MX2011001503A - Produccion, formulacion, y usos de formulaciones liquidas estables de proteina harpin. - Google Patents

Abstract

Se describe un método para preparar una composición líquida estable que contiene una proteína harpin o polipéptido, un portador líquido, una cantidad efectiva de un agente biológico, y opcionalmente, una cantidad efectiva de uno o ambos de un inhibidor de proteasa y un tensioactivo no iónico. La composición mantiene la actividad de harpin al menos 72 horas. También se describe un método de inducir una respuesta de una planta aplicando una composición a una planta o semilla de la planta.

Description

PRODUCCION, FORMULACION, Y USOS DE FORMULACIONES LIQUIDAS ESTABLES DE PROTEINA HARPIN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la producción, formulación, y uso de formulaciones líquidas estables de proteína harpin.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN I Las plantas han desarrollado una serie compleja de vías i bioquímicas que les permiten reconocer y responder a las ¡ señales del medio ambiente, incluyendo la infección por! patógenos. Hay dos tipos principales de interacciones entre j un patógeno y la planta — compatible e incompatible. Cuando! i un patógeno y una planta son compatibles, generalmente se( presenta la enfermedad. Si un patógeno y una planta son' incompatibles, la planta usualmente es resistente a ese! patógeno en particular. En una interacción incompatible, una| planta restringirá la proliferación de patógenos, causandoj necrosis localizada, o la muerte de los tejidos, en una' I pequeña zona que rodea el sitio de la infección. Esta, reacción de la planta se define como la respuesta de| i hipersensibilidad ( "HR" ) (Kiraly, "Defenses Triggered by the Invader: Hypersensit ivity" , Plant Disease: An Advanced Treatise 5:201-224 J. G. Horsfall y E. B. Cowling, ediciones.; I Academic Press, Nueva York (1980) ; Klement^ Ref.:217359 í i i "Hypersensitivity" , Phytopathogenic Prokaryotes 2:149-177, ' i M.S. Mount y G. H. Lacy, ediciones. Academic Press, Nueva | York (1982)). La muerte celular localizada no sólo contiene 1 al patógeno infectante de la diseminación adicional, sino que j conduce también a una resistencia sistémica que previene las ¦ infecciones posteriores por otros patógenos. Por lo tanto, la ! HR es una forma común de resistencia de la planta a las ; enfermedades causadas por bacterias, hongos, nematodos virus .

I Un conjunto de genes designados como hrp (Respuesta de Hipersensibilidad y Patogenicidad, por sus siglas en inglés) es responsable de la inducción de la HR por la bacteria 1 patogénica, incluyendo, entre otras, Erwinia spp, Pseudomonas j spp, Xanthomonas spp, y Ralstonia spp (Willis y otros, "hrp' I Genes of Phytopathogenic Bacteria," Mol. Plant-Microbei i Interact. 4:132-138 (1991); Bonas, "hrp Genes of| Phytopathogenic Bacteria," pp . 79-98 en: Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol . 192, Bacterial Pathogenesis^ of Plants and Animáis: Molecular and Cellular Mechanisms. J .\ í L. Dangl, edición. Springer- Verlag, Berlín (1994); Alfano otros, "Bacterial Pathogens in Plants: Life Up Against thej Wall," Plant Cell 8:1683-98 (1996)). Típicamente, existen múltiples genes hrp agrupados en un segmento de 30- 40 kb de1 i ADN. La mutación en cualquiera de los genes hrp dará lugar a la pérdida de la patogenicidad bacteriana en las plantas I hospederas y la HR en las plantas no hospederas.

Sobre la base de la caracterización genética y ¡ bioquímica, la función de los genes hrp se puede clasificar ' en tres grupos: (1) genes estructurales que codifican para los inductores de la HR localizados extracelularmente , por ! ejemplo, las harpins (Wei y otros, "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen ¡ Erwinia amylovora" Science 257:85 (1992); He y otros, ! i "Pseudomonas syringae pv. Syringae harpinpES: A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the i Hypersensitive Response in Plants" , Cell 73:1255 (1993);' Arlat y otros, "PopAl, a Protein which Induces ai Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes,' is Secreted Via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum" , ¡ EMBO J. 13:543-53 (1994); Kim y otros, "HrpW of Erwinia¡ amylovora, a New Harpin that Contains a Domain Homologous to| Pectate Lyases of a Distinct Class" , J. Bacteriol . 180:5203-, 10 (1998)); (2) genes de secreción que codifican un aparato! secretor para la exportación de inductores de HR y otras' proteínas del citoplasma bacteriano a la superficie celular o! el espacio extracelular (Van Gijsegem y otros, "Evolutionary1 i Conservation of Pathogenicity Determinante Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria", Trends Microbiol . 1:175-180 (1993); He y otros, "Pseudomonas syringae pv. Syringae harpinpss: A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and I Elicits the Hypersensitive Response in Plants" , Cell 73:1255 ¡ (1993); Wei y otros, "HrpI of Erwinia amylovora Functions in j Secretion of Harpin and is a Member of a New Protein Family" , j J. Bacteriol. 175:7985-67 (1993); Arlat y otros, "PopAl, a ! Protein which Induces a Hypersensitive -Like Response on ¡ Specific Petunia Genotypes, Is Secreted via the Hrp Pathway J of Pseudomonas solanacearum" EMBO J. 13:543-53 (1994); Gal n ¡ i y otros, "Cross-talk Between Bacterial Pathogens and Their j Host Cells", Ann. Rev. Cell Dev. Biol . 12:221-55 (1996); ; Bogdanove y otros, "Erwinia amylovora Secretes Harpin via a j Type III Pathway and Contains a Homolog of yopN of ¡ Yersinia, " J". Bacteriol. 178:1720-30 (1996); Bogdanove otros, "Homology and Functional Similarity of a hrp-linked^ Pathogenicity Operon, dspEF, of Erwinia amylovora and the ; avrE Locus of Pseudomonas syringae Pathovar Tomato" , Proc . , í Nati. Acad. Sci. USA 95:1325-30 (1998)); y (3) genes: reguladores que controlan la expresión de los genes hrp (Wei, .

"Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by: j the Plant Pathogen Erwinia amylovora" Science 257:85 (1992);' I Wei y otros, "hrpL Activates Erwinia amylovora hrp Genes in i Response to Environmental Stimuli", J". Bacteriol. 174:1875-82; (1995); Xiao y otros, "A Single Promoter Sequence Recognized! by a Newly Identified Altérnate Sigma Factor Directs| Expression of Pathogenicity and Host Range Determinants in1 Pseudomonas syringae", J. Bacteriol. 176:3089-91 (1994); KiJ i j I y otros, "The hrpA and hrpC Operons of Erwinia amylovora Encode Components of a Type III Pathway that Secretes Harpin" , J. Bacteriol . 179: 1690-97 (1997); Kim y otros, "HrpW of Erwinia amylovora, a New Harpin that Contains a ¡ Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class" , J. \ Bacteriol. 180:5203-10 (1998); engelnik y otros, "HrpG, A i Key hrp Regulatory Protein of Xanthomonas campestris pv. i Vesicatoria is Homologous to Two Component Response | Regulators", Mol. Plant-Microbe Interact . 9:704-12 (1996)). I Debido a su papel en las interacciones entre plantas y 1 microorganismos, los genes hrp han sido un foco de patogenicidad bacteriana y estudios de defensa de la planta. ¡ Además de la respuesta de defensa local, la HR activa! también el sistema de defensa en las partes no infectadas de! I la misma planta. Esto da lugar a una resistencia sistémicaj general para una infección secundaria denominada Resistencia,1 Sistémica Adquirida ("SAR") (Ross, "Systemic Acquired! Resistance Induced by Localized Virus Infections in Plants,"! i Virology 14:340-58 (1961); Malamy y otros, "Salicylic Acid! and Plant Disease Resistance", Plant J. 2:643-654 (1990)). Laj SAR confiere resistencia de larga duración a la enfermedad' sistémica contra un amplio espectro de patógenos y se asocia¡ con la expresión de un determinado conjunto de genes (Ward y otros, "Coordínate Gene Activity in Response to Agents that Induce Systemic Acquired Resistance", Plant Cell 3:1085-94 i i i (1991)) . La SAR es un componente importante de la resistencia a enfermedades de las plantas, y durante mucho tiempo ha sido de interés debido a que el potencial de inducir la planta a auto-protegerse podría reducir o eliminar la necesidad de pesticidas químicos. La SAR puede ser causada por agentes bióticos (microbios) o abióticos (química) (Gorlach y otros, "Benzothiadiazole , A Novel Class of Inducers of Systemic Acquired Resistance, Activates Gene Expression and Disease Resistance In Wheat", Plant Cell 8:629-43 (1996)) . ! i Históricamente, los patógenos virulentos débiles se usaron i i como un agente de inducción biótico para la SAR. Las | bacterias no-virulentas que promueven el crecimiento de la j planta se reportaron también por ser capaces de inducir la ¡ resistencia de algunas plantas contra diversas enfermedades. ¡ La SAR inducida por agente biótico ha sido objeto del mucha investigación. Con el avance de la biología molecular,! el primer inductor proteico de HR con amplio espectro de¡ huésped se aisló en 1992 a partir de Erwinia amylovora, unaj bacteria patógena que causa el tizón de fuego en la manzana y! la pera. El inductor de HR se denominó "harpin" y ahora se' conoce como harpinEa o HrpNEa. El harpinEa consiste de 403? aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 40 kDaJ El gen que codifica esta proteína, hrpN, está contenido en u I fragmento de 1.3 kb de ADN localizado en el centro del' j agrupamiento de genes hrp . El harpinEa se secreta dentro dei i espacio extracelular y es muy sensible a la digestión con proteinasa .

Desde que harpinEa se aisló de Erwinia amylovora, varias otras harpins o proteínas similares a la harpin se han aislado de otros grupos principales de bacterias patogénicas de plantas. Además de harpinEa, las siguientes proteínas harpin o similares a harpin se aislaron y caracterizaron: HrpN de Erwinia chrysanthemi , Erwinia carotovora (Wei y otros, "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora" , Science 257:85 (1992)), y Erwinia stewartii; HrpZ de Pseudomonas syringae (He y otros, "Pseudomonas syringae pv. Syringae harpinpss: A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants" , Cell 73:1255 (1993)), PopA de Ralstonia solanacearum (Arlat y otros, "PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive -Like! Response on Specific Petunia Genotypes, Is Secreted via the, Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum" , EMBO J. 13:543-53' (1994)); y Hrp de Erwinia amylovora (Kim y otros, "HrpW of' ¡ Erwinia amylovora , a New Harpin that Contains a Domain' ? Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class" , J"J Bacteriol . 180:5203- 10 (1998)) y Pseudomonas syringae. \ Las proteínas similares a harpin comparten' características comunes. Son proteínas termo-estables y ricas i en glicina, con no más que un residuo de cisteína (más típicamente, sin residuos de cisteína) , sensibles a la digestión por proteinasas, y desencadenan la HR e inducen resistencia en muchas plantas contra muchas enfermedades. Basado en las características bioquímicas y biofísicas compartidas, así como las funciones biológicas, estos inductores de HR de diferentes bacterias patógenas pertenecen a la familia de la proteína harpin. Estas características compartidas y su capacidad para inducir la HR en un amplio intervalo de plantas distingue la familia de proteínas harpin de otros inductores proteicos de HR huésped específicos, por ejemplo, elicitinas de Phytop t ora spp. (Bonnet y otros, "Acquired Resistance Triggered by Elicitors in Tobacco and, Other Plants", Bur.^ J. Plant Path. 102:181-92 (1996); Keller| y otros, "Physiological and Molecular Characteristics of 1 Elicitin- induced Systemic Acquired Resistance in Tobacco" , ¡ Plant Physiol. 110:365- 76 (1996)) y las proteínas' I avirulentas (tal como Avr9) de Cladosporium fulvum, que sóloj son capaces de inducir la HR en una variedad específica o! especies de una planta. j En la naturaleza, cuando se presentan ciertas] infecciones bacterianas, la proteína harpin se expresa y después se secreta por las bacterias, indicando a la planta montar una defensa contra la infección. La harpin sirve como una señal para activar la defensa de las plantas y otros sistemas fisiológicos, que incluyen la SAR, la mejora del crecimiento y la resistencia a ciertos daños por insectos.

Hasta la fecha, la producción de harpin y su uso en las aplicaciones agrícolas y hortícolas ha sido como un sólido pulverizado cubierto de almidón. Esto limita el uso y la versatilidad de las proteínas harpin, debido a que las ! suspensiones líquidas de las proteínas harpin pulverizadas en el agua tienen una vida útil eficaz de sólo 48 a 72 horas 1 antes de que se presente la degradación significativa y ' pérdida de actividad.

La presente invención se dirige a superar estas y otras > i limitaciones de la técnica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN j Un aspecto de la presente invención se dirige a uii| método para preparar una composición líquida estable que | contiene una proteína o polipéptido harpin. Este método! involucra obtener un extracto líquido que está¡ sustancialmente libre de restos celulares y comprende una¡ proteína o polipéptido harpin. Un agente biocida y,' opcionalmente , uno o ambos de un inhibidor de proteasa y un! tensioactivo no iónico se introducen en el extracto líquido,! obteniendo de esta forma una composición líquida que comprende la proteína o polipéptido harpin que mantiene la actividad de harpin durante al menos aproximadamente 72¡ horas . ¡ Otro aspecto de la presente invención se dirige a una ¡ I composición que comprende un portador acuoso, una proteína o polipéptido harpin, una cantidad eficaz de un agente biocida, ' í y, opcionalmente , una cantidad eficaz de uno o ambos de un : inhibidor de proteasa y tensioactivo no- iónico. La ! composición mantiene la actividad de harpin durante al menos | I aproximadamente 72 horas.

I Un aspecto adicional de la presente invención se dirige ; a un método de inducir una respuesta de la planta. Este ' método consiste en aplicar a una planta o semilla de la i planta la composición de la presente invención. La aplicación ¡ i de la composición de la presente invención a la planta o la! í semilla de la planta se lleva a cabo bajo condiciones, eficaces para inducir una respuesta de la planta. 1 i La presente invención se dirige a un nuevo método de, fabricar una preparación líquida estable de proteínas o¡ I polipéptidos harpin. Como se demuestra en el Ejemploj acompañante, se han preparado formulaciones estables co capacidad de retener la actividad que induce la respuesta I hipersensible significativa durante un período de varios' meses. La capacidad de extender la vida útil de las i formulaciones líquidas de harpin es de gran importancia en la fabricación y distribución de los productos que contienen i harpin, debido a que ya no se requiere del procesamientó extensivo para producir formulaciones que contienen harpin I pulverizada. Esto resulta en varias ventajas o beneficios, , i que incluyen (i) ahorros de costos mediante la eliminación de ¡ un material portador pulverizado y de los procesos de secado 1 que se emplean comúnmente ' en la producción de formulaciones pulverizadas; (ii) la evasión del riesgo de polvo para los i i usuarios; (iii) la formulación líquida es más fácil de usar, i ya que fácilmente se puede diluir en agua y mezclar con otros líquidos (otros productos químicos agrícolas que se aplican) 1 mientras que la disolución de las formulaciones pulverizadas j debe ser monitoreada; (iv) la formulación líquida se puede I dispensar con mayor precisión, debido a que es más fácil i dispensar un volumen adecuado que pesar la cantidad correcta, de una formulación pulverizada; y (v) la formulación líquida! I tiene el potencial de ser usada como un material de calidad i técnica para la formulación con otros productos químicosj i agrícolas . ' i I DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención se dirige a un método para preparar una composición líquida estable que' contiene una proteína o polipéptido harpin. Este método involucra obtener un extracto líquido que está sustancialmente libre de restos celulares y comprende una proteína o polipéptido harpin. Un agente biocida y, opcionalmente , uno o ambos de un inhibidor de proteasa y un ! tensioactivo no iónico se introducen en el extracto líquido, obteniendo de esta forma una composición líquida que comprende la proteína o el polipéptido harpin que mantiene la actividad de harpin durante al menos aproximadamente 72 horas .

Como se usa en la presente, el término "proteína o polipéptido harpin" se refiere a cualquier miembro de la clase de proteínas reconocidas en la técnica que se producen por bacterias de plantas, y que comparten características estructurales y una capacidad para inducir una respuesta i i hipersensible de la planta. Bioquímicamente, estas proteínas: I I o polipéptidos tienen un número de características¦ estructurales comunes. Estas incluyen ser rica en glicina, | termoestable , hidrofílica, sin una secuencia señal N- ! i terminal, y susceptible a la proteólisis. Véase Bonas , : "Bacterial Home Goal by Harpins" , Trends Microbiol . 2:1-2; (1994); Gopalan y otros, "Bacterial Genes Involved in the! i Elicitation of Hypersensitive Response and Pathogenesis" , j Plant Disease 80:604-10 (1996); y Alfano y otros, "The Typej III (Hrp) Secretion Pathway of Plant Pathogenic Bacteria:! Trafficking Harpins, Avr Proteins, and Death" , Journal of Bacteriology 179:5655-5662 (1997), los que se incorporan en este documento como referencia en su totalidad. Además, las harpins comparten una única estructura secundaria que se ha! í asociado con , sus actividades biológicas distintas. La estructura tiene dos componentes primarios, una unidad de hélice alfa y una unidad ácida relajada que tiene una estructura en hoja o giro aleatorio. En ausencia de uno o de ambos componentes, no ocurre la inducción de respuesta hipersensible . Véase la PCT Publ . Núm. WO 01/98501 de Fan y otros, que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

I I Las proteínas harpin comparten también la capacidad de | inducir respuestas específicas de la planta (es decir, después del tratamiento de la planta o de una semilla a partir de la que cual se cultiva la planta) . La inducción de resistencia a enfermedades de la planta, el crecimiento de planta, la' resistencia a los insectos, la resistencia a la desecación, y la resistencia a enfermedades posteriores a la cosecha (en los productos vegetales cosechados, tales como las frutas y verduras) son varias de las utilidades más ¡ importantes. Estos usos de las proteínas harpins se describen i i en la patente de los Estados Unidos, núm. 6,277,814 de Qiu y otros; patente de los Estados Unidos, núm. 5,776,889 de Wei y otros; patente de los Estados Unidos, núm. 5,977,060 de Zitter y otros; patente de los Estados Unidos, núm. 6,235,974 | de Qiu y otros; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos, núm. 2003/0104979 de Wei y otros; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos. núm. j 2002/0019337 de Wei y otros; y la publicación de solicitud de! patente de los Estados Unidos, núm. 2004/0265442, las que se incorporan en este documento como referencia en su totalidad. La inducción de estas respuestas se debe a la sobrerregulación de las vías de defensa del ácido j asmónico/etileno y ácido salicílico, así como las vías de crecimiento de las plantas que regulan la fotosíntesis y la absorción de nutrientes.

Un grupo de proteínas o polipéptidos harpin incluye, sin limitación, los homólogos HrpN de Erwinia amylovora, que incluyen aquellos de las especies de Erwinia, Pantoea y ¡ Pectobacterium. Los ejemplos de tales homólogos incluyen i aquellas proteínas harpins identificadas en el Genbank con ! los números de acceso AAC31644 (Erwinia amylovora); AAQ21220, ¡ AAQ17045, CAE25423, CAE25424, CAE25425, y CAF74881 (Erwinia, pyrifoliae) ; CAC20124, Q47278, Q47279, y AAY17519 {Erwinia¡ chrysanthemi) ; CAE25422 (cepa JP557 de Erwinia) ; AAG01466 j {Pantoea stewartii) ; AAF76342 (Pantoea agglomerans) ; i ABZ05760, ABI15988, ABI15989, ABI15990, ABI15991, ABI15992,i ABI15996, ABK80762, ABD04037, ABI15994, ABD04035, ABD04036,| AAY17521, AAX38231, ABI15995, AAQ73910, y CAL69276: (Pectobacterium carotovorum) ; YP_050198, AAS20361, y CAE45180 (Pectobacterium atrosepticum) ,- y ABD22989 (Pectobacterium! betavasculorum) , los que se incorporan en este documento como! I referencia en su totalidad. ¡ Otro grupo de proteínas o polipéptidos harpin incluye,! sin limitación, los homólogos HrpW de Erwinia amylovora y HrpW de Pseudomonas syringae, que incluyen aquellos de las especies de Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Acidovorax y Pectobacterium. Los ejemplos de homólogos incluyen aquellas proteínas harpins identificadas en el Genbank con los números de acceso U94513, CAA74158, AAC04849 y AAF63402 (Erwinia amylovora) ; AAQ17046 {Erwinia pyrifoliae) ; YP_001906489 (Erwinia tasmaniensis) ; YP_050207 (Pectobacterium atrosepticum) ; AF037983 (Pseudomonas syringae pv. tomato) ; AAO50075 (Pseudomonas syringae pv. phaseolicola) ; AAL84244 i (Pseudomonas syringae pv. maculicola) ; AAX58537, AAX58557 AAX58525, AAX58531, AAX58527, AAX58577, AAX58491, AAX58515 AAX58517, AAX58523, AAX58583, AAX58451, AAX58561, AAX58453 AAX58541, AAX58589, AAT96311, AAX58497, AAX58579, AAX58449 AAX58485, AAX58563 , AAX58581, AAX58575, AAX58569, AAX58567 AAX58505, AAX58591, AAX58503, AAX58507, AAX58509, AAX58469 AAX58441, AAX58543 , AAX58495, AAX58549, AAX58593, AAX58511 7AAX58519, AAT96270, AAX58447, AAX58571, AAX58465, AAX58489 AAX58533, AAX58535, AAX58461, AAT96350, AAX58473, AAX58483 AAX58475 , AAX58457, AAX52 1461, AAX52457, AAT96222 (Pseudomonas viridiflava) ; ABA47299 y BAG24117 (Pseudomonas^ cichorii) ; CAH57075 (Pseudomonas avellanae) ; BAE80274 y| BAE80242 (Acidovorax avenae) ; y AAM37767 (Xanthomonas, axonopodis pv. citri) ; los que se incorporan en este1 I documento como referencia en su totalidad.

Otro grupo aún de proteínas o polipéptidos harpin incluye, sin limitación, los homólogos HrpZ de Pseudomonas syringae, que incluyen aquellos de otras especies de Pseudomonas. Los ejemplos de homólogos incluyen aquellas proteínas harpins identificadas en el Genbank con los números de acceso P35674, AAB00127, ABL01505, AAQ92359, BAD20880, BAD20876, BAD20892 , BAD20884 , BAD20928 , BAD20936 , BAD20932, . 1 1 BAD20924, BAD20856, BAD20864, BAD20860, BAD20848, BAD20844, , 1 BAD20836, BAD20840, BAD20824, BAD20842 , BAD20820 , BAD20916, ! 1 BAD20872, BAC81526, 087653 , BAA74798, BAD20904, AAB86735, · BAD20912, BAD20908, ABL01504 , BAB40655, AB026225 , AB026228 i (Pseudomonas syringae pv. ) ; BAD20868 (Pseudomonas' ficuserectae); ÁAX52452, AAT96159, AAX52266, AAX52396,! AAT96322, AAT96281, AAX52272, AAX52306, AAX52270, AAX52402,; AAX52276, AAX52318, AAX52262, and AAT96361 (Pseudomonasi viridiflava) ; CAJ76697 (Pseudomonas avellanae) ; YP_001185537¡ í (Pseudomonas mendocina) ; y ABA47309 y BAG24128 (Pseudomonas] cichorii) ; los que se incorporan en este documento como! referencia en su totalidad. ! i Un grupo adicional de proteínas o polipéptidos harpin1 I incluye, sin limitación, los homólogos HreX de Xanthomonas campestris (véase la patente de los Estados Unidos núm. i 6,960,705 de Wei y otros, que se incorpora a este documentó I como referencia en su totalidad) , que incluyen aquellas otras i especies de Xanthomonas. Los ejemplos de tales homólogos I I ? incluyen aquellas proteínas harpins identificadas en el Genbank ' con los números de acceso NP_636614, YP_001904470 , YP_362171 ! {Xanthomonas campestris) ; ABB72197, ABK51585, ABU48601, j ABK51584, YPJ198734, y ZP_02245223 (Xanthomonas oryzae) ; y ¡ ABK51588 y NP_640771 {Xanthomonas axonopodis) ; los que se incorporan en este documento como referencia en su totalidad.

La presente invención también abarca las formulaciones 1 líquidas estables que contienen los fragmentos de proteínas o ¡ polipéptidos harpin enumerados anteriormente que inducen la j respuesta hipersensible . Los fragmentos preferidos incluyen dos unidades estructurales: una unidad a-hélice estable con 12 o más aminoácidos de longitud, y una unidad ácida, hidrófila, con 12 o más aminoácidos de longitud, que podría ser una forma beta, un; giro beta, o formas desordenadas. Los fragmentos preferidos! también se caracterizan por un valor de pl ácido, que está, de ' preferencia, por debajo de 5. Los fragmentos preferidos: contienen entre 28 a 40 aminoácidos, aunque pueden estar ¡ presentes menos o mas residuos de aminoácidos. I| Los ejemplos de los fragmentos adecuados se identifican! en la patente de los Estados Unidos, núm. 6,583,107 de Laby y¡ otros, y la publicación PCT núm. O 01/098501 de Fan y otros, ¡ las que se incorporan en este documento como referencia en sui totalidad. La publicación PCT núm. WO 01/098501 de Fan y¡ otros, describe también los métodos para la obtención de! fragmentos de la proteína o el polipéptido harpin que podrían' ser empleados en la presente invención.

Los fragmentos de polipéptidos adecuados que inducen HR incluyen, sin limitación, aquellos identificados en la Tabla 1 a continuación: Tabla 1: Lista de los fragmentos que inducen HR.

Dominio HR Fuente de Residuos de pi aislamiento Aminoácidos HrpNEa-l E. amylovora 43-70 3.09 HrpNEa-2 E. amylovora 140-176 3.17 HrpNEch-l E. chrysanthemi 78-118 5.25 HrpNEch-2 E. chrysanthemi 256-295 4.62 HrpNEcc-l E. carotovora 25-63 4.06 HrpNEcc-2 E. carotovora 101-140 3.00 HrpWpss-l P. syringae 52-96 4.32 HrpWEa-l E. amylovora 10-59 4.53 HrpZpss-l P. syringae 97-132 3.68 HrpZpgg- 2 P. syringae 153-189 3.67 HrpZPss-3 P. syringae 271-308 3.95 PopAlRS-l R. solanacearum 92-125 3.75 PopAlRS-2 R. solanacearum 206-260 3.62 I Los fragmentos adecuados de la proteína o el polipéptido harpin pueden no inducir la respuesta de hipersensibilidad en las plantas, pero todavía pueden ser útiles en las formulaciones y composiciones de la invención. Tales fragmentos se describen en la patente de los Estados Unidos, núm. 6,858,707 de Wei y otros, que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

Los fragmentos adecuados se pueden producir por varios medios. De acuerdo con un enfoque, los subclones del gen que codifican una proteína o polipéptido harpin conocidos se producen por la manipulación genética molecular convencional por subclonación de los fragmentos de genes. Los subclones, entonces, se expresan in vitro o in vivo en células bacterianas para producir una proteína o péptido pequeño que se puede probar para la actividad.

Como un enfoque alternativo, los fragmentos se pueden! producir por la digestión de una proteína harpin de longitud total o un polipéptido con enzimas proteolíticas como la| quimotripsina o la proteinasa A de Staphylococcus, o laj tripsina. Diferentes enzimas proteolíticas están, ¡ probablemente, para cortar las proteínas inductoras en¡ diferentes sitios en base a la secuencia de aminoácidos de la: proteína harpin. Algunos de los fragmentos que resulten de la. proteólisis pueden ser inductores activos de resistencia.

En otro enfoque aún, basado en el conocimiento de la^ i I estructura primaria de la proteína, los fragmentos del gen de j la proteína harpin se pueden sintetizar usando la técnica de j PCR junto con un conjunto específico de cebadores i seleccionados para representar porciones particulares de la : proteína. Estos después podrían ser clonados dentro de un ¡ vector apropiado para la expresión de un péptido o proteína ; truncada .

La síntesis química se puede usar también para hacer los J fragmentos adecuados. Tal síntesis se lleva a cabo usando las ¡ i secuencias de aminoácidos conocidas para la harpin a producirse. 1 I Alternativamente, someter una harpin de longitud total a altas ¡ i temperaturas y presiones producirá los fragmentos. Estos ! fragmentos se pueden separar después por procedimientos j convencionales (por ejemplo, cromatografía, SDS-PAGE) .

La proteína o el polipéptido harpin de la presente : invención pueden incluir también las proteínas aisladas I i inductoras de la respuesta de hipersensibilidad que comprenden! uno o más pares de dominios que inducen HR separados, cada uno¦ comprendiendo una porción ácida unida a una hélice alfa y capaz ! de inducir una respuesta de hipersensibilidad en las plantas, j como se describe en la publicación PCT núm. O 01/098501 de Fan; ¡ y otros, que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Por ejemplo, los bloques de construcción que; contienen uno o más dominios que inducen HR incluyen, sinj limitación, los bloques de construcción identificados en la I Tabla 2 a continuación: Tabla 2 : Dominios de bloques de construcción de Superharpin Secuencia Fuente PM P Dominio (kDa) a . a A PopA70-146 10.69 104 6.48 (I½) HrpNEa40-80 6.754 68 6.78 ¡ (Nj»)2 Dímero de HrpNEa40-80 10.84 111 6.13 ¡ (Nw)3 Triplémero de HrpNEa40- 14.93 154 5.63 i 80 i (Nw)4 Tetrámero de HrpNEa40-80 19.01 197 4.95 I (Nc) HrpNEa140-180 7.224 68 5.01 ' I (Nc) 2 Dímero de HrpNEa140-180 11.78 111 3.98 i i (Nc) 3 Trímero de HrpNEa140-180 16.34 154 3.72 I (Nc)4 Tetrámero de HrpNEa140 - 20.89¦ 197 3.58 i 180 (Nc C)l 10 Decámero de HrpNEa140- 48.23 455 3.28 180 (Nc) l6 Hexadecámero de 75.57 713 3.18 HrpNEa140-180 w HrpNEa10-59 7.986 77 6.48 ZN HrpZ90-150 8.087 78 5.38 ^266-308 HrpZ266-308 7.029 70 6.40 Con la combinación de estos (y otros) dominios que inducen HR, los nuevos polipéptidos de harpin (es decir, las superharpin) se pueden producir con una mayor potencia de HR y con la capacidad mejorada para inducir la respuesta conveniente de la planta (por ejemplo, resistencia a la enfermedad, resistencia a los insectos, crecimiento mejorado, tolerancia al estrés ambiental, y resistencia a las enfermedades posteriores a la cosecha) . Las superharpin se pueden formar usando una unidad repetitiva del dominio HR (cancatómero) , diferentes combinaciones de los dominios HR, y/o los dominios biológicamente activos de otros inductores.

Usando estos bloques de construcción, varias proteínas superharpin aisladas incluyen, sin limitación, aquellos identificados en la Tabla 3 a continuación: Tabla 3 : Construcciones de la Superharpin Proteína Secuencia Dominio PM (kDa) # a. a pl SH-1 *W(NW) 4A(Nc)4Z266-308 54.955 545 3.69 SH-2 *W(NN)4ZN(NC)4Z26S_308 52.341 519 3.54 SH-3 *W(NN)4ZW(NC)4Z266-308A 60.375 598 3.67 Estas superharpin son termoestables y solubles, y se ha demostrado que poseen una mejoría del crecimiento y/q actividad de resistencia a las enfermedades incrementada en comparación con las proteínas harpin aisladas de bacterias patógenas de plantas, tales como HrpN. Estas superharpin se describen en la publicación PCT núm. O 01/098501 de Fan y otros, la cual se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

Una proteína superharpin preferida, comercialmente disponible ahora de Plant Healthcare Inc., se caracteriza por una secuencia de aminoácidos de sec . con núm. de ident . : 1 como sigue: MSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTHMPGTSS5PGLFQSGGDNGLGGHNANSA LGQQPID QTIEQMAQLLAELLKSLLDSGEKLGDNFGASADSASGTGQQDLMTQVLN GLAKSMLDDLLTKQDGGTSFSEDDSGPAKDGNANAGANDPSKNDPSKSQGPQSA KT GNVDDANNQDPMQALMQLLEDLVKLLKAALHMQQPGGNDKG GVGGDSGQNDDSTSG TDSTSDSSDPMQQLL MFSEIMQSLFGDEQDGTDSTSGSRFTRTGIGMKAGIQALND IGTHSDSSTRSFVNKGDRAMAKEIGQFMDQY PEVFG PQYQ GPGQEVKTDDKSVÍAK ALSKPDDDGMTPASMEQFNKAKGMIKSMAGDTGNGNLQARGAGGSSLGIDAMMAGD AINNMALGKLGAA Los residuos de 1-30 corresponden a la secuencia N-terminal de HrpNEa, los residuos 31-34 (en negrita) son1 artefactos de la unión de los dominios de HR juntos, los; residuos 35-83 corresponden a un dominio de HR de HrpWEa¡ (residuos 10-59) , los residuos 84-86 (en negrita) son! artefactos de la unión de los dominios de HR juntos, los] residuos de 87-138 corresponden a un dominio de HR de HrpZPsS| (residuos 90-141) ; los residuos 139-140 (en negrita) son artefactos de la unión de los dominios de HR juntos, los I residuos 141-211 corresponden a un dominio de HR de PopA (residuos 70-140) , los residuos 212-220 corresponden a los artefactos de la unión de los dominios de HR juntos, los residuos de 221 a 261 corresponden a un dominio de HR de HrpNEa (residuos 140-180) ; los residuos 262-271 corresponden a los artefactos de la unión de los dominios de HR juntos, y los residuos 272- 412 corresponden a la secuencia C-terminal de HrpNEa (residuos 263-403) .

La proteína superharpin de sec. con núm. de ident. : 1 es codificada por la secuencia nucleotídica de sec. con núm. de ident. : 2 como sigue: A GAGTCTGAA ACAAGTGGGGTGGGAGCGTCAACGATGCAAATTTC ATCGGCGGT GCGGGCGGAAATAACGGGTTGCTGGGTACGCATATGCCCGGGACCICGTCCTCGCCG GGTCTGTTCCAGTCCGGGGGGGACAACGGGCTTGGTGGTCATAATGCAAATTCTGCG TTGGGGCAACAACCCATCGATCGGCAAACCATTGAGCAAATGGCTCAATTATTGGCG GAACTGTTAAAGTCACTGCTAGATAGTGGGGAAAAGCTCGGTGACAACTTCGGCGCG TCTGCGGACAGCGCCTCGGGTACCGGACAGCAGGACCTGATGACTCAGGTGCTCAAT GGCCTGGCCAAG CGATGCTCGATGATCTTCTGACCAAGCAGGATGGCGGGACCAGC TTCTCCGAAGACGATAGTGGGCCGGCGAAGGACGGCAATGCCAACGCGGGCGCCAAC GACCCGAGCAAGAAGGACCCGAGCAAGAGCCAGGGTCCGCAGTCGGCCAACAAGACC GGCAACGTCGACGACGCCAACAACCAGGA CCGATGCAAGCGCTGATGCAGCTGCTG GAAGACCTGGTGAAGCTGCTGAAGGCGGCCCTGCACATGCAGCAGCCCGGCGGCAAT GACAAGGGCAACGGGGTGGGCGGTGATAGTGGGGAAAACGACGATTCCACCTCCGGC ACAGATTCCACCTCAGACTCCAGCGACCCGATGCAGCAGCTGC GAAGATGTTCAGC GAGATAATGCAAAGCCTGTTTGGTGATGAGCAAGATGGCACCGATAGTACTAGCGGC TCGAGGTTTACTCGTACCGGTATCGGTATGAAAGCGGGCATTCAGGCGCTGAATGAT ATCGGTACGCACAGCGACAG TCAACCCG TCTTTCGTCAATAAAGGCGATCGGGCG ATGGCGAAGGAAATCGGTCAGTTCATGGACCAGTATCCTGAGGTGTTTGGCAAGCCG CAGTACCAGAAAGGCCCGGGTCAGGAGGTGAAAACCGATGACAAATCATGGGCAAAA GCACTGAGCAAGCCAGATGACGACGGAA GACACCAGCCAGTATGGAGCAGTTCAAC AAAGCCAAGGGCATGATCAAAAGCGCCATGGCGGGTGATACCGGCAACGGCAACCTG CAGGCACGCGGTGCCGGTGGTTCTTCGCTGGGTATTGA GCCATGATGGCCGGTGAT GCCATTAACAATATGGCACTTGGCAAGCTGGGCGCGGCTTAA De acuerdo con la presente invención, el método de preparar una composición líquida estable que contiene una proteína o polipéptido harpin involucra obtener un extracto líquido que está sustancialmente libre de restos celulares y comprende una proteína o polipéptido harpin. Esto se puede llevar a cabo mediante la fermentación de una suspensión de la bacteria de planta que produce la proteína o el j polipéptido harpin. La proteína o polipéptidos harpin se pueden producir fácilmente a través de la fermentación de ! bacterias de crecimiento rápido. Por ejemplo, la Escherichia ¡ coli recombinante se puede usar para la producción de la proteína o polipéptido harpin a gran escala. La tecnología j actual permite la producción de concentraciones j I intracelulares relativamente grandes de las proteínas o ' polipéptidos de harpin.

Las metodologías recombinantes generalmente involucran la inserción de una molécula de ADN que expresa una proteína ! o polipéptido de interés en un sistema de expresión para el I cual la molécula de ADN es heterologa (es decir, normalmente , no está presente) . La molécula de ADN heterologa se inserta j en el sistema o vector de expresión en la orientación con : i sentido apropiado y marco de lectura correcto. El vecto ¡ contiene los elementos necesarios para la transcripción y la , j traducción de las secuencias que codifican para la proteína j insertada. La transcripción del ADN depende de la presencia] de un promotor. Del mismo modo, la traducción del ARNm en; procariotas depende de la presencia de las señales de! procariotas apropiadas que difieren de las de eucariotas . ¡ Para una revisión sobre maximizar la expresión génica, véase Roberts y Lauer, Methods in Enzymology 68:473 (1979), la cualj se incorpora en este documento como referencia.

A pesar de las secuencias de regulación específicas empleadas, la molécula de ADN se clona dentro del vector usando los procedimientos de clonación estándares en la técnica, según es descrito por Sambrook y otros,- Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, N.Y. (1989), el cual se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Una vez que molécula de ADN aislada, que codifica para la proteína o el polipéptido harpin, se ha clonado en un sistema de expresión, éste está listo para ser incorporado en una célula huésped. Tal incorporación se puede llevar a cabo por diversas formas de transformación, en dependencia del vector /sistema de la célula huésped. Las células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, bacteria, virus, levadura, células de mamíferos, insecto, planta, y similares.

Opcionalmente , las células huésped recombinantes pueden ser las células huésped que expresan un sistema de secreción tipo III funcional, nativo o recombinante . Esto se describe en detalle en la patente de los Estados Unidos. núm. 6,596,509 de Bauer y otros, la cual se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Como consecuencia de la expresión del sistema de secreción tipo III funcional, las células expresarán la proteína o el polipéptido harpin y después secretarán la proteína en el medio de cultivo. Esto I I puede simplificar el aislamiento y la purificación de la | proteina o el polipéptido harpin. i Las células huésped recombinantes pueden ser cultivadas en cámaras de fermentación apropiadas, de preferencia bajo I condiciones de temperatura y nutriente que optimicen el : crecimiento de las células huésped y la expresión de las ' proteínas o polipéptidos de harpin. Las personas con I conocimiento en la técnica son plenamente capaces de ¡ identificar las condiciones óptimas para las células huésped j en particular. ¡ i Después de la fermentación, la suspensión bacteriana se ¡ I puede diluir en, por ejemplo, aproximadamente 2 a 5 veces el I volumen de un tampón para ajustar el pH entre aproximadamente de 5.5 a 10, con mayor preferencia a un pH entre! aproximadamente 7 a 9, y aún con mayor preferencia a un pH de! aproximadamente 8.0. Los tampones adecuados son bienI I conocidos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, el! tampón fosfato de potasio o un tampón Tris-EDTA. La| concentración del tampón puede ser desde aproximadamente; 0.001 mM hasta aproximadamente 0.5 M. ; I Después del ajuste del pH, la solución de la suspensión! bacteriana se trata con calor a una temperatura de aproximadamente 60-130°C, de preferencia a una temperatura de1 aproximadamente 95-125°C. El tratamiento con calor se puede' llevar a cabo durante cualquier período de tiempo adecuado.! I j En una modalidad, el tratamiento con calor se lleva a cabo durante un período de aproximadamente cinco minutos hasta aproximadamente 30 minutos.

La solución de la suspensión calentada después se enfría. Una temperatura adecuada de enfriamiento es, sin limitación, aproximadamente 35-55°C, de preferencia aproximadamente 45 °C.

Después del enfriamiento, las células bacterianas en la suspensión bacteriana se lisan, si es necesario, para liberar la proteína o el polipéptido harpin. La lisis celular se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el contactó de la suspensión bacteriana con una lisozima. La concentración de la lisozima puede ser cualquiera desde aproximadamente 2 ppm1 a 100 ppm. Por otra parte, la lisis celular puede involucrar j métodos no químicos, tales como la alta presión o sonicación, 1 los que son bien conocidos por las personas con experiencia: i ordinaria en la técnica. ' Puede ser conveniente, después de la lisis celular,! incubar la suspensión bacteriana. Los tiempos adecuados de¡ incubación pueden variar. Por ejemplo, puede ser conveniente,' incubar la. suspensión bacteriana durante un período de¡ i aproximadamente 30-45 minutos a una temperatura de' I aproximadamente 40-42°C.

Después de lisis, la proteína o el polipéptido1 conveniente (es decir, la proteína o el polipéptido harpin)¡ se puede extraer, además, mediante la eliminación de los restos de células y las proteínas desnaturalizadas resultantes de la etapa anterior de tratamiento con calor. En una modalidad, el extracto se centrifuga durante aproximadamente 10-20 minutos para eliminar algunos de los restos celulares. Las velocidades de centrifugación adecuadas pueden ser de aproximadamente 4.000 a 20.000 rpm y el tiempo de giro puede ser de aproximadamente 10 minutos a 20 minutos. Después, los restos celulares se pueden eliminar, además, por tratamiento con calor y centrifugación del sobrenadante para obtener un extracto líquido que esté sustancialmente libre de restos celulares por la eliminación de más de aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% de los sólidos i totales. Este tratamiento posterior con calor se puede llevar| a cabo a una temperatura de aproximadamente 60°C durante uní máximo de aproximadamente dos horas, a aproximadamente ai 100 °C durante aproximadamente 10 minutos, o a aproximadamente' i 121°C con 15 psi de presión durante aproximadamente 5 minutos. Estas temperaturas y los tiempos pueden varia j dependiendo de otras condiciones. ; El método de preparar una composición líquida estable que contiene una proteína o polipéptido harpin de la presentd invención involucra, además, introducir en el extracto I líquido un agente biocida y, opcionalmente , uno o ambos de uri í inhibidor de proteasa y un tensioactivo no iónico, í I obteniendo, de esta forma, una composición líquida que ¡ I comprende la proteína o el polipéptido harpin. En una ¡ modalidad, un inhibidor de proteasa se introduce en el | extracto líquido sin un tensioactivo no iónico. En otra j modalidad, un tensioactivo no iónico se introduce en el | extracto líquido sin un inhibidor de proteasa. En una modalidad adicional, tanto un inhibidor de proteasa como un ¡ tensioactivo no iónico se introducen en el extracto líquido. | En otra modalidad aún, no se introducen ningún inhibidor de i proteasa ni tensioactivo no iónico en el extracto líquido. 1 Los agentes biocidas se adicionan al extracto líquido i para la conservación. Los agentes biocidas adecuados, incluyen, sin limitación, antibióticos, sustancias químicas i tóxicas, y desinfectantes. Por ejemplo, un antibiótico, I adecuado es la estreptomicina, un agente tóxico adecuado es i la azida sódica, y un desinfectante adecuado es un, i en masa) ; cloruro de alquilo (C12-16) dimetilbencilammonio' (12.4% en masa) ,- carbonato de sodio (3% en masa) ; y edentato de sodio (2.5% en masa)) . La concentración del agente biocida' introducido puede estar en el intervalo de aproximadamente l! ppm a aproximadamente 100 ppm, más preferentemente dé I j ? aproximadamente de 2 ppm a 30 ppm, más preferentemente aún de ¡ aproximadamente de 5 ppm a 10 ppm. I Los inhibidores de proteasas se pueden adicionar para evitar la degradación de la harpin por proteasas residuales en el extracto de harpin. Los inhibidores de proteasas ¡ incluyen diversos inhibidores clasificados por tipo de : proteasa o por su mecanismo de acción. Los inhibidores de proteasas adecuados pueden incluir, sin limitación, los | inhibidores de cisteína proteasa, inhibidores de serina j proteasa (serpinas) , inhibidores de tripsina, inhibidores de I treonina proteasa, inhibidores de ácido aspártico proteasa e inhibidores de metaloproteasas . Los inhibidores de proteasas I adecuados se pueden seleccionar de acuerdo a su mecanismo de i i acción. Por ejemplo, los inhibidores de proteasas adecuados pueden incluir, sin limitación, los inhibidores suicidas, los' inhibidores de estado de transición, los inhibidores del proteína proteasas, y los agentes quelantes. Los ejemplos dej los inhibidores de proteasas disponibles en el mercado^ incluyen, sin limitación, la aprotinina, bestatina, inhibidor! de calpaína I, inhibidor de calpaína II, quimostatina, E-64,| (iV-acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal) leupeptina, alfa- 2-j macroglobulina , pefabloc SC, pepstatina, PMSF (fluoruro de' i fenilmetanosulfonilo) , y la cetona tosil-L-lisina clorometilo! (TLCK) .

Los inhibidores de proteasas se pueden adicionar al; i I i extracto a una concentración de aproximadamente 1 ppm a 100 j I ppm, más preferentemente de aproximadamente de 2 ppm a 30 | ppm, más preferentemente aún de aproximadamente de 5 ppm a 10 ppm. ! Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen, sin limitación, el éster del ácido graso sorbitán, el éster del ! ácido graso de glicerina, poliglicérido de ácido graso, éter de poliglicol alcohol de ácido graso, acetilenglicol, alcohol ¡ acetileno, polímero en bloque de oxialquileno, alquil éter de polioxietileno, alquilaril éter de polioxietileno, estirilaril éter de polioxietileno, alquil éter de ' polioxietilenglicol , éster del ácido graso de polioxietileno, j éster del ácido graso de polioxietilensorbitán, éster del ' ácido graso de glicerina polioxietileno, aceite de ricino polioxietilenado hidrogenado, y éster del ácido graso de j polioxietileno. | Los tensioactivos no iónicos se pueden adicionar al j extracto en una cantidad en volumen de aproximadamente 0.005 : a aproximadamente 20%, más preferentemente de aproximadamente j i 0.01 a aproximadamente 15%, con la máxima preferencia de | aproximadamente de 0.05% a 10%. * ; j Como resultado de introducir el agente biocida y, j opcionalmente , el inhibidor de proteasa y tensioactivo como' i se describió anteriormente, las composiciones de la presente! invención se caracterizan por mantener su actividad de harpint durante al menos 72 horas y preferentemente mucho más tiempo. De preferencia, la composición líquida producida por los métodos de la presente invención mantiene la actividad de harpin durante más de aproximadamente 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, o 4 semanas, con mayor preferencia durante al menos aproximadamente 2 a 3 meses, y con la máxima preferencia más de aproximadamente 4 a 6 meses. Como se usa en este documento, la retención de la actividad de harpin se puede determinar mediante la comparación de la actividad de la composición líquida envejecida con una composición líquida de reciente preparación o con una evaluación anterior hecha de la misma composición. La actividad se puede medir por los efectos de la composición en las plantas según la evaluación i de la resistencia a la enfermedad, la mejora del crecimiento, j la resistencia al estrés, etc., de las plantas después del | desafío. De preferencia, las composiciones de la presente! i invención mantienen (por más de 72 horas) al menos! aproximadamente el 70% de la actividad, más preferentemente! al menos aproximadamente de 70% a aproximadamente 80% de laj actividad, y con la máxima preferencia al menosj aproximadamente de 80% a 90% de la actividad. ; i Alternativamente, la estabilidad de la composición1 i líquida de la presente invención se puede evaluar usando, porj ejemplo, el análisis HPLC u otros procedimientos adecuados' que permitan identificar la cantidad de una proteína oj polipéptido específico. La estabilidad de la proteína o el polipéptido harpin en una composición de la presente invención se puede determinar mediante la comparación de la cantidad de proteína harpin en la composición líquida envejecida con la de una composición líquida de reciente preparación, o con una cuantificación anterior realizada sobre la misma composición. La medida.de la estabilidad de la proteína harpin se correlaciona fuertemente con la retención de la actividad.

Otro aspecto de la presente invención se dirige a una composición que comprende un portador acuoso, una proteína o polipéptido harpin, una cantidad eficaz de un agente biocida, y, opcionalmente , una cantidad eficaz de uno o ambos de un inhibidor de proteasa y un tensioactivo no iónico. La composición mantiene la actividad de harpin durante al menos aproximadamente 72 horas.

La composición de la presente invención se puede formular dentro de cualquier forma adecuada, que incluye, sin limitación, una solución, emulsión, concentrado emulsificable , suspensión, espuma, pasta, aerosol, concentrado de suspoemulsión, o lechada. Las composiciones adecuadas incluyen aquellas para HV, LV, y el rociado por ULV y para formulaciones UVL que nebulizan en frío y caliente. De preferencia, la composición de la presente invención se formula de manera adecuada para aplicaciones en la agricultura y la horticultura a gran o pequeña escala.

Estas formulaciones se producen de una manera conocida, J por ejemplo, mediante la mezcla de la composición líquida con ¡ I aditivos, es decir, solventes líquidos, gases licuados bajo i I presión, y/o portadores sólidos. Los agentes humectantes y/o ; tensioactivos, es decir, emulsificadores y/o dispersantes, agentes secuestrantes, plastificantes , abrillantadores, agentes de flujo, agentes coalescentes , ceras, rellenos, polímeros, agentes anticongelantes, biocidas, espesantes, I I agente de pegajosidad y/o formadores de espuma y agentes \ i antiespumantes se puede usar también de maneras comúnmente i conocidas por aquellas personas con conocimiento ordinarios en la técnica. Si el aditivo usado es el agua, es posible también emplear, por ejemplo, solventes orgánicos como solventes auxiliares. Otros aditivos posibles son los aceites ¡ minerales y vegetales, colorantes, tales como los pigmentos ¡ inorgánicos, y los nutrientes trazas. j La naturaleza y la acción de tales aditivos se conoce j bien por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica de las formulaciones líquidas. Los aditivos no deben! i interferir con la acción de las proteínas o polipéptidos , harpin o cualquier otro componente biológicamente activo j j incluido en la formulación. j El contenido del compuesto activo de la proteína o; polipéptido harpin contenido en la formulación de la presente! invención puede variar dentro de un intervalo amplio. Por , ¡ ejemplo, la concentración del compuesto activo (es decir, la j proteína o el polipéptido harpin activo) puede ser de i 0.0000001 a 20% por peso, y de preferencia de 0.0001 a 15% ' por peso. | En una modalidad, puede ser conveniente combinar la composición de la presente invención con cantidades eficaces ' de otros productos químicos agrícolas u hortícolas, tales | como herbicidas (por ejemplo, el glifosato) , insecticidas, ! acaricidas, nematicidas, molusquicidas , atrayentes, i esterilizantes, bactericidas, acaricidas, nematicidas, fungicidas y/o reguladores de crecimiento. j Un herbicida preferido es el glifosato, comúnmente i I conocido como ácido 2 ( fosfonometilamino) acético. Las sales1 de glifosato se pueden usar también. Las sales de glifosatoj i adecuadas incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, las: ¡ sales de isopropilamina , sales de diamonio, y las sales de¡ trimetilsulfonio . Las mezclas que incluyen el glifosatoj incluyen típicamente uno o más tensioactivos , típicamente uno' I o más tensioactivos no iónicos, aunque pudiera no serj requerido ningún tensioactivo . Las formulaciones que contienen glifosato se aplican típicamente a las plantas! convenientes y las partes de las plantas que son resistentes! al glifosato. ' Los ejemplos de otros herbicidas útiles en las! composiciones descritas en este documento incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a: herbicidas de amida, que incluyen alidoclor, amicarbazona , beflubutamida, benzadox, benzipram, bromobutida, cafenstrol, CDEA, ciprazol, dimetenamida, dimetenamida-P, difenamida, epronaz, etnipromid, fentrazamida, flucarbazona, flupoxam, fomesafen, halosafen, isocarbamida, isoxaben, napropamida, naptalam, petoxamida, propizamida, quinonamida, saflufenacilo, y tebutam; herbicidas de anilida, que incluyen cloranocrilo, cisanilida, clomeprop, cipromida, diflufenicán, etobenzanida , fenasulam, flufenacet, flufenicán, ipfencarbazona, mefluidida mefenacet, metamifop, monalida, naproanilida, pentanoclor, picolinafeno, propanilo, sulfentrazona ; herbicidas de arilalanina, que incluyen benzoilprop, flamprop, y flamprop- ; herbicidas de cloroacetanilida, que incluyen acetoclor, alaclor, butaclor, butenaclor, delaclor, dietatilo, dimetaclor, metazaclor, metolaclor, S-metolaclor , pretilaclor, propaclor, propisoclor, prinaclor, terbuclor, j tenilclor y xilaclor herbicidas de sulfonanilida , que1 í incluyen benzofluor, cloransulam, diclosulam, florasulam, ¡ flumetsulam, metosulam, perfluidona, pirimisulfán yj profluazol herbicidas de sulfonamida que incluyen asulam, carbasulam, fenasulam, orizalin, penoxsulam y piroxsulam;| herbicidas de tioamida, que incluyen bencarbazona y I clortiamida ; herbicidas antibióticos, que incluyen bilanafos;1 i j I I herbicidas de ácidos aromáticos; herbicidas del ácido ; benzoico, que incluyen cloramben, dicamba, 2, 3,6-TBA, y¡ tricamba; herbicidas del ácido pirimidiniloxibenzoico, que í incluyen bispiribac y piriminobac ; herbicidas del ácido ¡ pirimidiniltiobenzoico, que incluyen piritiobac ; herbicidas j del ácido ftálico, que incluyen clortal; herbicidas del ácido i picolínico, aminopiralida , clopiralida, y picloram; l herbicidas del ácido quinolinacarboxílico, que ¡ incluyen quinclorac y quinmerac; herbicidas arsenicales, que! incluyen el ácido cacodílico, C A, DSMA, hexaflurato, MAA, ? i MAMA, MSMA, arsenito de potasio, y el arsenito de sodio; i herbicidas de benzoilciclohexanediona , que incluyen^ mesotriona, sulcotriona, tefuriltriona y tembotriona ; ¡ I herbicidas de benzofuranil alquilsulfonato, que incluyen benfuresato y etofumesato ; herbicidas de benzotiazol, que j incluyen benazolin, benztiazurón, fentiaprop, mefenacet y! metabenztiazurón; herbicidas de carbamato, que incluyen; asulam, carboxazol, clorprocarb, diclormato, fenasulam,; ¡ karbutilato y terbucarb; herbicidas de carbanilato, que i incluyen barban, BCPC, carbasulam, carbetamida, CEPC,' I clorbufam, clorprofam, CPPC, desmedifam, fenisofam, i fenmedifam, etil - fenmedifam, profam y swep; herbicidas de oxima ciclohexeno, que incluyen aloxidim, butroxidim,' cletodim, cloproxidim, cicloxidim, profoxidim, setoxidim, tepraloxidim y tralcoxidim; herbicidas de ciclopropilisoxazol , que incluyen isoxaclortol e isoxaflutol; herbicidas de dicarboximida, que incluyen etil-cinidón, flumezin, flumiclorac, flumioxacin, y flumipropin; herbicidas de dinitroanilina , que incluyen benfluralin, butralin, dinitramina, etalfluralin, flucloralin, isopropalin, metalpropalin, nitralin, orizalin, pendimetalin, prodiamin, profluralin, y la trifluralin,- herbicidas de dinitrofenol , que incluyen dinofenato, dinoprop, dinosam, dinoseb, dinoterb, DNOC, etinofen y medinoterb; herbicidas de difenil éter, que incluyen etoxifen; herbicidas de nitrofenil éter, que incluyen acifluorfen, aclonifen, bifenox, clometoxifen, clornitrofen, etnipromid, fluorodifen, fluoroglicofen, ! fluoronitrofen, fomesafen, furiloxifen, halosafen, lactofen, ' nitrofen, nitrofluorfen y oxifluorfen; herbicidas de! ditiocarbamato, que incluyen dazomet y metam; herbicidasl alifáticos halogenados, que incluyen alorac, cloropon,! dalapon, flupropanato, hexacloroacetona, yodometano, bromuro! de metilo, ácido monocloroacético, SMA, y TCA; herbicidas de¡ imidazolinonas , que incluyen imazametabenz , imazamox,¡ imazapic, imazapir, imazaquin e imazetapir; herbicidasj inorgánicos, que incluyen sulfamato de amonio, bórax, clorato de calcio, sulfato de cobre, sulfato ferroso, azida de potasio, cianuro de potasio, azida de sodio, clorato dé I sodio , y ácido sulfúrico, herbicidas de nitrilo, que I incluyen bromobonilo, bromoxinilo, cloroxinilo, diclobenilo, ioxinilo yodobonilo, y piraclonilo ; herbicidas organofosforados , que incluyen metilo-amiprofos , anilofos, bensulida, bilanafos, butamifos, 2,4-DEP, DMPA, EBEP, fosamina, glufosinato, glufosinato-P, glifosato, y piperofos; herbicidas de oxadiazolona, que incluyen dimefurón, metazol, oxadiargilo y oxadiazon; herbicidas de oxazol, que incluyen carboxazol, isourón, isoxaben, isoxaclortol , isoxaflutol, monisourón, piroxasulfona y topramezona ; herbicidas de fenoxi, que incluyen bromofenoxim, clomeprop, 2,4-DEB, 2,4-DEP, difenopenten, disul, erbon, etnipromid, fenteracol, y trifopsima; herbicidas fenoxiacéticos, que incluyen 4-CPA, 2,4-D, 3,4-DA, MCPA, tioetil- MCPA, y el 2,4,5-T; herbicidas i I fenoxibutíricos, que incluyen 4-CPB, 2,4 DB, 3,4-DB, MCPB, y, ! 2,4, 5 -TB; herbicidas fenoxipropiónicos , que incluyen cloprop,, 4-CPP, diclorprop, diclorprop-P, 3,4-DP, fenoprop, mecoprop y! mecoprop-P; herbicidas ariloxifenoxipropiónicos , que incluyen: clorazifop, clodinafop, clofop, cihalofop, diclofop,j fenoxaprop, fenoxaprop-P, fentiaprop, fluazifop , fluazifop i P, haloxifop, haloxifop-P, isoxapirifop , metamifop,: propaquizafop, quizalofop, quizalofop-P, y trifop; herbicida^ de fenilendiamina, que incluyen dinitramina y prodiamina herbicidas de pirazol, que incluyen azimsulfurón,j difenzocuat, halosulfurón, metazaclor, pirazosulfurón,¡ y piroxasulfona ; herbicidas de benzoilpirazol , que incluyen benzofenap, pirasulfotol , pirazolinato, pirazoxifen, Ii topramezona; herbicidas de fenilpirazol , que incluyen fluazolato, nipiraclofen y piraflufeno ; herbicidas de piridazina, que incluyen credazina, piridafol y piridato; herbicidas de piridazinona, que incluyen brompirazon, cloridazon, dimidazon, flufenpir , metflurazon, norflurazon, oxapirazon y pidanon; herbicidas de piridina, que incluyen aminopiralida, cliodinato, clopiralida, diflufenicán, ditiopir, flufenican, fluroxipir, haloxidina, picloram, picolinafen, piriclor, piroxsulam, tiazopir, y triclopir; herbicidas de pirimidinadiamina, que incluyen iprimidam y tioclorim ; herbicidas de amonio cuaternario, que incluyen cipercuat, dietamcuat, difenzocuat, dicuat, morfamcuat y el paracuat ; herbicidas de tiocarbamato, que incluyen butilato, cicloato, di-alato, EPTC, esprocarb, etiolato, isopolinato, raetiobencarb, molinato, orbencarb, pebulato, prosulfocarb , piributicarb, sulfalato, tiobencarb, tiocarbazil, tri-alato y¡ i vernolato; herbicidas de tiocarbonato , que incluyen dimexano, ¡ EXD, y proxan; herbicidas de tiourea, que incluyen metiuro,^ herbicidas de triazina, que incluyen dipropetrina, triaziflam' y trihidroxitriazina ; herbicidas de clorotriazina , que incluyen atrazina, clorazina, cianazina, ciprazina,; i eglinazina, ipazina, mesoprazina, prociazina, proglinazina propazma, sebutilazina, simazma, terbutilazina, trietazina; herbicidas de metoxitriazina , que incluyen atraton, metometon, prorneton, secbumeton, simeton y terbumeton, herbicidas de metiltiotriazina que incluye ametrin, aziprotrina, cianatrin, desmetrin, diraetametrin, metoprotrina, proraetrin, simetrin, terbutrin; herbicidas de triazinona, que incluyen ametridiona, amibuzin, hexazinona, isometiozin, metamitron, metribuzin; herbicidas de triazol, que incluyen amitrol, cafenstrol, epronáz, y flupoxam; herbicidas de triazolona, que incluyen amicarbazona, bencarbazona , carfentrazona, flucarbazona, ipfencarbazona, propoxicarbazona, sulfentrazona y tiencarbazona; herbicidas de triazolopirimidina, que incluyen cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, piroxsulam; herbicidas de uracilo, que incluyen benzfendizona , bromacilo, butafenacilo , flupropacilo, isocilo, lenacilo, saflufenacilo, y terbacilo; herbicidas de urea, que incluyen benztiazurón, cumilurón, ciclurón, dicloralurea, diflufenzopir, isonorurón, isourón, metabenztiazurón, monisouron y noruron; herbicidas¡ de fenilurea, que incluyen anisurón, buturón, clorbromurón, ¡ cloreturón, clorotolurón, cloroxurón, daimurón, difenoxurón, ' dimefurón, diuron , fenurón, fluometurón, fluotiurón(| isoproturón, linurón, metiurón, metildimron, metobenzurón,| I metobromurón, metoxurón, monolinurón, monurón, neburón,' paraflurón, fenobenzurón, sidurón, tetrafluron y tidiazuron,-j herbicidas de sulfonilureas ; herbicidas pirimidinilsulfonilurea, que incluyen amidosulfurón,' i azimsulfurón, bensulfurón, clorimurón, ciclosulfamurón,(' I I I I etoxisulfurón, flazasulfurón, flucetosulfurón, flupirsulfurón, foramsulfurón, halosulfurón, imazosulfurón, mesosulfurón, nicosulfurón, ortosulfamurón, oxasulfurón, primisulfurón, pirazosulfurón, rimsulfurón, sulfometurón, sulfosulfurón, y trifloxisulfurón; herbicidas de triazinilsulfonilurea, que incluyen clorsulfurón, cinosulfurón, etametsulfurón, yodosulf rón, metsulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, triasulfurón, tribenurón, triflusulfurón y tritosulfurón; herbicidas de tiadiazolilurea, que incluyen butiurón, etidimurón, l tebutiurón, tiazaflurón y tidiazurón y herbicidas no i I clasificados, que incluyen acrolema, alcohol alilico, I aminociclopiraclor , azafenidina, bentazona, i benzobiciclon, butidazol, cianuro de calcio, cambendiclor, j clorfenac, clorfenprop, clorflurazol , clorflurenol , j I cinmetilina, clomazona, CPMF, cresol, cianamida, orto-J diclorobenceno , dimepiperato, endotal, fluromidina , ; fluridona, fluorcloridona, flurtamona, flutiacet, indanofan,( isotiocianato de metilo, OCH, oxaziclomefona , ! ¡ pentaclorofenol , pentoxazona, acetato de fenilraercurio,; i pinoxaden, . prosulfalin, piribenzoxim, piriftalido^1 quinoclamina , rodetanilo, sulglicapin, tidiazimin, tridifano,: trimeturón, tripropindan, y tritac. La lista anterior es solo un ejemplo y otros herbicidas se pueden usar y considerar dentro del alcance de la presente invención.

Los ejemplos de insecticidas, acaricidas, nematicidas , y molusquicidas específicos que se pueden usar en las composiciones mostradas en este documento incluyen, pero no se limitan a: abamectina; acefato; acetamiprida; acrinatrina; alanicarb; aldicarb; alfa-cipermetrina ; alfametrina; amitraz; azinfos A; azinfos-metilo; azociclotina; bendiocarb; benfuracarb; bensultap; ciflutrina beta,- bifentrina ,-brofenprox; bromofos A; bufencarb; buprofezina; butocarboxin; butilpiridaben; cadusafos; carbaril, carbofurano, j i carbofenotión; carbosulfán; cartap; cloetocarb; i í clorantraniliprol; cloroetoxifos ; , I clorfenvenfos ; clorofluazurón; cloromefos; cloropirifos ; I cisresmetrina; clocitrina; clofentezina ; clotianidina ; cianoimina; cianofos; cicloprotrina, ciflutrina, cihexatina ; ¡ deltametrina ; deméton M; demeton S; demeton-S-metilo;j diafentiurón; dibutilaminotio; diclofentión; ¡ diclifos; dietion; diflubenzuron; dimetoato; dimetilvinfos ,-j dinotefurán; dioxatión; doramectina ; edifenfos; emamectina;! i endosulfan; esfenvalerato ; etiofencarb ; etión; etiprol;; i etofenprox; etoprofos; etrimfos; fenamifos; fenazaquin; óxido de fenbutatina ; fenitrotión; fenobucarb; fenotiocarb;¡ fenoxicarb; fenpropatrin; fenpirad; fenpiroximato; fentión;! fenvalerato; fipronil; fluazinam; flubendiamida ;¡ I flucicloxuron; flucitrinato; flufenoxuron; flufenprox;' i fluxofenim; fonofos; formotión; fostiazato; fubfenprox; I I I cihalotrina gamma; HCH; heptenofos; hexaflumurón; hexitiazox; imidacloprid; iprobenfos; isoprocarb; isoxatión; ivermectina, cihalotrina lambda, lindano, lufenurón, malatión; mecarbam; mesulfenfos; metaldehido; metamidofos; metiocarb; metomilo; metolcarb; mevinfos; milbemectina ; oxima milbemicina; moxidectina; naled; NC 184; nitenpiram; nitrometileno ; ometoato; oxamilo; oxidemeton ; oxideprofos, paratión, paratión-metilo; permetrina; fentoato; forato; fosalona; fosmet; foxim; pirimicarb; A pirimifos; pirimifos M; promecarb; propafos; propoxur; protiofos; protoato; j pimetrozina; piraclofos; piradafention; piresmetrina ; piretrun; piridabeno; pirimidifeno ,- ! piripfoxifeno; piriproxifeno; rinaxipir; salition; sebufos; ¡ I silafluofen; sulfotep; sulprofos; tebufenozida; tebufenpirad; ' tebupirimfos ; teflubenzurón; teflutrina; temefos; terbam; , i terbufos; tetraclorovinfos ; tiacloprid; tiafenox; tiametoxam; tiodicarb; tiofanox; tionazin; turingiensin; tralometrina ; triarteno; triazamato; triazofos; triazurón; triclorofona; triflumurón; trimetacarb; vamidotiona; xililcarb; zeta-cipermetrina ; zetametrina; y productos de Bacillus ¡ thuringiensis (Bt) , que incluyen las sales y ésteres de éstos. La lista anterior es solo un ejemplo y otros] j insecticidas se pueden usar y considerar dentro del alcance; de la presente invención.

Una variedad de fungicidas se pueden usar en lasj I modalidades de la presente invención. Ellos incluyen, por ejemplo, aquellos clasificados y enumerados por el Comité de Acción para la Resistencia a Fungicidas (FRAC) , LISTA 1 DEL CODIGO FRAC: Fungicidas, ordenados por el Código FRAC, diciembre de 2006, que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Un resumen de esta lista incluye: metil benzimidazol carbamatos (MBC) : por ejemplo, benzimidazoles y tiofanatos; dicarboximidas ; inhibidores de la desmetilación (DMI) (SBI: Clase I) : por ejemplo, imidazoles, piperazinas, piridinas, pirimidinas, y triazoles; fenilamidas (PA) : por ejemplo, acilalaninas , oxazolidinonas , y butirolactonas ; aminas (SBI: Clase II) : por ejemplo, morfolinas, piperidinas y espiroquetalaminas fósforo-tiolatos y ditiolanos; carboxamidas : por ejemplo, benzamidas, furano carboxamidas, oxatin carboxamidas, tiazol, I carboxamidas, pirazol carboxamidas y piridin carboxamidas;; hidroxi - ( 2 -amino) pirimidinas; anilino-pirimidinas (AP) ; N-! i fenil carbamatos, inhibidores externos de la quinona (Qol) :! por ejemplo, metoxiacrilatos , metoxi-carbamatos , oximind ¡ acetatos, oximino-acetamidas , oxazolidina-diones , dihidro-! dioxazinas, imidazolinonas y bencil carbamato; fenilpirroles ;'¦ quinolinas; hidrocarburos aromáticos (AH) y heteroaromáticos j I: por ejemplo, 1 , 2 , 4 -tiadiazoles ; ácidos cinámico,! í inhibidores reductasa de la biosíntesis de melanina (MBI- R) :' i por ejemplo, isobenzofuranona , pirroloquinolinona y I j i ¡ triazolobenzo-tiazol ; inhibidores deshidratasa de la ' biosíntesis de melanina (MBI-D) : por ejemplo, ciclopropano- 1 carboxamida, carboxamida y propionamida; hidroxianilidas [ I (SBI: Clase III); hidroxianilidas (SBI : Clase IV): por' i ejemplo, tiocarbamatos y alilaminas; polioxinas: por ejemplo^ nucleósido peptidil pirimidina; fenilureas; inhibidores j dentro de la quinona (Qil) : por ejemplo, cianoimidazol y i sulfamoil-triazoles ; benzamidas : por ejemplo, toluamidas; ¡ antibióticos: por ejemplo, ácido enopiranurónico, ' i hexopiranosil , estreptomicina, y validamicina; I cianoacetamida-oximas , carbamatos; dinitrofenil crotonatos ; j pirimidinona-hidrazonas , 2 , 6 -dinitro-anilinas ,- compuestos | orgánicos del estaño: por ejemplo, compuestos de trifenil! estaño; ácidos carboxílieos ; heteroaromáticos II: por ejemplo1 isoxazoles e isotiazolonas ; fosfonatos: por ejemplo, etilj fosfonatos y ácido fosforoso y sales, ácidos ftalámicos ; I I benzotriazinas ,- benceno-sulfonamidas ; piridazinonas ,- tiofeno-j carboxamidas ; pirimidinamidas ; CAA-fungicidas (amidas de¡ ácidos carboxílicos) : por ejemplo, amidas del ácido cinámico,! carbamatos de valinamida y amidas del ácido mandélico;' í tetraciclina ; tiocarbamato ; benzamidas: por ejemplo,', i acilpicolidas ; inductores de defensa de la planta huésped^ por ejemplo, benzo-tiadiazol BTH, bencisotiazol y tiadiazol-; carboxamidas; materiales no clasificados: por ejemplo, tiazoli i carboxamidas, fenil-acetamida, quinazolinona y benzofenona;' i I materiales de contacto multi-sitio .· por ejemplo , sales de cobre, azufre, ditiocarbamatos , y similares, ftalimidas, cloronitrilos (ftalonitrilos) , sulfamidas, guanidinas, triazinas, y quinonas (antraquinonas) ; materiales no clasificados: por ejemplo, aceites minerales, aceites orgánicos, bicarbonato de potasio, y materiales biológicos.

Aquellas personas con conocimientos en la técnica podrán reconocer que el uso de otros fungicidas es posible también en varias modalidades de la invención, y el fallo al enumerar un fungicida o una clase de fungicida en este documento no implica la limitación de las reivindicaciones.

La composición de la presente invención se puede microencapsular en una sustancia polimérica. Los ejemplos de los materiales de microencapsulación adecuados incluyen las siguientes clases de materiales para los que miembros representativos. Será evidente personas con conocimientos en la técnica que materiales con propiedades poliméricas se pueden usar y que! í otros materiales dentro de cada clase dada y otras clases1 I poliméricas se pueden usar para la microencapsulación. En1 I esta descripción, la microencapsulación se toma para incluir i los métodos y los materiales para la nanoencapsulación . Los' i ejemplos incluyen pero no se limitan a: las gomas y las' I macromoléculas naturales: tales como, goma arábica, agar,' alginato de sodio, carragenano, y gelatina; carbohidratos :: t tales como, almidón, dextrana, sacarosa, sirope de maíz, y ß- ¡ ciclodextrina celulosas y macromoléculas semisintéticas : j tales como, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, I etilcelulosa, nitrocelulosa, acetilcelulosa, acetato-ftalato 1 de celulosa, acetato-butilato-ftalato de celulosa, epoxi y j poliéster; lípidos: tales como cera, parafina, ácido : i esteárico, monoglicéridos , fosfolípidos , diglicéridos , cera de abeja, aceites, grasas, aceites endurecidos, y lecitina; ; materiales inorgánicos: tales como, sulfato de calcio, j silicatos y arcillas; proteínas: tales como, gluten, caseína, gelatina, y albúmina; materiales biológicos: tales como, las > células vacías a partir de organismos como la levadura del ! panadero y otros microorganismos junto con otros tej idos j celulares anteriormente vivos. Además, estos materiales se pueden usar por separado o compuestos en los procesos de ! micro o nano-encapsulación . ¡ Otro aspecto aún de la presente invención se dirige a unj método de inducir una respuesta de la planta. Este método consiste en aplicar a una planta, semilla de la planta oi fruto, la composición de la presente invención. La aplicaciónj de la composición a una planta, semilla de la planta o fruto, se lleva a cabo bajo condiciones eficaces para inducir una respuesta de la planta a la aplicación de la composición. ' La respuesta de las plantas a la composición incluye! cualquier respuesta que se produce por el contacto con una; proteína o polipéptido harpin. Por ejemplo, la respuesta puede incluir, sin limitación, resistencia a enfermedades, j crecimiento de la planta, resistencia a los insectos, \ resistencia al estrés, resistencia a enfermedades posteriores ¡ a la cosecha y la resistencia a la desecación.

I Con respecto a conferir la resistencia a las ¦ enfermedades, no se puede atribuir inmunidad absoluta contra i la infección, pero la gravedad de la enfermedad se puede i reducir y se puede retrasar el desarrollo de los síntomas. El i i número de lesiones, el tamaño de la lesión, y la extensión de ¡ la esporulación de los patógenos fúngicos se pueden disminuir. Este método de conferir resistencia a las' enfermedades tiene el potencial de tratar las enfermedades ! previamente intratables, el tratamiento de las enfermedades] de forma sistémica que no se podrían tratar por separado! debido al costo, y evitar el uso de los agentes infecciosos o; materiales ambientalmente perjudiciales.

En lo que respecta a la desecación, no se puede conferirj protección completa contra la desecación, pero se puedej reducir la gravedad de la desecación. La protección contra la¡ i desecación dependerá inevitablemente, al menos en cierta; medida, de otras condiciones tales como las temperaturas de: almacenamiento, la exposición a la luz, etc. Sin embargo,! controlar la desecación tiene el potencial de eliminar! algunos otros tratamientos (es decir, el uso de ceras dé recubrimiento) , que pueden contribuir a reducir los costos o, al menos, sustancialmente no aumentar los costos.

Conferir resistencia a los patógenos de las plantas, de acuerdo con la presente invención es útil para conferir resistencia a una amplia variedad de patógenos que incluyen j virus, bacterias y hongos. La resistencia, entre otras cosas, j para los siguientes virus se puede lograr por el método de la presente invención: el virus del mosaico del tabaco y el > virus del mosaico del tomate. La resistencia, entre otras cosas, para las siguientes bacterias también se puede < I conferir a las plantas de acuerdo con la presente invención:! Pseudomonas solancearum, Pseudomonas syringae pv. tabaci yj Xanthamonas campestris pv. pelargonii. Las plantas se puedenj hacer resistentes, entre otras cosas, a los siguientes hongosj por el uso del método de la presente invención: Fusarium j oxysporum y Phytophthora infestans .

Con respecto a mejorar el crecimiento de las plantas, se i pueden lograr diversas formas de mejora o promoción del crecimiento de las plantas. Esto puede ocurrir tan temprano' como cuando la planta comienza a crecer a partir de las semillas o más tarde en la vida de una planta. Por ejemplo,j el crecimiento de las plantas de acuerdo con la presente invención incluye un mayor rendimiento, una cantidad aumentada de semillas producidas, un porciento aumentado dé semillas germinadas, aumento del tamaño de la planta, mayor biomasa, más y mayores frutos, 'coloración temprana del fruto, 1 y maduración temprana de la planta y del fruto. Como j resultado, las composiciones de la presente invención I proporcionan beneficio económico significativo para los cultivadores. Por ejemplo, la germinación temprana y la maduración temprana permiten que los cultivos crezcan en ; I zonas donde las temporadas cortas de crecimiento podrían, de ¡ otra manera, impedir su crecimiento en ese lugar. El j í porciento aumentado de germinación de las semillas da lugar a sitios de cultivo mejorados y un uso más eficiente de las i semillas. Un mayor rendimiento, el tamaño aumentado y la ! producción de biomasa mejorada permiten una mayor generación, de ingresos a partir de una determinada parcela. i El control de los insectos, de acuerdo con la presente I invención, incluye prevenir el contacto de los insectos con las plantas a las que se les aplicó el inductor de respuesta; hipersensible , prevenir el daño directo del insecto a las! plantas mediante el perjuicio a la alimentación, provocar la¡ salida de los insectos de esas plantas, matar a los insectos1 próximos a esas plantas, interferir con la alimentación de la] larva del insecto en esas plantas, evitar la colonización de; los insectos en las plantas hospederas, evitar la liberación de fitotoxinas de los insectos colonizadores, etc. La! composición de la presente invención puede evitar también el daño posterior de enfermedades de las plantas que resulta de I la infección de los insectos.

La composición de la presente invención es eficaz contra una amplia variedad de insectos. El barrenador del maíz europeo es una plaga importante del maíz (maíz dentado y dulce) , pero también se alimenta de más de 200 especies de plantas, que incluyen las judías verdes, frijolillos, habas, soya, pimientos, papa, tomate, y muchas especies de malas hierbas. Las plagas adicionales que alimentan las larvas de insectos que dañan una variedad amplia de cultivos vegetales incluyen, sin limitación, el gusano de la remolacha, oruga medidora del repollo, gusano de la mazorca de maíz, gusano cogollero, polilla dorso de diamante, gusano de la raíz de la col, gusano de la cebolla, gusano de la semilla de maíz, barrenador (gusano de melón) , gusano del pimiento, y lombriz del tomate. Conjuntamente, este grupo de plagas de insectos] representan el grupo de plagas de mayor importancia económica' i i para la producción de vegetales en todo el mundo. i Otro aspecto de la presente invención se refiere a\ i conferir a las plantas resistencia al estrés. El estrési i incluye cualquier factor ambiental que tenga un efecto' adverso sobre la fisiología y el desarrollo de la planta. Los ejemplos de estrés ambiental, incluyen, sin limitación, el estrés relacionado con el clima (por ejemplo, sequía, agua,' i las heladas; baja temperatura, alta temperatura, luz excesiva y luz insuficiente) , el estrés por la contaminación del aire I í I (por ejemplo, dióxido de carbono, monóxido de carbono, dióxido de azufre , NOX, hidrocarburos, ozono, radiación ultravioleta, lluvia ácida) , químicos (por ejemplo, insecticidas, fungicidas, herbicidas, metales pesados) , y el estrés nutricional (por ejemplo, fertilizantes, micronutrientes , macronutrientes) . La composición de la presente invención se puede usar para conferir resistencia a las plantas contra tales formas de estrés ambiental.

Este método de la presente invención se puede usar para controlar un número de enfermedades posteriores a la cosecha causadas por una variedad de patógenos. Estas enfermedades posteriores a la cosecha y los agentes causales que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen, sin limitación, los siguientes: Penicillium (por ejemplo, I Penicillium digitatum) , Botrytis (por ejemplo, Botrytis I cinereaon) , Phytophthora {por ejemplo, Phytophthora\ i ci rop hora) y Erwinia {por ejemplo, Erwinia carotovora) . \ El método de la presente invención, que involucra laj aplicación de la composición de la presente invención, se¡ puede llevar a cabo a través de una variedad de' procedimientos cuando toda o parte de la planta se trata e incluye, sin limitación, las hojas, tallos, raíces, propágulos (por ejemplo, recortes) , fruto, etc. Esto puede1 (aunque no necesariamente) involucrar la infiltración de la proteína o polipéptido harpin en la planta. Los métodos de I aplicación adecuados incluyen la pulverización a alta o baja presión, la inyección, y la abrasión de la hoja próximo a cuando tiene lugar la aplicación del inductor. Los medios de j aplicación adecuados también pueden incluir atomización, j espumado, nebulización, recubrimiento, e incrustación. i Al tratar las semillas de las plantas, la proteína o | polipéptido harpin se puede aplicar por pulverización a baja ! o alta presión, recubrimiento, inmersión, o | inyección. Aquellas personas con conocimientos en la técnica 1 i pueden prever otros procedimientos de aplicación adecuados : que proporcionen la posibilidad de efectuar el contacto de la t i proteína o polipéptido inductor de la respuesta hipersensible con las células de la planta o las semillas de las I plantas. Una vez tratadas con la composición de la presente | invención, las semillas se pueden plantar en el suelo natural o artificial y cultivar mediante procedimientos! convencionales para producir las plantas. Después que las¡ plantas se reproducen a partir de las semillas tratadas de¡ acuerdo con la presente invención, las plantas se pueden' tratar con una o más aplicaciones de la composición de la' i presente invención para conferir a las plantas resistencia a; la enfermedad, para mejorar el crecimiento de la planta, para; controlar los insectos en las plantas, conferir resistencia I al estrés, y/o resistencia a las enfermedades posteriores a la cosecha. ¡ I La aplicación de la composición de la presente invención a un fruto o vegetal se puede llevar a cabo para mejorar la longevidad del fruto o la madurez vegetal, así como inhibir el desarrollo de enfermedades posteriores de la cosecha y la desecación del fruto o vegetal cosechado. De acuerdo con una modalidad, un fruto o vegetal se trata con una composición líquida de la presente invención bajo condiciones eficaces para lograr estos efectos. La aplicación de una composición i I líquida de la presente invención a un fruto o vegetal se¦ puede realizar tanto antes de la cosecha como después de la, cosecha del fruto o vegetal, usando las técnicas descritas en i este documento. I En una modalidad, la aplicación de la composición es aj una planta, j La aplicación de la composición a una planta se puede llevarl a cabo a una tasa de aproximadamente 0.1 a 10.000 g/ha de¡ proteína o polipéptido harpin. De preferencia, la aplicación; a una planta se lleva a cabo a una tasa de aproximadamente 10¡ a 1.000 g/ha de proteína o polipéptido harpin. ' i i En otra modalidad de este método de la presente i invención, la aplicación de la composición es a la semilla de I i la planta. La aplicación de la composición a una semilla de la planta se puede llevar a cabo a una tasa de i aproximadamente 0.001 a 50 g/kg de proteína o polipéptido harpin a la semilla. De preferencia, la aplicación a una semilla de la planta se lleva a cabo a una tasa de I aproximadamente 0.01 a 10 g/kg de proteína o polipéptido 1 harpin a la semilla. I Las composiciones de la presente invención se pueden 1 aplicar a una planta, semilla de la planta, o fruto de acuerdo con la presente invención, solo o en una mezcla con ! otros materiales. Alternativamente, la composición de la | presente invención se puede aplicar por separado a las ¡ plantas con otros materiales que se aplican en diferentes momentos . I I El método de la presente invención se puede utilizar: i para tratar una amplia variedad de plantas o sus semillas, para conferir resistencia a las enfermedades, mejorar el ¡ crecimiento, controlar los insectos, conferir resistencia' i al estrés, y/o resistencia a las enfermedades posteriores a la cosecha. Las plantas adecuadas incluyen las! dicotiledóneas y monocot iledóneas . Más particularmente,' las plantas de cultivo útiles pueden incluir, sin limitación, la alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, j algodón, girasol, maní, maíz, papa, boniato, frijoles, ¡ i guisantes, achicoria, lechuga, escarola, col, brotes de1 I Bruselas, remolacha, chirivía, nabo, coliflor, brócoli,; nabo, rábano, espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimiento,! apio, zanahoria, calabaza, calabacín, pepino, manzana; j pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soya, i tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar. Los ejemplos de las plantas ornamentales incluyen, sin limitación, Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunias, geranios, flor de pascua, crisantemo, clavel, y zinnia.

Estos aspectos de la presente invención se ilustran, además, mediante los ejemplos a continuación EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar las modalidades de la presente invención, pero no pretenden, I I de ninguna manera, limitar su alcance. i i Ejemplo 1 - Preparación de una composición liquida estable que contiene aß harpin y su eficacia en un ensayo de¡ resistencia a las enfermedades ! La E. coli recombinante se usó para expresar ß harpin¡ I (la superharpin de sec . con núm. de ident . : 1) bajo el. control de un promotor constitutivo. Después de la| fermentación, la suspensión se diluyó en dos veces el volumen! de tampón fosfato de potasio para ajustar el pH de la' I I suspensión a 7.0.

La solución resultante se trató con calor a 95 °C durante 10 minutos con un sistema de intercambio de calor y después se enfrió en 40 minutos a 45 °C. Después de alcanzar entre aproximadamente 38-42°C, se adicionó lisozima a la solución i mezclando a la concentración final de 1 ppm, y después se dejó reaccionar durante 45 minutos. Esto facilitó la ruptura de la pared celular bacteriana, lo que resulta en la formación de un extracto crudo de aß harpin.

El extracto crudo resultante se centrifugó después durante 5 minutos para eliminar algunos de los restos celulares. El sobrenadante resultante se dividió, y después se trató con calor, a (i) 121°C bajo 15 psi de presión durante 5 minutos, o (ii) 100°C durante 10 minutos. Después que la temperatura se enfrió a 20-25°C, el extracto se centrifugó durante otros 5-10 I minutos a 20.000 rpm para eliminar los restos dej células restantes y algunas de las proteínas¡ desnaturalizadas. El sobrenadante clarificado, quej contenía ß harpin libre de los restos celulares y la¡ mayoría de las proteínas desnaturalizadas, se usó paral formar la composición líquida estable. j En un tratamiento de los dos sobrenadantes clarificados; (i) y (ii), se adicionó el desinfectante de Triple Acción al! I extracto de la ß harpin a una concentración final de 0.5%; i para evitar, además, el crecimiento de cualquier organismo vivo. En otro tratamiento, no se adicionaron antibióticos ni i desinfectantes. j Las composiciones resultantes se probaron para (i) lá proteína aß harpin con el análisis HPLC y (ii) su eficacia en I un ensayo de resistencia a la enfermedad. Una composición procesada de forma similar que contiene tampón fosfato salino con y sin 0.5% de Triple Acción se usaron como controles negativos. El producto comercial ProAct™ (Plant Healthcare, Inc.) , con 1% de aß harpin se usó como un control positivo en el ensayo de inducción de resistencia a las enfermedades.

Análisis HPLC Para el análisis HPLC las siguientes pruebas se llevaron a cabo. Muestra 1: tratada a 100°C durante 10 j minutos sin Triple Acción; Muestra 2: tratada a 100°Cj i durante 10 minutos más 0.5% de Triple Acción; Muestra 3:j tratada a 121°C durante 5 minutos sin Triple Acción, y Muestra 4: tratada a 121°C durante 5 minutos con 0.5% de, Triple Acción.

El análisis HPLC indicó que la composición líquida de: I i aß harpin solo es estable durante aproximadamente 4 semanas en el tratamiento de 100°C durante 10 minutos sin; la adición de un desinfectante. El mismo tratamiento, pero' I con la adición de 0.5% de desinfectante Triple Acción i resultó en la estabilidad de aß harpin durante más de 3¡ i ¡ meses. El tratamiento a 121°C durante 5 minutos con o sin Í la adición de desinfectante es también estable durante más i de 3 meses. Los resultados de estos experimentos que i muestran la concentración de aß harpin se exponen en la I I I Tabla 4 a continuación.

Tabla 4: Datos de la estabilidad de las composiciones líquidas Semana 1 2 3 4 5 6 7 100°C,10 min., sin desinfectante 5.87 6.35 6.32 l 4/7 Tl 3.8 100°C, 10 min., 5.61 5.97 5.51 6.02 6 6.6 6.1 0.5% desinfectante (Triple Acción) ¡ 121°C, 5 min., sin desinfectante 5.67 6.6 6.4 5.6 5.4 5.4 5.9 ¡ 121°C, 5 min., 0.5% desinfectante 6.98 6.2 6.6 5.7 6.4 6.4 5.89 i (Triple Acción) ' Semana 8 9 Ib" ?? 12 13 14 15 ' 100°C, 10 min., sin desinfectante 2.7 _ _ _ _ _ _ . 100°C, 10 min., 5.9 5.7 5.86 5.95 5.7 5.65 6.23 5.71 ¡ 0.5% desinfectante (Triple | Acción) I 121°C, 5 min., sin desinfectante 5.88 5.75 5.5 5.4 5.6 5.5 5.7 5.65 121°C, 5 min. ,0.5% desinfectante 6.5 6.6 6.6 6.7 6.2 5.57 5.4 6.1 ! (Triple Acción) ! i I I Estos resultados indican que la biodegradación de una! formulación líquida de la proteína aß harpin se atribuye I principalmente al medio ambiente natural de un organismo vivo. Sin embargo, con el tratamiento a altas temperaturas o en presencia de un desinfectante, la formulación líquida dé la proteína aß harpin puede permanecer estable durante un período prolongado de tiempo.

Pruebas de inducción de resistencia a las enfermedades Las pruebas de inducción de resistencia a las enfermedades se condujeron de la siguiente manera. Además de las cuatro muestras descritas anteriormente, un 1% del producto seco ProAct™ se usó como un control positivo y 5 mM de tampón fosfato de potasio con y sin desinfectante se usaron como controles negativos. Todas las muestras que contienen harpin se aplicaron tópicamente por pulverización foliar a una tasa de 5 ppm a 6 plántulas de tabaco 8 semanas i i a continuación de la aparición de las primeras hojas | verdaderas. Todas las plántulas se cultivaron en condiciones j de invernadero a una temperatura de día de aproximadamente j 25°C y una temperatura nocturna de aproximadamente 18°C, con j aproximadamente 16 horas de luz solar durante el día yi aproximadamente 8 horas de oscuridad en la noche. La humedad} se mantuvo alrededor de 70%. ¡ Las plantas de tabaco se desafiaron con un virus del¡ mosaico del tabaco ("TMV") a una concentración de 2 ug/ml. Lal gravedad de la enfermedad se evaluó por el conteo del número: I de lesiones que aparecen en las hojas 7 días después de la ? inoculación. Los datos de la prueba (Tabla 5) mostraron que! las composiciones líquidas de aß harpin lograron resultados' comparables con el producto comercial ProAct™ en términos de reducción de las lesiones TMV. Teniendo en cuenta los i i importantes beneficios que ofrecen las formulaciones líquidas sobre las formulaciones pulverizadas, señalados anteriormente, los usuarios podrían preferir las formulaciones líquidas, dada la eficacia comparable. 5: Resultados de las pruebas de inducción de encía a la enfermedad.

Si bien la invención se ha descrito en detalle con propósitos de ilustración, se entiende que tales detalles sólo son para este propósito, y aquellas personas con conocimiento en la técnica pueden realizar variaciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención el que se define por las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (33)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método de preparar una composición líquida estable que contiene una proteína o polipéptido harpin, caracterizado porque comprende : obtener un extracto líquido que está sustancialmente libre de restos celulares y comprende una proteína o polipéptido harpin; e introducir en el extracto líquido un agente biocida y, opcionalmente , uno o ambos de un inhibidor de proteasa y un tensioactivo no iónico, obteniendo de esta forma una composición líquida que comprende la proteína o polipéptido j harpin que mantiene la actividad harpin por al menos! I aproximadamente 72 horas. - j

2. El método de conformidad con la reivindicación l,t caracterizado porque la proteína o polipéptido harpin se i I selecciona de uno o más del grupo que consiste de homólogos; de Erwinia amylovora HrpN, homólogos de Erwinia amylovora, i HrpW, homólogos de Pseudomonas syringae HrpW, homólogos de Pseudomonas syringae HrpZ, homólogos de Xanthomonas i campestris HreX, y una proteína de fusión que comprende dos o más dominios inductores de respuesta hipersensible . .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la obtención comprende: calentar una suspensión bacteriana fermentada a una temperatura de aproximadamente 60 a 100 °C; enfriar la suspensión; lisar las células en la suspensión bacteriana; y eliminar los restos celulares de la suspensión.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, j caracterizado porque comprende, además, antes de el! calentamiento, ajustar el pH de la suspensión bacteriana; fermentada a un pH de aproximadamente 5.5 a 10. I

5. El método de conformidad con la reivindicación 4,¡ caracterizado porque el ajuste se lleva a cabo usando un, tampón fosfato de potasio o un tampón Tris-EDTA. i

6. El método de conformidad con la reivindicación 3,j caracterizado porque la lisis se lleva a cabo con una¡ lisozima a una concentración de aproximadamente 1 ppm a 100.

7. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el agente biocida se introduce en extracto líquido a una concentración de aproximadamente 1 a 100 ppm .

8. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque un inhibidor de proteasa se introduce el extracto líquido.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el inhibidor de proteasa se introduce en el extracto líquido a una concentración de aproximadamente 1 ppm a 100 ppm.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el inhibidor de proteasa se selecciona de la aprotinina, bestatina, inhibidor I de la calpaína, inhibidor II de la calpaína, quimostatina, E-64, leupeptina, alfa-2 -macroglobulina, pefabloc SC, pepstatina, fluoruro fenilmetanosulfonilo y tosil-L- lisina clorometil cetona.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un tensioactivo no iónico se introduce j en el extracto líquido. I

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, j caracterizado porque el tensioactivo no iónico se introduce en el extracto líquido en una cantidad en volumen de ¡ aproximadamente 0.05% a 10%. !

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, j caracterizado porque tanto un inhibidor de proteasa y un! tensioactivo no iónico se introducen en el extracto líquido. ¡ I

14. Una composición líquida caracterizada porque se! Í obtiene por el método de la reivindicación 1. j

15. Una composición caracterizada porque comprende un! portador acuoso, una proteína o polipéptido harpin, unaj I cantidad eficaz de un agente biocida, y, opcionalmente , una¡ I i cantidad eficaz de uno o ambos de un inhibidor de la proteasa y un tensioactivo no iónico, donde la composición mantiene la actividad harpin durante al menos aproximadamente 72 horas.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la proteína o polipéptido harpin se i selecciona de uno o más del grupo que consiste de los homólogos de Erwinia amylovora HrpN, homólogos de Erwinia j amylovora HrpW, homólogos de Pseudomonas syringae HrpW, J homólogos de Pseudomonas syringae HrpZ, homólogos de j Xanthomonas campestris HreX, y una proteína de fusión que 1 comprende dos o más dominios inductores de respuesta hipersensible .

17. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el agente biocida está presente en una cantidad de aproximadamente 1 ppm a 100 ppm.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque está en forma de una solución, i emulsión, concentrado emulsificable, suspensión, espuma, aerosol, concentrado suspoemulsión, lechada, o pasta. i i

19. La composición de conformidad con la reivindicación | 15 caracterizada porque comprende, además: una cantidad eficaz de un herbicida, insecticida, ¡ atrayente, esterilizante, bactericida, acaricida, ! nematicida, fungicida, y/o regulador del crecimiento.

20. La composición de conformidad con la reivindicación l i I I 15, caracterizada porque está microencapsulada en una sustancia polimérica.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque mantiene al menos aproximadamente i 50% de la actividad durante más de 72 horas. i

22. La composición de conformidad con la reivindicación j 15, caracterizada porque mantiene al menos aproximadamente j 90% de la actividad durante más de 3 meses. j

23. La composición de conformidad con la reivindicación! 15, caracterizada porque comprende un inhibidor de proteasa.

24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el inhibidor de proteasa se presenta en una cantidad de aproximadamente 1 ppm a 100 ppm.

25. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el inhibidor de proteasa se selecciona de aprotinina, bestatina, inhibidor I de la calpaína, inhibidor II de la calpaína, quimostatina , E-64, ¡ leupeptina, alfa-2-macroglobulina, pefabloc SC, pepstatina, PMSF, y TLCK.

26. La composición de conformidad con la reivindicación ¡ I 15, caracterizada porque comprende un tensioactivo no iónico.

27. La composición de conformidad con la reivindicación! 26, caracterizada porque el tensioactivo no iónico sel presenta en una cantidad en volumen de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 10%.

28. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende tanto un inhibidor de proteasa como un tensioactivo no iónico.

29. Un método de inducir una respuesta de la planta caracterizado porque comprende: aplicar a una planta, semilla de la planta o fruto, la composición de conformidad con la reivindicación 14, la aplicación se lleva a cabo bajo condiciones eficaces para inducir una respuesta de la planta a la aplicación.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, í caracterizado porque la respuesta de la planta es una o más i de resistencia a enfermedades, crecimiento de la planta,! resistencia a los insectos, y resistencia a la desecación. í

31. El método de conformidad con la reivindicación 29, ¡ I caracterizado porque la aplicación se lleva a cabo mediante( pulverización, atomización, espuma, nebulización,! i recubrimiento, y/o incrustación. , I

32. El método de conformidad con la reivindicación 29, | caracterizado porque la aplicación es a una planta a una tasaj de aproximadamente 0.1 a 10,000 g/ha de proteína oj polipéptido harpin. j

33. El método de conformidad con la reivindicación 29,; caracterizado porque la aplicación es a una semilla de la planta a una tasa de aproximadamente 0.001 a 50 g/kg de I proteína o polipéptido harpin a la semilla. 1