y transformar el producto obtenido a partir del paso de descarboxilación del mismo metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático en el diol alifático se hacen también con base en las vías metabólicas conocidas y genes endógenos de E. coli. Sin embargo, el experto en la técnica puede usar estrategias similares para introducir o eliminar genes correspondientes en otros microorganismos con genes y vías conocidos.
I. Preparación de etilenglicol La vía de biosíntesis para la producción de etilenglicol de acuerdo con la invención comprende tres reacciones enzimáticas empezando con transformación del precursor 3-fosfohidroxipiruvato (precursor para serina). Primero una actividad fosfatasa permite la conversión de fosfohidroxipiruvato en hidroxípiruvato. El hidroxipiruvato es después transformado en glicolaldehído con una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa. Por último, una actividad hidroxi aldehido reductasa permite la conversión de glicolaldehído en etilenglicol. Otra vía para la producción de etilenglicol empieza a partir de L-serina como precursor. Primero una actividad transaminasa o aminoácido oxidasa permite la conversión de serina en hidroxipiruvato. Los siguientes dos pasos son similares a la primera vía antes descrita.
La vía de biosintesis global está representada en la figura 1.
La presente invención provee un método para la producción fermentativa de etilenglicol, sus derivados o precursores, que comprende: cultivar un microorganismo, particularmente una bacteria, en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y recuperar etilenglicol del medio de cultivo.
En una modalidad preferida, el método se lleva a cabo con un microorganismo, particularmente una bacteria, que contiene al menos un gen que codifica un polipéptido con actividad ácido 2-ceto descarboxilasa y un gen que codifica un polipéptido con actividad hidroxi aldehido reductasa. Esos genes pueden ser exógenos o endógenos, pueden ser expresados cromosómica o extracromosómicamente.
En otra modalidad de la invención, el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, en la cual la disponibilidad del intermediario 3-fosfoglicerato es incrementada. De preferencia, el incremento se obtiene atenuando el nivel de expresión de genes que codifican fosfoglicerato mutasas, en particular uno o ambos genes gpmA y pgml. Esto se puede hacer reemplazando el promotor tipo silvestre de estos genes por un promotor más débil, o mediante el uso de un elemento que desestabilice el ARN mensajero correspondiente o la proteína. Si es necesario, la atenuación completa de los genes se puede realizar también mediante la deleción de las secuencias de ADN correspondientes. La invención se refiere además al microorganismo usado en esta modalidad particular de la invención, es decir, un microorganismo, particularmente una bacteria que presenta una disponibilidad incrementada de 3-fosfoglicerato, en particular un microorganismo, de preferencia una bacteria, en la cual la expresión de los genes que codifican para fosfoglicerato mutasas es atenuada, de preferencia la expresión de uno o ambos genes gpmA y pgml.
En otra modalidad, el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, en la cual el flujo a la vía de biosintesis de serina es estimulado. Esto se puede lograr incrementando el nivel de expresión de 3-fosfoglícerato deshidrogenasa y/o fosfoserina aminotransferasa, codificada por los genes serA y serC respectivamente. Incrementar el nivel de expresión de la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa y/o fosfoserina aminotransferasa se puede lograr introduciendo promotores artificiales que impulsen la expresión de los genes serA y/o serC, incrementando el número de copias en la célula o introduciendo mutaciones en los genes serA y/o serC que incrementen la actividad de las proteínas correspondientes. La expresión del gen serA se puede incrementar también reemplazando el gen Irp tipo silvestre (que codifica la proteína reguladora de respuesta a leucina) por un alelo mutado con Irp (tal como el alelo lrp-correspondiente a una sustitución GLU1 I4ASP en la proteina Irp) que produce la activación constitutiva de la transcripción del gen serA. La invención se refiere también al microorganismo, en particular una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En una modalidad particular de la invención se pueden introducir mutaciones en el gen serA que reducen la sensibilidad de la proteína SerA a la serina inhibidora de retroalimentación (alelos desensibilizados a retroalimentación) y permiten asi una actividad incrementada en presencia de serina. Ejemplos de alelos desensibilizados, es decir, alelos insensibles a retroalimentación, han sido descritos en EP 0 931 833 (Ajinomoto) o EP 0 620 853 (Wacker).
En otra modalidad el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, en la cual el flujo a la vía de biosintesis de hidroxipiruvato es estimulado. Este resultado se puede lograr incrementando el nivel de expresión de serina transaminasa o serina oxidasa (para la vía empezando a partir de serina como precursor), o incrementando la expresión de 3-fosfohidroxipiruvato fosfatasa. Incrementar el nivel de expresión de serina oxidasa se puede lograr introduciendo y sobreexpresando el gen que codifica para L-aminoácido oxidasa a partir de R. opacus, o introduciendo mutaciones en el gen que incrementen la actividad de la proteína correspondiente. Un incremento en la expresión de serina transaminasa se puede lograr introduciendo promotores artificiales que impulsen la expresión del gen serC de E. coli, incrementando el número de copias en la célula o introduciendo mutaciones en el gen serC que incrementen la actividad de la proteina correspondiente. Un incremento de la expresión de 3- fosfohidroxipiruvato fosfatasa se puede lograr introduciendo promotores artificiales que impulsen la expresión del gen yeaB o gen serB de E. coli, incrementando el número de copias en la célula o introduciendo mutaciones en el gen yeaB o el gen serB que incrementen la actividad de las proteínas correspondientes. Un incremento de la expresión de 3-fosfohidroxipiruvato fosfatasa se puede lograr también introduciendo y sobreexpresando el gen GPP2 de S. cerevisiae, o introduciendo mutaciones en el gen GPP2 que incrementen la actividad de la proteina correspondiente. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En otra modalidad de la invención, el microorganismo, particularmente una bacteria, es modificado para presentar un nivel atenuado de conversión de serina a otros compuestos distintos de etilenglicol. Este resultado se puede obtener atenuando el nivel de enzimas que consumen serina como serina deaminasas (codificadas por sdaA y sdaB y tdcG), serina transacetilasa (codificada por cysE), triptófano sintasa (codificada por trpAB) o serina hidroximetiltransferasa (codificada por glyA). Estos genes pueden ser atenuados reemplazando el promotor natural por un promotor de menor fuerza o por elementos que desestabilicen el ARN mensajero correspondiente o la proteina. Si es necesario, la atenuación completa del gen se puede lograr también mediante una deleción de la secuencia de ADN correspondiente. Asimismo la invención se refiere al microorganismo, en particular una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En otra modalidad de la invención, el microorganismo, particularmente una bacteria, es modificado para presentar un nivel atenuado de conversión de hidroxipiruvato a otros compuestos distintos de glicolaldehido. Este resultado se puede obtener atenuando el nivel de enzimas que consumen hidroxipiruvato como hidroxipiruvato reductasa (codificada por ghrA) o hidroxipiruvato isomerasa (codificada por hyi). Estos genes pueden ser atenuados reemplazando el promotor natural por un promotor de menor fuerza o por elementos que desestabilicen el ARN mensajero correspondiente o la proteína. Si es necesario, la atenuación completa del gen se puede lograr también mediante una deleción de la secuencia de ADN correspondiente. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En otra modalidad de la invención, el microorganismo, en particular una bacteria, es modificado para presenter un nivel atenuado de conversión de glicolaldehido a otros compuestos distintos de etilenglicol. Esto se puede obtener atenuando el nivel de enzimas que consumen glicolaldehido como hidroxitreonina aldolasa (codificada por ItaE) o glicolaldehido deshidrogenasa (codificada por aldA, aldB). La atenuación de estos genes se puede hacer reemplazando el promotor natural por un promotor de menor fuerza o por elementos que desestabilicen el ARN mensajero correspondiente o la proteína. Si se necesita, la atenuación completa del gen se puede lograr también por medio de una deleción de la secuencia de ADN correspondiente.
Igualmente la invención se refiere al microorganismo, en particular una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En un aspecto de la invención, la eficiencia de la importación de azúcar es incrementada, ya sea usando un sistema de importación de azúcar que no depende de fosfoenolpiruvato (PEP) como donador de fósforo como galP que se sabe que transporta glucosa, o proveyendo más fosfoenolpiruvato (PEP) al sistema de fosfotransferasa de azúcar. Existen diversos medios que se pueden usar para incrementar la disponibilidad de PEP en un microorganismo. En particular, esto se puede lograr atenuando la reacción PEP? piruvato. De preferencia, al menos un gen seleccionado de entre pykA y pykF, que codifican piruvato cinasa, es atenuado en dicha cepa a fin de obtener este resultado. Otra manera de incrementar la disponibilidad de PEP es favorecer la reacción piruvato? PEP. Esto se puede lograr incrementando la actividad de fosfoenolpiruvato sintasa la cual cataliza la reacción anterior. Esta enzima es codificada por el gen ppsA. Por lo tanto, en el microorganismo, la expresión del gen ppsA es de preferencia incrementada. Ambas modificaciones pueden estar presentes en el microorganismo de manera simultánea.
II. Preparación de 1 ,3-propanodiol La vía de biosíntesis para la producción de 1 ,3-propanodiol de acuerdo con la invención comprende tres reacciones enzimáticas empezando con transformación del precursor L-homoserina (obtenido de L-aspartato).
Primero una actividad homoserina transaminasa o una actividad homoserina oxidasa permite la conversión de L-homoserina en 4-hidroxi-2-cetobutirato. Una segunda actividad ácido 2-ceto descarboxilasa permite la conversión de 4-hidroxi-2-cetobutirato en 3-hidroxipropionaldehido. 3-hidroxipropionaldehido es después convertido en 1 ,3-propanodiol con una actividad hidroxi aldehido reductasa.
La vía de biosintesis global está representada en la figura 2.
La presente invención provee un método para la producción fermentativa de 1 ,3-propanodiol, sus derivados o precursores, que comprende: cultivar un microorganismo, particularmente una bacteria, en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y recuperar 1 ,3-propanodiol del medio de cultivo.
En una modalidad preferida, el método se lleva a cabo con un microorganismo, particularmente una bacteria, que contiene al menos un gen que codifica un polipéptido con actividad ácido 2-ceto descarboxilasa y un gen que codifica un polipéptido con actividad hidroxi aldehido reductasa. Esos genes pueden ser exógenos o endógenos, y pueden ser expresados cromosómica o extracromosómicamente.
En otra modalidad, el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, cuyo flujo en la vía de biosintesis de oxaloacetato es estimulado; este resultado se puede lograr incrementando el nivel de expresión de fosfoenolpiruvato carboxilasa, codificada por el gen ppc. Incrementar la expresión de fosfoenolpiruvato carboxilasa se puede lograr introduciendo promotores artificiales que impulsen la expresión del gen ppc, incrementando el número de copias en la célula o introduciendo mutaciones en el gen ppc que incrementen la actividad de la proteina correspondiente. La disponibilidad del producto intermediario oxaloacetato se puede incrementar atenuando el nivel de expresión de genes que codifican para fosfoenolpiruvato carboxicinasa y/o enzimas mélicas, codificadas por los genes pckA y/o maeA y/o maeB, respectivamente. Esto se puede hacer reemplazando el promotor tipo silvestre de estos genes por un promotor más débil, o mediante el uso de un elemento que desestabilice el ARN mensajero correspondiente o la proteína. Si es necesario, la atenuación completa de los genes se puede realizar también mediante la deleción de las secuencias de ADN correspondientes. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención, es decir, un microorganismo, particularmente una bacteria, que presenta una disponibilidad incrementada del oxaloacetato.
En otra modalidad, el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, en la cual el flujo a la vía de biosíntesis de homoserina es estimulado. Esto se puede lograr incrementando la expresión de aspartocinasa y homoserina deshidrogenasa y/o aspartato semialdehído deshidrogenasa, codificadas por los genes thrA y asd, respectivamente. Incrementar la expresión de aspartocinasa y homoserina deshidrogenasa y/o aspartato semialdehído deshidrogenasa se puede lograr introduciendo promotores artificiales que impulsen la expresión de los genes thrA y/o asd, incrementando el número de copias en la célula o introduciendo mutaciones en los genes thrA y/o asd que incrementen la actividad de las proteínas correspondientes. La invención se refiere también al microorganismo, en particular una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En una modalidad particular de la invención se pueden introducir mutaciones en el gen thrA que reducen su sensibilidad a la treonina inhibidora de retroalimentación (alelos desensibilizados a retroalimentación) y permiten asi una actividad incrementada en presencia de treonina.
En otra modalidad el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, en la cual el flujo a la vía de biosíntesis de 4-hidroxi-2-cetobutirato es estimulado. Este resultado se puede lograr incrementando la expresión de homoserina transaminasa u homoserina oxidasa. Incrementar la expresión de homoserina oxidasa se puede lograr introduciendo y sobreexpresando el gen que codifica para L-aminoácido oxidasa a partir de R. opacus, o introduciendo mutaciones en el gen que incrementen la actividad de la proteína correspondiente. Incrementar el nivel de expresión de homoserina transaminasa se puede lograr introduciendo promotores artificiales que impulsen la expresión del gen serC de E. coli, incrementando el número de copias en la célula o introduciendo mutaciones en el gen serC que incrementen la actividad de la proteína correspondiente. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención En otra modalidad de la invención, el microorganismo, particularmente una bacteria, es modificado para presentar un nivel atenuado de conversión de homoserina a otros compuestos distintos de 1 ,3-propanodiol. Este resultado se puede obtener atenuando el nivel de enzimas que consumen homoserina como homoserina cinasa y treonina sintasa (codificadas por thrB y thrC), homoserina O-transsuccinilasa (codificada por metA) o dihidrodipicolinato sintasa (codificada por dapA). Estos genes pueden ser atenuados reemplazando el promotor natural por un promotor más débil o por elementos que desestabilicen el ARN mensajero correspondiente o la proteina. Si es necesario, la atenuación completa del gen se puede lograr también mediante la deleción de la secuencia de ADN correspondiente. Asimismo la invención se refiere al microorganismo, en particular una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En otra modalidad de la invención, el microorganismo, particularmente una bacteria, es modificado para presentar un nivel atenuado de conversión de 3-hidroxipropionaldehido a otros compuestos distintos de 1 ,3-propanodiol. Esto se puede obtener atenuando el nivel de enzimas que consumen 3-hidroxipropionaldehído como 3-hidroxipropionaldehido deshidrogenasa (codificada por aldA, aldB). Estos genes pueden ser atenuados reemplazando el promotor natural por un promotor más débil o por elementos que desestabilicen el ARN mensajero correspondiente o la proteina. Si es necesario, la atenuación completa del gen se puede lograr también mediante la deleción de la secuencia de ADN correspondiente. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En un aspecto de la invención, la eficiencia de la importación de azúcar es incrementada, ya sea usando un sistema de importación de azúcar que no depende de fosfoenolpiruvato (PEP) como donador de fósforo como aquel codificado por galP que se sabe que transporta glucosa, o proveyendo más fosfoenolpiruvato (PEP) al sistema de fosfotransferasa de azúcar. Existen diversos medios que se pueden usar para incrementar la disponibilidad de PEP en un microorganismo. En particular, esto se puede lograr atenuando la reacción PEP? piruvato. De preferencia, al menos un gen seleccionado de entre pykA y pykF, que codifican piruvato cinasa, es atenuado en dicha cepa a fin de obtener este resultado. Otra manera de incrementar la disponibilidad de PEP es favorecer la reacción piruvato ? PEP. Esto se puede lograr incrementando la actividad de fosfoenolpiruvato sintasa la cual cataliza la reacción anterior. Esta enzima es codificada por el gen ppsA. Por lo tanto, en el microorganismo, la expresión del gen ppsA es de preferencia incrementada. Ambas modificaciones pueden estar presentes en el microorganismo de manera simultánea.
III. Preparación de 1 ,4-butanodiol La vía de biosintesis para la producción de 1 ,4-butanodiol de acuerdo con la invención comprende cinco reacciones enzimáticas empezando con la transformación del precursor 2-cetoglutarato (metabolito del ciclo de Krebs).
Una primera actividad, 4-oxoglutaril-CoA sientetasa, permite la conversión de 2-cetoglutarato en 4-oxoglutaril-CoA. Este compuesto es después convertido en 5-hidroxi-2-cetopentanoato con las combinaciones de dos actividades, primero aldehido deshidrogenasa después alcohol deshidrogenasa ambas codificadas por el gen adhE2 de Clostridium acetobulylicum o adhE de Escheríchia coli. La actividad ácido 2-ceto descarboxilasa permite entonces la conversación de 5-hidrox¡-2-oxopentanoato a 4-hidroxibutiraldehido, que es después convertido en 1 ,4-butanodiol que se basa en actividad hidroxi aldehido reductasa.
La vía de biosíntesis global está representada en la figura 3.
La presente invención provee un método para la producción fermentativa de 1 ,4-butanodiol, sus derivados o precursores, que comprende: cultivar un microorganismo, particularmente una bacteria, en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y recuperar 1 ,4-butanodiol del medio de cultivo.
En una modalidad preferida, el método se lleva a cabo con un microorganismo, particularmente una bacteria, que contiene al menos un gen que codifica un polipéptido con actividad ácido 2-ceto descarboxilasa y un gen que codifica un polipéptido con actividad hidroxi aldehido reductasa. Esos genes pueden ser exógenos o endógenos, y pueden ser expresados cromosómica o extracromosómicamente.
En otra modalidad de la invención, el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, en la cual el flujo a la vía de biosíntesis de oxaloacetato es estimulado (entrada del ciclo de Krebs). Esto se puede lograr incrementando la expresión de fosfoenolpiruvato carboxilasa, codificada por el gen ppc. Incrementar la expresión de fosfoenolpiruvato carboxilasa se puede lograr introduciendo promotores artificiales que impulsen la expresión del gen ppc, incrementando el número de copias en la célula o introduciendo mutaciones en el gen ppc que incrementen la actividad de la proteína correspondiente. La disponibilidad del producto intermediario oxaloacetato se puede incrementar también atenuando el nivel de expresión de genes que codifican para fosfoenolpiruvato carboxicinasa y/o enzimas mélicas, codificadas por los genes pckA y/o maeA y/o maeB, respectivamente. Esto se puede hacer reemplazando el promotor tipo silvestre de estos genes por un promotor más débil, o mediante el uso de un elemento que desestabilice el ARN mensajero correspondiente o la proteina. Si es necesario, la atenuación completa de los genes se puede realizar también mediante la deleción de las secuencias de ADN correspondientes. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención, es decir, un microorganismo, particularmente una bacteria, que presenta una disponibilidad incrementada de 2-cetoglutarato.
En otra modalidad el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, en la cual el flujo a la vía de biosíntesis de 2- cetoglutarato es estimulado. Esto se puede lograr incrementando la expresión de citrato sintasa y/o isocitrato deshidrogenase, codificadas por los genes gltA e icd, respectivamente. Incrementar la expresión de citrato sintasa y/o isocitrato deshidrogenase se puede lograr introduciendo promotores artificiales que impulsen la expresión de los genes gltA y/o icd, incrementando el número de copias en la célula o introduciendo mutaciones en los genes gltA y/o icd que incrementen la actividad de las proteínas correspondientes. La actividad isocitrato deshidrogenasa es modulada por fosforilación o desfosforilación, reacciones que son catalizadas por AceK. La fosforilación reduce la actividad de Icd y la desfosforilación reactiva la enzima Icd. Por lo tanto, la actividad de la enzima Icd puede ser también controlada introduciendo genes aceK mutantes que tienen actividad cinasa reducida o actividad fosfatasa incrementada en comparación con la enzima AceK tipo silvestre. El nivel de actividad AceK puede ser también disminuido atenuando la expresión del gen aceK. Esto se puede hacer reemplazando el promotor tipo silvestre del gen por un promotor más débil, o mediante el uso de un elemento que desestabilice el ARN mensajero correspondiente o la proteína. Si es necesario, la atenuación completa del gen se puede realizar también mediante la deleción de la secuencia de ADN correspondiente. La disponibilidad del intermediario 2-cetoglutarato se puede incrementar también atenuando la expresión de genes que codifican para 2-cetoglutarato descarboxilasa o succinil-CoA sintetasa y/o isocitrato liasa o malato sintasa, codificados por los genes sucAB o sucCD y/o aceA o aceB, respectivamente.
Esto se puede hacer reemplazando el promotor tipo silvestre de estos genes por un promotor más débil, o mediante el uso de un elemento que desestabilice el ARN mensajero correspondiente o la proteína. El flujo en el ciclo de Krebs puede ser también incrementado aliviando la represión de ArcA (codificado por el gen arcA) que reprime los genes que codifican el ciclo de Krebs. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención, es decir, un microorganismo, particularmente una bacteria, que presenta una disponibilidad incrementada del 2-cetoglutarato.
En otra modalidad el método se realiza con un microorganismo, particularmente una bacteria, en la cual el flujo a la vía de biosíntesis de 5-hidroxi-2-cetopentanoato es estimulado. Esto se puede lograr incrementando la expresión de la 4-oxoglutaril-CoA sintetasa (formadora de AMP, tal como codificada por el gen prpE, o formadora de ADP tal como codificada por los genes sucC y sucD) y/o la aldehido reductasa/alcohol deshidrogenasa. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En otra modalidad de la invención, el microorganismo, particularmente una bacteria, es modificado para presentar un nivel atenuado de conversión de 2-cetoglutarato a compuestos distintos de 1 ,4-butanodiol. Esto se puede obtener atenuando el nivel de enzimas que consumen 2-cetoglutarato como glutamato deshidrogenasa o glutamato sintasa (codificadas por gdhA y gltB). Estos genes pueden ser atenuados reemplazando el promotor natural por un promotor más débil o por elementos que desestabilicen el ARN mensajero correspondiente o la proteina. Si es necesario, la atenuación completa del gen se puede lograr también mediante la deleción de la secuencia de ADN correspondiente. Asimismo la invención se refiere al microorganismo, en particular una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En otra modalidad de la invención, el microorganismo, particularmente una bacteria, es modificado para presentar un nivel atenuado de conversión de 4-hidroxibutiraldehído a compuestos distintos de 1 ,4-butanodiol. Esto se puede obtener atenuando el nivel de enzimas que consumen 4-hidroxibutiraldehido como 4-hidroxibutiraldehido deshidrogenase (codificada por aldA, aldB). Estos genes pueden ser atenuados reemplazando el promotor natural por un promotor más débil o por elementos que desestabilicen el ARN mensajero correspondiente o la proteina. Si es necesario, la atenuación completa del gen se puede lograr también mediante la deleción de la secuencia de ADN correspondiente. La invención se refiere también al microorganismo, particularmente una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
En otra modalidad de la invención, el microorganismo, particularmente una bacteria, es modificado a fin de producir ,4-butanodiol en condiciones anaeróbicas. Para lograr dicha capacidad, en dicho microorganismo, el sistema de transporte de azúcar de PTS es eliminado para metabolizar azúcar vía un sistema de transporte permeasa/cinasa. Para producir suficiente ATP para crecimiento del microorganismo bajo condiciones anaeróbicas, oxaloacetato debe ser producido a partir de fosfoenolpiruvato vía actividad fosfoenolpiruvato carboxicinasa codificada por el gen pckA en E. coli. Esto genera un mol de ATP por mol de oxaloacetato producido. En una manera similar, la conversión de 2-oxoglutarato en 4-oxoglutaril-CoA debe ser lograda por 4-oxoglutaril-CoA sintetasa. La actividad formadora de ADP, tal como codificada por los genes sucC y sucD en E. coli, consume solamente un mol de ATP por mol de 4-oxoglutaril-CoA producida. La vía metabólica descrita para producir 1 ,4-butanodiol a partir de D-glucosa está particularmente adaptada para condiciones de crecimiento anaeróbicas. El balance de reacción global de dicha vía es: D-glucosa + ADP + Pi - 1 ,4-butanodiol + formiato + C02 + ATP + H2O. En otra modalidad de la invención, el microorganismo, particularmente una bacteria, es modificado para presentar un nivel atenuado de conversión de acetil-CoA a compuestos distintos de 1 ,4-butanodiol; este resultado se puede obtener atenuando el nivel de enzimas que consumen acetil-CoA como acetato cinasa y fosfato acetiltransferasa (codificadas por ackA y pta). La atenuación de estos genes se puede hacer reemplazando el promotor natural por un promotor de menor fuerza o por elementos que desestabilicen el ARN mensajero correspondiente o la proteína. Si es necesario, la atenuación completa del gen se puede lograr también mediante una deleción de la secuencia de ADN correspondiente. Asimismo la invención se refiere al microorganismo, en particular una bacteria, usado en esta modalidad particular de la invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de cepas que expresan un gen que codifica ácido 2-ceto descarboxilasa y un gen que codifica hidroxi aldehido reductasa: MG1655 (pMEIOI-kivDII-yqhD-TTOJ) 1 .1 Construcción del plásmido plv1-Ptrc01 -kivDII-TT07 para la sobreexpresión de kivD de Lactococcus lactis que codifica alfa-ceto-isovalerato descarboxilasa Un gen sintético del Lactococcus lactis kivD que codifica para la alfa-ceto-isovalerato descarboxilasa fue preparado por Geneart (Alemania). El uso de codón y contenido de GC del gen fueron adaptados a Escherichia coli de acuerdo con la matriz del proveedor. La expresión del gen sintético fue impulsada por un promotor Ptrc constitutivo. Un terminador transcripcional fue agregado hacia el extremo 3' del gen. La construcción fue clonada en vectores pM del proveedor y verificada mediante secuenciación. En caso de ser necesario, el gen sintético fue clonado en el vector pME101 (este plásmido se deriva del plásmido pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 )) antes de transformar una cepa de E. coli.
Ptrc01 -kivDil-TT07 sitios de restricción (BamHI, Hindlll, EcoRV) (SEQ ID NO 1 ): ggatccatgcaagcttatgcgatatc promotor PtrcOI (SEQ ID NO 2): gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaggaggtataac secuencia del gen k/VDII optimizada para E. coli (CAG34226.) (SEQ ID NO 3): atgtataccgtgggtgattatctgctggatcgtctgcatgaactgggcattgaagaaattttc ggcgttccgggtgattataatctgcagtttctggatcagattattagccataaagatatgaaatgggtgggtaat gccaatgaactgaatgcaagctatatggcagatggttatgcccgtaccaaaaaagcagcagcatttctgacc acctttggtgttggtgaactgagcgcagttaatggtctggctggtagctatgcagaaaatctgccggttgttgaa attgttggtagcccgaccagcaaagttcagaatgaaggcaaatttgtgcatcataccctggccgatggtgattt taaacatttcatgaaaatgcatgaaccggttaccgcagcacgtaccctgctgaccgcagaaaatgcaaccg ttgaaattgatcgtgttctgagcgcactgctgaaagaacgtaaaccggtgtatattaatctgccggtggatgttg cagcagcaaaagcagaaaaaccgagcctgccgctgaaaaaagaaaatagcaccagcaataccagcg atcaggaaattctgaataaaattcaggaatccctgaaaaacgccaaaaaaccgattgtgattaccggtcatg aaattaüagctttggcctggaaaaaaccgttacccagtttattagcaaaaccaaactgccgattaccaccctg aattttggtaaaagcagcgttgatgaagcactgccgagctttctgggtatttataatggcaccctgagcgaacc gaatctgaaagaatttgtggaaagcgcagatttcattctgatgctgggtgttaaactgaccgatagctctaccg gtgcatttacccatcatctgaatgaaaacaaaatgattagcctgaatattgatgaaggcaaaatttttaatgaa cgcattcagaattttgattttgaaagcctgattagcagcctgctggatctgagcgaaatcgaatataaaggcaa atatattgataaaaaacaggaagattttgttccgagcaatgcactgctgtctcaggatcgtctglggcaggcag ttgaaaatctgacccagagcaatgaaaccattgttgcagaacagggcaccagcttttüggtgcaagcagca tttttctgaaaagcaaaagccattttattggtcagccgctgtggggtagcattggttatacctttccggcagcact gggtagccagatlgcagataaagaaagccgtcatctgctgtttattggtgatggtagcctgcagctgaccgttc aggaactgggtctggccattcgcgaaaaaattaatccgatttgctttattatcaataatgatggctataccgtgg aacgtgaaattcatggtccgaatcagagctataatgatattccgatgtggaattatagcaaactgccggaatct tttggtgcaaccgaagatcgtgttgtgagcaaaattgtgcgcaccgaaaatgaatttgtgagcgtgatgaaag aagcacaggcagatccgaatcgtatgtattggattgaactgattctggccaaagaaggtgcaccgaaagttc tgaaaaaaatgggcaaactgttcgccgaacagaataaaagctaa secuencia de terminador T7Te (ref: Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Nati Acad Sci U S A. 24 de abril de 2001 ;98(9):5019-24.) (SEQ ID N0 4): attacgtagaAGATCTtcctggctcaccttcgggtgggcctttctg sitios de restricción (Smal, BamHI, EcoR\) (SEQ ID NO 5): ccccgggatgcggatccatgcgaattc Para la expresión de un vector de bajo número de copias el plásmido p E101 fue construido como sigue. El plásmido pCL1920 fue amplificado por PCR usando los oligonucleótidos PME101 F y PME 101 R y el fragmento BstZUI - Xmnl del vector pTRC99A que contiene el gen /acl y el promotor Ptrc fue insertado en el vector amplificado. El vector resultante fue restringido por Ncol y BamHI y el vector que contenía el gen kivDW fue restringido por Afllll y BamHI. El fragmento que contenía kivDW fue después clonado en el vector pME101 : El plásmido resultante fue nombrado pME101 -toVDII-TT07 PME 10 F (SEQ ID NO 6): ccgacagtaa gacgggtaag cctg PME101 R (SEQ ID NO 7): agcttagtaa agccctcgct ag 1 .2 Construcción de un plásmido pME101 -kivDII -yqhD-TT07 para la sobreexpresión de kivD de Lactococcus lactis que codifica alfa-cetoisovalerato descarboxilasa y yqhP de Escherichia coli que codifica metilqlioxal reductasa El vector pME101 y el vector que incluye los genes kivDW fueron restringidos por SnaBI y Bglll y el fragmento que contiene yqhD fue clonado en el vector pME101 , el plásmido resultante fue nombrado pME101 -A/VDII-yp 7D -TT07.
El gen yqhD fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico de la cepa de E. coli MG1655 con los oligonucleótidos yqhD F y yqhD R : yqhD F (SEQ ID NO 8) T7 \CG7>¾cccagcaaagggagcaagtaatgaacaac - una región para adición de un sitio de restricción SnaBI (letra mayúscula itálica negrita) - una región (letra minúscula) homologa a la región E. coli MG1655 yqhD de 3153357 a 3153385 yqhD R (SEQ ID NO 9) aagafcrtcTTAGCGGGCGGCTTCGTATATAC - una región (letra mayúscula) homologa a la región E. coli MG 1655 q/7D de 3154540 a 3154518 - una región para adición de un sitio de restricción Bg/ll (letra minúscula itálica negrita).
El fragmento amplificado por PCR fue cortado con las enzimas de restricción SnaBI y Bg/ll y clonado en los sitios SnaB\ - Bg/ll del vector pME101 -/</VD//-TT07 dando por resultado el vector pME101 -/</VD// -yqhD-TT07.
EJEMPLO 2 Construcción de cepas con flujo de vía de etilenglicol incrementado: MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrc18-gpmA Ptrc18-gpmB (pME101-kivDII- yqhD-TT07) 2.1 Construcción de la cepa MG1655 AsdaA AsdaB Para eliminar el gen sdaA gene, se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permitió la inserción de un cassette de resistencia a cioranfenicol o un cassette de resistencia a kanamicina, mientras eliminaba la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito los siguientes oligonucleótidos fueron usados: AsdaAF (SEQ ID NO 10) gtcaggagtattatcgtgattagtctattcgacatgtttaaggtggggattggtccctcatcttc ccataccgtagggccTGTAG GCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (1894941-1895020) y el gen sdaA (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), AsdaAR (SEQ ID NO 11) GGGCGAGTAAGAAGTATTAGTCACACTGGACTTTGATTGCC AGACCACCGCGTGAGGTTTCGCGGTATTTGGCGTTCATGTCCCATATGAA TATCCTCCTAAG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (1896336-1896254) del gen sdaA (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos AsdaAF y AsdaAR fueron usados para amplificar el cassette de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido fue luego introducido mediante electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina fueron seleccionados y la inserción del cassette de resistencia fue verificada por medio de análisis PCR con los oligonucleótidos sdaAF y sdaAR definidos más adelante La cepa retenida fue designada MG1655 AsdaA::Km. sdaAF (SEQ ID NO 12) . cagcgttcgattcatctgcg (homologa a la secuencia de 1894341 a 1894360). sdaAR (SEQ ID NO 13) : GACCAATCAGCGGAAGCAAG (homologa a la secuencia de 1896679 a 1896660).
Los transformantes resistentes a kanamicina fueron después seleccionados y AsdaA .Km se verificó mediante análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos sdaAF y sdaAR. La cepa retenida fue designada MG1655 AsdaA:.Km. Luego DsdaB::Cm se introdujo en la cepa MG1655 AsdaA '.Km mediante transducción. MG1655 AsdaB::Cm se construyó primero usando el mismo método como se describe previamente con los siguientes oligonucleótidos : AsdaBF (SEQ ID NO 14) cggcattggcccttccagttctcataccgttggaccaatgaaagcgggtaaacaatttacc gacgatctgattgcccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (2927627-2927705) del gen sdaB (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. , 2000, PNAS, 97: 6640-6645), AsdaBR (SEQ ID NO 15) CGCAGGCAACGATCTTCATTGCCAGGCCGCCGCGAGAGGT TTCGCGGTACTTGGCGTTCATATCTTTACCTGTTTCGTACCATATGAATAT CCTCCTTAG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (2928960-2928881 ) del gen sdaB (secuencia de referencia en el sitio web http./ygenolist.pasteur.fr/Colibri/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos AsdaBF y AsdaBR fueron usados para amplificar el cassette de resistencia a cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido fue luego introducido por medio de electroporación en la cepa MG1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a cloranfenicol fueron después seleccionados y la inserción del cassette de resistencia fue verificada mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos sdaBF y sdaBR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 Asda8::Cm. sdaBF (SEQ ID NO 16) : Gcgtaagtacagcggtcac (homologa a la secuencia de 2927450 a 2927468). sdaBR (SEQ ID NO 17) CGATGCCGGAACAGGCTACGGC (homologa a la secuencia de 2929038 a 2929017). Para transferir AsdaS::Cm, se usó el método de transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 &sdaB :Cm se usó para la transducción en la cepa MG1655 AsdaA: Km.
Los transformantes resistentes a cloranfenicol fueron después seleccionados y AsdaB::Cm se verificó por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos sdaBF y sdaBR. La cepa retenida fue designada MG1655 AsdaA::Km AsdaB::Cm. Los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol fueron después eliminados. El plásmido pCP20 que lleva FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol fue después introducido en los sitios recombinantes mediante electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol fue verificada por medio de un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos que se usaron previamente (sdaAF / sdaAR y sdaBF / sdaBR). La cepa retenida fue designada MG1655 DsdaA AsdaB. 2.2 Construcción de la cepa MG1655 AsdaA AsdaB ApykF6 Para eliminar el gen pykF, se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permitió la inserción de un cassette de resistencia a cloranfenicol o un cassette de resistencia a kanamicina, mientras eliminaba la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos: ApykFF (SEQ ID NO 18) cccatccttctcaacttaaagactaagactgtcatgaaaaagaccaaaattgtttgcacca tcggaccgaaaaccgaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (1753689-1753766) de la región pykF (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecoqene.org/), - una región (letra mayúscula) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), ApykFR (SEQ ID NO 19) ggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaccata actacaacgtcacctttgtgCATATGAATATCCTCCTTAG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (1755129-1755051 ) de la región pykF (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B. L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos ApykFF y ApykFR fueron usados para amplificar el cassette de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido fue luego introducido por medio de electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina fueron después seleccionados y la inserción del cassette de resistencia fue verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos pykFF y pykFR definidos más adelante. La cepa retenida fue designada MG1655 ApykF..Kvn. pykFF (SEQ ID NO 20) : gcgtaaccttttccctggaacg (homologa a la secuencia de 1753371 a 1753392). pykFR (SEQ ID NO 21 ) : gcgttgctggagcaacctgccagc (homologa a la secuencia de 1755518 a 1755495).
Para transferir ApykF::Km, se usó el método de transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 ApykF: :Km se usó para la transducción en la cepa G1655 AsdaA AsdaB.
Los transformantes resistentes a kanamicina fueron después seleccionados y ApykF Km se verificó por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos pykFF y pykFR. La cepa retenida fue designada MG1655 AsdaA AsdaB ApykFv.Km.
El cassette de resistencia a kanamicina fue después eliminado. El plásmido pCP20 que lleva FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT del cassette de resistencia a kanamicina fue después introducido en los sitios recombinantes mediante electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los cassettes de resistencia a kanamicina fue verificada por medio de un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos que se usaron anteriormente (sdaAF / sdaAR, sdaBF / sdaBR y pykFF / pykFR). La cepa retenida fue designada MG1655 AsdaA AsdaB ApykF. 2.3 Construcción de la cepa MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrc18-qpmA Ptrc18-qpmB Para incrementar el nivel de 3-fosfoglicerato, los mutantes Ptrcl8-gpmA y Ptrcl8-gpmB son construidos. Primero, para reducir la expresión del gen íosfoglicerato mutasa gpmA, el promotor es reemplazado por un promotor trc constitutivo modificado con actividad débil. El Ptrc18-gpmA es transferido a la cepa MG1655 AsdaA AsdaB ApykF por medio de transducción.
La cepa MG1655 Ptrcl8-gpmA::Km es primero construida usando el mismo método que se describe anteriormente con los siguientes oligonucleótidos: Ptrcl8-gpmAF (SEQ ID NO 22) CCACTGACTTTCGCCATGACGAACCAGAACCAGCTTAGTTA CAGCCATAATATACCTCCTTATTCCACACAgTATACGAGCCGGATGATTAA TcGcCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (786771 - 786819) del gen gpmA (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L , 2000, PNAS, 97. 6640-6645), - una región (letra mayúscula itálica) para la secuencia de promotor trc donde las cajas -35 y -10 están subrayadas.
Ptrcl8-gpmAR (SEQ ID NO 23) ggttatgcgtaagcattgctgttgctlcgtcgcggcaatataatgagaattattatcattaaaa gatgatttgaggagtaagtatCATATGAATATCCTCCTTAG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (786903-786819) de la región hacia el extremo 5' del gen gpmA (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos Ptrcl8-gpmAF y Ptrcl8-gpmAR son usados para amplificar el cassette de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido es después introducido mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46), en la cual la enzima recombinasa Red expresada permite la recombinación homologa. Los transformantes resistentes a kanamicina son después seleccionados, y la inserción del cassette de resistencia es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos gpmAF y gpmAR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG 655 Ptrcl8-gpmA:.Km. gpmAF (SEQ ID NO 24): CCTTCCTCTTTCAGCAGCTTACC (homologa a la secuencia de 786673 a 786695). gpmAR (SEQ ID NO 25) : cgacgatcagcgcaaagtgaaagg (homologa a la secuencia de 787356 a 787333).
Para transferir la modificación Ptrcl8-gpmA::Km, se usó transducción con el fago Pl. El protocolo seguido es ¡mplementado en dos pasos, primero con la preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 Ptrcl8-gpmA::Km, y segundo la transducción en la cepa MG1655 ksdaA AsdaB ApykF. La construcción de la cepa se describe anteriormente. 1 - Preparación del lisado de fago Pl Inoculación con 00 pl de un cultivo de toda la noche de la cepa MG1655 Ptrcl8-gpmA::Km de 10 mi de LB + Km 50 pg/ml + glucosa 0.2% + CaCI2 5 mM. Incubación durante 30 minutos a 37°C con agitación. -Adición de 100 pl de lisado de fago Pl preparado en la cepa MG1655 (aproximadamente 1.109 fago/ml).
Agitación a 37°C durante 3 horas hasta que todas las células fueron lisadas. A adición de 200 µ? de cloroformo y sometimiento a acción de remolino.
Centrifugación durante 10 minutos a 4500 g para eliminar los residuos de células.
Transferencia del supernadante a un tubo estéril y adición de 200 µ? de cloroformo.
Almacenamiento del lisado a 4°C. 2- Transducción Centrifugación durante 10 minutos a 1500 g de 5 mi de un cultivo de toda la noche de la cepa MG1655 AsdaA AsdaB ApykF en medio LB.
Suspensión de la pella de células en 2.5 mi de MgS04 10 mM, CaCI2 5 m Tubos de control: 100 µ? células. 100 µ? de fagos Pl de la cepa MG1655 Ptrc18-gpmA::Km -Tubo de ensayo: 100 pl de células + 100 µ? de fagos Pl de la cepa MG1655 Ptrc18-gpmA::Km.
Incubación durante 30 minutos a 300C sin agitación. Adición de 100 µ? de citrato de sodio 1 M en cada tubo y sometimiento a acción de remolino.
Adición de 1 mi de LB. - Incubación durante 1 hora a 37°C con agitación.
Esparcimiento en cajas de Petri de LB + Km 50 µg/ml después de centrifugación de los tubos durante 3 minutos a 7000 rpm.
Incubación a 37°C durante toda la noche. 3- Verificación de la cepa Los transformantes resistentes a kanamicina son después seleccionados y la modificación del promotor Ptrc18-gpmA::Km es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos gpmAF y gpmAR anteriormente descritos. La cepa retenida es designada MG1655 &sdaA AsdaB ApykF Ptrc18-gpmA::Km. Luego el Ptrcl8-gpmB es transferido a la cepa G1655 AsdaA ásdaB pykF Ptrcl8- gpmA:.Km mediante transducción. MG 1655 Ptrcl8-gpmB::Cm se construye primero usando el mismo método que se describe anteriormente con los siguientes oligonucleótidos: Ptrcl8-gpmBR (SEQ ID NO 26) CGGCGTTCC ACTGCGTTTCACCGTGGCGGACTAGGTATACCTGTAACATA AT AT AC CTC CTT ATTCC AC AC AgTATACG AG C C GG ATG ATT A ATcGcCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (4631414-4631366) del gen gpmB (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645), - una región (letra mayúscula itálica) para la secuencia de promotor trc donde las cajas -35 y -10 están subrayadas.
Ptrcl8-gpmBF (SEQ ID NO 27) Gcgggattggtggtcgcacagacaacttggtgcataatcagcattactcagaaaattaac gttacagcagtatacggaaaaaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (4631280-4631365) de la región hacia el extremo 5' del gen gpmB (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos Ptrcl8-gpmBF y Ptrcl8-gpmBR se usan para amplificar el cassette de resistencia a cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido es después introducido mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46), en la cual la enzima recombinasa Red expresada, permite la recombinación homologa. Los transformantes resistentes a cloranfenicol son luego seleccionados y la inserción del cassette de resistencia es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos gpmBF y gpmBR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 Ptrcl8-gpmB::Cm gpmBF (SEQ ID NO 28): ccttacgaccaatctcatcaataccgg (homologa a la secuencia de 4630906 a 4630932). gpmBR (SEQ ID NO 29) : GCAATACCATGACTCACCAGC (homologa a la secuencia de 4631823 a 4631803).
Para transferir la modificación Ptrcl8-gpmB::Cm, se usa transducción con el fago Pl. El lisado de fago de la cepa MG1655 Ptrcl8-gpmB::Cm se usa para la transducción en la cepa MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA: :Km. Los transformantes resistentes a cloranfenicol son seleccionados luego y Ptrcl8-gpmB::Cm se verifica mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos gpmBF y gpmBR. La cepa retenida es designada MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA::Km Ptrcl8-gpmB::Cm. Los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol pueden ser entonces eliminados. El plásmido pCP20 que lleva FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es después introducido en los sitios recombinantes por medio de electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es verificada mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos usados anteriormente (gpmAF / gpmAR y gpmBF / gpmBR). La cepa retenida es designada MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB. 2.4 Construcción de la cepa MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrc18-qpmA Ptrc18-qpmB (pME 01 -kivDII-yqhD-TT07) El plásmido pME101-kivDII-yqhD-TT07 es después introducido en la cepa MG1655 AsdaA AsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB.
EJEMPLO 3 Construcción de cepas con flujo de vía de 1 ,3-propanodiol incrementado: MG1655 AmetA Ap cF Af irLA8C::TT07-Ptrc-thrA*1 (pME101 -kivDII-yqhD-TT07) (pMA-aaoro) 3.1 Construcción de la cepa MG1655 AmetA Para eliminar el gen metA, se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un cassette de resistencia a cloranfenicol o un cassette de resistencia a kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos: AmetAF (SEQ ID NO 30) : ttcgtglgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatg acaacttctcgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (4212310-4212389) de la región metA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), AmetAR (SEQ ID NO 31 ) : atccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagacgtaatagttga gccagttggtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (4213229-4213150) de la región metA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos AmetAF y AmetAR se usaron para amplificar el cassette de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido fue después introducido mediante electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina fueron luego seleccionados y la inserción del cassette de resistencia fue verificada mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos AmetAF y AmetAR definidos más adelante. La cepa retenida fue designada MG 1655 AmetA::Km. metAF (SEQ ID NO 32) : tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc (homologa a la secuencia de 4212203 a 4212232). metAR (SEQ ID NO 33) : ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt (homologa a la secuencia de 4213301 a 4213272).
El cassette de resistencia a kanamicina fue después eliminado. El plásmido pCP20 que lleva FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT del cassette de resistencia a kanamicina fue después introducido en los sitios recombinantes mediante electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida del cassette de resistencia a kanamicina fue verificada por medio de un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos que se usaron anteriormente (metAF / metAR). La cepa retenida fue designada MG1655 AmetA. 3.2 Construción de la cepa MG1655 AmetA ApykF Para transferir ApykF: :Km, se usó transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 ApykFv.Km (antes descrita) se usó para la transducción en la cepa MG 655 AmetA.
Los transformantes resistentes a kanamicina son después seleccionados y ApykF.: Km se verificó por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos pykFF y pykFR. La cepa retenida fue designada MG1655 AmetA DpykF .Kw. 3.3 Construcción de la cepa MG1655 DmetA DpykF DthrLABC : :TT07-Ptrc-thrA* 1 Para incrementar la expresión del alelo resistente a retroalimentación de la aspartocinasa/homoserina deshidrogenasa, thrA* 1 , se construyeron los siguientes plásmidos: pSB1 para obtener thrA*1 y pSB2 para reemplazar el operón thrLABC por el alelo Ptrc-thrA*1.
El plásmido pSB1 se deriva del plásmido pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 ) y contiene el alelo thrA* de la aspartocinasa/homoserina con resistencia a retroalimentación reducida a treonina (Lee et al. 2003 J. Bacteriol. 185, 18 pp. 5442-5451 ) expresado a partir del promotor Ptrc. Para la construcción de pSB1 , thrA fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico usando los siguientes oligonucleótidos.
BspHIthrA (SEQ ID NO 34) : TTATCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (341 -371 ) del gen thrA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecoqene.org/), - una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción SspHI y bases extra, SmalthrA (SEQ ID NO 35) : TTACCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (2871 -2841 ) del gen thrA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecoqene.org/), - una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción Smal y bases extra.
El fragmento amplificado por PCR fue cortado con las enzimas de restricción BspHI y Smal y clonado en los sitios Ncol / Smal del vector pTRC99A (Stratagene). Para la expresión a partir de un vector de bajo número de copias el plásmido p E 101 fue construido como sigue. El plásmido pCL1920 fue amplificado por PCR usando los oligonucleótidos P E101 F y P E101 R y el fragmento BstZ17l-Xmnl del vector pTRC99A que contiene el gen lacl y el promotor Ptrc fue insertado en el vector amplificado. El vector resultante y el vector que contiene el gen thrA fueron restringidos por Apal y Smal y el fragmento que contiene thrA fue clonado en el vector pME101 . Para liberar ThrA de inhibición de retroalimentación la mutación thrAS345F fue introducida por mutagénesis dirigida en el sitio (Stratagene) usando los oligonucleótidos ThrA SF for y ThrA SF rev, dando por resultado el vector pSB1 .
PME101 F (SEQ ID NO 36) ccgacagtaagacgggtaagcctg PME101 R (SEQ ID NO 37) agcttagtaaagccctcgctag ThrA SF for (SEQ ID NO 38) CGTATTTCCGTGGTGCTGATTACGCAATTCTCTTCCGAGTAC TCAATCAGTTTCTGC ThrA SF rev (SEQ ID NO 39) GCAGAAACTGATTGAGTACTCGGAAGAGAATTGCGTAATCA GCACCACGGAAATACG Para eliminar el operón thrLABC y reemplazarlo por el alelo Ptrc-thrA*1 , se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un cassette de resistencia a cloranfenicol o un cassette de resistencia a kanamicina pero también de ADN adicional, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se construyó el siguiente plásmido, pSB2.
El plásmido pSB2 se deriva del plásmido pUC 18 (Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106) y contiene el cassette de resistencia a cloranfenicol asociado al alelo Ptrc-thrA*1 , clonado entre la región hacia el extremo 5' de thrL y la región hacia el extremo 3' de thrC.
Para la construcción de pSB2, la región hacia el extremo 5' de thrL y la región hacia el extremo 3' de thrC fueron amplificadas por PCR a partir de ADN genómico usando los siguientes oligonucleótidos: HpalupthrLF (SEQ ID NO 40) CGTAGTTAACGAATTCccaactagttgcatcatacaactaataaacgtgg con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (4638698-4638731) de la región thrL (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción Hpa\ y EcoR\ y bases extra.
BstZ17lupthrl_R (SEQ ID NO 41 ) CCCGGGGGAGGCGCCCGCGGATCCCGGTATACCAGAAAG GCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGAaggtaaccagttcagaagctgctatcag con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (87-60) de la región thrL (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula negrita) para la secuencia de terminador transcripcional T7te (Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Nati Acad Sci U S A. 24 de abril de 2001 ;98(9):5019-24 ), - una región (letra mayúscula) para el sitio de clonación múltiple que se compone de los sitios de restricción SsfZ17l, SamHI, Sfo\ y Sma\.
BamHIdownthrCF (SEQ ID NO 42) TCCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGGTATACCGGGA TCCGCGGGCGCCTCCCCCGGGaatctattcattatctcaatcaggccggg con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (5021-5049) de la región thrC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecoqene.org/), - una región (letra mayúscula negrita) para la secuencia de terminador transcripcional T7te (Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Nati Acad Sci U S A. 24 de abril de 2001 ;98(9):5019-24.), - una región (letra mayúscula) para el sitio de clonación múltiple que se compone de los sitios de restricción BsfZ17l, BamHI, Sfol y Smal .
HpaldownthrCR (SEQ ID NO 43) CGTAGTTAACGAATTCgagaatgcccgagggaaagatctg con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (6054-6031 ) de la región thrC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción /-/pal y EcoR\ y bases extra.
Primero, los fragmentos "upthrL" y "downthrC" fueron amplificados por PCR a partir de ADN génomico MG1655 usando oligonucleótidos HpalupthrLF / BstZ17lupthrLR y BamHIdownthrCF / HpaldownthrCR, respectivamente. Segundo, el fragmento "upthrL-downthrC" fue amplificado a partir de fragmentos PCR "upthrL" y "downthrC" (que posee una región superpuesta compuesta de un terminador transcripcional T7Te y el sitio de clonación múltiple compuesto de los sitios de restricción BsfZ17l, fíamHI, Sfo\ y Smal) usando oligonucleótidos HpalupthrLF / HpaldownthrCR. El fragmento PCR "upthrL-downthrC" fue cortado con la enzima de restricción Hpal y clonado en los sitios EcoR\ I Sfo\ del vector pUC18, dando el plásmido pUC18-DthrLABC::TT07-SMC.
Después, el cassette de resistencia a cloranfenicol fue amplificado por PCR a partir del vector pKD3 usando los siguientes oligonucleótidos: BstZ17ICmF (SEQ ID NO 44) GGGGTATACtgtaggctggagctgcttcg con - una región (letra minúscula) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción BstZM\ y bases extra.
BamHICmR (SEQ ID NO 45) CGCGGATCCcatatgaatatcctccttag con - una región (letra minúscula) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción BamHI y bases extra.
El fragmento PCR fue cortado con las enzimas de restricción BsrZ17l y fiamHI y clonado en los sitios BsfZ17l / BamH\ del plásmido pUC18-AthrLABC :TT07-SMC, dando el plásmido pUC18-AthrLABC::TT07-SMC::Cm.
Por ultimo, el alelo Ptrc-thrA*1 fue cortado del plásmido pSB1 con las enzimas de restricción Sfo\ y Smal y clonado en los sitios Sfol / Sma\ del plásmido pUC18-Athrl_ABC::TT07-SMC::Cm, dando el plásmido pUC18-&\hrLABCTJ07-Ptrc-thrA*1 :Cm o pSB2.
El fragmento Ar/)r BC::TT07-Ptrc-thrA*1 ::Cm fue obtenido cortando el plásmido pSB2 con la enzima de restricción EcoRI y después fue introducido por electroporación en la cepa MG1655 (pKD46), en la cual la enzima recombinasa Red permite la recombinación homologa. Los transformantes resistentes a cloranfenicol son después seleccionados y la inserción del cassette de resistencia es verificada mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos thrA*1 F y thrA*1 R definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 MhrLABO :TT07-Ptrc-thrA*1 ::Cm. thrA*1 F (SEQ ID NO 46) : cgtgttgcgtgttaccaactcg (homologa a la secuencia (4638276-4638297) de la región thrL (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/)). thrA*1 R (SEQ ID NO 47) cggaaactgacgcctccgcag (homologa a la secuencia (6345- 6325) de la región thrC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecoqene.org/)).
Los plásmidos recombinantes fueron verificados mediante secuenciación de ADN.
Para transferir AfhrLA8C::TT07-Ptrc-thrA ::Cm, se usa transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 A//?r SC::TT07-Ptrc-thrA*1 ::Cm se usa para la transducción en la cepa MG1655 AmetA DpykF::Km.
Los transformantes resistentes a kanamicina y cloranfenicol son seleccionados luego y A/ftrL46C::TT07-Ptrc-thrA*1 ::Cm se verifica mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos thrA*1 F y thrA*1 R. La cepa retenida es designada MG1655 AmetA ApykF::Km AfftrLAfíC: :TT07-Ptrc-thrA*1 ::Cm.
Los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol pueden ser entonces eliminados. El plásmido pCP20 que lleva FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es después introducido en los sitios recombinantes por medio de electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es verificada mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos usados anteriormente (metAF / metAR, pykF / pykFR y thrA*1 F / thrA* 1 R). La cepa retenida es designada G1655 AmetA kpykF ffrrLAeC: :TT07-Ptrc-thrA* . 3.4 Conslrucción del plásmido pMA-aaoro Un gen sintético del gen Rhodococcus opacus aao que codifica para aminoácido oxidasa fue preparado por Geneart (Alemania). El uso de codón y contenido de GC del gen fueron adaptados a Escherichia coli de acuerdo con la matriz del proveedor. La expresión del gen sintético fue impulsada por un promotor Ptrc constitutivo. La construcción fue clonada en el vector pMA del proveedor y verificada mediante secuenciación.
Ptrc01-aaoro : sitios de restricción (Kpnl, EcoRI, Smal) (SEQ ID NO 48): ggtaccgaattccccggg promotor PtrcOI y RBS (SEQ ID NO 49): gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaaggatcccccgggtaagg aggttataa secuencia del gen aaoro optimizada para E. coli (AY053450.) (SEQ ID NO 50): atggcatttacccgtcgcagctttatgaaaggtctgggtgcaaccggtggtgcaggtctgg catatggtgcaatgagcaccctgggtctggcaccgtctacagcagcaccggcacgtacctttcagccgctgg cagccggtgatctgattggtaaagtgaaaggtagccatagcgttgttgttctgggtggtggtccggcaggtctgt gtagcgcatttgaactgcagaaagccggttataaagttaccgttctggaagcacgtacccgtccgggtggtcg tgtttggaccgcacgtggtggtagcgaagaaaccgatctgagcggtgaaacccagaaatgtacctttagcg aaggccatttttataatgttggtgccacccgtattccgcagagccatattaccctggattattgtcgcgaactggg tgttgaaattcagggtttcggcaatcaaaatgccaatacctttgtgaattatcagagcgataccagcctgagcg gtcagagcgttacctatcgtgcagcaaaagcagatacctttggctatatgagcgaactgctgaaaaaagca accgatcagggtgcactggatcaggttctgagccgtgaagataaagatgcactgagcgaatttctgagcgat tttggtgatctgtctgatgatggtcgttatctgggtagcagccgtcgtggttatgatagcgaaccgggtgccggtc tgaattttggcaccgaaaaaaaaccgtttgccatgcaggaagttattcgtagcggtattggtcgcaattttagctt tgattttggctatgatcaggccatgatgatgtttacaccggtlggtggtatggatcgtatttattatgcctttcaggat cgtattggcactgataacatcgtgttcggtgccgaagttaccagcatgaaaaatgttagcgaaggtgtgaccg ttgaatataccgcaggcggtagcaaaaaaagcattaccgcagattatgccatttgtaccattcctccgcatctg gttgglcgtctgcagaataatctgcctggtgatgttctgaccgcactgaaagcagcaaaaccgagcagcagc ggtaaactgggtattgaatatagccgtcgttggtgggaaaccgaagatcgcatttatggtggtgcaagcaata ccgataaagatattagccagattatgtttccgtatgatcattataatagcgatcgtggtgttgttgttgcatattata gctctggtaaacgccaggaagcatttgaaagcctgacccatcgtcagcgtctggcaaaagcaattgcagaa ggcagcgaaattcacggcgaaaaatatacccgtgatattagcagcagctttagcggtagctggcgtcgtacc aaatatagcgaaagcgcatgggcaaattgggcaggtagcggtggttctcatggtggtgcagccactccgga atatgaaaaactgctggaaccggtggataaaatttattttgccggtgatcatctgagcaatgcaatcgcatggc agcatggtgcactgaccagcgcacgtgatgttgttacccatattcatgaacgtgttgcacaggaagcctaa sitios de restricción (Bglll, EcoRV, Pací, Sacl, Xbal, Hindlll) (SEQ ID NO 51 ): gatctgatatcttaattaagagctctctagaaagctt 3.5 Construcción de la cepa MG1655 AmetA ApykF AthrLABC: :TT07-Ptrc-thrA (pME101 -kivDII-yqhD-TT07) (pMA-aaoro) Los plásmidos pME101-k¡vDII-yqhD-TT07 y pMA-aaoro son luego introducidos en la cepa MG1655 AmefA ApykF Aí/?rLABC::TT07-Ptrc-thrA*1.
EJEMPLO 4 Construcción de cepas con flujo de vía de 1 ,4-butanodiol incrementado: MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AqdhA (pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01 - adhE2ca-prpE-TT02) (pME101 -kivDII-yqhD-TT07) 4 1 Construcción de la cepa MG 655 AaceBAK AsucCD Para eliminar los genes aceBAK, se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un cassette de resistencia a cloranfenicol o un cassette de resistencia a kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos: AaceBAKF (SEQ ID NO 52) : ctggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccgaagcggt agaatttctgactgagctggtTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (4213531-4213610) de la región aceB (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), AaceBAKR (SEQ ID NO 53) : aacatcttccacatgcccttcacgtatgcggttttgtagtgcgcgccagtaatcagcgcgga acaggtcggcgtgcatcCATATGAATATCCTCCTTAG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (4218298-4218220) de la región aceK (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos AaceBAKF y AaceBAKR se usan para amplificar el cassette de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido es luego introducido mediante electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina son después seleccionados y la inserción del cassette de resistencia es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos aceBAKF y aceBAKR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 AmerA:Km. aceBAKF (SEQ ID NO 54) : cgttaagcgattcagcaccttacc (homologa a la secuencia de 4213251 a 4213274). aceBAKR (SEQ ID NO 55) : aacgcattacccactctgtttaatacg (homologa a la secuencia de 4218728 a 4218702).
Para eliminar los genes sucCD, se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un cassette de resistencia a cloranfenicol o un cassette de resistencia a kanamicina, mientras elimina la mayoria de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos: AsucCDF (SEQ ID NO 56) : tttttgcccgctatggcttaccagcaccggtgggttatgcctgtactactccgcgcgaagca gaagaagccgcttcaaaaCATATGAATATCCTCCTTAG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (762268-762347) de la región sucC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), AsucCDR (SEQ ID NO 57) : atatccgccaggctgcgaacggttttcacgcctgcggcttccagagcagcgaatttctcat ccgcagtccctttaccggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (764241 -764168) de la región sucD (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L. , 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos DsucCDF y DsucCDR se usan para amplificar el cassette de resistencia a cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido es después introducido mediante electroporación a la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a cloranfenicol son luego seleccionados y la inserción del cassette de resistencia es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos sucCDF y sucCDR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 AsucCD :Cm. sucCDF (SEQ ID NO 58) : tcgcgaatccgtgggcttcctggtaacg (homologa a la secuencia de 761887 a 761914). sucCDR (SEQ ID NO 59: cctctgatgccaaccgaagagatgagccg (homologa a la secuencia de 764555 a 764527).
Para transferir AaceBAKv.Km, se usa el método de transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 DaceBAK: :Km se usa para la transducción en la cepa MG1655 AsucCD: :Cm .
Los transformantes resistentes a kanamicina y cloranfenicol son seleccionados luego y AaceBA ::Km se verifica mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos aceBAKF y aceBAKR. La cepa retenida es designada MG1655 sucCD .Cm AaceBAK .Km.
Los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol pueden ser entonces eliminados. El plásmido pCP20 que lleva FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es después introducido en los sitios recombinantes por medio de electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es verificada mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos usados anteriormente (aceBAKF / aceBAKR, y sucCDF / sucCDR). La cepa retenida es designada MG1655 AsucCD AaceBAK. 4.2 Construcción de la cepa MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AqdhA Para eliminar el gen arcA, se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un cassette de resistencia a cloranfenicol o un cassette de resistencia a kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos: AarcAF (SEQ ID NO 60) : cccgcacattcttatcgttgaagacgagttggtaacacgcaacacgttgaaaagtattttcg aagcggaaggctatgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (4638322-4638245) de la región arcA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), AarcAR (SEQ ID NO 61 ) : ccagatcaccgcagaagcgataaccttcaccgtgaatggtggcgatgatttccggcgtat ccggcgtagattcgaaatgCATATGAATATCCTCCTTAG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (4637621-4637699) de la región arcA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), Los oligonucleótidos DarcAF y DarcAR se usan para amplificar el cassette de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido es después introducido mediante electroporación a la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina son luego seleccionados y la inserción del cassette de resistencia es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos arcAF y arcAR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 AarcA .Kvn. arcAF (SEQ ID NO 62) . cgacaattggattcaccacg (homologa a la secuencia de 4638746 a 4638727). arcAR (SEQ ID NO 63) : gcggtattgaaaggttggtgc (homologa a la secuencia de 4637308 a 4637328).
Para transferir AarcA..Km, se usa transduccion con el fago Pl. El lisado de fago de la cepa MG1655 DarcA::Km se usa para la transduccion en la cepa MG1655 AsucCD AaceBAK.
Los transformantes resistentes a kanamicina son seleccionados luego y AarcA: . Km se verifica mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos arcAF and arcAR. La cepa retenida es designada MG1655 AsucCD AaceBAK AarcAv.Km.
Para eliminar el gen gdhA, se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Los oligonucleótidos AgdhAF y AgdhAR se usan para amplificar el cassette de resistencia a cloranfenicol a partir del plásmido pKD3.
AgdhAF (SEQ ID NO 64) : taaacaacataagcacaatcgtattaatatataagggttttatatctatgTGTAGGCT GGAGCTGCTTCG con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia ( 1840348 to 1840397) hacia el extremo 5' del gen gdhA (http://ecogene.org/blast.php) - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), AgdhAR (SEQ ID NO 65) : taagcgtagcgccatcaggcatttacaacttaaatcacaccctgcgccagCATATGA ATATCCTCCTTAG con : - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (1841767 a 1841718) al extremo y la región hacia el extremo 3' del gen gdhA (http://ecogene.org/blast.php) - una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del cassette de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
El producto PCR obtenido es después introducido mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a cloranfenicol son luego seleccionados y la inserción del cassette de resistencia es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos Ptrc-gdhAverF y gdhA R.
Ptrc-gdhAverF(SEQ ID NO 66) : CCTTAACGTTATTGTCTCTGC - una región homologa a la secuencia (1840168-1840188) de la región hacia el extremo 5' del gen gdhA (http://ecogene.org/blast.php) gdhA R(SEQ ID NO 67) : GGAGGAAGCCCCAGAGCAGG - una región homologa a la secuencia (1842274-1842293) de la región hacia el extremo 3' del gen gdhA (http://ecogene.org/blast.php).
La cepa obtenida fue nombrada MG1655 AgdhA .Cm.
Para transferir AgdhA::Cm, se usa transducción con el fago Pl. El lisado de fago de la cepa MG1655 AgdhA/.Cm se usa para la transducción en la cepa MG1655 AsucCD AaceBAK AarcAv.Km.
Los transformantes resistentes a kanamicina y cloranfenicol son seleccionados luego y AgdhA..Cm se verifica mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos Ptrc-gdhAverF y gdhA R. La cepa retenida es designada MG1655 AsucCD AaceBAK AarcAv.Km AgdhA::Cm.
Los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol pueden ser entonces eliminados. El plásmido pCP20 que lleva FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es después introducido en los sitios recombinantes por medio de electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los cassettes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es verificada mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos usados anteriormente (aceBAKF / aceBAKR, sucCDF / sucCDR, arcAF / arcAR, y gdhAverF / gdhA R). La cepa retenida es designada MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AgdhA. 4.3 Construcción de un plásmido para sobreexpresión del acetaldehído-CoA/alcohol deshidroqenasa bifuncional adhE2 de Clostridium acetobutylicum y el gen propionil-CoA sintetasa prpE de Escherichia coli: pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01 -adhE2ca-prpE-TT02 El gen adhE2 de Clostridium acetobutylicum que codifica para la acetaldehído-CoA/alcohol deshidrogenase bifuncional fue clonado en el plásmido pUC19. El gen prpE que codifica para la propionil-CoA sintetasa fue clonado hacia el extremo 5' adhE2.
El gen adhE2 fue amplificado por PCR a partir del megaplásmido pSoM de la cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC824 (posición 33722 a 36298) con los oligonucleótidos adhE2Ca F y adhE2Ca R. adhE2Ca F (SEQ ID NO 68) : ggtaccggatccgggcccqaqctqttqacaattaatcatccqgctcgtataatgtgtqq aaf/qfQaQcqf,Qa/aacaafrT CGTAtaaqqagqtatattATGAAAGTTACAAATCAAAA AGAAC con - región (letra minúscula negrita) para la adición del sitio de restricción Kpn\, SamHI, Apa\. - región (letra minúscula subrayada) para la adición del promotor PtrcOI - región (letra minúscula itálica) para la adición de una secuencia de operador OP01 - región (letra mayúscula negrita) para la adición del sitio de restricción SnaBI - región (tetra minúscula) para la adición de la secuencia RBS01 - región (letra mayúscula subrayada) homologa a la región C.acetobutylicum adhE2 de 33722 a 33752 adhE2Ca R (SEQ ID NO 69) : GAGCTCAAGCTTaacagataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcct ttcgttttaWgatqcc/aqqgcfaqcrcfaqaf aaTT/AAAATGATTTTATATAGATATCCTT AAGTTCAC, con - región (letra mayúscula) para la adición del sitio de restricción H/ndlll, Sacl. - región (letra minúscula subrayada negrita) para la adición del terminador TT02 - región (letra itálica) para la adición del sitio de restricción Pací, Xba\ , Nhe\, Avrí\ - región (letra mayúscula subrayada) homologa a la región C.acetobutylicum adhE2 de 36264 a 36298).
Este fragmento PCR fue digerido con BamHI y Hind\\\ y clonado en el vector pUC19 digerido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido obtenido fue nombrado pUC19-Ptrc01 /OP01 /RBS01 -ad ?E2ca-TT02.
Para amplificar el gen prpE, una PCR se lleva a cabo usando ADN cromosómico de E. coli como plantilla y los iniciadores prpE F y prpE R. prep F (SEQ ID NO 70) : tctagaggatccaagttcaacaggaqagcattatq - una región (negrita subrayada) para la adición de los sitios de restricción Xba\ y fíamHI - una región homologa (letra minúscula) a la región de 351910 a 351932 (http://ecogene.org/blast.php) prep R_(SEQ ID NO 71 ) : ggatccgctagccctaggtacgtactactcttccatcqcctqqc - una región (negrita subrayada) para la adición de los sitios de restricción SamHI, Nhe\, Avrí\, SnaBW - una región (letra minúscula) homologa a la región de 353816 a 353797 (http://ecogene.org/blast.php) Este fragmento PCR fue digerido con Xba\ y Nhe\ y clonado en el vector pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01 -ad/7E2ca-TT02 digerido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido obtenido fue nombrado pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01 -adA)E2ca-prpE-TT02. 4.4 Construcción de la cepa MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AqdhA (pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01 -adhE2ca-prpE-TT02) (pME101 -kivDII-vqhD-TT07) Los plásmidos pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02 y pME101-kivDII-yqhD-TT07 son después introducidos en la cepa MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA AgdhA.
EJEMPLO 5 Fermentación de cepas que producen etilenglicol en matraces Erlenmeyer Los rendimientos de las cepas fueron evaluados en cultivos en matraz Erlenmeyer con deflectores de 500 mi usando medio M9 modificado (Anderson, 1946, Proc Nati. Acad. Sci. USA 32: 120-128) que fue complementado con 10 g/l MOPS y 10 g/l glucosa y ajustado a pH 6.8. En caso de ser necesario se añadió espectinomicina a una concentración de 50 mg/l y/o cloranfenicol se añadió en caso de ser necesario a una concentración de 30mg/l. Un precultivo de 24h se usó para inocular un cultivo de 50 mi a un OD600 nm de aproximadamente 0.3. Los cultivos fueron mantenidos en un agitador a 37°C y 200 rpm hasta que la glucosa en el medio de cultivo se agotó. Al final del cultivo, la glucosa y productos principales fueron analizados mediante CLAR usando una columna Biorad HPX 97H para la separación y un reíractómetro para la detección. La producción de etilenglicol fue confirmada por medio de cromatografía de gases /espectrometría de masa (GC/MS) con un cromatógrafo de gases Hewlett Packard serie 6890 acoplado a un detector selectivo de masa Hewlett Packard serie 5973 (El) y una columna HP-INNOWax (25 m de longitud, 0.20 mm i.d., grosor de película 0.20 mieras). El tiempo de retención y espectro de masa de etilenglicol generado fueron comparados con aquel de etilenglicol auténtico.
La comparación de los rendimientos entre la cepa de producción y la cepa de referencia se da en el cuadro a continuación (ver a continuación para la construcción de la cepa de producción).
Reí del Genotipo de la cepa [etilenglicol] cultivo (mM) FbDI_0180 MG1655 DpykF nd FbDI_0184 MG1655 DpykF (pME101 -kivDII- 0.63 yqhD-yeaB-TT07) (pCC 1 BAC-serA) nd : no detectado.
EJEMPLO 6 Construcción de una cepa con flujo de vía de etilenglicol incrementado: MG1655 ApykF (pME101 -/c/VDII-yqA>D-yeaB-TT07) (pCC1BAC-serA) 6.1 Construcción de un plásmido para la sobreexpresión del ácido hidroxi ceto descarboxilasa kivD de Lactococcus lactis, los genes hidroxi aldehido reductasa yqhD y fosfohidroxi piruvato fosfatasa yeaB de Escherichia coli: plásmido pME101-kivDH -yqhD-yeaB-TT07 El fragmento que contiene yeaB fue restringido por Xba\ y BglU y clonado en el vector pME 101 -/(/VDII-yqihD restringido por las mismas enzimas de restricción, el plásmido resultante fue llamado pME101 -/</VDII- yqhD-yeaB- TT07.
El gen yeaB fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico de la cepa MG1655 de E. coli con los oligonucleótidos yeaB F y yeaB R : yeaB F (SEQ ID NO 72) AGCJGTATACTA GAA TICA TA GA TC rtaaqqaqqtatattATGGAAT ACCGTAGCCTGACGC - una región (letra mayúscula itálica negrita) para adición de los sitios de restricción Bs/2171, EcoRI y BglW. - una región (letra minúscula subrayada) para adición de un sitio de unión de ribosoma. - una región (letra mayúscula) homologa a la región G1655 yeaB de E. coli de 1894195 a 18942 5 (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), yeaB R (SEQ ID NO 73) GC TTATAAGCCAGCTGGCTC TAGATAGCAGAAAGGCCCACC CGAAGGTGAGCCAGGA G TA TA CA TGAA G CA TTTCCG TTAA TTAA CGGAGC 7CATCC77\GGTCAGGGTTTCACACCAATTTGCAGCGCC - una región (letra mayúscula negrita) homologa a la región MG1655 yeaB de E. coli de 1894772 a 1894745 (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula subrayada) homologa a la secuencia de terminador T7Te (ref: Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Nati Acad Sci U S A. 24 de abril de 2001 ;98(9):5019-24.) : - una región (letra mayúscula itálica) para adición de los sitios de restricción Ps/I, PvuW, Xba\, BstZM\, Xmn\, Pací, Sacl y Avril.
El fragmento amplificado por PCR fue cortado con las enzimas de restricción Xba\ y BglW y clonado en los sitios Xbal - fíg/ll del vector pME 101 -/oVDII-yq ?D-TT07 dando el vector pME 101 -/aVDII-yg/?D-yeaB-TT07. 6.2 Construcción de un plásmido para sobreexpresión del fosfoglicerato deshidroqenasa serA de Escherichia coli: plásmido pCC I BAC-serA Para incrementar la expresión del gen serA, el gen fue expresado a partir del vector de control de copia pCC BAC (Epicentre) usando su propio promotor.
Para este propósito, el gen serA fue amplificado a partir del genoma de E. coli usando los oligonucleótidos serA F y serA R. El producto PCR fue restringido usando las enzimas Xba\ y Smal y clonado en el vector pUC 18 (Stratagene) restringido por las mismas enzimas de restricción. El vector resultante fue nombrado pl)C18-serA. serA F (SEQ ID NO 74) : ctagTCTAGATTAGTACAGCAGACGGGCGCG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (3055199 - 3055220) del gen serA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (negrita) que contiene el sitio Xbal serA R (SEQ ID NO 75) : tccCCCGGGAAGCTTCCGTCAGGGCGTGGTGACCG con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (3056880 - 3056861 ) de la región del gen serA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene org/), - una región (negrita) que contiene los sitios Smal y Hind\\\.
Para transferir el gen serA en el vector de control de copia pCC BAC, el vector pUC18-serA fue restringido con la enzima HindIII y clonado en HindIII pCCI BAC listo para clonación (Epicentre).
La construcción resultante fue verificada y llamada pCCI BAC-serA. 6.3 Construcción de la cepa MG1655 ApykF (pME 101 -kivDII-yqhD-veaB-TT07) (pCC 1 BAC-serA) La construcción de la cepa MG1655 ApykF fue detallada anteriormente (parte 2.2).
Los plásmidos pCC 1 BAC-serA y pME 101 -/í/VDII-yq/7D-yeaB-TT07 fueron después introducidos en la cepa MG 655 ApykF.
EJEMPLO 7 Demostración de la actividad ácido hidroxi ceto descarboxilasa codificada por el gen kivD de Lactococcus lactis 7.1 Construcción de la cepa para caracterización de KivD: BL21 (pPAL7-kivDII) Para caracterizar la proteina KivD, el gen correspondiente fue precisado a partir del vector de expresión pPAL7 (Bio-rad).
Para este propósito, el gen kivD fue amplificado a partir del genoma de Lactococcus lactis usando los oligonucleótidos pPAL7-kivDII F y pPAL7-kivDII R. El producto PCR fue restringido usando las enzimas Hind\\\ y EcoRI y clonado en el vector pPAL7 restringido por las mismas enzimas de restricción. El vector resultante fue nombrado pPAL7-kivDII. pPAL7-kivDII F (SEQ ID NO 76) : cccAAGCTTtqACTTCT/A TG TA TA CCGTGGGTGA TTA TC con - una región (itálica) homologa a la secuencia del gen sintético del gen Lactococcus lactis kivD, - una región (negrita) que contiene los nucleótidos necesarios para generar proteína libre de etiqueta que contiene una extensión de aminoácido N-terminal corta para favorecer la purificación. - una región (subrayada) que contiene el sitio de restricción HindW). pPAL7-kivDII R (SEQ ID NO 77) : g GAATTC TTAGC TTTTA TTC TG TTCGGCGAA CA G con - una región (itálica) homologa a la secuencia del gen sintético del gen Lactococcus lactis kivD, - una región (subrayada) que contiene el sitio de restricción EcoRI.
El plásmido pPAL7-/</VDII fue después introducido en las células competentes de la cepa BL21 (DE3) (Invitrogen). 7.2 Sobreproducción de la proteina KivD La sobreproducción de la proteina KivD se realizó en un matraz Erlenmeyer de 2 I, usando caldo LB (Bertani, 1951 , J. Bacteriol. 62:293-300) que fue complementado con 2.5 g/l glucosa y 100 mg/l de ampicilina. Un precultivo de toda la noche se usó para inocular un cultivo de 500 mi a un OD6oonm de aproximadamente 0.15. Este precultivo se llevó a cabo en un matraz Erlenmeyer de 500 mi lleno con 50 mi de caldo LB que fue complementado con 2.5 g/l glucosa y 100 mg/l de ampicilina. El cultivo se mantuvo primero en un agitador a 37°C y 200 rpm hasta que OD6oo nm fue aproximadamente 0.5 y después el cultivo fue movido en un segundo agitador a 25°C y 200 rpm hasta que OD6oo nm fue 0.6 - 0.8 (aproximadamente una hora), antes de inducción con IPTG 500 µ?. El cultivo se mantuvo a 25°C y 200 rpm hasta que OD6oo nm fue aproximadamente 4, y después fue detenido. Las células fueron centrifugadas a 7000 rpm, 5 minutos a 4°C, y luego almacenadas a -20°C. 7.3 Purificación de la proteina KivD 7.3.1 Paso 1 : Preparación de extractos libres de células Aproximadamente 188 mg de biomasa de E. coli fueron suspendidos en 30 mi de fosfato de potasio 100 mM pH 7.6, y una mezcla de inhibidor de proteasa. La suspensión de células (15 mi por tubo cónico) fue sonicada en hielo (Bandelin sonoplus, 70 W) en un tubo cónico de 50 mi durante 8 ciclos de 30 seg con intervalos de 30 seg. Después de la sonicación, las células fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente con MgCI2 5 mM y 1 UI/ml de DNasel. Los residuos de las células fueron retirados por medio de centrifugación a 12000g durante 30 minutos a 4°C . 7.3.2 Paso 2: Purificación por afinidad La proteina fue purificada a partir de extracto de células crudo por afinidad en una columna Profinity (BIORAD, Bio-Scale Mini Profinity cartucho exacto 5 mi) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El extracto crudo fue cargado en un cartucho exacto Profinity de 5 mi equilibrado con fosfato de potasio 100 mM pH 7.6. La columna fue lavada con 10 volúmenes de columna del mismo regulador de pH e incubada toda la noche con fosfato de potasio 100 mM pH 7.6, fluoruro 100 mM a 4°C. La proteina fue eluída de la columna con 2 volúmenes de columna de fosfato de potasio 100 mM pH 7.6. La etiqueta permaneció fuertemente unida a la resina y la proteína purificada fue liberada. Las fracciones que contenían la proteina fueron depositadas y dializadas contra fosfato de potasio 100 mM, NaCI 150 mM y 0% glicerol pH 8.
La concentración de proteína fue medida usando el ensayo de proteína Bradford. 7.4 Ensayo de ácido hidroxi ceto descarboxilasa 7.4.1 Síntesis química de ácido 5-hidroxi-2-cetopentanoico La síntesis química de ácido 5-hidroxi-2-cetopentanoico ha sido descrita en la publicación: Friedhelm Korte, Karl Heinz Büchel, a,-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung, X. a-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung in wáBriger Salzsáure Chemische Berichte, Volumen 92 Ejemplar 4, páginas 877 - 883 (1959). 7.4.2 Síntesis química de ácido 4-hidroxi-2-cetobutirico La síntesis química de ácido 4-hidroxi-2-cetobutirico ha sido descrita en la publicación: R S Lañe ;EE Dekker ; (1969). 2-keto-4-hydroxybutyrate. Synthesis, chemical properties, and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscle Biochemistry., 8 (7), 2958-2966. 7.4.3 Ensayo de ácido hidroxi ceto descarboxilasa La descarboxilación de ácidos hidroxi ceto fue medida a 30°C usando un ensayo enzimático acoplado. El ensayo de actividad ácido hidroxi ceto descarboxilasa se llevó a cabo con regulador de pH de fosfato de potasio 50 mM pH 6, NADH 0.2 mM, MgS04 1 mM, difosfato de tiamina 0.5 mM, 72 unidades/ml alcohol deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae, ácido hidroxi ceto 10 mM neutralizado (ácido hidroxipirúvico o ácido 4-hidroxi-2-cetobutírico o ácido 5-hidroxi-2-cetopentanoico) y aproximadamente 40 g de proteína purificada en un volumen total de 1 mi. El consumo de NADH fue monitoreado a 340 nm en un espectrofotómetro. La actividad detectada en ensayo de control, que carece del sustrato, fue sustraída de la actividad detectada en el ensayo con sustrato. Una unidad de actividad ácido hidroxi ceto descarboxilasa es la cantidad de enzima requerida para catalizar la descarboxilación de 1 pmol de ácido hidroxi ceto por minuto a 30°C. (Epsilon 340 nm = 6290 M-1 cm-1). 7.5 Actividad de enzima purificada EJEMPLO 8 Demostración de la actividad hidroxi aldehido reductasa codificada por el gen yqhD de Escherichia coli 8.1 Construcción de una cepa para caracterización de YqhD: MG1655 ApykF::Km (pTRC99A-vqhD) 8.1.1 Construcción de la cepa MG1655 AvqhD::Km Para eliminar el gen yqhD, se usó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un cassette de resistencia a cloranfenicol o kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos: AyqhDF (SEQ ID NO 78) atgaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattctgtttggtaaaggcgcaatcgctg gtttacgcgaacaaattccgtgtaggctggagctgcttcg con - una región (letra minúscula) homologa a la secuencia (3153377 a 3153456) de la región yqhD (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecoqene.org/), - una región (letra mayúscula) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), AyqhDR (SEQ ID NO 79) ttagcgggcggcttcgtatatacggcggctgacatccaacgtaatgtcatgattttcgccca gttgqqtcatgccgtgctccatatgaatatcctccttag con - una región (letra mayúscula) homologa a la secuencia (3154540 a 3154460) de la región yqhD (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (letra mayúscula) para la amplificación del cassette de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos AyqhDF y AyqhDR se usan para amplificar el cassette de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido es después introducido por medio de electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina son luego seleccionados y la inserción del cassette de resistencia es verificada mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos yqhDF y yqhDR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 Ayg/iD::Km. yqhDF (SEQ ID NO 80) : ggcgtctcgccatacaacaaacgcacatcgggc (homologa a la secuencia de 3153068 a 3153100). yqhDR (SEQ ID NO 81 ) : gggctttgccgacaccttcttcgttcttg (homologa a la secuencia de 3154825 a 3154797). 8.1 .2 Construcción del plásmido pTRC99A-vqhD Para caracterizar la proteina YqhD, el gen correspondiente fue expresado a partir del vector pTRC99A (Amersham).
Para este propósito, el gen yqhD fue amplificado a partir del genoma de E. coli usando los oligonucleótidos yqhD F pTRC99A F y yqhD R pTRC99A R. El producto PCR fue restringido usando las enzimas Hind\\\ y SspHI y clonado en el vector pTRC99A restringido por las enzimas de restricción Nco\-Hind\\\. El vector resultante fue nombrado pTRC99A-yqhD. yqhD F pTRC99A F (SEQ ID NO 82) : cgatgcacgtcatgaacaactttaatctqcacaccccaacccq, con: - una región (subrayada) homologa a la secuencia (3153377 a 3153408) del gen yqhD (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - un sitio de restricción BspH\ (negrita) yqhD R pTRC99A R (SEQ ID NO 83) : gqcqtaaaaaqcttaqcqqqcggcttcgtatatacggcggctqacatccaacqtaatqt c tqattttcq con. - una región (subrayada) homologa a la secuencia (3154540 a 3154483) del gen yqhD (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - un sitio de restricción Hind\\\ (negrita).
El plásmido pTRC99A-ycftD fue después introducido en la cepa MG1655 AyqhD::Km. 8.2 Sobreproducción de la proteina YqhD La proteína YqhD fue sobreproducida a 37°C bajo condiciones aeróbicas en matraces Erlenmeyer con deflectores de 2 I con 500 mi de medio LB con 2.5 g/l glucosa y 50 mg/l de ampicilina y 50 mg/l de kanamicina. Los matraces fueron agitados a 200 rpm en un agitador orbital. Cuando la densidad óptica medida a 550 nm alcanzó 0.5 unidades, los matraces fueron incubados a 25°C. Cuando la densidad óptica alcanzó 1.2 unidades, la producción de proteínas YghD fue inducida añadiendo IPTG a una concentración final de 500 µ?. La biomasa fue cosechada mediante centrifugación cuando los cultivos alcanzaron una densidad óptica por arriba de 3.5 unidades. El supernadante fue desechado y la pella fue almacenada a -20°C antes de usar. 8.3 Purificación de la proteina YqhD 8.3.1 Paso 1 : Preparación de extractos libres de células 400 mg de biomasa de E. coli fueron suspendidos en 70 mi de Hepes 50 mM pH 7.5, y una mezcla de inhibidor de proteasa. Las células fueron sonicadas en hielo (Branson sonifier, 70W) en un Rosett cell RZ3 durante ocho ciclos de 30 seg con intervalos de 30 seg. Después de la sonicación, las células fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con MgCI2 1 mM y 1 UI/ml de DNasel. Los residuos de células fueron retirados mediante centrifugación a 12000g durante 30 minutos a 4°C. El supernadante se mantuvo como el extracto crudo. 8.3.2 Paso 2: Precipitación de sulfato de amonio El extracto crudo fue precipitado a una concentración de 50% sulfato de amonio: sulfato de amonio sólido (300 g/l) se añadió al extracto crudo en hielo. Después de 15 minutos de incubación a 4°C, la mezcla fue centrifugada a 12000g durante 15 minutos a 4°C. El supernadante fue desechado y el precipitado fue disuelto en 50 mi de Hepes 50 mM pH 7.5, sulfato de amonio 1 M. 8.3.3 Paso 3: Cromatografía hidrofóbica Usando un purificador Akta (GE Healthcare), el extracto de proteína del paso anterior fue cargado en una columna HiTrap PhenylHP de 5 mi (GE Healthcare) equilibrada con el mismo regulador de pH. La columna fue lavada con 10 volúmenes de columna del mismo regulador de pH. Las proteínas fueron eluídas con dos gradientes de etapas, un gradiente de 10 volúmenes de columna de sulfato de amonio de 1 M a 0.5 M y un gradiente de 20 volúmenes de columna de sulfato de amonio de 0.5 M a 0 M. Después de la elución, la columna fue lavada con 10 volúmenes de columna de Hepes 50 mM pH 7.5. El índice de flujo de la columna fue 2.5 ml/min y se recolectaron fracciones de 2.5 mi. Las fracciones que contienen la proteína fueron depositadas, dializadas en Hepes 50 mM pH 7.5 y concentradas a una concentración de 1.14 g/pl. 8.4 Ensayos de hidroxi aldehido reductasa 8.4.1 Síntesis química de 4-hidroxibutiraldehido La síntesis química de 4-hidroxibutiraldehído ha sido descrita en la publicación: N° 158 Transposition des dihydro-2.5 furannes en dihydro-2.3 furannes. - Application á la préparation de l'hydroxy-4 butanal ; par R. PAUL, M. FLUCHAIRE et G. GOLLARDEAU.
Bulletin de la Société Chimique de France, 668-671 , 1950. 8.4.2 Ensayo de actividad qlicolaldehido y 4-hidroxibutiraldehído reductasa La actividad glicolaldehido y 4-hidroxibutiraldehido reductasa fue sometida a ensayo midiendo el índice inicial de oxidación de NADPH con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 340 nm y a una temperatura constante de 30°C. La mezcla de reacción usando glicolaldehido o 4-hidroxibutiraldehído como sustrato se llevó a cabo en Hepes 20 mM pH 7.5, sulfato de zinc 0.1 mM, NADPH 0.2 mM, 2 g de enzima purificada en un volumen final de 1 mi. La mezcla de reacción fue incubada durante 5 min a 30°C y luego la reacción fue iniciada mediante la adición del sustrato (glicolaldehido o 4-hidroxibutiraldehído) a una concentración final de 10 mM. Un ensayo de control (blanco), que carecía del sustrato, se realizó en paralelo y el valor medido para el control fue sustraído del valor medido para el ensayo para tomar en cuenta oxidación no específica de NADPH. (Epsilon 340 nm = 6290 M-1 cm-1 ).
Una unidad de actividad de enzima fue definida como la cantidad de enzima que consumió 1 pmol de sustrato por minuto bajo las condiciones del ensayo. La actividad de enzima especifica fue expresada como unidades por mg de proteina. 8.4.3 Ensayo de actividad 3-hidroxipropionaldehido reductasa La actividad de YqhD hacia el sustrato 3-hidroxipropionaldehído (3-HPA) ha sido descrita en la publicación: Hongmei Li ;Jia Chen ;Hao Li ;Yinghua Li ;Ying Li (2008).Enhanced activity of yqhD oxidoreductase ¡n synthesis of 1 ,3-propanediol by error-prone PCR Prog Nal Sci., 18 (12), 1519-1524.
Estos autores han usado cloruro de zinc 5mM, EDTA 1 mM y Beta-mercaptoetanol 1 mM para sus ensayos de 3-hidroxipropionaldehido reductasa. 8.5 Actividad de enzima purificada EJEMPLO 9 Demostración de la actividad L-serina transaminasa codificada por el gen serC de Escherichia coli 9.1 Construcción de la cepa para caracterización de SerC: BL21 (pPAL7-serC) Para caracterizar la proteína SerC, el gen correspondiente fue expresado a partir del vector de expresión pPAL7 (Bio-rad).
Parece propósito, el gen serC fue amplificado a partir del genoma de E. coli usando los oligonucleótidos pPAL7-serC F y pPAL7-serC R. El producto PCR fue restringido usando las enzimas Hind\\\ y EcoRI y clonado en el vector pPAL7 restringido por las mismas enzimas de restricción. El vector resultante fue nombrado pPAL7-serC. pPAL7-serC F (SEQ ID NO 84) : cccAAGCTTtqATGGCTCAAATCTTCAATTTTAGTTCTGG con - una región (negrita) homologa a la secuencia (956876 -956904) del gen serC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (subrayada) que contiene el sitio de restricción Hind\\\ pPAL7-serC R (SEQ ID NO 85) : qGAATTCTTAACCGTGACGGCGTTCGAACTCAACC con - una región (negrita) homologa a la secuencia (957964 - 957937) de la región del gen serC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), - una región (subrayada) que contiene el sitio de restricción EcoRI.
El plásmido pPAL7-se/C fue después introducido en células BL21 (DE3) competentes (Invitrogen). 9.2 Sobreproducción de la proteina SerC La sobreproducción de la proteína SerC se hizo aplicando el mismo protocolo que el ejemplo #7.2 9.3 Purificación de la proteina SerC 9.3.1 Paso 1 : Preparación de extractos libres de células Aproximadamente 280 mg de biomasa de E. coli fueron suspendidos en 45 mi de fosfato de potasio 100 mM pH 7.6, y una mezcla de inhibidor de proteasa. La suspensión de células (15 mi por tubo cónico) fue sonicada en hielo (Bandelin sonoplus, 70 W) en un tubo cónico de 50 mi durante 8 ciclos de 30 seg con intervalos de 30 seg. Después de la sonicación, las células fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente con MgCI2 5 mM y 1 UI/ml de DNasel. Los residuos de las células fueron retirados por medio de centrifugación a 12000g durante 30 minutos a 4°C. 9.3.2 Paso 2: Purificación por afinidad La proteína fue purificada a partir de extracto de células crudo por afinidad en una columna Profinity (BIORAD, Bio-Scale Mini Profinity cartucho exacto 5 mi) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El extracto crudo fue cargado en un cariucho exacto Profinity de 5 mi equilibrado con fosfato de potasio 100 mM pH 7.6. La columna fue lavada con 10 volúmenes de columna del mismo regulador de pH e incubada 30 minutos con fosfato de potasio 100 mM pH 7.6, fluoruro 100 mM a temperatura ambiente. La proteina fue eluida de la columna con 2 volúmenes de columna de fosfato de potasio 100 mM pH 7.6. La etiqueta permaneció firmemente unida a la resina y la proteína purificada fue liberada. Las fracciones que contenían la proteína fueron depositadas y dializadas contra Tris HC1 100 mM, NaCI 150 mM y 10% glicerol pH 8.
La concentración de proteina fue medida usando el ensayo de proteina Bradford. 9.4 Ensayo de actividad L-serina transaminasa Para el ensayo de actividad L-serina transaminasa aproximadamente 30 pg de enzima purificada fueron agregados a un regulador de pH que contiene regulador de pH Tris-HCI 50 mM pH 8.2, L-Serina 3 mM, ácido a-cetoglutárico 1 mM en un volumen total de 300 µ?. La reacción fue incubada durante 60 minutos a 30°C. El producto de reacción (ácido hidroxipirúvico) fue medido directamente mediante LC-MS/MS. 9.5 Actividad de enzima purificada EJEMPLO 10 Demostración de la actividad 3-fosfohidroxipiruvato fosfatasa codificada por el gen GPP2 de Saccharomyces cerevisiae 10.1 Construcción de una cepa para caracterización de GPP2sc: BL21 (pPAl_7-qpp2sc) Para caracterizar la proteína GPP, el gen correspondiente es expresado a partir del vector de expresión pPAL7 (Bio-rad).
Para este propósito, el gen gpp es amplificado a partir del genoma de Saccharomyces cerevisiae usando los oligonucleótidos pPAL7-gpp2sc F y pPAL7-gpp2sc R. El producto PCR es restringido usando las enzimas Hind\\\ y BamHI y clonado en el vector pPAL7 restringido por las mismas enzimas de restricción. El vector resultante es nombrado pPAL7-gpp2sc. pPAL7-gpp2sc F (SEQ ID NO 86) . cccAAGCTTTqATGGGATTGACTACTAAACCTCTATC con - una región (negrita) homologa a la secuencia (280680 -280655) de la región del gen gpp2 (secuencia de referencia en el sitio web http://www.yeastgenome.org/), - una región (subrayada) que contiene el sitio de restricción HindW pPAL7-kivDII R (SEQ ID NO 87) : gGGATCCTTACCATTTCAACAGATCGTCCTTAGC con - una región (negrita) homologa a la secuencia (279928 -279954) de la región del gen gpp2 (secuencia de referencia en el sitio web http://www.yeastgenome.org/), - una región (subrayada) que contiene el sitio de restricción BamHI.
El plásmido pPAL7-gpp2sc es después introducido en células BL21 (DE3) competentes (Invitrogen). 10.2 Sobreproducción de la proteina GPP2sc La sobreproducción de la proteina GPP2sc se realizó aplicando el mismo protocolo que el ejemplo #7.2 10.3 Purificación de la proteina GPP2sc 10.3.1 Paso 1 : Preparación de extractos libres de células Aproximadamente 294 mg de biomasa de E. coli fueron suspendidos en 45 mi de fosfato de potasio 100 mM pH 7.6, y una mezcla de inhibidor de proteasa. La suspensión de células (15 mi por tubo cónico) fue sonicada en hielo (Bandelin sonoplus, 70 W) en un tubo cónico de 50 mi durante 8 ciclos de 30 seg con intervalos de 30 seg. Después de la sonicación, las células fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente con MgCI2 5 mM y 1 UI/ml de DNasel. Los residuos de las células fueron retirados por medio de centrifugación a 12000g durante 30 minutos a 4°C. 10.3.2 Paso 2: Purificación por afinidad La proteina fue purificada a partir del extracto de células crudo por afinidad en una columna Profinity (BIORAD, Bio-Scale Mini Profinity cartucho exacto 5 mi) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El extracto crudo fue cargado en un cartucho exacto Profinity de 5 mi equilibrado con fosfato de potasio 100 mM pH 7.6. La columna fue lavada con 10 volúmenes de columna del mismo regulador de pH e incubada toda la noche con fosfato de potasio 100 mM pH 7.6, fluoruro 100 mM a temperatura ambiente. La proteina fue eluída de la columna con 2 volúmenes de columna de fosfato de potasio 100 mM pH 7.6. La etiqueta permaneció firmemente unida a la resina y la proteina purificada fue liberada. Las fracciones que contenían la proteina fueron depositadas y dializadas contra fosfato de potasio 100 mM, NaCI 150 mM y 10% glicerol pH 8 y concentradas a una concentración de 0.22 pg/µ?.
La concentración de proteina fue medida usando el ensayo de proteina Bradford. 10.4 Ensayo de actividad 3-fosfohidroxipiruvato fosfatasa 10.4.1 Síntesis química de 3-fosfohidroxipiruvato La síntesis química de 3-fosfohidroxipiruvato ha sido descrita en la publicación: CE Ballou ;H Hesse ;R Hesse ; (1956).The Synthesis and Properties of Hydroxypyruvic Acid Phosphate J Am Chem Soc, 78 (15), 3718- 3720. 10.4.2 Ensayo de actividad 3-fosfohidroxipiruvato fosfatasa El ensayo de actividad 3-fosfohidroxipiruvato fosfatasa se llevó a cabo con regulador de pH Tris-HCI 50 mM pH 8.2, MgCI2 5 mM, 3- fosfohidroxipiruvato 3.6 mM y aproximadamente 6 pg de enzima purificada (Gpp) en un volumen total de 300 µ?. La reacción fue incubada durante 120 minutos a 30°C. El producto de reacción (ácido hidroxipirúvico) fue medido directamente por medio de LC-MS/MS. 10.5 Actividad de enzima purificada Actividad de enzima purificada (mUI/mg) Ensayo de 3-fosfohidroxipiruvato fosfatasa 9 EJEMPLO 11 Simulación de rendimientos máximos para producción de etilenglicol, 1,3-propanodiol y 1 ,4-butanodiol 1 1.1 Parámetros usados para simulaciones Se han realizado simulaciones con nuestro software patentado METEX METOPT™. Se ha usado a una red metabólica simplificada de E. coli que incluye una red metabólica central, vías metabólicas para todos los precursores de biomasa y vías de producción especificas como se describe anteriormente. Se ha usado una composición de biomasa clásica para E. coli. Para cada diol específico, se han realizado dos simulaciones. La primera para calcular un rendimiento máximo teórico (tomando en cuenta solamente la estequiometría del modelo, sin crecimiento y sin energía de mantenimiento). La segunda para calcular un rendimiento máximo práctico, tomando en cuenta un índice de crecimiento de 0.1 h"1 y una energía de mantenimiento de 5 mmolATP güw"1 h' . Todas las simulaciones se han realizado con un índice de absorción especifico de glucosa de 3 mmol.gDw'Vh"1. Para etilenglicol y 1 ,3-propanodiol, se han realizado simulaciones en condiciones aeróbicas. Específicamente para 1 ,4-butanodiol, se han realizado simulaciones en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas. Para condiciones anaeróbicas, el índice de crecimiento no pudo ser impuesto a 0.1 h"1. El índice de crecimiento es el índice de crecimiento máximo que se puede alcanzar de acuerdo con el ATP disponible. 1 1.2 Resultados de las simulaciones Etilenglicol 1 ,3- 1 ,4- 1 ,4-butanodiol propanodiol butanodiol (anaeróbico) (aeróbico) Rendimiento 0.69 0.60 0.50 0.50 teórico máximo (g/g) Rendimiento 0.50 0.39 0.35 0.45 práctico (µ™„=0.03?-1) máximo (g/g)

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1 - Un microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de un diol alifático, en donde el microorganismo comprende una vía metabólica para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático con una enzima que tiene una actividad ácido 2-ceto descarboxilasa, el producto obtenido a partir de dicho paso de descarboxilación es reducido aún más en el diol alifático correspondiente con una enzima que tiene actividad hidroxi aldehido reductasa, y en donde el microorganismo es genéticamente modificado para la producción mejorada de dicho metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático.
2 - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1 , seleccionado de entre el grupo que consiste de una bacteria, levadura o un hongo.
3. - El microorganismo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Clostñdiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae.
4. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1 a 3, caracterizado además porque el microorganismo comprende un gen endógeno que codifica para ácido 2-ceto descarboxilasa.
5.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el microorganismo es modificado aún más para aumentar la expresión del gen endógeno que codifica para el ácido 2-ceto descarboxilasa.
6.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1 a 3, caracterizado además porque el microorganismo comprende un gen heterólogo que codifica para un ácido 2-ceto descarboxilasa.
7. - El microorganismo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque el diol alifático es etilenglicol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático es hidroxipiruvato.
8. - El microorganismo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque el diol alifático es 1 ,3-propanodiol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático es 4-hidroxi-2-cetobutirato.
9.- El microorganismo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque el diol alifático es 1 ,4-butanodiol y el metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático es 5-hidroxi-2-cetopentanoato.
10.- Un método para la producción fermentativa de un diol alifático, que comprende los pasos de: - cultivar un microorganismo de una de las reivindicaciones 1 a 9 en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y - recuperar el diol alifático del medio de cultivo.
1 1 - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el diol es purificado aún más.
12.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 10 u 1 1 , caracterizado además porque la fuente de carbono se selecciona de entre hexosas, pentosas, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, melaza, almidón y combinaciones de los mismos.
13 - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la fuente de carbono se selecciona de entre glucosa y sacarosa.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1862189T3 (pl) 2006-06-02 2012-01-31 Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh Pojemnik napełniony ciekłym koncentratem do przygotowywania dializatu
US8129169B2 (en) 2009-06-04 2012-03-06 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
MX2012011723A (es) * 2010-04-13 2013-02-27 Genomatica Inc Microorganismos y metodos para la produccion de etilenglicol.
TWI500768B (zh) * 2010-07-05 2015-09-21 Metabolic Explorer Sa 由蔗糖製備１，３－丙二醇之方法
JP2013544516A (ja) * 2010-11-03 2013-12-19 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア タンパク質性バイオマスの発酵を介した組換え微生物によるバイオ燃料および化学物質の生成
EP2503003A1 (en) * 2011-03-24 2012-09-26 Volker Sieber Synthetic pathway for the production of alcohols or amines
WO2012177983A2 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing ethylene glycol and methods related thereto
EP2540834A1 (en) 2011-06-29 2013-01-02 Metabolic Explorer Method for the preparation of 1,3-propanediol
US9914947B2 (en) * 2011-07-27 2018-03-13 Alliance For Sustainable Energy, Llc Biological production of organic compounds
AU2012318597A1 (en) * 2011-10-05 2014-04-24 The Procter & Gamble Company Microorganisms and methods for producing acrylate and other products from homoserine
WO2013076144A2 (en) 2011-11-21 2013-05-30 Metabolic Explorer Microorganism strains for the production of 2,3-butanediol
US20130316416A1 (en) * 2012-02-23 2013-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Engineering microbes and metabolic pathways for the production of ethylene glycol
WO2013184602A2 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
WO2014004625A1 (en) * 2012-06-26 2014-01-03 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing ethylene glycol using synthesis gas
ES2800341T3 (es) * 2012-07-11 2020-12-29 Adisseo France Sas Método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato
WO2014037912A2 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Cellworks Research India Pvt. Ltd Methods for production of isobutanol through nutrient stress and genetically modified microorganisms thereof
WO2014049382A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Metabolic Explorer Ethylenediamine fermentative production by a recombinant microorganism
KR102113254B1 (ko) 2013-08-23 2020-05-21 삼성전자주식회사 1,4―ｂｄｏ 생산을 위한 유전자 스크리닝 방법
EP2930244A1 (en) * 2014-04-07 2015-10-14 The Procter and Gamble Company Microorganisms and methods for producing acrylate and other products from homoserine
WO2015167043A1 (ko) * 2014-04-30 2015-11-05 삼성전자 주식회사 증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올 생산방법
WO2016050959A2 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 Metabolic Explorer Mutant glutamate dehydrogenase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate
WO2016094526A1 (en) * 2014-12-11 2016-06-16 Ciris Energy Inc. Genetically modified microbes for the biological conversion of carbonaceous materials to diols
MX376225B (es) 2015-02-24 2025-03-07 Bioatla Llc Proteínas biológicas condicionalmente activas
US20180179499A1 (en) 2015-06-04 2018-06-28 Bioamber Inc. Biobased production of functionalized alpha-substituted acrylates and c4-dicarboxylates
US10801050B2 (en) 2015-10-23 2020-10-13 Metabolic Explorer Microorganism modified for the assimilation of levulinic acid
CN105441372A (zh) * 2015-10-30 2016-03-30 清华大学 一种重组谷氨酸棒杆菌与应用
KR102430878B1 (ko) 2016-07-08 2022-08-09 메타볼릭 익스플로러 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (pts)을 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물에 의한 관심 분자의 발효적 생산을 위한 방법
CN106957878B (zh) * 2017-04-19 2020-10-30 波顿（上海）生物技术有限公司 一种生物催化生产2-苯乙醇的方法
EP3470512A1 (en) 2017-10-10 2019-04-17 Metabolic Explorer Mutant phosphoserine aminotransferase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate
US12486513B2 (en) 2018-12-28 2025-12-02 Braskem S.A. Modulation of carbon flux through the meg and C3 pathways for the improved production of monoethylene glycol and C3 compounds
EP3906313A1 (en) 2019-02-15 2021-11-10 Braskem S.A. Microorganisms and methods for the production of glycolic acid and glycine via reverse glyoxylate shunt
WO2020168408A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Braskem S.A. Degradation pathway for pentose and hexose sugars
EP3908663A1 (en) 2019-02-20 2021-11-17 Braskem S.A. Microorganisms and methods for the production of oxygenated compounds from hexoses
WO2021004614A1 (en) * 2019-07-08 2021-01-14 Symrise Ag Biotechnological production of diols
CN111349643B (zh) * 2020-03-17 2022-06-24 花安堂生物科技集团有限公司 生物合成异戊二醇的菌株及方法
US20250327099A1 (en) * 2021-10-20 2025-10-23 Genomatica, Inc. Aldehyde dehydrogenase variants and methods of use
CN116355821B (zh) * 2023-03-10 2023-09-29 湖北大学 一种生产乙二醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW313589B (es) 1991-12-12 1997-08-21 Wacker Chemie Gmbh
US5686276A (en) 1995-05-12 1997-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism
JP4066543B2 (ja) 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
FR2796081B1 (fr) 1999-07-09 2003-09-26 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation du 1,3-propanediol par un micro-organisme recombinant en l'absence de coenzyme b12 ou de l'un de ses precurseurs
HK1044963B (en) 1999-08-18 2007-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the biological production of 1,3-propanediol
BR0314498A (pt) * 2002-10-04 2005-08-16 Du Pont Linhagens de e. coli e método para a bioprodução de 1,3-propanodiol
EP1597364B1 (fr) 2003-02-18 2013-07-24 Metabolic Explorer Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques
DE10331291A1 (de) * 2003-07-10 2005-02-17 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
FR2862068B1 (fr) 2003-11-06 2007-10-12 Metabolic Explorer Sa Souches de microorganismes optimisees pour des voies de biosyntheses consommatrices de nadph
FR2864967B1 (fr) 2004-01-12 2006-05-19 Metabolic Explorer Sa Microorganisme evolue pour la production de 1,2-propanediol
WO2005111202A1 (en) 2004-05-12 2005-11-24 Metabolic Explorer Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity
WO2006082252A2 (en) 2005-02-07 2006-08-10 Metabolic Explorer Method for the enzymatic production of alpha-ketobutyrate
US20080286840A1 (en) 2005-02-07 2008-11-20 Rainer Figge Microorganisms Comprising Enzymes Express with Low Gamma-Elimination Activity
WO2007017710A1 (en) 2005-08-11 2007-02-15 Metabolic Explorer Process for the preparation of aspartate and derived amino acids like lysine, threonine, isoleucine, methionine, homoserine, or valine employing a microorganism with enhanced isocitrate lyase and/or malate synthase expression
DK2314710T3 (en) 2006-01-04 2016-06-13 Metabolic Explorer Sa A process for the production of methionine by culturing a microorganism modified to enhance the production of cysteine
US7659104B2 (en) * 2006-05-05 2010-02-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation
WO2007140816A1 (en) 2006-06-09 2007-12-13 Metabolic Explorer Glycolic acid production by fermentation from renewable resources
WO2007144018A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Metabolic Explorer Ethanolamine production by fermentation
CN101528930B (zh) 2006-10-03 2013-12-11 代谢探索者公司 用于在梭菌属中进行染色体整合和dna序列替换的方法
US8236994B2 (en) 2006-10-31 2012-08-07 Metabolic Explorer Process for the biological production of 1,3-propanediol from glycerol with high yield
WO2008052596A1 (en) 2006-10-31 2008-05-08 Metabolic Explorer Process for the biological production of n-butanol with high yield
CN103540559A (zh) * 2007-02-09 2014-01-29 加利福尼亚大学董事会 利用重组微生物生产生物燃料
CN105936887A (zh) * 2007-03-16 2016-09-14 基因组股份公司 用于1,4-丁二醇和其前体生物合成的组合物和方法

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