MX2011000696A - Dosificacion terapeutica de una neurregulina o una subsecuencia de la misma para el tratamiento o la profilaxis de insuficiencia cardiaca. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al tratamiento de insuficiencia cardiaca en un mamífero; por consiguiente, la invención está dirigida a establecer un régimen de dosificación mediante el cual se mantienen y/o se realzan los beneficios terapéuticos conferidos mediante la administración de una neurregulina, tal como el factor 2 de crecimiento glial (GGF2), o una subsecuencia de la misma, mientras que se reducen al mínimo concomitantemente cualesquiera efectos secundarios potenciales.

Description

DOSIFICACIÓN TERAPÉUTICA DE UNA NEURORREGULINA O UNA SUBSECUENCIA DE LA MISMA PARA EL TRATAMIENTO O PROFILAXIS DE LA FALLA CARDIACA CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención se refiere al tratamiento de la falla cardiaca. Más específicamente, la invención está dirigida a un régimen de dosificación mejorado con el cual se mantienen y/o incrementan los beneficios terapéuticos de la administración de una neurorregulina, tal como el factor de crecimiento glial 2 (GGF2) o un fragmento del mismo, minimizando cualquier posible efecto secundario.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un reto fundamental asociado con la administración de los medicamentos a los pacientes en necesidad de los mismos es la relación entre tolerancia y eficacia. El índice terapéutico es la escala entre una dosis eficaz de una sustancia que se puede administrar a un paciente y una dosis a la que se notan efectos secundarios indeseables en el paciente. En general, a mayor diferencia entre la dosis eficaz y la dosis a la que se inician los efectos secundarios, es más benigna la sustancia y es más probable que sea tolerada por el paciente.

La falla cardiaca, particularmente la falla congestiva cardiaca (CHF), es una de las causas principales de muerte en las naciones industrializadas. Los factores que son la base de la falla congestiva cardiaca incluyen la presión sanguínea alta, enfermedad isquémica del corazón, exposición a compuestos cardiotóxicos tales como los antibióticos de tipo antraciclina, exposición a la radiación, trauma físico y defectos genéticos asociados con un mayor riesgo de falla del corazón. Así, muchas veces la CHF se origina por un aumento de la carga de trabajo en el corazón debido a hipertensión, daño del miocardio por isquemia crónica, infarto del miocardio, enfermedad viral, toxicidad química, radiación y otras enfermedades tales como esclerodermia. Estas afecciones resultan en una disminución progresiva de la capacidad de bombeo del corazón. Inicialmente, el aumento de la carga de trabajo que resulta de la presión sanguínea elevada o la pérdida de tejido contráctil induce hipertrofia compensatoria del cardiomiocito y engrasamiento de la pared ventricular izquierda, aumentando con ello la contractilidad y manteniendo la función cardiaca. Sin embargo, con el tiempo la cámara ventricular izquierda se dilata, la función de bombeo sistólico se deteriora, los cardiomiocitos sufren muerte celular apoptótica, y la función miocárdica se deteriora progresivamente.

Las neurorregulinas (NRG's) y los receptores de NRG comprenden un sistema de tirosina cinasa receptor del factor de crecimiento para la señalización célula-célula, que está implicado en la organogénesis y desarrollo celular en el nervio, músculo, epitelio y otros tejidos (Lemke, Mol.

Cell. Neurosci. 7:247-262, 1996, y Burden et al, Neuron, 18:847-855, 1997). La familia de NRG consiste en cuatro genes que codifican muchos ligandos que contienen dominios semejantes al factor de crecimiento epidérmico (EGF), inmunoglobulina (Ig), y otros dominios reconocibles. Muchas isoformas secretadas y unidas a la membrana funcionan como ligandos en este sistema de señalización. Todos los receptores para los ligandos de NRG son miembros de la familia de receptores de EGF (EGFR), e incluyen EGFR (o ErbB1), ErbB2, ErbB3 y ErbB4, conocidos también como HER1 a HER4, respectivamente, en humanos (Meyer et al., Development 124:3575-3586, 1997; Orr-Urtreger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 1867-71 , 1993; Marchionni et al., Nature 362:312-8, 1993; Chen et al., J. Comp. Neurol. 349:389-400, 1994; Cortas et al., Neuron 14:103-115, 1995; Meyer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 1064-1068, 1994; y Pinkas-Kramarski et al., Oncogene 15:2803-2815, 1997).

Los cuatro genes NRG, NRG-1 , NRG-2, NRG-3 y NRG-4, se localizan en distintos locus cromosómicos (Pinkas-Kramarski et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :9387-91 , 1994; Carraway et al., Nature 387:512-516, 1997; Chang er a/., Nature 387:509-51 1 , 1997; y Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:9562-9567, 1997), y codifican colectivamente una serie diversa de proteínas NRG. Los productos del gen de NRG-1 , por ejemplo, comprenden un grupo de aproximadamente 15 isoformas distintas relacionadas estructuralmente (Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 7:247-262, 1996, y Peles y Yarden, BioEssays 15:815-824, 1993). Las primeras isoformas identificadas de NRG-1 incluyeron el factor de diferenciación Neu (NDF; Peles et al., Cell 69, 205-216, 1992, y Wen et al., Cell 69, 559-572, 1992), herregulina (HRG; Holmes et al., Science 256:1205-1210, 1992), actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA; Falls et al., Cell 72:801-815, 1993), y los factores de crecimiento glial GGF1 , GGF2 y GGF3 (Marchionni et al. Nature 362:312-8, 1993).

El gen NRG-2 se identificó por clonación de homología (Chang et al., Nature 387:509-512, 1997; Carraway et ai, Nature 387:512-516, 1997; y Higashiyama et al., J. Blochem. 122:675-680, 1997), y mediante propuestas genómicas (Busfield et al., Mol. Cell. Biol. 17:4007-4014, 1997). Los ADNc's de NRG-2 también se conocen como activador de cinasas de ErbB derivado de tejido nervioso o derivado del timo (NTAK; No. de Registro de Genbank AB005060), divergente de neurorregulina (Don-1 ), y factor de crecimiento derivado de cerebelo (CDGF; solicitud de PCT WO 97/09425). La evidencia experimental muestra que las células que expresan ErbB4 o la combinación ErbB2/ErbB4 probablemente exhiben una respuesta particularmente robusta a NRG-2 (Pinkas-Kramarski et al., Mol. Cell. Biol. 18:6090-6101 , 1998). También se sabe que el producto del gen NRG-3 (Zhang et al., supra) se une a los receptores ErbB4 y los activa (Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13:1061-1067, 1998).

Un dominio semejante a EGF está presente en el núcleo de todas las formas de NRG's, y se requiere para la unión y activación de los receptores ErbB. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los dominios semejantes a EGF codificadas en los tres genes son aproximadamente 30-40 % idénticas (comparaciones por pares). Además, parece que hay por lo menos dos subformas de dominios semejantes a EGF en NRG-1 y NRG-2, que pueden conferir diferentes bioactividades y potencias específicas de tejido.

Las respuestas celulares a NRG's son mediadas por las tirosina cinasas receptoras de NRG EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico. La unión de alta afinidad de todas las NRG's es mediada principalmente por ErbB3 o ErbB4. La unión de ligandos de NRG conduce a dimerización con otras subunidades de ErbB y transactivación por fosforilación en residuos específicos de tirosina. En algunas situaciones experimentales, casi todas las combinaciones de receptores ErbB parecen ser capaces de formar dímeros en respuesta a la unión con isoformas de NRG-1. Sin embargo, parece que el ErbB2 es un socio de dimerización preferido que puede tener una función importante en la estabilización del complejo ligando-receptor. El ErbB2 no se une al ligando por si mismo sino que debe aparearse heterologamente con uno de los otros subtipos de receptor. El ErbB3 tiene actividad de tirosina cinasa pero es un blanco de los otros receptores para fosforilación. Se sabe que la expresión de NRG-1 , ErbB2 y ErbB4 es necesaria para la trabeculación del miocardio ventricular durante el desarrollo del ratón.

Las neurorregulinas estimulan el crecimiento hipertrófico compensatorio e inhiben la apoptosis de los miocardíocitos sometidos a estrés fisiológico. De acuerdo con estas observaciones, la administración de una neurorregulina es útil para prevenir, minimizar o revertir la enfermedad congestiva cardiaca que se origina de factores subyacentes tales como hipertensión, enfermedad isquémica del corazón y cardiotoxicidad. Véase por ejemplo la patente de Estados Unidos No. (USPN) 6,635,249, que se incorpora aquí en su totalidad.

En vista del alto predominio de la falla cardiaca en la población general, persiste la necesidad no cubierta de prevenir o minimizar el avance de esta enfermedad, por ejemplo inhibiendo la pérdida de la función cardiaca o mejorando la función cardiaca.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención comprende un método de tratamiento o prevención de la falla cardiaca en un mamífero. El método se basa en la observación sorprendente de que se pueden obtener beneficios terapéuticos de un péptido que comprende un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (semejante a EGF), usando regímenes de dosificación de neurorregulina que no mantienen un estado estacionario, por ejemplo administrando una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido a un mamífero a intervalos de administración de 48, 72, 96 o más horas. Por consiguiente, el presente método requiere la administración intermitente o discontinua (cada 48 a 96 horas, o intervalos aún más largos) de un péptido que contiene un dominio semejante a EGF al mamífero, en donde el dominio semejante a EGF es codificado por un gen de neurorregulina, y en donde la administración del péptido es en una cantidad efectiva para tratar o prevenir la falla cardiaca en el mamífero. Los regímenes de dosificación de neurorregulina que no mantienen concentraciones de estado estacionario son tan eficientes como los regímenes de dosificación más frecuentes, pero sin la inconveniencia, costo ni efectos secundarios que resultan de la administración más frecuente. Como se usa aquí, el término administración intermitente o discontinua incluye un régimen de dosificación a intervalos de por lo menos 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 1 1 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, o cualquier combinación o incremento de los mismos, siempre que el intervalo/régimen sea de por lo menos 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses. Como se usa aquí, el término administración intermitente o discontinua incluye un régimen de dosificación a intervalos no menores no menores de 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 1 1 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, o cualquier combinación o incremento de los mismos, siempre que el intervalo/régimen no sea menor de 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 1 1 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses.

De acuerdo con la presente invención, la administración intermitente o discontinua de un péptido que contiene un dominio semejante a EGF al mamífero, en donde el dominio semejante a EGF es codificado por un gen de neurorregulina, está dirigida a obtener un régimen de dosificación en donde no se mantienen concentraciones de estado estacionario reducidas del péptido administrado, reduciendo así la probabilidad de que el mamífero experimente los efectos secundarios adversos que se pueden originar del mantenimiento de niveles suprafisiológicos del péptido administrado durante un periodo prolongado. Por ejemplo, los efectos secundarios asociados con niveles suprafisiológicos de NRG administrada exógenamente incluyen hiperplasia de la vaina nerviosa, hiperplasia mamaria, nefropatía renal, hipospermia, elevación de las enzimas hepáticas, cambios de la válvula cardiaca y cambios de la piel en el sitio de la inyección.

En una modalidad preferida, la presente invención está dirigida a un régimen de dosificación intermitente que provoca o permite fluctuaciones en los niveles séricos del péptido que comprende un dominio semejante a EGF codificado por un gen de neurorregulina, y por lo tanto reduce el potencial de efectos secundarios adversos asociados con la administración más frecuente del péptido. El régimen de dosificación intermitente de la presente invención confiere así una ventaja terapéutica al mamífero, pero no mantiene niveles terapéuticos de estado estacionario del péptido que comprende el dominio semejante a EGF codificado por un gen de neurorregulina. Como apreciarán los expertos en la materia, hay varias modalidades de la invención para obtener la dosificación intermitente; los beneficios de estas modalidades se pueden plantear de varias maneras, por ejemplo, dicha administración no mantiene niveles terapéuticos de estado estacionario de dicho péptido; la administración reduce el potencial de los efectos secundarios adversos asociados con la administración más frecuente del péptido NRG; etcétera.

En modalidades particulares de la invención, la neurorregulina puede ser el gen, el producto del gen o una subsecuencia respectiva o fragmento de la misma que comprende, consiste esencialmente, o consiste en: NRG-1 , NRG-2, NRG-3 o NRG-4. En una modalidad preferida, una subsecuencia o fragmento de NRG de la invención comprende un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (semejante a EGF) o un homólogo del mismo. Como apreciarán los expertos en la materia, un péptido homólogo de un péptido del dominio semejante a EGF se determina por el hallazgo de homología estructural o determinando si el péptido homólogo actúa como lo hace un péptido semejante a EGF en pruebas funcionales, por ejemplo por unión y activación de los receptores ErbB. Preferiblemente, el fragmento es de por lo menos 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85 aminoácidos de longitud. Un péptido de neurorregulina de la invención, a su vez, puede ser codificado por cualquiera de estos genes de neurorregulina (o subsecuencias de los mismos). En una modalidad más particular, el péptido usado en el método es el GGF2 humano recombinante o un fragmento o subsecuencia del mismo. Véanse las figuras 8A-8D para ver las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos del GGF2 humano de longitud completa.

En un aspecto de la invención, los mamíferos adecuados incluyen, sin limitación, ratones, ratas, conejos, perros, monos o cerdos. En una modalidad de la invención el mamífero es un humano.

En otras modalidades de la invención, la falla cardiaca puede resultar de hipertensión, enfermedad isquémica del corazón, exposición a un compuesto cardiotóxico (por ejemplo, cocaína, alcohol, un anticuerpo anti-ErbB2 o anticuerpo anti-HER, tal como HERCEPTIN®, o un antibiótico de tipo antraciclina, tal como doxorrubicina o daunomicina), miocarditis, enfermedad tiroidea, infección viral, gingivitis, abuso de drogas, abuso de alcohol, periocarditis, aterosclerosis, enfermedad vascular, cardiomiopatía hipertrófica, infarto agudo del miocardio o infarto miocárdico previo, disfunción sistólica ventricular izquierda, cirugía de derivación coronaria, inanición, exposición a radiación, un trastorno de la alimentación, o un defecto genético.

En otra modalidad de la invención, se le administra al mamífero un anticuerpo anti-ErbB2 o anti-HER2, tal como HERCEPTIN®, antes, durante o después de la administración de antraciclina.

En otras modalidades de la invención, el péptido se administra antes de la exposición a un compuesto cardiotóxico, durante la exposición a dicho compuesto cardiotóxico, o después de la exposición a dicho compuesto cardiotóxico; el péptido se administra antes o después del diagnóstico de falla congestiva cardiaca en dicho mamífero. Un método de la invención puede realizarse después de que el sujeto mamífero ha sufrido hipertrofia cardiaca compensatoria; un método de la invención comprende que el resultado del método sea mantener hipertrofia ventricular izquierda o prevenir el avance del adelgazamiento del miocardio, o inhibición de la apoptosis del cardiomiocito. En un método de la invención, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en, un dominio semejante a EGF codificado por un gen de neurorregulina. Un péptido de la invención se administra antes, durante, o después de la exposición a un compuesto cardiotóxico. En otra modalidad, el péptido que contiene el dominio semejante a EGF se administra durante dos o tres de estos periodos. De acuerdo con la presente invención, el péptido que contiene un dominio semejante a EGF codificado por un gen de neurorregulina se administra a intervalos de cada 48 horas a 96 horas. En una modalidad de la presente invención, el péptido que contiene un dominio semejante a EGF codificado por un gen de neurorregulina es el GGF2. En otras modalidades de la invención, el péptido se administra ya sea antes o después del diagnóstico de falla congestiva cardiaca en el mamífero. En otra modalidad de la invención, el péptido se administra a un mamífero que ha sufrido hipertrofia cardiaca compensatoria. En otras modalidades particulares de la invención, la administración del péptido mantiene la hipertrofia ventricular izquierda, previene el avance del adelgazamiento del miocardio, y/o inhibe la apoptosis del cardiomiocito.

Las modalidades de la invención incluyen las siguientes: Un método de tratamiento de la falla cardiaca en un mamífero, dicho método comprendiendo administrar a dicho mamífero un péptido exógeno que comprende un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (semejante a EGF), en donde dicha administración a dichos intervalos reduce los efectos secundarios adversos asociados con la administración de dicho péptido exógeno en dicho mamífero. Un método de tratamiento de la falla cardiaca en un mamífero, dicho método comprendiendo administrar a dicho mamífero un péptido exógeno que comprende un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (semejante a EGF), en donde dicho dominio semejante a EGF es codificado por el gen de neurorregulina (NRG) 1 , y dicho péptido exógeno se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva para tratar la falla cardiaca en dicho mamífero, a intervalos de por lo menos 48 horas, en donde dicha administración a dichos intervalos no mantiene niveles de estado estacionario de dicho péptido exógeno en dicho mamífero. Un método de tratamiento de la falla cardiaca en un mamífero, dicho método comprendiendo administrar a dicho mamífero un péptido exógeno que comprende un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (semejante a EGF) u homólogo del mismo, y dicho péptido exógeno se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva para tratar la falla cardiaca en dicho mamífero a intervalos de por lo menos, o no menores de, 48 horas, en donde dicha administración a dichos intervalos permite una fluctuación entre dosis de las concentraciones séricas de dicho péptido exógeno con respecto al nivel basal o previo a la administración en dicho mamífero.

Como se usa aquí, el término efecto secundario adverso o nocivo se refiere a una consecuencia no buscada y no deseable de un tratamiento médico. Con respecto a la presente invención, un efecto secundario adverso o nocivo que resulta de la administración de un péptido exógeno puede incluir cualesquiera de uno o más de los siguientes: hiperplasia de la vaina nerviosa, hiperplasia mamaria, nefropatía renal, y cambios de la piel en el sitio de la inyección.

Como se usa aquí, el término "fluctuación entre dosis de las concentraciones séricas de dicho péptido exógeno con respecto al nivel previo a la administración en dicho mamífero", se refiere a la diferencia entre las concentraciones séricas antes de la administración de una dosis de un péptido exógeno.

Como se usa aquí, el término "niveles de estado estacionario" se refiere a los niveles de un agente exógeno (por ejemplo un péptido) que son suficientes para obtener un equilibrio (dentro de una escala de fluctuación entre dosis subsiguientes) entre la administración y la eliminación. El "mantener niveles terapéuticos de estado estacionario" se refiere a sostener la concentración de un agente exógeno a un nivel suficiente para conferir un beneficio terapéutico a un sujeto o paciente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un histograma que representa la función cardiaca ejemplificada por los cambios en la fracción de expulsión y acortamiento fraccional. Como se indica, las ratas fueron tratadas con GGF2 a 0.625 mg/kg o una cantidad equimolar de un fragmento semejante a EGF (fragmento; EGF-ld) por vía intravenosa (i.v.) cada día (c/24 h).

La figura 2 muestra una gráfica lineal que representa la función cardiaca revelada por cambios en la fracción de expulsión y el acortamiento fraccional. Como se indica, las ratas fueron tratadas con GGF2 a 0.625 mg/kg o 3.25 mg/kg i.v. c/24 h.

La figura 3 muestra una gráfica lineal que representa la función cardiaca revelada por un mejoramiento significativo en el volumen sistólico final durante el periodo de tratamiento. Como se indica, las ratas fueron tratadas con GGF2 a 0.625 mg/kg o 3.25 mg/kg i.v. c/24 h.

La figura 4 muestra una gráfica lineal que representa la función cardiaca revelada por cambios en la fracción de expulsión y el acortamiento fraccional. Como se indica, las ratas fueron tratadas con GGF2 a 3.25 mg/kg por vía intravenosa (i.v.) cada 24, 48 o 96 horas.

La figura 5 muestra una gráfica lineal que representa la función cardiaca revelada por cambios en la fracción de expulsión ecocardiográfica. Como se indica, las ratas fueron tratadas con vehículo o GGF2 a 3.25 mg/kg por vía intravenosa (i.v.) con o sin BSA.

La figura 6 muestra una gráfica lineal que representa la vida media de GGF2 humano recombinante (rhGGF2) después de la administración i.v.

La figura 7 muestra una gráfica lineal que representa la vida media de GGF2 humano recombinante (rhGGF2) después de la administración subcutánea.

Las figuras 8A - 8D muestran las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de GGF2 de longitud completa. La secuencia de ácidos nucleicos se distingue como SEQ ID NO: 1 , y la secuencia de aminoácidos se distingue como SEQ ID NO: 2.

La figura 9 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos del dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGFL) 1. La secuencia de ácido nucleico del dominio 1 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 3, y la secuencia de aminoácidos del dominio 1 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 4.

La figura 10 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos del dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGFL) 2. La secuencia de ácido nucleico del dominio 2 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos del dominio 2 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 6.

La figura 1 1 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos del dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGFL) 3. La secuencia de ácido nucleico del dominio 3 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos del dominio 3 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 8.

La figura 12 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos del dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGFL) 4. La secuencia de ácido nucleico del dominio 4 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 9, y la secuencia de aminoácidos del dominio 4 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 10.

La figura 13 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos del dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGFL) 5. La secuencia de ácido nucleico del dominio 5 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 1 1 , y la secuencia de aminoácidos del dominio 5 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 12.

La figura 14 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos del dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGFL) 6. La secuencia de ácido nucleico del dominio 6 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 13, y la secuencia de aminoácidos del dominio 6 de EGFL se distingue aquí como SEQ ID NO: 14.

La figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGFL), que se distingue aquí como SEQ ID NO: 21.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores hicieron el sorprendente descubrimiento de que la administración discontinua o intermitente de una neurorregulina a intervalos de tiempo adecuadamente espaciados suministra una cantidad terapéuticamente efectiva de neurorregulina a un paciente en necesidad de la misma, y dicho régimen de tratamiento es útil para la prevención, profilaxis, alivio, minimización, tratamiento o reversión de la enfermedad cardiaca, tal como la falla congestiva cardiaca.

A pesar del conocimiento convencional y la práctica de desarrollo pertenecientes al diseño de regímenes de dosificación, que dictan mantener las concentraciones de estado estacionario en escalas más estrechas, los presentes inventores demuestran aquí que regímenes de dosificación para la administración de neurorregulina que no mantienen concentraciones de estado estacionario estrechas son igualmente efectivas que los regímenes de dosificación más frecuentes. En realidad, los presentes inventores han mostrado que el tratamiento de la falla cardiaca con neurorregulina a intervalos de dosificación de por lo menos 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 1 días, 12 días, 13 días, 14 días, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, o cualquier combinación o incremento de los mismos, siempre que el intervalo/régimen sea de por lo menos 48 horas, es tan efectivo como la dosificación diaria.

Para evaluar la farmacocinética de la NRG exógena, los presentes inventores han mostrado que la vida media de la neurorregulina cuando se suministra por vía intravenosa es de 4 a 8 horas, y cuando se suministra por vía subcutánea es de 1 -15 horas; véanse por ejemplo los cuadros 1 y 2 y las figuras 6 y 7. Por lo tanto, la dosificación en regímenes tan infrecuentes como cada cuatro días, no mantendría ningún nivel detectable durante por lo menos tres días entre las dosis. Basándose en estos hallazgos, antes de la presente invención no se podía haber predicho que tales índices valle-pico se correlacionen con un beneficio terapéutico consistente. Es notable que los compuestos con una vida media de este orden generalmente se administran de acuerdo con un régimen de dosificación frecuente (por ejemplo dosis diarias o múltiples). En realidad, basándose en los datos farmacocinéticos disponibles para GGF2, el desarrollo tradicional predeciría que el tratamiento óptimo incluiría dosificación subcutánea diaria.

Manteniéndose en el conocimiento convencional y la práctica de desarrollo, otros tratamientos médicos para la CHF se administran típicamente en una base por lo menos diaria. Se piensa que es necesaria la periodicidad de dicho régimen porque la CHF es una condición crónica causada comúnmente por el deterioro de la contracción y/o relajación del corazón, más que una condición aguda. En personas con un corazón débil que conlleva a un deterioro de la relajación y CHF, los tratamientos médicos incluyen fármacos que bloquean la formación o acción de neurohormonas específicas (por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de ACE), antagonistas del receptor de angiotensina (ARB's), antagonistas de aldosterona y bloqueadores del receptor beta-adrenérgico). Estos y otros medicamentos son ahora estándar de cuidado en la CHF crónica pues se ha demostrado que mejoran los síntomas, la esperanza de vida o reducen las hospitalizaciones. En la situación de exacerbación aguda o síntomas crónicos, frecuentemente se trata a los pacientes con inótropos (por ejemplo, dobutamina, digoxina) para aumentar la contractilidad cardiaca, junto con vasodilatadores (por ejemplo, nitratos, nesiritida) y/o diuréticos (por ejemplo furosemida) para reducir la congestión. Los pacientes con hipertensión y falla congestiva cardiaca se tratan con uno o más agentes hipertensivos tales como los bloqueadores beta, inhibidores de ACE y ARB's, nitratos (dinitrato de isosorbida), hidralazina, y bloqueadores del canal de calcio.

De esta manera, a pesar de la práctica típica con respecto al tratamiento de CHF, los presentes inventores han demostrado que un régimen de dosificación novedoso resulta en un tratamiento eficaz de la CHF, evitando efectos secundarios indeseables. Aunque no se desea limitarse por teoría, es probable que dicho tratamiento con neurorregulina refuerce la capacidad de bombeo del corazón estimulando la hipertrofia del cardiomiocito e inhiba parcial o totalmente el deterioro adicional del corazón suprimiendo la apoptosis del cardiomiocito.

A manera de antecedente adicional, el principio básico de la dosificación es determinar una concentración efectiva en circulación y diseñar un régimen de dosificación para mantener esos niveles. Se combinan estudios farmacocinéticos (PK) y farmacodinámicos (PD) para predecir un régimen de dosificación que mantenga un nivel de estado estacionario de un fármaco particular. El plan típico es minimizar la diferencia entre la Cmax y la Cm¡n y reducir así los efectos secundarios.

Los fármacos se describen por su "índice terapéutico", que es una relación entre la dosis o nivel en circulación tóxica dividida entre la dosis o concentración en circulación efectiva. Cuando el índice terapéutico es grande, existe un margen de seguridad amplio en donde se puede administrar una dosis efectiva sin aproximarse a los niveles tóxicos. Cuando resultan efectos no deseados a concentraciones muy cercanas a las concentraciones efectivas, se dice que el índice terapéutico es estrecho y entonces es difícil administrar el fármaco seguramente.

Al desarrollar regímenes de dosificación se combinan los datos de PK/PD con el conocimiento del índice terapéutico para diseñar una dosis y frecuencia de administración tales que el compuesto se mantenga a una concentración en un paciente (por ejemplo en un humano) arriba de la concentración efectiva y debajo de la concentración tóxica. Si durante el desarrollo no se puede mantener una concentración efectiva del fármaco sin inducir efectos peligrosos, el fármaco será fallido. Comentarios adicionales relativos al desarrollo de fármacos se pueden encontrar en una variedad de referencias que incluyen: "Pharmacokinetics in Drug Development: Clinical Study Design and Analysis" (2004, Peter Bonate y Danny Howard, eds.), que se incorpora aquí en su totalidad.

Las neurorregulinas son factores de crecimiento relacionados con los factores de crecimiento epidérmico que se unen a los receptores erbB. Se ha mostrado que mejoran la función cardiaca en múltiples modelos de falla cardiaca, cardiotoxicidad e isquemia. También se ha mostrado que protegen el sistema nervioso en modelos de ataque cerebral, lesión de la médula espinal, exposición a agente nervioso, daño de nervio periférico y quimiotoxicidad.

Sin embargo, se ha mostrado que el mantenimiento de niveles supranormales de neurorregulinas suministradas exógenamente tiene efectos no deseados que incluyen hiperplasia de la vaina nerviosa, hiperplasia mamaria y nefropatía renal. Estos efectos fueron observados después de la administración subcutánea diaria de neurorregulina; véase por ejemplo el cuadró lo.

Como se expone aquí, la administración subcutánea se exploró debido a la vida medía prolongada en comparación con la administración intravenosa, y a la creencia inicial de que sería ventajoso mantener niveles constantes de ligando. El desarrollo de regímenes de dosificación para reducir estos efectos aumentaría significativamente la capacidad de utilización de las neurorregulinas como agentes terapéuticos, y es hacia este fin al que está dirigido la presente invención. La demostración de que una dosificación menos frecuente que no mantiene niveles constantes también es eficaz, habilita este desarrollo.

Neurorregulinas: Como se indicó arriba, los péptidos codificados por los genes de NRG-1 , NRG-2, NRG-3 y NRG-4 tienen dominios semejantes a EGF que les permiten unirse a los receptores ErbB y activarlos. Holmes et. al. {Science 256:1205-1210, 1992) han mostrado que el dominio semejante a EGF solo es suficiente para unirse al receptor p185erbB2 y activarlo. Por consiguiente, en los métodos de la invención se puede usar cualquier producto peptídico codificado por el gen NRG-1 , NRG-2 o NRG-3, o cualquier péptido semejante a neurorregulina, por ejemplo un péptido que tiene un dominio semejante a EGF codificado por un gen o ADNc de neurorregulina (por ejemplo un dominio semejante a EGF que contienen los subdominios del péptido NRG-1 C-C/D o C-C/D', como se describe en los documentos USPN 5,530,109, USPN 5,716,930 y USPN 7,037,888; o un dominio semejante a EGF como se describe en WO 97/09425), para prevenir o tratar la falla congestiva cardiaca. El contenido de cada uno de los documentos USPN 5,530,109, USPN 5,716,930, USPN 7,037,888, y WO 97/09425, se incorpora aquí en su totalidad.

Factores de riesgo. Los factores de riesgo que aumentan la probabilidad de que un individuo desarrolle falla congestiva cardiaca son muy conocidos, estos incluyen, sin limitación, fumar, obesidad, presión sanguínea alta, enfermedad isquémica del corazón, enfermedad vascular, cirugía de derivación coronaria, infarto del miocardio, disfunción sistólica ventricular izquierda, exposición a compuestos cardiotóxicos (alcohol, drogas como cocaína, y antibióticos del tipo de antraciclina tales como doxorrubicina y daunorrubicina), infección viral, pericarditis, miocarditis, gingivitis, enfermedad tiroidea, exposición a la radiación, defectos genéticos que aumentan el riesgo de falla cardiaca (como los que se describen en Bachinski y Roberts, Cardiol. Clin. 16:603-610,1998; Siu et al., Circulation 8:1022-1026, 1999; y Arbustini et al., Heart 80:548-558, 1998), inanición, trastornos de la alimentación tales como anorexia y bulimia, historia familiar de falla cardiaca, e hipertrofia del miocardio.

De acuerdo con la presente invención, las neurorregulinas se pueden administrar intermitentemente para lograr la profilaxis, por ejemplo previniendo o reduciendo la velocidad del avance de la enfermedad congestiva cardiaca en las personas identificadas en riesgo. Por ejemplo, la administración de neurorregulina a un paciente con hipertrofia compensatoria temprana permite mantener el estado hipertrófico y previene el avance hacia la falla cardiaca. Además, a los identificados en riesgo se les puede dar un tratamiento cardioprotector de neurorregulina antes del desarrollo de hipertrofia compensatoria.

La administración de neurorregulina a los pacientes de cáncer antes y durante quimioterapia con antraciclina, o terapia de combinación antraciclina /anticuerpo anti-ErbB (anti-HER2) (por ejemplo, HERCEPTIN®), puede prevenir que los cardiomiocitos del paciente sufran apoptosis, preservando así la función cardiaca. Los pacientes que ya han padecido pérdida de cardiomiocito también obtienen beneficio del tratamiento con neurorregulina, porque el tejido miocárdico remanente responde a la exposición de neurorregulina exhibiendo un crecimiento hipertrófico y mayor contractilidad.

Terapia: Las neurorregulinas y los péptidos que contienen dominios semejantes a EGF codificados por genes de neurorregulina se pueden administrar a pacientes o animales experimentales con un diluente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de la invención se pueden proveer en formas farmacéuticas unitarias.

La práctica farmacéutica convencional se utiliza para proveer formulaciones o composiciones adecuadas, y para administrar dichas composiciones a los pacientes o animales experimentales. Aunque se prefiere la administración intravenosa, se puede utilizar cualquier vía de administración adecuada, por ejemplo parenteral, subcutánea, intramuscular, transdérmica, intracardiaca, intraperitoneal, intranasal, por aerosol, oral o tópica (por ejemplo aplicando un parche adhesivo que lleva una formulación capaz de atravesar la dermis y entrar a la corriente sanguínea).

Las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral las formulaciones pueden estar en forma de tabletas o cápsulas; y para administración intranasal en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Los métodos conocidos para preparar formulaciones se encuentran por ejemplo en "Remington's Pharmaceutical Sciences". Las formulaciones para administración parenteral, por ejemplo, pueden contener excipientes, agua estéril, o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, o naftalenos hidrogenados. Otros sistemas de suministro parenteral potencialmente útiles para administrar las moléculas de la invención incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen por ejemplo éter de polioxietileno-9-laurilo, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales, o como un gel.

Como un aspecto adicional de la invención se proveen los presentes compuestos para usarse como un agente farmacéutico, especialmente en el tratamiento o prevención de las afecciones y enfermedades anteriormente mencionadas. También se provee aquí el uso de los presentes compuestos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una o más de las afecciones y enfermedades anteriormente mencionadas.

Con respecto a las inyecciones intravenosas, las dosis varían de aproximadamente 0.001 mg/kg, 0.01 mg/kg, a por lo menos 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de por lo menos aproximadamente cada 24, 36, 48 horas, a aproximadamente cada 96 horas, y en especial cada 48, 72 o 96 horas o más como se indica en la presente. En una modalidad particular, las dosis para inyección intravenosa varían de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en intervalos de tiempos regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas, y en especial cada 48, 72 o 96 horas o más como se indica en la presente. En otra modalidad particular, las dosis para inyección intravenosa varían de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas, y en especial cada 48, 72, o 96 horas o más como se indica en la presente. En otra modalidad particular, las dosis para inyección intravenosa varían de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas, y en especial cada 48, 72 o 96 horas o más, como se indica en la presente. En otra modalidad particular, las dosis para inyección intravenosa varían de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas, y en especial cada 48, 72, o 96 horas o más como se indica en la presente.

Con respecto a las inyecciones subcutáneas, las dosis varían de aproximadamente 0.01 mg/kg a por lo menos 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas, y en especial cada 48, 72, o 96 horas o más como se indica en la presente. En una modalidad particular, las dosis para inyección varían de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas o más como se indica en la presente, y en especial cada 48, 72 o 96 horas. En otra modalidad particular, las dosis para inyección varían de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas o más como se indica en la presente, y en especial cada 48, 72 o 96 horas. En otra modalidad particular las dosis para inyección varían de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas o más como se indica en la presente, y en especial cada 48, 72 o 96 horas. En otra modalidad particular, las dosis para inyección varían de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 48 horas a aproximadamente cada 96 horas o más como se indica en la presente, y en especial cada 48, 72 o 96 horas.

Las dosis transdérmicas generalmente se seleccionan para proveer niveles sanguíneos similares o menores que los obtenidos utilizando dosis de inyección.

Los compuestos de la invención se pueden administrar como el único agente activo, o se pueden administrar en combinación con otros agentes que incluyen otros compuestos que muestran una actividad terapéutica igual o similar y que sean seguros y eficaces para dicha administración combinada. Otros de estos compuestos usados para el tratamiento de CHF incluyen el péptido natriurético del cerebro (BNP), fármacos que bloquean la formación o acción de neurohormonas específicas (por ejemplo inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de ACE), antagonistas del receptor de angiotensina (ARB's), antagonistas de aldosterona y bloqueadores del receptor beta-adrenérgico), inótropos (por ejemplo, dobutamina, digoxina) para aumentar la contractilidad cardiaca, vasodilatadores (por ejemplo, nitratos, nesiritida), y/o diuréticos (por ejemplo, furosemida) para reducir la congestión, y uno o más agentes antihipertensivos tales como bloqueadores beta, inhibidores de ACE y ARB's, nitratos (dinitrato de isosorbida), hidralazina, y bloqueadores del canal de calcio.

Como se indica arriba, la intervención médica que incluye el tratamiento con fármacos requiere la selección de un fármaco adecuado y su o suministro en un régimen de dosificación adecuado. Un régimen de dosificación adecuado incluye una dosis suficiente y una vía, frecuencia y duración de tratamiento adecuadas. El objetivo final de la terapia farmacológica es la adquisición de concentraciones óptimas del fármaco en el sitio de acción, a fin de permitir que paciente tratado venza el proceso patológico para el cual necesita tratamiento. Hablando ampliamente, el conocimiento básico de los principios de la disposición de fármacos facilita la selección de los regímenes de dosificación apropiados. Sin embargo, el monitoreo del fármaco (TDM) se puede usar en este contexto como una herramienta complementaria para ayudar al médico a cargo a determinar los regímenes de dosificación eficaces y seguros de los fármacos seleccionados para la terapia médica de pacientes individuales.

Concentración objetivo y ventana terapéutica: La definición de concentración óptima de fármaco varía dependiendo de las características farmacodinámicas del fármaco particular. Por ejemplo, la terapia óptima de antibióticos dependientes del tiempo como la penicilina, se relaciona con la obtención de relaciones de concentración pico a MIC (concentración inhibitoria mínima) de 2-4 y un tiempo arriba de la MIC igual a 75% del intervalo de la dosis. Por ejemplo, para antibióticos dependientes de la concentración como la gentamicina, la eficacia se relaciona con la obtención de relaciones de concentración pico a MIC de aproximadamente 8-10. Sin importar los matices asociados con la administración de un fármaco particular, la terapia farmacológica apunta a lograr concentraciones plasmáticas objetivo (que muchas veces reflejan las concentraciones en el sitio de acción) dentro de los límites de una "ventana terapéutica", que ha sido determinada previamente basándose en los perfiles farmacocinéticas, farmacodinámicos y de toxicidad del fármaco en la especie objetivo. La amplitud de esta ventana varía para diferentes fármacos y especies. Cuando la diferencia entre la concentración efectiva mínima y la concentración tóxica mínima es pequeña (de 2 a 4 veces), la ventana terapéutica se considera estrecha. En contraste, cuando hay una diferencia grande entre la concentración efectiva y la tóxica, se considera que el fármaco tiene una ventana terapéutica amplia. Un ejemplo de un fármaco con una ventana terapéutica estrecha es la digoxina, en donde la diferencia entre las concentraciones efectivas y tóxicas promedio es de 2 o 3 veces. Por otra parte, la amoxicilina tiene una escala terapéutica amplia y la sobredosificación de un paciente generalmente no se asocia con problemas de toxicidad.

Variabilidad en la respuesta al fármaco: La variabilidad pronunciada entre sujetos sanos de la misma especie con respecto a la respuesta a un fármaco es común. Además, estados patológicos tienen el potencial de afectar sistemas de órganos y funciones (por ejemplo, riñon, hígado, contenido de agua), que a su vez pueden afectar la respuesta a los fármacos. Esto a su vez contribuye a mayores diferencias en las respuestas a los fármacos en los individuos enfermos a quienes se les administra el fármaco. Otro problema relevante se refiere a la administración de más de un fármaco a la vez, lo que resulta en interacciones farmacocinéticas que pueden llevar a alteraciones en la respuesta a uno o los dos fármacos. En resumen, factores fisiológicos (por ejemplo la edad), patológicos (por ejemplo efectos de la enfermedad), y farmacológicos (por ejemplo interacción farmacológica) pueden alterar la disposición de los fármacos en los animales. El incremento de variabilidad entre los individuos puede resultar en el fracaso terapéutico o toxicidad de los fármacos con un índice terapéutico estrecho.

La población de pacientes que se beneficiaría de un régimen de tratamiento de la presente invención es muy diversa, por ejemplo los pacientes con deterioro de la función renal son buenos candidatos porque los niveles continuos de proteínas terapéuticas frecuentemente se asocian con depósitos glomerulares renales. Por lo tanto, un régimen terapéutico que no mantiene niveles plasmáticos constantes como se describe en esta invención sería muy beneficioso para los pacientes con función renal comprometida, en los cuales sería nociva cualquier disminución de la función existente. Similarmente, la exposición breve e intermitente a un agente terapéutico tal como GGF2, como se describe aquí, puede ser beneficiosa para los pacientes con tumores de tipo responsivo a la estimulación crónica y continua con un factor de crecimiento. Otros pacientes que se pueden beneficiar específicamente de la terapia intermitente que se describe en la presente son los pacientes con schwanomas y otras neuropatías periféricas. Es una ventaja de la presente invención que la dosificación intermitente puede tener ventajas significativas al no mantener la estimulación continua relacionada con efectos secundarios de varios tejidos.

La programación apropiada del muestreo de sangre con la finalidad de determinar el nivel de un fármaco en la sangre, así como también la interpretación del nivel reportado requieren considerar las propiedades farmacocinéticas del fármaco medido. En los siguientes párrafos se definen algunos términos utilizados en la exposición de estas propiedades.

Vida media: El tiempo requerido para que la concentración sérica presente al comienzo de un intervalo disminuya 50%. El conocimiento de una vida media aproximada es esencial para el médico puesto que determina el programa de dosificación óptimo con agentes orales, la fluctuación entre dosis de la concentración en el suero, y el tiempo requerido para lograr el estado estacionario.

En resumen, se han realizado múltiples estudios farmacocinéticos para GGF2. Las vidas medias típicas para GGF2 son entre 4 y 8 horas para la vía intravenosa (i.v.), mientras que la vida media de GGF2 administrado por vía subcutánea (s.c.) es entre 11 y 15 horas. La Cmax, AUC, Tmax y T1/2 se muestran más abajo en los cuadros 1 y 2. Si la vida media es demasiado larga para ser determinada con precisión por estos métodos se presenta un guión en lugar del tiempo.

CUADRO 1 Farmacocinética media de la radioactividad derivada de 125l-rhGGF2 en el plasma de ratas Sprage-Dawlev machos después de una sola dosis intravenosa o subcutánea de 125l-rhGGF2 Grupo 1 (n=2) Grupo 2 (n=1 ) Parámetros Total TCA precip. Total TCA precip.

Cmax (Mg eq/g) 0.3289 0.2953 0.0157 0.01 AUCo-t (pg eq-h/g) 1.27 0.01 0.27 0.17 AUC¡nf (pg eq-h/g) 1.37 0.96 0.39 0.26 Tmax (h) 0.08 0.08 6.0 6.0 Vida media 6.37 6.11 13.20 14.66 Grupo 1- i.v.; Grupo 2- s.c.

CUADRO 2 Farmacocinética media de la radioactividad derivada de 12Sl-rhGGF2 en el plasma de ratas Sprage-Dawley machos después de una sola dosis intravenosa o subcutánea de 125l-rhGGF2 Grupo 1 (n=2) Grupo 2 (n=1 ) Parámetros Total TCA precip. Total TCA precip.

Cmax (pg eq/g) 0.2611 0.2291 0.0197 0.0034 AUCo-t (Mg eq-h/g) 1.488 0.567 0.335 0.064 AUC¡nf (Mg eq-h/g) 1.667 0.62 - - Tmax (h) 0.08 0.08 12.0 12.0 Vida media 7.75 7.95 - - Grupo 1 - i.v.; Grupo 2- s.c.

Las concentraciones plasmáticas después de la administración se muestran en las figuras 6 y 7 para administración i.v. y s.c, respectivamente. Como se muestra en las figuras 6 y 7, la Cmax se refiere a la concentración plasmática máxima (la concentración máxima medida en el plasma a cualquier tiempo después de la administración); AUC¡nf se refiere al área bajo la curva de concentración contra tiempo para el tiempo infinito (cuyo método se usa para anticipar que la prueba tiene límites de detección); AUC0-t se refiere al área bajo la curva de la concentración plasmática (la curva de tiempo desde tiempo 0 hasta la última concentración mensurable); la AUC mediante cualquier método se refiere a un cálculo de la exposición total del animal; y el Tmax se refiere al tiempo medio de la concentración plasmática máxima.

Como es evidente de los cuadros y figuras, no es posible mantener niveles terapéuticos de estado estacionario con una dosificación cada cuatro días, cada tercer día, o cada 24 h, mediante cualquier vía de administración. Los niveles no son mensurables después de un día, e incluso mucho antes de eso, como lo reflejan los datos indicados en el cuadro 1 1.

CUADRO 11 Parámetros farmacocinéticos para GGF2 después de administración intravenosa* 'Tornado de datos obtenidos de concentraciones plasmáticas de GGF2 medidas por ELISA. Datos reportados como media ±SD Estado estable: Las concentraciones séricas en estado estacionario son aquellos valores que se repiten con cada dosis y representan un estado de equilibrio entre la cantidad de fármaco administrado y la cantidad de fármaco eliminado en un intervalo de tiempo dado. Durante la dosificación a largo plazo con cualquier fármaco, los dos principales determinantes de su concentración sérica media de estado estacionario son la velocidad a la que se administra el fármaco y la eliminación total de fármaco en ese paciente particular.

Concentración sérica pico: El punto de concentración máxima en la curva de concentración sérica contra el tiempo. El tiempo exacto de la concentración sérica pico es difícil de predecir puesto que representa relaciones complejas entre las velocidades de entrada y salida.

Concentración sérica valle: La concentración sérica mínima encontrada durante un intervalo de dosificación. Teóricamente, las concentraciones valle están presentes en el periodo que precede inmediatamente a la administración de la siguiente dosis.

Absorción: El proceso mediante el cual un fármaco entra al cuerpo. Los fármacos administrados intravascularmente son absorbidos totalmente, pero la administración extravascular produce grados y velocidades de absorción variables. La relación entre la velocidad de absorción y la velocidad de eliminación es el principio determinante de la concentración del fármaco en la corriente sanguínea.

Distribución: La dispersión del fármaco disponible sistémicamente del espacio intravascular a los fluidos y tejidos extravasculares, y por lo tanto a los sitios del receptor objetivo.

Escala terapéutica: Aquella escala de concentraciones séricas de fármaco asociadas con un alto grado de eficacia y un bajo riesgo de toxicidad relacionada con la dosis. La escala terapéutica es un concepto estadístico: es la escala de concentraciones asociadas con la respuesta terapéutica en la mayoría de los pacientes. Como consecuencia, algunos pacientes muestran una respuesta terapéutica a niveles séricos por debajo del límite inferior de la escala, mientras que otros requieren niveles séricos que rebasan el límite superior para obtener un beneficio terapéutico.

La programación correcta de la recolección de muestras es importante, puesto que frecuentemente la terapia farmacológica se revisa basándose en las determinaciones de la concentración sérica. Las fases de absorción y distribución deben ser completas y se debe obtener una concentración de estado estacionario antes de extraer la muestra. Los niveles obtenidos antes de que exista una concentración de estado estacionario pueden ser erróneamente bajos; el aumento de la dosificación basándose en dicho resultado podría producir concentraciones tóxicas. Además, cuando se hacen mediciones comparativas, es importante que el tiempo de muestreo sea consistente.

La programación de las muestras sanguíneas con respecto a la dosificación es crítica para la interpretación correcta de los resultados de concentración sérica. La selección del tiempo en el que se extrae la muestra con respecto a la administración del fármaco se debe basar en las propiedades farmacocinéticas del fármaco, su forma farmacéutica y la razón clínica para analizar la muestra (por ejemplo, determinación de la eficacia o aclaración de la posible toxicidad inducida por el fármaco). Para el monitoreo rutinario del nivel sérico de fármacos con vidas medias cortas, se debe recolectar una muestra de estado estacionario tanto pico como valle para caracterizar el perfil de la concentración sérica; para fármacos con una vida media larga, generalmente son suficientes solo las muestras valle de estado estacionario.

Por "falla congestiva cardiaca" se entiende el deterioro de la función cardiaca que hace al corazón incapaz de mantener el gasto sanguíneo normal en el reposo o con ejercicio, o mantener un gasto cardiaco normal en la situación de presión de llenado cardiaco normal. Una fracción de expulsión ventricular izquierda de aproximadamente 40% o menos es indicativa de falla congestiva cardiaca (a manera de comparación, una fracción de expulsión normal es de aproximadamente 60%). Los pacientes con falla congestiva cardiaca muestran síntomas y signos clínicos muy conocidos tales como taquipnea, efusiones plurales, fatiga en el repuso o con ejercicio, disfunción contráctil y edema. La falla congestiva cardiaca se diagnostica fácilmente por medio de métodos muy conocidos (véase por ejemplo "Consensus recommendations for the Management of chronic heart failure" Am. J. Cardiol., 83 (2A): 1A-38-A, 1999).

La severidad relativa y el avance de la enfermedad se determinan usando métodos muy conocidos, tales como examen físico, ecocardiog rafia, imagografía de radionúclido, monitoreo hemodinámico invasivo, angiografía de resonancia magnética, y prueba de caminadora para ejercicio junto con estudios de captación de oxígeno.

Por "enfermedad isquémica del corazón" se entiende cualquier trastorno que se origina de un desequilibrio entre la necesidad miocárdica de oxígeno y la suficiencia del suministro de oxígeno. La mayoría de los casos de enfermedad isquémica del corazón se originan por estrechamiento de las arterias coronarias, como ocurre en la aterosclerosis u otros trastornos vasculares.

Por "infarto del miocardio" se entiende un proceso mediante el cual la enfermedad isquémica hace que una región del miocardio sea reemplazada por tejido cicatrizal.

Por "cardiotóxico" se entiende un compuesto que disminuye la función cardiaca deteriorando directa o indirectamente los cardiomiocitos o destruyéndolos.

Por "hipertensión" se entiende una presión sanguínea que es considerada por un profesional médico (por ejemplo un médico o una enfermera) mas alta que lo normal, y conlleva un mayor riesgo de desarrollar falla congestiva cardiaca.

Por "tratamiento" se entiende que la administración de una neurorregulina o péptido semejante a neurorregulina retarda o inhibe el avance de la falla congestiva cardiaca durante el tratamiento, con respecto al avance de la enfermedad que ocurriría en ausencia del tratamiento, de una manera estadísticamente significativa. Para evaluar el avance de la enfermedad se pueden usar indicios muy conocidos tales como la fracción de expulsión ventricular izquierda, realización de ejercicio y otras pruebas clínicas como las mencionadas arriba, así como también las tasas de supervivencia y las tasas de hospitalización. Se puede determinar si un tratamiento retarda o inhibe o no el avance de una enfermedad de una manera estadísticamente significativa, por medio de métodos que son muy conocidos (véase por ejemplo SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med 327:685-691 , 1992, y Cohn et al., N. Engl. J. Med. 339:1810-1816, 1998).

Por "prevención" se entiende minimizar o inhibir parcial o totalmente el desarrollo de la falla congestiva cardiaca en un mamífero en riesgo de desarrollar la falla congestiva cardiaca (como se define en "Consensus Recommendations for the Management of Chronic Heart Failure" Am. J. Cardiol; 83(2A): 1A-38-A, 1999). La determinación de si la falla congestiva cardiaca es minimizada o prevenida por la administración de una neurorregulina o péptido semejante a neurorregulina se hace mediante métodos conocidos como los que describen SOLVD Investigators, supra, y Cohn et al; supra.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa aquella cantidad de fármaco o agente farmacéutico que provoca la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano, que es buscada por el investigador, veterinario, doctor en medicina u otro médico. Un cambio terapéutico es un cambio en una característica bioquímica medida en una dirección que se espera que alivie la enfermedad o afección manejada. Mas particularmente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para reducir los síntomas asociados con una afección o enfermedad, para normalizar las funciones corporales frente a la enfermedad o trastornos que producen deterioro de funciones corporales específicas, o para mejorar uno o más de los parámetros medidos clínicamente de una enfermedad.

El término "cantidad profilácticamente efectiva" significa aquella cantidad de agente farmacéutico que previene o reduce el riesgo de ocurrencia del evento biológico o médico que el investigador, veterinario, doctor en medicina u otro médico busca prevenir en un tejido, sistema, animal o humano.

El término "ventana terapéutica" significa la escala de dosis entre la cantidad mínima para obtener cualquier cambio terapéutico y la cantidad máxima que resulta en una respuesta, que es la respuesta inmediatamente anterior a la toxicidad para el paciente.

Por "en riesgo de falla congestiva cardiaca" se entiende un individuo que fuma, es obeso (esto es, con 20% o más sobre su peso ideal), ha sido o será expuesto a un compuesto cardiotóxico (tal como un antibiótico del tipo de antraciclina), o tiene (o tuvo) presión sanguínea alta, enfermedad isquémica del corazón, un infarto del miocardio, un defecto genético que aumente el riesgo de falla cardiaca, una historia familiar de falla cardiaca, hipertrofia miocárdica, cardiomiopatía hipertrófica, disfunción sistólica ventricular izquierda, cirugía de derivación coronaria, enfermedad vascular, aterosclerosis, alcoholismo, periocarditis, una infección viral, gingivitis o un trastorno de la alimentación (por ejemplo anorexia nerviosa o bulimia), o es un alcohólico o adicto a la cocaína.

Por "reducir el avance del adelgazamiento del miocardio" se entiende mantener hipertrofia de los cardiomiocitos ventriculares de tal manera que el grosor de la pared ventricular se mantenga o aumente.

Por "inhibe la apoptosis del miocardio" se entiende que el tratamiento con neurorregulina inhibe la muerte de los cardiomiocitos en al menos 10%, de preferencia por lo menos 15%, de preferencia por lo menos 25%, de preferencia por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 75%, y muy de preferencia por lo menos 90%, en comparación con los cardiomiocitos no tratados.

Por "neurorregulina" o "NRG" se entiende un péptido que es codificado por un gen o ácido nucleico (por ejemplo un ADNc) de NRG-1 , NRG-2 o NRG-3, y se une a los receptores ErbB2, ErbB3 o ErbB4, o combinaciones de los mismos, y los activa.

Por "neurorregulina 1 ", "NRG-1 ", "herregulina", "GGF2", o "ligando p185erbB2" se entiende un péptido que se une al receptor ErbB2 cuando se aparea con otro receptor (ErbB1 , ErbB3 o ErbB4), y es codificado por el gen del ligando p18erbB2 que se describe en la patente de EE. UU. No. 5,530,109; la patente de EE. UU. No. 5,716,930; y la patente de EE. UU. No. 7,037,888, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Por "péptido semejante a neurorregulina" se entiende un péptido que tiene un dominio semejante a EGF codificado por un gen de neurorregulina, y se une a ErbB2, ErbB3, ErbB4, o una combinación de los mismos, y los activa.

Por "dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico" o "dominio semejante a EGF" se entiende un motivo de péptido codificado por el gen NRG-1 , NRG-2 o NRG-3 que se une y activa a ErbB2, ErbB3, ErbB4, o combinaciones de los mismos, y lleva una similitud estructural con el dominio de unión del receptor del EGF como se describe en Holmes et al; Science 256:1205-1210, 1992; patente de EE. UU. No. 5,530,109; patente de EE. UU. No. 5,716,930; patente de EE. UU. No. 7,037,888; Hijazi et al; Int. J. Oncol. 13: 1061-1067, 1998; Chang et al; Nature 387: 509,-512, 1997; Carraway ef al; Nature 387: 512-516, 1997; Higashiyama et al; J Biochem. 122:675-680, 1997; y WO 97/09425). Véanse las figuras 9-14 para ver las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que corresponden a los dominios 1-6 de EGFL codificados por el gen NRG-1.

Por "anticuerpo anti-ErbB2" o "anticuerpo anti-HER2" se entiende un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular del receptor ErbB2 (conocido también como HER2 en humanos), y previene la transducción de señal dependiente de ErbB2 (HER2) iniciada por la unión con la neurorregulina.

Por "célula transformada" se entiende una célula (o un descendiente de una célula) en la que se ha introducido una molécula de ADN que codifica una neurorregulina o péptido que tiene un dominio semejante a EGF de neurorregulina, por medio de técnicas de ADN recombinante o técnicas conocidas de terapia génica.

Por "promotor" se entiende una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. También se incluyen en la invención aquellos elementos promotores que son suficientes para hacer controlable la expresión del gen dependiente de promotor, basándose en el tipo de célula o estado fisiológico (por ejemplo condiciones hipóxicas contra normóxicas), o inducible por señales o agentes externos; tales elementos se pueden localizar en las regiones 5' o 3' o internas del gen nativo.

Por "enlazado operativamente" se entiende que un ácido nucleico que codifica un péptido (por ejemplo un ADNc) y una o más secuencias reguladoras, están unidos de tal manera que permiten la expresión del gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo proteínas activadoras de transcripción) se unen a las secuencias reguladoras.

Por "vector de expresión" se entiende un plásmido o virus construido por ingeniería genética, derivado por ejemplo de un bacteriófago, adenovirus, retrovirus, poxvirus, herpesvirus, o cromosoma artificial, que se usa para transferir una secuencia codificadora de péptido (por ejemplo una neurorregulina), enlazada operativamente a un promotor, a una célula hospedera, de tal manera que el péptido o el péptido codificado es expresado dentro de la célula hospedera.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados entendidos comúnmente por el experto en el campo al que pertenece esta invención.

La exposición de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos y similares se incluye en esta especificación únicamente con la finalidad de proveer un contexto para la presente invención. No se sugiere ni se representa que cualquiera o todas estas materias formen parte de la base de la técnica anterior, o que fueron conocimiento general común en el campo relevante de la presente invención antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

Otras modalidades Aunque la invención se ha descrito con respecto a modalidades específicas de la misma, se entenderá que es susceptible de modificaciones adicionales; esta solicitud pretende cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención que sigue en general los principios de la invención, e incluye tales desviaciones dentro del conocimiento o práctica habitual del campo al que pertenece la invención, y se pueden aplicar a las características esenciales anteriormente indicadas, y siguen el alcance de las reivindicaciones anexas.

Los siguientes ejemplos ayudarán a los expertos en la materia a entender mejor la invención y sus principios y ventajas. Se considera que estos ejemplos son ilustrativos de la invención y no limitan su alcance.

EJEMPLOS Como se indicó arriba, las neurorregulinas son una familia de factores de crecimiento relacionados estructuralmente con el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y son esenciales para el desarrollo normal del corazón. La evidencia sugiere que las neurorregulinas son una posible terapia para el tratamiento de enfermedades del corazón que incluyen falla cardiaca, infarto del miocardio, toxicidad quimioterapéutica y miocarditis viral.

Los estudios aquí descritos sirvieron para definir la dosificación en el modelo de ligación de la arteria anterior izquierda descendente (LAD) de falla congestiva cardiaca en la rata. Se clonaron y produjeron múltiples variantes de empalme de la neurorregulina. Se comparó un fragmento de neurorregulina que consiste en el dominio semejante a EGF (EGF-ld) de reportes previos (Liu et al., 2006), con una neurorregulina de longitud completa conocida como factor de crecimiento glial 2 (GGF2), y el dominio semejante a EGF con el dominio de Ig (EGF-lg). Ratas Sprague-Dawley machos y hembras se sometieron a ligación de la arteria LAD. Siete días después de la ligación, las ratas se trataron diariamente por vía intravenosa (i.v.) con neurorregulina. La función cardiaca se monitoreó por ecocardiog rafia.

El primer estudio comparó 10 días de dosificación con cantidades equimolares de EGF-ld o GGF2 (para GGF2 estas se calculan a 0.0625 mg/kg y 0.325 mg/kg). El tratamiento con GGF2 mejoró significativamente la fracción de expulsión (EF) (p<0.05) y resultó en un acortamiento fraccional (FS) mayor que con EGF-ld al final del periodo de dosificación. El segundo estudio comparó 20 días de GGF2 con EGF-ld y EGF-lg a concentraciones equimolares. El tratamiento con GGF2 mejoró significativamente EF, FS y LVESD (p<0.01). Los mejoramientos de la fisiología cardiaca no se mantuvieron durante este periodo ni con EGF-ld ni con EGF-lg. El tercer estudio comparó la dosificación diaria (c/24 h), cada tercer día (c/48 h), y cada cuatro días (c/96 h) durante 20 días con GGF2 (3.25 mg/kg). Los tres regímenes de tratamiento con GGF2 mejoraron significativamente la fisiología cardiaca incluso EF, ESV y EDV, y los efectos se mantuvieron durante 10 días después de terminar la dosificación. Los estudios aquí presentados confirman a GGF2 como el compuesto de neurorregulina guía y establecieron regímenes de dosificación óptimos para administrarla.

Como se muestra aquí, los presentes estudios establecieron la eficacia relativa de GGF2 en comparación con los fragmentos de neurorregulina publicados (Liu er a/., 2006), iniciaron los estudios de escalas y frecuencias de las dosis y determinaron si el excipiente BSA se requiere como se reportó previamente.

Materiales y métodos Clonación, expresión y purificación del dominio IgEGF (lg154Y) del ADN de GGF2 (EGF-lg): El dominio de IgEGF se amplificó de un ADNc de GGF2 existente, y se clonó en el vector pet15b (Novagen No. cat.69661-3) usando sitios de restricción Ndel y BamHI. La proteína resultante es una His tag de 21.89 kDa + ~3kDa (= - 25 kDa).

Secuencia del ADN del clon IgEgf pet 15: Las secuencias subrayadas son los iniciadores usados para la amplificación. Las secuencias en negrita son los sitios de clonación usados para insertar la secuencia en el vector pet (Ndel y BamHI).

CATATGttqcctccccaattgaaagagatgaaaagccaggaatcggctgcaggttccaaa L P P Q L K E M K S Q E S A A G S K ctagtccttcggtgtgaaaccagttctgaatactcctctctcagattcaagtggttcaag L V L R C E T S S E Y S S L F K W F K aatgggaatgaattgaatcgaaaaaacaaaccacaaaatatcaagatacaaaaaaagcca N G N E L N R K N K P Q N I K I Q K K P gggaagtcagaacttcgcattaacaaagcatcactggctgattctggagagtatatgtgc G K S E L R I N K A S L A D S G E Y M C aaagtgatcagcaaattaggaaatgacagtgcctctgccaatatcaccatcgtggaatca K V I S K L G N D S A S A N I T I V E S aacgctacatctacatccaccactgggacaagccatcttgtaaaatgtgcggagaaggag N A T S T S T T G T S H L V K C A E K E aaaactttctgtgtgaatggaggggagtgcttcatggtgaaagacctttcaaacccctcg K T F C V N G G E C F M V K D L S N P S agatacttgtgcaagtgcccaaatgagt tactggtgatcgctgccaaaactacgtaatg R Y L C K C P N E F T G D R C Q N Y V M gccagcttctacGGATCC (SEQ ID NO: 15) A S F Y (SEQ ID NO: 16) Abajo se muestra la proteína traducida final del vector pet15b. La porción de vector está subrayada.

M G G S H H H H H H G M A S M T G G T A N G V G D L Y D D D D K V P G S L P P Q L K E M K S Q E S A A G S K L V L R C E T S S E Y S S L R F K W F K N G N E L N R K N K P Q N I K I Q K K P G K S E L R I N K A S L A D s G E Y M C K V I S K L E N D s A s A N I T I V E S N A T S T s T T G T S H L V K C A E K E K T F C V N G G E c F M V K D L S N P S R Y L c K C P N E F T G D R C Q N Y V M A s F Y (SEQ ID NO: 17) Expresión de la proteína: El clon se transformó en células B121 para la expresión de la proteína usando el sistema de autoinducción Overnight Express Autoinduction System (Novagen) en medio LB a 25°C durante 24 horas.

Repliegue de la proteína: Adaptado del kit de repliegue de proteína Novagen Protein Refolding, 70123-3.

Purificación de la proteína: Columnas de His TRAP- según las instrucciones del fabricante.

Western blotting: La expresión de la proteína se determinó por medio de Western blotting. La banda resultante con la His tag corre a alrededor de 25 kD.

Se usó un criterio de gel 4-20 % (Biorad) para la resolución de la proteína, seguido por transferencia a un papel de nitrocelulosa Protran (tamaño de poro 0.1 µ??, de Schliecher and Schull). El blot se bloqueó en leche al 5% en TBS-T (0.1 %). Anticuerpo primario (Ab policlonal anti-EGF Humano NRG1-alfa/HRG1-alfa purificado por afinidad, No. cat. AF-296-NA de R&D Systems), dilución 1 :1000 en leche al 5% en TBS-T, 1 hora a t.a. (también funciona a 4°C durante la noche). Se usó anticuerpo secundario anti-HRP de cabra de conejo a dilución 1 :10,000 en leche al 5% en TBS-T, 1 hora a t.a. Todos los lavados se hicieron en TBS-T.

Protocolo de purificación para lg154Y: Los cultivos se desarrollaron a 25 °C en el sistema de autoinducción Overnight Express Autoinduction System 1 de Novagen (cat. No. 71300-4). El cultivo se centrifugó y las pellas se extrajeron, se solubilizaron y se volvieron a plegar para adquirir la lg154Y antes de que ocurriera la purificación.

Materiales para la extracción, solubilización v repliegue Amortiguador de lavado 10X: 200 mM de Tris-HCI, pH 7.5, 100 mM de EDTA, 10% de Tritón X-100 Amortiguador de solubilización 10X: 500 mM de CAPS, pH 1 1.0 Amortiguador de diálisis 50X: 1 M de Tris-HCI, pH 8.5 N-laurilsarcosina 30%- Agregar como polvo (Sigma 61739-5G) DTT 1 M Glutatión reducido (Novagen 3541) Glutatión oxidado (Novagen 3542) A. Lisis celular y preparación de cuerpos de inclusión -Las pellas celulares se descongelaron y se resuspendieron en 30 mi de amortiguador de lavado 1X.

-Se agregaron a la suspensión inhibidores de proteasa (25 ul de 10 X por 50 mi), DNasa (200 ul de 1 mg/ml por 50 mi) y MgCI2 (500 ul de 1 M por 50 mi).

-Las células se lisaron por medio de sonicación enfriando sobre hielo.

-Después de la sonicación los cuerpos de inclusión se recogieron por centrifugación a 10000 xg durante 12 minutos.

-El sobrenadante se retiró y la pella se resuspendió muy bien en 30 mi de amortiguador de lavado 1X.

-El paso 4 se repitió.

-La pella se resuspendió muy bien en 30 mi de amortiguador de lavado 1X.

-Los cuerpos de inclusión se recogieron por centrifugación a 10000 x g durante 10 minutos.

B. Solubilización y repliegue -Del peso húmedo de los cuerpos de inclusión por procesar, se calculó la cantidad de amortiguador de solubilización 1X necesario para resuspender los cuerpos de inclusión a una concentración de 10-15 mg/ml. Si el volumen calculado era mayor de 250 mi, se utilizaron 250 mi.

-A temperatura ambiente, se preparó el volumen calculado de amortiguador de solubilización 1X complementado con 0.3% de N-laurilsarcosina (se puede usar hasta 2% si se requiere para mayor optimización) (300 mg/100 mi de amortiguador) y 1 mM DTT.

-La cantidad calculada de amortiguador de solubilización 1X del paso 2 se agregó a los cuerpos de inclusión y se mezcló suavemente. Los desechos grandes se pueden romper por pipeteo repetido.

-Se incubó en un incubador-agitador-refrigerador a 25 °C, 50-100 rpm durante 4-5 horas (o más si era necesario para optimización adicional).

-Se clarificó por centrifugación a 10000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.

-El sobrenadante que contenía la proteína soluble se transfirió a un tubo limpio.

C. Protocolo de diálisis para el repliegue de la proteína -Se preparó el volumen requerido de amortiguador para la diálisis de la proteína solubilizada. La diálisis se debe hacer con al menos 2 cambios de amortiguador de más de 50 veces el volumen de la muestra. Se diluyó el amortiguador de diálisis 50X a 1X al volumen deseado y se complementó con 0.1 mM de DTT.

-Se dializó durante por lo menos 4 horas a 4 °C. Se cambió el amortiguador y se continuó. Se dializó 4 horas adicionales o más.

-Se preparó amortiguador de diálisis adicional como se indica en el paso 1 , pero omitiendo el DTT.

-Se continuó la diálisis por dos cambios adicionales (minutos 4 horas cada uno) con el amortiguador de diálisis que carece de DTT.

D. Amortiguador redox de repliegue para promover la formación de enlace disulfuro -Se preparó un amortiguador de diálisis que contenía 1 mM de glutatión reducido (1.2 g /4 I) y 0.2 mM de glutatión oxidado (0.48 g /4 I) en amortiguador de diálisis 1X. El volumen debe ser 25 veces mayor que el volumen de la muestra de proteína solubilizada. Se enfrió a 4 °C.

-La proteína replegada del paso 1 se dializó durante la noche a 4 °C.

Materiales para la purificación Todos los procedimientos se hicieron a 4 °C.

Reactivos químicos: Trizma clorhidrato (Sigma T5941-500G) Solución de cloruro de sodio 5M (Sigma S6546-4L) Hidróxido de sodio 10N (JT Baker 5674-02) Imidazol (JT Baker N811-06) A. Purificación sobre la columna HISPrep FF 16/10 -20 mi (GE Healthcare) Amortiguador A: 20 mM de Tris-HCI + 500 mM de NaCI, pH 7.5 Amortiguador B: Amortiguador A + 500 mM de imidazol, pH 7.5 Equilibrio de la columna: Amortiguador A- 5 vol. col., Amortiguador B- 5 vol. col., Amortiguador A- 10 vol. col.

Se cargaron 20 mi de muestra por corrida sobre 20 mi de columna a 0.5 ml/min La columna se lavó con 5 vol. col. de amortiguador A La columna se eluyó con 5 vol. col. de 280 mM de imidazol.

Se lavó con 10 vol. col. del amortiguador B 100% Se equilibró con 15 vol. col. del amortiguador A.

Las fracciones se analizaron por tinción de plata de SDS-PAGE.

Las fracciones con lg154Y se reunieron.

B. Remoción de la His-Tag La remoción de la His-Tag se hizo con el kit Thrombin Cleavage Capture de Novagen (No. cat. 69022-3). Basándose en las pruebas previas, las mejores condiciones son a temperatura ambiente durante 4 horas con trombina a 0.005 U de enzima por µ?, por cada 10 pg de proteína lgl54Y. Después de 4 h de incubación se agregaron 16µ? de suspensión de estreptavidina agarosa por unidad de enzima trombina. Se agitó la muestra 30 minutos a temperatura ambiente. La lgl54Y se recuperó por centrifugación-filtración o esterilización por filtración (dependiendo del volumen). Se determinó corte completo por medio de EGF y Western blotting anti-His.

C. Concentración de lq154Y Se ajustó a la concentración deseada con 15 mi de concentrador Centriprep 3000 MWCO de Millipore (Ultracel YM-3, 4320).

D. Almacenamiento en el amortiguador final Se guardó en 20 mM de Tris + 500 mM de NaCI, pH 7.5, y PBS 1X + 0.2% de BSA.

Clonación, expresión y purificación de 156Q (EGF-ld) [dominio de EGF NRG1 b2 (156Q)1 ADN: El dominio NRG1 b2 egf se clonó de ADNc de cerebro humano y se clonó en el vector pet15b (Novagen No. cat. 69661 -3) usando los sitios de restricción Ndel y BamHI. La proteína resultante es una His tag de 6.92 kDa + ~3kDa (= 9.35 kDa).

Secuencia de ADN del clon NRG1 b2 egf pet15: Las secuencias subrayadas son los sitios de la clonación (Ndel y BamHI): CATATGAGCCA TCTTGTAAAA TGTGCGGAGA AGGAGAAAAC TTTCTGTGTG AA GGAGGGG AGTGCTTCAT GGTGAAAGAC CTTTCAAACC CCTCGAGATA CTTGTGCAAG TGCCCAAATG AGTTTACTGG TGATCGCTGC CAAAACTACG TAATGGCCAG CTTCTACAAG GCGGAGGAGC TGTACCAGTA AGGATCC (SEQ ID NO 18) Abajo se muestra la proteína traducida final del vector pet15b. El dominio egf se destaca en verde. 10 20 30 MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MSHLVKCAEK EKTFCVNGGE CFMVKDLSNP 60 70 80 SRYLCKCPNE FTGDRCQNYV MASFYKAEEL YQ (SEQ ID NO : 19) pl/Mw calculado: 7.69 / 9349.58 Expresión de la proteína El clon se transformó en células B121 para la expresión de la proteína usando el sistema de autoinducción Overnight Express Autoinduction System (Novagen) en medio LB a 25°C durante 24 horas. La expresión es principalmente en cuerpos de inclusión ¡nsolubles.

Repliegue de la proteína: Adaptado del kit de repliegue de proteína Novagen Protein Refolding kit, 70123-3.

Purificación de la proteína: La proteína se cargó en una columna de intercambio aniónico DEAE a 2.5 ml/min. El fragmento EGF-ld permaneció en el flujo continuo, mientras que los contaminantes se unieron y se eluyeron a una concentración de sal más alta. El amortiguador de carga y lavado fue Tris 500 mM, pH 7.9, y el amortiguador de elución fue Tris 50 mM, pH 7.9, con NaCI 1 M. El flujo continuo se reunió y se concentró con Centriprep YM-3 de Millipore.

Western blotting: La expresión de la proteína se determinó por medio de Western blotting. La banda resultante corre a alrededor de 10 kD.

Se usó un criterio de gel 4-20 % (Biorad) para la resolución de la proteína, seguido por transferencia a un papel de nitrocelulosa Protran (tamaño de poro 0.1 µ??, de Schliecher and Schull). El blot se bloqueó en leche al 5% en TBS-T (0.1 %). Anticuerpo primario (Ab policlonal anti-EGF Humano NRG1-alfa/HRG1-alfa purificado por afinidad, No. cat. AF-296-NA de R&D Systems), dilución 1 :1000 en leche al 5% en TBS-T, 1 hora a t.a. (también funciona a 4°C durante la noche). Se usó anticuerpo secundario anti-HRP de cabra de conejo a una dilución 1 :10,000 en leche al 5% en TBS-T, 1 hora a t.a. Todos los lavados se hicieron en TBS-T.

Protocolo de purificación para NRG-156Q Los cultivos se desarrollaron a 25 °C en el sistema de autoinducción Overnight Express Autoinduction System 1 de Novagen (cat. No. 71300-4). Hubo muy poco NRG-156Q (EGF-Id) soluble presente. El cultivo se centrifugó y las pellas se extrajeron, se solubilizaron y se volvieron a plegar para adquirir la NRG-156Q antes de que ocurriera la purificación.

Materiales para la extracción, solubilización y repliegue Amortiguador de lavado 10X: 200mM de Tris-HCI, pH 7.5, 100 mM de EDTA, 10% Tritón X-100 Amortiguador de solubilización 10X: 500 mM de CAPS, pH 11.0 Amortiguador de diálisis 50X: 1 M de Tris-HCI, pH 8.5 N-laurilsarcosina 30%- Agregar como polvo (Sigma 61739-5G) DTT 1 M Glutatión reducido (Novagen 3541 ) Glutatión oxidado (Novagen 3542) A. Lisis celular v preparación de cuerpos de inclusión -Las pellas celulares se descongelaron y se resuspendieron en 30 mi de amortiguador de lavado 1X. Se mezcló conforme fue necesario para una resuspensión completa.

-Se agregaron a la suspensión inhibidores de proteasa (25 ul de 10 X por 50 mi), DNasa (200 ul de 1 mg/ml por 50 mi) y MgCI2 (500 ul de 1 M por 50 mi).

-Las células se lisaron por medio de sonicación. a. Enfriar las células sobre hielo durante todo este paso. b. Usando la punta cuadrada, aplicar sonicación 30 segundos al nivel 6, 10 veces hasta que la suspensión se haga menos viscosa; dejar enfriar la suspensión sobre hielo durante 60 segundos entre cada sonicación; mantener el volumen a no más de 40 mi en un tubo cónico de 50 mi cuando se somete a sonicación.

-Cuando se completó, cada suspensión se transfirió a botellas de centrífuga de cuello angular de 250 mi para usarse con el rotor F-16/250.

-Los cuerpos de inclusión se recogieron por centrifugación a 10,000 x g durante 12 minutos.

-El sobrenadante se retiró (se guardó una muestra para análisis de la proteína soluble) y la pella se resuspendió muy bien en 30 mi de amortiguador de lavado 1X.

-Se repitió la centrifugación como en el paso 4 y se guardó la pella.

-Nuevamente, la pella se resuspendió muy bien en 30 mi de amortiguador de lavado 1X.

-Los cuerpos de inclusión se recogieron por centrifugación a 10,000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó y los últimos rastros de líquido se removieron golpeando ligeramente el tubo invertido sobre una toalla de papel.

B. Solubilízación y repliegue -Del peso húmedo de los cuerpos de inclusión por procesar, se calculó la cantidad de amortiguador de solubilízación 1X necesario para resuspender los cuerpos de inclusión a una concentración de 10-15 mg/ml. Si el volumen calculado era mayor de 250 mi, se utilizaron 250 mi.

-A temperatura ambiente, se preparó el volumen calculado de amortiguador de solubilízación 1X complementado con 0.3% de N-laurilsarcosina (se puede usar hasta 2% si se requiere para mayor optimización) (300 mg/100 mi de amortiguador) y 1 mM de DTT.

-La cantidad calculada de amortiguador de solubilízación 1X del paso 2 se agregó a los cuerpos de inclusión y se mezcló suavemente. Los desechos grandes se pueden romper por pipeteo repetido.

-Se incubó en un incubador-agitador-refrígerador a 25 °C, 50-100 rpm durante 4-5 horas.

-Se clarificó por centrifugación a 10,000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.

C. Protocolo de diálisis para el repliegue de la proteína -Se preparó el volumen requerido de amortiguador para la diálisis de la proteína solubilizada. La diálisis se debe hacer con al menos 2 cambios de amortiguador de más de 50 veces el volumen de la muestra.

-Se diluyó el amortiguador de diálisis 50X a 1X al volumen deseado y se complementó con 0.1 mM de DTT.

-Se dializó durante por lo menos 4 horas a 4 °C. Se cambió el amortiguador y se continuó. Se dializó 4 horas adicionales o más.

-Se preparó amortiguador de diálisis adicional como se indica en el paso 1 , pero omitiendo el DTT.

-Se continuó la diálisis por dos cambios adicionales (minutos 4 horas cada uno) con el amortiguador de diálisis que carece de DTT.

D. Amortiguador redox de repliegue para promover la formación de enlace disulfuro -Se preparó un amortiguador de diálisis que contenía 1 mM de glutatión reducido (1 .2 g 14 I) y 0.2 mM de glutatión oxidado (0.48 g /4 I) en amortiguador de diálisis 1 X. El volumen debe ser 25 veces mayor que el volumen de la muestra de proteína solubilizada. Se enfrió a 4 °C.

-La proteína replegada del paso 1 se dializó durante la noche a 4 °C.

Materiales para la purificación Todos los procedimientos se hicieron a 4 °C.

Reactivos químicos: Trizma clorhidrato (Sigma T5941 -500G) Solución de cloruro de sodio 5M (Sigma S6546-4L) Hidróxido de sodio 10N (JT Baker 5674-02) E. Purificación sobre la columna aníónica DEAE HiPrep 16/10 -20 mi (GE Healthcare) Amortiguador A: 50 mM de Tris-HCI, pH 8.0 Amortiguador B: 50 mM de Tris-HCI con 1 M de NaCI, pH 8.0 Equilibrio de la columna: Amortiguador A- 5 vol. col., Amortiguador B- 5 vol. col., Amortiguador A- 10 vol. col.

-Se cargaron 50 mi de muestra por corrida sobre 20 mi de columna a 2.0 ml/min (el NRG-156 (EGF-ld) está en el flujo continuo).

-La columna de 20 mi se lavó con 5 vol. col. de amortiguador A. La columna de 20 mi se eluyó con un gradiente a 100% de B con 5 vol. col. Esto es para eluir los contaminantes.

-Se lavó con 10 vol. col. del amortiguador B 100%.

-Se equilibró con 15 vol. col. del amortiguador A.

-Las fracciones se analizaron por tinción de plata de SDS-PAGE. -Las fracciones con NRG-156Q (1 OkDa) se reunieron.

F. Concentración de NRG-156 (EGF-ld) -Se concentró con 15 mi de concentrador Centriprep 3000 MWCO de Millipore (Ultracel YM-3, 4320).

-Se usó una prueba de proteína de Lowry modificada para determinar la concentración.

G. Remoción de la His-Tag La remoción de la His-Tag se hizo con el kit Thrombin Cleavage Capture de Novagen (No. cat. 69022-3). Basándose en las pruebas previas, las mejores condiciones son a temperatura ambiente durante 4 horas con trombina a 0.005 U de enzima por µ?, por cada 10 pg de proteína NRG-156Q (EGF-ld). Después de 4 h de incubación se agregaron 16 µ? de suspensión de estreptavidina agarosa por unidad de enzima trombina. Se agitó la muestra 30 minutos a temperatura ambiente. La NRG-156Q se recuperó por centrifugación-filtración o esterilización por filtración (dependiendo del volumen). Se determinó corte completo por medio de EGF y Western anti-His.

H. Almacenamiento en el amortiguador final Se guardó en PBS 1X con 0.2% de BSA a 4 °C.

Expresión y purificación de GGF2 Para la clonación e información de apoyo sobre GGF2, véase el documento USPN 5,530,109. La línea de células se describe en USPN 6,051 ,401. El contenido completo de USPN 5,530,109 y USPN 6,051 ,401 se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Línea de células CHO-(Alfa2HSG)-GGF: Esta línea de células se diseñó para producir cantidades suficientes de fetuin (alfa2HSG humana) para sostener tasas de producción altas de rhGGF2 en condiciones libres de suero.

Las células Cho(dhfr-) se transfectaron con el vector de expresión pSV-AHSG. Las células estables se desarrollaron bajo selección por ampicilina. La línea celular se denominó (dhfr7a2HSGP). Las células dhfr'/a2HSGP se transfectaron entonces con el vector pCMGGF2 que contenía la secuencia codificadora de GGF2 humana, usando el reactivo de lípido catiónico DMRIE-C (Life Technologies No.10459-014).

Se derivaron líneas celulares estables y de alta producción de acuerdo con los protocolos normales, usando metotrexate (100 nM, 200 nM, 400 nM, 1 µ?), a intervalos de 4-6 semanas. Las células se ablactaron gradualmente del medio que contenía suero. Los clones se aislaron por medio de métodos normales de dilución limitativa. Los detalles de los requerimientos de medio se encuentran en los reportes arriba mencionados.

Para mejorar la transcripción, la secuencia codificadora de GGF2 se puso después de la secuencia intermedia (MIS) de EBV BMLF-1.

Secuencia MIS (SEQ ID NO: 20): CGAT [AACTAGCAGCATTTCCTCCAACGAGGATCCCGCAG ( GTAAGAAGCTACACCGGCCAGTGGCCGGGGCC CGATAACTAGCAGCATTTCCTCCAACGAGGATCCCGCAG ( GTAAGAAGCTACACCGGCC AGTGGCCGGGGCC GTGGAGCCGGGGGCATCCGGTGCCTGAGACAGAGGTGCTCAAGGCAGTCTCCACCTTTT GTCTCCCCTCTGCAG ) AGAGCCACATTCTGGAA] GTT Secuencia codificadora de GGF2 (SEQ ID NO: 1 ): atgagatgg cgacgcgccc cgcgccgctc cgggcgtccc 301 ggcccccggg cccagcgccc cggctccgcc gcccgctcgt cgccgccgct gccgctgctg 361 ccactactgc tgctgctggg gaccgcggcc ctggcgccgg gggcggcggc cggcaacgag 421 gcggctcccg cgggggcctc ggtgtgctac tcgtccccgc ccagcgtggg atcggtgcag 481 gagctagctc agcgcgccgc ggtggtgatc gagggaaagg tgcacccgca gcggcggcag 541 cagggggcac tcgacaggaa ggcggcggcg gcggcgggcg aggcaggggc gtggggcggc 601 gatcgcgagc cgccagccgc gggcccacgg gcgctggggc cgcccgccga ggagccgctg 661 ctcgccgcca acgggaccgt gccctcttgg cccaccgccc cggtgcccag cgccggcgag 721 cccggggagg aggcgcccta tctggtgaag gtgcaccagg tgtgggcggt gaaagccggg 781 ggcttgaaga aggactcgct gctcaccgtg cgcctgggga cctggggcca ccccgccttc 841 ccctcctgcg ggaggctcaa ggaggacagc aggtacatct tcttcatgga gcccgacgcc 901 aacagcacca gccgcgcgcc ggccgccttc cgagcctctt tcccccctct ggagacgggc 961 cggaacctca agaaggaggt cagccgggtg ctgtgcaagc ggtgcgcctt gcctccccaa 1021 ttgaaagaga tgaaaagcca ggaatcggct gcaggttcca aactagtcct tcggtgtgaa 1081 accagttctg aatactcctc tctcagattc aagtggttca agaatgggaa tgaattgaat 1141 cgaaaaaaca aaccacaaaa tatcaagata caaaaaaagc cagggaagtc agaacttcgc 1201 attaacaaag catcactggc tgattctgga gagtatatgt gcaaagtgat cagcaaatta 1261 ggaaatgaca gtgcctctgc caatatcacc atcgtggaat caaacgctac atctacatcc 1321 accactggga caagccatct tgtaaaatgt gcggagaagg agaaaacttt ctgtgtgaat 1381 ggaggggagt gcttcatggt gaaagacctt tcaaacccct cgagatactt gtgcaagtgc 1441 ccaaatgagt ttactggtga tcgctgccaa aactacgtaa tggccagctt ctacagtacg 1501 tccactccct ttctgtctct gcctgaatag Secuencia de la proteína GGF2 (SEQ ID NO: 2): MRWRRAPRRSGRPGPRAQRPGSAARSSPPLPLLPLLLLLGTAAL APGAAAGNEAAPAGASVCYSSPPSVGSVQELAQRAAVVIEGKVHPQRRQQGALDRKAA AAAGEAGA GGDREPPAAGPRALGPPAEEPLLAANGTVPSWPTÁPVPSAGEPGEEAPY LVKVHQVWAVíAGGL DSLLTVRLGTWGHPAFPSCGRLKEDSRYIFFMEPDANSTSR APAAFRASFPPLETGRNLKKEVSRVLCKRCALPPQLKE KSQESAAGSKLVLRCETSS EYSSLRFKWFKNGNELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLG NDSASANITIVESNATSTSTTGTSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCK CPNEFTGDRCQNYVMASFYSTSTPFLSLPE Producción de GGF2: La GGF2 en un frasco a 2.2 X106 células/ml se descongeló en 100 mi de medio Acorda 1 (véase el cuadro 3) y se expandió hasta alcanzar cantidades suficientes para sembrar recipientes de producción. Las células se inocularon en el medio de producción Acorda 2 (véase el cuadro 4) a 1.0 X 105 células/ml en botellas de rotación ventiladas de dos litros. Las botellas de rotación se mantuvieron a 37 °C durante 5 días y después a 27 °C durante 26 días. Las botellas de rotación se monitorearon para contar las células y ver la apariencia general pero no se les alimenta. Una vez que la viabilidad era menor de 10%, las células se centrifugaron y el medio acondicionado se cosechó y se esterilizó por filtración.

CUADRO 3 Medio 1 Artículo Vendedor No. catálogo Concentración final CD-CHO Invitrogen 10743-029 -retirar 50 mi, después agregar los componentes de abajo FeS04-EDTA Sigma F-0518 1x (10 ml/l) L-Glutamina Cellgro 25-005-CI 4 mM (20 ml/l) Insulina humana Sigma I-9278 290 U/l (1 ml/l) recombinante Aminoácido no Cellgro 25-025-CI 1x (10 ml/l) esencial Peptona tipo 4 Sigma P0521 Polvo- Se pone 20X en CD-CHO (50 ml/l) Soya HySoy Gentamicina Invitrogen 15750-078 100 pg (2 ml/l) CUADRO 4 Medio 2 Protocolo de purificación para GGF2 Todos los procedimientos se hicieron a 4 °C.

Reactivos químicos: Acetato de sodio Acido acético glacial (para ajuste del pH) NaOH 0N (para ajuste del pH) NaCI Sulfato de sodio L-Arginina (No. cat. JT Baker 2066-06) Manitol (No. cat. JT Baker 2553-01) Material inicial: Sobrenadante del medio acondicionado. El pH justó a 6.5.

Paso 1 : Captura- Cromatografía de intercambio catiónico HiPrep SP 16/10 (Amersham Biosciences) Equilibrio de la columna: Amortiguador A amortiguador B - 5 vol. col., amortiguador B 15%- 5 vol. col.

Amortiguador A: 20 mM de acetato de Na, pH 6.0 Amortiguador B: 20 mM de acetato de Na, pH 6.0, 1 M de NaCI La muestra se cargó a 2 ml/min con una carga continua durante la noche cuando fue posible. La unión es mejor con carga continua.

Capacidad máxima para una muestra inicial: 5 mg de GGF2 /mi de medio Velocidad de flujo: 3 ml/min Primer lavado: 15% B, 10 vol. col.

Segundo lavado: 35% B, 10 vol. col.

Elución de GGF2: 60% B, 8 vol. col.

Lavado de columna: 100% B, 8 vol. col.

Amortiguadores: Composición Conductivdad Uso 15%B 20 mM Acetato Na, pH 6.0, 150 mM NaCI Preequilibrio Primer lavado 35%B 20 mM Acetato Na, pH 6.0, 350 mM NaCI Segundo lavado 60%B 20 mM Acetato Na, pH 6.0, 600 mM NaCI Elución de GGF2 100%B 20 mM Acetato Na, pH 6.0, 1000 mM NaCI 88 mS/cm Lavado de columna Paso 2: Refinación- Cromatografía de filtración en gel Sephacryl S200 26/60 Amortiguador de elución: 20 mM de acetato de Na, 100 mM de sulfato de sodio, 1 % de manitol, 10 mM de L-arginina, pH 6.5 Conductividad del amortiguador: Muestra: Elución del GGF2 SP reunido, concentrado hasta ~ AU280 1.0 Velocidad de flujo: 1.3 ml/min Elución pico: a ~0.36 vol. col. desde el comienzo de la inyección Paso 3: Remoción de ADN y endotoxina- filtración a través de una membrana Intercept Q.

Amortiguador de preequilibrio: 20 mM de acetato de Na, 100 mM de sulfato de sodio, 1 % de manitol, 10 mM de L-arginina, pH 6.5.

Se recogió el flujo continuo.

Paso 4: Formulación final y preparación de la muestra Se agregaron 90 mM adicionales de L-arginina a la muestra.

Se concentró.

Se esterilizó por filtración.

El vehículo/artículo de control usado aquí fue albúmina de suero bovino (BSA) 0.2%, 0.1 M de fosfato de sodio, pH 7.6.

Se usaron las razas de rata CD®IGS [Crl:CD®(SD)/MYOINFARCT] y Sprague Dawley intactas. Estas razas se obtuvieron de Charles River Laboratories. Los animales de prueba eran de aproximadamente 6-7 semanas de edad al llegar y pesaron aproximadamente 160 - 200 g al momento del procedimiento quirúrgico. La escala real puede variar y se documenta en los datos.

Todos los animales Sprague Dawley intactos recibidos se estudiaron y se asignaron al grupo 1. Los animales considerados adecuados para el estudio se pesaron antes del tratamiento.

Todos los animales CD®IGS [Crl:CD®(SD)/MYOINFARCT] recibidos se aleatorizaron en grupos de tratamiento (grupos 2-5), usando un procedimiento simple de aleatorización basado en la fracción de expulsión calculada de exámenes ecocardiográficos realizados el día 7 después del procedimiento quirúrgico, realizado en los laboratorios Charles River Laboratories. La aleatorización simple se hizo para obtener en cada grupo de tratamiento (grupos 2-5) que consiste en números aplicables de animales, una fracción de expulsión media de grupo aproximadamente igual (±3%) entre los grupos 2-5.

Todos los animales de los grupos 2-6 se aclimataron en los Charles River Laboratories de acuerdo con los procedimientos estándares de operación de ese laboratorio. Subsiguientemente los animales se aleatorizaron en los grupos de tratamiento. Todos los animales intactos del grupo 1 se aclimataron durante aproximadamente 24 horas después de recibidos y antes de sus exámenes ecocardiográficos primarios.

Los animales se alojaron individualmente en jaulas suspendidas de tipo malla de alambre de acero inoxidable; en general no se usaron jaulas de fondo sólido porque los roedores son coprofágicos y la ingestión de heces que contienen el artículo de prueba y productos metabólicos excretados o la ingestión del lecho mismo puede confundir la interpretación de los resultados en este estudio de toxicidad.

Se suministró iluminación fluorescente por medio de un cronómetro automático durante aproximadamente 12 horas por día. En ocasiones, el ciclo de oscuridad se interrumpió intermitentemente debido a actividades relacionadas con el estudio. La temperatura y la humedad se monitorearon y registraron diariamente y se mantuvieron al máximo posible entre 17.8 °C y 26.1 °C, y 30% y 70%, respectivamente.

La dieta basal fue la dieta de bloque certificada de roedor Lab Diet® No. 5002, PMI Nutrition International, Inc. Esta dieta se puso disponible libremente a menos que se designara de otra manera. Cada número de lote usado fue identificado en los registros del estudio. Se suministró libremente agua de la llave a todos los animales por medio de un sistema automático de agua, a menos que se indique de otra manera.

DISEÑOS DEL ESTUDIO CUADRO 5 GGF2 contra el fragmento EGF-ld (Liu et al., 2006) dosificados durante 10 días empezando el día 7 después de LAD Grupo Tratamiento Duración en Dosis Intervalo de Puntos de vida dosificación! tiempo de ECO (post-op) 1 Control 17 días post- Vehículo solo 24 h Día 6, 17 (n = 5 M; n = 5 F) (Vehículo) op 2 GGF2 17 días post 0.0625 mg/kg 24 h Día 6, 17 (n = 6 M; n = 6 F) 3 GGF2 17 días post 0.625 mg/kg 24 h Día 6, 17 (n = 6 M; n = 6 F) 4 EGF-ld 17 días post Equimolar 24 h Día 6, 17 (n = 6 M; n = 7 F) 5 EGF-ld 17 días post Equimolar 24 h Día 6, 17 (n = 7 M; n = 6 F) CUADRO 6 Dosis más alta de GGF2 en comparación con EGF-ld y EGF-lg dosificados durante 20 días empezando el día 7 después de LAD y 10 días de depuración Puntos de Duración en Intervalo de Grupo Tratamiento Dosis vida dosificaciónt tiempo de ECO (post-op) N/A: Controles 1 30 días post tD\a 1 , 12, 22, y intactos NA NA (n = 5 M; n = 5 F) ECO primaria 32 igualados en edad 2 Control Vehículo *Día 7, 18, 28, y 38 días post-op 24 h (n = 6 M; n = 6 F) (Vehículo) solo 38 3 *Día 7, 18, 28, y GGF-2 38 días post-op 0.625 mg/kg 24 h (n = 6 M; n = 6 F) 38 4 *Día 7, 18, 28, y GGF-2 38 días post-op 3.25 mg/kg 24 h (n = 6 M; n = 7 F) 38 5 *Día 7, 18, 28, y EGF-1d 38 días post-op Equimolar 24 h (n = 7 M; n = 6 F) 38 6 *Día 7, 18, 28, y EGF-lg 38 días post-op Equimolar 24 h (n = 7 M; n = 6 F) 38 CUADRO 7 Frecuencia de la dosis de GGF2 - Artículo de prueba 1 ; M = machos; F= hembras CUADRO 8 GGF2 con v sin BSA Puntos de Duración en Grupo Tratamiento Dosis Intervalo de tiempo de vida dosificación! ECO (post-op) N/A: Controles 1 intactos 17 días post-op NA NA Día 6 y 17 (n = 5 M; n = 5 F) igualados en edad 2 Control Vehículo 17 días post 24 h Día 6 y 17 (n = 6 M; n = 6 F) (Vehículo) solo 3 GGF-2 + 17 días post 3.25 mg/kg 24 h Día 6 y 17 (n = 6 M; n = 6 F) BSA 4 GGF-2 sin 17 días post 3.25 mg/kg 24 h (n = 6 M; n = 7 F) BSA Día 6 y 17 Administración del artículo de prueba y control Vía de administración Los artículos de prueba y control se administraron mediante inyección intravenosa. Los animales asignados al grupo 1 no fueron tratados con vehículo ni artículos de prueba; estos animales sirvieron como controles sin tratamiento, igualados en edad. La frecuencia de administración, la duración y las dosis fueron como se describe en los cuadros 5-8. El volumen de las dosis fue de aproximadamente 1 mi por kg.

Administración del artículo de prueba Los artículos de prueba y control se administraron a través de la vena de la cola. Las dosis individuales se basaron en los pesos corporales más recientes. Las dosis se administraron por inyección de bolo, a menos que el patrocinador lo indicara de otra manera.

Preparación del sistema de prueba Procedimiento quirúrgico- Ligación de la arteria anterior izquierda descendente: Los procedimientos quirúrgicos se hicieron en los Charles River Laboratories como se describe en Charles River Laboratories Surgical Capabilities Reference Paper, Vol. 13, No.1 , 2005. Brevemente, se hace una incisión cráneo-caudal en el pecho, ligeramente a la izquierda del esternón, a través de la piel y los músculos pectorales. Se transeca la tercera y cuarta costilla y los músculos intercostales se disecan sin corte. Rápidamente se entra a la cavidad torácica y se abre completamente el pericardio. El corazón se exterioriza a través de la incisión. Se identifica el cono pulmonar y la aurícula izquierda. Se usa una aguja pequeña curva para pasar una pieza de sutura de seda 5-0 debajo de la arteria coronaria anterior izquierda descendente. La ligadura se ata y el corazón se vuelve a poner en el tórax. La cavidad torácica se aprieta suavemente para sacar el aire mientras se cierra la pared torácica y la incisión de la piel. El animal se resucita usando ventilación de presión positiva y se pone en un medio rico en oxígeno.

Recuperación postoperatoria Los Charles River Laboratories hicieron monitoreo postoperatorio a corto plazo y administración de analgésicos apropiados como se describe en Charles River Laboratories Surgical Capabilities Reference Paper, Vol. 13, No.1 , 2005.

Se hizo un monitoreo postoperatorio a largo plazo para determinar los signos de dolor o infección en los animales. Las observaciones diarias del sitio de incisión continuaron durante 7 días después de recibir los animales. Se administró terapia complementaria de manejo de dolor y antimicrobiana según fue necesario.

CUADRO 9 Medicamentos y dosificaciones programadas 5 * Día de procedimiento del ECO definido por la asignación del grupo de animales como se indica Q abaio Evaluaciones dé estudio antemórtem Observaciones en la jaula Todos los animales se observaron por lo menos dos veces al día 5 para determinar la morbilidad, mortalidad y disponibilidad de alimento y agua.

Cualquier animal con mala salud se designó para monitoreo adicional y posible eutanasia.

Pesos corporales Los pesos corporales se midieron y registraron por lo menos una 0 vez antes de la aleatorización y semanalmente durante el estudio.

Consumo de alimento El consumo de alimento no se midió pero se registró la inapetencia.

Exámenes ecocardiográficos Se hicieron exámenes ecocardiográficos en todos los animales asignados al grupo 1 los días 1 , 12, 22 y 32 posteriores a la recepción (día 0). Se hicieron exámenes ecocardiográficos en todos animales asignados a los grupos 2-5 los días 7, 18, 28 y 38 posteriores al procedimiento quirúrgico realizado en los Charles River Laboratories (día 0).

Para el examen ecocardiográfico, cada animal se anestesió de acuerdo con el cuadro 5 y se esquilaron desde el tórax. Se aplicó gel de acoplamiento al transductor ecocardiográfico y se obtuvieron imágenes para medir la función cardiaca en múltiples niveles. Se obtuvieron imágenes de cada animal en vista de eje corto (a nivel medio-papilar u otro, dependiendo de la localización del área de infarto observada por ecocardiografía).

Parámetros ecocardiográficos (ECO) Las imágenes ECO se tomaron a la altura del músculo medio-papilar u otro, dependiendo de la localización del área del infarto observada por ecocardiografía, del ventrículo izquierdo. Se registraron imágenes en modo M y 2-D y se guardaron en CD y/o MOD. Los parámetros de medición obtenidos con el ECO incluyen: grosor de la pared septal intraventricular (diástole), unidades = cm; grosor de la pared septal intraventricular (sístole), unidades = cm; dimensión interna ventricular izquierda (diástole); unidades = cm; dimensión interna ventricular izquierda (sístole), unidades = cm; grosor de la pared papilar ventricular izquierda (diástole), unidades = cm; grosor de la pared papilar ventricular izquierda (sístole), unidades = cm; volumen diastólico final, unidades = mi; volumen sistólico final, unidades = mi; fracción de expulsión, reportada como porcentaje; volumen latido, unidades = mi; y acortamiento fraccional, reportado como porcentaje.

Eutanasia Agonía Cualquier animal moribundo según la definición del Procedimiento Estándar de Operación de Instalaciones de Prueba se sometió a eutanasia por razones humanitarias. Todos los animales sometidos a eutanasia in extremis o encontrados muertos se sometieron a una necropsia rutinaria.

Método de eutanasia La eutanasia se hizo por medio de una inyección de solución saturada de cloruro de potasio en la vena cava, seguida por un método aprobado para asegurar la muerte, por ejemplo, exsanguinación.

Disposición final Todos los animales sobrevivientes estudiados se sometieron a eutanasia de acuerdo con la programación de su necropsia o, cuando fue necesario, se sometieron a eutanasia in extremis.

Resultados Estudio 1- El tratamiento de las ratas con GGF2 a 0.625 mg/kg i.v. c/24 h mejoró significativamente la función cardiaca como lo muestran aquí los cambios de la fracción de expulsión y el acortamiento fraccional. El fragmento EGF-ld no produjo el mismo grado de mejoramiento; véase el cuadro 5.

Estudio 2- El tratamiento de las ratas con GGF2 a 0.625 mg/kg y 3.25 mg/kg i.v. c/24 h mejoró significativamente la función cardiaca como lo muestran aquí los cambios de la fracción de expulsión y el acortamiento fraccional. También se observaron mejoramientos significativos en los volúmenes finales sistólico y diastólico durante el periodo de tratamiento; véase el cuadro 6.

Estudio 3- El tratamiento de las ratas con GGF2 a 3.25 mg/kg i.v. c/24 h, c/48 h o c/96 h mejoró significativamente la función cardiaca como lo muestran aquí los cambios de la fracción de expulsión y el acortamiento fraccional. También se observaron mejoramientos significativos en los volúmenes finales sistólico y diastólico durante el periodo de tratamiento; véase el cuadro 7.

Reportes previos (Liu et al.) mostraron que se requiere una proteína vehículo, tal como BSA, para obtener estabilidad y actividad óptimas de la neurorregulina. La GGF2 ha mostrado estabilidad sin vehículos como BSA. Este experimento se diseñó para probar si el GGF2 es estable y activo en un régimen terapéutico sin BSA. Después de 10 días de tratamiento, las formulaciones que contienen GGF2 tanto con BSA como sin BSA produjeron mejoramientos de la fracción de expulsión, en comparación con los controles de vehículo, similares a los observados en los estudios previos. Por lo tanto, de este estudio resulta evidente que no se requiere BSA ni otra proteína vehículo en las formulaciones de GGF2 para el tratamiento de la CHF; véase el cuadro 8.

CUADRO 10 Hallazgos de patología ++ presente frecuentemente; + presente; +/- observado ocasionalmente; - raro o no observado Como se muestra en el cuadro 10, la dosificación intermitente de GGF2 reduce los efectos secundarios asociados con los niveles supranormales del GGF2 administrado exógenamente. Los presentes inventores han descubierto que este hallazgo sigue siendo válido sin importar si el GGF2 se administra intravenosamente o subcutáneamente.

Algunas veces se observa hiperplasia y efectos cardiacos con la dosificación cada tercer día. Los presentes autores no lo observaron con una dosificación menos frecuente.

En esta solicitud se citan varias publicaciones y documentos de patente para describir más completamente el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia como si se indicara específica e individualmente que cada una de ellas se incorporara como referencia.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un péptido que comprende un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (semejante a EGF) en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la falla cardiaca en un mamífero, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable a un intervalo de por lo menos 48 horas.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable cada 48 horas.

3. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable cada 96 horas.

4. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en un régimen seleccionado del grupo que consiste en cada 4 días, cada semana, cada 10 días, cada 14 días, cada mes, cada dos meses, cada tres meses o cada cuatro meses.

5. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho mamífero es un humano.

6. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho péptido es el GGF2 humano recombinante.

7. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el péptido es: SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTG DRCQNYVMASFYKAEELYQ.

8. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el péptido es: SHLVKCAEKEKTFCVNGGECF VKDLSNPSRYLCKCPNEFTG DRCQNYVMASFYKAEELY.

9. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el péptido es codificado por el gen de neurorregulina (NRG) 1 , el gen de neurorregulina (NRG) 2, el gen de neurorregulina (NRG) 3, o el gen de neurorregulina (NRG) 4.