MX2011001173A - Proceso para la coproduccion de quintina, sus derivados y polimeros que contienen glucosa, manosa y/o galactosa, por medio de la fermentacion de la levadura pichia pastoris. - Google Patents

Abstract

La invención es concerniente a un proceso para la coproducción de polímeros de glucosamina (quitina, quitosan o cualquiera de sus derivados) y los polímeros que contienen glucosa, manosa y/o galactosa por la alta fermentación de densidad de células de la levadura Pichia pastoris en un biorreactor bajo condiciones aerobias, preferentemente usando el subproducto de la industria del biodiesel glicerol como fuente de carbono. También pueden ser empleados glicerol puro, metanol puro, mezclas ricas en glicerol o ricas en metanol como fuentes de carbono. La presente invención también concierne al proceso de fermentación de P. pastoris debidamente optimizado para alcanzar las altas densidades celulares y alto contenido de quitina de la pared celular así como los polímeros que contienen glucosa, manosa y/o galactosa.

Description

PROCESO PARA LA COPRODUCCION DE QUITINA, SUS DERIVADOS Y POLÍMEROS QUE CONTIENEN GLUCOSA, MAÑOSA Y/O GALACTOSA, POR MEDIO DE LA FERMENTACIÓN DE LA LEVADURA PICHIA PASTORIS CAMPO DE LA INVENCIÓN I La presente invención se relaciona con un proceso I para la producción microbiana, en gran cantidad, de quitina y polímeros que contienen glucosa, mañosa y/o galactosa, y sus derivados, usando materias primas de bajo costo. Por lo tanto[ se describe un proceso de producción basado en el cultij/o en biorreactor de alta densidad celular de la levadura P. pastoris, usando el subproducto glicerol a partir de la producción de biodiesel como la fuente de carbono preferencial .

Los biopolímeros referidos son ampliamente utilizados en la industria agroalimenticia, cosmética, biomédica, textiles, tratamiento de aguas residuales, entre otrasj aplicaciones médicas y procesos industriales.

I ANTECEDENTES DE LA INVENCION ? Los polímeros son moléculas de alto peso molecular, formados a través de la polimerización de una o más unidades estructurales, llamados monómeros . Los polímeros formados por monosacáridos (monómeros de carbohidratos) son referidos como polisLcáridos . Las moléculas más pequeñas (oligosacáridos) puedeiji derivatizarse a partir de estos últimos por hidrólisis parcial enfática o quisca.

^ La quitina es un polisacárido lineal compuesto por residuos de D-glucosamina (GlcN) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) enlazados a través de enlaces ß(1,4) (véase esquemática, donde (1) y (2) representan GlcN y GlcNAc, respectivamente) . Las moléculas de quitina forman puentes de hidrógeno intermoleculares que resultan en tres formas cristalinas diferentes, dependiendo del su arreglo, a-quitina, la cual es la forma más común y estable, se caracteriza por un arreglo antiparalelo de las cadenas, mient as que la ß-quitina se forma por capas paralelas. La forma, más rara, ?-quitina, se caracteriza por una cadena antiparalela y dos cadenas paralelas.

(Chern. i l Los puentes de hidrógeno son responsables baja ¡solubilidad de la quitina tanto en agua como en la i mayoría de disolventes orgánicos. Las soluciones alcalinas o acidas ocasionan la hidrólisis del polímero y la deacetilación y por lo tanto no son adecuadas para su I solubilización . Los puentes de hidrógeno también son responsables de la ausencia aparente de temperatura de fusión, así como de la alta rigidez del polímero y la baja j permeabilidad de los materiales quitinosos.

Las propiedades fisicoquímicas de la quitina también están íntimamente relacionadas con la porción de los dos mbnómeros estructurales. Cuando la fracción molar de GlcN en el polímero (referido como el grado de deacetilación, % DD) es mayo a 50%, el polímero es llamado quitosan, principal derivado de la quitina. Debido a su muy bajo contenido de radicales acetilo, el quitosan es soluble en ácidos débiles, i tiene! un carácter de polielectrolito y una reactividad muy elevada. El quitosan es obtenido normalmente por deacejtilación de la quitina.

Debido a estas características, el quitosan tiene actualmente más aplicaciones que la quitina.

Su alta capacidad de enlace especifica se usa para extrajer aceites, metales pesados, proteínas y materia en partí'culas finas de las aguas residuales (Hennen, 1996) . La j mismaj propiedad permite su uso en cromatografía de afinidad (Synovliecki y colaboradores, 2003) y para la reducción de la absorción del colesterol. El quitosan pasa a través del tracto digestivo humano y al enlazarse al colesterol de baja densidad restringe su absorción en el torrente sanguíneo i (ICNHP, 1995, Hennen, 1996).

En la industria alimenticia, el quitosan es i utilizado principalmente para recubrir fruta y huevos (Hennen, 1996); Kim y colaboradores, 2007), actúa como una barrera para el dióxido de carbono y los microorganismos patógenos, así incrementa la vida media de los productos alimenticios, también es utilizado como emulsificante y como un agente conservador y clarificador para bebidas (Kim, 2004; Synowlecki y colaboradores, 2003). El quitosan es utilizado también en cosméticos, principalmente en productos para el I cabello, debido a su alta estabilidad y bajo carácter electrostático (Kim, 2004).

Las aplicaciones biomédicas del quitosan se ha i vueltp cada vez más relevante debido a la biocompatibilidad y biode'gradación de sus derivados que permite, para su uso en i la curación de heridas (Hamliying y colaboradores, 2004; Tanab y colaboradores, 2006; Singh y colaboradores, 2000) , I soportes para tejidos (Tangsadthakun y colaboradores, 2007), sistemas de distribución de fármacos (Singh y colaboradores, 2000)', entre otros.

I , Las aplicaciones biomédicas de la quitina incluyen su us'o como material para sutura (Hamliyn y colaboradores, 2004); Okada y colaboradores, 1999; Hallman y colaboradores, 1999). También se usa para la manufactura de textiles que permiten la transpiración, tal como calcetines (ICNHP. 1995) .

En contraste con los polímeros sintéticos, la quitina y el quitosan son biodegradables , lo que hace su uso i un beneficio para el ambiente.

Además, el quitosan, los derivados de quitina incluyen los polisacáridos , en los cuales el grupo C6-hidrokilo en de GlcNAc esta sustituido por otros radicales, i tales como, por ejemplo, grupos alquilo o carboxilo. La inserción de estos nuevos radicales incrementa las funcipnalidades de los polímeros, así se hace posible desarrollar nuevas aplicaciones, tales como nuevas fibras, geles!, etc.

Junto a la celulosa, la quitina es el segundo j biopojlímero más abundante en la naturaleza. Se encontró principalmente en la cutícula y exoesqueleto de los organ|ismos de Phylum Arthropoda y Crustácea y en la pared celular de levaduras y hongos. En esos organismos, la quitina da a las células rigidez y resistencia mecánica, y juega un papelj importante durante la meiosis (Keller y colaboradores, 1970;) Momany y colaboradores, 1997). La presencia de quitina o cualquiera de sus derivados aún no han sido identificados I en bacterias ni en hongos mixomicetos . La quitina extraída de I crustáceos y artrópodos es más rígida y tiene un grado más alto de deacetilación que la quitina microbiana.

La mayoría de los derivados de la quitina y la quitina disponibles comercialmente se obtienen de los i caparázones de crustáceos tales como cangrejos, camarones y I langostas. El proceso de extracción usualmente incluye tres pasos: desmineralización, extracción de lípidos y proteínas, y blanqueado. El primer paso se realiza al mezclar los caparazones con ácido (usualmente, HC1), mientras se lleva a cabo ¡la extracción de los lípidos y proteínas en un medio alcalino (NaOH o KOH) en presencia de etanol .

La extracción de pigmentos (especialmente caroténoides ) se logra al lavar con disolventes orgánicos, tales, como acetona, cloroformo o mezclas de etanol con éteres . i No obstante, el carácter de temporal de esta materia prima y la variabilidad de la composición de los caparazones como una función de las especies y la edad del animal, hace este proceso bastante caro y con baja I reproducibilidad . La rigidez de los exoesqueletos de las especlies tales como langostas y cangrejos también dificulta j la extracción y lo hace más caro. Sin embargo, ya que la quitina extraída de los caparazones de los crustáceos es de fuente animal, su uso para aplicaciones biomédicas y farmacéuticas es altamente restringido por las regulaciones de la Administración de Fármacos y Alimentos (FDA) . También la presencia de proteínas y contaminantes absorbidos por el i animal también dificulta la purificación de la quitina.

Debido a la posibilidad de reacciones alergénicas, los polímeros extraídos de crustáceos son menos adecuados para aplicaciones biomédicas.

Mientras la quitina en los artrópodos y crustáceos se agrega a proteínas y minerales de los caparazones (principalmente sales de calcio) , en los microorganismos está asociada a otros polisacáridos de la pared celular. Sus terminaciones de cadena se enlazan a los extremos no reductivos de ß- ( 1 , 3 ) -glucanos (polímeros de glucosa), los cuales son enlazados a ß- ( 1 , 6 ) -glucanos , galactomanos (polímeros formados por residuos de galactosa y mañosa) y glicoproteínas . La composición de la pared celular es I dependiente de la cepa y también es variable durante la fase de crecimiento de los organismos. Al cambiar las condiciones de fermentación, tal como composición y concentración del medio| (por ejemplo, disponibilidad de sustrato), temperatura o concentración de oxígeno disuelto (Aguilar-Uscanga y I colaboradores, 2003), puede resultar en la variación de la proporción relativa de cada uno de los componentes de la pared j celular .

La producción microbiana de quitina permite para el uso de materias primas económicas, con disponibilidad quasi sin restricción y para la optimización continua del proceso. La ajdaptación de la pared celular a las condiciones ambientales puede ser usada con ventaja para optimizar el proceso. De hecho, ya ha sido demostrado que la producción de quitina por fermentación puede ser mejorada por la complementación del medio con iones y precursores específicos para : la síntesis enzimática de quitina (Camargo y colaboradores, 1967; Keller y colaboradores, 1970). Tanto la composición y las propiedades de los polímeros también son más estables que aquellos obtenidos por el método de i extracción tradicional a partir de crustáceos.

Actualmente, no existe un protocolo para la producción de quitina utilizando microorganismos, excepto cuandjo se emplean organismos manipulados genéticamente (Hammer y colaboradores, 2006) . La mayoría de quitina microbiana comercialmente disponible se extrae a partir de Sacch'aromyces carlsbergensis , proveniente de la industria cervejcera, o a partir de Aspergillus niger proveniente de la producción de ácido cítrico (Versall y colaboradores, 2003) . En lá última, la quitina puede sumar por hasta 42% de la i pared; celular de los microorganismos. Sin embargo, los cultivos de Aspergillus niger sumergidos no alcanzan las j densidades celulares tan altas como aquellos enriquecidos por algunas levaduras. Por otro lado, la producción de quitina por especies Saccharomyces no sobrepasa el 8% del peso seco i de las células. También pueden emplearse los desechos del cultivo de algunos hongos comestibles, tales como Agaricus i bis-porusand A.campestris (GB2259709), pero el contenido de quitina no mayor al 8% del peso seco de los organismos.

Pichia pastoris es una levadura Hemiascomicetes/Saccharomycetes , comúnmente utilizada para la expresión de proteínas heterólogas. Esta especie su principal ventaja sobre otros microorganismos usados para la producción de quitina es el hecho de que consigue altas densidades celulares durante su fermentación sobre una amplia variedad de sustratos. Incluyendo glucosa, metanol o glicerol sin purificar, mientras acumulan un alto porcentaje de quitina en i su pared celular. Además, el glicerol es un subproducto de bajo 1 costo proveniente de la industria del biodiesel, i disponible en grandes cantidades y reportado como eficiente para usarse para el crecimiento de P. pastoris (Celik y colab¡oradores, 2008). Así, el uso del subproducto glicerol proveniente de la industria del biodiesel para la producción de quitina y quitosan por P. pastoris puede ser un proceso para |su valoración. Además, los costos de operación son reducidos, ya que no es necesario el uso de concentraciones de oxájgeno disuelto altas para que crezca el cultivo.

En el presente, no existen reportes disponibles del uso dé Pichia pastoris para la producción de los biopolimeros que son el objeto de la presente invención.

I SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención describe el uso de la levadura Pichia pastoris como el organismo productor de polisacáridos de la pared celular, tales como quitina, polímeros que contienen glucosa, mañosa y/o galactosa o sus I productos de derivatización, usando sustratos de bajo costo tales' como el subproducto glicerol de la industria del i biodiesel . i 1 Los organismos usados con este propósito puede ser ! cepasj de Pichia pastoris de referencia, sus variantes o i mutantes o cepas modificadas genéticamente, ya sea cepas que utilizan metanol (MUT) o constitutivas, para la expresión de protejínas heterólogas, como por ejemplo para la expresión de enzimás usadas en el proceso corriente abajo.

' La productividad de estos polisacáridos está I infidamente relacionada con el crecimiento celular microbiano. Así, el proceso ha sido optimizado para obtener altasj velocidades de crecimiento celular y altas densidades celulares con el objetivo de hacer la producción de quitina o quitosan por P. pastoris económicamente viable.

I i En vista de esto, la presente invención describe un ? proceso para la producción de polisacáridos de la pared celular que contiene glucosamina, glucosa, galactosa y/o í ma osa, por la fermentación aerobia de Pichia pastoris, i usando una fuente de carbono preferencial el subproducto de la industria del biodiesel glicerol. Las fuentes de carbono alternativas incluyen glicerol, metanol y glucosa puros o mezclas de los mismos.

El uso del subproducto de bajo costo glicerol como la principal fuente de carbono es una ventaja importante, debido a que permite la reducción de los costos de producción en comparación con otros sustratos de alta pureza y más costoso. La productividad volumétrica del proceso puede ser maximizada al adoptar un proceso de fermentación operado en i modo I continuo y preferentemente operado bajo presión para i incrementar la capacidad de transferencia de oxigeno, de ese i modo hacer posible más alta la densidad celular. 1 Durante las fermentaciones con P. pastoris, la concentración de oxigeno disuelto se mantiene aproximadamente 5% d la concentración de saturación. Este parámetro es controlado por la adición de la fuente de carbono, lo que puede' realizarse de manera continua o semicontinua . De esta manera', se logran las altas densidades celulares, se evitan í condiciones anaerobias y se logra la máxima actividad metabolica .

' La extracción de polisacáridos , producidos durante I la férmentación, puede realizarse por cualquier método i descrito en la literatura para la extracción de polímeros a partir de la pared celular de hongos o levaduras (por ejemplo, Synowiecki y colaboradores, 2003) . El proceso químico utilizado en la presente invención, además de generar una mezcla de polisacáridos rica en quitina, resulta en la producción de diferentes fracciones de otros polisacáridos i que contienen glucosa, mañosa y/o galactosa, lo que pueden tenerj varias aplicaciones biomédicas y agroaliment icias . 1 Las operaciones de extracción química tienen algunos riesgos de degradación del polímero.

Alternativamente, pueden ser adoptados los procedimientos de extracción enzimática usando proteasa y lisozimas, para degradar el material proteico y el glucano de la pared i celular, respectivamente. Aunque son métodos menos contaminantes, tienen la desventaja de ser relativamente más costo'sos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS j Figura 1 - Perfil del peso seco de las células de Pichija pastoris durante su fermentación utilizando glicerol I i puro (i 99 % ) o subproducto de glicerol (86%) proveniente de la i industria del biodiesel, como fuentes de carbono.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Producción del polímero 1.1. Microorganismos - La presente invención es concerniente a la producción de quitina y polímeros que contienen glucosa, mañosa y/o galactosa así como sus derivados, por la fermentación de cepas de referencia Pichia pastoris, sus variantes y mutantes. 1.2. Medio de fermentación - La fermentación de Pichia pastoris se realiza en un medio acuoso, que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas .

La fuente de carbono es preferiblemente una mezcla rica ¡en glicerol generada por la industria del biodiesel.

También pueden emplearse, glicerol, metanol, glucosa puros o mezclas de los mismos. De manera alternativa, P. pastoris es capaZj de crecer sobre otros diversos compuestos, incluyendo alcoholes, azucares, ácidos orgánicos, ácidos grasos o aminoácidos, en sus formas oligoméricas , diméricas o monomericas .

' Todos estos sustratos pueden ser compuestos puros o, preferiblemente, originados a partir de residuos o subproductos agroindustriales, tales como la industria del I biodiesel. La fuente de nitrógeno es, preferentemente, amoniaco, aunque pueden emplearse sales de amonio o compuestos nitrogenados orgánicos (por ejemplo, extracto de levadura, urea o peptona) .

: El medio de fermentación también incluye sales que contienen iones (por ejemplo, Ca2+, K+, Mg2+, S042~, P043") y i trazas de metales, tal como cobalto, cobre, manganeso y hierrp . i Los medios descritos son meramente ilustrativos de la amplia diversidad de sustratos que pueden ser empleados I para el crecimiento de P. pastoris y no deben ser considerados restrictivos. 1.3. Condiciones de fermentación Las presente invención concierne a cualquier procedimiento o protocolo para la producción de polisacáridos de la pared celular, como quitina, polímeros que contienen glucojsa, mañosa y/o galactosa o sus productos de derivatización, usando la fermentación con Pichia pastoris.

Más específicamente, la presente invención describe algunas metodologías que favorecen el crecimiento de P. pastoris para logra'r altas densidades celulares y alto contenido de quitilna/glucano en la pared celular de los microorganismos.

La fermentación se lleva a cabo en un medio acuoso, bajo i aireación con aire comprimido. La temperatura es controlada entre 10 y 60°C, preferentemente entre 20 y 40°C y el PH! es controlado entre 1.0 y 10.0, preferiblemente entre 3.0 y 8.0, por la adición automática de una base (por ejemplo, NaOH, KOH o NH3) . Cuando se utiliza hidróxido de amonio o amoniaco, estas también sirven como fuentes de nitrógeno. La concentración de oxigeno disuelto en el caldo de fermentación gradualmente disminuye concomitante con el crecimiento celular. Este descenso se determina por la velocidad de crecimiento especifica de la cepa. La limitación de oxigeno se evita a través de la manipulación de la velocidad de agitación, la velocidad del flujo de aire, presión, temperatura y/o velocidad de alimentación de la fuente de carbono limitante, de acuerdo con la capacidad y limitaciones del biorreactor. i Para lograr las altas densidades celulares, el modo de operación puede ser continuo o por lote de alimentación y pueden tener una fase de lote inicial.

Cuando el proceso se inicia en el modo de lote, la alimentación del caldo de fermentación se inicia cuando la fuente de carbono alcanza las concentraciones limitantes de crecimiento, manteniéndose, asi, preferiblemente con una I velocjidad de alimentación exponencial hasta que la concentración de oxigeno disuelto alcanza un valor umbral critibo, previamente definido con base en las propiedades del reactor. La solución de alimentación está compuesta por la fuente de carbono y una solución salina al 2% (v/v) . Si el pH es controlado con una base diferente a amoniaco, la solución de aljimentación debe incluir la fuente de nitrógeno en la misma i relación carbono/nitrógeno presente en el medio de cultivo inicial (aproximadamente 3:1).

^ La producción de polisacáridos es asociada con el i crecimiento. Asi, la fermentación de alimentación por lotes se termina cuando el cultivo entra en la fase de crecimiento estacionaria. Si el proceso es operado en modo continuo, la velocidad de dilución se mantiene cercana al valor de umbral de lavado siempre y cuando la concentración de oxigeno disuelto no caiga a 0%. i ( La producción de quitina y quitosan puede variar entre! 10 y 40 g/L y hasta 10 g/L, respectivamente. Estos valores varían de acuerdo con la densidad celular obtenida, i que usualmente es mayor a 150 g/L. El contenido de quitina/quitosan en la biomasa puede ser incrementado al alarg r la fermentación bajo condiciones que favorezcan su producción no acoplada al crecimiento celular. Tales condiciones incluyen incrementar la temperatura (hasta 30°C), el pH (entre 5 y 8) o la fuerza iónica durante la fase estacjionaria de crecimiento. El proceso de la presente invención, asociado a la producción de quitina/quitosan, también prevé la coproducción de polisacáridos de pared celular que contengan glucosa, mañosa y/o galactosa, lo que puede representar hasta 45% del peso seco de las células. 2. Extracción y purificación de los productos de fermentación Los protocolos que pueden ser utilizados para i extraer y purificar los polisacáridos descritos en la presente invención son los siguientes: Las células son separadas del caldo de fermentación por filtración, decantación o centrifugación, este último es el método más eficiente.

, Las células separadas preferiblemente por centrifugación son sometidas al tratamiento con una solución alcalina (pH arriba de 10.0) con el objetivo de remover lípidós, proteínas y ácidos nucleicos. Las proteínas y ácidos nucleicos son degradados al hacerlos reaccionar con altas concentraciones de una base fuerte (NaOH o KOH) , mientras que I los lípidos son removidos por la reacción con disolventes j orgánicos (por ejemplo, etanol, metanol, acetona) o detergentes. Esos procedimientos toman entre 30 minutos y 3 horasi, dependiendo de la temperatura (65-90°C) y pueden realizarse de manera consecutiva o simultáneamente, lo que i hace el proceso menos costoso e incrementa el rendimiento.

El material insoluble obtenido de ese modo está compuesto principalmente por material inorgánico, quitina y sus derivados y otros polisacáridos insolubles, tales como glucanos y mananos . Los polisacáridos solubles, principalmente, ß-glucanos altamente ramificados y OÍ-1,3- glucanos y galactomananos (polímeros compuestos de residuos de mañosa y galactosa) permanecen en el sobrenadante.

! Después de la centrifugación y lavado con agua y I etanol (u otros disolventes orgánicos, como metanol, dietil éter . o acetona) , la quitina es separada de otros polisacáridos insolubles. Para este propósito, se realiza una I hidrólisis parcial con ácido acético (u otro ácido débil), a una temperatura arriba de 75°C o con HCl diluido (u otro ácido! inorgánico), a una temperatura de 50°C. Este i procedimiento tiene en cuenta la solubilización de algunos ß- i 1 , 6-glucanos ramificados que no fueron extraídos previamente. La mayoría de los glucanos son recuperados por extracción I alcalina, seguido por centrifugación para recuperar la fracción insoluble donde está incluida la quitina.

El material insoluble está suspendido en una base fuerte caliente (NaOH) para disolver los glucanos solubles en álcalis. La temperatura debe ser arriba de 20 °C pero por debaj'o de 75°C para evitar la degradación de la quitina. i El material insoluble es recuperado por centr|ifugación y lavado completamente con agua y etanol (u otro disolvente orgánico) . Después, el quitosan es extraído por solubilización en ácido acético al 2% (v/v) y separado por centrifugación. El quitosan permanece en el sobrenadante, mientras que el pellet contiene quitina y otros polímeros insolübles. El quitosan se precipita al ajusfar el pH a 6.0 y recuperado por centrifugación.

El pellet que contiene quitina y otros polímeros insolübles (complejo quitina/glucano) se disuelve en una solución de cloruro de litio al 5% en dimetilacetamida (DMAC) o en dimetilsulfoxido (DMSO) . La solución se guarda bajo agitación constante por al menos 12 horas, para completar la disolución de los polímeros. Después de la centrifugación para extraer el material que no fue solubilizado, el complejo quitina/glucano se precipita por adición de agua. La solución de DM;AC (o DMSO) se mezcla con agua varias veces, hasta que no se ve más formación de precipitado. El complejo quitina/glucano extraído es lavado minuciosamente con agua para jextraer todo el disolvente. El paso final consiste en secarj a temperaturas hasta 60°C o liofilí zación .

¡ Alternativamente, pueden utilizarse condiciones sevefas, mientras se trata con una base fuerte, así se obtiene una deacetilación completa de quitina a quitosan. Esas ¡condiciones extremas incluyen incrementar la temperatura hasta) 128°C, utilizando una concentración de base de 15N o I incrementar el tiempo de reacción hasta 7 horas.

I Los procedimientos de extracción y purificación descritos anteriormente resultan en la generación de varias I fracciones de otros polímeros, además del complejo quitima/glucano . Aquellos polímeros son principalmente polisácáridos compuestos de residuos de glucosa, mañosa y/o galactosa . i Los glucanos de pared celular solubles en álcalis están principalmente compuestos de uniones glicosidicas ß-(1,3). y ß-(1,6). Son extraídos al disolver en una solución alcalina, seguido por su recuperación por precipitación en disolventes inmiscibles o por diálisis que resulta en aproximadamente 4% de glucanos solubles en álcalis. i Ejemplos ' Ejemplo 1: Fermentación con Pichia pastoris en glice ol 14.25 L de medio de fermentación con la composición I descrita en la Tabla 1 se inoculó con 750 mL de un cultivo de Pichi'a pastoris DSMZ 70877. La fermentación se realizó en un biorr'eactor a escala piloto (LP351, 50L, BioEngineering, Suizaj) con temperatura controlada y pH (30°C y 5.0, respectivamente). La velocidad del flujo de aire se mantuvo a 30 L/pin y la presión se mantuvo a 0.102 kg/cm2 (0.10 bar), duranjte la corrida completa. El pH se controló por la adición de hidróxido de amonio. La velocidad de agitación inicial fue de 300 rpm.

I Después de 30 h de fermentación, la concentración de oxigeno disuelto (p02) cae a 50%. Desde ese punto, se controló el 20%, al incrementar la velocidad de agitación hasta 1000 rpm. Cuando la velocidad de agitación alcanzo las 440 rpm, el biorreactor comenzó a ser alimentado con una solución que contenia glicerol (990 g/L) y 24 g/L de la solución mineral descrita en la Tabla 1. La velocidad de alimentación fue exponencial y se calculó de acuerdo a la velocidad de crecimiento celular prevista.

Tabla 1: Composición del medio de fermentación. ,( "^composición de solución mineral: 6. 0 g/L de CuSC 5H20 , 0.08 ¡g/L de Nal, 3 . 0 g/L de MnS04'H20, 0.2 g/L de Na2Mo04¦ 2H20, 0.02 |g/L de H3B03 , 0 . 5 g/L de CoCl2, 20. 0 g/L de ZnCl, 65. 0 g/L de FeSCV 7 H20 , 0.2 g/L de biotina y 5 . 0 mL/L de H2S04 ) I Cuando se alcanzó la velocidad de agitación máxima (lOOc rpm) (aproximadamente 44 h de fermentación), la p02 se controló en 20% por limitación del sustrato. La adición de la solución de alimentación se ajustó continuamente para prevenir que la p02 cayera por debajo de 20%.

Dentro de las 70 h- de fermentación, el cultivo I entro en fase estacionaria de crecimiento y la corrida se terminó. Las células se recuperaron por centrifugación del caldo de fermentación (8000 rpm, 45 min) y se liofilizaron . Se obtuvieron 237 g de células por cada litro de caldo de fermentación .

Ejemplo 2: Producción del complejo quitina /glucano por fermentación con Pichia pastoris en el subproducto de la industria de biodiesel glicerol El protocolo descrito en el ejemplo 1 se usó para cultivar Pichia pastoris DSMZ 70877.

I El glicerol puro se reemplazó por el subproducto de ? la industria del biodiesel glicerol, que contiene 86% de glicejrol. Las velocidades de flujo de la solución de alimentación se corrigieron tomando en cuenta la composición del riuevo sustrato. La evolución del peso seco de las células para ¡ambas corridas y se representa en la Figura 1. j Al final de la fermentación, se obtuvieron 224 g/L de biomasa. La fase estacionaria de crecimiento se alcanzó aproximadamente a 6 h antes que en la fermentación con glicerol puro.

I 1 Usando el procedimiento de extracción propuesto por I Synowiecki y colaboradores, (2003) , se obtuvieron 0.352 g del complejo quit ina/glucano, que corresponden a 11.7% de la biomasa de P. pastoris. Considerando la densidad celular obtenida al final de la fermentación, la productividad del polímero fue 8.99 kg/m al día.

Al usar un kit enzimático para el análisis de glucano (K-YBG, Megazyme) el contenido de biomasa sobre glucahos fue 14%, nientras que el complejo quitina/glucano extraído contenía 38.2% de glucanos. La glucosa y glucosamina fueron los únicos monómeros de azucares detectados por cromajtografía de líquidos, después de la hidrólisis acida.

Así, 'el complejo quitina/glucano extraído tuvo 9% de quitina, 1% de¡ humedad, 4% de cenizas y 6% de proteínas.

^ Al considerar estos resultados, se concluyó que la I biomajsa obtenida en el ejemplo 2 tuvo un contenido de quitina de 3%|.

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I I i

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. El proceso para la producción del complejo quitina- glucano y/o derivados caracterizado porque comprende la fermentación de Pichia pastoris en un medio de cultivo que comprende el subproducto rico en glicerol, generado por la industria del biodiesel, como fuente de carbono i favorecida y el contenido de complejo quitina-glucano i y/o derivados obtenidos es al menos de 15% del peso de células seco total producido.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el subproducto generado por la industria del biodiesel comprende 100% de glicerol como fuente de carbono.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el subproducto generado por la ¡industria del biodiesel alternativamente comprende el i 'subproducto rico en metanol y/o mezclas glicerol- metanol .

. El proceso de conformidad con la reivindicación 3 ¡caracterizado porque el subproducto generado por la i industria del biodiesel comprende 100% de metanol como i fuente de carbono.

5. El proceso de conformidad con las reivindicaciones previas caracterizado porque el medio de cultivo además comprende un alcohol, un azúcar, un ácido orgánico, un poliol, un ácido graso y/o un aminoácido en sus formas monoméricas, diméricas u oligoméricas y/o un residuo industrial o alimenticio o subproducto que comprenden uno o más de los compuestos mencionados anteriormente.

6. Él proceso de conformidad con cualquiera de las i reivindicaciones previas caracterizado porque la I temperatura se mantiene arriba de 37 °C y/o el pH por debajo de 5 para el enriquecimiento de quitina en el complejo quitina-glucano y/o derivados.

7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas 1 a 5 caracterizado porque la I temperatura se mantiene arriba de 45°C y/o el pH entre I 5-6 para el enriquecimiento de quitosan en el complejo jquit ina-glucano y/o derivados. i

8. El proceso de conformidad con cualquiera de las i 'reivindicaciones previas 1 a 5 caracterizado porque la ? temperatura se mantiene por debajo de 35°C y/o el pH por árriba de 6 para el enriquecimiento de glucano en el 'complejo quitina-glucano y/o derivados. ?

9. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas caracterizado porque el contenido del complejo quitina-glucano y/o derivados obtenidos es al menos de 20% del total de la biomasa producida .

10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas caracterizado porque la productividad volumétrica del complejo quitina-glucano es al menos 0.5 g/L*h.

11. ' El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas caracterizado porque la I densidad celular de la levadura es por arriba de 100 g/L.

12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas caracterizado porque los biopolimeros obtenidos durante la fermentación comprenden, además del complejo quitina-glucano y/o derivados, polisacáridos de glucosa, mañosa y/o cjalactosa solubles en agua. i

13. El proceso de conformidad con las reivindicaciones previas caracterizado porque los biopolimeros obtenidos 'durante la fermentación comprenden polisacáridos de 'glucosa, mañosa y/o galactosa hasta 45% del peso seco de as células.