MX2011002037A - Sistema de electrodo para medir una concentracion del analito bajo condiciones in vivo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un sistema de electrodo para medir la concentración de un analito bajo condiciones in-vivo, que comprende un electrodo contador (2) que tiene un conductor eléctrico (2a), un electrodo de trabajo (1) que tiene un conductor eléctrico (la) en el cual se arregla una capa enzimática (5) que contiene moléculas enzimáticas inmovilizados para conversión catalítica del analito, y una barrera de difusión que reduce la difusión del analito a partir de fluido corporal circundante el sistema de electrodo para disminuir las moléculas enzimáticas. La presente invención proporciona la capa enzimática (5) en la forma de campos múltiples que se arreglan en el conductor (la) del electrodo de trabajo (1) a una distancia entre sí.

Description

SISTEMA DE ELECTRODO PARA MEDIR UNA CONCENTRACION DEL ANALITO BAJO CONDICIONES IN VIVO Campo de la Invención La invención se refiere a un sistema de electrodo para medir- una concentración del analito bajo condiciones in vivo que tienen las características especificadas en el preámbulo de la reivindicación 1. Un sistema de electrodo de este tipo se conoce a partir del documento WO 2007/147475.

Antecedentes de la Invención Los sensores con sistemas de electrodos implantables o insertables facilitan las mediciones para hacerse de analitos fisiológicamente significantes tales como, por ejemplo, lactato o glucosa en un tejido del cuerpo del paciente. Los electrodos de trabajo de sistemas de este tipo tienen capas enzimáticas eléctricamente conductivas en las cuales las moléculas enzimáticas se unen que liberan carga de portadores por conversión catalítica de moléculas del analito. En este proceso, se genera una corriente eléctrica ya midiendo la señal cuya amplitud se correlaciona con la concentración del analito.

La conductividad eléctrica de capas buenas de enzimas debe ser tan alta como sea posible para permitir carga de portadores que son liberadas para ser detectadas como medición de señal ya completamente como sea posible, Ref.: 216573 deben ser suficientemente permeables al agua para permitir a las moléculas del analito difundirse de fluido corporal acuoso, usualmente este será fluido intersticial o sangre, en la capa enzimática, y finalmente debe enlazar las moléculas enzimáticas contenidas ahí tan completamente posible de manera que estas no puedan escapar en el tejido corporal circundante .

Las capas de enzima adecuada pueden ser elaboradas, por ejemplo, de negro de platino, las cuales pueden ser impregnadas con solución enzimática y muestran buena permeabilidad al agua debido a su estructura similar a esponja, o de partículas eléctricamente conductivas, por ejemplo partículas de metal o carbono, y un agente enlazante. Capas de enzima de este tipo son usualmente frágiles. Por esta razón, la capa enzimática del electrodo de trabajo de sensores conocidos cubre solamente un área muy pequeña, usualmente solamente una fracción de un milímetro cuadrado. Un ejemplo de este es el sistema de electrodo conocido del documento US 4,655,880, en el cual el conductor del electrodo de trabajo se extiende sobre aproximadamente 200 ym. Para incrementar la densidad de corriente local, este conductor se proporciona con revestimiento eléctricamente aislante en el cual aperturas pequeñas con un diámetro de aproximadamente 10 µp? son mordentadas antes de que el conductor se cubra sobre su longitud completa con una pasta que contiene la enzima para formar una capa enzimática.

Sin embargo, debido a la investigación y desarrollo extensivo, sistemas de electrodos conocidos son susceptibles a interferencia y se asocian con una desventaja en que pueden ser usados para determinar la concentración del analito solamente a exactitud y conflabilidad inferior que es factible usar un análisis convencional ex vivo.

Para incrementar la exactitud de medición, el documento US 2005/0059871 Al propone medir la concentración del analito de interés usando electrodos de trabajo múltiples simultáneamente y estadísticamente analizar las mediciones de este modo obtenidas. Como una medida adicional, se propone usar además sensores para determinar otras concentraciones de analito o parámetros fisiológicos y probar la plausibilidad de re-ajustes individuales con base en la concentración de diferentes analitos de este modo obtenidos.

Sin embargo, el uso de un gran número de electrodos de trabajo no solamente incrementa la utilización de recursos de equipo, sino también conduce a un problema si señales de medición inconsistentes de electrodos de trabajo individuales no hacen claro cuál de los diferentes valores de medición refleja exactamente la concentración del analito en el cuerpo del paciente.

Breve Descripción de la Invención Es por lo tanto el objeto de la invención diseñar una forma de medir concentraciones de analito en cuerpo humano o animal más confiablemente y más exactamente.

Este objeto se cubre por un sistema de electrodo para medición in vivo de la concentración del analito que tiene las características especificadas en la reivindicación 1. Desarrollos ventajosos de la invención son la materia objeto de las sub-reivindicaciones .

La invención proporciona la capa enzimática del electrodo de trabajo en la forma de campos múltiples que son arreglados a una distancia de entre" sí en el conductor del electrodo de trabajo. Preferiblemente, al menos dos de estos campos son espaciados al menos 3 milímetros, preferiblemente al menos 5 milímetros, distantes de entre sí. Por ejemplo, una serie de campos múltiples puede ser proporcionada, por medio de lo cual la distancia entre el primero y último campo de la serie es más grande de 5 milímetros. Los campos individuales de un electrodo de trabajo de conformidad con la invención básicamente forman una serie de electrodos de trabajo que son arregladas en serie. Entre estos campos, el conductor del electrodo de trabajo puede ser cubierto por una capa aislante. Arreglando los campos de la capa enzimática en la parte superior de aberturas de una capa eléctricamente aislante se puede mejorar la relación señal a ruido.

La invención permite mediciones significantemente más confiables de una concentración del analito en un tejido del cuerpo del paciente a realizar. Proporcionando la capa enzimática de un electrodo de trabajo en la forma de campos individuales, por ejemplo, sobre una distancia de al menos 3 milímetros, preferiblemente al menos 5 milímetros, la concentración del analito se puede medir en un volumen correspondientemente grande. Interferir influencias que afectan solamente un elemento de volumen pequeño con un diámetro de aproximadamente 0.1 mm es por lo tanto significante con un sistema de electrodo de conformidad con la invención. De manera sorprendente, una fracción principal de los problemas observados durante las mediciones in vivo usando sensores conocidos parece basarse simplemente en el hecho de que, debido al tamaño pequeño de la capa enzimática, la concentración del analito medida en un elemento de volumen que fue así pequeño que no fue a menudo representativa por el resto del cuerpo del paciente debido a efectos locales temporales .

Para hinchamiento de la capa enzimática sobre una distancia larga de pocos milímetros y más, el electrodo de trabajo debe ser flexible de manera que puede ajustar su forma a movimientos del cuerpo. Sin embargo, las propiedades relativamente frágiles del material de la capa enzimática conductiva conocida parecen proporcionar un electrodo de trabajo flexible imposible de hacer. Sin embargo, la medición de conformidad con la invención, es decir, diseñar la capa enzimática en la forma de campos múltiples que son arreglados a una distancia de entre sí sobre el conductor del electrodo de trabajo, permite al electrodo de trabajo ser doblable sin la exfoliación de la capa enzimática debido a las propiedades frágiles del material de capa enzimática.

La causa de las mediciones con electrodos de trabajo convencionales cuya área efectiva, es decir, la capa enzimática, se extiende sobre menos de 0.2 milímetros cuadrados, para ser errónea se presume por ser que los movimientos de un paciente pueden temporalmente prevenir el intercambio de fluido en un elemento de volumen pequeño, por ejemplo por células que son pasadas contra el electrodo de trabajo y fluido intersticial siendo desplazado o por vasos capilares siendo comprimidos y con ello obstruidos. Presumiblemente, esto puede conducir a la concentración del analito en el elemento de volumen correspondiente en el entorno inmediato del electrodo de trabajo no siendo representativo del resto del cuerpo del paciente. Estos elementos de volumen, en los cuales un intercambio de fluido es temporalmente prevenido, parecen ser muy pequeños, aunque, y usualmente tienen un diámetro de menos de.1 mm. Es probable que la consistencia elástica y suave del tejido corporal permita a las fuerzas relajarse sobre distancias muy cortas y el intercambio del fluido corporal es por lo tanto adversamente afectado solamente en elementos de volumen que son estos pequeños en tamaño. Teniendo al menos algunos de los campos que forman la capa enzimática en un sistema de electrodo de conformidad con la invención siendo distribuido sobre una distancia sustancial, por ejemplo al menos 5 mm distante de entre sí, preferiblemente al menos 1 cm distante de entre sí, por lo tanto proporciona solamente una parte pequeña y usualmente insignificante, del electrodo de trabajo siendo adversamente afectado aún en el caso más desfavorable.

En este contexto, la distancia entre dos campos de la capa enzimática de un electrodo de trabajo de conformidad con la invención se mide desde el borde de un campo al otro borde del campo que lo enfrenta.

En este contexto, la distancia entre los campos adyacentes se prefiere por ser al menos 0.3 milímetros, en particular al menos 0.5 milímetros. Los campos individuales cada uno preferiblemente se extiende menos de dos milímetros, preferiblemente menos de un milímetro, en particular menos de 0.6 milímetros, en dos direcciones que son perpendiculares entre sí. Los campos pueden, por ejemplo, ser círculos con un diámetro de menos de 1 milímetro o rectángulos con una longitud de borde de menos de 1 milímetro. Preferiblemente, los campos son arreglados en una fila en el conductor del electrodo de trabajo. Sin embargo, también es factible, por ejemplo arreglar los campos en varias filas y columnas en un conductor circular o rectangular. El número de campos puede ser seleccionado virtualmente libre. Sin embargo, el electrodo de trabajo preferiblemente tiene al menos 5 campos.

El electrodo de trabajo de un sistema de electrodo de conformidad con la invención se proporciona con una barrera de difusión que desacelera la difusión del analito a partir del fluido corporal circundante del sistema de electrodo a moléculas enzimáticas que son inmovilizadas en la capa enzimática. La barrera de difusión puede, por ejemplo, ser una capa de revestimiento que reviste la capa enzimática. Sin embargo, es factible solo así también que las partículas que inhiben la difusión son incorporadas en la capa enzimática para servir como barrera de difusión. Por ejemplo, los poros de la capa enzimática pueden ser llenados con un polímero a través del cual las moléculas del analito pueden difundirse solamente lentamente. Tal polímero debe ser hidrofílico y tener una absorción de agua rápida. Una barrera de difusión puede ventajosamente ser usada para reducir el consumo de las moléculas del analito en el electrodo de trabajo. Si los movimientos del paciente interfieren temporalmente con el intercambio de fluido corporal en un entorno de un campo de capa enzimática del electrodo de trabajo, que tiene una velocidad de conversión baja de moléculas del analito que contribuyen a reducir el impacto de tal interferencia. Cuanto menor sea el consumo del analito, más tiempo toma para que ocurran los efectos de depleción, es decir, para la concentración del analito en el área correspondiente a la caída como una consecuencia de las mediciones que se realizaron.

Un desarrollo ventajoso de la invención proporciona el electrodo de trabajo que tiene un espaciador que es arreglado sobre la capa enzimática, como se observa del conductor, y proporciona una distancia mínima entre la capa enzimática y el -tejido corporal que rodea las células. El espaciador forma un reservorio para moléculas del analito. Por este medio, el impacto de una alteración temporal del intercambio de fluido en los alrededores del electrodo de trabajo se puede reducir además. El espaciador puede, por ejemplo, ser una capa hecha de un polímero biocompatible que facilita la permeación del analito. Un espaciador puede ser usado para crear un volumen amortiguador de analito a partir del cual los campos de enzima del electrodo de trabajo son proporcionados. En esta forma se puede lograr ventajosamente que efectos adversos no notables en la señal de medición ocurran aún en la presencia de alteración sustancial del intercambio de fluido en el entorno de un campo de capa enzimática por un periodo de media hora. El espaciador puede solo ser también proporcionado, por ejemplo, como una membrana porosa, por ejemplo una membrana de diálisis, o una malla. El espaciador preferiblemente es de 3 micrómetros hasta 30 micrómetros de espesor. El espaciador puede ser arreglado en una capa de cubierta que inhibe la difusión. Sin embargo, es factible solo así también para arreglar el espaciador directamente en la capa enzimática. En este contexto, el espaciador también puede actuar como una barrera de difusión y reducir descendentemente la difusión de moléculas del analito a la capa enzimática.

El espaciador preferiblemente cubre el electrodo de trabajo y el electrodo contador y si uno está presente -el electrodo de referencia en la forma de una capa continua. El espaciador preferiblemente cubre la superficie completa implantada del sustrato. Si el espaciador se hace de un material biocompatible , el tejido responsable a ser implantado puede ser reducido. Independiente de esto, también se prefiere que el espaciador sea arreglado en una capa de cubierta que inhibe la difusión y sea más hidrofílico que la capa de cubierta.

Como el conductor eléctrico del electrodo contador de un sistema de electrodo de conformidad con la invención, el conductor eléctrico del electrodo de trabajo es preferiblemente diseñado como una trayectoria de conductor en un sustrato, por ejemplo una trayectoria de conductor hecha de metal o grafito o una placa de plástico. Sin embargo, es factible solo así también diseñar el conductor en la forma de alambres. Los campos de capa enzimática pueden ser arreglados en el conductor que es diseñado en la forma de un alambre, por ejemplo, en la forma de segmentos en forma de anillo. En el caso de segmentos en forma de anillo en un alambre, el objeto explicado anteriormente, es decir que los campos individuales cada uno preferiblemente se extiende menos de 2 milímetros, más preferiblemente menos de un milímetro, en particular menos de 0.6 milímetros, en dos direcciones que son perpendiculares entre sí, se debe entender que la amplitud del anillo y su diámetro son las dos direcciones que son perpendiculares entre sí.

El uso de alambres metálicos y trayectorias conductoras en un sustrato permite diseñar un sensor flexible que puede ser doblado por 90 grados y más adentro del cuerpo de un paciente sin romperse.

Es común para trayectorias conductoras extenderse en un ángulo lateral del sustrato solamente. Sin embargo, en principio es factible solo así también para un conductor único extenderse en lados opuestos del sustrato, por ejemplo a través de un agujero único o alrededor de un borde lateral .

Otro desarrollo ventajoso de la invención proporciona la enzima para interactuar en la capa enzimática con un mediador redox catalítico que reduce o previene una dependencia de oxígeno de la conversión catalítica del analito. Los mediadores redox catalíticos de este tipo son algunas veces llamados electrocatalizadores puesto que favorecen la transferencia de electrones a componentes conductivos del electrodo de trabajo, por ejemplo, partículas de grafito en la capa enzimática. Por ejemplo, dióxido de manganeso, en la forma de polirosulita, u otros óxidos de metales los cuales oxidan peróxido de hidrógeno catalíticamente y, en el proceso, se puede usar transferencia de electrones a componentes conductivos del electrodo de trabajo como mediadores redox catalíticos. Un mediador redox catalítico en la forma de un óxido de metal puede ventajosamente reducir el potencial del electrodo de trabajo por más de 100 milivolts de manera que la influencia de sustancias de interferencia, por ejemplo ascorbato o ácido úrico, en la señal de medición, se reduce significantemente. En el caso de enzimas que oxidan moléculas del analito y generan peróxido de hidrógeno en el proceso, el uso de un mediador redox catalítico de este tipo permite contrarrestar la depleción de oxígeno en los alrededores del electrodo de trabajo y por lo tanto proporciona la velocidad de conversión dependiente solamente de la concentración del analito, pero no en la concentración de oxígeno, sobre un amplio intervalo de concentraciones.

Compuestos organometálicos, por ejemplo, cobalto-ftalocianina, son también adecuados como mediadores redox catalíticos que degradan peróxido de hidrógeno. El mediador redox catalítico puede ser unido covalentemente a la molécula enzimática o ser incorporado en la capa enzimática, por ejemplo en la forma de partículas separadas.

Sin embargo, también es factible para el mediador redox catalítico efectuar una transferencia directa de electro. Esto significa que, tener un mediador redox catalítico que se une covalentemente a la enzima se puede usar para efectuar una oxidación de moléculas del analito y una transferencia del electrón al electrodo de trabajo sin la etapa intermediaria de generar peróxido de hidrógeno. En una transferencia directa de electrón, un electrón de un grupo prostético de la enzima se transfiere directamente al mediador redox catalítico y de ahí a un componente conductivo del electrodo de trabajo, por ejemplo grafito o partículas de metal en la capa enzimática.

Se puede efectuar una transferencia directa de electrón, por ejemplo, con enzimas tales como deshidrogenasas que tienen pirroloquinolinaquinona (PQQ) como el grupo prostético. En el caso de glucosa deshidrogenasa (GlucDH) de Acinetobacter calcoaceticus , la PQQ es transferida a un estado reducido por la enzima durante la oxidación de glucosa. Este grupo prostético puede ser covalentemente unido directamente a un conductor por medio de nanopartículas de oro para facilitar una transferencia directa de electrón a partir de la PQQ reducida al conductor. Aparentemente, el oxígeno no reacciona con PQQ reducida, lo cual significa que no compite con la transferencia de electrón. Otra forma de transferir los electrones de PQQ reducida se basa en la insignia de que la PQQ misma puede estar presente en etapas de oxidación múltiples.

PQQ + e" + H+ PQQH PQQH + e" + H+ <? PQQH2 y puede por lo tanto ser usada como mediador redox catalítico. Por consiguiente, moléculas de PQQ adicionales pueden ser unidas covalentemente en la enzima GlucDH y servir para recibir electrones de un paquete catalíticamente activo de la proteína, es decir, del grupo prostético de PQQ presente ahí. Otra opción se basa en una variante de GlucDH (de Burkholderia cepacia) , la cual tiene flavina-adenina-dinucleótido (FAD) como el grupo prostético, y tiene la proteína del citocromo C en otra sub-unidad, que puede transferir electrones de FADH2.

Un sistema de electrodo de conformidad con la invención puede tener, además, un electrodo de referencia. El electrodo de referencia puede suministrar un potencial de referencia para el electrodo de referencia que es definido, por ejemplo, por el sistema redox plata/cloruro de plata. Sin embargo, un sistema de electrodo de conformidad con la invención puede además tener electrodos, por ejemplo electrodos de trabajo adicionales, en particular electrodos de trabajo con diferentes sensibilidades de medición como se describe en el documento US 2007/0151868 Al.

Combinado con un potenciostato que está conectado con el sistema de electrodo y un amplificador para amplificación de señales de medición, un sistema de electrodo de conformidad con la invención forma un sensor. Preferiblemente, el amplificador y el potenciostato son arreglados en un tablero de circuito impreso que porta los conductores del electrodo contador y electrodo de trabajo. Los electrodos pueden ser arreglados en un sustrato, por ejemplo, en la forma de una placa de plástico cuyo un extremo está unido al tablero del circuito. Es factible solo así también integrar un tablero de circuito impreso en el substrato sobre el cual los electrodos son arreglados. El potenciostato y el pre-amplificador pueden, por ejemplo, ser arreglados en una placa de plástico flexible la cual simultáneamente forma un tablero de circuito impreso y un sustrato para trayectorias conductoras del sistema de electrodo .

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un sistema de electrodo para medir la concentración de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un contador electrodo que tiene un conductor eléctrico, un electrodo de trabajo que tiene un conductor eléctrico sobre el cual se arregla una capa enzimática que contiene moléculas enzimáticas inmovilizadas para conversión catalítica del analito, y una barrera de difusión que reduce la difusión del analito del fluido corporal que rodea el sistema de electrodo a las moléculas enzimáticas, en donde la barrera de difusión es una capa que reviste la capa enzimática, caracterizada porque la barrera de difusión se hace de una mezcla de al menos dos polímeros. La capa enzimática de tal sistema de electrodo es preferiblemente -pero no necesariamente-diseñada en la forma de campos múltiples.

La barrera de difusión de tal sistema de electrodo es una solución sólida de al menos dos diferentes polímeros, preferiblemente de acrilatos. Por lo tanto, la barrera de difusión puede combinar propiedades' favorables de diferentes polímeros con respecto a permeabilidad, absorción de agua, hinchamiento y flexibilidad. Uno o todos los polímeros pueden ser un acrilato. Preferiblemente uno o todos los polímeros es un copolímero, especialmente un copolímero de hidroxietilmetacrilato . Un copolímero es un polímero hecho por polimerización de al menos dos diferentes monómeros . Se ha encontrado que el hidroxietilmetacrilato tiene una absorción de agua muy favorable combinada con hinchamiento menor .

Es ventajoso usar una mezcla de polímeros los cuales tienen una temperatura de transición vitrea diferente. Por ejemplo, un polímero puede tener una temperatura de transición vitrea de menos de 90°C, especialmente menos de 70°C, mientras el otro polímero tiene una temperatura de transición vitrea de más de 100°C, especialmente más de 110°C. La temperatura de transición vitrea se mide por calorimetría de exploración diferencial usando una tasa de calentamiento de 10 K por minuto.

Por ejemplo la barrera de difusión puede ser una mezcla de un copolímero de metil-metacrilato e hidroxetilmetacrilato con un copolímero de butilmetacrilato e hidroxetilmetacrilato . Tal mezcla puede por ejemplo comprender 5 hasta 50% en peso de un copolímero de butilmetacrilato y hidroxetilmetacrilato para lograr buena flexibilidad de la barrera de difusión.

Breve Descripción de las Figuras Detalles adicionales y ventajas de la invención se explican con base en modalidades ejemplares haciendo referencia a los dibujos adjuntos. En las figuras: La Figura 1: muestra una modalidad ejemplar de un sistema de electrodo de conformidad con la invención; La Figura 2 : muestra una vista detallada de la Figura 1 ; La Figura 3: muestra otra vista detallada de la Figura 1 ; La Figura 4 : muestra una sección a lo largo de la línea de sección CC, de la Figura 2 ; La Figura 5: muestra curvas funcionales in vitro del sistema de electrodo mostrado en la Figura 1 que tiene una diferente capa de cubierta; La Figura 6: muestra ejemplos de mediciones in vivo de sistemas de electrodo de conformidad con la invención; y La Figura 7: muestra mediciones in vitro comparativas de un sistema de electrodo a varias concentraciones de oxígeno.

Descripción Detallada de la Invención La Figura 1 muestra una modalidad ejemplar de un sistema de electrodo para inserción en el tejido corporal de un humano o animal, por ejemplo en cutis o tejido graso subcutáneo. Una amplificación de la vista detallada A se muestra se muestra en la Figura 2, una amplificación de la vista detallada B se muestra en la Figura 3. La Figura 4 muestra una vista seccional correspondiente a lo largo de la línea de sección CC, de la Figura 2.

El sistema de electrodo mostrado tiene un electrodo de trabajo 1, un electrodo contador 2, y un electrodo de referencia 3. Los conductores eléctricos de los electrodos la, 2a, 3a son arreglados en la forma de trayectorias conductoras metálicas, preferiblemente hechas de paladio u oro, en un sustrato 4. En la modalidad mostrada, el sustrato 4 es una placa de plástico flexible, por ejemplo hecha de poliéster. El sustrato 4 es menos de 0.5 mm de espesor, por ejemplo 100 a 300 micrómetros, y es por lo tanto fácil de doblar de manera que puede adaptarse a movimientos del tejido corporal circundante después de su inserción. El substrato 4 tiene un eje estrecho para inserción en el tejido corporal de un paciente y una cabeza amplia para conexión a un sistema electrónico que es arreglado hacia afuera del cuerpo. El eje del sustrato 4 preferiblemente es al menos 1 cm de longitud, en particular 2 cm a 5 cm.

En la modalidad ejemplar mostrada, una parte de la instalación de medición, es decir la cabeza del sustrato, se proyecta del cuerpo de un paciente durante el uso. Alternativamente, es factible solo así también, sin embargo, implantar la instalación y transmitir datos de medición en una forma inalámbrica a un receptor que se arregla hacia afuera del cuerpo.

El electrodo de trabajo 1 porta una capa enzimática 5 que contiene las moléculas enzimáticas inmovilizadas para conversión catalítica del analito. La capa enzimática 5 puede ser aplicada, por ejemplo, en la forma de una pasta de curado de partículas de carbono, un agente enlazante polimérico y moléculas enzimáticas. Detalles de la producción de una capa enzimática 5 de este tipo se describen, por ejemplo, en el documento WO 2007/147475, referencia al cual se hace en este contexto. El analito a ser medido puede, por ejemplo, ser glucosa, lactato u otras moléculas médicamente significantes. Usualmente, se usa una oxidasa se usa como enzima, por ejemplo una glucosa oxidasa o lactato oxidasa, o una deshidrogenasa, por ejemplo, una glucosa deshidrogenasa .

En la modalidad ejemplar mostrada, la capa enzimática 5 no se aplica continuamente sobre el conductor la del electrodo de trabajo 1, sino preferiblemente en la forma de campos individuales que son arreglados a una distancia de entre sí. Aunque la capa enzimática 5 es frágil, estos medios permiten que el sistema de electrodo se pueda doblar sin la capa enzimática 5 desprendida. El sistema de electrodo puede por lo tanto ser doblado por más de 90° sin rompimiento de manera que pueda adaptarse a movimientos corporales después de su inserción.

Los campos individuales de la capa enzimática 5 en la modalidad ejemplar mostrada son arreglados en serie, con ello existe una distancia entre el primero y último campo de esta serie de más de 1 cm. Existe una distancia de al menos 0.3 mm, en particular más de 0.5 mm, entre campos vecinos cada uno, con ello la distancia está siendo medida desde el borde de un campo al borde del otro campo. Los campos individuales cada uno se extiende 0.2 mm hasta 0.6mm, por ejemplo 0.2 mm hasta 0.4 mm en dos direcciones que son perpendiculares entre sí. La forma de los campos puede, por ejemplo, ser circular o cuadrada. El área total de todos los campos tomados juntos puede ser elegida virtualmente de manera libre. En general, un área total de menos de 1 milímetro cuadrado es suficiente. El área total en la modalidad ejemplar mostrada es aproximadamente 0.4 hasta 0.6 milímetros cuadrados.

El conductor la del electrodo de trabajo 1 tiene sitios estrechos entre los campos de capa enzimática que son vistos particularmente bien en la Figura 2. El conductor 2a del electrodo contador 2 tiene un contorno que sigue el curso del conductor la del electrodo de trabajo 1. Estos medios resultan en un arreglo interbloqueado o intercalante de electrodo de trabajo 1 y electrodo contador 2 con trayectorias de corriente ventajosamente cortas y baja densidad de corriente. El conductor la del electrodo de trabajo 1 de la modalidad ejemplar mostrada es diseñado para ser relativamente estrecho y tiene una amplitud de menos de 1 mm. En la modalidad ejemplar mostrada, el conductor la tiene una amplitud de menos de 0.6 mm, es decir aproximadamente 0.3 mm hasta 0.5 mm, en sus sitios amplios que son cubiertos por campos de la capa enzimática 5. En los sitios estrechos interyacentes los conductores la y 2a tienen una amplitud de menos de 0.3 mm, es decir 0.05 mm hasta 0.2 mm. Sin embargo, un arreglo intercalante de los conductores no es obligatorio. En principio, los conductores la, 2a pueden solo así también ser diseñados para ser lineales y tener amplitud constante.

Para incrementar su superficie efectiva, el electrodo contador 2 puede ser proporcionado con una capa porosa eléctricamente conductiva 6 que se sitúa en la forma de campos individuales en el conductor 2a del electrodo contador 2. Del mismo modo la capa enzimática 5 del electrodo de trabajo 1, esta capa 6 puede ser aplicada en la forma de una pasta de curado de partículas de carbono y un agente enlazante polimérico. Los campos de la capa 6 tienen preferiblemente las mismas dimensiones como los campos de la capa enzimática 5, aunque esto no es obligatorio. Sin embargo, las mediciones para incrementar la superficie del electrodo contador pueden solo así también ser no percibidos y el electrodo contador 2 puede solo así también ser diseñado para ser una trayectoria conductora lineal sin revestimientos de cualquier tipo.

El electrodo de referencia 3 es arreglado entre el conductor la del electrodo de trabajo 1 y el conductor 2a del electrodo contador 2. El electrodo de referencia mostrado en la Figura 3 consiste de un conductor 3a en el cual se arregla un campo 3b de pasta conductiva de plata/cloruro de plata.

La Figura 4 muestra una vista en sección esquemática a lo largo de la línea de sección CC, de la Figura 2. La línea de sección CC, se extiende a través de uno de los campos de enzima 5 del electrodo de trabajo 1 y entre los campos de la capa conductiva 6 del electrodo contador 2. Entre los campos de la capa enzimática 5, el conductor la del electrodo de trabajo 1 puede ser cubierto con una capa eléctricamente aislante 7, como el conductor 2a del electrodo contador 2 entre los campos de las capas conductivas 6, para prevenir reacciones de interferencia las cuales pueden de otro modo ser catalizadas por el metal de las trayectorias conductoras la, 2a. Los campos de la capa enzimática 5 son por lo tanto situados en aberturas de la capa aislante 7. Del mismo modo, los campos de la capa conductiva 6 del electrodo contador 2 pueden también ser colocados en la parte superior de aberturas de la capa aislante 7.

La capa enzimática 5 está cubierta por una capa de cubierta 8 la cual presenta una resistencia de difusión al analito a ser medido y por lo tanto actúa como una barrera de difusión. La capa de cubierta 8 puede, por ejemplo, consistir de poliuretano, un acrilato, en particular un copolímero de metilmetacrilato e hidroxetilmetacrilato, u otro polímero que muestra menor hinchamiento pero rápida absorción de agua. La capa de cubierta 8 puede ventajosamente ser elaborada de una mezcla de al menos dos diferentes acrilatos los cuales pueden ser cada uno un copolímero. Resultados especialmente favorables se pueden lograr mezclando un copolímero de metilmetacrilato e hidroxetilmetacrilato con un copolímero de butilmetacrilato e hidroxetilmetacrilato.

Un espesor favorable de la capa de cubierta 8, es por ejemplo, 3 hasta 30 micrómetros. Debido a su resistencia a la difusión, la capa de cubierta 8 provoca que menos moléculas del analito alcancen la capa enzimática 5 por unidad de tiempo. Por lo tanto, la capa de cubierta 8 reduce el índice al cual las moléculas del analito se convierten, y por lo tanto contrarresta una depleción de la concentración del analito.

La capa de cubierta 8 se extiende continuamente esencialmente sobre el área completa del conductor la del electrodo de trabajo 1. En la capa de cubierta 8, una membrana compatible se arregla como espaciador 9 que establece una distancia mínima entre la capa enzimática 5 y las células del tejido corporal circundante. Esto significa que ventajosamente genera un reservorio para moléculas del analito a partir del cual las moléculas del analito pueden llegar al campo de la capa enzimática 5 correspondiente en caso de una alteración temporal del intercambio de fluido en la cercanía de un campo de capa enzimática 5. Si el intercambio de fluido corporal en la cercanía del sistema de electrodo es temporalmente limitado o aún prevenido, las moléculas del analito almacenadas en el espaciador 9 mantienen la difusión de la capa enzimática 5 del electrodo de trabajo 1 en donde se convierten. El espaciador 9 por lo tanto provoca una depleción notable de la concentración del analito y ocurre una falsificación correspondiente de los resultados medidos solamente después de un periodo significativamente prolongado de tiempo. En la modalidad ejemplar mostrada, la membrana que forma el espaciador 9 también cubre el electrodo contador 2 y el electrodo de referencia 3.

La membrana del espaciador 9 puede, por ejemplo, ser una membrana de diálisis. En este contexto, una membrana de diálisis se entenderá una membrana que es impermeable para moléculas más grandes que un tamaño máximo. La membrana de diálisis se puede prefabricar en un proceso de manufacturación separado y puede después ser aplicada durante la fabricación del sistema de electrodo. El tamaño máximo de las moléculas al cual la membrana de diálisis es permeable se selecciona de forma que las moléculas del analito pueden pasar, mientras las moléculas más grandes son retenidas.

Alternativamente, en lugar de una membrana de diálisis, se hace un revestimiento de un polímero que es muy permeable para el analito y agua, por ejemplo a base de poliuretano, puede ser aplicado sobre el sistema de electrodo como membrana espaciadora 9.

La capa enzimática 5 puede contener partículas de óxido de metal, preferiblemente partículas de dióxido de manganeso, como mediador redox catalítico. El dióxido de manganeso catalíticamente convierte peróxido de hidrógeno que es formado, por ejemplo, por oxidación enzimática de glucosa y otros biotinilados . Durante la degradación de peróxido de hidrógeno, las partículas de dióxido de manganeso transfieren electrones a componentes conductivos del electrodo de trabajo 1, por ejemplo a partículas de grafito en la capa enzimática 5. La degradación catalítica de peróxido de hidrógeno contrarresta cualquier disminución de la concentración de oxígeno en la capa enzimática 5 para no ser limitada por la concentración de oxígeno local . El uso del mediador redox catalítico por lo tanto contrarresta una falsificación del resultado medido por la concentración de oxígeno siendo bajo. Otra ventaja de un mediador redox catalítico es que previene la generación de concentraciones de células dañadas de peróxido de hidrógeno.

La figura 5 muestra curvas funcionales, medidas bajo condiciones in vivo, del sistema de electrodo descrito anteriormente que tiene diferentes capas de revestimiento 8. La resistencia medida de la corriente, en nA, es trazada como una función de la concentración de glucosa, en mg/dl, como curvas funcionales. La curva funcional superior A se mide con un sistema de electrodo cuya membrana revestida 8 hecha de poliuretano hidrofilizado tiene un espesor de cinco micrómetros . Para comparación, se muestra, como curva funcional inferior B, la dependencia de la corriente en la concentración de glucosa por un sistema de electrodo que tiene una membrana de revestimiento 8 que presenta aproximadamente dos veces la resistencia de difusión para moléculas del analito, por ejemplo debido a un espesor correspondientemente grande o hidrof ilización menor. Los sistemas de electrodo de las curvas funcionales en la Figura 5 son operados con un voltaje de polarización de 350 mV.

Los poliuretanos hidrofilizados (HPUs) usados como capas de revestimiento se pueden producir por policondensación de 4 , 4 ' -metilen-bis (ciclohexilisocianato) y mezclas de diol . Los dos componentes de la mezcla diol, los cuales se usan para ajustar el grado de hidrofilización del polímero, son propilen glicol (PEG, PM (pero molecular) = 100 g/mol) y polipropilen glicol (PPG, PM (peso molecular) = 1500 g/mol) . Para la curva funcional A, la capa de revestimiento de HPU 8 se produce en una relación PEG a PPG de 1 a 3. Para la curva funcional B, la capa de revestimiento de HPU 8 se produce a una relación PEG: PPG que corresponde a 1:7. La capa de cubierta 8 es aproximadamente 5 im de espesor en ambos casos.

Para la concentración del analito en las cercanías del sistema de electrodo a ser influenciado en la medida de lo menos posible y por lo tanto ser falsificado no más que un grado menor aún en una perturbación temporal del intercambio de fluido corporal, es ventajoso tener índices de conversión del analito bajo y por lo tanto corrientes de medición bajas. Se pueden obtener buenos resultados con sistemas de electrodo que generan, con un área total de la capa enzimática de 1 mm2 o menor, una corriente de menos que 50 nA, en particular menos de 10 nA a una concentración de glucosa de 180 mg/dl.

Por ejemplo, el sistema de electrodo de la curva funcional B mostrada en la Figura 5 se usa para medir, en el cutis de un cerdo, una corriente de 3 nA a una concentración de glucosa de 180 mg/dl. Las señales de medición que son pequeñas, son difícil para transmitir sobre distancias grandes. Es por lo tanto preferible arreglar un potenciostato y un amplificador en la cercanía inmediata del sistema de electrodo. Un potenciostato 10 y un amplificador 11 pueden, por ejemplo, ser arreglados en una cabeza del sustrato 4, como se muestra en la Figura 1. Es posible del mismo modo que se una el sustrato 4 a un borde de la trayectoria del conductor que porta el potenciostato y amplificador.

La figura 6 muestra mediciones in vivo que se miden en el tejido graso subcutáneo abdominal de un diabético dependiente de insulina usando los dos sistemas de electrodos cuyas curvas funcionales se muestran en la Figura 5 y las cuales, además, se proporcionan con un espaciador. Los dos sistemas de electrodo se implantan a una distancia de aproximadamente 10 cm.

Las señales características de los dos sensores que se implantan simultáneamente muestran que los resultados obtenidos usando sistemas de electrodo de conformidad con la invención son muy consistentes. No existe desviación relevante en la concentración de glucosa local entre los dos sitios de inserción. Los resultados mostrados también documentan que no parece existir desviación temporal en la concentración de glucosa entre sangre (círculos) y tejido (líneas sólidas y punteadas) .

Los valores de corriente eléctrica de los dos sensores se convierten a valores de glucosa calculando usando un índice de muestreo de un valor medido por minuto sin filtrar.

La conversión se realiza con base a valores de azúcar en sangre que se determinan en muestras de fluido corporal bajo condiciones ex vivo.

Para las mediciones in vivo mostradas en la Figura 6, el sistema de electrodo primero tiene una capa de cubierta de poliuretano hidrofílico 8 aplicada a este y después se sumerge en una solución etanólica 12.5% del copolímero de butilmetacrilato (BMA) y 2 -metacriloxietil - fosforilcolina (MPC) (Lipidure CM5206, NOF Corp, Japón), y el revestimiento tiene un espesor de 25 µt? de esta forma generado y después se seca por 12 horas. La densidad actual está virtualmente sin cambio por este espaciador 9 hecho de BMA-MPC: en la ausencia del espaciador 9, el sistema de electrodo de la Figura 5, la curva funcional A, alcanza aproximadamente 40 nA/mm2 a 180 mg/dl, mientras que alcanza 38 nA/mm2 en la presencia de espaciador BMA-MPC. No hay diferencia en la amplitud de corriente que puede ser detectada en todos en el caso del sistema de electrodo de la curva funcional B: 10 nA/mm2 a 180 mg/dl en la presencia, así como en la ausencia del espaciador 9 hecho de BMA-MPC.

El espaciador suprime los efectos de movimientos in vivo en el sensor. Por lo tanto, la fracción de amplitud contribuye a la fluctuación de la señal del sensor en esta modalidad ejemplar, la cual es claramente relacionada a efectos de movimiento, es reducida por el espaciador de 5 a 25% de la altura de señal media de 0.5 hasta 5% de la altura de señal media.

La figura 7 muestra un diagrama en barra de la corriente I medida bajo condiciones in vivo por tres diferentes concentraciones de glucosa g, llamada 0 mg/dl, 180 mg/dl y 360 mg/dl, a dos diferentes concentraciones de oxígeno cada una, llamadas 0.22 mmol/1 (barra de la izquierda en cada caso) y 0.04 mmol/1 (barra de la derecha de los pares de barras mostradas en cada caso) . Se realizan las mediciones por el sistema de electrodo descrito anteriormente, con ello la capa enzimática 5 se construye de forma que se asegura una transferencia directa de electrón. Se usa GlucDH (EC 1.1.99.17) de Acinetobacter calcoaceticus como la enzima. En una primera etapa, moléculas PQQ adicionales son inicialmente unidas covalentemente a GlucDH como mediador redox catalítico, por ejemplo agregando la enzima a cloruro de ácido de PQQ. En una segunda etapa, nanotubos de carbono (NanoLab, Newton, MA, USA; multiparedes CNT, grado de investigación) se agregan a una pasta que contiene grafito para mejorar la conductividad y porosidad, esto entonces se mezcla con la GlucDH modificada por PQQ, y la pasta de electrodo de trabajo de este modo generada se imprime sobre la trayectoria conductora la en un arreglo distribuido y después se cura a 40°C en un vacío por 4h. Temprano, el sistema de electrodo se proporciona con una capa aislante 7, un electrodo de referencia 3, y un electrodo contador 2 que tiene una capa conductiva 6. La enzima no inmovilizada es removida enjuagando con amortiguador de fosfato. La pasta que contiene grafito contiene un agente enlazante polimérico, por ejemplo con base en cloruro de polivinilo.

Una capa de revestimiento 8 hecha de poliuretano hidrofílico (HPU, relación de polietilenglicol : polipropilen glicol = 1:3) se dispensa tres veces sobre la capa enzimática 5 de este modo producida en la forma de una solución etanólica al 2.5%, y se seca a temperatura ambiente por 24 h. El espesor de la capa de revestimiento de este modo producida es de 2 µp\. Para medir la función in vitro, los sistemas de electrodo son operados en solución que mide la glucosa a varias concentraciones de oxígeno a un voltaje de polarización de 200 mV con relación al electrodo de referencia Ag/AgCl. La media y desviación estándar de la corriente de medición se calculan para cada uno de los 4 sensores. La Figura 7 muestra estos valores para una saturación de oxígeno normal de la solución de medición de aproximadamente 0.22 mmol/1 y una concentración de oxígeno marcadamente reducida de 0.04 mmol/1. No se observa influencia relevante o significante de la concentración de oxigeno en la función in vitro del sistema de electrodo con transferencia directa de electrón.

Lista de Números de Referencia 1 Electrodo de trabajo la Conductor eléctrico del electrodo de trabajo 2 Electrodo contador 2a Conductor eléctrico del electrodo contador 3 Electrodo de referencia 3a Conductor eléctrico del electrodo de referencia 3b de la capa de plata/cloruro de plata 4 Sustrato 5 Capa enzimática 6 Capa conductiva 7 Capa aislante 8 Capa de cubierta 9 Espaciador 10 Potenciostato 11 Amplificador Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Sistema de electrodo para medir la concentración de un analito bajo condiciones in vivo, que comprende un electrodo contador que tiene un conductor eléctrico, un electrodo de trabajo que tiene un conductor eléctrico en el cual se arregla una capa enzimática que contiene moléculas enzimáticas inmovilizadas para conversión catalítica del analito, y una barrera de difusión que reduce la difusión del analito del fluido corporal que circunda el sistema de electrodo a las moléculas enzimáticas, caracterizado porque la capa enzimática se diseña en la forma de campos múltiples que son arreglados en el conductor del electrodo de trabajo a una distancia de entre sí.

2. Sistema de electrodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque entre los campos de la capa enzimática el conductor del electrodo de trabajo es revestido por una capa aislante.

3. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos dos de los campos de la capa enzimática son al menos 3 mm, preferiblemente al menos 5 rara, distantes de entre sí.

4. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque existe una distancia de al menos 0.3 mm entre campos vecinos de la capa enzimática.

5. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los campos de la capa enzimática cada uno se extiende menos de 2 mm en dos direcciones que son perpendiculares entre sí.

6. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la barrera de difusión se diseña en la forma de una capa que cubre la capa enzimática.

7. Sistema de electrodo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la barrera de difusión se hace de una mezcla de al menos dos diferentes acrilatos.

8. Sistema de electrodo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque al menos uno de los acrilatos es un copolímero.

9. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la enzima interactúa con un mediador redox catalítico que está contenido en la capa enzimática y reduce o previene una dependencia de oxígeno de la conversión catalítica del analito.

10. Sistema de electrodo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el mediador redox catalítico convierte peróxido de hidrógeno.

11. Sistema de electrodo de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el mediador redox catalítico efectúa una transferencia directa de electrón.

12. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la capa enzimática es cubierta por un espaciador.

13. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el espaciador cubre el electrodo de trabajo y el electrodo contador en la forma de una capa continúa.

14. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el conductor eléctrico del electrodo de trabajo y el conductor eléctrico del electrodo contador son arreglados en un sustrato.

15. Sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el conductor del electrodo de trabajo se estrecha entre los campos de capa enzimática y el conductor del electrodo contador tiene un contorno que sigue el curso del conductor del electrodo de trabajo.

16. Sensor caracterizado porque comprende un sistema de electrodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, un potenciostato conectado al sistema de electrodo, y un amplificador para amplificación de señales de medición del sistema de electrodo.

17. Sensor de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los electrodos del sistema de electrodo son arreglados en un sustrato que porta el potenciostato o se une en un tablero de circuito que porta el potenciostato.