MX2011004082A

MX2011004082A - Peptidos de dominio citoplasmico muc-1 como inhibidores del cancer.

Info

Publication number: MX2011004082A
Application number: MX2011004082A
Authority: MX
Inventors: Donald W Kufe; Surender Kharbanda
Original assignee: Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2011-10-14
Also published as: CA2741065C; JP2012505922A; JP5657549B2; ES2395028T1; IL212383A; AU2009305550B2; WO2010045586A8; WO2010045586A2; DK2352508T3; BRPI0920360A2; EP2352508B1; PL2352508T3; DE09740811T1; JP2015096513A; PT2352508E; WO2010045586A3; EP2352508A2; US20120172312A1; KR20110093801A; AU2009305550A1

Abstract

La presente invención proporciona péptidos del dominio citoplásmico MUC1 y, métodos de uso de los mismos. Estos péptidos pueden inhibir la oligomerización MUC1, evitando de esta manera el crecimiento de las células del tumor, induciendo la apoptosis de las células del tumor y necrosis del tejido del tumor in vivo.

Description

PÉPTIDOS DE DOMINIO CITOPLÁSMICO MUC-1 COMO INHIBIDORES DEL CÁNCER Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio sobre la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana Serie No. 61/106,380, presentada en Octubre 17, 2008, y la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana Serie No. 61/177,109, presentada en Mayo 11, 2009, cuyos contenidos completos están incorporados a la presente descripción como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a la regulación de la proliferación celular, y más particularmente a la regulación del crecimiento de células cancerosas. En particular, los péptidos MUC1 derivados de una región particular del dominio citoplásmico MUC1 han mostrado inhibir la oligomerización del MUC1 y la transubicación nuclear, ocasionando la inhibición y hasta la muerte de las células del tumor que expresan la MUC1.

Antecedentes de la Invención Las mucinas son proteínas O-glicosiladas extensamente que son expresadas predominantemente por las células del epitelio. Las mucinas enlazadas a la membrana y secretadas forman una barrera física que protege los límites apicales de las células del epitelio del daño inducido por las toxinas, microorganismos y otras formas de esfuerzos que ocurren con la interfase con el medio ambiente externo. La mucina transmembrana 1 (MUC1) puede también señalar al interior de la célula a través de su dominio citoplásmico. La MUC1 no tiene similitud de secuencia con otras mucinas enlazadas a la membrana, excepto por la presencia de un dominio de proteína-enterocinasa-agrina (SEA) de esperma de erizo marino (Duraisamy y asociados, 2006). En ese aspecto, la MUC1 es producida como un solo polipéptido y luego pasa por la autodisociación en el dominio SEA (Macao, 2006).

La subunidad MUC1 de la terminal-N (MUC1-N) contiene números variables de repeticiones aleatorias con una alta proporción de serinas y treoninas que son modificadas mediante la O-glicosilación (Siddiqui, 1988). La MUC1-N se extiende más allá del glucocáliz de la célula y es atada a la superficie de la célula a través de un enlace no covalente en la subunidad de MUC1 de la terminal-C de transmembrana (MUC1-C) (Merlo, 1989). La MUC1-C consiste de un dominio extracelular de 58 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 28 aminoácidos y un dominio citoplásmico de 72 que interactúan con diversas moléculas de señalización (Kufe, 2008). El derramamiento de la MUC1-N en la barrera física protectora deja la MUC1-C en la superficie de la célula como un receptor putativo para transducir las señales intracelulares que confieren el crecimiento y sobrevivencia (Ramasamy y asociados, 2007; Ahmad y asociados, 2007).

La evidencia disponible indica que los carcinomas humanos tienen una función explotada de la MUC1 en la promoción de la tumorigenicidad. En este contexto, con la transformación y pérdida de polaridad, la MUC1 es expresada en niveles altos en la superficie completa de la célula en carcinomas de los epitelios de mama y otros (Kufe, 1984). Otro trabajo ha mostrado que la sobre-expresión de MUC1 confiere el crecimiento independiente del anclaje y la tumorigenicidad (Li y asociados, 2003a; Raina y asociados, 2004; Ren y asociados, 2004; Wei y asociados, 2005), por lo menos en parte a través de la estabilización de la ß-catenina (Huang y asociados, 2005). Además, consistente con una función de sobrevivencia para las células normales del epitelio, la sobre-expresión de las células MUC1 confiere resistencia de las células del carcinoma a la apoptosis inducida por el esfuerzo (Ren y asociados, 2004; Yin y Kufe, 2003; Yin y asociados, 2004; Yin y asociados, 2007).

La pérdida de restricción para la membrana apical permite la formación de complejos con el receptor del factor de crecimiento de la epidermis (EGFR) y la coactivación de la señalización portada por EGFR (Li y asociados, 2001; Ramasamy y asociados, 2007). La sobre-expresión de las células MUC1 por las células del carcinoma también está asociada con la acumulación de la MUC1-C en el citosol y el envío al objetivo de esta subunidad al núcleo (Li y asociados, 2003b; Li y asociados, 2003c) y la mitocondria (Ren y asociados, 2004; Ren y asociados, 2006). Lo que es importante, que es necesaria la oligomerización de la MUC1-C para su envío al objetivo nuclear e interacción con diversos efectuadores (Leng y asociados, 2007). Por ejemplo, el dominio citoplásmico UC1-C (MUC1-CD) funciona como un substrato para las c-Src (Li y asociados, 2001), c-Abl (Raina y asociados, 2006), la cinasa de proteína C6 (Ren y asociados, 2002) y la cinasa de sintasa de glicógeno 3ß (Li y asociados, 1998) e interactúa directamente con el efectuador de la trayectoria Wnt, ß-catenina (Yamamoto y asociados, 1997; Huang y asociados, 2005), y el supresor de tumor p53 (Wei y asociados, 2005). Por lo tanto, aunque parece ser importante la oligomerización, no ha existido una evidencia directa de que la interferencia con la formación del oligómero MUC1 tendría cualquier efecto benéfico en las células del tumor, mucho menos la forma en que esto podría ser logrado.

Breve Descripción de la Invención Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método de inhibición de las células del tumor positivas de MUC1 en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto del péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde la cisteína de la terminal amino de la CQC está cubierta en su terminal-NH2 por al menos un residuo de aminoácidos que no necesita corresponder a la secuencia transmembrana de la MUC-1 de tipo natural. El péptido puede comprender por lo menos 5 residuos consecutivos de MUC1, por lo menos 6 residuos consecutivos de MUC1, por lo menos 7 residuos consecutivos de MUC1, por lo menos 8 residuos consecutivos de MUC1 y la secuencia puede comprender más específicamente los CQCR (SEQ ID NO:54), CQCRR (SEQ ID NO:50), CQCRRR (SEQ ID NO:51), CQCRRRR (SEQ ID NO:52), CQCRRK (SEQ ID NO:4), o CQCRRKN (SEQ ID NO:53). El péptido puede contener no más de 10 residuos consecutivos, 11 residuos consecutivos, 12 residuos consecutivos, 13 residuos consecutivos, 14 residuos consecutivos, 15 residuos consecutivos, 16 residuos consecutivos, 17 residuos consecutivos, 18 residuos consecutivos o 19 residuos consecutivos de MUC1. El péptido puede ser fusionado a un dominio de administración de células, tal como el poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K. El péptido puede comprender todos los L aminoácidos, todos los D aminoácidos, o una mezcla de aminoácidos L y D.

Las células de tumor positivas de MUC1 pueden ser una célula de carcinoma, una célula de leucemia o una célula de mieloma, tal como una célula de carcinoma de próstata o mama. La administración puede comprender la administración intravenosa, intra-arterial, ¡ntratumoral, subcutánea, tópica o intraperitoneal, o local, regional, sistémica, o la administración continua. La inhibición puede comprender inducir la detención del crecimiento de dicha célula del tumor, la apoptosis de dicha célula del tumor y/o la necrosis del tejido del tumor que comprende dicha célula del tumor. El sujeto puede ser un humano.

El método puede comprender además la administración a dicho sujeto de una segunda terapia anti-cáncer. La segunda terapia anti-cáncer puede ser cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia de toxinas, inmunoterapia, y crioterapia. La segunda terapia anti-cáncer puede ser administrada antes de dicho péptido, después de dicho péptido, o al mismo tiempo que dicho péptido. El método puede comprender además el paso de evaluar la expresión de la MUC1 en una célula del tumor de dicho sujeto antes de administrar dicho péptido y/o el método puede comprender además el paso de evaluar el efecto de dicho péptido en la expresión de MUC1 en un tumor de dicho sujeto.

El péptido puede ser administrado en una cantidad de 0.1 a 500 mg/kg/día, o de 10 a 100 mg/kg/día. El péptido puede ser administrado diariamente, por ejemplo, durante 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, un mes, 6 semanas, 8 semanas, dos meses, 12 semanas, o 3 meses. El péptido puede ser administrado semanalmente, por ejemplo, durante 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, o 12 semanas.

En otra modalidad, se proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde la cisteína de la terminal amino de CQC está cubierta en su terminal-NH2 por lo menos un residuo de aminoácidos que no necesita corresponder con la secuencia transmembrana de I a MUC1 de tipo natural, y (b) un vehículo, regulador o diluyente farmacéuticamente aceptable. I El péptido puede ser de por lo menos 5, 6, 7 u 8 residuos consecutivos de MUC1. El péptido puede ser de no más de 10 residuos consecutivos, 11 residuos consecutivos, 12 residuos consecutivos, 13 residuos consecutivos, 14 residuos consecutivos, 15 residuos consecutivos, 16 residuos consecutivos, 17 residuos consecutivos, 18 residuos consecutivos o 19 residuos consecutivos de MUC1. El péptido puede ser fusionado a un dominio de administración de células, tal como el poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K, o un dominio de transducción de células, tal como un dominio de transducción de células HIV tat. El péptido puede ser de por lo menos 8 residuos de longitud, y por lo menos dos residuos no adyacentes de un puente a través de sus cadenas laterales. El puente puede comprender un enlazador, cadenas laterales modificadas químicamente, o la unión de carbohidratos. Los enlazadores pueden comprender modificaciones que estabilizan la estructura alfa-helicoidal de dicho péptido. El regulador puede comprender ß-mercaptoetanol, glutationa o ácido ascórbico, u otros agentes reductores que mantienen el péptido en una condición monomérica.

Todavía en otra modalidad, se proporciona un método para inhibir la oligomerización de las células MUC1 y el transporte nuclear en una célula que comprende poner en contacto una célula que expresa la MUC1 con un péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde la cisteína de la terminal amino de la CQC está cubierta en su terminal-NH2 por al menos un residuo de aminoácidos que no necesita corresponder a la secuencia transmembrana de MUC1 de tipo natural. El péptido puede comprender por lo menos 5 residuos consecutivos de UC1, por lo menos 6 residuos consecutivos de MUC1, por lo menos 7 residuos consecutivos de MUC1, por lo menos 8 residuos consecutivos de MUC1, y la secuencia puede comprender más específicamente CQCR, CQCRR, CQCRRR, CQCRRRR, CQCRRK, o CQCRRKN. El péptido puede contener no más de 10 residuos consecutivos, 11 residuos consecutivos, 12 residuos consecutivos, 13 residuos consecutivos, 14 residuos consecutivos, 15 residuos consecutivos, 16 residuos consecutivos, 17 residuos consecutivos, 18 residuos consecutivos o 19 residuos consecutivos de MUC1. El péptido puede ser fusionado a un dominio de administración de células, tal como poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K. El péptido puede comprender todos los L aminoácidos, todos los D aminoácidos, o una mezcla de aminoácidos L y D.

Las células que expresan el MUC1 pueden ser una célula de tumor, tal como una célula de carcinoma, una célula de leucemia o una célula de mieloma, tal como una célula de carcinoma de próstata o mama. La célula de tumor puede estar localizada en un sujeto vivo. El sujeto vivo puede ser un sujeto humano.

Todavía en otra modalidad adicional, se proporciona un mimético del péptido que imita la estructura y la capacidad de enlace de MUC-1 de un péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde la cisteína de la terminal amino de la secuencia CQC está cubierta en su terminal-NH2 de por lo menos un residuo de aminoácidos que no necesita corresponder con la secuencia transmembrana MUC1 de tipo natural. Una modalidad adicional proporciona un péptido MUC1 de por lo menos 3 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde todos los residuos de aminoácidos de dicho péptido son D-aminoácidos. El péptido puede comprender además la secuencia KRRCQC (SEQ ID NO:49).

La célula cancerosa puede ser, por ejemplo, de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer del colon, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer del estómago, cáncer del hígado, cáncer de los huesos, cáncer hematológico, cáncer del tejido neural, melanoma, cáncer del ovario, cáncer testicular, cáncer de la próstata, cáncer cervical, cáncer vaginal, o células cancerosas de la vejiga.

También se comprenden por la presente invención los métodos para exterminar una célula cancerosa. Los métodos pueden incluir, antes, después, o al mismo tiempo que se realizan los métodos descritos anteriormente, exponiendo al sujeto a una o más terapias adicionales. Las terapias pueden ser, por ejemplo, una o más formas de radiación de ionización y/o uno o más agentes quimioterapéuticos. El uno o más agentes quimioterapéuticos pueden ser, por ejemplo, cisplatino, carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalan, clorambucil, bisulfan, nitrosurea, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoposida, verampil, podofilotoxina, tamoxifen, taxol, transplatino, 5-fluorouracil, vincristina, vinblastina, metotrexato, o un análogo de cualquiera de los anteriores. También está contemplado como terapias de combinación la terapia hormonal, inmunoterapia, terapia de toxinas, crioterapia y cirugía.

Está contemplado que cualquier método o composición aquí descritos pueden ser implementados con respecto a cualquier otro método o composición aquí descrita.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando es utilizada en conjunto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la descripción puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más de uno". La palabra "aproximadamente" significa más o menos 5% del número manifestado.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención podrán ser apreciados a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, deberá quedar entendido, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades específicas de la invención, se proporcionan a modo de ilustración solamente, ya que se les pueden hacer varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la presente invención las cuales podrán ser apreciadas para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Breve Descripción de las Figuras Los siguientes dibujos forman parte de la presente descripción y están incluidos para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede ser entendida mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de la invención.

Figuras de la 1A a la 1D. Oligomerización de células MUC1 en bloques de péptidos MUC1/CQC. (Figura 1A) Muestra una representación esquemática de la subunidad MUC1-C y la secuencia de 72 aminoácidos de la MUC1-CD. Los 15 aminoácidos de la terminal-N (secuencia sombreada) MUC1/CQC y péptidos mutados de MUC1/AQA fueron sintetizados con el dominio de transducción poli-dArg. (Figura 1B) Las células His-MUC1 -CD (1.4 mg/ml) fueron inmovilizadas en un chip de sensor en un aparato BIAcore. La MUC1/CQC fue inyectado sobre el chip en una cantidad de 10 µ?. Los datos de enlace simples fueron analizados por el software BIAevaluation versión 3.0 y adaptados a un modelo de enlace de Languir 1:1. (Figura 1C) Se incubó el His-MUC1 -CD (1.5 mg/ml) purificado con PBS, 200 µ? de MUC1/CQC o 200 µ? de MUC1/AQA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas fueron separadas en gel de poliacrilamida SDS no reductor y analizadas mediante inmunotinción con anti-MUC1 -C. (Figura 1D) Se transfectaron transitoriamente 293 células para expresar un vector vacío o GFP-MUC1 -CD y de Señal-MUC1 -CD. 48 horas después de la transfección , las células fueron tratadas con 5 µ? de MUC1/CQC o MUC1/AQA durante 3 días. Las células fueron entonces recolectadas por medio de inmunotinción con anti-MUC1 -C (cuadro izquierdo). Los lisatos completos de las células también fueron precipitados con el anti-Señal y los precipitados fueron inmunoteñidos con los anticuerpos indicados (cuadros derechos).

Figuras de la 2A a la 2C. Localización nuclear de los bloques de péptidos MUC1/CQC del MUC1-C. (Figura 2A) Se incubaron las células ZR-75-1 con 5 µ? de péptido MUC1/CQC etiquetado FITC por los tiempos indicados y luego fueron analizados por citometría de flujo. El índice de fluorescencia promedio (MFI) está incluido en cada uno de los cuadros. (Figuras 2B y 2C) ZR-75-1 (figura 2B) y MCF-7 (figura 2C) las células fueron incubadas en la presencia de 5 µ? del péptido MUC1/CQC o MUC1/AQA durante 3 días. Los lisatos celulares completos (WCL) (cuadros izquierdos) y los lisatos nucleares (cuadros derechos) fueron inmunoteñidos con los anticuerpos indicados.

Figuras de la 3A a la 3D. El péptido MUC1/CQC induce la detención v necrosis de la fase S. Las células ZR-75-1 (figuras 2A y 2B) y MCF-7 (figuras 2C y 2D) fueron tratadas con 5 µ? de MUC1/CQC o MUC1/AQA durante 3 y 4 días. Las células fueron fijadas y analizadas por su distribución del ciclo celular mediante citometría de flujo (figuras 2A y 2C). El porcentaje de células en las fases G1, S y G2/M está incluido en los cuadros. Las células también fueron teñidas con yoduro de propidio y analizadas por citometría de flujo para la necrosis (figuras 2B y 2D). El porcentaje de las células necróticas se encuentra en los cuadros.

Figuras de la 4A a la 4E. Selectividad de las células UC1/CQC para las células de cáncer de mama que expresan el MUC1. (Figura 4A) Las células ZR-75-1 fueron infectadas de manera estable con un lentivirus vacío (vector) o uno que expresa un siARN MUC1. Los lisatos para las células infectadas fueron inmunoteñidos con los anticuerpos indicados. (Figura 4B) Se dejaron las células ZR-75-1 /vector sin tratar (diamantes), y ZR-75-1/vector (cuadrados) y ZR-75-1 /siARN de MUC1 (triángulos) fueron tratados con 5 µ? del péptido MUC1/CQC por los tiempos indicados. El número de células viables fue determinado mediante la exclusión de azul tripano. (Figura 4C) 293 células se dejaron sin tratar (diamantes), y fueron tratadas con 5 µ? de MUC1/CQC (cuadrados) o MUC1/AQA (triángulos) por los tiempos indicados. El número de células viables fue determinado por la exclusión de azul tripano. (Figura 4D) Las células MCF-10A se dejaron sin tratar (cuadro izquierdo), y fueron tratadas con 5 µ? de MUC1/CQC (cuadro medio) o MUC1/AQA (cuadro derecho). Durante 3 días, las células fueron analizadas por la distribución del ciclo celular. (Figura 4E) Las células MCF-10A se dejaron sin tratar (diamantes), y fueron tratadas con 5 µ de MUC1/CQC (cuadrados) o MUC1/AQA (triángulos) por los tiempos indicados. El número de células viables fue determinado por la exclusión de azul tripano.

Figuras de la 5A a la 5C. Crecimiento de bloques de péptidos MUC1/CQC de los xenoiniertos de tumor de mama ZR- 75-1. (Figura 5A) Los ratones nu/nu Balb-c hembras de 4 a 6 semanas de edad fueron implantados con tapones de 17-ß-estradiol. Después de 24 horas, las células de cáncer de mama ZR-75-1 (incrustadas en matrigel) fueron inyectadas subcutáneamente en el flanco. Cuando los tumores eran de un tamaño de -150 mm3, los ratones fueron acoplados en grupos e inyectados intraperitonealmente con PBS (vehículo de control; cuadros cerrados), 50 mg/kg del péptido UC1/AQA (péptido de control; cuadros abiertos) o 10 mg/kg del péptido MUC1/CQC (triángulos cerrados) diariamente durante 21 días. Otro grupo fue tratado con 50 mg/kg del péptido MUC1/CQC diariamente durante 6 días (triángulos abiertos). Los ratones fueron pesados dos veces a la semana y las mediciones del tumor se realizaron cada 4 días. (Figuras 5B y 5C) En el día 24 (asterisco), los tumores fueron recolectados de los grupos de control y el grupo tratado con 50 mg/kg/día por 6 días fueron teñidos con H&E (figura 5B) y con un anticuerpo contra MUC1 (figura 5C).

Figuras 6A y 6B. Efectos prolongados del péptido MUC1/CQC en los tumores ZR-75-1. (Figura 6A) Se inyectaron los ratones con células ZR-75-1 como se describió en la descripción de la figura 5A. Cuando los tumores tenían una medida de -275 mm3, los ratones fueron acoplados en grupos e inyectados intraperitonealmente con PBS (vehículo de control; cuadros abiertos) o 30 mg/kg del péptido MUC1/CQC (cuadros cerrados) diariamente durante 21 días. Los ratones de control fueron sacrificados en el día 32 cuando los tumores alcanzaron un tamaño de -1200 mm3. Los ratones tratados fueron monitoreados hasta el día 52 cuando los tumores fueron recolectados mediante una tinción H&E (figura 6B).

Figura 7. El MUC1 7-mer inhibe el carcinoma de próstata. Las células de carcinoma de próstata DU145 fueron tratadas con péptidos de 5 µ? de CQC corto (7-mer) y 5 µ? de CQC largo (15-mer) durante 4 días. El crecimiento celular fue medido mediante el ensayo MTT. Los datos representan el porcentaje de inhibición del crecimiento comparado con las células sin tratar (control).

Figura 8. Secuencias de Péptidos Unidos con MUC1-CD. Figura 9A. Los efectos de los péptidos unidos MUC1-CD en el crecimiento de las células de carcinoma de pulmón de célula no pequeña H1650. Para evaluar la sensibilidad de la inhibición de la función de la MUC1, las células H1650 NSCLC fueron tratadas con 1 µ? y 5 µ? del péptido unido MUC1 CQC (GO-200-1B) durante 7 días. El tratamiento de las células H1650 con 5 µ? de GO-200-1B fue asociado con la inhibición importante del crecimiento y luego una disminución en un número de células.

Figura 9B. Efecto del GO-200-2B en la proliferación celular. La línea de células H-1975 de carcinoma de pulmón de célula no pequeña fueron recolectadas en DMEM con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% con 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y 2 mmol/L de L-glutamina. Las células fueron sembradas de nuevo un día antes del tratamiento. Las células fueron tratadas con 5 µ? de GO-200-2B durante 3 días y la viabilidad de las células fue determinada por medio de la exclusión de azul tripano.

Figura 10. Efecto de los péptidos diferentes MUC1-CD de la región CQC en la proliferación de células de carcinoma de mama dependiente de las hormonas. Para determinar si la exposición a diferentes péptidos que contienen MUC1-CD de la región CQC afecta el crecimiento, las células ZR-75-1 de carcinoma de mama fueron tratadas con 5 µ? de diferentes péptidos durante 4 días y monitoreadas para su proliferación celular. De manera importante, existió una inhibición de crecimiento substancial comparada con la de las células que se dejaron sin tratar.

Figura 11. Efecto de los diferentes péptidos MUC1-CD de la región CQC en el crecimiento de células de carcinoma de célula no pequeña. Las células A549 de carcinoma de pulmón de célula no pequeña fueron tratadas con 5 µ? de GO-203, GO-203-2 o GO-203cyc durante 7 días. El número de células viables en el día 7 fue determinado por la exclusión de azul tripano y el porcentaje de inhibición del crecimiento fue calculado comparando el crecimiento celular de las células no tratadas.

Figura 12. Efecto de diferentes péptidos UCI-CD de la región CQC en la proliferación de las células H1975 de carcinoma de célula no pequeña. Las células H1975 de carcinoma de pulmón de célula no pequeña fueron tratadas con 5 µ? de diferentes péptidos MUC1-CD de la región CQC durante 6 días. El número de células viables en el día 6 fue determinado por la exclusión de azul tripano. Los resultados demuestran que el tratamiento de las células H1975 con 5 µ? de los diferentes péptidos estaba asociado con una inhibición importante del crecimiento.

Figura 13. Efecto de diferentes péptidos MUC1-CD de la región CQC en el crecimiento de células de carcinoma de mama triple negativo. Las células MDA-MB-231 de carcinoma de mama triple negativo fueron tratadas con 5 µ? de diferentes péptidos MUC1-CD de la región CQC durante 6 días. El número de células viables en el día 6 fue determinado por la exclusión de azul tripano. Los resultados demuestran que el tratamiento de las células MDA-MB-231 con diferentes péptidos estaba asociado con una inhibición importante del crecimiento.

Figura 14. Efecto de los péptidos GO-203 más cortos en la proliferación de las Células de Cáncer de Mama ZR-75-1. Las células de cáncer de mama ZR-75-1 humanas fueron cultivadas en RPMI1640 suplementado por suero fetal bovino inactivado por calor al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina. Las células fueron tratadas con diferentes péptidos en cantidades de 5 µ? diarias durante 4 días y la viabilidad de las células fue determinada por la exclusión de azul tripano. En contrataste con GO-210, el tratamiento de las células de carcinoma de mama ZR-75-1 con 5 µ? de GO-203 (SEQ ID NO:53), GO-207 (SEQ ID NO:4), GO-208 (SEQ ID NO:50) y GO-209 (SEQ ID NO:54) cada día durante 4 días fue asociado con una inhibición importante del crecimiento.

Figuras de la 15A a la 15D. Efectos de las células GO-203 en combinación con diferentes fármacos anti-cáncer. Las células ZR-75-1 fueron expuestas a las concentraciones indicadas del Cisplatino (figura 15A), Doxorubicina (figura 15B), rh-TNF-a (figura 15C) y Taxol (figura 15D) solo o en combinación con GO-203. El tratamiento fue consecutivo para el Cisplatino, Doxorubicina y Taxol en donde las células fueron expuestas a estos agentes durante 72 horas seguidos por el tratamiento con 5 µ? de GO-203 durante 72 horas. En los estudios con rh-TNF, las células fueron expuestas consecutivamente a diferentes concentraciones de rh-TNF solas o en combinación con 5 µ? de GO-203 durante 72 horas. Los ensayos de MTS fueron utilizados para determinar la sobrevivencia de las células.

Figura 16. El GO-203 es aditivo o sinérgico con los agentes anti-cáncer. Las gráficas muestran la combinación de los índices contra los niveles de los efectos diferentes (fracción afectada). El nivel de efecto fue obtenido tratando las células con las combinaciones indicadas de los fármacos anti-cáncer y Descripción Detallada de la Invención I. La Presente Invención Las células MUC1 han sido estudiadas extensamente por los inventores y otros por su rol en el cáncer. Como se explicó anteriormente, la MUC1 humana es una glicoproteína heterodimérica, traducida como un solo polipéptido y disociada en las subunidades de la terminal-N y terminal-C en el retículo endoplásmico (Ligtenberg y asociados, 1992; Macao y asociados, 2006; Levitin y asociados, 2005). La sobre-expresión aberrante de la MUC1, como se encuentra en la mayor parte de los carcinomas humanos (Kufe y asociados, 1984), confiere el crecimiento independiente del anclaje y la tumorigenicidad (Li y asociados, 2003a; Huang y asociados, 2003; Schroeder y asociados, 2004; Huang y asociados, 2005). Otros estudios han demostrado que la sobre-expresión de MUC1 confiere resistencia a la apoptosis inducida por el esfuerzo oxidativo y los agentes anti-cáncer genotóxicos (Yin y Kufe, 2003; Ren y asociados, 2004; Raina y asociados, 2004; Yin y asociados, 2004; Raina y asociados, 2006; Yin y asociados, 2007).

La familia de las mucinas secretadas y atadas funciona para proporcionar una barrera protectora de la superficie celular del epitelio. Con el daño a la capa del epitelio, las uniones estrechas entre las células vecinas fue interrumpida, y la polaridad es pérdida conforme las células inician un programa de reparación inducido por heregulina (Vermeer y asociados, 2003). La MUC1-N es derramada de la superficie celular (Abe y Kufe, 1989), dejando que la MUC1-C funcione como un transductor de las señales de esfuerzo ambiental al interior de la célula. En este aspecto, la superficie de la célula MUC1-C forma complejos con los elementos de la familia receptora ErbB, y la MUC1-C es enviada al objetivo al núcleo en la respuesta al estímulo de la heregulina (Li y asociados, 2001; Li y asociados, 2003c). La MUC1-C también funciona para integrar el receptor ErbB y las trayectorias de señalización Wnt a través de las interacciones directas entre el dominio citoplásmico MUC1 (CD) y los elementos de la familia de catenina (Huang y asociados, 2005; Li y asociados, 2003c; Yamamoto y asociados, 1997; Li y asociados, 1998; Li y asociados, 2001; Li y Kufe, 2001). Otros estudios han demostrado que la MUC1-CD es fosforilada por la cinasa de sintasa de glicógeno 3ß, c-Src, la cinasa de proteína C6, y c-Abl (Raina y asociados, 2006; Li y asociados, 1998; Li y asociados, 2001; Ren y asociados, 2002).

Los mecanismos responsables del envío al objetivo nuclear de la MUC1-C no son claros. Las proteínas que contienen una señal de localización nuclear clásica (NLS) son importadas en núcleos por el primer enlace para la importina a y luego, a la vez, la importina ß (Weis, 2003). La importina de cargo a/ß es un complejo que se aloja en el poro nuclear enlazándose a las nucleoporinas y es transportada a través del poro por un mecanismo dependiente del Ran GTPase. Las NLSs clásicas son monopartitas con una sola acumulación de 4 a 5 aminoácidos básicos o bipartitas con dos acumulaciones de aminoácidos básicos separados por un enlazador de 10 a 12 aminoácidos. La MUC1-CD contiene un patrón RRK que no se conforma a un monopartita prototípica NLS (Hodel y asociados, 2002). Sin embargo, ciertas proteínas que contienen el NLS no clásico son transportadas a través del poro nuclear enlazándolas directamente con la importina ß (Kau y asociados, 2004). La importina ß se asocia con varias nucleoporinas (Ryan y Wente, 2000), incluyendo la Nup62, la cual se encuentra localizada tanto en las caras citoplásmicas como nucleoplásmicas de los complejos del poro nuclear (Percipalle y asociados, 1997). Otros estudios han indicado que la ß-catenina es importada dentro del núcleo por un mecanismo de importina y nucleoporina independiente (Suh y Gumbiner, 2003).

En 2006, los inventores reportaron que la MUC1 es importada en núcleos por un mecanismo que comprende el enlace al Nup62. Ellos también demostraron que la MUC1 forma oligómeros a través del patrón CQC en el dominio citoplásmico de MUC1 y que la oligomerización de MUC1 es necesaria para la importación nuclear. Aquí, han extendido este trabajo para comprender un entendimiento adicional del rol que el patrón CQC juega en la formación del oligómero. También han demostrado que los péptidos cortos que corresponden a esta región pueden interrumpir la formación del oligómero de MUC1, evitando el transporte dentro del núcleo de las células del tumor. Estos péptidos pueden inhibir el crecimiento de la célula de tumor, así como inducir la apoptosis de dichas células y hasta la necrosis del tejido del tumor. Éste y otros aspectos de la presente invención se describirán con mayor detalle más adelante.

II. MUC1 A. Estructura La MUC1 es una glicoproteína de tipo de mucina que es expresada en los límites apicales de las células normales secretorias del epitelio (Kufe y asociados, 1984). La MUC1 forma un heterodímero que sigue la síntesis como un solo polipéptido y la disociación del precursor en dos subunidades en el retículo endoplásmico (Ligtenberg y asociados, 1992). La disociación puede ser portada por un proceso autocatalítico (Levitan y asociados, 2005). La subunidad MUC1 de la terminal-N de >250 kDa (MUC1 N-ter, MUC1-N) contiene números variables de 20 repeticiones aleatorias de aminoácidos que son imperfectas con las variaciones altamente conservadas y son modificadas por los glicanos enlazados-O (Gendier y asociados, 1988; Siddiqui y asociados, 1988). La MUC1-N está atada a la superficie celular por dimerización con la subunidad de la terminal-C de -23 kDa (MUC1 C-ter, MUC1-C), la cual incluye una región extracelular de 58 aminoácidos, un dominio transmembrana de 28 aminoácidos y un dominio citoplásmico de 72 aminoácidos (CD; SEQ ID NO:1) (Merlo y asociados, 1989). La secuencia MUC1 humana se muestra a continuación: GSVWQLTLAFREGTI NVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSD VPFPFSAQSGAGVPGWGI ALLVLVCVLVALAI VYLI ALAVCQCRRKN YGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAG NGGSSLSYTNPAVAATSANL (SEQ ID NO:2) La secuencia negrita indica el CD, y la porción subrayada es un péptido de inhibición del oligómero (SEQ ID NO:3) descrito en los ejemplos.

Con la transformación del epitelio normal a los carcinomas, la MUC1 es sobre-expresada de manera aberrante en el citosol y sobre la membrana completa de la célula (Kufe y asociados, 1984; Perey y asociados, 1992). La MUC1 asociada con la membrana de la célula es enviada al objetivo para los endosomas mediante la endocitosis portada por clatrina (Kinlough y asociados, 2004). Además, la MUC1-C, pero no la MUC1-N, es enviada al objetivo al núcleo (Baldus y asociados, 2004; Huang y asociados, 2003; Li y asociados, 2003a; Li y asociados, 2003b; Li y asociados, 2003c; Wei y asociados, 2005; Wen y asociados, 2003) y la mitocondria (Ren y asociados, 2004).

B. Función La MUC1 interactúa con los elementos de la familia receptora de ErbB (L¡ y asociados, 2001b; Li y asociados, 2003c; Schroeder y asociados, 2001) y con el efectuador Wnt, la ß-catenina (Yamamoto y asociados, 1997). El receptor del factor de crecimiento de la epidermis y el c-Src fosforilado del dominio citoplásmico de MUC1 (MUC1-CD) en el Y-46 y por lo tanto aumenta el enlace de la MUC1 y la ß-catenina (Li y asociados, 2001a; Li y asociados, 2001 b). El enlace de la MUC1 y la ß-catenina también es regulado por la cinasa de sintasa de glicógeno 3ß y la cinasa de proteína C6 (Li y asociados, 1998; Ren y asociados, 2002). La MUC1 se colocaliza con la ß-catenina en el núcleo (Baldus y asociados, 2004; Li y asociados, 2003a; Li y asociados, 2003c; Wen y asociados, 2003) y la transcripción coactiva de los genes del objetivo Wnt (Huang y asociados, 2003). Otros estudios han mostrado que la MUC1 también se enlaza directamente al p53 y regula la transcripción de los genes del objetivo p53 (Wei y asociados, 2005). Notablemente, la sobre-expresión de la MUC1 es suficiente para inducir el crecimiento independientemente del anclaje y la tumorigenicidad (Huang y asociados, 2003; Li y asociados, 2003b; Ren y asociados, 2002; Schroeder y asociados, 2004).

La mayor parte de las proteínas de la mitocondria son codificadas en el núcleo y son importadas dentro de la mitocondria por medio de los complejos de transubicación en las membranas exterior e interior de la mitocondria. Ciertas proteínas de la mitocondria contienen secuencias de envío al objetivo de la mitocondria de la terminal-N e interactúan con el Tom20 en la membrana externa de la mitocondria (Truscott y asociados, 2003). Otras proteínas de la mitocondria contienen secuencias de envío al objetivo internas e interactúan con el receptor Tom70 (Truscott y asociados, 2003). El trabajo reciente mostró que las proteínas de la mitocondria sin secuencias de envío al objetivo internas son enviadas al Tom70 por un complejo de HSP70 y HSP90 (Young y asociados, 2003). III. Péptidos MUC1 A. Estructura La presente invención contempla el diseño, producción y uso de varios péptidos MUC1. Las características estructurales de estos péptidos son las siguientes. Primero, los péptidos no tienen más de 20 residuos consecutivos de MUC1. Por lo tanto, el término "un péptido que no tiene más de 20 residuos consecutivos", aún cuando incluye el término "que comprende", no puede entenderse que comprenda un número mayor de residuos consecutivos de MUC1. Segundo, los péptidos contendrán el patrón CQC, y también pueden incluir el patrón CQCR, el patrón CQCRR y el patrón CQCRRK. Por lo tanto, los péptidos tendrán, como mínimo, estos tres residuos consecutivos del dominio de MUC1-C. Tercero, los péptidos tendrán por lo menos un residuo de aminoácidos adherido al lado de la terminal-NH2 del primer residuo C del patrón CQC, de modo que el primer residuo C es "cubierto" por dicho al menos un aminoácido enlazado al mismo. Este residuo puede ser natural para la MUC1 (por ejemplo, del dominio transmembrana), puede ser seleccionado de manera aleatoria (cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural o análogos de los mismos), o pueden ser parte de otra secuencia de péptidos (por ejemplo, una secuencia tag para la purificación, una secuencia de estabilización, o un dominio de envío a la célula). En general, los péptidos tendrán 50 residuos o menos, nuevamente, comprendiendo no más de 20 residuos consecutivos de MUC1. La longitud general puede ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ó 50 residuos. Están contemplados los rangos de longitud de los péptidos de 4 a 50 residuos, de 5 a 50 residuos, de 6 a 50 residuos, de 7 a 50 residuos, de 7 a 25 residuos, de 4 a 20 residuos, de 5 a 20 residuos, de 6 a 20 residuos, de 7 a 20 residuos, y de 7 a 15 residuos. El número de residuos consecutivos de MUC1 pueden ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20. Están contemplados rangos de residuos consecutivos de 4 a 20 residuos, de 5 a 20 residuos, de 6 a 20 residuos, de 7 a 20 residuos y de 4 a 15 residuos, de 5 a 15 residuos, de 6 a 15 residuos o de 7 a 15 residuos.

La presente invención puede utilizar una configuración de L-aminoácidos, configuración de D-aminoácidos, o una mezcla de los mismos. Aunque los L-aminoácidos representan la mayoría vasta de los aminoácidos encontrados en las proteínas, los D-aminoácidos encontrados en algunas proteínas producidos por organismos marinos exóticos, tales como el caracol de cono. También pueden ser abundantes componentes de las paredes de la célula péptidoglicano de las bacterias. La D-serina puede actuar como un neurotransmisor en el cerebro. La convención L y D para la configuración de aminoácidos se refiere no a la actividad óptica del aminoácido mismo, sino más bien a la actividad óptica del isómero del gliceraldehído del cual ese aminoácido puede ser sintetizado teóricamente (el D-gliceraldehído es dextro-rotatorio; el L-gliceraldehído es levo-rotatorio).

Una forma de un péptido "todo-D" es un péptido retro-inverso. La modificación retro-inversa de los polipéptidos que ocurren de manera natural comprende el ensamblaje sintético de aminoácidos con la a-carbón estereoquímica opuesta a la de los L-aminoácidos correspondientes, por ejemplo, D-aminoácidos en orden inverso con respecto a la secuencia natural del péptido. Un análogo retro-inverso por lo tanto ha invertido las terminales e invertido la dirección de los enlaces péptidos (NH-CO en vez de CO-NH) aunque aproximadamente mantiene la topología de las cadenas laterales como en la secuencia natural del péptido. Ver la Patente Norteamericana No. 6,261,569, incorporada a la presente descripción como referencia.

Como se mencionó anteriormente, la presente invención contempla la fusión o conjugación de un dominio de envío de células (también denominado un vector de envío de células, o un dominio de transducción de células). Dichos dominios son bien conocidos en la técnica y generalmente son caracterizados como péptidos anfipáticos o catiónicos cortos y derivados péptidos, que con frecuencia contienen residuos múltiples de Usina y arginina (Fischer, 2007). De interés particular son las secuencias de poli-D-Arg y poli-D-Lys (por ejemplo, los residuos dextro-rotatorios, de ocho residuos de longitud), mientras que los otros se muestran en la Tabla 1, siguiente.

TAB LA 1 PÉPTIDOS CDD/CTD SEQ B0 O QAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE 5 RQIKIWFQNRRMKW K 6 RRMKWKK. 7 RRWRRWWRRWWRRWRR 8 RGGRLSYSRRRFSTSTGR 9 YGRKKRRQRRR 10 RKKRRQRRR 11 YARAAARQARA 12 RRRRRRRR 13 K KKKKK 14 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKXIL 15 LLILLRRRIRKQANAHSK 16 SRRHHCRSKAKRSRHH 17 NRARRNRRRVR 18 RQLRIAGRRLRGRSR 19 KLIKGRTPIKFGK 20 RRIPNRRPRR 21 KLALKLALKALKAALKLA 22 PÉPTIDOSCDD/CTD SEQ ?) NO KLAKLAKKLAKLAK 23 GALFLGFLGAAGSTOGAWSQPKKKRKV 24 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 25 GALFLGWLGAAGSTMGAKKKRKV 26 MGLGLHLLVLAAALQGAKSKRKV 27 AAVALLPAVLLALLAPAAANYKKPKL 28 MA LGYWLLALFVTM TDVGLCK RPKP 29 LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 30 DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPXPD 31 PPPPPPPPPPPPPP 32 VRLPPPVRLPPPVRLPPP 33 PRPLPPPRPG 34 SVRRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPP 35 TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK 36 GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS 37 KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK 38 ALWMTLLKKVLKAAAKAALNAVLVGANA 39 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 40 INLKALAALAKKIL 41 GFFALIPKIISSPLPKTLLSAVGSALGGSGGQE 42 LAKWALKQGFAKLKS 43 SMAQDHSTIGDLVKWIIQTVNXFTK 44 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKQRIKDFLANLVPRTES 45 LKKLLKKLLKKLL KLLKKL 46 KLKLKLKLKLKLKLKLKL 47 PAWRKAFRWAWRMLKKAA 48 También como se mencionó anteriormente, los péptidos modificados para su uso in vivo mediante la adición, en los extremos de la terminal amino y/o carboxilo, de un agente de bloqueo están contemplados para facilitar la sobrevivencia del péptido in vivo. Esto puede ser útil en aquellas situaciones en las cuales las terminales péptidas tienden a ser degradadas por las proteasas antes de la asimilación celular. Dichos agentes de bloqueo pueden incluir, sin limitación, secuencias de péptidos relacionadas adicionales o no relacionadas que pueden ser enlazadas a los residuos de la terminal amino y/o carboxilo del péptido que va a ser administrado. Estos agentes pueden ser agregados ya sea químicamente durante la síntesis del péptido, o mediante la tecnología de ADN recombinante por métodos familiares en la técnica. Alternativamente, los agentes de bloqueo tales como el ácido piroglutámico y otras moléculas conocidas en la técnica pueden ser enlazadas a los residuos de la terminal amino y/o carboxilo.

B. Síntesis Será provechoso producir péptidos que utilizan técnicas sintéticas de fase sólida (Merrifield, 1963). Otras técnicas de síntesis de péptidos son bien conocidas para los expertos en el arte (Bodanszky y asociados, 1976; Síntesis de Péptidos (Peptide Synthesis), 1985; Solid Phase Peptide Synthelia, 1984). Los grupos protectores apropiados para utilizarse en dicha síntesis se encontrarán en los textos anteriores, así como en los Grupos Protectores en Química Orgánica, 1973. Estos métodos sintéticos comprenden la adición consecutiva de uno o más residuos de aminoácidos o residuos protegidos de aminoácidos adecuados para una cadena de péptidos en crecimiento. Normalmente, ya sea el grupo amino o carboxilo del primer residuo de aminoácidos es protegido por un grupo protector removible selectivamente, y adecuado. Un grupo protector removible selectivamente diferente es utilizado para los aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, tal como Usina.

Utilizando la síntesis de fase sólida como ejemplo, los aminoácidos protegidos o derivados son enlazados a un soporte sólido inerte a través de sus grupos carboxilo o amino no protegidos. El grupo protector amino o carboxilo entonces es removido selectivamente y el siguiente aminoácido de la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) protegido adecuadamente es mezclado y se hace reaccionar con el residuo ya adherido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo entonces es removido de su residuo de aminoácidos recientemente agregado, y el siguiente aminoácido (protegido convenientemente) entonces es agregado, y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados han sido enlazados en la secuencia correcta, cualesquiera grupos protectores de la terminal o del grupo lateral (y el soporte sólido) son removidos consecutivamente o concurrentemente, para producir el péptido final. Los péptidos de la presente invención están desprovistos preferentemente de aminoácidos bencilados o metilbencilados. Dichas porciones de grupos protectores pueden ser utilizadas en el curso de la síntesis, pero son removidos antes de que sea utilizado el péptido. Las reacciones adicionales pueden ser necesarias, como se describen en cualquier parte de esta descripción, para formar enlaces intramoleculares para restringir la conformación.

Al lado de los 20 aminoácidos estándar que pueden ser utilizados, existe un número vasto de aminoácidos "no-estándar". Dos de estos pueden ser especificados por el código genético, pero son más bien raros en las proteínas. La selenocisteína es incorporada en algunas proteínas en el codón UGA, el cual generalmente es un codón de detención. La pirrolisina es utilizada por algunas arcas metanogénicas en enzimas que ellos utilizan para producir el metano. Es codificada por un codón UAG. Los ejemplos de los aminoácidos no estándar que se encuentran en las proteínas incluyen lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, deshidroalanina y ácido neurotransmisor gama-aminobutírico. Los aminoácidos no estándar ocurren con frecuencia como intermediarios en las trayectorias metabólicas para los aminoácidos estándar - por ejemplo, la ornitina y la citrulina ocurren en el ciclo de urea, parte del catabolismo de los aminoácidos. Los aminoácidos que no son estándar generalmente son formados a través de modificaciones a los aminoácidos estándar. Por ejemplo, la homocisteína es formada a través de una trayectoria de transsulfuración o por medio de desmetilación de metionina por medio del metabolito intermediario de metionina S-adenosilo, mientras que la hidroxiprolina se hace por medio de una modificación de la prolina posterior a la traducción.

C. Enlazadores Los enlazadores y agentes de reticulación pueden ser utilizados para fusionar los péptidos MUC1 a otras secuencias proteináceas. Los reactivos de reticulación bifuncional han sido extensamente utilizados para una variedad de propósitos incluyendo la preparación de matrices de afinidad, la modificación y estabilización de estructuras diversas, la identificación del ligando y los sitios de enlace del receptor, y los estudios estructurales. Los reactivos homobifuncionales que son portadores de dos grupos funcionales idénticos probaron ser altamente eficientes para inducir la reticulación entre las macromoléculas o subunidades idénticas o diferentes de una macromolécula, y el enlace de los ligandos del polipéptido a sus sitios de enlace específicos. Los reactivos heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales diferentes. Aprovechando las reactividades diferenciales de los dos grupos funcionales diferentes, se puede controlar la reticulación tanto selectivamente como consecutivamente. Los reactivos de reticulación bifuncional pueden ser divididos de acuerdo con la especificidad de sus grupos funcionales, por ejemplo, amino-, sulfidrilo-, guanidino-, indol-, o grupos específicos carboxilo. De estos, los reactivos dirigidos a los grupos libres amino se han convertido en especialmente populares debido a su disponibilidad comercial, facilidad de síntesis y las condiciones de reacción suaves bajo las cuales pueden ser aplicados. La mayor parte de los reactivos de reticulación heterobifuncionales contienen un grupo amina reactivo primario y un grupo reactivo tiol.

En otro ejemplo, los reactivos de reticulación heterobifuncionales y los métodos para utilizar los reactivos de reticulación se describen en la Patente Norteamericana No. 5,889,155, específicamente incorporada en su totalidad al presente documento como referencia. Los reactivos de reticulación combinan un residuo de hidrazida nucleofílico con un residuo de maleimida electrofílico, permitiendo el acoplamiento en un ejemplo, de los aldehidos a los tioles libres. El reactivo de reticulación puede ser modificado para reticular varios grupos funcionales y por lo tanto útiles para la reticulación de polipéptidos. En los casos en donde un péptido particular no contiene un residuo sensible para un reactivo de reticulación determinado en su secuencia natural, se pueden utilizar cambios conservadores genéticos o cambios sintéticos de aminoácidos en la secuencia primaria.

Otro de los enlazadores en el contexto de los péptidos como productos terapéuticos son los denominados "Péptidos Unidos" de tecnología de Aileron Therapeutics. El método general para la "unión" de un péptido es que dos residuos clave dentro del péptido son modificados mediante el enlace de los enlazadores a través de las cadenas laterales de aminoácidos. Una vez sintetizados, los enlazadores son conectados a través de un catalizador, creando de esta manera un puente que restringe físicamente el péptido dentro de su forma a-helicoidal natural. Además de ayudar a retener la estructura natural necesaria para interactuar con una molécula objetivo, esta conformación también proporciona estabilidad contra las peptidasas así como propiedades de permeación de células. Las Patentes Norteamericanas Nos. 7,192,713 y 7,183,059, que describen esta tecnología, son incorporadas a la presente descripción como referencia. Ver también la publicación de Schafmeister y asociados, Journal of the American Chemical Society, 2000. 122(24): páginas 5891 a 5892.

D. Diseño, Variantes y Análogos La presente invención se enfoca en péptidos que comprenden la secuencia CQC. Tiene identificada esa estructura clave en la formación del oligómero MUC1, los inventores también contemplan que se pueden emplear las variantes de la secuencia CQC. Por ejemplo, ciertos aminoácidos no naturales que satisfacen las restricciones estructurales de la secuencia CQC pueden ser substituidos sin una pérdida, y quizá con una mejora en, la función biológica. Además, los inventores actuales también contemplan que los compuestos similares estructuralmente pueden ser formulados para imitar sus porciones clave del péptido o polipéptidos de la presente invención. Dichos compuestos, los cuales pueden ser denominados peptidomiméticos, pueden ser utilizados de la misma manera que los péptidos de la invención y, de ahí que, también son equivalentes funcionales.

Ciertos miméticos que imitan los elementos de la estructura secundaria y terciaria de las proteínas se describen en la publicación de Johnson y asociados, (1993). La explicación subyacente detrás del uso de los péptidos miméticos es que la estructura del péptido de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de un modo tal como para facilitar las interacciones moleculares, tales como aquellas de anticuerpo y/o antígeno. Un péptido mimético por lo tanto es diseñado para permitir interacciones moleculares similares a la de la molécula natural.

Los métodos para generar las estructuras específicas han sido descritos en la técnica. Por ejemplo, las imitaciones de la a-hélice se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,446,128; 5,710,245; 5,840,833; y 5,859,184. Los métodos para generar las vueltas ß y las protuberancias ß se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,440,013; 5,618,914; y 5,670,155. Otros tipos de vueltas miméticas incluyen la inversa y las vueltas y. Las vueltas miméticas inversas se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,475,085 y 5,929,237, y las vueltas ? miméticas se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,672,681 y 5,674,976.

Como se usa en la presente descripción, "modelación molecular" significa un análisis cuantitativo y/o cualitativo de la estructura y función de una interacción física de proteína a proteína basada en la información estructural tridimensional y los modelos de interacción de proteína a proteína. Esto incluye la dinámica molecular basada numérica convencional y los modelos de minimización de energía, modelos gráficos de computadora interactiva, modelos mecánicos moleculares modificados, geometría de distancia y otros modelos de restricción basados en la estructura. La modelación molecular generalmente es realizada utilizando una computadora y puede ser optimizada adicionalmente utilizando métodos conocidos. Los programas de cómputo que utilizan los datos de cristalografía de rayos-X son particularmente útiles para diseñar dichos compuestos. Los programas tales como RasMol, por ejemplo, pueden ser utilizados para generar modelos tridimensionales. Los programas de cómputo tales como INSIGHT (Accelrys, Burlington, MA), GRASP (Anthony Nicholls, Columbia University), Dock (Molecular Design Institute, University of California en San Francisco), y Auto-Dock (Accelrys) permiten la manipulación adicional y la capacidad para introducir nuevas estructuras. Los métodos pueden comprender el paso adicional de producir a un aparato de salida un modelo de una estructura 3-D del compuesto. Además, los datos 3-D de los compuestos candidatos pueden ser comparados con una base de datos de cómputo de, por ejemplo, estructuras 3-D.

Los compuestos de la presente invención también pueden ser diseñados interactivamente de la información estructural de los compuestos aquí descritos utilizando otras técnicas de modelación/diseño basadas en la estructura (ver, por ejemplo, Jackson, 1997; Jones y asociados, 1996). Los compuestos candidatos pueden entonces ser probados en ensayos estándar que son familiares para los expertos en la técnica. Los ensayos de ejemplo se describen en la presente descripción.

La estructura 3-D de las macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, y lípidos) pueden ser determinadas de los datos obtenidos por una variedad de metodologías. Estas metodologías, las cuales han sido aplicadas de la manera más efectiva a la evaluación de la estructura 3-D de las proteínas, incluyen: (a) cristalografía de rayos-x; (b) espectroscopio de resonancia magnética nuclear (RMN); (c) análisis de restricciones de distancia física formada entre los sitios definidos en una macromolécula, por ejemplo, reticulaciones químicas intramoleculares entre los residuos en una proteína (por ejemplo, PCT/US00/14667, cuya descripción está incorporada al presente documento en su totalidad como referencia), y (d) los métodos de modelación molecular basados en un conocimiento de la estructura primaria de una proteína de interés, por ejemplo, técnicas de modelación de homología, algoritmos de encordado, o la estructura ab initio de modelación que utiliza los programas de cómputo tales como MONSSTER "Modelación de Nuevas Estructuras de Restricciones Secundarias y Terciarias" (M deling Of New Structures from Secondary and Tertiary Restraints) (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional No. PCT/US99/11913, cuya descripción está incorporada a la presente descripción como referencia en su totalidad). Otras técnicas de modelación molecular pueden también ser empleadas de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, Cohén y asociados, 1990; Navia y asociados, 1992), cuyas descripciones están incorporadas a la presente descripción como referencia en su totalidad). Todos estos métodos producen datos que son sensibles al análisis de cómputo. Otros métodos espectroscópicos que pueden también ser útiles en el método de la presente invención, pero que no proporcionan actualmente un detalle estructural de nivel atómico acerca de las biomoléculas, incluyen el dicroísmo circular y la fluorescencia y la espectroscopia de absorbencia de luz visible/ultravioleta. Un método preferido de análisis es una cristalografía de rayos-x. Se proporcionan más adelante las descripciones del procedimiento y de la espectroscopia RMN.

Cristalografía de rayos-X. La cristalografía de rayos-X está basada en la difracción de la radiación-X de una longitud de onda característica por medio de nubes de electrones que rodean los núcleos atómicos en un cristal de una molécula o complejo molecular de interés. La técnica utiliza cristales de macromoléculas biológicas purificadas o complejos moleculares (pero estos frecuentemente incluyen componentes de solvente, cofactores, substratos, u otros ligandos) para determinar la resolución cercana a la atómica de los átomos que forman la macromolécula biológica particular. Un requisito previo para solucionar la estructura 3-D por la cristalografía de rayos-x es un cristal bien ordenado que difractará los rayos-x de una manera fuerte. El método dirige un rayo de rayos-x en una adaptación de repetición regular, de muchas moléculas idénticas de modo que los rayos-x son difractados desde la adaptación en un patrón del cual la estructura de una molécula individual puede ser recuperada. Los cristales bien ordenados de, por ejemplo, las moléculas de proteína globular son grandes, esféricos y objetos elipsoidales con superficies irregulares. Los cristales contienen canales grandes entre las moléculas individuales. Estos canales, generalmente ocupan más de una mitad del volumen del cristal, son llenados con moléculas desordenadas de solvente, y las moléculas de proteína se encuentran en contacto entre ellas solamente en unas pocas regiones pequeñas. Esta es una razón por la cual las estructuras de las proteínas en los cristales generalmente son la misma que aquellas de las proteínas en solución.

Los métodos para obtener las proteínas de interés se describen más adelante. La formación de los cristales depende de un número de diferentes parámetros, incluyendo el pH, temperatura, la concentración de la macromolécula biológica, la naturaleza del solvente y el precipitante, así como la presencia de iones agregados o ligandos de la proteína. Muchos experimentos de cristalización de rutina pueden ser necesarios para seleccionar todos estos parámetros para las combinaciones que dan un cristal adecuado para el análisis de difracción de rayos-x. Los robots de cristalización pueden automatizar y elevar la velocidad del trabajo de las preparaciones reproducibles de un gran número de experimentos de cristalización (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,790,421, cuya descripción está incorporada en su totalidad al presente documento como referencia).

La cristalización del polipéptido ocurre en soluciones en las cuales la concentración del polipéptido excede su solubilidad máxima (es decir, que la solución del polipéptido está supersaturada). Cada una de las soluciones puede ser restaurada al equilibrio reduciendo la concentración del polipéptido, preferentemente a través de la precipitación de los cristales del polipéptido. Con frecuencia, los polipéptidos pueden ser inducidos a cristalizarse a partir de soluciones supersaturadas agregando agentes que alteran las cargas de superficie del polipéptido o perturban la interacción entre el polipéptido y el agua para promover las asociaciones que conducen a la cristalización.

Las cristalizaciones generalmente se llevan a cabo a temperaturas entre 4°C y 20°C. Con frecuencia se utilizan substancias conocidas como "precipitantes" para disminuir la solubilidad del polipéptido en una solución concentrada formando una precipitación desfavorable energéticamente en una capa agotada alrededor de las moléculas del polipéptido (Weber, 1991). Además de los precipitantes, otros materiales a veces son agregados a la solución de cristalización del polipéptido. Estas incluyen reguladores para ajusfar el pH de la solución y sales para reducir la solubilidad del polipéptido. En la técnica se conocen varios precipitantes e incluyen los siguientes: etanol, 3-eti I-2-4 pentanediol, y muchos de los poliglicoles, tales como polietilénglicol (PEG). Las soluciones de precipitación pueden incluir, por ejemplo, del 13% al 24% de PEG 4000, del 5% al 41% de sulfato de amonio, y cloruro de sodio de 1.0 a 1.5 M, y un pH en un rango de 5.0 a 7.5. Otros aditivos pueden incluir Hepes 0.1 M, del 2% al 4% de butanol, de 20 a 100 mM de acetato de sodio, de 50 a 70 mM de ácido cítrico, de 120 a 130 mM de fosfato de sodio, 1 mM de ácido etilendiamin tetra-acético (EDTA), y 1 mM de ditiotreitol (DTT). Estos agentes son preparados en reguladores y son agregados en forma de gotas en diferentes combinaciones al regulador de cristalización. Las proteínas que van a ser cristalizadas pueden ser modificadas, por ejemplo, mediante fosforilación o utilizando una imitación de fosfato (por ejemplo, tungstato, cacodilato, o sulfato).

Los métodos de cristalización del polipéptido utilizados generalmente incluyen las siguientes técnicas: lote, colgado de gotas, el inicio de semilla, y la diálisis. Cada uno de estos métodos, es importante para promover la cristalización continua después de la nucleación manteniendo una solución supersaturada. En el método de lote, el polipéptido es mezclado con precipitantes para lograr la supersaturación, y el recipiente es sellado y colocado a un lado hasta que aparecen los cristales. En el método de diálisis, el polipéptido es retenido en una membrana de diálisis sellada que es colocada dentro de una solución que contiene el precipitante. El equilibrio en la membrana aumenta las concentraciones del polipéptido y el precipitante, ocasionando de esta manera que el polipéptido alcance niveles de supersaturación.

En la técnica de gota colgante preferida (McPherson, 1976), una mezcla inicial de polipéptidos es creada agregando un precipitante a una solución concentrada de polipéptido. Las concentraciones del polipéptido y los precipitantes son tales que en esta forma inicial, el polipéptido no se cristaliza. Una gota pequeña de esta mezcla es colocada en un portaobjetos de vidrio que es invertido y suspendido sobre un recipiente de una segunda solución. Luego el sistema es sellado. Generalmente, la segunda solución contiene una concentración más alta de precipitante y otro agente de deshidratación. La diferencia en las concentraciones del precipitante ocasionan que la solución de proteína tenga una presión de vapor más alta que la segunda solución. Debido a que el sistema que contiene las dos soluciones es sellado, se establece un equilibrio, y el agua de la mezcla del polipéptido se transfiere a la segunda solución. Este equilibrio aumenta la concentración del polipéptido y el precipitante en la solución del polipéptido. En una concentración crítica del polipéptido y el precipitante, se puede formar un cristal del polipéptido.

Otro método de cristalización introduce un sitio de nucleación en una solución concentrada del polipéptido. Generalmente, una solución concentrada del polipéptido es preparada y un cristal de semilla del polipéptido es introducido dentro de esta solución. Si las concentraciones del polipéptido y cualesquiera precipitantes son correctas, el cristal de semilla proporcionará un sitio de nucleación alrededor del cual se forma un cristal más grande.

Todavía otro método de cristalización es un método de electrocristalización en el cual se hace uso de los momentos del dipolo de las macromoléculas de la proteína que se auto-alinean en la capa de Helmholtz adyacentes a un electrodo (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,597,457, cuya descripción está incorporada en su totalidad al presente documento como referencia).

Algunas proteínas pueden ser recalcitrantes para la cristalización. Sin embargo, hay disponibles varias técnicas para los expertos en el arte para inducir la cristalización. Por ejemplo, la remoción de los segmentos flexibles del polipéptido en el extremo de la terminal amino o carboxilo de la proteína puede facilitar la producción de muestras de proteína cristalina. La remoción de dichos segmentos puede hacerse utilizando técnicas de biología molecular o tratamiento de la proteína con proteasas tales como tripsina, quimiotripsina, o subtilisina.

En experimentos de difracción, un rayo angosto y paralelo de rayos-x es tomado de la fuente de rayos-x y dirigido sobre el cristal para producir rayos difractados. Los rayos de incidencia primaria ocasionan daño a ambos la macromolécula y las moléculas del solvente. Por lo tanto, el cristal es, enfriado (por ejemplo, a temperaturas de entre -220eC y -50eC) para prolongar su tiempo de vida. El rayo primario puede golpear el cristal de muchas direcciones para producir todos los puntos de difracción posibles, de modo que el cristal sea girado en el rayo durante el experimento. Las gotas difractadas son registradas en una película o por medio de un detector electrónico. La película expuesta tiene que ser digitalizada y cuantificada en un aparato de exploración, mientras que los detectores electrónicos alimentan las señales que ellos detectan directamente dentro de una computadora. Los detectores del área electrónica reducen de manera importante el tiempo requerido para recolectar y medir los datos de difracción. Cada rayo de difracción, el cual es registrado como un punto en la película o una placa detectora, es definido por tres propiedades: la amplitud, la cual es medida de la intensidad de la gota; la longitud de onda, la cual es ajustada por la fuente de rayos-x; y la fase, la cual es perdida en los experimentos de rayos-x. Todas estas tres propiedades son necesarias para todos los rayos difractados con el objeto de determinar las posiciones de los átomos que originan los rayos difractados. Un medio para determinar las fases es denominado el Reemplazo Isomorfo Múltiple (MIR), el cual requiere la introducción de difusores de rayos-x exógenos (por ejemplo, átomos pesados tales como átomos de metal) dentro de la celda de unidad del cristal. Para una descripción más detallada del MIR, consultar, la Patente Norteamericana No. 6,093,573 (columna 15) cuya descripción está incorporada en su totalidad al presente documento como referencia.

Las coordenadas atómicas se refieren a las coordenadas Cartesianas (posiciones x, y, y z) derivadas de las ecuaciones matemáticas que comprenden la síntesis de Fourier de los datos derivados de los patrones obtenidos por medio de la difracción de un rayo monocromático de rayos-x por los átomos (centros de difusión) de la macromolecula biológica de interés en forma de cristal. Los datos de difracción son utilizados para calcular ios mapas de densidad del electrón de las unidades de repetición en el cristal (celdas de unidad). Los mapas de densidad de los electrones son utilizados para establecer las posiciones (coordenadas atómicas) de los átomos individuales dentro de la celda de unidad del cristal. Los valores absolutos de las coordenadas atómicas transportan las relaciones espaciales entre los átomos debido a que los valores absolutos ascritos a las coordenadas atómicas pueden ser cambiados mediante un movimiento de rotación y/o translación a lo largo de los ejes x, y, y/o z, juntos o por separado, mientras que se mantiene las mismas relaciones espaciales relativas entre los átomos. Por lo tanto, una macromolécula biológica (por ejemplo, una proteína) cuyo conjunto de valores absolutos de coordenadas atómicas puede ser ajustado a manera de rotación o traslación para que coincida con un conjunto de valores previamente determinados de un análisis de otra muestra es considerado que tiene las mismas coordenadas atómicas que aquellas obtenidas de la otra muestra.

Los detalles adicionales sobre la cristalografía de rayos-x se pueden obtener de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2005/0015232, la Patente Norteamericana No. 6,093,573 también pendientes y la Solicitudes Internacionales Nos. PCT/US99/18441 , PCT/U S99/11913 , y PCT/US00/03745. Las descripciones de todos estos documentos de patente están incorporadas en su totalidad como referencia a la presente descripción.

Espectroscopia RMN. Mientras que la cristalografía de rayos-x requiere cristales solos de una macromolécula de interés, las mediciones de RMN se llevan a cabo en una solución bajo condiciones cercanas a las fisiológicas. Sin embargo, las estructuras derivadas de RMN no son tan detalladas como las estructuras derivadas del cristal.

Aunque el uso de la espectroscopia RMN estaba limitada hasta muy recientemente a la elucidación de la estructura 3-D de las moléculas relativamente pequeñas (por ejemplo, las proteínas de 100 a 150 residuos de aminoácidos), los avances recientes que incluyen la etiquetación isotópica de la molécula de interés y la espectroscopia optimizada por relajación transversal (TROSY) han permitido que la metodología sea extendida al análisis de moléculas mucho más grandes, por ejemplo, proteínas con un peso molecular de 110 kDa (Wider, 2000).

La técnica de RMN utiliza la radiación de radiofrecuencia para examinar el ambiente de los núcleos atómicos magnéticos en un campo magnético homogéneo de impulsos con una radiofrecuencia específica. Los impulsos perturban la magnetización nuclear de aquellos átomos con núcleos de rotación que no son de cero. Las señales de dominio de tiempo transitorias son detectadas conforme el sistema regresa al equilibrio. La transformación de Fourier de la señal transitoria en un dominio de frecuencia produce un espectro RMN de una dimensión. Los picos en estos espectros representan los cambios químicos de los diferentes núcleos activos. El cambio químico de un átomo es determinado por su ambiente electrónico local. Los experimentos de RMN de dos dimensiones pueden producir información acerca de la proximidad de varios átomos en la estructura y el espacio tridimensional. Las estructuras de las proteínas pueden ser determinadas realizando un número de experimentos RMN de dos (y algunas veces 3 ó 4) dimensiones y utilizando la información resultante como restricciones en una serie de estimulaciones de doblez de la proteína.

Se puede utilizar más información sobre la espectroscopia RMN incluyendo descripciones detalladas de la forma en que los datos simples obtenidos de un experimento RMN pueden ser utilizados para determinar la estructura 3-D de una macromolécula que se pueden encontrar en: "Espectroscopia RMN de Proteínas, Principios y Práctica" (Protein NMR Spectroscopy, Principies and Practice), (1996); Gronenborn y asociados. (1990); y Wider (2000), mencionados anteriormente, cuyas descripciones de todos se encuentran incorporadas al presente documento en su totalidad como referencia.

También son de interés los compuestos peptidomiméticos que están diseñados basados en la secuencia de aminoácidos de los compuestos de la presente invención que son péptidos.

Los compuestos peptidomiméticos son compuestos sintéticos que tienen una conformación de "patrón" tridimensional que es substancialmente la misma que la conformación tridimensional de un péptido seleccionado. El patrón péptido proporciona al compuesto peptidomimético con la capacidad para inhibir la oligomerización de la MUC1. Los compuestos peptidomiméticos pueden tener características adicionales que mejoran su utilidad ¡n vivo, tales como permeabilidad aumentada de la célula y vida media biológica prolongada. Los peptidomiméticos generalmente tienen una estructura que es parcial o completamente no péptida, pero con grupos laterales que son idénticos a los grupos laterales de los residuos de aminoácidos que ocurren en el péptido en el cual está basado el peptidomimético. Varios tipos de enlaces químicos, por ejemplo, éster, tioéster, tioamida, retroamida, carbonilo reducido, dimetileno y enlaces cetometilenos, son conocidos en la técnica que son generalmente substitutos útiles para los enlaces péptidos en la construcción de peptidomiméticos resistentes a la proteasa.

IV. Terapias A. Formulaciones Farmacéuticas y Rutas de Administración En donde están contempladas las aplicaciones clínicas, será necesario preparar composiciones farmacéuticas en una forma apropiada para la aplicación pretendida. Generalmente, éstas comprenderán la preparación de las composiciones que son esencialmente libres de pirógenos, así como otras impurezas que podrían ser dañinas para los humanos o animales.

Generalmente se desea emplear las sales y reguladores apropiados para producir vectores de administración estables y que permitan la asimilación por medio de las células objetivo. Los reguladores también serán empleados cuando son introducidas las células recombinantes en un paciente. Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad efectiva del vector a las células, disuelto o dispersado en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones son a las que también nos referimos como los inóculos. La frase "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversa, alérgicas, o de otro tipo cuando son administradas a un animal o un humano. Como se usa en la presente descripción, el "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y antimicóticos, agentes de demora de isotónicos y absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes de substancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto a lo que se refiere a cualesquiera medios o agentes convencionales que sean incompatibles con los vectores o células de la presente invención, está contemplado su uso en composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos suplementarios también pueden ser incorporados en las composiciones.

Las composiciones activas de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente invención será por medio de una ruta o de cualquier ruta común siempre que el tejido objetivo esté disponible por medio de dicha ruta. Dichas rutas incluyen la ruta oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración puede ser mediante una inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, o intravenosa. Dichas composiciones generalmente serán administradas en la forma de composiciones farmacéuticamente aceptables, descritas anteriormente. De interés particular es la administración intratumoral directa, la perfusión de un tumor, o la administración local o regional a un tumor, por ejemplo, en la vasculatura local o regional o el sistema linfático, o en un lecho resecado del tumor.

Los compuestos activos también pueden ser administrados parenteralmente o intraperitonealmente. Las soluciones de los compuestos activos en la forma de base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden ser preparados en agua mezclados adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden ser preparadas en glicerol, polietilénglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar la proliferación de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para las soluciones que se pueden inyectar incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe de ser estéril y debe de ser líquida hasta el grado de que exista la facilidad de envasarlos en una jeringa. Deben de ser estables bajo condiciones de manufactura y almacenamiento y deben de ser conservadas contra la acción de la contaminación de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilénglicol, y polietilénglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez correcta puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones o mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede llevar para diferentes agentes antibacteriales y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede traerse aproximadamente por el uso en las composiciones de agentes de demora de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles son preparadas incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea requerido, seguido por la esterilización filtrada. Generalmente, se preparan las dispersiones incorporando los diferentes ingredientes activos esterilizados dentro del vehículo estéril el cual contiene el medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos de aquellos anteriormente enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación preferidos son técnicas de secado al vacío y secado por congelación las cuales producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución filtrada estéril previamente del mismo.

Como se usa en la presente descripción, el "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y antimicóticos, agentes de demora isotónicos y absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para las substancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto hasta el punto de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, está contemplado su uso en las composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos suplementarios también pueden ser incorporados dentro de las composiciones.

Para la administración oral, los polipéptidos de la presente invención pueden ser incorporados con excipientes y utilizados en la forma de enjuagues bucales y dentrificos no digeribles. Un enjuague bucal puede ser preparado incorporando el ingrediente activo en una cantidad requerida en un solvente apropiado, tal como una solución de borato de sodio (Solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo puede ser incorporado en un lavado antiséptico que contiene borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio. El ingrediente activo también puede ser dispersado en dentrificos incluyendo: geles, pastas, polvos y mezclas. El ingrediente activo puede ser agregado en una cantidad terapéuticamente efectiva a un dentífrico en pasta que puede incluir agua, enlazadores, abrasivos, agentes saborizantes, agentes de formación de espuma, y humectantes.

Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas en una forma neutral o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de las proteínas) y las cuales son formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico y fosfórico, o dichos ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden ser derivadas de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

Al momento de la formulación, las soluciones serán administradas de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea efectiva terapéuticamente. Las formulaciones son fácilmente administradas en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación del fármaco y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe de ser regulada de manera adecuada de ser necesario y el diluyente líquido primero se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal . En esta relación, los medios acuosos estériles que pueden ser empleados serán conocidos para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación podría ser disuelta en 1 mi de solución de NaCI isotónico y ya sea agregada a 1000 mi de un líquido de hipodermoclisis o inyectado en el sitio de infusión propuesto, (ver por ejemplo, "Ciencias Farmacéuticas de Remington" (Remington's Pharmaceutical Sciences), 15a Edición, páginas de la 1035 a la 1038 y de la 1570 a la 1580). Alguna variación en la dosificación ocurrirá necesariamente dependiendo de la condición del sujeto que está siendo tratado. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración en humanos, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad y pureza general requeridos por la Oficina de la FDA de estándares Biológicos.

B. Tipos de Cáncer y Sujetos Las células cancerosas a las cuales los métodos de la presente invención pueden ser aplicadas incluyen generalmente cualquier célula que exprese la MUC1, y más particularmente, que sobre-exprese la MUC1. Una célula de cáncer apropiada puede ser de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer del colon, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer del estómago, cáncer del hígado, cáncer de los huesos, cáncer hematológico (por ejemplo, leucemia o linfoma), cáncer del tejido neural, melanoma, cáncer del ovario, cáncer testicular, cáncer de la próstata, cáncer cervical, cáncer vaginal, o células cancerosas de la vejiga. Además, los métodos de la presente invención pueden ser aplicados a un amplio rango de especies, por ejemplo, humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, babuinos, o chimpancés), caballos, ganado, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, conejos, cobayos, gerbos, hámsters, ratas, y ratones.

C. Métodos de Tratamiento Los péptidos o análogos que inhiben la formación del oligómero MUC1 son generalmente útiles como agentes terapéuticos o profilácticos contra el cáncer. Pueden ser administrados a sujetos mamíferos (por ejemplo, pacientes de cáncer de mama humanos) solos o en conjunto con otros fármacos y/o radioterapia. Los compuestos también pueden ser administrados a sujetos que son genéticamente y/o ambientalmente (debido a, por ejemplo, factores fisiológicos y/o ambientales) susceptibles al cáncer, por ejemplo, sujetos con historia de cáncer de la familia (por ejemplo, cáncer de mama), sujetos con inflamación crónica o sujetos con esfuerzo crónico, o sujetos que están expuestos a condiciones carcinogénicas ambientales no naturales o naturales (por ejemplo, exposición excesiva a la luz del sol, carcinógenos industriales, o fumadores de tabaco).

Cuando los métodos son aplicados a sujetos con cáncer, antes de la administración de un compuesto, el cáncer puede ser probado opcionalmente por la expresión de la MUC1 (la proteína MUC1 o la expresión de mARN de MUC1) mediante métodos conocidos en la técnica. De este modo, los sujetos pueden ser identificados como que tienen un cáncer de expresión o sobre-expresión de MUC1. Dichos métodos pueden ser realizados ¡n vitro sobre las células cancerosas obtenidas de un sujeto. Alternativamente, se pueden llevar a cabo las técnicas de elaboración de imagen in vivo que utilizan, por ejemplo, anticuerpos radioetiquetados específicos para MUC1. Además, los fluidos corporales (por ejemplo, sangre u orina) de los sujetos con cáncer pueden ser probados por niveles elevados de la proteína MUC1 o fragmentos de la proteína MUC1.

Las dosificaciones requeridas dependen de la elección de la ruta de administración; la naturaleza de la formulación; la naturaleza de la enfermedad del paciente; el tamaño, peso, área de superficie, edad, y sexo del sujeto; otros fármacos que están siendo administrados y la opinión del médico que los atiende. Las dosificaciones adecuadas se encuentran en un rango de 0.0001 mg/kg hasta 100 mg/kg. Las variaciones amplias en la dosis necesaria deberán ser esperadas en vista de la variedad de compuestos disponibles y las eficiencias diferentes de las diferentes rutas de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiriera dosis más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en los niveles de dosificación pueden ser ajustadas utilizando rutas empíricas estándar para la optimización así como es bien entendido en la técnica. Las administraciones pueden ser solas o múltiples (por ejemplo, de 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-, o más veces). La encapsulacion del polipéptido en un vehículo de administración adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o aparatos que se pueden implantar) puede aumentar la eficacia de la administración, particularmente para la administración oral.

V. Terapias de Combinación La resistencia de las células del tumor a los agentes dañinos del ADN representa un problema principal en la oncología clínica. Una meta de la investigación actual del cáncer es encontrar los medios para mejorar la eficacia de la quimioterapia y la radioterapia. Un medio es combinando dichas terapias tradicionales con la terapia genética. En el contexto de la presente invención, está contemplado que la terapia del péptido MUC1 podría ser utilizada de manera similar en conjunto con la intervención quimioterapéutica, radioterapéutica , o inmunoterapéutica.

Para exterminar las células, inhibir el crecimiento de las células, inhibir las metástasis, inhibir la angiogénesis o invertir o reducir de otra manera el fenotipo maligno de las células del tumor, utilizando los métodos y composiciones de la presente invención, generalmente se pondría en contacto una célula objetivo con un péptido MUC1 y por lo menos otra terapia. Estas terapias serian proporcionadas en una cantidad combinada efectiva para exterminar o inhibir la proliferación de la célula. Este proceso puede comprender poner en contacto las células con los agentes/terapias al mismo tiempo. Puede ser logrado poniendo en contacto las células con una sola composición o formulación farmacológica que incluye ambos agentes, o poniendo en contacto las células con dos composiciones diferentes o formulaciones, al mismo tiempo, en donde una composición incluye el péptido MUC1 y la otra incluye el agente.

Alternativamente, el tratamiento de MUC1 puede preceder o seguir el otro tratamiento en intervalos en un rango de minutos a semanas. En las modalidades en donde el otro tratamiento y el péptido MUC1 son aplicados por separado a la célula, generalmente se aseguraría que no expirará un período importante de tiempo entre el tiempo de cada administración, de modo que las terapias todavía pudieran ejercer un efecto combinado ventajosamente sobre la célula. En dichos casos, se contempla que se pondría en contacto la célula con ambas modalidades dentro de aproximadamente 12 a 24 horas entre ellas, y dentro de aproximadamente 6 a 12 horas entre ellas, o con una demora de tiempo de solamente aproximadamente 12 horas. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el período de tiempo para el tratamiento de manera importante; sin embargo, en donde existe un lapso de varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) o varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas.

También es concebible que se desea más de una administración de cualquier péptido MUC1 o la otra terapia. Se pueden emplear varias combinaciones, en donde el péptido MUC1 es "A", y la otra terapia es "B", de acuerdo con el ejemplo siguiente: A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B También están contempladas otras combinaciones. Nuevamente, para lograr la exterminación de las células, ambas terapias son administradas a una célula en una cantidad efectiva combinada para exterminar la célula.

Los agentes o factores adecuados para utilizarse en una terapia combinada incluyen cualquier compuesto químico o método de tratamiento que induce el daño del ADN cuando es aplicado a una célula. Dichos agentes y factores incluyen la radiación y ondas que inducen el daño del ADN tales como la irradiación ?, rayos-X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas, y similares. Una variedad de compuestos químicos, también descritos como "quimioterapéuticos" o "agentes genotóxicos", se pretende que sean de uso en los métodos de tratamiento combinados aquí descritos. En el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención, se pondrían en contacto las células del tumor con un agente además de la construcción de expresión. Este puede ser logrado irradiando el sitio del tumor localizado con radiación tal como rayos-X, luz UV, rayos-? o hasta microondas. Alternativamente, las células del tumor se pueden poner en contacto con el agente administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica.

Varias clases de agentes quimioterapéuticos están contempladas para utilizarse en combinación con los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, los antagonistas selectivos del receptor de estrógeno ("SERMs"), tales como Tamoxifeno, 4-hidroxi Tamoxifeno (Afimoxfeno), Falsodex, Raloxifeno, Bazedoxifeno, Clomifeno, Femarelo, Lasofoxifeno, Ormeloxifeno, y Toremifeno.

Los agentes quimioterapéuticos contemplados para ser utilizados incluyen, por ejemplo, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C. La presente invención también comprende el uso de una combinación de uno o más agentes para dañar el ADN, ya sea basados en radicación o compuestos reales, tales como el uso de rayos-X con cisplatino o el uso de cisplatino con etoposida. El agente puede ser preparado y utilizado como una composición terapéutica combinada, o equipo, combinándolo con un péptido MUC1, como se describió anteriormente.

La proteína de choque de calor 90 es una proteína regulatoria encontrada en muchas células eucarióticas. Los inhibidores de HSP90 han mostrado ser útiles en el tratamiento del cáncer. Dichos inhibidores incluyen Geldanamicina, 17-(Alilamino)-17-desmetoxigeldanamicina, PU-H71 y Rifabutina.

También están previstos los agentes que reticulan directamente el ADN o forman aducios. Se pueden utilizar agentes tales como el cisplatino, y otros agentes de alquilación del ADN. El cisplatino ha sido ampliamente utilizado para tratar el cáncer, con dosis eficaces utilizadas en aplicaciones clínicas de 20 mg/m2 por 5 días cada tres semanas por un total de tres cursos. El cisplatino no es absorbido realmente y debe por lo tanto ser administrado por medio de inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral, o intraperitoneal.

Los agentes que dañan el ADN también incluyen compuestos que interfieren con la duplicación, mitosis y segregación del cromosoma del ADN. Dichos compuestos quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, también conocida como Doxorubicina, Etoposida, Verapamil, Podofilotoxina, y similares. Estos compuestos ampliamente utilizados en un establecimiento clínico para el tratamiento de neoplasmas, son administrados a través de inyecciones intravenosas de bolo de bolo en dosis en un rango de 25 a 75 mg/m2 en intervalos de 21 días para la Doxorubicina, de 35 a 50 mg/m2 para la administración intravenosa de etoposida o el doble de la dosis intravenosa oralmente. También están contemplados los inhibidores de microtúbulos, tales como taxanos. Estas moléculas son diterpenos producidas por las plantas del género Taxus, e incluyen paclitaxel y docetaxel.

Inhibidores del receptor del factor de crecimiento de la epidermis, tales como Iressa, mTOR, el objetivo del mamífero de rapamicina, también conocido como la proteína de enlace FK506, la proteína asociada con 12-rapamicina 1 (FRAP1) es una cinasa de proteína de serina/treonina que regula el crecimiento celular, la proliferación celular, la movilidad celular, la sobrevivencia celular, la síntesis de proteína, y la transcripción. La rapamicina y análogos de la misma ("rapálogos") son por lo tanto contemplados para utilizarse en combinación con la terapia del cáncer de acuerdo con la presente invención.

Otra terapia de combinación posible con los péptidos aquí reivindicados es el TNF-a (factor de necrosis de tumor-alfa), una citocina comprendida en la inflamación sistémica y un elemento de un grupo de las citocinas que estimulan la reacción de fase aguda. El rol principal del TNF es en la regulación de las células inmunes. El TNF también puede inducir la muerte apoptótica de las células, para inducir la inflamación, y para inhibir la tumorigénesis y duplicación viral.

Los agentes que interrumpen la síntesis y la fidelidad de los precursores de ácido nucleico y subunidades también conducen al daño del ADN. Como tales, ha sido desarrollado un número de precursores de ácido nucleico. Son particularmente útiles los agentes que han pasado por pruebas extensas y están fácilmente disponibles. Como tales, los agentes tales como 5-fluorouracil (5-FU), son preferentemente utilizados en los tejidos neoplásticos, haciendo este agente particularmente útil para el envío al objetivo a las células neoplásticas. Aunque algo tóxico, el 5-FU, es aplicable en un amplio rango de vehículos, incluyendo, la administración tópica, sin embargo, la generalmente utilizada es la administración intravenosa con dosis en un rango de 3 a 15 mg/kg/día.

Otros factores que ocasionan el daño del ADN y que han sido utilizados extensamente incluyen los que son generalmente conocidos como rayos-?, rayos-x, y/o la administración dirigida de radioisótopos a las células del tumor. Otras formas de factores de daño del ADN también están contempladas tales como las microondas y la irradiación UV. Lo más probable es que todos estos factores efectúan un amplio rango de daño del ADN, en los precursores de ADN, la duplicación y reparación del ADN, y el ensamble y mantenimiento de los cromosomas. Los rangos de dosificación para los rayos-x se encuentran en un rango de dosis diaria de 50 a 200 roéntgenes para períodos prolongados de tiempo (de 3 a 4 semanas), a dosis simples de 2000 a 6000 roéntgenes. Los rangos de dosificación para los radioisótopos varían ampliamente, y dependen de la vida media del isótopo, la resistencia y tipo de la radiación emitida, y la asimilación por las células neoplásticas.

Los expertos en la técnica se dirigen al libro "Ciencias Farmacéuticas de Remington" (Remington's Pharmaceutical Sciences) 15a Edición, capítulo 33, en particular a las páginas de la 624 a la 652. Alguna variación en la dosificación ocurrirá necesariamente dependiendo de las condiciones del sujeto que está siendo tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración en humanos, las preparaciones deben cubrir los estándares de esterilidad, pirogenicidad , seguridad y pureza general requeridos por la Oficina de la FDA de estándares Biológicos.

Los inventores proponen que la administración local o regional de los péptidos MUC1 a los pacientes con cáncer será un método muy eficiente para el tratamiento de la enfermedad clínica. De un modo similar, la quimioterapia o la radioterapia pueden ser dirigidas a una región particular afectada del cuerpo del sujeto. Alternativamente, la administración sistémica o regional de la construcción de expresión y/o el agente pueden ser apropiados en ciertas circunstancias, por ejemplo, en donde han ocurrido metástasis extensas.

Además de combinar las terapias de MUC1 con la quimioterapia y la radioterapia, también está contemplado la combinación con inmunoterapia, terapia hormonal, terapia de toxinas y cirugía. En particular, se pueden emplear terapias enviadas al objetivo tales como Avastina, Erbitux, Gleevec, Herceptina y Rituxan.

También deberá señalarse que cualquiera de las terapias anteriores pueden probar ser útiles por ellas mismas en el tratamiento del cáncer.

VI. Ejemplos Los ejemplos siguientes están incluidos para demostrar las modalidades particulares de la invención. Deberá apreciarse por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la presente invención, y por lo tanto pueden ser consideradas que constituyen modalidades particulares de su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica deben a la luz de la presente descripción, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que están descritas y todavía obtener un resultado similar o igual sin salirse del espíritu y alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1 - Materiales y Métodos Cultivo Celular. Las líneas de células slARN ZR-75-1, ZR-75-1/vector, ZR-75-1/MUC1 de cáncer de mama humano (Ren y asociados, 2004) fueron cultivadas en un medio RPMI1640 suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (HI-FBS), 100 U/ml de penicilina, y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen) en un incubador humidificado a una temperatura de 37°C y C02 al 5%. Las células de cáncer de mama MCF-7 humanas y 293 células fueron cultivadas en un medio Eagle modificado de Dulbecco con HI-FBS al 10%, antibióticos y 2 mM L-glutamina. Las células del epitelio de mama MCF-10A humano fueron cultivadas en medio de crecimiento de células del epitelio mamario (MEGM; Lonza). Las células fueron tratadas con los péptidos MUC1/CQC o MUC1/AQA sintetizados por MIT Biopolymer Laboratory, Cambridge, MA. La viabilidad fue determinada mediante la exclusión de azul tripano.

Inmunoprecipitación y Análisis de Inmunotinción. Las células completas y los lisatos nucleares fueron preparados como lo describen (Leng y asociados, 2007). Las proteínas solubles fueron sometidas a la inmunoprecipitación con anti-Señal (Sigma, St. Louis, MO). Los inmunoprecipitados y las proteínas solubles fueron analizados por inmunotinción con anti-His (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GFP (Millipore, Danvers, MA), anti-Señal, anti-MUC1-C (Abl; NeoMarkers, Fremont, CA), anti-lamina B (EMD, La Jolla, CA) o anti-P-actina (Sigma). La reactividad fue detectada con peroxidasa de rábano conjugada con los segundos anticuerpos y la quimioluminiscencia.

Transfección Celular. 293 células fueron transfectadas con vectores que expresan GFP, GFP-MUC1-CD o Señal-MUC1- CD en la presencia de Lipofectamina como lo describen (Leng y asociados, 2007).

Asimilación del Péptido. Las células fueron incubadas con el péptido MUC1/CQC marcado FITC (MIT Biopolymer Laboratory), lavadas con PBS frío, fijadas en paraformaldehído/PBS al 1% y analizadas por la fluorescencia mediante citometría de flujo.

Análisis de la Distribución del Ciclo Celular, Apoptosis y Necrosis. Las células fueron recolectadas, lavadas con PBS, fijadas con etanol al 80%, e incubadas en PBS con un contenido de 40 pg/ml de RNAse y 40 pg/ml de yoduro de propidio durante 30 minutos a una temperatura de 37°C. La distribución del ciclo celular fue determinada por citometría de flujo. El contenido de ADN Sub-G1 fue evaluado mediante la tinción fijada de etanol y las células permeabilizadas con regulador de citrato con yoduro de propidio y monitoreadas por citometría de flujo como lo describen (Yin y asociados, 2007). Para la evaluación de la necrosis, las células fueron incubadas con 1 pg/ml de yoduro de propidio/PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego monitoreadas por citometría de flujo como lo describen (Yin y asociados, 2007).

Modelo de Xenoinjerto del Tumor de Mama Humano. Los ratones hembra nu/nu Balb-c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), de edad de 4 a 6 semanas con un peso de 18 a 22 gramos, fueron implantados subcutáneamente con tapones de 17- -estrad¡ol (0.72 mg; Innovative Research, Sarasota, FL) utilizando una pistola de trocar. Después de 24 horas, las células 1 x 107 ZR-75-1 incrustadas en Matri-Gel (BD Biosciences) fueron inyectadas subcutáneamente en el flanco. Cuando los tumores fueron detectables en un tamaño de -150 mm3 (Cohorte 1) o 275 mm3 (Cohorte 2), los ratones fueron acoplados en parejas en grupos de tratamiento y control. Cada grupo contenía 5 ratones, cada uno de los cuales fue marcado en la oreja y seguido durante el estudio. La dosis inicial fue administrada al momento del acoplamiento (día 1). La solución regulada por fosfato (vehículo), el péptido MUC1/CQC y el péptido MUC1/AQA fueron administrados diariamente mediante inyección intraperitoneal. Los ratones fueron pesados dos veces a la semana, y las mediciones del tumor se realizaron utilizando calibradores cada 4 días. El volumen del tumor (V) fue calculado utilizando la fórmula V = W2 x L/2, en donde W y L son los diámetros más pequeños y más grandes, respectivamente. En el momento del sacrificio, los ratones fueron perfundidos con solución salina y luego con formalina regulada por fosfato mediante la administración cardíaca. Los tumores fueron cortados, la inmersión fijadas durante 4 horas, deshidratados a través de una serie graduada de etanoles, y procesados para la incrustación de rutina en parafina. Los tumores fueron evaluados mediante la tinción de H&E y para la tinción de inmunoperoxidasa con anti-MUC1 como lo describe (Kufe, 1984).

Fármacos y citocinas. Cisdiamindicloroplatino (II), Doxorubicina (adriamicina), Taxol (Paclitaxel) fueron comprados de Sigma (St. Louis, MO). El rh-TNF-alfa fue comprado en Promega (Madison, Wl). El péptido GO-203 fue sintetizado por Anaspec Inc.

Citotoxicidad in vitro y ensayos de combinación. Las células fueron sembradas en una placa de microtitulación de fondo plano de 96 depósitos (Fisher) en una cantidad de 1000 células por depósito para un experimento de 6 días o de 3000 células por depósito para un experimento de 3 días. Las células fueron cultivadas entonces durante 24 horas. Los fármacos contra el cáncer y el GO-203 fueron diluidos a la concentración indicada y agregados a las células. El GO-203 (5 µ????/L) fue agregado cada 24 horas durante 72 horas. La viabilidad de las células fue determinada agregando reactivo MTS a las células y leyendo la absorbancia en 490 nm mediante un lector de microplacas.

Análisis de datos. Los valores IC50 para todos los fármacos anti-cáncer fueron determinados por el análisis de regresión no lineal utilizando el Software Graphpad Prism (GraphPad Software, San Diego CA). El programa de cómputo CombiTool (versión 2.001, IMB Jena Biocomputing Group) fue utilizado para calcular el índice de combinación dentro de un rango de dosis en la presencia de 5 pmol/L GO-203.

EJEMPLO 2 - Resultados Efectos del péptido MUC1/CQC en la formación del oligómero MUC1. El dominio citoplásmico MUC1 (MUC1-CD) contiene un patrón CQC que es necesario para la formación de oligómeros y la localización nuclear (Leng y asociados, 2007). Para determinar si una molécula pequeña puede ser diseñada para bloquear la oligomerización, los inventores sintetizaron un péptido derivado de una región de la terminal-N del MUC1-CD que contiene el patrón CQC (el péptido MUC1/CQC; figura 1A). Un dominio de transducción de poli D-arginina fue incluido en la síntesis para facilitar la entrada del péptido en las células (Fischer, 2007) (figura 1A). Como control, un péptido similar fue sintetizado en el cual el patrón CQC fue alterado al péptido AQA (péptido MUC1/AQA; figura 1A). Para evaluar el enlace del péptido al MUC1-CD, los inventores inmovilizaron las células MUC1-CD etiquetadas-His a un chip de un sensor BIAcore. El péptido MUC 1 /CQC enlazado al His-MUC 1 -CD con una constante de disociación (Kd) de 30 nM (figura 1B), el cual es similar al obtenido con el oligómero MUC1-CD (Leng y asociados, 2007). En contraste, no existió enlace aparente del péptido MUC1/AQA (datos no mostrados). Los oligómeros de las formas MUC1-CD etiquetadas-His purificadas según fueron detectadas por electroforesis en geles de poliacrilamida (figura 1C). La incubación del His-MUC1 -CD con el péptido MUC1/CQC disminuyó substancialmente la formación del oligómero y aumentó los monómeros (figura 1C). Además, la incubación con el péptido MUC1/AQA tuvo poco si tuvo algún efecto (figura 1C). Para evaluar los efectos en la oligomerización de la MUC1 in vivo, se transfectaron 293 células con los vectores de expresión GFP-MUC1-CD y Señal-MUC1 -CD (figura 1D, izquierda). Los complejos de GFP-MUC1 -CD y Señal-MUC1 -CD fueron detectables mediante la coprecipitación de los lisatos de las células no expuestas al péptido (figura 1D, derecha). De acuerdo con los resultados in vitro, la incubación de las 293 células transfectadas con el péptido MUC1/CQC fueron asociadas con la interrupción de la interacción entre la Señal- UC1-CD y GFP-MUC1 -CD (figura 1D, derecha). Además, el péptido MUC1/AQA no tuvo efecto aparente (figura 1D, derecha). Estos resultados indican que el péptido MUC1/CQC se enlaza al MUC1-CD y bloquea la formación de oligómeros MUC1-CD in vitro y en las células.

El péptido MUC1/CQC bloquea el envío al objetivo del MUC1-C al núcleo. Las células de cáncer de mama ZR-75-1 y MCF-7 humanas sobre-expresan la MUC1 endógena, y por lo tanto representa modelos potenciales para efectos de evaluación del péptido MUC1/CQC (Ramasamy y asociados, 2007). Para evaluar la asimilación, las células ZR-75-1 fueron incubadas con 5 µ? de péptido FITC- UC1/CQC (figura 2A). A las 2 horas, el análisis de las células por citometría de flujo mostró un aumento substancial en la intensidad de la fluorescencia con un promedio de (MFI) de 145 (figura 2A). Los aumentos adicionales del MFI fueron identificados a las 6 y 24 horas (figura 2A). La oligomerización de la MUC1-C es necesaria para su importación nuclear (Leng y asociados, 2007). El tratamiento de las células ZR-75-1 con la MUC1/CQC o el péptido MUC1/AQA no tuvo efecto en los niveles de la MUC1-C celulares (figura 2B). Sin embargo, de acuerdo con los efectos en la oligomerización, el tratamiento con el MUC1/CQC, y no el MUC1/AQA, el péptido fue asociado con las disminuciones en los niveles MUC1-C nucleares (figura 2B). Se observaron efectos similares en las células MCF-7 con la desactivación de los niveles MUC1-C nucleares en respuesta al tratamiento con el péptido MUC1/CQC (figura 2C). Los descubrimientos indican que el péptido MUC1/CQC bloquea la oligomerización de la MUC1-C y por lo tanto el envío al objetivo de la MUC1-C al núcleo.

El péptido MUC1/CQC bloquea el crecimiento e induce la necrosis. Para determinar si el péptido MUC1/CQC afecta el crecimiento, las células ZR-75-1 fueron tratadas con 5 µ? de MUC1/CQC por 72 horas y monitoreadas por la distribución del ciclo celular. De manera importante, hubo una detención substancial en la fase S comparada con la de las células dejadas sin tratar o tratadas con el péptido MUC1/AQA (figura 3A). Para las 96 horas, la población de la fase S fue disminuida, potencialmente a través del desgaste por la muerte celular (figura 3A). Hubo poca si alguna acumulación de células con un contenido de ADN sub-G1 para soportar la inducción de la apoptosis (figura 3A). Sin embargo, el tratamiento de las células ZR-75-1 con el MUC1/CQC, y no el MUC1/AQA, el péptido fue asociado con la inducción de la necrosis, la cual se pudo detectar a las 72 horas y más prominente a las 96 horas (figura 3B). Las células MCF-7 respondieron de manera similar al péptido MUC1/CQC con la detención del crecimiento en la fase S (figura 3C) y la inducción de la necrosis (figura 3D). Estos descubrimientos indican que el péptido MUC1/CQC inhibe el crecimiento e induce la necrosis de las células de cáncer de mama humano.

Especificidad del péptido UC1/CQC para las células del carcinoma que expresan MUC1. Para determinar si el péptido MUC1/CQC tiene actividad selectiva contra las células del carcinoma de mama que sobre-expresan la MUC1 endógena, los inventores trataron las células ZR-75-1 que son silenciadas establemente para la expresión de la MUC1 con un siARN de UC1 (figura 4A). En contraste con la detención del crecimiento y muerte de las células del vector/ZR-75-1 de control, el péptido MUC1/CQC tuvo un efecto substancialmente menor en las células ZR-75-1 /siARN de MUC1 (figura 4B). Además, el péptido MUC1/CQC no tuvo efecto aparente en el crecimiento de las 293 células negativas de MUC1 (figura 4C). Los estudios también se realizaron en las líneas de células del epitelio mamario sin transformar MCF-10A (Muthuswamy, 2001; Soule, 1990), las cuales expresan la MUC1, pero en niveles inferiores a los encontrados en las células ZR-75-1 y MCF-7 (Ahmad y asociados, 2007). De manera notable, en contraste con las células ZR-75-1 y MCF-7, el péptido MUC1/CQC no tuvo efecto en la distribución del ciclo celular MCF-10A (figura 4D) y el crecimiento (figura 4E). Estos descubrimientos indican que el péptido MUC1/CQC tiene una actividad selectiva contra células del carcinoma de mama que sobre-expresan la MUC1 endógena.

El péptido MUC1/CQC inhibe la tumorigenicidad in vivo.

Para determinar si la administración del péptido MUC1/CQC está asociada con los efectos del peso corporal, cinco ratones rasurados hembra (nu/nu) fueron inyectados intraperitonealmente (IP) una vez al día con una dosis de 50 mg/kg. La administración del péptido por 11 días no tuvo efecto aparente en el peso de los ratones individuales. Además, no hubo un efecto posterior en el peso corporal por los siguientes 28 días después de detener la administración de MUC1/CQC (datos no mostrados). Para evaluar la actividad anti-tumor, las células ZR-75-1 (1 x 107) fueron implantadas subcutáneamente en los flancos de los ratones rasurados. Después de 12 días, los ratones portadores de los tumores de aproximadamente 150 mm3 fueron tratados con el péptido MUC1/CQC en dosis de 10 y 50 mg/kg/día. Como controles, los ratones fueron tratados con vehículo solo o con el péptido MUC1/AQA. La administración del péptido MUC1/CQC en una cantidad de 10 mg/kg/día x 21 días disminuyó el crecimiento comparado con la disminución obtenida con el péptido MUC1/AQA administrada en una cantidad de 50 mg/kg/día (figura 5A). Además, la administración del péptido MUC1/CQC en una cantidad de 50 mg/kg/día bloqueo el crecimiento por los 7 días iniciales del tratamiento (figura 5A). Por consiguiente, el tratamiento fue detenido y los ratones monitoreados por el nuevo crecimiento. De manera importante no hubo crecimiento detectable de los tumores por los siguientes 17 días (figura 5A). Para evaluar en parte la base de la actividad, los tumores recolectados de los ratones de control y los tratados fueron examinados mediante histopatolog ía. Los tumores de los ratones tratados con MUC1/CQC (10 y 50 mg/kg) fueron necróticos marcadamente comparados con los ratones tratados con el vehículo o el péptido MUC1/AQA (figura 5B y datos no mostrados). Sin embargo, de manera notable, también se detectaron células del tumor alrededor de las áreas de necrosis (figura 5B). Las secciones de los tumores fueron teñidas también con un anticuerpo contra la MUC1. El tratamiento con el péptido MUC1/AQA estuvo asociado con una desactivación marcada de la expresión de la MUC1 comparada con la de los tumores de control y aquellos tratados con el péptido MUC1/AQA (figura 5C y datos no mostrados).

También se realizaron estudios en tumores más grandes (~275 mm3) (figura 6A). La administración del péptido MUC1/CQC en una dosis intermedia de 30 mg/kg/día x 21 días estuvo asociada con la detección del crecimiento del tumor (figura 6A). Además, no existió nuevo crecimiento aparente en los siguientes 31 días posteriores al tratamiento (figura 6A), indicando además que el péptido MUC1/CQC es efectivo para detener el crecimiento del tumor. Los tumores recolectados en el día 52 exhibieron áreas extensas de necrosis (figura 6B) y la desactivación de la expresión de MUC1. Estos descubrimientos indican que el péptido MUC1/CQC desactiva la expresión de MUC1 y está asociado con la inducción de la necrosis y la detención prolongada del crecimiento del tumor.

Péptidos Unidos CQC de la terminal MUC1-C. Las interacciones intracelulares de proteína a proteína que rigen muchas trayectorias biológicas son portadas frecuentemente por las estructuras de a-hélice de las proteínas. Los péptidos helicoidales también pueden interferir con o estabilizar las interacciones de proteína a proteína. Los péptidos helicoidales naturales tienen desventajas mayores como agentes terapéuticos debido a la baja potencia, inestabilidad y la administración ineficiente a las células. Los estudios recientes han mostrado que estos problemas podrían ser solucionados por una modificación química de los péptidos a-helicoidales denominados como unión de hidrocarburos.

Los inventores utilizaron la secuencia del péptido endógeno de la terminal MUC1-C (Al VYLIALAVCQCRRKNYG) y generaron dos péptidos a-helicoidales, GO-200-1B y GO- 200-2B utilizando la unión de hidrocarburos: GO-200-1 B Ac-AIVYL-S5-ALA-S5-CQCRRKNYG-NH2 GO-200-2B: Ac-AKKYL-S5-ALA-B5-CQC-S5-RKNY-NH2 Para determinar si la exposición al GO-200-1B afecta el crecimiento de células del carcinoma de pulmón de célula no pequeña, las células H-1650 fueron tratadas con de 1 µ? a 5 µ? de GO-200-1 B por 7 días y monitoreadas por el crecimiento. Los resultados demuestran que el tratamiento de las células con 5 µ? de GO-200-1B estaba asociado con una inhibición importante en el crecimiento (figura 9A). Además, otra línea de células de carcinoma de pulmón de célula no pequeña, H-1975, fue tratada con 5 µ? de GO-200-2B durante 3 días y monitoreada por el crecimiento de las células así como la muerte de las células. Los resultados demuestran que el tratamiento de las células H-1975 con GO-200-2B por 3 días estaba asociado con no más del 80% de inhibición de proliferación de células. Además, el GO-200-2B también estuvo asociado con la inducción importante de la muerte de células (figura 9B). Estos descubrimientos indican que los péptidos MUC1-C unidos son efectivos en la inducción de la detención del crecimiento y la muerte de las células de cáncer MUC1 positivas humanas.

Análogos de GO-203. Los inventores en estudios recientes han mostrado que el péptido MUC1 de la terminal-C (CQCRRKNYGQLDIFP) es activo para inhibir el crecimiento de múltiples líneas de células de carcinoma. También han demostrado que un péptido MUC1 de la terminal-C más corto, CQCRRKN, es también activo para exterminar las células del tumor. Sin embargo, estos péptidos MUC1 de la terminal-C consisten de L-aminoácidos. De manera importante, los péptidos con L-aminoácidos son susceptibles a la degradación por las enzimas proteolíticas, mientras aquellos que contienen D-aminoácidos han mostrado ser más estables. Por consiguiente, ellos han generado la forma toda-dextro del péptido MUC1 de la terminal-C más corto descrito anteriormente, en la cual los L-aminoácidos fueron cambiados por D-aminoácidos (GO-203). Además, para determinar los residuos mínimos de aminoácidos de la región MUC1 de la terminal-C que son requeridos para retener la actividad del exterminio de las células, también han generado muchas versiones diferentes del GO-203 como se describió en la figura 8.

Las líneas de células de tumor múltiples (ZR-75-1, Carcinoma de Mama Dependiente de la Hormona; MDA-MB-231 , Carcinoma de Mama Negativo Triple; A549, Carcinoma de Pulmón de Célula No Pequeña; H-1975, Carcinoma de Pulmón de Célula No Pequeña) fueron cultivadas en RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino desactivado por calor al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina y 2 mmol/L de L-glutamina. Las células fueron tratadas por separado con 5 µ? de diferentes análogos de GO-203 (figura 8) por un período de 3 a 7 días y la viabilidad fue determinada mediante la exclusión de azul tripano. La proliferación de las diferentes líneas celulares fue comparada con las células tratadas con el vehículo únicamente. Los resultados demuestran que el tratamiento de las líneas de las células del tumor múltiples con 5 µ? de diferentes análogos de GO-203 estaba asociado con la inhibición importante del crecimiento (figuras de la 10 a la 14).

Terapia de combinación. Los valores del índice de combinación (Cl) generados por el programa CombiTool fueron trazados contra la fracción afectada por la combinación del fármaco. Los valores Cl fueron cercanos 1 para el Cisplatino y GO-203, indicando una interacción aditiva. Los valores Cl obtenidos para la Doxorubicina (25, 50, 100, 200 nM), Taxol (25, 50, 100 nM) y TNF (10, 20, 40 ng/ml) con GO-203 fueron menores de 1, soportando un efecto aditivo fuerte o sinergia (figuras de la 15A a la 15D y 16).

Ejemplo 3 - Explicación El péptido MUC1/CQC bloquea la oligomerización de UC1. La sobre-expresión del MUC1 es suficiente para la inducción del crecimiento y tumorigenicidad independiente del anclaje (Li y asociados, 2003a; Huang y asociados, 2003; Huang y asociados, 2005). Sin embargo, de manera notable, la función de transformación del MUC1 es abrogada mediante la mutación del patrón CQC en el dominio citoplásmico del AQA (Leng y asociados, 2007). El MUC1 forma oligómeros y el patrón CQC es necesario para esta oligomerización (Leng y asociados, 2007). Además, la formación del oligómero es necesaria para el envío al objetivo de la subunidad MUC1-C al núcleo (Leng y asociados, 2007). Otras funciones de la subunidad MUC1-C, tales como la activación de las trayectorias Wnt/p-catenina y IKKP?NF-KB, también depende de la formación de los oligómeros MUC1-C (datos sin publicar). Basados en estos descubrimientos, los inventores razonaron que la interrupción de la oligomerización del MUC1 por una molécula pequeña tendría el potencial de bloquear la función de transformación del MUC1. En este contexto, ellos sintetizaron un péptido derivado de MUC1 que contiene el patrón CQC y un dominio de administración de la célula poli-Arg para la entrada a las células. Los estudios iniciales con este péptido MUC1/CQC mostraron que inhibe la oligomerización del MUC1-CD in vitro. Como se mostró anteriormente por el análisis BIAcore, el péptido MUC1-CD forma dímeros con una constante de disociación (Kd) de 33 nM (Leng y asociados, 2007). El péptido MUC1/CQC de manera similar es enlazado al MUC1-CD con un Kd de 30 nM. Además, la demostración de que el péptido MUC1/AQA tiene poco si algún efecto en la oligomerización del MUC1 proporcionó el soporte para la dependencia del patrón CQC. El MUC1/CQC, y no el MUC1/AQA, fue también efectivo en el bloqueo de la oligomerización del MUC1-CD en las células. Por lo tanto estos descubrimientos indicaron que el péptido MUC1/CQC puede ser utilizado par interrumpir la oligomerización MUC1 y potencialmente la función MUC1 en las células de carcinoma de mama humano.

Selectividad del péptido MUC1/CQC para las células de carcinoma que sobre-expresan el MUC1. Los dominios de administración de células, tales como el poli-D-Arg, y sus conjugados entran en las células, por lo menos en gran parte, mediante la endocitosis y luego necesitan alcanzar su objetivo pretendido (Fischer, 2007). La entrada del péptido MUC1/CQC en las células de cáncer de mama ZR-75-1 fue detectable fácilmente y persistió por al menos 24 horas. De manera importante y consistente con el envío al objetivo nuclear del MUC1 siendo dependiente de la oligomerización (Leng y asociados, 2007), la asimilación del péptido MUC1/CQC estuvo asociada con la desactivación de los niveles de MUC1-C en el núcleo. Se obtuvieron resultados similares con las células de cáncer de mama MCF-7, indicando que esta respuesta al péptido MUC1/CQC no es específica de la célula. Además y de manera notable, la exposición de estas células al MUC1/CQC, y no al MUC1/AQA, estaba asociada con la detención del crecimiento y la inducción de la necrosis. De importancia es si el MUC1/CQC induce la muerte por un mecanismo dependiente de la expresión de su objetivo pretendido o es una citotoxina no específica. En este contexto, silenciar el MUC1 en las células ZR-75-1 abrogó los efectos citotóxicos del MUC1/CQC. En contraste, la exposición de las células del epitelio mamario MCF-10A no malignas al péptido MUC1/CQC tuvo poco efecto. Estos descubrimientos indican que la sensibilidad del péptido MUC1/CQC depende de la sobre-expresión del MUC1 y la función del MUC1 asociada con un fenotipo maligno. El péptido UC1/CQC por lo tanto parece tener una actividad negativa dominante que es selectiva para las células de carcinoma que sobre-expresan el MUC1.

Actividad anti-tumor del péptido MUC1/CQC. Los dominios de administración de células están siendo utilizados para administrar cargas terapéuticas (Fischer, 2007). Sin embargo, como con cualquiera de estos agentes, un problema de omisión es si el péptido MUC1/CQC puede ser administrado in vivo con un índice terapéutico efectivo, que es una actividad contra el tumor y un perfil de toxicidad aceptable. Al resolver este problema, los inventores descubrieron que la administración del péptido MUC1/CQC en cantidades de 10 y 30 mg/kg/día por 21 días fuera bien tolerada sin toxicidades agudas aparentes. También se descubrió que el tratamiento en estas dosis era efectivo para abrogar el crecimiento del tumor. Estos resultados fueron en contraste con la administración del péptido MUC1/AQA en una cantidad de 50 mg/kg/día por 21 días, la cual no tuvo actividad antitumor. Además y de una manera algo sorprendente, no existió evidencia de nuevo crecimiento del tumor después de la dosificación en una cantidad de 30 mg/kg/día por 21 días. La administración del péptido UC1/CQC en una cantidad de 50 mg/kg/día por 7 días también demostró que el crecimiento del tumor permanece detenido por períodos prolongados después del tratamiento. Estos resultados son explicados, por lo menos en parte, por el descubrimiento de que el tratamiento con el péptido MUC1/CQC está asociado con la inducción de la necrosis del tumor.

La actividad in vitro del MUC1/CQC 7-mer es tan potente como la del MUC1/CQC 15-mer. Basados en estos descubrimientos, se anticiparía que el MUC1 /CQC 7-mer también sería activo como un agente anti-tumor en modelos de tumor in vivo.

Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados en este documento se pueden hacer y ejecutar sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de la presente invención han sido descritos en términos de modalidades preferidas, los expertos en la técnica podrán apreciar que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos aquí descritos sin salirse del concepto, espíritu y alcance de la presente invención. Más específicamente, será aparente que ciertos agentes los cuales están tanto química como fisiológicamente relacionados pueden ser substituidos con los agentes aquí descritos mientras que se lograrían los mismos resultados o resultados similares. Todos dichos substitutos y modificaciones apreciados por los expertos en la técnica se considera que se encuentran dentro del espíritu, alcance y concepto de la presente invención definida por las reivindicaciones adjuntas. VII. Referencias Las siguientes referencias, hasta el grado en que proporcionan procedimientos de ejemplo u otros detalles suplementarios a los aquí establecidos, están incorporadas específicamente en el presente documento como referencia: Patente Norteamericana No. 5,440,013 Patente Norteamericana No. 5,446,128 Patente Norteamericana No. 5,475,085 Patente Norteamericana No. 5,597,457 Patente Norteamericana No. 5,618,914 Patente Norteamericana No. 5,670,155 Patente Norteamericana No. 5,672,681 Patente Norteamericana No. 5,674,976 Patente Norteamericana No. 5,710,245 Patente Norteamericana No. 5,790,421 Patente Norteamericana No. 5,840,833 Patente Norteamericana No. 5,859,184 Patente Norteamericana No. 5,889,155 Patente Norteamericana No. 5,929,237 Patente Norteamericana No. 6,093,573 Patente Norteamericana No. 6,261,569 Solicitud de Patente Norteamericana 2005/0015232 Abe y Kufe, Cáncer Res., 49(11): páginas 2834 a 2839, 1989. Ahmad y asociados, Nat. Cell Biol, 9: páginas 1419 a 1427, 2007.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para inhibir una célula de tumor positivo MUCT en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto de un péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC (SEQ ID NO:4), caracterizado porque la cisteína de la terminal amino de CQC está cubierta en su terminal-NH2 por al menos un residuo de aminoácidos que no necesita corresponder a la secuencia transmembrana MUC-1 natural.

2. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido comprende al menos 5, 6, 7 u 8 residuos consecutivos de MUC1.

3. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido contiene no más de 10 residuos consecutivos, 11 residuos consecutivos, 12 residuos consecutivos, 13 residuos consecutivos, 14 residuos consecutivos, 15 residuos consecutivos, 16 residuos consecutivos, 17 residuos consecutivos, 18 residuos consecutivos o 19 residuos consecutivos de MUC1.

4. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la célula de tumor positivo MUC1 es una célula de carcinoma, una célula de leucemia o una célula de mieloma.

5. El método tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque la célula de carcinoma es una célula de carcinoma de próstata o de mama.

6. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido es fusionado a un dominio de administración de la célula.

7. El método tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el dominio de administración de la célula es poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K.

8. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la administración comprende la administración intravenosa, intra-arterial, intratumoral, subcutánea, tópica o intraperitoneal.

9. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la administración comprende la administración local, regional, sistémica, o continua.

10. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la inhibición comprende inducir la detención del crecimiento de dicha célula de tumor, la apoptosis de la célula de tumor y/o necrosis del tejido del tumor que comprende la célula de tumor.

11. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además administrar a dicho sujeto una segunda terapia contra el cáncer.

12. El método tal y como se describe en la reivindicación 11, caracterizado porque la segunda terapia contra el cáncer es cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia de toxinas, inmunoterapia, y crioterapia.

13. El método tal y como se describe en la reivindicación 11, caracterizado porque la segunda terapia contra el cáncer es administrada antes de dicho péptido.

14. El método tal y como se describe en la reivindicación 11, caracterizado porque la segunda terapia contra el cáncer es administrada después de dicho péptido.

15. El método tal y como se describe en la reivindicación 11, caracterizado porque dicha segunda terapia contra el cáncer es administrada al mismo tiempo que dicho péptido.

16. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho sujeto es un humano.

17. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido es administrado en una cantidad de 0.1 a 500 mg/kg/día.

18. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido es administrado en una cantidad de 10 a 100 mg/kg/día.

19. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido es administrado diariamente.

20. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque dicho péptido es administrado diariamente por 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, un mes, 6 semanas, 8 semanas, dos meses, 12 semanas, o 3 meses.

21. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido es administrado semanalmente.

22. El método tal y como se describe en la reivindicación 21, caracterizado porque dicho péptido es administrado semanalmente por 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, o 12 semanas.

23. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende todos los L aminoácidos.

24. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende todos los D aminoácidos.

25. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende una mezcla de L aminoácidos y D aminoácidos.

26. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además el paso de evaluar la expresión del MUC1 en una célula de tumor de dicho sujeto antes de administrar dicho péptido.

27. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además el paso de evaluar el efecto de dicho péptido en la expresión de MUC1 en una célula de tumor de dicho sujeto.

28. Una composición farmacéutica que comprende (a) un péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde la cisteína de la terminal amino de CQC es cubierta en su terminal-NH2 por al menos un residuo de aminoácidos que no necesita corresponder a la secuencia transmembrana del MUC1 de tipo natural, y (b) un vehículo, regulador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

29. La composición tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizada porque dicho péptido es de por lo menos 5, 6, 7 u 8 residuos consecutivos de MUC1.

30. La composición tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizada porque no contiene más de 10 residuos consecutivos, 11 residuos consecutivos, 12 residuos consecutivos, 13 residuos consecutivos, 14 residuos consecutivos, 15 residuos consecutivos, 16 residuos consecutivos, 17 residuos consecutivos, 18 residuos consecutivos o 19 residuos consecutivos de MUC1.

31. La composición tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizada porque el péptido es fusionado al dominio de administración de la célula o a un dominio de transducción de la célula.

32. La composición tal y como se describe en la reivindicación 31, caracterizada porque el dominio de transducción de la célula es un dominio de transducción de una célula HIV tat.

33. La composición tal y como se describe en la reivindicación 31, caracterizada porque el dominio de administración de la célula es poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K.

34. La composición tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizada porque el péptido es de por lo menos 8 residuos de longitud, y por lo menos dos residuos no adyacentes de un puente a través de sus cadenas laterales.

35. La composición tal y como se describe en la reivindicación 34, caracterizada porque el puente comprende un enlazador, cadenas laterales modificadas químicamente, o la unión de hidrocarburos.

36. La composición tal y como se describe en la reivindicación 34, caracterizada porque los enlazadores comprenden modificaciones que estabilizan una estructura alfa-helicoidal de dicho péptido.

37. La composición tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizada porque el regulador comprende ß-mercaptoetanol, glutationa o ácido ascórbico.

38. Un método para inhibir la oligomerización de MUC1 y el transporte nuclear en una célula que comprende poner en contacto la célula que expresa el MUC1 con un péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde la cisteína de la terminal amino del CQC está cubierta en su terminal-NH2 por al menos un residuo de aminoácidos que no necesita corresponder a la secuencia transmembrana de UC1 natural.

39. El método tal y como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque el péptido es de por lo menos 5, 6, 7 u 8 residuos consecutivos de MUC1.

El método tal y como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque no contiene más de 10 residuos consecutivos, 11 residuos consecutivos, 12 residuos consecutivos, 13 residuos consecutivos, 14 residuos consecutivos, 15 residuos consecutivos, 16 residuos consecutivos, 17 residuos consecutivos, 18 residuos consecutivos o 19 residuos consecutivos de MUC1.

41. El método tal y como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque dicho péptido es fusionado a un dominio de administración de la célula.

42. El método tal y como se describe en la reivindicación 41, caracterizado porque el dominio de administración de la célula es poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K.

43. El método tal y como se describe en la reivindicación 42, caracterizado porque dicha célula que expresa MUC1 es una célula de tumor.

44. El método tal y como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque la célula de tumor MUC1 positivo es una célula de carcinoma, una célula de leucemia o una célula de mieloma.

45. El método tal y como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque la célula de carcinoma es una célula de carcinoma de próstata o mama.

46. El método tal y como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque la célula del tumor está localizada en un sujeto vivo.

47. El método tal y como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque dicho sujeto vivo es un sujeto humano.

48. Un péptido mimético que imita la estructura y una capacidad de enlace de MUC-1 de un péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde la cisteína de la terminal amino del CQC está cubierta en su terminal-NH2 por al menos un residuo de aminoácidos que no necesita corresponder a la secuencia transmembrana MUC1 natural.

49. Un péptido MUC1 de por lo menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20 residuos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQC, en donde todos los residuos de aminoácidos de dicho péptido son D-aminoácidos.

50. El péptido tal y como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque comprende la secuencia KRRCQC.