MX2014011781A

MX2014011781A - Anticuerpos regulados por proteasa.

Info

Publication number: MX2014011781A
Application number: MX2014011781A
Authority: MX
Inventors: John Murphy; Zhuozhi Wang; Ruth Winter
Original assignee: Bayer Healthcare Llc
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2014-11-26
Also published as: CN104185474A; WO2013148248A1; IL234848A0; CN107266574A; RU2014143639A; EP2841082A4; BR112014024373A2; CN104185474B; US20180251570A1; AU2013240279A1; KR20150030639A; HK1204571A1; US20150064169A1; US9975962B2; JP2018064579A; JP6283017B2; TW201402605A; JP2015514085A; EP2841082A1; SG11201406129QA

Abstract

La presente divulgación proporciona anticuerpos regulados por proteasa que se unen específicamente al inhibidor de la ruta del factor de tejido (TFPI). Los anticuerpos son útiles para tratar trastornos hemorrágicos tales como hemofilia.

Description

ANTICUERPOS REGULADOS POR PROTEASA La presente solicitud reivindica el beneficio del documento n° de serie 61/617.837 presentado el 30 de marzo de 2012, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Todos los documentos citados en la presente divulgación se incorporan en el presente documento por referencia en sus totalidades.

CAMPO TÉCNICO El campo técnico es el tratamiento de hemofilia y otras coagulopatías.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIG. 1. Ilustración de una realización de un anticuerpo regulado por proteasa. VH, región variable de cadena pesada; VL, región variable decadena ligera; CH, región constante de cadena pesada; CL, región constante de cadena ligera.

FIG. 2. Transferencia Western de dos fragmentos Fab anti-TFPI regulados por proteasa ("Fab-1" y "Fab-2"), con y sin digestión con trombina.

FIG. 3. Gráfica que muestra la unión al inhibidor de la ruta del factor de tejido (TFPI) de Fab-1 y Fab-2, con y sin digestión con trombina, ensayada por ELISA.

FIG. 4. Gráfica que muestra la medición de BIACORE™ de la unión a TFPI de Fab-1 (Fab1) y Fab-2 (Fab2) con y sin digestión con trombina.

FIG. 5. SDS-PAGE de anticuerpo IgG purificado expresado en células HEK293 6E.

FIG. 6. Transferencia Western de IgG parental ("IgG parental;" arriba) e lgG2-conectorl (abajo). Carril 1 , digestión con trombina (1 unidad); carril 2, sin proteasa (control); carril 3, digestión con plasmina bovina; carril 4, digestión con enterocinasa (0,02 pg); carril 5, digestión con factor Xa bovino (1 pg); carril 6, digestión con mathptasa (MTSP) (0,5 pg); carril 7, digestión con urocinasa (uPA) (0,25 pg); carril 8, digestión con proteasa del rinovirus 3C humano (HRV 3C) (2 unidades).

FIG. 7. Gráfica que muestra la unión a TFPI de IgG con y sin digestión con trombina, ensayada por ELISA.

FIG. 8. Gráfica que muestra la medición de BIACORE™ de la unión a TFPI de IgG parental e lgG-conector1 , con y sin digestión con trombina.

FIG. 9. Transferencia Western que muestra la digestión con proteasa de IgG-conectorl y anticuerpo WT con proteasas humanas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente divulgación proporciona anticuerpos regulados por proteasa que se unen específicamente al inhibidor de la ruta del factor de tejido (TFPI). Los anticuerpos son útiles para tratar trastornos hemorrágicos tales como hemofilia. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa pueden ser escindidos por trombina y/o plasmina. Inhibiendo inicialmente TFPI, tales anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa promueven la generación de trombina y/o plasmina, que a su vez escinde los anticuerpos y elimina o reduce significativamente su actividad de unión a TFPI. Esta realimentación negativa permite que los anticuerpos promuevan la coagulación dentro de una ventana terapéutica segura. 1. Anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa Los anticuerpos regulados por proteasa desvelados en el presente documento se unen específicamente a TFPI; es decir, se unen a TFPI con una afinidad que es mayor (por ejemplo, al menos dos veces mayor) que su afinidad de unión por un antígeno ¡rrelevante (por ejemplo, BSA, caseína). El término "inhibidor de la ruta del factor de tejido" o "TFPI" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier variante, isoforma y especie homologa de TFPI humano que se expresa naturalmente por células.

En algunas realizaciones, los anticuerpos regulados por proteasa se unen a TFPI con una afinidad de al menos aproximadamente 105 M" a aproximadamente 1012 M'1 (por ejemplo, 105 M"1, 105'5 M"1, 106 M"1, 106'5 M"1, 107 M"\ 107·5 M"1, 108 M" , 108·5 M"1, 109 M"1, 109'5 M'1, 1010 M"1, 1010'5 M"1, 1011 M"1, 1011·5 M" , 1012 M"1). La afinidad (Kd) de la unión del anticuerpo a un antígeno puede ensayarse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica que incluye, por ejemplo, inmunoensayos tales como ensayo inmunoespecífico ligado a enzima (ELISA), análisis de interacción bimolecular (BIA) (por ejemplo, Sjolander & Urbaniczky; Anal. Chem. 63:2338-2345, 1991 ; Szabo y col., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705, 1995) y citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) para la cuantificación de la unión del anticuerpo a células que expresan un antígeno. BIA es una tecnología para analizar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIACORE™). Pueden usarse cambios en la resonancia de plasmones superficiales (SPR) de fenómeno óptico como indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa puede construirse usando una molécula de ¡nmunoglobulina de longitud sustancialmente completa (por ejemplo, lgG1 , lgG2a, lgG2b, lgG3, lgG4, IgM, IgD, IgE, IgA), un fragmento de unión a antígeno de la misma, tal como Fab o F(ab')2, o una construcción que contiene un sitio de unión a antígeno, tal como scFv, Fv o diacuerpo, que puede unirse específicamente a TFPI. El término "anticuerpo" también incluye otros andamiajes de proteína que pueden orientar insertos de región determinante de la complementariedad (CDR) de anticuerpos en la misma conformación de unión activa que la encontrada en anticuerpos naturales de forma que la unión a TFPI observada con estas proteínas quiméricas se mantenga con respecto a la actividad de unión a TFPI del anticuerpo natural del que se derivaron las CDR.

Un "anticuerpo aislado" como se usa en el presente documento es un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une a TFPI está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen a antígenos distintos de TFPI). Un anticuerpo aislado que se une a un epítopo, isoforma o variante de TFPI humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de TFPI). Un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

Los anticuerpos regulados por proteasa desvelados en el presente documento se manipulan para comprender un sitio de escisión por proteasa reconocido por una o más proteasas. Como se usa en el presente documento, "sitio de escisión por proteasa" se refiere a una secuencia de aminoácidos que es reconocida y escindida por una proteasa. En algunas realizaciones, el sitio de escisión por proteasa está situado entre sus regiones variables y constantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa incluyen uno o más sitios de escisión por proteasa que pueden escindirse por trombina, plasmina y/o factor Xa. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos entre las regiones variables y constantes de un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa comprende un conector de polipéptido, además del sitio de escisión por proteasa (como se ilustra, por ejemplo, en la FIG. 1). El conector puede ser un único aminoácido o una secuencia de polipéptidos (por ejemplo, hasta 100 aminoácidos). Por ejemplo, el conector puede ser GGGGS (SEC ID N°: 149). Otros conectores útiles incluyen aquellos mostrados en SEC ID N°: 151-176. En otras realizaciones no está presente el conector, y el propio sitio de escisión está insertado entre las regiones variables y constantes.

Se han determinado al menos dos sitios de escisión óptimos para trombina: (1) X-TX2-P-R-X3-X4 (SEC ID N°: 147), en la que X^ y X2 son aminoácidos hidrófobos y X3 y X4 son aminoácidos no ácidos; y (2) GRG. La trombina se escinde específicamente después del residuo de arginina. La plasmina también puede escindir por los dos sitios de escisión anteriormente mencionados, pero con menos especificidad en comparación con la trombina. Otros sitios de escisión por trombina útiles se proporcionan como SEC ID N°: 1-60. Otros sitios de escisión por plasmina útiles se proporcionan como SEC ID N°: 12, 47, 48, 53 y 61-130. En algunas realizaciones, el sitio de escisión es LVPRGS (SEC ID N°: 137).

En algunas realizaciones se usa un sitio de escisión por factor Xa, tal como I-(E o D)-G-R (SEC ID N°: 148). Otros sitios de escisión por factor Xa útiles se proporcionan como SEC ID N°: 29, 59 y 61-69. Otros sitios de escisión por trombina y FXa o secuencias pueden encontrarse en la publicación previa escrita por Bianchini [Bianchini EP y col., 2002 JBC]. Un anticuerpo regulado por proteasa puede comprender más de un sitio de escisión por proteasa.

Además del sitio de escisión, un segundo sitio de unión de proteasa, llamado exositio, puede introducirse en un anticuerpo para TFPI regulado por proteasa para hacer la escisión más eficaz. El exositio de trombina puede ser del exositio nativo de sustratos de proteasa o inhibidor, tal como PAR1 , fibrinógeno e hirudina. El exositio también puede ser un derivado del exositio nativo.

Los anticuerpos para TFPI regulados por proteasa pueden producirse sintéticamente o recombinantemente. Están disponibles varias tecnologías para producir anticuerpos. Por ejemplo, puede usarse tecnología de fago-anticuerpo para generar anticuerpos (Knappik y col., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000). Otro enfoque para obtener anticuerpos es cribar una biblioteca de ADN de linfocitos B como se describe en los documentos WO 91/17271 y WO 92/01047. En estos procedimientos se producen bibliotecas de fago en las que los miembros muestran diferentes anticuerpos sobre sus superficies externas. Los anticuerpos se expresan normalmente como fragmentos Fv o Fab. Los anticuerpos que se expresan en fago se seleccionan por enriquecimiento por afinidad para unirse a una proteína seleccionada. También pueden producirse anticuerpos usando metodología de triomas (por ejemplo, Oestberg y col., Hybrídoma 2:361-367, 1983; patente de EE.UU. 4.634.664; patente de EE.UU. 4.634.666).

También pueden purificarse anticuerpos de cualquier célula que exprese los anticuerpos, que incluyen células huésped que se han transfectado con construcciones de expresión que codifican anticuerpos. Las células huésped pueden cultivarse en condiciones por las cuales los anticuerpos se expresan. El anticuerpo purificado puede separarse de otros componentes celulares que pueden asociarse con el anticuerpo en la célula, tales como ciertas proteínas, hidratos de carbono o lípidos, usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión por tamaño, fraccionamiento con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y electroforesis preparativa en gel. La pureza de las preparaciones puede evaluarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Una preparación de anticuerpos purificados puede contener más de un tipo de anticuerpo.

Alternativamente, los anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa pueden producirse usando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tal como por síntesis directa de péptidos usando técnicas en fase sólida (por ejemplo, Merrifieid, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963; Roberge y col., Science 269:202-204, 1995). La síntesis de proteínas puede realizarse usando técnicas manuales o por automatización. Opcionalmente, pueden sintetizarse por separado fragmentos de anticuerpos y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.

También puede construirse un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa en un "formato de Fv monocatenario (scFv)" en el que un sitio de escisión por proteasa se inserta en o alrededor de un conector peptídico entre la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv. Como el conector peptídico es necesario para mantener juntas las dos regiones variables de un scFv para la unión a antígeno, la escisión del conector peptídico o región flanqueante permite inactivar una proteasa de interés o regular por disminución la unión de scFv a su antígeno. La secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 179 (que puede codificarse por SEC ID N°: 180) es un ejemplo de un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa en el formato scFv.

En algunas realizaciones, los anticuerpos para TFPI regulados por proteasa se construyen en "formato de IgG", que tienen dos sitios de unión, y pueden comprender uno, dos, tres o cuatro sitios de escisión por proteasa sobre la cadena pesada, cadena ligera, o ambas. En cada caso, un sitio de escisión por proteasa puede flanquearse en cualquiera o ambos lados por un conector. Además, en cada caso, los sitios de escisión pueden ser iguales o diferentes. "IgG-conectorl " (Ejemplo 5) e "lgG-conector2" son ejemplos de los anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa en formato de IgG: 2. Realimentación negativa Los anticuerpos regulados por proteasa pueden incluir un sitio de escisión por proteasa de una proteasa regulada por incremento o generada como resultado de la función del anticuerpo. Tal proteasa puede entonces escindir el anticuerpo regulado por proteasa proporcionando así un bucle de realimentación negativa que puede ser útil en prevenir el exceso de actividad del anticuerpo regulado por proteasa.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa que pueden escindirse por trombina y/o plasmina pueden presentar un efecto de realimentación negativa tal. Tales anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa promueven la generación de trombina y/o plasmina. La trombina y plasmina escindirán a su vez los anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa y eliminarán o reducirán significativamente su actividad de unión a TFPI. Esta realimentación negativa permite que los anticuerpos promuevan la coagulación dentro de una ventana terapéutica segura. 3. Polinucleótidos La presente divulgación también proporciona polinucleótidos que codifican anticuerpos regulados por proteasa. Estos polinucleótidos pueden usarse, por ejemplo, para producir cantidades de los anticuerpos para uso terapéutico.

Las moléculas de ADNc que codifican anticuerpo pueden prepararse con técnicas de biología molecular convencionales, usando ARNm como molde. A partir de aquí, las moléculas de ADNc pueden replicarse usando técnicas de biología molecular conocidas en la técnica y desveladas en manuales tales como Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) vol. 1-3). Puede usarse una técnica de amplificación, tal como PCR, para obtener copias adicionales de los polinucleótidos. Alternativamente, pueden usarse técnicas de química sintética para sintetizar polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa.

Para expresar un polinucleótido que codifica un anticuerpo, el polinucleótido puede insertarse en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden usarse procedimientos que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican anticuerpos y elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) y en Ausubel y col. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1995).

Puede utilizarse una variedad de sistemas de vector de expresión/huésped para contener y expresar secuencias que codifican anticuerpos. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, plásmido o cósmido; levadura transformada con vectores de expresión en levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV); o vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas de células de animales.

Los elementos de control o secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector— potenciadores, promotores, regiones no traducidas de 5' y 3'— que interaccionan con proteínas celulares huésped para llevar a cabo la transcripción y traducción. Tales elementos pueden variar en fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y huésped puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, que incluyen promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles. El promotor de poliedrina de baculovirus puede usarse en células de insecto. Promotores o potenciadores derivados de los genomas de células vegetales (por ejemplo, genes de proteínas de choque térmico, RUBISCO y de almacenamiento) o de virus de vegetales (por ejemplo, promotores virales o secuencias conductoras) pueden clonarse en el vector. En sistemas de células de mamífero pueden usarse promotores de los genes de mamífero o de los virus de mamífero. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, pueden usarse vectores basados en SV40 o VEB con un marcador de selección apropiado.

Textos generales que describen técnicas de biología molecular útiles adicionales, que incluyen la preparación de anticuerpos, son Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel y col. [Eds.], Current Protocols, una empresa conjunta entre Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (complementado a lo largo del 2000)); Harlow y col., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.]); Fundamental Immunology (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); y Harlow y col. (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). 4. Composiciones farmacéuticas Un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa puede proporcionarse en una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable es preferentemente no pirógeno. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa puede administrarse solo o en combinación con al menos otro agente, tal como compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril, que incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Puede emplearse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina al 0,4 %, glicina al 0,3 %, y similares. Estas disoluciones son estériles y generalmente están libres de materia en partículas. Estas disoluciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales muy conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, etc. La concentración de anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa en una composición farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5 %, normalmente en o al menos aproximadamente el 1 %, a tanto como el 15 o el 20 % en peso y se seleccionará principalmente basándose en volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado. Véase la patente de EE.UU. n° 5.851.525. Si se desea, puede incluirse más de un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa diferente en una composición farmacéutica.

Además de los principios activos, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente adecuados aceptables que comprenden excipientes y coadyuvantes que facilitan el procesamiento de las composiciones en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por muchísimas vías que incluyen, pero no se limitan a, medios orales, intravenosos, intramusculares, intra-arteriales, intramedulares, ¡ntratecales, intraventriculares, transdérmicos, subcutáneos, intrapehtoneales, intranasales, parenterales, tópicos, sublinguales o rectales.

Después de prepararse las composiciones farmacéuticas, pueden disponerse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afección indicada. Tal etiquetado incluiría cantidad, frecuencia y procedimiento de administración. 5. Procedimientos Las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los anticuerpos anti-TFPI regulados por proteasa pueden administrarse a un paciente solas, o en combinación con otros agentes, fármacos o factores de coagulación, para tratar hemofilia u otros trastornos de la coagulación. Una "dosis terapéuticamente eficaz" de anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa se refiere a la cantidad de anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa que promoverá la coagulación o reducirá el tiempo de hemorragia. La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está perfectamente dentro de la capacidad de los expertos en la materia.

Una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente tanto en ensayos de cultivo celular como en modelos animales, normalmente ratas, ratones, conejos, perros o cerdos. También puede usarse un modelo animal para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Tal información puede entonces usarse para determinar la dosis y vías útiles para la administración en seres humanos.

La eficacia terapéutica y toxicidad, por ejemplo, DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) de un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa puede determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales. La relación de dosis de efectos tóxicos con respecto a terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, DL50/DE50.

Se prefieren composiciones farmacéuticas que presenten grandes índices terapéuticos. Se usan datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación contenida en tales composiciones está preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada, sensibilidad del paciente y la vía de administración.

La dosificación exacta se determinará por el médico, en vista de factores relacionados con el paciente que requiere tratamiento. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del anticuerpo para TFPI regulado por proteasa o para mantener el efecto deseado. Factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, salud general del sujeto, edad, peso y sexo del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación(es) de fármacos, sensibilidades a reacciones y tolerancia/respuesta a terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y tasa de eliminación de la formulación particular.

En algunas realizaciones, dosificaciones in vivo terapéuticamente eficaces de un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa están en el intervalo de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg/kg, de peso corporal del paciente.

El modo de administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa puede ser cualquier vía adecuada que administre el anticuerpo al huésped (por ejemplo, administración subcutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal).

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa se administra sin otros agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa se administra en combinación con otros agentes, tales como fármacos o factores de coagulación, para potenciar la producción inicial de trombina al tiempo que que se asegura que el nivel de trombina permanece por debajo del intervalo que puede producir trombosis en algunas personas con coagulopatía. La administración del anticuerpo anti-TFPI regulado por proteasa puede ser antes, después o sustancialmente en el mismo momento que la administración de otros agentes.

Nada en esta memoria descriptiva debe considerarse como limitante del alcance de la presente divulgación. Todos los ejemplos presentados son representativos y no limitantes. Las realizaciones anteriormente descritas pueden modificarse o variarse, según sea apropiado, por los expertos en la materia a la luz de las enseñanzas anteriores. Por tanto, debe entenderse que, dentro del alcance de las reivindicaciones y sus equivalentes, las realizaciones desveladas en el presente documento pueden ponerse en práctica de otro modo distinto al específicamente descrito.

EJEMPLO 1 Construcción de fragmentos Fab anti-TFPI regulados por proteasa Dos Fab anti-TFPI regulados por proteasa, "Fab-1 " y "Fab-2", se basaron en las secuencias de anticuerpos anti-TFPI mostradas en SEC ID N°: 177 (cadena pesada) y SEC ID N°: 178 (cadena ligera). Ambos Fab tienen el sitio de escisión por la proteasa trombina/plasmina, LVPRGS (SEC ID N°: 137) insertado en el extremo C con respecto a ambos dominios variables. El sitio de escisión en Fab-1 está flanqueado por un conector (Gly)4Ser. Fab-2 contiene el sitio de escisión de seis aminoácidos solo, ningún conector está presente. La trombina y la plasmina escindirán el extremo C con respecto al residuo de Arg (R) de LVPRGS (SEC ID N°: 137). El ADN que codifica los Fab se sintetizó por GenScript con codones optimizados para la expresión bacteriana. Las secuencias de aminoácidos y de ADN para los Fab se identifican en la siguiente tabla.

Las regiones codificantes de Fab se digirieron con las enzimas de restricción Bsa\ y HincñU (New England Biolabs). Los fragmentos de ADN se purificaron usando un gel de agarosa y se subclonaron en pBADmycHisA (Invitrogen). El ADN clonado se ligó y se transformó usando técnicas convencionales. Los clones positivos se confirmaron por secuenciación de ADN y se usaron para la expresión en E. coli de BL21.

EJEMPLO 2 Transferencia Western de Fab escindidos por trombina Se digirieron aproximadamente 2,5 g de Fab-1 y Fab-2 purificados grosso modo con 0, 2 ó 10 unidades de trombina (Novagen) durante 1 h a 37 °C. Los digestos migraron sobre un gel CRITEREON™ TGX™ al 4-15 % (Bio-Rad). La proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se sondó con un anticuerpo anti-Fab humano (Southern Biotech).

La transferencia Western de la escisión de Fab-1 y Fab-2 se muestra en la FIG. 2. Todas las muestras se redujeron. Se observaron bandas a aproximadamente 12 kDa para ambos Fab cuando se trataron con trombina. Estas bandas no estuvieron presentes en las muestras sin digestión con trombina, lo que indica que la proteína de pequeño tamaño era el producto de la escisión por trombina.

EJEMPLO 3 ELISA de TFPI de Fab-1 y Fab-2 digeridos con trombina Se digirieron aproximadamente 2,5 pg de Fab-1 y Fab-2 parcialmente purificados con 2 unidades de trombina biotinilada (Novagen) a 23 °C durante la noche. Se añadieron perlas de estreptavidina-Sepharose (100 pl) a la digestión para agotar la trombina. Las muestras de Fab digeridas se aplicaron a una columna que captura el complejo de perlas de Sepharose/trombína. El eluido contenía los Fab digeridos.

Se recubrió una placa de 96 pocilios MAXISORP® (Nunc) con 1 pg/ml de TFPI en PBS durante la noche a 4 °C. La placa se bloqueó durante 1 h a temperatura ambiente (TA) en 5 % de leche desnatada en polvo-PBS/0,5 % de Tween-20® (PBS-T). Se añadieron diluciones dobles sucesivas de Fab-1 y Fab-2 no digeridos y digeridos a los pocilios (100 µ?/pocillo) y se incubaron durante 1 h a TA. Las placas se lavaron cinco veces con PBS-T. Se añadió un anticuerpo secundario anti-Fab conjugado con HRP (100 µ? de una dilución 1 :10.000) para la detección con una disolución AMPLEX® Red (Invitrogen). Como se muestra en la FIG. 3, la digestión con trombina redujo significativamente la señal de unión a TFPI.

EJEMPLO 4 Mediciones de Bl ACORE™ de Fab-1 y Fab-2 digeridos con trombina Se digirieron aproximadamente 2,5 pg de Fab-1 y Fab-2 purificados grosso modo con 2 unidades de trombina biotinilada (Novagen) a 23 °C durante la noche. Se añadieron perlas de estreptavidina-Sepharose (100 µ?) a la digestión para agotar la trombina. Las muestras de Fab digeridas se aplicaron a una columna que captura el complejo de perlas de Sepharose/trombina. El eluido contenía los Fab digeridos.

Para el análisis de BIACORE™, se inmovilizó TFPI humano (American Diagnostics) usando acoplamiento de amina al nivel objetivo de 100 unidades relativas (UR), y los anticuerpos se inyectaron en la fase móvil. Se usó HBS-p como tampón de desarrollo. Se preparó un canal de referencia usando inmovilización del blanco en el que la superficie se activó y luego se inactivo sin ninguna proteína inmovilizada. Se realizó una ejecución manual para medir las elevadas UR de los Fab y un control de tampón.

Como se muestra en la FIG. 4, el Fab parental sin conector escindible generó 24,6 UR, comparable a Fab-1 (25,6 UR) y Fab2 (27,9 UR) no digeridos. Después de la escisión por trombina, la señal de unión de Fab-1 y Fab-2 se redujo más del 50%, lo que indica que Fab-1 y Fab-2 escindidos no solo perdieron el dominio constante, sino que también perdieron actividad de unión a TFPI.

EJEMPLO 5 Expresión y purificación de IgG Se construyó una molécula de inmunoglobulina anti-TFPI regulada por proteasa, "lgG-conector1 ," basándose en las secuencias de anticuerpos anti-TFPI parentales mostradas en SEC ID N°: 177 (cadena pesada) y SEC ID N°: 178 (cadena ligera). Para facilitar la clonación molecular, se introdujo un sitio Blp\ en la secuencia codificante de la cadena pesada. En comparación con la posición del conector escindible por proteasa en Fab-1 , la introducción del sitio Blpl desplaza la posición del conector de lgG-conector1 dos aminoácidos a la región constante.

Se transfectaron células HEK293 6E con vectores de expresión de IgG construidos, y se recogió el sobrenadante de cultivo que contenía los anticuerpos IgG. Los anticuerpos se purificaron usando una columna de afinidad MABSELECT SURE™ seguido de cromatografía SUPERDEX™ 200. El lgG-conector1 purificado sobre SDS-PAGE se muestra en la FIG. 5.

EJEMPLO 6 Transferencia Western de IgG parental e lgG-conector1 Se digirieron IgG parental purificada e lgG-conector1 (0,5 pg) con trombina, plasmina bovina, factor Xa bovino, matriptasa (MTSP), urocinasa (uPA) o proteasa del rinovirus 3C humano (HRV 3C). Los anticuerpos se incubaron con las proteasas durante 1 h a 37 °C. Los digestos migraron sobre un gel CRITEREON™ TGX™ al 4-20 % (Bio-Rad). La proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se sondó con un anticuerpo de cadena pesada y ligera anti-lgG humana (Pierce). Las transferencias Western de lgG2 y lgG2-conector1 se muestran en la FIG. 6. Todas las muestras se redujeron.

IgG intacta produjo dos bandas bajo condiciones reductoras. Las dos bandas se corresponden con la cadena pesada (50 kD) y la cadena ligera (25 kD). El anticuerpo lgG-conector1 digerido mostró un desplazamiento en el peso molecular frente al anticuerpo no digerido. Se usaron las siguientes proteasas para digerir los anticuerpos: trombina, plasmina, factor Xa bovino, MTSP y uPA. El anticuerpo IgG-conectorl digerido mostró un desplazamiento en el peso molecular de la cadena pesada de 50 kD a 37 kD. Este desplazamiento de tamaño se correlaciona con la pérdida del dominio VH de la cadena pesada. También hubo un desplazamiento de peso molecular de la cadena ligera de 25 kD a una banda apenas visible de aproximadamente 16 kDa, que indica escisión del dominio VL de la cadena ligera. Las proteasas no escindieron IgG parental, lo que indica que la pérdida de peso molecular fue un resultado de la digestión con proteasa debido al sitio de escisión manipulado en el anticuerpo.

EJEMPLO 7 ELISA de unión a TFPI de IgG parental e lgG-conector1 digeridos con trombina Se digirieron un microgramo de anticuerpos de longitud completa, IgG parental e lgG-conector1 con 1 unidad de trombina biotinilada (Novagen) durante 1 h a 37 °C. Entonces se añadieron 50 µ? de estreptavidina-perlas de Sepharose a la digestión para agotar la trombina. Las muestras de IgG digeridas se aplicaron a una columna que captura el complejo de perlas de Sepharose/trombina. El eluido contiene las IgG digeridas.

Se recubrió una placa de 96 pocilios MAXISORP® (Nunc) con 1 pg/ml de TFPI en PBS durante la noche a 4 °C. La placa se bloqueó durante 1 h a temperatura ambiente (TA) en leche desnatada en polvo al 5 %-PBS/ Tween® 20 al 0,5 % (PBS-T). Se añadieron diluciones dobles sucesivas de IgG parental e lgG-conector1 no digeridos y digeridos a los pocilios (100 µ?/pocillo) y se incubaron durante 1 h a TA. La placa se lavó cinco veces en PBS-T. Se añadió un anticuerpo secundario anti-Fab conjugado con HRP (100 µ? de una dilución 1 :10.000) para la detección con una disolución AMPLEX® Red (Invitrogen).

Los resultados del ELISA de unión a TFPI se muestran en la FIG. 7. Se muestra la pérdida de unión a TFPI por lgG-conector-1 digerido con trombina. La unión a TFPI de lgG-conector1 no digerido fue similar a la unión a TFPI del IgG parental no digerido y digerido con trombina.

EJEMPLO 8 Análisis Bl ACORE™ de IgG parental e lgG-conector1 Se inmovilizó un chip sensor C 4 con una baja densidad de TFPI humano usando un kit de acoplamiento de amina (GE HealthCare). Se realizaron ensayos cinéticos de IgG parental e lgG-conector1 usando diferente concentración de los anticuerpos, seguido de regeneración con tampón de glicina a pH 1 ,5. Los anticuerpos IgG parental e lgG-conector1 a una concentración de 1 [ig se digirieron con 1 unidad de trombina biotinilada (Novagen) durante 1 h a 37 °C. Los anticuerpos con o sin digestión se inyectaron a un sistema BIACORE™ para el análisis de unión a TFPI. La siguiente figura muestra la señal generada a partir de la inyección de 45 µ? de 6,25 pg/ml de anticuerpos o muestras de control.

En el ensayo cinético, IgG parental e lgG2-conector1 tienen velocidades de asociación (ka) de 1 ,536x106 / s y 1 ,902 x 106/Ms, respectivamente. Los dos anticuerpos no tuvieron disociación medible en 30 minutos. Esto indica que la inserción del conecto no cambió significativamente la actividad de unión del anticuerpo.

El efecto de la escisión por trombina sobre los anticuerpos se muestra en la FIG. 8. La digestión con trombina disminuyó ligeramente la unión de IgG parental sobre TFPI, mientras que la digestión con trombina redujo la unión de lgG2-conectorl sobre TFPI de 20 UR a 5 UR, una disminución del 75%.

EJEMPLO 9 Transferencia Western de lgG-conector1 e IgG parental tratados con proteasa/factor de coagulación Se usaron las siguientes proteasas humanas/factores de coagulación para digerir 80 nM de IgG-conector 1 y el anticuerpo WT: trombina (0,1 µ?), plasmina (0,1 µ?), factor Vlla (0,01 µ?), factor IXa (0,089 µ?), factor Xa (13 µ?), factor Xla (0,031 µ?), factor Xllla (0,03 µ?). El material tratado migró sobre un gel CRITEREON™ TGX al 4-15 % (Bio-Rad). Se transfirieron proteínas a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con un anticuerpo anti-lgG humana (Pierce).

La trombina, la plasmina y el factor Xa humanos digirieron lgG-conector1 , digiriendo la trombina más eficazmente (FIG. 9) como se muestra por la aparición de una banda de 37 kDa. Las proteasas no escindieron la IgG parental, lo que indica que la pérdida de peso molecular fue un resultado de la digestión con proteasa debido al sitio de escisión manipulado en el anticuerpo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo regulado por proteasa que se une específicamente al inhibidor de la ruta del factor de tejido (TFPI), caracterizado porque comprende un dominio variable, un dominio constante y una secuencia de aminoácidos que une el dominio variable con el dominio constante, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un sitio de escisión por proteasa.

2. El anticuerpo regulado por proteasa de la reivindicación 1, caracterizado porque el sitio de escisión por proteasa es un sitio de escisión por trombina.

3. El anticuerpo regulado por proteasa de la reivindicación 1, caracterizado porque el sitio de escisión por proteasa es un sitio de escisión por plasmina.

4. El anticuerpo regulado por proteasa de la reivindicación 1, caracterizado porque el sitio de escisión por proteasa es un sitio de escisión por factor Xa.

5. El anticuerpo regulado por proteasa de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N°: 131 , aminoácidos 1-239 de SEC ID N°: 133, SEC ID N°: 135, aminoácidos 1-229 de SEC ID N°: 136, SEC ID N°: 139, SEC ID N°: 140, SEC ID N°: 143 y SEC ID N°: 144.

6. El anticuerpo regulado por proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos comprende además un conector de aminoácidos.

7. El anticuerpo regulado por proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 caracterizado porque un anticuerpo de longitud completa.

8. El anticuerpo regulado por proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.

9. Una composición farmacéutica caractarizada porque comprende el anticuerpo regulado por proteasa tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque codifica el anticuerpo regulado por proteasa tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

11. Un procedimiento de tratamiento de una coagulopatía, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo regulado por proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

12. El procedimiento de la reivindicación 11 , en el que la coagulopatía es hemofilia.

13. Un procedimiento de modulación de la actividad procoagulante de un anticuerpo anti-TFPI, caracterizado porque comprende añadir un sitio de escisión por proteasa en el anticuerpo anti-TFPI.

14. El procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque el sitio de escisión por proteasa es un sitio de escisión por trombina.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, caracterizado porque el sitio de escisión por proteasa es un sitio de escisión por plasmina.

16. El procedimiento de la reivindicación 13, caracterizado porque el sitio de escisión por proteasa es un sitio de escisión por factor Xa.

17. Un procedimiento de promoción de la generación de trombina o plasmina, caracterizado porque comprende poner en contacto TFPI con un anticuerpo regulado por proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.