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MX2011001351A - Anticuerpos monoclonales contra el inhibidor de la via del factor tisular. - Google Patents

Anticuerpos monoclonales contra el inhibidor de la via del factor tisular.

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MX2011001351A
MX2011001351A MX2011001351A MX2011001351A MX2011001351A MX 2011001351 A MX2011001351 A MX 2011001351A MX 2011001351 A MX2011001351 A MX 2011001351A MX 2011001351 A MX2011001351 A MX 2011001351A MX 2011001351 A MX2011001351 A MX 2011001351A
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MX
Mexico
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seq
variable region
amino acid
acid sequence
light chain
Prior art date
Application number
MX2011001351A
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English (en)
Inventor
Haiyan Jiang
John E Murphy
Junliang Pan
Zhuozhi Wang
Bing Liu
Original Assignee
Bayer Healthcare Llc
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Publication date
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Abstract

Se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados que se unen al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano y las moléculas de ácido nucléico aisladas que los codifican. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales anti-TFPI y procedimientos para tratar deficiencias o defectos de la coagulación mediante administración de los anticuerpos. También se proporcionan procedimientos para producir los anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA EL INHIBIDOR DE LA VÍA DEL FACTOR TISULAR (TFPI) CAMPO DE LA INVENCION Se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados y fragmentos de los mismos que se unen al inhibidor de la vía del factor tisular humano (TFPI) e invenciones relacionadas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La coagulación sanguínea es un proceso por el cual la sangre forma coágulos estables para detener el sangrado. El proceso implica una serie de proenzimas y procofactores (o "factores de coagulación") que están circulando en la sangre. Las proenzimas y procofactores interaccionan a través de varías vías mediante se convierte, bien secuencial o simultáneamente, en la forma activada. En última instancia, el proceso da como resultado la activación de protrombina en trombina mediante el Factor X activado (FXa) en presencia del Factor Va, calcio iónico y plaquetas. A su vez, la trombina activada induce la agregación plaquetaria y convierte el fibrinógeno en fibrina, que después se retícula mediante el Factor XIII activado (FXIIIa) para formar un coágulo.
El proceso que conduce a la activación del Factor X se puede llevar a cano mediante dos vías distintas: la vía de activación por contacto (antes conocida como la vía intrínseca) y la vía del factor tisular (anteriormente conocida como la vía extrínseca). Antes se pensaba que la cascada de la coagulación constaba de dos vías de igual importancia unidas por una vía común. Se sebe que la vía principal para el inicio de la coagulación de la sangre es la vía del factor tisular.
El Factor X se puede activar mediante el factor tisular (FT) en combinación con el Factor VII activado (FVIIa). El complejo del Factor Vlla y su cofactor esencial, FT, es un potente iniciador de la cascada de coagulación.
La vía del factor tisular de la coagulación está controlada negativamente por el inhibidor de la vía del factor tisular ("TFPI"). El TFPI es un inhibidor de retroalimentación, natural dependiente de FXa del complejo FVIIa/TF. Es un miembro de los inhibidores serina-proteasa multivalentes de tipo Kunitz. Fisiológicamente, el TFPI se une al Factor X activado (FXa) para formar un complejo heterodimérico, que posteriormente interacciona con el complejo FVII/TF para inhibir su actividad, de modo que cierra la vía de coagulación del factor tisular. En principio, el bloqueo de la actividad del TFPI puede restablecer la actividad de FXA y FVIIa/TF, de modo que se prolonga la duración de la acción de la vía del factor tisular y se amplifica la generación de FXa, que es el defecto común en la hemofilia A y B.
De hecho, algunas pruebas experimentales preliminares han indicado que el bloqueo de la actividad de TFPI por los anticuerpos contra el TFPI normaliza el tiempo de coagulación prolongado o acorta el tiempo de sangrado. Por ejemplo, Nordfang y col. Mostraron que el tiempo de protrombina diluida prolongado de hemofilia en plasma se normalice después de tratar el plasma con anticuerpos frente a TFPI (Thromb. Haemost., 1991 , 66(4): 464-467). De forma similar, Erhardtsen y col. Mostraron que el tiempo de sangrado en un modelo de conejo con hemofilia A se acortó significativamente con anticuerpos anti-TFPI (Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394). Estos estudios sugieren que la inhibición del TFPI mediante anticuerpos anti-TFPI puede ser útil para el tratamiento de la hemofilia A o B. En estos estudios sólo se usó el anticuerpo policlonal anti-TFPI.
Usando técnicas de hibridoma se prepararon e identificaron anticuerpos monoclonales contra el TFPI humano recombinante (rhTFPI). Véase Yang y col., Chin. Med. 7, 1998, 111(8): 718-721. Se investigó el efecto del anticuerpo monoclonal sobre el tiempo de protrombina (PT) diluido y el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT). Los experimentos mostraron que el anticuerpo monoclonal anti-TFPI acortó el tiempo de coagulación de tromboplastina a diluida del plasma deficiente en Factor IX. Se ha sugerido que la vía del factor tisular desempeña un papel importante, no sólo en la coagulación fisiológica sino también en la hemorragia por hemofilia (Yang y col., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300).
La patente de EE.UU. n° 7.015.194 de Kjalke y col. Divulga composiciones que comprenden FVIIa y un inhibidor de TFPI, incluidos anticuerpos monoclonales o policlonales, o un fragmento de los mismos, para el Tratamiento o profilaxis de episodios de hemorragia o Tratamiento de coagulación. El uso de tal composición para reducir el tiempo de coagulación en plasma de mamífero normal también se divulga. También se sugiere que un Factor VIII o una variante del mismo se pueden incluir en la composición divulgada de FVIIa y el inhibidor del TFPI. No se sugiere una combinación de FVIII o Factor IX con el anticuerpo monoclonal TFPI.
Además del tratamiento de la hemofilia, también se ha sugerido que los inhibidores TFPI, incluidos los anticuerpos policlonales o monoclonales, se pueden usar para el tratamiento del cáncer (véase la patente de EE.UU. n° 5.902.582 de Hung).
En consecuencia, anticuerpos específicos para TFPI son necesarios para tratar enfermedades hematológicas y cáncer.
Generalmente, los anticuerpos terapéuticos para enfermedades humanas se han generado usado ingeniería genética para crear anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados o completamente humanos. Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales murinos tienen un uso limitado como agentes terapéuticos por una semivida sérica corta, una incapacidad para desencadenar funciones efectoras humanas y la producción de anticuerpos humanos anti-ratón. Brekke and Sandlie, "Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century," Nature 2, 53, 52-62 (Jan. 2003). Se ha mostrado que los anticuerpos quiméricos dan lugar a respuestas de anticuerpos humanos anti-quiméricos. Los anticuerpos humanizados minimizan además el componente de ratón de los anticuerpos. No obstante, un anticuerpo completamente humano evita la inmunogenicidad asociada con los elementos murinos completamente. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar anticuerpos completamente humanos para evitar la inmunogenicidad asociada con otras formas de anticuerpos monoclonales sometidos a ingeniería genética. En particular, el tratamiento profiláctico crónico tal como el que se requeriría pata el tratamiento de la hemofilia con un anticuerpo monoclonal anti-TFPI tiene un riesgo elevado de desarrollar una respuesta inmunitaria a la terapia si se usa un anticuerpo con un componente murino o de origen murino debido a la frecuente dosificación requerida y a la larga duración de la terapia. Por ejemplo, el tratamiento con anticuerpos de la hemofilia A puede requerir dosificación durante la vida de un paciente. Esto sería un reto continuo para el sistema inmunitario. Por tanto, existe la necesidad de un anticuerpo completamente humano para la terapia con anticuerpos de la hemofilia y las deficiencias y defectos genéticos y adquiridos en la coagulación relacionados.
Los anticuerpos terapéuticos se han fabricado a través de tecnología de hibridoma descrita por Koehler y ilstein en "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature 256, 495-497 (1975). Los anticuerpos completamente humanos también pueden elaborarse de forma recombinante en procariotas y eucariotas. Para un anticuerpo terapéutico se prefiere la producción recombinante de un anticuerpo en una célula huésped en lugar de la producción de hibridoma. La producción recombinante tiene las ventajas de mayor consistencia del producto, probable mayor nivel de producción y una fabricación controlada que minimiza o elimina la presencia de proteínas derivadas de animales. Por estos motivos es deseable tener un anticuerpo monoclonal anti-TFPI producido de forma recombinante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Se proporcionan anticuerpos monoclonales contra el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI humano. También se proporcionan las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el mismo. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales anti-TFPI y procedimientos de tratamiento de deficiencias o defectos en la coagulación genéticos y adquiridos tales como hemofilia A y B. También se proporcionan procedimientos para acortar el tiempo de sangrado administrando un anticuerpo monoclonal anti-TFPI a un paciente que lo necesite. También se proporcionan procedimientos para producir un anticuerpo monoclonal que se une al TFPI de acuerdo con la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1 : La actividad de unión de ejemplos representativos de Fabs, seleccionados de cribado en fase sólida y detección selectiva, al TFPI humano ("h-TFPI") y al TFPI de ratón ("m-TFPI"). Se analizó un Fab control contra estradiol— BSA ("EsB") y 12 Fab (1-4 y 6-13) seleccionada de cribado en fase sólida {panning) de TFPI. El eje Y indica las unidades de fluorescencia de los resultados de ELISA.
Fig. 2: La actividad funcional in vitro dependiente de la dosis de cuatro anticuerpos anti-TFPI representativos (4B7: TP-4B7, 2A8: TP-2A8, 206: TP-2G6, 207: TP-2G7) obtenidos del cribado en fase sólida y la detección selectiva de una biblioteca de anticuerpos humanos tal como se muestra mediante su acortamiento de dPT. El experimento implicó 0,5 µ9 ?t?? de nTFPI introducidos en plasma con depleción de TFPI.
Fig. 3: La actividad funcional in vitro de Fab anti-TFPI, Fab-2A8 (de TP-2A8), como se analiza en el ensayo ROTEM.
Fig. 4: La actividad de unión al TFPI humano y al TFPI de ratón de los clones TP-2G6 ("2G6") después de la conversión a IgG. 4: ?: unión lgG-2G6 al TFPI de ratón;?: unión lgG-2G6 al TFPI humano; Á : unión de IgG control al TFPI de ratón; ¦: unión de IgG control al TFPI humano.
Fig 5: Los anticuerpos anti-TFPI TP-2A8 ("2A8"), TP-3G1 ("3G1"), y TP-3C2 ("3C2") acortaron el tiempo de coagulación de la sangre entera en ratones con hemofilia A como se analiza en el ensayo ROTEM. Cada punto representa un ratón individual con hemofilia A.
Fig. 6: La alineación de la secuencia de aminoácidos entre las cadenas ligeras variables de los anticuerpos monoclonales anti-TFPI TP-2A10 (SEC ID N° 18), TP-2B 1 (SEC ID N° 22), TP- 2A2 (SEC ID N° 2), TP-2G2 (SEC ID N° 66), TP-2A5.1 (SEC ID N° 6), TP-3A3 (SEC ID N° 98), TP-2A8 (SEC ID N° 14), TP-2B8 (SEC ID N° 34), TP-2G7 (SEC ID N° 82), TP-4H8 (SEC ID N° 170), TP-2G4 (SEC ID N° 70), TP-3F2 (SEC ID N° 134), TP- 2A6 (SEC ID N° 10), TP-3A2 (SEC ID N° 94), TP-2C1 (SEC ID N° 42), TP-3E1 (SEC ID N° 126), TP-3F1 (SEC ID N° 130), TP-3D3 (SEC ID N° 122), TP-4A7 (SEC ID N° 150), TP-4G8 (SEC ID N° 166), TP-2B3 (SEC ID N° 26), TP-2F9 (SEC ID N° 62), TP- 2G5 (SEC ID N° 74), TP-2G6 (SEC ID N° 78), TP-2H 0 (SEC ID N° 90), TP-2B9 (SEC ID N° 38), TP-2C7 (SEC ID N° 46), TP-3G3 (SEC ID N° 142), TP-3C2 (SEC ID N° 1 14), TP-3B4 (SEC ID N° 1 10), TP-2E5 (SEC ID N° 58), TP-3C3 (SEC ID N° 1 18), TP-3G1 (SEC ID N° 138), TP-2D7 (SEC ID N° 50), TP-4B7 (SEC ID N° 158), TP-2E3 (SEC ID N° 54), TP-2G9 (SEC ID N° 86), TP-3C1 (SEC ID N° 86), TP-3A4 (SEC ID N° 102), TP-2B4 (SEC ID N° 30), TP-3H2 (SEC ID N° 146), TP-4A9 (SEC ID N° 154), TP-4E8 (SEC ID N° 162) y TP-3B3 (SEC ID N° 106).
Fig. 7: La alineación de la secuencia de aminoácidos entre las cadenas ligeras variables de los anticuerpos monoclonales anti-TFPI TP-2A10 (SEC ID N° 20), TP-3B3 (SEC ID N° 108), TP-2G4 (SEC ID N° 72), TP-2A5.1 (SEC ID N° 8), TP-4A9 (SEC ID N° 156), TP-2A8 (SEC ID N° 16), TP-2B3 (SEC ID N° 28), TP-2B9 (SEC ID N° 40), TP-2H10 (SEC ID N° 92), TP-3B4 (SEC ID N° 1 12), TP-2C7 (SEC ID N° 48), TP-2E3 (SEC ID N° 56), TP-3C3 (SEC ID N° 120), TP-2G5 (SEC ID N° 76), TP-4B7 (SEC ID N° 160), TP-2G6 (SEC ID N° 80), TP-3C2 (SEC ID N° 1 16), TP-2D7 (SEC ID N° 52), TP-3G1 (SEC ID N° 140), TP-2E5 (SEC ID N° 60), TP-2B8 (SEC ID N° 36), TP-3F1 (SEC ID N° 132), TP-3A3 (SEC ID N° 100), TP-4E8 (SEC ID N° 164), TP-4A7 (SEC ID N° 152), TP- 4H8 (SEC ID N° 172), TP-2A6 (SEC ID N° 12), TP-2C1 (SEC ID N° 44), TP-3G3 (SEC ID N° 144), TP-2B 1 (SEC ID N° 24), TP-2G7 (SEC ID N° 84), TP-3H2 (SEC ID N° 148), TP-2A2 (SEC ID N° 4), TP-3E1 (SEC ID N° 128), TP-2G2 (SEC ID N° 68), TP-3D3 (SEC ID N° 124), TP-2G9 (SEC ID N° 88), TP-2B4 (SEC ID N° 32), TP-3A2 (SEC ID N° 96), TP-2F9 (SEC ID N° 64), TP-3A4 (SEC ID N° 104), TP-3C 1 (SEC ID N° 136), TP-3F2 (SEC ID N° 136), y TP-4G8 (SEC ID N° 168).
Fig. 8: Gráfico que muestra la tasa de supervivencia en 24 horas tras la transacción de la vena de la cola en ratones tratados con (1) el anticuerpo anti-TFPI TP-2A8 ("2A8"), (2) 2A8 y factor VIII recombinante, (3) IgG de ratón y (4) factor VIII recombinante.
Fig. 9: Gráfico que muestra los ensayo del tiempo de coagulación y del tiempo de formación de coágulos para ratones tratados con el anticuerpo anti-TFPI TP-2A8 ("2A8"), factor Vlla y la combinación de 2A8 y factor Vlla.
Fig. 10: Gráfico que muestra el tiempo de coagulación para sangre humana normal tratada con un inhibidor del FVIII con el anticuerpo anti-TFPI TP-2A8 ("2A8") y el anticuerpo anti-TFPI TP-4B7 ("4B7") en comparación con el inhibidor de FVIII solo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCION Definiciones El término "inhibidor de la vía del factor tisular" o "TFPI" como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a cualquier variante, isoforma y homólogo de especie del TFPI humano que se expresa de forma natural en las células. En una forma de realización preferida de la invención, la unión de un anticuerpo de la invención al TFPI reduce el tiempo de coagulación sanguínea.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, un "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo entero y a cualquier fragmento de unión al antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o una cadena sencilla del mismo. El término incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (p. ej., un anticuerpo IgG) que es natural o se forma mediante procedimientos recombinantes de fragmento génico de inmunoglobulina normal o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina, tal como un fragmento de anticuerpo, que conserva la actividad de unión específica. Con independencia de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-TFPI se une a un epítopo del TFPI. La función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab es un fragmento monovalente compuesto por los dominios VL, VH, CL y CH I; (ii) un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward y col., Nature 341 :544-546, 1989) que consta de un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes distintos, pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, mediante un ligador sintético que permite que se formen en forma de una proteína de una cadena en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Estos anticuerpos de cadena sencilla también se pretende que entren dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la técnica y los fragmentos se seleccionan según su utilidad del mismo modo que son anticuerpos intactos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos "que inhibe la unión" y "bloquea la unión" (p. ej., en referencia a la inhibición/bloqueo de la unión del ligando de TFPI al TFPI) se usan de forma intercambiable y abarcan la inhibición o bloqueo total y parcial También se pretende que inhibición y bloqueo incluyan cualquier disminución mensurable en la afinidad de unión del TFPI a un sustrato fisiológico cuando entra en contacto con un anticuerpo anti-TFPI en comparación con el TFPI que no está en contacto con un anticuerpo anti-TFPI, por ejemplo el bloqueo de la interacción del TFPI con el factor Xa o el bloqueo de la interacción de un complejo TFPI-factor Xa con un factor tisular, el factor Vlla o el complejote factor tisular/factor Vlla en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %.
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión sencilla por un epítopo concreto. De acuerdo con esto, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una especificidad de unión única que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o especificidad e sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo).
Con un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente memoria, se pretende hacer referencia a un anticuerpo que es sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une al TFPI está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen a antígenos distintos al TFPI). Un anticuerpo aislado que se une a un epítopo, isoforma o variante de TFPI humano puede, no obstante, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (p. ej., homólogos de especies del TFPI). Además, un anticuerpo asilado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas.
Como se usa en la presente memoria, "unión específica" se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 05 M"1 y se une al antígeno predeterminado con una afinidad superior, por ejemplo al menos dos veces mayor, que su afinidad de unión a un antígeno irrelevante (p. ej., BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico de un antígeno" se usan de forma intercambiable en la presente memoria con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno." Como se usa en la presente memoria, el término "afinidad alta" para un anticuerpo IgG se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 107 M"1, en algunas formas de realización de al menos aproximadamente 108 M"1, en algunas formas de realización de al menos aproximadamente 109 M"1, 1010 M~1, 1011 M" o mayor, por ejemplo de hasta 1013 M"1 o mayor. No obstante, unión de "afinidad elevada" puede variar para otros isotipos del anticuerpo. Por ejemplo, unión de "afinidad elevada" para un isotipo IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 1 ,0 x 107 M"1. Como se usa en la presente memoria, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (p. ej., IgM o lgG1) codificado en los genes de la región constante de la cadena pesada.
"Región determinante de la complementariedad" o "CDR" se refiere a una de tres regiones hipervariables dentro de la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera de una molécula de anticuerpo que forman la superficie de unión a antígeno en el extremo N que es complementaria a la estructura tridimensional del antígeno unido. Desde el extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones determinantes de la complementariedad están indicadas como "CDR1 ," "CDR2," y "CDR3," respectivamente. Las CDR están implicadas en la unión antígeno-anticuerpo y la CDR3 comprende una región única específica para la unión antígeno-anticuerpo. Por tanto, un sitio de unión a antígeno puede incluir seis CDR, que comprenden las regiones CDR de cada una de las regiones V de las cadenas pesada y ligera.
Como se usa en la presente memoria, "sustituciones conservadoras" se refiere a modificaciones de un polipéptido que implican la sustitución de uno o más aminoácidos para aminoácidos que tienen propiedades bioquímicas similares que no tienen como resultado la pérdida de una función biológica o bioquímica del polipéptido. Una "sustitución conservadora de aminoácido" es una en la que el residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta— ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Se cree que los anticuerpos de la presente invención pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadoras y seguir conservando su actividad.
Para ácidos nucleicos y polipéptidos, la expresión "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos o dos polipéptidos, o sus secuencias designadas, cuando se alinean y comparan óptimamente, son idénticas, con las adecuadas inserciones o deleciones de nucleótidos o de aminoácidos, en al menos aproximadamente el 80 % de los nucleótidos o aminoácidos, normalmente al menos aproximadamente del 85 %, preferentemente aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, o 95 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, o 99,5 % de los nucleótidos o aminoácidos. Como alternativa, existe una homología sustancial para los ácidos nucleicos cuando los segmentos hibridan en condiciones de hibridación selectiva con la hebra complementaria. La invención incluye secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de polipéptidos que tienen homología sustancial con las secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de polipéptidos específicas citadas en la presente memoria.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología= n° de posiciones ¡dénticas/n° total de posiciones por 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se han de introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede conseguir usando un algoritmo matemático, tal como, sin limitaciones, el módulo AlignX™ de Vector NTI™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para el AlignX™, los parámetros por defecto de la alineación múltiple son: penalización por abertura de huecos: 10; penalización por extensión huecos: 0,05; intervalo de penalización por separación de huecos: 8; % de identidad para retraso de la alineación: 40. (otros detalles se pueden encontrar en http://www.invitrogen.coT/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEACommunities/ Vector-NTI-Community/ Sequence -analysis-and- data-management- softwarefor- PC s/A1 ignX-Module-for- Vector-NTI-Advance.reg.us .html).
Otro procedimiento para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencias sujeto, también denominado alineación de la secuencia global, se puede determinar usando el programa CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680), que se basa en el algoritmo de Higgins et al., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191 ). En una alineación de secuencias, las secuencias problema y sujeto son ambas secuencias de ADN. El resultado de dicha alineación de secuencia global está en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en una alineación CLUSTALW de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad a través de alineaciones pareadas son: Matriz = IUB, k-tuple = 1 , Número de diagonales superiores = 5, Penalización por hueco = 3, Penalización por abertura de hueco = 10, Penalización por extensión de hueco = 0,1. Para alineaciones múltiples se prefieren los siguientes parámetros CLUSTALW: Penalización por abertura de hueco= 10, parámetro por extensión de hueco = 0,05; Intervalo de por Penalización por separación de hueco = 8; %ldentidad para retraso de alineación= 40.
Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aisla" o se "convierte en sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares con los que normalmente está asociado en el entorno natural. Para aislar un ácido nucleico se puede usar técnicas estándar tales como las siguientes: tratamiento alcalino/SDA, bandas con CsCI, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica.
Anticuerpos monoclonales Se identificaron 44 anticuerpos de unión a TFPI mediante cribado en fase sólida y detección selectiva de bibliotecas de anticuerpos humanos contra TFPI.. La región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de cada anticuerpo monoclonal se secuenciaron y se identificaron sus regiones CDR. Los números de identificación de secuencia ("SEC ID N°") corresponden a estas regiones de cada anticuerpo monoclonal y se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Resumen de los números de identificación de secuencia (("SEC ID N°") de la región variable de la cadena pesada ("VH") y de la región variable de la cadena ligera ("VL") de cada anticuerpo monoclonal de unión a TFPI. Los números de identificación de secuencia para las regiones CDR (("CDR1 ," "CDR2," y "CDR3") de cada cadena ligera y pesada también se proporcionan. A.N.: secuencia de ácido nucleico; A.A: secuencia de aminoácidos.
VL V H VL VH Clon A.N. A.A. A.N. A.A. CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 TP-2A2 1 2 3 4 173 216 259 302 345 388 TP-2A5.1 5 6 7 8 174 217 260 303 346 389 TP-2A6 9 10 11 12 175 218 261 304 347 390 TP-2A8 13 14 15 16 176 219 262 305 348 391 TP-2A10 17 18 19 20 177 220 263 306 349 392 TP-2B1 21 22 23 24 178 221 264 307 350 393 TP-2B3 25 26 27 28 179 222 265 308 351 394 TP-2B4 29 30 31 32 180 223 266 309 352 395 TP-2B8 33 34 35 36 181 224 267 310 353 396 TP-2B9 37 38 39 40 182 225 268 311 354 397 TP-2C1 41 42 43 44 183 226 269 312 355 398 TP-2C7 45 46 47 48 184 227 270 313 356 399 TP-2D7 49 50 51 52 185 228 271 314 357 400 TP-2E3 53 54 55 56 186 229 272 315 358 401 TP-2E5 57 58 59 60 187 230 273 316 359 402 TP-2F9 61 62 63 64 188 231 274 317 360 403 TP-2G2 65 66 67 68 189 232 275 318 361 404 TP-2G4 69 70 71 72 190 233 276 319 362 405 V V H VL VH Clon A.N. A.A. A.N. A.A. CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 TP-2G5 73 74 75 76 191 234 277 320 363 406 TP-2G6 77 78 79 80 192 235 278 321 364 407 TP-2G7 81 82 83 84 193 236 279 322 365 408 TP-2G9 85 86 87 88 194 237 280 323 366 409 TP-2H10 89 90 91 92 195 238 281 324 367 410 TP-3A2 93 94 95 96 196 239 282 325 368 41 1 TP-3A3 97 98 99 100 197 240 283 326 369 412 TP-3A4 101 102 103 104 198 241 284 327 370 413 TP-3B3 105 106 107 108 199 242 285 328 371 414 TP-3B4 109 110 1 11 112 200 243 286 329 372 415 TP-3C2 113 114 1 15 1 16 201 244 287 330 373 416 TP-3C3 1 17 118 119 120 202 245 288 331 374 417 TP-3D3 121 122 123 124 203 246 289 332 375 418 TP-3E1 125 126 127 128 204 247 290 333 376 419 TP-3F1 129 130 131 132 205 248 291 334 377 420 TP-3F2 133 134 135 136 206 249 292 335 378 421 TP-3G1 137 138 139 140 207 250 293 336 379 422 TP-3G3 141 142 143 144 208 251 294 337 380 423 TP-3G2 145 146 147 148 209 252 295 338 381 424 TP-4A7 149 150 151 152 210 253 296 339 382 425 TP-4A9 153 154 155 156 211 254 297 340 383 426 TP-4B7 157 158 159 160 212 255 298 341 384 427 TP-4E8 161 162 163 164 213 256 299 342 385 428 VL V H VL VH Clon A.N. A.A. A.N. A.A. CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 TP-4G8 165 166 167 168 214 257 300 343 386 429 TP-4H8 169 170 171 172 215 258 301 344 387 430 TP-3C1 85 86 135 136 194 237 280 335 378 421 En una forma de realización se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une al inhibidor de la vía del factor tisular, en el que el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N° 388-430. Estas CDR3 se identifican de las cadenas pesadas de los anticuerpos ¡denrificados durante el cribado en fase sólida y la detección selectiva. En otra forma de realización, este anticuerpo comprende además (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 302-344, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 345-387, o () una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 302-344 y una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 345-387.
En otra forma de realización se proporcionan anticuerpos que comparten una CDR3 de una de las cadenas ligeras de los anticuerpos identificados durante el cribado en fase sólida y la detección selectiva. Por tanto, a presente invención está dirigida a un anticuerpo monoclonal aislado que se une al inhibidor de la vía del factor tisular, en el que el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N° 259-301. En otras formas de realización, el anticuerpo comprende además (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 173-215, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 216-258, o () una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 173-215 y una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 216-258.
En otra forma de realización, el anticuerpo comprende una CDR3 de una cadena pesada y una CDR3 de una cadena ligera de los anticuerpos seleccionados mediante cribado en fase sólida y la detección selectiva. Por tanto, se proporciona un anticuerpo que se une al inhibidor de la vía del factor tisular, en el que el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N° 388-430 y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 259-301. En otra forma de realización, el anticuerpo comprende además (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 302-344, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 345-387, (c) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 173-215 y/o (d) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 216-258.
En otras formas de realización específicas, el anticuerpo comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, que comprende: (a) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 173, 216 y 259, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 302, 345 y 388; (b) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 174, 217 y 260, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 303, 346 y 389; (c) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 175, 218 y 261 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 304, 347 y 390; (d) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 176, 219 y 262, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 305, 348 y 391 ; (e) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 177, 220 y 263, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 306, 349 y 392; (f) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 178, 221 y 264, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 307, 350 y 393; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 179, 222 y 265, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 308, 351 y 394; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 180, 223 y 266, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 309, 352 y 395; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 181 , 224 y 267, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 310, 353 y 396; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 182, 225 y 268, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 31 1 , 354 y 397; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 183, 226 y 269, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 312, 355 y 398; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 184, 227 y 270, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 313, 356 y 399; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 185, 228 y 271 , y una región vanable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 314, 357 y 400; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 186, 229 y 272, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 315, 358 y 401 ; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 187, 230 y 273, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 316, 359 y 402; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 188, 231 y 274, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 317, 360 y 403; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 189, 232 y 275, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 318, 361 y 404; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 190, 233 y 276, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 319, 362 y 405; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 191 , 234 y 277, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 320, 363 y 406; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 192, 235 y 278, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 321 , 364 y 407; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 193, 236 y 279, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 322, 365 y 408; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 194, 237 y 280, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 323, 366 y 409; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 195, 238 y 281 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 324, 367 y 410; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 196, 239 y 282, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 325, 368 y 411 ; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 197, 240 y 283, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 326, 369 y 412; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 198, 241 y 284, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 327, 370 y 413; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 199, 242 y 285, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 328, 371 y 414; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 200, 243 y 286, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 329, 372 y 415; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 201 , 244 y 287, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 330, 373 y; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 202, 245 y 288, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 331 , 374 y 417; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 203, 246 y 289, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 332, 375 y 418; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 204, 247 y 290, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 333, 376 y 419; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 205, 248 y 291 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 334, 377 y 420; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 206, 249 y 292, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 335, 378 y 421 ; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 207, 250 y 293, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 336, 379 y 422; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 208, 251 y 294, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 337, 380 y 423; una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 209, 252 y 295, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 338, 381 y 424; (II) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 210, 253 y 296, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 339, 382 y 425; (mm) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 21 1 , 254 y 297, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 340, 383 y 426; (nn) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 212, 255 y 298, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 341 , 384 y 427; (oo) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 213, 256 y 299, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 342, 385 y 428; (pp) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 214, 257 y 300, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 343, 386 y 429; (qq) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 215, 258 y 301 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 344, 387 y 430; o (rr) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 194, 237 y 280, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 335, 378 y 421.
En otra forma de realización, la invención está dirigida a anticuerpos que comprenden: (a) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 2 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 4; (b) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 6 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 8; (C) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 10 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 12; (d) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 14 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 16; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 18 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 20; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 22 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 24; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 26 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 28; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 30 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 32; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 34 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 36; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 38 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 40; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 42 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 44; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 46 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 48; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 50 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 52; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 54 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 56; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 58 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 60; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 62 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 64; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 66 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 68; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 70 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 72; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 74 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 76; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 78 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 80; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 82 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 84; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 86 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 88; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 90 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 92; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 94 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 96; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 98 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 100; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 102 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 104; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 106 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 108; (bb) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 110 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 112; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 114 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 116; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 118 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 120; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 122 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 124; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 126 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 128; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 130 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 132; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 134 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 136; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 138 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 140; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SÉC ID N° 142 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 144; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 146 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 148; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 150 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 152; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 154 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 156; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 158 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 160; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 162 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 164; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 166 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 168; (qq) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 170 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 172; o (rr) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 86 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 136.
También se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 99,5 % con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID N° 4, SEC ID N° 8, SEC ID N° 12, SEC ID N° 16, SEC ID N° 20, SEC ID N° 24, SEC ID N° 28, SEC ID N° 32, SEC ID N° 36, SEC ID N° 40, SEC ID N° 44, SEC ID N° 48, SEC ID N° 52, SEC ID N° 56, SEC ID N° 60, SEC ID N° 64, SEC ID N° 68, SEC ID N° 72, SEC ID N° 76, SEC ID N° 80, SEC ID N° 84, SEC ID N° 88, SEC ID N° 92, SEC ID N° 96, SEC ID N°100, SEC ID N° 104, SEC ID N° 108, SEC ID N° 112, SEC ID N° 116, SEC ID N° 120, SEC ID N° 124, SEC ID N° 128, SEC ID N° 132, SEC ID N° 136, SEC ID N° 140, SEC ID N° 144, SEC ID N° 148, SEC ID N° 152, SEC ID N° 156, SEC ID N° 160, SEC ID N° 164, SEC ID N° 168 y SEC ID N° 172.
También se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 99,5 % con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID N° 2, SEC ID N° 6, SEC ID N° 10, SEC ID N° 14, SEC ID N° 18, SEC ID N° 22, SEC ID N° 26, SEC ID N° 30, SEC ID N° 34, SEC ID N° 38, SEC ID N° 42, SEC ID N° 46, SEC ID N° 50, SEC ID N° 54, SEC ID N° 58, SEC ID N° 62, SEC ID N° 66, SEC ID N° 70, SEC ID N° 74, SEC ID N° 78, SEC ID N° 82, SEC ID N° 86, SEC ID N° 90, SEC ID N° 94, SEC ID N° 98, SEC ID N° 102, SEC ID N° 106, SEC ID N° 1 10, SEC ID N° 114, SEC ID N° 118, SEC ID N° 122, SEC ID N° 126, SEC ID N° 130, SEC ID N° 134, SEC ID N° 138, SEC ID N° 142, SEC ID N° 146, SEC ID N° 150, SEC ID N° 154, SEC ID N° 158, SEC ID N° 162, SEC ID N° 166, y SEC ID N° 170.
Además de depender de las descripciones de anticuerpos usando los identificadores de secuencia tratados con anterioridad, algunas formas de realización también se pueden describir por referencia a los clones de Fab aislados en los experimentos descritos en la presente memoria. En algunas formas de realización, los anticuerpos recombinantes comprenden las CDR3 de las cadenas pesada y/o ligera de los clones siguientes: TP-2A2, TP-2A5.1 , TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B1 , TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP- 2C1 , TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3 , TP-3B4, TP-3C 1 , TP-3C2, TP-3C3 , TP-3D3, TP-3E1 , TP-3F1 , TP-3F2, TP-3G1 , TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8. En algunas formas de realización, los anticuerpos pueden comprender además las CDR2 de estos anticuerpos y seguir comprendiendo las CDR1 de estos anticuerpos. En otras formas de realización, los procedimientos pueden además comprender cualquier combinación de las CDR.
De acuerdo con esto, en otra forma de realización se proporcionan anticuerpos anti-TFPI que comprenden: (1) regiones estructurales de la cadena pesada humana, una región CDR1 de la cadena pesada humana, una región CDR2 de la cadena pesada humana y una región CDR3 de la cadena pesada humana, en las que la región CDR3 de la cadena pesada humana es la CDR3 de la cadena pesada de CDR3 de TP-2A2, TP-2A5.1 , TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B 1 , TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1 , TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3 , TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1 , TP-3C2, TP-3C3 , TP-3D3, TP-3E1 , TP-3F1 , TP-3F2, TP-3G1 , TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8; y (2) regiones estructurales de la cadena ligera humana, una región CDR1 de la cadena ligera humana, una región CDR2 de la cadena ligera humana y una región CDR3 de la cadena ligera humana, en las que la región CDR3 de la cadena ligera humana es la CDR3 de la cadena ligera de TP-2A2, TP-2A5.1 , TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B 1 , TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1 , TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C 1 , TP-3C2, TP-3C3 , TP-3D3, TP-3E1 , TP-3F1 , TP-3F2, TP-3G1 , TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8, en las que el anticuerpo se une a TFPI. El anticuerpo puede además comprender la CDR2 de la cadena pesada y/o la CDR2 de la cadena ligera de TP-2A2, TP-2A5.1 , TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B 1 , TP-2B3, TP-2B4, TP-2B 8, TP-2B9, TP-2C1 , TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3 , TP-3B4, TP-3C1 , TP-3C2, TP-3C3 , TP-3D3, TP-3E1 , TP-3F1 , TP-3F2, TP-3G1 , TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8. El anticuerpo puede además comprender la CDR1 de la cadena pesada y/o la CDR1 de la cadena ligera de TP-2A2, TP-2A5.1 , TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B 1 , TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1 , TP-2C7, TP-2D7, TP- 2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2?10, ??-3?2, ??-3?3, ??-3?4, ??-3?3 , ??-3?4, TP-3C1 , TP-3C2, TP-3C3, ??-3D3, ??-3?1 , TP-3F1 , TP-3F2, TP-3G1 , TP-3G3, ??-3?2, ??-4?7, ??-4?9, ??-4?7, ??-4?8, TP-4G8, o ??-4?8.
Las regiones CDR1 , 2 y/o 3 de los anticuerpos sometidos a ingeniería descritos con anterioridad pueden comprender la(s) secuencia(s) de aminoácidos exactas como las de TP-2A2, TP-2A5.1 , TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B 1 , TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1 , TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1 , TP-3C2, TP-3C3 , TP-3D3, TP-3E1 , TP-3F1 , TP-3F2, TP-3G1 , TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8 divulgadas en la presente memoria.
No obstante, el experto en la técnica apreciará que algunas desviaciones de las secuencias exactas de las CDR de TP-2A2, TP-2A5.1 , TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B 1 , TP- 2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1 , TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP- 2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3 , TP-3B4, TP-3C 1 , TP-3C2, TP-3C3 , TP-3D3, TP-3E1 , TP-3F1 , TP-3F2, TP-3G1 , TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, o TP-4H8 pueden ser posibles al tiempo que mantienen la capacidad del anticuerpo para unirse al TFPI de forma eficaz. De acuerdo con esto, en otra forma de realización, el anticuerpo sometido a ingeniería puede estar compuesto por una o más CDR que tienen, por ejemplo, una identidad de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % con una o más CDR de TP-2A2, TP-2A5.1 , TP-2A6, TP-2A8, TP-2A10, TP-2B 1 , TP-2B3, TP-2B4, TP-2B 8, TP-2B9, TP-2C1 , TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H10, TP-3A2, TP-3A3, TP- 3A4, TP-3B3 , ??-3?4, TP-3C1 , TP-3C2, TP-3C3 , TP-3D3, ??-3?1 , TP-3F1 , ??-3F2, TP-3G1 , TP-3G3, ??-3?2, ??-4?7, ??-4?9, ??-4?7, ??-4?8, TP-4G8, o ??-4?8.
El anticuerpo puede ser de cualquiera de varias clases de anticuerpos, tales como, sin limitaciones, un anticuerpo lgG1 , Ig02, lgG3, Ig04, IgM, lgA1 , lgA2, una IgA secretora e IgD, e IgE.
En otra forma de realización se proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado frente al inhibidor de la vía del factor tisular humano.
En otra forma de realización se proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado frente al dominio 2 de Kunitz del inhibidor de la vía del factor tisular humano. Ácidos nucleicos También se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican cualquiera de los anticuerpos monoclonales descritos con anterioridad.
Procedimientos para preparar anticuerpos frente a TFPI El anticuerpo monoclonal se puede producir de forma recombinante expresando una secuencia de nucleótidos que codifica las regiones variables del anticuerpo monoclonal de acuerdo con las formas de realización de la invención en una célula huésped. Con la ayuda de un vector de expresión, un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos se puede transfeccionar y expresar en una célula huésped adecuada para la producción. De acuerdo con esto, también se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal que se une al TFPI humano, que comprende: (a) transfeccionar una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal de la invención en una célula huésped. (b) cultivar la célula huésped para expresar el anticuerpo monoclonal en la célula huésped y, opcionalmente, (c) aislar y purificar el anticuerpo monoclonal producido, en el que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monoclonal de la presente invención.
En un ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, obtenidos mediante técnicas de biología molécula estándar se insertan en vectores de expresión de modo que los genes están operablemente unidos a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, la expresión "unido de forma operativa" quiere decir que un gen del anticuerpo está ligado en un vector tal que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector sirven a la función prevista de regulación de la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se escogen de modo que sean compatibles con la célula huésped usada para la expresión. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores distintos o, más normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos estándar (p. ej., ligando sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y en el vector, o ligando los extremos romos si no hay sitios de restricción presentes). Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden usar para crear genes de los anticuerpos de longitud completa de un isotipo de anticuerpo insertándolas en vectores de expresión que ya codifican las regiones constante de la cadena pesada y constantes de la cadena ligera del isotipo deseado, de modo que el segmento VH está operativamente unido al(los) segmento(s) CH dentro del vector y el segmento VL está unido operablemente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente, o como alternativa, el vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo a partir de una célula huésped. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el péptido señal esté unido dentro del marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteina no inmunoglobulínica).
Además de los genes que codifican la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula huésped. Con la expresión "secuencia reguladora" se pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de la cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen en, por ejemplo, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Ejemplos de secuencias reguladoras para la expresión en células huésped de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen niveles elevados de expresión proteica en células de mamífero, tal como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus 40 de simios (SV40), adenovirus (p. ej., el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP)), y polioma. Como alternativa, se pueden usar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de ß-globina.
Además de los genes de la cadena del anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionabas. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel y col.) Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, a una célula huésped en la que el vector se ha introducido. Ejemplos de genes marcadores seleccionares preferidos se incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células huésped dhfr- con selección con metotrexato/amplificación) y el gen neo (para la selección de G418).
Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el(los) vector(es) de expresión que codifican las cadenas ligera y pesada se transfeccionan en una célula huésped mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" están destinadas a abarcar una amplia variedad de técnicas usadas habitualmente para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección en DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células huésped tanto procariotas como eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y más preferentemente en células huésped de mamífero, es la más preferida porque es más probable que dichas células eucariotas, y en particular las células de mamífero, se ensamblen y secreten un anticuerpo inmunológicamente activo y adecuadamente plegado.
Ejemplos de células huésped de mamífero para expresar los anticuerpos recombinantes incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas las células dhfr-, CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usaron con un marcador seleccionare de DHFR, por ejemplo tal como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol 159:601-621), células de myeloma NSO, células COS, células HKB1 y células 5P2. Cuando los vectores de expresión que codifican los genes de anticuerpo se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen mediante cultivo de las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando procedimientos de purificación proteica estándar, tales como ultrafiltración, cromatografía de exclusión por tamaño, intercambio de cromatografía y centrifugación.
Uso de secuencias parciales de anticuerpos para expresar anticuerpos intactos Los anticuerpos interaccionan con antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se localizan en las seis CDR de la cadena pesada y la ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Véase, por ejemplo, las Fig. 6 y 7, en las que se identifican las regiones CDR en las cadenas variables ligera y pesada, respectivamente, del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención. Dado que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que simulen las propiedades de los anticuerpos específicos naturales construyendo vectores de expresión que incluyan secuencias CDR del anticuerpo natural específico introducido en las secuencias estructurales de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321 :522-525; and Queen, C. et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033). Dichas secuencias estructurales se puede obtener de bases de datos de ADN públicos que incluye las secuencias génicas de anticuerpo germinal. Estas secuencias germinales diferirán de las secuencias del gen del anticuerpo maduro porque no incluyen genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante la unión V(D)J durante la madurez de las células B, No es necesario obtener toda la secuencia de ADN de un anticuerpo concreto para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (véase el documento WO 99/45962). La secuencia parcial de las cadenas pesadas y ligeras que abarcan las regiones CDR normalmente es suficiente para este fin. La secuencia parcial se usa para determinar qué segmentos génicos germinales variables y de unión contribuyeron a los genes variables del anticuerpo recombinado. La secuencia germinal se usa después para llenar las porciones perdidas de las regiones variables. Las secuencias líder de las cadenas pesada y ligera se escinden durante la maduración de las proteínas y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Por esta razón es necesario usar la correspondiente secuencia líder germinal para los constructos de expresión. Para añadir secuencias perdidas, las secuencias de ADNc clonadas se pueden combinar con oligonucleótidos sintéticos mediante ligadura o amplificación por PCR. Como alternativa, toda la región variable se puede sintetizar como un grupo de oligonucleótidos cortos, solapantes, y combinarse mediante amplificación por PCR para crear un clon de región variable enteramente sintética. Este procedimiento tiene ciertas ventajas, tales como la eliminación o inclusión de sitios de restricción concretos, u optimización de codones concretos.
Las secuencias nucleotídicas de los transcritos de las cadenas pesada y ligera se usan para diseñar un grupo solapante de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con idénticas capacidades de codificación de aminoácidos que las secuencias naturales. Las secuencias sintéticas de las cadenas pesada y kappa pueden diferir de las secuencias naturales de tres modos: Tiras de bases nucleotídicas repetidas se interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; los sitios óptimos de inicio de la traducción se incorporan de acuerdo con las normas de Kozak (Kozak, 1991 , J. Biol. Chem. 266:19867-19870); y los sitios Hindlll se introducen antes de los sitios de inicio de la traducción.
Para las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, las secuencias codificadoras optimizadas, y las correspondientes no codificadora, se rompen en 30-50 secciones nucleotídicas en aproximadamente el centro del oligonucleótidos no codificador correspondiente, Por tanto, para cada cadena, los oligonucleótidos se pueden ensamblar en grupos de doble hebra solapantes que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos. Los grupos se usan después como moldes para producir productos de amplificación por PCR de 150-400 nucleótidos. Normalmente, un único grupo de oligonucleótidos de la región variable se romperá en dos grupos que se amplifican por separado para generar dos productos de PCR solapantes. A continuación, estos productos solapantes se combinan mediante amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento solapante de la región constante de la cadena pesada o ligera en la amplificación por PCR para generar fragmentos que se puedan clonar fácilmente en los constructos del vector de expresión.
Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera reconstruidas se combinan después con secuencias clonadas promotoras, de inicio de la traducción, región constante, región 3' no traducida, de poliadenilación y de terminación de la transcripción para formar constructos de vectores de expresión. Los constructos de expresión de las cadenas pesada y ligera se pueden combinar en un único vector, cotransfeccionar, transfeccionar en serie o transfeccionar por separado en células huésped que se condensan después para formar una célula huésped que expresa ambas cadenas.
Por tanto, en otro aspecto, las características estructurales de un anticuerpo anti-TFPI humano, por ejemplo TP2A8, TP2G6, TP2G7, TP4B7, etc., se usan para crear anticuerpos anti-TFPI humanos estructuralmente relacionados que conservan la función de la unión al TFPI. Más específicamente, una o más CDR de las regiones de cadena pesada y ligera identificadas específicamente de los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden combinar de forma recombinante con regiones estructurales y CDR humanas conocidas para crear anticuerpos anti-TFPI humanos sometidos a ingeniería recombinante de la invención.
De acuerdo con esto, en otra forma de realización se proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-TFPI que comprende: Preparar un anticuerpo que comprende (1) regiones estructurales de la cadena pesada humana y CDR de la cadena pesada humana, en las que la CDR3 de la cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de de aminoácidos SEC ID N° 388-430 y/o (2) regiones estructurales de la cadena ligera humana y CDR de la cadena ligera humana, en las que la CDR3 de la cadena ligera humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de de aminoácidos SEC ID N° 259-301 ; en las que el anticuerpo conserva la capacidad de unirse al TFPI. En otras formas de realización, el procedimiento se pone en práctica usando otras CDR de la invención.
Composiciones farmacéuticas También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades terapéuticamente eficaces de un anticuerpo monoclonal anti-TFPI y un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" es una sustancia que se puede añadir al ingrediente activo para ayudar a formular o estabilizar la preparación y que no produce efectos toxicológicos adversos significativos en el paciente. Ejemplos de dichos vehículos son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen agua, azúcares tales como maltosa o sacarosa, albúmina, sales tales como cloruro sódico etc. Otros vehículos se describen en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal anti-TFPI.
Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Preferentemente, la composición se formula para inyección parenteral. La composición se puede formular en forma de una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la elevada concentración del fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. En algunos casos, incluirá agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición.
Se pueden preparar soluciones inyectables estériles mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en lo que antecede, según se requiera, seguido por esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados en lo que antecede. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, algunos procedimientos de preparación preferidos son secado al vacío y liofilización, que da un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo previamente filtrada para esterilizar.
Usos farmacéuticos El anticuerpo monoclonal puede usarse para fines terapéuticos para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales en las formas de realización descritas con anterioridad se pueden usar para bloquear la interacción de TFPI con FXa o para prevenir la inhibición dependiente de TFPI de la actividad de TF/FVIIa. De forma adicional, el anticuerpo monoclonal puede usarse también para restablecer una generación dirigida por TF/FVIIa de Fxa para sortear la insuficiencia de la amplificación de Fxa dependiente de FVIII o FIX.
Los anticuerpos monoclonales tienen uso terapéutico en el tratamiento de trastornos de hemostasia tales como trombocitopenia, trastornos de las plaquetas y trastornos de hemorragia (p. ej., hemofilia A y hemofilia B). Dichos trastornos se pueden tratar administrando una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal anti-TFPI a un paciente que lo necesite. Los anticuerpos monoclonales también tienen uso terapéutico en el tratamiento de hemorragias no controladas en indicaciones tales como traumatismos e ictus hemorrágico. Por tanto, también se proporciona un procedimiento para acortar el tiempo de sangrado que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-TFPI de la invención a un paciente que lo necesite.
Los anticuerpos se pueden usar en forma de monoterapia o en combinación con otras terapias para abordar un trastorno hemostásico. Por ejemplo, se cree que la coadministración de uno o más anticuerpos de la invención con un factor de coagulación tal como el factor Vlla, el factor VIII o el factor IX es útil para tratar la hemofilia. En una forma de realización, se proporciona un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación, que comprende administrar (a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano y (b) una segunda cantidad de factor VIII o de factor IC, en el que dichas cantidades primera y segunda juntas son eficaces para tratar dichas deficiencias o defectos. En otra forma de realización, se proporciona un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación, que comprende administrar (a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano y (b) una segunda cantidad de factor VIII o de factor IC, en el que dichas cantidades primera y segunda juntas son eficaces para tratar dichas deficiencias o defectos, y, además, en el que el factor VII no se administra de manera conjunta. La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la combinación de un anticuerpo monoclonal de la invención y el factor VIII o factor IX, en la que la composición no contiene factor VII. "Factor VII" incluye el factor VII y el factor Vlla. Es probable que estas terapias de combinación reduzcan la frecuencia de infusión necesaria del factor de coagulación. Por coadministración o terapia de combinación se quiere decir administración de los dos fármacos terapéuticos, cada uno formulado por separado o juntos en una composición y, cuando se formulan por separado, se administran aproximadamente a la vez o en momentos diferentes, pero en el mismo periodo terapéutico.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía parenteral a los sujetos que sufran hemofilia A o B, a una dosificación y frecuencia que puede variar con la gravedad del episodio de sangrado o, en el caso de la terapia profiláctica, puede variar con la gravedad de la deficiencia de la coagulación del paciente.
Las composiciones se pueden administrar a los pacientes que las necesiten en forma de bolo o de infusión continua. Por ejemplo, una administración en bolo de un anticuerpo de la invención presente en forma de fragmento Fab puede estar en una cantidad de 0,0025 a 100 mg/kg de peso corporal, de 0,025 a 0,25 mg/kg, de 0,010 a 0,10 mg/kg o de 0,10-0,50 mg/kg. Para la infusión continua, un anticuerpo de la invención presente en forma de fragmento Fab se puede administrar a 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/minuto, de 0,0125 a 1 ,25 mg/kg/min, de 0,010 a 0,75 mg/kg/min, de 0,010 a 1 ,0 mg/kg/min o de 0,10-0,50 mg/kg/min. Durante un periodo de 1-24 horas, 1-12 horas, 2-12 horas, 6-12 horas, 2-8 horas o 1-2 horas. Para la administración de un anticuerpo de la invención presente en forma de anticuerpo de longitud completa (con las regiones constantes completas), las cantidades de dosificación pueden ser de aproximadamente 1-10 mg/kg de peso corporal, 2-8 mg/kg, o 5-6 mg/kg. Dichos anticuerpos de longitud completa se administrarían, normalmente, mediante infusión ampliada a un periodo desde treinta minutos a tres horas. La frecuencia de la administración dependería de la gravedad de la afección. La frecuencia podría variar desde tres veces a la semana a una vez cada dos o tres semanas.
De forma adicional, las composiciones se pueden administrar a los pacientes mediante inyección subcutánea. Por ejemplo, una dosis de 10 a 100 mg de anticuerpo anti-TFPI se puede administrar a los pacientes mediante inyección subcutánea semanalmente, cada dos semanas o mensualmente, Como se usa en la presente memoria, "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un anticuerpo monoclonal anti-TFPI o de una combinación de dicho anticuerpo y factor VIII o factor IX que es necesaria para aumentar de forma eficaz el tiempo de coagulación in vivo o, de otro modo, producir un beneficio mensurable in vivo en un paciente que lo necesite. La cantidad exacta dependerá de numerosos factores, incluidos, entre otros, los componentes y las características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes a la que está destinado, el modo de administración, las consideraciones de cada paciente individual y similares, y un experto en la técnica puede determinarla con facilidad.
Ejemplos Materiales y procedimientos generales Ejemplo 1 Cribado en fase sólida y detección selectiva de la biblioteca de anticuerpos monoclonales contra el TFPI humano Cribado en fase sólida de la biblioteca de anticuerpos monoclonales contra el TFPI Los anticuerpos anti-TFPI se seleccionaron mediante cribado en fase sólida de fagos que expresaron biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos HuCal Gold (Rothe et al., J. Mol. BioL, 2008, 376: 1182-1200) contra el TFPI humano (American Diagnostica). En pocas palabras, placas Maxisorp de 96 pocilios se revistieron con 200 µ? de TFPI (5 µg/ml) durante la noche a 4 °C y las placas se bloquearon después con un tampón de PBS con 5 % de leche. Después de lavar las placas con PBS que contiene 0,01 % de Tween-20 (PBST), se añadió una alícuota de la biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos a los pocilios revestidos con TFPI y se incubaron durante 2 horas. El fago no unido se eliminó mediante lavado con PBST y el fago unido al antígeno se eluyó con ditiotreitol, se infectó y amplificó en la cepa de E. coli TG1. El fago se rescató mediante fagos colaboradores para el siguiente ciclo de cribado en fase sólida. Se realizó un total de tres ciclos de cribado en fase sólida y los clones de los últimos dos ciclos se sometieron a detección selectiva con TFPI humano en un ensayo de ELISA.
Detección selectiva de clones de anticuerpos mediante unión a antígeno en un ELISA Para seleccionar los clones que se unen al TFPI humano, los genes de Fab de los clones de los fagos del segundo y tercer ciclo de cribado en fase sólida se subclonaron en un vector de expresión bacteriano y se expresaron en la cepa TG1 de E. coli. El lisado bacteriano se añadió a los pocilios de las placas Maxisorp revestidas con TFPI. Después de lavar, el Fab anti-humano de cabra conjugado con HRP se usó como anticuerpo de detección y las placas se desarrollaron añadiendo AmplexRed (Invitrogen) con peroxide de hidrógeno. Una señal de al menos cinco veces mayor que la inicial se consideró positiva. La reactividad cruzada de los anticuerpos anti-TFPI humano con TFPI de ratón se determinó mediante un ELISA similar de unión a TFPI de ratón. Las placas se revistieron con TFPI de ratón (R&D System), BSA y lisozima. Los últimos dos antígenos se usaron como controles negativos. Un grupo representativo de datos se muestra en la Fig. 1.
Secuencias de los anticuerpos anti-TFPI humano Después del cribado en fase sólida y de la detección selectiva de la biblioteca de anticuerpos humanos HuCal Gold contra TFPI, se realizó la secuenciación del ADN sobre los clones de anticuerpos positivos, lo que dio como resultado 44 secuencias únicas de anticuerpos (Tabla 2). Entre estas secuencias de anticuerpos, 29 cadenas ligeras lambda y 15 cadenas ligeras kappa. Nuestro análisis de la región variable de las cadenas pesadas revela 28 de VH3, 14 de VH6, 1 de VH1 y 1 de VH5.
Tabla 2. Secuencia peptídica de la región variable de 44 anticuerpos anti-TFPI.
Reactividad cruzada con el TFPI de ratón Los 44 clones anteriores de unión a TFPI humano también se sometieron a ensayo de unión al TFPI de ratón en un ELISA. Se encontró que diecinueve anticuerpos presentaban reacción cruzada con el TFPI de ratón. Pata facilitar el estudio usando un modelo de hemofilia en ratón, los autores caracterizaron además estos 19 anticuerpos, así como cinco anticuerpos que eran específicos del TFPI humano. En la Fig, 1 se muestra un grupo representativo de datos. Ninguno de estos anticuerpos se unió a BSA o a la lisozima en el ELISA.
Ejemplo 2 Expresión y purificación de anticuerpos anti-TFPI Los anticuerpos anti-TFPI (como fragmentos Fab) se expresaron y purificaron en la cepa bacteriana TG1. En pocas palabras, se escogió una única colonia de la cepa bacteriana TG1 que contenía el plásmido de expresión del anticuerpo y se cultivó durante la noche en 8 mi de medio 2 x YT en presencia de 34 µg/ml de cloranfenicol y 1 % de glucosa. Un volumen de 7 mi del cultivo se transfirió a 250 mi de medio 2 x YT fresco que contenía 34 µg/ml de cloranfenicol y 0,1 % de glucosa. Después de 3 horas de incubación se añadió IPTG o,5 mM para inducir la expresión de Fab. El cultivo continuó durante la noche a 25 °C. El cultivo se centrifugó para sedimentar las células bacterianas. Después, el sedimento se resuspendió en tampón de lisis Bug Búster (Novagen). Después de centrifugar, el sobrenadante de la lisis bacteriana se filtró. Los fragmentos Fab se purificaron por afinidad a través de una columna de Ni-NTA (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 3 Determinación de la CE50 y la afinidad de unión de los anticuerpos anti-TFPI Los anticuerpos Fab purificados se usaron para determinar la CE50 de los anticuerpos anti-TFPI frente a TFPI de ratón o humano. La CE50 se evaluó en un ELISA, de un modo similar al descrito en lo que antecede. Los resultados se analizaron con SoftMax. La afinidad de unión de los anticuerpos anti-TFPI se determinó en un ensayo Biacore. En pocas palabras, el antígeno, TFPI humano o de ratón, se inmovilizó en los chips CM5 usando el kit de acoplamiento de amina (GE HealthCare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de TFPI inmovilizado se ajustó a la masa del antígeno para dar aproximadamente 300 RU. Las Fab del anticuerpo se analizaron en la fase móvil y al menos cinco concentraciones diferentes (0,1 , 0,4, 1 ,6, 6,4 y 25 nM) de los anticuerpos purificados se usaron en el ensayo Biacore. La cinética y la afinidad de unión se calcularon con el software Biacore T100 Evaluation.
Como se muestra en la Tabla 3, los 24 Fab anti-TFPI mostraron varias CE5o frente al TFPI humano (de 0,09 a 792 mM) y el TFPI de ratón (0,06 a 1035 nM) y la afinidad redeterminada mediante Biacore estaba de acuerdo con varios TFPI humanos (1 ,25 a 1140 nM). En el estudio Biacore de los Fab frente al TFPI de ratón, la variación de la afinidad fue menor (3,08 a 51 ,8 nM).
Tabla 3: La actividad de unión de 24 anticuerpos contra TFPI humano o de ratón determinada mediante ELIS y Biacore (hTFPI: TFPI humano; mTFPI: TFPI de ratón; Neg: La señal fue menor de dos veces la inicial; ND, no disponible).
Ejemplo 4 Conversión de Fab anti-TFPI en IgG Todos los anticuerpos anti-TFPI identificados son Fab completamente humanos que se pueden convertir fácilmente en IgG humana como agente terapéutico. No obstante, en este ejemplo, los Fab seleccionados se convirtieron en un anticuerpo quimérico que contiene una región constante de IgG de ratón, de modo que son más adecuados para análisis en un modelo de ratón. La región variable de los anticuerpos seleccionados se injertó en un vector de expresión en mamíferos que contiene regiones constantes de ratón. La molécula de IgG completamente ensamblada se transfeccionó y expresó en células HKB 1 1 (Mei et al., Mol. Biotechnol., 2006, 34: 165-178). El sobrenadante del cultivo se recogió y se concentró. Las moléculas de IgG anti-TFPI se purificaron por afinidad a través de una columna de Hitrap Protein G (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 5 Selección de anticuerpos anti-TFPI neutralizantes Los anticuerpos anti-TFPI neutralizantes se seleccionaron en base a su inhibición de la actividad de TFPI en tres condiciones experimentales. La actividad del TFPI se midió usando el ensato de actividad de TFPI ACTICHROME® (American Diagnostica Inc., Stamford, CT), un ensayo cromogénico de tres etapas para medir la capacidad del TFPI para inhibir la actividad catalítica del complejo TF/FVIIa para activar el factor X en factor Xa. La actividad neutralizante del anticuerpo anti-TFPI es proporcional a la cantidad de la generación de FXa restarurado. En el primer escenario, los anticuerpos anti-TFPI purificados se incubaron con TFPI humano o de ratón recombinante (R&D System) a las concentraciones indicadas. Tras la incubación, las muestras se mezclaron con TF/FVIIa y FX, y la actividad residual del complejo TF/FVIIa se midió después usando SPECTROZYME® Fxa, un sustrato cromogénico de Fxa altamente específico. Este sustrato sólo fue escindido por el FXa generado en el ensayo, liberando un cromóforo de p-nitroanilina (pNA), que se midió a 405 nm. La actividad del TFPI presente en la muestra se interpoló de una curva estándar construida usando niveles de actividad de TFPI conocidos. El ensayo se realizó en un modo de punto final. En otros dos escenarios, los anticuerpos anti-TFPI se introdujeron en plasma humano normal o en plasma con hemofilia A y se midió la generación de FXa restablecido.
Ejemplo 6 Los anticuerpos anti-TFPI acortan el tiempo de coagulación en un ensayo del tiempo de protrombina diluida (dPT) El ensayo de dPT se realizó esencialmente como han descrito Welsch et al., Thrombosis Res., 1991 , 64(2): 213-222. En pocas palabras, se prepararon plasma humano normal (FACT, George King Biomedical), plasma con depleción de TFPI humano (American Diagnostica) o plasma de hemofilia A (George King Biomedical) mezclando el plasma con 0,1 volúmenes del tampón control con anticuerpos anti-TFPI. Tras incubar durante 30 minutos a 25 °C, las muestras de plasma (100 µ?) se combinaron con 200 µ? de simplastina (Biomerieux) adecuadamente diluida (dilución 1 :500) como fuente de tromboplastina y se determine el tiempo de coagulación usando un fibrómetro STA4 (Stago). La tromboplastina se diluyó con PBS o tampón basado en Tris 0,05M (pH 7,5) que contiene cloruro sódico 0,1 M, seroalbúmina bovina 0,1 % y cloruro cálcico 20 µ .
Ejemplo 7 Anticuerpos anti-TFPI, solos o en combinación con el factor recombinante VIII o el factor IX, acortan el tiempo de coagulación sanguínea en un ensayo ROTEM El sistema ROTEM (Pentapharm GmbH) incluyó un instrumento de cuatro canales, un ordenador, patrones de plasma, activadores y tazas y pinzas desechables. Los parámetros trombolastográficos de los sistemas hemostásicos ROTEM incluyeron: Tiempo de coagulación (CT), que refleja el tiempo de reacción (tiempo requerido para obtener una amplitud de 2 mm tras el inicio de la recolección de datos) para el inicio de la coagulación sanguínea; tiempo de formación de coágulos (CFT) y el ángulo alfa para reflejar la propagación de la coagulación, y la amplitud máxima y los módulos elásticos máximos para reflejar la firmeza del coágulo. En el ensayo ROTEN, se evaluaron 300 µ? de sangre entera o plasma citrada fresca. Todos los constituyentes se reconstituyeron y se mezclaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con recolección de datos durante el periodo de tiempo requerido para cada sistema. En pocas palabras, las muestras se mezclaron retirando/dispensando 300 µ? de sangre o plasma con una pipeta automática en tazas ROTEM con adición de 20 µ? de CaCI2 (200 mmol), seguido por mezclado inmediato de la mezcla e inicio de la recolección de datos. Los datos se recogieron durante 2 horas usando un sistema ROTEM (versión del software 2,986) controlado por ordenador.
En sas Fig. 3 y 5 se muestran un ejemplo de resultado del ensayo ROTEM en la detección del efecto de los anticuerpos anti-TFPI en el acortamiento del tiempo de coagulación de la sangre. La Fig. 3 muestra que TP-2A8-Fan acortaba el tiempo de coagulación en plasma humano de hemofílico A o en sangre entera de ratón hemofílico A, solo o en combinación con FVIII recombinante, cuando el sistema ROTEM se inició con NATEM. La Fig. 5 muestra que los anticuerpos anti-TFPI en formato IgG (TP-2A8, TP-3G1 , and TP-3C2) acortaban los tiempos de coagulación en comparación con un anticuerpo de ¡Gg de control en ratones. En case a estos resultados y la comprensión del campo, el experto en la técnica esperaría que estos anticuerpos anti-TFPI también acorten el tiempo de coagulación en combinación con FIX recombinante en comparación con estos anticuerpos solo.
Ejemplo 8 Actividad funcional in vitro de los anticuerpos anti-TFPI Para investigar los anticuerpos TFPI en el bloqueo de la función del TFPI, se usaron el ensayo cromogénico ACTICHROME y el tiempo de protrombina diluida (dPT) para analizar la actividad funcional de los anticuerpos obtenidos del cribado en fase sólida y la detección selectiva. En ambos ensayos se uso un anticuerpo monoclonal anti-TFPI de rata (R&D System) como control positivo y el Fab policlonal humano se usó como control negativo. En el ensayo cromogénico, ocho de los anticuerpos inhibieron más del 50 % de la actividad del TFPI en comparación con el anticuerpo monoclonal de rata (Tabla 4). En el ensayo dPT los ocho Fab anti-TFPI mostraron un efecto altamente inhibidor, acortando el tiempo de coagulación por debajo de 80 segundos, y cuatro de los ocho Fab acortaron el dPT por debajo de 70 segundos. La dependencia de la dosis de cuatro clones representativos en el acortamiento del dPT se muestra en la Fig. 2. No obstante, los Fab anti-TFPI humano con una actividad inhibidora del TFPI baja o ausente también acortó el tiempo de coagulación en dPT. Por ejemplo, TP-3B4 and TP-2C7, aunque mostraron una actividad inhibidora inferior al 25 %, podrían acortar el dPT a menos de 7o segundos. UN simple análisis de regresión lineal de la actividad inhibidora y dPT sugiere una correlación significativa (p= 0,0095) pero una gran varianza (R. cuadrado= 0,258.) Tabla 4. Actividad funcional in vitro de los anticuerpos anti-TFPI determinada mediante inhibición de su actividad den el ensayo TFPI y el ensayo dPT humanos.
Uno de los Fab anti-TFPI, Fab-2A8, también se analizó en un ensayo ROTEM en el que se usó plasma humano con hemofilia A con niveles bajos del factor VIII o sangre entera de ratón con hemofilia A. Como se muestra en la Fig. 3, comparando un anticuerpo policlonal anti-TFPI de conejo, Fab-2A8 mostró una actividad similar en el plasma humano con hemofilia A, disminuyendo el tiempo de coagulación (CT) de 2200 segundos a aproximadamente 1700 segundos. Cuando se usó sangre entera de ratón con hemofilia A, el anticuerpo control, anti-TFPI de conejo, acortó el CT de 2700 segundos a 1000 segundos, mientras que el FAB-2a8 acortó el CT de 2650 segundos a 1700 segundos. Estos resultados indican que Fab-2A8 pueden acortar significativamente el tiempo de coagulación tanto en plasma humano como en sangre de ratón (p= 0,03).
Ejemplo 9 Función de los anticuerpos anti-TFPI tras la conversión IgG quimérica Ensayos in vitro de generación de factor Xa y tiempo de protrombina diluida indican que al menos seis de los 24 Fab anti-TFPI, TP-2A8, TP-2B3, TP-2G6, TP-3C2, TP-3G1 y TP-4B7, pudieron bloquear la función del TFPI. Para facilitar el estudio in vivo usando ratones con hemofilia A, los autores convirtieron estos seis Fab anti-TFPI humano en IGg quimérica usando el isotipo lgG1 murino. El vector de expresión de IgG se transfeccionó en células HKB11 y el anticuerpo expresado se recogió en el sobrenadante del cultivo y se purificó en columna con Proteína G. Cuando un clon 2G6-Fab representativo se convirtió en IgG, el_ 2G6-lgG mostró un incremento de dos veces la CE50 de unión a TFPI humano (de 0,48 nM, 22 nM) y un incremento de diez veces con respecto TFPI de ratón (de 5,18 nM a 0,51 nM). Los resultados de la unión de lgG-2G6 al TFPI humano y de ratón se muestran en la Fig 4 Ejemplo 10 Efecto sobre la tasa de supervivencia en el modelo de transección de la vena de la cola en ratones con hemofilia A (HemA) Se ha establecido un modelo de transección de la vena de la cola en ratones para evaluación farmacológica. Este modelo simula el amplio abanico de fenotipos de sangrado observados entre individuos normales y hemofílicos graves. Para estos estudios, se usaron ratones macho con hemofilia A (de 8 semanas de edad y de 20 a 26 gramos de peso). Los ratones recibieron el anticuerpo monoclonal anti-TFPI (40 µg/Gatón) a través de infusión en la vena de la cola, solo o junto con un factor de coagulación como FVIIII (0,1 Ul/ratón) antes de la lesión. A las 24 horas de la dosis se transeccionó la vena izquierda de la cola a 2,7 mm de la punta (en diámetro). La supervivencia se observó en las 24 horas posteriores a la transección.. Se demostró que la tasa de supervivencia era dependiente de la dosis cuando se administraba con el FVIII recombinante (datos no mostrados). Los datos mostrados en la Fig. 8 procedían de dos estudios distintos (n= 15 y n= 10, respectivamente). Los resultados mostraron que TP-2A8-lgG prolongaba de forma significativa la supervivencia de los ratones con hemofilia A en comparación con la IgG de ratón control; y, en combinación con FVIII recombinante, demostró una tasa de supervivencia mejor que como agente solo.
Ejemplo 11 Combinación de un anticuerpo anti-TFPI con el factor VI la recombinante acortó adicionalmente el tiempo de coagulación y el tiempo de formación del coágulo El efecto combinado del anticuerpo anti-TFPI y el FVIIa recombinante (Novo Nordisk) se evaluó en un sistema ROTEM usando EXTEM (dilución 1 :1000) y sangre entera de ratón con hemofilia A. Las cantidades indicadas del anticuerpo anti-TFPI , TP-2A8-lgG ("2A8"), y del FVIIa recombinante ("FVIIa") se añadieron en 300 µ? de sangre entera citrada de ratón con hemofilia A y se inició la coagulación de la sangre usando el sistema EXTEM. L Fig. 9 muestra que la adición de TP-2A8-lgG o FVIIa recombinante en la sangre entera de ratón con hemofilia A acortó el tiempo de coagulación y el tiempo de formación de coágulos, respectivamente. La combinación de TP-2A8-lgG y FVIIa recombinante (("2A8 + FVIIa") acortó más el tiempo de coagulación y el tiempo de formación de coágulos, lo que indica que la combinación del anticuerpo anti-TFPI con FVIIa recombinante es útil en el tratamiento de pacientes con hemofilia con o sin inhibidores.
Ejemplo 12 Los anticuerpos anti-TFPI acortaron el tiempo de coagulación en sangre de ser humano hemofílico inducida mediante inhibidor FVIII Determinados anticuerpos anti-TFPI, 2A8 and 4B7, también se analizaron en un ensayo ROTEM usando anticuerpos FVIII neutralizantes para inducir hemofilia en sangre entera extraída de pacientes no hemofílicos. La Figura 10 muestra que la sangre humana normal tiene un tiempo de coagulación de 1000 segundos. En presencia de anticuerpos neutralizantes de FVIII (PHA, 100 microgramos/ml), el tiempo de coagulación se prolongó hasta aproximadamente 5200 segundos. El tiempo de coagulación prolongado se acortó significativamente mediante la adición de un anticuerpo anti-TFPI 2A8 o 4B7, lo que indica que el anticuerpo anti-TFPI 2A8 es útil en el Tratamiento de los pacientes de hemofilia con inhibidores.
Ejemplo 13 Anticuerpos inhibidores anti-TFPI se unen al dominio 2 de Kunitz del TFPI HUMANO Se usaron transferencias de tipo western y ELISA para determinar qué dominio(s) del TFPI de los anticuerpos inhibidores se unen. El TFPI humano de longitud completa recombinante o los dominios TFPI se usaron para estos estudios. El ELISA fue similar al del Ejemplo 3 en la transferencia de tipo western, los TPFI humanos o los dominios se introdujeron en un tampón de carrera MES en SDA- PAGE 4-12 % de Bis-TRIS (Invitrogen, Carlsbad, CA) y después se transfirieron a la membrana de celulosa. Tras la incubación con anticuerpos inhibidores durante 10 minutos, la membrana se lavó tres veces usando el sistema SNAPid Millipore, Billerica, MA). Un anticuerpo anti-ratón de burro conjugado con HRP (Pierce, Rockford, IL) a una dilución de 1 10,000 se incubó con la membrana durante 10 minutos. Después de una etapa de lavado similar, la membrana se desarrolló usando sustrato Supersignal (Pierce, Rockford, IL Mientras que el anticuerpo 1 con el dominio anti-Kunitz control se une al TFPI de longitud completa, TFPI truncado y dominios de TFPI, los anticuerpos anti-TFPI inhibidores sólo se unen a TFPI que contiene el dominio 2 de Kunitz. Esto indica que la unión al dominio 2 de Kunitz es necesaria para la función inhibidora del anticuerpo.
Tala 5. Los dominios unidos por anticuerpos tal como se determina en las transferencias WESTERN y ELISA.
Aunque la presente invención se ha descrito con respecto a las formas de realización específicas y los ejemplos, debe entenderse que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones y los equivalentes pueden sustituirse sin desviarse del verdadero espíritu y alcance de la invención La especificación y los ejemplos deben considerarse de naturaleza ilustrativa y no tan restrictivos. Además, todos los artículos, libros, publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan por referencia en su totalidad.

Claims (35)

  1. REIVINDICACIONES Un anticuerpo monoclonal aislado que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, caracterizado porque el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N° 388-430. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo comprende además (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 302-344, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 345-387, o () una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 302-344 y una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 345-387. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, caracterizado porque el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N° 259-301. El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo comprende además (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 173-215, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 216-258, o () una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 173-215 y una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 216-258. El anticuerpo de la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo comprende además una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 259-301. El anticuerpo de la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo comprende además (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 302-344, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 345-387, (c) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 173-215 y (d) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 216-258. El anticuerpo de la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, que comprende: (a) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 173, 216 y 259, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 302, 345 y 388; (b) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 174, 217 y 260, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 303, 346 y 389; (c) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 175, 218 y 261 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 304, 347 y 390; (d) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 176, 219 y 262, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 305, 348 y 391 ; (e) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 177, 220 y 263, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 306, 349 y 392; (f) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 178, 221 y 264, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 307, 350 y 393; (g) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 179, 222 y 265, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 308, 351 y 394; (h) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 180, 223 y 266, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 309, 352 y 395; (i) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 181 , 224 y 267, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 310, 353 y 396; (j) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 182, 225 y 268, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 31 1 , 354 y 397; (k) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 183, 226 y 269, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 312, 355 y 398; (I) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 184, 227 y 270, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 313, 356 y 399; (m) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 185, 228 y 271 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 314, 357 y 400; (n) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 186, 229 y 272, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 315, 358 y 401 ; (0) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 187, 230 y 273, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 316, 359 y 402; (p) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 188, 231 y 274, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 317, 360 y 403; (q) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 189, 232 y 275, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 318, 361 y 404; (r) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 190, 233 y 276, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 319, 362 y 405; (s) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 191 , 234 y 277, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 320, 363 y 406; (t) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 192, 235 y 278, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 321 , 364 y 407; (u) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 193, 236 y 279, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 322, 365 y 408; (v) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 194, 237 y 280, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 323, 366 y 409; (w) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 195, 238 y 281 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 324, 367 y 410; (x) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 196, 239 y 282, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 325, 368 y 41 1 ; (y) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 197, 240 y 283, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 326, 369 y 412; (z) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 198, 241 y 284, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 327, 370 y 413; (aa) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 199, 242 y 285, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 328, 371 y 414; (bb) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 200, 243 y 286, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 329, 372 y 415; (ce) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 201 , 244 y 287, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 330, 373 y 473; (dd) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 202, 245 y 288, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 331 , 374 y 417; (ee) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 203, 246 y 289, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 332, 375 y 418; (ff) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 204, 247 y 290, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 333, 376 y 419; (gg) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 205, 248 y 291 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 334, 377 y 420; (hh) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 206, 249 y 292, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 335, 378 y 421 ; (ii) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 207, 250 y 293, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 336, 379 y 422; (jj) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 208, 251 y 294, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 337, 380 y 423; (kk) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 209, 252 y 295, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 338, 381 y 424; (II) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 210, 253 y 296, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 339, 382 y 425; (mm) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 211, 254 y 297, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 340, 383 y 426; (nn) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 212, 255 y 298, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 341 , 384 y 427; (oo) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 213, 256 y 299, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 342, 385 y 428; (pp) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 214, 257 y 300, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 343, 386 y 429; (qq) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 215, 258 y 301 , y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 344, 387 y 430; o (rr) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 194, 237 y 280, y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID N° 335, 378 y 421. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende: (a) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 2 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 4; (b) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 6 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 8; (c) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 10 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 12; (d) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 14 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 16; (e) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 18 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 20; (f) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 22 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 24; (g) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 26 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 28; (h) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 30 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 32; (i) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 34 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 36; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 38 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 40; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 42 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 44; (I) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 46 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 48; (m) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 50 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 52; (n) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 54 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 56; (o) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 58 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 60; (p) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 62 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 64; (q) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 66 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 68; (r) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 70 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 72; (s) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 74 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 76; (t) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 78 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 80; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 82 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 84; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 86 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 88; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 90 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 92; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 94 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 96; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 98 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 100; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 102 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 104; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 106 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 108; (bb) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 110 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 112; (ce) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 114 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 116; (dd) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 118 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 120; (ee) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 122 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 124; (ff) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 126 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 128; (gg) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 130 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 132; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 134 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 136; una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 138 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 140; (jj) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 142 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 144; (kk) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 146 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 148; (II) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 150 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 152; (mm) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 154 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 156; (nn) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 158 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 160; (oo) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 162 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 164; (pp) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 166 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 168; (qq) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 170 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 172; o (rr) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 86 y una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID N° 136; Un anticuerpo monoclonal aislado caracterizado porque se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 96 % con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID N° 4, SEC ID N° 8, SEC ID N° 12, SEC ID N° 16, SEC ID N° 20, SEC ID N° 24, SEC ID N° 28, SEC ID N° 32, SEC ID N° 36, SEC ID N° 40, SEC ID N° 44, SEC ID N° 48, SEC ID N° 52, SEC ID N° 56, SEC ID N° 60, SEC ID N° 64, SEC ID N° 68, SEC ID N° 72, SEC ID N° 76, SEC ID N° 80, SEC ID N° 84, SEC ID N° 88, SEC ID N° 92, SEC ID N° 96, SEC ID N°100, SEC ID N° 104, SEC ID N° 108, SEC ID N° 112, SEC ID N° 116, SEC ID N° 120, SEC ID N° 124, SEC ID N° 128, SEC ID N° 132, SEC ID N° 136, SEC ID N° 140, SEC ID N° 144, SEC ID N° 148, SEC ID N° 152, SEC ID N° 156, SEC ID N° 160, SEC ID N° 164, SEC ID N° 168 y SEC ID N° 172. Un anticuerpo monoclonal aislado caracterizado porque se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera humana que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 97 % con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID N° 2, SEC ID N° 6, SEC ID N° 10, SEC ID N° 14, SEC ID N° 18, SEC ID N° 22, SEC ID N° 26, SEC ID N° 30, SEC ID N° 34, SEC ID N° 38, SEC ID N° 42, SEC ID N° 46, SEC ID N° 50, SEC ID N° 54, SEC ID N° 58, SEC ID N° 62, SEC ID N° 66, SEC ID N° 70, SEC ID N° 74, SEC ID N° 78, SEC ID N° 82, SEC ID N° 86, SEC ID N° 90, SEC ID N° 94, SEC ID N° 98, SEC ID N° 102, SEC ID N° 106, SEC ID N° 110, SEC ID N° 114, SEC ID N° 118, SEC ID N° 122, SEC ID N° 126, SEC ID N° 130, SEC ID N° 134, SEC ID N° 138, SEC ID N° 142, SEC ID N° 146, SEC ID N° 150, SEC ID N° 154, SEC ID N° 158, SEC ID N° 162, SEC ID N° 166, y SEC ID N° 170. 11. El anticuerpo de la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9 o 10, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo constituido por un anticuerpo lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, una IgA secretora, un anticuerpo IgD, e lgE. 12. El anticuerpo de la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 caracterizado porque el tiempo de coagulación sanguínea en presencia del anticuerpo se acorta medido mediante el tiempo de protrombina diluida. 13. El anticuerpo de la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 , caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena sencilla. 14. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 o 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 15. Un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación, caracterizado porque comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 14. 16. El procedimiento de la reivindicación 15, caracterizado porque el procedimiento trata la hemofilia A o B. Un procedimiento para acortar el tiempo de sangrado, caracterizado porque comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 14. 18. Un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación, caracterizado porque comprende administrar (a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano y (b) una segunda cantidad de factor VIII o de factor IX, en el que dichas cantidades primera y segunda juntas son eficaces para tratar dichas deficiencias o defectos y, además, en el que el factor VII no se administra de manera conjunta. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la combinación de (a) un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 o 13 y (b) el factor VIII o factor IX, en la que la composición no contiene factor VII. Un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 19. 21. Un procedimiento acortar el tiempo de sangrado, caracterizado porque comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 19. 22. Un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado frente al inhibidor de la vía del factor tisular humano. 23. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 22 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 24. Un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación, caracterizado porque comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 23. 25. El procedimiento de la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende administrar el factor VIII o el factor IX. 26. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque codifica un anticuerpo que se une al inhibidor de la vía del factor tisular, en el que el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N° 388-430. 27. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, caracterizada porque el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N° 259-301. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal completamente humano que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, caracterizado porque comprende: (i) transfeccionar una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo monoclonal completamente humano en una célula huésped; y 1 (ii) cultivar la célula huésped de modo que exprese el anticuerpo monoclonal. El procedimiento de la reivindicación 28, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias compuesto por las SEC ID N° 388-430. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano, caracterizado porque comprende: (i) transfeccionar una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo monoclonal en una célula huésped; y (ii) cultivar la célula huésped de modo que exprese el anticuerpo monoclonal, en el que el anticuerpo monoclonal comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias compuesto por las SEC ID N° 259-301. El procedimiento de la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las SEC ID N° 388-430 y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias compuesto por las SEC ID N° 259-301. Un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado frente al dominio Kunitz 2 del inhibidor de la vía del factor tisular humano. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 32 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un procedimiento para tratar deficiencias o defectos genéticos y adquiridos de la coagulación, caracterizado porque comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 33. 35. El procedimiento de la reivindicación 34, caracterizado porque además comprende administrar el factor VII, el factor VIII o el factor IX.
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