MX2011002928A - Anticuerpos anti-notch2 y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La invención provee anticuerpos anti-Notch, y en particular, anticuerpos que se fijan a Notch2 NRR, y métodos para su uso.

Description

ANTICUERPOS ANTI-NOTCH2 Y MÉTODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisoria de los Estados Unidos N.° 61/101.917, presentada el 1 de octubre de 2008, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más específicamente, la invención se ocupa de los anticuerpos anti-Notch, incluso los anticuerpos anti-Notch2 de la región reguladora negativa (NRR), y sus usos. También se proveen los anticuerpos Anti-Notch1 , NRR y los métodos de uso.

ANTECEDENTES La familia de receptores Notch es una clase de receptores transmembrana conservados en la evolución que transmiten señales que afectan el desarrollo en organismos tan diversos como los erizos de mar y los humanos. Los receptores Notch y sus ligandos, Delta y Serrate (denominados Jagged en mamíferos), son proteínas transmembrana con grandes dominios extracelulares que contienen repeticiones símil factor de crecimiento epidérmico (EGF). La cantidad de paralogos Notch difiere entre especies. Por ejemplo, hay cuatro receptores Notch en mamíferos (Notch1-Notch4), dos en Caenorhabditis elegans (LIN-12 y GLP- ) y uno en Drosophila melanogaster (Notch). Los receptores Notch son procesados proteolíticamente durante el transporte a la superficie celular por una proteasa símil furina en un sitio S1 del lado N-terminal del dominio transmembrana, con producción de una subunidad Notch (ECN) extracelular y una subunidad Notch transmembrana (NTM). Estas dos subunidades permanecen asociadas en forma no covalente y constituyen el receptor maduro heterodimérico de la superficie celular. Los receptores Notch y las vías de señales Notch son revisadas, por ejemplo, en Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3:587-613, 2008, y Bolos et al., Endocrine Reviews 28:339-363, 2007.

Las subunidades Notch2 ECN contienen 36 repeticiones N-terminales símil EGF seguidas de tres módulos repetidos en tándem Lin 12/Notch (LNR) que preceden el sitio S1. Cada módulo LNR contiene tres enlaces disulfuro y un grupo de residuos ácidos y polares conservados de los que se predice que coordinan un ión calcio. Dentro de la región de repetición EGF se encuentran sitios de unión para los ligandos activadores.

El Notch2 NTM comprende una región extracelular (la cual contiene el sitio de escisión S2), un segmento transmembrana (el cual contiene en sitio de escisión S3), y una gran porción intracelular que incluye un dominio RAM23, seis repeticiones de anquirina, un dominio de transactivación y una secuencia carboxiteminal PEST. La asociación estable de las subunidades ECN y NTM depende de un dominio de heterodimerización (HD) que comprende el extremo carboxiterminal de ECN (denominado HD-N) y el extremo aminoterminal extracelular de NTM (denominado HD-C). Antes de la activación inducida por ligando, Notch se mantiene en una conformación de reposo mediante una región reguladora negativa (NRR), la cual comprende los tres LNR y el dominio HD. La estructura cristalina de Notch2 NRR es informada en Gordon et al., (2007) Nature Structural & Molecular Biology 14:295-300, 2007.

La fijación de un ligando Notch a la subunidad ECN inicia dos escisiones proteolíticas sucesivas que ocurren por proteólisis intramembrana regulada. La primera escisión por una metaloproteasa (ADAM17) en el sitio S2 produce la subunidad transmembrana Notch susceptible de una segunda escisión en el sitio S3 cerca de la hojuela interna de la membrana plasmática. La escisión en el sitio S3, la cual es catalizada por un complejo multiproteico que contiene presenilina y nicastrina, y que promueve la -actividad de ?-secretasa, libera la porción intracelular de la subunidad transmembrana Notch, lo cual permite su traslocación hacia el núcleo y activa la transcripción de los genes objetivo. (Para una revisión de la escisión proteolítica de Notch ver, por ejemplo, Sisodia et al., Nal Rev. Neurosci. 3:281-290, 2002.) Se han identificado cinco ligandos Notch de las clases símil Jagged y Delta en humanos (Jaggedl (también denominado Serratel ), Jagged2 (también denominado Serrate2), símil Deltal (también denominado DLL1 ), símil Delta3 (también denominado DLL3) y símil Delta4 (también denominado DLL4)). Cada uno de estos ligandos es una proteína transmembrana de paso único con un motivo conservado N-terminal Delta, Serrate, LAG-2 (DSL) esencial para la fijación de Notch. Un conjunto de módulos símil EGF C-terminales respecto del motivo DSL precede el segmento que abarca la membrana. A diferencia de los receptores Notch, los ligandos tiene cortas colas citoplasmáticas de 70-215 aminoácidos en el C terminal. Además, se han informado otros tipos de ligandos (por ejemplo, DNER, NB3, y F3/Contactin). (Para la revisión de los ligandos Notch y la activación de Notch mediada por ligandos, ver, por ejemplo, D'Souza et al., Oncogene 27:5148-5167, 2008.) Las funciones de la vía Notch durante los diversos procesos de desarrollo y fisiológicos incluyen las que afectan la neurogénesis en moscas y vertebrados. En general, la señal Notch interviene en la inhibición lateral, las decisiones de linaje y el establecimiento de límites entre grupos de células (ver, por ejemplo, Bray, Molecular Cell Biology 7:678-679, 2006). Se ha demostrado que diversas enfermedades humanas, incluso cánceres y trastornos neurodegenerativos, son el resultado de mutaciones de genes codificadores de receptores Notch o sus ligandos (ver, por ejemplo, Nam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6:501^509, 2002). La conexión entre las señales Notch no restringidas y malignidad recién fue reconocida cuando se identificó una translocación cromosómica recurrente t(7;9)(q34;q34.3) que crea una variante truncada, constitutivamente activa de Notchl humano en un subconjunto de leucemias linfoblásticas agudas humanas (T-ALL) (ver, por ejemplo, Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3:587-613, 2008). En modelos murinos, se ha demostrado que las señales Notchl son esenciales para el desarrollo de las células T y que las señales mediadas por Notchl promueven el desarrollo de las células T a expensas del desarrollo de las células B (ver, por ejemplo, Wilson et al., J. Exp. Med. 194:1003-1012, 2001 ).

Notch2 también interviene en ciertos cánceres. En particular, se observa sobreexpresión de Notch2 en leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), la cual a su vez conduce a la sobreexpresión de CD23, un referente en las células de B-CLL. (Ver Hubmann et al., Blood 99:3742-3747, 2002.) Tanto Notchl como Notch2 presentan elevada expresión en células de mieloma múltiple (células B plasmáticas cancerosas), y la estimulación con ligando produce un fuerte incremento del crecimiento de las células tumorales. (Ver Jundt et al., Blood 103:351 1-3515, 2004.) Notch2 y los efectores corriente abajo están sobreexpresados en melanomas (ver Hoek et al., Cáncer Res. 64:5270-5282, 2004; Seykora et al., Am J Dermatopathol 25:6-11 , 2003), y el sitio Notch2 está amplificado en forma recurrente en las líneas celulares de melanoma (Jonsson et al., Oncogene, 26:4738-4748, 2007). Además, numerosos estudios han relacionado señales Notch2 aberrantes a cáncer de mama y otros tumores sólidos (revisado por Leong y Karsay, Blood 107:2223-2233, 2006). Notch2 también se requiere para el desarrollo de células B en zonas marginales. (Ver Pillai et al., Annu. Rev. Immunol. 23:161-196, 2005.) Debido a la intervención de las señales Notch en una amplia variedad de enfermedades humanas es obvio que se mantiene la necesidad de agentes que regulen las señales Notch y que tengan atributos clínicos favorables para el desarrollo como agentes terapéuticos. La invención descrita en la presente cubre esa necesidad y provee otros beneficios.

Todas las referencias citadas en la presente, incluso las solicitudes de patentes y las publicaciones, se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.

SÍNTESIS La invención provee anticuerpos anti-Notch y métodos para usarlos.

En un aspecto, se provee un anticuerpo monoclonal que se fija a Notch2 NRR. En una forma de realización, el anticuerpo inhibe la actividad de Notch2. En otra forma de realización, el anticuerpo no se fija significativamente a un miembro de la familia Notch fuera de Notch2. En otra forma de realización, el anticuerpo se fija a Notch2 NRR murino y Notch2 NRR humano. En otra forma de realización, el anticuerpo se fija a un Notch2 NRR con Kd de < 10 nM.

En aún otra forma de realización, se provee un anticuerpo monoclonal que se fija a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende: (a) un HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:3; (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (d) un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO: 10; (e) un HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:14; y (f) un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:19.

En una de estas formas de realización, el anticuerpo comprende un HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:1-2; un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:6-9; un HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:11-13; y un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:15-18. En una de estas formas de realización, el HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 , el HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, el HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 , y el HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. En otra de estas formas de realización, el HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, el HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, el HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 , y el HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16. En otra de estas formas de realización, el HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, el HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, el HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, y el HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17. En otra de estas formas de realización, el HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, el HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, el HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, y el HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18. En cualquiera de las anteriores formas de realización, el anticuerpo también comprende al menos un marco seleccionado de un marco aceptor VH 2 humano y un marco de consenso VL kappa de subgrupo I humano.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo monoclonal que se fija a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende un. dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:20-21 y un dominio variable de cadena liviana que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:22-25. En una forma de realización, el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 y un dominio variable de cadena liviana que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22. En una de estas formas de realización, el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, y el dominio variable de cadena liviana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22. En otra forma de realización, el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y un dominio variable de cadena liviana que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:23-25. En una de estas formas de realización, el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:21 , y el dominio variable de cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:23-25.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo aislado que se fija al mismo epitopo que un anticuerpo seleccionado de Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2, o Anticuerpo D-3. En otro aspecto, se provee un anticuerpo aislado que se fija al dominio LNR-A y el dominio HD-C de Notch2.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-Notch2 NRR es un fragmento de anticuerpo seleccionado de un fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, o (Fab')2. En otro aspecto, un anticuerpo anti-Notch2 NRR es un anticuerpo humanizado, quimérico o humano.

Cualquiera de las anteriores formas de realización se puede presentar sola o en combinación.

En otro aspecto; se provee un método para inhibir la actividad de Notch2, en donde el método comprende exponer una célula que expresa Notch2 a un anticuerpo como en cualquiera de las anteriores formas de realización. En otro aspecto, se provee un método para tratar un trastorno asociado con aumento de expresión o actividad de Notch2, en donde el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo como en cualquiera de las anteriores formas de realización. En otro aspecto, se provee un método para tratar una enfermedad maligna por células B, en donde el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo como en cualquiera de las anteriores formas de realización. En otro aspecto, se provee un método para tratar melanoma, en donde el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo como en cualquiera de las anteriores formas de realización.

En otro aspecto, se provee un método para tratar un trastorno asociado con incremento de la expresión o la actividad de Notchl , en donde el método comprende coadministrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Notch1 NRR y un agente terapéutico seleccionado de dexametasona y tamoxifeno, en donde el agente terapéutico reduce la diferenciación alterada de las células intestinales causada por el anticuerpo. En una de estas formas de realización, el trastorno es una enfermedad maligna por células T.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra las secuencias de la región hipervariable de las cadenas pesadas H1 , H2, y H3 (HVR) de los anticuerpos monoclonales anti-Notch2 NRR designados Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2 y Anticuerpo D-3, tal como se describe en el Ejemplo B(1 ). Las posiciones de los aminoácidos están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat tal como se describe más adelante.

La Figura 2 muestra las secuencias de HVR de las cadenas livianas L1 , L2 y L3 de los anticuerpos monoclonales anti-Notch2 NRR designados Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2, y Anticuerpo D-3, tal como se describe en el Ejemplo B(1 ). Las posiciones de los aminoácidos están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat tal como se describe más adelante.

La Figura 3 muestra un alineamiento de las secuencias de la región variable de las cadenas pesadas de Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2 y Anticuerpo D-3. Los HVR están encerrados en cajas, tal como se describe en Ejemplo B(1).

Figura 4 muestra un alineamiento de las secuencias de la región variable de las cadenas livianas de Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2 y Anticuerpo D-3. Los HVR están encerrados en cajas.

Las Figuras 5A y 5B muestran ejemplos de secuencias marco de consenso pesadas variables aceptoras humanas (VH) para el uso en la puesta en práctica de la presente invención. Los identificadores de secuencia son los siguientes: - marco de consenso de VH subgrupo I humano "A" menos CDR de Kabat (SEQ ID NO:32, 33, 34, 35). - marcos de consenso de VH subgrupo I humano "B", "C", y "D" menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NO:36, 37, 34, 35; SEQ ID NOs:36, 37, 38, 35; y SEQ ID NO:36, 37, 39, 35). - marco de consenso de VH subgrupo II humano "A" menos CDR de Kabat (SEQ ID NO:40, 41 , 42, 35). - marcos de consenso de VH subgrupo II "B", "C", y "D" menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOs:43, 44, 42, 35; SEQ ID NOs:43, 44, 45, 35; y SEQ ID NOs:43, 44, 46, y 35). - marco de consenso de VH subgrupo III humano "A" menos CDR de Kabat (SEQ ID NOs:47, 48, 49, 35). - marcos de consenso de VH subgrupo III "B", "C", y "D" menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOs:50, 51 , 49, 35; SEQ ID NOs:50, 51 , 52, 35; y SEQ ID NOs:50, 51 , 53, 35). - marco aceptor VH humano "A" menos CDR de Kabat (SEQ ID NOs:54, 48, 55, 35). - marcos aceptores VH humanos "B" y "C" menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOs:50, 51 , 55, 35; y SEQ ID NOs:50, 51 , 56, 35). - marco aceptor VH humano 2 "A" menos CDR de Kabat (SEQ ID NOs:54, 48, 57, 35). - marcos aceptores VH humanos 2 "B", "C", y "D" menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID NOs:50, 51 , 57, 35; SEQ ID NOs:50, 51 , 58, 35; y SEQ ID NOs:50, 51 , 59, 35).

La Figura 6 muestra ejemplos de secuencias marco de consenso variables livianas aceptoras humanas (VL) para el uso en la puesta en práctica de la presente invención. Los identificadores de secuencia son los siguientes: - marco de consenso de subgrupo I VL kappa humano (??1 ): SEQ ID NOs:60, 61 , 62, 63 - marco de consenso de subgrupo II VL kappa humano (KV2): SEQ ID NOs:64, 65, 66, 63 - marco de consenso de subgrupo III VL kappa humano (??3): SEQ ID NOs:67, 68, 69, 63 - marco de consenso de subgrupo IV VL kappa humano (KV4): SEQ ID NOs:70, 71 , 72, 63 La Figura 7 muestra secuencias marco de las cadenas livianas y pesadas huMAb4D5-8. Los números de superíndice/negrita indican las posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.

La Figura 8 muestra secuencias marco de las cadenas livianas y pesadas huMAb4D5-8 con las modificaciones indicadas. Los números de superíndice/negrita indican las posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.

Las Figuras 9A y 9B muestran que los anticuerpos ant¡-NRR1 y anti-NRR2 se fijan específicamente a sus receptores cognados, tal como se describe en el Ejemplo B(1 ). (A) Ensayo por ELISA que mide la fijación de ariti-NRR1 (panel izquierdo) y anti-NRR2 (panel derecho) a los fragmentos de proteína purificada NRR proveniente de cada uno de los cuatro receptores Notch humanos (h) y murinos (m). La fijación, mostrada como A560 en el eje y se gráfica en función de una titulación de anti-NRR1 o anti-NRR2. (B) Ensayo FACS que mide la fijación de anti-NRR1 (paneles 1-6) o anti-NRR2 (paneles 7-12) a células no transfectadas K1-CHO (paneles 1 , 4, 7 y 10), células K1-CHO transfectadas en forma estable con N-myc-Notch1 (paneles 2, 5, 8 y 11) o células K1-CHO transfectadas en forma estable con N-myc-Notch2 (paneles 3, 6, 9 y 12). Los transgenes N-nnyc-Notch se expresaron bajo el control del promotor inducible tet; hilera inferior, expresión de control en ausencia de inducción con doxiciclina (-Dox); hilera superior, expresión inducida después de la adición de doxiciclina (+Dox); nótese que la línea K1-CHO expresa endógenamente Notch2, el cual se detecta mediante anti-NRR2 en presencia y ausencia de doxiciclina (por ejemplo, comparar paneles 7 y 10).

Las Figuras 10A-C muestran cómo anti-NRR1 y anti-NRR2 inhiben específicamente las señales de sus receptores objetivo, incluso los receptores portadores de mutaciones activadóras, tal como se describe en los Ejemplos B(2) y B(3). (A) Ensayo de cocultivo que mide la inhibición por anti-NRR1 de las señales de Notchl . Se usaron células NIH-3T3 transfectadas en forma estable con Jagl para inducir señales Notch en células NIH-3T3 transfectadas en forma estable con Notchl (excepto "-Jag1", que usa células no transfectadas NIH-3T3 en lugar de célula que expresan Jag1 ). Las señales Notch se midieron mediante el uso de un gen informador Notch (promotor dependiente de CSL que dirige la expresión de luciferasa de luciérnaga) y se expresa respecto de la expresión de genes control (promotor constitutivo que dirige la expresión de luciferasa de Renilla) normalizado para las condiciones DAPT (definidas como valor de 1 ). +Jag1 , ensayo estándar de cocultivo; DMSO, vehículo DAPT solo; DAPT, 5 µ? en DMSO; a-gD, anticuerpo de control de isotipo a 2000 ng/ml; a-NRR1 , anticuerpo anti-NRR1 en las concentraciones indicadas; Los últimos cuatro ensayos incluyeron 80 ng/ml de a-NRR1 o a-gD más fragmentos proteicos purificados de Notchl o Notch2 NRR, tal como se indica (+NRR1 o +NRR2). (B) Ensayo de cocultivo que mide inhibición de anti-NRR2 de señales Notch2. Se usaron células NIH-3T3 transfectadas en forma estable con Jag1 para inducir las señales Notch en células U87MG, las cuales expresan niveles elevados de Notch2. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en (A). (C) Ensayo de cocultivo que mide la inhibición anti-NRR1 de las señales Notchl proveniente de receptores de tipo silvestre o mutantes Notchl . Se llevó a cabo el ensayo tal como en (A) excepto en que las células que expresan el receptor fueron generadas por transfección transitoria de los plásmidos que expresan los receptores Notchl indicados. WT, Notchl de tipo silvestre; APEST, Notchl carente del dominio PEST; L1594P, Notchl portador de la mutación puntual activadora constitutiva indicada; E25, 625 ng/ml anticuerpo control de isotipo; a-NRR1 , 625 ng/ml anticuerpo anti-NRR1 ; DMSO, vehículo GSI solo; DAPT, 5 µ? en DMSO; CmpE, 1 µ? de compuesto E en DMSO.

Las Figuras 11A-D muestran que anti-NRR1 y anti-NRR2 funcionan como inhibidores específicos de receptor ¡n vivo, tal como se describe en el Ejemplo B(4). Ratones Balb/c fueron inyectados cuatro veces por cada cuatro días con 5 mg/kg de a-gD control de isotipo, a-NRR1 o a-NRR2, y se cosecharon células del timo o el bazo el día 13, un día después de la cuarta dosis. (A) Mediciones de peso del timo. Los pesos del timo (en mg) se expresan respecto del peso corporal total (en g). Los valores representan la media más la desviación estándar para tres ratones por grupo. (B) Recuento de células del timo. (C) CD4 y CD8 FACS para identificar célula T doble positivas CD4+/CD8+. Los números representan el porcentaje de células tímicas en las poblaciones doble negativas, simples positivas y dobles positivas. Respecto del control anti-gD (77,5%), anti-NRR1 redujo notablemente el porcentaje de células en la población CD4+/CD8+ (5,89%) mientras que anti-NRR2 (80%) no tuvo efecto significativo. (D) CD21 y CD23 FACS para identificar célula B de la zona marginal. Los números representan los porcentajes medios ± la desvío estándar (de tres animales) de células dentro del portal MZB, el cual es una caja; también se destacan los valores p; se grafican puntos representativos de uno de los tres animales de cada grupo. Respecto del control anti-gD (6,61%), anti-NRR2 casi eliminó las células MZB (0,97%) mientras que anti-NRR1 (6%) no tuvo efecto significativo.

En las Figuras 12A-D, una estructura de 2,2 A de cocristal anti-NRR1 Fab/NRR1 indica que anti-NRR1 está simultáneamente en contacto con los dominios LNR-A, LNR-B y HD-C, tal como se describe en el Ejemplo B(5). (A) Tabla que resume la unión de a-NRR1 o a-NRR2 a los fragmentos proteicos quiméricos Notch1-NRR o Notch2 NRR. Los fragmentos de proteína NRR indicada (azul oscuro, secuencias Notchl ; azul claro, secuencias Notch2) se expresan como proteínas secretadas fusionadas a fosfatasa alcalina para permitir las mediciones rápidas de fijación de anticuerpo en un ensayo basado en placa. Después de usar la actividad de la fosfatasa alcalina para normalizar la expresión y la secreción de NRR, se añadió medio de cultivo que contiene las proteínas quiméricas NRR indicadas a una placa de 96 cavidades que había sido recubierta con a-NRR1 , a-NRR2 o un anticuerpo control de isotipo (usado para evaluar la fijación de base, no mostrada). La fijación del anticuerpo se evaluó mediante la medición de la actividad de la fosfatasa alcalina que permanecía fijada a la placa. Y, unión fuerte; N, no se observa unión; W, se observa unión débil. (B) Estructura de Notch NRR1 humano. NRR1 se muestra como un cuadrado C-alfa. Los tres iones calcio del motivo LNR se muestran como esferas. La posición del sitio de la escisión S2 se marca con una flecha. (C) Superposición de NRR1 sobre NRR2 (cadena A del código pdb 2004) basado en los átomos conservados estructuralmente. NRR1 (sombreado) y NRR2 (blanco) se muestran como trazas C-alfa. (D) Vista a libro abierto de la interfaz entre NRR1 (izquierda) y a-NRR1 Fab (derecha, el borde entre las cadenas pesada y liviana se muestra como una línea de puntos negra). Se indica el grado hasta el cual la superficie accesible al solvente está cubierta por la formación de complejo. Los residuos ocultos al menos hasta el 50% están rotulados, con idénticos residuos NRR en Notch 1 y Notch2 rotulados en fuente negrita (Ver también la Figura 18).

Las Figuras 13A-C muestran que anti-NRR1 causa hiperbrotación de las células endoteliales, tal como se describe en el Ejemplo B(6). (A) ensayo de brotación de células endoteliales in vitro. Las HUVEC se recubrieron con perlas Cytodex y se cocultivaron con fibroblastos de piel. Los cultivos se trataron en falso (control) o se trataron con 1 µ? de DBZ, 5 pg/ml de a-NRR1 o 5 pg/ml de a-DII4. Barra = 100 µ?t?. (B) Medición de la longitud de los brotes de los cultivos en (A). (C) ensayo de retina de ratón neonato sobre brotación de células endoteliales y angiogénesis. Ratones recién nacidos se inyectaron en P1 y P3 con los anticuerpos indicados, y se prepararon las retinas en P5 para visualizar la perfusión de isolectina o el marcador K¡67 para la proliferación. Paneles I y II, Barra = 1 mm. Paneles lll-VI representan alargamiento de partes de los paneles I y II, barra = 0,2 mm.

Las Figuras 14A-E muestran que el bloqueo selectivo por anticuerpos de las señales NotcM altera la angiogénesis de los tumores e inhibe crecimiento tumoral, tal como se describe en Ejemplo B(7). Gráficos para tres modelos de xénoinjerto tumoral que demuestran volumen tumoral (media +/- SEM) versus tiempo después del tratamiento con los anticuerpos indicados: a-Ragweed (control negativo), a-VEGF o a-NRR1. Se muestran los valores p para comparación de a-Ragweed vs. a-NRR1. (A) Modelo Calu6. (B) Modelo HM7. (C) Modelo HM7 con titulación de dosis de a-NRR1. (D) Tinción de células endoteliales en secciones representativas de tumor del modelo Calu6 mostrado en (A). Los anticuerpos usados en el modelo de xénoinjerto se muestran en la parte superior. Se usaron DAPI y a-CD31 para teñir ADN y células endoteliales, respectivamente. La hilera inferior de los paneles muestra las imágenes fusionadas. Barra = 50 pm. (E) Cuantificación de la tinción CD31 mostrada en (D). El uso de ImageJ para cuantificar la tinción CD31 y DAPI en imágenes similares a las mostradas en (D), tinción relativa CD31 (tinción CD31 normalizada respecto de tinción DAPI) se gráfico para cada uno de los tres tratamientos de anticuerpo respecto del control a-Ragweed, el cual se fijó en un valor de 1 ; los datos representan la media +/- desvío estándar para 8 campos de imagen.

Las Figuras 15A-C muestran que el bloqueo selectivo por anticuerpos de Notchl es suficiente para alterar el destino de las células del intestino delgado, tal como se describe en el Ejemplo B(8). (A) Cambio total de peso corporal (media +/- desvío estándar) vs. tiempo. Los ratones se trataron tal como se describió para la Figura 11 con control de isotipo anti-gD, LTpR-Fc, anti-NRR1 o anti-NRR2. Las flechas marcan los días de dosificación. (B) Análisis inmunohistoquímico de intestino delgado. Los ratones se trataron con las concentraciones indicadas de control de isotipo anti-gD, DBZ o anti-NRR1 los días O, 2 y 6, y se prepararon los intestinos delgados para el análisis inmunohistoquímico el día 7. En cada hilera indicada se muestra la tinción de hematoxilina y eosina (H & E), Alcian Blue para mucina y para marcar células secretoras caliciformes, lisozima para marcar células de Panet, Ki-67 para la proliferación y Hes1 como objetivo corriente abajo de Notch. Ver las Figuras 19 y 20 para los análisis del intestino grueso el día 7 y del intestino delgado el día 2, respectivamente. Barra = 40 pm. (C) Comparación de inhibición específica de Notchl versus Notch2 sobre la diferenciación de las células del intestino delgado. Los intestinos delgados provenientes del estudio descrito en (A) se prepararon para Alcian Blue y Ki-67 un día después de la dosificación final con a-gD, a-NRR1 o a-NRR2, tal como se indicó. Barra = 50 pm.

La Figura 16 muestra que anti-NRR1 es un poderoso inhibidor de las señales Notchl inducidas por múltiples ligandos, tal como se describe en el Ejemplo B(2). Se realizaron ensayos de cocultivo de señales Notchl tal como se describe en la Figura 10A excepto en que las células que expresan ligando expresaban Jag1 , Jag2 o DII1 , tal como se indica.

La Figura 17 muestra construcciones proteicas quiméricas Notchl NRR/Notch2 NRR de bajo rendimiento, tal como se describe en el Ejemplo B(5). La tabla complementa la Figura 12A, al enumerar las proteínas NRR quiméricas que produjeron escasa o nula actividad secretora de la fosfatasa alcalina, lo cual sugiere que las quimeras estaban mal plegadas o eran inestables de otro modo. Para los fragmentos que produjeron actividad débil pero detectable de la fosfatasa alcalina, se resume la fijación de a-NRR1 o a-NRR2. , sin expresión y fijación no probada; N, sin expresión o fijación; W, expresión o fijación débil.

La Figura 18 muestra la conservación de los residuos NRR1 en contacto con anti-NRR1 , tal como se describe en el Ejemplo B(1 ) y B(5). Alineamiento de las secuencias de aminoácidos del dominio de Notchl NRR humano (SEQ ID NO:26), el dominio de Notchl NRR murino (SEQ ID NO:27), dominio de Notch2 NRR humano (SEQ ID NO:28) y dominio de Notch2 NRR murino (SEQ ID NO:29), con los límites de subdominio mostrados a la derecha. Notchl NRR humano está listado como secuencia de referencia, y los residuos en las demás secuencias NRR que son idénticas a las de Notchl humano se muestran en fuente negrita. Se destacan los residuos que están ocultos al menos 25% en la estructura anti-NRR1-Fab/Notch1-NRR (Figura 12), en donde las líneas enteras versus las líneas de puntos reflejan el aumento del grado de cobertura de los residuos. Dé los 21 aminoácidos que están ocultos al menos 25% en la secuencia Notchl humana, los 21 son idénticos en la secuencia Notchl del ratón, pero sólo seis son idénticos en las secuencias Notch2 humanas y murinas (más una séptima diferencia conservadora de T en lugar de S en el Notchl S1712 humano); de estos residuos idénticos y "ocultos" en las secuencias Notch2, ninguno pertenece a la clase de ocultos en >75%. Esta comparación de secuencias concuerda con (a) una fuerte fijación de anti-NRR1 (afinidades aproximadamente iguales) a Notchl humano y murino, y (b) una falta de fijación de anti-NRR1 a Notch2 humano y murino. Además, todos los residuos ocultos se encuentran dentro de LNR-A, LNR-B y HD-C, lo cual concuerda con el experimento de cambio de dominio de las Figuras 11 A y 17.

La Figura 19 muestra que el bloqueo selectivo por anticuerpos de Notchl es suficiente para alterar el destino de las células en el intestino grueso, tal como se describe en el Ejemplo B(8). Los análisis histopatológicos son de las muestras de intestino grueso obtenidas el día 7 del experimento descrito en la Figura 15B.

La Figura 20 muestra que el cambio de destino de las células intestinales ocurre 2 días después del bloqueo de Notchl , tal como se describe en el Ejemplo B(8). Los análisis histopatológicos son de las muestras de intestino delgado obtenidas el día 2 del experimento descrito en la 15B, el cual presenta las muestras obtenidas el día 7.

La Figura 21 muestra que anti-NRR1 no bloquea las señales inducidas por Notch2 in vitro, tal como se describe en el Ejemplo B(2). Ensayo de cocultivo en células U87MG, tal como se describe en la Figura 10B. Si bien antí-NRR1 inhibe con fuerza las señales Notchl in vitro (Figura 10A) e in vivo (Figuras 11A-C), no afecta las señales Notch2, incluso cuando se usa en una concentración (1000 ng/ml) más de 100 veces superior a IC50. Este resultado concuerda con la fijación específica de anti-NRR1 a Notchl (Figuras 9 y 12) asi como la falta de inhibición por anti-NRR1 de Notch2 in vivo (Figura 11 D).

La Figura 22 muestra los posibles efectos sinérgicos de anti-NRR1 y anti-NRR2 sobre la diferenciación de las células intestinales, tal como se describe en el Ejemplo B8.

La Figura 23 muestra que dexametasona rescata al menos parcialmente el fenotipo intestinal causado por anti-NRR1 , tal como se describe en el Ejemplo B(9).

Las Figuras 24A y B muestran que el bloqueo selectivo de Notchl o Notch2 minimiza o evita la metaplasia de las células caliciformes asociada con inhibición pan-Notch, mientras que el bloqueo de Notchl y Notch2 causa severa metaplasia de las células caliciformes. (A) Tal como se describe en el Ejemplo B8, se dosaron ratones con 5 mg/kg de anti-NRR1 , anti-NRR2 o ambos, o un anticuerpo control negativo anti-gD los días marcados con flechas; se muestra el cambio de peso corporal total (media +/- desvío estándar) vs. tiempo. (B) Análisis inmunohistoquímicos de intestinos delgados de ratones tratados como en (A), mediante el uso de Alcian Blue para mucina para marcar las células secretoras caliciformes.

Las Figuras 25A y 25B muestran que anti-NRR2 (referido como "anti-N2") inhibe el crecimiento de las líneas de células de melanoma humano SK23 y LOX-IMVI in vitro, tal como se describe en el Ejemplo B(10).

La Figura 26 muestra el efecto de ant¡-NRR2 (referido como "anti-Notch2") sobre cinco líneas de células de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) (enumeradas a la derecha). Tal como se describe en el Ejemplo B(11 ), el crecimiento de una de las líneas celulares, "DB", estaba fuertemente inhibida por el tratamiento con anti-NRR2.

La Figura 27 muestra el efecto de anti-NRR2 (referido como "anti-Notch2") sobre el crecimiento de la línea celular DB DLBCL con el transcurso del tiempo, tal como se describe en el Ejemplo B(1 1 ).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee anticuerpos aislados que se fijan a Notch y métodos para usarlos, por ejemplo, para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresión o la actividad de Notch.

I. TÉCNICAS GENERALES Las técnicas y los procedimientos descritos o referenciados en la presente son generalmente bien comprendidos y comúnmente usados mediante el uso de metodología convencional por parte de los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas que se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3.a edición (2001 ) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie Metodes in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practica! Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lañe, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, y Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleótido Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Metods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley y Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polimerase Cadena Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991 ); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley y Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practica! Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practica! Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. DEFINICIONES A los fines de interpretar la presente memoria descriptiva, se aplican las siguientes definiciones, y siempre que corresponda, los términos usados en singular también incluyen el plural y viceversa. En el caso de que cualquier definición establecida a continuación no coincida con cualquier documento incorporado en la presente por referencia, prevalecerá la definición establecida a continuación.

El término "anticuerpo" en la presente se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo los anticuerpos biespecíficos) formados al menos a partir de dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada.

Un anticuerpo "aislado" es aquél que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían en los usos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En algunas formas de realización, un anticuerpo es purificado (1 ) hasta más de 95% en peso de anticuerpo tal como se determina, por ejemplo, por el método de Lowry, y en algunas formas de realización, a más del 99% en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de N-terminal o de secuencia interna de aminoácidos mediante el uso de, por ejemplo, un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras, por ejemplo, mediante el uso de tensión con azul Coomassie o argéntica. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, dado que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, por lo general el anticuerpo aislado se prepara mediante al menos una etapa de purificación.

Los "anticuerpos nativos" son usualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestos por dos cadenas livianas (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena liviana está ligada a una cadena pesada a través de un enlace disulfuro covalente, mientras que la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena liviana y cadena pesada tiene también puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de una cantidad de dominios constantes. Cada cadena liviana tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; El dominio constante de la cadena liviana se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena liviana se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas livianas y de las cadenas pesadas.

El término "anticuerpo anti-Notch1 NRR" o "un anticuerpo que se fija a Notchl NRR" se refiere a un anticuerpo capaz de fijar Notchl NRR con suficiente afinidad para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico dirigido Notchl . Con preferencia, el grado de fijación de un anticuerpo anti-Notch1 NRR a una proteína no Notch no relacionada es inferior a aproximadamente el 10% de la fijación del anticuerpo a Notchl NRR medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas formas de realización, un anticuerpo que se fija a Notchl NRR tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 µ?, = 100 nM, < 10 nM, =1 nM, o =0,1 nM. En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-Notch1 NRR se fija a un epitopo de Noten que está conservado entre los Notch provenientes de diferentes especies, por ejemplo, roedores (ratones, ratas) y primates.

El término "anticuerpo anti-Notch2 NRR" o "un anticuerpo que se fija a Notch2 NRR" se refiere a un anticuerpo capaz de fijar Notch2 NRR con suficiente afinidad para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico dirigido a Notch2. Con preferencia, el grado de fijación de un anticuerpo anti-Notch2 NRR a una proteína no Notch no relacionada es inferior a aproximadamente el 10% de la fijación del anticuerpo a Notch2 NRR medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas formas de realización, un anticuerpo que se fija a Notch2 NRR has a constante de disociación (Kd) de < 1 µ?, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, o= 0,1 nM. En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-Notchl NRR se fija a un epitopo de Notch que está conservado entre los Notch provenientes de diferentes especies, por ejemplo, roedores (ratones, ratas) y primates.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de las cadenas pesadas o las cadenas livianas del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede referir como "VH". El dominio variable de la cadena liviana se puede referir como "VL". Estos dominios son en general las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de fijación del antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la fijación y la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVR) tanto en los dominios variables de las cadenas livianas como de las cadenas pesadas. Las porciones de dominios variables más altamente conservadas se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas livianas y las cadenas pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que en general adoptan una configuración de lámina beta, conectada mediante tres HVR, las cuales forman giros que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina beta. Las HVR de cada cadena se mantienen unidos en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de fijación del antígeno de los anticuerpos (Ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, National Institute of Health, Betesda, MD (1991 )). Los dominios constantes no intervienen directamente en la fijación de un anticuerpo con un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

Las "cadenas livianas" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) provenientes de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa (?) y lambda (?), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Según las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de ellas se pueden subdividir a su vez en subclases (¡sotipos), por ejemplo, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgAi e lgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones dimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y descritas en general, por ejemplo, en Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4° ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión mayor, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos.

Los términos "anticuerpo de longitud total", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se usan en la presente en forma indistinta para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no como fragmentos de anticuerpos tal como se define más adelante. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fe.

Un "anticuerpo desnudo" a los fines de la presente es un anticuerpo que no está conjugado a un resto citotóxico o marca radiactiva.

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, con preferencia que comprende su región fijadora de antígeno correspondiente. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monoicatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos fijadores de antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio fijador de antígeno, y un fragmento residual "Fe", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que posee dos sitios de combinación con el antígeno y aún es capaz de formar enlaces cruzados con el antígeno.

"Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio fijador de antígeno completo. En una forma de realización, una especie bicatenaria de Fv consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena liviana en asociación estrecha no covalente. En una especie monocatenaria de Fv (scFv), un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena liviana pueden estar ligados covalentemente a través de un péptido ligador flexible de manera tal que las cadenas livianas y pesadas se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie bicatenaria de Fv. En está configuración, los tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio fijador de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En forma colectiva, los seis HVR confieren especificidad de fijación de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVR específicos para un antígeno) tiene capacidad para reconocer y fijar el antígeno, aunque con menor afinidad que todo el sitio de fijación.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de las cadenas pesadas y las cadenas livianas y también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para el Fab' en el cual el(os) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. El fragmento F(ab')2 de los anticuerpos era producido originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisternas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos de fragmentos de anticuerpos.

Los fragmentos de anticuerpo "monocatenarios Fv" o "scFv" comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido scFv también comprende in ligador polipéptido entre los dominios VH y VL, el cual permite que el scFv forme la estructura deseada para la fijación del antígeno. Para una revisión de scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology on Monoclonal Antlbodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), pp. 269-315.

El término "diacuerpos" se refiere fragmentos de anticuerpo con dos sitios fijadores de antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL). Mediante el uso de un ligador que ^es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzador a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios fijadores de antígeno. Losa diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen mejor, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO ,1993/01 161 ; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat Med. 9:129-134 (2003).

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones que ocurren en la naturaleza, que pueden estar presentes en cantidades menores. En consecuencia, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos diferenciados. En ciertas formas de realización, dicho anticuerpo monoclonal generalmente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptido que se fija a un objetivo, en donde la secuencia de polipeptido fijador del objetivo se obtiene por un proceso que incluye la selección de una única secuencia de polipéptido fijador de objetivo dentro de una pluralidad de secuencias de polipéptido. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon singular dentro de una pluralidad de clones, tales como un pool de clones de hibridoma, de clones de fagos o de clones de ADN recombinante. Se debe entender que también se puede alterar un a fijación a un objetivo seleccionado, por ejemplo, con la finalidad de mejorar la afinidad por el objetivo, para humanizar la secuencia fijadora del objetivo, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia fijadora del objetivo alterada también es un anticuerpo monoclonal de la presente invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, las cuales generalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un único determinante de un antígeno. Además de su especificidad, preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas en cuanto a que generalmente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales usados de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por diversas técnicas, incluso, por ejemplo, el método del hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981 )), métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567), tecnologías de presentación de fago (ver, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991 ); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 1 19-132(2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o símil humanos en animales que poseen partes o la totalidad de los sitios de inmunoglobulinas humanas o genes codificadores de secuencias de inmunoglobulinas humanas (ver, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741 ; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); las patentes de los Estados Unidos N.° 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 y 5.661.016; Marks er a/., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o la cadena liviana es idéntica u homologa a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivadas de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567; y Morrison er a/., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en donde la región fijadora de antígeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, al inmunizar monos macacos con el antígeno de interés.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una forma de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la cual los residuos de un HVR del receptor son reemplazados por residuos de un HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, la afinidad y/o la capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos FR de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden hacer para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente todos los giros hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad o sustancialmente todos los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), generalmente el de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver, por ejemplo, Jones ef al., Nature 321 :522-525 (1986); Rlechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y las patentes de los Estados Unidos N.° 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha preparado mediante el uso de cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos human tal como se describe en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos fijadores de antígenos no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir mediante el uso de diversas técnicas conocidas en la técnica, incluso bibliotecas con presentación de fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991 ); Marks ef al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991 ). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos descritos en Colé ef al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner ef al., J. Immunol., 147(1 ):86-95 (1991 ). Ver también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001 ). Los anticuerpos humanos se pueden preparar al administrar el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir dicho anticuerpos en respuesta al desafío antigénico, pero se han desactivado los sitios endógenos, por ejemplo, xenoratones inmunizados (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.° 6.075.181 y 6.150.584 respecto de tecnología XENO OUSE™). Ver también, por ejemplo, Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) respecto de anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridoma de células B humanas.

El término "región hipervariable", "HVR", o "HV", cuando se usa en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son ' hipervariables eji secuencia y/o forman giros definidos estructuralmente. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en VH (H1 , H2, H3), y tres en VL (L1 , L2, L3). En los anticuerpos nativos, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de los seis HVR, y en particular se cree que H3 juega un papel singular para conferir especificidad fina a anticuerpos. Ver, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Metods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos camélidos que se encuentran en la naturaleza y que consisten de una sola cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de cadena liviana. Ver, por ejemplo, Hamers- Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Numerosas delineaciones de HVR son. de uso y están abarcadas en la presente. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las usadas más comúnmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5o Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, MD. (1991 )). En cambio Chothia se refiere a la ubicación de los giros estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los AbM HVR representan un compromiso entre los HVR de Kabat y los giros estructurales de Chothia, y se usan mediante el software de modelado de anticuerpo AbM Oxford Molecular. Los HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada uno de estos HVR se presentan a continuación.

Giro Kabat AbM Chothia Contacto L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Los HVR pueden comprender "HVR extendidos" como sigue: 24-36 o 24-34 (L1 ), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en VL y 26-35 (H1 ), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en VH. Los residuos de dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

Los residuos "marco" o "FR" son los residuos de dominio variable distintos de los residuos HVR tal como se definen en la presente.

El término "numeración de residuo de dominio variable según Kabaf o "numeración de posición de , aminoácidos según Kabat" y sus variaciones, se refiere al sistema de numeración usado para el dominio variable de las cadenas pesadas o el dominio variable de las cadenas livianas de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Mediante el uso de este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o más aminoácidos correspondientes a un acortamiento o una inserción en FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo residuos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la cadena pesada FR. La numeración de residuos según Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado a través del alineamiento en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada "estándar" de Kabat.

El sistema de numeración de Kabat se usa en referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena liviana y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (p.ej, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5o Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, Md. (1991 )). El "sistema dé numeración de UE" o "índice UE" se usa en general en referencia a un residuo en una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice UE informado en Kabat et al., supra). El "índice UE según Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo UE lgG1 humano. A menos que se indique otra cosa en la presente, las referencias a los números de residuo en los dominios variables de los anticuerpos significa la numeración de los residuos según el sistema de numeración de Kabat. A menos que se indique otra cosa en la presente, las referencias a los números de residuo en los dominios constantes de los anticuerpos significa la numeración de los residuos según el sistema de numeración UE (por ejemplo, ver publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos N.° US 2008/0181888 A1 , Figuras para la numeración UE).

Un anticuerpo "maduro por afinidad" es aquel con una o más alteraciones en uno o más de sus HVR, que da como resultado un mejoramiento de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, comparado con un anticuerpo original que no posee dicha alteración. En una forma de realización, un anticuerpo maduro por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno objetivo. Los anticuerpos maduros por afinidad se pueden obtener mediante el uso de ciertos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describes la maduración por afinidad por arrastre de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de HVR y/o los residuos marco se describe, por ejemplo, en Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813 (1994); Schier er a/. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Un anticuerpo "bloqueador" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que fija. Ciertos anticuerpos bloqueadores o anticuerpos antagonistas inhiben sustancialmente o completamente la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista" tal como se usa en la presente, es un anticuerpo que simula totalmente o en parte al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

Los anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos que impiden o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual se fija el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede impedir o reducir la proliferación de las células cancerosas in vltro y/o in vivo.

Los anticuerpos que "inducen la apoptosis" son aquellos que inducen la muerte celular programada tal como se determina mediante ensayos estándar de apoptosis, tales como fijación de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación de retículo endoplasmático, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos de apoptosis).

Las "funciones efectoras" de un anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región de secuencia nativa Fe o una región de secuencia variante de aminoácidos Fe) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: fijación de C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); fijación de receptor Fe; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación hacia debajo de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de células B); y activación de células B.

El término "región Fe" se usa en la presente para definir una región C— terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluso las regiones Fe de secuencia nativa y las regiones variantes Fe. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fe de la cadena pesada de IgG humana se suele definir como extensión desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el carboxilo terminal correspondiente. La lisina C terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de UE) de la región Fe se puede extraer, por ejemplo, durante la producción o la purificación del anticuerpo, o mediante ingeniería genética recombinante de los ácidos nucleicos codificadores de una cadena pesada del anticuerpo. En consecuencia, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, las poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 eliminados, y las poblaciones de anticuerpo que tienen mezclas de anticuerpos con y sin residuo K447.

Una "región funcional Fe" posee una "función efectora" de una región Fe nativa. Los ejemplos de "funciones efectoras" incluyen fijación de C1q; CDC; fijación de receptor Fe; ADCC; fagocitosis; regulación hacia debajo de receptores celulares (por ejemplo receptor de células B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras en general requieren combinar la región Fe con un dominio de fijación (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se pueden evaluar mediante el uso de diversos ensayos según se describe, por ejemplo, en las definiciones en la presente.

Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe que se encuentra en la naturaleza. Las regiones Fe de secuencia nativa humanas incluyen una región Fe de lgG1 de secuencia nativa humana (alotipos no A y A); región Fe de lgG2 de secuencia nativa humana; región Fe de lgG3 de secuencia nativa humana; y región Fe de lgG4 de secuencia nativa humana así como sus variantes que se encuentran en la naturaleza.

Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la región Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido, con preferencia una o más sustituciones de aminoácidos. Con preferencia, la región Fe variante tuene al menos una sustitución de aminoácido comparado con una región Fe de secuencia nativa o con la región Fe de un polipéptido original, por ejemplo desde aproximadamente una hasta aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y con preferencia desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido original. La región Fe variante en la presente con preferencia posee al menos aproximadamente 80% de homología con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido original, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 90% de homología con ella, con mayor preferencia al menos aproximadamente 95% de homología con ella.

El "receptor Fe " o "FcR" describe un receptor que se fija a la región Fe de un anticuerpo. En algunas formas de realización, un FcR es un FcR humano nativo. En algunas formas de realización, un FcR es aquel que fija un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl y FcyRIII, incluso variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de dichos receptores. Los receptores FcyRIl incluyen FcyRI IA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos. El receptor activador FcyRI IA contiene un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplasmático (ver, por ejemplo, Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991 ); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluso los que se identifiquen en el futuro, quedan abarcados por el término "FcR" en la presente.

El término " receptor Fe " o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de IgG maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y la regulación de la homeostasis de las inmunoglobulinas. Se conocen métodos para medir la fijación de FcRn (ver, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton er al.).

La fijación a FcRn humano in vivo y la vida media sérica de los polipéptidos de fijación con alta afinidad por FcRn humano se puede analizar, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares transfectadas humanas , que expresan FcRn humano, o en primates a los cuales se administran polipéptidos con una región Fe variante. El documento WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con fijación mejorada o disminuida a FcR. Ver también, por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001 ).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En ciertas formas de realización, las células expresan al menos FcyRIII y realizan funciones efectoras de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células natural killer (NK), monolitos, células T citotoxicas, y neutrófilos. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.

La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig secretada fijada a receptores Fe (FcR) presentes en ciertas células citotoxicas (por ejemplo células NK, neutrófilos, y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotoxicas se fijen específicamente a una célula objetivo portadora de antígeno y luego maten la célula objetivo mediante citotoxinas. Las células principales para mediar ADCC, las células NK, sólo expresan FcyRIII, mientras que los monolitos expresan FcyRI, FcyRIl, y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991 ). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo in vitro de ADCC, tal como la descrita en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.500.362 o 5.821.337 o la patente de los Estados Unidos N.° 6.737.056 (Presta). Las células efectora útiles para tales ensayos incluyen PBMC y células NK. Alternativamente, o además, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia de complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia por la fijación del primer componente del sistema del complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase adecuada), los cuales se fijan a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Metods 202:163 (1996). Las variantes de polipéptidos con secuencias de aminoácidos de región Fe alteradas (polipéptidos con una región Fe variante) y aumento o disminución de la capacidad de fijación de C1 q se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos N.° 6.194.551 B1 y el documento WO 1999/51642. Ver también, por ejemplo, Idusogie ef al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

El término "anticuerpo que comprende una región Fe" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fe. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración UE) de la región Fe se puede eliminar, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o mediante ingeniería recpmbinante de los ácidos nucleicos codificadores del anticuerpo. En consecuencia, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región Fe de acuerdo con la presente invención puede comprender un anticuerpo con K447, con eliminación de todo K447, o una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.

La "afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de fijación de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su contraparte de fijación (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique otra cosa, tal como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 :1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su contrapartida Y en general se puede representar por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluso los descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad en general se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse con facilidad, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se unen al antígeno más rápidamente y tienden a mantenerse unidos por más tiempo. Diversos métodos para medir la afinidad de unión se conocen en la técnica, cualquiera de los cuales se puede usar a los fines de la presente invención. Las formas de realización ilustrativas y ejemplificativas específicas para medir la afinidad de unión se describen a continuación.

En una forma de realización, "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con la presente invención se mide mediante un ensayo de fijación de antígeno con marca radiactiva (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión de Fabs en solución por el antígeno se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno con marca (125l) en presencia de una serie de titulaciones de antígeno sin marca, y luego captar el antígeno fijado con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo,s Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, MICROTITER® se recubren placas de cavidades múltiples (Thermo Scíentific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo que captura anti-Fab (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9,6), y luego se bloquea con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de [125l]-antígeno con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, que concuerde con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés luego se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más prolongado (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) a fin de asegurar que se alcance el equilibrio. Luego las mezclas son transferidas a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego se retira la solución removed y la placa se lava ocho veces con 0,1 % de TWEEN-20™ en PBS. Cuando se secan las placas, se agrega 150 µ?/cavidad de centellante (MICROSCINT-20™; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual de 20% de fijación máxima se eligen para el uso en ensayos de fijación competitivos.

De acuerdo con otra forma de realización, el valor de Kd o Kd se mide mediante el uso de ensayos de resonancia de plasmón de superficie mediante el uso de BIACORE®-2000 o BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) son activados con clorhidrato de /V-etora-A/'- (3-dimetoraaminoprofora)-carbodiimida (EDC) y A/-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4,8, hasta 5 g/ml (-0,2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Luego de la inyección de antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos que no reaccionaron. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas al medio de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de agente tensioactivo TWEEN-20™ (PBST) a 25 °C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kon) y de disociación (k0ff) se calculan mediante el uso de un modelo de fijación simple uno a uno de Langmuir (BIACORE ® Evaluation Software versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación (Kd) de equilibrio se calcula como la relación k0ff/kon Ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad positiva supera 10^ M_1 s-1 por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces se puede determinar la velocidad positiva mediante el uso de una técnica de atemperado fluorescente que mide el incremento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de pasaje de banda) a 25 °C de 20 nM de un anticuerpo anti-antígeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas mediante un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro serie 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) con cubeta agitada.

También se puede determinar una "velocidad positiva", "velocidad de asociación", "tasa de asociación" o "kon" de acuerdo con la presente invención tal como se describió con anterioridad mediante el uso de un sistema BIACORE ®-2000 o BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).

El término "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual" tal como se usa en la presente, denota un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador), de manera tal que el experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores es de escasa o nula significancia biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, los valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, inferior a aproximadamente 50%, inferior a aproximadamente 40%, inferior a aproximadamente 30%, inferior a aproximadamente 20%, y/o inferior a aproximadamente 10% en función de un valor de referencia/comparador.

La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente" tal como se usa en la presente, denota un grado suficientemente elevado de diferencia entre dos valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparadora) de manera tal que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, los valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, superior a aproximadamente 10%, superior a aproximadamente 20%, superior a aproximadamente 30%, superior a aproximadamente 40%, y/o superior a aproximadamente 50% en función del valor para la molécula de referencia/comparadora.

Un "marco aceptor humano" o un "marco, humano aceptor" a los fines de la presente es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco VL o VH derivado de un marco de ¡nmunoglobulina humana o un marco de consenso humano. Un marco aceptor humano "derivado de" un marco de ¡nmunoglobulina humana o un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos correspondiente, o puede contener cambios preexistentes de la secuencia de aminoácidos. En algunas formas de realización, la cantidad de cambios preexistentes de aminoácidos son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. Cuando están presentes cambios preexistentes de aminoácido en un VH, con preferencia dichos cambios ocurren en sólo tres, dos, o una de las posiciones 71 H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácidos en dichas posiciones pueden ser 71 A, 73T y/o 78A. En una forma de realización, el marco aceptor humano VL es idéntico en secuencia a la secuencia marco de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia marco de consenso humana.

Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los residuos de aminoácido que aparecen más comúnmente en una selección de secuencias marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias marco de VL o VH de inmunoglobulina humana proviene de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo según Kabat et al., supra. En una forma de realización, para el VL, el subgrupo es subgrupo kappa I según Kabat et al., supra. En una forma de realización, para el VH, el subgrupo es subgrupo III según Kabat et al., supra.

Un "marco de consenso de VH subgrupo III" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III pesado variable de Kabat et al., supra. En una forma de realización, un marco aceptor humano se deriva del marco de consenso de VH subgrupo III y comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una porción o o la totalidad de cada una de las siguientes secuencias: (SEQ ID NO:50)-H1-(SEQ ID NO:51 )-H2-(SEQ ID NO:57 o 59)-H3-(SEQ ID NO: 35). En algunas formas de realización, el último residuo (S11 ) de SEQ ID NO:35 es sustituido por una alanina.

Un "marco de consenso de VL subgrupo I" comprende la secuencia de consenso obtenida a partir de las secuencias de aminoácidos en subgrupo I variable liviano kappa de Kabat et al., supra. En una forma de realización, las secuencias de aminoácidos del marco de consenso de VH subgrupo I comprenden al menos una porción o la totalidad de cada una de las siguientes secuencias: (SEQ ID NO:60)-L1-(SEQ ID NO:61 )-L2-(SEQ ID NO:62)-L3-(SEQ ID NO:63).

"Purificado" significa que una molécula está presente en una muestra en una concentración de al menos 95% en peso, o al menos 98% en peso de la muéstra en la cual está contenida.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que está separada de al menos otra molécula de ácido nucleico con la cual se asocia normalmente, por ejemplo, en su ambiente natural. Una molécula de ácido nucleico aislada también incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que comúnmente expresan la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

El término "vector," tal como se usa en la presente, tiene por finalidad referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual está ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un ADN bicatenario circular en el cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en las células huésped en las cuales son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped luego de la introducción en la célula huésped, y luego son replicados junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están ligados operativamente. Dichos vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión recombinante" o simplemente, "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar indistintamente, dado que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector.

"Polinucleótido" o "ácido nucleico" tal como se usan indistintamente en la presente, se refieren a los polímeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleotidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado en un polímero por la ADN o ARN polimerasa o por una reacción de síntesis. Un polinucleótido puede comprender nucleotidos modificados tales como nucleotidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación de una estructura de nucleótido puede ser impartida antes o después del ensamblado del polímero. La secuencia de nucleotidos puede estar interrumpida por componentes distintos de nucleotidos. Un polinucleótido puede comprender modificación(es) efectuadas después de la síntesis, tales como conjugación con un rótulo. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "casquetes", la sustitución de uno o más de los nucleotidos naturales por un análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, los que tienen enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquiladores, los con enlaces modificados (por ejemplo, ácido nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como las , formas no modificadas de los polinucleotidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo comúnmente presentes en los azúcares puede ser reemplazado, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar con soporte sólidos o semisólidos. Los OH 5' y 3' terminales se pueden fosforilar o sustituir con aminas o restos de grupos de cubierta orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivar a grupos protectores estándar. Los polinucleotidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que son conocidas en general en la técnica, incluso, por ejemplo, 2 -O-metil-, 2'— O— alil— , 2 -fluoro-o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos, y análogos básicos de nucleosidos tales como metilribósidos. Una o más enlaces fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, sin limitaciones, formas de realización en donde el fosfato es reemplazado por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR\ CO, o CH2 ("formacetal"), en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que opcionalmente contiene un enlace éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces de un polinucleótido deben ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos referidos en la presente, incluso ARN y ADN.

"Oligonucleótido", tal como se usa en la presente, en general se refiere un polinucleótido corto, en general monocatenario, en general sintético que en general, pero no necesariamente, es inferior a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior de polinucleótidos es igualmente y totalmente aplicable a los oligonucleótidos.

El término "Noten", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier Notch nativo (Notch1-4) proveniente de cualquier fuente de vertebrados, incluso mamíferos tales como primates (por ejemplo humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique otra cosa. El término abarca Notch "de longitud total" no procesado así como cualquier forma de Notch que sea el resultado del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes naturales de Notch, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas.

El término "Notchl", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier Notchl nativo proveniente de cualquier fuente de vertebrados, incluso mamíferos tales como primates (por ejemplo humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique otra cosa. El término abarca Notchl "de longitud total" no procesado así como cualquier forma de Notchl que sea el resultado del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes naturales de Notchl , por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas.

El término "Notch2", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquiera Notch2 nativo proveniente de cualquier fuente de vertebrados, incluso mamíferos tales como primates (por ejemplo humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique otra cosa. El término abarca Notch2 "de longitud total" no procesado así como cualquier forma de Notch2 que sea el resultado del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes naturales de Notch2, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas.

El término "actividad de Notch2" se refiere a las señales de Notch2. Un agente (por ejemplo, un anticuerpo) que "inhibe la actividad de Notch2" disminuye significativamente las señales de Notch2 respecto del nivel de señales de Notch2 observadas en un control apropiada en condiciones sustancialmente idénticas. En ciertas formas de realización, se puede evaluar la actividad de Notch2 mediante un ensayo informador adecuado, tal como se describe en la presente en el Ejemplo B(2). En ciertas formas de realización, se puede evaluar la actividad de Notch2 actividad mediante la medición de la generación de células de la zona marginal B, tal como se describe en la presente en el Ejemplo B(4). En ciertas formas de realización, el descenso de la señal de Notch2 es al menos 2, 3, 4, 5, o 10 veces inferior al nivel observado en el control.

El término "Notch2 NRR" se refiere a una región de Notch2 que consiste de los tres módulos LNR (LNR-A, LNR-B, y LNR-C) y el dominio HD (HD-N y HD-C). Loe ejemplos de secuencias Notch2 NRR humanas y murinas se muestran en la Figura 18 (SEQ ID NOs:28 y 29, respectivamente). El Notch2 NRR puede consistir de fragmentos ligados no covalentemente, por ejemplo, que son el resultado del procesamiento de Notch2 en S1 , así como una única secuencia contigua de polipéptido. A modo de ejemplo y con referencia a la Figura 18, Notch2 NRR humano puede consistir de los aminoácidos 1422-1677 de Notch2 humano (SEQ ID NO:75), o alternativamente, los aminoácidos 1422-1608 de SEQ ID NO:75 ligados no covalentemente a los aminoácidos 1609-1677 de SEQ ID NO:75.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir brechas, de ser necesario, a fin de obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento a los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que son conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de software de computación disponible para el público tales como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (ADNSTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los . parámetros apropiados para alinear secuencias, incluso cualquier algoritmo necesario para obtener el máximo alineamiento para la longitud total de las secuencias que se comparan. A los fines de la presente, sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos son generados mediante el uso del programa de computación para comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computación para comparación de secuencias ALIGN-2 fue autorizado por Genentech, Inc., y el código de fuente se presentó con documentación de usuario en la Oficina de Copyright de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde está registrado con el Registro de Copyright de los Estaedos Unidos N.° TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público de Genentech, Inc., San Francisco Sur, California, o puede ser compilado mediante el código fuente. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, con preferencia UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones en las cuales se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (las cuales se pueden alternativamente parafrasear como secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos calificados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de A y B del programa, y en donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácido de B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto de B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto de A. A menos que se establezca específicamente otra cosa, la totalidad de los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en la presente se obtienen tal como se describe en el párrafo inmediatamente precedente mediante el uso del programa de computación ALIGN-2.

Un "trastorno" es cualquier condición patológica o enfermedad que se beneficiaría del tratamiento con una composición o un método de la invención.

Esto incluye trastornos crónicos y agudos que incluyen las condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos por tratar en la presente incluyen condiciones tales como cáncer.

"Enfermedades malignas de células B", también denominadas "neoplasias de células B" incluyen sin limitaciones enfermedad de Hodgkin (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin con predominio de linfocitos (LPHD)); linfoma no Hodgkin (NHL); linfomas de células de centro folicular (FCC); leucemia linfocítica aguda (ALL, también denominada B-ALL); leucemia linfoblástica de células precursoras B; leucemia linfocítica crónica (CLL, también denominada B-CLL); leucemia de células pilosas; linfomas de células B de zona marginal (incluso los tipos nodal, MALT, y esplénicos); mieloma múltiple (plasmocitoma, mieloma de células plasmáticas); linfomas de células pequeñas no escindidas (por ejemplo, linfoma de Burkitt); linfomas de células grandes (incluso de células grandes difusas (células B), células mixtas difusas, y linfoma inmunoblástico); linfoma de células del manto; linfoma de linfocitos pequeños; linfoma relacionado con sida y macroglobulinemia de Waldenstrom. El linfoma indolente es una enfermedad incurable de desarrollo lento en el cual el promedio de los pacientes sobrevive entre seis y 10 años después de numerosos periodos de remisiones y recidivas; los linfomas agresivos son formas de linfoma de crecimiento rápido que abarcan NHL de grado elevado y algunas categorías de grado intermedio.

El término "melanoma" se refiere a un tumor maligno de melanocitos, los cuales se encuentran principalmente en la piel pero también se encuentran en el ojo (melanoma uveal) o en los intestinos.

Tal como se usa en la presente, "tratamiento" (y sus variaciones tales como "tratar" o "tratado") se refiere a una intervención clínica para intentar alterar el curso natural del individuo o la célula tratada, y se puede realizar por prevención o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparición o la recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquiera consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir metástasis, disminuir la velocidad del progreso de la enfermedad, aliviar y paliar el estado de enfermedad, y la remisión o el mejoramiento del pronóstico. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno o para frenar la progresión de una enfermedad o trastorno.

Un "individuo" "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En ciertas formas de realización, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, sin limitaciones, animales de granja (tales como vacas), animales de deporte, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En ciertas formas de realización, un mamífero es un humano.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite la efectiva la actividad biológica del ingrediente activo, y la cual no contiene componentes adicionales de toxicidad inaceptable para un sujeto al cual se administre la formulación. Dichas formulaciones pueden ser estériles.

Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todo microorganismo vivo y sus esporas.

Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva con la dosis y por los periodos necesarios para lograr el resultado terapéutico o preventivo deseado.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia /molécula de la invención puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la sustancia /molécula para generar la respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva abarca una cantidad para la cual cualquier efecto tóxico o en detrimento de la sustancia /molécula es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva con la dosis y por los periodos necesarios para lograr el resultado terapéutico o preventivo deseado. Generalmente, pero no necesariamente, dado que una dosis preventiva se usa en los sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva puede ser inferior a la cantidad terapéuticamente efectiva.

El término "agente citotóxico" tal como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o causa la muerte o la destrucción celular. El término pretende incluir los isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi2 2, P32, Pb212 y los isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y sus fragmentos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluso sus fragmentos y/o variantes, y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos descritos a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células tumorales.

Una "toxina" es cualquier sustancia capaz de tener un efecto en detrimento del crecimiento o la proliferación de una célula.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilmelamina; acetogeninás (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colcicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluso el análogo sintético topotecano (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC— 1065 (incluso sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluso sus análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1 ); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiína; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediína (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammal I y caliqueamicina omegaM (ver, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor oral de alfa-4 integrina; dinemicina, incluso dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y antibióticos de cromoproteínas relacionadas de enediína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-d¡azo-5-oxo-L-norleuc¡na, doxorrubicina (incluso ADRIAMICINA®, morfolinodoxorrublclna, clanomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, doxorrubicina HCI en inyección de liposoma (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®), y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, rstreptonigrina, rstreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubician; antimetabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona, y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas obtenidas por ingeniería de albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™), y docetaxel (TAXOTERE®); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®), y carboplatino; vincas, que impiden la polimerización de la tubulina para formar microtúbulos, incluso vinblastina (VELBAN®), vincristinea (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®), y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico, incluso bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico /zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo ,3-dioxolano de nucleósido de citosina); oligonucleótidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresión de genes en las vías de señales implicadas en la proliferación celular aberrant, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor de de factor crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunidadinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo celecoxíb o etoricoxib), inhibidor de proteosoma (por ejemplo PS341 ); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidores de Bcl-2 tales como oblimersen sodio (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR (Ver definición más adelante); inhibidores de tirosinacinasa (Ver definición más adelante); inhibidores de serinatreoninacinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y las sales, los ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como las combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviación de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviación de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.

Los agentes quimioterapéuticos tal como se definen en la presente incluyen "agentes antihormonales" o "terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer. Pueden ser hormonas por sí mismas, incluso, sin limitaciones: antiestrógenos con perfil mixto agonista/antagonista, incluso tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, keoxifeno y moduladores selectivos de receptor de estrógeno (SERMs) tales como SERM3; antiestrógenos puros sin propiedades agonistas, tales como fulvestrant (FASLODEX®), y EM800 (dichos agentes pueden bloquear la dimerización del receptor de estrógeno (ER), inhibir la fijación a ADN, incrementar el recambio de ER, y/o suprimir los niveles de ER); inhibidores de aromatasa, incluso inhibidores esteroides de aromatasa tales como formestano y exemestano (AROMASIN®), y inhibidores no esteroides de aromatasa tales como anastrazol (ARIMIDAX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyen vorozol (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®), fadrozol y 4(5)-imidazoles; agonistas de hormola liberadora de hormona lutenizante, incluso leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®), goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides sexuales, incluso progestágenos tales como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrogenos tales como dietorastilbestrol y premarina, y androgenos /retinoides tales como fluoximesterona, ácido todo transretinoico y fenretinida; onapristona; antiprogesteronas; reguladores hacia debajo de receptor de estrógeno (ERD); antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y las sales, los ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como las combinaciones de dos o más de los anteriores.

Una "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (tal como una célula que expresa Notch) ya sea in vitro o ¡n vivo. En consecuencia, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células (tal como una célula que expresa Notch) en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en un sitio distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención en G1 y la detención en la fase M. Los bloqueadores de fase clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido, y bleomicina. Los agentes que detienen G1 también pasan a la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Más información se puede hallar en Mendelsohn y Israel, eds., The Molecular Basis of Cáncer, Capítulo 1 , intitulado "Cell cicle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer derivados ambos del árbol de tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblado de los microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al impedir la despolimerización, lo cual da por resultado la inhibición de la mitosis en las células.

III. COMPOSICIONES Y MÉTODOS La invención se basa en parte en la identificación de los agentes fijadores de Notch, por ejemplo, anticuerpos y sus fragmentos. En formas de realización específicas, la invención se refiere a agentes fijadores de la región reguladora negativa de Notch2 (NRR), tales como anticuerpos aislados que fijan Notch2 NRR y sus fragmentos. Dichos anticuerpos son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o el tratamiento de trastornos asociados con la expresión y/o la actividad de Notch2 (por ejemplo, aumento de la expresión o la actividad). En formas de realización específicas, los anticuerpos anti-Notch2 NRR son útiles para el diagnóstico o el tratamiento de cáncer, por ejemplo, enfermedades malignas de células B y melanoma. En consecuencia, la invención provee métodos, composiciones, kits, y artículos de fabricación relacionados con la fijación de Notch2 NRR.

A. Anticuerpos anti-Notch2 NRR 1. Ejemplos de anticuerpos derivados de bibliotecas de fagos Los ejemplos de anticuerpos monoclonales derivados de una biblioteca de fagos se proveen en la presente, tal como se describe en el Ejemplo B. Se aisló un anticuerpo designado "Anticuerpo D" que se fija a Notch2 NRR. Dicho anticuerpo se maduró por afinidad a fin de generar anticuerpos designados Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2, y Anticuerpo D-3. Las secuencias de las regiones hipervariables de cadena pesada y cadena liviana (HVR) del Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2, y Anticuerpo D-3 se muestran en las Figuras 1 y 2. Las secuencias de los dominios variables de las cadenas pesadas y de las cadenas livianas de Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2, y Anticuerpo D-3 se muestran en las Figuras 3 y 4. Otras formas de realización de anticuerpos anti-Notch2 NRR se proveen como sigue.

En un aspecto, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionados de: (a) un HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:3; (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (d) un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:10; (e) un HVR-L2 que comprende una secuencia, de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:14; y (f) un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:19.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5 y al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco HVR seleccionados de (a), (b), (d), (e), y (f) anteriores. En otro aspecto, el anticuerpo comprende (a), (b), (c), (d), (e), y (f) anteriores, con respecto a (a), (d), (e), y (f), cualquiera de una o más de las siguientes formas de realización están contempladas: HVR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:1-2; HVR-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:6-9; HVR-L2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:11-13; y HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:15-18.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende un HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:3, un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5. En una forma de realización, HVR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:1-2.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO: 10, un HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:14, y un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:19. Las siguientes formas de realización están contempladas en cualquier combinación: HVR-L1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:6-9; HVR-L2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:11-13; y HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:15-18. En una forma de realización, un anticuerpo que se fija a Notch2 NRR comprende un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 ; y un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15. En otra forma de realización, un anticuerpo que se fija a Notch2 NRR comprende un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 ; y un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En otra forma de realización, un anticuerpo que se fija a Notch2 NRR comprende un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; y un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17. En otra forma de realización, un anticuerpo que se fija a Notch2 NRR comprende un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; y un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18.

En una forma de realización, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende: (a) un HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 ; (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (d) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; (e) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 ; y (f) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15.

En otra forma de realización, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende: (a) un HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (d) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; (e) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 ; y (f) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

En otra forma de realización, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende: (a) un HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (d) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; (e) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; y (f) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17.

En otra forma de realización, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende: (a) un HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (d) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; (e) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y (f) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18.

En ciertas formas de realización, cualquiera de los anticuerpos anteriores también comprende al menos un marco seleccionado de un marco de consenso VH subgrupo III y un marco de consenso VL subgrupo I.

En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-Notch2 NRR se madura por afinidad. Por ejemplo, se puede hacer cualquiera de una o más de las siguientes sustituciones en las posiciones HVR indicadas (numeración de Kabat) made en cualquier combinación: - en HVR-H1 (SEQ ID NO:1 ): S28T; T30S; - en HVR-L1 (SEQ ID NO:6): S28N; I29N o V; S30R o K; S31 R; Y32F - en HVR-L2 (SEQ ID NO:11 ): G50R; S53I o T; A55E - en HVR-L3 (SEQ ID NO: 15): S93I o R; L96W o H Los anticuerpos específicos descritos en la presente, es decir, Anticuerpo D así como las formas maduradas por afinidad de Anticuerpo D (D-1 , D-2, y D-3), pueden ser sometidos a ulterior maduración por afinidad. En consecuencia, se proveen las formas maduradas por afinidad de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente.

En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-Notch2 NRR que tiene cualquiera de las anteriores secuencias HVR también puede comprender cualquiera secuencia marco de dominio variable adecuada, siempre que se mantenga sustancialmente la actividad respecto de Notch2 NRR. En ciertas formas de realización, un anticuerpo antnNotch2 NRR comprende una secuencia marco de consenso variable pesada (VH) humana, como en cualquiera de las secuencias marco de consenso VH mostradas en las Figuras 5A y 5B. En una forma de realización, la secuencia marco de consenso VH comprende una secuencia marco de consenso humana de cadena pesada de subgrupo III, por ejemplo, tal como se muestra en las Figuras 5A y 5B. En otra forma de realización, la secuencia marco de consenso VH comprende una secuencia marco "aceptor 2", por ejemplo, tal como se muestra en las Figuras 5A y 5B. En una particular forma de realización, la secuencia marco de consenso VH comprende FR1-FR4 de aceptor 2B o aceptor 2D, en donde FR4 comprende SEQ ID NO:35 (Figuras 5A y 5B), con el último residuo de SEQ ID NO:35 (S11 ) opcionalmente sustituido por alanina. En otra particular forma de realización, la secuencia marco de consenso VH comprende las secuencias de SEQ ID NOs:50; 51 ; 57 o 59; y 35, en donde S11 de SEQ ID NO:35 está opcionalmente sustituido por alanina.

En ciertas formas de realización, un anticuerpo que tiene anti-Notch2 NRR cualquiera de las secuencias HVR anteriores también puede comprender una secuencia marco de consenso variable liviana (VL) humana tal como se muestra en las Figuras 6A y 6B. En una forma de realización, la secuencia marco de consenso VL comprende una secuencia marco de consenso humana VL kappa subgrupo I (??1 ), por ejemplo, tal como se muestra en las Figuras 6A y 6B. En otra forma de realización, la secuencia marco de consenso VL comprende FR1-FR4 de hu Ab4D5-8 tal como se muestra en las Figuras 7 o 8. En una particular forma de realización, la secuencia marco de consenso VL comprende las secuencias de SEQ ID NOs:60, 61 , 62, y 63.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-Notch2 NRR comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:20-21. En ciertas formas de realización, una secuencia VH que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones, o eliminaciones respecto de la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti- Notch2 NRR que comprende dicha secuencia retiene la capacidad para fijarse a Notch2 NRR. En ciertas formas de realización, un total de 1 a 10 aminoácidos han sido sustituidos, insertados y/o eliminados en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:20-21. En ciertas formas de realización, se hacen sustituciones, inserciones, o eliminaciones en regiones fuera de los HVR (es decir, en FR). En una particular forma de realización, el VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de: (a) un HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:3, (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5. En una de estas formas de realización, HVR-H1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:1-2.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena liviana (VL) que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:22-25. En ciertas formas de realización, una secuencia VL que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones, o eliminaciones respecto de la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-Notch2 NRR que comprende dicha secuencia retiene la capacidad para fijarse a Notch2 NRR. En ciertas formas de realización, un total de 1 a 10 aminoácidos han sido sustituidos, insertados y/o eliminados en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:22-25. En ciertas formas de realización, las sustituciones, inserciones, o eliminaciones ocurren en regiones fuera de HVR (es decir, en FR). En una particular forma de realización, el VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de (a) un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:10; (b) un HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:14; y (c) un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:19. En una de estas formas de realización, el VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de (a) un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:6-9; (b) un HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:11-13; y (c) un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:15-18. En una de estas formas de realización, el VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de (a) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; (b) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 ; y (c) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15. En otra de estas formas de realización, el VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de (a) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; (b) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 ; y (c) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En otra de estas formas de realización, el VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de (a) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; (b) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12; y (c) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. En otra de estas formas de realización, el VL comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de (a) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9; (b) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID ??. 3; y (c) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18.

En ciertas formas de realización de las secuencias variantes VH y VL provistas con anterioridad pueden ocurrir sustituciones, inserciones, o eliminaciones dentro de HVR. En dichas formas de realización, pueden ocurrir sustituciones, inserciones, o eliminaciones dentro de uno o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente reduce la capacidad del anticuerpo para fijar el antígeno. Por ejemplo, se pueden hacer alteraciones conservadoras en HVR que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión. En ciertos casos, las alteraciones en HVR en realidad pueden mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden hacer en los "puntos calientes" de HVR (es decir, residuos codificados por codones que sufren mutación con gran frecuencia durante el proceso de maduración somática) a fin de incrementar la afinidad del anticuerpo. (Ver, por ejemplo, Chowdhury, Methids Mol. Biol. 207:179-196, 2008.) En ciertas formas de realización de las secuencias variantes VH y VL provistas con anterioridad, cada HVR está conservado (no alterado), o contiene no más de una única sustitución, inserción o eliminación de aminoácido.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las formas de realización provistas con anterioridad, y un VL como en cualquiera de las formas de realización provistas con anterioridad. En una forma de realización, el anticuerpo comprende un VH que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, y un VL que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22. En una de estas formas de realización, el VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de: (a) un HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 , (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y el VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de (a) un HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; (b) un HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 ; y (c) un HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15. En una particular forma de realización, el anticuerpo comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

En otra forma de realización, un anticuerpo anti-Notch2 NRR que se fija específicamente a Notch2 NRR comprende un VH que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 , y un VL que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:23-25. En una de estas formas de realización, el VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de: (a) un HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, y (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y el VH comprende uno, dos o tres HVR seleccionados de (a) un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:7-9; (b) un HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:11-13; y (c) un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:16-18. En particulares formas de realización, el anticuerpo comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:23-25.

En ciertas formas de realización, se provee una forma madurada por afinidad de cualquiera de los anticuerpos anteriores. En otras formas de realización, sed provee una proteína recombinante que se fija específicamente a Notch2 NRR, en donde la proteína recombinante comprende un sitio de fijación del antígeno de cualquiera de los anticuerpos anteriores. En una de estas formas de realización, una proteína recombinante comprende cualquiera de uno o más de los HVR provistos con anterioridad.

En ciertas formas de realización, se provee un polinucleótido codificador de cualquiera de los anticuerpos anteriores. En una forma de realización, se provee un vector que comprende el polinucleótido. En una forma de realización, se provee una célula huésped que comprende el vector. En una forma de realización, la célula huésped es eucarionte. En una forma de realización, la célula huésped es una célula CHO. En una forma de realización, se provee un método para preparar un anticuerpo anti-Notch2 NRR, en donde el método comprende cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido codificador del anticuerpo, y aislar el anticuerpo. 2. Otros ejemplos de anticuerpos En una forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-Notch2 NRR aislado que inhibe la actividad de Notch2. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden modular uno o más aspectos de las señales Notch2, incluso la disrupción de cualquier vía de señales Notch2 biológicamente relevante.

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-Notch2 NRR aislado que se fija a Notch2 NRR con una Kd de < 100 nM. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-Notch2 NRR se fija a Notch2 NRR con una Kd de < 10 nM, < 1 nM, o < 0,1 nM. Tal como se describe en los Ejemplos en la presente, el ejemplo de fago Anticuerpo D-3 se fija con una Kd de 5 nM. Tal como está bien establecido en la técnica, la afinidad de unión de un ligando respecto de su receptor puede ser determinada mediante el uso de cualquiera de diversos ensayos, y expresada en término de diversos valores cuantitativos. En consecuencia, en una forma de realización, la afinidad de unión se expresa como valores de Kd y refleja la afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados). En general y con preferencia, la afinidad de unión se mide in vitro, ya sea en condiciones sin células o asociadas a células. Cualquiera de numerosos a ensayos conocidos en la técnica, incluso los descritos en la presente, se pueden usar para obtener mediciones de la afinidad de unión, incluso, por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA), y ELISA.

En otra forma de realización, se provee un anticuerpo aislado que se fija a Notch2 NRR, en donde el anticuerpo no se fija significativamente a un miembro de la familia Notch distinto de Notch2 (es decir, Notch , 3, y 4 en mamíferos). Dicho anticuerpo puede ser identificado mediante el uso de los ensayos provistos en el Ejemplo B(1 ). En una forma de realización, el anticuerpo se fija a Notch2 NRR humano y a Notch2 NRR de al menos una otra especie no humana, por ejemplo, ratón.

En otra forma de realización, es provee un anticuerpo aislado que se fija al mismo epitopo que un anticuerpo provisto en la presente. En una forma de realización, se provee un anticuerpo anti-Notch2 NRR aislado que se fija al mismo epitopo que un anticuerpo seleccionado de Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2, y Anticuerpo D-3. En otra forma de realización, la invención ' provee un anticuerpo anti-Notch2 NRR que compite con un anticuerpo seleccionado de Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2, y Anticuerpo D-3. En otra forma de realización, se provee un anticuerpo aislado que se fija a al menos un dominio seleccionado del dominio LNR-A y el dominio HD-C de Notch2. En una de estas formas de realización, el anticuerpo se fija tanto al dominio LNR-A como al dominio HD-C. En otra de estas formas de realización, el anticuerpo también se fija a los dominios LNR-B y/o HD-N. Estos dominios se delinean en la Figura 18.

Las anteriores formas de realización de anticuerpos anti-Notch2 NRR se pueden presentar separados o en cualquier combinación. Además, cualquiera anticuerpo anti-Notch2 NRR descrito en la presente puede poseer cualquiera de una o más de las siguientes propiedades: en ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-Notch2 NRR es un anticuerpo monoclonal. En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-Notch2 NRR es un fragmento de anticuerpo seleccionado de un fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, o (Fab')2. En otra forma de realización, un anticuerpo anti-Notch2 NRR es un anticuerpo humanizado, humano o quimérico. 3. Fragmentos de anticuerpos La presente invención abarca fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser generados por medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o por técnicas recombinantes. En ciertas circunstancias hay ciertas ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, en lugar de los anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite una depuración rápida, y puede conducir a mejor acceso a los tumores sólidos. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, ver Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-1 17 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar todos y secretar a partir de E. coli, lo cual permite la sencilla producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpo analizados con anterioridad. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplas químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro abordaje, se pueden aislar los fragmentos F(ab')2 directamente de cultivos de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')2 con aumento de la vida media ¡n vivo que comprenden residuos de epitopo fijadores de receptor de salvataje se describen en la patente de los Estados Unidos N.° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán aparentes para el operador experto. En ciertas formas de realización, un anticuerpo es un fragmento de cadena única Fv (scFv). Ver el documento WO 93/16185; las patentes de los Estados Unidos N.° 5.571 .894; y 5.587.458. Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; en consecuencia, pueden ser adecuadas para la fijación reducida no específica durante el uso in vivo. Se pueden construir proteínas de fusión scFv para obtener la fusión de una proteína efectora en el terminal amino o carboxi de un scFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. 4. Anticuerpos humanizados La invención abarca anticuerpos humanizados. Se conocen varios métodos en la técnica para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácido introducidos provenientes de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos a menudo son referidos como residuos "importados", los cuales generalmente son tomados de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente según el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321 :522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), al sustituir las secuencias de la región hipervariable por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia proveniente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto livianos como pesados, usados en la fabricación de los anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado "más capaz", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza respecto de toda la biblioteca de las secuencias de dominios variables humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor luego es aceptada como el marco humano para el anticuerpo humanizado. Ver, por ejemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 :2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro método usa un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas livianas o pesadas. Se puede usar el mismo marco para diversos anticuerpos humanizados diferentes. Ver, por ejemplo, Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151 :2623.

En general también es deseable que los anticuerpos se humanicen con retención de gran afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. A fin de lograr este objetivo, de acuerdo con un método, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y diversos productos conceptuales humanizados que usan modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica. Se dispone de programas de computación que ilustran y presentan probables estructuras de conformación tridimensional de las secuencias candidatas seleccionadas de ¡nmunoglobulinas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, es decir, el análisis de los residuos que influyen sobre la capacidad de la ¡nmunoglobulina candidata a fijar su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar residuos FR y combinarlos con las secuencias del receptor e importadas de manera tal que se obtienen las características de anticuerpo deseadas, tales como mayor afinidad por el antígeno objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable están involucrados directamente y más sustancialmente en la influencia sobre la fijación del antígeno. 5. Anticuerpos humanos Los anticuerpos humanos de la invención se pueden construir por combinación de las secuencias de dominio variable del clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación de fagos derivados de humanos con secuencias de dominio constante humanas conocidas tal como se describió con anterioridad. Alternativamente, se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos de la invención por el método del hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos, por ejemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991 ).

Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que tienen capacidad, luego de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos human en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigoto del gen de la región adjunta (JH) de la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da por resultado la completa inhibición de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la disposición del gen de ¡nmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal da por resultado la producción de anticuerpos humanos luego de la exposición al antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits eí al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al. , Year en Immunol., 7: 33 (1993).

También se puede usar el arrastre génico para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos no humanos, por ejemplo de roedores, cuando el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de inicio. De acuerdo con este método, que también se denomina "imprimación de epitopo", la región variable de la cadena pesada o la cadena liviana de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido mediante técnicas de presentación de fago tal como se describe en la presente es reemplazada por un repertorio de genes de dominio V humano, por lo cual se crea una población de quimeras scFv o Fab de cadena no humana/cadena humana. La selección con antígeno da por resultado el aislamiento de un scFv o Fab quimérico de cadena no humana/cadena humana en donde la cadena humana restablece el sitio de fijación del antígeno destruido luego de la remoción de la correspondiente cadena no humana en el clon de presentación del fago primario, es decir el epitopo gobierna (imprime) la elección de la contrapartida de la cadena humana. Cuando se repite el proceso a fin de reemplazar el resto de la cadena no humana, se obtiene un anticuerpo humano (Ver PCT WO 93/06213 publicado el 1o de abril de1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos por injerto de CDR, esta técnica provee anticuerpos completamente humanos, los cuales no tienen residuos FR o CDR de origen no humano. 6. Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales que tiene especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En ciertas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanos o humanizados. En ciertas formas de realización, una de las especificidades de unión es para Notch2 y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden fijar a dos epitopos diferentes de Notch2. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos contra células que expresan Notch2. Estos anticuerpos poseen un brazo fijador de Notch2 y un brazo que se fija al agente citotóxico, tal como, por ejemplo, saporina, antünterferón-a, alcaloide de vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud total o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos contra F(ab')2).

Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas livianas y cadenas pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas diferentes de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, lo cual usualmente se realiza por etapas de cromatografía por afinidad, es bastante laboriosa, y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991 ).

De acuerdo con un abordaje diferente, se fusionan los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) a las secuencias de los dominios constantes dé la inmunoglobulina. La fusión, por ejemplo, tiene lugar con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, las regiones CH2 y CH3. En ciertas formas de realización, la primera región constante de la cadena pesada (CH1 ), que contiene el sitio necesario para la fijación de la cadena liviana, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN codificadores de la fusión de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena liviana de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y son cotransfectados a un organismo huésped adecuado. Esto provee gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en las formas de realización cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proveen los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras de dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da por resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen particular significancia.

En una forma de realización de este abordaje, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada híbrida de inmunoglobulina con una primera especificidad de unión en un brazo y un par híbrido de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina (que provee una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, dado que la presencia de una cadena liviana de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica provee una forma sencilla de separación. Este abordaje se describe en el documento WO 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh eí al., Methods in Enzymology, 121 :210 (1986).

De acuerdo con otro abordaje, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede someter a ingeniería a fin de maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz comprende al menos una parte del dominio CH3 del dominio constante de un anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la molécula del primer anticuerpo son reemplazadas por cadenas más grandes (por ejemplo tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadena(s) lateral(es) grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo por el reemplazo de grandes cadenas laterales de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina). Esto provee un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero respecto de otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos con enlaces cruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para células del sistema inmune objetivo respecto de células no deseadas (patente de los Estados Unidos N.° 4.676.980), y para el tratamiento de infección HIV (documentos WO 91/00360, WO 92/00373, y EP 03089). Se pueden fabricar anticuerpos heteroconjugados mediante el uso de cualquier método conveniente de entrecruzamiento. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la patente de los Estados Unidos N.° 4.676.980, junto con numerosas técnicas de entrecruzamiento.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también han sido descritas en la bibliografía. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos mediante el uso de uniones químicas. Brennan er al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos . son escindidos proteol ¡ticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente formador de complejos de ditiol arsenito de sodio, a fin de estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados luego son convertidos en derivados tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB luego es reconvertido en el Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico producido se puede usar como agente para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los progresos recientes han facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de E. coli, los cuales se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby er al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')2 totalmente humanizado. Cada fragmento Fab1 fue secretado por separado de E. coli y sometido a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuérpo biespecífico así formado era capaz de fijarse a células con sobreexpresion de receptor HER2 y las células T normales humanas, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos de tumor de mama humanos.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos mediante el uso de cierres de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos del cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha provisto un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) mediante un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento se ven forzados a aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, por lo que se forman dos sitios fijadores de antígeno. También se ha informado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros monocatenarios Fv (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Están contemplados los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991 ). 7. Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápidamente que un anticuerpo bivalente por una célula que exprese un antígeno al cual se fije el anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (los cuales son distintos de la clase IgM) con tres o más sitios fijadores de antígeno (por ejemplo anticuerpos tetravalentes), los cuales se pueden producir fácilmente por expresión recombinante de ácidos nucleicos codificadores de las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios fijadores de antígeno. En ciertas formas de realización, el dominio de dimerización comprende (o consiste de) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprende una región Fe y tres o más sitios fijadores de antígeno aminoterminales respecto de la región Fe. En ciertas formas de realización, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho sitios fijadores de antígeno. En una de estas formas de realización, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste de) cuatro sitios fijadores de antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (por ejemplo, dos cadenas de polipéptido), en donde la(s) cadena(s) de polipéptido comprende(n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido puede(n) comprender VD1-(X1 )n -VD2-(X2)n -Fe, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido puede(n) comprender: VH-CH1-ligador flexible -VH-CH1 -cadena de región Fe; o VH-CH1-VH-CH1 -cadena de región Fe. El anticuerpo multivalente en la presente también puede comprender al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena liviana. El anticuerpo multivalente en la presente puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena liviana. Los polipéptidos de dominio variable de cadena liviana contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena liviana y, opcionalmente, también comprenden un dominio CL. 8. Anticuerpos de dominio único En algunas formas de realización, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de dominio único. Un anticuerpo de dominio único es una única cadena de polipéptido que comprende la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena liviana de un anticuerpo. En ciertas formas de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 6.248.516 B1). En una forma de realización, un anticuerpo de dominio único consiste de la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo. 9. Variantes de anticuerpo En algunas formas de realización, se contemplan modificación(es) de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar mediante la introducción de cambios adecuados en la secuencia de nucleotidos codificadores del anticuerpo, o por síntesis de péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones, y/o inserciones y/o sustituciones, de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se puede hacer para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácido se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento en el cual se fabrica dicha secuencia.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" tal como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aquí se identifica un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y son reemplazados por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego son refinadas al introducir otras variantes en los sitios de sustitución. Así, si bien el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, a fin de analizar el comportamiento de una mutación en un sitio determinado, se realiza barrido ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región objetivo y las inmunoglobulinas expresadas son analizadas respecto de la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de terminales amino y/o carboxilo que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos únicos o múltiples de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo N-terminal metionilo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del N o C terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media sérica del anticuerpo.

En ciertas formas de realización, un anticuerpo de la invención se altera para incrementar o disminuir el grado de glucosilación del anticuerpo. La glucosilación de los polipéptidos generalmente está ligada a N o ligada a O. Ligado a N se refiere a la fijación de un resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquiera aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento de la fijación enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. En consecuencia, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un potencial sitio de glucosilación. La glucosilación ligada a O se refiere a la fijación de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición o la eliminación de sitios de glucosilación al anticuerpo se logra convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de manera tal que se crea o elimina una o más de las secuencias de tripéptido descritas con anterioridad (para los sitios de glucosilación ligados a N). La alteración también se puede realizar por la adición, deleción o sustitución de uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glucosilación ligados a O).

Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el hidrato de carbono adosado se puede alterar. Los anticuerpos nativos producidos por las células de mamífero generalmente comprenden un oligosácárido ramificado con dos antenas que en general está adosado a través de un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, Wright et al. (1997) TI B TECH 15:26-32. El oligosacárido puede incluir diversos hidratos de carbono, por ejemplo, mañosa, N-acetilglucosamina (GIcNAc), galactosa, y ácido siálico, así como una fucosa adosada a un GIcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido con dos antenas. En algunas formas de realización, se pueden hacer modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención a fin de crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

Por ejemplo, se proveen variantes de anticuerpo que tienen una estructura de hidrato de carbono que carece de mucosa adosada (en forma directa o indirecta) a una región Fe. Dichas variantes pueden tener función de ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, las publicaciones de patentes de los Estados Unidos N.° US 2003/0157108 (Presta, L); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes "defucosiladas" o "deficientes en fucosa" de anticuerpos incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621 ; US 2004/0132140; US 2004/01 10704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/0851 19; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen las células Lec13 CHO deficientes en fucosilación proteica (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente de los Estados Unidos N.° US 2003/0157108 A1 , Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1 , Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11 ), y las líneas de células knockout, tales como el gen de alfa-1 ,6-fucosiltransferasa, FUT8, células knockout CHO (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).

También se proveen variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en los cuales un oligosacárido con dos antenas adosado a la región Fe del anticuerpo está bisecado por GIcNAc. Dichas variantes de "anticuerpo pueden tener función reducida de fucosilación y/o función mejorada de ADCC. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 2003/01 1878 (Jean-Mairet er a/.); la patente de los Estados Unidos N.° 6.602.684 (Umana ef al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proveen variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido adosado a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener función CDC mejorada. Dichas variantes anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).

En ciertas formas de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácido que mejoran aún más ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración de residuos UE). Dichas sustituciones pueden aparecer en combinación con cualquiera de las variaciones descritas con anterioridad.

En ciertas formas de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo cual la transforma en una candidata deseable para muchas aplicaciones en las cuales 1a vida media del anticuerpo in vivo es importante, pero ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o dañinas. En ciertas formas de realización, las actividades de Fe del anticuerpo se miden para asegurar que sólo se mantienen las propiedades deseadas. Se pueden conducir ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/depleción de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden conducir ensayos de receptor Fe (FcR) a fin de asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero mantiene la capacidad de unión FcRn. Las principales células para mediar ADCC, las células NK, sólo expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991 ). Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 5.500.362 (ver, por ejemplo Hellstrom, I., et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (Ver Bruggemann, . et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radiactivos (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células Natural Killer (NK). Alternativamente, o además, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluar en vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de fijación de C1 q para, confirmar que el anticuerpo es incapaz de fijar C1q y en consecuencia carece de actividad CDC. A fin de evaluar la activación de complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol.

Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101 :1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden hacer determinaciones de fijación de FcRn y de depuración in vivo /vida media mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18( 2): 1759-1769 (2006)).

También se proveen otras variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Los cambios más sustanciales, denominados "ejemplos de sustituciones" se proveen en la Tabla 1 , o tal como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés y los productos se analizan, por ejemplo, respecto de una actividad deseada, tal como mejoramiento de la fijación a antígeno, disminución de la inmunogenicidad, mejoramiento de ADCC o CDC, etc.

TABLA 1 Residuo original Ejemplos de sustituciones Sustituciones preferidas Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Residuo original Ejemplos de sustituciones Sustituciones preferidas Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg lle (l) Leu; Val; Met; Ala; Leu Phe; Norleucina Leu (L) Norleucina; lie; Val; lie Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; lie Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Leu Ala; Norleucina Las modificaciones de las propiedades biológicas de un anticuerpo se pueden lograr al seleccionar sustituciones que afectan (a) la estructura del esqueleto de polipéptidos en el área de la sustitución, por ejemplo, como conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la masa de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las similitudes de las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)): (1 ) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polar sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) ácido: Asp (D), Glu (E) (4) básico: Lys (K), Arg (R), His(H) Alternativamente, los residuos que aparecen en la naturaleza se pueden dividir en grupos sobre la base de las propiedades comunes de la cadena lateral: (1 ) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que incluyen sobre la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras implican cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en los sitios de sustitución conservadora o en los sitios remanentes (no conservados).

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultantes seleccionadas para el posterior desarrollo tendrán propiedades biológicas modificadas (por ejemplo, mejoradas) respecto del anticuerpo original del cual son generadas. Un ejemplo de variante por sustitución es un anticuerpo maduro por afinidad, el cual puede ser generado convenientemente mediante el uso de técnicas de maduración por afinidad basadas en presentación de fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) a fin de generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos así generados se presentan a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con al menos parte de una proteína de cubierta de fago (por ejemplo, el producto de ten III de M13) envuelto dentro de cada partícula. Las variantes presentadas por el fago luego se analizan respecto de su actividad biológica (por ejemplo afinidad de unión). A fin de identificar los sitios candidatos de región hipervariable para la modificación, se puede efectuar mutagénesis de barrido (por ejemplo, barrido de alanina) a fin de identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a la fijación del antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica, incluso los elaborados en la presente. Una vez que se generan dichas variantes, se somete el panel de variantes a análisis mediante técnicas conocidas en la técnica, incluso las descritas en la presente, se pueden seleccionar las variantes con mejores propiedades en uno o más ensayos relevantes para su ulterior desarrollo.

Las moléculas de ácidos nucleicos codificadoras de las secuencias de aminoácidos de las variantes del anticuerpo se preparan por diversos métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, sin limitaciones, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de que aparezcan en la naturaleza secuencias de aminoácidos variantes) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida a sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis por cásete de una variante preparada con anterioridad o una versión no variante del anticuerpo.

Puede ser deseable introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fe de los anticuerpos de la invención, para así generar una variante de región Fe.. La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido que incluyen la de una cisteína de la bisagra.

De acuerdo con la presente descripción y las enseñanzas de la técnica, se contempla que en algunas formas de realización, un anticuerpo de la invención puede comprender una o más alteraciones, comparada con la contrapartida de anticuerpo de tipo silvestre, por ejemplo en la región Fe. Sin embargo, estos anticuerpos retendrían sustancialmente las mismas características requeridas para la utilidad terapéutica, comparados con sus contrapartidas de tipo silvestre. Por ejemplo, se cree que se pueden hacer ciertas alteraciones en la región Fe que darían por resultado una alteración (es decir, un mejoramiento o disminución) de la fijación de C1q y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 99/51642. Ver también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de los Estados Unidos N.° 5.648.260; la patente de los Estados Unidos N.° 5.624.821 ; y el documento W094/29351 referidos a otros ejemplos de vanantes de la región Fe. Losa documentos WO00/42072 (Presta) y WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpo con fijación mejorada o disminuida a FcR. El contenido de dichas publicaciones de patente se incorpora específicamente en la presente por referencia. Ver también Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001 ). Los anticuerpos con vidas medias aumentadas y fijación mejorada al receptor neonatal Fe (FcRn), el cual es responsable de la transferencia de las IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones que mejoran la fijación de la región Fe a FcRn. Las variantes de polipéptido con alteración de las secuencias de aminoácidos de la región Fe y aumento o disminución de la capacidad de fijación de C1q se describen en la patente de los Estados Unidos N.° 6.194.551 B1 , el documento W099/51642. Los contenidos de dichas publicaciones de patente se incorporan específicamente en la presente por referencia. Ver también, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

En otro aspecto, la invención provee anticuerpos que comprenden modificaciones de la interfaz de polipéptidos Fe que comprende la región Fe, en donde las modificaciones facilitan y/o promueven la heterodimerización. Estas modificaciones comprenden la introducción de una protuberancia en un primer polipéptido Fe y una cavidad en un segundo polipéptido Fe, en donde la protuberancia se ubica en la cavidad a fin de promover la formación de complejo entre el primer y el segundo polipéptido Fe. Los métodos para generar anticuerpos con estas modificaciones son conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 5:731.168.

En aún otro aspecto,, puede ser deseable crear anticuerpos obtenidos por ingeniería de cisteína, por ejemplo, "tioMAbs", en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo son sustituidos por residuos de cisteína. En formas de realización particulares, los residuos sustituidos aparecen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir dichos residuos con cisteína, se ubican grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugare el anticuerpo con otros restos, tales como restos de fármacos o restos ligadores de fármacos, tal como se describe en la presente. En ciertas formas de realización, cualquiera de uno o más de los siguientes residuos puede ser sustituido por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena liviana; A118 (numeración de UE) de la cadena pesada; y S400 (numeración de UE) de la cadena pesada de la región Fe. 10. Derivados de anticuerpos Los anticuerpos de la presente invención también se pueden modificar para contener restos no proteináceos adicionales que son conocidos en la técnica y están disponibles fácilmente. Con preferencia, los restos adecuados para la derivación del anticuerpo son polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, sin limitaciones, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1 ,3-dioxolano, poli— 1 ,3,6-trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sean homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de prolilpropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, y sus mezclas. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener la ventaja de fabricación de ser estable en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros adosados al anticuerpo puede variar, y si están adosados más de un polímero, pueden ser moléculas ¡guales o diferentes. En general, la cantidad y/o el tipo de polímeros usados para la derivación se pueden determinar sobre la base de consideraciones que incluyen, sin limitaciones, las propiedades particulares o funciones del anticuerpo que se desea mejorar, ya sea que el derivado de anticuerpo se use en una terapia en condiciones definidas, etc.

En otra forma de realización, se proveen los conjugados de un anticuerpo y el resto no proteináceo que se puede calentar selectivamente por exposición a radiación. En una forma de realización, el resto no proteináceo es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 1 1600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, sin limitaciones, las longitudes de onda que no dañan las células comunes, pero que calientan el resto no proteináceo a una temperatura a la cual mueren las células proximales al anticuerpo-resto no proteináceo.

B. Ciertos métodos para preparar anticuerpos 1. Ciertos métodos basados en hibrídoma Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden preparar mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), y luego descrito, por ejemplo, en Hongo et al., Hybrídoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodfies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2' ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981 ), y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) respecto de hibridomas humano-humano. Otros métodos incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos N.° 7.189. 826 referida a la producción de anticuerpos monoclonales IgM humanos naturales a partir de líneas celulares de hibridoma. La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trióma) está descrita en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings ¡n Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Para diversas otras técnicas de hibridoma, ver, por ejemplo, los documentos US 2006/258841 ; US 2006/183887 (anticuerpos totalmente humanos), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; y las patentes de los Estados Unidos N.°. 7.078.492 y 7.153.507. Un ejemplo de protocolo para producir anticuerpos monoclonales mediante el método de hibridoma se describe como sigue. En una forma de realización, un ratón u otro animal huésped adecuado, tal como un hámster, es inmunizado para producir linfocitos productores o capaces de producir anticuerpos que se fijen específicamente a la proteína usada para la inmunización. Se generan los anticuerpos en los animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) de un polipéptido que comprende Notch2 o uno de sus fragmentos (por ejemplo, Notch2 NRR), y un coadyuvante, tal como monofosforillípido A (MPL)/ dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT). Se puede preparar un polipéptido que comprende Notch2 o uno de sus fragmentos mediante métodos bien conocidos en la técnica, tales como métodos recombinantes, algunos de los cuales también se describen en la presente. Se analiza el suero de los animales inmunizados para determinar los anticuerpos anti-notch2, y opcionalmente se administram inmunizaciones, de refuerzo. Se aislan los linfocitos de los animales productores de anticuerpos anti-notch2. Alternativamente, se pueden inmunizar linfocitos in vitro.

Los linfocitos luego se fusionan con células de mieloma mediante el uso de un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Ver, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principlesand y Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986). Se pueden usar células de mieloma que se fusiona eficientemente, soportan la producción estable de alto nivel de anticuerpo por parte de las células seleccionadas productoras de anticuerpo, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Los ejemplos de células de mieloma incluyen, sin limitaciones, líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores murinos MOPC—21 y MPC—11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EE.UU. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma murino-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibodies Production Techniques and Aplicaciones, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, un medio que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las célula de mieloma no fusionadas originales. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantinaguaninafosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluye hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT. Con preferencia, se usan métodos de cultivos celulares de hibridoma sin suero para reducir el uso de suero derivado de animal tal como suero fetal bovino, tal como se describe, por ejemplo, en Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

Los oligopéptidos como herramientas para mejorar la productividad de los cultivos de células de hibridoma se describen en Franek, Trends in Monoclonal Antibodies Research, 1 1 1-122 (2005). Específicamente, los medios de cultivo estándar son enriquecidos con ciertos aminoácidos (alanina, serina, asparagina, prolina), o con fracciones de hidrolizado de proteínas, y se puede suprimir significativamente la apoptosis mediante oligopeptidos sintéticos constituidos por de tres a seis residuos de aminoácidos. Los péptidos están presentes en concentraciones milimolares o superiores.

El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se puede ensayar para la producción de anticuerpos monoclonales que se fijan a Notch2. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se puede determinar por inmunoprecipitación o por un ensayo de fijación in vitro, tal como, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por análisis de Scatchard. Ver, por ejemplo, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen los anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y cultivar por métodos estándar. Ver, por ejemplo, Goding, supra. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-ME o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, el fluido ascítico, o el suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilpatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía por afinidad. Un procedimiento para el aislamiento de proteínas provenientes de las células de hibridoma se describe en el documento US 2005/176122 y la patente de los Estados Unidos N.° 6. 919.436. El método incluye el uso de sales mínimas, tales como sales liotrópicas, en el proceso de fijación y con preferencia también mediante el uso de pequeñas cantidades de solventes orgánicos en el proceso de elución. 2. Algunos métodos de rastreo de bibliotecas Los anticuerpos de la invención se pueden preparar usando bibliotecas combinatorias para rastrear anticuerpos con la actividad o las actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en el arte una variedad de métodos para generar bibliotecas de despliegue y rastreo de fagos, poseyendo dichas bibliotecas para anticuerpos las características de ligadura deseadas. Tales métodos se describen generalmente en Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001 ). Por ejemplo, un método para generar anticuerpos de interés es a través del uso de una biblioteca de anticuerpos de fagos como se describe en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93.

En principio, se seleccionan clones de anticuerpos sintéticos rastreando las bibliotecas de fagos que contienen fagos que despliegan varios fragmentos de región variable de anticuerpo (Fv) fusionados a la proteína de cubierta del fago. Tales bibliotecas de fagos son paneadas por cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos de Fv capaces de ligarse al antígeno deseado son adsorbidos en el antígeno y así separados de los clones no lígadores en la biblioteca. Los clones ligadores son eluidos luego del antígeno, y pueden ser enriquecidos adicionalmente por ciclos adicionales de adsorción/elución del antígeno. Cualesquiera de los anticuerpos de la invención pueden ser obtenidos diseñando un procedimiento de rastreo de antígenos adecuado para seleccionar el clon del fago de interés seguido por la construcción de un clon de anticuerpo de longitud completa usando las secuencias de Fv del clon del fago de interés y las secuencias de la región constante (Fe) adecuada descriptas en Kabat et al., Sequences of Proteins of mnmunological Interest, Quinta Edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991 ), vols. 1-3.

En algunas formas de realización, el dominio de ligadura del antígeno de un anticuerpo está formado por dos regiones variables (V) de aprox. 110 aminoácidos, uno de cada una de las cadenas liviana (VL) y pesada (VH), presentando las dos tres lazos hipervariables (HVRs) o regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Los dominios variables pueden ser desplegados funcionalmente en el fago, ya sea como fragmentos de cadena simple Fv (scFv), en donde la VH y la VL están unidas en forma covalente a través de un péptido flexible, corto, o como fragmentos Fab, en donde los mismos son fusionados cada uno a un dominio constante e interactúan en forma no covalente, como se describe en Winter ef al., Ann. Rev. Inmunol., 12: 433-455 (1994). Como se usa en la presente, los clones de fagos que codifican scFv y los clones de fagos que codifican Fab son denominados colectivamente "clones de fagos Fv" o "clones de Fv".

Los repertorios de genes VH y VL pueden ser clonados separadamente por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y recombinados aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que pueden ser rastreadas luego con respecto a clones que ligan antígenos como se describe en Winter ef al., Ann. Rev. Inmunol., 12: 433-455 (1994). Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proveen anticuerpos de alta afinidad con el inmunógeno sin el requerimiento de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio naif puede ser clonado para proveer una sola fuente de anticuerpos humanos a un amplio rango de no auto-antígenos y también auto-antígenos sin una inmunización como describen Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas naif también pueden ser preparadas sintéticamente clonando los segmentos del gen V no reordenados de células madre, y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro como describen Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

En algunas formas de realización, se usa el fago filamentoso para desplegar fragmentos de anticuerpos por fusión a la proteína menor de la cubierta plll. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser desplegados como fragmentos Fv de cadena simple, en donde los dominios VH y VL son conectados en la misma cadena de polipéptidos por un espaciador de polipéptidos flexible, por ejemplo, como describen Marks ef al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991 ), o como fragmentos Fab, en donde una cadena es fusionada a plll y la otra es segregada en el periplasma celular del huésped bacteriano, en donde se ensambla en el conjunto de una estructura de la proteína de la cubierta Fab que es desplegada en la superficie del fago, desplazando algunas de las proteínas de la cubierta de tipo salvaje, por ejemplo, como se describe en Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991 ).

En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos son obtenidos de células inmunes cosechadas de humanos o animales. Si se desea una biblioteca desviada en favor de clones anti-Notch2 (por ejemplo, clones anti-Notch2 NRR), el sujeto es inmunizado con Notch2 (o Notch2 NRR) para generar una respuesta de anticuerpos, y se recuperan células del bazo y/o células B circulantes y otros linfocitos de la sangre periférica (PBLs) para la construcción de la biblioteca. En una forma de realización preferida, se obtiene una biblioteca de fragmentos de genes de anticuerpos humanos desviada en favor de clones anti-Notch2 generando una respuesta de anticuerpos anti-Notch2 en ratones transgénicos que llevan un conjunto de genes de inmunoglobulina humana funcional (y que no tienen un sistema de producción de anticuerpos endógenos funcional) de tal modo que la inmunización con Notch2 da lugar a células B que producen anticuerpos humanos contra Notch2. La generación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se describe más abajo.

El enriquecimiento adicional con respecto a poblaciones de células reactivas anti-Notch2 se puede obtener usando un procedimiento de rastreo adecuado para aislar células B que expresan anticuerpos ligados a la membrana específicos de Notch2, por ejemplo, por separación de células usando cromatografía de afinidad de Notch2 o adsorción de células en Notch2 marcado con fluorocromo seguido por selección celular por citometría de flujo (FACS).

Alternativamente, el uso de células del bazo y/o células B u otros PBLs de un dador no inmunizado provee una mejor representación del repertorio de anticuerpos posible, y también permite la construcción de una biblioteca de anticuerpos usando cualquier especie animal (humana o no humana) en donde Notch2 no es antigénico. Para bibliotecas que incorporan construcción de genes de anticuerpos in vitro, se cosechan células madre del sujeto para proveer ácidos nucleicos que codifican segmentos de genes de anticuerpos no reordenados. Las células inmunes de interés se pueden obtener de una variedad de especies animales, tales como las especies humana, ratón, rata, lagomorfa, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina y aviar, etc.

Los ácidos nucleicos que codifican segmentos de genes variables de anticuerpos (incluyendo los segmentos VH y VL) son recuperados de las células de interés y amplificados. En el caso de bibliotecas de genes VH y VL reordenadas, se puede obtener el ADN deseado aislando ADN o mARN genómico de linfocitos seguido por reacción en cadena de polimerasa (PCR) con cebadores que concuerdan con los extremos 5' y 3' de genes VH y VL reordenados como se describe en Orlandi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), realizando así diversos repertorios de genes V para la expresión. Los genes V pueden ser amplificados de cADN y ADN genómico, con cebadores inversos en el extremo 5' del exón que codifican el dominio V maduro y cebadores directos basados en el segmento J como se describe en Orlandi et al. (1989) y en Ward eí al., Nature, 341 : 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar a partir de cADN, los cebadores inversos también pueden estar basados en el exón líder como se describe en Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991 ) y los cebadores directos dentro de la región constante como se descnbe en Sastry et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar la complementariedad, se puede incorporar la degeneración en los cebadores como se describe n Orlandi eí al. ( 989) o Sastry et al. (1989). En algunas formas de realización, la diversidad de la biblioteca es maximizada usando cebadores de PCR direccionados a cada familia de genes V para amplificar todos los reordenamientos de VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácidos nucleicos de la célula inmune, por ejemplo, como se describe en el método de Marks eí al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991 ) o como se describe en el método de Orum eí al., Ácido nucleicos Res., 21 : 4491-4498 (1993). Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción raros en el cebador de PCR como una etiqueta en un extremo como se describe en Orlandi et al. (1989), o por amplificación adicional por PCR con un cebador marcado con etiqueta como se describe en Clackson eí al., Nature, 352: 624-628 (1991 ).

Los repertorios de genes V reordenados sintéticamente se pueden derivar in vitro de segmentos de genes V. La mayoría de los segmentos de genes VH humanos han sido clonados y secuenciados (informado en Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), y mapeados (informado en Matsuda et al., Nature Genet, 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluyendo todas las conformaciones mayores del lazo H1 y H2) pueden ser usadas para generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de PCR que codifican lazos H3 de diversa secuencia y longitud como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Los repertorios de VH también pueden ser preparados con toda la diversidad de secuencia enfocada en un lazo H3 largo de una longitud simple como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Los segmentos VK y VA humanos han sido clonados y secuenciados (informado en Williams y Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) y pueden ser usados para preparar repertorios de cadena liviana sintéticos. Los repertorios de genes V sintéticos, basados en un rango de pliegues VH y VL, y longitudes L3 y H3, codificarán anticuerpos de diversidad estructural considerable. Después de amplificación del gen V que codifica los ADNs, los segmentos de genes V de la línea germinal pueden ser reordenados in vitro de acuerdo con los métodos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

Los repertorios de los fragmentos de anticuerpos pueden ser construidos combinando los repertorios de genes VH y VL juntos de diversas maneras. Cada repertorio puede ser creado en diferentes vectores y los vectores pueden ser recombinados in vitro, por ejemplo, como se describe en Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), o in vivo por infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouse et al., Nucí. Acids Res., 21 : 2265-2266 (1993). La propuesta de recombinación in vivo explota la naturaleza de dos cadenas de los fragmentos Fab para superar el límite del tamaño de biblioteca impuesto por la eficiencia de transformación de E. col. Los repertorios VH y VL naif son clonados separadamente, uno en un fagémido y el otro en un vector fago. Las dos bibliotecas se combinan luego por infección por fago de bacterias que contienen fagémidos de modo que cada célula contiene una combinación diferente y el tamaño de la biblioteca está limitado sólo por el número de células presente (aprox. 1012 clones). Ambos vectores contienen señales de recombinación in vivo de modo que los genes VH y VL son recombinados en un solo replicón y son co-empaquetados en viriones de fagos. Estas enormes bibliotecas proveen grandes números de diversos anticuerpos de buena afinidad (K<f1 de aprox. 10-8 M).

Alternativamente, los repertorios pueden ser clonados secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991 ), o ensamblados juntos por PCR y luego clonados, por ejemplo, como se describe en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991 ). El ensamble de PCR también se puede usar para unir los ADNs de VH y VL con ADN que codifica un espaciador de péptidos flexible para formar repertorios de cadena simple Fv (scFv). En otra técnica, se usa el "ensamble de PCR en células" para combinar los genes de VH y VL dentro de linfocitos por PCR y luego se clonan repertorios de genes ligados como se describe en Embleton et al., Nucí. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Los anticuerpos producidos por bibliotecas naif (ya sea naturales o sintéticas) puede ser de afinidad moderada (K<f1 de aprox. 106 a 107 M_1), pero la maduración de afinidad también puede ser simulada in vitro construyendo y reseleccionando a partir de bibliotecas secundarias como se describe en Winter eí al. (1994), supra. Por ejemplo, la mutación puede ser introducida aleatoriamente in vitro usando polimerasa tendiente al error (informado en Leung et al., Technique, 1 : 11-15 (1989)) en el método de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el método de Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, la maduración de afinidad puede ser llevada a cabo mutando aleatoriamente una o más CDRs, por ejemplo, usando PCR con cebadores que portan la secuencia aleatoria que abarca la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y rastreando para determinar clones de mayor afinidad. La WO 9607754 (publicada el 14 de marzo de 1996) describe un método para inducir mutagénesis en una región determinante de complementariedad de una cadena liviana de inmunoglobulina para crear una biblioteca de genes de cadena liviana. Otra propuesta efectiva es recombinar los dominios VH o VL seleccionados por despliegue de fagos con repertorios de variantes de dominio V que existen naturalmente obtenidas de dadores no inmunizados y rastrear para determinar mayor afinidad en varias rondas de reordenamiento de cadena como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades de aprox. 10-9 M o menos.

El rastreo de las bibliotecas se puede realizar por diversas técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, se puede usar el Notch2 (o Notch2 NRR) para recubrir las cavidades de placas de adsorción, expresado en células huésped fijadas a placas de adsorción o usado en selección de células, o conjugado a biotina para captura con perlas recubiertas con estreptavidina, o usado en cualquier otro método de paneo de bibliotecas de despliegue de fagos.

Las muestras de la biblioteca de fagos se ponen en contacto con Notch2 inmovilizado bajo condiciones adecuadas para ligar por lo menos una parte de las partículas de fagos con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, incluyendo pH, concentración iónica, temperatura y similares son seleccionadas para simular las condiciones fisiológicas. Los fagos ligados a la fase sólida se lavan y luego se eluyen con ácido, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991 ), o con álcalis, por ejemplo, como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991 ), or por competencia del antígeno de Notch2, por ejemplo, en un procedimiento similar al método de competencia del antígeno de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991 ). Los fagos pueden ser enriquecidos 20-1.000 veces en una sola ronda de selección. Además, los fagos enriquecidos pueden ser cultivados en cultivos dé bacterias y sometidos a otras rondas de selección.

La eficiencia de la selección depende de muchos factores, incluyendo la cinética de disociación durante el lavado, y si múltiples fragmentos de anticuerpos en un solo fago pueden engancharse simultáneamente con el antígeno. Los anticuerpos con cinética de disociación rápida (y afinidades de ligadura débiles) pueden ser retenidos usando lavados cortos, despliegue de fagos multivalente y alta densidad de recubrimiento del antígeno en fase sólida. La alta densidad no sólo estabiliza el fago a través de interacciones multivalentes, sino que favorece la nueva ligadura del fago que ha sido disociado. La selección de anticuerpos con cinética de disociación lenta (y buena afinidad de ligadura) puede ser estimulada por el uso de lavados largos y despliegue de fagos monovalente como se describe en Bass et al., Proteínas, 8: 309-314 (1990) y en WO 92/09690, y una baja densidad de recubrimiento del antígeno como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Es posible seleccionar entre anticuerpos de fagos de diferentes afinidades, aún con afinidades que difieren levemente, para Notch2. Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como se realiza en algunas técnicas de maduración de afinidad) es probable que de lugar a muchos mutantes, la mayoría que se ligan a antígenos y unos pocos de mayor afinidad. Con limitación de Notch2, se podría sacar de competencia los fagos de alta afinidad. Para retener todos los mutantes de mayor afinidad, los fagos pueden ser incubados con Notch2 biotinilado en exceso, pero con el Notch2 biotinilado a una concentración de menor molaridad que la constante de afinidad molar objetivo para Notch2. Los fagos de ligadura de alta afinidad pueden ser capturados luego por perlas paramagnéticas recubíertas con estreptavidina. Tal "captura de equilibrio" permite que los anticuerpos sean seleccionados de acuerdo con sus afinidades de ligadura, con sensibilidad que permite aislamiento de clones mutantes con tan poco como una afinidad dos veces mayor de un gran exceso de fagos con menor afinidad. Las condiciones usadas en el lavado de fagos ligados a una fase sólida también pueden ser manipuladas para discriminar en base a la cinética de disociación.

Los clones anti-Notch2 pueden ser seleccionados en base a la actividad.

En algunas formas de realización, la invención provee anticuerpos anti-Notch2 que se ligan a células vivas que expresan naturalmente el Notch2. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-Notch2 que bloquean la ligadura entre un ligando de Notch2 y Notch2, pero no bloquean la ligadura entre un ligando de Notch2 y una segunda proteína. Los clones de Fv que corresponden a tales anticuerpos anti-Notch2 pueden ser seleccionados (1 ) aislando clones anti-Notch2 de una biblioteca de fagos como se describió más arriba y opcionalmente amplificando la población de clones de fagos aislada cultivando la población en un huésped bacteriano adecuado; (2) seleccionando el Notch2 y una segunda proteína contra los cuales se desea actividad bloqueadora y no bloqueadora, respectivamente; (3) adsorbiendo los clones de fagos anti-Notch2 a Notch2 inmovilizado; (4) usando un exceso de la segunda proteína para eluir cualesquiera clones indeseados que reconocen a los determinantes de ligadura de Notch2 que se superponen o son compartidos con los determinantes de ligadura de la segunda proteína; y (5) eluyendo los clones que permanecen adsorbidos después del paso (4). Opcionalmente, los clones con las propiedades bloqueadoras/no bloqueadoras deseadas pueden ser enriquecidos adicionalmente repitiendo los procedimientos de selección descriptos en la presente una o más veces.

El ADN que codifica anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma o clones de Fv de despliegue de fagos de la invención es aislado y secuenciado fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando cebadores oligonucleótidos diseñados para amplificar específicamente las regiones codificadoras de cadena pesada y liviana de interés de molde de ADN de fago o de hibridoma). Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que son transfectados luego en células huésped tales como células de E. col, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células huésped recombinantes. Artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica anticuerpos incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5: 256 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

El ADN que codifica los clones de Fv de la invención puede ser combinado con secuencias de ADN conocidas que codifican regiones constantes de cadena pesada y/o de cadena liviana (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas se pueden obtener de Kabat et al., supra) para formar clones que codifican cadenas pesadas y/o livianas de longitud completa o parcial. Se apreciará que se pueden usar para este propósito las regiones constantes de cualquier isotipo, incluyendo las regiones constantes IgG, Ig , IgA, IgD e IgE, y que tales regiones constantes pueden obtenerse de cualquier especie humana o animal. Un clon de Fv derivado del ADN del dominio variable de un animal (tal como un ser humano) y luego fusionado al ADN de región constante de otra especie animal para formar secuencia(s) codificadpra(s) para de longitud completa, "híbrido", está incluido en la definición de anticuerpo "quimérico" e "híbrido" como se usa en la presente. En algunas formas de realización, un clon de Fv derivado de ADN variable humano es fusionado a ADN de la región constante humana para formar secuencia(s) codificadora(s) para cadenas pesadas y/o livianas humanas de longitud completa o parcial..

El ADN que codifica el anticuerpo anti-Notch2 derivado de un hibridoma de la invención también puede ser modificado, por ejemplo, substituyendo la secuencia codificadora para los dominios constantes de cadena pesada y liviana humanos en lugar de secuencias de ratón homologa derivadas del clon de hibridoma (por ejemplo, como en el método de Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 (1984)). El ADN que codifica un anticuerpo o fragmento derivado de un clon de Fv o de hibridoma puede ser modificado adicionalmente uniéndose en forma covalente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificadora para un polipéptído que no es una inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de ligadura de los anticuerpos derivados de clones de hibridoma o clones de Fv de la invención. 3. Vectores, células huésped y métodos recombinantes Los anticuerpos también pueden ser producidos usando métodos recombinantes. Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-Notch2, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo es aislado e insertado en un vector replicable para clonación ulterior (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo puede ser aislado y secuenciado fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de ligarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo). Se encuentran disponibles muchos vectores. Los componentes de vectores incluyen generalmente, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. a) Componente de la secuencia señal Un anticuerpo de la invención puede ser producido en forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en el término N de la proteína o el polipéptido maduros. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen y procesan una secuencia señal de anticuerpo nativa, la secuencia señal es substituida por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de los líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II estable al calor. Para la secreción de levadura la secuencia señal nativa puede ser substituida, por ejemplo, por el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor a (incluyendo los líderes del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans, o la señal descripta en la WO 90/13646. En la expresión celular en mamíferos, se encuentran disponibles las secuencias señal en mamíferos así como también los líderes secretores virales, por ejemplo, la señal de herpes simplex gD. b) Origen de la replicación Ambos vectores, de expresión y de clonación, contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al vector replicarse en una o más células huésped, seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican en forma autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus.. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. En general, el origen del componente de replicación no se necesita para los vectores de expresión en mamíferos (el origen SV40 se puede usar típicamente sólo porque contiene el promotor temprano). c) Componente del gen de selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, denominado también un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y así sobrevive al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionabas adécuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar al ácido nucleico que codifica el anticuerpo, tales como DHFR, glutamina sintetasa (GS), timidina quinasa, metalotioneína I y II, preferentemente genes de metalotioneína de primates, adenosina desaminása, ornitina decarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen DHFR son identificadas cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Bajo estas condiciones, el gen DHFR es amplificado junto con cualquier otro ácido nucleico co-transformado. Se puede usar una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR endógena (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, las células- transformadas con el gen GS son identificadas cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene L-metionina sulfoximina (Msx), un inhibidor de GS. Bajo estas condiciones, el gen GS es amplificado junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. El sistema de selección/amplificación de GS puede ser usado en combinación con el sistema de selección/amplificación de DHFR descrito más arriba.

Alternativamente, células huésped (particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de interés, gen DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionare tal como la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionadas por células cultivadas en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionare tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Ver patente U.S. Nro. 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para el uso en levaduras es el gen frp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb ef al., Nature, 282:39 (1979)). El gen frp1 provee un marcador de selección para una cepa muíante de levadura que no tiene la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión de frp1 en el genoma de la célula huésped de levadura provee luego un ambiente efectivo para detectar la transformación por cultivo en ausencia de triptófano. Similarmente, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 or 38,626) son complementadas por plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido pKD1 circular de 1 ,6 µ?t? pueden ser usados para la transformación de levaduras de Kluyveromyces. Alternativamente, se informó un sistema de expresión para la producción en gran escala de quimosina de ternero recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se divulgaron vectores de expresión de múltiples copias estables para la secreción de albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991 ). d) Componente de promotor Los vectores de expresión y clonación contienen generalmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está ligado en forma operativa a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo. Los promotores adecuados para usar con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas de promotores de ß-lactamasa y lactosa, el promotor de la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, también son adecuados otros promotores adecuados. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada en forma operativa al ADN que codifica un anticuerpo.

Las secuencias de promotores son conocidas para los eucariotas. Casi todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en donde se inició la transcripción. Otra secuencia hallada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificadora. Todas estas secuencias son insertadas adecuadamente en vectores de expresión eucarióticos.

Ejemplos de secuencias de promotores adecuadas para usar con huéspedes de levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables para la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión en levadura se describen adicionalmente en la EP 73.657. Los intensificadores de levaduras también se usan ventajosamente como promotores de levaduras.

La transcripción de anticuerpos a partir de vectores en células huésped de mamíferos puede ser controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis-B, el virus de simio 40 (SV40), o de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de shock térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral SV4Q de replicacion. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción Hindlll E. Un sistema para expresar el ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como un vector se divulga en la patente U.S. Nro. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente U.S. Nro. 4.601.978. Ver también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre expresión del cADN de ß-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simplex. Alternativamente, se puede usar como promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous. e) Componente de elemento intensificador La transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo de esta invención por eucariotas superiores es aumentada frecuentemente insertando una secuencia intensificadora en el vector. Se conocen ahora muchas secuencias intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el intensificador SV40 en lado tardío del origen de replicacion (bp 100-270), el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el lado tardío del origen de replicacion e intensificadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para la activación de promotores eucarióticos. El intensificador puede ser cortado y empalmado en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica el anticuerpo, pero está ubicado preferentemente en un sitio 5' del promotor. f) Componente de terminación de transcripción Los vectores de expresión usados en células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mARN. Tales secuencias se encuentran disponibles comúnmente de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3", de ADNs o cADNs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del anticuerpo que codifica el mARN. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver la WO94/1 1026 y el vector de expresión vector allí divulgado. g) Selección y transformación de células huésped Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente son las células procariotas, de levaduras, o eucariotas superiores descriptas más arriba. Procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimuríum, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como también Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P divulgado en la DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31 ,446), aunque también son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 ,537), y E. coli W31 10 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitativos.

Anticuerpos de longitud completa, proteínas de fusión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos pueden ser producidos en bacterias, en particular cuando no se necesita glicosilación y la función efectora Fe, tal como cuando el anticuerpo terapéutico es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) que por sí misma muestra efectividad en la destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor vida media en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más eficiente en cuanto al costo. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, U.S. 5.648.237 (Cárter et. al.), U.S. 5.789.199 (Joly et al.), U.S. 5.840.523 (Simmons et al.), que describen la región de iniciación de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la expresión y la secreción. Ver también Charlton, Methods ¡n Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli. Después de la expresión, el anticuerpo puede ser aislado de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede ser purificado a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo en forma similar al procedimiento para purificar anticuerpos expresado, por ejemplo, en células de CHO.

Además de los procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panificación, es el que se usa más comúnmente entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, una cantidad de otros géneros, especies y cepas se encuentran disponibles comúnmente y son útiles en la presente, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Cyida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanníomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Para un panorama comentando el uso de levaduras y hongos filamentosos para la producción de proteínas terapéuticas, ver, por ejemplo, Gerngross, Nal Biotech. 22:1409-1414 (2004).

Se pueden seleccionar algunos hongos y cepas de levaduras en donde las vías de glicosilación han sido "humanizadas", dando por resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcialmente o completamente humano. Ver, por ejemplo, L¡ et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (que describe la humanización de la vía de glicosilación en Pichia pastoris); y Gerngross et al., supra.

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilados también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de planta y de insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y células huésped de insectos permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus* (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx morí. Una variedad de cepas virales para transfección se encuentran disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y tales virus pueden ser usados como los virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden usar como huéspedes cultivos de células de plantas de algodón, maíz, papa, soja, petunia, tomate, lenteja de agua {Lemnaceae), alfalfa (M. truncatula) y tabaco. Ver, por ejemplo, las patentes US Nros. 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

Se pueden usar las células de vertebrados como huéspedes, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha tornado un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651 ); la línea de riñon embrionario humano (293 o 293 células subclonadas para cultivar en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)) ; células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de sertoli del ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) ); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas de células huésped de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células DHFR" CHO (Urlaub eí ai, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como NSO y Sp2/0. Para una reseña de algunas líneas de células huésped de mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpos, ver, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, e<±, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 255-268.

Las células huésped son transformadas con los vectores de expresión o clonación arriba descriptos para la producción de anticuerpos y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados como resulte apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. h) Cultivar las células huésped Las células huésped usadas para producir un anticuerpo de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como Ham's F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, se puede usar cualquiera de los medios descriptos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Pat. U.S. Nros. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente U.S. Re. 30.985 como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), búferes (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también se pueden incluir en concentraciones apropiadas conocidas por los expertos en el arte. Las condiciones de cultivo, tales como, temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y resultarán evidentes para los expertos en el arte. i) Purificación de anticuerpos Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido intracelularmente, en el espacio periplásmico, o segregado directamente en el medio. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, como un primer paso, el debris en partículas, ya sea células huésped o fragmentos lisados, es retirado, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son segregados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular es descongelada en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aprox. 30 min. El debris celular puede ser retirado por centrifugación. En donde el anticuerpo es segregado en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión son concentrados primero generalmente usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de los pasos precedentes para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición del anticuerpo preparado a partir de células puede ser purificada usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad uno de los pasos de purificación típicamente preferidos. La adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas ?1 , ?2, o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Inmunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para ?3 humana (Guss eí al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es frecuentemente agarosa, pero otras matrices también están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poros controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. En donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, SEPHAROSE™ cromatografía en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también se encuentran disponibles dependiendo del anticuerpo a ser recuperado.

Después de cualquier paso o pasos de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede ser sometida a cromatografía de interacción hidrófoba a bajo pH usando un búfer de elución a un pH entre aprox. 2,5-4,5, realizada preferentemente con bajas concentraciones de sales (por ejemplo, de aprox. 0-0.25M de sal).

En general, diversas metodologías para preparar anticuerpos para usar en investigación, ensayos y clínica están bien establecidas en el arte, consistentes con las metodologías arriba descriptas y/o como se considere apropiado por un experto en el arte para un anticuerpo de interés particular.

C. Inmunoconjugados La invención también provee inmunoconjugados (denominados en forma intercambiable "conjugados de anticuerpo-fármaco" o "ADCs") que comprenden un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente que inhibe el crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina de proteína, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, de planta o de animal, o fragmentos de los mismos), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Los inmunoconjugados han sido usados para el suministro local de agentes citotóxicos, es decir, fármacos que detienen o inhiben el crecimiento o la proliferación de células, en el tratamiento del cáncer (Lambed, J. (2005) Curr. Opinión in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnoiogy 23(9):1 137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; U.S. Pat. Nro. 4.975.278). Los inmunoconjugados permiten el suministro direccionado de una parte de fármaco a un tumor, y la acumulación intracelular allí, en donde la administración sistémica de fármacos no conjugados puede dar por resultado niveles inaceptables de toxicidad para células normales así como también células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biológica! Y Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) págs. 475-506. Se ha informado que ambos, los anticuerpos policlonales y los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowly et al., (1986) Cáncer Immunol. Immunother. 21 :183-87). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowly et al., (1986) supra). Las toxinas usadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como la toxina de la difteria, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina (Miler et al (2000) J. Nat. Cáncer Inst. 92(19):1573-1581 ; Miler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Miler et al (2002) Bloconjugate Chem. 13:786-791 ), maitansinoidess (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y caliqueamicina (Lode et al (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos por mecanismos que incluyen ligadura a tubulina, ligadura a ADN o inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando son conjugados a grandes anticuerpos o ligandos de receptores de proteínas.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal lgG1 de ratón dirigido contra el antígeno CD20 hallado en la superficie de linfocitos B normales y malignos y radioisótopos 1111? o 90Y ligados por un quelante ligante de tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Aunque ZEVALIN tiene actividad contra el linfoma no Hodgkin de las células B (NHL), la administración da por resultado citopenias graves y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MILOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por un anticuerpo huCD33 ligado a caliqueamicina, fue aprobado en 2000 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda por inyección {Drugs of the Future (2000) 25(7):686; patentes US Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001 ). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 ligado a través del ligador disulfuro SPP a la parte de fármaco de maitansinoide, DM1 , está avanzando en los ensayos de Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como cáncer de cojon, pancreático, gástrico, y otros cánceres. El MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Inmunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal de antígeno de la membrana específico anti-prostático (PSMA) ligado a la parte de fármaco maitansinoide, DM1 , está en desarrollo para el tratamiento potencial de los tumores de la próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, fueron conjugados a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específico para Lewis Y en carcinomas) y cAC10 (específico para CD30 en tumores malignos hematológicos) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnol. 21(7):778-784) y están bajo desarrollo terapéutico.

En algunas formas de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo y un agente quimioterapéutico u otra toxina. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de ¡nmunoconjugados se describen en la presente (por ejemplo, más arriba). Las toxinas enzimáticamente más activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no ligadores de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modecina, la alfa-sarcina, proteínas de Aíeurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, la WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993. Una variedad , de radionúclidos se encuentran disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi, 1311, 31ln, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N— succinimidü— 3— (2— piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCI), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil>-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianató), y compuestos de flúor bis— activos (tales cómo 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isot¡ocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ilustrativo para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Ver la WO94/11026.

Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se consideran en la presente. 1. Maitansina y maitansinoides.

En algunas formas de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (longitud completa o fragmentos) conjugado a una o más moléculas de maitansinoide.

Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló primero del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente U.S. Nro. 3.896.111 ). Subsiguientemente, se descubrió que algunos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C—3 (patente U.S. Nro. 4.151.042). EL maitansinol sintético y derivados y análogos de los mismos se divulgan, por ejemplo, en las patentes U.S. Nros. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821 ; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.

Las partes de fármacos maitansinoides son partes de fármacos atractivas en conjugados de anticuerpo y fármaco debido a que son: (i) relativamente accesibles para su preparación por fermentación o modificación química, derivación de productos de fermentación, (ii) sujetos a derivación con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de ligadores no disulfuro a anticuerpos, (iii) estable en plasma, y (iv) efectivos contra una variedad de líneas de células tumorales.

Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, los métodos de preparación de los mismos y su uso terapéutico se divulgan, por ejemplo, en las patentes U.S. Nros. 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1 , cuyas divulgaciones se incorporan de este modo expresamente por referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 ligado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se halló que el conjugado era muy citotóxico con respecto a las células de cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad antitumoral en ún ensayo de crecimiento de tumores in vivo. Chari et al.. Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconjugados en donde un maitansinoide fue conjugado a través de un ligador disulfuro al anticuerpo de ratón A7 que se liga a un antígeno en las líneas celulares de cáncer de colon humanas, o a otro anticuerpo monoclonal de ratón TA.1 que liga el oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado maitansinoide TA.1 fue testeada in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 HER-2 antígenos de superficie por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que pudo ser aumentado incrementando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.

Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan ligando químicamente un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica ya sea del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Ver, por ejemplo, patente U.S. Nro. 5.208.020 (cuya divulgación se incorpora de este modo expresamente por referencia). Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia para aumentar la citotoxicidad de células objetivo sin afectar negativamente la función o la solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que aún una molécula de toxina/anticuerpo aumentara la citotoxicidad con respecto al uso de un anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos en el arte y pueden ser sintetizados por técnicas conocidas o aislados de fuentes naturales.

Maitansinoides adecuados se divulgan, por ejemplo, en la patente U.S. Nro. 5.208.020 y en las otras patentes y publicaciones que no son patentes mencionadas , más arriba. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como varios ésteres de maitansinol.

Hay muchos grupos ligandores conocidos en el arte para preparar conjugados de anticuerpo-maitansinoides, incluyendo, por ejemplo, aquellos divulgados en la patente U.S. Nro. 5.208.020 o la patente EP 0 425 235 B1 , Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992), y la solicitud de patente U.S. publicación No. US 2005/016993 A1 , cuyas divulgaciones se incorporan de este modo expresamente por referencia. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente ligador SMCC pueden ser preparados como se divulga en la US 2005/016993 A1. Los grupos ligadores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos ácido lábiles, grupos fotolábiles, grupos peptidasa lábiles o grupos esterasa lábiles, como se divulga en las patentes arriba mencionadas, prefiriéndose los grupos disulfuro y tioéter. Los grupos ligadores adicionales se describen e ilustran en la presente.

Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCI), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), disocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis- activos (tales como 1 ,5-difluoro-2,4-din¡trobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N— succinimidil— 3— (2— piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proveer un enlace disulfuro.

El ligador puede ser unido a . la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de unión. Por ejemplo, una unión éster se puede formar por reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C- 14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C— 20 que tiene un grupo hidroxilo. En una forma de realización preferida, la unión se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol. 2. Auristatinas y dolastatinas En algunas formas de realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a dolastatinas o análogos peptídicos de dolastatinas y derivados, las auristatinas (patentes US Nros, 5635483; 5780588). Se ha demostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la divisón nuclear y celular (Woyke et al (2001 ) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad anticáncer (US 5663149) y antifúnga (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965). La parte de fármaco de dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo a través del término N (amino) o el término C (carboxilo) de la parte de fármaco peptídica (WO 02/088172).

Las formas de realización de las auristatinas ilustrativas incluyen las partes DE y DF de fármaco de monometilauristatina ligada al término N, divulgadas en "Monomethilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. Nro. 10/983.340, presentada el 5 de Noviembre de 2004, cuya divulgación se incorpora de este modo expresamente por referencia en su totalidad.

Típicamente, las partes de fármacos basadas en péptidos pueden ser preparadas formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Tales enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (ver E. Schroder y K. Lübke, "The Peptides", volumen 1 , págs. 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de los péptidos. Las partes de fármaco de auristatina/dolastatina pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos de: US 5635483; US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111 :5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863. Ver también Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; "Monomethilvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, presentada el 5 de noviembre de 2004, incorporada de este modo por referencia en su totalidad (que divulga, por ejemplo, ligadores y métodos de preparación de compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugados a ligadores). 3. Caliqueamicina ¦ En otras formas de realización, el ¡nmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir rupturas del ADN de doble hebra a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, ver patentes U.S. Nros. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701 , 5.770.710, 5.773.001 , 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden usar incluyen, pero no están limitados a, ?1 ?, a2?, a3?, N— acetil— ?11, PSAG y T?1 (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes U.S. arriba mencionadas de American Cyanamid). Otra droga anti-tumoral a la que se puede conjugar el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Ambas, la caliqueamicina y la QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo aumenta mucho sus efectos citotóxicos. 4. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar a los anticuerpos incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descripta en las patentes U.S. 5.053.394, 5.770.710, así como también las esperamicinás (patente U.S. 5.877.296).

Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no ligadores de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogeliná, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, la WO 93/2 232 publicada el 28 de octubre de 1993.

La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa; ADNsa).

Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo muy radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos se encuentran disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen A+t211 , . I131 , , I125 , v Y90 , Re 186 , D Re 188 , S em 153 , D ?¡?212 , D P32 , D Pb212 e _ ¦ isó ?+to?„po?„s radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para la detección, el mismo puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo tc99m o 1123, o una marcación de espín para la toma de imágenes por resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida como toma de imágenes por resonancia magnética, mri), tales como yodo-123 nuevamente, yodo-131 , indio— 111 , flúor— 19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los radiomarcadores u otros marcadores pueden ser incorporados en el conjugado de diversas maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede ser biosintetizado o puede ser sintetizado por síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que comprenden, por ejemplo, flúor— 19 en lugar de hidrógeno. Marcadores tales como tc"m o I123, Re186, Re188 y ln111 se pueden unir a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio— 90 se puede unir a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) se puede usar para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal; CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-p¡rid¡ld¡t¡o) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) c¡clohexano-1-carbox¡lato (SMCC), ¡minotiolano (IT), derivados bifuncionales de ¡midoésteres (tales como dimetil adipimidato HCI), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ilustrativo para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Ver la WO 94/11026. El ligador puede ser un "ligador que se puede dividir" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, se puede usar un ligador ácido-lábil, un ligador sensible a la peptidasa, un ligador fotolábil, un ligador dimetilo o un ligador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); patente U.S. Nro. 5.208.020).

Los compuestos comprenden expresamente, pero no están limitados a, ADC preparado con reactivos de ligadores cruzados: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vin¡lsulfona)benzoato) que se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A). Ver páginas 467-498, 2003-2004 "Applications Handbook and Catalog". 5. Preparación de conjugados de anticuerpo y fármaco En los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC), un anticuerpo (Ab) es conjugado a una o más partes de un fármaco (D), por ejemplo, aprox. 1 a aprox. 20 partes de fármaco por anticuerpo, a través de un ligador (L). EL ADC de Fórmula I puede ser preparado por varias vías, empleando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos por los expertos en el arte, incluyendo: (1) reacción de de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo ligador bivalente, para formar Ab-L, a través de una unión covalente, seguido por reacción con una parte de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de una parte de fármaco con un reactivo ligador bivalente, para formar D-L, a través de una unión covalente, seguido por reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo. Métodos adicionales para preparar ADC se describen en la presente.

Ab-(L-D)p I El ligador puede estar compuesto por uno o más componentes ligadores.

Los componentes ligadores ilustrativos incluyen 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), N-succinimidil 4— (2— piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-cuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC) y N-succinimidil (4-yodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Componentes ligadores adicionales son conocidos en el arte y algunos se describen en la presente. Ver también "IVIonomethyIvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983.340, presentada el 5 de noviembre de 2004, cuyo contenido se incorpora de este modo por referencia en su totalidad.

En algunas formas de realización, el ligador puede comprender residuos de aminoácidos. Componentes ligadores de aminoácidos ilustrativos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Los dipéptidos incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe). Los tripéptidos ilustrativos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly— val— cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente ligador de aminoácido incluyen aquellos que existen naturalmente, así como también aminoácidos menores y análogos de aminoácidos que no existen naturalmente, tales como la citrulina. Los componentes ligadores de aminoácidos pueden ser denominados y optimizados en su selectividad por la división enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada con tumores, catepsina B, C y D o una plasmina proteasa.

Los grupos nucleofílicos en anticuerpos incluyen, pero no están limitados a: (i) grupos amina N-terminales, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcar en donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrofílicos en partes de ligadores y reactivos de ligadores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros de ácidos; (¡i) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. Algunos anticuerpos tienen disulfuros de intercadena reductible, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos se pueden hacer reactivos para conjugación con reactivos ligadores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente cisteína formará así, teóricamente, dos nucleófilos tiol reactivos. Grupos nucleofílicos adicionales pueden ser introducidos en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando por resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden ser introducidos en el anticuerpo (o fragmento del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro, o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no nativos).

Los conjugados de anticuerpo y fármaco también se pueden producir por modificación del anticuerpo para introducir partes electrofílicas, que pueden reaccionar con substituyentes nucleofílicos en el reactivo ligador o el fármaco. Los azúcares de anticuerpos glicosilados pueden ser oxidados, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos ligadores o las partes de fármaco. Los grupos de base de Schiff imina resultantes pueden formar una unión estable, o pueden ser reducidos, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar uniones amina estables. En una forma de realización, la reacción de la parte de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con o bien galactosa oxidasa o meta-peryodato de sodio puede dar grupos carboniol (aldehido y cetona) en la proteína que puede reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra forma de realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N terminales pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, dando por resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Un aldehido como éste se puede hacer reaccionar con una parte de fármaco o nucleófilo ligador.

Igualmente, los grupos nucleofílicos en una parte de fármaco incluyen, pero no están limitados a: amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y grupos arilhídrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en partes de ligadores y reactivos de ligadores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros ácidos; (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida.

Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico puede ser preparada, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos partes del conjugado ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido ligador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En otra forma de realización, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en predireccionamiento a un tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por remoción de conjugado no ligado de la circulación usando un agente de depuración y luego administrando un "ligando" (por ejemplo, avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).

D. Métodos 1. Métodos de diagnóstico y métodos de detección En un aspecto, los anticuerpos de la invención son útiles para detectar la presencia de Notch2 en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en la presente, comprende la detección cuantitativa o cualitativa. En algunas formas de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como un tejido canceroso.

En un aspecto, la invención provee un método para detectar la presencia de Notch2 en una muestra biológica. En algunas formas de realización, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-Notch2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Notch2 NRR) bajo condiciones permisivas para ligar el anticuerpo anti-Notch2 a Notch2, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-Notch2 y Notch2.

En un aspecto, la invención provee un método de diagnóstico de un trastorno asociado con la expresión aumentada de Notch2. En algunas formas de realización, el método comprende poner en contacto una célula de prueba con un anticuerpo anti-Notch2; determinar el nivel de expresión (ya sea cuantitativamente o cualitativamente) de Notch2 por la célula de prueba detectando la ligadura del anticuerpo anti-Notch2 a Notch2; y comparando el nivel de expresión de Notch2 por la célula de prueba con el nivel de expresión de Notch2 por una célula control (por ejemplo, una célula normal del mismo origen del tejido que la célula de prueba, o una célula que expresa Notch2 a niveles comparables a los de una célula normal de este tipo, o un nivel promedio de expresión entre múltiples células control), en donde un mayor nivel de expresión de Notch2 por la célula de prueba en comparación con a célula control indica la presencia de un trastorno asociado con la expresión aumentada de Notch2. En algunas formas de realización, la célula de prueba se obtiene de un individuo del cual se sospecha que tiene un trastorno asociado con la expresión aumentada de Notch2. En algunas formas de realización, el trastorno es un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer o un tumor.

Trastornos ilustrativos que pueden ser diagnosticados usando un anticuerpo de la invención incluyen cáncer, por ejemplo, tumores malignos de las células B, melanoma, tumores malignos de las células T (por ejemplo, T-ALL), cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer cervical, cáncer de colon y cáncer pancreático.

Se pueden usar otros métodos para detectar la ligadura de anticuerpos a Notch2. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, ensayos de ligadura de antígeno que son bien conocidos en el arte, tales como transferencias western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo ¡nmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A e inmunohistoquímica (IHC).

En algunas formas de realización, los anticuerpos son marcados con marcadores. Los marcadores incluyen, pero no están limitados a, marcadores o partes que son detectados directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromoforos, densos a los electrones, quimioluminiscentes y radioactivos), así como también partes, tales como enzimas o ligandos, que son detectados indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ilustrativos incluyen, pero no están limitados a, los radioisótopos 32P, 14C, 125l, 3H, y 131l, fluoróforos tales como quelatos de las tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de las luciérnagas y luciferasa bacteriana (Pat. U.S. Nro. .4.737.456), luciferina, 2,3-dihidrofthalazinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, etiquetas de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares.

En algunas formas de realización, los anticuerpos son inmovilizados en una matriz ¡nsoluble. La inmovilización puede comprender separar un anticuerpo anti- Notch2 de cualquier Notch2 que quede libre en solución. Esto se logra convencionalmente ya sea insolubilizando el anticuerpo anti-Notch2 antes del procedimiento de ensayo, como por adsorción a una superficie o matriz insoluble en agua (Bennich et al.., U.S. 3.720.760), o por acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulación de glutaraldehído), o insolubilizando el anticuerpo anti-Notch2 después de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti— Notch2 y Notch2, por ejemplo, por inmunoprecipitación.

Se entiende que cualquiera de las formas de realización arriba mencionadas de diagnóstico o detección puede ser llevada a cabo usando un inmunoconjugadó de la invención en lugar de o además de, un anticuerpo anti— Notch2. 2. Métodos terapéuticos Se puede usar un anticuerpo de la invención, por ejemplo, in vitro, ex vivo, e in vivo en métodos terapéuticos. En un aspecto, la invención provee métodos para inhibir la actividad de Notch2, es decir, señalización Notch2, ya sea in vivo o in vitro, comprendiendo el método exponer una célula a un anticuerpo anti-Notch2 NRR de la invención bajo condiciones permisivas para la ligadura del anticuerpo a Notch2. En algunas formas de realización, la célula es una célula de cáncer, por ejemplo, una célula B cancerosa o una célula de melanoma. En una forma de realización, un anticuerpo anti-Notch2 NRR de la invención se puede usar para inhibir la actividad de Notch2, comprendiendo el método exponer Notch2 a un anticuerpo anti-Notch2 NRR de la invención de tal modo que se inhibe la actividad de Notch2.

Se puede usar un anticuerpo anti-Notch2 NRR de la invención, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos asociados con la expresión y/o la actividad de Notch2, por ejemplo, trastornos asociados con expresión o actividad aumentada de Notch2, o trastornos en donde la expresión o actividad de Notch2 contribuye a un estado patogénico. Un "trastorno asociado con la expresión o actividad aumentada de Notch2" se refiere a un trastorno en donde la expresión o la actividad aumentada de Notch2 es significativamente mayor que la normal.

En un aspecto, se usa un anticuerpo de la invención para tratar o prevenir el cáncer, por ejemplo, tumores malignos de las células B, melanoma, tumores malignos de las células T (por ejemplo, T-ALL), cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer cervical, cáncer de colon y cáncer pancreático. En algunas formas de realización, se usa un anticuerpo anti-Notch2 NRR para tratar un cáncer, tal como cáncer de mama, un tumor de las células B o melanoma.

En un aspecto adicional, un anticuerpo de la invención se usa para tratar o prevenir un cáncer, específicamente un tumor sólido que contiene células madre de cáncer. Las células madre de cáncer son capaces de proliferar para dar lugar a células madre de cáncer adicionales así como también a otras poblaciones de células tumorales. Ver, Al-Hajj et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 100: 3983-3988 (2003). Se cree que las células madre de cáncer contribuyen a la recurrencia de los cánceres y a la resistencia de los cánceres a las terapias con fármacos. Los receptores Notch han sido identificados como marcadores de las células madre de cáncer y como un objetivo para eliminar las células madre de cáncer responsables de la formación y recurrencia de los tumores sólidos. Ver, WO 2008/091641. Tales tumores sólidos incluyen, pero no están limitados a, los cánceres de mama, colon, pancreático, de próstata, pulmón, cabeza y cuello, rectal, y colorrectal.

En un aspecto, la invención provee métodos para tratar un cáncer que comprende administrar a un individuo que lo requiere una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención. En algunas formas de realización, un método para tratar un cáncer comprende administrar a un individuo que lo requiere una cantidad efectiva de una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y, opcionalmente, por lo menos un agente terapéutico adicional, tal como aquellos provistos más abajo.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar o bien solos o en combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser co-administrado con por lo menos un agente terapéutico adicional y/o adyuvante. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-Notch1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Notch1 NRR) es administrado con un agente terapéutico adicional que inhibe o reduce la diferenciación celular intestinal alterada que de otro modo sería inducida por un anticuerpo anti-Notch1 de este tipo. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es dexametasona o tamoxifeno. Tal terapia de combinación sería útil, por ejemplo, para tratar trastornos angiogénicos, incluyendo angiogénesis asociada a tumores y cáncer. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-Notch2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Notch2 NRR) es administrado con un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente quimioterapéutico. Tal terapia de combinación sería útil, por ejemplo, para tratar el cáncer, tal como los tumores malignos de las células B y el melanoma.

Tales terapias combinadas indicadas más arriba comprende la administración combinada (en donde dos o más agentes terapéuticos están incluidos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración separada, en donde sea el caso, la administración del anticuerpo de la invención puede ocurrir antes de, simultáneamente, y/o después de, la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Los anticuerpos de la invención también se pueden usar en combinación con terapia radiante.

En un aspecto, por lo menos algunos de los anticuerpos de la invención pueden ligar a Notch2 de una especie distinta de la humana. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención se pueden usar para ligar a Notch2, por ejemplo, en un cultivo de células de mamíferos que expresa Notch2 endógeno o recombinante, en humanos, o en otros mamíferos que tienen un Notch2 con el cual reacciona en forma cruzada un anticuerpo de la invención (por ejemplo, los monos chimpancé, baboon, marmoset, cynomolgus y rhesus, cerdo, rata o ratón).

En una forma de realización, un anticuerpo de la invención se usa en un método para ligar Notch2 en un individuo que padece un trastorno asociado con la expresión y/o actividad de Notch2 aumentada, el método comprende administrar al individuo el anticuerpo, de tal modo que se liga el Notch2 en el individuo. En una forma de realización, el Notch2 es Notch2 humano, y el individuo es un individuo humano. Alternativamente, el individuo puede ser un mamífero que expresa Notch2 al cual se liga un anticuerpo de la invención. Además, el individuo puede ser un mamífero en el cual se ha introducido Notch2 (por ejemplo, por administración de Notch2 o por expresión de un transgén que codifica Notch2).

Un anticuerpo de la invención puede ser administrado a un ser humano para propósitos terapéuticos. Además, un anticuerpo de la invención puede ser administrado a un mamífero no humano que expresa Notch2 con el cual reacciona en forma cruzada el anticuerpo (por ejemplo, un primate, un cerdo, una rata o un ratón) para propósitos veterinarios o como un modelo animal de una enfermedad humana. Con respecto a esto último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de la invención (por ejemplo, probando las dosificaciones y los tiempos de administración).

Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico o adyuvante adicional) puede ser administrado por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si desea, para tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, endovenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo es administrado adecuadamente para infusión por pulsos, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones endovenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de que la administración sea breve o crónica.

La ubicación del objetivo de ligadura de un anticuerpo de la invención puede tomarse en consideración en la preparación y la administración del anticuerpo. Cuando el objetivo de ligadura es una molécula intracelular, algunas formas de realización de la invención proveen que se introduzca el anticuerpo o fragmento que liga el antígeno del mismo en la célula en donde está ubicado el objetivo de ligadura. En una forma de realización, un anticuerpo de la invención se puede expresar en forma intracelular como un intracuerpo. El término "intracuerpo", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo o una parte del mismo que liga un antígeno, que se expresa intracelularmente y que es capaz de ligarse selectivamente a una molécula objetivo, como se describe, por ejemplo, en Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); patentes U.S. Nros. 6.004.940 y 6.329.173; publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. 2003/0104402 y publicación PCT Nro. WO2003/077945. Ver también, por ejemplo, la WO96/07321 publicada el 14 de marzo de 1996, referida al uso de la terapia génica para generar anticuerpos ¡ntracelulares.

La expresión intracelular de un intracuerpo puede ser efectuada introduciendo un ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado o una parte del mismo que liga un antígeno (que no tiene la secuencia líder de tipo salvaje y señales secretoras asociadas normalmente con el gen que codifica el anticuerpo o el fragmento que liga el antígeno) en una célula objetivo. Uno o más ácidos nucleicos que codifican todo o una parte de un anticuerpo de la invención pueden ser suministrados a una célula objetivo, de tal modo que se expresan uno o más intracuerpos que son capaces de ligarse a un polipéptido objetivo intracelular y modular la actividad del polipéptido objetivo. Se puede usar cualquier método estándar para introducir ácidos nucleicos en una célula, incluyendo, pero no limitado a, microinyección, inyección balística, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, liposomas y transfección con vectores retrovirales, adenovirales, virales adenoasociados y vacunales que portan el ácido nucleico de interés.

En algunas formas de realización, el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) puede ser introducido en células de un paciente por métodos in vivo y ex vivo. En un ejemplo de suministro in vivo, el ácido nucleico es inyectado directamente en el paciente, por ejemplo, en el sitio en el que se requiere la intervención terapéutica. En otro ejemplo de suministro in vivo, el ácido nucleico es introducido en una célula usando transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus del Herpes simplex I o virus adenoasociado) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia del gen mediada por lípidos son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). Para un panorama de algunos protocolos de marcación de genes y de terapia con genes, ver Yerson et al., Science 256:808-813 (1992) y WO 93/25673 y las referencias allí citadas. En un ejemplo de tratamiento ex vivo, se retiran células del paciente, se introduce ácido nucleico en esas células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente o bien directamente o, por ejemplo, encapsuladas con membranas porosas que son implantadas en el paciente (ver, por ejemplo, patentes U.S. Nros. 4.892.538 y 5.283.187). Un vector usado comúnmente para el suministro ex vivo de un ácido nucleico es un vector retroviral.

En otra forma de realización, se provee la internalización de anticuerpos. Los anticuerpos pueden poseer algunas características que aumentan el suministro de anticuerpos en células, o pueden ser modificados para poseer tales características. Las técnicas para lograr esto son conocidas en el arte. Por ejemplo, se conoce la cationización de un anticuerpo para facilitar su captación en células (ver, por ejemplo, patente U.S. Nro. 6.703.019). Las lipofecciones o los liposomas también se pueden usar para suministrar el anticuerpo a las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpos, puede ser ventajoso el fragmento inhibidor más pequeño que se liga específicamente a la proteína objetivo. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas de péptidos que retienen la capacidad para ligar a la secuencia de proteína objetivo. Tales péptidos pueden ser sintetizados químicamente y/o producidos por tecnología de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).

El ingreso de anticuerpos en las células objetivo puede aumentarse mediante otros métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, algunas secuencias, tales como las derivadas de HIV Tat o la proteína homeodominio de Antennapedia son capaces de dirigir una captación eficiente de proteínas heterólogas a través de las membranas celulares. Ver, por ejemplo, Chen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329.

Cuando el objetivo de ligadura de un anticuerpo está ubicado en el cerebro, algunas formas de realización de la invención permiten que el anticuerpo atraviese la barrera hematoencefálica. Existen varias propuestas conocidas en el arte para transportar moléculas a través de la barrera hematoencefálica, incluyendo, pero no limitado a, métodos físicos, métodos basados en lípidos, métodos basados en células madres y métodos basados en receptores y basados en canales.

Los métodos físicos para transportar un anticuerpo a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no están limitados a, círcumvenir la barrera hematoencefálica completamente, o crear aberturas en la barrera hematoencefálica. Los métodos de circunvención incluyen, pero no están limitados a, inyección directa en el cerebro (ver, por ejemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)), suministro aumentado por infusión/convección intersticial (ver, por ejemplo, Bobo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 2076-2080 (1994)), e implante de un dispositivo de suministro en el cerebro (ver, por ejemplo, Gilí et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); y Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Métodos para crear aberturas en la barrera incluyen, pero no están limitados a, ultrasonido (ver, por ejemplo, publicación de patente U.S. Nro. 2002/0038086), presión osmótica (por ejemplo, por administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A., Implication of theBlood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols. 1 y 2, Plenum Press, N.Y. (1989)), permeabilizacion, por ejemplo, por bradiquinina o permeabilizador A-7 (ver, por ejemplo, patentes U.S. Nros. 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206, y 5.686.416), y transfección de neuronas que atraviesan la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican el anticuerpo (ver, por ejemplo, publicación de patente U.S. Nro. 2003/0083299).

Los métodos basados en lípidos para transportar un anticuerpo a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no están limitados a, encapsular el anticuerpo en liposomas que son acoplados a fragmentos que ligan el anticuerpo que se ligan a receptores en el endotelio vascular de la barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo, publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. 20020025313) y recubrir el anticuerpo con partículas de lipoproteínas de baja densidad (ver, por ejemplo, publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. 20040204354) o apolipoproteína E (ver, por ejemplo, publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. 20040131692).

Los métodos basados en células madres para transportar un anticuerpo a través de la barrera hematoencefálica comprenden células progenitoras neurales creadas por ingeniería genética (NPCs) para expresar el anticuerpo de interés y luego implantar las células madre en el cerebro del individuo a ser tratado. Ver Behrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 de diciembre de 2005, publicación adelantada online (informando que las NPCs creadas por ingeniería genética para expresar el factor neurotrófico GDNF redujeron síntomas de la enfermedad de Parkinson cuando se implantaron en los cerebros de modelos de roedores y primates).

Los métodos basados en receptores y canales para transportar un anticuerpo a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no están limitados a, usar bloqueadores de glucocorticoides para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo, publicación de las solicitudes de patentes U.S. Nros. 2002/0065259, 2003/0162695 y 2005/0124533); activar los canales de potasio (ver, por ejemplo, publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. 2005/0089473), inhibir los transportadores de fármaco ABC (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. 2003/0073713); recubrir los anticuerpos con una transferrina y modular la actividad del uno o más receptores de transferrina (ver, por ejemplo, publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. 2003/0129186) y cationizar los anticuerpos (ver, por ejemplo, patente U.S. Nro. 5.004.697).

Los anticuerpos de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular a ser tratado, el mamífero particular a ser tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el esquema de administración y otros factores conocidos por los médicos clínicos. El anticuerpo no necesita estar, pero está opcionalmente formulado con uno o más agentes que se usan comúnmente para evitar o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores comentados más arriba. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y con las vías de administración que se describieron en la presente, o aprox. de 1 a 99% de las dosis descriptas en la presente, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente como apropiada.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, el tipo de anticuerpo, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo es administrado para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico. El anticuerpo es administrado adecuadamente al paciente una sola vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aprox. 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser la dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede oscilar entre aprox. 1 pg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para las administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantendría generalmente hasta que ocurra una la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ilustrativa del anticuerpo estaría en el rango de aprox. 0,05 mg/kg a aprox. 10 mg/kg. Así, una o más dosis de aprox. 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) puede ser administrada al paciente. Tales dosis pueden ser administradas en forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de. tal modo que el paciente recibe de aprox. dos a aprox. veinte, o por ejemplo, de aprox. seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar también una dosis de carga inicial superior, seguida por una o más dosis menores. Un régimen de dosificación ilustrativo comprende la administración de una dosis de carga inicial de aprox. 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aprox. 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, también pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia es monitoreado fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de los métodos terapéuticos arriba mencionados puede ser llevado a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de, o además de, un anticuerpo anti-Notch2. 3. Ensayos Los anticuerpos anti-Notch2 NRR de la invención pueden ser caracterizados por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por varios ensayos conocidos en el arte. a) Ensayos de actividad En un aspecto, se proveen ensayos para identificar anticuerpos anti-Notch2 (por ejemplo, anticuerpos anti-Notch2 NRR) que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, inhibición o reducción de la actividad de Notch2, por ejemplo, señalización por Notch2. También se proveen los anticuerpos que tienen tal actividad biológica in vivo y/o in vitro.

En algunas formas de realización, se testea un anticuerpo anti-Notch2 NRR de la invención con respecto a su capacidad para inhibir la generación de células B de la zona marginal. Un ensayo ilustrativo se provee en los Ejemplos. En algunas otras formas de realización, se testea un anticuerpo de la invención con respecto a su capacidad para inhibir la expresión de un gen reportero que es responsable de la señalización por Notch2. Un ensayo ilustrativo se provee en los Ejemplos. b) Ensayos de ligadura y otros ensayos En un aspecto, se testea un anticuerpo de la invención con respecto a su actividad de ligadura de un antígeno, por ejemplo, por métodos conocidos tales como ELISA, transferencia Western, etc. En otro aspecto, los ensayos de competencia pueden ser usados para identificar un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) que compite con un anticuerpo de la invención. En una forma de realización, un anticuerpo compite con el Anticuerpo D, el Anticuerpo D-1 , el Anticuerpo D-2 o el Anticuerpo D-3 por la ligadura a Notch2. En una forma de realización como ésta, un anticuerpo que compite se liga al mismo epitopo (por ejemplo, un epitopo lineal o un epitopo conformacional) que está ligado por el Anticuerpo D, el Anticuerpo D-1 , el Anticuerpo D-2 o el Anticuerpo D-3. En otra forma de realización, un anticuerpo que compite se liga al mismo epitopo (por ejemplo, un epitopo lineal o un epitopo conformacional) que está ligado por un anti-NRR1 como se describe en Ejemplo B(5), es decir, un epitopo que comprende los dominios LNR-A, LNR-B y HD-C de Notchl NRR. Los ensayos de competencia ilustrativos incluyen, pero no están limitados a, ensayos de rutina tales como aquellos provistos en Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual c.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Métodos ilustrativos detallados para mapear un epitopo al cual se liga un anticuerpo se proveen en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Se dice que dos anticuerpos "se ligan al mismo epitopo" si cada uno bloquea la ligadura del otro en un 50% o más.

En un ensayo de competencia ilustrativo, Notch2 NRR inmovilizado es incubado en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se liga a Notch2 NRR (por ejemplo, el Anticuerpo D, el Anticuerpo D-1 , el Anticuerpo D-2 o el Anticuerpo D-3) y un segundo anticuerpo no marcado que está siendo testeado con respecto a su capacidad para competir con el primer anticuerpo para ligarse a Notch2 NRR. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como un control, Notch2 NRR inmovilizado es incubado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de incubación bajo condiciones permisivas para la ligadura del primer anticuerpo a Notch2 NRR, se retira el exceso de anticuerpo no ligado, y se mide la cantidad de marcador asociado con el Notch2 NRR inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el Notch2 NRR inmovilizado está sustancialmente reducida en la muestra de prueba con respecto a la muestra control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo para ligarse a Notch2 NRR.

En un aspecto, los anticuerpos de la invención pueden ser caracterizados adicionalmente por una serie de ensayos que incluyen, pero no están limitados a, secuenciación N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía líquida de alta presión de exclusión de tamaño no desnaturalizante (HPLC), espectrometría de masas, cromatografía de intercambio de iones y digestión con papaína.

Se entiende que cualquiera de los ensayos arriba mencionados puede ser llevado a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de, o además de, un anticuerpo anti-Notch2 NRR.

E. Artículos de manufactura En otro aspecto de la invención, se provee un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descriptos más arriba. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de envase en, o asociado con, el recipiente. Recipientes adecuados incluyen, por. ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar hechos de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente aloja una composición que es por sí misma o combinada con otra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y puede tener una abertura de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución endovenosa o un vial que tiene un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención. La etiqueta o el inserto del envase indica que la composición se usa para tratar la condición de elección. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer recipiente con una composición allí contenida, en donde la composición comprende un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición allí contenida, en donde la composición comprende otro agente citotóxico o agente terapéutico de otro modo. El artículo de manufactura en esta forma de realización de la invención puede comprender además un inserto del envase que indica que las composiciones pueden ser usadas para tratar una condición particular. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un búfer farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina con búfer fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros búferes, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

IV. EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden llevar a la práctica varias otras formas de realización, en base a la descripción general brindada más arriba.

A. Materiales y Métodos 1. Generación de anticuerpos anti-Notch2 NRR Selección y rastreo de la biblioteca para identificar a los anticuerpos anti-Notch2 NRR Se usaron para el paneo bibliotecas de anticuerpos de fagos humanos con diversidades sintéticas en las regiones determinantes de complementariedad seleccionadas (H1 , H2, H3, L3), que simulan la diversidad natural del repertorio de IgG humana. Los fragmentos Fab fueron desplegados en forma bivalente en la superficie de partículas de bacteriófagos M13. (Ver Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073-1093 (2004).) Los fragmentos de Notch2 NRR fueron expresados como proteínas segregadas fusionadas a etiquetas de epitopos (FLAG o 6xHis) usando el sistema de vector de expresión de baculovirus o células 293T, purificados a >90% de pureza usando cromatografía de afinidad y testeados con respecto a la falta de agregación usando dispersión de luz. Las secuencias de los antígenos Notch2 NRR eran como sigue: FLAG-Notch2-NRR-Humano-6xHis: KDDDDKGSGDVCPQMPCLNGGTCAVASNMPDGFICRCPPGFSGARCQS SCGQVKCRKGEQCVHTASGPRCFCPSPRDCESGCASSPCQHGGSCHP QRQPPYYSCQCAPPFSGSRCELYTAPPSTPPATCLSQYCADKARDGVCD EACNSHACQWDGGDCSLTMENPWANCSSPLPCWDYINNQCDELCNTVE CLFDNFECQGNSKTCKY DKYCADHFKDNHCNQGCNVERCGWDGLDCAADQPENLAEGTLVIWLM PPEQLLQDARSFLRALGTLLHTNLRIKRDSQGELMVYPYYGEKSAAMKKQ RM TRRSLPGEQEQEVAGSKVFLEIDNRQCVQDSDHCFKNTDAAAALLASHAI QGTLSYPLVSWSESLTPERTEFGLVPRGSGHHHHHH (SEQ ID NO:73) Notch2-NRR-de ratón-FLAG: ADVCPQKPCLNGGTCAVASNMPDGFICRCPPGFSGARCQSSCGQVKCR RGEQCIHTDSGPRCFCLNPKDCESGCASNPCQHGGTCYPQRQPPHYSC RCPPSFGGSHCELYTAPTSTPPATCQSQYCADKARDGICDEACNSHACQ WDGGDCSLTMEDPWANCTSTLRCWEYINNQCDEQCNTAECLFDNFECQ RNSKTCKYDKYCADHFKDNHCDQGCNVERCGWDGLDCASDQPENLAE GTLIIWLLPPEQLLQDSRSFLRALGTLLHTNLRIKQDSQGALMVYPYFGEK SAAMKKQKMTRRSLPEEQEQEQEVIGSKIFLEIDNRQCVQDSDQCFKNTD AAAALLASHAIQGTLSYPLVSVFSELESPRNARRAGSGDYKDDDDKENLY FQ (SEQ ID NO:74) Inmunoplacas Maxisorp Nunc de 96 cavidades fueron recubiertas durante la noche a 4°C con el antígeno objetivo (10 Mg/ml) y fueron bloqueadas durante 1 hora a temperatura ambiente con búfer de bloqueo de fagos PBST (solución salina con búfer fosfato (PBS) y 1 % (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,05% (v/v) tween-20). Las bibliotecas de anticuerpos de fagos VH (ver, por ejemplo, Lee et al., J. Inmunol. Meth. 284:119-132, 2004) y VHA L (ver Liang et al., J. Mol. Blol. 366: 815-829, 2007) se agregaron a las placas de antígenos separadamente y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. El día siguiente las placas recubiertas con antígeno se lavaron diez veces con PBT (PBS con 0,05% de Tween-20) y se ligaron los fagos ligados con 50 mM de HCI y 500 mM de NaCI durante 30 minutos y se neutralizaron con un volumen igual de base Tris 1 M (pH 7,5). Los fagos recuperados fueron amplificados en células de E. coli XL-1 Blue. Durante las rondas de selección subsiguientes, la incubación de fagos de anticuerpo con las placas recubiertas con antígenos se redujo a 2-3 horas, y se aumentó gradualmente la atención estricta del lavado de las placas.

Después de 4 rondas de paneo, se observó un enriquecimiento significativo. Se tomaron 96 clones de cada selección de biblioteca de VH y VH VL para determinar si se habían ligado específicamente al Notch2 NRR humano y al de ratón. Las regiones variables de estos clones fueron secuenciados por PCR para identificar clones de secuencia única.

Las afinidades de los anticuerpos de fagos fueron clasificados usando ELISA de competencia de manchas. Los valores IC50 de los anticuerpos de fagos fueron determinados adicionalmente usando ELISA de ligadura de fagos competitivo. Los anticuerpos de fagos únicos que ligan tanto el Notch2 NRR humano como el de ratón fueron elegidos y reformateados a IgGs de longitud completa para evaluación en un ensayo de células in vitro.

Los clones de interés fueron reformateados en IgGs clonando las regiones VL y VH de clones individuales en el vector LPG3 y LPG4 respectivamente, expresándolos transitoriamente en células CHO de mamíferos y purificándolos con una columna de proteína A.

Bibliotecas de constructos para mejorar la afinidad del anticuerpo D El fagémido pW0703 (derivado del fagémido pV0350-2b (Lee et al., J. Mol.

Biol 340, 1073-1093 (2004)) que despliega el Fab monovalente en la superficie del bacteriófago M13) sirvió como el molde de biblioteca para injertar dominios variables de cadena liviana (VL) y pesada (VH) del Anticuerpo D de la biblioteca VH/VL para maduración de afinidad. Luego se incorporaron codones de detención en la CDR-L3 del molde de la biblioteca. Se usó una estrategia de aleatorización suave para la maduración de afinidad, que introdujo un valor de mutación de aproximadamente 50% en las posiciones seleccionadas usando una estrategia de oligonucleótidos impurificados con 70-10-10-10 mezclas de bases que favorecían a los nucleótidos de tipo salvaje (Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)). Se direccionó específicamente a residuos en las posiciones 28-32 de CDR-L1 , 50 y 53-55 de CDR-L2, 91-94 y 96 de CDR-L3, 28-35 de CDR-H1 , 50-58 de CDR-H2, 95-100 de CDR-H3. También se construyeron tres diferentes bibliotecas con combinaciones de lazos CDR suavemente aleatorizados, L1/L2/L3, L3/H1/H2 y L3/H3.

Estrategia de selección de fagos para generar la mejora de afinidad Para la selección de la mejora de afinidad, se sometieron las bibliotecas de fagos a selección en placas para la primera ronda, seguido por cinco rondas de selección en solución. Las bibliotecas fueron seleccionadas con respecto a Notch2 NRR humano y de ratón separadamente. En la primera ronda de selección de placas, se seleccionaron tres bibliotecas contra placas recubiertas con el objetivo (placa Maxisorp NUNC) separadamente con ingreso de fagos aprox. 3 O.D./ml en 1% de BSA y 0,05% de Tween 20 durante 2 horas a temperatura ambiente. Para la siguiente ronda de selección en solución, 1 O.D./ml de fagos de la primera ronda de selección en placas fueron incubados con 50 nM de proteína objetivo biotinilada (la concentración se basa en el valor IC50 del fago del clon parental) en 100 µ? de búfer gue contenía 1% de Superblock (Pierce Biotechnology) y 0;05% de Tween 20 durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó adicionalmente 10X con 1 % de Superblock y se aplicaron 100 µ?/cavidad a cavidades recubiertas con neutravidina (5 g/ml) durante 15 minutos a temperatura ambiente con suave agitación para capturar los fagos ligados al objetivo biotinilado. Las cavidades se lavaron luego con PBS-0,05% de Tween 20, diez veces. Para determinar la ligadura de base, cavidades control que contenían fagos con objetivos que no fueron biotinilados fueron capturadas en placas recubiertas con neutravidina. Los fagos ligados fueron eluidos con HCI 0,1 N durante 20 minutos, neutralizados con 1/10 volumen de Tris 1 M, pH 11 , titulados y propagados para la ronda siguiente. A continuación se llevaron a cabo cuatro rondas más de selección en solución junto con dos métodos para aumentar la severidad de la selección. El primero de los cuales es para una selección "on-rate" disminuyendo, la concentración de la proteína objetivo biotinilada de 10 nM a 0,5 nM, y el segundo de los cuales es para la selección "off-rate" agregando cantidades en exceso de proteína objetivo no biotinilada (100~500 veces más) para retirar de la competencia ligadores más débiles a temperatura ambiente. Además, se disminuyó el ingreso de fagos (0,1~0,5 O.D/ml) para bajar la ligadura de fagos de base.

ELISA de rastreo de afinidad de alta producción (Competencia de una sola mancha) Se tomaron colonias de la selección de la sexta ronda y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 500 µ?/cavidad de medio 2YT con 50 pg/ml de carbenicilina y 1 E 10/ml de KO7 en placas de 96 cavidades (Falcon). De la misma placa, se tomó una colonia de fagos principales infectados con XL-1 , como control. Las placas de 96 cavidades Nunc Maxisorp fueron recubiertas con 100 µ?/cavidad de proteína Notch2 NRR humana y de ratón (1 pg/ml) separadamente en PBS a 4 °C durante la noche o temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas fueron bloqueadas con 65 µ? de 1% de BSA durante 30 min y 40 µ? de 1 % Tween 20 durante otros 30 minutos.

El sobrenadante de fagos se diluyó 1 :5 en búfer ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado. a enzimas) (PBS con 0,5% de BSA, 0,05% de Tween 20) con o sin 10 nM de proteína objetivo en 100 µ? de volumen total y se incubó por lo menos 1 hora a temperatura ambiente en una placa F (NUNC). Se transfirieron 75 µ? de una mezcla con o sin la proteína objetivo lado a lado con las placas recubiertas con la proteína objetivo. La placa se agitó suavemente durante 15 min para permitir la captura de fagos no ligados a la placa recubierta con la proteína objetivo. La placa se lavó por lo menos cinco veces con PBS-0,05% de Tween 20. La ligadura fue cuantificada agregando anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en búfer ELISA (1 :5000) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS-0,05% de Tween 20 por lo menos cinco veces. A continuación, se agregaron 100 µ?/cavidad de una relación 1:1 de S.S'.S.S'-tetrametilbenzidina (TMB) Peroxidasa sustrato y Peroxidasa Solución B (H2O2) (Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)) a la cavidad y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo agregando 100 µ? de ácido fosfórico 1 M (H3PO4) a cada cavidad y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. La OD (densidad óptica) del color amarillo en cada cavidad se determinó usando un lector de placas ELISA estándar a 450 nm. La reducción de la OD (%) se calculó mediante la siguiente ecuación. reducción de OD45onm (%) = [(OD45onm de cavidades con competidor) / (OD45onm de cavidad sin compet¡dor)]*100 En comparación con la reducción de la OD450nm (%) de la cavidad del fago principal (100%), los clones que tenían la reducción de OD450nm (%) menor que 50% para ambos, el objetivo humano y el de ratón, fueron tomados para análisis de secuencias. Se seleccionaron clones únicos para la preparación de fagos para determinar la afinidad de ligadura (IC50 del fago) contra el Notch2 NRR humano y de ratón por comparación con clones principales. Los clones cón la mayor mejora de la afinidad fueron reformateados en lgG1 humana y expresados en células de mamíferos.

Caracterización de anticuerpos anti-Notch2 NRR (Biacore) Las afinidades de ligadura de anticuerpos anti-Notch2 NRR se midieron por Resonancia del Plasmón Superficial (SRP) usando un instrumento BIAcore™-3000. IgGs humanas anti-Notch2 NRR fueron capturadas por IgG anti-humana de ratón recubierta en el chip sensor CM5 para alcanzar aproximadamente 200 unidades de respuesta (RU). Para las mediciones de cinética, se inyectaron diluciones seriadas dos veces de Notch2 NRR humano y de ratón (3,9 nM a 500 nM) en búfer PBT (PBS con 0,05% de Tween 20) a 25°C con un caudal de 30 µ?/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (/<½) se calcularon usando un modelo de ligadura de Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2). Se calculó la constante de disociación de equilibrio ( D) como la relación kofí/kori. 2. Generación de anticuerpos anti-Notch1 NRR La generación y caracterización de algunos anticuerpos anti-Notch1 NRR ha sido descripta previamente. Ver la publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. US 2009/0081238 A1. 3. ELISA Se usó un anticuerpo anti-Flag para capturar proteína NRR marcada con Flag de los cuatro receptores Notch en una placa altamente ligante, de paredes negras (Greiner). El anticuerpo NRR y los anticuerpos control E25 fueron ligados a las proteínas NRR y se retiraron por lavado con PBS. Se usó un anticuerpo secundario anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina (H+L) (Jackson InmunoResearch) para detectar anti-NRR y E25 ligados. El secundario no ligado se retiró por lavado y se detectó AP con sustrato PNPP (Pierce). 4. FACS Se prepararon plásmidos de expresión en donde el dominio extracelular Notchl o Notch2 y los dominios transmembrana fueron marcados con myc N-terminalmente y expresados bajo el control de un Elemento de Respuesta de Tetraciclina (TRE) corriente arriba de un promotor temprano inmediato de CMV mínimo. Estos plásmidos fueron transfectados en forma estable en células CHO-K1 (Clonetech), creadas por ingeniería para expresar una proteína transactivadora en presencia de doxiciclina que se liga a, y activa, la TRE en el plásmido transfectado. Las células fueron tratadas con 1 mg/ml de doxiciclina o vehículo durante 48 hs, y luego coloreadas con anticuerpos control anti-NRR, anti-myc (9E10, illipore) o E25 y o bien anticuerpos secundarios Alexa 488 o Alexa 647 anti-humanos de cabra (Invitrogen). Después de la coloración, las células se corrieron en una máquina FACScalibur (BD Biosciences) y se recogieron 15000 eventos y se graficaron aberturas de rango para evaluar poblaciones coloreadas en forma positiva y negativa. 5. Ensayo de repórter Notch Células NIH-3T3 transfectadas en forma estable con Notch 1 o transfectadas transitoriamente con plásmidos que contenía otros receptores Notch fueron co-transfectadas con un repórter de luciferasa de luciérnaga TP-1 (12X CSL) que respondía a Notch y un repórter de Renilla Luciferasa constitutivamente activo (pRL-CMV, Promega) para controlar con respecto a la eficiencia de transfección. Se dejaron recuperar las células de la transfección desde 6 horas hasta durante toda la noche. Se usaron tratamientos de anticuerpos y células NIH-3T3 transfectadas en forma estable con ligando para estimular las células receptoras. Después de 20 horas, se midieron la luciferasa de luciérnaga y Renilla con el sistema de ensayo Dual Glo Luciferase (Promega). Se analizaron ocho réplicas para cada condición dividiendo la señal de la luciérnaga por la señal de Renilla para controlar la eficiencia de transfección. Se calcularon las desviaciones promedio y estándar y se normalizaron los valores a valores calculados para cocultivo estimulados con células NIH-3T3 sin ligando transfectado. 6. Mapeo de epitopos Se diseñaron secuencias sintéticas de Notchl y Notch2 NRR con sitios de restricción únicos en uniones entre los cinco dominios de NRR - LNR-A; LNR-B; LNR-C; HD-N; y HD-C - y se produjeron por tecnología Blue Heron Technology (Bothell, WA). El intercambio de varios dominios entre las dos secuencias sintéticas, usando el sitio de restricción creado por ingeniería genética, generó proteínas NRR quiméricas. Los clones quiméricos fueron ensamblados en un vector pUC19 modificado y transferidos a un vector que contenía SEAP, pCSC.AP, para expresión. Las proteínas NRR marcadas con AP se produjeron por transfección de células 293T. Después de 72 hs de cultivo, se recogieron los medios condicionados, se depuraron por centrifugación y se testearon con respecto a actividad AP usando el sistema Fosfa-Light (Applied Biosystems, Bedford, A). La actividad AP en cada muestra se normalizó y se realizó un ELISA para testear la capacidad de a-NRR1 o a-NRR2 para ligar las proteínas NRR quiméricas. El ELISA se realizó como sigue: se capturó o bien a-NRR1 o a-NRR2 por un anticuerpo a-Fc ligado a una placa en un formato de 96 cavidades y se incubó con el medio condicionado durante la noche. La placa se lavó para retirar la proteína no ligada y se testeó la proteína capturada con respecto a la actividad AP usando el sistema Fosfa-Light. La actividad AP resultante se usó para cuantificar la capacidad de cada anticuerpo a-NRR para ligar proteínas quiméricas específicas e inferir epitopos importantes para la ligadura. 7. Ensayo de perlas en gel de fibrina HUVEC Se cultivaron células HUVEC en perlas en gel de fibrina como se describió previamente (Nakatsu et al., 2003). Perlas de Cytodex 3 (Amersham Pharmacia Biotech) se recubrieron con 350-400 HUVECs por perla en 2 mi de medio EGM-2 (Clonetics). Alrededor de 200 perlas recubiertas con HUVEC fueron incorporadas en coágulo de fibrina en una cavidad de una placa de cultivo de tejidos de 12 cavidades. 6 X 104 Detroit 551 células de fibroblastos fueron colocadas en placas encima del coágulo y medio que contenía o bien 5 ug/ml de anti-NRR1 , 5 ug/ml de anti-DLL4, 1 uM de DBZ o vehículos control. El medio se cambió cada dos días. Después de siete a nueve días, se fijaron los geles de fibrina con 4% de paraformaldehído y las células endoteliales se colorearon con anti-CD31 (R&D Systems AF806) usando un anticuerpo secundario conjugado con FITC para la detección. 8. Ensayo in vivo retinal neonatal Se inyectó i.p. en neonatos CD1s a P1 y P3 con 10 mg/kg de control de ambrosía o 20 mg/kg de Notch-1. Se recogieron los ojos a P5 y se fijaron con 4% de PFA. Se disecaron las retinas, se bloquearon (5% de BSA, 0,5% de Tritón X-100) durante una hora, seguido por tratamiento durante 10 min con citrato de sodio 1 M. Se incubaron luego las retinas durante la noche a 4 °C con ¡solectina biotinilada B4 (Sigma) y anticuerpo Ki67 (NeoMarkers). Subsiguientemente se lavaron las retinas y se colorearon con estreptavidina Alexa 488 y Cy3 anti-conejo de cabra en 1 % de BSA, 0,5% de Tritón X-100. Se colocaron las retinas en forma plana y se tomaron imágenes usando un microscopio de epifluoresencia. 9. Estudios de tumores in vivo Las líneas celulares de tumores humanos Calu-6 y HM7 fueron cultivadas en Ham's F12, DMEM 1 :1 de bajo contenido de glucosa suplementado con 10% v/v de FBS, 1% v/v de penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-Gln y 1 pg/ml de Fungizone™ (Invitrogen™, CA). Las células fueron incubadas a 37 °C en una atmósfera de 95% de aire/5% de CO2. Para experimentos de xenoinjertos en el ratón, se suspendieron células tumorales a una concentración de 1 x 108 o 1 x 109 células/ml y se inyectaron (100 µ?/ratón) subcutáneamente en el flanco dorsal de ratones desnudos Balb-c (Harían Sprague Dawley, IN). Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 400 mm3, se seleccionó al azar un grupo (n = 10) como controles del día 0. Los ratones restantes se dividieron en grupos de 10 ratones, y se les administró el anticuerpo de fago Anti- Notcht i.p. a la dosis de 10 mg/kg dos veces por semana. Los tumores transplantados se midieron dos veces por semana a lo largo del eje más largo y el eje perpendicular como se describió. Para cada día en el cual se midieron los tumores, se calculó el volumen del tumor para cada ratón, y la media de volumen del tumor de cada grupo de anticuerpo control (anti-ambrosía), anti-VEGF se comparó con la media de volumen de los ratones tratados con Anti- Notchl por medio de la prueba t de Dunnett implementada en el sistema de análisis estadístico JMPTM (versión 5.1 para Windows; SAS Institute, Cary, NC), a un nivel de P < 0,05. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó 2.000 mm3. Los tumores fueron seccionados por criostato a 7 micrpnes, se fijaron con acetona y se colorearon con DAPI (Invitrogen), anti-CD31 de hámster (Serotech, Inc.) y un secundario Cy3 anti-hámster (Jackson Inmunolabs). Se montaron las diapositivas con un Medio de Montaje Fluorescente (Dako). Se tomaron imágenes con un microscopio Zeiss Axioskop2 y se analizaron por ImageJ para el área de coloración con DAPI y la coloración con Cy3. La coloración con Cy3 se dividió por el área de coloración con DAPI para normalizar el número de células presente y los valores fueron normalizados al tumor tratado anti-ambrosía. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el "Institutional Animal Care and Use Committee". 10. Análisis de las células B de la zona marginal A ratones Balb-c (Jackson) de 12 semanas se les inyectaron i.p. dos veces por semana durante dos semanas 5 mg/kg de anti-gD, anti-NRR1 o anti-NRR2. Se aislaron los esplenocitos de los ratones y se colorearon para FACS con B220-PerCP, CD23-PE y CD21-FITC (BD Biosciences) como se describió previamente (Saito, et al., Immunity, Vol. 18, 675-685, Mayo 2003). 11. Histología e inmunohistoquímica de tejido del intestino de ratón A seis grupos de seis ratones C57BL/6 (Jackson) de 10 semanas se les administró o bien MCT cada día por medio, DBZ a 30 umoles/kg cada día por medio, Anti-NRR1 a 10, 2, o 0,4 mg/kg o control Anti-gD (HSV-1 ) a 10mg/kg los días 0, 2 y 6, o como se indique de otra manera. Tejidos del intestino delgado de ratón embebido en parafina y fijado en formalina fueron seccionados con un espesor de 3 micrones. La identificación histoquímica de los tipos celulares intestinales se realizaron con azul Alción según recomendación del fabricante (PoliScientific). Para la coloración de anti-K¡67, las secciones se trataron previamente con "Target Retrieval Solution" (S1700, DAKO), y se incubaron con anti-K¡67 de conejo (1 :200, clon SP6, Neomarkers). Se detectó anti-conejo de cabra secundario a 7,5 pg/ml (Vector labs) con el kit Vectastain ABC Elite Kit (Vector labs). Las secciones coloreadas de Ki67 fueron contracoloreadas con hematoxilina de Mayer. Para la coloración anti-lisozima, se procesaron las secciones en la plataforma Discovery XT (Ventana Medical Systems, Inc.) usando condiciones de recuperación de epitopos CC1 m, detección de OmniMap-conejo y Ventana hematoxilina ll/con contracoloreado azulado. Para la coloración HES-1 , anti-rat HES-1 (clon NM1 , MBL, International) fue seguido por TSA-HRP.

B. Resultados 1. Generación de anticuerpos sintéticos que están direccionados específicamente a las regiones reguladoras negativas Notchl y Notch 2 Para permitir el antagonismo independiente de señalización por Notchl y Notch2 en seres humanos y ratones, usamos despliegue de fagos para direccionar el NRR y seleccionar con respecto a anticuerpos humanos, sintéticos, con las siguientes cualidades. Primero, cada anticuerpo fue seleccionado para inhibir potencialmente su objetivo cognato— Notchl o Notch2— pero no otros receptores Notch. Segundo, los anticuerpos fueron seleccionados para ligarse a secuencias objetivo humanas para permitir el direccionamiento terapéutico. Tercero, para descubrir las consecuencias biológicas de inhibir sistémicamente Notchl o Notch2 in vivo y para estudiar las funciones de estos receptores en modelos de ratón, los anticuerpos fueron coseleccionados para ligarse a las secuencias de ratón ortólogas. Cuarto, para evitar una respuesta inmunológica anti-anticuerpo humano, se clonaron las regiones determinantes de complementariedad en un marco de inmunoglobulina humana.

Siguiendo esta propuesta, aislamos exitosamente anticuerpos anti-Notch1 NRR y anti-Notch2 NRR con cada una de estas propiedades deseadas. Estos anticuerpos tienen varias ventajas con respecto a los inhibidores "pan-Notch" que están direccionados a múltiples receptores Notch, tales como los inhibidores de la ?-secretasa. Debido a que estos anticuerpos distinguen a los receptores Notch individuales, pueden distinguir las distintas funciones de aquellos receptores individuales. Además, los inhibidores pan-Notch muestran efectos colaterales potencialmente ¡ndeseados in vivo debido a la inhibición dual de ambos, Notchl y Notch2, y por lo tanto anticuerpos que son selectivos para Notchl o Notch2 pueden ser candidatos más atractivos para propósitos terapéuticos. Los anticuerpos anti-Notch1 NRR y anti-Notch2 NRR aislados de acuerdo con la propuesta arriba mencionada son descriptos y caracterizados con mayores detalles más abajo: El aislamiento y la caracterización de anticuerpos anti-Notch NRR1 se comenta en la publicación de la solicitud de patente U.S. Nro. US 2009/0081238 A1. Uno de los anticuerpos divulgado en esa solicitud, el "Anticuerpo A-2", fue caracterizado con respecto a su estructura y algunas actividades biológicas. Algunos estudios comentados en esa solicitud son recapitulados en la presente. Por conveniencia, el "Anticuerpo A-2" de la publicación de la solicitud de patenteU.S. Nro. US 2009/0081238 A1 es denominado en la presente "anti-NRR1." El aislamiento y la caracterización de anticuerpos anti-Notch2 NRR se describe en la presente. Se aisló un anticuerpo anti-Notch2 NRR, denominado "Anticuerpo D". Ese anticuerpo fue madurado por afinidad como se describió más arriba, dando por resultado el Anticuerpo D-1 , el Anticuerpo D-2 y el Anticuerpo D-3. La Figura 1 muestra las secuencias HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3 del Anticuerpo D, del Anticuerpo D-1 , del Anticuerpo D-2 y del Anticuerpo D-3. La Figura 2 muestra las secuencias HVR-L1 , HVR-L2 y HVR-L3 del Anticuerpo D, del Anticuerpo D-1 , del Anticuerpo D-2 y del Anticuerpo D-3. La Figura 3 muestra las secuencias de región variable de cadena pesada del Anticuerpo D, del Anticuerpo D-1 , del Anticuerpo D-2 y del Anticuerpo D-3. La Figura 4 muestra las secuencias de la región variable de cadena liviana del Anticuerpo D, del Anticuerpo D-1 , del Anticuerpo D-2 y del Anticuerpo D-3. Por conveniencia, el Anticuerpo D-3 es denominado en la presente "anti-NRR2." Las mediciones de las afinidades de ligadura usando la resonancia del plasmón superficial (SPR) revelaron que el anti-NRR1 se ligó con afinidades similares y altas (Kd = 3 nM) a las proteínas NRR1 purificadas dé la secuencia humana y de ratón. Observamos una afinidad similar (Kd = 5 nM) con respecto a los antígenos NRR2 en ensayos de anti-NRR2. La ligadura de ambos anticuerpos pareció altamente específica para el receptor cognato; no se detectó ligadura a las secuencias humanas o de ratón de cualquiera de los otros tres receptores no direccionados tanto para anti-NRR1 como para anti-NRR2 usando una variedad de técnicas, incluyendo SPR, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y la selección celular activada con fluorescencia (FACS) (Figura 9 y datos no mostrados). Por ejemplo, los resultados de ELISA mostraron que el anti-NRR1 se ligó igualmente bien a las proteínas Notch1-NRR humana y de ratón purificadas, observándose una ligadura semi-máxima a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,1 pg/ml. El anti-NRR1 no se ligó en forma detectable a las proteínas Notch2 NRR, Notch3-NRR o Notch4-NRR humanas o de ratón purificadas, aún a la mayor concentración de anticuerpo testeada (Figura 9A, panel izquierdo), a pesar del hecho de que las secuencias de Notch1-NRR humana y Notch2 NRR humana son 45% idénticas (Figura 18). Observamos resultados similares para anti-NRR2, que se ligó específicamente a las proteíns Notch2 NRR pero no a las proteínas NRR de los otros receptores Notch (Figura 9A, panel derecho).

Para determinar si anti-NRR1 y anti-NRR2 también se ligan específicamente a los receptores de longitud completa expresados en la superficie de las células, usamos selección celular actividad con fluorescencia (FACS). Evaluamos la ligadura a Notchl o Notch2, llevando cada una una etiqueta de epitopo myc en el término N para distinguir los receptores Notch transgénicos de los receptores Notch expresados endógenamente (particularmente Notch2, que fue expresado por las células K1-CHO). La expresión del receptor fue inducida en células K1-CHO que se dejaron o bien no transfectadas (Figura 9B, Paneles 1 , 4, 7 y 10), transfectadas con myc-Notch1 (Figura 9B, Paneles 2, 5, 8 y 11 ) o transfectadas con myc-Notch2 (Figura 9B, Paneles 3, 6, 9 y 12). La ligadura de anti-NRR1 a células myc-positivas se observó en las células myc-N1 (Figura 9B, panel 2), pero no en las células principales K1-CHO (Figura 9B, panel 1 ) y sólo después de inducción (Figura 9B, comparar paneles 2 y 5), indicando que el anti-NRR1 se ligó específicamente a Notchl . Por contraste, aunque la expresión de myc-Notch2 fue claramente inducida en las células myc-N2 (Figura 9B, comparar paneles 3 y 6), el anti-NRR1 no se ligó a myc-Notch2 (Figura 9B, comparar paneles 2 y 3). Realizamos un análisis similar usando anti-NRR2 (Figura 9B, paneles 7-12), aunque este análisis fue complicado por la expresión que falla de myc-Notch2 en ausencia de inducción (Figura 9B, paneles 6 y 12) y la expresión endógena de Notch2 de hámster en la línea K1-CHO (Figura 9B, comparar paneles 7 y 10 con los paneles 1 y 4). No obstante, el anti-NRR2 se ligó significativamente sólo a células que expresan myc-Notch2 después de la inducción, consistente con la ligadura específica a Notch2 (Figura 9B, comparar panel 9 con los paneles 8 y 12). Considerados en conjunto, nuestros resultados de ligadura usando proteínas NRR purificadas así como también la expresión de la superficie celular de los receptores de longitud completa demuestran que el anti-NRR1 se liga específicamente a Notch1-NRR1 y no a Notch2 NRR, e igualmente, que el anti-NRR2 se liga específicamente a Notch2 NRR y no a Notch1-NRR. Esta especificidad es sustentada adicionalmente por los numerosos estudios estructurales y funcionales descriptos más abajo. 2. Función anti-NRR1 y anti-NRR2 como inhibidores potentes y específicos de la señalización por Notchl y Notch2 in vitro Para evaluar si los anticuerpos anti-NRR afectaron la señalización por Notch, usamos primero un ensayo de cocultivo que empleó líneas celulares NIH-3T3 creadas por ingeniería genética para expresar Jag1 , como el ligando Notch, o bien Notchl (Figura 10A) o Notch2 (Figura 10B) como el receptor Notch. Los ensayos reflejaron con exactitud la señalización por Notch porque una fuerte señal repórter de Notch (luciferasa de luciérnaga) dependía de la presencia de ambas, las células que expresan los ligandos y los receptores (Figuras 10A y B, comparar -Jag1 con + Jag1 ), y el nivel repórter se redujo a la base cuando se incluyó un GSI (inhibidor de ?-secretasa) (Figuras 0A y B, comparar DMSO con DAPT).

La adición de cantidades crecientes de anti-NRR1 inhibió las señalización en las células Notchl , observándose inhibición completa a una concentración de anticuerpo entre 80 y 400 ng/ml (Figura 10A). Un anticuerpo humano control no inhibió la señalización (Figura 10A, comparar a-gD con titulación a-NRR1 ), como lo hicieron numerosos otros anticuerpos dirigidos a antígenos distintos de Notchl (datos no mostrados). Para testear adicionalmente si esta actividad inhibidora reflejaba la ligadura anti-NRR1 , preguntamos si la adición de antígeno NRR1 purificado rescataba la señalización en presencia de una concentración inhibidora (80 ng/ml) de anticuerpo anti-NRR1 , compitiendo por la ligadura del anticuerpo a Notchl expresada en las células de señalización. La adición del antígeno NRR1 pero no el antígeno NRR2 (que apareció activo y plegado apropiadamente en otros ensayos; ver Figura 10B) restauró la señalización a niveles control, (Figura 10A, comparar 80 ng/mlde a-NRR1 + NRR1 con 80 ng/ml de a-NRR1 sólo y 80 ng/ml de a-NRR1 + NRR2). Como un control, ni los antígenos NRR1 ni los antígenos NRR2 afectaron la señalización en cocultivos que contenían un anticuerpo control, confirmando que los fragmentos NRR propiamente dichos no tienen un efecto directo en la señalización por Notch (Figura 10A, a-gD + NRR1 y a-gD + NRR2). Usando las células que expresan Notch2 para ensayar la actividad anti-NRR2, observamos resultados similares para la inhibición anti-NRR2 de la señalización por Notch2 (Figura 10B). Ambos anticuerpos inhibieron la señalización inducida a través de todos los ligandos de Notch que hemos testeado, a saber, Jag1 , Jag2, DII1 y DII4 (Figura 16 y datos no mostrados). Considerados en conjunto, estos resultados demuestran que anti-NRR1 y anti-NRR2 son potentes inhibidores paralogo-específicos de la señalización por Notchl y Notch2, respectivamente. 3. El Anti-NRR1 inhibe la señalización a través de las dos clases principales de receptores dé mutantes hallados en T- ALLs Un mecanismo a través del cual se ha demostrado que la señalización por Notch afecta directamente la oncogénesis es a través de la activación mutacional de la señalización por Notchl en T-ALL. En particular, las mutaciones activadoras de Notchl en T-ALL entran en dos amplias categorías: (1 ) aquellas que truncan el dominio PEST, estabilizando así el ICD y aumentando la señalización de una manera dependiente de un ligando, y (2) aquellas que desestabilizan el NRR, permitiendo así la división de ADAM y estimulando la señalización de una manera independiente del ligando. Para testear si el anti-NRR1 puede abrogar la señalización a través de tales receptores mutantes, modificamos el ensayo de cocultivo para expresar el Notch1-WT (Notchl tipo salvaje), Notchl -APEST (Notchl que no tiene el dominio PEST) o Notch1-L1594P (Notchl que porta la mutación L1594P en el dominio de heterodimerización (HD) del NRR). Como se observó para la señalización por Notchl tipo salvaje (Figura 10C, panel superior), el anti-NRR1 inhibió completamente la señalización dependiente del ligando y la independiente del ligando a través de Notchl-APEST y Notch1-L1594P (Figura 10C, paneles central e inferior). Así, el anti-NRR1 antagoniza la señalización a través de ambas clases de receptores mutantes, incluyendo la mutación L1594P que está comprendida y desestabiliza el mismo dominio direccionado por el anticuerpo. 4. Anti-NRR1 y anti-NRR2 funcionan como inhibidores potentes y específicos de la señalización por Notchl y Notch2 in vivo Para determinar si el anti-NRR1 y el anti-NRR2 funcionan como inhibidores específicos de los receptores in vivo, investigamos cómo afectaron los anticuerpos las decisiones de destino de las células para las cuales las técnicas genéticas establecieron un rol para Notchl o Notch2. Específicamente, la inactivación condicional de Notchl o Notch2 reveló previamente que Notchl es clave para determinar un destino de las células T versus B durante el desarrollo linfoide, mientras que Notch2 se requiere para generar las células B de la zona marginal esplénica (MZB). Consistente con una función crucial para Notchl en el desarrollo de las células T, hallamos que el tratamiento de los ratones con anti-NRR1 , pero no anti-NRR2, redujo significativamente los pesos del timo (Figuras 11A y B). Igualmente, el anti-NRR1 , pero no el anti-NRR2, redujo en forma notable el número total de células en el timo (Figura 11 B) e inhibió casi completamente la generación de células T dobles-positivas CD4+/CD8+ (Figura 11 C).

Por contraste, los efectos del anticuerpo fueron revertidos cuando se examinaron las células MZB. El tratamiento con anti-NRR2 casi eliminó las células MZB (0,97 +/- 0,45 en comparación con el valor control de 6,61 +/- 0,25), reduciendo la población aún más notablemente que lo hizo la proteína de fusión Fe del receptor de la linfotoxina-ß recombinante (LTpR) purificada (3,48 +/- 0,06), que sirvió como un control positivo (Figura 11 D). Este efecto inhibidor fue específico para anti-NRR2 porque el anti-NRR1 no redujo de manera significativa la población de MZB (6,00 +/- 0,44) con relación al anticuerpo control anti-gD (6,61 +/- 0,25; Figura 11 D). Considerados en conjunto, estos estudios in vivo indican que ambos anticuerpos son potentes inhibidores de sus objetivos respectivos que pueden inducir cambios biológicamente significativos en las decisiones de los destinos de las células; además porque el anti-NRR1 afecta la generación de las células T pero no de las células MZB, mientras que el anti— NRR2 afecta la generación de MZB pero no las células T, cada anticuerpo funciona específicamente para su objetivo previsto in vivo. 5. Una estructura cocristalina revela que el antí-NRR1 puentea los dominios LNR y HD-C y probablemente estabiliza el NRR "fuera" de la conformación Para elucidar la especificidad de ligadura de anti-NRR1 y anti-NRR2 y obtener una comprensión del mecanismo en la actividad antagonista del anticuerpo, testeamos la ligadura de ambos anticuerpos a una batería de proteínas NRR quiméricas. Específicamente, preparamos NRRs quiméricos por intercambio de cada uno de los subdominios de NRR (LNR-A, LNR-B, LNR-C, HD-N y HD-C) entre Notchl y Notch2, expresamos estas quimeras como proteínas segregadas fusionadas a fosfatasa alcalina para fácil detección, y ensayamos la ligadura de cantidades normalizadas de cada NRR quimérico a anti-NRR1 o ant¡-NRR2. De los 26 NRRs quiméricos que expresamos, 17 fueron detectados eficientemente como proteínas segregadas (Figura 12A), 7 fueron detectados débilmente y 2 no fueron detectados por encima de la base (Figura 17), sugiriendo que la mayoría pero no todos los NRRs quiméricos fueron expresados, plegados adecuadamente y segregados. El intercambio del dominio LNR-A individual de NRR2 en el esqueleto de NRR1 interrumpió la ligadura de anti-NRR1 (Figura 12A, quimera BC.Hd y todos los otros con LNR-A de NRR2), indicando que los contactos anti-NRR1 con el subdominio LNR-A de NRR1 son esenciales para la ligadura. Por contraste, el intercambio de los dominios LNR-C y/o HD-N de NRR2 en NRR1 no afectó la ligadura anti-NRR1 (Figura 12A, quimeras AB.Hd, ABC.Hc y AB.Hc), demostrando que ninguno de estos dominios es esencial para la especificidad de ligadura. Finalmente, AB.Hc era la quimera con la menor cantidad de subdominios NRR1 que soportaba aún la ligadura a anti-NRR1 completa (aunque se observó una ligadura débil a la quimera AB), sugiriendo que la mayoría, y quizás todos, los contactos requeridos para la especificidad de ligadura a anti-NRR1 están contenidos en los dominios LNR-A, LNR-B y HD-C.

La caracterización de anti-NRR2 reveló un patrón de ligadura similar al definido para anti-NRR1 , aunque con algunas claras diferencias. El intercambio del dominio LNR-A de NRR1 en el esqueleto de NRR2 interrumpió completamente la ligadura de anti-NRR2, mientras que los intercambios de LNR-B o LNR-C no tenían efecto; por lo tanto, como fue el caso para el anti-NRR1 , la ligadura de anti-NRR2 requiere el subdominio LNR-A de Notch2. Igualmente, el dominio HD-C de Notch2 también era esencial. Dos diferentes quimeras (C.Hn y BC) con sólo tres subdominios de NRR2 sustentaron la ligadura completa en este ensayo; las dos quimeras comparten los subdominios LNR-A y HD-C de NRR2 y, consistente con esta observación, la quimera que contenía sólo los subdominios LNR-A y HD-C de NRR2 soportó una ligadura débil pero detectable al anti-NRR2. Así, al definir los subdominios que determinan la especificidad de ligadura anti-NRR2, los experimentos de intercambio del dominio: (a) revelan que el LNR-A y el HD-C son los más importantes (necesarios y parcialmente suficientes para la especificidad de ligadura) y (b) sugieren que los contactos del anticuerpo-NRR2 en LNR-B y HD-N también pueden tener un rol.

Para entender mejor la base molecular de la actividad antagonista de anti- NRR1 , determinamos la estructura cristalina de 2,2 A del fragmento Fab del anticuerpo ligado al NRR1 humano. Esta estructura reveló que NRR1 forma una estructura compacta muy similar a la del NRR2 humano, con tres módulos LNR que ligan Ca2+ envueltos alrededor del dominio HD núcleo (Figuras 2B y C). La estructura revela que el efecto aparente de la ligadura de Fab es estabilizar las interacciones de LNR-HD de tal modo que S2 no es accesible para la escisión, manteniendo así la cascada de señalización por Notehl quieta. Esta interpretación es sustentada por la observación de que Fab no obstruye directamente el sitio S2 sino que en cambio se liga a la interfase entre los dominios HD, LNR-A y LNR-B (Figura 12D), consistente con los experimentos de intercambio del dominio (Figura 12A). Esta interfase tapa -2000 A2 del área de superficie accesible con el solvente, dividida en forma igual entre el fab y el NRR1. La cadena pesada de Fab se pone en contacto con LNR-B, la hélice final en el dominio HD-C y la periferia de LNR-A. La CDR H3 anida en la interfase entre LNR-B y HD. En particular, R99 de H3 forma una unión hidrógeno con el esqueleto carbonilo de Phe1501 de LNR-A mientras que la parte alifática de la cadena lateral ¡nteractúa con L1710 del dominio HD. La cadena liviana representa -40% del área de superficie tapada a la que contribuyó el Fab y se pone en contacto con el lazo de conexión antes de la hélice final en el dominio HD así como también LNR-A.

Esta estructura también revela la base de especificidad de Fab con respecto a Notchl por encima de Notch2. A pesar de la identidad de secuencia de -45% entre los dominios NRR de Notchl y Notch2, la mayoría de los residuos involucrados en la interfase son distintos entre las dos proteínas. Por ejemplo, de los 21 residuos de NRR que tapan por lo menos 25% de área de superficie accesible con solvente para ligar Fab, sólo seis son idénticos en Notchl y Notch2. Estos seis residuos contribuyen menos que un cuarto del área de superficie en el epitopo de Fab y son distribuidos en el epitopo (Figuras 12D y 18). 6. La inhibición selectiva de la señalización por Notchl desregula la angiogénesis Para comenzar a explotar los anticuerpos específicos del receptor de Notch para definir la importancia funcional de los receptores individuales in vivo, preguntamos primero si el bloque selectivo de la señalización por Notchl con anti-NRR1 interrumpiría la angiogénesis de los mamíferos. Numerosos informes indican que la vía Notch funciona corriente abajo del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y tiene un rol clave en la angiogénesis regulando la elección del destino celular endotelial entre las células de la punta y el tallo. Los experimentos usando una variedad de herramientas genéticas y bioquímicas, incluyendo los anticuerpos de bloqueo específico de DII4, han establecido el DII4 como el ligando de Notch clave involucrado en la señalización angiogénica de Noten, aunque dos receptores de Notch, Notchl y Notch4, han estado involucrados como receptores para DII4 en la angiogénesis.

Testeamos primero si la inhibición selectiva de Notchl afectaba el brote endotelial in vitro. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) cocultivada con fibroblastos de la piel humana generan brotes con estructuras tipo lumen. Consistente con el trabajo previo, hemos hallado que la inhibición de pan- Notch usando DBZ, un inhibidor de ?-secretasa, así como también el anticuerpo selectivo bloqueador de DII4 aumentó tanto el número como la longitud de los brotes celulares endoteliales. Es importante que el bloqueo selectivo de la señalización por Notchl usando anti-NRR1 generó un fenotipo similar (Figuras 13A y 13B).

Para determinar si el anti-NRR1 afecta la angiogénesis in vivo, usamos un • modelo basado en el desarrollo de la vasculatura retinal en neonatos de ratón. El suministro sistémico de anti-NRR1 interrumpió en forma notable el dedarrollo de la vasculatura retinal en ratones neonatos tratados (Figura 13C). Con relación al tratamiento con un anticuerpo anti-ambrosía control, el tratamiento anti-NRR1 generó una red vascular entremezclada y compacta, densa (Figura 13C, comparar paneles I y III con paneles II y IV, respectivamente). Esta acumulación aumentada de células endoteliales se correlacionó con la proliferación aumentada, como se evaluó marcando con el marcador de proliferación Ki67 (Figura 13C, comparar paneles V y VI). Estas observaciones, incluyendo la densidad vascular aumentada, la acumulación celular endotelial y la proliferación aumentada, todas simulan muy bien aquellas hallados después de la inhibición de DII4 o ?-secretasa usando este mismo modelo de neonato (datos no mostrados) y son consistentes con los resultados de otros estudios, incluyendo el análisis de la vasculatura tumoral (Figuras 13D y 13E) y el ensayo de la bolsa córnea del ratón (datos no mostrados). Nuestros resultados demuestran no sólo que el anti-NRR1 posee potente actividad biológica sino también que la inhibición de Notc sólo, como opuesto a Notch4 o una combinación de Notchl y Notch4, es suficiente para interrumpir notablemente la angiogénesis en mamíferos. 7. El bloqueo selectivo con anticuerpos de Notchl inhibe el crecimiento tumoral en modelos preclínicos Para determinar si el bloque selectivo de Notchl usando anti-NRR1 sería suficiente para inhibir el crecimiento tumoral, usamos modelos tumorales preclínicos y comparamos el crecimiento de tumores establecidos después del tratamiento con anticuerpos anti-NRR1 , anti-VEGF o anti-ambrosía. En los modelos Calu6 y HM7, los grupos tratados con anti-NRR1 mostraron una disminución significativa en el tamaño del tumor con relación a los grupos control, aún en los primeros puntos de tiempo examinados, tres a cuatro días después de la dosis inicial (Figuras 13A-C). En el modelo Calu6, el grupo anti-NRR1 mostró una disminución en el tamaño del tumor, desde aproximadamente 250 mm3 a menos de 100 mm3, similar a la disminución observada en el grupo anti-VEGF; por contraste, los tumores en el grupo control antiambrosía crecieron a un tamaño mayor que 400 mm3 (Figura 14A). Observamos resultados similares usando el modelo HM7 que crecía agresivamente; el tratamiento con anti-NRR1 hizo que el tamaño del tumor permaneciera estático (Figura 14B) o casi estático (Figura 14C) durante 12-13 días, una diferencia notable con relación al crecimiento de seis días de 250 mm3 a más de 900 mm3 que se observó en el grupo control (Figuras 14B y 5C). Observamos una inhibición similar del crecimiento del tumor usando un rango de concentraciones de dosis de anti-NRR1 , entre 20 mg/kg y 2,5 mg/kg, aunque los grupos de 10 y 20 mg/kg mostraron una tendencia hacia una mayor inhibición con relación a los grupos de 2,5 y 5 mg/kg (Figura 14C).

Investigamos los modelos de tumores Calu6 o HM7 porque su respuesta a los agentes anti-angiogénicos ha sido bien documentada. Para testear directamente si el anti-NRR1 interrumpía la angiogénesis en el modelo Calu6, examinamos la vasculatura en secciones de tumores representativas de ratones en los tres grupos de tratamiento. Normalizando la coloración de CD31 , un marcador de células endoteliales, con la coloración de ADN, usando DAPI, hallamos que el anti-NRR1 aumentó significativamente la coloración de CD31 con relación a los otros grupos (Figura 14D). Este aumento era estadísticamente significativo (p < 0,01 ), y se observó consistentemente en múltiples imágenes (Figura 14E). Por contraste y como se esperaba, el anti-VEGF causó una reducción en la coloración de CD31 (Figuras 14D y 14E). Los resultados del bloqueo selectivo de Notchl reflejan así los informados para el bloqueo selectivo de DII4, que lleva similarmente a un aumento en la coloración CD31 del tumor así como también a la generación de vasculatura tumoral que funciona pobremente. Considerados en conjunto, estos resultados sugieren que los efectos anti-tumorales ejercidos por el anti-NRR1 en los modelos Calu6 y HM7 reflejan principalmente una disrupción en la angiogénesis tumoral. 8. La inhibición de anticuerpos de Notchl y Notch2 tiene efectos marcados sobre el destino celular intestinal Los inhibidores de la gamma-secretasa (GSIs), que son inhibidores de pan-Notch que inhiben múltiples receptores de Notch, causan pérdida de peso y metaplasia de las células caliciformes, reflejando el rol que tiene el Notch en la determinación del destino de las células manteniendo la proliferación de las células progenitoras de la cripta intestinal y prohibiendo la diferenciación a un destino celular secretor. (Ver van Es et al., Nature 435:959-963 (2005).) Además, los estudios genéticos usando ratones knockout Notch condicionales sugiere que se requiere la disrupcion de ambos, Notchl y Notch2, para causar la metaplasia de las células caliciformes intestinales. (Ver Riccio et al., EMBO Rep. 9:377-383 (2008).) Usamos anti-NRR1 y anti-NRR2 para determinar los efectos de la inhibición selectiva de Notchl o Notch2, o ambos, sobre la pérdida de peso y la diferenciación celular intestinal.

Los ratones tratados con anti-NRR1 presentaron una leve disminución en el peso corporal total durante el curso de la dosificación del anticuerpo. En un primer experimento comparando directamente anti-NRR1 y anti-NRR2, hallamos que anti-NRR1 causó una disminución de 5% en el peso corporal total, por contraste con el aumento de peso observado en el anti-NRR2 así como también en los grupos control anti-gD y anti-LTpR-Fc (Figura 15A). En un segundo experimento, la inhibición selectiva de Notchl o Notch2 usando anti-NRR1 o anti-NRR2, respectivamente, dio por resultado poco o ningún efecto sobre el peso. Los resultados del experimento se ilustran en la Figura 24A, en donde se administró a los ratones 5 mg/kg de ánti-NRR1 (cuadrados), anti-NRR2 (triángulos), o un anticuerpo control ("ri-gD", rombos) en los días indicados por flechas. Sin embargo, los ratones tratados con ambos, anti-NRR1 y anti-NRR2 ("X"s en la Figura 24A) perdieron aproximadamente 20% de su peso corporal inicial tan pronto como en el día 7.

Investigamos si la leve pérdida de peso resultante del tratamiento con anti-NRR1 solamente, o la mayor pérdida de peso resultante del tratamiento con ambos, anti-NRR1 y anti-NRR2, reflejaba cambios en la determinación del destino celular intestinal. Después de administrar a los ratones anti-NRR1 o anti- gD o DBZ como controles, se analizaron secciones de los intestinos grueso (Figura 19) y delgado el día 2 (Figura 20) y el día 7 (Figura 15B) usando una variedad de coloraciones histoquímicas. El DBZ tenía los mismos efectos que los descriptos previamente para GSIs (Figura 15B, columna DBZ): la inhibición de la expresión de Hes1 se correlacionó con una disminución en la proliferación celular progenitora (como se muestra por coloración de Ki-67) y una expansión importante de la población celular caliciforme (como se muestra por coloración de azul Alcián de mucina). La coloración con lisozima también sugirió que el DBZ aumentó el número y/o la actividad de las células Paneth, una segunda población celular secretora (Figura 15B), una sugerencia que fue sustentada luego usando coloración Azure A-Eosin B para los gránulos de células de Paneth (datos no mostrados). El anti-NRR1 a 10 mg/kg indujo cambios intestinales que no se pueden distinguir de aquellos inducidos por DBZ (Figura 15A, comparar DBZ, 30 pmoles/kg con a-NRR1 10 mg/kg). Estos cambios intestinales dependían de la concentración de anti-NRR1 , de tal modo que se observaron cambios del destino celular significativos usando 10 mg/kg y 2,0 mg/kg pero se observaron pocos, si es que había algunos, cambios notables, usando 0,4 mg/kg. El intestino grueso respondió similarmente al tratamiento con DBZ y con anti-NRR1 : ambos tratamientos redujeron significativamente la señalización por Notch (Figura 19, coloración Hes1 ), la proliferación celular progenitora bloqueada (Figura 19, Ki-67) y aumentaron el número de células caliciformes (Figura 19, azul Alcián y H&E). Los cambios del destino celular intestinal eran sólo débilmente detectables en un punto de tiempo temprano, el día 2 de este estudio (Figura 20; notar los cambios leves pero detectables, causados por ambos DBZ y anti-NRR1, observados con coloración Ki-67 y azul Alcián).

Para determinar si la inhibición de la señalización por Notch2 podría afectar símilarmente la determinación del destino celular intestinal, comparamos directamente los efectos de anti-NRR1 y anti-NRR2 sobre los intestinos grueso (datos no mostrados) y delgado (Figura 15C, mostrando coloración con azul Alcián y Ki-67 y Figura 24B, mostrando coloración con azul Alcián). Mientras que anti-NRR1 causó metaplasia de las células caliciformes que coincidía con una disminución en la expresión de Ki-67 en los progenitores de la cripta, el anti-NRR2 no causó ningún efecto detectable (Figuras 15C y 24B, comparar anti-NRR2 con control anti-gD). Como el anti-NRR1 y el anti-NRR2 funcionan como inhibidores potentes y específicos de la señalización por Notchl y Notch2, respectivamente, tanto in vivo (Figura 11 ) como in vitro (Figuras 9, 10 y 21 ), estos resultados sugieren fuertemente que la inhibición selectiva de Notchl , pero no de Notch2, es suficiente para alterar la determinación del destino de las células intestinales.

También se investigó el efecto de inhibir a ambos, Notchl y Notch2, en la determinación del destino de las células intestinales. La Figura 22 muestra efectos sinérgicos de anti-NRR1 y anti-NRR2 sobre la diferenciación celular intestinal alterada. Se administró a ratones hembras Balb/c 5 mg/kg de anti-NRR1 , 5 mg/kg de anti-NRR2 o 5 mg/kg de anti-NRR1 más 5 mg/kg de anti-NRR2 los días 0, 4, 7 y 11. Se retiraron los intestinos y se colorearon con H&E para revelar la morfología de la cripta. Para ratones tratados con anti-NRR1 o anti-NRR2 solamente, los intestinos fueron retirados el día 12; para ratones tratados con ambos anticuerpos juntos, los intestinos fueron retirados el día 6 debido a que los ratones en este grupo bajaban rápidamente de peso. El análisis de los intestinos indicó que la combinación de anticuerpos dio por resultado un fenotipo más severo que el observado después del tratamiento con anti-NRR1 solamente, sugiriendo que Notchl y Notch2 actúan juntos y parcialmente en forma redundante en el intestino de mamíferos. Experimentos ulteriores confirmaron esta observación. Como se muestra en la Figura 24B, los intestinos de ratones tratados con anti-NRR1 y anti-NRR2 mostraron severa metaplasia de las células caliciformes. Aunque el tratamiento con anti-NRR1 sólo fue suficiente para inducir una leve metaplasia de las células caliciformes, el efecto de anti-NRR1 sólo era leve con relación al efecto de ambos, anti-NRR1 y anti-NRR2 en combinación.

Considerados en conjunto, los resultados indican que Notchl y Notch2 actúan de manera redundante en la diferenciación celular intestinal, aunque la potente inhibición de Notchl , pero no Notch2, es suficiente para revelar un fenotipo parcial. Nuestra hipótesis es que nuestra capacidad para detectar este fenotipo parcial, no informado previamente en estudios genéticos, refleja que el ant¡-NRR1 provee una inhibición más uniforme y potente de la señalización por Notchl en las células de la cripta que puede ser alcanzada después de knockout de genes condicional, que puede ser incompleto. Es importante, porque reducen o evitan significativamente la metaplasia de las células caliciformes, que es un rasgo distintivo de la inhibición general de Notch, que los inhibidores de anticuerpos específicos de Notchl y Notch2 informados en la presente representan una clara mejora sobre los inhibidores pan-Notch existentes tales como GSIs. 9. Rescate del fenotipo intestinal anti-NRR1 La Figura 23 muestra que dexametasona rescata por lo menos parcialmente el fenotipo intestinal causado por anti-NRR1. Los anticuerpos fueron administrados intraperitonealmente (IP) en ratones desnudos hembras NCR (tres ratones por grupo) como sigue: Grupo A) Combinación de vehículos, MCT, una vez por día, anticuerpo control anti-gD a 4 mg/kg, cada cuarto día (no mostrado en la figura); Grupo B) Dexametasona, 90 mg/kg, diariamente (no mostrado en la figura); Grupo C) Anti-NRR1 , 4 mg/kg, cada cuarto día; Grupo D) Dexametasona, 90 mg/kg, diariamente, y Anti-NRR1 , 4 mg/kg, cada cuarto día.

El vehículo era 0,5% (p/v) de hidroxipropilmetilcelulosa (Methocel E4M) y 0,1 % (p/v) de Tween 80 en agua (MCT), que se demostró previamente que no causaba efectos clínicos adversos.

Se retiraron los intestinos el día 9 y se colorearon con anti-K¡67 (marcador de proliferación) y azul Alcián (para mucina). Este experimento reveló que los ratones tratados con la dexametasona más la combinación anti-NRR1 mostraron un fenotipo intestinal más leve con relación a los ratones tratados con anti-NRR1 sólo, sugiriendo así que la dexametasona protege al intestino de los cambios inducidos por anti-NRR1 en la diferenciación. 10. El Anti-NRR2 suprime el crecimiento de lineas celulares de melanoma Se investigó el efecto de anti-NRR1 y anti-NRR2 sobre el crecimiento de líneas celulares de melanoma. Líneas celulares de melanoma humano SK23 y LOX-IMVI fueron colocadas en placas en medio que contenía 2% de FBS a baja densidad (4000 células/cavidad para SK23, 2500 células/cavidad para LOX-IMVI) en placas de 96 cavidades que fueron recubiertas sin (— jag— ) o con ligando Jagged-1 (+jag-1) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Se agregaron a los cultivos Anti-NRR1 (20 mg/ml), anti-NRR2 (20 mg/ml) o inhibidor de la gamma-secretasa (GSI) DAPT (5 µ?) y se volvieron a agregar día por medio a continuación. Un volumen igual de DMSO sirvió como el vehículo control, mientras que una concentración igual de anticuerpo de fago HuB6 anti-gD sirvió como el anticuerpo control del isotipo. Se realizaron ensayos Cell Titer Glo (Promega, Madison, Wl) seis días después de la colocación en placas. Los resultados se muestran en las Figuras 25A y 25B (anti-NRR1 y anti-NRR2 son denominados "anti-N1 " y "anti-N2"). En las Figuras 25A y 25B, la viabilidad de las células (eje y) se expresa con relación a los valores del vehículo DMSO, cavidades control— jag— 1. Ambas líneas celulares de melanoma mostraron una disminución en la viabilidad en respuesta al tratamiento con GSI (especialmente en presencia del ligando Jag1 ) y al tratamiento con anti-NRR2, pero no con el tratamiento con anti-NRR1. 11. El Anti-NRR2 suprime el crecimiento del linfoma de las células B grandes difusas in vitro El linfoma de las células B grandes difusas (DLBCL) es el tipo más común de linfoma no Hodgkin. Un estudio reciente de células de cáncer de pacientes con DLBCL indicó que aproximadamente 8% de los pacientes tiene una mutación del dominio PEST en Notch2, una mutación que se predice que prolonga la señalización por Notch2 después de la activación del ligando. (Ver Lee et al., Cáncer Sci. 100:920-926, 2009.) Sin embargo, no se conocía cómo responderían las células DLBCL a la inhibición de Notch2. Por lo tanto, investigamos el efecto de anti-NRR2 sobre cinco líneas celulares de DLBCL. Las líneas de DLBCL indicadas a la derecha en la Figura 26 fueron cultivadas en réplicas durante tres días en cavidades de una placa de 384 cavidades. Los cultivos de células incluían las concentraciones indicadas de anti-NRR2 (denominado "anti-Notch2" en las Figuras 26 y 27), que correspondía a diluciones seriadas tres veces comenzando con 10 g/ml. Se evaluó el crecimiento usando ensayos Cell Titer Glo (Promega), se representaron en un gráfico como el porcentaje de viabilidad celular con relación al tratamiento con un anticuerpo de control de isotipo. Los puntos de datos en la Figura 26 representan valores promedio obtenidos de cavidades individuales para cada línea celular a las concentraciones de anticuerpos indicadas. Como se muestra en la Figura 26, el crecimiento de una de las líneas celulares, "DB", fue inhibido fuertemente por el tratamiento con anti-NRR2. La Figura 27 muestra el crecimiento de la línea celular de DB en función del tiempo. La línea celular DB se cultivó en cavidades de una placa de 12 cavidades, y los cultivos fueron tratados con DMSO, el inhibidor de la gamma-secretasa DAPT, el anticuerpo control de isotipo anti-gD o anti-NRR2 a las concentraciones indicadas. Se evaluó el crecimiento contando las células viables (Vi-CELL, Beckman Coulter, Fullerton, CA) en los días 2, 3 y 5 después de la inoculación y el tratamiento de los cultivos. Los valores representan el promedio de las mediciones de los tres cultivos independientes, más/menos la desviación estándar. La Figura 27 muestra que el anti-NRR2 suprime el crecimiento de la línea celular DB DLBCL in vitro.

Aunque la invención precedente ha sido descripta con algunos detalles a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de mejor comprensión, las descripciones y ejemplos no deberían interpretarse como limitando el alcance de la invención. Las divulgaciones de todas las patentes y literaturas científicas citadas en la presente se incorporan expresamente en su totalidad por referencia.

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que se fija a Notch2 NRR e inhibe la actividad de Notch2, en donde el anticuerpo se enlaza a Notch2 NRR con un Kd de < 10nM.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo no se fija significativamente a un miembro de la familia Notch distinto de Notch2.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo se fija a Notch2 NRR murino y Notch2 NRR humano.

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo comprende: (a) un HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:3¡ (b) un HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (c) un HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5; (d) un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:10; (e) un HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:14; y (f) un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia de consenso de SEQ ID NO:19.

5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el anticuerpo comprende un HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:1-2; un HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:6-9; un HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:11-13; y un HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:15-18.

6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 , el HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, el HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 , y el HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos.de SEQ ID NO:15.

7. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, el HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, el HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 , y el HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, el HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, el HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12, y el HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17.

9. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, el HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, el HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, y el HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18.

10. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, que además comprende al menos un marco seleccionado de un marco aceptor 2 de VH humano y un marco de consenso VL kappa subgrupo I humano.

11. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:20-21 y un dominio variable de cadena liviana que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:22-25.

12. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11 , en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 y un dominio variable de cadena liviana que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

13. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, y el dominio variable de cadena liviana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

14. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11 , en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 y un dominio variable de cadena liviana que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:23-25.

15. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21 , y el dominio variable de cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs:23-25.

16. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo se fija al mismo epitopo que un anticuerpo seleccionado de Anticuerpo D, Anticuerpo D-1 , Anticuerpo D-2, o Anticuerpo D-3.

17. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el anticuerpo se fija al dominio LNR-A y el dominio HD-C de Notch2.

18. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado de un fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, o (Fab')2.

19. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico.

20. Un método para inhibir la actividad de Notch2, el. donde el método comprende exponer una célula que expresa Notch2 a un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

21. Un método para tratar un trastorno asociado con aumento de la expresión o actividad de Notch2, en donde el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

22. Un A método para tratar una enfermedad maligna por células B, en donde el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

23. Un método para tratar melanoma, en donde el método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

24. El uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno asociado con aumento de la expresión o actividad de Notch2.

25. El uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad maligna por células B.

26. El uso de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para la fabricación de un medicamento para tratar melanoma.

' 27. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para usar como medicamento.

28. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para usar en el tratamiento de un trastorno asociado con aumento de la expresión o la actividad de Notch2.

29. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para usare en el tratamiento de una enfermedad maligna por células B.

30. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para usar en el tratamiento de melanoma.