CN108264563A - 葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽及其制备方法，它由三种Hrps多肽和葡聚糖通过共价修饰形成共价三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)_n‑(C₆H₁₀O₅)_n；其中，三种Hrps多肽为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。通过葡聚糖修饰几个Hrps多肽组合片段，以共价复合的方式，将葡聚糖和几个Hrps功能多肽组合片段制备成完全和部分不完全共价三聚肽，即(3Hrps)_n‑(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽，使获得的Hrps‑葡聚糖新产品的乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，功能更多，应用范围更广。

Description

葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及葡聚糖修饰几个Hrps功能多肽组合片段的技术方法，以及通过该技术方法，将葡聚糖和几个Hrps功能多肽片段不同程度的共价复合，生成完全和部分不完全共价三聚肽，以及共价三聚肽产物在多领域的应用。

背景技术

所有生物的细胞表面都由许多不同类型的糖链所包被,而且在细胞内也存在各种类型的糖基化。寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸以多种形式共价连接,构成糖蛋白的糖肽连接链。糖蛋白是参与许多生物过程的基本物质,这些过程包括细胞生长、细胞与细胞的粘着、免疫应答、受精、凝血块的降解、病毒增殖、寄生虫感染和炎症反应等。随着蛋白质组技术的不断发展,糖基化蛋白质组的研究将越来越受到广泛的重视。

植物在长期进化中，在同周围各种生存和生长环境条件(包括生物的和非生物的)相互作用中，形成了一种共同的适应能力，这就是进化中形成的共同防御系统和生长系统，这是植物共有的一类防御机制和生长机制，并由多条信号通路和代谢途径来实现。

研究表明，Hrp蛋白类作为植物的上游信号物质，与植物细胞壁中广泛存在的受体Hrp结合蛋白(Harpin-binding proteins)结合并激活植物中的多条信号通路，这些信号通路的激活，将实现对植物固有的细胞防御和生长多条代谢途径和机制的启动和调控，这就是Hrp蛋白类作为植物生长调节剂和生物农药的作用机制。目前，称为超敏蛋白的Hrp蛋白类产品已被广泛研究、开发和应用，具有广阔的前景。

随着基因工程技术的发展，越来越多的多肽、酶、信号分子、细胞因子等蛋白类制品被研究开发，这些蛋白类制品具有专一性强、时效高、应用广泛、安全性好等优点，但同时也发现了几个显著的不足之处，比如(1)可溶性和均一度较差；(2)抗原性及免疫原性；(3)容易从循环系统中被快速清除；(4)不稳定，容易被体内外的酶降解；(5)外用时，容易被外界环境的微生物快速降解和光降解。

对于Hrps类蛋白来说，由于植物种类繁多，不同物种间、品种间生物学特性差异较大，内外环境也不同以及基因间互作的差异，不同来源和条件下获得的Hrps类蛋白及其制剂的性质在使用条件和效果上存在明显的选择性差异，单一种类的Hrps蛋白在功效上已经明显表现出不足；Hrps类蛋白作为应用于植物的一类上游功能性信号蛋白质，其可溶性和稳定性较差，同时，在自然条件下使用(叶面喷施和根施时)，很容易被外界环境的微生物快速降解和光降解，从而影响它们的时效和功效。

鉴于以上原因，需要对Hrps类蛋白进行结构改造和化学修饰。

结构改造和化学修饰法是指在分子水平上对蛋白质进行局部改造和修饰，即在体外将蛋白质的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的分子基团和大分子进行共价连接，形成完全和部分不完全的共价复合物，从而部分改变蛋白质的性质和结构，并显示出比各自独立存在时更优越的性能，该技术和方法已经在医药卫生和食品业的蛋白质产品的应用上引起越来越广泛的重视。

需要强调指出的是，对不同来源的Hrps类蛋白多肽进行组合、结构改造和化学修饰形成共价复合物，国内外目前均未见报道。

常见用于蛋白质修饰的分子基团和大分子很多，主要有聚乙二醇类(包括PEG和mPEG等)、多糖类，以及同源蛋白质及人工合成的多肽类、聚氨基酸等。对蛋白质的结构改造和化学修饰技术近几年来发展很快，针对不同的酶、多肽或蛋白质的化学修饰形成了多种技术和方法，但是，都有其适用范围和局限性，至今还没有普适的通用技术和方法可供选择和利用，随着蛋白质修饰技术研究的深入和发展，必将进一步促成能提高对各种不同蛋白质的修饰特异性好、修饰率高、操作简便、产物稳定性和功效性好的新技术和新方法的产生。

发明内容

本发明目的是提供一种葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽及其制备方法，使Hrps多肽乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，功能更多，应用范围更广。

本发明的技术方案为：葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，它由三种Hrps多肽和葡聚糖通过共价修饰形成共价三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n；其中，三种Hrps多肽为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。

进一步地，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4的质量配比为3:2:3:2。

进一步地，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为10:1至1:10。

进一步地，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为1:2。

进一步地，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为5300-257200。

进一步地，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为32000-38000。

葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽的制备方法，制备步骤如下：

(1)从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；

(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入葡聚糖，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为：10:1至1:10；加入磷酸缓冲液，使体系pH值为2-10；静置0-5小时，在温度为15-80℃、搅拌速度为30-300r/min条件下反应3-25小时；

(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得共价三聚肽，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n。

进一步地，步骤(2)中，磷酸缓冲液的浓度为10-200mmol/L，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和葡聚糖总质量的10-100倍。

优选地，制备方法如下：

(1)从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；其中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4四种Hrps多肽的质量配比为3:2:3:2。

(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入葡聚糖，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为32000-38000；三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为：1:2；加入浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和葡聚糖总质量的40倍，使体系pH值为7，静置1小时；在温度为46℃、搅拌速度为60r/min条件下反应12小时；

(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得共价三聚肽，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n。

四个Hrps功能多肽片段分别是:

SEQ NO ID:1所示的Hrps多肽片段来源于由356个氨基酸组成的HrpsNEccs基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸157-356)。

SEQ NO ID:2所示的Hrps多肽片段来源于由370个氨基酸组成的HrpsZpst基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由312个氨基酸组成，位于蛋白的N-端及C-端(氨基酸1-270和329-370)。

SEQ NO ID:3所示的Hrps多肽片段来源于由370个氨基酸组成的HrpsNEcb基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸171-370)。

SEQ NO ID:4所示的Hrps多肽片段来源于由339个氨基酸组成的HrpsNEch基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由326个氨基酸组成，位于蛋白的中段(氨基酸9-334)。

这些功能多肽片段都是专利发明人自主完成的基因及其表达产物研究成果，已由专利发明人在GenBank注册，它们注册号分别是：AY999002.1,AY999004,DQ355519.1及AY999001；按照这些功能多肽片段的大小、在保守区域位置和序列差异，以及Hrp蛋白基因来源细菌的特征，互补性地选择了这些片段，配置了四个组合，每种组合含有3个不同的多肽片段，将要进行的修饰多肽的四个片段组合分别是，I:1号、2号、3号,II:1号、2号、4号,III:1号、3号、4号和IV:2号、3号、4号，它们的表达通式是(3Hrps)_n，四个片段组合的表达式分别为(3Hrps)_n(I)、(3Hrps)_n(II)、(3Hrps)_n(III)和(3Hrps)_n(IV)。

对以上4个Hrps功能多肽片段作进一步的说明：

1、几个Hrps功能多肽来源的源头基因编码的Harpin蛋白，它们的大小和氨基酸序列组成都差异较大。1号HrpNEccs蛋白由356个氨基酸组成；2号HrpZpst蛋白由370个氨基酸组成；3号HrpNEcb蛋白由370个氨基酸组成；而4号HrpNEch蛋白只有339个氨基酸。

2、四个基因编码的Harpin蛋白都含Harpin家族蛋白质高度保守区域(DOMAIN)。Harpin家族蛋白质高度保守区域是Harpin类蛋白的主要功能区域，其卓越的生物功效主要由所含Harpin家族蛋白质高度保守区域的序列，以及这些保守区域的多肽高级结构所决定。

3，四个Harpin蛋白及其所含之Harpin家族蛋白质高度保守区域间的氨基酸序列无论从序列大小、位置以及氨基酸组成，它们间的差异都极大。1号蛋白的Harpin家族蛋白质高度保守区域由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸157-356)；2号蛋白的Harpin家族蛋白质高度保守区域由312个氨基酸组成，位于蛋白的N-端及C-端(氨基酸1-270和329-370)；3号蛋白的Harpin家族蛋白质高度保守区域由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸171-370)；4号蛋白的Harpin家族蛋白质高度保守区域由326个氨基酸组成，位于蛋白的中段(氨基酸9-334)。这4个Harpin家族蛋白质高度保守区域的多肽片段氨基酸序列以及保守区域的多肽高级结构决定了它们具有的卓越的生物功效。

寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸以多种形式共价连接,构成糖蛋白的糖肽链,我们所涉及的Hrps功能蛋白多肽片段，它们是只有一、二、三级结构而无四级结构的非酶蛋白质，不含胱氨酸和半胱氨酸，富含能与寡糖链以其它3种类型共价连接形成糖肽链的氨基酸。HrpNEccs基因编码蛋白中有丝氨酸40个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有丝氨酸19个；有苏氨酸13个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有苏氨酸10个；有赖氨酸18个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有赖氨酸16个；有脯氨酸9个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有脯氨酸6个；有甘氨酸75个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有甘氨酸26个；有精氨酸5个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有精氨酸6个；有天冬氨酸15个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有天冬氨酸13个；有谷氨酸9个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有谷氨酸7个。HrpZpst基因编码蛋白中有丝氨酸38个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有丝氨酸32个；有苏氨酸23个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有苏氨酸18个；有赖氨酸11个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有赖氨酸11个；有脯氨酸12个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有脯氨酸8个；有甘氨酸57个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有甘氨酸46个；有精氨酸4个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有精氨酸2个；有天冬氨酸27个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有天冬氨酸25个；有谷氨酸9个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有谷氨酸9个。HrpNEcb基因编码蛋白中有丝氨酸34个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有丝氨酸16个；有苏氨酸13个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有苏氨酸9个；有赖氨酸17个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有赖氨酸15个；有脯氨酸8个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有脯氨酸7个；有甘氨酸87个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有甘氨酸29个；有精氨酸4个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有精氨酸3个；有天冬氨酸17个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有天冬氨酸14个；有谷氨酸8个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有谷氨酸6个；以及HrpNEch基因编码蛋白中有丝氨酸40个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有丝氨酸40个；有苏氨酸14个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有苏氨酸13个；有赖氨酸21个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有赖氨酸20个；有脯氨酸5个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有脯氨酸5个；有甘氨酸55个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有甘氨酸55个；有精氨酸3个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有精氨酸3个；有天冬氨酸22个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有天冬氨酸22个；有谷氨酸4个，其中Harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有谷氨酸4个。这些结构决定了它们可以与寡糖链以多种形式共价连接的方式,构成糖蛋白的糖肽连接链，实现燕麦β-葡聚糖经修饰几个Hrps功能多肽片段制备共价三聚肽。

寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸以多种形式共价连接,构成糖蛋白的糖肽连接链,简称糖肽链。根据糖肽链类型,蛋白质糖基化可以分为四类,即以丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基为连接点,形成-O-糖苷键型；以天冬酰胺的酰胺基、N₂末端氨基酸的α-氨基以及赖氨酸或精氨酸的ω-氨基为连接点,形成-N-糖苷键型；以天冬氨酸或谷氨酸的游离羧基为连接点,形成酯糖苷键型以及以半胱氨酸为连接点的糖肽键。

燕麦中的β-(1→3，1→4)葡聚糖，简称燕麦β-葡聚糖，是一种非淀粉多糖。它由单体β-D-吡喃葡萄糖，通过β-(1→3)和β-(1→4)糖苷键连接起来形成的一种高分子聚合物。85％以上的燕麦β-葡聚糖分子中每2-3个β-(1→4)糖苷键间有1个β-(1→3)糖苷键连接，15％是由长链β-(1→4)糖苷键间隔1个β-(1→3)糖苷键组成，其长度可能有4、5个或8个葡萄糖残基。具有β-(1→3)键的直链状而无分支的多糖体结构，其中β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键的比例约为2.4:1。在燕麦胚乳和糊粉层细胞壁成分中，β-葡聚糖占85％以上。燕麦β-葡聚糖是一种相对分子质量较小的短链葡聚糖，其相对分子质量的变化范围为5300-257200。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明中，通过葡聚糖修饰几个Hrps多肽组合片段，以共价复合的方式，将葡聚糖和几个Hrps功能多肽组合片段制备成完全和部分不完全共价三聚肽，即(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽，使获得的Hrps-葡聚糖新产品的乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，功能更多，应用范围更广。

具体实施方式

技术实施过程和条件包含：

(1)Hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mM计量)配比：通常是以相同至不同mM质量组成组合；(2)葡聚糖的选择：相对分子质量范围为5300-257200；(3)多肽片段四个组合中的3个Hrps功能多肽片段和葡聚糖的质量配比：10:1至1:10之间；(4)反应溶液浓度：3个Hrps多肽片段和葡聚糖混合,10-200mM磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至100倍；(5)反应pH和静置处理：10-200mM磷酸缓冲液pH 2-10，静置处理0-5小时；(6)反应温度和时间：反应温度为15℃-80℃，反应时间3-25小时，反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度为每分钟30-300转；(7)制备Hrps功能多肽组合片段-葡聚糖共价三聚肽的最佳条件以反应溶液静置沉淀时间和诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间以及燕麦胚轴生长速度作为最终筛选依据(生物学效应)；(8)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3Hrps多肽)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽，简化通式为：(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n；(9)生成物检测：采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，结果表明,(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽形成大分子，在分离胶和浓缩胶界面处出现大分子量的新谱带,3个Hrps多肽片段的电泳谱带随着制备反应的进行逐渐减弱，证实Hrps多肽组合片段与葡聚糖之间发生共价交联，产生了共价复合物。对比试验表明，Hrps多肽组合片段经葡聚糖修饰后,(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽的乳化稳定性显著提高；zeta电位发生明显变化,等电点下降1个pH单位以上。

Hrps蛋白多肽片段的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽的制备，均采用相同方法同时并列进行，取得一致的结果。

实施例1

Hrps功能多肽组合片段-葡聚糖共价三聚肽的制备:

(1)Hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mM计量)配比：通常是以相同至不同mM质量组成组合；

(2)葡聚糖的选择：燕麦β-葡聚糖分子质量的通常范围是5300-257200；

(3)多肽片段四个组合中的Hrps功能多肽片段和葡聚糖的质量配比，通常为10:1至1:10之间；

(4)反应浓度，Hrps多肽组合片段和葡聚糖混合,10-200mM磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至100倍；

(5)反应pH和静置处理时间，通常为10-200mM磷酸缓冲液pH2-10和0-5小时；

(6)反应温度和时间：反应温度通常为15℃-80℃，反应时间通常为3-25小时，反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度每分钟通常为30-300转；

(7)制备Hrps功能多肽组合片段-葡聚糖共价三聚肽的最佳条件以反应溶液静置沉淀时间和诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间以及燕麦胚轴生长速度为最终筛选依据(生物学效应)；

(8)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽；

(9)产物检测：采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)表明,(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽形成大分子，在分离胶和浓缩胶界面处出现大分子量新谱带,3个Hrps多肽片段的电泳谱带随着制备反应的进行逐渐减弱，证实Hrps多肽组合片段与葡聚糖之间发生共价交联,产生了共价复合物。对比试验表明，Hrps多肽组合片段经葡聚糖修饰后，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽的乳化稳定性显著提高；zeta电位明显变化,等电点下降1个pH单位以上。

Hrps蛋白多肽片段的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽的制备，均采用同样方法同时并列进行，取得一致的结果。

制备Hrps多肽功能组合片段-葡聚糖共价聚合体的最佳条件以最终筛选依据(生物学效应)为响应值时，经多次对制备条件进行试验和筛选，获得优选的控制条件是，(1)Hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mM计量)配比：通常是以相同至不同mM质量组成组合，优选为1、2、3、4号片段均为相同mM质量，更优选为1号2mM、2号3mM、3号2mM和4号3mM，最优选为1号3mM、2号2mM、3号3mM和4号2mM组成组合；(2)燕麦β-葡聚糖的选择：分子量的通常范围是5300-257200，优选分子量为60000-70000、更优选为50000-60000、进一步优选为40000-50000，最优选为32000-38000；(3)Hrps多肽功能片段和葡聚糖的质量配比：通常为10:1到1:10，优选为8:1，更优选为1:8，进一步优选为4:1，再优选为1:4，最优选为1:2；(4)反应浓度：Hrps多肽组合片段和葡聚糖混合,通常50mM磷酸缓冲液稀释为混合物质量的为10-100倍，优选为20倍，更优选为80倍，进一步优选为30倍，再优选为60倍，最优选为40倍；(5)反应pH和静置处理时间：通常10-200mM磷酸缓冲液pH为2-10和时间为0-5小时，磷酸缓冲液，优选为10mM，更优选为150mM，进一步优选为30mM，再优选为80mM，最优选为50mM；反应pH,优选pH为4，更优选为pH8，进一步优选为pH 6，最优选为pH 7；优选静置处理时间为0小时，更优选为4小时，进一步优选为2小时，最优选为1小时；(6)反应温度和时间：反应温度通常为35℃-75℃，优选为40℃，更优选为60℃，进一步优选为50℃，最优选为46℃，特别要指出的是，提高热处理的温度可以增加糖基化产物的接枝度，但是，对于Hrps功能多肽而言，不要把温度提高到80℃，以免影响Hrps功能多肽的生物学效应；反应时间通常为3-25小时，优选为7小时，更优选为20小时，进一步优选为10小时，再优选为14小时，最优选为12小时；反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度通常为每分钟30-300转，优选为30转，更优选为250转，进一步优选为50转，再优选为100，最优选为60转；(7)制备Hrps功能多肽组合片段-葡聚糖共价三聚肽的最佳条件最终筛选依据是：反应溶液静置沉淀时间不得少于2小时，诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间不得超过4小时，以及燕麦胚轴生长速度不得低于0.03cm/h(生物学效应)；(8)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3Hrps多肽)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽，简化通式为：(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n。

Hrps蛋白多肽片段的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n共价三聚肽制备的优选控制条件试验，均采用同样方法同时并列进行，取得上述一致的结果。完成最终生成物(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽的制备以及产物检测。

进一步采用同样制备技术和条件，优选控制条件，以葡聚糖修饰更多Hrps类蛋白(Harpin_Eccs、Harpin_Ecc、Harpin_Ea、Harpin_Ech、Harpin_pst、Harpin_psg、Harpin_pss等，以及通过基因重组方式获得的融合蛋白Harpin_Eccs+Harpin_Ecc、Harpin_Eccs+Harpin_Ea、Harpin_Eccs+Harpin_Ech、Harpin_Ecc+Harpin_Eca、Harpin_Ecc+Harpin_Ech、Harpin_Ea+Harpin_Ech等)，制备多类型的异源共价二聚体、异源共价三聚体、异源共价四聚体以及异源共价多聚体。

实施例2

葡聚糖修饰Hrps蛋白多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽剂型设计:

(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽在制备、储存和应用中的设计剂型有：原药，包括固体即原粉和液体即原油；储存和应用的产品剂型包括颗粒剂、可湿性粉剂、水剂、缓释剂以及与其他肥料、或杀菌剂、杀虫剂或植物生长调节剂调制的混合制剂等。另外，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽的相关辅料和助剂，包括食品级的可溶性大量营养成分及少量营养成分。由于这类功能多肽共价聚合体(共价三聚肽)及其制剂无毒、无公害，使用时无需特殊的防护。

实施例3

葡聚糖修饰Hrps蛋白多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽的使用方法和要求:

应用这类功能多肽共价聚合体时：(1)处理植物的适宜方法包括浸种、拌种、种子包衣、蘸根、叶面喷雾、根施、注射、花果喷涂等；(2)处理植物的适宜条件包括选择适宜的用药时间和用药时的环境气象条件；颗粒剂、可湿性粉剂或水剂应用无氯的河水、井水、地下水或自来水配成要求的使用浓度，切忌与酸、碱混合，药品应保存在阴凉干燥处；(3)处理植物的具体要求包括整个生长季节均适于用药，一季作物可施药3-6次，每次间隔10-20天，施用时间和次数视使用目的确定，使用时已配制好的药液建议在24小时内用完。

实施例4

葡聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽的稳定性检测:

我们按实施例1方法制备的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽与对应的Hrps多肽组合的混合片段，在几种条件下的稳定性进行了比较，结果如下：

在室温下，均配制成含量3％的水溶液，Hrps多肽组合的混合片段水溶液静置20分钟后，出现明显的分层，1小时后，形成絮状沉淀；(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽水溶液静置6小时后，溶液仍均匀，未出现分层。

裸露在自然条件下，均配制成含量3％的水溶液，分别在培养皿注入一薄层配制的水溶液，Hrps多肽组合的混合片段水溶液3天后，取样电泳时Hrp蛋白谱带已经很弱了，5天后，Hrps蛋白谱带已经消失，表明Hrps多肽基本解体；(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽水溶液7天后，电泳时它们的谱带还清晰可见。

在100℃条件下，均配制成含量3％的水溶液，Hrps多肽组合混合片段水溶液加热25分钟后，注射不再引起烟草叶片过敏反应，Hrps多肽基本丧失活性；(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽水溶液加热30分钟后，注射引起烟草叶片过敏反应，共价三聚肽仍有活性，50分钟后还有较弱的活性保持。

暴露在30000Lux强光照条件下，均配制成含量3％的水溶液，分别在培养皿注入一薄层配制的水溶液，Hrps多肽组合混合片段水溶液强光照60分钟后，注射不再引起烟草叶片过敏反应，Hrps多肽丧失活性；(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽强光照120分钟后，注射引起烟草叶片过敏反应，仍有活性，150分钟后不再引起烟草叶片过敏反应，才丧失活性。

Hrps蛋白多肽片段的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽的稳定性试验，同样方法同时并列进行，获得类似的结果。

实施例5

葡聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽的更多的功能

用于浸种、拌种，使种子出芽早，发芽率高，出芽整齐，芽苗茁壮，防病抗逆，根系发达；用于幼苗叶面喷施、根施，植株健壮，生长势好，防病抗逆，根系发达；用于成苗叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，枝叶繁茂，分枝分蘖多，植株造型好，提高孕花孕果率，增强作物对病虫害和多类不良环境(低温、高热，干旱、水涝等)危害的防御能力，大幅度减轻危害，并具强大的修复能力；用于花前叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，花枝花穗多，提前开花挂果，果枝果穗多，防止落花落果，增强作物对病虫害和多类不良环境(低温、高热，干旱、水涝等)危害的防御能力，大幅度减轻危害，并具强大的修复能力；用于开花结果叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，提高坐果率、结实率和成熟度，果实大小均匀，显著提高产量和质量，提升农产品商品品质，减轻收获后病害危害，延长农产品货架保鲜期，增产增收。

实施例6

葡聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽的更广的使用范围

进行(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽与单一HrpEcb蛋白和对应的Hrps多肽组合的混合片段三种蛋白制剂生物学活性—过敏反应的比较试验，对36种植物叶片进行过敏反应试验，24小时后，观察统计发生典型特征性过敏反应的植物种类数，过敏反应是植物诱导抗逆性的外在表现，因而通过植物是否发生过敏反应或过敏反应的强弱，就可以比较相应诱抗蛋白的生物学活性和诱导植物抗性的能力，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽能诱导35种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季、槐树、豌豆、桃树、一串红、丝瓜、四季豆、花椰菜、菠菜、油菜、薯蓣、豇豆、蚕豆、玉米、水稻、大豆、仙客来、桑树、南瓜、椿树，过敏反应斑较大，组织坏死程度(过敏反应强度)较高；单一HrpEcb蛋白能诱导16种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季,过敏反应斑或组织坏死程度(过敏反应强度)一般或较弱；对应的Hrps多肽组合的混合片段能诱导26种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季、槐树、豌豆、桃树、一串红、丝瓜、四季豆、花椰菜、菠菜、油菜、薯蓣，过敏反应斑或组织坏死程度(过敏反应强度)一般或较弱。

结果表明，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽、单一HrpEcb蛋白和对应的Hrps多肽组合的混合片段都具有诱导供试植物抗性的能力和生物学活性，在诱导过敏反应的植物种类范围以及诱导抗性的能力和生物学活性上，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽最优、最强，其次是对应的Hrps多肽组合的混合片段，再其次是单一HrpEcb蛋白，显然，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽具有更广的使用范围和更强的诱抗能力。

实施例7

葡聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽更强大的增效动力

作为添加中间补体，应用于肥料产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升肥料使用效果和效率，可以节省30％以上的肥料使用量，并实现增产、增收、抗逆、安全的效果。

作为添加中间补体，应用于农药产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升农药使用效果和效率，特别是对细菌和病毒病害的防治效果十分显著，可以节省80％的农药使用量，并实现增产、增收、抗逆、安全的效果。

作为添加中间补体，应用于植物生长调节剂产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升植物生长调节剂使用效果和效率，可以节省80％的植物生长调节剂使用量，并实现增产、增收、抗逆、安全的效果。

实施例8

葡聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n(I-IV)共价三聚肽在多种供试作物上的使用效果

(1)四川省德阳市2个市县的5个镇村进行了20余批次大田的共价三聚肽试验和示范，实施面积总量360余亩，主要供试作物为土豆、黄瓜、玉米、辣椒、西红柿、晒烟、红油菜、花椰菜、水稻、桑树、油桃等，增产幅度为8％至36％，表现出对病虫害和逆境的显著诱抗作用，提高了产品品质和商品性，并延长了产品的保存期。

(2)四川省成都市5个区县的7个村进行了三个生长季节10余批次大田的共价三聚肽试验和示范，实施面积总量280余亩，主要供试作物为土豆、黄瓜、辣椒、茄子、芹菜、白菜、茶叶(白茶)、草莓、果桑、葡萄、枇杷，薯蓣以及紫金花、仙客来、蝴蝶兰、三色堇、一品红、矮牵牛、非洲凤仙花、菊花、倒挂金钟、金鱼草、玻璃海棠等二十余种花卉，蔬菜和水果类增产幅度为12％至32％，表现出对病虫害和逆境的显著诱抗作用，提高了产品品质和商品性，并延长了产品的保存期；花卉表现出对病虫害和逆境的显著诱抗作用，塑型作用较强，提高了产品商品性，并延长了花期，增加了花数和色彩更为鲜艳；茶叶提高了品质，并可以多采摘1次，经济效益显著。

(3)四川省泸州市2个区县的共价三聚肽效果试验示范，主要作物为树莓、莲花白和高粱，总面积60余亩，树莓和莲花白的产量提高30％以上，高粱产量提高24％，表现出对病虫害和逆境的显著诱抗作用，提高了产品品质和商品性。

(4)云南省2个村的云烟种植基地共价三聚肽效果试验示范，共种植120余亩烟草，烟叶收获后，烟叶等级普遍提高一个级别，产量增加24％，每亩烟田烟农提高收入380余元(增收达30％)。

(5)云南省1个县的花卉基地，60余亩多种花卉栽培种植中，示范使用共价三聚肽产品，结果表明，对病虫害和逆境具有显著驱避和诱抗作用，对花的株形，塑型作用较强，提高了产品商品性，并延长了花期，增加了花数和色彩更为鲜艳。

(6)云南省玉溪市的2个村镇的蔬菜种植基地，在50余亩玉米、辣椒、茄子、西芹的种植中，示范使用了共价三聚肽产品，结果表明，收获时，除对病虫害和逆境具有显著驱避和诱抗作用外，产量提高15％至38％，并提高了产品的商品性。

(7)云南省1个县的普洱茶基地，在60余亩普洱茶种植地示范使用共价三聚肽产品，提前了收获期，产量提高30％以上，熟化加工过程更快了，大幅度提升口感和茶香味。

(8)山西省榆次的农科试验基地，在黄瓜、生菜、芹菜种植地示范使用和验证共价三聚肽产品的功效，经严格测产，黄瓜增产25％，每亩增产黄瓜900余公斤，芹菜增产10.8％，生菜增产7.6％，取得了良好的经济效益。

(9)山西省运城1个县的棉花种植，第一年8亩，第二年60亩，在棉花种植地示范使用和验证共价三聚肽产品的功效，经有关部门专家亲自严格测产，棉花增产幅度达31.46％以上。

(10)山西省运城2个县市的黄瓜、油白菜、芹菜使用共价三聚肽产品的试验示范，经严格测产验收，黄瓜增产50％以上，油白菜、芹菜增产20％以上，给农户带来显著地经济效益。

(11)山西省1个县的1个村镇的小麦、玉米、西瓜、甜瓜、西红柿、杏、苹果、梨、大枣等使用共价三聚肽产品的试验示范，进行了3年的试验，总面积280余亩，结果表明，除对病虫害和逆境具有显著驱避和诱抗作用外，小麦产量提高8.7％-13％，玉米的产量提高22.6％以上，特别是小麦度过了倒春寒，玉米抗过了严重的春旱，西红柿提高28％，西瓜产量提高28％，甜瓜提高32％，杏提高30％，苹果、梨、大枣的产量提高25％，提高了产品的商品性和延长了储存期。

(12)青海省三江源和牧区的草原植被保护和牧区的人工种植牧草，在30000亩草场上大面积示范使用共价三聚肽产品，结果表明，用不同方式使用共价三聚肽产品，牧草的产量提高了27％至33％。

(13)青海省1个县2个村镇的多种蔬菜和粮食作物使用共价三聚肽产品的试验示范，在青稞、小麦、大葱、西红柿等作物的试验表明，除对病虫害和逆境具有显著驱避和诱抗作用外，青稞产量提高11.47％，小麦提高15％，大葱提高19％，西红柿提高13％，并大大提高了产品的商品性。

(14)甘肃河西走廊地区的特种药材种植基地和土豆种植基地的共价三聚肽有关试验和示范，种植面积300余亩，结果表明，特种药材有效成分的产量和品质大幅度提升，加工品质尤为突出，土豆增产21％以上，大大提高了经济效益。

(15)新疆建设兵团2个农场的棉花使用共价三聚肽产品的试验和示范，两个农场实施了120亩的试验和示范，结果表明，棉花植株明显驱避棉铃虫，并抗黄萎病，产量提高19％-20％，经济效益显著。

(16)新疆南疆1个县的大枣使用共价三聚肽产品的试验和示范，实施面积180亩，结果表明，使用共价三聚肽产品后，裂果率减少了80％，商品率大幅度提高，产量提高10％-25％，经济效益显著。

(17)黑龙江鸡西市的有关共价聚合体产品试验和示范，密山市实施面积26.5亩，农垦实施面积40亩，结果表明，在2014年非常风调雨顺的情况下，普通大田的产量也非常高，在这样的条件下，玉米增产11.8％，大豆增产10.4％，水稻增产7.7％，已经实属罕见。

(18)黑龙江齐齐哈尔的使用共价聚合体产品有关试验和示范，实施大豆种植面积110余亩，结果表明，平均增产16.7％，按试验要求管理的试验区，增产幅度达27％，取得了良好的试验结果。

(19)该技术及其制备相关产物可以广泛应用于农业领域的蛋白多肽类农肥、农药、生长调节剂产品生产，应用于医药领域的蛋白多肽类外用药、内服药、肌肉注射药和静脉注射药产品生产，以及食品业的有关蛋白多肽产品的生产加工。

Hrps蛋白之间及功能多肽片段(DOMAIN)之间的比对

SEQUENCE LISTING

<110> 四川本原作物科技有限公司

<120> 葡聚糖修饰的 Hrps 共价三聚肽及其制备方法

<160> 4

<170> PatentIn Version 2.1

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌白菜亚种（Erwiniacarotovorum subsp. Carotovorumstrain CSSY002 ）

<220>

<221> DOMAIN

<222> (157)-(357)

<400> 1

Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys

1 5 10 15

Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala

35 40 45

Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met

50 55 60

Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu

85 90 95

Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu

100 105 110

Gly Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met

115 120 125

Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly

130 135 140

Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Lys Gln Pro Ser Ser

145 150 155 160

Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu

180 185 190

Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe

195 200 205

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210 215 220

Leu Gln Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg

225 230 235 240

Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys

290 295 300

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305 310 315 320

Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly

325 330 335

Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Lys

340 345 350

Lys Leu Ser Ser

355

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213>西红柿叶斑菌（Pseudomonas syringae pv. tomato strain CSCS008）

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)-(270)，(329)-(370)

<400> 2

Met Gln Ala Leu Asn Ser Ile Ser Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Phe Pro Val Ser Leu Asn Ser Asp Val Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Lys Glu Leu Lys Ala Val Ile Asp Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr

35 40 45

Gln Ser Gly Gln Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala

50 55 60

Lys Ala Met Ala Ala Asp Gly Lys Ser Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile

65 70 75 80

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85 90 95

Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly

100 105 110

Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala

115 120 125

Gly Ala Gly Gln Ser Asp Leu Met Ser Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly

130 135 140

Lys Ala Val Leu Asp Asp Leu Leu Thr Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr

145 150 155 160

Thr Phe Ser Ser Asp Asp Met Pro Thr Leu Glu Lys Val Ala Gln Phe

165 170 175

Met Asp Asp Asn Lys Ala Gln Phe Pro Thr Arg Asp Gly Gly Ser Trp

180 185 190

Met Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Gly Leu Asp Ala Gln Glu Thr Ala

195 200 205

Gln Phe Arg Ser Ala Leu Asp Val Ile Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln

210 215 220

Gln Gly Asp Ala Ser Gly Val Thr Ser Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro

225 230 235 240

Val Ser Asp Ser Ser Leu Gly Asn Pro Ala Ile Asp Ala Asn Thr Gly

245 250 255

Pro Ala Ala Asn Gly Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Gln Leu Ile Gly

260 265 270

Gln Leu Ile Asp Arg Gly Leu Gln Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu

275 280 285

Gly Thr Pro Val Asp Asn Ser Thr Gln Pro Thr Gly Gly Thr Pro Ala

290 295 300

Ala Asn Pro Thr Gly Asn Val Ser Asn Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu

305 310 315 320

Ser Gly Leu Leu Gln Arg Gly Leu Glu Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly

325 330 335

Asn Thr Gly Ala Asp Leu Gln Ser Ser Ala Ala Gln Val Ala Ala Gln

340 345 350

Leu Ile Asn Ala Leu Leu Gln Gly Thr Asn Asn Gln Thr Asn Gln Ala

355 360 365

Val Ala

370

<210> 3

<211> 370

<212> PRT

<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种（Pectobacteriumbetavasculorum strainEcbCSL101）

<220>

<221> DOMAIN

<222> (171)-(370)

<400> 3

Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys

1 5 10 15

Ala Gly Gly Asn Gly Asp Leu Phe Gln Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Ala Pro Ser Gln Leu Gly Leu Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala

35 40 45

Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met

50 55 60

Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly

65 70 75 80

Gly Ala Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly

85 90 95

Leu Leu Gly Gln Gly Leu Gly Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ala Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly

115 120 125

Ala Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met Met Gly

130 135 140

Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly Met Ser

145 150 155 160

Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Lys Gln Pro Ala Ser Pro Glu

165 170 175

Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Thr Leu Ser Ala Ile Leu

180 185 190

Gly Asn Gly Leu Ser Gln Ala Lys Gly Gln His Ser Pro Leu Gln Leu

195 200 205

Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln

210 215 220

Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Gly Val Gly Gln Lys Ala Gly Leu Gln

225 230 235 240

Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Gly Ser Pro Thr Arg Tyr Phe

245 250 255

Val Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met

260 265 270

Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Asn

275 280 285

Trp Gln Thr Ala Lys Gln Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser

290 295 300

Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys Phe Met

305 310 315 320

Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn

325 330 335

Thr Asn Leu Asn Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp

340 345 350

Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln Lys Leu

355 360 365

Ser Ser

370

<210> 4

<211> 339

<212> PRT

<213> 菊花软腐欧文氏菌（Erwinia chrysanthemi strain CSCL006）

<220>

<221> DOMAIN

<222> (9)-(334)

<400> 4

Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser

1 5 10 15

Gly Leu Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala

20 25 30

Ser Ser Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys

35 40 45

Leu Thr Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln

50 55 60

Gly Leu Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly

65 70 75 80

Gln Ser Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val

85 90 95

Pro Lys Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu

100 105 110

Asp Asp Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser

115 120 125

Asn Gln Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Met Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile

145 150 155 160

Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser

165 170 175

Leu Gly Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn

180 185 190

Gln Leu Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu

195 200 205

Ser Ala Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His

210 215 220

Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe

225 230 235 240

Met Asp Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp

245 250 255

Gly Trp Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu

260 265 270

Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe

275 280 285

Arg Gln Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly

290 295 300

Asn Thr Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile

305 310 315 320

Asp Ala Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Val Ala

325 330 335

Ala Asn Ala

Claims (9)

1.葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，它由三种Hrps多肽和葡聚糖通过共价修饰形成共价三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n；其中，三种Hrps多肽为SEQ IDNO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。

2.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4的质量配比为3:2:3:2。

3.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为10:1至1:10。

4.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为1:2。

5.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为5300-257200。

6.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为32000-38000。

7.根据权利要求1-6任一项所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

(1)从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；

(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入葡聚糖，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为：10:1至1:10；加入磷酸缓冲液，使体系pH值为2-10；静置0-5小时，在温度为15-80℃、搅拌速度为30-300r/min条件下反应3-25小时；

(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得共价三聚肽，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n。

8.根据权利要求7所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，磷酸缓冲液的浓度为10-200mmol/L，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和葡聚糖总质量的10-100倍。

9.根据权利要求7所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽的制备方法，其特征在于，制备方法如下：

(1)从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；其中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4四种Hrps多肽的质量配比为3:2:3:2；

(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入葡聚糖，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为32000-38000；三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为：1:2；加入浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和葡聚糖总质量的40倍，使体系pH值为7，静置1小时；在温度为46℃、搅拌速度为60r/min条件下反应12小时；

(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得共价三聚肽，(3Hrps)_n-(C₆H₁₀O₅)_n。