MX2011002389A

MX2011002389A - Anticuerpos multi-especificos.

Info

Publication number: MX2011002389A
Application number: MX2011002389A
Authority: MX
Inventors: Germaine Fuh; Jenny M Bostrom
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2008-09-03
Filing date: 2009-09-01
Publication date: 2011-05-23
Also published as: JP2012501648A; AR073538A1; PH12013502230A1; EP2324061A1; EP2324061B1; SG193851A1; KR101705911B1; CA2734905A1; ES2628108T3; CN102143977B; US20100322946A1; US8193321B2; AU2009288167A1; US9017686B2; US9522960B2; IL211349A0; WO2010027981A1; RU2011112324A; AU2009288167B2; PE20150222A1

Abstract

La invención proporciona anticuerpos multi-específicos y los métodos de hacer y usar tales anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS MULTI -ESPECÍFICOS Campo de la Invención La presente invención se relaciona a anticuerpos multi-específieos, y a los métodos para hacer y usar tales anticuerpos.

Antecedentes de la Invención Los anticuerpos son polipéptidos de inmunoglobulina específicos producidos por el sistema inmune de los vertebrados impugnables por proteínas extrañas, glicoproteínas , células o cualquier otra substancia antigénica extraña. Una parte importante de este proceso es la generación de anticuerpos que se unen o enlazan específicamente a una substancia extraña particular. La especifidad de ligadura de tales péptidos a un antígeno particular es altamente refinada, y la multitud de especifidades capaces de ser generadas por el vertebrado individual es notable en su complejidad y variabilidad. Miles de antígenos son capaces de obtener respuestas, cada una casi exclusivamente dirigida a un antígeno particular que lo provocó.

El reconocimiento del antígeno específico es esencial para que los anticuerpos funcionen en la respuesta inmune adaptativa. En la generación del repertorio de anticuerpos, la asociación combinativa de la cadena pesada (CP) y la cadena ligera (CL) es conservada en todos los vertebrados. Existe, sin embargo, asimetría de diversidad en las dos cadenas. El dominio variable de la CP (VH) contiene una diversidad de secuencia altamente diversa y contribuye a los determinantes del reconocimiento de antígenos en más oportunidades que el dominio variable de la CL (VL) .

El rol de la CL en determinar la especificidad del antígeno es indicada por un proceso llamado edición del receptor. La recombinación en curso de los genes VL para editar la célula receptora B es el mecanismo principal para corregir los precursores de anticuerpos que reaccionan por sí mismo, lo cual parece constituir una porción significativa del repertorio inicial (-75%) . La alteración de la cadena ligera es demostrada para extinguir la especificidad o multi-especificidad de ligadura no deseadas .

La especificidad de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos para un antígeno particular o antígenos, hace que los anticuerpos sean agentes terapéuticos deseados. Los anticuerpos y fragmentos de los anticuerpos pueden ser usados para orientar tejidos particulares, por ejemplo, un tumor, y por ende minimizar el potencial de los efectos secundarios de la orientación no específica. Como tal, existe una actual y continua necesidad de identificar y caracterizar los anticuerpos terapéuticamente, especialmente los anticuerpos, los fragmentos, y derivados de los mismos, útiles en el tratamiento del cáncer y otros desórdenes proliferativos .

Compendio de la Invención La presente invención proporciona un anticuerpo aislado que contiene una secuencia de región hipervariable (HVR) Ll que contiene la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1), en donde el anticuerpo se liga específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . En una forma de realización, el anticuerpo adicionalmente contiene un HVR-L2 que contiene la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO : 2 ) y/o un HVR-L3 que contiene la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO : 3 ) . En otra forma de realización, el anticuerpo contiene adicionalmente, una, dos, o tres secuencias seleccionadas de (i) HVR-H1 que contiene la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO:4) ; (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) . En otra forma de realización, el anticuerpo contiene adicionalmente, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8) ; y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

En otro aspecto, la invención caracteriza un anticuerpo aislado que contiene una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia X I X3X4X5X6X7X8X9 (SEQ ID NO: 83), en donde Xx es un aminoácido excepto ácido aspártico, X3 es un aminoácido excepto prolina, X4 es un aminoácido excepto arginina, y X5 es un aminoácido excepto serina, en donde el anticuerpo se liga específicamente a HER2 y VEGF. En una forma de realización, un anticuerpo que contiene la secuencia ??? X3X4X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO: 83) posee un asparagina en X1( una alanina en X3 , una lisina en X4, una treonina en X5( una serina en X7, y/o una glicina en X8, o una combinación de cualquiera de los mismos. En varias formas de realización de este aspecto de la invención, cualquiera de los residuos de HVR-L1 mostrados en la Figura 57 que tienen un valor F de más de 1, 5, o 10 son residuos que son mantenidos preferiblemente como el mismo residuo encontrado en la misma posición de HVR-L1 de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NO:l) . En formas de realización adicionales, cualquiera de los residuos HVR-L1 mostrados en la Tabla 14 de tener valores ??T mayor de 1 son residuos que son preferiblemente mantenidos al igual que el residuo encontrado en la misma posición de HVR-L1 of bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID N0:1) . En una forma de realización, el anticuerpo comprende una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RX2X3X4X5X6X7X8X9R (SEQ ID NO:84) . En una forma de realización, el anticuerpo contiene adicionalmente un HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO: 2) y/o un HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO : 3 ) . En otra forma de realización, el anticuerpo contiene adicionalmente, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID N0:4) ; (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID N0:6). En otra forma de realización, el anticuerpo contiene adicionalmente , una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID N0:8) ; y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado que contiene una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RX2X3 4 5X6X7X8X9 (SEQ ID NO: 85), en donde X5 es cualquier aminoácido excepto treonina y X6 es cualquier aminoácido excepto asparagina y en donde el anticuerpo se liga específicamente a HER2 y VEGF. En otra forma de realización, un anticuerpo conteniendo la secuencia RX2 3X4X5X6X7X- 9R (SEQ ID NO: 84) tiene una tirosina en X8. En una forma de realización, un anticuerpo conteniendo la secuencia RX2X3X4XSX6X7X8X9R (SEQ ID NO: 84) tiene una serina en X5 y/o un ácido glutámico en X6. En otra forma de realización de este aspecto, los anticuerpos contienen adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas del grupo de una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO : 1 ) , una HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO:2), y/o una HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO: 3) . En cualquiera de las formas de realización descritas en la presente, los anticuerpos contienen adicionalmente, una o dos secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO: 4) y (ii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) . En una forma de realización adicional, los anticuerpos contienen adicionalmente, uno o dos secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7) y (ii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

En varias formas de realización de este aspecto de la invención, cualquiera de los residuos HVR-H2 mostrados en la Figura 57 para tener un valor F de mayor de 1, 5, o 10 son residuos que son aparentemente mantenidos igual que los residuos encontrados en la misma posición de HVR-H2 de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NOS: 8 y 5, respectivamente) . En formas de realización adicionales, cualquiera de los residuos HVR-H2 mostrados en las Tablas 14 de tener un valor ??T mayor de 1 son residuos que son mantenidos preferiblemente igual que el residuo encontrado en la misma posición de HVR-H2 de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NOS: 8 y 5, respectivamente) .

En formas de realización particulares, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-L2 que contiene GSFLY (SEQ ID NO:2); una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID NO: 3) ; una secuencia HVR-H1 que contiene NIKDTY (SEQ ID NO:4) ; una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y una secuencia HVR-H3 que contiene WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) o contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID NO:l) ; una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID NO: 2) ; una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID NO:3); una secuencia HVR-H1 que contiene NISGTY (SEQ ID NO: 7); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y/o una secuencia HVR-H3 que contiene WVGVGFYAMD (SEQ ID NO : 9 ) .

En una forma de realización particular adicional el anticuerpo aislado contiene HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3 , HVR-H1, HVR-H2 , y HVR-H3 , en donde cada una contiene en orden la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1); WGSFLY (SEQ ID N0:2); HYSSPP (SEQ ID NO:3); NIKDTY (SEQ ID NO : 4 ) ; RIYPTNGYTR (SEQ ID NO : 5 ) ; y WGGDGFYAMD (SEQ ID NO : 6 ) y se liga específicamente a HER2 y VEGF. En otra forma de realización particular, el anticuerpo contiene HVR-Ll, HVR-L2 , HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3, en donde cada uno contiene en orden la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); WGSFLY (SEQ ID NO : 2 ) ; HYSSPP (SEQ ID NO:3); NISGTY (SEQ ID NO:7); RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9) y se liga específicamente a HER2 y VEGF.

En varias formas de realización de cualquiera de los aspectos descritos en la presente, el anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con un Kd de 150 nM o más fuerte, y HER2 con un Kd de 7 nM o más fuerte. En formas de realización adicionales, el anticuerpo inhibe la proliferación inducida de células VEGF y la proliferación de una célula expresando HER2 relativo a un control. En una forma de realización particular, el anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con un Kd de 36 nM o más fuerte y HER2 con un Kd de 1 nM o más fuerte. En una forma de realización adicional, el anticuerpo inhibe la ligadura de VEGF a VEGFR2.

En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado que se liga a VEGF humano y de ratón con un Kd de 150 nM o más fuerte y HER2 con un Kd de 7 nM o más fuerte y en donde el anticuerpo inhibe la proliferación inducida de células VEGF y la proliferación de células expresando HER2 relativo a un control. En una forma de realización, el anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con un Kd de 36 nM o más fuerte y HER2 con un Kd de 1 nM o más fuerte.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo aislado que une VEGF humano con un Kd de 58 nM o más fuerte y HER2 con un Kd de 6 nM o más fuerte, y/o inhibe inhibe la proliferación inducida de células VEGF y la proliferación de células expresando HER2 relativo a un control. En una forma de realización particular, el fragmento de anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con un Kd de 33 nM o más fuerte y HER2 con un Kd de 0.7 nM o más fuerte . En otra forma de realización particular, el fragmento es un fragmento Fab o un fragmento variable de cadena única (scFv) .

En cualquiera de los aspectos descritos anteriormente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal . En otra forma de realización de los aspectos anteriormente descritos, el anticuerpo puede ser un anticuerpo IgGy. En formas de realización adicionales por lo menos una porción de la estructura de las secuencias del anticuerpo puede ser una estructura de consenso de una secuencia humana En otro aspecto, la invención presenta un fragmento de un anticuerpo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. Una forma de realización de un fragmento del anticuerpo es un fragmento que contiene una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1) que se liga específicamente a HER2 y VEGF. En otra forma de realización, el fragmento del anticuerpo contiene adicionalmente una o dos secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO:2) ; y (ii) HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO: 3) . En otra forma de realización, el fragmento del anticuerpo contiene adicionalmente, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia GGDGFYAMD (SEQ ID NO:6) . En una forma de realización adicional, el fragmento del anticuerpo contiene adicionalmente, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO.-7); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) . En formas de realización particulares, el fragmento del anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID NO:2); una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID NO:3); una secuencia HVR-H1 que contiene NIKDTY (SEQ ID N0:4); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y una secuencia HVR-H3 que contiene WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) o contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID NO:2); una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID NO:3); una secuencia HVR-H1 que contiene NISGTY (SEQ ID NO: 7); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y una secuencia HVR-H3 que contiene WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) . En una forma de realización, el fragmento es un fragmento Fab o un fragmento variable de cadena única (scFv) . En formas de realización adicionales de todos los aspectos anteriores, por lo menos una porción de la estructura de la secuencia del anticuerpo es una estructura de consenso de una secuencia humana.

En aspectos adicionales, la invención presenta polinucleótidos que codifican cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en la presente, así como un vector que contiene tal polinucleótido . En formas de realización particulares, el anticuerpo codificado contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID NO:l) . Opcionalmente o adicionalmente, el polinucleótido codifica un anticuerpo que también contiene una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID N0:2); y/o una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID N0:3), o cualquier combinación de los mismos. En un aspecto adicional, el polinucleótido puede codificar adicionalmente un anticuerpo que contiene una, dos o tres secuencias de una secuencia HV -H1 que contiene NIKDTY (SEQ ID NO: 4) ; una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPTNGYTR (SEQ ID NO: 5); y una secuencia HVR-H3 que contiene WGGDGFYAMD (SEQ ID NO : 6 ) ; o un anticuerpo que contiene una, dos o tres secuencias de una secuencia HVR-H1 qué contiene NISGTY (SEQ ID NO: 7); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y/o una secuencia HVR-H3 que contiene WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9).

En aspectos adicionales de la invención, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia de NISGTY (SEQ ID NO:7), una secuencia HVR-H2 secuencia de RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8), o una secuencia HVR-H3 de WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9), o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos, la invención presenta un polinucleótido aislado que codifica una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l) y, opcionalmente, el polinucleótido codifica adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO: 4) ; (ii) una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y (iii) una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). En aspectos adicionales, la invención caracteriza un polinucleótido aislado que codifica una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); y (i) una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO: 2) o (ii) una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID N0:3), o ambos, y opcionalmente , el polinucleótido codifica adicionalmente una, dos o tres secuencias HV seleccionadas de (i) una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID N0:4); (ii) una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID N0:5); y (iii) una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID N0:6).

En un aspecto adicional, la invención presenta un polinucleótido aislado que codifica una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7) ; una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia VGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) . En aun otro aspecto, la invención caracteriza un polinucleótido aislado que codifica una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO:2) ; una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO:3); una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7); una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID N0:8); y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9).

En otros aspectos, la invención presenta un polinucleótido aislado que codifica una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7), un polinucleótido aislado que codifica una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID N0:8), y un polinucleótido aislado que codifica una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID N0:9). En otro aspecto, la invención presenta un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que contiene una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7); una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

En una forma de realización adicional de la invención, el polinucleótido aislado codifica una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia XÍIX3X4X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO: 83), en donde Xi es cualquier aminoácido excepto ácido aspártico, X3 es cualquier aminoácido excepto prolina, X4 es cualquier aminoácido excepto arginina, y X5 es cualquier aminoácido excepto serina. En otra forma de realización de la invención, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia X1IX3X4X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO:83), en donde Xi es cualquier aminoácido excepto Asp, X3 es cualquier aminoácido excepto prolina, X4 es cualquier aminoácido excepto arginina, y X5 es cualquier aminoácido excepto serina; y una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY ( SEQ ID NO: 2) y/o una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO: 3.) . En formas de realización adicionales de este aspecto de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo conteniendo la secuencia X1IX3X4 5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO:83) que tiene un asparagina en Xi, una alanina en X3, una lisina en X , una treonina en X5, una serina en X7< y/o una glicina en X8( o cualquier combinación de los mismos. En varias formas de realización de este aspecto de la invención, cualquiera de los residuos HVR-Ll mostrados en la Figura 57 a tener un valor F de más de 1, 5, o 10 son residuos que son mantenidos preferiblemente como el mismo residuo encontrado en la misma posición de HVR-Ll de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NO:l) . En formas de realización adicionales, cualquiera de los residuos HVR-Ll mostrados en la Tabla 14 de tener un valor ??T mayor de 1 son residuos que son mantenidos preferiblemente como el mismo residuo encontrado en la misma posición de HVR-Ll de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NO : 1 ) .

En una forma de realización adicional de la invención, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RX2X3X4X5X6X7 8 9R (SEQ ID NO:85), en donde X5 es cualquier aminoácido excepto treonina y X6 es cualquier aminoácido excepto asparagina. En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7) ; una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RX2X3X4X5X6 7 8 9 (SEQ ID NO: 85), en donde X5 es cualquier aminoácido excepto treonina y X6 es cualquier aminoácido excepto asparagina; y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) . En una forma de realización adicional de la invención, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RX2X3X4 5X6 7 8X9R (SEQ ID NO: 84) que tiene una serina en X5, un ácido glutámico en X6, y/o una tirosina en X8, o cualquier combinación de los mismos. En varias formas de realización del aspecto de la invención, cualquiera de los residuos HVR-H2 mostrados en la Figura 57 por tener un valor F mayor de 1 , 5, o 10 son residuos que son mantenidos preferiblemente como los mismos residuos encontrados en la misma posición de HVR-H2 de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NOS: 8 y 5, respectivamente) . En formas de realización adicionales, cualquiera de los residuos HVR-H2 mostrados en la Tabla 14 de tener valores ??T mayores de 1 son residuos que son mantenidos preferiblemente como los mismos residuos encontrados en la misma posición de HVR-H2 de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NOS: 8 y 5, respectivamente) .

En aspectos adicionales, la invención presenta un polipéptido aislado que contiene una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO : 1 ) o un polipéptido aislado que contiene una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1) ; una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO : 2 ) ; y/o una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID N0:3) . En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que contiene una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia XiIX3X X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO:83), en donde X-¡_ es cualquier aminoácido excepto ácido aspártico, X3 es cualquier aminoácido excepto prolina, X4 es cualquier aminoácido excepto arginina, y X5 es cualquier aminoácido excepto serina. En otra forma de realización de este aspecto, el polipéptido contiene la secuencia HVR-L1 XXI X3X4X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO:83), en donde Xi es cualquier aminoácido excepto ácido aspártico, X3 es cualquier aminoácido excepto prolina, X4 es cualquier aminoácido excepto arginina, y X5 es cualquier aminoácido excepto serina. Opcionalmente, el polipéptido además incluye una secuencia HVR-L2 secuencia conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID N0:2) y/o una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID N0:3). En formas de realización particulares de cualquiera de los aspectos anteriores que incluyen un polipéptido que contiene la secuencia XiIX3X4X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO: 83), hay una asparagina en Xi, una alanina en X3, una lisine en X , una treonina en X5, una serina en X7, y/o una glicina en X8, o cualquier combinación de los mismos. En varias formas de realización de este aspecto de la invención, cualquiera de los residuos de HVR-L1 mostrados en la Figura 57 por tener un valor F mayor de 1, 5, o 10 son residuos que son mantenidos preferiblemente como los mismos residuos encontrados en la misma posición de HVR-L1 de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NO:l). En formas de realización adicionales, cualquiera de los HVR-L1 mostrados en la Tabla 14 por tener AAG mayores de 1 son residuos que son mantenidos preferiblemente como los mismos residuos encontrados en la misma posición de HVR-Ll de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NO : 1 ) .

La invención también proporciona una polipétpdio que contiene una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RX2X3 4 SX6 7X8X9R (SEQ ID NO:85), en donde X5 es cualquier aminoácido excepto treonina y X6 es cualquier aminoácido excepto asparagina. En otro aspecto de la invención, el polipéptido contiene la secuencia HVR-H2 RX2X3X 5 6X7X8X9R (SEQ ID NO:85), en donde X5 es cualquier aminoácido excepto treonina y Xe es cualquier aminoácido excepto asparagina, una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7), y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) . En formas de realización diferentes de los aspectos anteriormente mencionados, el polipéptido que contiene la secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RX2X3X4X5 6 8X9R (SEQ ID NO: 84) tiene una serina en X5, un ácido glutámico en X6, y/o una tirosina en X8, o cualquier combinación de los mismos. En varias formas de realización de este aspecto de la invención, cualquiera de los residuos HVR-H2 mostrados en la Figura 57 por tener un valor F mayor de 1, 5, o 10 son residuos que son mantenidos preferiblemente como el mismo residuo encontrado en la misma posición de HVR-H2 de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NOS: 8 y 5, respectivamente) . En formas de realización adicionales, cualquiera de los HVR-H2 mostrados en la Tabla 14 por tener un valor ??? mayor de 1 son residuos que son mantenidos preferiblemente como el mismo residuo encontrado en la misma posición de HVR-H2 de bHl-44 o bHl-81 (SEQ ID NOS: 8 y 5, respectivamente) .

La invención también proporciona un polipéptido que contiene una, dos o tres secuencias de una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7), una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID N0:8), y/o una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYA D (SEQ ID NO: 9), o cualquier combinación de los mismos .

En cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido aislado puede contener adicionalmente una, dos o tres secuencias de una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO:4); una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO: 5); y/o una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) , o cualquier combinación de los mismos.

En cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido aislado puede contener adicionalmente una, dos o tres secuencias de una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID N0:2); una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO: 3) .

En cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido aislado puede contener adicionalmente una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO: 4) ; una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO: 5); y/o una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6), o cualquier combinación de los mismos.

En cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido aislado puede contener adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7); una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID N0:8); y/o una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID N0:9), o cualquier combinación de los mismos.

En aspectos adicionales, la invención caracteriza un polipéptido aislado que contiene una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1) y (i) una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO : 2 ) o (ii) una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO:3), o ambas; y una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y (iii) una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYA D (SEQ ID NO: 9).

En aspectos adicionales, la invención presenta un polipéptido asilado que contiene una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1) y (i) una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO: 2) o (ii) una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO: 3), o ambas, y una, dos y tres secuencias HVR seleccionadas de (i) una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO:4) ; (ii) una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y/o (iii) una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6), o cualquier combinación de las mismas.

En aspectos adicionales, la invención caracteriza un polipéptido aislado que contiene una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7), un polipéptido aislado que comprende una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID N0:8), y un polipéptido aislado que contiene una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) . En aun una forma de realización adicional, la invención presenta un polipéptido aislado que contiene una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7); una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

En una forma de realización, la invención proporciona un vector que contiene cualquiera de los anteriormente descritos polinucleótidos de la invención. En otro aspecto, la invención presenta una célula hospedera que contiene cualquiera de los vectores de la invención. En una forma de realización, la célula hospedera es procariótica . En otra forma de realización, la célula hospedera es eucariótica, por ejemplo, una célula de mamífero .

En otro aspecto, la invención presenta un método para producir cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo anteriormente descritos. Este método incluye cultivar una célula hospedera que contenga un vector que contiene un polinucleótido que codifica al anticuerpo y recuperar el anticuerpo. En ciertas formas de realización, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1) y, opcionalmente, el polinucleótido codifica adicionalmente una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO: 4) ; una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMO (SEQ ID N0:6). En otras formas de realización, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1); una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO: 2) ; y una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO : 3 ) y, opcionalmente el polinucleótido codifica adicionalmente una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO: 4) ; una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO: 5) ; y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia GGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). En otra forma de realización, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7); una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID N0:9). En aún otra forma de realización, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1) ; una secuencia HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID N0:2); una secuencia HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID N0:3); una secuencia HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7) ; una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

En formas de realización adicionales, el polinucleótido codifica una secuencia HVR-H conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7), una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8), o una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9). En aún otra forma de realización, el polinucleótido codifica un polipéptido que contiene una secuencia HVR-H1 comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7); una secuencia HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y una secuencia HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO:9).

En una forma de realización, la célula hospedera es procariótica y en otra forma de realización, la célula hospedera es eucariótica, tal como una célula de mamífero.

En un aspecto adicional, la invención caracteriza un método de tratamiento de un tumor en un sujeto. Este método incluye adminsitar a un sujeto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo en la presente descritos, en donde la administración es por un tiempo y en una cantidad suficiente para tratar o prevenir el tumor en el sujeto. En una forma de realización, el tumor es un tumor colorectal, un tumor de seno, un tumor de pulmón, un carcinoma de célula renal, un glioma, un glioblastoma, o un cáncer de ovario. En otra forma de realización, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l) y se liga específicamente a HER2 y VEGF. De acuerdo con una forma de realización, el anticuerpo contiene adicionalmente una o dos secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO:2); y (ii) HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO : 3 ) . En otra forma de realización, el anticuerpo contiene, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) . En una forma de realización adicional, el anticuerpo contiene una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9). En formas de realización particulares, el anticuerpo comprende una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID N0:1); una secuencia HVR-L2 que contiene GSFLY (SEQ ID N0:2); una secuencia HVR-L que contiene HYSSPP (SEQ ID NO:3); una secuencia HVR-H1 que contiene NIKDTY (SEQ ID N0:4); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPTNGYTR (SEQ ID NO: 5); y una secuencia HVR-H3 que contiene WGGDGFYAMD (SEQ ID N0:6) y se liga específicamente a HER2 y VEGF. En otra forma de realización, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID N0:1); una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID NO : 2 ) ; una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID NO:3); una secuencia HVR-H1 que contiene NISGTY (SEQ ID NO: 7); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y una secuencia HVR-H3 que contiene WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) y se liga específicamente a HER2 y VEGF.

En una forma de realización, el método incluye adicionalmente adminsitrar a un sujeto una terapia anti-cáncer adicional. En otra forma de realización, la terapia anti-cáncer adicional incluye otro anticuerpo, un agente de quimioterapia, un agente citotóxico, un agente anti-angiogénico, un agente inmunosupresivo, un pro-fármaco, una citocina, un antagonista de citocinas, radioterapia citotóxica, un corticoide, un antiemético, una vacuna contra el cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento.

En una forma de realización adicional, la terapia anti-cáncer adicional es administrada antes de o subsecuentemente a la administración del anticuerpo. En una forma de realización adicional, la terapia anti-cáncer adicional es adminsitrada concurrentemente con un anticuerpo.

En un aspecto adicional, la invención presenta un método de tratamiento de una enfermedad auto-immune en un sujeto. Este método incluye administrar a un sujeto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo descrito en la presente, en donde la administración es por un tiempo y una cantidad suficientes para tratar o prevenir la enfermedad auto- inmune en el sujeto. En una forma de realización, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-Ll conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l) y se liga específicamente a HER2 y VEGF. De acuerdo con una forma de realización, el anticuerpo contiene una o dos secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-L2 conteniendo la secuencia GSFLY (SEQ ID NO:2); y (ii) HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID N0:3) . En otra forma de realización, el anticuerpo contiene, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO : 4 ) ; (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). En una forma de realización adicional, el anticuerpo contiene, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) . En formas de realización particulares, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID N0:1) ; una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID N0:2); una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID N0:3) ; una secuencia HVR-Hl que contiene NIKDTY (SEQ ID NO: 4) ; una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPTNGYTR (SEQ ID N0:5); y una secuencia HVR-H3 que contiene WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) y se liga específicamente a HER2 y VEGF o el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 que comprende NIAKTISGY (SEQ ID N0:1); una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID NO : 2 ) ; una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID N0:3); una secuencia HVR-Hl que contiene NISGTY (SEQ ID NO: 7); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPSEGYTR (SEQ ID N0:8); y una secuencia HVR-H3 que contiene WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) y se liga específicamente a HER2 y VEGF.

En aún otro aspecto, la invención presenta un método de tratamiento de una enfermedad no maligna que involucra la activación de HER2 en un sujeto. Este método incluye adminsitrar al sujeto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descritos en la presente, en donde la administración es por un tiempo y por una cantidad suficientes para tratar o prevenir la enfermedad no maligna en el sujeto. En una forma de realización, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l) y se liga específicamente a HER2 y VEGF. De acuerdo con una forma de realización, el anticuerpo comprende una o dos secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID N0:2); y (ii) HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO: 3) . En otra forma de realización, el anticuerpo contiene adicionalmente , una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID N0:4); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID N0:5); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) . En una forma de realización adicional, el anticuerpo contiene, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYA D (SEQ ID NO: 9). En formas de realización particulares, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID NO: 2) ; una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID NO:3); una secuencia HVR-H1 que contiene NIKDTY (SEQ ID NO: 4) ; una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPTNGYTR (SEQ ID NO: 5); y una secuencia HVR-H3 que contiene WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6) y se liga específicamente a HER2 y VEGF o el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 que comprende NIAKTISGY (SEQ ID NO:l) ; una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID NO:2); una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID NO : 3 ) ; una secuencia HVR-H1 que contiene NISGTY (SEQ ID NO:7); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8); y una secuencia HVR-H3 que contiene WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) y se liga específicamente a HER2 y VEGF.

Aspectos adicionales de la invención presentan el uso de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos descritos en la presente, en el tratamiento de un tumor, una enfermedad auto-immune, o una enfermedad no maligna que involucra la activación de HER2 en un sujeto, asi como el uso en la fabriación de un medicamento para el tratamiento de un tumor, una enfermedad auto- inmune, o una enfermedad no maligna que comprende la activación anormal de HER2 en un sujeto. En una forma de realización de estos usos, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 conteniendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO : 1 ) y se liga específicamente a HER2 y VEGF. De acuerdo con una forma de realización, el anticuerpo contiene adicionalmente uno o dos secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-L2 conteniendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO:2); y (ii) HVR-L3 conteniendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO : 3 ) . En otra forma de realización, el anticuerpo contiene, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID N0:4); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO:5); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO:6). En una forma de realización adicional, el anticuerpo contiene, una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas de (i) HVR-H1 conteniendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2 conteniendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8); y (iii) HVR-H3 conteniendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) . En formas de realización particulares, el anticuerpo contiene una secuencia HVR-L1 que contiene NIAKTISGY (SEQ ID NO:l); una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID N0:2) ; una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ID N0:3); una secuencia HVR-H1 que contiene NIKDTY (SEQ ID NO:4); una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPTNGYTR (SEQ ID N0:5) ; y una secuencia HVR-H3 que contiene WGGDGFYAMD (SEQ ID N0:6) y se liga específicamente HER2 y VEGF o el anticuerpo contiene una secuencia HVR-Ll que contiene NIAKTISGY (SEQ ID NO : 1 ) ; una secuencia HVR-L2 que contiene WGSFLY (SEQ ID N0:2); una secuencia HVR-L3 que contiene HYSSPP (SEQ ?? N0:3) ; una secuencia HVR-H1 que contiene NISGTY (SEQ ID N0:7) ; una secuencia HVR-H2 que contiene RIYPSEGYTR (SEQ ID NO:8) ; y una secuencia HVR-H3 que contiene WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) y se liga específicamente HER2 y VEGF.

En una forma de realización de los métodos de tratamiento de un tumor, una enfermedad auto-immune, o una enfermedad no maligna que involucra la activación anormal de HER2 en la presente descrita, el sujeto es un humano.

También, se contemplan kits, composiciones, y artículos de fabricación que comprenden los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos descritos en la presente.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la diversidad diseñada en varias bibliotecas de CL.

La Figura 2 muestra un resumen de cuatro bibliotecas de cadenas ligeras usadas para alterar los anticuerpos anti-VEGF o anticuerpos anti-Her2 para ligar un objetivo adicional. Los NNK y XYZ cursivos se refieren a series de codón. Los Ys , Ds , Ts y Ss se refieren a aleatorizaciones suaves teniendo ácido aspártico, treonina y serina, respectivamente, que ocurren 50% del tiempo y cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren los otros 50% del tiempo. D/Ds y T/Ts se refieren a una aleatorización suave que tiene D o T, respectivamente, que ocurre 75% del tiempo y cualquiera de los 20 aminoácidos ocurre el otro 25% del tiempo.

La Figura 3 muestra secuencias de residuos de CDR de CP, CL de plantillas de cadena ligera.

La Figura 4 muestra la diverisdad natural y diseñada de CDRs de cadena ligera. En cada posición, la secuencia de anticuerpo Herceptin es mostrada en paréntesis. Un "*" denota una inserción no presente en el anticuerpo Herceptin.

Las Figuras 5A y 5B1-5B2 muestran las secuencias de clones que se ligan a antígenos específicos aislados de la biblioteca de cadenas ligeras (CL) . La Figura 5A muestra las secuencias de CDR de CL de clones de fago monoespecífieos ligándose a VEGF, DR5, y Fe, y la Figura 5B muestra Fabs bi-especificos ligándose a VEGF/HER2, DR5/HER2, y Fc/HER2. La estructura de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada corresponden con aquellas del anticuerpo Herceptin con la excepción de la sustitución de la estructura de CL R66G.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la especifidad de ligadura de los anticuerpos deriavados de la biblioteca de CL. Se muestran los resultados para los anticuerpos bHl , bH3 , 3-1, bDl, bD2 , 4-1, y 4-5. Anticuerpos IgG ligados fueron detectados espectrofotométricamente (densidad óptica a 450 nm, eje-y) . Las proteínas incluidas en el ensayo fueron (de izquierda a derecha para cada anticuerpo) del factor de crecimiento vascular endotélico A (hVEGF-A) , hVEGF-C, hVEGF-D, dominio extracelular hHER2 (ECD) , dominio extracelular del factor de crecimiento epidérmico (hEGFR) , receptor humano de muerte 5 (hDR5) , albúmina de suero de bovino (BSA) , caseína, suero fetal bovino (FBS) , lisado de células WIL2 y lisado de células NR6.

La Figura 7 muestra condiciones de clasificación y enriquecimientos de Bibliotecas C y D.

La Figura 8 muestra ligadores de VEGF. Los residuos 28, 30, 30a, 31, 92, 93, y 93a fueron completamente diversos. Los residuos 32, 50, 53, 91 y 94 fueron restringidos. Los residuos 29, 33, y 51 fueron limitados (<3).

La Figura 9 muestra ligadores humanos de VEGF, selección de placa y solución combinada.

Las Figuras 10A y 10B muestran clones que se ligan tanto a VEGF y HER2.

La Figura 11 muestra clones que solamente se ligan a VEGF y perdieron la actividad de ligadura con HER2.

La Figura 12 muestra clones ligados a VEGF.

Las Figuras 13A y 13B muestran clones que bloquean la ligadura de VEGF a VEGFR1-D2 o DI.

Las Figuras 14A y 14B muestran ligadores de VEGF y las afinidades de los ligadores de VEGF de la biblioteca L1/L2/L3-C,D.

La Figura 15 muestra clones que pueden ligarse tanto a VEGF y HER2.

La Figura 16 muestra los ligadores de biblioteca de CL usados en la formación de scFv'2 y exhibidos sobre fago.

La Figura 17 muestra la expresión de varios clones en la forma Fab o hlgG.

Las Figuras 18A y 18B muestran ELISAs de los clones en la forma hlgG ligándose a hVEGF165.

La Figura 19 muestra ELISAs de clones en la forma de hlgG ligándose a objetivos de proteína inmovilizados.

La Figura 20 muestra ELISAs competitivos de clones en la forma de hlgG en presencia de Her2 y VEGF o DR5.

La Figura 21 muestra un Análisis Biacore de ligadura a VEGF o HER2.

La Figura 22 muestra ligadura a HER2-ECD o hVEGF con una IgG o Fab teniendo una cadena ligera obtenida de un clon de ligadura diferente.

Las Figuras 23A y 23B muestran un anticuerpo anti-VEGF que bloquea la interacción VEGF con VEGFR1 D 1-3 y KDR Dl-7.

La Figura 24 muestra anticuerpos bloqueadores de B20-4.1 y ligadura a VEGF.

La Figura 25 muestra anticuerpos bloqueadores de anticuerpo Avastin y ligadura a VEGF.

La Figura 26 muestra estructuras de cristal de bHl Fab bi-específico ligado a HER2 o VEGF.

La Figura 27 es un gráfico que muestra anticuerpos anti-VEGF bloquean ligadura de hVEGF a receptor 2 de VEGF (VEGFR2) .

La Figura 28 muestra estructuras de cristal de bHl Fab bi-especí ico ligado a HER2 o VEGF.

La Figura 29 es una serie de gráficas de círculo mostrando las contribuciones de CDRs individuales al paratopo estructural para bHl. El tamaño de paratopo para VEGF es 730Á2 y para HER2 es 690Á2. Las CDRs de cadena pesada se indican en gris y las CDRs de cadena ligera en blanco.

La Figura 30 muestra la superposición de los bucles de CDR de bHl ligado a VEGF/HER2 o anticuerpo Herceptin ligado a HER2 en la misma orientación como la Figura 28.

La Figura 31 muestra estructuras de cristal de bHl Fab bi-específico ligado a HER2 o VEGF. CDR-L1 de los dos complejos bHl son mostradas en la misma orientación.

La Figura 32 muestra los sitios de ligadura energéticamente importantes de bHl para ligadura a VEGF y HER2.

La Figura 33 muestra codones de bHl que fueron explorados con secuenciación aleatoria.

La Figura 34 muestra una construcción de la biblioteca.

La Figura 35 muestra un clon de anticuerpo exhibiendo mutaciones de exploración de secuenciación aleatoria mediante ligadura a VEGF.

La Figura 36 muestra un clon de anticuerpo exhibiendo mutaciones de exploración de secuenciación aleatoria mediante ligadura a HER2.

Las Figuras 37A-37D muestran resultados de exploración de alanina. Las Figuras 37A y 37B muestran los resultados de una exploración de alanina de bHl para (Figura 37A) ligadura a VEGF o (Figura 37B) ligadura a HER2 , y los resultados de una exploración homologa de bHl para (Figura 37C) ligadura a VEGF o (Figura 37D) ligadura a HER2.

La Figura 38 muestra resultados de exploración de alanina de bHl o de los mutantes de anticuerpo Herceptin.

Las Figuras 39A1-39A3 y 39B1-39B3 muestran la exploración de secuenciación aleatoria de alanina y exploración homologa de bHl Fab para ligadura a VEGF y HER2.

Las Figuras 40A-40B muestran los sitios de ligadura energéticamente importantes de bHl para ligadura a VEGF y HER2.

La Figura 41 muestra secuencias de clon maduradas por de afinidad a bHl VEGF y afinidad de ligadura para VEGF o HER2.

La Figura 42 muestra la inhibición de la proliferación de células HUVEC inducida por VEGF con anticuerpos anti-VEGF.

La Figura 43 muestra ligadura de anticuerpos bi-específicos a HER2 expresada en células NR6.

La Figura 44 muestra los resultados de experimentos de ligadura competitva para bHl a VEGF o HER2.

La Figura 45 muestra que bHl y los variantes mejoradas por afinidad bHl-44 y bHl-81 IgG inhiben proliferación de células mediada por HER2 y VEGF in vitro.

La Figura 46 muestra la especifidad de ligadura de anticuerpos bi-específicos derivados de la biblioteca de CL.

La Figura 47 muestra que anticuerpos anti-VEGF bloquean ligdura de VEGF a receptores VEGFR2. La Figura 47A muestra ligadura a VEGF humano y la Figura 47B muestra ligadura a VEGF murino .

Las Figuras 48A y 48B muestra que VEGF y HER2 compiten para ligadura a IgG bi-específica bHl-44 en solución.

Las Figuras 49A y 49B muestran que los anticuerpos bi-específicos bHl y bHl-44 se ligan a células de fibroblasto de ratón expresando HER2 (NR6; Figura 49B) , pero no a células NR6 negativas a HER2 (Figura 49A) .

La Figura 50 muestra que el anticuerpo bHl bi -específico específicamente inmunoprecipita VEGF o HER2 a partir de lisados de fibroblastos de ratón (NR6), pero no otras proteínas.

La Figura 51 muestra la inhibición de tumor de bHl-44 en xeno- injertos Colo205 y BT474M1 en ratones inmuno comprometidos.

Las Figuras 52A, 52B, y 53 ilustran secuencias de estructura de consenso humanas aceptadoras ejemplares para su uso en practicar la presente invneción con identificadores de secuencia como se indica a continuación: Estructuras de consenso de Cadena Variable Pesada (VH) (FIG. 52A y 52B) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo I de VH humana FRl , FR2 , FR3, y FR4 menos CDRs Kabat (IA: SEQ ID NOS: 42 -45, respectivamente) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo I de VH humana FRl, FR2 , FR3 , y FR4 menos regiones hipervariables extendidas (IB: SEQ ID NOS: 46, 47, 44, y 45, respectivamente; IC: SEQ ID NOS: 46-48 y 45, respectivamente; ID: SEQ ID NOS: 42, 47, 49, y 45, respectivamente) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo II de VH humana FRl, FR2, FR3, y FR4 menos CDRs Kabat (HA: SEQ ID NOS: 50-52 y 45, respectivamente) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo II de VH humana FRl, FR2 , FR3 , y FR4 menos regiones hipervariables extendidas (IIB: SEQ ID NOS : 53 , 54, 52, y 45, respectivamente; IIC: SEQ ID NOS: 53 -55 y 45, respectivamente; IID: SEQ ID NOS: 53, 54, 56, y 45, respectivamente) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo III de VH humana FRl, FR2, FR3, y FR4 menos CDRs Kabat (IIIA: SEQ ID NOS: 57-59 y 45, respectivamente) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo III de VH humana FRl, FR2 , FR3 , y FR4 menos regiones hipervariables extendidas (IIIB: SEQ ID NOS:60, 61, 59, y 45, respectivamente; IIIC:SEQ ID NOS: 60-62 y 45, respectivamente; IIID:SEQ ID NOS: 60, 61, 63, y 45, respectivamente) Regiones de estructura de aceptador de VH humana FRl, FR2, FR3 , y FR4 menos CDRs Kabat (Aceptador A: SEQ ID NOS: 64, 58, 65, y 45, respectivamente) Regiones de estructura de aceptador de VH humana FRl, FR2 , FR3 , y FR4 menos regiones hipervles extendidas (Aceptador B: SEQ ID NOS: 60, 61, 65, y 45, respectivamente; Aceptador C: SEQ ID NOS: 60, 61, 66, y 45, respectivamente) Regiones de estructura de aceptador 2 de VH humana FRl, FR2 , FR3 , y FR4 menos CDRs Kabat (Segundo Aceptador A: SEQ ID NOS: 64, 58, 67, y 45, respectivamente) Regiones de estructura de aceptador 2 de VH humana FRl, FR2, FR3, y FR4 menos regiones hipervariables extendidas (Segundo Aceptador B: SEQ ID NOS: 60, 61, 67, y 45, respectivamente ; Segundo Aceptador C: SEQ ID NOS: 60, 61, 68, y 45, respectivamente; Segundo Aceptador D: SEQ ID NOS: 60, 61, 69, y 45, respectivamente) Estructura de Consenso de Cadena Variable Ligera (VL) (FIG. 53) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo I kappa de VH humana FR1 , FR2 , FR3 , y FR4 (kvl: SEQ ID NOS: 70-73, respectivamente) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo II kappa de VH humana FR1, FR2 , FR3 , y FR4 (kv2 : SEQ ID NOS: 74-76 y 73, respectivamente) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo III kappa de VH humana FR1 , FR2 , FR3 , y FR4 (kv3 : SEQ ID NOS: 77-79 y 73, respectivamente) Regiones de estructura de consenso de sub-grupo IV kappa de VH humana FR1 , FR2 , FR3 , y FR4 (kv4 : SEQ ID NOS: 80-82 y 73, respectivamente) La Figura 54 muestra los residuos que hacen el contacto estructural o una interacción energética con HER2 , VEGF, o ambos. Los residuos que hacen el contacto estructural (>25% enterrado) o una interacción energética (??T > 10% del total de la energía de ligadura) con HER2 (gris claro) , VEGF (gris) , o ambos (compartidos, negro) están mapeados sobre la superficie de bHl ligado a HER2.

La Figura 55 muestra las interfaces de ligadura bHl/VEGF y bHl/HER2. Un acercamiento de la interfaz de ligadura Hl/VEGF (A) y bHl/HER2 (B) ilustra las diferencias estructurales entre VEGF y HER2 en las regiones de ligadura de anticuerpo. Representaciones de la superficie de VEGF (C) y HER2-ECD (D) se muestran en la misma orientación relativa a bHl Fab. Son resaltados los residuos en contacto con bHl Fab (más cerca que 4.5 Á) . No hay una similitud aparente entre los dos epítopos para bHl en términos de composición química o topología.

La Figura 56 muestra que los anticuerpos bHl y bHl-44 bloquean ligadura de VEGF humano a VEGFR1. VEGFi65 biotinilado humano fue incubado con concentraciones en incremento de IgG (eje x) , luego capturado sobre VEGFR1-Fc inmobilizado humano, y detectado con peroxidasa de rábano picante conjugado con estreptavidina con substrato añadido (OD450 % normalizado, eje y) .

La Figura 57 muestra resultados de exploración de alanina de mutantes de bHl y bHl-44. Mutagénesis de exploración de alanina identificó los residuos funcionalmente importantes para ligadura a VEGF y/o HER2. Los valores F representan la contribución relativa de cada residuo explorado a ligadura de antígeno. Los valores F fueron determinados para ligadura de bHl-44 a VEGF y HER2 (barras negras) , y comparados con los valores F de bHl (barras blancas) . Los aminoácidos en paréntesis denotan los residuos de bHl-44 que difieren de bHl. Este gráfico fue adaptado de la Figura 56.

La Figura 58 muestra la ligadura de anticuerpos bHl-44 129A Y32A bHl-44 y R50A R58A bHl-44 a VEGF y HER2. Los ensayos de ligadura ELISA muestran la habilidad de bHl-44 IgG y los dos mutantes dobles para ligarse a VEGF109 biotinilado (izquierda) o HER2-ECD (derecha) , y compiten con el anticuerpo inmovilizado anti-VEGF o Herceptin, respectivamente. El mutante I29A/Y32A CL ha perdido ligadura a VEGF, mientras que mantiene afinidad similar para HER2 como bHl-44. El mutante R50A/R58A CP ha perdido afinidad para HER2 , pero retiene ligadura a VEGF.

La Figura 59 muestra las medidas calorimétricas de los cambios de entalpia asociados con ligadura de antigeno. Las Figuras 59A-F muestran los datos para ligadura de bHl a VEGF, ligadura de bHl a HER2 , ligadura de bHl-44 a VEGF, ligadura de bHl-44 a HER2, ligadura de bHl-44 CP-R50A + R58A a VEGF, ligadura de bHl-44 CL-I29A + Y32A a HER2 , respectivamente. Las figuras muestran los pulsos térmicos individuales (superior) y los calores de reacción (inferior) , que son calculados por integración de cada pulso, trazados como una función en proporción del anticuerpo al antígeno al final de las inyecciones. La pequeña magnitud de los cambios de la entalpia requirió concentraciones relativamente altas de proteína, lo cual excluye la estimación precisa de KD cuando la afinidad fue alta. Figuras 59A-D: Solucioness de VEGF109 o HER2-ECD a concentraciones varianddo 10-20 µ? fueron valorados por 15 inyecciones de bHl o bHl-44 Fab a concentraciones de 100 a 200 µ? . Figuras 59E-F: Soluciones de VEGF109 o HER2-ECD a concentraciones de 10 a 20 µ? fueron valorados por 20 inyecciones de bHl-44 CL-I29A+Y32A Fab o bHl-44 CP-R50A+R58A Fab a concentraciones de 150 y 250 µ? . Debido al ruido de los instrumentos las titulaciones números 1 y 13 (figura 59E) fueron excluidas del análisis.

La Figura 60 muestra los perfiles termodinámicos de las variantes bHl y del anticuerpo Herceptin. Cada variante dual específico (bHl, bHl-81, y bHl-44) tiene perfiles termodinámicos caracterizados por entalpia y entropía favorable para ligadura a tanto VEGF y HER2. Los variantes CP-R50A+R58A y CL-129A+Y32A que han perdido afinidad para HER2 o VEGF respectivamente, exhibieron perfiles termodinámicos similares a bHl-44. Los perfiles termodinámicos de la interacción bHl-44/HER2 son distintos de Herceptin/HER2.

La Figura 61 muestra la comparación de los puntos calientes de bHl, bHl-44, y del anticuerpo Herceptin para ligadura a HER2 con base en los datos de mutagénesis de exploración de alanina. Los residuos de punto caliente son resaltados en gris mapeados sobre la estructura de Herceptin (Herceptin) o las estructura de bHl Fab (bHl, bHl-44) . Los puntos calientes o críticos son definidos como ??? mayor o igual a 10% de la energía libre de ligadura total (AG) . Los sitios de contacto estructurales (dentro 4.5 Á de los antígenos en las estructuras) son delineados por líneas ligeramente punteadas. Las CP y CL son separadas por una línea negra punteada. Los residuos subrayados difieren en secuencia de Herceptin.

La Figura 62 muestra los cambios estimados de la capacidad calorífica asociados con ligadura de bHl-44 Fab con VEGF or HER2. ACp se determinó a partir de la pendiente de la dependencia de temperatura de ?? entre 20 y 37°C. Sobre este rango, ACp parece ser independiente de T, con base en la relación lineal entre ?? y T (R = 0.991 para bHl-44/HER2, R = 0.9989 para bHl-44/VEGF) . El ACp para Herceptin/HER2 fue determinado previamente por Kelley et al. (Biochemistry, 1992).

Las Figuras 63A-B muestran la cinética de ligadura de los variantes de bHl-44 medidos por BIAcore . Las figuras muestran la sobreposición de trazos de respuesta representativa contra el tiempo para las interacciones de ligadura entre (A) VEGF109 o (B) HER2-ECD inmovilizados y soluciones 0.5 µ? de bHl-44 Fab (A y B: superior) , bHl-44 -CL-Y32 (A: segundo desde abajo; B: segundo desde arriba), bHl-44-CL-I29A+Y32A (A: inferior; B: segundo desde abajo) , y bHl-44-CP-R50A+R58A (A: segundo desde arriba; B: inferior) . Los trazos representan ligadura al mismo chip C 5 inmovilizado, después de cada corrida de Fab. No se detectó ligadura para bHl-44-CL-I29A+Y32A a VEGF o para bHl-44-CP-R50A+R58A a HER2 a 0.5 µ? . El variante bHl-44 -Y32A exhibió una ligadura significativamente debilitada a VEGF comparada con bHl-44 de tipo silvestre.

Las Figuras 64A-D muestran el mapa de los residuos determinantes de especificidad de bHl-44 sobre la estructura de cristal de bHl. Los residuos que son importates para ligadura a VEGF (CL-I29 y CL-Y32 : A y B) y los residuos que son importantes para ligadura a HER (HC-R50 y HC-R58; C y D) son mostrados en gris oscuro como barras sobre las estructuras de cristal de bHl/VEGF (A y C, resolución 2.6 Á) o bHl/HER2 (B y D, resolución 2.9 Á) . Los residuos 129 y Y32 parecen estar involucrados en interacciones intra-cadena que sirven para mantener la conformación de bucle CDR-Ll necesaria para ligadura a VEGF. 129 es expuesto a solvente en la estructura HER2. Y32 se empaca contra HER2 , pero no se vincula en contacto con antígenos productivos. R50 y R58 se empacan contra D560 y E558 sobre HER2 , y parecen vincularse en interacciones de carga-carga. R50 y R58 son expuestos a solvente en la estructura solvente VEGF.

La Figura 65 muestra la expresión de Fabs mutantes de Herceptin (R50A, R58A, y R50A/R58A) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona métodos para preparar anticuerpos multi-específicos y fragmentos de anticuerpos, así como anticuerpos identificaqdos usando estos métodos y sus usos. En general, los métodos de la invención involucran diversificar el dominio variable de cadena ligera o el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo para generar variantes que puedan ser expresados de manera estable en una biblioteca. Anticuerpos diversificados que son capaces de ligarse específicamente a dos epítopos son entonces seleccionados a partir de esta biblioteca y caracterizados adicionalmente .

Anticuerpos ejemplares identificados usando los métodos de la invención incluyen anticuerpos que se ligan a tanto HER2 (receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano) y VEGF (factor de crecimiento vascular endotelial) . En particular, los datos descritos en la presente, por ejemplo, en los ejemplos mas adelante, muestran que mutaciones en las regiones determinantes de complementariedad en la cadena ligera (CDRs) de un anticuerpo HER2 confieren capacidades ligadura duales para antígenos de proteínas no relacionados así como para HER2. Se caracteriza extensivamente un anticuerpo HER2/VEGF bi-específico de alta afinidad. Además, las estructuras de cristal de este Fab bi-específico en complejo con HER2 y VEGF se muestran y la contribución energética de los residuos Fab mediante mutagénesis es evaluada. Los sitios de ligadura para los dos antígenos se traslapan extensivamente; la mayoría de los residuos de CDR que hacen contacto con HER2 también vinculan VEGF. Sin embargo, energéticamente, los residuos de la cadena pesada dominan la especifidad a HER2 mientras que la cadena ligera domina la especifidad a VEGF.

El anticuerpo HER2/VEGF bi-específico inhibe la proliferación de células mediada por HER2 y VEGF tanto in vitro e in vivo. Estos resultados demuestran que alterar la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo puede generar anticuerpos con especifidad y función duales. Por ejemplo, bHl-44 y bHl-81 tienen el potencial de apuntar a dos mecanismos de progresión de tumores: la proliferación celular del tumor mediada por HER2 y la angiogénesis de tumor mediada por VEGF. Co-apuntar a dos antígenos con un solo anticuerpo es una alternativa a terapia de combinación.

I. Definiciones El término "anticuerpo multi-específico" se usa en el sentido más amplio y específicamente abarca un anticuerpo que comprende un dominio de cadena pesada (VH) y un dominio de cadena ligera (VL) , en donde la unidad VHVL tiene una especif idad poliepitópica (es decir, es capaz de ligarse a dos epítopos diferentes sobre una molécula biológica, o cada epítopo sobre una molécula biológica diferente) . Tales anticuerpos multi-específieos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos y triacuerpos bi -especificos , fragmentos de anticuerpo que han sido enlazados covalentemente o no covalentemente . "Especificidad Poliepitópica" se refiere a la habilidad para ligarse específicamente a dos o más epítopos diferentes sobre el mismo o diferente objetivo(s) . "Mono-específico" se refiere a la habilidad para ligarse solamente a un epítopo. De acuerdo con una forma de realización el anticuerpo multi-especí fico es una forma IgGl que se liga a cada epítopo con una afinidad de 5 µ? a 0.001 pM, 3 µ? a O.OOlpM, 1 µ? a O.OOlpM, 0.5 µ? a 0.001 pM o 0.1 µ? a 0.001 p .

La unidad de anticuerpo básico de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste de 5 de las unidades básicas heterotetraméricas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J, y por ende contiene 10 sitios de ligadura de antígeno, mientras que anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes que comprenden 2-5 unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J) . En el caso de igGs, la unidad de 4 cadenas es generalmente de aproximadamente 150,000 daltones. Cada cadena L está unida a una cadena H mediante un enlace covalente de disulfuro, mientras que las dos cadenas H están enlazadas entre sí mediante uno o más enlaces de disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L posee también regularmente puentes de disulfuro intra-cadena separados. Cada cadena H tiene, en la terminal N, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constants (¾) para cada una de las cadenas a y ? y cuatro dominios ¾ para isotipos µ y e. Cada cadena L tiene, en la terminal N, un dominio variable (V"L) seguido por un dominio constante (¾) en su otro extremo. El L está alineado con VH y el ¾ está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (¾1) . Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. El apareamiento de VH Y VL forman juntos un solo sitio de ligadira a antígeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver, v.gr., Basic and Clinical Immunology, 8va edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, p. 71 y Capítulo 6.

La cadena L de cualquier especie de vertebrados puede ser asignada a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases o isotipos dependiendo de la secuencia de los aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas (CH) . Existen cinco clases de inmunoglobulinas: igA, IgD, IgE, IgG, e IgM, teniendo cadenas pesadas designadas , d, ?, e, y µ, respectivamente. Las clases ? y OÍ son adicionalmente divididas en sub-clases en la base de diferencias relativamente menores en la secuencia C¾ y funciones, v.gr. , las humanos expresan las siguientes sub-clases: IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl , y IgA2.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos. El dominio V regula ligadura de antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. Por el contrario, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables denominados regiones de estructura (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables" que son cada una de 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, que adoptan en gran medida la configuración de una hoja beta, conectada por tres regiones hipervariables, las cuales forman bucles conectando, y en algunos casos formando parte de, la estructura de la hoja beta. Las regiones hipervariables en cada cadena son sostenidas juntas en una cercana proximidad mediante las FRs y, con las regiones hipervariables de otra cadena, contribuyen a la formación de sitios de ligadura de antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no se encuentran involucrados directamente en la ligadura de un anticuerpo con un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables por la ligadura de antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (v.gr., alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y alrededor de aproximadamente los residuos 26-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la V¾ (en una forma de realización, Hl está alrededor de aproximadamente los residuos 31-35); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (v.gr., los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2), y 91-96 (L3) en la VL, y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2), y 96-101 (H3) en la VH; Chothia and Lesk, J.

Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

"Regiones de estructura" (FR) son aquellos residuos de dominio variable distintos a los residuos de CDR. Cada dominio variable tiene típicamente cuatro FRs identificadas como FR1, FR2 , FR3 y FR4. Si las CDRs están definidas de acuerdo con Kabat, los residuos de FR de cadena ligera están posicionados alrededor de los residuos 1-23 (LCFR1) , 35-49 (LCFR2 ) , 57-88 (LCFR3), y 98-107 (LCFR4) , y los residuos de FR de la cadena pesada están posicionados aproximadamente en los residuos 1-30 (HCFR1) , 36-49 (HCFR2) , 66-94 (HCFR3 ) , y 103-113 (HCFR4) en los residuos de la cadena pesada. Si las CDRs comprenden residuos de aminoácidos a partir de bucles hipervariables , los residuos de FR de cadena ligera están posicionados aproximadamente en los residuos 1-25 (LCFR1) , 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), y 97-107 (LCFR4) en la cadena ligera y los residuos de FR de cadena pesada están posicionados aproximadamente en los residuos 1-25 (HCFRI) , 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), y 102-113 (HCFR4) en los residuos de la cadena pesada. En algunos casos, cuando la CDR comprende aminoácidos a partir de tanto una CDR como fue definida por Kabat y aquellos de un bucle hipervariable, los residuos de FR se ajustarán de manera acorde. Por ejemplo, cuando CDRH1 incluye los aminoácidos H26-H35, los residuos de FR1 de cadena pesada están en las posiciones 1-25 y los residuos de FR2 están en las posiciones 36-49.

Una "Estructura de Consenso Humana" es un estructura que representa los residuos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias de estructura VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es a partir de un sub-grupo de las secuencias de dominio variable. Generalmente, los sub-grupos de secuencias son un sub-grupo como en Kabat. En una forma de realización, para VL, el sub-grupo es el sub-grupo kappa I como en Kabat. En una forma de realización, para VH, el sub-grupo es el sub-grupo III como en Kabat.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son sustancialmente similares y se ligan al mismo epítopo(s), excepto por posibles variantes que puedan surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente estando presentes en cantidades menores. Tal anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una región variable que se liga a un objetivo, en donde el anticuerpo se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección del anticuerpo a partir de una pluralidad de anticuerpos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único a partir de una pluralidad de clones, tales como un conjunto de clones de hibridomas, clones de fagos o clones de ADN recombinante . Deberá entenderse que el anticuerpo seleccionado puede ser alterado adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad para el objetivo, para humanizar al anticuerpo, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multi-específico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas en que son típicamente no contaminados por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal", indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como requiriendo producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por una variedad de técnicas, incluyendo el método de hibridoma (v.gr., Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al . , en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (ver, v.gr., la patente US 4,816,567), tecnologías de exhibición de fagos (ver, v.gr., Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol . 338 (2) :299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 ( 5) : 1073 - 1093 (2004); Fellouse, Proc . Nat . Acad. Sci . USA 101 (34) : 12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Immunol. Methods 284 ( 1-2 ): 119-132 (2004)) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a humanos a partir de animales que tienen partes o todos de los locus de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (ver v.gr., WO 98/24893, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); las patentes US 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; WO 97/17852, las patentes US 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016, y Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (,1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)).

Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de ligadura de antígeno, así como un CL y, al menos dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser de dominios constantes de secuencia nativa (v.gr., dominios constantes de secuencia nativa humana) o variante de secuencia aminoácidos de la misma. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente, la región de ligadura de antígeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab 1 , F(ab')2# y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver patente US 5,641,870, ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multi-específicos formados de fragmentos de anticuerpo. La expresión "anticuerpos lineales" se refiere generalmente a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng., 8 ( 10 ): 1057- 1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd en tándem (VH-CH1-VH-Ch1) los cuales, junto con los polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de ligadura de antígeno. Anticuerpos lineales pueden ser bi-específicos o mono-específicos.

La"" digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de ligadura a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" , y un fragmento residual "Fe", una designación que refleja la capacidad de cristalizar con facilidad. El fragmento Fab consiste en una cadena L entera junto con un dominio de región variable de la cadena H (V^) , y el primer dominio constante de una cadena pesada (<¾1) . Tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un solo fragmento grande F(ab')2 que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab enlazados por disulfuro teniendo actividad de ligadura a antígeno divalente y es todavía capaz de reticular al antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener algunos residuos adicionales en la terminal carboxi del dominio C¾l incluyendo uno o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en donde el residuo (s) de cisteína de los dominios constantes muestra un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 fueron originalmente producidos como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre ellos. Otros acoplantes químicos de fragmentos de anticuerpos son igualmente conocidos.

El fragmento Fe comprende porciones de terminal carboxilo de ambas cadenas H mantenidas unidas por disulfuro. Las funciones efectoras de los anticuerpos son determinadas por secuencias en la región Fe; esta región es también la parte reconocida por receptores de Fe (Fc ) encontrados en ciertos tipos de células. "Fv" consiste de un dímero de un dominio de región variable de una cadena pesada y una cadena ligera, en asociación no covalente, ajustada. Desde el plegado de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de las cadenas H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácidos para el enlace de antígeno y confieren especificidad al enlace del antígeno con el anticuerpo. Sin embargo, aún en un solo dominio variable (o mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs específicos para un antígeno) posee la habilidad de reconocer y ligar al antígeno, aunque frecuentemente a una afinidad menor que el sitio de ligadura entero.

"Fv" de una sola cadena" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden dominios de anticuerpo V¾ y VL conectados en una sola cadena de polipéptidos . Preferiblemente, el polipétpido sFv comprende adicionalmente un enlazador de polipéptido entre los dominios V^ y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para ligadura de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun in The Pharmacology of onoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) ; Borrebaeck 1995.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños preparados mediante construir fragmentos sFv (ver párafos anteriores) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios Vj-¡ y VL tal que apareamiento inter-cadena pero no intra-cadena de los dominios V se logre, resultando en un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de ligadura de antígeno. Diacuerpos bi-específicos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "cruzados" en donde los dominios V¾ y VL de los dos anticuerpos están presentes sobre cadenas de polipéptidos diferentes. Los diacuerpos son descritos de manera mas completa en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90 :6444-6448 (1993) .

Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (v.gr., roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada a partir de anticuerpos no humanos. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son las inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en las cuales residuos a partir de una región hipervariable del receptor se sustituyen por los residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpos donadores) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano con la especificidad, la afinidad y capacidad del anticuerpo deseadas. En algunos casos, residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios de anticuerpo, en los cuales todos o sustancialmente todos de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992).

Como usado en la presente, "conjunto de codones" se refiere a un conjunto de diferentes secuencias de triplete de nucleótidos usadas para codificar aminoácidos variantes deseados. Un conjunto de oligonucleótidos puede sintetizarse, por ejemplo, por síntesis de fase sólida, incluyendo las secuencias que representan todas las combinaciones posibles de tripletes de nucleótidos proporcionados por el conjunto de codones y que codificarán al grupo deseado de aminoácidos. Una forma estándar de designación de codones es aquella del código IUB, la cual es conocida en la materia y descrita en la presente. Un conjunto de codones típicamente es representado por 3 letras mayúsculas en cursiva, v.gr., NNK, NNS, XYZ, DVK, y similares (v.gr., el codón NNK se refiere a N = A/T/G/C en las posiciones 1 y 2 en el codón y K = G/T en una relaión equimolar en la posición 3 para codificar todos los 20 aminoácidos naturales) . Un "conjunto de codones no aleatorio", como se utiliza en la presente, por ende se refiere a un conjunto de codones que codifica aminoácidos seleccionados que cumplen parcialmente, de preferencia por completo, con los criterios para selección de aminoácidos como se describen en la presente. Síntesis de oligonucleótidos con la "degeneración" de nucleótidos seleccionada en ciertas posiciones es bien conocida en la materia, por ejemplo, el enfoque TRINI (Knappek et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 1999); Garrard and Henner, Gene 128:103, 1993). Estos conjuntos de oligonucleótidos teniendo ciertos conjuntos de codones pueden sintetizarse usando sintetizadores de ácidos nucleicos comerciales (disponibles de, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA) , o pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, MD) . Por lo tanto, un conjunto de oligonucleótidos sintetizados que tienen un conjunto de codones particular típicamente incluirá una pluralidad de oligonucleótidos con secuencias diferentes, las diferencias establecidas por el conjunto de codones dentro de la secuencia general. Oligonucleótidos, como se utilizan de acuerdo con la invención, tienen secuencias que permiten la hibridación a una plantilla de ácidos nucleicos de dominio variable y también pueden, pero no necesariamente, incluir sitios de enzima de restricción útiles para, por ejemplo, propósitos de clonación.

Un anticuerpo de la invención "que liga" un antígeno de interés es uno que enlaza al antígeno con una afinidad suficiente para que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en apuntar a una proteína o una célula o tejido que expresa al antígeno, y no reacciona de modo cruzado significativamente con otras proteínas. En tales formas de realización, la extensión de ligadura del anticuerpo a una proteína "no objetivo" será menor que aproximadamente 10% de la ligadura del anticuerpo a su proteína objetivo particular tal como ha sido determinado por el análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) o radio-inmunoprecipitación (RIA) o ELISA. Con respecto a la ligadura de un anticuerpo a una molécula objetivo, el término "ligadura específica" o "Específicamente se liga a" o es "específico para" un polipéptido en particular o un epítopo sobre un objetivo de polipéptido particular significa que la ligadura es mesurablemente diferente de una interacción no específica (v.gr., para bHl-44 o bHl-81, una interacción no específica es ligadura a albúmina de suero bovino, caseína, suero bovino fetal, o neuravidina) . Ligadura específica se puede medir, por ejemplo, mediante la determinar la ligadura de una molécula comparada con la ligadura de una molécula de control. Por ejemplo, ligadura específica puede ser determinado por la competencia con una molécula de control que es similar al objetivo, por ejemplo, un exceso de objetivo no marcado. En este caso, la ligadura específica se indica si la ligadura del objetivo marcado a una sonda es completamente inhibida por objetivo no marcado en exceso. El término "ligadura específica" o "se liga específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo sobre un objetivo de polipéptido particular como se usa en la presente puede exhibirse, por ejemplo, mediante una molécula teniendo un Kd para el objetivo de por lo menos alrededor de 200 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 150 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 100 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 60 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 50 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 40 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 30 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 20 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 10 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 8 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 6 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 4 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 2 nM, alternativamente por lo menos alrededor de 1 nM, o mayor. En una forma de realización, el término "ligadura específica" se refiere a ligadura donde una molécula se liga a un polipéptido particular o epítopo sobre un polipéptido particular sin sustancialmente ligarse a cualquier otro polipéptido o epítopo de polipéptido .

"Afinidad de ligadura" se refiere generalmente a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un solo sitio de ligadura de una molécula (v.gr., un anticuerpo) y su socio de ligadura (v.gr., un antígeno) . A menos que se indique lo contrario, como se usa en la presente, "afinidad de ligadura" se refiere a la afinidad de ligadura intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de ligadura (v.gr., anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su socio Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd) . Deseablemente, la Kd es de aproximadamente 200 nM, 150 nM, 100 nM, 50 n , 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 n , 10 nM, 8 n , 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, o más fuerte. La afinidad puede ser medida por métodos comunes conocidos en la materia, incluyendo aquellos descritos en la presente. Anticuerpos de baja afinidad generalmente se ligan a antígeno lentamente y tienden a disociarse rápidamente, mientras que anticuerpos de alta afinidad generalmente se ligan a antígeno rápidamente y tienden a permanecer ligados por más tiempo. Una variedad de métodos para medir afinidad de ligadura son conocidos en la materia, cualquiera de los cuales pueden ser usados para propósitos de la presente invención.

En una forma de realización, la "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con la presente invención se mide usando ensayos de resonancia de plasmones de superficie usando un BIAcore-2000 o un BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado at -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de bio-sensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) son activados con hidrocloruro de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno es diluido con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8, en 5 (-0.2 µ?) antes de la inyección a una tasa de flujo de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, etanolamina 1 es inyectada para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones de cinética, diluciones en serie de dos tantos de Fab (v.gr., 0.78 n a 500 nM) son inyectadas en PBS con Tween 20 al 0.05% (PBST) a 25°C a una tasa de flujo de aproximadamente 25pl/min. Tasas de asociación (kon) y tasas de diasociación (k0ff) son calculadas usando un modelo de ligadura Langmuir de uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante ajustar simultáneamente al sensorgrama de asociación y disociación. La contante de disociación de equilibrio (Kd) es calculada como la relación koff/kon. Ver, v.gr., Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol . 293:865-881. Si la tasa de asociación excede 106 M"1 S"1 por el ensayo de resonancia plasmones de superficie anterior, entonces la tasa de asociación puede determinarse usando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución en la intensidad de las emisiones fluorescentes (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones en aumento de antígeno según se mide en un espectograma , tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja de agitación.

Una "tasa de asociación" o "kon" de acuerdo con esta invención también puede ser determinada con la misma técnica de resonancia de plasmones de superficie descrita anteriormente usando un BIAcore-2000 o un BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips C 5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips bio-sensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) son activados con hidrocloruro de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones de proveedor. El antígeno es diluido con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8 , en 5 ug/ml (~0.2 µ?) antes de la inyección a una tasa de flujo de 5 µ?/minuto para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Luego de la inyección de antígeno, etanolamina 1M es inyectada para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones de cinética, diluciones en serie de dos tantos de Fab (v.gr., 0.78 nM a 500 nM) son inyectadas en PBS con Tween 20 al 0.05% (PBST) a 25°C a una tasa de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las tasas de asociación (k0n) y tasas de disoasociación (koff) son calculadas usando un modelo de ligadura Langmuir de uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante el ajustar simultáneamente al sensorgrama de asociación y disasociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) es calculada como la relación koff/kon. Ver, v.gr., Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol . 293:865-881. Sin embargo, si la tasa de asociación excede 106 M"1 S"1 por el ensayo de resonancia de plasmones de superficie anterior, entonces la tasa de asociación es preferiblemente dedterminada usando técnicas de extinción de fluoresencia que miden el incremento o decremento en la intensidad de las emisiones de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones en incremento de antígeno según se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con paro de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

"Biológicamente activo" y "actividad biológica" y "características biológicas" con respecto a un polipéptido de esta invención significa tener la capacidad de ligarse a una molécula biológica, excepto cuando se especifique lo contrario.

"Molécula biológica" se refiere a un ácido nucleico, una proteína, un carbohidrato, un lípido, y combinaciones de los mismos. En una forma de realización, la molécula biológica existe en la naturaleza.

"Aislado", cuando se utiliza para describir los varios anticuerpos revelados en la presente, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de una célula o un cultivo celular a partir del cual se expresa. Componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente interferirán con usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En formas de realización preferidas, el anticuerpo será purificado (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos terminales N o internos por el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Anticuerpo aislado incluye anticuerpos in situ dentro de células recombinantes, debido a que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Por lo general, sin embargo, polipéptido aislado será preparado por al menos una etapa de purificación.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de ligadura de ribosoma .

Células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores .

El ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o punta secretora se enlaza operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como un pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido, un promotor o potenciador está enlazado operativamente a una secuencia de codificación de si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de ligadura de ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si se coloca con el fin de facilitar la traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas, y, en el caso de una punta secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por ligadura en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o enlazadores se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de polipéptidos identificadas en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en el polipéptido siendo comparado, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo de porcentaje de identidad de secuencia, y no considerando niguna substitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse mediante varias maneras que están dentro del estado de la técnica, por ejemplo, usando software de computador públicamente disponible tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los técnicos en la materia puede determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que sea necesario para lograr el máximo alineamiento sobre la longitud total de las secuencias siendo comparadas. Para propósitos de la presente, sin embargo, los valores del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos son generados usando el programa de computador de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computador de comparación de secuencias ALIGN- 2 es autoría de Genentech, Inc. y el código fuente ha sido inscrito con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos de América -U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559-, en donde se encuentra registrado bajo el número de registro de derechos de autor US No. TXU510087. El programa ALIGN-2 es públicamente disponible a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. El programa ALIGN-2 deberá compilarse para uso en un sistema de operación UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital.

Todos los parámetros de comparación de secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y- no varían.

Las secuencias de aminácidos descritas en la presente son secuencias de aminoácidos contiguos a menos que se especifique de otra manera.

Moléculas biológicas "estructuralmente no similares" de acuerdo con la presente invención se refieren a moléculas biológicas que no están en la misma clase (proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, etc.) o, por ejemplo, al referirse a proteínas, que tienen menos de 60% de identidad de aminoácidos, menos del 50% de identidad de aminoácidos, menos del 40% de identidad de aminoácidos, menos del 30% de identidad de aminoácidos, menos del 20% de identidad de aminoácidos o menos que 10% de identidad de aminoácidos en comparación entre sí.

"Rigor" de reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un técnico en la materia, y, generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, temperatura de lavado, y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para templado adecuado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación en general depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a templar cuando cadenas complementarias están presentes en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseado entre la sonda y secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, siguie que temperaturas relativas más altas tendrían una tendencia a hacer las condiciones de reacción mas rigurosas, mientras que temperturas más bajas menos. Para detalles adicionales y la explicación de rigor de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) .

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alto rigor", como se definen en el presente, pueden ser identificadas por aquellas que: (1) emplean resistencia iónica baja y alta temperatura para el lavdo, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/ citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con un albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/regulador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) hibridación durante la noche en una solución que emplea formamida al 50%, SSC 5x (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sometido a tratamiento sónico (50 µ?/p??) , SDS al 0.1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con un lavado de 10 minutos a 42 °C en SSC 0.2x (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por lavado a alto rigor por 10 minutos consistiendo en SSC 0. lx conteniendo EDTA a 55 °C.

"Condiciones moderadamente rigurosas" pueden ser identificadas según se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluir el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (v.gr., temperatura, reistencia iónica, y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de las condiciones moderadamente rigurosas es una incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado cortado, seguido por lavar los filtros en SSC lx a alrededor de 37-50°C. El técnico en la materia cómo ajustar la temperatura, resistencia iónica, etc. según sea necesario para dar cabida a factores como la longitud de la sonda y similares.

"Funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: ligadura Clq y citotoxicidad dependiente de complemento; ligadura de receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) ; fagocitosis; regulación hacia abajo de los receptores de superficie celular (v.gr., receptor de células B) ; y activación de células B. "Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual Ig secretada se liga sobre receptores de Fe (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (v.gr., células Asesinas Naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) que permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula objetivo portando antígeno y subsecuentemente maten a la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son absolutamente requeridos para tal matanza. Las células primarias para mediar la ADCC, células NK, expresan FCYRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI , FcyRII, y FCYRIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo in vi tro de la ADCC, como el descrito en la Patente US 5,500,362 y 5,821,337. Células efectoras útiles para estos análisis incluyen las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y células Asesinas Naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, como lo divulgado en Clynes et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA) 95:652-656 (1998).

"Receptor de Fe" o "FcR" describe un receptor que se liga a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Más aun, un FcR preferido es uno que se liga a un anticuerpo de IgG (receptor gamma) e incluye receptores de las sub-clases FcyRI, FcyRII, y FCYRIII, incluyendo las variantes alélicas y alternativamente formas empalmadas de estos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FCYRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias similares de aminoácidos que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene en su dominio citoplasmático un motivo de activación a base de tirosina inmuno-receptor (ITAM) . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene en su dominio citoplasmático un motivo de inhibición a base de tirosina inmuno-receptor (ITIM) (ver reseña en Daéron M . , Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994), y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) . Otros FcR, incluyendo aquellos a ser identificados en el futuro, están abarcados por el término "FcR" presente. El término también incluye al receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable por la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).

"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan por lo menos FcyRIII y realizan función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas, y neutrófilos ; con PBMCs y células NK siendo preferidas. Las células efectoras se pueden aislar a partir de una fuente nativa, v . gr . , de sangre .

"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia del complemento. La activación de la trayectoria clásica del complemento se inicia por la ligadura del primer componente del sistema del complemento (Clq) a los anticuerpos (de la sub-clase apropiada) que están ligados a su antígeno afin. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC, v.gr., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Métodos 202:163 (1996).

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso de un tumor (v.gr., un tumor cánceroso) , la cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo o fragmento de anticuerpo (v.gr., un anticuerpo o fragmento de anticuerpo multi-específico que se liga específicamente a HER2 y VEGF) puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, reducir en velocidad en cierta medida y de preferencia detener) la infiltración de células de cáncer hacia órganos periféricos; inhibir (es decir, reducir en velocidad en cierta medida y de preferencia detener) metástasis del tumor; inhibir, en cierta medida, crecimiento del tumor; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puedan impedir el crecimiento y/o destruir las células cáncerosas ya existentes, pueden ser citostáticos y/o citotóxicos . Para terapia de cáncer, la eficacia in vivo puede, por ejemplo, ser medida por la evaluación de la duración de la supervivencia, el tiempo de progresión de la enfermedad (TTP) , las tasas de respuesta (RR) , la duración de la respuesta, y/o calidad de vida.

Por "reducir o inhibir" se entiende la habilidad para ocasionar una disminución global de preferencia de 20% o más, más preferentemente de 50% o más, y más preferiblemente del 75%, 85%, 90%, 95% o mayor. Reducir o inhibir puede referirse a los síntomas del trastorno a tratar, la presencia o el tamaño de las metástasis, el tamaño del tumor primario, o el tamaño o el número de los vasos sanguíneos en los trastornos angiogénicos .

Los términos "cáncer" y "cánceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento/proliferación irregulares de células. En esta definición están incluidos cánceres benignos y malignos. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limita a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos mas particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer de estómago o gástrico incluyendo cáncer gastro- intestinal , cáncer de páncreas, glioblastoma , glioma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon (v.gr., carcinoma de células renales) , cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Por "cáncer en etapa temprana" se entiende un cáncer que no es invasivo o metastásico o se clasifica como un cáncer en etapa 0, I o II.

El término "pre-cánceroso" se refiere a una condición o un crecimiento que normalmente precede a o se convierte en un cáncer .

Por "no metastásico" se entiende un cáncer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado hacia el sistema linfático o de vasos sanguíneos o a tejidos distintos del sitio primario. En general, un cáncer no metastásico es cualquier cáncer en una etapa 0, I o II, y ocasionalmente un cáncer en etapa III.

Una "enfermedad o trastorno no maligno que involucra la activación anormal de HER2" es una condición que no implica un cáncer en donde ocurre la activación anormal de HER2 en las células o el tejido del sujeto teniendo, o predispuesto a, la enfermedad o trastorno. Ejemplos de tales enfermedades o trastornos incluye enfermedades autoinmunes (v.gr., psoriasis), ver definición mas adelante; endometriosis , esclerodermia, restenosis, pólipos tales como pólipos de colon, pólipos nasales o pólipos gastro- intestinales, fibroadenoma , enfermedad respiratoria (v.gr., bronquitis crónica, asma, incluyendo asma aguda y asma alérgica, fibrosis quística, bronquiectasias , sinusitis o rinitis alérgica, deficiencia de anti-tripsina al, tos, enfisema pulmonar, fibrosis pulmonar o vías respiratorias hiper-reactivas , enfermedad pulmonar obstructiva crónica y trastorno pulmonar obstructivo crónico) ; colecistitis; neurofibromatosis , enfermedad poliquística renal, enfermedades inflamatorias, enfermedades de la piel como psoriasis y dermatitis, enfermedades vasculares; condiciones que implican proliferación anormal de células epiteliales vasculares, úlceras gastrointestinales, enfermedad de Ménétrier, adenomas secretores o síndrome de pérdida de proteínas, trastornos renales, trastornos angiogénicos , enfermedad ocular como degeneración macular relacionada con la edad, síndrome de presunta histoplasmosis ocular, neovascularización retiniana de retinopatía diabética proliferativa, vascularización retiniana, retinopatía diabética o degeneración macular relacionada con la edad; patologías asociadas con los huesos como osteoartritis , raquitismo y osteoporosis , daños tras un evento isquémico cerebral; enfermedades fibrósicas o de edemia tales como cirrosis hepática, fibrosis pulmonar, carcoidosis, tiroiditis, síndrome de hiperviscosidad sistémico, enfermedad de Osler Weber-Rendu, enfermedad pulmonar oclusiva crónica, o edema después de quemaduras, trauma, radiación, apoplejía, hipoxia o isquemia, reacción de hipersensibilidad de la piel; retinopatía diabética y nefropatía diabética; síndrome de Guillain-Barré; enfermedad injerto contra hospedero o rechazo de trasplantes; enfermedad de Paget; inflamación de articulaciones o huesos; foto-enve ecimiento (v.gr., ocasionado por radiación UV de la piel humana) ; hipertrofia benigna de próstata; ciertas infecciones microbianas incluyendo patógenos microbianos seleccionados a partir de adenovirus, hantavirus, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp. y Bordetella pertussis; trombosis causada por aglomeración de plaquetas; condiciones reproductivas como endometriosis , síndrome de hiper-estimulación de ovarios, pre-eclampsia , hemorragia uterina disfuncional, o menometrorragia ; sinovitis; ateroma; nefropatías agudas y crónicas (incluyendo glomerulonefritis proliferativa y enfermedad renal inducida por diabetes) ; eczema; formación de cicatrices hipertróficas; choque endotóxico e infección por hongos; adenomatosis poliposis familiar, enfermedades neurodegenerativas (v.gr., enfermedad de Alzheimer, demencia relacionada con el SIDA, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, atrofia muscular espinal y degeneración del cerebelo) ; síndromes mielodisplásicos ; anemia aplásica; lesión isquémica; fibrosis de pulmón, riñon o hígado; enfermedad de hiper- sensibilidad mediada por células T; estenosis pilórica hipertrófica infantil; síndrome de obstrucción urinaria; artritis psoriásica; y tiroiditis de Hasimoto.

Una "enfermedad auto- inmune" presente es una enfermedad o trastorno que surge de y dirigido contra los propios tejidos de un individuo o una co-segregación o manifestación de los mismos o condición resultante de los mismos. Ejemplos de enfermedades o trastornos auto- inmunes incluyen, pero no se limitan a, artritis (artritis reumatoide tal como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, artritis vertebral, y artritis reumatoide que aparece en la juventud, osteoartritis , artritis progrediente crónica, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, y espondilitis anquilosante) , enfermedades inflamatorias de la piel hiper-proliferativas , psoriasis tal como psoriasis en placa, gutatte psoriasis, psoriasis pustulosa, y psoriasis de las uñas, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiforme , y dermatitis atópica, síndrome de hiper-IgM ligado al cromosoma x, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria crónica auto- inmune, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma (incluyendo escleroderma sistémica) , esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (E ) tal como MS espino-óptica, EM progresiva primaria (EMPP) , y EM remitente reincidente (EMRR) , esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis , arteriesclerosis, esclerosis diseminada y esclerosis atáxica, enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, las enfermedades gastrointestinales mediadas auto-inmunes, colitis tal como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante , y colitis transmural, y enfermedad inflamatoria intestinal auto-inmune) , pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, epiescleritis) , síndrome de dificultad respiratoria incluyendo síndrome de dificultad respiratoria de adultos o aguda (SDRA) , meningitis, inflamación de la totalidad o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico auto- inmune, espondilitis reumatoide, pérdida repentina de la audición, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxia y rinitis alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o de tronco cerebral, uveítis, tal como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis granulomatosa, uveítis facoantigénica , uveítis posterior, o uveítis auto-inmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN mediada inmunológicamente , GN membranosa (nefropatía membranosa) , GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa membrano o membranosa (GNPM) , incluyendo tipo I y tipo II, y GN rápidamente progresiva, condiciones alérgicas, reacción alérgica, eczema incluyendo eczema alérgico o atópico, asma tal como asma bronquial, asma bronquial, y asma auto- inmune, condiciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis auto- inmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus eritematodes sistémico tal como LES cutáneo, lupus eritematoso cutáneo sub-agudo, síndrome de lupus neonatal (NLE) , lupus eritematoso diseminado, lupus (incluyendo nefritis, encefalitis, pediátrico, no renal, extra-renal, discoide, alopecia), diabetes mellitus de inicio juvenil (tipo I) , incluyendo diabetes mellitus dependiente de insulina pediátrico (DMDI) , diabetes mellitus de inicio en adultos (diabetes tipo II) , diabetes auto-inmune, diabetes insípida idiopática, respuestas inmunes asociadas con hiper-sensibilidad aguda y retardada mediadas por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis , vasculitides , incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu) ) , vasculitis de vasos medianos (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa) , poliarteritis microscópica, vasculitis del SNC, vasculitis necrotizante , cutánea, o de hiper-sensibilidad, vasculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociada a ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS) ) , arteritis de la temporal, anemia aplástica, anemia aplástica auto-inmune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune incluyendo anemia hemolítica auto-inmune (AHAI) , anemia perniciosa (anemia perniciosa), enfermedad de Addison, anemia pura de células rojas o aplasia (APCR) , deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia auto- inmune, pancitopenia , leucopenia, enfermedades involucrando diapédesis leucocitos, trastornos inflamatorios del SNC, el síndrome de lesión de múltiples órganos tales como aquellos secundarios a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal anti-glomerular , síndrome de anticuerpo anti- fosfolípidos , neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Raynaud, Síndrome de Sjógren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide ampolloso y penfigoide de la piel, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo de moco-penfigoide de membrana, y pénfigo eritematoso) , poliendocrinopatías auto- inmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis por inmuno-complej os , nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis óptica, polineuropatías , neuropatía crónica tal como polineuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (según se desarrolla por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo) incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y trombocitopenia auto- inmune inmuno-mediada tal como púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) incluyendo PTI crónica o aguda, enfermedad auto- inmune de los testículos y ovarios incluyendo orquitis auto- inmune y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas auto-inmunes incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis auto-inmune, la enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) , o tiroiditis sub-aguda, enfermedad tiroidea auto- inmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares auto- inmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular) , síndromes paraneoplásicos , incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como síndrome miasténico de Lambert -Eaton o síndrome de Eaton-Lambert , síndrome de hombre rígido o de persona rígida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica y la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , miastenia gravis tal como miastenia gravis asociada a timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonía, opsoclono o síndrome de opsoclono mioclono (SO ) , y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis auto- inmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica auto-inmune, neumonitis intersticial linfoide, bronquiolitis obliterante (sin trasplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré , enfermedad de Berger (nefropatía por IgA) , nefropatía por IgA idiopática, dermatosis de IgA lineal, cirrosis biliar primaria, neumono- cirrosis , síndrome de enteropatía auto-inmune, enfermedad celíaca, enfermedad celíaca, esprue celíaco (enteropatía por gluten) , esprue refractario, esprue idiopático, crioglobulinemia , esclerosis lateral amilotrófica (ELA, enfermedad de Lou Gehrig) , enfermedad arterial coronaria, enfermedad auto- inmune del oído tal como enfermedad auto-inmune del oído interno (EAOI) , pérdida de la audición auto-inmune, síndrome de opsoclono mioclono (SOM) , policondritis tal policondritis refractaria o reincidente, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, linfocitosis no cáncerosa, una linfocitosis primaria, la cual incluye linfocitosis monoclonal de células B (v.gr., gammapatía monoclonal benigna y garnmopatia monoclonal de significado incierto, GMSI) , neuropatía periférica, síndrome para-neoplásico , canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria , glomeruloesclerosis segmental focal (GESF) , oftalmopatía endocrina, uveoretinitis , coriorretinitis , trastornos hepatológicos auto- inmunes , fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades auto- inmunes desmielinizantes , nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, alteración de la motilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasias) , infertilidad auto-inmune masculina y femenina, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome post-cardiotomía , síndrome de Cushing, pulmón pajarero, angiitis alérgica granulomatosa , angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a la transfusión, lepra, malaria, leishmaniasis , kipanosomiasis , esquistosomiasis , ascariasis, aspergilosis , síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis , eritema elevado y diutino, eritroblastosis fetal, faciitis eosinofílica , síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis , o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), infección por ecovirus, cardiomiopatía , enfermedad de Alzheimer, infección por parvovirus, infección por virus de la rubéola, síndromes post-vacunación, infección por rubéola congénita, infección por virus de Epstein-Barr , parotiditis, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal auto-inmune, corea de Sydenham, nefritis post-estreptocócica, tromboangitis uberans, tirotoxicosis , tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de células gigantes, oftamopatía endocrina, neumonitis por hipersensibilidad crónica, querato-conjuntivitis seca, querato- conjuntivitis epidémica, síndrome nefrótico idiopático, nefropatía de cambios mínimos, lesión por reperfusión de isquemia y familiar benigna, auto- inmunidad de la retina, inflamación de las articulaciones, bronquitis, enfermedad de vías aéreas obstructiva crónica, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos , aspermiogenesa , hemolisis auto- inmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, febris reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida de la audición sensoneural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileitis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema idiopática primaria, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa orquitis, pancreatitis, poliradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tireoiditis de Quervain, atrofia espénica adquirida, infertilidad debida a anticuerpos anti-espermatozoarios , timoma no maligna, vitíligo, enfermedades asociadas con SCID y virus Epstein-Barr , síndrome de inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) , enfermedades parasitarias tales como Leishmania, síndrome de choque tóxico, intoxicaciones alimentarias, condiciones que involucran infiltración de células T, deficiencia de adhesión leucocitaria, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediadas por citocinas y linfocitos T, enfermedades que involucran diapédesis de leucocitos, síndrome de lesiones de órganos múltiples, enfermedades mediadas por complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal anti-glomerular , neuritis alérgica, poliendocrinopatías auto- inmunes , ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmune, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmune de tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de aparición en adultos (HIAA) , alopecia total, cardiomiopatía dilatada, epidermolisis bullosa adquirida (EBA) , hemocromatosis , miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoidal, frontal, maxilar, o esfenoidal, trastorno relacionado con eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia de infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica , aspergiloma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritides seronegativas , enfermedad auto- inmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclerótica, epiesclerótica, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogamma-globulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia , trastornos auto-inmunes asociados con enfermedades del colágeno, reumatismo, enfermedades neurológicas , trastorno de reperfusión isquémica, reducción en la respuesta de la presión arterial, disfunción vascular, antgiectasis , lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral y enfermedad acompañante de vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritides , lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de los tejidos del miocardio u otros, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros desórdenes inflamatorios del sistema nervioso central, enfermedades inflamatorias oculares y orbitales, síndromes asociados con transfusión de granulocitos , toxicidad inducida por citocinas, inflamación grave aguda, inflamación crónica intratable, pielitis, neumono-cirrosis , retinopatía diabética, trastorno diabético de arterias grandes, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis, y endometriosis .

Un "agente anti-angiogénesis" o "inhibidor de angiogénesis" se refiere a sustancias de pequeño peso molecular, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante , un anticuerpo o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhiben la angiogénesis , vasculogénesis , o la permeabilidad vascular indeseables, ya sea directamente o indirectamente. Por ejemplo, un agente anti-angiogénesis es un anticuerpo u otro antagonista a un agente angiogénico como se define anteriormente, v.gr., anticuerpos contra VEGF (v.gr., bevacizumab (AVASTIN) , bHl, bHl-44, bHl-81), anticuerpos a receptores de VEGF, pequeñas moléculas que bloquean la señalización del receptor de VEGF (v.gr., PTK787/ZK2284 , SU6668, SUTENT/SU11248 (malato de sunitinib) , AMG706) . Agentes anti -angiogénesis incluyen inhibidores de angiogénesis nativos, v.gr., angiostatina, endostatina, etc. Véase, v.gr., Klagsbrun y D'Amore, Annu. i?ev. Physiol., 53:217-39 (1991), Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (v.gr., la Tabla 3 listando terapia anti-angiogénica en melanoma maligno) , Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5 (12) : 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (v.gr., la Tabla 2 listando factores anti-angiogénicos) , y, Sato Int. J. Clin. Oncol . , 8:200-206 (2003) (v.gr., la Tabla 1 enumera agentes anti-angiogénicos utilizados en ensayos clínicos) . Alteración de la regulación de la angiogénesis puede conducir a muchos trastornos que pueden ser tratados por las composiciones y métodos de la invención. Estos trastornos incluyen tanto condiciones no neoplásticas y neoplásticas .

El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de un célula y/u ocasiona la destrucción de una célula. El término tiene la intención de incluir isótopos radiactivos (v.gr., At211, 3- 13 G ? 125 ( ? 90 ; Re186 ( Re1881 8 g ( ^153 ^ ^223 ^ p 3 2 ( e i g ó t opo s radiactivos de Lu) , agentes de quimioterapia, v.gr., metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina , vinblastina, etopósido) , doxorrubicina , melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina y otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas , antibióticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, de hongos, de plantas o de animales, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y diversos agentes anti-tumorales o anti-cáncerosos revelados en la presente. Otros agentes citotóxicos son descritos en la presente. Un agente tumoricida ocasiona la destrucción de células tumorales.

Un "agente de quimioterapia" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterápicos son agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXA , sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina , trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina ; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) , delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL) , beta- lapacona ; lapacol; colquicina, ácido betulínico, una camptotecina (incluyendo el análogo sintético de topotecano (HYCA TIN) , CPT-11 ( irinotecano, CAMPTOSAR) , acetilcamptotecina , escopolectina , y 9-aminocamptotecina) ; briostatina ; calistatina, CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos: adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina, ácido podofilinico; tenipósido; criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina ; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina pancratistatina , una sarcodictina ; espongistatina ; mostazas nitrogenadas, tales como el clorambucilo, mecloretamina clornafazina , colofosfamida, estramustina , ifosfamida, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina , trofosfamida , mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina ; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (v.gr., caliqueamicina , especialmente caliqueamicina gamma 1 (véase, v.gr., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina, así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de cromo-proteína eneidina relacionados), aclacinomisinas , actinomicina , autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina , carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorubicina , detorubicin, 6 -diazo-5-oxo-L-norleucina , doxorrubicina ADRIAMYCIN (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como la mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina , estreptozocina , tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) , análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6 -mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina , doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona , epitiostanol , mepitiostano, testolactona ; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostane; restablecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona,- aldofosfamida glucósido, ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina ; acetato de eliptinio, una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea ; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona ; mitoxantrona ; mopidanmol ; nitraerina; pentostatina ; fenamet; pirarrubicin; losoxantrona ; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacáridos PS (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxane; rizoxina; sizofirano; espirogermanio , ácido tenuazónico ; triazicuona, 2,2' , 2 " -triclorotrietilamina ; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano ; vindesina (ELDISINE, FILDESIN) ; dacarbazina mannomustina ; mitobronitol ; mitolactol; pipobromano ; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, v.gr., paclitaxel TAXOL (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , formulación de paclitaxel en nano-partículas diseñada por albúmina, libre de Cremophor ABRAXANE (American Pharmaceutical Partners, Schaumburg, Illinois) , y doxetaxel TAXOTERE (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; chloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR) ; 6 -tioguanina mercaptopurina ; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina , vinblastina (VELBAN) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosf mida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN) , oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina ; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA) ; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para la terapia combinada de ciclofosfamida , doxorrubicina , vincristina y prednisolona , y FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN) en combinación con 5-FU y leucovovina .

También incluidos en esta definición están agentes antihormonales que actúan para regular, reducer, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que puedan promover el crecimiento del cáncer, y se encuentra generalmente en la forma de un tratamiento sistémico o de cuerpo completo. Pueden ser las hormonas mismas. Ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs) , incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (que incluye tamoxifeno NOLVADEX) , raloxifeno EVISTA, droloxifeno, 4 -hidroxitamoxifeno, trioxifeno, cetoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno FARESTON; anti-progesteronas ; reguladores hacia abajo del receptor de estrógeno (ERD) , agentes que funcionan para suprimir o apagar los ovarios, por ejemplo, agonistas de hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) tales como LUPRON y acetato de leuprolida ELIGARD, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina ; otros anti-andrógenos como flutamida, nilutamida y bicalutamida ; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, la cual regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5) -imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol EGASE, exemestano AROMASIL, formestania, fadrozola, vorozola RIVISOR, letrozola FEMARA, y anastrozola ARIMIDEX. Además, tal definición de agentes quimioterápicos incluye bifosfonatos como clodronato (por ejemplo, BONEFOS u OSTAC) , etidronato DIDROCAL, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato ZO ETA, alendronato FOSAMAX, pamidronato AREDIA, tiludronato SKELID o risedronato ACTONEL, así como troxacitabina (un análogo de 1 , 3 -nucleósido dioxolano citosina); oligonucleótidos anti-sentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en las trayectorias de señalización implicadas en proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf , H-Ras, y el factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como vacuna THERATOPE y vacunas de terapia de genes, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN, vacuna LEUVECTIN y vacuna VAXID; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECA ; rmRH ABARELIX; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de moléculas pequeñas de tirosina quinasa dual de ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016) , y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Un "agente de inhibición del crecimiento" cuando es usado en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula ya sea in vi tro o in vivo. Por lo tanto, el agente de inhibición del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en la fase S. Ejemplos de agentes de inhibición del crecimiento incluyen agentes que bloquean el ciclo de progresión celular (en un lugar distinto de la fase S) , tales como agentes que inducen la detención de Gl y la detención de la fase M. Bloqueadores clásicos de la fase M incluyen los vincas (v.gr., vincristina y vinblastina) , taxanos , e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina , etoposida, y bleomicina. Los agentes que detienen Gl también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilatados de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5 - fluorouracilo, y ara-C. Información adicional puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds . , Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia , 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anti-cáncer ambos derivados del tejo. Docetaxel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo europeo, es un análogo semi-sintético de paclitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de micro-túbulos a partir de dímeros de tubulina y micro-túbulos estabilizados mediante la prevención de la despolimerización, lo cual resulta en la inhibición de la mitosis en las células.

"Terapia anti-cáncer" como se usa en la presente se refiere a un tratamiento que reduce o inhibe el cáncer en un sujeto. Ejemplos de terapia anti-cáncer incluyen radioterapia citotóxica así como la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente de inhibición del crecimiento, una vacuna de cáncer, un inhibidor angiogénico, un pro- fármaco, una citocina, un antagonista de citocina, un corticoesteroide , un agente inmunosupresivo, un anti-emético, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o un analgésico al sujeto.

El término "pro-fármaco" como se utiliza en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico para células tumorales en comparación con el fármaco original y es capaz de ser activado enzimáticamente o convertido hacia la forma más activa original. Véase, v.gr. , Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions , 14, pp. 375-382, 615a sesión Belfast (1986) y Stella et al. "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Profármacos incluyen, pero no se limitan a, pro-fármacos que contienen fosfato, pro-fármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, pro- fármacos que contienen péptidos, pro-fármacos modificados por aminoácido D, pro-fármacos glicosilados , pro-fármacos que contienen beta-lactama, opcionalmente pro- fármacos que contienen fenoxiacetamida sustituida u opcionalmente pro- fármacos que contienen fenilacetamida sustituida, 5- fluorocitosina y otros pro-fármacos de 5-fluorocitosina que puede convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivarse en una forma pro- fármaco para su uso en la presente invención incluyen, pero se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

El término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores inter-celulares . Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas polipeptídicas tradicionales. Se incluyen entre las citocinas las hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana (HGH) , hormona de crecimiento humana N-metionilo, y la hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidea ; tiroxina; insulina; pro- insulina, relaxina; pro-relaxina ; hormonas de glicoproteína tales como hormona estimulante de folículo (FSH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) , y la hormona luteinizante (LH) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) ; prolactina; lactógeno de la placenta; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mülleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento de nervios tales como NGF-alfa; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como el TGF-alfa y TGF-beta, factores de crecimiento I y II similares a insulina; eritropoyetina (EPO) , factores osteo-inductivos; interferones tales como el interferón alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonias (CSF) tales como los CSF de macrófagos (M-CSF) ; CSF de granulocitos macrófagos (GM-CSF) , y CSF de granulocitos (G-CSF) , interleucinas (IL) , tales como IL-1, IL-lalfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, un factor de necrosis tumoral como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y el ligando de kit (KL) . Como se usa en la presente, el término citocina incluye proteínas a partir de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

Por "antagonista de citocina" se entiende una molécula que parcialmente o completamente bloquea, inhibe o neutraliza la actividad biológica de al menos una citocina. Por ejemplo, los antagonistas de citocina pueden inhibir la actividad de las citocinas mediante inhibición de la expresión y/o secreción de citocinas, o mediante ligarse a una citocina o a un receptor de citocina. Antagonistas de citocinas incluyen los anticuerpos, péptidos de secuencia sintética o nativa, inmuno-adhesinas , y antagonistas de moléculas pequeñas que se ligan a una citocina o receptor de citocina. El antagonista de citocina es opcionalmente conjugado con o fusionado a un agente citotóxico. Antagonistas de TNF ejemplares son etanercept (ENBREL) , infliximab (REMICADE) y adalimumab (HUMIRA) .

El término "agente inmunosupresor" como se usa en la presente se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmunológico del sujeto que est siendo tratado. Esto incluye sustancias que suprimen la producción de citocinas, regula a la baja o reprime expresión de auto-antígenos, o enmascara a los antígenos MHC. Ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (véase patente US 4,665,077), micofenolato mofetilo como CELLCEPT; azatioprina (IMURAN, AZASAN) , 6 -mercaptopurina ; bromocriptina, danazol, dapsona, glutaraldehído (que enmascara los antígenos de MHC, como se describe en la patente US 4,120,649); anticuerpos anti- idiotípicos para antígenos de MHC y fragmentos de MHC, ciclosporina A, esteroides, tales como corticosteroides y glucocorticosteroides , v.gr., prednisona, prednisolona tal como PEDIAPRED (fosfato de sodio prednisolona) u ORAPRED (solución oral de fosfato de sodio prednisolona) , metilprednisolona y dexametasona ; metotrexato (oral o subcutáneo) (RHEUMATREX, TREXALL) hidroxiclorocina/clorocina ; sulfasalazina, leflunomida, antagonistas de citocina o del receptor de citocina incluyendo anticuerpos anti-interferón-?, ßt , o - , anticuerpos anti-factor de necrosis tumoral a (infliximab o adalimumab) , inmuno-adesina anti-TNFa (ENBREL, etanercept) , anticuerpos anti-factor de necrosis tumoral-ß, anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos anti-receptor de IL-2; anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo anticuerpos anti-CDlla y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocitos heteróloga ; anticuerpos policlonales o pan-T, o anticuerpos monoclonales anti-CD3 o anti -CD4/CD4a péptidos solubles conteniendo un dominio de ligadura a LFA-3 (WO 1990/08187, publicada el 26 de julio de 1990); estreptoquinasa ; el TGF-ß; estreptodornasa; ARN o ADN del hospedero; FK506; RS-61443; desoxispergualina ; rapamicina; receptor de células T (Cohén et al., patente US 5,114,721), fragmentos de receptor de células T (Offner et al. Science, 251:430-432 (1991); WO 1990/11294; Ianeway, Nature, 341:482 (1989), y WO 1991/01133); anticuerpos del receptor de células T (EP 340,109) tales como T10B9; ciclofosfamida (CYTOXAN) ; dapsona, penicilamina (CUPRIMIE) , intercambio de plasma; o inmunoglobulina intravenosa (IglV) . Estos pueden ser usados solos o en combinaciones entre sí, particularmente combinaciones de esteroides y otro agente inmuno- supresor o tales combinaciones seguidas por una dosis de mantenimiento con un agente no esteroidal para reducir la necesidad de esteroides.

Un "analgésico" se refiere a un fármaco que actúa para inhibir o suprimir el dolor en un sujeto. Analgésicos ejemplares incluyen fármacos anti- inflamatorios no esteroidales (NSAIDs) incluyendo ibuprofeno (MOTRIN) , naproxeno (NAPROSYN) , ácido acetilsalicílico, indometacina , sulindac, y tolmetina, incluyendo sales y derivados de los mismos, así como varios otros medicamentos utilizados para reducir los dolores punzantes que pudieran ocurrir, incluyendo anti -convulsi os (gabapentina, feniloína, carbamacepina) o anti-depresivos tricíclicos. Ejemplos específicos incluyen paracetamol, aspirina, amitriptilina (ELAVIL) , carbamazepina (TEGRETOL) , feniltoína (DILA TIN) , gabapentina (NEURONTIN) , (E) -N-vanillil- 8-metil-6-noneamida (CAPSAICIN) , o un bloqueador de los nervios.

"Corticoesteroide" se refiere a cualquiera de varias substancias sintéticas o naturales con la estructura química general de esteroides que imitan o aumentan los efectos de los corticoesteroides naturales. Ejemplos de corticoesteroides sintéticos incluyen prednisona, prednisolona (incluyendo metilprednisolona) , dexametasona triamcinolona , y betametasona .

Una "vacuna contra el cáncer" , como se usa en la presente es una composición que estimula una respuesta inmunológica en un sujeto contra un cáncer. Vacunas contra el cáncer típicamente consisten en una fuente de materiales o células asociados al cáncer (antígeno) que pueden ser autólogos (del mismo) o alogénicos (de otros) al sujeto, junto con otros componentes (v.gr. , coadyuvantes) para estimular e impulsar adicionalmente la respuesta inmune contra el antígeno. Las vacunas contra el cáncer resultan deseablemente en estimulación del sistema inmunológico del sujeto para producir anticuerpos contra uno o varios antígenos específicos, y/o para producir células asesinas T para atacar a las células cáncerosas que tienen esos antígenos.

"Radioterapia citotóxica" como se usa en la presente se refiere a la terapia con radiación que inhibe o impide la función de células y/u ocasiona destrucción de las células. La terapia con radiación puede incluir, por ejemplo, irradiación de haz externa o terapia con un agente de marcado radiactivo, tal como un anticuerpo. El término tiene la intención de incluir el uso de isótopos radiactivos (v.gr., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223 , P32, y los isótopos radiactivos de Lu) .

Una "anti-emético" es un compuesto que reduce o previene las náuseas en un sujeto. Compuestos anti -eméticos incluyen, por ejemplo, antagonistas del receptor de neuroquinina- 1 , antagonistas del receptor de 5HT3 (como el ondansetrón, granisetrón, tropisetrón, y zatisetrón) , agonistas del receptor de GABAB, tal como baclofeno, un corticosteroide tal como la dexametasona, KENALOG, ARISTOCORT, o NASALIDE , un anti-dopaminérgico, fenotiazinas (por ejemplo, proclorperazina, flufenazina, tioridazina, tioridazina y mesoridazine ) , dronabinol, metroclopramida, domperidona, haloperidol, ciclizina, lorazepam, proclorperazina, y levomepromazina .

Un "sujeto" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Mamíferos incluyen, pero no se limitan a animales de granja (tales como vacas) , animales de deportes, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas.

Reactivos disponibles comercialmente a los que se refiere en los ejemplos se utilizan según las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a través de la especificación, por números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. A menos que se indique lo contrario, la presente invención utiliza procedimientos estándar de la tecnología del ADN recombinante , tales como los descritos anteriormente en la presente y en los libros de texto siguientes: Sambrook et al., supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates y Wiley Interscience, NY, 1989) ; Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: NY, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984) ; Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones, la palabra "comprende" , o variaciones como "comprendiendo" o "que comprende" se entenderá implicando la inclusión de un número entero o grupo de números enteros declarado, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros .

II. Vectores, Células Hospederas, y Métodos Recombinantes Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que lo codifica es aislado e insertado en un vector replicable para su posterior clonación (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica al anticuerpo es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (v.gr., mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de ligarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Muchos vectores están disponibles. La elección del vector depende en parte de la célula hospedera a ser utilizada. Generalmente, las células hospederas preferidas son de origen ya sea procariotas o eucariotas (generalmente de mamíferos) . Se apreciará que las regiones constantes de cualquier isotipo pueden utilizarse para este propósito, incluyendo las regiones constantes de igG, igM, IgA, IgD, e IgE, y que tales regiones constantes pueden obtenerse a partir de cualquier especie humana o animal. a. Generación de anticuerpos usando células hospederas procariotas : i. Vector de construcción Las secuencias de polinucleótidos que codifican los componentes de polipéptido del anticuerpo de la invención pueden obtenerse usando técnicas recombinantes estándar. Las secuencias de polinucleótidos deseadas pueden aislarse y secuenciarse a partir de células productoras de anticuerpo tales como células de hibridoma. Alternativamente, polinucleótidos pueden sintetizarse usando técnicas de sintetización o PCR de nucleótidos. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipeptidos se insertan en el vector recombinante capaz de replicarse y expresar polinucléotidos heterólogos en hospederos procariotas. Muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la materia pueden usarse para los propósitos de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos a ser insertados en el vector y a la célula hospedera particular a ser transformada con el vector. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo, o ambos) y su compatibilidad con la célula hospedera particular en la cual reside. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de ligadura de ribosomas (RBS) , una secuencia de señal, la inserción de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de transcripción.

En general, vectores de plásmidos que contienen secuencias de replicación y control que se derivan de especies compatibles con la célula hospedera, se utilizan en conexión con estos hospederos. El vector normalmente lleva un sitio de replicación, así como secuencias de marcado que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli típicamente se transforma usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y por lo tanto proporciona medios fáciles para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos pueden además contener, o pueden modificarse para contener, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados de pBR322 utilizados para expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Cárter et al., patente US 5,648,237.

Además, vectores de fago conteniendo secuencias de replicación y control que son compatibles con el microorganismo hospedero pueden ser utilizados como vectores de transformación en conexión con estos hospederos. Por ejemplo, bacteriófagos tales como GEM.TM.-ll pueden ser utilizados en la fabricación de un vector recombinante que puede ser utilizado para transformar células hospederas susceptibles tales como E. coli LE392.

El vector de expresión vector de la invención puede comprender dos o más pares de promotor-cistrón, que codifican cada uno de los componentes del polipéptido. Un promotor es una secuencia regulatoria no traducida situado corriente arriba (5') a un cistrón que modula su expresión. Promotores procariotas típicamente caen en dos clases, inducible y constitutivo. Un promotor inducible es un promotor que en respuesta a cambios en la condición del cultivo inicia niveles elevados de transcripción del cistrón bajo su control, v.gr., la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.

Son bien conocidos, un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células hospederas potenciales. El promotor seleccionado puede enlazarse operativamente a ADN de cistrón que codifica la cadena ligera o pesada mediante remover al promotor de la fuente de ADN mediante digestión de enzima de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de la invención. Tanto la secuencia promotora nativa y muchos promotores heterólogos pueden utilizarse para amplificación y/o expresión directas de los genes objetivo. En algunas formas de realización, promotores heterólogos son utilizados, ya que en general permiten una mayor transcripción y rendimientos más altos del gen objetivo expresado según se compara con el promotor de polipéptido objetivo nativo.

Promoteres adecuados para uso con hospederos procariotas incluyen los sistemas del promotor PhoA, ß-galactamasa y promotor de lactosa, un sistema promotor de triptofano (trp) y promotores híbridos tales como los promotores tac o trc . Sin embargo, son igualmente adecuados otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos) . Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo así que un técnico en la materia pueda ligarlos con cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas objetivo (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) usando enlazadores o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido .

En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia de señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN de polipéptido objetivo que se inserta en el vector. La secuencia de señal seleccionada para el propósito de esta invención debe ser una que es reconocida y procesada (es decir, disociada por una peptidasa de señal) por la célula hospedera. Para células hospederas procariotas que no reconocen y procesan las secuencias de señal nativas de los polipéptidos heterólogos, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo que consiste de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o puntas de enterotoxina II (StlI) estables al calor, LamB, PhoE, PelB, OmpA, y MBP. En una forma de realización de la invención, las secuencias de señal utilizadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias de señal STII o variantes de las mismas.

En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas de acuerdo con la invención puede ocurrir en el citoplasma de la célula hospedera, y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. En ese sentido, las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina son expresadas, plegadas y ensambladas para formar inmunoglobulinas funcionales en el citoplasma. Ciertas cepas hospederas (v.gr., las cepas trxB de E. coliB) establecen las condiciones de citoplasma que son favorables para la formación de puentes de disulfuro, con ello permitiendo el pliegue y ensamblaje apropiados de sub-unidades de proteína expresadas (Proba y Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)).

Células hospederas procariotas adecuadas para expresar anticuerpos de la invención incluyen Archaebacteria y Eubacteria, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos . Ejemplos de bacterias útiles incluyen las especies Escherichia (v.gr., E. coli) , Bacilli (v.gr., B. subtilis) , Enterobacteria, Pseudomonas (v.gr., P. aeruginosa) , Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla , o Paracoccus . En una forma de realización, son usadas las células gram-negativas . En una forma de realización, células E. coli son usadas como hospederas para la invención. Ejemplos de cepas E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol . 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; no. De depósito ATCC 27,325) y derivados de la misma, incluyendo la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ??p???? (nmpc-fepE) degP41 kanR (patente US 5,639,635). También son adecuadas otras cepas y derivados de las mismas, tales como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli ? 1776 (ATCC 31,537) y E. coli RV308 (ATCC 31,608). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitativos. Métodos para la construcción de derivados de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas teniendo genotipos definidos son conocidos en la materia y se describen en, por ejemplo, Bass et al., Proteínas, 8:309-314 (1990). Generalmente es necesario seleccionar las bacterias adecuadas tomando en consideración la capacidad de replicación del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, cuando plásmidos bien conocidos como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 son usados para suministrar el replicón, pueden utilizarse adecuadamente las especies E. coli, Serratia, o especies de Salmonella como el hospedero. Típicamente la célula hospedera debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas , e inhibidores de proteasa adicionales pueden ser deseables de incorporarse en el cultivo de células. ii. Producción de Anticuerpo Células hospederas se transforman con los vectores de expresión anteriormente descritos y cultivadas en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que condifican las secuencias deseadas.

Transformación significa introducir ADN en el hospedero procariota de tal forma que el ADN sea replicable, ya sea como un elemento extra-cromosómico o por integrante cromosómico. Dependiendo de la célula hospedera utilizada, transformación se lleva a cabo usando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento de calcio empleando cloruro de calcio se utiliza generalmente para las células bacterianas que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro método para la transformación emplea polietileno glicol/DMSO. Aun otra técnica utilizada es la electroporación .

Las células procariotas utilizadas para producir los polipéptidos de la invención son cultivadas en medios conocidos en la materia y adecuados para cultivar las células hospederas seleccionadas. Ejemplos de medios adecuados incluye caldo de Luria (LB) , más los suplementos de nutrientes necesarios. En algunas formas de realización, los medios también contienen un agente de selección, elegido con base en la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, la ampicilina se añade a los medios de crecimiento de las células que expresan genes resistentes a la ampicilina.

Cualquier suplemento necesario además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico se puede incluir también en las concentraciones adecuadas, introducido solo o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como una fuente de nitrógeno complejo. Opcionalmente , el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados a partir del grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol .

Lás células hospederas procariotas son cultivadas a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, los rangos preferidos de temperatura son desde aproximadamente 20°C a aproximadamente 39°C, más preferiblemente desde aproximadamente 25°C a aproximadamente 37°C, aún más preferiblemtne a aproximadamente 30°C. El pH del medio puede ser cualquier pH en el rango desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo hospedero. Para E. coli, el pH es preferiblemente desde aproximadamente 6.8 hasta aproximadamente 7.4, y más preferiblemente aproximadamente 7.0.

Si un promotor inducible es utilizado en la expresión del vector de la invención, se induce la expresión de proteínas bajo condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, promotores de PhoA se utilizan para controlar la transcripción de los polipéptidos . De manera acorde, las células hospederas transformadas son cultivadas en un medio de limitación de fosfato para inducción. Preferentemente, el medio de limitación de fosfato es el medio C.R.A.P (véase, v.gr., Simmons et al., J. Immunol. Métodos (2002), 263:133-147). Como es conocido en la materia, una variedad de otros inductores pueden utilizarse, de acuerdo la construcción de vector empleada.

En una forma de realización, los polipéptidos expresados de la presente invención son secretados en y recuperados a partir de la periplasma de las células hospederas . Recuperación de proteínas normalmente implica interrumpir al microorganismo, generalmente por medios tales como el choque osmótico, tratamiento sónico o lisis. Una vez que las células se rompen, restos celulares o células enteras pueden ser removidos por centrifugación o filtración. Las proteínas pueden ser después purificadas, por ejemplo, mediante cromatografía de resina de afinidad. Alternativamente, las proteínas pueden ser transportadas hacia los medios de cultivo y aisladas en los mismos. Células pueden ser removidas del cultivo y el sobrenadante de cultivo ser filtrado y concentrado para purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden adicioanlmente ser aislados e identificados utilizando los métodos comúnmente conocidos como la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y el ensayo Western blot .

En un aspecto de la invención, la producción de anticuerpos es conducida en grandes cantidades mediante un proceso de fermentación. Están disponibles varios procesos de fermentación a alta escala y alimentación para la producción de proteínas recombinantes . Fermentaciones de gran escala tienen una capacidad de por lo menos 1,000 litros, preferiblemente alreadedor de 1,000 a 100,000 litros de capacidad. Estos fementadores usan impulsores agitadores para distribuir el oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente preferida de carbono/energía) . Fermentación de pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en un termentador que no es mayor de aproximadamente 100 litros en - in¬ capacidad volumétrica, y puede estar en el promedio desde aproximadamente 1 litro hasta aproximadamente 100 litros.

En un proceso de fermentación, la inducción de la expresión de la proteína suele iniciarse después de que las células hayan sido cultivadas bajo condiciones adecuadas a la densidad deseada, v.gr., una OD550 de alrededor de 180-220, etapa en la cual las células están en la fase estacionaria temprana. Una variedad de inductores pueden ser utilizados, de acuerdo con la construcción de vector empleada, como es conocido en la materia y descrito anteriormente. Células pueden ser cultivadas por períodos más cortos antes de la inducción. Células son generalmente inducidas por cerca de 12-50 horas, aunque puede utilizarse mayores o menores tiempos de inducción.

Para mejorar el rendimiento de la producción y la calidad de los polipéptidos de la invención, varias condiciones de fermentación pueden modificadarse . Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y pliegue apropiados de los polipéptidos de anticuerpo secretados, se pueden utilizar vectores adicionales que sobre-expresan proteínas chaperonas, como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD , y/o DsbG) o FkpA (un cis peptidilprolil , trans-isomerasa con actividad chaperona) para co-transformar las células procariotas hospederas . Las proteínas chaperonas han demostrado que facilitan el plegamiento y la solubilidad apropiados de proteínas heterólogas producidas en las células hospederas bacterianas. Chen et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., patente US 6,083,715; Georgiou et al., patente US 6,027,888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun, (2000) J. Biol . Chem. 275:17106-17113, Arie et al., (2001) Mol. Microbiol . 39:199-210.

Para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son sensibles proteolíticamente) , ciertas cepas de células hospederas deficientes de enzimas proteolíticas pueden ser utilizadas por la presente invención. Por ejemplo, cepas de células hospederas pueden ser modificadas para efectuar mutaciones genéticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de los mismos. Algunas cepas deficientes de proteasa de E. coli están disponibles y son descritas en, por ejemplo, Joly et al., (1998), Proc . Nati. Acad. Sci. USA 95:2773-2777; Georgiou et al., patente US 5,264,365; Georgiou et al., patente US 5,508,192; Hará et al., Microbial Drug Resistance 2:63-72 (1996).

En una forma de realización, cepas de E. coli deficientes de enzimas proteolíticas y transformadas con plasmidos sobre-expresando uno o más proteínas chaperonas son usadas como células hospederas en el sistema de expresión de la invención. iii. La Purificación del Anticuerpo Métodos estándar de purificación de proteínas conocidos en la materia pueden emplearse. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmuno-afinidad o intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC en fase en reversa, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromato-enfoque , SDS-PAGE, la precipitación con sulfato de amonio, y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75.

En un aspecto, proteína A inmovilizada en una fase sólida se usa para purificación de inmunoafinidad de productos de anticuerpo de longitud completa de la invención. Proteína A es proteína de pared celular 41kD de Staphylococcus aureus que se liga con alta afinidad a la región Fe de los anticuerpos. Lindmark et al., (1983) J. Immunol . Meth. 62:1-13. La fase sólida a la cual se inmoviliza la proteína A es preferentemente una columna que comprende una superficie de vidrio o de sílice, más preferiblemente una columna de vidrio poroso controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna ha sido recubierta con un reactivo, tal como glicerol, en un intento por impedir adherencia no específica de contaminantes.

Como primer paso de la purificación, la preparación derivada del cultivo celular como se describió anteriormente se aplica sobre la proteína A inmovilizada en fase sólida para permitir ligadura específica del anticuerpo de interés a la Proteína A. La fase sólida es entonces lavada para eliminar los contaminantes no ligados específicamente a la fase sólida. Por último, el anticuerpo de interés es recuperado de la fase sólida por elución . b. Generación de anticuerpos usando células hospederas eucariotas : Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una señal de secuencia, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mej orador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción . (i) Componente de Señal de Secuencia Un vector para su uso en una célula hospedera eucariota también puede contener una secuencia de señales u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en la terminal N de la proteína madura o polipéptido de interés. La secuencia de señal heteróloga de preferencia seleccionada es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señal) por la célula hospedera. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias de señal de mamíferos, así como las puntas de secreción viral, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex, están disponibles.

El ADN para tal región precursora se liga en marco de lectura al ADN que codifica al anticuerpo. (i i) Origen de replicación En general, no es necesario un componente de origen de replicación para vectores de expresión de mamíferos. Por ejemplo, podría usarse normalmente el origen SV40 sólo debido a que contiene al promotor temprano. (iii) Un componente de genes de selección Vectores de expression y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable . Genes típicos de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, v.gr., ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas , en donde sea relevante, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en el medio de complej o .

Un ejemplo de un sistema de selección es el que utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedera. Aquellas células que se transformaron con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y por ende sobrevive al régimen de selección. Ejemplos de tal uso de selección dominante son el fármaco neomicina, ácido micofenólico, y higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para conocer el ácido nucleico del anticuerpo, tales como DHFR, timidina quinasa, metalotioneínas I y II, preferentemente genes de metalotioneína de primates, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, células transformadas con el gen de selección DHFR son primero identificadas mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (MTX) , un antagonista competitivo de DHFR. Cuando DHFR de tipo silvestre se emplea, una célula hospedera apropiada es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR (v.gr., ATCC CRL-9096).

Alternativamente, células hospederas (particularmente hospederos de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, proteína DHFR de tipo silvestre, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferesa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio conteniendo un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico anmino-glicosídico, v.gr., kanamicina, neomicina, o G418. Véase la patente US 4 , 965, 199. (iv) Componente promotor Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedero y es enlazado operativamente al ácido nucleico del polipéptido de anticuerpo. Secuencias promotoras son conocidas para los eucariotas . Genes aleucariotas virtualmente tienen una región AT-enriquecida localizada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio donde comenzó la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del comienzo de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucléotido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias son insertadas adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.

Transcripción de polipéptidos de anticuerpo a partir de vectores en células hospederas de mamíferos es controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus de polioma, el virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2) , virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus , retrovirus, virus de la hepatitis B, y virus del simio 40 (SV40) , a partir de promotores heterólogos de mamíferos, v.gr., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con sistemas de célula hospedera.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 son convenientemente obtenidos como un fragmento de restricción de SV40, que también contiene el origen de replicación viral SV40. El promotor temprano inmediato de los citomegalovirus humanos es convenientemente obtenido como un fragmento de restricción HindIII E. En la patente US 4,419,446 se revela un sistema para expresar ADN en hospederos mamíferos usando al virus del papiloma bovino como un vector. Una modificación de este sistema se describe en la patente US 4,601,978. Alternativamente, la repetición del terminal del virus del sarcoma de Rous puede ser usada como el promotor. (v) Un componente de elemento potenciador La transcripción del ADN que codifica al polipéptido de anticuerpo de la presente invención por eucariotas superiores es en frecuentemente incrementada mediante insertar una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadores son conocidas ahora para genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) . Normalmente, sin embargo, se usará un potenciador a partir de un virus de célula eucariota . Ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270) , el potenciador de promotor de citomegalovirus temprano, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus . Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre los elementos potenciadores para activación de promotores eucariotas. ] El potenciador puede empalmarse en el vector en la posición 5' o 3' a la secuencia de codificación de polipéptido de anticuerpo, pero de preferencia se localiza en el sitio 5' del promotor. (vi) Componente de terminación de transcripción Vectores de expresión usados en células hospederas eucariotas típicamente también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADNs o cADNs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos treanscritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina. Ver WO 94/11023 y el vector de expresión divulgado en la misma. (vii) Selección y transformación de células hospederas Células hospederas adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente incluyen las células eucariotas mayores descritas en la presente, incluyendo células hospederas de vertebrados. Propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares hospederas de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon del mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC C L 1651), la línea de riñon de embriones humanos (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol . 36:59 (1977)); células renales de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc . Nati. Acad. USA 77: 4216 (1980)); células de ratón de Sertoli (TM4, Mather, Biol .

Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñón del mono verde de África (VERO-76, ATCC CRL -1587) ; células de carcinoma del cuello uterino humanas (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñón canino ( DCK, ATCC CCL 34) ; células del hígado de la rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células del pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células del hígado humano (Hep G2 , HB 8065); tumor mamario del ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 , y una línea de hepatoma humana (Hep G2) .

Las células hospederas se transforman con los vectores de expresión y clonación anteriormente descritos para producción de anticuerpos y cultivadas en un medio de nutrientes convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (viii) Cultivar las células hospederas Las células hospederas usadas para producir un anticuerpo de esta invención pueden ser cultivadas usando una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma) , Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Adicionalmente , cualquier medio descrito en Ham et al., Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem .102 : 255 (1980), patentes US 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; O 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente US Re. 30,985 puede usarse como un medio de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado cuando sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , reguladores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como el fármaco GENTA YCIN) , elementos de traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micro-molar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede estar incluido en concentraciones adecuadas que serían conocidas por los técnicos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, H, y similares, son aquellas utilizadas anteriormente con la célula hospedera seleccionada para expresión, y será evidente para el técnico en la materia. (ix) Purificación del anticuerpo Cuando se usan técnicas de recombinación, el anticuerpo puede ser producido dentro de la célula, o directamente secretado al medio. Si el anticuerpo se produce dentro de la célula, como un primer paso, los restos de partículas, ya sea las células hospederas o fragmentos de lisis, se eliminan, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. En donde el anticuerpo se secreta hacia el medio, sobrenadantes a partir de tales sistemas de expresión son en general primero concentrados utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente , por ejemplo, una unidad de ultra- filtración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir proteólisis y antibióticos pueden ser incluidos para evitar el crecimiento de los contaminantes accidentales.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede ser purificada usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita , electrofóresis en gel, diálisis, cromatografía por afinidad, con cromatografía por afinidad siendo la técnica de purificación preferida. La adecuacidad de la proteina A como un ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteina A puede usarse para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas ?? , ?2 , o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)) . La proteina G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando por afinidad es en la mayoría de las veces agarosa, sin embargo están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como las controladas por vidrio poroso o por poli (estirenodivinilo) -benceno permiten para tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que lo que se puede lograr con agarosa. En donde el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABX (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPLC en fase en reversa, cromatografí sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE, cromatografía sobre una resina de intercambio de cationes (tal como una columna de poli (ácido aspártico) , cromato-enfoque , SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a ser recuperado.

Después de cualquier paso de purificación preliminar, la mezcla que comprende al anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un regulador de elución a un pH entre alrededor de 2.5-4.5, preferiblemente ejecutado a bajas concentraciones de sal (v.gr., desde aproximadamente 0-0.25 M de sal) .

Tmmimo - conjugados La invención también proporciona inmuno-conjugados (indistintamente denominados "conjugados anticuerpo- fármaco" o "ADC" ) , que comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Notchl NRR descritos en la presente conjugados con un agente citotóxico, como un agente de quimioterapia, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (v.gr., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, de hongos, de plantas, o animal, o fragmentos de la misma) , o un isótopo radiactivo (es decir, un radio-conjugado) .

El uso de conjugados anticuerpo- fármaco para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos , es decir, medicamentos para eliminar o inhibir células tumorales en el tratamiento de cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; Patente US 4,975,278), permite la entrega selectiva de la fracción de fármaco a tumores, y la acumulación intracelular de la misma, donde administración sistémica de estos agentes de fármaco no conjugados puede resultar en niveles de toxicidad no aceptables para las células normales así como las células del tumor que se pretende eliminar (Baldwin et al., (1986) pp Lancet. (15 de marzo 1986) :603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monoclonal Antibodies ' 84 : 1 Biological And Clinical Applications, Pinchera A. et al. (ed.s), p . 475-506). Lo que se busca es máxima eficacia con una toxicidad mínima. Tanto anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales han sido reportados como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol . Immunother., 21:183-87). Los fármacos utilizados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . Las toxinas utilizadas en los conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina de la difteria, toxinas de plantas tales como el ricino, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina ( andler et al (2000) Jour . of the Nat . Cáncer Inst. 92 (19) :1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad. US 93:8618-8623), y caliqueamicina (Lode et al., (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al., (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos incluyendo ligadura de tubulina, ligadura de ADN, o inhibición de topoisomerasa . Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando son conjugados con grandes anticuerpos o ligandos del receptor de proteína.

ZEVALIN (ibritumomab tiuxetano, Biogen/Idec) es un conjugado anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal kappa IgGl murino dirigido contra el antígeno CD20 encontrado sobre la superficie de linfocitos normales y malignos B, y radioisótopos luIn o 90Y ligados por un quelante de enlazador de tiourea (Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucí.. Med. 27 (7):766-77; Wiseman et al., (2002) Blood 99 (12) :4336-42 ; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20 ( 10 ) : 2453 -63 ; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15) : 3262-69) . Aunque ZEVALIN tiene actividad contra linfoma no de Hodgkin (LNH) de células B, la administración resulta en citopenias severas y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals) , un conjugado anticuerpo- fármaco compuesto de un anticuerpo huCD33 enlazado a caliqueamicina , fue aprobado en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25 (7): 686 y patentes US 4,970,198, 5,079,233, 5,585,089, 5,606,040; 5,693,762; 5,739,116, 5,767,285, 5,773,001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 enlazado a través del enlazador de disulfuro SPP a la fracción de fármaco maitansinoide, DM1, está avanzando a ensayos de Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como el de colon, pancréatico, gástrico, y otros. MLN-2704 (Milennium Pharm., BZL Biologics, ImmunoGen Inc.), una conjugado anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo monoclonal de antígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) enlazado a la fracción de fármaco maitansinoide, DM1, está bajo desarrollo para el tratamiento potencial de tumores de próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina, fueron conjugados a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos a Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos a CD30 en neoplasias hematológicas) (Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21 (7) : 778-784) y están en fase de desarrollo terapéutico.

Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmuno-conjugados se describen en la presente (v.gr., los anteriores) . Toxinas enziraáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser utilizadas incluyen una cadena de difteria A, fragmentos activos no de ligadura de toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica carantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos . Véase, v.gr., O 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993. Una variedad de radio-núclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radio-conj ugados . Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 18SRe. Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HC1) , ásteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmuno-toxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1- isotiocianatobencil-3 -me ildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) etiquetado con carbono 14 es un agente quelante ej emplificativo para conjugación de radio-nucelótido al anticuerpo. Ver WO 94/11026.

Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como caliqueamicina, maitansinoides , dolastatinas , aurostatinas , un tricothecena , y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en la presente. i. Maitansina y maitansinoides En algunas formas de realización, el inmuno-conjugado comprende un anticuerpo (de longitud completa o fragmentos) de la invención conjugado a una o más moléculas de maitansinoides.

Los maitansinoides son inhibidores mitósicos que actúan mediante inhibir la polimerización de tubulina. La maitansina fue primero aislado a partir de el arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente US 3,896,111). Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres de maitansinol C-3 (patente US 4,151,042). El maitansinol sintético y derivados y análogos de los mismos se divulgan, por ejemplo, en las patentes US 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.

Fracciones del fármaco maitansinoides son fracciones de fármaco atractivas en los conjugados anticuerpo- fármaco debido a que son: (i) relativamente accesibles para preparerse mediante fermentación o modificación química, derivación de productos de fermentación, (ii) susceptibles a derivación con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de enlazadores no de disulfuro a anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) efectivos contra una variedad de líneas de células tumorales.

Inmuno-conjugados conteniendo maitansinoides, métodos para hacerlos, y su uso terapéutico se divulgan, por ejemplo, en las patentes US 5,208,020, 5,416,064 y la patente europea EP 0 425 235 Bl, las divulgaciones de las cuales se expresan por consiguiente de manera expresa por referencia. Liu et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describe inmuno-conjugados comprendiendo un maitansinoide designado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico hacia las células de cáncer de colon cultivadas, y mostró una actividad anti-tumoral en un ensayo in vivo del crecimiento del tumor. Chari et al., (1992 Cáncer Research 52:127-131) describe inmuno-conjugados en los que un maitansinoide fue conjugado al anticuerpo A7 murino a través de un enlazador de disulfuro ligando con un antígeno sobre las líneas celulares de cáncer de colon, o a otro anticuerpo monoclonal de ratón TA.l que se liga al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.l-maitansinoide fue probada in vi tro en la línea celular SK-BR-3 de cáncer de mama humano, la cual expresa 3xl05 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al fármaco de maitansinoide libre, el cual podría incrementarse mediante aumentar el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7 -maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.

Conjugados anticuerpo-maitansinoide se preparan mediante enlazar químicamente un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir de manera significativa la actividad biológica de ya sea el anticuerpo o la molécula de maitansinoide. Véase, v.gr., la patente US 5,208,020 (la divulgación de la cual se incorpora de manera expresa en la presente por referencia) . Un promedio de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por molécula de anticuerpo ha demostrado eficacia en acrecentar la citotoxicidad de las células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que aun una molécula de toxina/anticuerpo acreciente citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Maitansinoides son bien conocidos en la materia y pueden ser sintetizados por técnicas conocidas o aislados a partir de fuentes naturales. Maitansinoides adecuados se divulgan, por ejemplo en patente US 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones no de patente referidas anteriormente en la presente. Maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en un anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tal como varios ásteres de maitansinol.

Existen muchos grupos enlazadores conocidos en la materia para hacer conjugados anticuerpo-maitansinoide , incluyendo, por ejemplo, aquellos descritos en la patente US 5,208,020 o en la Patente EP 0 425 235 Bl, Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992), y la solicitud de patente US 10/960,602, presentada el 8 de octubre de 2004, las divulgaciones de las cuales se incorporan de manera expresa en la presente por referencia. Conjugados anticuerpo-maitansinoide que comprenden al componente de enlazador SMCC pueden prepararse como se divulga en la solicitud de patente US 10/960,602, presentada el 8 de octubre de 2004. Los grupos enlazadores incluyen grupos de disulfuro, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábiles, grupos lábiles de peptidasa, o grupos lábiles de esterasa, como se divulga en las patentes anteriormente identificadas, siendo los grupos disulfuro y tioéter los preferidos. Se describen y ejemplifican en la presente grupos de enlace adicionales .

Conjugados del anticuerpo y el maitansinoide pueden hacerse utilizando una variedad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteínas, tales como N-succinimidil-3 - (2 -piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4 - (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (CCPA) , iminotiolano (TI) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidate HC1) , ásteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6 -diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2 -piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-succinimidil-4- (2 -piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfuro.

El enlazador puede asociarse a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo del enlace. Por ejemplo, un enlace éster se puede formar por reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 teniendo un grupo hidroxilo. En una forma de realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo del maitansinol. ii. Auris atinas y dolastatinas En algunas formas de realización, los inmuno-conjugados comprenden un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos peptídicos de dolostatinas y derivados, las auristatinas (patentes US 5,635,483 y 5,780,588) . Las dolastatinas y auristatinas han demostrado interferir con la dinámica de los micro-túbulos, la hidrólisis del GTP, y la división nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 ( 12 ) : 3580-3584 ) y tienen actividad contra el cáncer (patente US 5.663.149) y actividad antifúngica (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965) . La fracción de fármaco de dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través de la terminal N (amino) o la terminal C (carboxilo) de la fracción de fármaco peptídico ( O 02/088172) .

Formas de realización ejemplares de auristatina incluyen las fracciones de fármaco de monometilauristatina enlazadas a la terminal N, DE y DF, divulgadas en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" , solicitud de patente US 10/983,340, presentada el 5 de noviembre de 2004, cuya divulgación se incorpora de manera expresa por referencia en su totalidad .

Típicamente, se pueden preparar las fracciones de fármaco a base de péptidos mediante la formación de un enlace de péptido entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos péptidos. Tales enlaces de péptidos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (ver E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides," volumen 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de química de péptidos.

Las fracciones de fármaco de auristatina/dolastatina Pueden prepararse de acuerdo con los métodos de: patentes US 5,635,483 y 5,780,588; Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc . 111:5463-5465; Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans . 15:859-863. Ver también Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21 (7) : 778-784 ; " onomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," US 2005/0238649, publicada el 27 de octubre de 2005, incorporada en la presente por referencia en su totalidad (revelando, v.gr., enlazadores y métodos para preparar compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugados a enlazadores) . iii. Caliqueamicina En otras formas de realización, el inmuno-conjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir rompimientos de ADN de doble cadena en concentraciones sub-picomolares . Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, ver las patentes US 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, y 5,877,296 (todas de American Cyanamid Company) . Análogos estructurales de caliqueamicina que pueden ser utilizados incluyen, pero no se limitan a, ??1, OÍ2 t, a3 i, N-acetil-??1, PSAG y T 1 i (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes US antes mencionadas de American Cyanamid) . Otro fármaco anti-tumores que se puede conjugar al anticuerpo es QFA el cual es un anti-folato. Tanto caliqueamicina y QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpo mejora mayormente sus efectos citotóxicos. iv. Otros agentes citotóxicos Otros agentes anti- tumorales que pueden conjugarse con los -anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes colectivamente conocidos como complejo LL-E33288 descrito en las patentes US 5,053,394 y 5,770,710, así como las esperamicinas (patente US 5,877,296).

Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena de difteria A, fragmentos activos no de ligadura de la toxina de difteria, la cadena de exotoxina A (de Pseudo onas aeruginosa) , la cadena de ricina A, la cadena de abrina A, la cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica carantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicado el 28 de Octubre de 1993.

La presente invención adicionalmente contempla un inmuno-conjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (v.gr., una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como la deoxiribonucleasa ; ADNasa) .

Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos se encuentran disponibles para la producción de anticuerpos radio-conj ugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re185, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radioactivos de Lu. Cuando es usado el conjugado para detección, éste puede comprender un átomo radioactivo para los estudios centellográficos , por ejemplo tc99m o I123, o una etiqueta de giro para la imagen de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como toma de imágenes de resonancia magnética, MRI) , como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno- 15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro .

Las radio- u otras etiquetas pueden incorporarse en los conjugados mediante ensayos conocidos. Por ejemplo, el péptido puede ser bio-sintetizado o puede ser sintetizado mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que involucran, por ejemplo, flúor-19 en vez de hidrógeno. Etiquetas tales como Tc99m o I123, Re186, Re188 y In111 pueden anexarse mediante un residuo de cisteína en el péptido. Itrio-90 puede anexarse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 80:49-57 puede usarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe en detalle otros métodos.

Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden hacerse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4 - (N-maleimidometil ) ciclohexano-l-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HC1) , ásteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , compuestos bis-azido (tales como (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, se puede preparar una inmuno-toxina de ricina como es descrito en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) etiquetado con carbono- 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radio-nucleótido al anticuerpo. Ver WO 94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador hendible" que facilita la liberación en la célula del fármaco citotóxico. Por ejemplo, un enlazador lábil a ácido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador foto-lábil, enlazador dimetilo o enlazador de disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); patente US 5,208,020) pueden usarse.

Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a, ADC preparados con reactivos reticuladores : BMPS, EMCS, GMBS , HBVS, LC-SMCC, MBS , MPBH, SBAP, SIA, SIAB, S CC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, y SVSB ( succinimidil- (4 -vinilsulfona) enzoato) los cuales están comercialmente disponibles (v.gr., de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.). Ver páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. v. Preparación de conjugados anticuerpo-fármaco En los conjugados anticuerpo- fármaco (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) es conjugado a una o más fracciones de fármaco (D) , v.gr., aproximadamente 1 a aproximadamente 20 fracciones de fármaco por anticuerpo, a través de un enlazador (L) . El ADC de la Fórmula I puede prepararse mediante varias rutas, empleando reacciones, condiciones y reactivos químicos orgánicos conocidos por los técnicos en la materia, incluyendo: (1) la reacción de un grupo de nucleófilos de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente, para formar Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido por la reacción con una fracción de fármaco D; y (2) la reacción de un grupo nucleofilo de una fracción de fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido por la reacción con el grupo nucleofilo de un anticuerpo. Métodos adicionales para preparar ADC se describen en la presente.

A -(L-D)p I El enlazador puede estar compuesto por uno o más componentes enlazadores. Componentes enlazadores ej emplificativos incluye 6-maleimidocaproilo ( "MC" ) , maleimidopropanoilo ( "MP" ) , valina-citrulina ("val-cit")/ alanina-fenilalanina ( "ala-phe" ) , p-aminobenciloxicarbonil ("PAB"), N-Sucinimidilo 4- (2 -piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Sucinimidil 4 - (N-maleimidometil ) ciclohexano- 1 carboxilato ("SMCC), y N-Succinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Componentes enlazadores adicionales son conocidos en la materia y algunos son descritos en la presente. Ver también "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" solicitudes de patente US 10/983,340, presentada el 5 de noviembre de 2004, cuyos contenidos son incorporados en la presente en su totalidad por referencia.

En algunas formas de realización, el enlazador puede comprender residuos de aminoácidos. Componentes enlazadores de aminoácidos ej emplificativos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido . Dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Residuos de aminoácidos que comprenden un componente enlazador de aminoácidos incluyen los de origen natural, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos no naturales, tales como citrulina. Componentes enlazadores de aminoácidos pueden ser diseñados y optimizados en su selectividad para disociación enzimática por enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.

Grupos nucleófilos sobre anticuerpos incluyen, pero no están limitados a: (i) grupos amino terminales N, (ii) grupos amina de cadena secundaria, v.gr., lisina, (iii) grupos tiol de cadena secundaria, v.gr., cisteína, y (iv) grupos hidroxilo o amino de azúcar en donde el anticuerpo es glucosilado. Grupos amina, tiol, e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en fracciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros de ácido, (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas ; (iii) grupos de aldehidos, cetonas, carboxilos, y maleimidas. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros inter-cadena reducidos, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para conjugación con reactivos enlazadores mediante un tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) . Cada puente de cisteína formará de este modo, en teoría, dos nucleófilos reactivos tiol. Grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en antivuerpos mediante la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) resultando en conversión de una amina en un tiol. Grupos reactivos tiol pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento del mismo) mediante introducir uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (v.gr., preparar anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos de aminoácido cisteína no nativos) .

Conjugados anticuerpo- fármaco de la invención también pueden ser producidos por la modificación del anticuerpo para introducir fracciones electrófilas , las cuales pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos sobre el reactivo enlazador o fármaco. Los azúcares de anticuerpos glucosilados pueden ser oxidados, v.gr., con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazadores o fracciones de fármaco. Grupos base de Schiff-imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, v.gr., por reactivos borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una forma de realización, la reacción de la porción carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con ya sea glactosa oxidasa o meta-peryodato de sodio puede producir grupos de carbonilo (aldehidos y cetonas) en la proteína que puede reaccionar con grupos apropiados del fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra forma de realización, proteínas que contienen residuos serina o treonina terminales N pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, resultando en la producción de un aldehido en el lugar del primer aminoácido (Geoghegan y Stroh, (1992) Bioconjugate Chem.. 3:138-146; patente US 5,362,852). Tal aldehido puede reaccionarse con una fracción de fármaco o nucleófilo enlazador.

Del mismo modo, grupos nucleófilos sobre una fracción de fármaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina, y arilhidrazida capaz de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos sobre fracciones enladoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) ásteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros de ácido, (ii) haluros alquilo y bencilo tales como haloacetamidas ; (iii) grupos aldehido, cetona, carboxilo, y maleimida.

Alternativamente, puede hacerse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico, v.gr., mediante técnicas de recombinación o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican dos porciones del conjugado, ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En aún otra forma de realización, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en una pre-selección de tumor en donde el conugado anticuerpo-receptor se administra al individuo, seguido de la eliminación del conjugado no ligado de la circulación usando un agente de limpieza y luego la administración de un "ligando" (v.gr., avidina) el cual se conjuga a un agente citotóxico (v.gr., un radio-nucleótido) .

Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención se preparan para almacenamiento mediante mezclar al anticuerpo teniendo el grado de pureza deseada con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales {Remington : The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)) , en la forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones secas. Vehículos, excipientes o estabilizadores, en las dosis y concentraciones empleadas, son no tóxicos a los recipientes, e incluyen reguladores tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; anti-oxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ,- polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmuno-globulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra- iones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (v.gr., complejos Zn-proteína) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietileno glicol (PEG) .

La formulación presente también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular siendo tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito de intención .

Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en micro-cápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas co-acertivas o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, micro-cápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y micro-cápsulas de poli (metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de liberación coloidal del fármaco (por ejemplo, liposomas, micro-esferas de albúmina, micro-emulsiones, nano-partículas y nano-cápsulas) o en macro-emulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000) .

Las formulaciones a ser usadas para la adminsitración in vivo deben ser estériles. Esto es fácilmente logrado por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Pueden ser preparadas preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluye matrices semi -permeables de polímeros sólidos hidrófobos que contiene la inmuno-globulina de la invención, las cuales matrices están en forma de artículos configurados, v.gr., películas o micro-cápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (metacrilato de 2 -hidroxietilo) , o poli (alcohol vinílico) ) , poliláctidos (patente US 3,773,919), los co-polímeros de ácido L-glutámico y ?-etil L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, co-polímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT (micro-esferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y poli-ácido D-(-)-3-hidroxibutírico . Aunque polímeros como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos. Cuando inmuno-globulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de exposición a la humedad a 37°C, resultando en una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización en función del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubrió que es la formación del enlace S-S intermolecular a través de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse mediante la modificar residuos sulfhidrilo, liofilizar a partir de soluciones ácidas, controlar el contenido de humedad, utilizar aditivos apropiados, y desarrollar composiciones específicas de matriz de polímero.

III. Usos terapéuticos Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en la presente que se ligan a tanto HER2 y VEGF (v.gr., bHl-44 o bHl-88 o fragmentos de los mismos) pueden usarse para el tratamiento de tumores, incluyendo tumores pre-cáncerosos , no-metastásicos , y cáncerosos (v.gr., cáncer en fase temprana) , para el tratamiento de enfermedades auto- inmunes , para el tratamiento de un desorden de angiogénesis , para el tratamiento de una enfermedad que involucra la activación anormal de HER2 , o para el tratamiento de un sujeto con riesgo de desarrollar cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, glioma, o cáncer de ovario) , un desorden de angiogénesis, una enfermedad auto- inmune, o una enfermedad que involucra la activación anormal de HER2.

El término cáncer abarca una colección de desórdenes proliferativos , incluyendo pero no limitados a crecimientos pre-cancerosos, tumores beningnos, y tumores malignos. Los tumores benignos permanecen localizados en el sitio de origen y no tienen la capacidad de infiltrarse, invadir o de metastizarse hacia sitios distintos. Los tumors malignos van a invadir y destruir otros tejidos alrededor de ellos. Ellos también pueden obtener la habilidad de irrumpir de donde comenzaron y esparcirse a otras partes del cuerpo (metastizar) , usualmente a través del torrente sanguíneo o a través del sistema linfático en donde se encuentran localizados los nodulos linfáticos. Los tumores primarios están clasificados por el tipo de tejido de los cuales ellos parten; los tumores metásticos son clasificados del tipo de tejido de los cuales las células de cáncer se derivan. Sobre el tiempo, las células de un tumor maligno se vuelven más anormales y parecen cada vez menos células normales. Este cambio en la aparicnecia de las células de cáncer es llamado grado del tumor y las células de cáncer están descritas como bien diferenciadas, moderadamente diferenciadas, pobremente diferenciadas o no diferenciadas. Las células bien diferenciadas son de apariencia bastante normal y se asemejan a células normales a partir de las cuales se originan. Las células no diferenciadas son células que se convirtieron tan anormales que ya no es possible determiner el origen de las células.

El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor de tejido no sólido o blando. Ejemplos de tumores de tejidos blandos incluyen leucemia (v.gr., leucemia mielogenosa crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica adulta aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda de células B maduras, leucemia linfocítica crónica, leucemia polinfocítica , o leucemia de células pilosas), o linfoma (v.gr., linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, o enfermedad de Hodgkin) . Un tumor sólido incluye cualquier cáncer de tejidos del cuerpo que no sean sangre, médula ósea, o el sistema linfático. Tumores sólidos pueden ser posteriormente divididos en aquellos de origen en células epiteliales y aquellos que no tienen un origen de células epiteliales. Ejemplos tumores sólidos de células epiteliales incluyen los tumores del tracto gastro- intestinal , colon, mama, próstata, pulmón, riñon, hígado, páncreas, ovario, cabeza y cuello, cavidad oral, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, ano, vesícula biliar, labio, nasofaringe, piel, útero, órganos genitales masculinos, órganos urinarios, vejiga y piel. Los tumores sólidos de origen no epitelial incluyen los sarcomas, tumores cerebrales y tumores de los huesos Los cáncers epiteliales generalmente evolucionan a partir de un tumor beningno a un estado pre-invasivo (v.gr., carcinoma in situ) , a un cáncer maligno, el cual ha penetrado la membrana basal e invadido al estroma epitelial.

Anticuerpos multi-específieos que se ligan tanto a VEGF y HER2 (v.gr., bHl-44 o bHl-88 o un fragmento de los mismos) usados preferiblemente para tratar el cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de célula renal, glioma, o cáncer de ovario.

Ahora está bien establecido que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos. Estos incluyen tumores sólidos y metástasis, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamación crónica, enfermedades intraoculares neovasculares tales como retinopatías proliferativas , v.gr., retinopatía diabética, degeneración macular senil (DMS) , glaucoma neovascular, rechazo inmunológico de tejido corneal trasplantado y otros tejidos, artritis reumatoide, y psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem . , 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991), y Garner, A., "Vascular diseases" , en: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds . , 2da. edición (Marcel Dekker, Nueva York, 1994) , pp 1625-1710.

La angiogénesis anormal se presenta cuando los vasos sanguíneos nuevos ya sea crecen excesivamente, insuficientemente o inadecuadamente (v.gr., la ubicación, el calendario o el inicio de la angiogénesis siendo no deseados desde un punto de vista médico) en un estado de enfermedad o tal que ocasione un estado de enfermedad. La angiogénesis excesiva, inapropiada o descontrolada se produce cuando hay crecimiento de nuevos vasos sanguíneos que contribuyen al empeoramiento del estado de la enfermedad o provoca un estado de enfermedad, tal como en cáncer, especialmente tumores sólidos vascularizados y tumores metastásicos (incluidos los de colon, cáncer de pulmón (especialmente cáncer de pulmón de células pequeñas) , o cáncer de próstata) , enfermedades causadas por la neovascularización ocular, especialmente la ceguera diabética, retinopatías , principalmente retinopatía diabética o degeneración macular senil (DMS) , edema macular diabético, edema cerebral (v.gr., asociados con el apoplejía aguda/lesión de cabeza cerrada/traumatismo) , inflamación sinovial, formación de pannus en artritis reumatoide, miositis osificante, formación ósea hipertrófica, ascitis refractaria, síndrome de ovario poliquístico, enfermedades de tercera separación de fluidos (pancreatitis, síndrome compartimental , quemaduras, enfermedades del intestino), fibromas uterinos, parto prematuro, neovascularización del ángulo (rubeosis) , derrames malignos pulmonares, restenosis vascular, hemangioblastoma tal como hemangioma; enfermedades inflamatorias renales, como glomerulonefritis , especialmente glomerulonefritis mesangioproliferativa, síndrome urémico hemolítico, nefropatía diabética o nefroesclerosis de hipertensión, diversas enfermedades inflamatorias, tales como artritis, especialmente artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, artritis psoriásica, placas de psoriasis, sarcoidosis, arterioesclerosis arterial, y enfermedades que se producen después de los trasplantes, el rechazo de alo-injertos renales, endometriosis o asma crónica, y más de 70 otras condiciones. Los nuevos vasos sanguíneos pueden alimentar a los tejidos enfermos, destruyen los tejidos normales, y en el caso del cáncer, los nuevos vasos pueden permitir que las células tumorales escapen a la circulación y se alojen en otros órganos (metástasis del tumor) . Angiogénesis insuficiente se produce cuando hay crecimiento de vasos sanguíneos inadecuado que contribuye al empeoramiento de un estado de enfermedad, v.gr., en enfermedades tales como enfermedad de las arterias coronarias, apoplejía, y curación de heridas retrasada. Además, las úlceras, apoplejías y ataques al corazón pueden resultar de la ausencia de angiogénesis que normalmente es necesaria para la curación natural. La presente invención contempla el tratamiento de aquellos pacientes que tienen o están en riesgo de desarrollo de las enfermedades antes mencionadas usando un anticuerpo que se liga específicamente a tanto VEGF y HER2 (v.gr., los anticuerpos BH1-81 o BH1-44) .

Otros pacientes que son candidatos para recibir composiciones de esta invención tienen, o están en riesgo de desarrollar, la proliferación anormal del tejido fibrovascular , acné rosácea, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, oclusión de arterias, queratitis atópica, úlceras bacterianas, enfermedad de Bechet, tumores de transmisión sanguínea, enfermedad obstructiva carotídea, neovascularización coroidea, inflamación crónica, desprendimiento de retina crónico, uveítis crónica, vitritis crónica, sobre-uso de lentes de contacto, rechazo del injerto corneal, neovascularización corneal, neovascularización del injerto de córnea, enfermedad de Crohn, enfermedad de Eales, queratoconjuntivitis epidémica, úlceras por hongos, infecciones por herpes simple, infecciones por herpes zóster, síndromes de hiperviscosidad, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneración de lípidos, enfermedad de Lyme, queratólisis marginal, úlcera Mooren, infecciones por micobacterias distintas de la lepra, miopía, enfermedad ocular neovascular, pozos ópticos, síndrome de Osler-Weber (síndrome de Osler-Weber-Rendu) , osteoartritis , enfermedad de Paget, pars planitis, penfigoide, filectenulosis , poliarteritis, complicaciones post-láser, infecciones por protozoos, pseudoxantoma elástico, queratitis seca pterigión, queratotomía radial, neovascularización de la retina, retinopatía del premadurez, fibroplasias retrolentales , sarcoidosis, escleritis de células falciformes, anemia, síndrome de Sogren, tumores sólidos, enfermedad de Stargart, enfermedad de Steven Johnson, queratitis límbica superior, sífilis, lupus sistémico, degeneración marginal de Terrien, toxoplasmosis , tumores de sarcoma de Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma , tumores de retinoblastoma , tumores de rabdomiosarcoma, colitis ulcerosa, obstrucción de la vena, deficiencia de vitamina A, sarcoidosis de Wegener, angiogénesis no deseada asociada a la diabetes, enfermedades parasitarias, cicatrización anormal, hipertrofia después de cirugía, lesiones o traumatismos (v.gr., lesión pulmonar aguda/SDRA) , inhibición de crecimiento del pelo, inhibición de ovulación y formación del cuerpo lúteo, inhibición de implantación, e inhibición de desarrollo del embrión en el útero.

Terapias anti-angiogénesis son útiles en el tratamiento general de rechazo del injerto, inflamación pulmonar, hipertensión pulmonar primaria, síndrome nefrótico, preeclampsia, y derrame pleural, enfermedades y trastornos que se caracterizan por permeabilidad vascular indeseable, v.gr., edema asociado con tumores cerebrales, ascitis asociada con tumores malignos, síndrome de Meigs, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, derrame pericárdico (tal como el asociado con pericarditis) , permeabilidad asociada con enfermedades cardiovasculares tales como la condición posterior a infartos de miocardio y apoplejías y similares, y sepsis.

Otras enfermedades dependientes de angiogénesis de conformidad con esta invención incluyen angiofibroma (sangre anormal de vasos que son propensos al sangrado) , glaucoma neovascular (crecimiento de vasos sanguíneos en el ojo) , malformaciones arteriovenosas (MAV; comunicación anormal entre arterias y venas) , fracturas sin unión (fracturas que no se curan) , placas de ateroscleróticas (endurecimiento de las arterias) , granuloma piogénico (lesión común de la piel compuesta de vasos sanguíneos) , escleroderma (una forma de enfermedad del tejido conectivo), hemangioma (tumor compuesto de vasos sanguíneos) , meningioma, hiperplasias tiroideas (incluyendo la enfermedad de Grave) , tracoma (principal causa de ceguera en el tercer mundo), articulaciones hemofílicas, sinovitis, dermatitis, adherencias vasculares, y cicatrices hipertróficas (formación anormal de cicatrices) .

IV. Dosificaciones y Formulaciones Las composiciones de anticuerpo (v.gr., bHl-44 o bHl-81) o fragmento de anticuerpo serán formuladas, dosificadas, y administradas en una manera consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular a ser tratado, el mamífero particular a ser tratado, las condiciones clínicas del sujeto individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación del agente, el método de administración, y otros factores conocidos a los practicantes de la medicina. La "cantidad terapeúticamente efectiva" del anticuerpo o fragmento del anticuerpo a ser administrado estará gobernada por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar, o tratar un cáncer o trastorno autoinmune. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo no necesita estar, pero es opcionalmente , formulado con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tartar cáncer o un trastorno auto- inmune o un riesgo de desarrollar cáncer o una enfermedad auto- inmune. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores mencionados anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y vías de administración como se utiliza en la presente anteriormente o alrededor de 1 a 99% de las dosis empleadas hasta ahora. En general, el alivio o tratamiento de un cáncer implica la disminución de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con el cáncer. La cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede alcanzar uno o una combinación de los siguientes: reducir (por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100 % o más) el número de células cáncerosas; reducir o inhibir el tamaño del tumor o la carga tumoral; inhibir (es decir, para disminuir en cierta medida y/o detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; reducir la secreción hormonal en el caso de adenomas; reducir la densidad de vasos; inhibir la metástasis de tumores; reducir o inhibir el crecimiento de tumores; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En algunas formas de realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se utiliza para prevenir la aparición o reaparición de cáncer o de un trastorno auto- inmune en el sujeto.

En una forma de realización, la presente invención puede ser usada para aumentar la duración de supervivencia de un paciente humano susceptible a o diagnosticado con un cáncer o trastorno auto-inmune. La duración de la supervivencia es definida como el tiempo desde la primera administración del fármaco hasta la muerte. La duración de la supervivencia puede también ser medida por el índice de riesgo estratificado (IR) del grupo de tratamiento contra el grupo control, el cual representa el riesgo de muerte para un paciente durante el tratamiento.

En aún otra forma de realización, el tratamiento de la presente invención incrementa significativamente la tasa de respuesta en un grupo de pacientes humanos susceptibles a o diagnosticados con un cáncer quienes son tratados con varias terapias anti-cáncer. La tasa de respuesta está definida como el procentaje de pacientes tratados que respondieron al tratamiento. En un aspecto, el tratamiento de combinación de la invención usando un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y cirugía, terapia de radiación, o uno o más agentes quimioterapéuticos incrementan significativamente la tasa de respuesta en el grupo de pacientes tratados comparados con el grupo tratado con cirugía, terapia de radiación, o sólo quimiterapia, el aumento teniendo un valor p chi-cuadrado menor que 0.005.

Mediciones adicionales de eficacia terpéutica en el tratamiento de cánceres son descritas en la solicitud de patente US 2005/0186208.

Se preparan formulaciones terapéuticas usando métodos estándar conocidos en la materia mediante mezclar al ingrediente activo teniendo el grado de pureza deseado con vehículos, excipientos o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition) , ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA) . Vehículos aceptables, incluyen solución salina, o reguladores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) , proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contra-iones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS, o PEG.

Opcionalmente , pero de preferencia, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferiblemente cloruro de sodio y, preferentemente en alrededor de concentraciones fisiológicas. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden contener un conservador farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización la concentración de conservadores varía de 0.1 a 2.0%, típicamente v/v. Conservadores adecuados incluyen aquellos conocidos en la materia de farmacéutica. Alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparabeno, y propilparabeno son conservadores preferidos. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden incluir un tensioactivo farmacéuticamente aceptable a una concentración de 0.005 a 0.02%.

La formulación presente puede contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a ser tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí . Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en combinación que son efectivas para el propósito de intención.

Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en micro-cápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de co-acervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, micro-cápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y micro-cápsulas de poli (metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas coloidales de entrega de fármacos (por ejemplo, liposomas, micro-esferas de albúmina, micro-emulsiones, nano-partículas , y nano-cápsulas) o en macro-emulsiones . Tales técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros sólidos hidrófobos que contienen al anticuerpo, las cuales matrices están en forma de artículos configurados, v.gr., películas, o micro-cápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) , o de poli (alcohol vinílico) ) , poliláctidos (patente US 3,773,919), co-polímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, co-polímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT (micro-esferas inyectables compuestas por co-polímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y poli (ácido D- ( - ) -3 -hidroxibutírico) . Aunque polímeros tales etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos. Cuando anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o aglomerarse como resultado de exposición a humedad a 37°C, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad . Estrategias racionales pueden diseñarse para estabilización en función del mecanismo implicado. Por ejemplo, si ' se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse mediante modificar residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímero.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en la presente descritos (v.gr., bHl-44 o bHl-81 o fragmentos de los mismos) se adminsitran a un sujeto humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por rutas intra-muscular, intra-peritoneal , intra-cerobrospinal , sub-cutánea, intra-articular, intra-sinovial , intratecal, oral, tópica, o de inhalación. La administración local puede ser deseada particularmente si efectos secundarios extensivos o toxicidad se se asocian con antagonismo de VEGF y/o HER2. Una estrategia ex vivo también puede ser utilizada para aplicaciones terapéuticas. Estrategias ex vivo involucran la transfección o transducción de células obtenidas a partir del sujeto con un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Las células transíectadas o transducidas son entonces devueltas al sujeto. Las células pueden ser cualquiera de una amplia gama de tipos incluyendo, sin limitación, células hematopoyéticas (v.gr., células de médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, células T, o células B) , fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales , queratinocitos , o células musculares .

En un ejemplo, el anticuerpo (v.gr., bHl-44 o bHl-81) o fragmento de anticuerpo es administrado localmente, v.gr., por inyecciones directas, cuando el trastorno o ubicación del tumor lo permite, y las inyecciones pueden repetirse periódicamente. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede también suministrarse sistemáticamente al sujeto o directamente a las células del tumor, v.gr., a un tumor o un lecho del tumor seguido por la extirpación quirúrgica del tumor, con el fin de prevenir o reducir la reincidencia local o metástasis.

V. Artículos de Manufactura y Kits Otra forma de realización de la invención es un artículo de manufactura que contiene materials útiles para el tratamiento de enfermedades auto- inmunes y cánceres. El artículo de manufactura comprende un contenedor y una etiqueta o inserto en el empaque sobre o asociado con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor mantiene una composición la cual es efectiva para el tratamiento de la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frascp que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo multiespecífico de la invención. La etiqueta o el inserto de empaque indican que la composición se utiliza para tratar la condición particular. La etiqueta o el inserto de empaque comprenderán además instrucciones para administrar la composición de anticuerpo al paciente. También se contemplan artículos de manufactura y kits que comprenden las terapias combinatorias descritas en la presente.

El inserto de empaque se refiere a instrucciones habitualmente incluidas en los empaques comerciales de productos terapéuticos que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias relativas a la utilización de dichos productos terapéuticos. En otras formas de realización, el inseto de empaque indica que la composición se utiliza para el tratamiento del cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, glioma, o cáncer de ovario.

Además, el artículo de manufactura puede incluir adicionalmente un segundo recipiente que comprende un regulador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina regulada por fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede además incluir otros materiales desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros reguladore, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

También se proporcionan kits que son útiles para varios propósitos, v.gr., para purificación o inmuno-precipitación de VEGF o HER2 a partir de células. Para aislamiento y purificación de VEGF, o HER2, el kit puede contener un anticuerpo VEGF/HER2 (v.gr., bHl-44 o bHl-81) acoplado a cuentas (v.gr., cuentas de sefarosa) . Kits pueden ser provistos que contienen los anticuerpos para la detección y cuantificación de VEGF o HER2 in vitro, v.gr., en un ELISA o Western blot . Al igual que con el artículo de manufactura, el kit comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de emapque sobre o asociado con el contenedor. El contenedor tiene una composición que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo multi-específico de la invención. Contenedores adicionales pueden incluirse que contienen, v.gr., diluyentes y reguladores o anticuerpos de control. La etiqueta o inserto de empaque pueden proporcionar una descripción de la composición, así como instrucciones para el uso in vi tro o de diagnóstico pretendido.

La descripción escrita anteriormente se considera suficiente para permitir que un experto en la materia practique la invención. Los siguientes ejemplos son ofrecidos sólo a efectos ilustrativos, y no están destinados a limitar de ninguna manera el alcance de la presente invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de aquellas indicadas y descritas en la presente serán evidentes a los técnicos en la materia a partir de la descripción anterior y entran en el ámbito de las reivindicaciones anexas.

Ejemplos Ejemplo 1. Diseño y construcción de biblioteca El sitio de ligadura de antígeno del anticuerpo es formado por la asociación del dominio variable (VH, VL) de cadena pesada (CP) y de cadena ligera (CL) , cada uno contiene tres bucles de CDR para el reconocimiento de antígenos. En muchos casos uno de los dos dominios variables, frecuentemente VH, determina la especifidad del antígeno. Ratones con un repertorio de CP transgénica pero con CL intacta generan títulos de anticuerpos neutralizados (Senn et al., Eur. J. Immunol . 33:950-961, 2003). Se investigó cómo la bi-especi icidad de un anticuerpo puede ocurrir y si la utilización diferente de los dominios VH y VL puede permitir especificidad de ligadura de antígeno dual.

Se tomó un acercamiento semi-empírico para encontrar un diseño para diversificar la composición de aminoácidos y la longitud de CDR de la cadena ligera del anticuerpo y una plantilla de biblioteca que permitió la generación de una biblioteca de anticuerpos exhibidos en fago funcionales a partir de la cual anticuerpos ligándos específicamente a un antígeno de proteína podrían seleccionarse. La diversidad de secuencias y longitudes de las regiones de CDR de aproximadamente 1,500 secuencias de cadena ligera kappa humanas, como se representa en la base de datos Kabat , sirvieron de guía para el proceso de diseño de la biblioteca. Residuos expuestos a solvente se apuntaron para aleatorización . Un sub-conjunto de las posiciones aleatorias se diseñó para representar aminoácidos que son parte del repertorio natural en estos sitios, mientras que los sitios restantes fueron aleatorizados para incluir todos los 20 aminoácidos naturales. En particular, la plantilla de la cadena ligera (dominio variable) señalada a continuación se modificó como se describe en la presente (los residuos subrayados son aleatorios) (SEQ ID NO: 10). DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQD28VNTAV-AWYQQKPGKAPKLLIYS50ASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQH91YTTP PTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC . Se generaron cuatro juegos de bibliotecas basados en 3 plantillas Fab y scFv humanas en donde distintos conjuntos de posiciones fueron escogidos para la aleatorización (Figura 1) .

En todas las bibliotecas la cadena pesada fue mantenida constante con su secuencia definida en la plantilla de biblioteca. La secuencia de plantilla de cadena pesada (dominio variable) se señala a continuación (SEQ ID NO:ll). EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVK GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS FP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH .

Los diseños de biblioteca están resumidos en la figura 1 y la figura 2. Todas las plantillas de biblioteca contienen un codón de paro (Sid u et al., 2004) incrustrado en la CDR Ll previniendo la presencia de cadena ligera de plantilla entre los miembros de biblioteca de anticuerpos exhibidos en fagos. Las secuencias CDR de plantilla están resumidas en la figura 3.

En un ejemplo, se introdujeron mutaciones en el dominio variable de CL de un anticuerpo específico de HER2 para identificar variantes que puedan ligarse a un antígeno de proteína diferente mientras se retiene la especificidad de ligadura original. Se tomó un acercamiento conservador para aletorizar los CDRs de CL a fin de generar variantes que puedan expresarse de manera estable. Se selecionaron doce posiciones de CDR de CL expuestas a solvente para aleatoriedad : cinco en CDR1 (28, 29, 30, 31, 32), tres en CDR2 (50, 51, 53) y cuatro en CDR3 (91, 92, 93, 94). Además, para guiar el diseño de diversidad de aminoácidos en sitios elegidos, la diversidad natural de estas posiciones fue examinada mediante análisis de aproximadamente 1,500 secuencias de CDR de CL kappa humanas (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res. 28:214, 2000; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . 196:901, 1987) (figura 4) . Algunas posiciones con diversidad relativamente alta (30, 31, 50, 92, 93) fueron completamente aleatorias mientras que otras posiciones fueron limitadas a tan pocos coo dos tipos de aminoácidos para imitar anticuerpos naturales. La variación de longitud de CDRl y CDR3 de CL también se reflejó en la biblioteca (figura 4) . En la figura 4, X denota tipos de aminoiacidos diseñados a baja frecuencia como es mostrado. La diversidad de longitud se construye mediante la inserción de 1 a 5 residuos entre los residuos 30 y 31 y entre 93 y 94 residuos.

La biblioteca de CL es un repertorio ingenuo productivo (Tabla 1) . Los resultados del análisis y selección de 95 clones al azar al final de cuatro rondas de selección se encuentran listados. En particular, se llevo a cabo la selección para la nueva especifidad de ligadura como se describió en los objetivos inmovilizados (VEGF, DR5, y Fe humano) (Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338:299, 2004) . Después de cuatro rondas de selección 95 clones de fago se ensayaron usando ELISA para ligadura al objetivo, HER2 , y una proteína no objetivo, BSA, para asegurar ligadura especifica. Para enriquecer para clones de ligadura a objetivo que mantuvieran ligadura a HER2, se realizó una ronda final de selección sobre HER2. Los clones positivos fueron secuenciados . Para identificar los ligadores de más alta afinidad, el IC50 para ligadura a antígeno fue determinado por ELISA competitivo (Sidhu et al., J. Mol. Biol . 338:299, 2004) . El número de clones únicos según se determina por análisis de secuencia y el número de clones únicos que mantienen ligadura a HER2 (clones biespecí fieos) se muestran. Estos clones muestran mínimas señales de ligadura de fondo a antígenos irrelevantes, tales como BSA.

Tabla 1. Resumen de selección de biblioteca de cadena ligera * = señal de ligadura débil * = señal de ligadura a Her2 débil ** = señal de ligadura a DR5 débil La selección contra tres antígenos de proteína: factor de crecimiento vascular endotelial humano (hVEGF) , receptor de muerte 5 (DR5) , y fragmento de ligadura de complemento de IgG (Fe) generaron muchos clones de ligadura (figura 5A) . Algunos clones perdieron su afinidad de ligdura a HER2 , mientras que otros mantuvieron ligadura a HER2 y fueron por tanto bi- específicos. Análisis de secuencia de los 131 variantes únicos de anticuerpo Herceptin con nueva especificidad de ligadura identificó las sustituciones e inserciones de aminoácidos comparadas con el anticuerpo Herceptin (figura 5B) .

El número de mutaciones varío de 3 a 17. Los clones que retuvieron ligadura a HER2 (los clones bi-específicos) contuvieron menos mutaciones en promedio que aquellos que perdieron ligadura a HER2. Fue preferido el retener la secuencia CDR-L3 del anticuerpo Herceptin pero no suficiente para conservar ligadura a HER2. Esto es consistente con el reporte de que la CDR-L3 de anticuerpo Herceptin es la CDR de LC mas importante para ligadura a HER2 (Kelley and O'Connell, Biochemistry 32:6828. 1993) . Clones de ligadura a VEGF representativos fueron expresados como proteínas Fab e IgG (Tabla 2) .

Tabla 2. Los anticuerpos representativos aislados a partir de la biblioteca de cadena ligera del anticuerpo Herceptin (SEQ ID NOS: 12-23) .

Diferencias del anticuerpo Herceptin son mostradas en resaltado .

Para demostrar que estos anticuerpos se ligan específicamente a sus antígenos afines y no interactuaron no específicamente con otras proteínas, se demostró que no había ligadura detectable a un panel de lisados de células de mamífero y proteínas no de antígeno. El ensayo confirmó la mono- y bi-especificidad de las IgGs o Fabs purificadas (figura 6) .

Las afinidades de ligadura de equilibrio (KD) de los anticuerpos mono-específicos derivados de biblioteca de LC variaron de 15 a 150 nM. Los anticuerpos bi-específicos ligaron los nuevos antígenos (es decir, VEGF) con afinidad de nM alta a µ? baja, y HER2 con afinidad nM baja (Tabla 2) . De los anticuerpos mostrados en la Tabla 2, el anticuerpo bHl exhibió la más alta afinidad bi-específica para los dos antígenos de proteína diferentes VEGF (KD=300 nM) y HER2 (KD=26 nM) .

Materiales Enzimas y fago auxiliar M13-K07 fueron a partir de New England Biolabs. E. coli XLl-Blue fue de Stratagene. Albúmina de suero bovino (BSA) , ovoalbúmina, y Tween 20 fueron de Sigma. Neutravidina , caseína, y Superblock fueron de Pierce. Proteína G inmovilizada y peroxidasa de rábano (HRP) conjugada anti-M13 fueron de GE Healthcare (Piscataway, NJ) . Inmuno-placas Maxisorp fueron de Nunc (Roskilde, Dinamarca) . Substrato de tetrametilbencidina (TMB) fueron de Kirkegaard and Perry Laboratories (Gaithersburg, MD) . Todos los antígenos de proteína fueron generados por grupos de investigación en Genentech, Inc. Las degeneraciones de ADN fueron representadas utilizando el código de IUB y a menos se indique lo contrario, representan mezclas equimolares: N=A/C/G/T, D=A/G/T, V=A/C/G, B=C/G/T, H=A/C/T, K=G/T, M=A/C, R=A/G, S=G/C, =A/T, Y=C/T.

Por ejemplo, en ciertas posiciones aleatorias, el codón de tipo silvestre fue reemplazado por un codón degenerado NNK (N=A/T/G/C, K=G/T en una relación equimolar) que codifica todos los 20 aminoácidos naturales. El codón XYZ se refiere a un codón con relaciones de nucleótidos desiguales en cada posición del triplete del codón. X contuvo 38% de G, 19% de A, 26% de T y 17% de C; Y contuvo 31% de G, 34% de A, 17% de T y 18% de C; y Z contuvo 24% de G y 76% de C.

Vectores Fagemidos para construcción de biblioteca Técnicas de biología molecular estándar fueron usadas para la construcción del vector. Tres plantillas fueron construidas para generación de la biblioteca. Todas las plantillas son derivadas del plásmido pV0354 utilizado en las bibliotecas de cadena pesada sobre la base de 4D5 humanizado modificado (versión 8) (Lee et al . , 2004a) .

El fagémido de plantilla 2C4 Fab-C, pJB0290, fue construido mediante la clonación del dominio variable de cadena pesada 2C4 en un vector pV0354-Fab-C que contiene al promotor de fosfatasa alcalina (Lowman et al., 1991) y la señal de secreción stll para tanto cadena ligera y cadena pesada de Fab. Es diseñado para contener una única cisteína en la terminal C en el dominio variable de cadena pesada 1 para permitir la exhibición de fagos M13 bivalentes del 2C4 Fab como se describió previamente (Lee et al., 2004b) . Las CDRs de cadena ligera de 2C4 se incorporaron en el vector Fab-C por mutagénesis dirigida a sitio utilizando el método de Kunkel et al. (Kunkel et al., 1987). Se añadió en la terminal C de cadena ligera un epítopo tag (gD tag) (Lasky y Dowbenko, 1984) para permitir la determinación del nivel de exhibición como se describe (Sidhu et al., 2004). La plantilla de biblioteca Fabl2-G, pV1283, fue creada por la clonación de un dominio variable de cadena pesada altamente exhibido en pV0354-Fab-C, y el dominio variable de cadena ligera fue modificado para contener CDR-L3 de Fab-12 (A4.6.1 humanizado, un anticuerpo anti-VEGF) . La VH altamente exhibida fue seleccionada a partir de una biblioteca Fab que escogió al azar los residuos de CDR de cadena pesada de G6 Fab utilizando mutagénesis de exploración de alanina disparada (Liang et al., 2006; Vajdos et al., 2002) con la CDR-L3 convertida a Fab-12 (Y9iSTVPW96; SEQ ID N0:24) por el encuadre sobre el anticuerpo anti-gD inmovilizado. El diseño y la construcción del fagémido pV1384, mostrando bivalentemente scFv 4d5 (LC-R66G) bivalentemente sobre la superficie de las partículas del fago M13 fueron modificados a partir de la plantilla pS2018 descrita previamente (Sidhu et al., 2004). El fragmento scFv contuvo un epítopo tag gD en la región de enlazador entre la cadena ligera y la cadena pesada. El residuo de estructura de CL Arg66 se mutó a Gly66, el cual es el residuo predominante en esa posición en más del 95% de las cadenas ligeras kappa naturales. Como se describe en elley y Connell (Biocehmistry 32:6828, 1993), la mutación R66G reduce afinidad de ligadura del anticuerpo Herceptin a HER2 sólo ligeramente (<2 veces) . Las secuencias de CDR de las plantillas de biblioteca se resumen en la figura 3.

Construcción de Biblioteca Bibliotecas exhibidas en fagos se crearon usando mutagenesis dirigida a oligonucelótidos como se describe (Sidhu et al., 2004). Los vectores de plantilla de biblioteca contuvieron un codón de paro (TAA) incrustrado en CDR-L1, el cual fue reparado durante la reacción de mutagénesis usando oligonucleótidos degenerados que se templaron sobre las secuencias que codifican CDR-L1, CDR-L3 (todas las bibliotecas), CDR-L2 (L1/L2/L3-A, -B, -C, +L4-D) y la estructura de cadena ligera 3 (L1/L4 y L1/L2/L3+L4-D) . Las reacciones de mutagénesis de biblioteca se llevaron a cabo de acuerdo con el método de Kunkel et al. (Kunkel et al., 1987) . Los diseños de CDR de cadena ligera para las bibliotecas son descritos en la figura 1, la cual resume los codones degenerados usados en cada posición para las diferentes bibliotecas. Tres o cuatro oligonucleótidos fueron mezclados a ciertas tasas para cada CDR para codificar la frecuencia deseada de tipos de aminoácidos en cada posición objetivo para aleatoriedad (figura 4) . Los oligonucleótidos fueron combinados en diferentes tasas para ajustar finamente la diversidad para reflejar la frecuencia de aminoácidos en posiciones seleccionadas en las secuencias kappa naturales de cadena ligera. Para CDR1 , se mezclaron tres oligonucleótidos que contiene codones para las posiciones 91-94: CAT NNK NNK RST (SEQ ID NO:25), KMT XYZ XYZ RST (SEQ ID NO:26) , o DGG XYZ XYZ RST (SEQ ID NO:27) en proporciones 1:3:1. XYZ es una variación de NNK que posee porporciones iguales de A/G/T/C para cada sitio para reducir la cobertura de aminoácidos hidrófobos alifáticos (Lee et al., J. Mol. Biol . 340:1073, 2004). Para CDR2 , se mezclaron cuatro oligonucleótidos que contienen codones para las posiciones 50-53: NNK GST TCC NNK (SEQ ID NO:28), TGG GST TCC NNK (SEQ ID NO:29), KGG GST TCC TMT (SEQ ID NO:30), o NNK GST TCC TMT (SEQ ID NO:31) a proprociones 1:1:2:10. Para CDR3 , cada longitud fue una mezcla de tres oligonucleótidos conteniendo codones para las posiciones 28-33: G7oA70C7o RTT NNK NNK TAC STA (SEQ ID NO: 32), G70A70C70 RTT NNK NNK DGG STA (SEQ ID NO: 33), o G70A70C70 RTT NNK NNK NMT STA (SEQ ID NO: 34) a proporciones 1:1:2. G70A70C70 es un codón "suave" que permite que 70% de los nucleótidos designados y 10% cada uno de los otros tres, codificando -50% de Glu y -50% de los otros aminoácidos .

Análisis estructural de un número de anticuerpos representativos con CLs kappa muestra CDR1 tiene el rango más amplio de conformaciones, lo cual es probablemente el resultado de la variación de longitudes del bucle (11-17 residuos entre las posiciones 24 y 34) . Diferentes longitudes de CDR-L1 (longitudes de 11-16) por ende se incluyeron en la biblioteca. CDR-L3 natural también varía en longitudes (longitudes de 7-10 residuos entre la posición 89-96) , lo cual es reflejado por el diseño de biblioteca (longitudes 8-10; figura 4) .

La figura 1 muestra la comparación de la diversidad natural de cadena ligera y los propios diseños de biblioteca. Los productos de mutagénesis se agruparon en una sola reacción por biblioteca y se electroporaron en células de E. Coli SS320 complementadas con fago auxiliar K07 y se cultivaron durante la noche a 30°C (Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073, 2004). ~~ 1011 células y 5-10 ig de ADN se utilizan en cada reacción de electroporación. La biblioteca de fagos se purificaron (Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338:299, 2004). El número de transformantes varió de 109-1010. El nivel de exhibición de Fabs o scFv intactos sobre la superficie del fago se determinó en un ensayo de ligadura ELISA donde 96 clones se seleccionaron al azar a partir de cada biblioteca se probaron con respecto a su capacidad para ligarse a un anticuerpo anti-gD. El nivel de exhibición varió entre 5-25% (figura 2) . El 25% de los clones exhibiendo un anticuerpo retuvieron ligadura a HER2. Alrededor de 150 clones de exhibición se secuenciaron para examinar la diversidad de biblioteca actual en comparación con la diversidad de diseño. Una porción (-30%) de los miembros de biblioteca exhibidos funcionalmente conservaron la secuencia CDR-L2 y/o CDR-L3 del anticuerpo Herceptin debido a mutagénesis incompleta (un codón de paro de plantilla en CDR-1 garantiza 100% de mutación de esta CDR en scFvs expresados) . Estos fueron excluidos del análisis de secuencia de la diversidad de biblioteca actual. En la mayoría de las posiciones al azar, la diversidad de la biblioteca exhibida en fagos de los clones de exhibición no se desvió significativamente (p> 0,05, prueba de tasas de probabilidad) de la diversidad diseñada. Excepciones fueron la posición 29 de la CDR-L1 donde Val se encontró estando ligeramente sobre-representada comparada con lie (p=0005) y las posiciones 51 y 53 de CDR-L2, donde Gly y Ser fueron mas prevalentes que Ala y Tyr, respectivamente (p <0,01) .

Ejemplo 2. Evaluación del desempeño de Biblioteca Clasificación y Selección de Biblioteca Una biblioteca se considera funcional cuando los anticuerpos ligándose específicamente a varios antígenos de proteínas se pueden aislar después de 4-5 rondas de clasificación. Muchos objetivos de proteína eran conocidos para permitir la inmovilización funcional para encuadre de biblioteca y anticuerpos específicos han sido generados a partir de bibliotecas exhibidas en fago validadas (Fellouse et al., 2005) (Lee et al., 2004a) . Para evaluar cada conjunto de bibliotecas, se eligió un sub-conjunto de estos objetivos para selección (figura 2) . Las bibliotecas fueron sometidas a una ronda inicial de selección de ligadura con un anticuerpo anti-gD o proteína L como el objetivo de captura para elimitar clones en los cuales el gen Fab/scFv se ha suprimido, seguida por 4-5 rondas de selección de antígenos. Alternativamente, se sometieron directamente a selección de ligadura al objetivo sin pre-selección con anti-gD o proteína L. Placas NUNC Maxisorp de 96 pozos fueron recubiertas durante la noche con un antígeno (5 \iq/mi) y bloqueadas durante 1 hora con agentes bloqueadores alternantes (figura 7) . Soluciones de fago de 1013 fagos/ml se añadieron a las inmuno-placas recubiertos en el primer ciclo de selección. La concentración de fagos se redujo en cada ronda de selección. Después de incubación de las soluciones de fago en las immuno-placas para permitir ligadura al antígeno inmovilizado, las placas fueron lavadas repetidamente con PBS, Tween 20 al 0.5%. Para aumentar el rigor, el tiempo de incubación se redujo (4 horas para la Ia ronda, 3 horas para la 2a, 3 horas para la 3a, 2 horas para la 4a, 1,75 horas para la 5a) y el número de lavados se incrementó en cada ronda de selección (figura 7) . Fago ligado se eluyó con HC1 0.1 M durante 30 minutos y el eluyente fue neutralizado con base Tris 1.0 M. la recuperación de fagos por pozo de inmuno-placa recubierto con antígeno se calculó y se comparó con aquellas de un pozo bloqueado sin antígeno recubierto para estudiar el enriquecimiento de clones de fagos exhibiendo Fabs o scFvs que se ligaron específicamente al antígeno objetivo (figura 7) . El fago eluido fue amplificado en E. coli y usado para otras rondas de selección. Clones aleatorios de las rondas 4 y 5 se seleccionaron para clasificación y se ensayaron usando ELISA de fagos en el cual ligadura a objetivo y anti-gD se comparó con ligadura de una proteína no relevante (BSA) para revisar ligadura no específica.

Clones que se ligan al anticuerpo anti-gD y el objetivo pero no la proteína no específica se consideraron positivos específicos. Bibliotecas L1/L3, L1/L4, L1/L2/L3-A, Ll/L2/L3-B_l y Ll/L2/L3-B_2 no rindieron algún clon positivo específico mientras que las bibliotecas L1/L2/L3-C y L1/L2/L3+L4-D permitieron aislamiento de anticuerpos específicos a los antígenos objetivo.

Por ejemplo, los clones al azar de la ronda cuatro fueron ensayados utilizando ELISA de fagos en donde ligadura de clones amplificados individualmente al objetivo y HER2 se compararon con ligadura de una proteína no objetivo (BSA) para evaluar la especi icidad de ligadura. Para enriquecer los clones de fagos que mantuvieron ligadura a HER2 , el fago eluido de las tercera y cuarta rondas de selección de VEGF o DR5 se amplificaron y se sometieron a una nueva ronda de selección sobre pozos recubiertos con HER2. Las regiones VL y VH de los clones positivos fueron amplificados por PCR y secuenciados .

La tasa de éxito para hFC, hVEGF , y hDR5-lf, fue de 63, 77, y 85% respectivamente. Las regiones VL de los clones positivos fueron amplificadas por PCR y secuenciadas como se describe (Sidhu et al., 2004) . El análisis de secuencia de ADN de los ligadores específicos positivos reveló un porcentaje de clones únicos de 51% (hFC) , 55% (hVEGF) , y 6.1% (hDR5-LF) . Las secuencias de los clones de ligadura a hVEGF únicos se resumen en la figura 8.

Selección combinada de placa y solución de clones de ligadura a hVEGF Alta diversidad de clones de ligadura a hVEGF se observó después de cuatro rondas de clasificación. Para identificar clones de ligadura a hVEGF de alta afinidad, un acercamiento de selección a base de solución se tomó después de la 4 a clasificación a base de placa. Se incubaró hVEGF biotinilado 50 n con el fago propagado a partir de la 4 a ronda de selección sobre antígeno inmovilizado. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente con agitación, fago ligado a hVEGF fue capturado sobre inmuno-placas cubiertos con neutravidina y bloqueadas seguido por lavados repetidos. Los clones de fago fueron eluídos, clasificados, y secuenciados como se describe anteriormente. Secuencias de clones de ligadura a hVEGF a partir del último paso de selección en solución se encuentran en la figura 9.

Aislamiento de clones bi-específieos de las bibliotecas L1/L2/L3-C y L1/L2/L3+L4-D La plantilla de biblioteca para las bibliotecas L1/L2/L3-C y L1/L2/L3+L4-D fue un fragmento scFv modificado a partir del anticuerpo hu4D5, el cual se liga a Her2 con alta afinidad. Cartografía del paratopo funcional de hu4D5-5 para ligadura a HER2 mediante mutagénesis de exploración de alanina de las regiones CDR mostró que residuos de cadena pesada contribuyen a la mayoría de la energía libre de ligadura, mientras que residuos de cadena ligera individuales contribuyen en menor medida (Kelley y O'Connell, 1993). Análisis de la estructura atómica del Fab de anticuerpo Herceptin en complejo con Her2-ECD humana demostró que mientras la cadena ligera está involucrada en hacer contacto con el antígeno, la cadena pesada proporciona la mayor parte de la interface estructural con el antígeno (Cho et al., Nature 421:756, 2003). Observamos que algunos de miembros de las bibliotecas funcionales de cadena ligera construidos sobre plantilla de anticuerpo Herceptin retuvieron la habilidad de ligadura a Her2. En un intento por aislar los fragmentos scFv bi-específicos de las bibliotecas funcionales L1/L2/L3-C y L1/L2/L3+L4-D, capaces de ligadura a Her2 así como a un segundo antígeno, se aplicaron dos estrategias. En un acercamiento, los clones positivos de la selección de antígeno objetivo previamente descrita fueron clasificados por ELISA para aquellos que retuvieron ligadura a Her2. Dependiendo de la especificidad del segundo antígeno, el porcentaje de clones positivos específicos capaces de ligarse a Her2. Solamente 1 de 61 clones positivos específicos hFc únicos aún se ligaron a Her2 (1.6%), 30 de 41 clones de ligadura a hVEGF únicos aún se ligaron a Her2 (73%) , y 2 de 5 ligadores hDR5 únicos aún se ligaron a Her2 (40%) . Además, se tomó un acercamiento a base de selección para aislar anticuerpos bi-específieos mediante la selección de ligadores a Her2 a partir del conjunto de anticuerpos de ligadura hVEGF y hDR5. La elución de la ronda 4 de clasificación de antígeno objetivo fue sometida a una ronda de selección adicional mediante incubar 2xl013 fago/ml sobre Her2 recubierto (5 µq/ml) e inmunoplacas Maxisorp bloqueadas con BSA por 1 hora. Las placas se lavaron 15 veces con PBS, Tween 20 al 0.5% y eluidos con fago ligado como se describe previamente. Se seleccionaron clones al azar y se ensayaron para ligadura a Her2 , anti-gD y objetivo y se compararon con ligadura no específica a una proteína no relevante (BSA) . Todos los 192 clones probados fueron identificados como positivos específicos y secuenciados como se describe previamente. El secuenciamiento reveló 94 secuencias únicas. En resumen, este método generó 94 clones bi-específicos de Her2 /hVEGF de los 94 clones únicos probados (100%) (figura 8) . Las secuencias de todos los anticuerpos bi-específicos de hVEGF/Her2 aislados únicos a partir de ambas estrategias de aislamiento se resumieron en las figuras 10A y 10B. Las secuencias de clones aislados que perdieron toda ligadura detectable a Her2 son mostradas en la figura 11. De los clones que tienen especificidad dual, casi todos retuvieron CDR-L3 de anticuerpo Herceptin, haciendo probable que mantener CDR-L3 sea importante para mantener ligadura a HER2. En el caso de hDR5 , 2 de los 7 clones de ligadura a Her2 únicos fueron bi-específ icos (29%, 12 clones secuenciados) . Uno de los clones específicos duales tuvo algunos cambios homólogos en CDR-L3.

Caracterización de alto rendimiento de clones de ligadura a hVEGF Un ELISA competitivo de un solo punto de alto rendimiento en un formato de 96 pozos (Sidhu et al., 2004) se usó para la clasificación de clones de alta afinidad para hVEGF y para estudiar los perfiles de bloqueo de VEGFR1. En pocas palabras, inmuno-placas Maxisorp se recubrieron con 2 ug/ml de hVEGFios durante la noche 4°C y se bloquearon con BSA al 1% (p/v) durante 1 hora. Clones fagémidos en E. coli XLl-azul fueron cultivados en 150 µ? de caldo 2YT suplementado con carbenicilina y fago auxiliar M13-K07; los cultivos crecieron con agitación durante la noche a 37°C en un formato de 96 pozos. Sobrenadantes de cultivo conteniendo fago se diluyeron cinco veces en PBST (PBS con Tween 20 al 0.05% y BSA al 0.5% (p/v)) con o sin la adición de hVEGFi09 100 nM para clasificación de afinidad. Para clasificaciones de bloqueo de receptor, pozos recubiertos con hVEGF se incubaron con o sin Dominio 1-3 de VEGFR1 (Dl-3) y Dominio 2 de VEGFR1 (D2) antes de añadir sobrenadante de fago diluido cinco veces (Liang et al., 2006; Wiesmann et al., 1997) . Después de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) , las mezclas se transfirieron a las placas cubiertas con hVEGFi09 y se incubaron durante 10 minutos. La placa se lavó con PBT (PBS con Tween 20 al 0.05%) y se incubó durante 30 minutos con conjugado de peroxidasa de rábano-anticuerpo anti-M13 diluido 5,000 veces a 1 nM en PBST. Las placas fueron lavadas, desarrolladas con sustrato TMB durante aproximadamente cinco minutos, ahogadas con H3P04 1.0 M, y leídas con un espectrofotómetro a 450 nm. En el ensayo de afinidad de un solo sitio, la relación entre la absorbancia en presencia de hVEGFiog en fase de solución con aquella en ausencia de hVEGFi09 en fase de solución fue utilizada como una indicación de la afinidad. Una proporción baja indicaría que la mayoría de los Fab-fago estaban ligados a hVEGFi09 en fase de solución en la etapa de incubación inicial y, por lo tanto, no estaban disponibles para captura por hVEGF109 inmovilizado. Los resultados del ensayo de afinidad de alto rendimiento de los primeros 41 clones únicos se resumen en la figura 12. Del mismo modo, para el ensayo de bloqueo, una baja relación indica que la ligadura de un clon a hVEGF109 está bloqueada por la interacción hVEGFliog-VEGFR1 , lo que indica que algunos clones tienen un sitio de ligadura de superposición (epítopo) en VEGF con los fragmentos respectivos de receptores de VEGF (figuras 13A y 13B) , y estos clones son propensos a estar mostrando los anticuerpos de bloqueo.

Caracterización de alto rendimiento de clones hVEGF/Her2 bi-específicos Los mismos principios aplicados en al sección previa fueron aplicados para facilitar el aislamiento de clones con una alta afinidad para hVEGF y Her2 para su caracterización adicional (figura 14A) . Se utilizó ELISA competitivo de un solo punto de alto rendimiento para clasificar clones de alta afinidad para hVEGF y Her2 mediante recubrir inmuno-placas Maxisorp con 2 g/ml de hVEGF109 , y Her2-ECD durante la noche a 4°C, seguido por bloqueo por 1 hora con BSA al 1% (p/v) . Los clones de fago que fueron identificados como bi-específieos en la clasificación por ELISA de un solo punto previa se cultivaron como se describió anteriormente y se incubaron con y sin la adición de Her2-ECD 20 n y hVEGF 50 n . Después de incubación por 1 hora a temepratura ambiente, las soluciones fueron aplicadas a las inmuno-placas recubiertas y las señales de ligadura registradas y analizadas como se describió en la sección anterior. Se seleccionaron para adicional caracterización, clones con una baja proporción para tanto hVEGF y Her2. Los clones de fago específicos de hVEGF y bi-específicos de hVEGF/Her2 que dieron lugar a las menores tasas de señal en el ELISA competitivo de un solo punto fueron seleccionados para medición de afinidad por ELISA competitivo, así como los clones de fago de ligadura a DR5 y bi-específicos de DR5/Her2 a partir de la clasificación ELISA de un solo punto inicial y clones de ligadura a VEGF a partir de la selección combinada de placa y solución. Clones de fago fueron propagados a partir de una sola colonia por crecimiento en 25 mi de cultivo 2YT suplementado con carbenicilina y fago auxiliar K07 durante la noche a 30°C. El fago purificado por precipitación en PEG/NaCl fue primero diluido serialmente en PBST y probado para ligadura a una placa recubierta con antígeno. La dilución que dió una señal de saturación de 50-70% fue usada en el ensayo de ligadura en solución en el cual el fago fue primero incubado por una o dos horas con concentraciones incrementadas de antígeno y luego transferido por 10-15 minutos a placas recubiertas con antígeno para así capturar al fago no ligado. La IC50 fue calculada como la concentración de antígeno en etapa de ligdura en solución que inhibió el 50% del fago contra ligadura al antígeno inmovilizado. La figura 14B ilustra las curvas a partir de las cuales la IC50 fue calculada para los clones de ligadura a hVEGF analizados a partir de la estrategia de clasificación de placa. Los valores de IC50 variaron de 22 nM a >1 µ? (figura 14B) . Los valores de IC50 para los ligadores a hVEGF aislados por la placa combinada y selección a base de solución varió entre 41 nM-226 nM (figura 9) . Los valores de IC50 de clones de ligadura a DR5 variaron entre 20 nM a >1 µ?. Los valores de IC50 para clones bi-específicos hVEGF/Her2 se resumen en la figura 15.

Ejemplo 3. Caracterización de Anticuerpos a partir de la Biblioteca de Cadena Ligera Conversión de scFvs a Fabs Para probar si la conversión de los scFvs'2 según se exhiben en fago a Fabs afectó la afinidad de los clones de ligadura de la biblioteca, se eligieron 2 clones (3-7 anti-hVEGF y 4-1 anti-hDR5) para conversión a Fab y fueron exhibidos en fagos. La región VL del ADN de fagémido para fragmentos de hVEGF y DR5 scFv seleccionados fue digerida con enzimas de restricción, las cuales rompen el ADN corriente arriba de la región que codifica para CDR-L1 (ScoRV) y corriente abajo de la región que codifica para CDR-L3 (??p?) . El fragmento de ADN digerido fue ligado en un vector similarmente digerido (pAP2009) diseñado para la exhibición de fagos de Fab hu4D5 por fusión al dominio terminal C de la proteína de recubrimiento menor de gen 3 M13 (Lee et al., 2004b) . El fagémido bi-cistrónico resultante contiene la cadena ligera fusionada a un epítopo (gD) tag en la terminal C y la cadena pesada (VH y CHI) fusionada al gen para la proteína de recubrimiento menor M13 (p3) terminal C bajo el control del promotor de fosfatasa alcalina. El primer cuadro de lectura abierto codifica un polipéptido compuesto de la señal de secreción stll seguido de la cadena ligera de Fab4D5, con las CDRs sustituidos por aquellas del 3-7 anti-hVEGF y 4-1 anti-hDR5 scFv'2, seguido de un epítopo gD-tag. El segundo cuadro de lectura abierto codifica un polipéptido de fusión que consiste por los siguientes: la señal de secreción stll, la cadena pesada de Fab4D5, un codón de paro ámbar (TAG), una secuencia enlazadora Gly/Ser y un dominio terminal C de la proteína g3 (cP3) . La expresión en E. coli XL-1 azul co-infectada con M13-K07 como resultado de la producción de bacteriófago M13 exhibiendo versiones de Fab de 3-7 y 4-1 scFv'2. ELISAs de fagos competitivos se usaron para estimar las afinidades de los scFvs y Fabs exhibidos en fagos para hVEGF y hDR5 como valores de IC50. Los datos de los dos formatos diferentes se extuvieron en buen acuerdo (datos no mostrados) .

Para permitir la exhibición de bHl Fab en la superficie del bacteriófago M13, el plásmido pAP2009 fue modificado para codificar bHl Fab. Versiones de la bHl Fab fueron utilizados como plantillas de biblioteca conteniendo codones de paro (TAA) en cualquiera de las tres CDRs de CL o las tres CDRs de CP para las bibliotecas de CL y CP, respectivamente. Se construyeron, como se describió previamente, bibliotecas de exploración de alanina y homólogos de cadena pesada y de cadena ligera (Vajdos et al., J. Mol. Biol . 320:415, 2002). La degeneración varió de lxlO5 a lxlO8 y el tamaño de biblioteca actual de 6xl09 a 4xl010. Las bibliotecas fueron construidas como se describió anteriormente. Dos a tres rondas de selección fueron realizadas sobre objetivos inmovilizados (VEGF, HER2-ECD, proteína L, o anti-gD mlgG) (Vajdos et al., J. Mol. Biol. 320:415, 2002). Los clones de ligadura a objetivo fueron clasificados por ELISA de fagos para ligadura a objetivo seguido por secuenciación de ADN y alineación de secuencia para calcular las tasas de tipo silvestre/mutación en cada posición. Las tasas a partir del análisis de secuencia de aproximadamente 100 secuencias únicas de clones ligados a VEGF y HER2 fueron corregidas para exhibición y efecto del plegamiento de proteínas mediante dividir con tasas calculadas a partir de las secuencias de más de 100 clones de ligadura anti-gD para rendir valores Fwt/mut. Puesto que sólo la cadena pesada de Fab se fusiona con el recubrimiento del fago, la exhibición de fago de gD tag, que se fusionó con la cadena ligera, es indicativa del correcto plegamiento y asociación de la cadena ligera y la cadena pesada. De manera consistente, ligadura de proteína L a un epítopo no lineal en la cadena ligera del Fab también resultó en tasas similares de tipo silvestre/mutación como selecciones de gD tag. Los valores Fwt/mut fueron convertidos a AAG usando la fórmula AAG=RTlr¡ (Ka,wt/Ka,mut) =RTln (Fwt/mut) como se describió en Vaj dos et al. (J. Mol. Biol. 320:415, 2002) .

Expresión de enlazadores de biblioteca como Fab y IgG humanos libres Para determinar de modo preciso la afinidad, la especificidad y otras propiedades de los anticuerpos, se seleccionaron clones representativos para cada grupo de especificidad exhibiendo la mayor afinidad en experimentos ELISA de competencia para expresión como Fab y hlgG libres (figura 16) . El dominio variable de cadena ligera y de cadena pesada fue clonado en un vector diseñado previamente para expresión de Fab en E. coli o expresión transitoria de IgG humana en células de mamífero (Lee et al., 2004a) . Se generó la proteína Fab mediante cultivar las células de E. coli 34B8 transformadas en un medio C.R.A.P completo a 30°C durante 26 horas como se describe (Presta et al., 1997) . Las hlgGs fueron expresadas por transfección transitoria de 293 células y hlgG se purificó con cromatografía de afinidad de proteína A (Fuh et al., J. Biol. Chem. 273:11197, 1998) . Los cultivos de E. coli de 1 L se purificaron con cromatografía de afinidad de proteína G. Las columnas fueron lavadas con PBS y proteína Fab fue eluída con ácido acético 100 mM y dializada contra PBS. Los cultivos de E. coli de 4 L fueron purificados sobre una columna de afinidad de proteína A seguido por cromatografía de intercambio catiónico como se describió previamente (Muller et al., 1998). Concentraciones de proteínas fueron determinadas espectrofotométricamente . El rendimiento final para Fab fue típicamente de 0.8-15 mg/1 purificado a partir del crecimiento en un matraz de agitación de pequeña escala. El rendimiento de producción de IgG fue de medio a alto en 6.7-60 mg/1 en cultivo de pequeña escala (figura 17) . Las proteínas purificadas fueron caracterizadas primero usando cromatografía de exclusión de tamaño y dispersión de luz para asegurar que las proteínas no exhibieran niveles significativos de aglomeración de la proteína (<5%) .

Brevemente, los Fabs y hlgGs expresados fueron clasificados por ELISA para ligar sus antígenos respectivos. Todos excepto uno de los variantes se encontraron ligándose con sus antígenos afines. El clón 4-6 perdió la habilidad de ligadura a hDR5 cuando se convierte a Fab e hlgG. Usando ELISA estándar (H3, H4_N, H4_D hlgG) y ELISA competitivo (bHl, 3-1, 3-6, 3-7 hlgG), clones selectos anti-VEGF, que surgieron en contra de la forma corta de hVEGF109, fueron probados para ligadura a hVEGFi6S . G6 hlgG (Fuh et al., 2006) fue usada como un control positivo (figuras 18A y 18B) . Como se esperaba, todos los clones se ligaron a hVEGFi65.

Para estudiar la extensión de aglomeración de proteínas, clones seleccionados se analizaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) seguida por un Análisis de Dispersión de Luz (LS) como Fab e IgG purificados. Las muestras fueron probadas en PBS a una concentración de 0.5 mg/ml (hlgG) y 1 mg/ml (Fab) . Un máximo de 5% de aglomeración se observó para todas las muestras a la concentración dada (figura 17) , la cual está dentro del rango de lo que se había observado previamente para otros anticuerpos derivados de exhibición de fagos. Los clones 3-6 y 3-7 no salieron en el punto del tiempo esperado, lo cual sugiere que tales IgG y Fab reformados exhiben aglomeración e interacción no específica con la resina (datos no mostrados) . Estos clones fueron scados del conjunto de clones que fueron sometidos a análisis adicional.

Para descartar la reactividad cruzada y ligadura no específica, se estudió ligadura de hlgG seleccionada a alta concentración (100 nM) a un panel de objetiovs de proeteína inmovilizados incluyendo lisados de células enteras, los antígenos afines, y homólogos en un ensayo ELISA estándar. Además del antígeno, se inmovilizaron una versión murina de hVEGF para probar la reactividad entre especies de los clones anti-hVEGF. En particular, el panel de proteínas fue inmovilizado en placas Maxisorp y bloqueado con BSA al 1% en PBS durante 1 hora. Las hlgGs (o Fabs) fueron diluidas en PBST a una concentración de 100 o 500 nM y trasladadas a las placas revestidas. Después de una incubación de 1 hora, se lavaron las placas y se incubaron con proteína A conjugada a HRP. Las señales de ligadura fueron desarrolladas por adición de substrato TMB durante aproximadamente 5 minutos, ahogadas con H3P04 1 M, y leídas espectrofotométricamente a A450. Las hlgGs probadas se ligaron específicamente a su antígeno(s) . Los clones bHl y 3-1 exhibieron reactividad cruzada a VEGF murino (mVEGF) (figura 19} .

Para probar si los anticuerpos bi -específicos bHl, H3 (anti-hVEGF/Her2), y DI (anti-hDR5/Her2 ) podían ligarse simultáneamente con sus antígenos afines o si los antígenos competían para ligadura a anticuerpo, hVEGF y hDR5 se inmovilizaron a una concentración de 2 g/ml. Una concentración fija de hlgG fue incubada con diluciones en serie de Her2-ECD seguida por la captura de hlgG sobre el antígeno inmovilizado. En cada caso, ligadura de Her2-ECD con los otros antígenos se encontró competitiva (figura 20) .

Para determinar con certeza la afinidad de igGs y Fabs (es decir., anti-hVEGF y anti-hVEGF/Her2 Fab e IgG aislados de las bibliotecas) y para estudiar los perfiles de ligadura en tiempo real, se usaron ensayos de resonancia de plasmón superficial (SPR) en una máquina BIAcore-3000 (BIAcore, Uppsala, Suecia) con circuitos de sensor inmovilizados de hVEGF, mVEGF, DR5 , y Her2-ECD CM5 a unidades de respuesta (RU) de 40-300 dependiendo del analito estudiado. La inmovilización se llevó a cabo como está descrito (Chen et al., 1999) . En estos casos para minimizar los efectos de avidez de los analitos IgG bivalentes, una menor densidad de ligando fue apuntada sobre el circuito de sensor. Muestras de concentraciones en incremento variando de una concentración aproximadamente 10 veces por debajo a 10 veces por encima de la KD estimada (con base en los experimentos ELISA de competencia) fueron inyectados a 22-30 µ? /minuto, y las respuestas de ligadura fueron correjidas mediante la substracción de RU a partir de un flujo de células de referencia. Además, las respuestas fueron doblemente referenciadas para normalizar por deriva del instrumento mediante restar RU del flujo de célulcas conjugadas a ligando inyectadas con regulador de muestra (PBS con Tween 20 al 0.05%) . Para análisis de cinética de los Fabs, un modelo de ligadura de Langmuir 1:1 se utilizó para calcular el kon y k Cuando fue necesario (a altas concentraciones de analitos) un modelo de ligadura Langmuir 1:1 con limitaciones de transferencia de masa se aplicó. Para los analitos de IgG, un modelo de ligadura bivalente de analito con o sin limitación de transferencia de masa se usó (BIAcore Evaluation Software 3.2) . En el caso de H3 hlgG, H4_N Fab, y H4_D hlgG, el aj uste de respuestas a los modelos ligadura cinéticos no fue satisfactorio. Por lo tanto, el análisis de ligadura de estado estable se aplicó donde la respuesta de equilibrio fue trazada contra la concentración del analito. La KD se estimó como la EC50. Un resumen del análisis de ligadura BIAcore se puede encontrar en la figura 21. La afinidad de los anticuerpos de ligadura a hVEGF 3-1, 3-6 y 3-7 se encontró estando en el rango nanomolar. Los anticuerpos bi -específicos analizados (bHl, H3 , H4_N, H4_D) mostraron afinidades micromolares bajas a micromolar para hVEGF. En contraste, las afinidades para Her2 variaron de 8-59 nM (Fab) .

Para determinar si la cadena ligera de enlazadores anti-hVEGF bHl, H3, y H4_N se puede ligar a hVEGF independiente de la secuencia de la cadena pesada asociada, los dominios variables de cadena ligera fueron injertados sobre el anti-Her2 2C4 Fab mediante la clonación de los dominios variables de cadena ligera en un vector de expresión de 2C4 Fab, pJB0524, por lo tanto reemplazando al dominio variable de cadena ligera 2C4. Los Fabs fuerron expresados como se describió con anterioridad. Los Fabs quiméricos bHl/2C4 y H3/2C4 no se expresaron en niveles detectables. La proteína Fab quimérica H4_N/2C4 fue aislada y probada para ligadura a hVEGF (especificidad original bHl) y Her2 (bHl, especificidad original 2C4) . No se detectó ligadura a hVEGF y Her2 por un ensayo de ligadura ELISA estándar (figura 22) . Los resultados indican que la cadena pesada de bHl se requiere para ligadura a antígeno.

Comparación de epítopos anti-hVEGF En un intento de mostrar en mapa rígidamente los epítopos de los anticuerpos anti-hVEGF sobre hVEGF, se estudió la habilidad de estos anticuerpos anti-VEGF recién aislados para competir con otros anticuerpos de ligadura a hVEGF y receptores de VEGF con sitios de ligadura conocidos (Fuh et al., 2006; Muller et al., 1998; Wiesmann et al., 1997) . Los ensayos fueron hechos en un formato ELISA competitivo en donde el Dominio 1-3 de VEGFRl (Flt) y anticuerpos anti-hVEGF Avastin (IgG) , B20-4.1 (IgG) , G6 (Fab) , y proteína de fusión Fe de Dominio 1-7 de KDR se inmovilizaron sobre inmuno-placas Maxisorp a 2 El ensayo de ligadura de competencia en solución usó VEGF biotinilado con diluciones en serie de proteínas IgG purificadas, y biotina-VEGF no ligada se capturó con HRP conjugada a estreptavidina (Lee et al., J. Mol. Biol . 340:1073, 2004) . Anticuerpos que bloquearon hVEGF de ligarse a otros anticuerpos de ligadura a hVEGF o receptores de hVEGF son probales a compartir epítopos superpuestos. Altas concentraciones (µ?) del anticuerpo de ligdura a hVEGF/Her2 bi-específico, bHl , permitió bloqueo completo de hVEGF ligándose a sus receptores, VEGFRl y VEGFR2 , lo que sugiere que el epítopo bHl se traslapa suficientemente con VEGFRl (figura 23) y VEGFR2 (figura 23) . Además, bHl bloquea ligadura de hVEGF a B20-4.1 (figura 24) . H3 , H4_N, y H4_D también bloquean ligadura de hVEGF a ambos receptores, lo cual apunta a epítopos similares a bHl (figura 23) . Los perfiles de bloqueo incompletos son probablemente una consecuencia de su relativamente baja afinidad para hVEGF (figura 21) . Por el contrario, 3-1, no bloquea hVEGF de ligadura a VEGFRl, aún a la concentración más alta (0.5 µ?) (figura 23) . AdicionaIntente , no se pudo detectar bloqueo a 3-1 hlgG del anticuerpo Avastin (figura 25) . Sin embargo, 3-1 hlgG bloquea ligadura de hVEGF a VEGFR2 (KDR) (figura 23) así como a B20-4.1 (figura 24) . Estos resultados indican que 3-1- posee un epitopo único en comparación con los otros anticuerpos.

Ejemplo 4. Estudios de la Estructura-Función del anticuerpo bi-específico anti-hVEGF/Her2 , bHl Para determinar la naturaleza de la interacción de bHl con sus dos antígenos, VEGF y HER2 , se llevaron a cabo estudios estructurales y funcionales. El anticuerpo Herceptin y bHl difieren en CDR-L1 (V29NTA32 vs . I29PRSISGY32 ; SEQ ID NOS: 35 y 36) y CDR-L2 (S50ASF53 vs . W50GSY53 ; SEQ ID NOS:37 y 38). El anti-VEGF/Her2 bHl fue escogido como representativa para caracterización estructural con base en su naturaleza específica dual y su relative alta afinidad para VEGF y Her2. A fin de estudiar los epítopos funcionales y estructurales sobre VEGF y Her2, se cristalizó bHl Fab en complejo con VEGF109 y el dominio extra-celular de hHer2 y se resolvieron las estructuras de los dos complejos mediante cristalografía de rayos X. Adicionalmente , se llevaron a cabo análisis de exploración de escopeta de la alanina y homólogos usando bibliotecas de combinaciones exhibidas en fagos como se describió (Vajdos et al., 2002) .

Expresión, Purificación, Cristalización y Colección de Datos de bHl Fab La porción de ligadura a receptor de VEGF humano, consistiendo de los residuos 8-109, se expresó, volvió a plegar y purificó como fue descrito con anterioridad, (Christinger et al., 1996) . Los residuos 1-624 del dominio extra-celular de Her2 fueron expresados y purificados como se describió previamente (Franklin et al., 2004; Hudziak y Ullrich, 1991).

Para preparación de bHl Fab de gran escala, toda la pelotilla celular fue obtenida a partir de una fermentación de E. coli de diez litros. 220 gramos de pasta celular se descongelaron en 1 L de PBS, EDTA 25 mM, PMSF lmM . La mezcla fue homogenizada y luego pasada dos veces a través de un micro- fluidizador . La suspensión fue entonces centrifugada a 12k en alícuotas de 250 mi por 90 minutos. La proteína fue entonces cargada sobre una columna de Proteina G (25 mi) equilibrada con PBS a 5 ml/minuto. La columna fue lavada con un regulador de equilibrio y luego eluída con ácido acético al 0.58%. Las fracciones fueron ensayadas por SDS PAGE (datos no mostrados) . Fracciones conteniendo bHl Fab fueron conjuntadas y luego cargadas sobre una columna de Sefarosa SP de intercambio de cationes de 50 mi (Pharmacia) equilibrada con MES 20 mM pH 5.5. El Fab fue eluído con gradiente de cloruro de sodio en el regulador de equilibrio. El gradiente fue lineal a NaCl 0.5 M, MES 20 mM pH 5.5. Fracciones que contienen al Fab fueron identificadas mediante SDS-PAGE (datos no mostrados), y conjuntadas. Los bHl Fab fueron eluídos a una concentración de NaCl de aproximadamente 0.5 M. La concentración de Fab fue determinada mediante medir la A28o- El rendimiento final de bHl Fab fue de 67 mg/1 de crecimiento del fermentador .

Complejos fueron obtenidos mediante me2clar el bHl Fab purificado y VEGF o Her2 ECD en una proporción molar de 2:1 y purificados mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SP-200, Pharmacia) en Tris-HCl 25 mM, pH 7.5 y de cloruro de sodio 0.3 M para complejo VEGF-Fab y con Tris-HCl 25 mM, pH 8 y cloruro de sodio 0.15 M para el complejo Her2 ECD-Fab. La composición de los complejos resultantes fue verificada por SDS PAGE (datos no mostrados) . El complejo de proteína fue concentrado y usado en pruebas de cristalización. Experimentos iniciales de gota pendiente usando el método de difusión de vapor a 19°C resultaron en pequeños cristales isomorfos de 14 diferentes condiciones dentro de 1 semana en el caso del complejo bHl-VEGF. Los cristales del complejo bHl-Her2 aparecieron en 4 condiciones dentro de una semana. Los cristales de una condición fueron escogidos para una optimización adicional en cada caso.

Para cristalización de bHl Fab-VEGF (8-109) , volúmenes iguales desolución de complejo de proteína (10.6 mg/ml proteina, NaCl 300 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7.5) y regulador de cristalización que contiene ácido málico D, L 0.15 M, pH 7.0, PEG3350 al 20% se mezclaron y equilibraron a 19°C. Cristales grandes aparecieron después de 24 horas, los cuales pertenecían al grupo de espacio C222i con dimensiones celulares de a=100.6, b=198.0, c=77.7. Las formas de cristal contenían en la unidad asimétirca 1 monómero de Fab y 1 monómero de VEGF. Antes de coleccionar los datos, los cristales fueron protegidos criogénicamente mediante la transferencia entre gotas que contienen 5%, 10%, y 15% de glicerol en un licor madre artificial, seguido por una congelación por destello en nitrógeno líquido. Datos fueron recolectados a 2.6 Á en la línea de haz 5.0.1 de la Fuente Avanzada de Luz (Berkeley) .

Cristales de bHl Fab-Her2 ( 1- 624 ) se obtuvieron mediante mezclar solución de proteína (11 mg/ml, Tris 25 mM, pH 8 y cloruro de sodio 150 mM) con regulador de cristalización que contiene PEG2000 al 25% p/v, MES 0.1 M, pH 6.5. Cristales pertenecientes al grupo de espacio P2i2i2i aparecieron después de 12 horas con dimensiones celulares de a=62.3, b=115.1, c=208.2. Los cristales contuvieron un complejo Her2-Fab en la unidad asimétrica. Antes de la colección de datos los cristales fueron congelados por destello en nitrógeno líquido con un Etileno Glicol al 20% como un crio-protector. Los datos fueron coleccionados a 2.9 Á en la linea de haz 5.0.1 de la Fuente Avanzada de Luz (Berkeley) .

Procesamiento de Datos, Determinación de Estructura, y Refinamiento Los datos fueron procesados usando Denzo y Scalepack (Otwinowski, 1997) . Las estructuras de los complejos de bHl Fab se resolvieron por Phaser (L. C. Storoni, 2004; Read, 2001) . El complejo bHl-Fab-VEGF (8-109) fue resuelto usando las coordenadas de VEGF a partir de un complejo VEGF-Fab previamente descrito (2FJG) y fragmentos Fab conteniendo ya sea los dominios variables VL/VH O los dominios constantes CHi/CL del complejo Fab de anticuerpo de Herceptin-Her2 (1N8Z) . Fragmentos de Her2 y el dominio variable del Fab de anticuerpo Herceptin a partir del complejo Her2-Fab 1N8Z fueron usados como modelos de búsqueda cuando resolvía la estructura de bHl-Her2. El dominio constante del bHl Fab no se pudo encontrar usando la porción constante del Fab de anticuerpo Herceptin como un modelo de búsqueda (1N8Z) y tuvo que ser archivado manualmente guiado por la estructura de complejo Fab de anticuerpo Herceptin-Her2. Construcción y refinamiento de modelo se llevaron a cabo usando los programas Refmac (Collaborative Computational Project, 1994) y Coot (Emsley y Cowtan, 2004), respectivamente. Los parámetros estereoquímicos fueron analizados usando MolProbity (Lovell et al., Proteins 50:437 (2003)). Las estructuras se refinaron a Rvaiue=0.22 y Rfree=0.27 para el complejo Fab-VEGF y Rvaiue=0.25 y Rfree=0.31 para el complejo Fab-Her2. Se modeló una estructura de cristal de bHl Fab en complejo con VEGF así como Her2 -ECD . Algunos de los residuos de bHl Fab estuvieron dentro de 4.5, 4.0, y 3.5 Á de los antígenos. Los dos paratopos (el área sobre el anticuerpo que hace contacto con el antígeno) para los dos antígenos sobre el mismo anticuerpo se traslapan significativamente y residuos a partir de ambas cadena ligera y cadena pesada están involucrados con la ligadura con ambos antígenos. bHl se liga a un epítopo similar sobre VEGF como el anticuerpo Avastin, y bHl se liga a Her2 sobre un epítopo esencialmente idéntico como el anticuerpo Herceptin .

Las estrucutras de cristal de bHl Fab ligado al dominio extra-celular (ECD) de HER2 (residuos 1-624) y al dominio de ligadura de receptor de VEGF (residuos 8-109) fueron determinadas a resoluciones de 2.9 Á y 2.6 Á, respectivamente (figura 26 y Tabla 3) . La figura 26 muestra la estructura de cristal de bHl Fab/HER2 superpuesta con el complejo anticuerpo Herceptin/HER2 , y la estructura de cristal del complejo bHl Fab/VEGF.

El complejo bHl/HER2 , el Fab se liga al dominio IV de HER2 en una manera similar al anticuerpo Herceptin (Cho et al., Nature 421:756, 2003); los dos complejos superpuestos con una desviación raíz cuadrática media (r.m.s.d.) de posiciones Ca de 2.3 Á. En el complejo VEGF, bHl reconoció un epítopo que se sobrepone con los sitios de ligadura de los receptores de VEGF, VEGFR1 y VEGFR2 , y de otros anticuerpos de VEGF (Wiesmann et al., Cell 91:695, 1997; Muller et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 94:7192, 1997) . Consistentemente, se observó el bloqueo de bHl para ligadura de VEGF con sus receptores (figura 27) . Para los datos mostrados en la figura 27, la VEGFi65 biotinilatada humana fue equilibrada con conentraciones incrementadas de IgG (eje x) . El hVEGFi65 no ligado fue capturado sobre fusión de^ Fe VEGFR2-ECD inmovilizado y detectado espectrofotométricamente (densidad óptica a 450 nm, eje y) · Como es mostrado en la figura 28, los sitios de ligadura para VEGF y HER2 sobre bHl se sobreponen extensivamente. Doce de los catorce residuos vinculan HER2 también hacen contacto con VEGF. Ambos sitios de ligadura incluyen residuos de CDR a partir de la CP así como de la CL. En el complejo de HER2 , las CDRs de CL y CP contribuyen a un área de contacto con el antígeno aproximadamente igual (53% y 47% respectivamente) mientras que en el complejo de VEGF, las CDRs de CL constituyen cerca del 70% de la superficie sepultada (figura 29) . Los sitios de ligadura de HER2 sobre el anticuerpo Herceptin y bHl son similares, y difieren solo en las regiones CDR-L1 y -L2 en donde la secuencia del anticuerpo Herceptin no se conservó en bHl (figura 28) . En la figura 28, los residuos sobre bHl o la superficie de Fab del anticuerpo Herceptin están sombreados de acuerdo con la extensión sepultada por VEGF o HER2 (sombreado oscuro u con letras blancas >75% sepultado, sombreado intermedio y letras blancas 50-75% sepultado, sombreado claro y letras negras 25-49% sepultado) . Los residuos subrayados difieren entre bHl y el anticuerpo Herceptin. La línea blanca punteada muestra la división de cadenas ligera y pesada.

Tabla 3. Estudios Cristalográficos Complejo bHl Tab/UVEGF Complejo bHl Fab/HER2-ECD . Estadística de Datos de Colección Grupa espacial C222, P2I Í2I Unidad Celular(A) a=I00.6, b=198.0, c=77.7 a=62.3, b=115.1, c=208.2 Linea de luz, longitud de onda AIS 5.0.1 ALS 5.0.1 Resolución (A) 50.0-2.6 50.0-2.9 Rsym' 0.090 (0.66) 0.095 (0.66) Número de Observaciones 151689 192951 Refleccioues únicas 24705 34149 Comnletado (Yo) * 99.8 (100) 100 (100) ; I c (1 )' 16.0 (3.0) 18.5 (2.6) Estadísticas de Refinamiento Contenido de Unidad asimétrica 1/2 VEGF dimero 1 Fab 1 Her2-ECD mono mero 1 Fab Resolución (A) 30.0-2.6 30.0-2.9 Reflexión usada 22977 32277 R Factor", Rlibre 0.19, 0.25 0.22, 0.28 Enlaces de Desviación RMS (A) 0.011 0.010 Angulos de Desviación RMS ) 1.3 1.3 Estadísticas Ramachandran Regiones R eferidas (%) 96.5% 89.9% Regiones Permitidas (%) 99.4% 97.9% Valores Extremos ( ) 0.6% 2.1% Niünero de Residuos 528 1017 Niüneto de Aguas 49 0 Número de Azúcares 0 2 Numero de Ligaiidos/montones 1 (Glicerol) 1 (MES) Rsyma=? I-<I> ?I. <I> es el promedio de intensidad de la simetría relacionada a obervaciones de una reflexión única.

R Factorb= ? FO-Fc ?I FO . Rlibre es calculado como R excepto para 5% las reflexiones excluidas de todos los refinamientos.

* Valores entre paréntesis denota valores de la más alta resolución .

La conformación de bHl Fab en complejo con HER2 fue marcadamente similar a la del Fab ligado a VEGF (r.m.s.d.= 0.7Á, Co¡) . Las CDRs de ambas estructuras de bHl Fab se superponen bien entre sí y con el Fv de anticuerpo Herceptin progenitor y bHl Fv (HER2) r.m.s.d.= 0.6Á, el Fv de anticuerpo Herceptin y bHl Fv (VEGF) r.m.s.d.= 1 . 2Á . La CDR-L1 es una excepción y difiere significativamente en las dos estructuras de complejo; la desviación es 4.6 Á (C de residuos 27-32). La figura 30 muestra que las conformaciones de CDR bHl Fab ligado a VEGF son marcadamente similares a bHl ligada a HER2 y al anticuerpo Herceptin, con excepción de la CDR-L1. La figura 30 es una superposición de los bucles de CDR como tubos bHl ligado a VEGF (sombreado oscuro) , bHl ligado a HER2 (blanco) y anticuerpo Herceptin ligado a HER2 (sombreado claro) . El bucle de CDR-L1 exhibió conformaciones significativamente diferentes en las dos estructuras de^ bHl (r . m . s . d . Ca=4.6 para bHl residuos 27-32) (figura 31) . En el complejo de HER2 , la CDR-L1 se involucra mínimamente en la interacción del antígeno y parte del bucle (residuos 28-30b) aparecen flexibles. Para ligadura a VEGF, el bucle entera está bien estructurada y contribuye a 26% del área superficial sepultada por VEGF.

Dos residuos en CDR-L1, Ile30c y Tyr32, tienen conformaciones diferentes y juegan roles distintos en ligadura de bHl a HER2 o VEGF. En el complejo de HER2 , la cadena secundaria de Ile30c está enterrada en el núcleo hidrófobo formado por los residuos de CDR-L1 y CDR-L3. En el complejo de VEGF, la cadena secundaria forma contactos hidrófobos con VEGF. El Ca de Tyr32 está en la misma posición en las dos estructuras, pero la cadena secundaria está girada -130 grados. En el complejo de HER2 , Tyr32 está empacado contra del receptor, mientras que en el complejo de VEGF la cadena secundaria, junto con Ile29, forma el núcleo hidrófobo y soporta la conformación de CDR-L1 y CDR-L3. La conformación de CDR-L1 es posteriormente estabilizada mediante enlaces de hidrógeno entre Tyr32 y el residuo de esqueleto de CL Gly72. El análisis structural confirma que Tyr32 es crítico para ligadura a VEGF ya que mutaciones a ya sea alanina o fenilalamina no se toleran. Contrario a la ligadura a VEGF, mutación de Tyr32 a alanina (de regreso al residuo del anticuerpo Herceptin) se prefiere para ligadura a HER2. La superposición de los dos complejos revela que VEGF chocaría con Tyr32 de CDR-L1 en su estado ligado a HER2 (figura 31) . En la figura 31 las cadenas secundarias de residuos Tyr32, Ile30c, Ile29, y Gly72 se encuentran mostrados como barras . Se muestran en un sombreado más oscuro los residuos con factores de temperatura más altos que el promedio (residuos 28-30b) . El enlace de hidrógeno entre Tyr32 y Gly72 es ilustrado mediante una línea punteada.

Los resultados anteriores indican que la capacidad de reacomodar CDR-L1 es necesaria para la bi-especif icidad de bHl . Se ha mostrado que flexibilidad conformacional similar de CDR-L1 juega un rol en el reconocimiento del antígeno de anticuerpos naturales .(Jiménez et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 100:92, 2003; Mylvaganam et al., J. Mol. Biol. 281:301, 1998) . Las figuras 26, 28, 30, 31, y 32 son generadas a partir de las coordenadas de estructura cristal (códigos PDB, 3BDY, 3BE1, 1N8Z) usando PYMOL (DeLano Scientfic, San Carlos, CA) .

Exploración de Secuenciación Aleatoria de bHl Para estudiar los sitios de ligadura a antígeno con bHl Fab, se llevó a cabo mutagénesis de combinación de exploración de secuenciación aleatoria usando bibliotecas de Fab exhibidas en fagos (Vajdos et al., J. Mol. Biol . 320:415, 2002; Weiss et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:8950, 2000) . Las selecciones de ligadura sobre los antígenos (hVEGF y Her2-ECD) para aislar clones funcionales, seguido por secuenciación del ADN permitió los cálculos de las relaciones de tipo silvestre/mutante en cada posición variada (Vajdos et al., 2002) . Estas proporciones fueron entonces usadas para determinar la contribución de cada cadena secundaria explorada para ligadura a VEGF y Her2. Los resultados permitieron mostrar en mapa el paratopo funcional para ligadura a VEGF y Her2.

Diseño de biblioteca de Secuenciación Aleatoria de bHl Los residuos expuestos a solventes en las CDRs fueron explorados usando bibliotecass exhibidas en fago en las cuales los residuos de tipo silvestre eran permitidos a variar como ya sea alanina o tipo silvestre (Exploración de Alanina) o como un residuo homólogo o de tipo silvestre (Exploración de Homólogo) . La naturaleza del código genético requirió que algunas otra substituciones fueran incluidas en la biblioteca además de residuos Wt/Alanina o Wt/Homólogos (figura 33) . Se construyeron bibliotecas separadas de exploración de alanina y homólogos de cadena pesada y cadena ligera. Las bibliotecass descritas están descritas en la figura 34. La degeneración varió de 1.3xl05 a 1.3xl08 y el tamaño de biblioteca actual de 6xl09 a 4xl010.

Construcción de bibliotecas de exploración de secuenciación aleatoria Como es notado anteriormente, para permitir la exhibición de bHl Fab sobre la superficie del bacteriófago M13( un plásmido AP2009 previamente descrito, diseñado para exhibir hu4D5Fab sobre fago fusionado al dominio terminal C de la proteína de recubrimiento menor de gen 3 M13 , fue modificado para codificar bHIFab usando técnicas estándar de biología molecular. La terminal C de la cadena ligera contuvo un epitopo (gD) tag. Se usaron como plantillas de biblioteca, versiones de "plantilla de paro" del bHl Fab (Sidhu et al., 2004) . La biblioteca de exploración de alanina y homólogos de cadena ligera tuvieron codones de paro en CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, y las bibliotecas de alanina y homólogos de cadena pesada contuvieron codones de paro en cada CDR de cadena pesada. Las bibliotecass fueron construidas por métodos previamente descritos (Sidhu et al., 2004) usando mutagénesis de Kunkel (Kunkel et al., 1987) sobre las plantillas de paro respectivas.

Selección de bibliotecas Las inmuno-placas NU C Maxisorp de 96 pozos fueron recubiertas con 5 ug/ml del objetivo de captura (hVEGF109, Her2-ECD or anti-gD mlgG) y se bloquearon con BSA al 1% (p/v) en PBS . El fago a partir de las bibliotecass anteriormente descritas fueron propagados con un fago auxiliar K07 (NEB) como se describe (Lee et al., 2004a) . Las soluciones de fago de biblioteca fueron añadiadas a las places recubiertas a una concentración de 1013 partículas de fago/ml y se incubaron por 1-2 horas a RT. Las placas fueron lavadas 8 veces con PBST y seguidas por elución de un fago ligado con HCl 0.1 M por 30 minutos. Se determina el enriquecimiento después de cada ronda de selección como se describió anteriormente. Después de 2 rondas de selección de objetivo, se observó enriquecimiento de 50-1,000 veces para todas las bibliotecas excepto para CL-Ala y CL-Hom clasificadas sobre hVEGF, que mostraron 5-10 veces de enriquecimiento. Un número de clones al azar de cada biblioteca que exhibían 50-1,000 veces de enriquecimiento fueron seleccionadas como se describió (Sidhu et al., 2004). La biblioteca de CL-Ala fue explorada para ligadura a hVEGF en ELISA de fago (Sidhu et al., 2000). Los clones que exhibieron señales de ELISA de hVEGF de por lo menos dos veces sobre señales en placas de control recubiertas con BSA fueron seleccionadas para la secuenciación . La biblioteca de CL-Hom fue sometida a 1 ronda adicional de selección sobre hVEGF seguido por exploración de ELISA de fago y secuenciación de clones de ligdura a VEGF .

Análisis de la secuencia de ADN Las secuencias de alta calidad a partir de cada biblioteca de las diferentes selecciones de objetivo fueron traducidas y alineadas (datos no mostrados) . El número de secuencias a partir de cada biblioteca sometida a análisis se resumen en la Tabla 4 siguiente .

Tabla 4. Número de Secuencias Analizadas Las tasas Wt/Mut fueron calculadas en cada posición variada (figura 35 y figura 36) permitiendo asi el cálculo de los valores Fwt/mut como fueron listados (figura 35 y figura 36) que son corregidos para exhibición por división de las tasas de la selección de objetivo por aquellos de la selección exhibida como se describió (Vajdos et al., 2002) . Un valor Fwt/mut mayor que 1 indica que Wt es preferible en esta posición y un Fwt/mut menor que 1 indica que la mutación es preferida. Fwt/mut >5 indica su rol importante en ligadura de antígeno. La importancia de cada residuo de CDR explorado se ilustra en las figuras 37A-37D. El resultado demuestra que residuos de tanto la cadena pesada y la cadena ligera contribuyen energéticamente a la ligadura de ambos antígenos (Her2 y hVEGF) . El impacto de los residuos de cadena ligera y de cadena pesada de bHl sobre ligadura a Her2 fue comparado con el de su anticuerpo progenitor hu4D5 (Kelley y O'Connell, 1993) (figura 38) .

La figura 39A y la figura 39B muestran exploración de alanina y de homólogos de secuenciación aleatoria de bHl Fab para el ligadura a VEGF y HER2. Los efectos de la mutación de alanina (mi) , o mutaciones adicionales (m2, m3 ; debido a las limitaciones de codones de alanina de secuenciación aleatoria) , o a un aminoácido homólogo (m4) fueron calculados como la relación de ocurrencia de tipo silvestre y mutantes (wt/mut) entre los clones ligándose a VEGF humano (figura 39A) o HER2 (figura 39B) . En los casos en donde solo aparecieron residuos del tipo silvestre, las relaciones son mostradas como mayores que ">" el conteo de tipo silvestre. La identidad de las substituciones de aminoácidos (ml-m4) se muestra como superíndices en los valores F. Cuando el residuo de tipo silvestre es alanina, se sustituyó por glicina (mi) . El "*" indica la extensión de los residuos bHl que están enterrados después de la formación del complejo VEGF o HER2 (*25-49% de área accesible enterrada, **50-75% de área accesible enterrada, ***mayor que o igual a 75% de área accesible enterrada) .

Los residuos que contribuyen significativamente a las interacciones energéticas constituyen los paratopos funcionales, los cuales constituyen un sub-conjunto de los sitios de ligadura estructurales . En contraste al traslape extenso entre los sitios de contacto de antígeno, los dos paratopos funcionales muestran traslape limitado (figuras 32 y 40) . En particular, con base en la mutagenesis de exploración de secuenciación aleatoria, los valores ??T (eje y, kcal/mol) son trazados para cada mutación a alanina (barra negra) o un aminoácido homólogo (barra blanca) para ligadura a VEGF (figura 40A) o HER2 (figura 40B) . La " representa un límite inferior, pues mutaciones no fueron observadas en esta posición. El "*" indica la extensión de área de superficie del residuo bHl enterrado después de la formación del complejo de VEGF o HER2. (*25-49% enterrado, **50-75%, ***>75%) . La interacción de ligadura a VEGF es mediada primordialmente por las CDRs de CL con Tyr32 de CDR-Ll e His91 de CDR-L3 como el punto caliente núcleo (AAGwt/aia >1.5 kcal/mol) . Ligadura a HER2 está contribuida primordialmente por CDRs de CP. La figura 32 muestra estructuras de cristal en donde los residuos de bHl y anticuerpo Herceptin están sombreados sobre la superficie de Fab en base a su importancia funcional (sombreado negro y letras blancas, AAG = 1.5 kcal/mol; sombreado intermedio y letras negras, 1 =¦ AAG <1.5 kcal/mol; sombreado claro y letras negras, 0.5 = ???<1 kcal/mol de mutación de alanina) . La línea negras punteada muestra el área de contacto como en la figura 28. La línea punteada blanca muestra la división de cadenas ligera y pesada .

Para ligadura a VEGF y ligadura a HER2 , los residuos de paratopo funcionales son distribuidos a través de CP y CL significando la sinergia de las dos cadenas. Trp95 de CDR-H3 is el único punto caliente común del residuo par alas dos interacciones (AñGwt/aia>l · 5 kcal/mol) . Como es mostrado anteriormente, la interacción de ligadura a VEGF es mediada primordialmente por las CDRs de CL mientras que ligadura a HER2 es dominada por CDRs de CP. Comparado al anticuerpo Herceptin, el bHl con afinidad de ligadura a HER2 más débil (300 veces) mantiene los mismos puntos calientes núcleo para ligadura a HER2 (Arg50, Trp95, y TyrlOOa) mientras que la importancia de los residuos periféricos es re-distribuida (figura 32) . En conjunto, la mayoría de las cadenas secundariass en la cadena pesada contribuyendo a ligadura a hu4D5/Her2 aún son importantes para ligadura a bHl/Her2 (??T>1.5 kcal/mol) . Hay algunos cambios. Residuos de cadena ligera tienen más re-acomodo en contribuciones - algunos residuos se volvieron menos importantes y algunos mas importantes. En conjunto, los sitios funcionales son parte de la interface estructural de la estructura cristal de los complejos bHl -VEGF y bHl-Her2.

En resumen, la interacción de bHl con dos proteínas grandes estructuralmente no relacionadas es caracterizada por la vinculación de un conjunto distinto de residuos de bHl en la interacción energética con cada antigeno. Mientras que la mayoría de los dos sitios de ligadura traslapados extensamente para los dos antígenos diferentes exhiben una conformación única, la flexibilidad de uno de los bucles de CDR (Ll) facilita el acomodo de tanto HER2 y VEGF. El mecanismo es reminiscente de la versatilidad molecular observada en anticuerpos multi-específicos ligándose a haptenos o péptidos menores no relacionados. Estudios previos describen multi-especificidad mediada ya sea por posicionamiento diferencial de los ligandos pequeños en regiones espacialmente distintas de una conformación de un solo anticuerpo (Sethi et al., Immunity 24:429, 2006) o por conformaciones múltiples pre-existentes del sitios de ligadura a antígeno (James et al., Science 299:1362, 2003). La versatilidad de las moléculas de anticuerpo en el reconocimiento de antigeno es posteriormente resaltada por cómo las mutaciones limitadas de CL pueden dar lugar a anticuerpos que se ligan a dos antígenos de proteína no relacionados.

Maturación de afinidad de bHl En un intento por investigar si la afinidad de ligadura a VEGF de bHl podría incrementarse mediante la optimización de la secuencia de cadena ligera antes de que los resultados estructurales y funcionales estén disponibles, se construyó una biblioteca en donde los residuos de CDR en posiciones altamente accesibles a solvente con base en la estructura de cristal de h4D542 Fab (Eigenbrot et al., 2001), la cual se asume que se asemeja cercanamente a bHl Fab, se diversificaron. Se permitió a los residuos objetivo variar a ya sea residuos del tipo silvestre o a unos cuantos homólogos (figura 34) . La biblioteca se construyó como se describe en la sección "Construcción de bibliotecas de exploración de secuenciación aleatoria." Se usó un método de selección a base de solución para seleccionar para ligadores a VEGF de mayor afinidad como se describe. Se llevaron a cabo dos rondas de selección a base de solución. El rigor fue incrementdo en cada ronda de selección mediante la disminución de la concentración de VEGF biotinilatado desde 50 n en la primera ronda a 20 nM en la segunda ronda. En la última ronda de selección se secuenciaron 138 clones. La mayoría de los clones fue encontrada de ser únicos. Se usó un ensayo ELISA de alto rendimiento con VEGF (8-109) inmovilizado, anticuerpo anti-gD, y Her2 -ECD para determiner los clones que enlazan a VEGF, Her2-ECD, y anti-gD mlgG pero no a BSA. Las señales de ligadura a VEGF-ELISA fueron normalizadas por las señales ELISA anti-gD para estimar la afinidad relativa de los clones de ligadura a VEGF. Se seleccionaron los clones con altas relaciones de VEGF/anti-gD para caracterización adicional. La afinidad de los clones seleccionados para VEGF y Her2 se estimó mediante ELISA de competencia como Fab exhibidos en fago como se indicó previamente. Los variantes de bHl mostraron una afinidad de ligadura a VEGF mejorada en comparación al clon parenteral bHl. Interesantemente, algunos clones tienen valores de IC50 ligeramente mejorados para ligadura a Her aunque esa selección a base de afinidad para Her2 no se llevó a cabo. Esto muestra que es possible de madurar en afinidad al clon de bHl para ligadura a VEGF sin afectar significativamente la habilidad de ligadura a Her2. Hay algunos clones mejorados en afinidad para VEGF que mostraron afinidad de ligadura a Her2 reducida en comparación con el clon progenitor de bHl. Este resultado indica que la cadena ligera contribuye activamente a la habilidad de ligadura de bHl a Her2 a pesar del hecho de que la cadena pesada es el principal contribuyente a la energía de ligadura con base en la estructura del complejo bHl-Her2 y el análisis de exploración de alanina de secuenciación aleatoria. Las secuencias y los valores IC50 de los clones caracterizados son resumidos en la figura 41. El descubrimiento de que la mayoría de las secuencias fueron únicas, sugiere que las secuencias de cadena ligera de estos variantes no ha sido completamente optimizada para ligadura a VEGF y que es posible mejorar en afinidad adicionalmente al clon bHl mediante rondas adicionales de selección.

Como es mostrado en la Tabla 5, es posible y generalente aplicable, el mejoramiento de la afinidad de un Fab único para dos antígenos. Por ejemplo, la KD para VEGF humano fue incrementado desde 250 (bHl; IgG) a 41 (bHl-81; IgG) o 16 nM (bHl -44; IgG) y el KD para HER2 fue aumentado desde 21 (bHl; IgG) a 7 (bHl-81; IgG) o 1 nM (bHl-44; IgG).

La afinidad fue mejorada mediante introducir mutaciones en las CDRs de CL y CP de bHl. Las posiciones fueron seleccionadas basadas en la información acerca de los paratopos funcionales para VEGF y HER2 en la presente descritos. Los variantes de bHl fueron aislados en dos pasos mediante la selección y clasificación de bibliotecas de exhibición en fago, como se describe en la presente. El clon bhl-81 mejorado fue aislado por selecciones a bae de afinidad de la biblioteca de exploración de secuenciación aleatoria homologa de cadena ligera descrita. En el segundo paso, se aisló el clon de más alta afinidad (bHl-44) a partir de una bilbioteca mediante residuos aleatorios de bHl-81. En particular, los oligonucleótidos fueron diseñados tal que sitios aleatorios en la CP y CL de bHl-81 (Tabla 5) codifiquen -50% del tipo silvestre y 50% de todos los demás 19 aminoácidos en cada posición (Gallop et al., Journal of Medicinal Chimistry 37 :1233 , 1994) .

Las KDs de variantes mejorados en afinidad de bHl (Tabla 5) fueron medidas para fragmentos Fab y anticuerpos IgG. Los fragmentos Fab y anticuerpos IgG fueron expresados en E. Coli y 293 células, respectivamente, y purificados como se ha descrito en la presente. Mediciones de resonancia de superficie de plasmón (SPR) con BIAcore3000 fueron usadas para determiner las afinidades de ligadura de los fragmentos Fab y anticuerpos IgG, tal como se describe en Lee et al. (J. Mol. Biol . 340:1073, 2004). Para estudiar la afinidad del anticuerpo como fragmentos Fab monovalentes, los antígenos (hVEGFi09 , VEGF102 murino, y HER2 ECD) fueron inmovilizados a baja densidad sobre un circuito BIAcore CM5. Diluciones en serie de fragmentos Fab fueron contactadas con los antígenos inmovilizados y las respuestas de ligadura fueron medidas mediante SPR. Un modelo de ligadura Langmuir 1:1 fue usado para calcular kon, Joff, y KD. Para determinar la KD de los anticuerpos IgG, se capturó el IgG sobre un circuito BIAcore CM5 por anticuerpo anti-Fc inmovilizado y expuest a las diluciones en serie de hVEGF109, VEGF102 murino, y HER2-ECD. Para HER2 , un modelo de ligadura Langmuir 1:1 simple fue usado para determinar la KD( mientras que el VEGF requirió de un modelo analítico bivalente. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 30°C.

Tabla 5 muestra las posiciones aleatorias en resaltado y resume las secuencias de CDR (SEQ ID NOS:l-9 y 39-41) de bHl, bHl-81, y bHl-44 y sus afinidades (como es determinado mediante la resonancia de superficie de plasmón) .

Tabla 5. Variantes de bHl con afinidad dual mejorada ND= no determinada.

Se midió mediante BIAcore la afinidad monovalente de los anticuerpos para VEGF10g humano, VEGF102 murino, y HER2 ECD. La Tabla 5 muestra las constantes de disociación respresentativas (Kd) para cada interacción de ligadura. El fragmento de ligadura a receptor de VEGF (VEGF109 ) fue usado en el experimento BIAcore por que las variantes de bHl se ligan a la proteína de longitud completa (VEGF165) y VEGF109 con afinidad similar en experimentos de competencia en solución (datos no mostrados) . Diferentes formatos de ensayo y modelos de evaluación fueron usados para calcular d para los fragmentos Fab/anticuerpos IgG como se describe en la presente. Los diferentes formatos de ensayo/evaluación rindieron constantes de disociación consistentes para las interacciones individuales.

Ejemplo 5. Análisis de actividad de IgG en ensayos de células Para determinar si los anticuerpos bHl y 3-1 podrían inhibir la proliferación inducida por hVEGF165 de células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) , éstos fueron probados en un ensayo de proliferación. Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (Cambrex, East utherford, NJ) se cultivaron y ensayaron según ha sido descrito (Fuh et al., J. Biol . Chem. 273:11197, 1998) . Aproximadamente 4,000 HUVECs fueron colocados mediante placas en cada pozo de la placa de cultivo de células de 96 pozos e incubadas en un medio Eagle's/F-12 modificado por Dulbecco (1:1) suplementado con 1.0% (v/v) de suero fetal bovino (medio de ensayo) por 18 horas. Medio de ensayo fresco con cantidades fijas de VEGF (concentración final de 0.2 nM) , que fue primero titulado a un nivel de VEGF que puede estimular la síntesis de ADN sub-maximal, y concentraciones incrementadas de anticuerpos anti-VEGF (v.gr., bHl) fueron entonces añadidos a las células. Después de la incubación a 37°C por 18 horas, las células fueron pulsadas con 0.5 µ??/???? de [3H] Timidina por 24 horas y cosechadas para conteo con un contador TopCount Microplate Scintillation . Los resultados demostraron que tanto 3-1 y bHl pueden inhibir el crecimiento inducido por VEGF de células HUVEC mediante la prevención de señalización inducida por hVEGF y subsecuente proliferación. El anticuerpo Avastin (anti-VEGF) fue usado como un control positivo y el anticuerpo Herceptin como un control negativo (figura 42) .

Para estudiar ligadura de anticuerpos anti-Her2/VEGF bi-especí fieos a Her2 expresados en células mamíferas, la ligadura de anticuerpos bHl y bH3 a células de fibroplastos NR6 sobre-expresando Her2 (NR6 -Her2 ) se estudió por Citometria de Flujo. Un millón de células NR6-Her2 fueron incubadas con 100 pg/ml de Fab e IgG por 1 hora, seguido por incubación con un anticuerpo IgG anti -humano murino conjugado a Alexa488 por 1 hora. Se estudió ligadura de Fab e IgG a células NR6 no expresivas como controles negativos. Como se demuestra en la figura 43, bHl y bH3 se ligan específicamente a Her2 sobre células NR6 como Fab y como IgG.

La figura 44 muestra los resultados de experimentos de ligadura competitiva para bHl a VEGF o HER2. bHl inhibió proliferación inducida por VEGF de células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) con un IC50 de 200 nM, lo cual es consistente con su afinidad de 300 nM, y la proliferación de la línea celular BT474 de cáncer de mama expresando HER2 después de 5 días de incubación, a pesar de una eficiencia menor que el anticuerpo Herceptin debido a su afinidad reducida (figura 45) . El anticuerpo IgG Herceptin y bevacizumab (anti-VEGF) sirvieron como controles. Como es mostrado en la figura 45, los anticuerpos bHl-81 y bHl-44 inhiben la proliferación inducida por VEGF de células HUVEC y el crecimiento de células BT474 en un mayor grado que bHl . Las potencias incrementadas de los variantes de bHl se correlacionan con sus afinidades relativas. El variante de mayor afinidad, bHl-44, inhibe el crecimiento de células HUVEC y BT474 con una potencia simiar a la de bevacizumab o anticuerpo Herceptin, respectivamente.

Para llevar a cabo estos experimentos, HUVECs estimuladas con VEGF fueron tratadas con concentraciones incrementadas de IgG humana y la inhibición de proliferación después de 2 días de incubación fue medida como se describe en Liang et al. (J. Biol . Chem. 281:951, 2006). Las células BT474 de cáncer de mama fueron cultivadas en medio RPMI suplementado con FBS al 10%. Para los ensayos, 104 células fueron colocadas en placas por pozo en una placa de 96 pozos e incubadas durante la noche (18 horas) a 37°C. Se añadieron a las células concentraciones aumentadas de IgG. Las células fueron entonces incubadas a 37°C por cinco días, seguido por la adición de AlamarBlue al 10% (Biosource International, Camarillo, CA) según las instrucciones del fabricante. La inhibición dependiente de anticuerpo de la proliferación de las células expresando HER2 fue determinada mediante medir la señal fluorescente después de 6 horas.

Ejemplo 6. Análisis de especificidad de ligadura La especificidad de ligadura de los anticuerpos derivada de la biblioteca de CL fue determinada. IgGs ligándose a varias proteínas inmobilizadas purificadas o células lisadas incluyendo los antígenos afines fueron ensayados por ELISA. Los antígenos fueron inmobil izados e incubados con hlgG a una concentración de 15 µg/mL por una hora. Se detectó espectrofotométricamente IgG ligada (densidad óptica a 450 nm; eje y; figura 46) . Las proteínas incluidas en el ensayo fueron (izquierda a derecha en la figura 46) : factor de crecimiento vascular endotelial A (VEGF) , factor de crecimiento vascular endotelial murino (VEGF murino) , factor de crecimiento vascular endotelial C, (hVEGF-C) , factor de crecimiento vascular endotelial D, (hVEGF-D) , dominio extra-celular de HER2 (HER2 ECD) , dominio extra-celular del receptor de factor de crecimiento epidérmico (hEGFR) , dominio extra-celular de ErbB3/HER3 (HER3 ECD) , receptor de muerte humano 5 (hDR5) , suero de albúmina de bovino (BSA) , caseína, suero fetal bovino (FBS) , Neutravidina, leche al 5%, lisado celular de fibroblasto de ratón, lisado celular de fibroblasto de ratón con hVEGF-A o HER2 ECD. En la figura 46, barras de error representan las medias de error estándar (SEM) de duplicados. Los anticuerpos bH3 , 3-1, bDl, bD2 , 4-1, y 4-5 no fueron probados para ligadura a VEGF, HER3 ECD, Neutravidina, leche al 5%, lisado celular fortalecido con hVEGF-A, y lisado celular fortalecido con HER2 ECD.

La capacidad de varios anticuerpos (anticuerpo Avastin, anticuerpo Herceptin, bHl , bH3 , bH4 , bHl-81, y bHl-44) para bloquear ligadura de VEGF a receptores de VEGF también fue determinada (figura 47) . El VEGF165 biotinilado humano (figura 47A) o VEGF164 murino (figura 47B) fueron equilibrados con crecientes concentraciones de IgG (eje x) . VEGF no ligado fue capturado sobre la proteína de fusión Fe VEGFR2 -ECD humana inmovilizada y detectado por espectrofotometría (densidad óptica a 450 nm, eje y) . Inhibición similar también se observó con VEGFR1. Los anticuerpos anti-VEGF bloquearon ligadura de VEGF a receptores de VEGF.

Los antígenos VEGF y HER2 fueron msotrados compitiendo para ligadura a anticuerpo IgG bi-específ ico bHl-44 en solución (figura 48) . El anticuerpo IgG humano bHl-44 a una concentración de 0.1 n fue incubado con VEGFi65 biotinilado humano 0.1 nM en presencia de concentraciones incrementadas de HER2 ECD. El bHl-44 fue capturado mediante Fe anti-humano inmovilizado y biotina-VEGF ligado a bHl-44 detectado con estreptavidina-HRP . Se detectó HER2 ECD ligado a bHl-44 capturado usando un anticuerpo anti-HER2 murino ligando a un epítopo que no se traslapa sobre HER2 seguido por una IgG anti-ratón de cabra conjugada a HRP (figura 48A) . IgG bHl-44 humano a una concentración de 0.2 nM fue incubado con HER2 biotinilado 0.6 nM en presencia de concentraciones incrementadas de VEGF16s .humano . El bHl-44 fue capturado por Fe anti-humano inmovilizado y biotina-HER2 ligado a bHl-44 detectado con estreptavidina-HRP (figura 48B) .

La ligadura específica de bHl y bHl-44 a células tambie'n se detectó mediante el uso de FACS (Clasificación Celular Activada por Fluorescencia; figura 49) . Los anticuerpos bi-específicos (bHl y bHl-44) se ligan a células de fibroblasto de ratón (NR6) expresando HER2 (Figura 49B) pero no a células NR6 negativas a HER2 (figura 49A) . 0.5-1 millones de células fueron incubadas con 15 yg/mL de hlgG sobre hielo por una hora. Se detectaron anticuerpos primarios ligados a células usando una IgG antihumana de cabra conjugada a PE fluorescente. Las células fueron analizadas usando un citómetro de flujo FACS Calibur. bHl y bHl-44 no reaccionaron de modo cruzado con el ortólogo de rata de HER2 , ya que no se detectó ligadura a las células de fibroblasto de ratón transíectadas con neu de rata (ortólogo de rata de HER2) .

Para caracterizar adicionalmente la especificidad de los variantes de anticuerpo bHl, bHl-81 y bHl-44, se realizaron experimentos de inmuno-precipitación y los variantes de anticuerpo bHl se mostraron inmuno-precipitando específicamente VEGF o HER2 a partir de lisados de fibroblasto de ratón (NR6 ) ., pero no otras proteínas (figura 50) . Las células NR6 fueron no específicamente biotiniladas , lisadas, y solubilizadas en detergente de proteínas de membrana celular. Los lisados celulares correspondientes a 5-10 millones de células/mL de células NR6 , células NR6 fortalecidas con 0.1 pg/mL de VEGF165 biotinilado, o células NR6 sobre- expresando HER2 fueron incubados con un 15 µg/mL de anticuerpo. El anticuerpo fue capturado usando perlas de sefarosa recubiertas con proteína A y las proteínas ligadas se eluyeron. Las proteínas eluidas fueron separadas mediante SDS-PAGE. Los lisados celulares correspondientes a aproximadamente 25-50,000 células e inmuno-precipitado a partir de aproximadamente 0.12-0.25 millones de células fueron cargados sobre el gel . Proteínas biotiniladas capturadas se detectaron por Western blot usando estreptavidina-HRP .

Ejemplo 7. Análisis de la actividad de IgG en ensayos in vivo Para determinar si la actividad dual de estos anticuerpos in vi tro se traslada a una actividad correspondiente in vivo, se emplearon modelos de tumor de xeno- injerto en ratón conocidos por responder al tratamiento por anticuerpo anti-VEGF (Colo205, línea celular del cáncer colorrectal) o anticuerpo Herceptin (BT474M1, línea celular del cáncer de mama) . En particular, se usaron xeno-injertos Colo205 en ratones nu/nu y se usaron xeno-injertos BT474 1 en ratones XID beige desnudos. Todos los estudios animales fueron hechos en concordancia con la guía de la American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (Asociación Americana para Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio) y el Genentech Institutional Animal Care and Use Committee (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales Genentech) .

En particular, las células BT474 1 (propias) y Colo205 (ATCC, Manassas, VA) fueron cultivadas en un medio RPMI/ suero fetal de bovino al 10%. 5xl06 células BT474M1 suspendidas en Solución Salina Regulada Hank 1 s (HBSS) y la mezcla de matrigel (1:1) fueron inyectadas en una almohadilla de grasa de mamífero de ratones XID beige desnudos Harían (Indianapolis, IN) implantadas subcutáneamente con una pelotilla de estradiol. Para xeno-injertos de Colo205, 5xl06 células Colo205 en HBSS fueron inyectadas subcutáneamente en ratones nu/nu Charles River (Hollister, CA) . Cuando el tamaño de tumor medio alcanzó -200 mm3, los ratones fueron agrupados aleatoreamente en 7 grupos de 8 ratones (BT474M1) o 10 ratones (Colo205) . Los anticuerpos fueron administrados intraperitonealmente una vez a la semana. Los tamaños del tumor fueron medidos dos veces por semana. Los volúmenes fueron calculados como V=0.5ab2 (siendo a la dimensión más larga del tumor y b perpendicular a a) . La evaluación estadística usó un análisis de una sola vía, seguido por las pruebas t de estudiantes de dos colas. El ajuste del nivel alfa debido a las múltiples comparaciones (Bonferroni) no alteró la significancia de las conclusiones. Respuestas parciales (PR) fueron definidas como una respuesta de 50-99% de reducción en el volumen del tumor comparado con V0. Muestras de suero fueron coleccionadas por 7 días después de los primer y tercer tratamientos. La concentración del anticuerpo humano fue determinada usando ELISA. IgG Fe de burro anti -humano fue inmobilizado en una inmuno-placa. Diluciones del suero y un anticuerpo estándar fueron incubadas sobre la placa por 2 horas. El anticuerpo ligado fue detectado mediante la peroxidasa de rábano conjugada con IgG Fe de cabra anti -humano seguido por Sustrato T B/Ácido Fosfórico 1M . Las places fueron leídas a 450/620 nm. Las concentraciones de muestra fueron determinadas usando un algoritmo de 4 parámetros.

Los grupos tratados con bHl-44 fueron comparados con grupos tratados con anti-VEGF (B20-4.1) (Liang et al., J. Biol . Chem. 281:951, 2006), anticuerpo Herceptin, o la combinación (anticuerpo Herceptin+anti-VEGF) para establecer posteriormente que el anticuerpo bHl-44 era capaz de inhibir crecimiento del tumor mediado por VEGF y HER2. En todos los grupos, el anticuerpo estuvo presente en suero a partir de xeno-inj ertos Colo205 en altos niveles (estimado por ELISA) 7 días después de empezar el tratamiento, indicando una fármaco-cinética normal (Tabla 6) .

Tabla 6. Niveles de Suero de Anticuerpo Para cada grupo, n=5; DS=Desviación Estándar El bHl-44 dosificado semanalmente a 10 mg/kg inhibió el crecimiento del tumor Colo205 comparado con el anticuerpo de control (p<0.0001, n=10) , con una eficacia similar como anti-VEGF (10 mg/kg/semana) , mientras que el anticuerpo Herceptin no tuvo efecto sobre el crecimiento de Colo205 (p=0.12, n=10) . Como se esperaba, el tratamieno en combinación mostró una eficacia similar como anti-VEGF sólo. El anticuerpo bHl-44 administrado a 10 y 20 mg/kg/semana rindió respuestas de dependientes de dosis. En el modelo deBT474Ml, se observó inhibición sigificativa del crecimiento en el grupo de ratones tratado con anticuerpo bHl-44 (10 mg/kg/semana, p=0.0005, n=8 y 20 mg/kg/semana, p=0.0001, n=7) . Así como los gurpos dosificados con anticuerpo Herceptin o la combianción de Herceptin/anti-VEGF, mas de la mitad de los tumores tratados con anticuerpo bHl-44 mostraron regresión de más del 50% del volumen inicial (es decir, respuesta parcial, figura 51) . Por el otro lado, anti-VEGF por sí solo solamente exhibió efectos inhibitorios de crecimiento modestos sobre BT474M1, en comparación con el control (p=0.06, n=7) y no exhibió una respuesta parcial. El anticuerpo bHl-44 bi-específico mostró por tanto dos mecanismos importantes distintos importantes para el crecimiento del tumor in vivo.

Los resultados anteriores indican el potencial de las variantes mejoradas por afinidad del anticuerpo bHl (v.gr., bHl-44 y bHl- 81) para inhibir dos mecanismos que son importantes para el crecimiento del tumor in vivo.

Ejemplo 8. Caracterización de las interfaces de ligadura de VEGF y HER2 con bHl y bHl-44 Para comparar adicionalmente las características estructurales de bHl y bHl-44, las interfaces de ligadura de VEGF y HER2 con estos anticuerpos fueron identificadas. Los contactos esctructurales listados en la Tabla 7 fueron identificados basados en las coordenadas 3BDY (bHl/VEGF) y 3BE1 (bHl/HER2) de la estructura cristal. La interface de ligadura fue calculada usando el programa XSAE. Este programa definió la interface como polar, hidrófoba y mixta. La Tabla 7 lista los residuos bHl con >25% del total de la superficie sepultada ante ligadura a HER2 o VEGF. La Tabla 7 también lista los residuos de VEGF y HER2 dentro de 4.5Á de los residuos de bHl. El área superficial de cada residuo que está enterrada ante la formación del complejo fue calculada usando IMOL basado en las coordenadas de las estructuras de cristal 3BDY, 3BE1, y 1N8Z (PDB) . Las áreas de interface polar e hidrófoba reportadas en la Tabla 11 reflejan el área de la interface polar y la mitad de la mixta. El área de interfaz hidrófoba reportada consiste de las áreas hidrófobas y la mitad de la mixta.

La estructura de cristal y la exploración de alanina mostraron que bHl retiene el mismo epítopo de ligadura sobre HER2 como el anticuerpo Herceptin (Bostrom et al., 2009) . La estructura de cristal de Fab de Herceptin en complejo con HER2 se superpone bien sobre el complejo bHl/HER2 (r.m.s.d de 0.8 Á) (Bostrom et al., 2009; Cho et al., 2003) . Adicionalmente, los residuos del anticuerpo Herceptin que contribuyen a más del 10% de la energía de ligadura total con base en mutagénesis de exploración de alanina se conservan, y muchos de ellos son también parte de los puntos calientes de ligadura de bHl y bHl-44 (Bostrom et al., 2009; Kelley and O'Connell, 1993) (Tabla 14, figura 62) . Las interfaces entre bHl/VEGF y bHl/HER2 entierran 1,506 Á2 y 1,579 Á2, respectivamente, y son principalmente hidrófobas (60% y 63%, respectivamente) . La interface de ligadura Herceptin/HER2 posee tamaño y composición similares a la interface bHl/HER2 (1,524 Á2, 60% hidrófoba, Tabla 11), y también está caracterizada por alta complementariedad de figura (Tabla 8) (Bostrom et al., 2009) . -232- Tabla 7. Lista de contactos estructurales de los complejos bHl Fab/HER2 ECD y bHl/Fab/VEGFi09. La Tabla lista residuos con >25% de área superficial total enterrada ante ligadura a HER2 y VEGF. Son listados los residuos de VEGF y HER2 dentro de 4.5 Á de los residuos bHl. El área superficial de cada residuo que está enterrada ante la formación del complejo se calculó usando IMOL con base en las coordenadas de las estructuras de cristal 3BDY, 3BE1, y 1N8Z (PDB) La complementariedad de figura (representada como Se en la Tabla 8) entre el anticuerpo y el antigeno fue determinada como se describe (Lawrence et al., 1993) . La alta complementariedad de figura en los complejos de bHl /VEGF y bHl/HER2 , similar a la complementariedad entre el anticuerpo Herceptin y HER2 , está en el rango de complejos anticuerpo-antígeno reportados (Se ~ 0.64-0.68; Lawrence et al., 1993) . La superposición de HER2 con bHl en su conformación ligada a VEGF o VEGF con bHl en su forma ligada a HER2 revela una pequeña complementariedad de figura observada cuando se yuxtapone al anticuerpo con un antígeno no relacionado. (Se ~ 0.35; Lawrence et al., 1993) . Los resultados demostraron la extensión a la cual bHl se reacomoda para acomodar los dos antígenos diferentes .

Tabla 8. Conformaciones de superficie diferentes de bHl para ligadura a HER2 y VEGF.

Com lementarte dad en la forma de los complejos anticue rpo/antígeno Anticuerpo Antigeno S * Herceptin HER2 0.75 bHl HER2 0.72 bHl VEGF 0M bHl (VEGF- conformación de enlace) ME 2 0.40 bHl (H£R2JC0Wf°rmación de enlace) VEGF 0.44 *Sc = Estadísticas de Complementariedad de Forma Mediana La afinidad de bHl fue mejorada mediante la selección del variante de alta afinidad bHl-44 a partir de biblotecas de anticuerpos exhibidas en fago de bHl. Mutagénesis de exploración de alanina de secuenciación aleatoria demostró que bHl-44 conservó los puntos calientes para ligadura de antígeno de bHl (Tablas 9A-B, 10, y 14) . La mutagenesis de exploración de alanina de secuenciación aleatoria de bHl-44 se llevó a cabo usando las técnicas descritas anteriormente para la mutagenesis de exploración de alanina de secuenciación aleatoria de bHl .

En las Tablas 9A-B los efectos de mutación a alanina (mi) , o mutaciones adicionales (m2, m3 ,- debido a las limitaciones de codones de secuenciación aleatoria) , o a un animoácido homólogo (m4) se calculan como la relación de ocurrencia de tipo silvestre (wt) o wt/mut para clones de ligadura a VEGF (Tabla 9A) o HER2 (Tabla 9B) . Cuando el wt fue alanina, se sustituyó por glicina (mi) . Las relaciones wt/mut se corrigen para efectos de pliegue/expresión de proteína mediante la división con relaciones wt/mut a partir de selección de exhibición para obtener los valores F. La selección de exhibición es llevada a cabo independientemente mediante seleccionar clones ligados a proteína L, la cual se liga a un epítopo no lineal de la cadena ligera de anticuerpo. Debido a que solo el Fab de cadena pesada es fusionado a la proteína de recubrimiento de fago (p3) , ligadura a proteína L indica el pliegue y la asociación apropiados de la cadena ligera y la cadena pesada.

En la Tabla 10, los residuos del anticuerpo de bHl y bHl-44 que hacen contacto con la estructura de cristal VEGF y/o HER2 son listados. Los puntos calientes energéticos para ligadura se definen por los residuos de anticuerpo que resultan en AAG„t/aia mayor que aproximadamente 10 % de la energía de l igadura total de la interacción .

Los datos en la Tabla 11 indican que la polaridad y el tamaño de las interfaces de l igadura son simi lares entre bHl /VEGF , bHl /HER2 , y el complej o Hercept in/HER2 . La polaridad de cada interface fue anal i zada usando XSAE . A menos se indique lo contrario , todos los números mostrados en la Tabla 11 representan el área en Á2 ' Tabla 9A . Explorac ión de alanina y homólogos de secuenciac ión aleatoria de bHl - 44 Fab para l igadura a VEGF .

Sclcccción de Selección Exhibida .. . _, . . . .„ .. ,.

Antígeno (VEGF) (Proteína L) Va,0reS Fwt/mUt AAG^' (kcal/m0,) wt/ wt/ wt/ wt/ wt/ wt/ wt/ wt/m Fwt/ Fwt/ Fwt/ Fwt/ AAG AAG AAG AAG mi m2 m3 m4 mi m2 m3 4 mi m2 m3 m4 Q27 0.3 1.0 9.0 1.2 0.8 0.9 0.4 2.8 0.4 1.1 20.3 0.5 -0.6 0.04 1.8 -0.5 N28 1.8 0.6 3.5 1.2 0.6 0.9 1.0 8.4 2.8 0.7 3.5 0.1 0.6 -0.2 0.7 -1.1 129 39.0 39.0 3.9 36.0 0.8 0.7 0.4 0.8 46.8 59.8 8.8 42.7 2.3 2.4 1.3 2.2 A30 2.8 NA NA 1.7 0.4 NA NA 0.2 6.5 9.9 1.1 1.4 K30a 3.0 2.7 9.0 1.6 1.4 3.1 1.1 0.2 2.1 0.9 7.8 8.7 0.4 -0.1 1.2 1.3 Ll T30b 7.0 NA NA 1.4 0.9 NA NA 0.5 7.7 2.7 1.2 0.6 I30c 16.0 5.3 0.5 0.9 2.3 2.1 0.7 1.0 7.1 2.6 0.7 0.9 1.2 0.6 -0.2 -0.1 S30d 15.7 NA NA 74.0 1.7 NA NA 0.5 9.1 150.4 1.3 3.0 G31 24.0 NA NA 74.0 2.6 NA NA 3.0 9.4 24.3 1.3 1.9 Y32 46.0 23.0 46.0 74.0 0.5 1.9 0.3 1.6 99.1 12.4 152.2 45.9 2.7 1.5 3.0 2.3 W50 46.0 15.3 46.0 74.0 2.3 1.5 2.4 1.1 20.4 10.2 19.2 65.1 1.8 CDR- G51 24.0 NA NA 74.0 7.3 NA NA 7.5 3.3 9.8 0.7 L2 S52 15.7 NA NA 36.0 4.1 NA NA 7.5 3.9 4.8 0.8 F53 22.0 44.0 14.7 5.7 1.9 2.4 1.4 0.4 1 1.6 18.1 10.8 13.5 1.5 CDR- H91 7.3 44.0 44.0 73.0 0.0 0.1 0.3 2.6 ^0' 880.0 154.0 27.9 3.0 4.0 3.0 2.0 L3 Y92 48.0.48.0 48.0 13.8 3.8 6.3 1.0 2.8 12.6 7.6 46.7 5.0 1.5 1.2 2.3 1 .0 593 1.0 NA NA 1 .7 3.0 NA NA 2.5 0.4 0.7 -0.6 -0.2 594 15.7 NA NA 3.4 1.0 NA NA 0.9 15.3 3.7 1.6 0.8 S30 1 .2 NA NA 1 .7 1 .2 NA NA 1.3 1.0 1.3 0.0 0.2 CDR- G31 2.4 NA NA 5.6 1.2 NA NA 5.0 2.0 1.1 0.4 0.1 Hl T32 0.5 NA NA 0.5 0.9 NA NA 0.6 0.5 0.9 -0.4 -0.1 Y33 10.2 1.0 2.2 12.5 1.4 2.0 0.8 2.3 7.1 0.5 2.6 5.5 1.2 -0.4 0.6 1.0 R50 0.6 0.9 20.5 0.4 2.1 1.3 70.0 1.3 0.3 0.7 0.3 0.3 -0.7 -0.2 -0.7 -0.8 Y52 1 .8 30.0 7.5 1.4 2.0 2.5 1.8 2.7 0.9 1 1 .9 4.3 0.5 -0.1 1.5 0.9 -0.4 CDR- S53 1.4 NA NA 1 .0 1.2 NA NA 1.1 1.2 0.9 0.1 0.0 H2 E54 1 .2 NA NA 0.7 0.4 NA NA 1.0 3.4 0.7 0.7 -0.3 Y56 9.2 6.5 6.9 0.7 1.6 2.3 1.3 1.2 5.8 2.8 5.3 0.6 1.0 0.6 1.0 -0.3 R58 1.5 1.8 8.1 1.3 2.1 2.3 4.9 2.7 0.7 0.8 1.6 0.5 -0.2 -0.2 0.3 -0.4 W95 Q Q 8.7 Q 0.8 0.2 0.3 4.5 ^ 685.7 27.2 53.7 3.1 3.9 2.0 2.4 V96 0.5 NA NA 1.4 2.1 NA NA 1.5 0.2 1 .0 -0.9 0.0 G97 0.8 NA NA 2.9 0.9 NA NA 5.7 0.9 0.5 -0.1 -0.4 V98 2.3 NA NA 1.2 1 .5 NA NA 0.8 1.6 1 .4 0.3 0.2 H3 G99 2.1 NA NA 3.0 1 .2 NA NA 1.8 1.7 1 .7 0.3 0.3 FlOO 6.2 9.5 5.0 2.2 2.0 2.0 0.9 1 .8 3.0 4.7 5.4 1.2 0.7 0.9 1.0 0.1 Y10° 27.2 27.2 15.1 2.2 1.5 1.5 0.6 0.9 17.9 18.6 26.6 2.5 1.7 1.7 1.9 0.5 a NA = Mutación no incluida.

Tabla 9B . Exploración de alanina y homólogos de secuenciación aleatoria de bHl-44 Fab para ligadura a HER2.

Selección de Selección Exhibida Valores F t/mut AAGwt/niu, (kcal/mol) Ant.geno (HER2) (proteina L) wt/m wt/m wt/m3 wt/m wt/ wt/ wt/ wt/ Fwt/ Fwt/ Fwt/ Fwt/ AAG ??? ??? ??? 1 2 m 4 mi m2 m3 m4 mi m2 m3 m4 wt m, wt m3 wt m4 Q27 0.9 1.0 0.6 1.4 0.8 0.9 0.4 2.8 1.2 1.0 1.3 0.5 0.1 0.0 0.1 -0.4| CDR- N28 1 .3 0.9 1.2 1.1 0.6 0.9 1.0 8.4 2.0 1.0 1.2 0.1 0.4 0.0 0.1 - 1.2 Ll 129 1 .5 1.9 0.8 0.8 0.8 0.7 0.4 0.8 1.8 3.0 1.7 1.0 0.3 0.6 0.3 0.0 A30 0.3 NA NA 1.1 0.4 NA NA 0.2 0.8 6.5 -0.2 1.1 30a 1.5 2.6 1.8 1.1 1.4 3.1 1.1 0.2 1.1 0.8 1.6 6.0 0.0 -0.1 0.3 1.1 T30b 1.0 NA NA 0.3 0.9 NA NA 0.5 1.1 0.6 0.1 -0.3 I30c 4.4 5.3 1.8 1.5 2.3 2.1 0.7 1.0 1.9 2.6 2.6 1.6 0.4 0.6 0.6 0.3 S30d 0.9 NA NA 1.0 1.7 NA NA 0.5 0.5 2.1 -0.4 0.4 G31 2.0 NA NA 2.2 2.6 NA NA 3.0 0.8 0.7 -0.1 -0.2 Y32 0.0 1.0 0.02 1.9 0.5 1.9 0.3 1.6 0.1 0.5 0.1 1.2 -1.8 -0.4 -1.6 0.1 W50 8.1 24.3 8.1 91.0 2.3 1.5 2.4 1.1 3.6 16.2 3.4 80.1 0.8 1.7 0.7 2.6 CDR- GS1 8.4 NA NA 44.5 7.3 NA NA 7.5 1.2 5.9 0.1 1.1 L2 S52 8.4 NA NA 6.6 4.1 NA NA 7.5 2.1 0.9 0.4 -0.1 F53 3.1 9.8 2.0 0.4 1.9 2.4 1.4 0.4 1.6 4.0 1.5 1.0 0.3 0.8 0.2 0.0 1 160.

H91 1.7 58.0 58.0 5.5 0.05 0.1 0.3 2.6 34.0 203.0 2.1 2.1 4.2 3.1 0.4 0 CDR- Y92 22.5 90.0 90.0 4.1 3.8 6.3 1.0 2.8 5.9 14.2 87.6 1.5 1.1 1.6 2.7 0.2 L3 S93 1.5 NA NA 2.8 3.0 NA NA 2.5 0.5 1.1 -0.4 0.1 S94 30.3 NA NA 7.3 1.0 NA NA 0.9 29.7 8.1 2.0 1.2 S30 1.3 NA NA 1.0 1.2 NA NA 1.3 1.0 0.8 0.0 -0.1 CDR- G31 1.5 NA NA 3.3 1.2 NA NA 5.0 1.3 0.7 0.1 -0.2 Hl T32 0.6 NA NA 1.5 0.9 NA NA 0.6 0.7 2.6 -0.2 0.6 Y33 150.0 150.0 150.0 5.7 1.4 2.0 0.8 2.3 104.3 75.0 179.3 2.5 2.8 2.6 3.1 0.5 R50 150.0 150.0 150.0 134.0 2.1 1.3 70.0 1.3 70.7 1 13.6 2.1 100.5 2.5 2.8 0.5 2.7 Y52 1.0 1.5 0.9 1.2 2.0 2.5 1.8 2.7 0.5 0.6 0.5 0.4 -0.4 -0.3 -0.4 -0.5 CDR- SS3 1.0 NA NA 1.1 1.2 NA NA 1.1 0.9 1.0 -0.1 0.0 H2 E54 1.2 NA NA 2.2 0.4 NA NA 1.0 3.4 2.2 0.7 0.5 Y56 49.0 147.0 147.0 0.9 1.6 2.3 1.3 1.2 31.2 64.1 1 12.3 0.7 2.0 2.5 2.8 -0.2 R58 23.7 142.0 142.0 66.0 2.1 2.3 4.9 2.7 1 1.2 61.4 28.8 24.8 1.4 2.4 2.0 1.9 W95 150.0 150.0 150.0 134.0 0.8 0.2 0.3 4.5 200.0740.0 470.0 29.6 3.1 3.9 3.6 2.0 CDR- V96 0.9 NA NA 1.2 2.1 NA NA 1.5 0.4 0.8 -0.5 -0.1 G97 1.8 NA NA 6.9 0.9 NA NA 5.7 2.0 1.2 0.4 0.1 H3 V98 0.6 NA NA 1.5 1.5 NA NA 0.8 0.4 1.8 -0.5 0.3 G99 6.5 NA NA 21.3 1.2 NA NA 1.8 5.2 12.0 1.0 1.5 F100145.0145.0 29.0 133.02.0 2.0 0.9 1.8 71.1 71.1 31.3 73.0 2.5 2.5 2.0 2.5 Y10° 149.0149.0 149.0 6.9 1.5 1.5 0.6 0.9 98.0 101.9262.7 7.8 2.7 2.7 3.3 1.2 a NA = Mutación no incluida. lttEtnacorassro Lieu Tabla 10. Paratopos estructurales y funcionales para VEGF y HER2 HER2 VEGF solo compartido solo m LC- S30b HC -Y56 LC-Y32 LC- I30c HC -R58 LC- 50 LC- S30d LC-Y53 ? LC' -G31 LC-H91 LC -T93 LC-Y92 K LC-T94 A HC-Y33 HC-R50 HC-W95 HC-G99 u HC-Y100a LC-I29 HC-Y33 LC-H91 ra LC- 50 HC-Y100a o -u LC-F53 ¦rl -H LC-Y92 (Q rH 0 (0 HC-Y100a Tabla 11. La polaridad y el tamaño de las interfaces ligadura de complejos bHl/VEGF, bHl/HER2 , y Herceptin/HER2. bm Fab VEGF -nterfaie de enlace bHl fihiHER: interface de enlate Hw. la IWHER: interfare de enlace bHl VECr íortaiaje(MÚimulo (Yo) <>H1 HERI (gng^g CcmJimaijo (V)H«>™ ri- HER ft,Ke taje Combinado (%) Total j¡ ¡ 29J «7 49.4 355 591 iV,i JO? JOS «14 40% Hidroffibico 43S 4« SCO «B4 470 51S 9SS «% 441 4d? 9!0 Wi Polar 74i> 7S7 ! 50« 778 800 157» 747 777 15.4 Anticuerpo bHl-44 específico dual HER2/VEGF mantiene la cinética de ligadura a HER2 del anticuerpo Herceptin Se llevó a cabo resonancia de plasmón de superficie para estudiar las cinética de ligadura de bHl y sus variantes Fab a VEGF o HER2 inmovilizado (Tabla 12) . Un ensayo basado en SPR se llevó a cabo usando un BIAcore 3000. Dominios extra-celulares de VEGF109 y HER2 fueron inmobilizados sobre circuitos CM5 a una densidad que permitió para Rmax en el rango de 50-150 RU. Diluciones en serie de Fabs en PBS con Tween20 al 0.05% se inyectaron a 30 µ?/min. Las respuestas de ligadura fueron corregidas mediante sustraer respuestas a partir de una célula de flujo en blanco y mediante normalizar los efectos del regulador. Un modelo de ajuste Langmuir 1:1 fue usado para estimar la ka (tasa activa) y kd (tasa inactiva) . Los valores KD fueron determinados a partir de las relaciones de ka y kd.

La interacción bHl Fab/VEGF está caracterizada por una tasa activa relativamente alta (kon=3.7xl04) y una tasa inactiva rápida (kOf f=0.013) , que resulta en una moderada KD de 300 nM. La afinidad de la interacción bHl/HER2 (KD=26 nM, kon=9.6xl04, koff=2.4xl0"3) es 52 veces menor que la interacción Herceptin/HER2 (KD=0.5 nM, kon=7. lxlO , k0ff=3.5xl0"4) con una tasa activa mas lenta y una tasa inactiva mas rápida. Los variantes de bHl mejorados en afinidad, bHl-81 y bHl-44, exhibieron mejoras en ambos de las tasas cativas y tasas inactivas de las interacciones de VEGF y HER2. El clon de alta afinidad bHl-44 se liga a HER2 con una afinidad similar a Herceptin (KD=0.2 nM, Tabla 12) .

La Tabla 12 muesta los perfiles cinéticos de las variantes de bHl y el anticuerpo Herceptin determinados por la medición de resonancia de plasmón de superficie usando BIAcore a 30 °C. En estos experimentos, los Fabs se ligaron a VEGF o HER2 inmovilizados, y la tasa activa (ka) , la tasa inactiva (kd) , y la constante de disociación (KD) fueron determinadas usando un modelo de ajuste de ligadura Langmuir 1:1. El anticuerpo bHl-44 tiene un perfil cinético y afinidad similares para HER2 como el anticuerpo Herceptin. Los dos dobles mutantes (bHl-44 I29A + Y32A y bHl-44 R50A + R58A) que perdieron ligadura a VEGF o HER2 retuvieron el perfil cinético y afinidad para el otro antígeno.

Tabla 12. Perfiles cinéticos de los variantes de bHl y anticuerpo Herceptin .

VEGF109 HER2 ECD kd ka ka (1/Ms) KD (nM) d (1/S) D (1/s) (1/Ms) (nM) - 3.5E- Herceptin Fab - NB 7.1E+05 0.5+/-0.06 04 Herceptin 2.0E- - NB 2.7E+04 74 (R50A) Fab - 03 Herceptin - - 7.3E- NB 5.9E+04 12 (R58A) Fab 04 Herceptin (R50A+R58A) - - NB - - NB Fab bHl Fab 3 7E+04 0.013 300+/-87 9.6E+04 2.4E-03 26+/-28 bHl-81 1 2E+05 0.007 58+/-12 2.2E+05 1.4E-03 6+/-0.6 bHl- 4 Fab 4 OE+05 0.001 3+/-0.3 3.7E+05 8.OE-05 0.2+/-0.07 bHl-44 (Y32A) Fab - - Semana 6.2E+05 3.5E-05 0.1 bHl-44 (I29A+Y32A) - - NB 4.2E+05 8.3E-05 0.2+/-0.07 Fab bHl-44 (R50A+R58A) 3 5E+05 0.001 3+/-0.7 - - NB Fab NB = Sin ligadura detectable.

Anticuerpos específicos duales interactuan con HER2 y VEGF con propiedades termodinámicas similares Los cambios de entalpia (??) y entropía (AS) para las interacciones entre los variantes de bHl Fab y dos anígenos; VEGF (el dominio de ligadura a receptor de VEGF, VEGF8_i09 ) y el dominio extra-celular de HER2 (ECD) también se determinaron (figuras 59A-F, figura 60, Tabla 13) usando calorimetría de titulación isotérmica (ITC) .

Mediciones micro-calorimétricas de las interacciones entre Fabs y VEGF109 humano y del dominio extra-celular de HER2 fueron llevadas a cabo sobre un calorímetro de titulación VP-ITC (Microcal Inc.) tal como se ha descrito (Starovasnik et al., 1999) . Soluciones de proteína fueron dializadas extensivamente en solución salina regulada con fosfato. El antígeno y Fabs fueron dializados en el mismo recipiente para minimizar los efectos térmicos del mezclado debidos a diferencias en la composición del regulador. Fabs a una concentración de 100-220 µ? fueron titulados en soluciones de antígeno (HER2-ECD o VEGF109) a una concentración de 10-22 µ? . Esta concentración de antígeno fue requerida para precisar las mediciones de entalpia, pero excluye la determinación de la KD en casos donde la afinidad de ligadura es alta. Quince o veinte inyecciones fueron llevadas a cabo para obterner un exceso de dos tantos de anticuerpo. Los calores de reacción fueron determinados, calores de la dilución Fab fueron sustraídos, y el ?? fue calculado.

Las constantes de disociación (KD) determinadas por resonancia de plasmón de superficie (Tabla 12) se usaron para calcular la energía libre de ligadura (?T) de acuerdo con: AG = RT ln (KD) El cambio de entropía ante asociación (AS) fue calculado de acuerdo con: AS = (AH-AG) /T, donde T es la temperatura (K) .

Para determinar el ACp, se llevaron a cabo mediciones micro-calorimétricas a diferentes temperaturas en el rango de 20 a 37°C tal como se describió anteriormente. El ACp fue determinado mediante la regresión lineal mediante trazar ?? como una función de la temperatura (figura 62) .

Las interacciones del anticuerpo específico dual bHl, con ya sea dos de sus antígenos, VEGF y HER2 fueron primero caracterizados. La ligadura de bHl con VEGF y HER2 exhibió propiedades termodinámicas similares (Tabla 13) . Ambas interacciones, medidas a 30°C en PBS a pH 7.4, son exotérmicas (??=-2.4 y -2.4 kcal/mol para VEGF y HER2 , respectivamente, Tabla 13, figura 60) con un cambio en la entropía altamente favorable contribuyendo a la energía de ligadura (-TÁS=-6.6 y -7.9 kcal/mol para VEGF y HER2 , respectivamente, Tabla 13, figura 60) .

La Tabla 13 ilustra el AG (energía libre de ligadura) , AS (cambio de entropía), y ?? (cambio de entalpia) en kcal/mol. Las afinidades mostradas fueron medidas en por lo menos dos experimentos independientes usando un análisis cinético por BIAcore a 30°C. El ?? fue medido usando ITC y representa el promedio de dos o tres mediciones independientes seguidas por las desviaciones estándar. El AG y AS fueron calculados como se describió anteriormente.

Los variantes de alta afinidad bHl -81 y bHl-44 exhibieron perfiles termodinámicos similares a bHl. Sus interacciones con VEGF y HER2 también fueron caracterizadas por entalpia y entropía favorables (Tabla 13, figura 60) . Para la interacción con VEGF, la mejora de afinidad fue asociada con un cambio en la entalpia significativamente favorable (??=-7.1 para bHl-44 contra -2.4 kcal/mol para bHl a 30°C) y un cambio de la entropía positiva ligeramente menor (-TAS=-6.6 para bHl-44 contra -4.7 para bHl a 30 °C, Tabla 13, figura 60) . La afinidad mejorada para HER2 fue también asociada con un cambio más favorable en la entalpia (??=-5.3 contra -2.4 kcal/mol, 30°C, Tabla 13, figura 60) .

Tabla 13. Afinidades de ligadura a antígeno y termodinámica para los variantes de bHl y el anticuerpo Herceptin.

VEGF, HER2-ECD KD KD AG ?? -TAS AG ?? -TAS (nM) (nM) Herceptin - - - - 0.5 - 12.9 +/-0.06 -13.6+/-0.2 -0.3+/-0.2 bHl 300 -9.0+/-0.2 -2.4+/-0.7 -6.6+/-0.7 26 - 10.5+/-0.4 -2.4+/-0.5 -7.9+/-0.6 bHl-81 58 -10+/-0.1 -6.2+/-0.1 -3.8+/-0.2 6 -1 1.4+/-0.05 -3.8 -7.6 bHl-44 3 - 1 1.8+/-0.07 -7.1+/-0.3 -4.7+/-0.3 0.2 -13.5+/-0.3 -5.3+/-0.4 -8.1 +/-0.5 bHl-44 - - - - 0.2 -13.5+/-0.3 -6.4+/-0.5 -7.6+/-0.6 (LC-I29A/Y32A) bHl-44 4 -1 1.6+/-0.1 -7.7 -3.9 - - - - (HCR50A/R58A) bHl-44 y Herceptin interactúan con HER2 con distinta termodinámica En contraste con los anticuerpos específicos duales, la interacción HER2/Herceptin está caracterizada por un cambio de la entalpia favorable grande (??=-13.6 kcal/mol) sin ningún cambio significativo en la entropía (-TAS=-0.3 kcal/mol, figura 60, Tabla 13) (Kelley et al., 1992) . A pesar de que bHl-44 interactúa con HER2 con una afinidad similar como Herceptin, la energía de ligadura libre está compuesta de un componente de entropía mayor (-TAS=-8.1 kcal/mol, 30°C) y un componente de entalpia menor (??=-5.3 kcal/mol, 30°C) . Las propiedades termodinámicas distintas constrastan con las muchas similitudes en las características de ligadura de HER2 entre Herceptin y bHl-44, que incluyen afinidad, cinética, y muchos de los residuos de los puntos calientes energéticos. A pesar de que los residuos de los puntos calientes de Herceptin que contribuyen a más del 10% con la energía total de ligadura para HER2 son similares a aquellos de bHl y bHl-44, hay algunas claras diferencias.

La Tabla 14 muestra los puntos calientes de bHl, bHl-44, y del anticuerpo Herceptin para ligadura a HER2 determinados mediante la mutagénesis de exploración de alanina. La mutagénesis se llevó a cabo como se describe en Kelley et al., 1993. Los números en la Tabla 14 representan el cambio de la energía libre de ligadura (AAGwt-mut) cuando el residuo es mutado a alanina. Los residuos de los puntos calientes en la Tabla 14 son sombreados y están definidos como una ??T mayor que o igual a 10% de la energía libre de ligadura (AG) total.

Los residuos LC-Thr94, HC-Tyr33, HC-Asp98 son conservados en la secuencia de bHl pero poseen diferentes funciones en la ligadura a HER2 (Tabla 14, figura 61) . Por lo tanto, las mutaciones en el sitio de ligadura a antígeno de Herceptin que reclutó ligadura a VEGF parecen haber hecho algunos cambios fundamentales respecto al sitio de ligadura del antígeno que afecta la interacción con HER2. Los anticuerpos específicos duales acomodan las mutaciones introducidas mediante la utilización de una estrategia diferente de reconocimiento de HER2 que resulta en afinidad igualmente alta para HER2 como Herceptin. Es intersante notar que excepto por CL-Ser94 de bHl-44, las mutaciones que mejoraron la afinidad para HER2 en más de 100 veces en comparación con bHl no son parte del punto caliente de ligadura, pero parecen optimizar las interacciones existentes. Altas capacidades caloríficas negativas en las interacciones específicas duales Para entender adicionalmente las energéticas comunes que impulsan las interacciones específicas duales y de cómo se distinguen de aquella del progenitor mono-específico Herceptin, se llevaron a cabo una serie de experimentos para estudiar las siguientes tres interacciones Fab/antígeno : bHl-44 con VEGF o HER2 , y Herceptin con HER2. Las capacidades caloríficas de las interacciones específicas duales fueron medidas mediante la determinación de la entalpia de ligadura (??) a temperaturas múltiples en los promedios desde 20°C a 37 °C (??=17 °C, figura 62, Tabla 15) . La capacidad calorífica (ACp) es una función de ?? y Temperatura (T) y puede describirse mediante la ecuación: ?0?=d(??) / d? ACp fue estimado a partir de la pendiente de la dependencia de temperatura de ?? mediante regresión lineal (figura 62, Tabla 15) . ACp de bHl-44 fue determinado a -400 cal/molK para la interacción con VEGF, y -440 cal/molK para la interacción con HER2. Las altas capacidades caloríficas negativas indican la importancia del efecto hidrófobo descrito anteriormente (Kauzmann, 1959) , el cual es consistente con la naturaleza hidrófoba de las interfaces estructurales en los dos complejos (Tabla 11) . La ACp para Herceptin/HER2 , que fue previamente determinada a -370 cal/molK en un intervalo de temperaturas similar (Kelley et al., 1992), es menor que ACp de bHl-44/HER2, pero aún indica el rol importante del efecto hidrofóbico en la ligadura a HER2.

El cambio total de la entropía (?3) de la energía de libre ligadura es una suma de los cambios de entropía a partir de tres fuentes ( urphy et al., 1994) : cambios de la entropía asociados con una disolvación de las superficies de enlace (ASSOLV) / cambios en la entropía debidos a la pérdida del grado de libertad de rotación y traslación (ASRT) , y cambios en la entropía debidos a los cambios de las dinámicas configuracionales y conformacionales de las moléculas que interactúan (ASCONF) · Típicamente, sólo ASSOLV es positivo mientras que ASRT ayASC0NF son ambos negativos. El término de entropía crática, ASRT, para la asociación de las dos moléculas puede estimarse a -8 cal/Kmol como ha sido descrito (Murphy et al., 1994) . ASSOLV puede asumirse de ser nominado por el efecto hidrófobo debido al entierro del área de superficie apolar y puede describirse como una función de ACp: (2) ??? ln(T/T*), T*=385 K AS CONF puede por tanto estimarse : (3) ASCONF = AS OT - ASR - ASSOLV De acuerdo con la ecuación (3) , ASSOLV es estimado en 96 calmol^K"1 para bHl-44/VEGF, 105 calmol^K"1 para bHl-44/HER2, y 89 calmol^K"1 para Herceptin/HER2 (Tabla 15) . Esto se traduce a ASCONF de -72 calmol^K"1 para bHl-44/VEGF, -70 calmol^K"1 para bHl-44/HER2, y -80 calmol^K"1 para Herceptin/HER2 (Tabla 15) .

Para examinar la estabilidad estructural total de los Fabs específicos duales comparados con su Herceptin progenitor, se llevaron a cabo experimentos de desnaturación térmica usando calorimetría de exploración diferencial (DSC) . Los experimentos de desnaturación térmica fueron llevados a cabo sobre un calorímetro de exploración diferencial de Microcal Inc. Los Fabs fueron dializados contra acetato de sodio 10 mM, pH 5, cloruro de sodio 150 mM . Las soluciones fueron ajustadas a una concentración de 0.5 mg/ml y calentadas a 95°C a una tasa de l°C/min. Los perfiles de fusión fueron las líneas de base corregidas y normalizadas. La temperatura de fusión (TM) fue determinada usando el software suministrado por el fabricante. Como se esperaba, ninguno de los Fabs exhibió perfiles de desnaturación térmica reversibles (Kelley et al., 1992) (datos no mostrados) . Las TM de los variantes de especificidad dual (77.2°C, 75.6°C, 74.3°C para bHl, bHl-81, y bHl-44, respectivamente, Tabla 16) fueron levemente inferiores a los de Herceptin (82.5°C), pero altos y dentro del rango de lo que ha sido reportado para otros anticuerpos terpapéuticos (Garber and Demarest, 2007) .

La cinética y termodinámica de ligadura de los variantes de bHl con alta afinidad para sólo VEGF o HER2 Interesantemente, los anticuerpos específicos duales derivan la mayoría de su energía de ligadura a partir de regiones completamente distintas del sitio de ligadura compartido de VEGF/HER2. Estos datos muestran que la funciónd de ligadura de VEGF o HER2 de los anticuerpos específicos duales puede ser interrumpida selectivamente sin afectar la especificidad de ligadura restante. Estudios estructurales indican que los paratopos estructurales sobre bHl para VEGF y HER2 se traslapan significativamente, pero la mutagénesis de secuenciación aleatoria de alanina de bHl y bHl-44 demostraron que las interacciones con VEGF y HER2 son mediadas por dos conjuntos únicos de residuos de CDR con un poco de traslape (figuras 54 y 57, Tablas 9A, 9B, y 10) . La exploración de alanina de secuenciación aleatoria de bHl y bHl-44 indica que algunos de los residuos de CDR son exclusivamente importantes para ligadura ya sea a VEGF o HER2 (figuras 54 y 57, Tablas 9A, 9B, y 10) , incluyendo LC-Ile29, LC-Tyr32, que son importantes para ligadura a VEGF, y HC-Arg50, HC-Arg58 para ligadura a HER2 (figuras 54 y 57, Tablas 9 y 10) . Para confirmar la importancia única de las cadenas secundarias de estas regiones en cada interacción, cada residuo fue mutado, individualmente o en combinación, a alanina en los andamiajes de bHl-44 (CL-Ile29, CL-Tyr32, CP-Arg50, CP-Arg58) o Herceptin (CP-Arg50, CP-Arg58) , y expresó los mutantes como Fabs e IgGs .

Los vectores que codifican Fabs de bHl-44 o Herceptin se fusionaron a la terminal N del gen III a través de la cadena pesada usada como las plantillas para mutagénesis de Kunkel (Kunkel et al., 1987) . Los oligonucleotidos fueron diseñados para introducir en las posiciones selccionadas las mutaciones de alanina deseadas. Los mutantes de alanina de Fab fueron expresados como fago, y la ligadura fue comprobada por ELISA de competencia (figura 58) . Los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera fueron entonces clonados en los vectores de expresión Fab e IgG, y Fabs e IgGs expresados y purificados como se describe (Bostrom et al., 2009) . SDS-PAGE verificó la posición correcta de la proteína (figura 65) . Cromatografía de exclusión de tamaño mostró niveles de aglomeración menores que 5%.

Ligadura a los dos antígenos fue examinada por ELISA de competencia y/o BIAcore. Todas las mutaciones de alanina únicas en los andamiajes de bHl-44 perjudicaron ligadura en diversos grados (datos no mostrados) . La mutación única más sorprendente fue CL-Y32A, la cual rompió significativamente ligadura a VEGF, mientras que mantuvo la afinidad y cinética de ligadura a HER2 (Tabla 12, figura 58, y figura 63) . Las mutaciones dobles I29A+Y32A (CL) o R50A+R58A (CP) interrumpieron casi por completo la ligadura a VEGF o HER2, respectivamente, mientras se mantuvo la afinidad y cinética de ligadura para el otro antígeno (Tabla 12, figura 58, y figura 63) . Las mutaciones de alanina CP-R50A, CP-R58A en el andamiaje de Herceptin también se interrumpieron ligadura a HER2 en diversos grados, mientras que el doble mutante R50A CP + R58A no mostró ligadura a HER2 detectable (Tabla 12) .

Los parámetros termodinámicos de los mutantes dobles fueron analizados posteriormente y comparados con los valores para bHl-44. La energía libre de ligadura del mutante bHl-44 CL-I29A+Y32A y CP-R50A+R58A con HER2 o VEGF, respectivamente, resultó de contribuciones favorables de entalpia y entropía (??=-7.7 y -TAS=-3.9 para VEGF, ??=-ß.4 y -TÁS=-7.6 para HER2 , Tabla 13, figura 60), la cual es aproximadamente equivalente a bHl-44 medida a 30°C (Tabla 13, figura 60) . Por lo tanto, los mutantes dobles exhiben los mismos perfiles termodinámicos y cinéticos como bHl-44.

Base Estructural para las funciones que alteran la especlfidad de los residuos Luego, fueron analizadas las estructuras de cristal del complejo bHl con VEGF o HER2 (Bostrom et al., 2009) para revelar las interacciones específicas de los determinantes de ligadura en cada complejo de antígeno (figura 64) . Los análisis resultantes explicaron cómo las mutaciones de dos residuos que determinan especifidads interrumpen la capacidad de ligadura para un antígeno sin afectar la afinidad, cinética, y termodinámica de ligadura para los otros. La CDR-L1 de bHl contiene la mayoría de los cambios en la secuencia de Herceptin y es importante para ligadura a VEGF. Las con ormaciones de CDR-L1 de bHl difieren significativamente en las dos estructuras de complejos; la desviación promedio es 4.6 Á (Ca de residuos 27-32) . Por el contrario, la conformación global de bHl Fab en complejo con VEGF es marcadamente similar a aquella de Fab ligado a HER2 (r.m.s.d.= 0.7 Á, para 398 átomos del esqueleto, C«) . El bucle CDR-L1 constituye 26% del área de superficie sepultada por VEGF mientras que este bucle es situado en la periferia del paratope HER2 e involucrado mínimamente en contacto con HER2.

La superposición de los dos complejos indica que VEGF chocaría con Tyr32 y los residuos adyacentes de CDR-L1 en su conformación ligada a HER2. La cadena principal de átomos Ca de Tyr32 reside en la misma posición en las dos estructuras, pero su cadena secundaria es girada por -130°. En el complejo de VEGF, Tyr32 y Ile29 parecen desempeñar funciones estructurales para la conformación de la CDR-L1 necesaria para ligadura a VEGF. La mutación de Tyr32 a cualquiera de Ala o Phe no es tolerada para ligadura a VEGF (Bostrom et al., 2009) . Aunque la cadena lateral Tyr32 enfoca hacia HER2 , no parece estar implicada en los contactos de antígeno productivos. Ile29 está muy lejos de HER2 , con su cadena secundaria expuesta al disolvente y la mutación de Ile29 y Tyr32 a Ala, es bien tolerada por la ligadura a HER2.

Tabla 14. Comparación de puntos calientes de bHl, bHl-44, y Herceptin para ligadura a HER2 determinados por la mutagénesis de exploración de alanina MG(kcal/mal) Residne bHIA GF bHl-44/VEGI bHlHER2 bHl- 4/H?R3 Herceptin 27 -0.6 0.1 30 0.2 0.0 -0.3 0.01' 0.6 31 0.2 0.4 0.4 0.1' 0.2 aResiduos bHl/bHl-44 que difieren del anticuerpo Herceptin. cIndica un residuo de contacto en las estructuras de complejo bHl/VEGF o bHl/HER2. (-) Indica que el anticuerpo Herceptin no posee residuos en esta posición.

Tabla 15 . Parámetros Termodinámicos de las interacciones de VEGF y HER2.

ACp AStot ASconf ASdesolv ASrt (cal/ mol) cal/Kmol) (cal/Kmo) (cal/Kmol) (cal/Kmol) bHl-44/VEGF -400 16 -72 96 -8 bHl-44/HER2 -440 27 -70 105 -8 Herceptin/HER2 -370 0.8 -80 89 -8 - ASRT como es descrito por Murphy Proteins, 1994. ASRT fue estimado en -8 cal/molK para una simple reacción de ligadura. ASS0LV = AS*+ ????? (T/Ts* ) , en donde T=303.15, Ts*=385.15 and AS*~0.

Tabla 16 . Temperaturas de Fusión (TM) de Fabs específicos duales y el anticuerpo Herceptin Fab TM (°C) Herceptin 82.5 bHl 77.2 bHl-81 75.6 bHl -44 74.3 Se examinó también la estructura de los residuos de una importancia única para ligadura a HER2 en el complejo a bHl/HER2. Las cadenas secundarias de Arg50 y Arg58 se empacan contra residuos ácidos en HER2 (Glu558 y Asp560) en la estructura bHl-HER2 ( figura 64 ) . Las interacciones parecen ser altamente específicas de cadenas secundarias, como mutaciones a Lys, así como Ala son perturbadoras (Bostrom et al., 2009). En la estructura de VEGF, sin embargo, Arg50 y Arg58 son solventes expuestos y lejos de VEGF, y las mutaciones a Ala o Lys son bien toleradas (Bostrom et al., 2009).

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Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes de patentes publicadas, y cualquier publicación citada o referida en esta especificación son en la presente incorporadas por referencia, en la misma extensión de como si cada patente independiente, solicitud de patente, solicitud de patente publicada o publicación haya sido indicada específicamente e individualmente a ser incorporada por referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que comprende una secuencia de región hipervariable (HVR) Ll que comprende la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1), en donde dicho anticuerpo se liga específicamente un receptor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) y un factor de crecimiento endotelio vascular (VEGF) .

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente uno o dos secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) HVR-L2 comprendiendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID N0:2); y (ii) HVR-L3 comprendiendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO: 3) .

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente, una, dos, o tres secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) HVR-H1 comprendiendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID N0:4); (ii) HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO : 5 ) ; y (iii) HVR-H3 comprendiendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO : 6 ) .

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente, uno, dos, o tres secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) HVR-Hl comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7); (ii) HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO : 8 ) ; y (iii) HVR-H3 comprendiendo la secuencia VGVGFYA D (SEQ ID NO : 9 ) .

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con una Kd de 150 nM o más fuerte, y a HER2 con una Kd de 7 nM o más fuerte.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo inhibe la proliferación celular inducida por VEGF y la proliferación de una célula que expresa HER2 con relación a un control .

7. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo inhibe ligadura de VEGF al receptor de VEGF 2 (VEGFR2 ) .

8. Un anticuerpo aislado, en donde dicho anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con una Kd de 150 nM o más fuerte, y a HER2 con una Kd de 7 nM o más fuerte, y en donde dicho anticuerpo inhibe la proliferación celular inducida por VEGF y la proliferación de una célula que expresa HER2 con relación a un control .

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en donde dicho anticuerpo se liga a VEGF humano o de ratón con una Kd de 36 nM o más fuerte y a HER2 con una Kd de 1 nM o más f erte .

10. Un fragmento de anticuerpo aislado, en donde dicho fragmento de anticuerpo se liga a VEGF humano con una Kd de 58 nM o más fuerte y a HER2 con una Kd de 6 nM o más fuerte, y en donde dicho fragmento de anticuerpo inhibe la proliferación celular inducida por VEGF y la proliferación de un célula que expresa HER2 con relación a un control.

11. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 10, en donde dicho fragmento de anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con una Kd de 33 nM o más fuerte, y a HER2 con una Kd de 0.7 nM o más fuerte .

12. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 10 u 11, en donde dicho fragmento es un fragmento Fab.

13. Un anticuerpo aislado, en donde dicho anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2 , HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3, en donde cada uno, en orden, comprende la secuencia de las SEQ ID NOs:l, 2, 3, 4, 5, y 6, y en donde dicho anticuerpo se liga específicamente a HER2 y VEGF.

14. Un anticuerpo aislado, en donde dicho anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2 , HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 , y HVR-H3 , en donde cada uno, en orden, comprende la secuencia de las SEQ ID NOs:l, 2, 3, 7, 8, y 9, y en donde dicho anticuerpo se liga específicamente a HER2 y VEGF.

15. Un anticuerpo aislado que comprende una secuencia HVR Ll comprendiendo la secuencia X1IX3X4X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO:83), en donde Xi es cualquier aminoácido excepto Asp, X3 es cualquier aminoácido excepto Pro, X4 es cualquier aminoácido excepto Arg, X5 es cualquier aminoácido excepto Ser, y en donde dicho anticuerpo se liga específicamente a HER2 y VEGF.

16. El anticuerpo aislado de la reivindicación 15, en donde Xi es Asn, X3 es Ala, X4 es Lys, X5 es Thr, o cualquier combinación de los mismos.

17. El anticuerpo aislado de las reivindicaciones 15 o 16, en donde X5 es Thr, X7 es Ser, y X8 es Gly.

18. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente una o dos secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) HVR-L2 comprendiendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO: 2) ; y (ii) HVR-L3 comprendiendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID N0:3) .

19. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) HVR-H1 comprendiendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID N0:4); (ii) HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO : 5 ) ; y (iii) HVR-H3 comprendiendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) .

20. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) HVR-Hl comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7); (ii) HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO : 8 ) ; y (iii) HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

21. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde dicho anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con una Kd de 150 n o más fuerte y a HER2 con una Kd de 7 nM o más fuerte .

22. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde dicho anticuerpo inhibe la proliferación celular inducida por VEGF y la proliferación de una célula que expresa HER2 con relación a un control.

23. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde dicho anticuerpo inhibe la ligadura de VEGF con VEGFR2.

24. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente una secuencia HVR H2 comprendiendo la secuencia RX2X3X4X5 6 7X8X9R (SEQ ID NO: 84), y en donde dicho anticuerpo se liga específicamente a HER2 y VEGF.

25. Un anticuerpo aislado que comprende una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RX2X3X4X5XSX7X8X9R (SEQ ID NO: 85), en donde X5 es cualquier aminoácido excepto Thr y X6 es cualquier aminoácido excepto Asn, y en donde dicho anticuerpo se liga específicamente a HER2 y VEGF.

26. El anticuerpo aislado de la reivindicación 25, en donde X5 es Ser, X6 es Glu, o X5 es Ser y X6 es Glu.

27. El anticuerpo aislado de la reivindicación 25 o 26, en donde X8 es Tyr.

28. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente una o dos secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) HVR-Hl comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7};. (ii) HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

29. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) HVR-L1 comprendiendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO : 1 ) ; (ii) HVR-L2 comprendiendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO:2); (iii) HVR-L3 comprendiendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO:3) .

30. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en donde dicho anticuerpo se liga a VEGF humano y de ratón con- una Kd de 150 nM o más fuerte y a HER2 con una Kd de 7 nM o más fuerte .

31. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en donde dicho anticuerpo inhibe la proliferación celular inducida por VEGF y la proliferación de una célula que expresa HER2 con relación a un control.

32. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en donde dicho anticuerpo inhibe la ligadura de VEGF con VEGFR2.

33. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o 13-32, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

34. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 13-32, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG.

35. Un fragmento del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o 13-32, en donde dicho fragmento se liga específicamente a HER2 y VEGF.

36. El fragmento de la reivindicación 35, en donde dicho fragmento es un fragmento Fab o un fragmento variable de cadena única (scFv) .

37. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, en donde por lo menos una porción de la secuencia de estructura es una secuencia de estructura de consenso humana.

38. Un polinucleótico que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37.

39. Un polinucleótico que codifica una secuencia HVR-L1 comprendiendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1).

40. Un polinucleótico que codifica una secuencia HVR-L1 comprendiendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1), y (i) una secuencia HVR-L2 comprendiendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID N0:2) , o (ii) una secuencia HVR-L3 comprendiendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO : 3 ) , o ambos (i) y (ii).

41. El polinucleótido de las reivindicaciones 39 o 40, en donde dicho polinucleótico codifica adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) un HVR-H1 comprendiendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO : 4 ) ; (ii) un HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO : 5 ) ; y (iii) un HVR-H3 comprendiendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO : 6 ) .

42. El polinucleótido de las reivindicaciones 39 o 40, en donde dicho polinucleótido codifica adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) un HVR-H1 comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO : 7 ) ; (ii) un HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO : 8 ) ; y (iii) un HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

43. Un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-H1 comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7) .

44. Un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO : 8 ) .

45. Un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: ) .

46. Un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-H1 comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7) ; una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8) ,- y una secuencia HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO : 9 ) .

47. Un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-L1 comprendiendo la secuencia X1IX3X4X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO:83) , en donde ?? es cualquier aminoácido excepto Asp, X3 es cualquier aminoácido excepto Pro, X4 es cualquier aminoácido excepto Arg, X5 es cualquier aminoácido excepto Ser.

48. Un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-L1 comprendiendo la secuencia X1 IX3X4 5X6X7 8X9Y (SEQ ID NO:83) , en donde Xi es cualquier aminoácido excepto Asp, X3 es cualquier aminoácido excepto Pro, X4 es cualquier aminoácido excepto Arg, X5 es cualquier aminoácido excepto Ser y (i) una secuencia HVR-L2 comprendiendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO:2), o (ii) una secuencia HVR-L3 comprendiendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO: 3) , o tanto (i) y (ii) .

49. El polinucleótido de las reivindicaciones 47 o 48, en donde Xi es Asn, X3 es Ala, x4 es Lys, X5 es Thr, X7 es Ser, Xs es Gly, o cualquier combinación de los mismos .

50. Un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RX2X3X4X5X6X7 8X9R (SEQ ID NO: 85) , en donde X5 es cualquier aminoácido excepto Thr y X6 es cualquier aminoácido excepto Asn.

51. Un polinucleótido que codifica una secuencia HVR-Hl comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID N0:7); una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RX2X3X4X5X6X7X8 9R (SEQ ID NO:85), en donde X5 es cualquier aminoácido excepto Thr y X6 es cualquier aminoácido excepto Asn; y una secuencia HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID N0:9).

52. El polinucleótido de las reivindicaciones 50 o 51, en donde X5 es Ser, X6 es Glu, X8 es Tyr, o cualquier combinación de los mismos.

53. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-Ll comprendiendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID NO:l).

54. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-Ll secuencia comprendiendo la secuencia X1IX3X4X5X6X7X8X9Y (SEQ ID NO:83), en donde Xi es cualquier aminoácido excepto Asp, X3 es cualquier aminoácido excepto Pro, X4 es cualquier aminoácido excepto Arg, X5 es cualquier aminoácido excepto Ser.

55. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-Ll comprendiendo la secuencia NIAKTISGY (SEQ ID N0:1), y (i) una secuencia HVR-L2 comprendiendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID NO: 2) , o (ii) una secuencia HVR-L3 comprendiendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID NO:3), o tanto (i) y (ii).

56. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-Ll comprendiendo la secuencia Xi^XíXs gXvXsXgY (SEQ ID NO:83), en donde Xi es cualquier aminoácido excepto Asp, X3 es cualquier aminoácido excepto Pro, X4 es cualquier aminoácido excepto Arg, X5 es cualquier aminoácido excepto Ser, y (i) una secuencia HVR-L2 comprendiendo la secuencia WGSFLY (SEQ ID N0:2), o (ii) una secuencia HVR-L3 comprendiendo la secuencia HYSSPP (SEQ ID N0:3), o tanto (i) y (ii) .

57. El polipéptido de las reivindicaciones 54 o 56, en donde Xi es Asn, X3 es Ala, X es Lys, X5 es Thr, X7 es Ser, X8 es Gly, o cualquier combinación de los mismos.

58. El polipéptido de las reivindicaciones 54, 55, 56, o 57, en donde dicho polipéptido comprende adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) un HVR-H1 comprendiendo la secuencia NIKDTY (SEQ ID NO : 4 ) ; (ii) un HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPTNGYTR (SEQ ID NO : 5 ) ; y (iii) un HVR-H3 comprendiendo la secuencia WGGDGFYAMD (SEQ ID NO: 6) .

59. El polipéptido de las reivindicaciones 54, 55, 56, o 57, en donde dicho polipéptido comprende adicionalmente una, dos o tres secuencias HVR secuencias seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) un HVR-H1 comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO : 7 ) ; (ii) un HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO : 8 ) ; y (iii) un HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

60. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-H1 comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7).

61. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID NO: 8).

62. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9).

63. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RX2X3X4X5X6X7X8 9R (SEQ ID NO: 85) , en donde X5 es cualquier aminoácido excepto Thr y X6 es cualquier aminoácido excepto Asn.

64. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-H1 comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO: 7); una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RIYPSEGYTR (SEQ ID N0:8); y una secuencia HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO : 9 ) .

65. Un polipéptido que comprende una secuencia HVR-H1 comprendiendo la secuencia NISGTY (SEQ ID NO:7); una secuencia HVR-H2 comprendiendo la secuencia RX2X3X4X5X6X7 8X9R (SEQ ID NO.-85), en donde X5 es cualquier aminoácido excepto Thr and X6 es cualquier aminoácido excepto Asn; y una secuencia HVR-H3 comprendiendo la secuencia WVGVGFYAMD (SEQ ID NO: 9) .

66. El polipéptido de las reivindicaciones 63 o 65, en donde X5 es Ser, X6 es Glu, X8 es Tyr, o cualquier combinación de los mismos.

67. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 38-52.

68. El vector de la reivindicación 67, en donde el vector es un vector de expresión.

69. Una célula hospedera que comprende un vector de las reivindicaciones 67 o 68.

70. La célula hospedera de la reivindicación 69, en donde la célula hospedera es procariótica .

71. La célula hospedera de la reivindicación 69, en donde la célula hospedera es eucariótica.

72. La célula hospedera de la reivindicación 71, en donde la célula hospedera es mamífera.

73. Un método para producir el anticuerpo o f agmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37, dicho método que comprende cultivar una célula hospedera que comprende un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 38-52 y recuperar tal anticuerpo.

74. El método de la reivindicación 73, en donde la célula hospedera es procariótica.

75. El método de la reivindicación 73, en donde la célula hospedera es eucariótica.

76. El método de la reivindicación 75, en donde la célula hospedera es mamífera.

77. Un método de tratamiento de una tumor en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar a dicho sujeto el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37, en donde dicha administración es por un tiempo y por una cantidad suficientes para tratar o prevenir dicho tumor en dicho sujeto.

78. El método de la reivindicación 77, en donde dicho tumor es un tumor colorectal, un tumor de seno, un tumor de pulmón, un célula carcinoma renal, un glioma, un glioblastoma, o un cáncer de ovario.

79. El método de la reivindicación 77, que comprende adicionalmente adminsitrar a dicho sujeto una terapia adicional anti-cáncer .

80. El método de la reivindicación 79, en donde dicha terapia adicional anti-cáncer comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente anti-angiogénico, un agente inmunosupresivo, un pro-fármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoesteroide, un anti-emético, una vacuna contra el cáncer, un analgésico, o un agente inhibidor del crecimiento.

81. El método de la reivindicación 79, en donde dicha terapia adicional anti-cáncer es administrada antes de o subsecuentemente a la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37.

82. El método de la reivindicación 79, en donde dicha terapia adicional anti-cáncer es administrada concurrentemente con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37.

83. Un método de tratamiento de una enfermedad auto-inmune en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar a dicho sujeto el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37, en donde dicha administración es por un tiempo y por una cantidad suficientes para tratar o prevenir dicha enfermedad auto- inmune en dicho sujeto.

84. Un método de tratamiento de una enfermedad no maligna que involucra la activación anormal de HER2 en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar a dicho sujeto el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-37, en donde dicha administración es por un tiempo y por una cantidad suficientes para tratar o prevenir dicha enfermedad no maligna en dicho sujeto.

85. El método de las reivindicaciones 77, 83, o 84, en donde el sujeto es un humano.