MX2012011723A

MX2012011723A - Microorganismos y metodos para la produccion de etilenglicol.

Info

Publication number: MX2012011723A
Application number: MX2012011723A
Authority: MX
Inventors: Anthony P Burgard; Robin E Osterhout; Prit Pharkya
Original assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2010-04-13
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2013-02-27
Also published as: WO2011130378A1; SG184848A1; US20110312049A1; CA2796118A1; BR112012025846A2; EP2558582A1; KR20130093481A; EP2558582A4

Abstract

La invención proporciona organismos microbianos que no se presentan naturalmente que tienen una trayectoria de etilenglicol. La invención adicionalmente proporciona métodos para utilizar tales microrganismos para producir etilglicol.

Description

MICROORGANISMOS Y MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE ETILENGLICOL Esta solicitud reclama el beneficio de la prioridad de la Solicitud Provisional Estadounidense No. de serie 61/323,650, presentada el 13 de abril de 2010, los contenidos completos de la cual se incorporan en la presente para referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a procesos biosintéticos , y más específicamente a organismos que tienen capacidad biosintética de etilenglicol .

El etilenglicol es una sustancia química comúnmente utilizada en muchas aplicaciones comerciales industriales que incluyen la producción de anticongelantes y refrigerantes. El etilenglicol se utiliza también como una materia prima en la producción de un amplio margen de productos que incluye fibra de poliéster para ropa, tapicería, alfombra y almohadas; las fibras de vidrio utilizadas en la producción de productos tales como motos acuáticas, bañeras, y bolas de boliche; y la resina de teleftalato de polietileno utilizada en películas de embalaje y botellas. Alrededor de 82% del etilenglicol consumido en todo el mundo se utiliza en la producción de fibras de poliéster, resinas y películas. El fuerte crecimiento en la demanda de poliéster ha conducido a un índice de crecimiento global de 5-6%/año para el etilenglicol. El segundo mercado más grande para el etileno es las formulaciones de anticongelante.

Típicamente, en la elaboración de etilenglicol, el óxido de etileno primero se produce por la oxidación de etileno en la presencia de oxígeno o aire y de un catalizador de óxido de plata. Una mezcla de etilenglicol sin purificar entonces se produce por la hidrólisis de óxido de etileno con agua bajo presión. Se utiliza la destilación fraccional bajo vacio para separar el etilenglicol de los glicoles superiores. El etilenglicol se fabricó previamente por la hidrólisis del óxido de etileno, que se produjo mediante clorohidrina pero este método será sustituido por la ruta de oxidación directa. El etilenglicol es un líquido de sabor dulce higroscópico, viscoso, inoloro, incoloro, y se clasifica como perjudicial por la Directiva de Sustancias Peligrosas CE.

Los organismos microbianos y métodos para producir efectivamente cantidades comerciales de etilenglicol se describen en la presente e incluyen ventajas relacionadas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza que contienen trayectorias de etilenglicol que comprenden por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol . La invención proporciona adicionalmente métodos para utilizar tales organismos microbianos para producir etilenglicol, mediante cultivo de un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que contiene trayectorias de etilenglicol como se describen en la presente bajo condiciones y durante un período suficiente de tiempo para producir etilenglicol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra trayectorias para producir etilenglicol. Las enzimas para transformación de sustratos identificados para productos incluyen: 1) Serina aminotrasferasa, 2) Serina oxidoreductasa (desaminante) , 3) Hidroxipuravato descarboxilasa, 4) Glicolaldehído reductasa, 5) Serina descarboxilasa, 6) Etanolamina aminotrasferasa, 7) Etanolamina oxidoreductasa (desaminante), 8) Hidroxipiruvato reductasa, 9) Glicerato descarboxilasa, 10) 3 -Fosfoglicerato fosfatasa, 11) Glicerato cinasa, 12) 2-Fosfoglicerato fosfatasa, 13) Glicerato 2-cinasa y 14) Gliceraldehído deshidrogenasa .

La Figura 2 muestra una trayectoria ejemplar para producción de etilenglicol. Las enzimas para transformación de sustratos identificados para productos incluye: 1) Glioxilato carboligasa, 2) Hidroxipiruvato isomerasa, 3) Hidroxipiruvato descarboxilasa, 4) Glicolaldehído reductasa y 5) Glicerato deshidrogenasa .

La Figura 3 muestra trayectorias ejemplares para producción de etilenglicol . Las enzimas para la transformación de sustratos identificados incluyen: 1) Glicoxilato reductasa, 2) Glicolil-CoA transferasa, 3) Glicolil-CoA sintetasa, 4) Glicolil-CoA reductasa (formación de aldehido), 5) Glicolaldehído reductasa, 6) Glicolato reductasa, 7) Glicolato cinasa, 8) Fosfotransglicolilasa, 9) Glicolilfosfato reductasa e 10) Glicolil-CoA reductasa (formación de alcohol) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige al diseño y producción de células y organismos que tienen capacidades de producción biosintética para etilenglicol. La invención en particular, se refiere al diseño de organismos microbianos capaces de producir etilenglicol al introducir uno o más ácidos nucleicos que codifican una enzima de trayectoria de etilenglicol .

En una modalidad, la invención utiliza modelos estequiométricos in silico de metabolismo de Escherichia coli que identifica los diseños metabólicos para la producción biosintética de etilenglicol. Los resultados descritos en la presente indican que las vías metabólicas pueden diseñarse y manipularse recombinantemente para lograr biosíntesis de etilenglicol en Escherichia coli y otras células u organismos. La producción biosintética de etilenglicol, por ejemplo, para los diseños in silico pueden confirmarse mediante la construcción de cepas que tienen el genotipo metabólico diseñado. Estas células u organismos metabólicamente diseñados también pueden someterse a evolución adaptativa para aumentar la biosíntesis de etilenglicol, incluyendo bajo condiciones cercanas al crecimiento máximo teórico.

En ciertas modalidades, las características de biosíntesis de etilenglicol de las cepas diseñadas se hacen genéticamente estables y particularmente útiles en bioprocesos continuos. Se identifican unas estrategias de diseño de las cepas separadas con la incorporación de diferentes capacidades de reacción no nativas o heterólogas en E. coli u otros organismos huésped que conduce a las vías metabólicas que producen etilenglicol de cualquiera de serina, 3-fosfoglicerato o glioxilato. Se identificaron los diseños metabólicos in silico que resultaron en la biosíntesis de etilenglicol en microorganismos de cada uno de estos sustratos o intermediarios metabólicos.

Las cepas identificadas mediante el componente computacional de la plataforma pueden ser puestas en producción real al manipular genéticamente cualquiera de las alteraciones metabólicas predic as, que conducen a la producción biosintética de etilenglicol u otros productos intermediarios y/o corriente abajo. En aún una modalidad adicional, las cepas que muestran la producción biosintética de este compuesto pueden además someterse a evolución adaptativa para el aumento adicional de la biosíntesis del producto. Los niveles de rendimiento de biosíntesis del producto después de la evolución adaptativa también pueden predecirse por el componente computacional del sistema.

El rendimiento de etilenglicol teórico máximo a partir de glucosa es 2.4 mol/mol (0.834 g/g) , de acuerdo con la ecuación: C6H1206 + 1.2 H20 ? 2.4 C2H602 + 1.2 C02 Las vías presentadas en las Figura 1-3 logran un rendimiento de 2 moles de etilenglicol por mol de glucosa utilizada. Es posible incrementar el rendimiento del producto a 2.4 mol/mol si las células son capaces de fijar C02 a través de las vías tal como el ciclo de TCA reductivo o la vía de ood-L ungdahl .

Como se utiliza en la presente, el término "que no se encuentra en la naturaleza" , cuando se usa en referencia a un organismo microbiano o microorganismo de la invención se pretende para significar que el organismo microbiano tiene al menos una alteración genética no encontrada normalmente en una cepa que se encuentra en la naturaleza de las especies de referencia, incluyendo las cepas de tipo silvestre de las especies mencionadas. Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen ácidos nucleicos expresables que codifican los polipéptidos metabólicos, otras adiciones de ácido nucleico, eliminaciones de ácidos nucleicos y/u otra interrupción funcional del material genético del organismo microbiano. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, regiones de codificación y fragmentos funcionales del mismo, para polipéptidos heterólogos, homólogos o tanto heterólogos como homólogos para las especies mencionadas. Las modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificadas en las cuales las modificaciones alteran la expresión de un gen u operón. Ejemplos de polipéptidos metabólicos incluyen enzimas o proteínas sin una trayectoria biosintética de etilenglicol .

Una modificación metabólica se refiere a una reacción bioquímica que se altera a partir de su estado que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, los microorganismos que no se encuentran en la naturaleza pueden tener modificaciones genéticas en los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos metabólicos, o fragmentos funcionales de los mismos. Ejemplos de modificaciones metabolicas se describen en la presente.

Como se utiliza en la presente, el término "etilenglicol", que tiene la fórmula molecular C2H602 y una masa molecular de 62.068 g/mol (véanse Figuras 1-3) (nombre de la IUPAC etan-1 , 2-diol) se utiliza intercambiablemente en todo con monoetilenglicol , MEG, y 1 , 2-etandiol . En su forma pura, el etilenglicol es un líquido inoloro, incoloro, almibarado de sabor dulce. El etilenglicol se utiliza ampliamente como un anticongelante en automóviles, como un medio para la transferencia de calor por conexión en sistemas de enfriamiento y como un precursor para fibras y resinas de poliéster. Por ejemplo, el tereftalato de polietileno el cual se utiliza para elaborar botellas de plástico se prepara a partir de etilenglicol. Otros usos conocidos para etilenglicol incluyen el uso como un desecante, como un intermedio químico en la fabricación de capacitores, como un aditivo para evitar la corrosión y como un grupo protector para grupos carbonilo en síntesis orgánica.

Como se usa en la presente, el término "aislado" cuando se utiliza con referencia a un organismo microbiano se pretende para significar un organismo que se encuentra sustancialmente libre de por lo menos un componente como el organismo microbiano de referencia se encuentra en la naturaleza. El término incluye un organismo microbiano que se remueve de alguno o todos los componentes como se encuentra en su ambiente natural . El término también incluye un organismo microbiano que se remueve de alguno o todos los componentes a medida que el organismo microbiano se encuentran en ambientes que no se encuentran en la naturaleza. Por lo tanto, un organismo microbiano aislado se encuentra parcial o completamente separado de otras sustancias como se encuentra en la naturaleza o como se cultiva, se almacena o subsiste en ambientes que no se encuentran en la naturaleza. Ejemplos específicos de organismos microbianos aislados incluyen microbios parcialmente puros, microbios sustancialmente puros y microbios cultivados en un medio que no se encuentra en la naturaleza .

Como se utiliza en la presente, los términos "microbiano", "organismo microbiano" o "microorganismo" se pretenden para significar cualquier organismo que existe como una célula microscópica que se incluye dentro del dominio de archaea, bacterias o eukarya. Por lo tanto, el término se pretende para abarcar células procariotas o eucariotas u organismos que tienen un tamaño microscópico e incluyen bacterias, archaea y eubacterias de todas las especies así como también microorganismos eucarióticos tales como levaduras y hongos. El término también incluye cultivos celulares de cualesquier especie que puede cultivarse para la producción de un bioquímico.

Como se utiliza en la presente, el término "CoA" o "coenzima A" se pretende para dar significar un cofactor orgánico o grupo prostético (porción no proteica de una enzima) , cuya presencia se requiere para la actividad de muchas enzimas (la apoenzima) para formar un sistema de enzima activo. Las funciones de coenzima A en ciertas enzimas de condensación, actúan en la transferencia de grupo acetilo u otro acilo y en síntesis de ácido graso y oxidación, oxidación de piruvato y en otra acetilacion.

Como se utiliza en la presente, el término "sustancialmente anaeróbico" cuando se utiliza con referencia a un cultivo o condición de crecimiento se pretende para significar que la cantidad de oxígeno es de menos de alrededor de 10% de la saturación para oxígeno disuelto en el medio líquido. El término también se pretende para incluir cámaras selladas de medio liquido o sólido mantenido con una atmósfera de menos de alrededor de 1% de oxígeno.

"Exógeno" como se utiliza en la presente se pretende para significar que la molécula de referencia o la actividad de referencia se introduce en el organismo microbiano huésped. La molécula puede introducirse, por ejemplo, mediante la introducción de un ácido nucleico de codificación en el material genético huésped tal como mediante la integración en un cromosoma huésped o como un material genético no cromosomico tal como un plásmido. Por lo tanto, el término como se utiliza en referencia a la expresión de un ácido nucleico de codificación se refiere a la introducción de un ácido nucleico de codificación en una forma expresable en el organismo microbiano. Cuando se utiliza con referencia a la actividad biosintética, el término se refiere a una actividad que se introduce en el organismo de referencia huésped. La fuente puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de codificación homólogo o heterólogo que expresa la actividad de referencia después de la introducción en el organismo microbiano huésped. Por lo tanto, el término "endógeno" se refiere a una molécula de referencia o actividad que se presenta en el huésped. Similarmente, el término cuando se utiliza en referencia a la expresión de un ácido nucleico de codificación se refiere a la expresión de un ácido nucleico de codificación contenido dentro del organismo microbiano. El término "heterólogo" se refiere a una molécula o actividad derivada de una fuente distinta de las especies de referencia mientras que "homólogo" se refiere a una molécula o actividad derivada del organismo microbiano huésped. Por consiguiente, la expresión exógena de un ácido nucleico de codificación de la invención puede utilizar cualquiera o ambos de un ácido nucleico de codificación heterólogo u homólogo.

Se entiende que cuando más de un ácido nucleico exógeno se incluye en un organismo microbiano que es cuando más de un ácido nucleico exógeno se refiere al ácido nucleico de codificación mencionado o actividad biosintética, como se discute en lo anterior. Se entiende además, como se describe en la presente, que más de uno de los ácidos nucleicos exogenos pueden introducirse en el organismo microbiano huésped sobre moléculas de ácido nucleico separadas, sobre moléculas de ácido nucleico policistrónicas , o una combinación de las mismos, y aún considerarse como más de un ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, como se describe en la presente un organismo microbiano puede diseñarse para expresar dos o más ácidos nucleico exogenos que codifican una enzima o prote na de la vía deseada. En el caso donde dos ácidos nucleico exogenos que codifican una actividad deseada se introducen en un organismo microbiano huésped, se entenderá que dos ácidos nucleicos exogenos pueden introducirse como un ácido nucleico simple, por ejemplo, sobre un plásmido simple, sobre un plásmido separado, puede integrarse hacia el cromosoma huésped en un sitio simple o sitios múltiples, y aún considerarse como dos ácidos nucleicos exogenos. Similarmente, se entenderá que más de dos ácidos nucleicos exogenos pueden introducirse en un organismo huésped en cualquier combinación deseada, por ejemplo, sobre un plásmido sencillo, sobre un plásmido separado, puede integrarse en el cromosoma huésped en un sitio simple o sitios múltiples, y todavía considerarse como dos o más ácidos nucleicos exógenos, por ejemplo, tres ácidos nucleicos exógenos. Por lo tanto, el número de ácidos nucleicos exógenos mencionados o actividades biosintéticas se refieren al número de ácidos nucleicos de codificación o el número de actividades biosintéticas, no al número de ácidos nucleicos separados introducidos en el organismo huésped.

Los organismos microbianos de la invención que no se encuentran en la naturaleza pueden contener alteraciones genéticas estables, con referencia a microorganismos que pueden cultivarse durante más de cinco generaciones sin pérdida de alteración. Generalmente, las alteraciones genéticas estables incluyen modificaciones que persisten más de 10 generaciones, particularmente modificaciones estables persistirán más de alrededor de 25 generaciones, y más particularmente, las modificaciones genéticas estables serán mayores que 50 generaciones, incluso indefinidamente.

Aquellos con experiencia en la técnica entenderán que las alteraciones genéticas, incluyendo modificaciones metabólicas ejemplificadas en la presente, se describen con referencia a un organismo huésped adecuado tal como E. coli y sus reacciones metabólicas correspondientes o un organismo fuente adecuado para material genético deseado, tal como genes para una vía metabólica deseada. Sin embargo, dando la secuenciación del genoma completo de una amplia variedad de organismos y el alto nivel de experiencia en el área de la genómica, aquellos con experiencia en la técnica fácilmente serán capaces de aplicar las enseñanzas y ubicación proporcionada en la presente para esencialmente todos los otros organismos. Por ejemplo, las alteraciones metabólicas de E. coli ejemplificadas en la presente pueden fácilmente aplicarse a otras especies al incorporar el mismo ácido nucleico de codificación o análogo de especies distintas de las especies mencionadas. Tales alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, alteraciones genéticas de especies homologas, en general, y en particular, desplazamientos genéticos ortólogos, parálogos o no ortólogos.

Un ortólogo es un gen o genes que se relacionan por el descenso vertical y son responsables de sustancialmente las mismas o idénticas funciones en diferentes organismos. Por ejemplo, la epóxido hidrolasa de ratón y la epóxido hidrolasa humana pueden considerarse ortólogas para la función biológica de hidrólisis de epóxidos . Los genes se relacionan por descenso vertical cuando, por ejemplo, comparten similaridad de secuencia de cantidad suficiente para indicar que son homologas, o se relacionan por evolución un progenitor común. Los genes también pueden considerarse ortólogos si comparten estructuras tridimensionales, pero no necesariamente la similitud de secuencia, de una cantidad suficiente para indicar que han evolucionado a partir de un progenitor común al grado que la similaridad de la secuencia primaria no es identificable . Los genes que son ortólogos pueden codificar proteínas con similaridad de secuencia de aproximadamente 25% a 100% de la identidad de secuencia de aminoácidos. Los genes que codifican las proteínas que comparten una similaridad de aminoácidos de menos de 25% pueden también considerarse que han surgido por descenso vertical si su estructura tridimensional también muestra similaridades . Los miembros de la familia serina proteasas de las enzimas, que incluyen activador de plasminogeno de tejido y elastasa, se considera que han surgido por el descenso vertical de un progenitor común.

Los ortólogos incluyen genes o sus productos de genes codificados que a través de, por ejemplo, evolución, discrepado en estructura o actividad general. Por ejemplo, donde una especie codifica un producto genético que muestra dos funciones y donde tales funciones se han separado en distintos genes en una segunda especie, los tres genes y sus productos correspondientes se considera que son ortólogos . Para la producción de un producto bioquímico, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el gen ortólogo que alberga la actividad metabólica para introducirse o interrumpirse se elegirá para la construcción del microorganismo que no se encuentra en la naturaleza. Un ejemplo de ortólogos que muestran actividades separables es donde las distintas actividades se han separado en distintos productos genéticos entre dos o más especies o dentro de una sola especie. Un ejemplo específico es la separación de proteólisis de elastasa y proteólisis de plasminógeno, dos tipos de actividad de serina proteasa, en distintas moléculas como activador de plasminógeno y elastasa. Un segundo ejemplo es la separación de la actividad de micoplasma 5 '-3' exonucleasa y polimerasa III de ADN de Drosophila. La polimerasa de ADN de las primeras especies puede considerarse un ortólogo en cualquiera o ambas de las exonucleasas o la polimerasa de la segunda especie y viceversa.

En contraste, los parálogos son homólogos relacionados por, por ejemplo, duplicación seguida por la divergencia evolutiva y tienen funciones similares o comunes, pero no idénticas. Loa parálogos pueden originarse o derivarse de, por ejemplo, las mismas especies o de especies diferentes. Por ejemplo, la epóxido hidrolasa microsomal (epóxido hidrolasa I) y la epóxido hidrolasa soluble (epóxido hidrolasa II) pueden considerarse parálogos debido a que representan dos distintas enzimas, co-evolucionadas a partir de un progenitor común, que catalizan distintas reacciones y tiene distintas funciones en la misma especie. Los parálogos son proteínas de la misma especie con similaridad de secuencia significativa entre sí que sugiere que son homólogos, o se relacionan a través de co-evolución de un progenitor común. Los grupos de familias de proteína paráloga incluyen homólogos HipA, genes de luciferasa, peptidasa, y otros .

Un desplazamiento de genes no ortólogos es un gen no ortólogo de una especie que puede sustituirse para una función genética mencionada en una especie diferente. La sustitución incluye, por ejemplo, ser capaz de realizar sus ancialmente la misma o similar función en las especies de origen comparadas con la función mencionada en las diferentes especies. Aunque por lo general, será identificable un desplazamiento del gen de no ortólogo como estructuralmente relacionado con un gen conocido que codifica la función mencionada, los genes estructuralmente menos relacionados, aunque funcionalmente similares y sus productos genéticos correspondientes, no obstante todavía caerán dentro del significado del término como se utiliza en la presente. La similaridad funcional requiere, por ejemplo, al menos alguna similaridad estructural en el sitio activo o región de unión de un producto genético no ortólogo en comparación con un gen que codifica la función que se busca sustituir. Por lo tanto, un gen no ortólogo incluye, por ejemplo, un parálogo o un gen no relacionado.

Por lo tanto, en la identificación y construcción de los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza de la invención, que tienen capacidad de biosíntesis de etilenglicol , aquellos con experiencia en la técnica entenderán con la aplicación de la enseñanza y orientación proporcionadas en la presente para una especie particular que la identificación de modificaciones metabólicas puede incluir la identificación e inclusión o la inactivación de ortólogos . En la medida en que los desplazamientos genéticos de parálogos y/o no ortólogos se encuentran presentes en el microorganismo de referencia que codifica una enzima que cataliza una reacción metabólica similar o sustancialmente similar, aquellos con experiencia en la técnica también pueden utilizar estos genes evolutivamente relacionados .

Los desplazamientos genéticos ortólogos, parálogos y no ortólogos pueden determinarse por métodos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, la inspección de ácido nucleico o secuencias de aminoácido para dos polipéptidos revelará la identidad de secuencia y similaridades entre las secuencias comparadas. En base a tales similaridades, alguien con experiencia en la técnica puede determinar si la similaridad es lo suficientemente alta para indicar que las proteínas se encuentran relacionadas a través de la evolución de un progenitor común. Los algoritmos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, tales como Align, BLAST, Clustal W y otros comparan y determinan una similaridad en bruto o identidad, y también determina la presencia o importancia de los vacíos en la secuencia que se puede asignar un peso o puntuación. Tales algoritmos también se conocen en la técnica y son similarmente aplicables para determinar la similaridad o identidad de secuencia de nucleótidos . Los parámetros para una similaridad suficiente para determinar la relevancia se calculan basados en métodos bien conocidos para calcular la similaridad estadística, o la probabilidad de encontrar una correspondencia similar en un polipéptido aleatorio, y la significancia de la correspondencia determinada. Una comparación por computadora de dos o más secuencias pueden, si se desea, también optimizarse visualmente por aquellos con experiencia en la técnica. Los productos genéticos relacionados o proteínas puede esperarse que tengan una alta similaridad, por ejemplo, 25% a 100% de la identidad de la secuencia. Las proteínas que no se relacionan pueden tener una identidad que es esencialmente la misma como podría esperarse que ocurra por correspondencia, si una base de datos de tamaño suficiente se escanea (alrededor de 5%) . Las secuencias entre 5% y 24% pueden o no representar homología suficiente para concluir que las secuencias comparadas se relacionan. El análisis estadístico adicional para determinar la significancia de tales correspondencias da el tamaño del conjunto de datos puede llevarse a cabo para determinar la relevancia de estas secuencias.

Los parámetros ejemplares para determinar la relevancia de dos o más secuencias utilizando el algoritmo BLAST, por ejemplo, pueden ser como se establece en lo siguiente. Brevemente, las alineaciones de secuencia de aminoácido pueden realizarse utilizando BLASTP versión 2.0.8 (Ene-05-1999 ) y los siguientes parámetros: Matrix: 0 BLOSUM62; abertura de vacío: 11; extensión de vacío: 1; x_dropoff: 50; esperado: 10.0; tamaño de palabra: 3; filtro: encendido. Las alineaciones de secuencia de ácido nucleico pueden realizarse utilizando BLASTN versión 2.0.6 (Sept-16-1998) y los siguientes parámetros: Correspondencia: 1 ; discordancia: -2; abertura de vacío: 5; extensión de vacío: 2; x_dropoff: 50; esperado: 10.0; tamaño de palabra: 11; filtro: apagado. Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que las modificaciones pueden hacerse a los parámetros anteriores ya sea para incrementar o disminuir el rigor de la comparación por ejemplo, y determinar la relevancia de dos o más secuencias .

En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol incluye una serina aminotransferasa, una serina oxidoreductasa, (desaminante) , una hidroxipirivato descarboxilasa, una glicolaldehído reductasa o serina descarboxilasa, una etanolamina aminotrasferasa, una etanolamina oxidoreductasa (desaminante) , una hidroxipiruvato reductasa o una glicerato descarboxilasa (véase las etapas 1-9 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una vía de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una serina aminotransferasa o una serina oxidoreductasa (desaminante) ; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa (véase etapas 1/2, 3 y 4 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una serina aminotransferasa o una serina oxidoreductasa (desaminante) ; una hidroxipiruvato reductasa, y una glicerato descarboxilasa (véase etapas 1/2, 8 y 9 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una serina descarboxilasa; una etanolamina aminotransferasa o una etanolamina oxidoreductasa (desaminante) ; y una glicolaldehído reductasa, (véase etapas 5, 6/7 y 4 de la Figura 1) .

En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una hidroxipiruvato descarboxilasa; una glicolaldehído reductasa, una hidroxipiruvato reductasa, una glicerato descarboxilasa, una 3-fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato cinasa, una 2-glicerato fosfatasa, una glicerato-2-cinasa o un gliceraldehído deshidrogenasa (véase las etapas 3, 4 y 8-14 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye hidroxipiruvato reductasa; hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa, (véase las etapas 8, 3 y 4 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una 3-fosfoglicerato fosfatasa o una glicerato cinasa; una hidroxipiruvato reductasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa, (véase etapas 10/11, 8, 3 y 4 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una 2-fosfaglicerato fosfatasa o una glicerato-2-cinasa; una hidroxipiruvato reductasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa, (véase las etapas 12/13, 8, 3 y 4 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una gliceraldehído deshidrogenasa, una hidroxipiruvato reductasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa, (véase las etapas 14, 8, 3 y 4 de la Figura 1) En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol incluyendo una glicerato descarboxilasa (véase etapa 9 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una 3-fosfoglicerato fosfatasa, o una glicerato cinasa y una glicerato descarboxilasa (véase etapa 10/11 y 9 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una 2-fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato-2-cinasa y una glicerato descarboxilasa (véase etapa 12/13 y 9 de la Figura 1) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una gliceraldehído deshidrogenasa y una glicerato descarboxilasa (véase etapa 14 y 9 de la Figura 1) .

En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato carboligasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa, una glicolaldehído reductasa o una glicerato deshidrogenasa (véase etapas 1, 2, 3, 4 o 5 de la Figura 2). En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato carboligasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa (véase etapas 1, 2, 3 y 4 de la Figura 2). En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glicerato deshidrogenasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa y una glicolaldehído reductasa (véase las etapas 5, 2, 3 y 4 de la Figura 2) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una 3-fosfoglicerato fosfatasa o una glicerato cinasa; una glicerato deshidrogenasa; una hidroxipiruvato isomerasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa; y una glicolaldehído reductasa (véase etapas 10/11 de la Figura 1 y las etapas 5, 2, 3 y 4 de la Figura 2) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una 2-fosfoglicerato fosfatasa o una glicerato-2-cinasa; una glicerato deshidrogenasa; una hidroxipiruvato isomerasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa; y una glicolaldehído reductasa, (véase las etapas 12/13 de la Figura 1 y las etapas 5, 2, 3 y 4 de la Figura 2) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol , la trayectoria de etilenglicol que incluye una gliceraldehído deshidrogenasa, una glicerato deshidrogenasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa (véase la etapa 4 de la Figura 1 y las etapas 5, 2, 3 y 4 de la Figura 2) .

En algunas modalidades, la invención proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa, una glicolil-CoA sintetasa, una glicolil-CoA reductosa (formación de aldehido), y una glicolaldehído reductasa, una glicolato reductasa, una glicolato cinasa, una fosfotransglicolilasa, una glicolil fosfato reductasa o una glicolil-CoA reductasa (formación de alcohol) (véase etapas 1-10 de la Figura 3) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa, o una glicolil-CoA sintetasa; una glicolil-CoA reductosa (formación de aldehido), y una glicolaldehído reductasa, (véase etapas 1, 2/3, 4 y 5 de la Figura 3) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolato reductasa, y una glicolaldehído reductasa (véase etapas 1, 6 y 5 de la Figura 3) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa o una glicolil-CoA sintetasa y una glicolil-CoA reductosa (formación de alcohol), (véase etapas 1, 2/3 y 10 de la Figura 3). En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolato cinasa, una fosfotransglicolilasa, glicolil-CoA reductasa (que forma aldehido) y una glicoaldehído reductosa (véase etapas 1, 7, 8, 4 y 5 de la Figura 3) . En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolato cinasa, una fosfotransglicolilasa y una glicolil-CoA reductosa (formación de alcohol), (véase etapas 1, 7, 8 y 10 de la Figura 3). En un aspecto, el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica las enzimas de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, glicolato cinasa, una glicolilfosfato reductosa y una glicolaldehído'' reductasa (véase las etapas 1, 7, 9 y 5 de la Figura 3) .

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que tiene una trayectoria de etilenglicol en donde el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto seleccionado que consiste de serina a hidroxipiruvato, hidroxipiruvato a glicolaldehído , glicolaldehído a etilenglicol, serina a etanolamina, etanolamina a glicolaldehído, 3-fosfoglicerato a glicerato; 2-fosfoglicerato a glicerato, gliceraldehído a glicerato, glicerato a hidroxipiruvato, hidroxipiruvato a glicerato, glicerato a etilenglicol, glicerato a semialdehído de tartronato, glioxilato a tartronato de semialdehído, semialdehído de tartronato a hidroxipiruvato, glioxilato a glicolato, glicolato a glicolaldehído, glicolato a glicolil osfato, glicolato a glicolil-CoA y glicolil CoA a etilenglicol, glicolil-CoA a glicolaldehído, glicolilfosfato a glicolil-CoA y glicolilfosf to a glicolaldehído. Alguien con experiencia en la técnica entenderá que estos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto pueden determinarse fácilmente por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la misma. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte las sustancias y productos de una trayectoria de etilenglicol , tal como la que se muestra en las Figuras 1-3.

Aunque se describe generalmente en la presente como un organismo microbiano que contiene una trayectoria de etilenglicol, se entiende que la invención adicionalmente proporciona un microorganismo que no se encuentra en la naturaleza que comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir un intermediario de una vía de etilenglicol. Por ejemplo, como se describe en la presente, una trayectoria de etilenglicol se ejemplifica en las Figuras 1-3. Por lo tanto, además de organismo microbiano que contiene una trayectoria de etilenglicol que produce etilenglicol, la invención adicionalmente proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol, en donde el organismo microbiano produce una trayectoria de etilenglicol intermedia como por ejemplo hidroxipiruvato, etanolamina, glicolaldehído, glicerato, semialdehído de tartronato, glicolato, glicolilfosfato o glicolil-CoA.

Se entiende que cualquiera de las vías descritas en la presente, como se describe en los Ejemplos y se ejemplifica en las Figuras, que incluyen las trayectorias de las Figuras 1-3, pueden utilizarse para generar un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que produce cualquier trayectoria intermedia o producto, como se desee. Como se describe en la presente, tal organismo microbiano que produce un intermediario puede utilizarse en combinación con otro organismo microbiano que expresa las enzimas de trayectoria corriente abajo para producir un producto deseado. Sin embargo, se entiende que un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que produce un intermediario de trayectoria de etilenglicol puede utilizarse para producir el intermedio como un producto deseado.

La invención se describe en la presente con referencia general a la reacción metabólica, reactivo o producto del mismo, o con referencia específica a uno o más ácidos nucleicos o genes que codifican una enzima asociada con o que cataliza, o una proteína asociada con, la reacción metabólica mencionada, reactivo o producto. A menos de que se establezca expresamente de otra forma en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que la referencia a una reacción también constituye la referencia a los reactivos y productos de la reacción. Similarmente, a menos que se establezca expresamente de otra forma en la presente, la referencia a un reactivo o producto también hace referencia la reacción, y la referencia a cualquiera de estos constituyentes metabólicos también hace referencia al gen o genes que codifican las enzimas que catalizan o las proteínas implicadas en la reacción mencionada, reactivos o productos. Asimismo, dando los campos bien conocidos de bioquímica metabólica, enzimología y genómica, la referencia en la presente a un gen o ácido nucleico de codificación también constituye una referencia a la enzima codificada correspondiente y la reacción cataliza o una proteína se asocia con la reacción, así como también los reactivos y los productos de la reacción.

Como se describe en la presente, los intermediarios glicerato, tartronato semialdehído, hidroxipiruvato y glioxilato, así como también otros intermediarios, son ácidos carboxilicos que pueden ocurrir en diversas formas ionizadas, incluyendo formas completamente protonadas, parcialmente protonadas y completamente desprotonadas . Por consiguiente, el sufijo "-ato", o la forma ácida, pueden utilizarse intercambiablemente para describir tanto la forma de ácido libre así como también cualquier forma desprotonada, en o particular puesto que la forma ionizada se conoce que depende del pH en el cual el compuesto se encuentra. Se entiende que los productos carboxilatos o intermediarios incluyen formas ésteres de productos carboxilato o intermediario de trayectoria tales como ésteres O-carboxilato y S-carboxilato . 0- y S- carboxilatos pueden incluir alquilo inferior, es decir oxilatos de cadena ramificada o lineal de Cl a C6. Algunos de tales 0- o S-carboxilatos incluyen, sin limitación, 0- o S-carboxilatos de metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, i-propilo, sec-butilo y tert-butilo, pentilo, hexilo, de los cuales cualquiera puede además poseer una insaturación, que proporciona por ejemplo, 0- o S-carboxilatos de propenilo, butenilo, pentilo y hexenilo. Los 0-carboxilatos pueden ser el producto de una trayectoria biosintética . Los 0-carboxilatos ejemplares accesados mediante la trayectoria biosintética pueden incluir, sin limitación, glicerato de metilo, glicerato de etilo, glicerato de n-propilo, semialdehído de tartronato de metilo, semialdehído de tartronato de etilo, semialdehído de tartronato de n-propilo, hidroxipiruvato de metilo, hidroxipiruvato de etilo, hidroxipiruvato de n-propilo, glioxilato de metilo glioxilato de etilo y glioxilato de n-propilo. Otros carboxilatos biosintéticamente accesibles pueden incluir medios para grupos de cadena larga, que es C7-C22, ésteres de O-carboxilato derivados de alcoholes grados, tales alcoholes heptílico, octílico, nonílico, decílico, undecílico, laurílico, tridecílico, miristílico, pentadecílico, cetílico, palmitolílico, heptadecílico , estearílico, nonadecílíco, araquidílico, heneicosílico y behenílico, cualquiera de los cuales puede ser opcionalmente ramificado y/o contener insaturaciones . Los esteres 0-carboxilato también pueden accesarse mediante proceso bioquímico o químico, tal como esterificación de un producto de ácido carboxílico libre o transesterificación de un 0- o S-carboxilato . Los S-carboxilatos se ejemplifican por los S-ésteres de CoA, S-ésteres de cisteína, alquiltioésteres y diversos arilos y heteroarilos tioésteres.

Los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza de la invención pueden producirse al introducir ácidos nucleicos expresables que codifican una o más enzimas o proteínas que participan en una o más trayectorias biosínteticas de etilenglicol . Dependiendo del organismo microbiano huésped elegido para biosíntesis los ácidos nucleicos para parte o todas de las trayectorias biosintéticas de etilenglicol particular pueden expresarse. Por ejemplo, si un huésped elegido es deficiente en una o más enzimas o proteínas para una trayectoria biosintética deseada, entonces los ácidos nucleicos expresables para la o las enzimas o la o las proteínas deficientes se introducen en el huésped para expresión exógena subsecuente.

Alternativamente, si el huésped elegido exhibe la expresión endógena de algunos genes de trayectoria, pero es deficiente en otros, entonces un ácido nucleico de codificación se necesita para la o las enzimas o la o las proteínas deficientes para lograr la biosíntesis de etilenglicol . De este modo, un organismo microbiano de la invención que no se encuentra en la naturaleza pueden producirse al introducir actividad de enzima o proteína exógenas para obtener una trayectoria biosintética deseada o una trayectoria biosintética deseada pueden obtenerse al introducir una o más actividades de enzima o proteína exógenas que, junto con una o más enzimas o proteínas endógenas, produce un producto deseado, tal como etilenglicol.

Los organismos microbianos huésped pueden seleccionar de, y los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza generados en, por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos o cualquiera de una variedad de otros microorganismos aplicables a procesos de fermentación. Las bacterias ejemplares incluyen especies seleccionadas de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogen.es, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, y Pseudomonas putida. Ejemplos de levaduras u hongos incluyen especies seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaecharomyees pombe, Kl yveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Rhizopus arrhizus, Rhizobus oryzae, Yarrowia lipolytica, y similares. E. coli es un organismo huésped particularmente útil puesto que es un organismo microbiano bien caracterizado adecuado para ingeniería genética. Otros organismos huésped particularmente útiles incluyen levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae. Se entiende que cualquier organismo huésped microbiano adecuado puede utilizarse para introducir modificaciones metabólicas y/o genéticas para producir un producto deseado.

Dependiendo de los constituyentes de trayectoria biosintética de etilenglicol de un organismo microbiano huésped seleccionado, los organismos microbianos de la invención que no se encuentran en la naturaleza incluirán al menos un ácido nucleico que codifica la trayectoria de etilenglicol expresada exogenamente y hasta todos los ácidos nucleicos codificados para una o más trayectorias biosintéticas de etilenglicol. Por ejemplo, la biosíntesis de etilenglicol puede establecerse en una deficiencia de huésped en una enzima o proteína de trayectoria a través de la expresión exógena del ácido nucleico de codificación correspondiente. En un huésped deficiente en todas las enzimas o proteínas de una trayectoria de etilenglicol , la expresión exógena de todas las enzimas o proteínas en la trayectoria pueden incluirse, aunque se entiende que todas las enzimas o proteínas de una trayectoria pueden expresarse incluso sin el huésped contiene una de la trayectoria de enzimas o proteínas. Por ejemplo, la expresión exógena de todas las enzimas o proteínas en una trayectoria para la producción de etilenglicol puede incluir, tal como una serina aminotransferasa, una serina oxidoreductasa (desaminante) una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa .

Dadas las enseñanzas y guía proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el número de ácidos nucleicos de codificación para incluir en una forma expresable serán, al menos, paralelos a las deficiencias de trayectoria de etilenglicol del organismo microbiano huésped seleccionado. Por lo tanto, un organismo microbiano de la invención que no se encuentra en la naturaleza puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez, hasta todos los ácidos nucleicos que codifican las enzimas o proteínas que constituyen una trayectoria biosintética de etilenglicol descrita en la presente. En algunas modalidades, los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza también pueden incluir otras modificaciones genéticas que facilitan u optimizan la biosíntesis de etilenglicol o que transfieren funciones útiles sobre los organismos microbiano huésped. La otra funcionalidad puede incluir, por ejemplo, aumento de síntesis de uno o más de los precursores de la trayectoria de etilenglicol tales como glicolaldehído , hidroxipiruvato , etanolamina, glicerato, semialdehído de tartronato, glicolato, glicolil-CoA o glicolilfosfato .

Generalmente, un organismo microbiano huésped se selecciona de tal manera que produce el precursor de una trayectoria de etilenglicol, ya sea como una molécula producida naturalmente o como un producto diseñado genéticamente que proporciona cualquier producción de novo de un precursor deseado o producción incrementada de un precursor naturalmente producido por el organismo microbiano huésped. Por ejemplo, la serina se produce naturalmente en un organismo huésped tal como E. coli. Un organismo huésped puede ser diseñado genéticamente para incrementar la producción de un precursor, como se describe en la presente. Además, un organismo microbiano que se ha diseñado genéticamente para producir un precursor deseado puede utilizarse como un organismo huésped y además diseñarse genéticamente para expresar enzimas o proteínas de una trayectoria de etilenglicol.

En algunas modalidades, un organismo microbiano de la invención que no se encuentra en la naturaleza se genera a partir de un huésped que contiene la capacidad enzimática para sintetizar etilenglicol . En esta modalidad especifica puede ser útil incrementar la síntesis o acumulación de un producto de trayectoria de etilenglicol para, por ejemplo, dirigir la reacción de trayectoria de etilenglicol hacia la producción de etilenglicol. La síntesis incrementada o acumulación se puede lograr, por ejemplo, sobreexpresión de ácidos nucleicos de codifican una o más de las enzimas o proteínas de trayectoria de etilenglicol descritas en lo anterior. La sobreexpresión de la enzima o enzimas y/o la proteína o proteínas de la trayectoria de etilenglicol puede ocurrir, por ejemplo, a través de la expresión exógena del gen o genes endógenos, o a través de la expresión exógena del gen o genes heterólogos . Por lo tanto, los organismos que se encuentran en la naturaleza pueden fácilmente generarse para ser organismos microbianos de la invención que no se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, producir etilenglicol, a través de la sobreexpresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o 10, es decir, hasta el total de ácidos nucleicos de codificación de enzimas o proteínas de trayectoria biosintética de etilenglicol. Además, un organismo que no se encuentra en la naturaleza puede generarse por mutagénesis de un gen endógeno que resulta en un incremento en la actividad de una enzima en la trayectoria biosintética de etilenglicol.

En modalidades particularmente útiles, se emplea la expresión exogena de los ácidos nucleicos de codificación. La expresión exogena confiere la capacidad para personalizar la expresión y/o los elementos regulatorios al huésped y la aplicación para lograr un nivel de expresión deseado que se controla por el usuario. Sin embargo, la expresión endógena también puede utilizarse en otras modalidades, tal como al remover un efector regulatorio negativo o inducción del promotor del gen cuando se enlaza a un promotor inducible u otro elemento regulatorio. De este modo, un gen endógeno que tiene un promotor inducible que se encuentra en la naturaleza supra regulados al proporcionar el agente de inducción apropiado, o la región regulatoria de un gen endógeno puede diseñarse genéticamente para incorporar un elemento regulatorio inducible, permitiendo por consiguiente la regulación de la expresión incrementada de una gen endógeno en un tiempo deseado. Similarmente, un promotor inducible puede incluirse como un elemento regulatorio de un gen exógeno introducido en un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza.

Se entiende que, en los métodos de la invención, cualquiera de uno o más ácidos nucleicos exógenos pueden introducirse en un organismo microbiano para producir un organismo microbiano de la invención que no se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos pueden introducirse para conferir, por ejemplo, una trayectoria biosintética de etilenglicol sobre el organismo microbiano. Alternativamente, los ácidos nucleicos de codificación pueden introducirse para producir un organismo microbiano intermediario que tiene la capacidad biosintética de catalizar parte de la reacción requerida para conferir la capacidad biosintética de etilenglicol. Por ejemplo, un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que tiene una trayectoria biosintética de etilenglicol puede comprender por lo menos dos ácidos nucleicos exógenos que codifican proteínas o enzimas deseadas, tal como la combinación de una hidroxipiruvato descarboxilasa y una glicolaldehído reductasa, o alternativamente una serina descarboxilasa y una etanolamina oxidoreductasa (desaminante) o alternativamente una glioxilato carboligasa y una hidroxipiruvato isomerasa, o alternativamente una glicolil-CoA reductasa (formación de aldehido) y una glicolaldehído reductasa, o alternativamente 2-fosfoglicerato fosfatasa y glicolaldehído reductasa y similares. De este modo, se entiende que cualquiera combinación de dos enzimas o proteínas de una trayectoria biosintética puede incluirse en un organismo microbiano de la invención que no se encuentra en la naturaleza. Similarmente, se entiende que cualquier combinación de tres o más enzimas o proteínas de una trayectoria biosintética pueden incluirse en un organismo microbiano de la invención que no se encuentra en la naturaleza, por ejemplo, una serina oxidoreductasa (desaminante) , una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa, o alternativamente, una glicerato cinasa; una hidroxipiruvato reductasa y una hidroxipiruvato descarboxilasa, o alternativamente una 3-fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato cinasa y una glicerato descarboxilasa, o alternativamente una glioxilato carboligasa, una hidroxipiruvato isomerasa y una hidroxipiruvato descarboxilasa, o alternativamente una glicolil-CoA transferasa, una glicolil-CoA reductasa (que forma aldehido) y una glicolaldehído reductasa, o alternativamente una glioxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa y una glicolil-CoA reductosa (que forma alcohol), y así sucesivamente, como se desea, siempre y cuando la combinación de enzimas y/o proteínas de la trayectoria biosintética deseada resulta en la producción del producto deseado correspondiente. Similarmente, cualquier combinación de cuatro, una serina descarboxilasa, una etanolamina aminotrasferasa, una etanolamina oxidoreductasa (desaminante) y una glicolaldehído reductasa, o alternativamente una 3-fosfogliceerato fosfatasa, una hidroxipiruvato reductasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa y una glicolaldehído reductasa, o alternativamente una glioxilato carboligasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa y una glicolaldehído reductasa, o alternativamente una glioxilato reductasa, glicolato cinasa, una glicolilfosfato reductasa y una glicolaldehído reductasa, o alternativamente una gliceraldehído deshidrogenasa, una glicerato deshidrogenasa, y una hidroxipiruvato descarboxilasa o más enzimas o proteínas de una trayectoria biosintetica como se describe en la presente pueden incluirse en un organismo microbiano de la invención que no se encuentra en la naturaleza, como se desea, siempre y cuando la combinación de enzimas y/o proteínas de la trayectoria biosintética deseada resulte en la producción del producto deseado correspondiente .

Además de la biosíntesis de etilenglicol como se describe en la presente, los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza y los métodos de la invención también pueden utilizarse en diversas combinaciones entre sí y con otros organismos microbianos y métodos bien conocidos en la técnica para lograr la biosíntesis del producto por otras rutas. Por ejemplo, una alternativa para producir etilenglicol distinto al uso de los productores de etilenglicol es a través de la adición de otro organismo microbiano capaz de convertir un intermediario de trayectoria de etilenglicol a etilenglicol .

Uno de tales procedimientos incluye, por ejemplo, la fermentación de un organismo microbiano que produce un intermediario de trayectoria de etilenglicol . El intermediario de trayectoria de etilenglicol puede entonces utilizarse como un sustrato para un segundo organismo microbiano que convierte el intermediario de trayectoria de etilenglicol a etilenglicol. El intermediario de trayectoria de etilenglicol pueden agregarse directamente a otro cultivo del segundo organismo o el cultivo original de los productores intermedios de trayectoria de etilenglicol pueden disminuirse de estos organismos microbianos, por ejemplo, separación' celular, y después la adición subsecuente del segundo organismo al caldo de fermentación puede utilizarse para producir el producto final sin etapas de purificación intermedias .

En otras modalidades, los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza y los métodos de la invención pueden ensamblarse en una amplia variedad de subtrayectorias para lograr la biosíntesis de, por ejemplo, etilenglicol. En estas modalidades, las trayectorias biosintéticas para un producto deseado de la invención pueden segregarse en organismos microbianos diferentes, y los organismos microbianos diferentes pueden co-cultivarse para producir el producto final. En tal esquema biosintético , el producto de un organismo microbiano es la sustancia para un segundo organismo microbiano hasta que se sintetiza el producto final. Por ejemplo, la biosíntesis de etilenglicol puede lograrse al construir un organismo microbiano que contiene las trayectorias biosinteticas para la conversión de un intermediario de trayectoria a otro intermediario de trayectoria o el producto. Alternativamente, el etilenglicol también puede ser producido biosinteticamente a partir de los organismos microbianos a través del co-cultivo o co-fermentación utilizando dos organismos en el mismo recipiente, en donde el primer organismo microbiano produce un intermedio de etilenglicol y el segundo organismo microbiano convierte el intermedio a etilenglicol.

Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que una amplia variedad de combinaciones y permutaciones existen para los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza y los métodos de la invención junto con otros organismos microbianos, con el co-cultivo de otros organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza que tienen subtrayectorias y con combinaciones de otros procedimientos químicos y/o bioquímicos bien conocidos en la técnica para producir etilenglicol.

Las fuentes de ácidos nucleicos de codificación para una enzima o proteína de trayectoria de etilenglicol pueden incluir, por ejemplo, cualquier especie donde el producto genético codificado es capaz de catalizar la reacción de referencia. Tales especies incluyen tanto organismos procarióticos como eucarióticos , incluyendo, pero no limitados a, bacterias, arqueas y eubacterias, y eucariotes, que incluyen levaduras, plantas, insectos, animales y de mamífero, incluyendo humanos. Especies ejemplares para tales fuentes incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Rattus norvegicus, Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Mus musculus , Sus scrofa, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Hyphomicrobium methylovorum, Methylobacterium extorquens, Thermotoga marítima, Halobacterium salinarum, Lactococcus lactis, Saccharonyces cerevisiae, Zymomonas mobilis, Acinetobacter sp. Strain M-l, Brassica napus , Beta vulgaris, Geobacillus s tearothermophilus , Agrobacterium tumefaciens, Acinetobacter calcoaceticus , Acinetobacter baylyi, Achromobacter denitrificans, Streptococcus thermoplhilus, Bacillus brevis, BAcillus subtílis, Bacillus megaterium, Enterobacter aerogenes, Ralstonia eutropha, Salmonella entérica, Salmonella typhimurium, Burkholderia ambifaria, Acidaminococcus fermentans, Archaeoglobus fulgidus, Haloarcula arismortui, Pyrobaculum aerophilum str. IM2 , Pseudomonas putida, Pseudomonas sp, Rhizobium leguminosarum, Clostridium kluyveri, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii , Porphyromonas gingivalis , Leuconostoc mesenteroides, Metallosphaera sedula, Sulfolobus tokodaii , Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius , nocardia iowensis, Streptomyces griseus, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe, Penicillium chrysogenum, bacteria que produce butirato L2-50, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholera, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, Leuconostoc mesenteroides, Chloroflexus aurantiacus, Roseiflexus castenholzii , Erythrobacter sp. NAPl, gamma proteobacterium marina HTCC2080, Simmondsia chinensis, Azospirillum brasilense, Bos Taurus, Clostridium kluyveri DSM 555, Geobacillus thermoglucosidasius, Methanocaldococcus jannaschii , Oryctolagus cuniculus, Oryza sativa, Phaseolus vulgaris, Picrophilus torridus, Pseudomonas aeruginosa, Pyrococcus furiosus, Ralstonia eutropha H16, Staphilococcus ureus, Thermoproteus tenax, Thermus thermophilus, y Zea mays así como también otras especies ejemplares descritas en la presente o disponibles como organismos fuente para genes correspondientes. Sin embargo, con la secuencia del genoma completa disponible por ahora de más de 550 especies (con más de la mitad de estas disponibles en base de datos públicas tales como la NCBI), incluyendo 395 genomas de microorganismo y una variedad de genomas de levadura, hongo, planta, y mamíferos, la identificación de genes que codifican la actividad biosintética de etilenglicol requerida para uno o más genes en especies relacionadas o distantes, incluyendo por ejemplo, desplazamientos genéticos, homólogos, ortólogos, parálogos y no ortólogos de genes conocidos, y el intercambio de alteraciones genéticas entre organismos es de rutina y bien conocido en la técnica. Por consiguiente, las alteraciones metabólicas permiten la biosíntesis de etilenglicol descrita en la presente con referencia a un organismo particular, tal como E. coli pueden aplicarse fácilmente a otros microorganismos, incluyendo organismos procarióticos y eucarióticos parecidos. Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que una alteración metabólica ejemplificada en un organismo puede aplicarse igualmente a otros organismos.

En algunos casos, tales como cuando una trayectoria biosintética de etilenglicol alternativa existe en una especie no relacionada, la biosíntesis de etilenglicol puede conferirse en la especie huésped, por ejemplo, expresión exógena de un parálogo o parálogos de las especies no relacionadas que catalizan una reacción metabólica aún no idéntica, similar para remplazar la reacción de referencia. Debido a que existen ciertas diferencias entre las redes metabólicas entre los diferentes organismos, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el uso del gen actual entre diferentes organismos puede diferir. Sin embargo, dadas las enseñanzas y la guía proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que las enseñanzas y métodos de la invención pueden aplicarse a todos los organismos microbianos utilizando las alteraciones metabólicas afines para aquellas ejemplificadas en la presente para construir un organismo microbiano en una especie de interés que sintetizará etilenglicol.

Los métodos para construir y probar los niveles de expresión de huésped que produce etilenglicol que no se encuentra en la naturaleza pueden realizarse, por ejemplo, por métodos recombinantes y de detección bien conocidos en la técnica. Tales métodos pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) .

Las secuencias de ácidos nucleicos exógenas implicadas en una trayectoria para producción de etilenglicol pueden introducirse estable o temporalmente en una célula huésped utilizando técnicas bien conocidas en el arte que incluyen, pero no limitan a, conjugación, electroporación, transformación química, transducción, transíección, y transformación por ultrasonido. Para la expresión exógena en E. coli u otras células procarióticas , algunas secuencias de ácidos nucleicos en los genes o los ADNc de ácidos nucleicos eucarióticos pueden codificar señales objetivo, tales como una señal mitocondrial N-terminal u otra señal objetivo, que pueden removerse antes de la transformación en las células huésped procarióticas , si se desea. Por ejemplo, la remoción de una secuencia líder mitocondrial conduce a una expresión incrementada en E. coli (Hoffmeister et al., «J. Biol . Chem. 280 : 4329 - 433 8 ( 2005 ) ) . Para la expresión exógena en levaduras u otras células eucariotas, los genes pueden expresarse en el citosol sin la adición de la secuencia líder, o pueden ser dirigidas a la mitocondria u otros organelos, o dirigirse para secreción, por la adición de una secuencia objetivo adecuada tal como una o señal objetivo o de secreción mitocondrial adecuada para las células huésped. De este modo, se entiende que las modificaciones apropiadas en una secuencia de ácido nucleico para remover o incluir una secuencia objetivo puede incorporarse en una secuencia de ácido ' nucleico exógeno para impartir propiedades deseables. Además, los genes pueden someterse a optimización de codón con técnicas bien conocidas en el arte para lograr la expresión optimizada de las proteínas.

Un vector o vectores de expresión pueden elaborarse para incluir uno o más trayectorias biosintéticas de etilenglicol que codifican los ácidos nucleicos como se ejemplifica en la presente enlazado operablemente a las secuencias de control de expresión funcionales en el organismo huésped. Los vectores de expresión aplicables para su uso en los organismos huésped microbianos de la invención incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores fago, vectores virales, episomas y cromosomas artificiales, que incluyen vectores y secuencias de selección o marcadores operables para la integración estable en un cromosoma huésped. Adicionalmente, los vectores de expresión pueden incluir uno o más genes marcadores seleccionables y secuencias de control de expresión apropiadas. Los genes marcadores seleccionables también pueden incluir que, por ejemplo, proporcionan resistencia a antibióticos o toxinas, deficiencias de complementos auxotróficos , o ningún nutriente crítico de suministro en el medio de cultivo. Las secuencias de control de expresión pueden incluir promotores constitutivos e inducibles, mejoradores de transcripción, terminadores de transcripción, y similares, que son bien conocidos en la técnica. Cuando dos o más exógenos que codifican ácidos nucleico van a co-expresarse, ambos ácidos nucleicos pueden insertarse, por ejemplo, en un vector de expresión simple o en vectores de expresión separados. Para el vector de expresión simple, los ácidos nucleicos de codificación pueden enlazarse operablemente a una secuencia de control de expresión común o enlazarse a secuencias de control de expresión diferentes, tal como un promotor inducible y un promotor constitutivo. La transformación de secuencias de ácidos nucleicos exógenos en una trayectoria metabólica o sintética pueden confirmarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, análisis de ácido nucleico tales como transferencias Northern o amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de mRNA, o inmunotransferencia para expresión de productos genéticos, u otros métodos analíticos adecuados para probar la expresión de una secuencia de ácido nucleico introducida o su producto genético correspondiente. Se entenderá por aquellos con experiencia en la técnica que los ácidos nucleicos exógenos se expresan en una cantidad suficiente para producir el producto deseado, y se entiende además que los niveles de expresión pueden optimizarse para obtener suficiente sobre-expresión utilizando métodos bien conocidos en la técnica y como se describe en la presente.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir etilenglicol que incluye cultivar un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol incluyendo por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol incluyendo una serina aminotransferasa, una serina oxidoreductasa (desaminante) , una hidroxipirivato descarboxilasa, una glicolaldehído reductasa, una serina descarboxilasa, una etanolamina aminotrasferasa, glicolaldehído reductasa, una serina descarboxilasa, una etanolamina transferasa, una etanolamina oxidoreductasa (desaminante) , una hidroxipiruvato reductasa o una glicerato descarboxilasa (véase las etapas 1-9 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una serina aminotransferasa o una serina oxidoreductasa (desaminante) ; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa (véase etapas 1/2, 3 y 4 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una serina aminotransferasa o una serina oxidoreductasa (desaminante) ; una hidroxipiruvato reductasa, y una glicerato descarboxilasa (véase etapas 1/2, 8 y 9 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una serina descarboxilasa; una etanolamina aminotransferasa o una etanolamina oxidoreductasa (desaminante) ; y una glicolaldehído reductasa, (véase etapas 5, 6/7 y 4 de la Figura 1) .

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir etilenglicol que incluye cultivar un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresadas en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol incluyendo una hidroxipiruvato descarboxilasa; una glicolaldehído reductasa, una hidroxipiruvato reductasa, una glicerato descarboxilasa, una 3 -fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato cinasa, una 2-glicerato fosfatasa, una glicerato-2-cinasa o un gliceraldehído deshidrogenasa (véase las etapas 3, 4 y 8-14 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una hidroxipiruvato reductasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa y una glicolaldehído reductasa, (véase las etapas 8, 3 y 4 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una 3-fosfoglicerato fosfatasa o una glicerato cinasa; una hidroxipiruvato reductasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa, (véase etapas 10/11, 8, 3 y 4 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una 2-fosfaglicerato fosfatasa o una glicerato-2-cinasa; una hidroxipiruvato reductasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa, (véase las etapas 12/13, 8, 3 y 4 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una gliceraldehído deshidrogenasa, una hidroxipiruvato reductasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa, (véase las etapas 14, 8, 3 y 4 de la Figura 1) En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir etilenglicol que incluye cultivar un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol incluyendo una glicerato descarboxilasa (véase etapa 9 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una 3-fosfoglicerato fosfatasa, o una glicerato cinasa y una glicerato descarboxilasa (véase etapa 10/11 y 9 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una 2-fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato-2-cinasa y una glicerato descarboxilasa (véase etapa 12/13 y 9 de la Figura 1) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una gliceraldehído deshidrogenasa y una glicerato descarboxilasa (véase etapa 14 y 9 de la Figura 1) · En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir etilenglicol que incluye cultivar organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato carboligasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa, una glicolaldehído reductasa o una glicerato deshidrogenasa (véase etapas 1, 2, 3, 4 o 5 de la Figura 2) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato carboligasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa (véase etapas 1, 2, 3 y 4 de la Figura 2) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una glicerato deshidrogenasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa y una glicolaldehído reductasa (véase las etapas 5, 2, 3 y 4 de la Figura 2) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una 3 -fosfoglicerato fosfatasa o una glicerato cinasa; una glicerato deshidrogenasa; una hidroxipiruvato isomerasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa; y una glicolaldehído reductasa (véase etapas 10/11 de la Figura 1 y las etapas 5, 2, 3 y 4 de la Figura 2) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una 2-fosfoglicerato fosfatasa o una glicerato-2-cinasa; una glicerato deshidrogenasa; una hidroxipiruvato isomerasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa; y una glicolaldehído reductasa, (véase las etapas 12/13 de la Figura 1 y las etapas 5, 2, 3 y 4 de la Figura 2) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una gliceraldehído deshidrogenasa, una glicerato deshidrogenasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa (véase la etapa 4 de la Figura 1 y las etapas 5, 2, 3 y 4 de la Figura 2) .

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir etilenglicol que incluye cultivar un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol, la trayectoria de etilenglicol que incluye por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol , la trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa, una glicolil-CoA sintetasa, una glicolil-CoA reductosa (formación de aldehido) , y una glicolaldehído reductasa, una glicolato reductasa, una glicolato cinasa, una fosfotransglicolilasa, una glicolil fosfato reductasa o una glicolil-CoA reductasa (formación de alcohol) (véase etapas 1-10 de la Figura 3). En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa, o una glicolil-CoA sintetasa; una glicolil-CoA reductosa (formación de aldehido) , y una glicolaldehído reductasa, (véase etapas 1, 2/3, 4 y 5 de la Figura 3) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolato reductasa, y una glicolaldehído reductasa (véase etapas 1, 6 y 5 de la Figura 3) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa o una glicolil-CoA sintetasa y una glicolil-CoA reductosa (formación de alcohol) , (véase etapas 1, 2/3 y 10 de la Figura 3). En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolato cinasa, una fosfotransglicolilasa, una glicolil-CoA reductasa (que forma aldehido) y una glicoaldeh do reductosa (véase etapas 1, 7, 8, 4 y 5 de la Figura 3) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, una glicolato cinasa, una fosfotransglicolilasa y una glicolil-CoA reductosa (formación de alcohol) , (véase etapas 1, 7, 8 y 10 de la Figura 3) . En un aspecto, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que incluye una glioxilato reductasa, glicolato cinasa, una glicolilfosfato reductosa y una glicolaldehído reductasa (véase las etapas 1, 7, 9 y 5 de la Figura 3) .

La purificación y/o ensayos adecuados para probar la producción de etilenglicol pueden realizarse utilizando métodos bien conocidos. Las replicas adecuadas tales como cultivos por triplicado pueden cultivarse para cada cepa diseñada genéticamente para probarse. Por ejemplo, la formación del producto y subproducto en el huésped de la producción diseñada genéticamente puede monitorearse . El producto final e intermedios, y otros compuestos orgánicos, pueden analizarse por métodos tales como HPLC (Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento) , GC-MS (Espectroscopia de Masa para Cromatografía de Gases) y LC-MS (Espectroscopia de Masa por Cromatografía de Líquidos) u otros métodos analíticos adecuados utilizando procedimientos de rutina bien conocidos en la técnica. La liberación del producto en el caldo de fermentación puede también probarse con el sobrenadante de cultivo. Los subproductos y la glucosa residual pueden cuantificarse por HPLC utilizando, por ejemplo, un detector de índice refractivo para glucosa y alcoholes, y un detector de UV para ácidos orgánicos (Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)), u otros ensayos adecuados y métodos de detección bien conocidos en la técnica. La enzima individual o actividades de proteína de la secuencia de ADN exógena pueden también ensayarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad glicoaldehído reductasa puede medirse por su reducción de glicoaldehído dependiente de NADH a etilenglicol utilizando un coeficiente de absorción molar de 6.22xl0~3 M"1 a 340 nm.

El etilenglicol puede ser separado de otros compuestos en el cultivo utilizando una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos de separación incluyen, por ejemplo, procedimientos de extracción, así como también métodos que incluyen la extracción de líquido-líquido continuo, pervaporación, filtración de membrana, separación de membrana, osmosis inversa, electrodiálisis , destilación, cristalización, centrifugación, filtración extractiva, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía por adsorción, y la ultrafiltración . Todos de los métodos anteriores son bien conocidos en la técnica.

Cualquiera de los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza descritos en la presente pueden cultivarse para producir y/o secretar los productos biosintéticos de la invención. Por ejemplo, los productores de etilenglicol pueden cultivarse para la producción biosintética de etilenglicol.

Para la producción de etilenglicol, las cepas recombinantes se cultivan en un medio con fuente de carbono y otros nutrientes esenciales . Es algunas veces deseable y puede ser altamente deseable mantener las condiciones anaeróbicas en el termentador para reducir el costo del proceso total. Tales condiciones pueden obtenerse, por ejemplo, al rociar primero el medio con nitrógeno y después sellar los matraces con un tapón con septo y reborde. Para las cepas en donde no se observa crecimiento anaerobicamente, condiciones microanaeróbicas , o sustancialmente anaeróbica pueden aplicarse al realizar el septo con un orificio pequeño para limitar la aireación. Se han descrito previamente condiciones anaeróbicas ejemplares, y se conocen bien en la técnica. Se describen condiciones aeróbicas y anaeróbicas ejemplares, por ejemplo, en la publicación de Estados Unidos 2009/0047719, presentada el 10 de agosto 2007. Las fermentaciones pueden realizarse en una manera de lote, lotes de alimentación o de manera continua, como se describe en la presente .

Si se desea, el pH del medio puede mantenerse en un pH deseado, en particular pH neutro, tal como un pH de alrededor de 7 mediante la adición de una base, tal como NaOH u otras bases, o ácido, cuando se necesita para mantener el medio de cultivo en un pH deseable. El índice de crecimiento puede determinarse al medir la densidad óptica utilizando un espectrofotómetro (600 nm) , y el índice de incorporación de glucosa al monitorear el agotamiento de fuente de carbono con el tiempo.

El medio de crecimiento puede incluir, por ejemplo, cualquier fuente de carbohidratos que puede suministrar una fuente de carbono al microorganismo que no se encuentra en la naturaleza. Tales fuentes incluyen, por ejemplo, azúcares tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, sacarosa, fructosa y almidón. Otras fuentes de carbohidratos incluyen, por ejemplo, materias primas renovables y biomasa. Tipos ejemplares de biomasa que pueden utilizarse como materia prima en los métodos de la invención incluyen biomasa celulósica, biomasa hemicelulósica y materias primas de lignina o porciones de materias primas. Tales materias primas de biomasa contienen, por ejemplo, sustratos de carbohidratos útiles como fuentes de carbono tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, y almidón. Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que las materias primas renovables y biomasa distintas a aquellas ejemplificadas en lo anterior también puede utilizarse para cultivar los organismos microbianos de la invención para la producción de etilenglicol .

Además de las materias primas renovables, tales como aquellas ejemplificadas en lo anterior, los organismos microbianos de etilenglicol de la invención también pueden modificarse para el crecimiento en el gas de síntesis como su fuente de carbono. En esta modalidad específica, una o más proteínas o enzimas se expresan en los organismos que producen etilenglicol para proporcionar una trayectoria metabólica para la utilización de syngas o de otra fuente de carbono gaseoso.

El gas de síntesis, también conocido como syngas o gas de gasógeno, es el principal producto de gasificación del carbón mineral y de materiales carbonáceos tales como materiales de biomasa, que incluyen cultivos agrícolas y residuos. Syngas es una mezcla principalmente de H2 y CO, y puede obtenerse a partir de gasificación de cualquier materia prima orgánica, incluyendo, pero no limitado a carbón mineral, aceite de carbón, gas natural, biomasa, y materia orgánica de desecho. La gasificación se lleva a cabo generalmente bajo una relación de alto combustible a oxígeno.

Aunque en gran parte H2 y CO, el syngas también puede incluir C02 y otros gases en cantidades más pequeñas. De este modo, la síntesis de gas proporciona una fuente de costo efectivo de carbón gaseoso tal como CO y, adicionalmente, C02.

La trayectoria de Wood-Ljungdahl cataliza la conversión de CO y H2 a acetil-CoA y otros productos tales como acetato. Los organismos capaces de utilizar CO y syngas también tienen generalmente la capacidad para utilizar C02 y mezclas de C02/H2 a través del mismo conjunto básico de enzimas y las transformaciones abarcadas por la trayectoria de Wood-Ljungdahl. La conversión dependiente de H2 de C02 a acetato por los microorganismos se reconoció mucho antes de que fuera revelado que CO también puede utilizarse por los mismos organismos, y que las mismas trayectorias estuvieron implicadas. Muchos acetógenos se han mostrado para cultivarse en presencia de C02 y producir compuestos tales como acetato, siempre y cuando el hidrógeno se encuentre presente para suministrar los equivalentes de reducción necesarios (véase, por ejemplo, Drake, Acetogenesis, pp . 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994) ) . Esto puede resumirse por la siguiente ecuación: 2 C02 + 4 H2 + n ADP n Pi ? CH3COOH + 2 H20 + n ATP Así pues, los microorganismos que no se encuentran en la naturaleza que poseen la trayectoria de Wood-Ljungdahl pueden utilizar mezclas de C02 y H2, así como también la producción de acetil-CoA y otros productos deseados.

La trayectoria de Wood-Ljungdahl es bien conocida en la técnica y consiste de 12 reacciones las cuales pueden separarse en dos ramificaciones: (1) ramificación de metilo y (2) ramificación de carbonilo. La ramificación de metilo convierte el syngas a metil-tetrahidrofolato (metil-THF) , mientras que la ramificación de carbonilo convierte el metil-THF a acetil-CoA. Las reacciones en la ramificación de metilo se catalizan para las siguientes enzimas o proteínas: férredoxina oxidoreductasa, formiato deshidrogenasa, formiltetrahidrofolato sintetasa, metileniltetrahidrofolato de ciclodehidratasa, metilentetrahidrofolato de deshidrogenasa y metilentetrahidrofolato de reductasa. Las reacciones en la ramificación de carbonilo se catalizan por las siguientes enzimas o proteínas: metiltetrahidrofolato : proteína corrinoide metiltransferasa (por ejemplo, AcsE) , proteína de hierro-sulfuro corrinoide, proteína de ensamble de proteína-níquel (por e emplo, AcsF) , férredoxina, acetil-CoA sintasa, monóxido de carbono deshidrogenasa y proteína de ensamblaje de proteína-níquel (por ejemplo, CooC) . Siguiendo las enseñanzas y guía proporcionadas en la presente para introducir un número suficiente de ácidos nucleicos de codificación para generar una trayectoria de etilenglicol , aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el mismo diseño de ingeniería también puede realizarse con respecto a introducir por lo menos los ácidos nucleicos que codifican los enzimas de Wood-L ungdahl o proteínas ausentes en el organismo huésped. Por lo tanto, la introducción de uno o más ácidos nucleicos de codificación en los organismos microbianos de la invención de tal manera que el organismo modificado contiene la trayectoria de Wood-Ljungdahl completa conferirá la capacidad de utilización del syngas .

Adicionalmente, el ciclo del ácido tricarboxílico reductivo (inverso) acoplado con la deshidrogenasa de monóxido de carbono y/o las actividades de deshidrogenasa pueden también utilizarse para la conversión de CO, C02 y/o H2 para acetil-CoA y otros productos tales como acetato. Los organismos capaces de fijar el carbono mediante la trayectoria de TCA reductiva pueden utilizar una o más de las siguientes enzimas: ATP citrato-liasa, citrato liasa, aconitasa, isocitrato deshidrogenasa, alfa-cetoglutarato : ferredoxina oxidoreductasa, succinil-CoA sintetasa, succinil CoA-transferasa, fumarato reductasa, fumarasa, malato deshidrogenasa, NAD(P)H: ferredoxina oxidoreductasa, monóxido de carbono deshidrogenasa, e hidrogenasa. Específicamente, los equivalentes de reducción extraídos a partir de CO y/o H2 por monóxido de carbono deshidrogenasa e hidrogenasa se utilizan para fijar C02 mediante el ciclo de TCA reductivo en acetil-CoA o acetato. El acetato puede convertirse a acetil-CoA por enzimas tales como acetil-CoA transferasa, acetato cinasa/fosfotransacetilasa y acetil-CoA sintetasa. La acetil-CoA puede convertirse en varios intermediarios metabólicos que incluyen serina, 3-fosfoglicerato, 2-fosfoglicerato, gliceraldehído y precursores de glioxilato por reacciones metabólicas centrales comunes, y gliceraldehído-3 -fosfato, fosfoenolpiruvato, y piruvato, por piruvato : ferredoxin oxidoreductasa y las enzimas de gluconeogenésis . Siguiendo las enseñanzas y guía proporcionadas en la presente para introducir un número suficiente de ácidos nucleicos de codificación para generar una trayectoria de serina, 3-fosfoglicerato, 2-fosfoglicerato, gliceraldehído y glioxilato, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el mismo diseño de ingeniería también puede realizarse con respecto a introducir por lo menos ácidos nucleicos que codifican las enzimas de trayectoria de TCA reductiva o proteínas ausentes en el organismo huésped. Por lo tanto, la introducción de uno o más ácidos nucleicos de codificación en el organismo microbiano de la invención de tal manera que el organismo modificado contienen la trayectoria de TCA reductiva completa conferirá capacidad de utilización de syngas .

Por consiguiente, dado las enseñanzas y guía proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza puede producirse y secrete los compuestos biosintetizados de la invención cuando crece en una fuente de carbono tal como un carbohidrato. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, etilenglicol y cualquiera de los metabolitos intermediarios en la trayectoria de etilenglicol. Todo lo que se requiere es diseñar en una o más de las enzimas requeridas o actividades de proteina para lograr la bios ntesis del compuesto deseado o intermediario incluyendo, por ejemplo, la inclusión de algunos o todas las trayectorias biosintéticas de etilenglicol. Por consiguiente, la invención proporciona un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza que produce y/o secreta etilenglicol cuando se cultiva en un carbohidrato u otra fuente de carbono y produce y/o secreta cualquiera de los metabolitos intermediarios mostrados en la trayectoria de etilenglicol cuando se cultiva en un carbohidrato u otra fuente de carbono. El etilenglicol que produce organismos microbianos de la invención puede iniciar la síntesis a partir de un intermediario, por ejemplo, hidroxipiruvato , etanolamina, glicolaldehído , glicerato, semialdehído de tartronato, glicolato, glicolilfosfato o glicolil-CoA.

Los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza de la invención se elaboran utilizando métodos bien conocidos en la técnica como se ejemplifica en la presente para expresar exógenamente por lo menos un ácido nucleico que codifica una enzima o proteína de trayectoria de etilenglicol en cantidades suficientes para producir etilenglicol . Se entiende que los organismos microbianos de la invención son cultivados bajo condiciones suficientes para producir etilenglicol. Siguiendo las enseñanzas y guía proporcionada en la presente, los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza de la invención pueden lograr biosíntesis de etilenglicol que resulta en la concentración intracelulares entre alrededor de 0.1-2000 mM o más. Generalmente, la concentración intracelular de etilenglicol se encuentra entre alrededor de 3-1500 mM, particularmente entre alrededor de 5-1250 mM, y más particularmente entre alrededor de 8-1000 mM, incluyendo alrededor de 10 mM, 100 mM, 200 mM, 500 mM, 800 mM, o más. Las concentraciones intracelulares entre y arriba de cada uno de estos márgenes ejemplares también se logran a partir de los organismos microbianos de la invención que no se encuentran en la naturaleza.

En algunas modalidades, las condiciones de cultivo incluyen crecimiento anaeróbico o sustancialmente anaeróbico o condiciones de mantenimiento. Las condiciones anaeróbicas ejemplares se han descrito previamente y son bien en la técnica. Las condiciones anaeróbicas ejemplares para el proceso de fermentación se describen en la presente y se describen, por ejemplo, en la Publicación estadounidense 2009/0047719, presentada el 10 de agosto 2007. Cualquiera de estas condiciones pueden emplearse con el organismo microbiano que no se encuentran en la naturaleza, así como también otras condiciones anaerobicas bien conocidas en la técnica. Bajo tales condiciones anaerobicas o sustancialmente anaerobicas, los productores de etilenglicol pueden sintetizar etilenglicol en concentraciones intracelulares de 5-10 mM o mayores, así como también otras concentraciones ejemplificadas en la presente. Se entiende que, incluso la descripción anterior se refiere a concentraciones intracelulares, el etilenglicol que produce los organismos microbianos puede producir etilenglicol intracelularmente y/o secretar el producto en el medio de cultivo.

Además de las condiciones de cultivo y fermentación descritas en la presente, la condición de crecimiento para lograr la biosíntesis del etilenglicol puede incluir la adición de un osmoprotector para las condiciones de cultivo. En ciertas modalidades, los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza de la invención pueden sustentarse, cultivarse o fermentarse como se describe en la presente en presencia de osmoprotectores . Brevemente, un osmoprotector se refiere a un componente que actúa como un osmolito y ayuda a un organismo microbiano como se describe en la presente a sobrevivir a la tensión osmótica. Los osmoprotectores incluyen, pero no se limitan a, betaínas, aminoácidos, y azúcar trehalosa. Ejemplos no limitantes de tales son glicina betaína, pralina betaína, dimetiltetina, dimetilsulfoniopropionato, 3-dimetilsulfonio-2-metilproprionato, ácido pipecólico, dimetilsulfonioacetato , colina, L-carnitina y ectoína. En un aspecto, el osmoprotector es glicina betaína. Se entiende por alguien con experiencia en la técnica que la cantidad y tipo de osmoprotector adecuado para proteger un organismo microbiano descrito en la presente de tensión osmótica dependerá del organismo microbiano utilizado. La cantidad de osmoprotector en las condiciones de cultivo puede ser, por ejemplo, no más de alrededor de 0.1 mM, no más de alrededor de 0.5 mM, no más de alrededor de 1.0 mM, no más de alrededor de 1.5 mM, no más de alrededor de 2.0 mM, no más de alrededor de 2.5 mM, no más de alrededor de 3.0 mM, no más de alrededor de 5.0 mM, no más de alrededor de 7.0 mM, no más de alrededor de 10 mM, no más de alrededor de 50 mM, no más de alrededor de 100 mM o no más de alrededor de 500 mM.

Las condiciones de cultivo pueden incluir, por ejemplo, procedimientos de cultivo líquido, así como también fermentación u otros procedimientos de cultivo a gran escala. Como se describe en la presente, los campos particularmente útiles de los productos biosintéticos de la invención pueden obtenerse bajo condiciones de cultivo anaeróbicas o sustancialmente anaerobicas.

Como se describe en la presente, una condición de crecimiento ejemplar para lograr la biosíntesis de etilenglicol incluye cultivo anaeróbico o condiciones de fermentación. En ciertas modalidades, los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza de la invención pueden sustentarse, cultivarse o fermentarse bajo condiciones anaerobicas o sustancialmente anaerobicas. Brevemente, las condiciones anaerobicas se refieren a un medio ambiente desprovisto de oxígeno. Las condiciones sustancialmente anaerobicas incluyen, por ejemplo, un cultivo, fermentación de lote o fermentación continua de tal manera que la concentración de oxígeno disuelto en el medio permanece entre 0 y 10% de saturación. Las condiciones sustancialmente anaerobicas también incluyen células de crecimiento o reposo en el medio líquido o en agar sólido dentro de una cámara sellada mantenida con una atmósfera de menos de 1% de oxígeno. El porcentaje de oxígeno puede mantenerse por, por ejemplo, al rociar el cultivo con una mezcla de N2/C02 u otro gas o gases sin oxígeno adecuados.

Las condiciones de cultivo descritas en la presente pueden ampliarse y crecer en forma continua para la elaboración de etilenglicol. El procedimiento de crecimiento ejemplar incluye, por ejemplo, fermentación de lote de alimentación y separación por lote; fermentación por lote de alimentación y separación continua o fermentación continua y separación continua. Todos estos procesos son bien conocidos en la técnica. Los procedimientos de fermentación son útiles particularmente para la producción biosintética de cantidades comerciales de etilenglicol . Generalmente, y como con los procedimientos de cultivo no continuos, la producción continua y/o casi continua de etilenglicol incluirá cultivar un etilenglicol que no se encuentra en la naturaleza que produce el organismo de la invención con nutrientes suficientes y medio para crecimiento sostenido y/o casi sostenido en una fase exponencial. El cultivo continuo bajo tales condiciones puede incluir, por ejemplo, el crecimiento por 1 día, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días o más. Adicionalmente, el cultivo continuo puede incluir períodos prolongados de 1 semana, 2, 3, 4 ó 5 o más semanas y hasta varios meses. Alternativamente, los organismos de la invención pueden cultivarse durante horas, si es adecuado para una aplicación particular. Se entenderá que las condiciones de cultivo continuas y/o casi continuas también pueden incluir todos los intervalos de tiempo entre estos períodos ejemplares. Se entiende además que el tiempo de cultivo de los organismos microbianos de la invención es durante un período suficiente de tiempo para producir una cantidad suficiente de producto para un propósito deseado.

Los procedimientos de fermentación son bien conocidos en la técnica. Brevemente, la fermentación para la producción biosintética de etilenglicol puede utilizarse en, por ejemplo, fermentación de lote alimentado y separación por lote; la fermentación por lote alimentado y la separación continua, o la fermentación continua y separación continúa. Ejemplos de procedimientos de fermentación por lote y continuos son bien conocidos en la técnica.

Además de los procedimientos de fermentación anteriores utilizando los productores de etilenglicol de la invención para la producción continua de cantidades sustanciales de etilenglicol, los productores de etilenglicol también pueden, por ejemplo, sometidos simultáneamente a procedimientos de síntesis química para convertir el producto a otros compuestos u el producto pueden separarse del cultivo de fermentación y secuencialmente someter a conversión química o enzimática para convertir el producto a otro compuesto, si se desea.

Para generar mejores productores, el modelado metabólico puede utilizarse para optimizar las condiciones de crecimiento. El modelado puede también utilizarse para diseñar los genes inactivos que adicionalmente optimizan la utilización de la trayectoria (véase, por ejemplo, las publicaciones de patentes estadounidense US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 y US 2004/0009466 y la Patente Estadounidense No. 7,127,379). El análisis de modelado permite la predicción confiable de los efectos en el crecimiento celular de cambiar el metabolismo hacia una producción más eficiente de etilenglicol .

Un método computacional para identificar y diseñar alteraciones metabólicas que favorecen la biosíntesis de un producto deseado es la infraestructura computacional OptKnock (Burgard et al. Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)). El OptKnock es un modelado metabólico y programas de simulación que sugiere estrategias de supresión o interrupción de genes que resulta en un microorganismo genéticamente estable que sobreproduce el producto objetivo. Específicamente, la estructura examina la red metabólica y/o bioquímica completa de un microorganismo para sugerir manipulación genética que fuerce el bioquímico deseado para volverse un subproducto obligatorio de crecimiento celular. Mediante el acoplamiento de producción bioquímica con el crecimiento celular a través de supresiones genéticas estratégicamente colocadas u otras interrupciones genéticas funcionales, las presiones de selección de crecimiento impuestas en las cepas de ingeniería después de largos períodos de tiempo en un bioreactor conducen a las mejoras en el rendimiento como un resultado de la producción bioquímica acoplada de crecimiento obligatorio. Finalmente, cuando las supresiones genéticas se construyen existe una posibilidad insignificante de que las cepas diseñadas reviertan a sus estados de tipo silvestre debido a los genes seleccionados por OptKnock se removerán completamente del genoma. Por lo tanto, esta metodología computacional puede utilizarse ya sea para identificar trayectorias alternativas que conducen a la biosíntesis de un producto deseado o utilizarse en junto con los organismos microbianos que no se encuentran en la naturaleza para optimización adicional de biosíntesis de un producto deseado.

Brevemente, el OptKnock es un término utilizado en la presente para determinar a un método y sistema computacional para modelar el metabolismo celular. El programa OptKnock se relaciona a una infraestructura de modelos y métodos que incorporan restricciones particulares en los modelos de análisis de balance de flujo (FBA) . Estas restricciones incluyen, por ejemplo, la información cinética cualitativa, la información reguladora cualitativa, y/o los datos experimentales de microdisposición de ADN. OptKnock también calcula las soluciones en diversos problemas metabólicos, por ejemplo, ajustar los límites de flujo derivados a través del modelo de balance de flujo y subsecuentemente el rendimiento límite de las redes metabólicas en la presencia de adiciones o supresiones genéticas. La infraestructura computacional OptKnock permite la construcción de formulaciones de modelo que permiten una consulta efectiva de los limites de rendimiento de las redes metabólicas y proporciona métodos para resolver los problemas de programación lineales de enteros mezclados resultantes. Los métodos del modelo metabolico y simulación se refieren en la presente como OptKnock se describen como, por ejemplo, la Publicación estadounidense 2002/0168654, presentada el 10 de enero de 2002, en la Patente Internacional No. PCT/US02/00660, presentada el 10 de enero de 2002, y la publicación estadounidense 2009/0047719, presentada el 10 de agosto de 2007.

Otro método computacional para identificar y diseñar las alteraciones metabólicas que favorecen la producción biosintética de un producto es un sistema de modelado metabolico y de simulación denominado SimPheny®. Este método computacional y sistema se describe en, por ejemplo, la Publicación estadounidense 2003/0233218, presentada el 14 de junio de 2002, y la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US03/18838 , presentada el 13 de junio de 2003. El SimPheny® es un sistema computacional que puede utilizarse para producir un modelo de red in silico y para simular el flujo de masa, energía o carga a través de las reacciones químicas de un sistema biológico para definir un espacio de solución que contiene cualquiera y todas las funcionalidades posibles de la reacción química en el sistema, determinando por consiguiente un margen de actividades permitidas por el sistema biológico. Este procedimiento se refiere como un modelado basado en restricciones debido a que el espacio de solución se define por las restricciones tales como la estequiometría conocida de las reacciones incluidas asi como también la reacción termodinámica y capacidad de restricciones asociada con el flujo máximo a través de la reacción. El espacio definido por estas restricciones puede cuestionarse para determinar las capacidades fenotípicas y comportamiento del sistema biológico, o de sus componentes bioquímicos.

Estos procedimientos computacionales son consistentes con las realidades biológicas ya que los sistemas biológicos son flexibles y pueden alcanzar el mismo resultado en muchas maneras diferentes. Los sistemas biológicos se diseñan a través de mecanismos evolutivos que se han restringido por restricciones fundamentales que todos los sistemas vivos deben enfrentar. Por lo tanto, la estrategia de modelado basada en restricciones abarca estas realidades generales. Además, la capacidad para imponer continuamente restricciones adicionales sobre un modelo de red mediante la hermeticidad de restricciones resulta en una reducción en el tamaño del espacio de solución, mejorando así la precisión con la que el rendimiento fisiológico o fenotipo puede predecirse.

Dadas las enseñanzas y guía proporcionada en la presente, aquellos con experiencia en la técnica serán capaces de aplicar diversas infraestructuras computacionales para modelado metabólico y simulación para diseñar e implementar la bios ntesis de un compuesto deseado en organismos microbianos huéspedes. Tal modelado metabólico y métodos de simulación incluyen, por ejemplo, sistemas computacionales ejemplificados en lo anterior como SimPheny® y OptKnock. Para ilustración de la invención, algunos métodos se describen en la presente con referencia oa la inf aestructura computacional OptKnock para modelado y simulación. Aquellos con experiencia en la técnica sabrán cómo aplicar la identificación, diseño e implementación de las alteraciones metabólicas utilizando OptKnock a cualquier otro modelado metabólico e infraestructuras computacionales de simulación y métodos bien conocidos en la técnica.

Los métodos descritos en lo anterior proporcionarán un conjunto de reacciones metabólicas para la interrupción. La eliminación de cada reacción dentro del conjunto o modificación metabolica puede resultar en un producto deseado como un producto obligatorio durante la fase de crecimiento del organismo. Debido a que las reacciones se conocen, una solución para problema de OptKnock de dos niveles también proporcionará el gen o genes asociados que codifican una o más enzimas que catalizan cada reacción dentro del conjunto de reacciones. La identificación de un conjunto de reacciones y sus genes correspondientes que codifican las enzimas que participan en cada reacción es generalmente un proceso automatizado, logrado a través de la correlación de las reacciones con una base de datos de reacción que tiene una relación entre las enzimas y los genes codificados.

Una vez identificado, el conjunto de reacciones que se interrumpirán para lograr la producción de un producto deseado se implementan en la célula u organismo objetivo mediante la interrupción funcional de por lo menos un gen que codifica cada reacción metabólica dentro del conjunto. Un medio particularmente útil para lograr la interrupción funcional del conjunto de reacción es la supresión de cada gen codificado. Sin embargo, en algunos casos, puede ser benéfico interrumpir la reacción por otras aberraciones genéticas que incluyen, por ejemplo, mutación, supresión de regiones regulatorias tales como promotores o sitios de enlace cis para factores de regulación, o por truncamiento de la secuencia de codificación en cualquiera de un número de ubicaciones. Estas últimas aberraciones, que resultan en por lo menos una supresión total del conjunto de gen puede ser útil, por ejemplo, cuando las evaluaciones rápidas del acoplamiento de un producto se desean o cuando es menos probable que se presente la reversión genética.

Para identificar las soluciones productivas adicionales para el problema OptKnock de dos niveles descrito en lo anterior lo cual conduce a conjuntos adicionales de reacciones para interrupción o modificaciones metabolicas que pueden resultar en la biosíntesis, incluyendo la biosíntesis de acoplamiento de crecimiento de un producto deseado, un método de optimización, denominado cortes completos, puede implementarse. Este método procede a resolver iterativamente el problema OptKnock e emplificado en lo anterior con la incorporación de una restricción adicional denominada como un corte entero en cada iteración. Las restricciones de corte entero impiden efectivamente el procedimiento de solución al elegir el mismo conjunto exacto de reacciones identificadas en cualquier iteración previa que acopla obligatoriamente la biosíntesis del producto para el crecimiento. Por ejemplo, si una modificación metabólica acoplada de crecimiento previamente identificada específica las reacciones 1, 2, y 3 para interrupción, entonces las siguientes restricciones impiden que las mismas reacciones se consideren simultáneamente en soluciones posteriores. El método de corte entero se conoce bien en la técnica y puede encontrarse descrito en, por ejemplo, Burgard et al, Biotechnol . Prog. 17:791-797 (2001). Como en todos los métodos descritos en la presente con referencia a su uso en combinación con la infraestructura computacional OptKnock para el moldeado metabólico y simulación, el método de corte entero de reducción de la redundancia en el análisis computacional iterativo también puede aplicarse con otras infraestructuras computacionales bien conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, SimPheny®.

Los métodos ejemplificados en la presente permiten la construcción de células y organismos que producen biosintéticamente un producto deseado, que incluyen . el acoplamiento obligatorio de producción del producto bioquímico objetivo para el crecimiento de la célula u organismo diseñado para alojar las alteraciones genéticas identificadas. Por lo tanto, los métodos computacionales descritos en la presente permiten la identificación e implementación de modificaciones metabólicas que se identifican por un método in silico seleccionado a partir de OptKnock o SimPheny®. El conjunto de modificaciones metabólicas pueden incluir, por ejemplo, la adición de una o más enzimas de trayectoria biosintética y/o interrupción funcional de una o más reacciones metabólicas que incluyen, por ejemplo, la interrupción por supresión genética.

Como se discute en lo anterior, la metodología OptKnock se desarrolló en la premisa de que las redes microbianas mutantes pueden evolucionar hacia sus fenotipos de crecimiento máximo computacionalmente predichos cuando se someten a largos períodos de selección de crecimiento. En otras palabras, el procedimiento aprovecha una capacidad del organismo para, auto-optimizarse bajo presiones selectivas. La infraestructura OptKnock permite la enumeración exhaustiva de combinaciones de supresión genética que fuerzan un acoplamiento entre la producción bioquímica y el crecimiento celular en base a la estequiometría de red. La identificación de desactivaciones genéticas/reacciones óptimas requiere la solución del problema de optimización de dos niveles que elige al conjunto de reacciones activas de tal manera que una solución de crecimiento óptima para la red resultante sobreproduce la bioquímica de interés (Burgard et al, Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)).

Un modelo estequiométrico in silico del metabolismo de E. coli puede emplearse para identificar los genes esenciales para las trayectorias metabólicas como se ejemplifica anteriormente y se describe en, por ejemplo, las publicaciones de patente estadounidense US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US2004/0072723 , US 2003/0059792, US 2002/0168654 y US 2004/0009466, y en la Patente Estadounidense No. 7,127,379. Como se describe en la presente, la infraestructura matemática OptKnock puede aplicarse para identificar las supresiones genéticas que conducen a la producción acoplada de crecimiento de un producto deseado. Además, la solución del problema OptKnock de dos niveles proporciona solamente un conjunto de supresiones. Para enumerar todas las soluciones significativas, es decir, todos los conjuntos de desactivación que conducen a la formación de producción de acoplamiento de crecimiento, una técnica de optimización, cortes completos denominados, pueden implementarse . Esto implica resolver iterativamente el problema OptKnock con la incorporación de una restricción adicional denominada como un corte entero en cada iteración, como se discute en lo anterior .

Como se describe en la presente, un cido nucleico que codifica una actividad deseada de una trayectoria de etilenglicol introducirse en un organismo huésped. En algunos casos, puede desearse modificar una actividad de una enzima o proteína de trayectoria de etilenglicol para incrementar la producción de etilenglicol. Por ejemplo, las mutaciones conocidas que incrementan la actividad de una proteína o enzima pueden introducirse en una molécula de ácido nucleico de codificación. Adicionalmente, los métodos de optimización pueden implementarse para incrementar la actividad de una enzima o proteína y/o disminuir una actividad inhibidora, por ejemplo, disminuir la actividad de un regulador negativo.

Un método de optimización es la evolución dirigida. La evolución dirigida es un procedimiento poderoso que involucra la introducción de mutaciones dirigidas a un gen específico para mejorar y/o alterar las propiedades de una enzima. Las enzimas mejoradas y/o alteradas pueden identificarse a través del desarrollo e implementación de ensayos de cribado de alto rendimiento sensibles que permiten la selección automatizada de muchas variantes de enzima (por ejemplo, >104) . Los ciclos iterativos de mutagénesis y selección típicamente se realizan para producir una enzima con propiedades optimizadas. Los algoritmos computacionales que pueden ayudar a identificar las áreas del gen para mutagénesis también se han desarrollado y puede reducir significativamente el número de variantes de enzima que necesitan generarse y seleccionarse. Numerosas tecnologías de evolución dirigida se han desarrollado (para revisiones, véase Hibbert et al, Biomol.Eng 22:11-19 (2005); Huisman and Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs . 717-742 (2007), Patel (ed. ) , CRC Press; Otten and Quax Biomol.Eng 22:1-9 (2005) y Sen et al, Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223 (2007)) para ser efectivas en crear diversas genotecas variantes, y estos métodos se han aplicado exitosamente a la mejora de un amplio margen de propiedades a través de diversas clases de enzimas. Las características de enzima que se han mejorado y/o alterado por las tecnologías de evolución dirigida incluyen, por ejemplo: selectividad/especificidad, para la conversión de sustratos no naturales, estabilidad de temperatura, para el procesamiento robusto de alta temperatura, estabilidad de pH, para bioprocesamiento bajo condiciones de pH altas o bajas; tolerancia del sustrato o producto, de manera que los títulos de alta producción pueden lograrse; enlace (Km) , que incluye el enlace de sustrato de ampliación para incluir sustratos no naturales; inhibición (Ki) , para remover la inhibición por productos, sustratos, o intermediarios clave; actividad (kcat) , para incrementar el índice de reacción enzimática para lograr el flujo deseado; niveles de expresión, para incrementar la producción de proteína y flujo de trayectoria general; estabilidad de oxígeno, para operación de las enzimas sensibles al aire bajo condiciones aeróbicas; y actividad anaeróbica, para operación de una enzima aeróbica en ausencia de oxígeno.

Un número de métodos ejemplares se han desarrollado para la mutagénesis y diversificación de genes para propiedades deseadas objetivo de enzimas específicas. Tales métodos son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Cualquiera de estas puede utilizarse para alterar y/o optimizar la actividad de una enzima o proteína de trayectoria de etilenglicol . Tales métodos incluyen, pero no se limitan a EpPCR, que introduce mutaciones de punto aleatorio al reducir la fidelidad de la polimerasa de ADN en reacciones de PCR (Pritchard et al., J" Theor. Biol 234:497-509 (2005)) ; Amplificación por Círculo Rodante Propenso a Errores (epRCA) , que es similar a PCR excepto que se utiliza un plásmido circular completo como la plantilla y exámeros aleatorios con ligaduras de tiofosfato resistentes a exonucleasa en los últimos dos nucleótidos se utilizan para amplificar el plásmido seguido por la transformación en células en las cuales el plásmido pueda circular en repeticiones en tándem (Pujii et al., Nucleic Acids Res. 32 :el45 (2004) ; y Fujii et al., Nat. Protoc. 1:2493-2497 (2006)); DNA o Barajado de Familia, el cual típicamente implica la digestión de dos o más genes variantes con nucleasa tal como Dnasa I o Endo V para generar un grupo de fragmentos aleatorios que se reagrupan por ciclos de recocido y extensión en la presencia de polimerasa de ADN para crear una genoteca de genes quiméricos (Stemmer, Proct Nati Acad Sci USA 91:10747-10751 (1994); y Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)); Extensión escalonada (StEP) , que implica la imprimación templada seguida por ciclos repetidos de 2 pasos de PCR con desnaturalización y duración muy corta de recocido/extensión (tan corta como 5 segundos) (Xhao et al., Nat. Biotechnol. 16:258-261 (1998)); La Recombinación de Imprimación Aleatoria (RPR) , en la cual los imprimadores de secuencia aleatoria se utilizan para generar fragmentos de ADN muy cortos complementariamente para segmentos diferentes del templado (Shao et al., Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998) ) .

Métodos adicionales incluyen Recombinación de Heteroduplex, en la cual el ADN de plásmido linearizado se utiliza para formar heteroduplex que se reparan por al reparar el desajuste (Volkov et al, Nucleic Acids Res. 27:el8 (1999) ; y Volkov et al., Methods Enzymol . 328:456-463 (2000) ); Quimera génesis Aleatorias en Moldes Transitorios (RACHITT) , que emplea fragmentación de Adnsa I y fragmentaciones de tamaño de ADN de hebra sencilla (ssDNA) (Coco et al. Nat. Biotechnol. 19:354-359 (2001)); Extensión Recombinada en moldes Truncados (RETT) , que implican aquellos que cambian de hebras unidireccionalmente crecientes de los imprimadores en la presencia de fragmentos de ssDNA unidireccional utilizados como un depósito de plantillas (Lee et al., J. Molec. Catalysis 26:119-129 (2003)); ?? 3a, Genético de Oligonucleótido Degenerado (DOGS) , en el cual los cebadores degenerados se utilizan para controlar la recombinación entre las moléculas; (Bergquist and Gibbs, Methods Mol Biol 352:191-204 (2007); Bergquist et al., Biomol. Eng 22:63-72 (2005); Gibbs et al., Gene 271:13-20 (2001)); Truncamiento en Aumento para la Creación de Enzimas Híbridas (ITCHY) , lo cual crea una genoteca combinatoria con las supresiones de 1 par base de un gen o fragmento de gen de interés (Ostermeier et Truncamial . , Proc. Nati. Acas . Sci . USA 96:3562-3567 (1999); y Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17:205-1209 (1999)); Thio-Truncamiento para la Creación de Enzimas Híbridas (THIO-ITCHY) , que es similar a ITCHY excepto que se utilizó dNTP fosfotioato para generar truncamientos (Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)); SCRATCHY, que combina dos métodos para genes recombinantes , ITCHY y barajado de ADN (Lutz et al., Proc. Ntl . Acad. Sci . USA 98:11248-11253 (2001)); Mutagénesis con Tendencia Aleatoria ( NDM) , en la cual las mutaciones hechas mediante epPCR son seguidas por cribado/selección de aquellos que retienen la actividad utilizable (Berquist et al., Biomol . Eng. 22:63-72 (2005)); Mutagénesis de Saturación de Secuencia (SeSaM) , un método de mutagénesis aleatorio que genera un grupo de fragmentos de longitud aleatorio utilizando la incorporación aleatoria de un nucleótido fosfotioato y de división, el cual se utiliza como una plantilla para extender la presencia de las bases "universales" tales como inosina, y replica de un complemento que contiene inosina da la incorporación de base aleatoria y, consecuentemente, mutagénesis ( ong et al., Biotechnol . J. 3:74-82 (2008); Wong et al., Nucleic Acids Res. 32:e26 (2004); y Wong et al., Anal. Biochem. 341:187-189 (2005)); Synthetic Shuffling, el cual utiliza nucleótidos traslapantes designados para codificar "todas la diversidad genética en los objetivos" y permite una diversidad muy alta para la progenie barajada (Ness et al., Nat Biotechnol. 20:1255 (2002)); Nucleotide Exchange and Excisión Technology NexT, que aprovechan una combinación de incorporación dUTP seguida por el tratamiento con uracilo de ADN glicosilasa y después piperidina para realizar la fragmentación de ADN de punto final (Muller et al., Nucleic Acids Res. 33:ell7 (2005)).

Los métodos adicionales incluyen la Recombinación de Proteína Independiente de Homología de Secuencia (SHIPREC) , en la cual un enlazador se utiliza para facilitar la función entre dos genes distantemente relacionados o no relacionados, y un margen de quimeras se genera entre dos genes que resulta en la genoteca de híbridos de cruce simple (Sieber et al., Nat Biotechnol. 19:456-460 (2001)); Gene Site Saturation Mutagenesis™ (GSSM™) , en la cual los materiales de partida incluyen un plásmido de ADN de doble hebra superenroliado (dsDNA) que contiene un inserto y dos cebadores que se generan en el sitio deseado de mutaciones (Kretz et al., Methods Enzymol . 388:3-11(2004)); Mutagenesis de Cásete Combinatorial (CCM) el cual implica el uso de casetes de oligonucléotidos cortos para remplazar las regiones limitadas con un gran número de alteraciones de secuencia de aminoácido posibles (Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564-586 (1991); y Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988)); Mutagénesis de Cásete Múltiple Combinatorial (CMCM) , la cual es esencialmente similar a CCM y utiliza epPCR en alto índice de mutación para identificar puntos de actividad y regiones de actividad y después la extensión por CMCM para cubrir una reacción definida de espacio de secuencia de proteínas (Reetz et al., Angew. Chem Int. Ed Engl. 40:3589-3591 (2001)); la técnica de Cepa de Mutadoras, en la cual plásmidos mutadores de tarjeta sencilla condicionales, que utilizan el gen mutD56 el cual codifica una subunidad mutante de ADN polimerasa III, permite incrementos de 20 a 4000-x en frecuencia de mutación aleatoria y natural durante la selección y acumulación por bloque de mutaciones nocivas cuando la selección no se requiere (Selifonova et al., Appl . Environ. Microbiol. 67 : 3 645 -3 649 ( 2001 ) ) ; Low et al., J. Mol. Biol . 260 : 359 - 3680 ( 1996 ) ) .

Métodos ejemplares adicionales incluyen la mutagénesis de revisión (LTM) , la cual es un método de mutagénesis muítidimensional que valora y optimiza la mutación combinatorial de aminoácidos seleccionados (Rajpal et al, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 102 : 8466 - 8471 ( 2005 ) ) ; Reensamble Genético, el cual es un método de barajado de ADN, que puede aplicarse a genes múltiples en un tiempo o crear una gran genoteca de quimeras (mutaciones múltiples) de un gen simple (Tunable GeneReassembly™ (TGR™) Tecnología proporcionada por Verenium Corporation) , Automatización de Diseño de Proteína in Silico (PDA) , la cual es un algoritmo de optimización que ancla la estructura principal de la proteína estructuralmente definida que posee un doblez particular, y busca el espacio de secuencia para sustituciones de aminoácido que puede estabilizar el doblez y la proteína energética general, y generalmente funciona más efectivamente en proteínas con estructuras tridimensionales conocidas (Hayes et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99: 15926-15931 (2002)); y la Mutagénesis de Saturación Interactiva (IS ) , que implica utilizar el conocimiento estructural /función para elegir un sitio probable para mejorar la enzima, realizando mutagénesis de saturación en el sitio de elección utilizando un método de mutagénesis tal como Stratagene QuikChange (Stratagene; San Diego CA) , cribado/selección para propiedades deseadas, y, utilizando clon o clones mejorados, iniciando sobre el otro sitio y continuar repitiendo hasta que se logre una actividad deseada (Reetz et al, Nat . Protoc . 2:891-903 (2007); and Reetz et al, Angew. Chem. Int. Ed Engl . 45:7745-7751 (2006)). Cualquiera de los métodos antes mencionados para mutagénesis puede utilizarse solo o en cualquier combinación. Adicionalmente, cualquiera o la combinación de los métodos de evaluación dirigidos pueden utilizarse junto con la técnica de evolución adaptativa, como se describe en la presente.

Se entenderá que las modificaciones que no afecten sustancialmente la actividad de las diversas modalidades de esta invención también se proporcionan dentro de la definición de la invención proporcionada en la presente. Por consiguiente, los siguientes ejemplos se pretenden para ilustrar pero no limitan la presente invención.

EJEMPLO I Trayectoria para producir etilenglicol a partir de serina Numerosas trayectorias se muestran en la Figura 1 para la síntesis de MEG a partir de serina. En una modalidad la serina se convierte a hidroxipiruvato por una serina-hidroxipiruvato aminotransferasa o una serina oxidoreductasa (desaminante) (Figura 1, Etapas 1 ó 2). El hidroxipiruvato se descarboxila subsecuentemente a glicolaldehído por hidroxipiruvato descarboxilasa (Figura 1, Etapa3 ) . Finalmente, el glicolaldehxdo se reduce a MEG por un aldehido reductasa (Figura 1, Etapa 4) . En una ruta alternativa, el intermediario hidroxipiruvato se reduce a glicerato por la hidroxipiruvato reductasa, y etilenglicol de producción subsecuentemente descarboxilada (Figura 1, Etapas 8 y 9). En aún otra trayectoria, la serina es primero decarboxilada a etanolamina (Figura 1, Etapa 5) . Este compuesto se convierte subsecuentemente a glicolaldehído por una serina aminotransferasa u oxidoreductasa (desaminante) (Figura 1, Etapas 6 ó 7) . Candidatos de enzima ejemplares para las enzimas de trayectoria de serina (Etapas 1-9 de la Figura 1) se describen en lo siguiente.

La conversión de la serina a hidroxipiruvato (Figura 1, Etapa 1) se cataliza por un enzima con actividad serina aminotransferasa . Las enzimas ejemplares incluyen serina rpiruvato aminotransferasa (EC 2.6.1.510), alanina rglioxilato aminotransferasa (EC 2.6.1.44) y serina : glioxilato aminotransferasa (EC 2.6.1.45) . La serina :piruvato aminotransferasa participa en el metabolismo de serina y destoxificación de glioxilato en mamíferos. Estas enzimas han mostrado utilizar una variedad de donadores oxo alternos tales como piruvato, fenilpiruvato y glioxilato; y los aceptores amino que incluyen alanina, glicina y fenilalanina (Ichiyama et al., Mol. Urol . 4:333-340 (2000)) . La mitocondria de rata serina: piruvato aminotransferasa, codificada por agxt, también se activa como una alanina-glioxylato aminotransferasa . Esta enzima se expresó heterólogamente en E. coli (Oda et al, J Biochem. 106:460-467 (1989)) . Enzimas similares se han caracterizado en humanos y moscas (Oda et al, Biochem. Biophys .Res .Commun. 228:341-346 (1996)) . La enzima humana, codificada por agxt, funciona como una serina : piruvato aminotransferasa, una alanina : glioxilato aminotransferasa y una serina : glioxilato aminotransferasa (Nagata et al., Biomed.Res. 30:295-301 (2009)) . La enzima de mosca se codifica por spat (Han et al, FEBS Lett. 527: 199-204 (2002)) . Una alanina : glioxilato aminotransferase ejemplar se codifica por AGTl de Arabidopsis thaliana . Además de la actividad de alanina : glioxilato, la AGTl recombinante purificada expresada en E. coli también cataliza actividades de serina : glioxilato y serina ¡piruvato aminotransferasa (Liepman et al., Plant J 25:487-498 (2001)) . En varios organismos las enzimas serina : glioxilato aminotransferasa (EC 2.6.1.45) también exhibe actividad serina :piruvato aminotransferasa reducida pero aceptable. Las enzimas ejemplares se encuentran en Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Sécale cereal y Spinacia olerácea. Las enzimas de serina : glioxilato aminotransferasa convierte a serina e hidroxypiruvato y utiliza glioxilato como un aceptor amino. La serina : glioxilato aminotransferasa de metilotrofo obligado Hyphomicrobium methylovorum GM2 se ha expresado funcionalmente en E. coli y caracterizado (Hagishita et al, Eur. J Biochem. 241:1-5 (1996) ) .

La conversión de serina a hidroxipiruvato (Figura 1, Etapa 1) se cataliza alternativamente por serina oxidoreductasa (desaminante) . Una enzima con esta funcionalidad de la serina oxidasa, la cual utiliza oxígeno como un aceptor de electrones, que convierte la serina, O2 y gua a amoniaco, peróxido de hidrógeno e hidroxipiruvato (Chumakov, et al, Proc. Nat. Acad. Sci . , 99 (21) : 13675-13680; Verral et al, Eur J Neurosci . , 26(6) 1657-1669 (2007) ) . Algunas amino oxidasas son específicas para el D-aminoácido (Dixon and Kleppe, Biochim Biophys Acta, 96: 368-382 (1965) ) y la L-serina puede convertirse a D-serina por racemato de serina (Miranda, et al., Gene, 256: 183-188 (2000) ) . Las enzimas en la EC clase 1.4.1 cataliza la desaminación oxidativa de alfa-aminoácidos con NAD+, NADP+ o FAD como aceptor, y las reacciones son típicamente reversibles. Las enzimas ejemplares con actividad serina oxidoreductasa (desaminante) que incluye serina deshidroxigenasa (EC 1.4.1.7) , L-aminoácido deshidrogenasa (EC 1.4.1.5) y glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2) . Una enzima con actividad serina deshidrogenasa de Petroselinum crispum se purificó y se caracterizó a través de del gen asociado con la enzima no se ha identificado hasta la fecha (Kretovich et al, Izv. Akad.Nauk SSSR Ser.Biol. 2:295-301 (1966) ) . La actividad serina deshidrogenasa atribuida a L-aminoácido deshidrogenasa se identificó en el aislamiento de la bacteria del suelo, pero los genes específicos no fueron identificados (Mohammadi et al., Irán Biomed.J 11: 131-135 (2007) ) . La glutamato deshidrogenasa de Vigna unguiculata acepta la serina como un sustrato alternativo. El gene asociado con esta enzima no se ha identificado hasta fecha. Otras enzimas de glutamato deshidrogenasa se codifican por gdhA en Escherichia coli (Korber et al, J Mol.Biol. 234:1270-1273 (1993) ; McPherson et al, Nucleic Acids Res. 11:5257-5266 (1983) ) , gdh de Thermotoga mari time (Kort et al, Extremophiles . 1:52-60 (1997) ; Lebbink et al, J Mol.Biol. 280:287-296 (1998) ; Lebbink et al, J Mol.Biol. 289:357-369 (1999) ) , y gdhAl de Halobacterium salinarum (Ingoldsby et al , Gene 349:237-244 (2005) ) .

La descarboxilación de hidroxipiruvato a glicolaldehído (Figura 1, Etapa 3 y Figura 2, Etapa 3) se cataliza por el hidroxipiruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.40) , una enzima encontrada en muchos mamíferos (Hendrick et al., Arch.Biochem.Biophys . 105:261-269 (1964) ) . La actividad enzimática se ha estudiado en el contexto de metabolismo de hidroxipiruvato a oxalato en la mitocondria de rata, aunque la actividad no se asocia con un gen hasta la fecha (Rofe et al., Bxochem. Med.Metab Biol . 36:141-150 (1986) ) . Otras ceto-ácido descarboxilasas incluyen piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1) , benzoilformiato descarboxilasa (EC 4.1.1.7) , alfa-cetoglutarato descarboxilasa y alfa cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada. Diversas enzimas ceto-ácido descarboxilasa se han mostrado para aceptar el hidroxipiruvato como un sustrato alterno, incluyendo el producto de gen kivd de Lactococcus lactis (de la Plaza et al, FEMS Microbiol Lett. 238:367-374 (2004) ) y el producto de gen pdcl de Saccharomyces cerevisiae (Cusa et al., J Bacteriol. 181:7479-7484 (1999)). La enzima S. cerevisiae se ha estudiado extensamente, diseñada genéticamente para actividad alterada, y expresada funcionalmente en E. coli (Killenberg-Jabs et al, EurJ.Biochem. 268:1698-1704 (2001); Li et al, Biochemistry. 38:10004-10012 (1999); ter Schure et al, Appl .Environ.Microbiol . 64:1303-1307 (1998)). El PDC de Zymomonas mobilus, codificado por pdc, también tiene un margen de sustrato amplio y ha sido un objetivo de estudios de ingeniería dirigidos para alterar la afinidad para diferentes sustratos (Siegert et al, Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). Un candidato adicional es el producto gen kdcA de Lactococcus lactis, que descarboxila una variedad de sustratos cetoácido lineales y ramificados incluyendo 2-oxobutanoato , 2-oxohexanoato, 2-oxopentanoato, 3-metil-2-oxobutanoato , 4-metil-2-oxobutanoato y isocaproato (Smit et al, Appl Environ Microbiol 71:303-311 (2005)).

La reducción de glicolaldehído a etilengl'icol (todas las Figuras) se catalizó por glicolaldehído reductasa. La 1,2-PDO oxidoreductasa activada con hierro (EC 1.1.1.77) E. coli codificada por fucO cataliza eficientemente la reducción de glicolaldehído (Obradors et al, Eur. J Biochem. 258:207-213 (1998); Boronat et al, J Bacteriol. 153:134-139 ( 1983 ) ) . Otros candidatos de enzima aldehido reductasa incluyen alrA de Acinetobacter sp. Cepa M-l que codifica un alcohol deshidrogenasa de cadena larga para C2-C14 (Tani et al., Appl. Environ.Microbiol. 66:5231-5235 ( 2000 ) ) , ADH2 de Saccharomyces cerevisiae (Atsumi et al, Nature 451:86-89 (2008)) y el producto de gen adhA de Zymomonas mobilis, que se demostró tiene actividad en un número de aldehidos que incluyen formaldehido, acetaldehído, propionaldehído, butiraldeh do, y acroleína (Kinoshita et al, Appl Microbiol Biotechnol 22:249-254 (1985)).

La serina descarboxilasa (EC 4.1.1.-) cataliza la descarboxilacion de serina a etanolamina (Figura 1, Etapa 5) . Las enzimas con esta actividad se han caracterizado en plantas tales como Spinacia olerácea, Arabidopsis thaliana y Brassica napus en el contexto de biosíntesis de colina. La serina descarboxilasa A. thaliana codificada por AtSDC es un tetrámero soluble y se caracteriza por la expresión heteróloga en E. coli y capacidad para complementar una mutante de levadura deficiente en biosíntesis de etanolamina (Rontein et al., J" Biol.Chem. 276:35523- 35529 (2001)). La serina descarboxilasa de Brassica napus se identificó y caracterizó en el mismo estudio. Una enzima similar encontró en Spinacia olerácea aunque el gen no se ha identificado hasta la fecha (Summers et al, Plant Physiol 103: 1269-1276 (1993) ) . Otros candidatos de serina descarboxilasa pueden identificarse por la homología de secuencia a la enzima Arabidopsis o Brassica. Un candidato con alta homología es la serina descarboxilasa putativa de Beta vulgaris .

La conversión de etanolamina a glicolaldehído se catalizó por una enzima con actividad etanolamina aminotransferasa . Tal actividad de enzima no se ha demostrado hasta la fecha. Los candidatos ejemplares son aminotransferasas con especificidad de sustrato de caldo que convierte aminas terminales a aldehidos, tal como gamma-aminobutirato GABA transaminasa (EC 2.6.1.19) , diamina aminotransferasa (EC 2.6.1.29) y putrescina aminotransferasa (EC 2.6.1.82) . La GABA aminotransferasa interconvierte naturalmente el semialdehído succínico y glutamato a 4-aminobutirato y alfa-cetoglutarato y se sabe que tiene un amplio margen de sustrato (Schulz et al, 56:1-6 (1990) ; Liu et al, 43:10896-10905 (2004) ) . Las dos GABA transaminasas en E. coli se codifican por gabT (Bartsch et al., J Bacteriol. 172:7035-7042 (1990)) y puuE (Kurihara et al, J.Biol.Chem. 280:4602-4608 (2005)) . Las GABA transaminasas en Mus musculus y Sus scrofa también se ha demostrado que reaccionan con un margen de sustratos alternarnos (Cooper, Methods Enzymol . 113:80-82 (1985)) . Los candidatos de enzima adicionales para interconvertir etanolamina y glicolaldehído son putrescina aminotransferasas y otras diamino aminotransferasas . La putrescino aminotransferasa de E. coli se codificó por el gen ygjG y la enzima purificada también fue capaz de trasminar cadaverina y espermidina (Samsonova et al., BMC.Microbiol 3:2 (2003)) . Además, la actividad de esta enzima en 1,7-diaminoheptano y con aceptores amino distintos de 2-oxoglutarato (por ejemplo, piruvato, 2-oxobutanoato) se han reportado (Samsonova et al, BMCMicrobiol 3:2 (2003); Kim, J Biol.Chem. 239:783-786 (1964)) .

La desaminación oxidativa de etanolamina a glicolaldehído se catalizó por etanolamina oxidoreductasa (desaminante) . Una enzima con esta funcionalidad es etanolamina oxidasa (EC 1.4.3.8), que utiliza oxígeno como un aceptor de electrones, que convierte etanolamina, O2 y agua a amoniaco, peróxido de hidrógeno y glicolaldehído (Schomburg et al, Springer Handbook of Enzymes . 320-323 (2005)). La etanolamina oxidasa se ha caracterizado en Pseudomonas sp y Phormia regina; sin embargo, la actividad de enzima no se ha asociado con el gen hasta la fecha. Alternativamente, la desaminacion oxidativa de etanolamina puede catalizarse por una desaminacion oxidoreductasa que utiliza NAD+, NADP+ o FAD como aceptor. Una enzima ejemplar para catalizar la conversión de un amina primaria a un aldehido es lisina 6-deshidrogenasa (EC 1.4.1.18), codificada por los genes lysDH. Esta enzima cataliza la desaminacion oxidativa del grupo 6-amino de L-lisina para formar 2-aminoadipato-6-semialdehído (Misono et al, J" Bacteriol . 150:398-401 (1982)). Los candidatos de enzima adicionales se encuentran en Geobacillus stearothermophilus (Heydari et al, Appl Environ .Microbiol 70:937-942 (2004)), Agrobacterium Cumefaciens (Hashimoto et al, J Biochem. 106:76-80 (1989); Misono y Nagasaki, J Bacteriol. 150:398-401 (1982)), y Achromobacter denitrificans (Ruldeekulthamrong et al, BMB.Rep. 41:790-795 (2008)).

Hidroxipiruvato reductasa (EC 1.1.1.29 y EC 1.1.1.81), también llamada glicerato deshidrogenasa, cataliza la reducción dependiente de NAD ( P) H reversible de hidroxipiruvato a glicerato (Figura 1, Etapa 8). Los genes ghrA y ghrB de E. coli codifica las enzimas con actividad hidroxipiruvato reductasa (Nunez et al, Biochem 354:707-715 (2001) ) . Ambos productos de gen también catalizan la reducción de glioxilato a glicolato y el producto de gen ghrB prefiere el hidroxipiruvato como sustrato. La hidroxipiruvato reductasa participa en el ciclo de serina en la bacteria metilotrópica tal como Methylobacterium extorquens AMI y Hypho icrobium methylovorum (Chistoserdova et al, J Bacteriol. 185:2980-2987 (2003)). Las enzimas hidroxipiruvato reductasa de Hyphomicrobium methylovorum y Methylobacterium sp. MB200 se han clonado y expresado heterólogamente en E. coli (Yoshida et al, Eur J Biochem. 223:727-732 (1994)). El Methylobacterium sp . MB200 HPR no se le ha asignado un identificador de Banco de Genes hasta la fecha pero la secuencia se encuentra disponible en la literatura y produce 98% de identidad a la secuencia de del producto de gen M. extorquens hprA, el cual utiliza tanto NADH como NADPH como cofactores (Chistoserdova et al, J Bacteriol. 173:7228-7232 (1991)). Las enzimas bifuncionales con actividades hidroxipiruvato reductasa y glioxilato reductasa (GRHPR) se encuentran en mamíferos que incluyen Homo sapiens y Mus musculus . Las enzimas GRHPR dependientes de NADPH recombinante y estos organismos fueron expresados heterólogamente en E. coli (Booth et al, J Mol.Biol. 360: 178-189 (2006)) .

Una enzima con actividad glicerato descarboxilasa se requiere para convertir glicerato a etilenglicol (Figura 1, Etapa 9) . Tal enzima no se ha caracterizado hasta la fecha. Sin embargo, una reacción de descarboxilación alfa,beta-hidroxiácido similar se catalizó por tartrato descarboxilasa (EC 4.1.1.73) . La enzima, caracterizada en el grupo Ve-2 Pseudomonas sp., es dependiente de NAD+ y cataliza una reacción de oxidación-reducción acoplada que procede a través de un intermediario oxaloglicolato (Furuyoshi et al., J" Bioche . 110:520-525 (1991)) . Una reacción colateral catalizada por esta enzima es la oxidación de tartrato dependiente de NAD+ (1% de actividad) . El glicerato no fue reactive como un sustrato para esta enzima y fue en cambio un inhibidor, de este modo la ingeniería de enzima o la evolución dirigida se requirió probablemente para esta enzima para funcionar en el contexto deseado. Un gene no se ha asociado con esta actividad de enzima hasta la fecha.

Una glicerato descarboxilasa candidato adicional es acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5) que participa en el catabolismo de citrato y la biosíntesis de aminoácido de cadena ramificada, que convierte el 2-acetolactato 2-hidroxiáicod a acetoina. En Lactococcus lactis la enzima es un hexámero codificado por gene aldB, y se activa por valina, leucina e isoleucina (Goupil-Feuillerat et al, J.Bacteriol. 182:5399-5408 (2000); Goupil et al, Appl .Environ.Microbiol . 62:2636-2640 (1996)). Esta enzima se ha sobreexpresado y caracterizado en E. coli (Phalip et al., FEBS Lett. 351:95-99 (1994) ) . En otros organismos la enzima es un dimero, codificado por aldC en Streptococcus ther ophilus (Monnet et al, Lett. Appl. Microbiol. 36:399- 405 (2003)), aldB en Bacillus brevis (Najmudin et al, Acta Crystallogr.D.Biol . Crystallogr. 59: 1073-1075 (2003); Diderichsen et al, J.Bacteriol. 172:4315-4321 (1990)) y budA de Enterobacter aerogenes (Diderichsen et al, J.Bacteriol. 172:4315-4321 (1990)). La enzima de Bacillus brevis se clonó y se sobreexpreso en Bacillus subtilis y se caracterizó estructuralmente (Najmudin et al, Acta Crystallogr.D.Biol. Crystallogr. 59: 1073-1075 (2003)). Una enzima similar de Leuconostoc lactis se ha purificado y caracterizado pero el gen no se ha aislado hasta la fecha (O'Sullivan et al, FEMS Microbiol . Lett. 194:245-249 (2001)).

EJEMPLO II Trayectorias para producir etilenglicol de 3-fosfoglicerato También se muestra en la Figura 1 las trayectorias para convertir 3-fosfoglicerato (3PG) a etilenglicol. En estas trayectorias, el 3-fosfoglicerato se convierte primero a glicerato por cualquiera de una enzima que es 3PG fosfatasa o una glicerato cinasa que funciona en la dirección que genera glicerato (Figura 1, Etapas 10 ó 11) . El glicerato es entonces descarboxilado lentamente en etilenglicol (Figura 1, Etapa 9) . Alternativamente, el glicerato se oxidiza por hidroxipiruvato (Figura 1, Etapa 8) , que se convierte subsecuentemente a etilenglicol por las acciones combinadas de hidroxipiruvato descarboxilasa y glicolaldehído reductasa como se describe previamente. Las enzimas candidato para las Etapas 10-11 de la Figura 1 se proporcionan en lo siguiente.

El 3-Fosfoglicerato fosfatasa (EC 3.1.3.38) cataliza la hidrólisis de 3PG a glicerato, liberando pirofosfato (Figura 1, Etapa 10) . La enzima se encuentra en plantas y tiene un amplio margen de sustrato que incluye fosfoenolpiruvato, ribulosa-1 , 5-bisfosfato , fosfato de dihidroxiacetona y glucosa-6-fosfato (Randall et al, Plant Physiol 48:488- 492 (1971); Randall et al , J Biol.Chem. 246:5510-5517 (1971)). La enzima purificada de diversas fuetes de plantas sea caracterizado pero un gen no se ha asociado con esta enzima hasta la fecha. Otra enzima con actividad 3-fosfoglicerato fosfatasa es la fosfoglicerato fosfatasa (EC 3.1.3.20) de hígado de cerdo (Fallón et al, Biochim.Biophys .Acta 105:43-53 (1965)). El gen asociado con esta enzima no se encuentra disponible.

La enzima alcalina fosfatasa (EC 3.1.3.1) hidroliza un amplio margen de sustratos fosforilados a sus alcoholes correspondientes . Estas enzimas típicamente se secretan en el periplasma en bacteria, donde juega un papel en el transporte y metabolismo de fosfato. El gen phoA de E. coli codifica una fosfatasa alcalina dependiente de zinc periplásmica activa bajo condiciones de privación de fosfato (Coleman Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:441-83 (1992)). Enzimas similares se han caracterizado en Campylobacter jejuni (van Mourik et al, Microbiol. 154:584-92 (2008)), Saccharomyces cerevisiae (Oshima et al, Gene 179: 171- 7 (1996)) y Staphylococcus aureus (Shah and Blobel, J". Bacteriol . 94:780-1 (1967)). La ingeniería de enzima y/o la remoción de secuencias objetivo puede requerirse para las enzimas aliña fosfatasas para funcionar en el citoplasma.

La interconversión de 3-fosfoglicerato y glicerato (Figura 1, Etapa 11) también se catalizó por glicerato cinasa (EC 2.7.1.31) . Esta enzima opera naturalmente en la dirección de fosforilación que consume ATP y no se ha mostrado que funcione en la dirección que genera ATP. Se han identificado tres clases de glicerato cinasa. Las enzimas en la clase I y II producen glicerato-2-fosfato, mientras que las enzimas de clase III se encuentran en plantas y la levadura produce glicerato-3-fosfato (Bartsch et al, FEBS Lett. 582:3025-3028 (2008) ) . En un estudio reciente, las enzimas de glicerato cinasa de clase III de Saccharomyces cerevisiae, Oryza sativa y Arabidopsis thaliana se expresan heterologamente en E. coli y se caracterizan (Bartsch et al, FEBS Lett. 582:3025-3028 (2008) ) . Este estudio también ensaya el producto de gen de glxK de E. coli para habilitar a que forma glicerato-3-fosfato y se encuentra que la enzima puede solo catalizar la formación de glicerato-2-fosfato, en contraste a la función previa (Doughty et al., J Biol.Chem. 241:568-572 (1966) ) .

EJEMPLO III Trayectorias para producir etilenglicol a partir de glioxilato mediante semialdehído tartronato La Figura 2 muestra una trayectoria para producir etilenglicol de glioxilato mediante un intermediario tartrato semialdehído. El precursor de glioxilato puede derivarse de metabolitos centrales tal como isocitrato, mediante isocitrato liasa, o glicina, mediante una de diversas enzimas aminotransferasa que utiliza glicina como un donador amino tal como serina : glioxilato aminotransferasa o glicina aminotransferasa . En la trayectoria propuesta, dos equivalentes de glioxilato se unen por glioxilato carboligasa para formar un equivalente de tartronato semialdehído (Figura 2, Etapa 1) . El tartronato semialdehído se isomeriza subsecuentemente para formar hidroxipiruvato por hidroxipiruvato isomerasa (Figura 2, Etapa 2) . La descarboxilación y reducción de hidroxipiruvato produce etilenglicol como se describe previamente (Figura 2, Etapas 3 y 4) . Las enzimas candidatos para las Etapas 1 y 2 de la Figura 2 se proporcionan en lo siguiente.

La glioxilato carboligasa (EC 4.1.1.47), también conocida como tartrato semialdehído sintasa, cataliza la condensación de dos moléculas de glioxilato para formar tartronato semialdehído (Figura 2, Etapa 2) . La enzima E. coli, codificada por gcl , se active bajo condiciones anaeróbicas y requiere FAD para la actividad aunque no necesita que se lleve a cabo la reacción redox (Chang et al, J Biol.Chem. 268:3911-3919 (1993) ) . La actividad de glioxilato carboligasa también se ha detectado en Ralstonia eutropha, donde se codifica por hl6_A3598 (Eschmann et al, Arch .Microbiol . 125:29-34 (1980) ) . Los candidatos de enzima de glioxilato carboligasa adicionales pueden identificarse por homología de secuencia. Dos candidatos ejemplares con alta homología a la enzima E. coli se encontraron en Salmonella entérica y Burkholderia ambifaria.

La hidroxipiruvato isomerasa cataliza la isomerización reversible de hidroxipiruvato y tartronato semialdehído . La enzima E. coli, codificada por hyi , se cotranscribe con glioxilato carboligasa (gcl) en un operón de utilización de glioxilato (Ashiuchi et al, Biochim. Biophys. Acta 1435: 153-159 (1999) ; Cusa et al, J Bacteriol. 181:7479-7484 (1999) ) . Esta enzima también se han purificado y caracterizado en Bacillus fastidiosus, aunque el gen asociado no se conoce (de Windt et al, Biochim. Biophys .Acta 613:556-562 (1980) ) . Los candidatos de enzima hidroxipiruvato isomerasa en otros organismos tal como Ralstonia eutropha y Burkholderia ambifaria pueden identificarse por homología de secuencia al producto de gen E. coli. Note que los candidatos de gen hidroxipiruvato isomerasa predichos en estos organismos también se colocalizan con genes predichos para codificar glioxilato carboligasa .

EJEMPLO IV Trayectorias para producir etilenglicol a partir de glioxilato mediante glicolato Las trayectorias adicionales de glioxilato a etilenglicol proceden a través del glicolato intermediario como se muestra en la Figura 3. En la primera etapa de todas las trayectorias, el glioxilato se convierte a glicolato por glioxilato reductasa (Figura 3 , Etapa 1 ) . El glicolato entonces se convierte a etilenglicol por una de las diversas rutas. En una ruta, el glicolato se convierte a glicolil-CoA por una CoA transferasa o sintetasa (Figura 3 , Etapa 2 / 3 ) . La glicolil-CoA entonces se desacila reductivamente a glicolaldehído por glicolil-CoA reductasa (formación de aldehido) (Figura 3 , Etapa 4 ) . El glicolaldehído se convierte a etilenglicol por glicolaldehído reductasa como se describe previamente (Figura 3, Etapa 5). Alternativamente, el glicolil-CoA se convierte directamente a etilenglicol por una enzima bifuncional con actividad CoA reductasa (formación de alcohol) (Figura 3, Etapa 10). En una ruta alternativa, el glicolato se convierte directamente a glicolaldehído por una enzima reductasa de ácido carboxilico con actividad glicolato reductasa (Figura 3, Etapa 6). En aún otra ruta, el glicolato se convierte a glicolaldehído mediante un intermediario glicolilfosfato por las enzimas glicolato cinasa y glicolilfosfato reductasa (Figura 3, Etapas 7 y 9). Alternativamente, el intermediario glicolilfosfato se convierte a glicolil-CoA por fosfotransglicolilasa (Figura 3, Etapa 8) . Las enzimas candidato para cada una de estas etapas se proporcionan en lo siguiente.

La reducción de glioxilato a glicolato se cataliza por glioxilato reductasa (EC 1.1.1.79 y EC 1.1.1.26). En E. coli esta reacción se cataliza por los productos de dos genes, ghrB y ghrA (Nunez et al, Biochem.J 54:707-715 (2001)) . Ambos productos de gen utilizan NADPH y también catalizan la reducción de hidroxipiruvato y el producto de gen ghrA prefiere glicolato como un sustrato. Los candidatos de enzima glioxilato reductasa eucarióticos que se han expresado en E. coli incluye el producto de gen YNL274C dependiente de NADPH o NADH de S. cerevisiae (Rintala et al., Yeast 24: 129-136 (2007)) y GRl de Arabidopsis thaliana (Hoover et al, CanJ.Bot. 85:896-902 (2007) ; Alian et al, J Exp.Bot. 59:2555-2564 (2008) ) . La enzima de levadura también cataliza la reducción de hidroxipiruvato .

La activación de glicolato a glicolil-CoA se cataliza por una enzima con actividad glicolil-CoA transferasa. Tal enzima no se ha caracterizado hasta la fecha. La glutaconil-CoA transferasa (EC 2.8.3.12) cataliza la transferencia de la 2-hidroxiácido, 2-hidroxiglutarato, a CoA. La enzima glutaconil-CoA-transferasa (EC 2.8.3.12) de bacteria aeróbica Acidamlnococcus fermentans reacciona con un margen de sustratos que incluyen 2-hidroxiglutarato, glutarato, crotonato, adipato y acrilato (Buckel et al., Eur.J Biochem. 118:315-321 (1981) ; Mack et al . , Eur. J. Biochem. 226:41-51 (1994) ) . Los genes que codifican esta enzima, gctA y gctB, se han clonado y expresado funcionalmente en E. coli (Mack et al, supra) .

La acilación dependiente de ATP de glicolilato a glicolil-CoA (Figura 3, Etapa 3) se cataliza por una glicolil-CoA sintetasa o ácido-tiol ligasa. Las enzimas que catalizan esta transformación exacta no se han caracterizado hasta la fecha; sin embargo, varias enzimas con amplia especificidad de sustrato se han descrito en esta literatura. La acetil-CoA sintetasa que forma ADP (ACD, EC 6.2.1.13) es una enzima que acopla la conversión de ácidos a sus ésteres acil-CoA correspondientes con el consumo concomitante de ATP. ACD I de Archaeóglobus fulgidus, codificada por AF1211, se mostró para operar en una variedad de sustratos de cadena lineal y ramificada que incluyen isobutirato, isopentanoato, y fumarato (Musfeldt et al., J Bacteriol . 184:636-644 (2002)). Una segunda ACD reversible en Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1983, también se mostró que tiene un amplio margen de sustrato con alta actividad sobre compuestos cíclicos de fenilacetato e indolacetato (Musfeldt et al., supra) . La enzima de Haloarcula marismortui, anotada como una succinil-CoA sintetasa, acepta propionato, butirato, y ácidos de cadena ramificada (isovalerato e isobutirato) como sustratos, y se muestra para operar en las direcciones recta e inversa (Brasen et al., Arch.Microbiol 182:277-287 (2004)). La ACD codificada por PAE3250 de crenarchaeon hipertermofílico Pyrohaculum aerophilum mostrada en el margen de substrato más amplio de todas las ACDs caracterizadas, que reacciona con acetil-CoA, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetil-CoA (Brasen and Schonheit, Arch.Microbiol 182:277-287 (2004) ) . La evolución o ingeniería dirigida pueden utilizarse para modificar esta enzima para operar a la temperatura fisiológica del organismo huésped. Las enzimas de A. fulgidus, H. marismortui y P. aerophilum todas se han clonado, expresado funcionalmente, y caracterizado en E. coli (Brasen and Schonheit, Arch .Microbiol 182:277-287 (2004) ; Musfeldt and Schonheit, J Bacteriol . 184:636-644 (2002) ) . Un candidato adicional es la enzima codificada por sucCD en E. coli, que cataliza naturalmente la formación de succinil-CoA de succinato con el consumo concomitante de una ATP, una reacción que es reversible in vivo (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985) ) . La acil CoA ligasa de Pseudomonas putida ha demostrado trabajar en varios sustratos alifáticos que incluyen ácido acético, propiónico, butírico, valérico, hexanóico, heptanóico, y octanóico y sobre compuestos aromáticos tales como ácidos fenilacético y fenoxiacético (Fernandez-Valverde et al, Appl . Environ. Microbiol . 59: 1149-1154 (1993) ) . Una enzima relacionada, malonil CoA sintetasa (6.3.4.9) de Rhizobium leguminosarum puede convertir los diversos diácidos, particularmente, etil-, propil-, alil-, isopropil-, dimetil-, ciclopropil- , ciclopropilmetileno- , ciclobutil-, y bencil-malonato en su monotioéster correspondiente (Pohl et al, J.Am.Che .Soc. 123:5822-5823 (2001) ) .

Varias acil-CoA deshidrogenasas son capaces de reducir una acil-CoA a su aldehido correspondiente y pueden utilizarse para catalizar la actividad glicolil-CoA reductasa (formación de aldehido) . Genes ejemplares que codifican tales enzimas incluyen la Acinetobacter calcoaceticus acrl que codifica una acil-CoA reductasa grasa (Reiser et al, J". Bacteriol. 179: 2969-2975 (1997)), la Acinetobacter sp. M-l acil-CoA reductasa grasa (Ishige et al, Appl .Environ.Microbiol. 68:1192-1195 (2002)), y un succinato semialdehido deshidrogenasa dependiente de CoA- y NADP-codificado por el gen SUCO en Clostridium kluyveri (Sohling et al, J Bacteriol. 178:871-880 (1996)). SucD de P. gingivalis es otro succinato semialdehido deshidrogenasa (Takahashi et al., J. Bacteriol. 182:4704-4710 (2000)). La acetaldehído deshidrogenasa acilante de enzima en Pseudomonas sp, codificada por bphG, es aún otra como se ha demostrado para oxidizar y acilar acetaldehído, propionaldehído , butiraldehído, isobutiraldehído y formaldehído (Powlowski et al, 175:377-385 (1993)). Además de reducir acetil-CoA a etanol, la enzima codificada por adhE en Leuconostoc mesenteroides ha mostrado que oxidiza el isobutiraldehído compuesto de cadena ramificada a isobutiril-CoA (Koo et al, Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005) ) . La butiraldehído deshidrogenasa cataliza una reacción similar, conversión de butiril-CoA a butiraldehído, en organismos solventogénicos tales como Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 71 ¡58-68 (2007) ) .

Un tipo de enzima adicional que convierte un acil-CoA a su aldehido correspondiente es malonil-CoA reductasa que transforma malonil-CoA a semialdehído malónico. La reductasa malonil-CoA es una enzima clave en la fijación de carbono autotrófico mediante el ciclo 3-hidroxipropionato en la batería archel termoacidofílica (Berg et al., Science 318: 1782-1786 (2007) ; Thauer, Science 318:1732-1733 (2007) ) . La enzima utiliza NADPH como un cofactor y se ha caracterizado en Metallosphaera y Sulfolobus spp (Alber et al, J". Bacteriol. 188:8551-8559 (2006) ; Hugler et al, J. Bacteriol . 184:2404-2410 (2002)). La enzima es codificada por Msed_0709 en Metallosphaera sedula (Alber et al, supra; Berg et al, supra) . Un gen que codifica una malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaii se clonó y se expresó heterologamente en E. coli (Alber et al, supra) . Esta enzima también se ha mostrado para catalizar la conversión de metilmalonil-CoA a su aldehido correspondiente (WO/2007/141208 ) . Aunque la funcionalidad de aldehido deshidrogenasa de estas enzimas es similar a la deshidrogenasa bifuncional de Chloroflexus aurantiacus, existe poca similaridad de secuencia. Ambos candidatos de la enzima malonil-CoA reductasa tienen alta similaridad de secuencia para aspartato-semialdehído deshidrogenasa, una enzima que cataliza la reducción y desfosforilación concurrente de aspartil-4-fosfato a aspartato semialdehido . Los genes candidatos adicionales pueden encontrarse por homología de secuencia a proteínas en otros organismos incluyendo Sulfolobus solfataricus y Sulfolobus acidocaldarius . Aún otro acil-CoA reductasa candidato (formación de aldehido) es el gen ald de Clostridium beijerinckii (Toth, Appl . Environ. Microbiol . 65:4973-4980 (1999)). Esta enzima se ha reportado que reduce acetil-CoA y butiril-CoA a sus aldehidos correspondientes. Este gen es muy similar a eutE que codifica el acetaldehído deshidrogenasa de Salmonella typhimurium y E. coli (Toth, et al . , supra) .

La conversión directa de glicolato a glicolaldehído se cataliza por una enzima ácido reductasa con actividad glicolato reductasa. Enzimas ejemplares incluyen ácido carboxílico reductasa, alfa-aminoadipato reductasa y ácido retinoico reductasa. El ácido carboxílico reductasa (CAR) se encuentra en Norcardia iowensis, cataliza el magnesio ATP y la reducción dependiente de NADPH de ácidos carboxílicos a sus aldehidos correspondientes (Venkitasubramanian et al., J. Biol. Chem. 282:478-485 (2007) ) . El sustrato natural de esta enzima es ácido vanílico y la enzima exhibe una aceptación de sustratos aromático y alifático (Venkitasubramanian et al., 425-440 (2006) ) . Esta enzima codificada por car, se clona y se expresa y se expresa funcionalmente en E. coli (Venkitasubramanian et al., J. Biol. Chem. 282:478-485 (2007) ) . CAR requiere activación post-translacional por una fosfopantoteína transferasa (PPTasa) que convierte la apo-enzima inactiva a la holo-enzima activa (Hansen et al., Appl .Environ.Microbiol 75:2765-2774 (2009) ) . La expresión del gen npt, que codifica una PPTasa específica, producto de actividad mejorada de la enzima. Una enzima candidato adicional encontrada en Stroptomyces griseus se codifica por los genes griC y griD. Estas enzimas se cree que convierten el ácido 3-amino-4-hidroxibenzoico a 3-amino-4hidroxibenzaldehíco como supresión de cualquier griC o griD conduce a la acumulación de ácido 3-acetilamino-4-hidroxibenzoico extracelular, un producto de derivación de metabolismo de ácido 3-amino-4-hidroxibenzoico (Suzuki, et al., J". Antibiot. 60 (6) :380-387 (2007)). Co-expresión de griC y griD con SGR_665, una enzima similar en secuencia a la Nocardia iowensis npt, puede ser benéfica.

Una enzima con características similares, alfa-aminoadipato reductasa (AAR, EC 1.2.1.31), participa en la trayectoria de biosíntesis de lisina en algunas especies fúngicas . Esta enzima naturalmente reduce alfa-aminoadipato a alfa-aminoadiptato semialdehído . El grupo carboxilo es primero activado a través de la formación dependiente de ATP de un adenilato que entonces se reduce por NAD ( P) H para producir el aldehido y AMP. CAR, esta enzima utiliza magnesio y requiere activación por una PPTasa. Los candidatos de enzima para AAR y sus PPTasa correspondientes se encuentran en Saccharomyces cerevisiae (Morris et al., Gene 98:141-145 (1991) ) , (Guo et al. Mol. Genet. Genomics 269:271-279 (2003) ) , y Schizosaccharomyces pombe (Ford et al., Curr Genet 28:131-137 (1995) ) . El AAR de S. pombe muestra la actividad significante cuando se expresa en E. coli (Guo et al., Yeast 21:1279-1288 (2004) ) . El AAR de Penicillium chrysogenum acepta S-carboximetil-L-cisteína como un sustrato alternativo, pero no reaccionó con adipato, L-glutamato o diaminopimelato (Hijarrubia et al. J. Biol. Chem. 278:8250-8256 (2003) ) . El gen que codifica el P. chrysogenum PPTase no se ha identificado hasta la fecha y no se identificaron aciertos de alta confianza mediante la búsqueda de homología de comparación de secuencia.

Las enzimas cinasa o fosfotransferasa transforman los ácidos carboxílicos a ácidos fosfónicos con hidrólisis concurrente de un ATP. Tal enzima con actividad glicolato cinasa se requiere para convertir glicolato a glicoililfosfato (Figura 3, Etapa 7) , Esta transformación exacta no se ha demostrado hasta fecha. Candidatos de enzima ejemplares incluyen butirato cinasa (EC 2.7.2.7), isobutirato cinasa (EC 2.7.2.14), aspartocinasa (EC 2.7.2.4), acetato cinasa (EC 2.7.2.1) y gamma-glutamil cinasa (EC 2.7.2.11). La butirata cinasa cataliza la conversión reversible de butiril-fosfato a butirato durante la acidogénesis en las especies Clostridial (Cary et al., Appl . Environ. Microbiol. 56:1576-1583 (1990) ) . La enzima Clorstridium acetobutylicum se codifica por cualquiera de dos productos de gen buk (Huang et al., J. Mol. Microbiol Biotechnol 2:33-38 (2000)). Otras enzimas butirato cinasa se encuentran en C. Butyricum y C. tetanomorphum (TWAROG et al., J. Bacteriol. 86:112-117 (1993)). Una enzima relacionada, isobutirato cinasa de Thermotoga marítima, se expresó en E. coli y se cristalizó (Diao et al., J". Bacteriol. 191: 2521-2529 (2009); Diao et al., Acta Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 59.1100-1102 (2003)). La asparticinasa cataliza la fosforilación dependiente de ATP de aspartato y participa en la síntesis de diversos aminoácidos . La enzima aspartocinasa III en E. coli codificada por lysC, tiene un amplio margen de sustrato y el residuo catalítico implicado en la especificidad del sustrato se ha elucidado (Keng et al., Arch. Biochem. Biophys. 335:73-81 (1996)) . Dos cinasas adicionales en E. coli son también buenos candidatos: el acetato cinasa y gamma-glutamil cinasa. La acetato cinasa de E. coli, codificada por ackA (Skarstedt et al., J. Biol. Chem. 251:6775-6783 (1976)), fosforilatos propionato además a acetato (Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-492 (1998)). La gamma-glutamil cinasa de E. coli, codificada por proB (Smith et al., J\ Bacteriol. 157:545-551 (1984a)), fosforila el grupo de ácido carbónico gamma de glutamato .

Una enzima con actividad fosfotransglicolilasa se requiere para convertir glicolilfosfato a glicolil-CoA (Figura 3, Etapa 8). Acetiltransferasa que transfiere fosfato ejemplar incluye fosfotransacetilasa (EC 2.3.1.8) y fosfotransbutirilasa (EC 2.3.1.19). El gen pta de E. coli codifica una fosfotransacetilasa que convierte reversiblemente acetil-CoA en acetilfosfato (Suzuki, Biochim. Biophys . Acta 191:559-569 (1969)). Esta enzima también puede utilizar propionil-CoA como un sustrato, que forma propionato en el proceso (Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27:477-1491 (1998) ) . Otras fosfatoacetiltransferasas que muestran actividad en propionil-CoA se encuentran en Bacillus subtilis (Rado et al., Biochim. Biophys. Acta 321:114-125 (1973)), Clostridium kluyveri (Stadtman, 1:596-599 (1955)), y Thermatoga marítima (Bock et al., J. Bacteriol. 181:11861- 1867 (1999) ) . Similarmente, el gen ptb de C. acetobutilicum codifica fosfotransbutirilasa, una enzima que convierte reversiblemente butiril-CoA en butiril-fosfato (Wiesenborn et al., Appl Environ. Microbiol 55:317-322 (1989) ; Walter et al., Gene 134:107-111 (1993) ) . Los genes ptb adicionales se encuentran en bacterias L2-50 que producen butirato (Louis et al., J". Bacteriol. 186:2099-2106 (2004) y Baci11us mega eriu (Vázquez et al., Curr. Microbiol 42:345-349 (2001) ) .

La conversión de glicolilfosfato a glicolaldehído se cataliza por glicolilfosfato reductasa (Figura 3, Etapa 9) . Aunque una enzima que cataliza esta conversión no se ha identificado hasta la fecha, transformaciones similares catalizadas por gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.2.1.12) , aspartato-semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.11) acetilglutamilfosfato reductasa (EC 1.2.1.38) y glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.) se encuentran bien documentadas . La aspartato semialdehído deshidrogenasa (ASD, EC 1.2.1.11) cataliza la reducción dependiente de NADPH de 4 aspartil fosfato a aspartato-4-semialdehído. ASD participa en la biosíntesis de aminoácido y recientemente se ha estudiado como un objetivo antimicrobiano (Hadfield et al., Biochemistry 40:14475-14483 (2001)) . La ASD de E. coli se ha resuelto (Hadfield et al., J". Mol. Biol. 289:991-1002 (1999)) y la enzima se ha mostrado para aceptar el sustrato alterno beta-3 -metilaspartil fosfato (Shames et al., J. Biol. Chem. 259:15331-15339 (1984)) . La enzima Haemophilus influenzae ha sido el objeto de los estudios de ingeniería de enzima para alterar la afinidad de enlace de sustrato en el sitio activo (Blanco et al., Acta Crystallogr.

D. Biol. Crystallogr. 60:1388-1395 (2004)) . Otros candidatos ASD se encuentran en Mycrobacterium tuberculosis (Shafiani et al., J. Appl Microbiol 98:832-838 (2005)) , Methanococcus jannaschii (Faehnle et al., J. Mol. Biol. 353:1055-1068 (2005) ) , y los microorganismos infecciosos Vibrio cholera y Helicobacter pylori (Moore et al., Protein Expr . Purif. 25:189-194 (2002)) . Un candidato de enzima relacionado es acetilglutamilfosfato reductasa (EC 1.2.1.38) , una enzima que reduce naturalmente acetilglutamilfosfato a acetilglutamato-5 -semialdehído, se encuentra en S. cerevisiae (Pauwels et al., Eur. J. Biochem. 270:1014-1024 (2003)), B . subtilis (O'Reilly et al., Microbiology 140 (Pt 5) :1023-1025 (1994)), E. coli (Parson et al., Gene. 68:275-283 (1988)), y otros organismos. Las enzimas de fosfato reductasa adicionales de E. coli incluyen gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa codificado por gapA (Branlant et al. , Eurl . J. Biochem. 150:61-66 (1985) ) y glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa codificado por proA (Smith et al. , J". Bacteriol . 157:545-551 (1984b) ) . Los genes que codifican las enzimas glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa de Salmonella typhimurium (Manan et al. , J". Bacteriol. 156:1249-1262 (1983) ) y Campylobacter jejuni (Louie et al. , Mol. Gen. Genet. 240:29-35 (1995) ) se clonaron y expresaron en E. coli.

La formación directa de etilenglicol a partir de glicolil-CoA se cataliza por una enzima bifuncional con actividad glicolil-CoA reductasa (formación de alcohol) (Figura 3, Etapa 10) . Las oxidoreductasas bifuncionales ejemplares que convierten moléculas acil-CoA a sus alcoholes correspondientes incluyen enzimas que transforman sustratos tales como acetil-CoA a etanol (por ejemplo, adhE de E . coli (Kessler et al., FEBS.Lett. 281:59-63 (1991) ) ) , butiril-CoA a butanol (por ejemplo, adhE2 de C. acetobutylicum (Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830 (2002))) y manonil-CoA para 3-hidroxipropanoato (por ejemplo, mcr de Chloroflexus aurantiacus (Hugler et al., J". Bacteriol. 184:2404-2410 (2002))) . Además de reducir aceti-CoA a etanol, la enzima codificada por adhE en Leuconostoc mesenteroides se ha mostrado que oxida isobutiraldehído de compuesto de cadena ramificada a isobutiril-CoA (Kazahaya et al., J. Gen.Appl .Microbiol . 18:43-55 (1972), Koo et al., supra) . La malonil-CoA reductasa que forma alcohol dependiente de NADPH de Chloroflexus aurantiacus participa en el ciclo de 3-hidroxipropionato (Hugler et al., 184:2404-2410 (2002); Strauss et al., Eur . J.Biochem. 215:633-643 (1993)) . Esta enzima, con una masa de 300 kDa, es un sustrato altamente específico y muestra poca similaridad de secuencia en otras oxidorreductasas conocidas (Hugler et al., supra) . Ninguna enzimas en otros organismos se han mostrado para catalizar esta reacción específica; sin embargo existe evidencia bioinformática que otros organismos pueden tener trayectorias similares (Klatt et al., supra) . Las enzimas candidato en otros organismos incluyen Roseiflexus castenholzii , Erythrobacter sp. NAPl y proteobacterium gamma marine HTCC2080 puede inferirse por similaridad de secuencia.

Las moléculas acil-CoA de cadena más larga pueden reducirse a sus alcoholes correspondientes por enzimas tales como la jo oba (Simmondsia chinensis) FAR que codifica una acil-CoA reductasa grasa que forma alcohol. Esta sobre-expresión en E. coli resulta en actividad FAR y la acumulación de alcohol graso (Metz et al. Plant Phisiology 122 :635-644 (2000) ) .

EJEMPLO V Trayectoria para convertir glicerato a etilenglicol La trayectoria para convertir glicerato a etilenglicol se muestra en la Figura 1. El glicerato es un intermediario metabólico común en diversas trayectorias biosintética metabólica y de degradación incluyendo la trayectoria Entner-Doudoroff no fosforilativa, la trayectoria serina de asimilación de formaldehído y degradación de gloxilato. El glicerato puede también formarse por oxidación de gliceraldehído por deshidrogenasa gliceraldehído u oxidasa gliceraldehído (Etapa 14 de la Figura 1) o desfosforilación de 3-fosfoglicerato o 2-fosfoglicerato por cualquiera de una fosfatasa (Etapas 10 y 12 de la Figura 1) o una cinasa que opera en la dirección inversa (Etapas 13 y 11 de la Figura 1) . El glicerato entonces se convierte a etilenglicol por una de las diversas trayectorias. En una trayectoria, el glicerato se convierte directamente a etilenglicol por una decarboxilasa (Etapa 9 de la Figura 1) . Las enzimas candidato para esta decarboxilasa se presentaron en el Ejemplo I. en una ruta alterna, el glicerato se oxidiza a hidroxipiruvato por hidroxipiruvato reductasa (Etapa 8 de la Figura 1) . El intermediario de hidroxipiruvato entonces se decarboxiló y redujo a etilenglicol por enzimas descritas en el Ejemplo I (Figura 1, Etapas 3, 4) . En aún otra ruta, el glicerato se convirtió a hidroxipiruvato en dos etapas: oxidación a semialdehído de tartronato por glicerato deshidrogenasa, seguido por la isomerización a hidroxipiruvato por hidroxipiruvato isomerasa (Etapas 5 y 2 de la Figura 2) . Las enzimas candidato para hidroxipiruvato isomerasa se describen en el Ejemplo III. Las enzimas candidato para 2-fosfogliceratofosfatasa, glicerato-2-cinasa, gliceraldehído deshidrogenasa, gliceraldehído oxidasa y glicerato deshidrogenasa se proporcionan en lo siguiente.

La 2-fosfogliceratofosfatasa (EC 3.1.3.20) cataliza la hidrólisis de 2PG a glicerato, liberando pirofosfato (Figura 1, Etapa 12) . Esta enzima se purificó a partir de extractos de células de Veillonella alcalescens (Pestka et al., Can.J Microbiol 27:808-814 (1981)), en donde se cree que participa en una trayectoria biosintética de serina. Una enzima similar también se caracterizó en un hígado de res (Fallón et al., Biochim Biophys Acta 105:43-53 (1965)). Sin embargo, los genes no se han asociado con cualquier enzima hasta la fecha. Las enzimas candidato fosfatasa 2PG adicionales son alcalinofosfatasa (EC 3.1.3.1) y ácidofosfatasa (EC 3.1.3.2). Ambas enzimas hidrolizan un amplio margen de sustratos fosforilados a sus alcoholes correspondientes. Las enzimas alcalinofosfatasas se secretan típicamente en el periplasma en bacterias, donde juegan un papen en el transporte y metabolismo de fosfato. El gen phoA de E. coli codifica una fosfatasa alcalina dependiente de zinc periplásmica activa bajo condiciones de privación de fosfato (Coleman Annu. Rev. Biophys. Biomol . Struct. 21:441-83 (1992)) . Se han caracterizado enzimas similares Campylobacter jejuni (van Mourik et al., Microbiol. 154:584-92 (2008)), Saccharomyces cerevisiae (Oshima et al., Gene 179:171-7 (1996)) y Staphylococcus aureus (Shah y Blobel, J". Bacteriol. 94:780-1 (1967)). La ingeniería de enzima y/o la remoción de secuencias objetivo puede requerirse para las enzimas alcalinofosfatasas para funcionar en el citoplasma. Las enzimas de ácidofosfatasa de Brassica nigra, Lupinus luteus y Phaseolus vulgaris se han demostrado para catalizar la hidrólisis de 2PG a glicerato (Yoneyama et al . , J" Biol Chem 279:37477-37484 (2004); Olczak et al., Biochim Biophys Acta 1341: 14-25 (1997); Duff et al., Arch . Biochem. Biophys 286:226-232 (1991)). Solamente la enzima P. vulgaris se ha asociado con un gen hasta la fecha.

La interconversión dependiente de ATP de 2-fosfoglicerato y glicerato (Figura 1, Etapa 13) se cataliza por glicerato-2-cinasa (EC 2.7.1.165). Esta enzima opera naturalmente en la dirección que consume ATP fosforilante y no se ha mostrado para función en la dirección que genera ATP inversa. Las enzimas de glicerato-2-cinasa se han estudiado en animales, bacterias metilotrópicas y organismos que utilizan una trayectoria de Entner-Doudoroff ramificado. Los genes candidato ejemplares incluyen glxK de E. coli (Bartsch et al., FEBS Lett. 582:3025-3028 (2008)), ST2037 de Sulfolobus tolodaii , garK de Thermoproteus tenax y Ptol442 de Picrophilus torridus (Liu et al., Biotechnol Lett. 31: 1937-1941 (2009); Kehrer et al., BMC Genomics 8:301 (2007); Reher et al., FEMS Microbiol Lett. 259:113-119 (2006)). La enzima termoestable de S. tolodaii y T. tenax se ha clonado y caracterizado en E. coli. Diversas enzimas en esta clase se inhiben por ADP, sin la remoción o atenuación de esta inhibición puede ser necesaria para la enzima para operar en la dirección deseada.

La deshidrogenasa gliceraldehído cataliza la oxidación de gliceraldehído a glicerato. Esta reacción puede catalizarse por cualquier oxidoreductasa dependiente de NAD(P)+ en la clase EC 1.2.1. Las enzimas ejemplares que catalizan esta conversión incluyen la glutarato semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.20) de Pseudomonas putida, lactato deshidrogenasa (EC 1.2.1.22) de Methanocaldococcus jannaschii, la betaína-aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.8) de E. coli (Gruez et al., J" Mol Biol 343:29-41 (2004)) y el succinato semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.24) de Azospirillum brasilense (Watanabe et al., J Biol Chem 281:28876-28888 (2006); Grochowski et al., J Bacteriol . 188:2836-2844 (2006); Chang et al., J Biol Chem 252:7979-7986 (1977)). Las enzimas de aldehido deshidrogenasa dependiente de NAD+- y NADP+- (EC 1.2.1.3 y EC 1.2.1.4 y EC 1.2.1.5) también son candidatos adecuados . Algunos productos de genes con actividad en gliceraldehído incluyen la enzima dependiente de NADP+ de Acetobacter aceti y ALDH de Saccharomyces cerevisiae (Vandecasteele et al., Methods Enzymol. 89 Pt D:484-490 (1982); Tamaki et al., J Biochem. 82:73-79 (1977)). Aldehido deshidrogenasa dependiente de NAD+- (EC 1.2.1.3) se encontró en el hígado humano, ALDH-1 y ALDH-2 , tienen amplios márgenes de sustrato para una variedad de aldehidos alifáticos, aromáticos y policíclicos (Klyosov, Biochemistry 35:4457-4467 (1996)). La ALDH-2 activo se ha expresado eficientemente en E. coli utilizando las proteínas GroEL como chaperoninas (Lee et al., Biochem. Biophys .Res .Commun. 298:216-224 (2002)). El aldehido deshidrogenasa de la mitocondria de rata también tiene un amplio margen de sustrato (Siew et al., Arch. Biochem. Biophys . 176:638- 649 (1976)). El gen E. coli astD también codifica una aldehido deshidrogenasa dependiente de NAD+- (Kuznetsova et al., FEMS Microbiol Rev 29 : 263-279 (2005)).

Las enzimas aldehido oxidasa (EC 1.2.3.1) pueden también catalizar la conversión de gliceraldehído agua y oxígeno a glicerato y peróxido de hidrógeno. Las enzimas aldehido oxidase en organismos tales como Streptomyces moderatus, Pseudomonas sp. y. Methylobacillus sp. Catalizan la oxidación de un amplio margen de aldehidos que incluyen formaldeh do, aldehidos aromáticos, y alifáticos incluyendo gliceraldehído (Koshiba et al., Plant Physiol 110:781-789 (1996)). Aunque los genes asociados con estas enzimas no se conocen hasta la fecha, los genes zmAO-1 y zmAO-2 Zea mays codifica isoenzimas aldehido oxidasas que contienen flavina y molibdeno (Sekimoto et al., J Biol.Chem. 272: 15280-15285 (1997) ) . Los candidatos gliceraldehído oxidase adicionales pueden inferirse por homología de secuencia en los genes Z. mays y se muestran en lo siguiente.

La oxidación de glicerato a semialdehído de tartronato se caracteriza por la glicerato deshidrogenasa (EC 1.1.1.60) . Las dos isoenzimas de esta enzima se codifican pro los genes garR y glxR de E. coli (Cusa et al . , J Bacteriol. 181:7479-7484 (1999); Monterrubio et al., J . Bacteriol. 182 : 2672-2674 (2000) ; Njau et al., J Biol Chem 275:38780-38786 (2000) ) . La glicerato deshidrogenasa codificada por garR de Salmonella typhimurium subs . entérica serovar Typhimurium se cristalizó recientemente (Osipiuk et al., J Struct .Funct. Genomics 10:249-253 (2009)).

Las alcoholes deshidrogenasas candidatas adicionales para convertir glicerato a semialdeh do de tartronato incluye alcohol deshidrogenasa de cadena media, 4-hidroxibutirato deshidrogenasa y 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa. Los genes ejemplares que codifican las enzimas alcohol deshidrogenasa de cadena media que cataliza la conversión de un alcohol a un aldehido incluye alrA que codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena media para C2-C14 (Tani et al., Appl . Environ. Microbiol. 66:5231-5235 (2000)), ADH2 de Saccharomyces cerevisiae (Atsumi et al., Nature 451: 86-89 (2008)), yqhD de E. coli la cual tiene preferencia por las moléculas más grandes que C(3) (Sulzenbacher et al., 342:489-502 (2004)), y bdhl y bdhll de C. acetobutylicum que convierte butiraldehído a butanol (Walter et al., 174:7149-7158 (1992)). El producto de gen de yqhD cataliza la reducción de acetaldehído , malondialdehído , propionaldehído, butiraldehído, y acroleína utilizando NADPH como el cofactor (Pérez et al . , J Biol.Chem. 283:7346-7353 (2008a); Pérez et al., J Biol.Chem. 283:7346-7353 (2008b)). El producto del gen adhA de Zymomonas mobilis se ha demostrado que tiene actividad en un número de aldehidos que incluye formaldehído, acetaldehído, propionaldehido, butiraldeh do, y acroleína (Kinoshita et al., Appl Microbiol Biotechnol 22:249-254 (1985)) . Los alcoholes deshidrogenasa candidatos adicionales se codifican por bdh en C. saccharoperbutylacetonicum y Cbei_1722 , Cbei_2181 y Cbei_2421 en C. beijerinckii .

Las enzimas que presentan actividad 4-hidroxibutirato deshidrogenasa (EC 1.1.1.61) se han caracterizado en Ralstonia eutropha (Bravo et al., J". Forensic Sci. 49:379-387 (2004)), Clostridium kluyveri (Wolff et al., Protein Expr.Purif. 6:206-212 (1995)) y Arabidopsis thaliana (Breitkreuz et al., J. Biol.Chem. 278:41552-41556 (2003)) . La enzima A. thaliana se clonó y se caracterizó en levadura (Breitkreuz et al., J. Biol.Chem. 278:41552-41556 (2003)) . Aún otro gen es la alcohol deshidrogenasa adhl de Geobacillus thermoglucosidasius (Jeon et al., J Biotechnol 135 : 127-133 (2008) ) .

La 3 -Hidroxiisobutirato deshidrogenasa (EC 1.1.1.31) cataliza la oxidación reversible de 3-hidroxiisobutirato a metilmalonato semialdehído . Esta enzima participa en la degradación de valina, leucina e isoleucina y se ha identificado en bacterias, eucariotos, y mamíferos. La enzima codificada por P84067 de Thermus thermophilus HB8 se ha caracterizado estructuralmente (Lokanath et al., 352:905-17 (2005) ) . Genes adicionales que codifican esta enzima incluye 3hidh en Homo sapiens (Hawes et al., 324:218-228 (2000) ) y Oryctolagus cuniculus (Hawes et al., Methods Enzymol. 324:218-228 (2000) ; Chowdhury et al., Biosci .Biotechnol Bioche . 60:2043-2047 (1996) ) , mmsB en Pseudo onas aeruginosa y Pseudomonas putida, y dhat en Pseudomonas putida (Aberhart et al . , J Che . Soc . [Perkin 1] 6: 1404-1406 (1979) ; Chowdhury et al., Biosci . Biotechnol Biochem. 60:2043-2047 (1996) ; Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 67:438-441 (2003) ) .

A lo largo de esta solicitud se hace referencia a diversas publicaciones. La descripción de esta publicación en su totalidad, incluyen números de publicaciones de Banco de Genes y GI, se incorporan en la presente para referencia en estas aplicaciones para describir en forma más completa el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque esta invención se ha descrito con referencia a los ejemplos proporcionados en lo anterior, se debe entender que diversas modificaciones pueden hacerse sin apartarse del espíritu de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, tal trayectoria de etilenglicol comprende una serina descarboxilasa, una serina aminotrasferasa, una serina oxidoreductasa (desaminante) una hidroxipiruvato descarboxilasa, una glicolaldehído reductasa, una etanolamina aminotrasferasa, una etanolamina oxidoreductasa (desaminante) , una hidroxipiruvato reductasa o una glicerato descarboxilasa.

2. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 1, en donde el organismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de trayectoria de etilenglicol .

3. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 1, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una serina aminotransferasa o una serina oxidoreductasa (desaminante) ; una hidroxipiruvato descarboxilasa y una glicolaldehído reductasa.

4. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 1, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una serina aminotransferasa o una serina oxidoreductasa (desaminante) ; una hidroxipiruvato reductasa, y una glicerato descarboxilasa .

5. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 1, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una serina descarboxilasa, una etanolamina aminotransferasa, o una etanolamina oxidoreductasa (desaminante) , y una glicoaldehído reductasa.

6. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 1, en donde por lo menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterologo.

7. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 1, en donde el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza es un medio de cultivo sustancialmente anaerobico.

8. Un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, tal trayectoria de etilenglicol comprende una hidroxipiruvato descarboxilasa, una glicolaldehído reductasa, una hidroxipiruvato reductasa, una glicerato descarboxilasa, una 3-fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato cinasa, una 2-fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato-2-cinasa o una deshidrogenasa gliceraldehído .

9. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 8, en donde el organismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de trayectoria de etilenglicol.

10. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 8, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una hidroxipiruvato reductasa; una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa .

11. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 8, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una glicerato descarboxilasa.

12. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de las reivindicaciones 10 u 11, en donde la trayectoria de etilenglicol además comprende una 3-fosfoglicerato fosfatasa o una glicerato cinasa.

13. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de las reivindicaciones 10 u 11, en donde la trayectoria de etilenglicol además comprende una 2-fosfoglicerato fosfatasa o una glicerato-2-cinasa.

14. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de las reivindicaciones 10 u 11, en donde la trayectoria de etilenglicol además comprende un deshidrogenasa gliceraldehído .

15. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 8, en donde por lo menos un ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterologo.

16. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 8, en donde el organismo microbiano que no existe en la naturaleza es un medio de cultivo sustancialmente anaerobico.

17. Un organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, tal trayectoria de etilen glicol comprende una glioxilato carboligasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa, una glicolaldehído reductasa o una glicerato deshidrogenasa .

18. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 17, en donde el organismo microbiano comprende dos, tres, cuatro o cinco ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de trayectoria de etilenglicol.

19. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 17, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una glicerato deshidrogenasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa, y una glicolaldehído reductasa.

20. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 19, en donde la trayectoria de etilenglicol además comprende una 3-fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato cinasa, una 2-fosfoglicerato fosfatasa, una glicerato-2-cinasa o una gliceraldehído deshidrogenasa.

21. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 17, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una glioxilato carboligasa, una hidroxipiruvato isomerasa, una hidroxipiruvato descarboxilasa y una glicolaldehído reductasa .

22. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 17, en donde al menos un ácido nucleico exógeno es una ácido nucleico heterologo.

23. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 17, en donde el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza es un medio de cultivo sustancialmente anaerobico.

24. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de etilenglicol que comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de etilenglicol expresada en una cantidad suficiente para producir etilenglicol, cada trayectoria de etilenglicol comprende una glioxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa, una glicolil-CoA sintetasa; una glicolil-CoA reductasa (formación de aldehido), una glicolaldehído reductasa, una glicolato reductasa, una glicolato cinasa, una fosfotransglicolilasa, una glicolifosfato reductasa o una glicolil-CoA reductasa (formación de alcohol) .

25. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde el organismo microbiano comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez ácidos nucleicos exógenos cada uno codificando una enzima de trayectoria de etilenglicol.

26. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una glicoxilato reductasa; una glicolil-CoA transferasa o una glicolil-CoA sintetasa; una glicolil-CoA reductasa (formación de aldehido) y una glicolaldehído reductasa.

27. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una glioxilato reductasa; una glicolato reductasa, y una glicolaldehído reductasa .

28. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una glicoxilato reductasa, una glicolil-CoA transferasa o una glicolil-CoA sintetasa, y una glicolil-CoA reductasa ( formación de alcohol) .

29. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde tal trayectoria de etilenglicol comprende una glioxilato reductasa, una glicolato cinasa, una fosfotransglicolilosa, glicolil-CoA reductasa (formación de aldehido) y una glicolaldehído reductasa.

30. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una glioxilato reductasa, una glicolato cinasa, una fos otransglicolilasa y una glicolil-CoA reductasa (formación de alcohol) .

31. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde la trayectoria de etilenglicol comprende una glioxilato reductasa, glicolato cinasa, una glicolilfosfato reductasa y una glicolaldehído reductasa.

32. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde al menos un ácido nucleico exógeno es una ácido nucleico heterologo.

33. El organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de la reivindicación 24, en donde tal organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza se encuentra en un medio de cultivo sustancialmente anaerobico.

34. Un método para producir etilenglicol , que comprende cultivar el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza de cualquiera de las reivindicaciones 1,8, 17 y 24 bajo condiciones y para un período de tiempo suficiente para producir etilenglicol.

35. El método de la reivindicación 43, en donde el organismo microbiano que no se encuentra en la naturaleza se encuentra en un medio de cultivo sustancialmente anaerobico.