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MX2011004360A - Imitadores sinteticos de la defensa del hospedante y usos de los mismos. - Google Patents

Imitadores sinteticos de la defensa del hospedante y usos de los mismos.

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Publication number
MX2011004360A
MX2011004360A MX2011004360A MX2011004360A MX2011004360A MX 2011004360 A MX2011004360 A MX 2011004360A MX 2011004360 A MX2011004360 A MX 2011004360A MX 2011004360 A MX2011004360 A MX 2011004360A MX 2011004360 A MX2011004360 A MX 2011004360A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
compound
formula
tert
halo
independently
Prior art date
Application number
MX2011004360A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard W Scott
Dahui Liu
Yongjiang Xu
Haizhong Tang
William F Degrado
Bozena Korczak
Original Assignee
Polymedix Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Polymedix Inc filed Critical Polymedix Inc
Publication of MX2011004360A publication Critical patent/MX2011004360A/es

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Abstract

La presente invención proporciona compuestos de arilamida y métodos para hacer y utilizar los mismos como antibióticos.

Description

IMITADORES SINTETICOS DE LA DEFENSA DEL HOSPEDANTE Y USOS DE LOS MISMOS Cam o de la Invención La presente invención se dirige, en parte, a compuestos de arilamida y a métodos para hacer y utilizar los mismos .
Antecedentes de la Invención Los péptidos antimicrobianos (AMPs, por sus siglas en inglés) representan una primera línea de defensa contra microbios para muchas especies. Los AMPs son anfifilos catiónicos típicamente pequeños (12-80 aminoácidos) . Existen dos tipos de AMPs que comprenden péptidos sintetizados de manera ribosomal y no ribosomal . Se han identificado más de 700 AMPs y son generalmente hojas-ß oc-hélicas (magainina y cecropina) o ricas en disulfuro (bactenecina y defensina) . Aunque los péptidos están compuestos de muchas secuencias diferentes, sus propiedades fisicoquímicas son notablemente similares. Adoptan una arquitectura anfifílica con grupos con carga positiva segregados a un lado de la estructura secundaria y grupos hidrófobos en la superficie opuesta. En los mamíferos, los péptidos son producidos y secretados en la piel, superficies mucosas y neutrófilos y actúan localmente en respuesta a una infección. Esto es las propiedades fisicoquímicas totales que son responsables en gran medida de REF: 219702 la actividad biológica de estos péptidos.
Algunas actividades antimicrobianas de las proteínas de defensa del hospedante han sido vinculadas con acciones citotóxicas directas y la modulación del sistema inmune innato. Se plantea que sus actividades antimicrobianas directas implican efectos tanto de membrana como no de membrana. Los péptidos antimicrobianos han continuado siendo un arma efectiva contra una infección bacteriana a través del tiempo evolutivo indicando que su mecanismo de acción previene respuestas bacterianas las cuales conducen a resistencia contra sustancias tóxicas. Esta premisa es soportada pór datos experimentales directos que muestran que ninguna resistencia apreciable a la acción de los péptidos antimicrobianos ocurre después de múltiples pases en serie de bacterias en presencia de concentraciones sub-letales de los péptidos .
Existe una seria necesidad de desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos que ataquen nuevos objetivos para evadir las cuestiones de resistencia que limitan la utilidad de muchos antibióticos. Adicionalmente , estos nuevos agentes deben ejercer su actividad antimicrobiana por vía de mecanismos que las bacterias no resistirán de manera efectiva. Se ha desarrollado una serie de análogos no peptídicos que tienen muchas ventajas sobre los péptidos debido a su tamaño pequeño, lo cual incrementa la estabilidad y mejora la distribución en el tejido y la capacidad para afinar sus propiedades físicas para la optimización de la potencia y seguridad. Se descubrió que una serie de compuestos de arilamida que imitan las propiedades estructurales de los péptidos antimicrobianos tienen potentes actividades antibacterianas y amplias relaciones de selectividad contra células de mamífero.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona los compuestos de la Fórmula I I en donde: cada A es, independientemente, -C=0, -C=S o -CH2; cada D es, independientemente, O o S; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; cada R2 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; cada R3 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halo o halo- alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En algunas modalidades, cada A es -C=0.
En algunas modalidades, cada D es O.
En algunas modalidades, cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo o metoxi. En algunas modalidades, cada R1 es hidrógeno.
En algunas modalidades, cada R2 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R2 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi o halo. En algunas modalidades, cada R2 es hidrógeno .
En algunas modalidades, cada R3 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R3 es, independientemente, metilo, metoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R3 es, independientemente, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R3 es, independientemente, halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R3 es trifluorometilo .
En algunas modalidades, cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi o halo. En algunas modalidades, cada R4 es hidrógeno.
En algunas modalidades, cada A es, independientemente, -C=0, -C=S o CH2; cada D es, independientemente, 0 o S; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo, halometilo o haloetilo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halometilo; cada R3 es, independientemente, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo, halometilo o haloetilo.
En algunas modalidades, cada A es, independientemente, -C=0 o -C=S; cada D es, independientemente, 0 o S; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halometilo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno, halo o halometilo; cada R3 es, independientemente, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo, halometilo o haloetilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo, halometilo o haloetilo .
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es 0; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, halo o halometilo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo cada R3 es, independientemente, metilo, metoxi, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halometilo.
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es O; cada R1 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, metilo, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, halo o halometilo.
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es 0; cada R1 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno o halo.
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es O; cada R1 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, metilo, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, halo o halometilo.
En algunas modalidades, el compuesto es Compuesto A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos descritos anteriormente o una sal de cualquiera de los compuestos descritos anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona formulaciones que comprenden uno o más de los compuestos descritos anteriormente, en donde la formulación comprende solución salina, agua, una solución de ciclodextrina o una solución amortiguada de pH 3 a 9. En algunas modalidades, la formulación es una formulación no absorbida por la ruta oral. En algunas modalidades, la formulación comprende un excipiente seleccionado de agua purificada, propilenglicol , polietilenglicol 400 (PEG 400) , glicerina, DMA, etanol, alcohol bencílico, ácido cítrico/citrato de sodio (pH 3) , ácido cítrico/citrato de sodio (pH 5), HCl de tris (hidroximetil ) amino-metano (pH 7.0), solución salina al 0.9% y solución salina al 1.2% o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, la formulación comprende un excipiente seleccionado de propilenglicol , agua purificada y glicerina. En algunas modalidades, la formulación comprende un excipiente seleccionado de propilenglicol al 20% en p/v en solución salina, propilenglicol al 30% en p/v en solución salina, propilenglicol al 40% en p/v en solución salina, propilenglicol al 50% en p/v en solución salina, propilenglicol al 15% en p/v en agua purificada, propilenglicol al 30% en p/v en agua purificada, propilenglicol al 50% en p/v en agua purificada, propilenglicol al 30% en p/v y etanol al 5% en p/v en agua purificada, glicerina al 15% en p/v en agua purificada, glicerina al 30% en p/v en agua purificada, glicerina al 50% en p/v en agua purificada, KleptoseR al 20% en p/v en agua purificada, KleptoseMR al 40% en p/v en agua purificada y CaptisolMR al 25% en p/v en agua purificada.
La presente invención también proporciona métodos para preparar el Compuesto A que comprenden: a) hacer reaccionar el (R) - ( - ) -N-Boc - 3 -pirrolidinol con una base fuerte para formar una mezcla; hacer reaccionar adicionalmente la mezcla con 2-cloro-5- ( trifluorometil) -1, 3 -dinitrobenceno para formar un compuesto que tiene la Fórmula II b) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula II con un alcohol y un catalizador de metal de transición en presencia de hidrógeno para formar un compuesto de la Fórmula III ??; c) agregar el compuesto de la Fórmula III y ácido pirimidin- , 6 -dicarboxílico a una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1, 3 , 5-triazina y N-metilmorfolina para formar un compuesto de la Fórmula IV IV; d) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula IV con ácido butírico de N-Boc-guanidina para formar un compuesto de la Fórmula V V; y e) desproteger el compuesto de la Fórmula V para producir el Compuesto A. En algunas modalidades, en el paso a) la base fuerte es NaH; y en el paso b) el catalizador de metal de transición es Pd/C y el alcohol es etanol .
La presente invención también proporciona métodos alternos para preparar el Compuesto A que comprenden: a) desprotonar el éster terc-butílico del ácido (R) -3-hidroxipirrolidin-l-carboxílico y hacer reaccionar el compuesto resultante con 2-cloro-l, 3-dinitro-5-trifluorometilbenceno para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi) pirrolidin-1-carboxílico ; b) reducir el éster terc-butílico del ácido (R)-3- (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi) pirrolidin- 1-carboxílico en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición e hidrógeno para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2, 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi ) -pirrolidin-l-carboxílico; c) acoplar el éster terc-butílico del ácido (R)-3- (2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi) -pirrolidin-l-carboxílico con ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico en presencia de clorhidrato de 1- [ (3- (dimetilamino) -propil) ] -3-etilcarbodiimida para formar la bis- { [3-amino-2- ( (R) -1- ( erc-butoxicarbonil) pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] mida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico; d) hacer reaccionar la bis- { [3-amino-2- ( (R) -1-( terc-butoxicarbonil) pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico con ácido ( { [ ( erc-butoxicarbonil ) amino] [ ( erc-butoxicarbonil ) imino] -metil } amino) pentanoico en presencia de oxicloruro fosforoso para formar la bis- { [3- (5- ({[( erc-butoxicarbonil) amino] [ (terc-butoxicarbonil) imino] metil } amino) -pentanoilamino) -2- ( (R) -1- (terc-butoxicarbonil) -pirrolidin-3 -iloxi) -5-trifluorometil-fenil] -amida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico ; e) desproteger la bis- { [3 - (5- ({[( terc-butoxicarbonil ) amino] [ ( erc-butoxicarbonil ) imino] metil } -amino) -pentanoilamino) -2- ( (R) -1- (terc-butoxicarbonil) -pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] -amida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico para formar el bis- {[3- (5-guanidino-pentanoilamino) -2- ( (R) -pirrolidin-3 - iloxi ) -5-trifluorometil-fenil] -amida} tetraclorhidrato del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico crudo; y f) purificar el bis- { [3 - (5-guanidino-pentanoilamino) -2- ( (R) -pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] -amida} tetraclorhidrato del ácido pirimidin-4 , 6- dicarboxílico crudo por medio de, por ejemplo, la cromatografía de fase inversa.
La presente invención' también proporciona métodos alternos secundarios para preparar el Compuesto A que comprenden : a) desprotonar el éster ere- but í 1 ico del ácido ( R) - 3 - hidroxi i rrol idin- 1 - carboxí 1 i co y hacer reaccionar adicionalmente el compuesto resultante con 2-cloro-l, 3-dinitro-5-trif luoromet ilbenceno para formar el éster te re -but í 1 i co del ácido (R)-3-(2,6-dinitro-4-tri f luoromet i lfenoxi) irrolidin-1-carboxí 1 ico ; b) reducir el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi ) pirrolidin-1-carboxílico en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición e hidrógeno, para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi) -pirrolidin- 1-carboxílico; c) acoplar el éster terc-butílico del ácido (R)-3- (2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi ) -pirrolidin-l-carboxílico con ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico en presencia de clorhidrato de 1- [ (3- (dimetilamino) -propil) ] -3-etilcarbodiimida para formar la bis- { [3 -amino-2 - ( (R) - 1- ( terc-butoxicarbonil ) irrolidin-3 -iloxi) -5-trifluorometil -fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico ; d) hacer reaccionar la bis- { [3 -amino-2- ( (R) -1-( erc-butoxicarbonil) irrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico con ácido N-Cbz en presencia de cloruro de tionilo; e) reducir el compuesto resultante del paso d) en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición e hidrógeno; f) hacer reaccionar el compuesto resultante del paso e) con di-Boc-pirazol ; y g) desproteger el compuesto resultante del paso f) para producir el Compuesto A.
La presente invención también proporciona métodos para preparar una sal farmacéuticamente aceptable del Compuesto A que comprenden: a) hacer reaccionar el (R) - ( - ) -N-Boc- 3 -pirrolidinol con una base fuerte para formar una mezcla; hacer reaccionar adicionalmente la mezcla con 2-cloro-5- (trifluorometil) -1, 3 -dinitrobenceno para formar un compuesto que tiene la Fórmula II f^ Boc b) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula II con un alcohol y un catalizador de metal de transición en presencia de hidrógeno para formar un compuesto de la Fórmula III el) agregar el compuesto de la Fórmula III y ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico a una mezcla de 2-cloro-4,6- dimetoxi-1, 3 , 5-triazina y N-metilmorfolina para formar un compuesto de la Fórmula IV IV; o c2) agregar el compuesto de la Fórmula III y ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico a una mezcla de clorhidrato de 1- etil-3 - [3 - (dimetilamino) propil] -carbodiimida (EDCl) y piridina anhidra para formar un compuesto de la Fórmula IV IV; d) agregar el compuesto de la Fórmula IV con un ácido N-Cbz a una solución que comprende piridina anhidra, dimetilaminopropilamina y cualquiera de cloruro de tionilo, POCl3, (EtO)2POCl o cloruro de oxalilo para formar un compuesto de la Fórmula Va e) la hidrogenólisis del grupo Cbz del compuesto de la Fórmula Va para producir el compuesto de la Fórmula VI VI; f) proteger el compuesto de la Fórmula VI para producir el compuesto de la Fórmula VII VII; y g) desproteger el compuesto de la Fórmula VII para producir una sal farmacéuticamente aceptable del Compuesto A.
La presente invención también proporciona métodos para inhibir el crecimiento de un microbio que comprenden poner en contacto el microbio con cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
La presente invención también proporciona métodos para tratar a un mamífero que tiene una infección microbiana que comprenden administrar al mamífero necesitado de los mismos una cantidad efectiva anti-microbiana de cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En algunas modalidades, el microbio o infección microbiana es un aerobio gram-negativo, aerobio gram-positivo, anaerobio gram-negativo, anaerobio gram-positivo, micobacteria o levadura. En algunas modalidades, el aerobio gram-negativo es Escherichia coli, Citrobacter freundii, Citrobacter diverus, Citrobacter koseri, Enterobacter cloacae, Enterobacter faecalis, Klebsiella pneumonía, Klebsiella oxytoca, Morganella morganii , Providencia stuartii, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter junii, Acinetobacter lwoffii, Haemophilus influenzae, Stenotrophomonas maltophilia o Pseudo onas aeruginosa . En algunas modalidades, el aerobio gram-positivo es Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus colmii, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus warneri , Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus, Streptococcus mitis o Streptococcus oralis. En algunas modalidades, el anaerobio gram-negativo es Bacteroides fragilis . En algunas modalidades, el anaerobio gram-positivo es Clostridium difficile o Clostridium perfringens . En algunas modalidades, la micobacteria es Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canetti o Mycobacterium microti . En algunas modalidades, la levadura es Candida albicans o Candida krusei.
La presente invención también proporciona cualquiera de los compuestos descritos anteriormente para tratar una infección microbiana.
La presente invención también proporciona cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para el uso en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana.
La presente invención también proporciona el uso de cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para inhibir el crecimiento de un microbio.
La presente invención también proporciona el uso de cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para el tratamiento de una infección microbiana en un mamífero.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1A y la Figura IB muestran estudios de mortalidad a través del tiempo del Compuesto A frente a S. aureus ATCC27660 (la Figura IB es una vista ampliada de la Figura 1A) .
La Figura 2 muestra la asociación del pase de S. aureus con norfloxacina con una elevación significativa en los valores MIC por el pase 3 (4 diluciones dobles) tanto para MSSA como para MRSA.
La Figura 3 muestra la eficacia del Compuesto A frente a S. aureus en el Modelo de Carga en el Muslo de Ratones .
La Figura 4 muestra la eficacia del Compuesto A frente a vancomicina contra S. aureus en el Modelo de Carga en el Muslo de Ratas.
La Figura 5 muestra la eficacia del Compuesto A contra S. aureus en el Modelo de Sepsis en Ratones (cuyo título es "Supervivencia de PMX30063: S. aureus").
Descripción Detallada de la Invención Como se utiliza en este documento, el término "aproximadamente" significa ± 5% del valor que describe. Por ejemplo, aproximadamente 100 significa de 95 a 105.
Como se utiliza en este documento, los términos "alquilo de 1 a 3 átomos de carbono" , "alquilo de 1 a 4 átomos de carbono" y "(CH2) i-7" significan cadenas de hidrocarburo ramificadas o no ramificadas, monovalentes, saturadas que tienen de 1 a 3 átomos de carbono, de 1 a 4 átomos de carbono y de 1 a 7 átomos de carbono, respectivamente. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no están limitados a, grupos alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, 2-metil-l-propilo, 2-metil-2-propilo, 2-metil-l-butilo, 3-metil-l-butilo, 2-metil-3-butilo, 2-metil-l-pentilo, 2,2-dimetil-l-propilo, 3-metil-l-pentilo, 4-metil-l-pentilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 2,2-dimetil-l-butilo, 3 , 3 -dimetil-l-butilo, 2-etil-l-butilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo y heptilo. Un grupo alquilo puede ser sustituido o no sustituido por uno o dos sustituyentes adecuados.
Como se utiliza en este documento, los términos "alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono" y "alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono" significan -0-alquilo, en donde alquilo es como se definiera anteriormente. Un grupo alcoxi puede ser sustituido o no sustituido por uno o dos sustituyentes adecuados. La cadena de alquilo de un grupo alquiloxi es de 1 a 3 o de 1 a 4 átomos de carbono de longitud.
Como se utiliza en este documento, el término "halo" significa un halógeno tal como flúor, cloro, bromo o yodo .
Como se utiliza en este documento, los términos "halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono" y "halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono" significan grupos alquilo como se definiera anteriormente, en donde uno o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) átomos de hidrógeno son reemplazados por halo, como se definiera anteriormente.
Como se utiliza en este documento, "aislado" significa que los Compuestos de la Fórmula I se separan de otros componentes de ya sea (a) una fuente natural, tal como una célula, tal como un cultivo de bacterias o (b) una mezcla de reacción química, orgánica, sintética, tal como por medio de técnicas convencionales, los compuestos de la Fórmula I se purifican .
Como se utiliza en este documento, el término "mamífero" significa un roedor (es decir, un ratón, rata o cobayo), mono, gato, perro, vaca, caballo, cerdo o humano. En algunas modalidades, el mamífero es un humano.
Como se utiliza en este documento, el término "microbio" significa una bacteria, hongo, protozoario o virus .
Como se utiliza en este documento, la frase "sal (es) farmacéuticamente aceptable (s) " incluye, pero no está limitada a sales de grupos ácidos o básicos.
Como se utiliza en este documento, el término "purificado" significa que, cuando se aisla, el producto aislado contiene por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de un compuesto de la Fórmula I en peso del producto aislado.
Como se utiliza en este documento, la frase "sustituyente adecuado" significa un grupo que no nulifica la actividad sintética o farmacéutica de los compuestos de la Fórmula I o los productos intermedios útiles para prepararlos. Los ejemplos de sustituyentes adecuados incluyen, pero no están limitados a: alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquenilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquinilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, -CN, -OH, oxo, halo, -N02, -C02H, -NH2, -NH (alquilo (Ci-C4)), -N (alquilo (Ci-C4))2, -CHO, -CO (alquilo (Cx-C4) ) y -C02 (alquilo (C1-C4) ) . Una persona experta en el campo puede seleccionar fácilmente un sustituyente adecuado con base en la estabilidad y actividad farmacológica y sintética del compuesto de la Fórmula I .
Como se utiliza en este documento, la frase "cantidad efectiva anti-microbiana" de un compuesto que comprende la Fórmula I se mide por medio de la efectividad anti-microbiana del compuesto. En algunas modalidades, una cantidad efectiva anti-microbiana inhibe el crecimiento de un microbio particular por al menos 10%, por al menos 20%, por al menos 30%, por al menos 40%, por al menos 50%, por al menos 60%, por al menos 70%, por al menos 80%, por al menos 90% o por al menos 95%. En algunas modalidades, una "cantidad efectiva anti-microbiana" también es una "cantidad terapéuticamente efectiva" por medio de la cual el compuesto reduce o elimina por lo menos un efecto dañino de un microbio sobre un mamífero.
La presente invención proporciona los compuestos de la Fórmula I en donde : cada A es, independientemente, -C=0, -C=S o CH2; cada D es, independientemente, O o S; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; cada R2 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; cada R3 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En algunas modalidades, por lo menos un A es -C=0. En algunas modalidades, cada A es -C=0.
En algunas modalidades, por lo menos un D es 0. En algunas modalidades, cada D es 0.
En algunas modalidades, cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo o metoxi. En algunas modalidades, por lo menos un R1 es hidrógeno. En algunas modalidades, cada R1 es hidrógeno.
En algunas modalidades, cada R2 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R2 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi o halo. En algunas modalidades, por lo menos un R2 es hidrógeno. En algunas modalidades, cada R2 es hidrógeno .
En algunas modalidades, cada R3 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R3 es, independientemente, metilo, metoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R3 es, independientemente, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R3 es, independientemente, halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, por lo menos un R3 es trifluorometilo . En algunas modalidades, cada R3 es trifluorometilo .
En algunas modalidades, cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. En algunas modalidades, cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi o halo. En algunas modalidades, por lo menos un R4 es hidrógeno. En algunas modalidades, cada R4 es hidrógeno.
En algunas modalidades, cada A es, independientemente, -C=0 o -C=S; cada D es, independientemente, O o S; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo, halometilo o haloetilo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halometilo; cada R3 es, independientemente, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo, halometilo o haloetilo.
En algunas modalidades, cada A es, independientemente, -C=0 o -C=S; cada D es, independientemente, O o S; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halometilo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno, halo o halometilo; cada R3 es, independientemente, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo, halometilo o haloetilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, halo, halometilo o haloetilo .
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es 0; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, halo o halometilo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, metilo, metoxi, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halometilo.
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es O; cada R1 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, metilo, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, halo o halometilo.
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es O; cada R1 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno o halo.
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es 0; cada R1 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, metilo, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, halo o halometilo.
En algunas modalidades, cada A es -C=0; cada D es 0; cada R1 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, halo o halometilo.
En algunas modalidades, el compuesto es el Compuesto A o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los ejemplos adecuados de sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico y ácido trifluoroacético .
Los compuestos de la Fórmula I pueden contener uno o más centros quirales y/o enlaces dobles y, por lo tanto, pueden existir como estereoisómeros , tales como isómeros de enlace doble (es decir, isómeros geométricos) , enantiómeros o diastereómeros . De acuerdo con la invención, las estructuras químicas representadas en este documento, y por lo tanto los compuestos de la Fórmula I, incluyen todos los enantiomeros y estereoisómeros correspondientes del compuesto, es decir, tanto en forma estereoméricamente pura (por ejemplo, geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) como mezclas enantioméricas y estereoisoméricas . Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas se pueden resolver en sus enantiomeros o estereoisómeros componentes por medio de métodos bien conocidos, tal como la cromatografía de gas en fase quiral, cromatografía líquida de alto desempeño en fase quiral, cristalización del compuesto como un complejo de sal quiral o cristalización del compuesto en un solvente quiral. Los enantiomeros y estereoisómeros también se pueden obtener a partir de productos intermedios, reactivos y catalizadores estereomérica o enantioméricamente puros por medio de métodos de síntesis, asimétricos, bien conocidos.
Los compuestos de la Fórmula I incluyen además hidratos y solvatos .
Los compuestos que contienen una función amina también pueden formar N-óxidos. Una referencia en este documento a un compuesto que contiene una función amina también incluye el N-óxido. Donde un compuesto contiene varias funciones amina, uno o más de un átomo de nitrógeno puede ser oxidado para formar un N-óxido. Los ejemplos de N-óxidos incluyen N-óxidos de una amina terciaria o un átomo de nitrógeno de un heterociclo que contiene nitrógeno. Los N-óxidos se pueden formar por medio del tratamiento de la amina correspondiente con un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno o un per-ácido (por ejemplo un ácido peroxicarboxílico) (véase, Advanced Organic Chemistry, por Jerry March, 4a Edición, Wiley Interscience) .
En algunas modalidades, los compuestos de la Fórmula I se aislan y/o purifican.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos descritos anteriormente, o una o más sales de los mismos, y un portador farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, composiciones no absorbidas por la ruta oral. Las composiciones adecuadas también incluyen, pero no están limitadas a, solución salina, agua, soluciones de ciclodextrina y soluciones amortiguadas de pH 3-9.
Los compuestos descritos en este documento, incluyendo el Compuesto A, o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se pueden formular con numerosos excipientes que incluyen, pero no están limitados a, agua purificada, propilenglicol , PEG 400, glicerina, DMA, etanol, alcohol bencílico, ácido cítrico/citrato de sodio (pH 3), ácido cítrico/citrato de sodio (pH 5) , HCl de tris (hidroximetil) amino-metano (pH 7.0), solución salina al 0.9% y solución salina al 1.2% y cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, el excipiente se selecciona de propilenglicol , agua purificada y glicerina.
En algunas modalidades, el excipiente es un sistema de múltiples componentes seleccionado de propilenglicol al 20% en p/v en solución salina, propilenglicol al 30% en p/v en solución salina, propilenglicol al 40% en p/v en solución salina, propilenglicol al 50% en p/v en solución salina, propilenglicol al 15% en p/v en agua purificada , propilenglicol al 30% en p/v en agua purificada , propilenglicol al 50% en p/v en agua purificada, propilenglicol al 30% en p/v y etanol al 5% en p/v en agua purificada, glicerina al 15% en p/v en agua purificada, glicerina al 30% en p/v en agua purificada, glicerina al 50% en p/v en agua purificada, KleptoseMR al 20% en p/v en agua purificada, KleptoseMR al 40% en p/v en agua purificada y CaptisolMR al 25% en p/v en agua purificada. En algunas modalidades, el excipiente se selecciona de propilenglicol al 50% en p/v en agua purificada, glicerina al 15% en p/v en agua purificada, KleptoseMR al 20% en p/v en agua purificada, KleptoseMR al 40% en p/v en agua purificada y CaptisolMR al 25% en p/v en agua purificada. En algunas modalidades, el excipiente se selecciona de KleptoseMR al 20% en p/v en agua purificada, propilenglicol al 20% en p/v en agua purificada y glicerina al 15% en p/v en agua purificada.
En algunas modalidades, la formulación comprende 50 mg/mL del Compuesto A en KleptoseMR al 20% en p/v en agua purificada.
En algunas modalidades, la formulación se puede liofilizar hasta un sólido y se puede reconstituir con, por ejemplo, agua antes del uso.
Cuando se administran a un mamífero (por ejemplo, a un animal para el uso veterinario o a un humano para el uso clínico) los compuestos de la Fórmula I se pueden administrar de forma aislada. Alternativamente, los compuestos de la Fórmula I se pueden administrar junto con (es decir, como una formulación combinada o como formulaciones separadas) otros antibióticos, tales como, por ejemplo: 1) inhibidores de la síntesis de proteínas que incluyen, pero no están limitados a, amikacina, anisomicina, apramicina, azitromicina, blasticidina S, brefeldina A, butirosina, cloranfenicol , clortetraciclina, clindamicina, clotrimazol , cicloheximida, demeclociclina , dibekacina, dihidroestreptomicina, doxiciclina, duramicina, emetina, eritromicina, ácido fusídico, G 418, gentamicina, ácido helvólico, higromicina B, jósamicina, kanamicina, kirromicina, lincomicina, meclociclina, mepartricina, midecamicina, minociclina, neomicina, netilmicina, nitrofurantoina, nourseotricina, oleandoraicina, oxitetraciclina, paromomicina, puromicina, rapamicina, ribostamicina, rifampicina, rifamicina, rosamicina, sisomicina, espectinomicina, es iramicina, estreptomicina, tetraciclina , tianfenicol, tioestrepton, tobramicina, tunicamicina , tilosina, viomicina y virginiamicina ; 2) agentes que interfieren con la síntesis del ADN que incluyen, pero no están limitados a, camptotecina, 10-desacetilbaccatina III, azacitidina, 7-aminoactinomicina D, 8-quinolinol , 9-dihidro-13-acetilbaccatina III, aclarubicina, actinomicina D, actinomicina I, actinomicina V, bafilomicina Al, bleomicina, capreomicina, cromomicina, cinoxacina, ciprofloxacino, dicloruro de cis-diaminoplatino (II) , coumermicina Al, ácido L (+) -láctico, citocalasina B, citocalasina D, dacarbazina, daunorrubicina , distamicina A, doxorrubicina, equinomicina, enrofloxacino, etoposida, flumequina, formicina, fumagilina, ganciclovir, gliotoxina, lomefloxacino, metronidazol , mitramicina A, mitomicina C, ácido nalidixico, netropsina, nitrofurantoina, nogalamicina, nonactina, novobiocina, ofloxacino, ácido oxolínico, paclitaxel, fenazina, fleomicina, ácido pipemidico, rebecamicina, sinefungina, estreptonigrina, estreptozocina, succinilsulfatiazol , sulfadiazina, sulfadimetoxina, sulfaguanidina purum, sulfametazina, sulfamonómetoxina, sulfanilamida, sulfaquinoxalina, sulfasalazina, sulfatiazol, trimetoprima, tubercidina, 5-azacitidina, cordicepina y formicina A; 3) agentes que interfieren con la síntesis de la pared celular que incluyen, pero no están limitados a, ácido (+) -6-aminopenicilánico, ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, bacitracina, carbenicilina, cefaclor, cefamandol, cefazolina, cefmetazol, cefoperazona, cefotaxima, cefsulodina, ceftriaxona, cefalexina, cefalosporina C, cefalotina, cefradina, cloxacilina, D-cicloserina, dicloxacilina, D-penicilamina, econazol, etambutol, lisostafina, moxalactam, nafcilina, nikomicina Z, nitrofurantoina , oxacilina, penicílico, penicilina G, feneticilina, ácido fenoximetilpenicilínico, fosfomicina, ácido pipemídico, piperacilina, ristomicina y vancomicina ; 4) agentes que interfieren con la permeabilidad de la membrana celular (ionóforos) que incluyen, pero no están limitados a, 2-mercaptopiridina, 4 -bromocalcimicina A23187, alameticina, anfotericina B, calcimicina A23187, clorhexidina, clotrimazol, colistina, econazol, hidrocortisona, filipina, gliotoxina, gramicidina A, gramicidina C, ionomicina, lasalocid A, lonomicina A, monensina, N- (6-aminohexil) -5 -cloro- 1-naftalensulfonamida , narasina, nigericina, nisina, nonactina, nistatina, fenazina, pimaricina, polimixina B, DL-penicilamina , polimixina B, prazicuantel , salinomicina, surfactina y valinomicina ; 5) inhibidores de enzimas que incluyen, pero no están limitados a, ácido (+) -úsnico, (±) -miconazol , (S) - (+) -camptotecina , 1-desoximanoj irimicina, N-óxido de 2-heptil-4-hidroxiquinolina, cordicepina, 1, 10-fenantrolina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, 8-quinolinol , antimicina, antipaina, ascomicina, azaserina, bafilomicina, cerulenina, cloroquina, cinoxacina, ciprofloxacino, mevastatina, concanamicina A, concanamicina C, coumermicina Al, ácido L (+) -láctico, ciclosporina A, econazol, enrofloxacino, etopósido, flumequina, formicina A, furazolidona, ácido fusarico, geldanamicina , gliotoxina, gramicidina A, gramicidina C, herbimicina A, indometacina, irgasan, lomefloxacino, ácido micofenólico, mixotiazol, N-(6-aminohexil) -5-cloro-l-naftalensulfonamida, ácido nalidixico, netropsina, niclosamida, nikomicina , N-metil-1-deoxinoj irimicina, nogalamicina, nonactina, novobiocina, ofloxacino, oleandomicina, oligomicina, ácido oxolínico, piericidina A, ácido pipemídico, radicicol, rapamicina, rebecamicina, sinefungina, estaurosporina, estigmatelina, succinilsulfatiazol , succinilsulfatiazol , sulfadiazina, sulfadimetoxina, sulfaguanidina, sulfametazina, sulfamonómetoxina, sulfanilamida, sulfaquinoxalina, sulfasalazina, sulfatiazol, triacsina C, trimetoprima y vineomicina Al; y 6) modificadores de la membrana que incluyen, pero no están limitados a, paracelsina.
En algunas modalidades, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o un gobierno estatal o listada en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para el uso en animales y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente con el cual se administra un compuesto de la Fórmula I. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, inclusive aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. Los portadores farmacéuticos también pueden ser solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizadores, de espesamiento, lubricantes y colorantes. Cuando se administran a un humano, los compuestos de la Fórmula I y los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser estériles. El agua es un portador adecuado cuando el compuesto de la Fórmula I se administra por la ruta intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados también incluyen excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, las presentes composiciones también pueden contener cantidades menores de agentes de humedecimiento o emulsificación o agentes amortiguadores de pH.
Las composiciones descritas en este documento pueden tomar la forma de una solución, suspensión, emulsión, tableta, pildora, gránulo, cápsula, cápsula que contiene un líquido, polvo, formulación de liberación sostenida, supositorio, aerosol, pulverización o cualquier otra forma adecuada para el uso. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, A.R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Co .
En una modalidad, los compuestos de la Fórmula I se formulan de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración a humanos. Típicamente, los compuestos de la Fórmula I son soluciones en un amortiguador acuoso, isotónico, estéril. Donde sea necesario, las composiciones también pueden incluir un agente de solubilización. Las composiciones para la administración intravenosa pueden incluir opcionalmente un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la invención. Generalmente, los ingredientes se suministran ya sea por separado o se mezclan juntos en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un . polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un contenedor sellado herméticamente tal como una ampolleta o un sobrecito indicando la cantidad del agente activo. Donde el compuesto de la invención debe ser administrado por medio de una infusión, se puede proporcionar, por ejemplo, con una botella de infusión que contiene agua estéril de grado farmacéutico o solución salina. Donde el compuesto de la Fórmula I se administra por medio de una inyección, se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.
Los compuestos de la Fórmula I y las composiciones que comprenden los mismos, se pueden administrar por la ruta oral. Los compuestos y composiciones para el suministro oral pueden estar en la forma de, por ejemplo, tabletas, pastillas rombóticas, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elíxires. Las composiciones administradas por la ruta oral pueden contener uno o más agentes opcionales, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartame o sacarina; agentes saborizantes tales como menta, aceite de gaulteria o cereza; agentes colorantes y agentes conservadores, para proporcionar una preparación farmacéuticamente apetitosa. Por otra parte, donde están en forma de tableta o pildora, las composiciones pueden ser revestidas para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal proporcionando en consecuencia una acción sostenida durante un período de tiempo prolongado. Las membranas selectivamente permeables que rodean un compuesto impulsor osmóticamente activo también son adecuadas para los compuestos de la Fórmula I administrados por la ruta oral. Las composiciones orales pueden incluir vehículos estándar tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etcétera. Estos vehículos son adecuadamente de grado farmacéutico.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de dosificación unitaria. En esta forma, la composición se puede dividir en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación empacada, el empaque contiene cantidades discretas de las preparaciones, por ejemplo, tabletas empacadas, cápsulas y polvos en frasquitos o ampolletas. La forma de dosificación unitaria también puede ser una cápsula, sobrecito o tableta misma o puede ser el número apropiado de cualquiera de estas formas empacadas .
La presente invención también proporciona métodos para preparar el Compuesto A que comprenden: la) hacer reaccionar el (R) - ( - ) -N-Boc-3 - pirrolidinol con una base fuerte para formar una mezcla; hacer reaccionar adicionalmente la mezcla con 2-cloro-5-(trifluorometil) -1, 3 -dinitrobenceno para formar un compuesto que tiene la Fórmula II ?; Ib) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula II con un alcohol y un catalizador de metal de transición en presencia de hidrógeno para formar un compuesto de la Fórmula III ni; le) agregar el compuesto de la Fórmula III y ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico a una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1, 3 , 5-triazina y N-metilmorfolina para formar un compuesto de la Fórmula IV IV; Id) hacer - reaccionar el compuesto de la Fórmula IV con ácido butírico de N-Boc-guanidina para formar un compuesto de la Fórmula V V; y le) desproteger el compuesto de la Fórmula V para producir el Compuesto A.
En algunas modalidades, en el paso a) la base fuerte es NaH; y en el paso b) el catalizador de metal de transición es Pd/C y el alcohol es etanol . En particular, este método se describe posteriormente con mayor detalle en el Ejemplo 1.
La presente invención también proporciona métodos alternos para preparar el Compuesto A que comprenden: a) desprotonar el éster terc-butílico del ácido (R) -3-hidroxipirrolidin-l-carboxílico y hacer reaccionar el compuesto resultante con 2-cloro-l, 3-dinitro-5-trifluorometilbenceno para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3 - (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi ) pirrolidin- 1-carboxílico ; b) reducir el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi ) pirrolidin- 1-carboxílico en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición e hidrógeno para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2, 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi) -pirrolidin-1-carboxílico; c) acoplar el éster terc-butílico del ácido (R)-3-(2 , 6-diamino-4-trifluorometilfenoxi) -pirrolidin-l-carboxílico con ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico en presencia de clorhidrato de 1- [ (3 - (dimetilamino) -propil) ] -3 -etilcarbodiimida para formar la bis- { [3 -amino-2 -( (R) -1- ( terc-butoxicarbonil ) pirrolidin-3 -iloxi) - 5-trifluorometil -fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico; d) hacer reaccionar la bis- { [3-amino-2- ( (R) -1- ( terc-butoxicarbonil) pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico con ácido ({ [( terc-butoxicarbonil) amino] [( erc-butoxicarbonil ) imino] -metil } amino) entanoico en presencia de oxicloruro fosforoso para formar la bis-{ [3- (5- ({[ (terc-butoxicarbonil) amino] [ (fcerc-butoxicarbonil) imino] metiljamino) -pentanoilamino) -2- ( (R) -1- (fcerc-butoxicarbonil) -pirrolidin-3 -iloxi) -5-trifluorometil-fenil] -amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico; e) desproteger la bis- { [3 -( 5- ({[( terc-butoxicarbonil ) amino] [ (terc-butoxicarbonil) imino] metil} -amino) -pentanoilamino) -2- ( (R) -1- (terc-butoxicarbonil) -pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] -amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico para formar el bis- {[3- (5- guanidino-pentanoilamino) -2- ( (R) -pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] -amida}tetraclorhidrato del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico crudo; y f) purificar el bis- { [3- (5-guanidino-pentanoilamino) -2- ( (R) -pirrolidin-3 - iloxi ) -5-trifluorometil-fenil] -amida}tetraclorhidrato del ácido pirimidin-4, 6-dicarboxílico crudo por medio de la cromatografía de fase inversa .
En algunas modalidades, en el paso b) el catalizador de metal de transición es Pd/C y el alcohol es etanol . En particular, este método se describe posteriormente con mayor detalle en el Ejemplo 2.
La presente invención también proporciona métodos alternos secundarios para preparar el Compuesto A que comprenden: a) desprotonar el éster terc-butílico del ácido (R) -3 -hidroxipirrolidin-1-carboxílico y hacer reaccionar adicionalmente el compuesto resultante con 2-cloro-l,3-dinitro-5-trifluorometilbenceno para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6-dinitro-4 -trifluorometilfenoxi) pirrolidin- 1-carboxílico ; b) reducir el éster terc-butílico del ácido (R)-3- (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi ) pirrolidin- 1-carboxílico en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición, e hidrógeno, para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi) -pirrolidin-l-carboxílico; c) acoplar el éster terc-butílico del ácido (R)-3-(2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi ) -pirrolidin-l-carboxílico con ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico en presencia de clorhidrato de 1- [ (3- (dimetilamino) -propil) ] -3-etilcarbodiimida para formar la bis- { [3-amino-2- ( (R) -1- ( terc-butoxicarbonil) pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico ; d) hacer reaccionar la bis- { [3-amino-2- ( (R) -1- ( terc-butoxicarbonil) pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico con ácido N-Cbz en presencia de cloruro de tionilo; e) reducir el compuesto resultante del paso d) en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición e hidrógeno; f) hacer reaccionar el compuesto resultante del paso e) con di-Boc-pirazol ; y g) desproteger el compuesto resultante del paso f) para producir el Compuesto A.
En algunas modalidades, en los pasos b) y e) el catalizador de metal de transición es Pd/C y el alcohol es etanol . En particular, este método se describe posteriormente con mayor detalle en el Ejemplo 3.
Una persona experta en el campo será capaz de sustituir los reactivos adecuados por los reactivos citados en los métodos descritos en este documento para producir el Compuesto A así como también los compuestos adicionales de la Fórmula I .
La presente invención también proporciona métodos para preparar una sal farmacéuticamente aceptable del Compuesto A que comprenden: a) hacer reaccionar el (R) - (-) -N-Boc-3 -pirrolidinol con una base fuerte para formar una mezcla; hacer reaccionar adicionalmente la mezcla con 2-cloro-5- (trifluorometil) -1, 3-dinitrobenceno para formar un compuesto que tiene la Fórmula ?; b) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula II con un alcohol y un catalizador de metal de transición en presencia de hidrógeno para formar un compuesto de la Fórmula ni; el) agregar el compuesto de la Fórmula III y ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico a una mezcla de 2-cloro-4,6- dimetoxi-l, 3 , 5-triazina y N-metilmorfolina para formar un compuesto de la Fórmula IV IV; o c2) agregar el compuesto de la Fórmula III y ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico a una mezcla de clorhidrato de 1-etil-3- [3- (dimetilamino) propil] -carbodiimida (EDC1) y piridina anhidra para formar un compuesto de la Fórmula IV d) agregar el compuesto de la Fórmula IV con un ácido N-Cbz a una solución que comprende piridina anhidra, dimetilaminopropilamina y cualquiera de cloruro de tionilo, P0C13, (EtO)2POCl o cloruro de oxalilo para formar un compuesto de la Fórmula Va Va; e) la hidrogenólisis del grupo Cbz del compuesto de Fórmula Va para producir el compuesto de la Fórmula VI; f) proteger el compuesto de la Fórmula VI para producir el compuesto de la Fórmula VII VII; y g) desproteger el compuesto de la Fórmula VII para producir una sal farmacéuticamente aceptable del Compuesto A.
La preparación de los compuestos de la Fórmula I puede implicar la protección y desprotección de varios grupos químicos. La necesidad de protección y desprotección y la selección de los grupos protectores apropiados pueden ser determinadas fácilmente por una persona experta en el campo. La química de los grupos protectores se puede encontrar, por ejemplo, en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed. , Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1999) , el cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad.
La presente invención también proporciona métodos para inhibir el crecimiento de un microbio que comprenden poner en contacto el microbio con uno o más compuestos descritos anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En algunas modalidades, el compuesto de la Fórmula I puede actuar como un agente antiséptico para limpiar superficies, tal como en, por ejemplo, cocinas y baños. En estas modalidades, el compuesto de la Fórmula I se puede formular para estos usos por medio de procedimientos bien conocidos para el artífice experto.
La presente invención también proporciona métodos para tratar a un mamífero que tiene una infección microbiana que comprenden administrar al mamífero necesitado de los mismos una cantidad efectiva anti -microbiana de uno o más compuestos descritos anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En algunas modalidades, el mamífero puede estar diagnosticado previamente con una infección microbiana antes del tratamiento. En algunas modalidades, puede no haberse hecho una diagnosis formal; en estas modalidades, se puede sospechar que el mamífero tiene una infección microbiana para la cual se reconoce que el tratamiento es deseable.
En una modalidad, "tratamiento" o "tratar" se refiere al alivio de una infección microbiana, o por lo menos un síntoma discernible de la misma; o al alivio de por lo menos un parámetro físico mesurable, no necesariamente discernible por el paciente; o a la inhibición del progreso de una infección microbiana; o al retardo del comienzo de una infección microbiana.
En algunas modalidades, el microbio es, o la infección microbiana es debido a, un aerobio gram-negativo, aerobio gram-positivo, anaerobio gram-negativo, anaerobio gram-positivo o levadura. En algunas modalidades, el aerobio gram-negativo se selecciona de, pero no está limitado a, Escherichia coli, Citrobacter freundii , Citrobacter diverus, Citrobacter koseri, Enterobacter cloacae, Enterobacter faecalis, Klebsiella pneumonía, Klebsiella oxytoca, Morganella morganii , Providencia stuartii , Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Acinetohacter haemolyticus, Acinetojbacter junii, Acinetobacter lwoffii, Haemophilus influenzae, Stenotrophomonas maltophilia y Pseudomonas aeruginosa . En algunas modalidades, el aerobio gram-positivo se selecciona de, pero no está limitado a, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus colmii, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus warneri, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus, Streptococcus mitis y Streptococcus oralis. En algunas modalidades, el anaerobio gram-negativo es Bacteroides fragilis . En algunas modalidades, el anaerobio gram-positivo es Clostridium difficile o Clostridium perfringens. En algunas modalidades, la micobacteria es Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canetti o Mycobacterium microti. En algunas modalidades, la levadura se selecciona de, pero no está limitado a, Candida albicans y Candida krusei.
En algunas modalidades, el microbio es una cepa de bacterias resistente a antibióticos, tal como aquellas citadas en los Ejemplos posteriores.
Los compuestos de la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y las composiciones que comprenden los mismos, se pueden administrar en una variedad de rutas, tales como, por ejemplo, por medio de la infusión o inyección de bolos, y se pueden administrar junto con otro agente biológicamente activo, tal como otro antibiótico. La administración puede ser sistémica o local. Se conocen varios sistemas de suministro, por ejemplo, encapsulamiento en liposomas, micropartículas , microcápsulas , cápsulas, etcétera, y se pueden utilizar para administrar un compuesto de la Fórmula I. Las rutas de administración incluyen, pero no están limitadas a, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral , intravaginal , transdérmica , rectal, pulmonar, por medio de inhalación o tópica, particularmente a los oídos, nariz, ojos o piel. En algunas modalidades, las rutas de administración adecuadas incluyen intravenosa, tópica y subcutánea. La ruta de administración deseada se deja a discreción del practicante y dependerá, en parte, del sitio de la infección microbiana y la condición médica del mamífero o humano que es tratado. En la mayoría de los casos, la administración puede dar por resultado la liberación de los compuestos de la Fórmula I en el torrente sanguíneo.
En algunas modalidades, puede ser deseable administrar uno o más compuestos de la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, localmente a un área necesitada de tratamiento. Esto se puede lograr, por ejemplo, y no a manera de limitación, por medio de una infusión local durante la cirugía, la aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con un aposito después de la cirugía, por medio de una inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, en donde el implante es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas de elastómero silicónico o fibras.
La cantidad de un compuesto de la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que será efectiva en el tratamiento de una infección microbiana particular dependerá del carácter del trastorno o condición, y se puede determinar por medio de técnicas clínicas estándar. Además, se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que es empleada en las composiciones también dependerá de la ruta de administración y la seriedad de la infección y debe ser decidida de acuerdo con el juicio del practicante y cada circunstancia del paciente. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para la administración son en general de aproximadamente 0.001 miligramos a aproximadamente 200 miligramos por kilogramo de peso corporal. En algunas modalidades, la dosis es de aproximadamente 0.01 miligramos a aproximadamente 70 miligramos por kilogramo de peso corporal, o de aproximadamente 0.1 miligramos a aproximadamente 50 miligramos por kilogramo de peso corporal, o de aproximadamente 0.5 miligramos a aproximadamente 20 miligramos por kilogramo de peso corporal, o de aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 10 miligramos por kilogramo de peso corporal. En algunas modalidades, la dosis es de aproximadamente 5 miligramos por kilogramo de peso corporal. Las cantidades de dosificación descritas en este documento se refieren a las cantidades totales administradas; es decir, si se administra más de un compuesto de la Fórmula I, las dosificaciones corresponden a la cantidad total de los compuestos de la Fórmula I administrados. Las composiciones pueden contener de 10% a 95% en peso de ingrediente activo. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales. Estos modelos animales y sistemas son bien conocidos en el campo.
La presente invención también proporciona uno o más compuestos descritos anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos descritos anteriormente, para tratar una infección microbiana.
La presente invención también proporciona uno o más compuestos descritos anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos descritos anteriormente, para el uso en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana.
La presente invención también proporciona el uso de uno o más compuestos descritos anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos descritos anteriormente, en la inhibición del crecimiento de un microbio .
La presente invención también proporciona el uso de uno o más compuestos descritos anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos descritos anteriormente, en el tratamiento de una infección microbiana en un mamífero.
Con el propósito de que la invención dada a conocer en este documento se pueda entender más eficientemente, a continuación se proporcionan ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos son para propósitos ilustrativos únicamente y de ninguna manera se deben interpretar como limitantes de la invención. Por todos estos ejemplos, las reacciones de clonación moleculares, y otras técnicas de ADN recombinante estándar, se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos descritos en Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor Press (1989), utilizando reactivos comercialmente disponibles, excepto donde se observa de otra manera.
Ej emplos En resumen, los resultados generados a partir de los ejemplos posteriores indican que el Compuesto A es activo contra Staphylococci spp. y otros organismos Gram-positivos y Gram-negativos . Por ejemplo, las selecciones de susceptibilidad se realizaron contra 150 productos aislados de S. aureus y Staphylococci negativos en coagulasa con susceptibilidades antibacterianas definidas para otros productos antimicrobianos. Generalmente, los valores MIC90 de 0.5 a 2.0 µ9/??1 se han obtenido en una selección de 150 organismos Staphylococci y no fueron afectados por los fenotipos de susceptibilidad para otros antibióticos. El pase en serie de las cepas susceptibles (MSSA ATCC 29213) y resistentes (MRSA ATCC 33591) a meticilina de S. aureus a concentraciones MIC 0.5x durante 17 pases no dio por resultado ningún cambio en los valores MIC. Generalmente, el Compuesto A fue bactericida con muertes a través del tiempo que variaban de 30 minutos a 6 horas.
El Compuesto A fue eficaz in vivo en un modelo de carga en el muslo de ratones contra MSSA 29213 y MRSA 33591 y en el modelo de peritonitis/sepsis en ratones contra MSSA 27660. En el modelo de carga en el muslo de ratones con MSSA 27660, el Compuesto A logró reducciones 24 horas después de la infección de hasta 410 en cfu/muslo en relación con los ratones de control, infectados, no tratados en dosificaciones que fueron bien toleradas en estudios de toxicidad de dosis repetidas. De esta manera, se observó una eficacia contundente contra MSSA y MRSA en un modelo de carga en el muslo de ratones y contra MSSA en un modelo de carga en el muslo de ratas y un modelo de peritonitis en ratones. El Compuesto A fue estable en presencia de plasma y hepatocitos aislados de múltiples especies.
El Compuesto A fue tolerado mejor en los estudios de toxicidad aguda cuando se administró por medio de una infusión IV. La MTD (bolos IV) para el Compuesto A en el ratón (30 mg/kg) es significativamente más alta que la dosis de eficacia estática en el modelo de carga en el muslo (2-4 mg/kg) .
El Compuesto A está actualmente en pruebas clínicas en humanos Fase 1 para el desarrollo de un agente pan-Staphylococcal IV.
Ejemplo 1: Síntesis del Compuesto A Paso 1 : El hidruro de sodio (1.12 g, 60% en aceite mineral, 28 mmol) se agregó en una porción a una solución en DMF anhidro (24 mL) de (R) - (-) -N-Boc-3 -pirrolidinol (5.0 g, 27.6 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó durante 15 minutos adicionales . Esta mezcla luego se agregó gota a gota a una solución en DMF (20 mL) de 2-cloro-5- (trifluorometil) -1 , 3-dinitrobenceno (7.45 g, 27.6 mmol) a 0°C. La solución de color rojo intenso se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se enfrió rápidamente por medio de agua helada y se extrajo por medio de acetato de etilo. La capa orgánica se lavó por medio de salmuera y agua y se secó sobre Na2S04. Después de la remoción del solvente, el residuo se purificó por medio de una columna con evaporación instantánea (acetato de etilo/hexanos = ¼, v/v) . El rendimiento fue 54%.
Paso 2 : El 3- (4- (trif luororaetil) -2, 6-dinitrofenoxi) - pirrolidin- 1 - carboxi lato de ( R) - tere -but i lo (4.84 g, 9.8 mmol) y Pd/C (0.78 g, 10% sobre carbón) y etanol (140 mL) se colocaron en una botella Parr. La mezcla se evaporó instantáneamente bajo hidrógeno tres veces y se agitó bajo 2.808 kg/cm2 (40 psi) de hidrógeno a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla se filtró a través de celite. La torta se lavó dos veces con etanol (2x20 mL) . El producto filtrado se evaporó bajo vacío. Un sólido de color blanquecino se obtuvo y se utilizó como tal para la reacción subsecuente. El rendimiento fue 100%.
Paso 3 : La 2-cloro-4 , 6-dimetoxi-l, 3 , 5-triazina (5.97 g, 34 mmol) se agitó en THF anhidro (200 mL) . Se agregó la N- metilmorfolina (7.5 mi, 68 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, el 3-(2 , 6-diamino-4- ( trifluoromet il ) fenoxi) pirrolidin-1-carboxilato de (R) -tere-butilo (10.84 g, 30 mmol) y el ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico (2.48 g, 14.8 mmol) se agregaron. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se evaporó completamente in vacuo. Se agregó agua (250 mL) y la mezcla se agitó durante 4 horas. Después de la filtración, la torta de color amarillo se lavó con agua (3x100 mL) y se agitó en agua (250 mL) durante 4 horas. El procedimiento de filtración y lavado se repitió dos veces. El sólido se secó en el aire y se agitó en diclorometano (20 mL) durante 30 minutos, seguido por un tratamiento ultrasónico durante 1 hora. Después de la filtración, la torta de color amarillo se lavó rápidamente con diclorometano frío (2x10 mL) . El producto (10.0 g, rendimiento: 79.1%) se utilizó como tal para la reacción subsecuente .
Paso 4 : El material de partida (6.5 g, 7.6 mmol) , ácido butírico de N - Boc -guanidina (10.9 g, 30.4 mmol) se agitaron en piridina anhidra (40 mL) a 0°C. El P0C13 (2.78 mL , 30.4 mmol) en piridina (4 mL) se agregó gota a gota. La mezcla resultante se agitó a 0°C durante 1.5 horas. La mezcla de reacción se evaporó bajo vacío. Se agregó agua (140 mL) al residuo. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (260 mL) . La capa orgánica se lavó con salmuera (100 mL) y se secó sobre Na2S04. Después de la evaporación, el residuo se purificó por medio de una columna (Eluyente: acetato de et ilo/hexanos/diclorometano = 1/1/1, v/v/v luego 2%~4% de metanol en diclorometano) . El rendimiento fue 29.1%. El valor Rf fue el mismo que la muestra estándar que se caracterizó por medio de RM .
Paso 5 : El material de partida (3.4 g, 2.3 mmol) se agitó en HCl 4N en dioxano (34 mL) a temperatura ambiente durante toda la noche. El solvente se retiró bajo vacío. El residuo se tituló en éter. El sólido se filtró y se purificó por medio de una columna C18 de fase inversa C18. Un sólido de color amarillo claro se obtuvo como el producto con una pureza de 98% (HPLC) ; LC-MS (M+l): 937. Rendimiento: 51%.
Paso 1: El éster terc-butílico del ácido (R) -3 droxipirrolidin-l-carboxílico es desprotonado con tere butóxido de potasio (KOtBu) en tetrahidrofurano (THF) . El anión resultante se hace reaccionar con 2-cloro-l,3-dinitro-5-trifluorometilbenceno en éter metílico de tere-butilo (MTBE) /THF . Cuando se completa la reacción, la mezcla -de reacción se enfría rápidamente con agua y se divide con más MTBE. La capa orgánica se lava con salmuera y agua y se concentra en un evaporador giratorio. El producto concentrado sólido se disuelve de nuevo en metanol y se precipita de nuevo con agua. El producto precipitado resultante se filtra y se seca para proporcionar el éster terc-butílico del ácido (R)-3-(2,6-dinitro-4 -trifluorometilfenoxi ) pirrolidin- 1 -carboxil ico el cual se puede utilizar en el siguiente paso sin purificación adicional.
Paso 2 : El producto del Paso 1 se disuelve en metanol y se hidrogena a 7.021-14.043 kg/cm2 (100-200 psi) y 30-50°C en presencia de Pd al 10%/C hasta que la reducción se considera completa mediante la HPLC . La mezcla de reacción se filtra a través de Celite. El producto filtrado se concentra y se seca para proporcionar el éster terc-butílico del ácido (R) - 3 - ( 2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi ) -pirrolidin- 1-carboxílico el cual se puede utilizar en el siguiente paso sin purificación adicional .
Paso 3 : El producto del Paso 2 se acopla con ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico, en una relación aproximada de 2 mol de diamina: l' mol de diácido, en presencia de clorhidrato de 1 - [ ( 3 - ( dimet i lamino) -pro i 1 ) ] - 3 - et i 1 carbodi imida (EDCI), en piridina, bajo una atmósfera inerte, a temperatura ambiente. Cuando se completa la reacción, la mezcla de reacción se diluye en agua. El producto precipitado resultante se separa y se disuelve de nuevo en MTBE . La solución de MTBE se lava con agua, HCl 0.2 N y salmuera, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se separa y se diluye en heptano. El producto precipitado resultante se aisla por medio de la filtración y se seca para proporcionar la bi s - { [ 3 - amino- 2 - ( ( R) - 1 - ( t erc-butoxi carboni 1 ) pirrolidin-3- i loxi ) -5-trifluororaetil-feni 1 ] - ami da } del ácido i r imidin - 4 , 6 - di carboxí 1 i co la cual se puede utilizar en el siguiente paso sin purificación adicional.
Paso 4 : El producto del Paso 3 se hace reaccionar con 2.5-3 equivalentes molares del ácido ( { [ ( tere-butoxicarbonil ) amino] [ (terc-butoxicarboni 1 ) imino] metil} -amino) pentanóico en piridina, en presencia de oxicloruro de fósforo, a una temperatura alrededor de -5 a -10°C. La reacción se enfría rápidamente con agua a una temperatura de 15°C. El sobrenadante se separa del producto precipitado amorfo el cual se disuelve de nuevo en MTBE , se lava con agua y salmuera, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se separa y se diluye en heptano. El producto precipitado resultante se aisla por medio de la filtración y se seca para proporcionar la bis - { [ 3 - ( 5 - ( { [ ( erc-butoxicarbonil ) amino] [ (terc-butoxicarbonil ) imino] met i 1 }- amino ) - pentanoi lamino ) -2- ( (R) -1- ( terc-butoxicarboni 1 ) -pi rol idin- 3 - i loxi ) -5-t ri f luoromet il - feni 1 ] - amida } del ácido p i rimidin- 4 , 6 -dicarboxí 1 ico la cual se utiliza en el siguiente paso sin purificación adicional.
Paso 5 : El producto del Paso 4 es desprotegido (remoción de seis grupos terc-butoxicarbonilo) con HCl / 1 , 4 - di oxano 4 M en ácido fórmico a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye con 1,4-dioxano. El producto precipitado resultante se filtra, se lava con 1,4-dioxano y se seca para proporcionar el bi s - { [ 3 - ( 5 - guanidino -pent anoi 1 amino ) -2- ( (R) -pirrol idin- 3 - i loxi ) -5-t ri f luoromet i 1 - f eni 1 ] -amida } tetraclorhidrato del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxí 1 ico crudo (Compuesto A crudo) . El producto crudo se purifica adicionalmente por medio de la re -prec ipi tac ion de una solución de metanol con THF (de 50°C a la temperatura ambiente) y/o la re-precipitación de una solución de agua/metanol con THF a temperatura ambiente.
Paso 6 (purificación c romatográf i ca ) : La purificación final del Compuesto A se logra por medio de la cromatografía de fase inversa (RP-HPLC) utilizando una suspensión espesa de fase YMC ODS-AQ, 50 micrómetros, 120 Angstroms, empacada en una columna de compresión axial dinámica ProChromMR . La fase móvil es un gradiente del solvente B en el solvente A, donde el solvente A es agua con ácido trif luoroacét ico al 0.05% (TFA) y el solvente B es acetonitrilo con TFA al 0.05%. Las fracciones que contienen el producto purificado se concentran por medio de la evaporación giratoria para proporcionar el Compuesto A como la sal de trifluoroacetato. La forma de sal de clorhidrato final se regenera por medio del pase de una solución en agua/metanol de la sal de trifluoroacetato a través de una columna de intercambio iónico Dowex 1x2-400 (forma-Cl) , la recolección del eluato que contiene API, la concentración y el secado.
La sustancia farmacológica a granel del Compuesto A se almacena a 2-8°C, se protege de la luz y el aire, en contenedores de HDPE de color ámbar o en bolsas de polietileno dobles en un tambor de fibra.
Ejemplo 3: Síntesis del Compuesto ? 4HCI Paso 1 : El éster terc-butílico del ácido (R)-3-hidroxipirrolidin-l-carboxílico (compuesto 20) es desprotonado con fcere-butóxido de potasio (KOtBu) en tetrahidrofurano (THF) . El anión resultante se hace reaccionar con 2 -cloro- 1 , 3 -dinitro-5 -trifluorometilbenceno (compuesto 2) en éter terc-butil-metílico (MTBE) /THF. Cuando se completa la reacción, la mezcla de reacción se enfría rápidamente con agua y se divide con más MTBE. La capa orgánica se lava con salmuera y agua y se concentra en un evaporador giratorio. El producto concentrado sólido se disuelve de nuevo en metanol y se precipita de nuevo con agua. El producto precipitado resultante se filtra y se seca para proporcionar el éster terc-butílico del ácido (R)-3- (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi ) pirrolidin- 1-carboxílico el cual se puede utilizar en el siguiente paso sin purificación adicional. Esta reacción se ha llevado a cabo a una escala utilizando 4.2 kg del compuesto 2.
Paso 2: El compuesto 21 se disuelve en metanol y se hidrogena a 7.021-14.043 kg/cm2 (100-200 psi) y 30-50°C en presencia de Pd al 10%/C hasta que la reducción se considera completa mediante la HPLC. La mezcla de reacción se filtra a través de Celite. El producto filtrado se concentra y se seca para proporcionar el éster terc-butílico del ácido (R)-3-(2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi ) -pirrolidin- 1-carboxílico (compuesto 22) con una pureza mediante la HPLC de 92.2%. La reacción se realiza en cuatro lotes con una escala de 1.64 kg del compuesto 21 para cada lote.
Paso 3 : El compuesto 22 se acopla con el ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico (compuesto 8), en la relación aproximada de 2 mol de diamina: 1 mol de diácido, en presencia de clorhidrato de 1- [ (3- (dimetilamino) -propil) ] -3-etilcarbodiimida (EDCI) , en piridina, bajo una atmósfera inerte, a temperatura ambiente. Cuando se completa la reacción, la mezcla de reacción se diluye en agua. El producto precipitado resultante se separa y se disuelve de nuevo en MTBE . La solución de MTBE se lava con agua, HC1 0.2 N y salmuera, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se separa y se diluye en heptano. El producto precipitado resultante se aisla por medio de la filtración y se seca para proporcionar la bis-{ [3-amino-2- ( (R) -1- ( erc-butoxicarbonil) -pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico (compuesto 23) el cual se puede utilizar en el siguiente paso sin purificación adicional. La reacción se lleva a cabo a una escala utilizando 3.15 kg del compuesto 22.
Paso 4: La solución de 3.66 g de DMAP en 60 mi de piridina anhidra se enfrió a 0°C con un baño de hielo. 3.60 g de cloruro de tionilo se agregaron lentamente. La solución resultante se agitó durante 10 minutos. El material de partida ácido N-Cbz (7.53 g, 30 mmol), Compuesto 23 (8.54 g, 10 mmol) , se agregaron a la solución respectivamente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Se agregó agua (500 mL) . Después de que la mezcla se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante 2 horas, el sólido se filtró y se lavó con 250 mL de agua. El sólido se disolvió en acetato de etilo (300 mL) . La capa orgánica se lavó con una solución de ácido cítrico al 10% (100 mL) y salmuera (100 mL) y se secó sobre Na2SÜ4. Después de la evaporación, el residuo se disolvió en 40 mL de DCM, luego se agregaron 250 mL de hexano . El producto precipitado se recolectó y se secó bajo vacío. 13.20 g del producto se obtuvieron en una pureza del 95%. Rendimiento: 100%.
Paso 5: El compuesto 26 (13.20 g) se disolvió en MeOH con 2 equivalentes de HCl 1 N y se agregó 1.0 g del catalizador de Pd/C (10%) . La mezcla de reacción se colocó en un hidrogenador Parr y se agitó durante 2 horas bajo 4.212 kg/cm2 (60 psi) de hidrógeno. La LCMASS no mostró progreso y se agregó otro 1.0 g de catalizador. La mezcla de reacción se colocó en un hidrogenador Parr y se agitó durante 3 horas bajo 4.212 kg/cm2 (60 psi) de hidrógeno. La mezcla se filtró a través de celite para retirar el catalizador. El producto filtrado se concentró a sequedad en un evaporador giratorio a 30 °C. 11.50 g del producto se obtuvieron en una pureza del 95%. Rendimiento: 100%.
Compuesto 27 Compuesto 28 Paso 6: El compuesto 27 (11.50 g, 10 mmol) se disolvió en 60 mi de metanol y DCM (1:1) . Luego, se agregaron 4.04 g de trietilamina (40 mmol) . Se agregaron 9.3 gramos de di - Boc - p i ra z o 1 (30 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la remoción de 95% del solvente, se agregaron 300 mL de agua y la mezcla se agitó vigorosamente durante 2 horas. El sólido se filtró y se lavó con 300 mL de agua. El sólido se disolvió en 300 mL de acetato de etilo y se secó sobre Na2S04. Después de la evaporación del solvente, el sólido se disolvió en 40 mL de DCM, luego se utilizaron 500 mL de hexano para precipitar el producto. El sólido se recolectó y se secó bajo vacío. 13.0 gramos del producto se obtuvieron en un rendimiento del 85% (pureza del 90%) .
Compuesto 28 P X30063.4HCI Paso 7: El compuesto 28 (1.5 g) se purificó en una columna de 80 g de gel de sílice por medio del uso de un gradiente de 10-88% de EtOAc en DCM. Las fracciones con una pureza superior a 95% se recolectaron, se evaporaron bajo vacío y se secaron. La recuperación fue de 50-60%. El compuesto 28 con una pureza del 95% (0.3 g) se disolvió y se agitó en acetato de etilo (3 mL) a temperatura ambiente (22°C) bajo argón. El gas de HC1 se burbujeó en la solución durante 20 minutos. El color de la solución se tornó amarillo intenso conforme el burbujeó estaba en progreso. El sólido comenzó la trituración en 15 minutos. La solución se agitó a temperatura ambiente durante otra hora. 4 mL adicionales de acetato de etilo se introdujeron en la mezcla de reacción debido a una pérdida de acetato de etilo. La mezcla se burbujeó con gas de HCl durante 10 minutos. La mezcla se agitó durante 2.5 horas. Un tercio de la mezcla se filtró y se lavó con acetato de etilo. Dos tercios de la mezcla se agitaron a temperatura ambiente durante toda la noche. Luego, 30 mL de acetato de etilo se agregaron a la mezcla. Después de la filtración, la torta se lavó dos veces con acetato de etilo (2x140 mL) y se secó. El sólido se sumergió en acetato de etilo (8 mL) y se mantuvo en un congelador. El proceso de reacción se realizó en 4 horas. La agitación durante toda la noche no mostró mucho cambio. La pureza del producto final fue 98% con una impureza mayor de 1.2%.
Ejemplo 4: Síntesis del Compuesto A Compuesto 2 Compuesto 21 Compuesto 22 pm = 270.55 pm = 421.33 pm = 361.36 Paso 5 H2, Pd/C, MeOH Paso 1 : A un matraz de fondo redondo con capacidad para 12 L de 4 cuellos purgado con nitrógeno se agregaron 305.32 g del compuesto 2, 700 mL de MTBE con agitación y la mezcla se enfrió en un baño de hielo/agua. El compuesto 20 (212.43 g) se disolvió con terc-butóxido de potasio (1.31 L de solución 1 M en THF) proporcionando una mezcla ligeramente turbia. Esta mezcla se agregó a la solución del compuesto 21 en el matraz de fondo redondo durante 86 minutos con agitación mientras se mantenía a una temperatura interna <9.0°C. La reacción se retiró del baño frío 30 minutos después y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 15.5 horas. Con la agitación, varios pedacitos pequeños de hielo se agregaron con una disminución de temperatura de 21.4°C a 18.4°C. Luego se agregó agua (1.5 L) y MTBE (1.5 L) y la mezcla se agitó durante 10 minutos. Se dividieron las fases de la mezcla y se separó en un embudo de decantación con capacidad para 6 L. La capa acuosa se extrajo de nuevo con MTBE (500 mL) . Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con agua/salmuera saturada 2:1 (3 x 900 mL) y se concentraron a un sólido de color rojizo/ladrillo bajo presión reducida. Este sólido se disolvió en 2.45 L de MeOH y la solución se transfirió a un matraz Erlenmeyer con capacidad para 4 L. Luego se agregó agua (1 L) con agitación, en porciones, dando por resultado una suspensión espesa. La mezcla se cubrió y se colocó en un refrigerador (1-5°C) durante 16 horas. El sólido se recolectó por medio de la filtración y se secó bajo vacío. El producto seco fue un polvo de color amarillo brillante. Rendimiento: 395.3 g, pureza mediante la HPLC 94.0% .
El terc-butóxido de potasio se puede reemplazar, por ejemplo, por cualquier alcóxido, hidruro de sodio, hidruro de potasio o cualquier base que pueda desprotonar el hidroxilo del compuesto 20. El compuesto 2 puede ser sustituido en la posición 2 por cualquier haluro.
Compunto 21 Compuesto 22 Paso 2 : A una unidad agitadora Parr de acero inoxidable con capacidad para 7.57 litros (2 galones) se agregó el catalizador de Pd/C (10% en peso, 20 g) , el compuesto 21 del Paso 1 (394.37 g) y luego 2 L de MeOH cuidadosamente con torbellino. El recipiente se cargó con hidrógeno y se ventiló dos veces. La mezcla luego se agitó iniciando a 5.757 kg/cm2 (82 psi) de hidrógeno; la presión descendió a O kg/cm2 (O psi) . El recipiente se llenó repetidamente a 4.357 kg/cm2, 1.966 kg/cm2 y 2.527 kg/cm2 (62 psi, 28 psi y 36 psi) , respectivamente, cada vez permitiendo que la presión regresara a 0 kg/cm2 (0 psi) captación total de 14.604 kg/cm2 (208 psi) en 51 minutos). La temperatura interna inició a 16 °C y la mezcla mostró una exoterma gradual pero rápida hasta un máximo de 38 °C. La temperatura interna se mantuvo a 33-38°C. El recipiente se presurizó a 3.440 kg/cm2 (49 psi) con captación de 1.614 kg/cm2 (23 psi). El recipiente se presurizó a 6.319 kg/cm2 (90 psi) con captación de 0.842 kg/cm2 (12 psi) durante 1 hora. El recipiente se presurizó a 8.425 kg/cm2 (120 psi) con captación de 5.757 kg/cm2 (82 psi) durante 6 horas. El recipiente luego se presurizó de nuevo a 3.581 kg/cm2 (51 psi) con captación de 2.597 kg/cm2 (37 psi) durante 14.33 horas (la captación total de hidrógeno fue 25.418 kg/cm2 (362 psi)). El reactor se desmanteló y la mezcla se filtró a través de una almohadilla de celite 545 humedecida previamente con MeOH (embudo Büchner de 11.0 cm de diámetro) . El reactor y la almohadilla entonces se enjuagaron con MeOH y la almohadilla se succionó hasta un producto filtrado de goteo lento e incoloro (volumen total de -3.0 L) . El producto filtrado se filtró adicionalmente a través de un disco de papel acanalado para retirar algunos polvos oscuros finos. El producto filtrado claro se transfirió a un matraz de fondo redondo con capacidad para 5 L y se concentró hasta un aceite viscoso de color anaranjado/café el cual se enfrió a 3-4°C durante toda la noche, tiempo durante el cual el material se solidificó/cristalizó parcialmente. El material se calentó y se succionó adicionalmente bajo presión reducida para formar un trozo sólido, duro, gomoso/ceroso de color ladrillo/café. Al matraz de fondo redondo se agregaron heptanos (2 x 700 mL) y MTBE (700 mL) . La mezcla se revolvió con agitación mecánica por encima durante 3.5 horas. La capa de líquido se decantó del sólido, el trozo se rompió en piezas pequeñas, el líquido se colocó nuevamente en el matraz de fondo redondo y la suspensión se agitó vigorosamente durante 16.75 horas. Luego, las piezas pequeñas dejadas se trituraron adicionalmente utilizando el extremo de un eje agitador de vidrio y la mezcla se agitó vigorosamente durante 70 minutos. La suspensión se filtró a través de un embudo de vidrio con frita, tarado utilizando el producto filtrado para completar la transferencia. El embudo se cubrió y se secó al vacío con calor bajo (41°C) durante 4 horas proporcionando el producto como un polvo de color durazno pálido/beige . Rendimiento 270.60 g, pureza mediante la HPLC 98.5%.
El catalizador de Pd/C se puede reemplazar, por ejemplo, por cualquier catalizador adecuado para la hidrogenación de un grupo nitro.
Paso 3 (Opción 1) : La 2 -cloro-4 , 6 -dimetoxi - 1 , 3 , 5 -triazina (4.0 g) se agitó en THF anhidro (60 mL) . Se agregó N-metilmorfolina (4.4 g) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se agregó el compuesto 22 (7.2 g) y ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico (1.68 g) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Luego, el solvente se evaporó completamente in vacuo. Se agregó agua (250 mL) y la mezcla se agitó durante 4 horas. Después de la filtración, la torta de color amarillo se lavó con agua (3x100 mL) y se agitó en agua (250 mL) durante 4 horas nuevamente. El procedimiento de filtración y lavado se repitió dos veces. Luego, el sólido se secó en el aire. El sólido se disolvió en 15 mL de solución de DCM : Hexano : Acetona (5:5:1). La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 días. El sólido se filtró y se lavó dos veces con 10 mL de solución de DCM:Hexano (1:1) . El procedimiento de recristalización se repitió una vez más para proporcionar un sólido de color amarillo claro. Rendimiento del 70%, pureza mediante HPLC del 100%.
Paso 3 (Opción 2) : El EDCI (6.0 g) se agitó en piridina anhidra (60 mL) . Luego, se agregó el compuesto 22 (7.2 g) y el compuesto 9 (0.56 g) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego, se agregó otra porción del ácido pirimidin- , 6 -dicarboxilico (0.56 g) . Después de que la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante otras 2 horas, se agregó la tercera porción de ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxilico (0.56 g) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas . Luego el solvente se evaporó completamente in vacuo. Se agregó agua (250 mL) y la mezcla se agitó durante 4 horas. Después de la filtración, la torta de color amarillo se lavó con agua (3x100 mL) y se agitó en agua (250 mL) durante 4 horas nuevamente. El procedimiento de filtración y lavado se repitió dos veces. Luego, el sólido se secó en el aire. El sólido se disolvió en 15 mL de solución de DCM : Hexano -.Acetona (5:5:1) . La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 días. El sólido se filtró y se lavó dos veces con 10 mL de solución de DCM:Hexano (1:1). El procedimiento de recristalización se repitió una vez más para proporcionar un sólido de color amarillo claro. Rendimiento del 70%, pureza mediante la HPLC del 100%.
El EDCI se puede reemplazar, por ejemplo, por cualquier reactivo de acoplamiento de amida que genere un anhídrido ácido o un éster activado tal como CDI , DCC, HOBt, HOAt, P0C13.
Paso 4: La solución de DMAP (3.66 g) en 60 mL de piridina anhidra se enfrió a 0°C con un baño de hielo. El cloruro de tionilo (3.60 g) se agregó lentamente. Luego, la solución resultante se agitó durante 10 minutos. El material de partida ácido N-Cbz (7.53 g, 30 mmol) , Compuesto 5 (8.54 g, 10 mmol), se agregaron a la solución respectivamente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Luego se agregó agua (500 mL) . Después de que la mezcla se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante 2 horas, el sólido se filtró y se lavó con 250 mL de agua. El sólido se disolvió en acetato de etilo (300 mL) . La capa orgánica se lavó con una solución al 10% de ácido cítrico (100 mL) y salmuera (100 mL) y se secó sobre Na2S0 . Después de la evaporación, el residuo se disolvió en 40 mL de DCM, luego se agregaron 250 mL de hexano. El producto precipitado se recolectó y se secó bajo vacío. Se obtuvieron 13.20 g del producto en una pureza del 95%. Rendimiento: 100%.
El cloruro de tionilo se puede reemplazar, por ejemplo, por P0C13, (EtO)2POCl o cloruro de oxalilo.
Paso 5: El compuesto 26 (13.20 g) se disolvió en MeOH con 2 equivalentes de HCl 1 N y se agregó 1.0 gramo del catalizador de Pd/C (10%) . La mezcla de reacción se colocó en un hidrogenador Parr y se agitó durante 2 horas bajo 4.212 kg/cm2 (60 psi) de hidrógeno. La LCMASS no mostró progreso y se agregó otro 1.0 gramo de catalizador. La mezcla de reacción se colocó en un hidrogenador Parr y se agitó durante 3 horas bajo 4.212 kg/cm2 (60 psi) de hidrógeno. La mezcla se filtró a través de celite para retirar el catalizador. El producto filtrado se concentró a sequedad en un evaporador giratorio a 30 °C. Se obtuvieron 11.50 g del producto en una pureza del 95%. Rendimiento: 100%.
El catalizador de Pd/C se puede reemplazar, por ejemplo, por cualquier catalizador adecuado para la hidrogenólisis del grupo CBZ.
Paso 6: El compuesto 27 (11.50 g, 10 mmol) disolvió en 60 mL de metanol y DCM (1:1). Luego se agregaron 4.04 g de trietilamina (40 mmol) . Se agregaron 9.3 gramos de di-Boc-pirazol (30 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la remoción de 95% del solvente, se agregaron 300 mL de agua y la mezcla se agitó vigorosamente durante 2 horas. El sólido se filtró y se lavó con 300 mL de agua. El sólido se disolvió en 300 mL de acetato de etilo y se secó sobre Na2S04. Después de la evaporación del solvente, el sólido se disolvió en 40 mL de DCM, luego 500 mL de hexano se utilizaron para precipitar el producto. El sólido se recolectó y se secó bajo vacío. Se obtuvieron 13.0 g del producto en un rendimiento del 85% (pureza del 95%) .
El di-Boc-pirazol se puede reemplazar, por ejemplo, por isourea o di-Boc-isourea .
Paso 7: El compuesto 28 (1.17 kg, 0.76 mol) se disolvió en 24 L de EtOAc, seguido por la adición de 281 mL de agua. El gas de HC1 se agregó a la solución mientras que la temperatura de reacción se controlaba abajo de 45°C al ajustar la velocidad de adición. El tiempo de reacción total es 5 horas entre las cuales 1.5 horas es el tiempo de la adición de HC1. La HPLC indicó que el material de partida es menor que 1% y el producto precipitado se recolectó por medio de la filtración bajo nitrógeno. El sólido se enjuagó con EtOAc, se trituró con MeOH/THF (1:1) y se secó bajo vacío. Rendimiento del 84%.
El HCl/EtOAc se puede reemplazar, por ejemplo, por HCl/dioxano .
Ejemplo 5: Actividad Antimicrobiana Frente a Aislados Clínicos Gram-Positivos (Tabla 1A) y Aislados Clínicos Gram-Negativos (Tabla IB) El Compuesto A se evaluó in vitro de acuerdo con los documentos de CLSI definidos que son específicos para los organismos (aeróbicos, anaeróbicos o levadura) sometidos a prueba en este estudio. La ampicilina, ceftazidima, cefuroxima, c iprof loxac ina , linezolida y vancomicina se sometieron a prueba al lado como agentes comparadores para bacterias aeróbicas; la clindamicina y el metronidazol se sometieron a prueba como comparadores para anaerobios; el fluconazol se sometió prueba como un comparador para aislados de levadura. Las soluciones madre del Compuesto A se prepararon en sulfóxido de dimetilo (DMSO) . La ampicilina, ceftazidima, cefuroxima, ciprofloxacina, linezolida, vancomicina, metronidazol, clindamicina y fluconazol se prepararon cada uno de acuerdo con los lineamientos del fabricante.
Aerobios (M7-A7)l Las concentraciones mínimas inhibitorias (MICs, por sus siglas en inglés) en g/ml se determinaron de acuerdo con los lineamientos de CLSI M7-A7 mediante la microdilución de caldo. Todos los aerobios se sometieron a prueba utilizando el medio de caldo de Mueller-Hinton con la excepción de Streptococcus spp. , los cuales se cometieron a prueba utilizando caldo de Mueller-Hinton con cationes ajustados complementado con 2-5% de sangre lisada de caballo. Los resultados se muestran en la Tabla 1A y la Tabla IB.
Tabla 1A *Ensayos de microdilución de caldo realizados de acuerdo con lineamientos de CLSI estándar.
Tabla IB *Ensayos de microdilución de caldo realizados de acuerdo con los lineamientos de CLSI estándar.
El Compuesto A exhibió una cobertura amplia contra los agentes patógenos Gram-positivos con S. aureus ? Staphyloccal species negativos en coagulasa mostrando las MICs más bajas. El Compuesto A fue activo contra los agentes patógenos Gram-negativos pero la cobertura total fue menor que para los organismos Gram-positivos .
Ejemplo 6: MICs con Staphylococcus Species con Fenotipos de Resistencia Definidos La evaluación de los perfiles de susceptibilidad del Compuesto A contra aislados seleccionados se llevó a cabo in vitro mediante la metodología de microdilución de caldo utilizando el medio de caldo de Mueller-Hinton de acuerdo con el documento de CLSI M7-A7. Los puntos de ruptura interpretativos de CLSI se aplicaron donde fue pertinente como se condujo por el documento de CLSI M100-S17. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 ?Ensayos de microdilución de caldo realizados de acuerdo c los lineamientos de CLSI estándar.
OXA-R: resistente a oxacilina; VRSA: S. aureus resistente vancomicina; VISA: S. aureus intermedio respecto a vancomicina ; LZD-NS: no susceptible a linezolida; DAP-NS: no susceptible a daptomicina.
El Compuesto A fue activo in vi tro contra todos los aislados de S. aureus y staphylococci negativos en coagulasa, incluyendo aislados de S. aureus con resistencia caracterizada a la daptomicina, linezolida y vancomicina (terapias de última línea para el tratamiento de S. aureus resistente tal como MR.SA) . Contra los aislados de S. aureus, no hubo alteración en la actividad contra aislados resistentes en relación con aislados susceptibles. Contra staphylococci negativos en coagulasa, la actividad no fue afectada por la resistencia a la meticilina.
Ejemplo 7: Citotoxicidad y Selectividad La citotoxicidad del Compuesto A se avaluó en un ensayo colorimétrico utilizando una línea de células de hígado humano transformadas (HepG2, HB-8065) y una línea de células de ratón embriónico (células NIH/3T3, CRL-1658) . Este ensayo mide la bio-reducción de un compuesto novedoso de tetrazolio a un producto soluble de formazan por medio de células viables. Las células HepG2 se sembraron en placas de 96 pocilios a 2 x 104 células/pocilio en medio MEM con suero bovino fetal al 10% (FBS, por sus siglas en inglés) 24 horas antes del uso. Las células NIH/3T3 se sembraron en placas de 96 pocilios a 2 x 104 células/pocilio en medio DMEM con suero de ternero al 10% (BCS, por sus siglas en inglés) 24 horas antes del uso. Las monocapas de células se enjuagaron en medios libres de suero y se incubaron durante una hora con el Compuesto A en medios libres de suero. Después de la incubación, los medios se reemplazaron con medios completados con suero y las células vivas se midieron utilizando el kit de Ensayo de No Proliferación Acuoso Cell Titer 96M (Promega, Madison, WI) . Los valores EC50 se determinaron utilizando una ecuación logística de cuatro parámetros: Y=Parte Inferior + (Parte Superior-Parte Inferior) / (1+10A ( (LogEC50- X) *Pendiente) ) .
La citotoxicidad del Compuesto A también se avaluó en un ensayo de hemolisis utilizando eritrocitos humanos. La sangre humana, entera, acumulada se centrifugó para separar los glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) . Los RBCs asilados se enjuagaron y se diluyeron en solución salina amortiguada con Tris (amortiguador de TBS, pH 7.4) para obtener una suspensión madre de RBC al 0.22%. 5 L de la solución madre del Compuesto A se agregaron a 45 L de la suspensión de RBC y se incubaron con agitación durante 1 hora a 37°C. En la conclusión del tiempo de incubación, las muestras se centrifugaron y 30 µL del sobrenadante se agregaron a 100 L de agua. Las mediciones de 0D4i4 se leyeron por la concentración de hemoglobina. El péptido de veneno de abeja melitina se utilizó como control positivo. Los valores EC50 se determinaron como se describiera anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3 El Compuesto A demuestra una gran selectividad total .
Ejemplo 8: Mortalidad a Través del Tiempo Frente a S. Aureus (ATCC 27660) Los estudios de mortalidad a través del tiempo del Compuesto A frente a E. coli ATCC25922, E. coli (cepa lab) D31 y S. aureus ATCC27660 se determinaron en un. protocolo estándar al medir el tiempo que toma para reducir las 3 unidades logarítmicas de inóculos iniciales. Tres mi del medio de Mueller-Hinton con cationes ajustados se inocularon con 20 L de solución madre bacteriana congelada y se incubaron a 37°C en una plataforma de agitación (250 rpm) durante toda la noche. La suspensión se diluyó a aproximadamente 5xl05 cfu/mL y se trató con MIC 2x, 5x, lOx y 20x (MIC = 1 . La solución madre del Compuesto A se preparó a 10 mg/mL en DMSO . Los puntos de tiempo se recolectaron y las bacterias viables se contaron en placas de Agar MH después de una incubación de 18 horas. Los estudios que examinaban la cinética de mortalidad a través del tiempo del Compuesto A contra S. aureus ATCC 27660 a concentraciones MIC 2x muestran que las reducciones de 3 unidades logio en el inoculo inicial ocurren en 5 horas. No se observa un crecimiento de nuevo en los cultivos durante 72 horas a concentraciones MIC lx. Véase la Figura- 1A y la Figura IB.
Ejemplo 9: Resistencia del Pase en Serie en SSA (ATCC 29213) y MRSA (ATCC 33591) Las soluciones madre bacterianas congeladas (20 µL) de S. aureus ATCC29213 o S. aureus resistente a meticilina (MRSA ATCC 33591) se inocularon en 3 mL de medio de Mueller-Hinton con cationes ajustados y se incubaron a 37 °C en una plataforma de agitación (250 rpm) durante toda la noche. La suspensión se diluyó a aproximadamente 5xl05 cfu/mL y se inoculó en una placa de fondo redondo de 96 pocilios de polipropileno (Costar) (volúmenes de 90 µL) . Las soluciones madre del Compuesto A y norfloxacina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO; Catálogo No. N9890) se prepararon en DMSO y las diluciones dobles en serie del compuesto se hicieron en ácido acético al 0.01%, albúmina de suero bovino al 0.2% directamente en los pocilios de la placa de polipropileno a 10 µ??/pocillo. Las concentraciones finales del Compuesto A fueron 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19, 0.098, 0.049 y 0.024 |0g/mL. Los intervalos de concentración finales de la norfloxacina fueron 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19, 0.098 y 0.049 µg/mL. Las concentraciones de DMSO no excedieron 1% en el ensayo. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Después de una incubación durante 24 horas a 37°C, el crecimiento de las células se valoró al observar la presencia de "crecimiento aceptable" , definido por CLSI como una turbidez de la parte inferior o definitiva >2 mm. Los pocilios de MIC se definieron como la concentración más baja donde no se observó un crecimiento aceptable. Para el pase en serie, se tomaron alícuotas de 50 |1L de 2 de 3 pocilios duplicados a MIC 0.5x y se combinaron en 900 |JL de medio de Mueller-Hinton con cationes ajustados reciente. La OD600 se midió y las suspensiones de células se inocularon en placas de fondo redondo de 96 pocilios de polipropileno (volúmenes de 90 (iL) a aproximadamente 5xl05 cfu/mL. Diez iL de las soluciones madre del compuesto se agregaron previamente a los pocilios para lograr los intervalos de concentración para cada compuesto descrito anteriormente. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37 °C. Este proceso se repitió durante un total de 17 pases y los valores MIC se registraron en cada pase.
El pase de S. aureus con norfloxacina se asoció con una elevación significativa en los valores MIC por el pase 3 (4 diluciones dobles) para tanto MSSA como MRSA que alcanzaron incrementos de 128 veces y 64 veces, respectivamente, por el pase 15. A la inversa, no hubo cambio en las MICs para el Compuesto A contra MSSA ATCC 29213 o MRSA ATCC 33591 durante el curso de tiempo completo de 17 pases. Véase la Figura 2.
Ejemplo 10: Estabilidad Metabólica In Vitro del Compuesto A - - Plasma Sanguíneo Las muestras de plasma acumuladas de humano (género mezclado) , rata (raza y género mezclados) y perro (raza y género mezclados) se incubaron con el Compuesto A (5 µ?) a 37°C durante 0 y 60 minutos (muestras duplicadas) . Las incubaciones se terminaron mediante la adición de un solvente de precipitación helado (acetonitrilo: ácido acético glacial, 9:1 v/v) . Los sobrenadantes se diluyeron con un volumen igual de ácido fórmico al 0.1% y se analizaron por medio de HPLC-MS/MS. La estabilidad en el plasma se reportó como el % de compuesto percusor en 60 minutos con relación a la cantidad del precursor en 0 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4 Existe poca o nada de pérdida del Compuesto A en el plasma de humano, rata y perro después de la incubación durante 1 hora a 37 °C, lo que indica una alta estabilidad en el plasma. También hubo poca o nada de pérdida del Compuesto A en humanos, monos cinomolgus y conejos (los datos no se muestran) .
Ejemplo 11: Eficacia del Compuesto ? en el Modelo de Carga en el Muslo de Ratones Los ratones hembra CD-1 de 6-7 semanas de edad se hicieron neutropénicos con ciclofosfamida (150 mg/kg, i.p.) en los días 4 y 1 antes de la inoculación i.m. con S. aureus (ATCC 13709) . El inoculo de S. aureus se preparó al transferir colonias de cultivos en agar de soya tríptico (TSA) de 18-20 horas a PBS estéril. La densidad se ajustó a aproximadamente 106 cfu/mL con la ayuda de un espectrofotómetro y la concentración del inoculo se determinó por medio del método de conteo de placas de dilución. Los ratones se inocularon al inyectar cada muslo posterior con 0.1 ttiL de inoculo. El Compuesto A se administró a grupos separados de ratones (4 hembras/grupo) por medio de dosis de bolos i.v. de 1 o 2 mg/kg/dosis en 1 y 5, l y 9 o l y l3 horas después de la inoculación como se muestra en la Tabla 5. Un grupo de control separado de 4 ratones recibió el inoculo sin tratamiento antibiótico. El Compuesto A se disolvió en agua purificada USP estéril/PBS 50%/50% v/v. Los muslos se recolectaron 25 horas después de la inoculación. El músculo del muslo y el tejido óseo se homogenizaron, las alícuotas de diluciones en serie se colocaron en TSA y se incubaron a 37 °C durante 20 horas y los conteos de colonias se obtuvieron para calcular las cfu/muslo. Los parámetros se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5 El Compuesto A fue el más efectivo en la reducción de la población bacteriana en los muslos inoculados cuando se administró a 2 mg/kg/dosis en ya sea 1 y 5 o 1 y 9 horas después de la inoculación. Las reducciones bacterianas en estos 2 grupos fueron 3.96 y 3.93 logaritmos más bajas, respectivamente, que aquellas del grupo de control inoculado. Véase la Figura 3.
Ejemplo 12: Eficacia Frente a la Vancomicina en el Modelo de Carga en el Muslo de Ratas Para cada experimento, las ratas hembra Crl:CD(SD) con cánula en la vena femoral de 8-9 semanas de edad se hicieron neutropénicas con ciclofosfamida (150 mg/kg, i.p.) en los días 4 y 1 antes de la inoculación i.m. con S. aureus (ATCC 13507) . Una suspensión de S. aureus se preparó a partir de colonias obtenidas de un cultivo durante toda la noche, se colocó en PBS y se ajustó a aproximadamente 107 cfu/mL con la ayuda de un espectrofotómetro . Cada rata se inyectó con 0.2 mL de inoculo en el músculo del muslo de la pata posterior derecha. Los muslos se recolectaron 25 horas después de la inoculación y se procesaron para determinar las cfu/muslo. El Compuesto A se administró por medio de una inyección de bolo i.v. en una vena de la cola o la infusión i.v. durante 1 hora o la infusión i.v. durante 4 horas por vía de las cánulas de la vena femoral en diferentes intervalos de tiempo después de la inoculación. Los grupos de control de inoculación separados se incluyeron en cada experimento, y los grupos de vancomicina se incluyeron como agentes comparativos en el primer y segundo experimento. Cada grupo, incluyendo los controles y el agente comparativo, consistió de 4 ratas .
Para el Compuesto A, un bolo i.v. (10 mg/kg/dosis, 20 mg/kg de dosis total) e infusiones i.v. durante 1 hora (10 mg/kg/dosis, 20 mg/kg de dosis total) redujeron la carga bacteriana por 3.2 y 3.0 logaritmos, respectivamente, en comparación con los controles inoculados. Las reducciones relativas a los niveles de inoculo en 1 hora después de la infección fueron aproximadamente 2.2 a 2.0 logaritmos, respectivamente. La eficacia fue comparable con la vancomicina. Véase la Figura .
Ejemplo 13: Eficacia del Compuesto ? en el Modelo de Sepsis de Ratón: Infección con £>. aureus La solución salina, la vancomicina o el Compuesto A se administraron a grupos separados de ratones hembra CD-1 de 8 semanas de edad (8 ratones/grupo) 1 y 7 horas después de inyecciones i.p. de S. aureus (ATCC 13709, 5 x 107 cfu/mL en mucina al 5%, 0.5 mL/ratón) . El Compuesto A se disolvió en agua purificada USP estéril/TBS 50%/50% v/v. Una suspensión de S. aureus se preparó a partir de colonias transferidas de la placa de TSA a PBS estéril. Una alícuota de la suspensión madre se agregó a mucina al 5% para una concentración final de aproximadamente 5 x 107 cfu/mL. El diseño del estudio y las dosis se muestran en la Tabla 6. Los ratones se observaron durante 6 días después de la inoculación por la mortalidad.
Tabla 6 La eficacia dependiente de la dosis se observó con el Compuesto A que fue comparable al grupo de tratamiento de vancomicina. Todos los ratones no tratados murieron dentro del primer día de tratamiento. En las dosis de 2x5 y 2x10 mg/kg del Compuesto A, se logró una protección completa con el Compuesto A. Véase la Figura 5.
Ejemplo 14: Estudios de Toxicidad Aguda -- Dosis Máximas Toleradas Las determinaciones de las dosis máximas toleradas (MTD) se hicieron en estudios de dosis ascendentes/descendentes en ratones y ratas. El Compuesto A se administró mediante ya sea una inyección de bolo i.v. en la vena de la cola de ratones y ratas o mediante una infusión i.v. por vía de un catéter en la vena femoral de ratas. En cada dosis, de dos a tres animales fueron administrados con el compuesto y los signos clínicos se registraron durante un período de 4 a 7 días. Una necropsia ordinaria se realizó en la conclusión del estudio. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7 La MTD para el Compuesto A en las ratas fue > 24 mg/kg cuando se administró mediante una infusión i.v. durante 1 hora.
Ejemplo 15: Farmacocine tica del Compuesto A en Ratas Las ratas Crl:CD (SD) fueron administradas con el Compuesto A mediante una inyección de bolo i.v. en las dosificaciones indicadas. El plasma se preparó a partir de muestras de sangre tomadas en 9 puntos de tiempo (n=3) durante 28 horas. Los niveles del compuesto se determinaron por medio de la HPLC-MS/MS . Todos los animales se equiparon con dos cánulas en la vena yugular (JVC, por sus siglas en inglés) , una para la administración de dosis y otra para la recolección de sangre. Cada ruta de administración se dosificó como N=3. Los animales fueron provistos con una dieta comercial para roedores y agua ad libitum. Cada rata recibió un bolo dosificado por vía de la ruta de administración apropiada en el tiempo cero en el día de la dosificación. Los tiempos de toma de muestras de sangre se muestran en la Tabla 8.
Cada muestra de sangre se recolectó de las ratas por vía de una JVC y se colocó en tubos de polipropileno enfriados que contenían EDTA sódico como anticoagulante. Las muestras se centrifugaron a una temperatura de 4°C y a una velocidad de 13,000 rpm durante 5 minutos. Las muestras se mantuvieron frías durante todo el procesamiento. Cada muestra de plasma entonces se transfirió dentro de tubos de polipropileno etiquetados, se colocó sobre hielo seco y se almacenó en un congelador ajustado para mantener de -60°C a -80°C.
Las muestras de estudio de plasma se extrajeron y se analizaron utilizando un método desarrollado previamente. Una curva estándar individual y seis réplicas de muestras de control de calidad en tres concentraciones se extrajeron utilizando DMSO que contenía ácido fórmico al 0.1%. Las muestras de plasma (50 µL) se agregaron a 150 µL de solvente y se centrifugaron. Los sobrenadantes se analizaron por medio de LC/MSMS utilizando una microbomba serie 200 de Perkin Elmer y un espectrómetro de masas de Electropulveri zac ión PE Sciex API4000MR. Las curvas estándar se prepararon en concentraciones de 10000, 5000, 1000, 500, 250, 100, 50 y 25 ng/mL. Las muestras de control de calidad se prepararon en concentraciones de 5000, 500 y 50 ng/mL. La curva estándar y las muestras de control de calidad se prepararon a partir de soluciones madre preparadas independientemente. Por lo menos 5/8 de los estándares deben tener una exactitud dentro de ±15%, excepto en LLOQ donde ±20% es aceptable. Dos tercios del lote QCs deben tener una exactitud dentro ±15% del nominal y por lo menos un lote QC debe pasar en cada nivel con el propósito de que la corrida sea aceptada .
Los datos individuales de concentración en el plasma frente al tiempo para el Compuesto A se sujetaron al análisis no compart imenta 1 utilizando el programa farmacoc inét i co inNonlin v4.1. A las concentraciones en el plasma inferiores al límite de cuant i f i cae i ón (25 ng/ml) se les asignó un valor de cero para el análisis farmacocinét ico . Las concentraciones de dosificación nominales se utilizaron en todos los cálculos.
Tabla 8 Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 9.
La vida media en el plasma para el Compuesto A en el plasma de rata fue significativamente prolongada y los valores de eliminación son bajos.
Ejemplo 16: Formulaciones La solubilidad hasta la saturación del Compuesto A en varios excipientes se investigó a 25 °C y los resultados se reportan en la Tabla 10 (solubilidad hasta la saturación del Compuesto A como la base libre) .
Tabla 10 Excipiente Categoría Compuesto A (base libre) Funcional solubilidad hasta la saturación a 25°C (mg/mL) Agua Purificada Control 65 Propilenglicol Cosolventes 90 PEG 400 18.5 Glicerina 53 DMA 0.60 Etanol 1.13 Alcohol bencílico 1.83 Acido cítrico/Citrato de Amortiguadores 65.5 Sodio (pH 3) Acido Cítrico/Citrato de 11.2 Sodio (pH 5) HC1 de 61.4 Tris (hidroximetil) amino metano (pH 7.0) Solución salina al 0.9% Diluyente N/A Solución salina al 1.2% N/A N/A: no disponible ya que la formulación formó un gel viscoso de color amarillo Las investigaciones preliminares indicaron que el alcohol bencílico, etanol y DMA fueron vehículos pobres para el Compuesto A con un valor de solubilidad hasta la saturación de 1.83, 1.13 y 0.60 mg/mL, respectivamente. Por otra parte, una buena solubilidad hasta la saturación de 90 mg/mL, 65 mg/mL y 53 mg/mL se logró en propi 1 engl icol , agua purificada y glicerina y en consecuencia se investigó adic ionalmente . Los valores de buena solubilidad se lograron a pH 3 y 7.4 con los valores de 65.5 y 61.4 mg/ml, respectivamente. Sin embargo, la solubilidad pareció descender a pH 5 con un valor de 12.1 mg/mL. La solubilidad hasta la saturación del Compuesto A en una solución de cloruro de sodio al 0.9% y 1.2% no se pudo detectar ya que la formulación formó un gel viscoso de color amarillo.
La solubilidad hasta la saturación del Compuesto A en varios sistemas de múltiples componentes se investigó a 25°C y los resultados se reportan en la Tabla 11 (solubilidad hasta la saturación del Compuesto A como la base libre) .
Tabla 11 N/A: no disponible ya que la formulación formó un gel viscoso de color amarillo * : La formulación se gelif icó durante la centrifugación pero se licuó con el reposo.
Las formulaciones las cuales exhibieron resultados adecuados incluyeron propilenglicol al 50% en p/v y glicerina al 15% en p/v en agua purificada con un valor de solubilidad hasta la saturación a 25 °C de 74.7 mg/mL y 63.5 mg/mL, respectivamente. También se logró una buena solubilidad hasta la saturación con varios agentes formadores de complejos con valores de 79.7, 102.0 y 64.3 mg/mL para KleptoseMR al 20% en p/v, KleptoseMR al 40% en p/v y CaptisolMR al 25% en p/v, respectivamente. Los resultados también indicaron que la adición del Compuesto A a propilenglicol al 20-50% en p/v en solución salina dio por resultado la formación de un gel viscoso de color amarillo y consecuentemente no se pudo analizar por medio de luz UV. Sin embargo, el fenómeno de gelificación fue dependiente de la concentración y se observó en formulaciones conforme. la concentración del Compuesto A en la formulación se acercaba al valor de solubilidad hasta la saturación del fármaco. Adicionalmente , el proceso de gelificación pudo ser invertido fácilmente por medio de la adición de un pequeño volumen de la formulación de excipiente o algunas gotas de etanol . La adición de etanol al 5% en p/v en la formulación no inhibió el fenómeno de gelificación pero aún fue reversible fácilmente y pudo ser analizado por medio de la espectrofotometría UV. Después de una evaluación de los datos preliminares de selección de excipientes, tres formulaciones adecuadas se seleccionaron para el desarrollo adicional de formulaciones. Estas formulaciones fueron solución de Kleptose"11 al 20% en p/v, propilenglicol al 20% en p/v en agua purificada y glicerina al 15% en p/v en agua purificada. La formulación de 50 mg/mL del Compuesto A en Kleptose"11 al 20% en p/v se seleccionó en la prueba clínica en fase I. además, las soluciones del Compuesto A en agua, Kleptose^ o Manitol se pueden prorratear y liofilizar hasta un sólido. El sólido se puede reconstituir con agua antes del uso.
Varias modificaciones de la invención, además de aquellas descritas en este documento, serán aparentes para aquellas personas expertas en el campo a partir de la descripción anterior. Estas modificaciones también tienen por objeto estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Esta solicitud reclama la prioridad para la solicitud provisional de los Estados Unidos No. de Serie 61/108,595 presentada el 27 de Octubre de 2008, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. La presente invención fue respaldada por fondos del Gobierno de los Estados Unidos (Concesiones de NIH Nos. AI74866 y 1R43AI058407) y por lo tanto el Gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la invención.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un compuesto de la fórmula I I caracterizado porque: cada A es, independientemente, -C=0, -C=S o -CH2; cada D es, independientemente, O o S; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; cada R2 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; cada R3 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. El compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque A es -C=0. 3. El compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizados porque cada D es 0. 4. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizados porque cada R1 es, independientemente, hidrógeno, metilo o metoxi . 5. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque cada R2 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, o halo. 6. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados porque cada R3 es, independientemente, metilo, metoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. 7. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizados porque cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halo-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. 8. El compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque: cada A es -C=0; cada D es 0; cada R1 es, independientemente, hidrógeno, halo o halometilo; cada R2 es, independientemente, hidrógeno o halo; cada R3 es, independientemente, metilo, metoxi, halo o halometilo; y cada R4 es, independientemente, hidrógeno, metilo, metoxi, halo o halometilo. 9. El compuesto, caracterizado porque tiene la fórmula : o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 10. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable . 11. Una formulación, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la formulación comprende un excipiente seleccionado de agua purificada, propilenglicol , PEG 400, glicerina, DMA, etanol, alcohol bencílico, ácido cítrico/citrato de sodio (pH 3) , ácido cítrico/citrato de sodio (pH 5), HCl de tris (hidroximetil ) amino-metano (pH 7.0), solución salina al 0.9% y solución salina al 1.2% o cualquier combinación de los mismos. 12. Una formulación, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la formulación comprende un excipiente seleccionado de propilenglicol al 20% en p/v en solución salina, propilenglicol al 30% en p/v en solución salina, propilenglicol al 40% en p/v en solución salina, propilenglicol al 50% en p/v en solución salina, propilenglicol al 15% en p/v en agua purificada, propilenglicol al 30% en p/v en agua purificada, propilenglicol al 50% en p/v en agua purificada, propilenglicol al 30% en p/v y etanol al 5% en p/v en agua purificada, glicerina al 15% en p/v en agua purificada, glicerina al 30% en p/v en agua purificada, glicerina al 50% en p/v en agua purificada, KleptoseMR al 20% en p/v en agua purificada, KleptoseMR al 40% en p/v en agua purificada y CaptisolMR al 25% en p/v en agua purificada. 108 III; c) agregar el compuesto de la fórmula III y ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico a una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1, 3 , 5-triazina y N-metilmorfolina para formar un compuesto de la fórmula IV IV; d) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula IV con ácido butírico de N-Boc-guanidina para formar un compuesto de la fórmula V V;y e) desproteger el compuesto de la fórmula V para producir el compuesto de conformidad con la reivindicación 9. 15. Un método para preparar el compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende : a) desprotonar el éster terc-butílico del ácido (R) -3-hidroxipirrolidin-l-carboxílico y hacer reaccionar el compuesto resultante con 2-cloro-l , 3-dinitro-5-trifluorometilbenceno para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6-dinitro-4-trifluorometilfenoxi)pirrolidin-l-carboxílico; b) reducir el éster terc-butílico del ácido (R)-3- (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi ) pirrolidin- 1-carboxí1ico en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición, e hidrógeno para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi) -pirrolidin-l-carboxílico ; c) acoplar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi) -pirrolidin-l-carboxílico con ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico en presencia de clorhidrato de 1- [ (3- (dimetilamino) -propil) ] -3-etilcarbodiimida para formar la bis- { [3-amino-2- ( (R) -1- ( terc-butoxicarbonil ) pirrolidin-3 - iloxi ) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico; d) hacer reaccionar la bis- { [3-amino-2 - ( (R) -1- ( erc-butoxicarbonil) pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico con ácido ({ [( terc-butoxicarbonil ) amino] [( terc-butoxicarbonil ) imino] -metiljamino) entanoico en presencia de oxicloruro fosforoso para formar la bis- { [3- (5- ({[( erc-butoxicarbonil) amino] [( terc-butoxicarbonil) imino] metil}amino) -pentanoilamino) -2- ( (R) -1- (terc-butoxicarbonil) -pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil- fenil] -amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico; e) desproteger la bis- { [3 - (5 -({[( terc-butoxicarbonil) amino] [ ( terc-butoxicarbonil) imino] metil } -amino) -pentanoilamino) -2- ( (R) -1- (terc-butoxicarbonil) -pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] -amida} del ácido pirimidin- , 6-dicarboxílico para formar el bis- {[3- (5-guanidino-pentanoilamino) -2- ( (R) -pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] -amida} tetraclorhidrato del ácido pirimidin- , 6 -dicarboxílico crudo; y f) purificar el bis- { [3- (5-guanidino-pentanoilamino) -2- ( (R) -pirrolidin-3-iloxi) -5 -trifluorometil -fenil] -amida} tetraclorhidrato del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico crudo por medio de la cromatografía de fase inversa . 16. Un método para preparar el compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende : a) desprotonar el éster terc-butílico del ácido (R) -3-hidroxipirrolidin-l-carboxílico y hacer reaccionar adicionalmente el compuesto resultante con 2-cloro-l,3-dinitro-5-trifluorometilbenceno para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6-dinitro-4-trifluorometilfenoxi) irrolidin- 1-carboxílico ; b) reducir el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -dinitro-4 -trifluorometilfenoxi ) pirrolidin-l-carboxílico en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición, e hidrógeno, para formar el éster terc-butílico del ácido (R) -3- (2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi) -pirrolidin-l-carboxílico; c) acoplar el éster terc-butílico del ácido (R)-3- (2 , 6 -diamino-4 -trifluorometilfenoxi ) -pirrolidin-l-carboxílico con ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico en presencia de clorhidrato de 1- [ (3- (dimetilamino) -propil) ] -3-etilcarbodiimida para formar la bis- { [3-amino-2- ( (R) -1- ( ercbutoxicarbonil) pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6-dicarboxílico; d) hacer reaccionar la bis- { [3-amino-2- ( (R) -1- ( terc-butoxicarbonil) pirrolidin-3-iloxi) -5-trifluorometil-fenil] amida} del ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico con ácido N-Cbz en presencia de cloruro de tionilo; e) reducir el compuesto resultante del paso d) en presencia de un alcohol, un catalizador de metal de transición e hidrógeno; f) hacer reaccionar el compuesto resultante del paso e) con di-Boc-pirazol ; y g) desproteger el compuesto resultante del paso f) para producir el compuesto de conformidad con la reivindicación 9. 17. Un método para preparar una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende: a) hacer reaccionar el (R) - ( - ) -N-Boc-3 -pirrolidinol con una base fuerte para formar una mezcla; hacer reaccionar adicionalmente la mezcla con 2-cloro-5- (trifluorometil) -1, 3-dinitrobenceno para formar un compuesto que tiene la fórmula II NBoc ii; b) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula II con un alcohol y un catalizador de metal de transición en presencia de hidrógeno para formar un compuesto de la fórmula III el) agregar el compuesto de la fórmula III y ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico a una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1, 3 , 5-triazina y N-metilmorfolina para formar un compuesto de la fórmula IV IV; o c2) agregar el compuesto de la fórmula III y ácido pirimidin-4 , 6 -dicarboxílico a una mezcla de clorhidrato de 1-etil-3- [3- (dimetilamino) propil] -carbodiimida (EDCl) y piridina anhidra para formar un compuesto de la fórmula IV IV; d) agregar el compuesto de la fórmula IV con un ácido N-Cbz a una solución que comprende piridina anhidra, dimetilaminopropilamina y cualquiera de cloruro de tionilo, P0C13, (EtO)2POCl o cloruro de oxalilo para formar un compuesto de la fórmula Va Va; e) la hidrogenólisis del grupo Cbz del compuesto fórmula Va para producir el compuesto de la fórmula VI f) proteger el compuesto de la fórmula VI para producir el compuesto de la fórmula VII g) desproteger el compuesto de la fórmula VII para producir una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de conformidad con la reivindicación 9. 18. Un método para inhibir el crecimiento de un microbio, caracterizado porque comprende poner en contacto el microbio con un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9. 19. Uso de una cantidad efectiva anti-microbiana de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para la manufactura de un medicamento para tratar un mamífero que tiene una infección microbiana. 20. Uso de conformidad con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, en donde el microbio o infección microbiana es un aerobio gram-negativo, aerobio gram-positivo, anaerobio gram-negativo, anaerobio gram-positivo o levadura . 21. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque es para tratar una infección microbiana. 22. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque es para el uso en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana. 23. El uso de un compuesto de. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la inhibición del crecimiento de un microbio. 24. El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el tratamiento de una infección microbiana en un mamífero.
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