MX2010013641A

MX2010013641A - Gen bacillus thuringiensis novedoso con actividad contra lepidopteros.

Info

Publication number: MX2010013641A
Application number: MX2010013641A
Authority: MX
Inventors: Andre R Abad; Hua Dong; Sue B Lo; Xiaomei Shi
Original assignee: Pionner Hi Bred International Inc
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2011-01-14
Also published as: ZA201101348B; EP2297188A1; US8129594B2; CN102076710B; BRPI0915102A2; AR072028A1; US20090313722A1; CA2727613C; CN102076710A; UA104428C2; EA201071400A1; WO2009152023A1; CA2727613A1

Abstract

La invención provee ácidos nucleicos, y variantes y fragmentos de los mismos, obtenidos de cepas de Bacillus thuringiensis que codifican polipéptidos que tienen actividad pesticida contra plagas de insectos, con inclusión de Lepidópteros. Las formas de realización particulares de la invención proveen ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas pesticidas, composiciones pesticidas, constructos de ADN, y plantas y microorganismos transformados que comprenden un ácido nucleico de las formas de realización. Estas composiciones encuentran uso en los métodos para controlar plagas, especialmente plagas en plantas.

Description

EN BACILLUS THURINGIENSIS NOVEDOSO CON ACTIVIDAD CON LEPIDÓPTEROS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con ácidos nucleicos recombi e ocurrencia natural obtenidos de genes Bacilius thuringiensis nov codifican polipéptidos pesticidas caracterizados por actividad pe tra plagas de insectos. Las composiciones y métodos de la inv izan los ácidos nucleicos revelados, y sus polipéptidos pes ificados, para controlar las plagas en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plagas de insectos son un factor principal en la pérdida ltivos agrícolas mundiales. Por ejemplo, la alimentación del gusano s ño del gusano cortador negro, o daño de la oruga taladradora e eden ser devastadores a nivel económico para los productores agrícol rdida de cultivos relacionada con la plaga de insectos solamente ques de la oruga taladradora europea en el campo y maíz du ticidas alternativos.

El control biológico de las plagas de insectos de significado agríco un agente microbiano, tal como hongo, bacteria, u otra especie de i ilita una alternativa comercialmente atractiva y favorable a nivel am a los pesticidas químicos sintéticos. En términos generales, el uso pesticidas presenta un riesgo inferior de contaminación y p bientales, y los biopesticidas proveen una especificidad blanco may característica de los insecticidas químicos de amplio espectro tradi imismo, los biopesticidas a menudo cuestan menos en producción e mejoran el rendimiento económico para una amplia variedad de cult Ciertas especies de microorganismos del gen Bacillus son conocid eer actividad pesticida contra un amplio rango de plagas de insect luyen lepidópteros, dípteros, coleópteros, hemípteros, y otros. El B ringiensis (Bt) y Bacillus papllliae se encuentran entre los agent control más exitosos descubiertos a la fecha. La patogenicidad del i sido atribuida a cepas de B. larvae; B. lentimorbus, B. sphaericus (Ha arrollado plantas de cultivo con resistencia reforzada a insect nipular genéticamente las plantas de cultivo para producir pro ticidas de Bacillus. Por ejemplo, las plantas de maíz y algodón ha nipuladas genéticamente para producir proteínas pesticidas aisladas as de Bt (véase, por ej., Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):41 nepf y colegas (1998) Microbio! Mol Biol Rev. 62(3):775-806). tivos genéticamente modificados se usan ampliamente en la actualida cultura norteamericana y le han brindado al agricultor una alte orable a nivel ambiental de los métodos de control de insectos tradicio imismo, las papas genéticamente manipuladas para contener toxin ticidas han sido vendidas al agricultor norteamericano. Si bie ostrado ser exitosas a nivel comercial, estas plantas de cultivos resis nsectos genéticamente manipuladas, brindan resistencia solamente go menor de plagas de insectos económicamente importantes.

Por consiguiente, existe la necesidad de nuevas toxinas Bt con un s amplio de actividad insecticida contra plagas de insectos, por ej., t sformados y plantas que expresan un polipéptido insecticida de las f realización. Dichas plagas incluyen plagas significativas a nivel ag s como, por ejemplo: oruga taladradora europea, por ej. Ostrínia n bner. En algunas formas de realización, las secuencias de nucl ifican polipéptidos que son pesticidas para al menos un insect tenece al orden de los lepidópteros.

Las formas de realización proveen un ácido nucleico y fragme iantes del mismo que codifican polipéptidos que poseen actividad pe tra plagas de insectos (por ej. la SEQ ID NO: 1 que codifica la SEQ I La secuencia de nucleótidos de tipo silvestre (por ej., de ocurrencia n las formas de realización, que se obtuvo de Bt, codifica un ecticida novedoso. Las formas de realización proveen, además, frag ariantes de la secuencia de nucleótidos revelada que codifican polip lógicamente activos (por ej., insecticidas).

Las formas de realización proveen, además, polipéptidos pes lados (por ej., insecticidas) codificados ya sea por un ácido nucle Los ácidos nucleicos de las formas de realización también se p r para producir plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas transg r ej., transformadas) que se caracterizan por genomas que compren nos un constructo de nucleótidos incorporado de manera establ prende una secuencia codificadora de las formas de realización liga a operativa a un promotor que dirige la expresión del polipéptido pe ificado. Por consiguiente, también se proveen células vegetales, etales, plantas y sus semillas, transformados.

En una forma de realización particular, una planta transformada producida usando un ácido nucleico que ha sido optimizado p resión incrementada en una planta huésped. Por ejemplo, uno ipéptidos pesticidas de las formas de realización pueden ser retro-trad a producir un ácido nucleico que comprende codones optimizados resión en un huésped particular, por ejemplo, una planta de cultiv o una planta de maíz (Zea mays). La expresión de una sec ificadora por dicha planta transformada (por ej., dicotiledón plagas de insectos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las formas de realización de la invención se dirigen a composici todos para impactar plagas de insectos, particularmente plagas en pi s específicamente, el ácido nucleico aislado de las formas de realiza gmentos y variantes del mismo, comprenden secuencias de nucleótid ifican polipéptidos pesticidas (por ej., proteínas). Las proteínas pes eladas son biológicamente activas (por ej., pesticidas) contra plag ectas tales como, mas sin limitarse a, plagas de insectos del orden idópteros. Las plagas de insectos de interés incluyen, mas no se lim trinia nubilalis (oruga taladradora europea); Papaipema nebris (barr tallo común); Diatraea grandiosella (oruga taladradora del sud odoptera exigua (gusano soldado de la remolacha); y Pluteila xyl lilla de lomo de diamante).

Las composiciones de las formas de realización comprenden leicos aislados, y fragmentos y variantes de los mismos, que co plagas de insectos.

Los ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las form lización se pueden usar para transformar cualquier organismo para pr proteínas pesticidas codificadas. Se proveen métodos que implican dichos organismos transformados para impactar o controlar las pla ntas. Los ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de las for lización también se pueden usar para transformar organelos tales roplastos (McBride y colegas (1995) Biotechnology 13: 362-365; y egas (1999) Proa Nati. Acad. Sci. USA 96: 1840-1845).

Las formas de realización se relacionan además con la identifica gmentos y variantes de la secuencia codificadora de ocurrencia natur ifica proteínas pesticidas biológicamente activas. Las secuenci leótidos de las formas de realización encuentran uso directo en los m ra impactar plagas, particularmente plagas de insectos tales como plag en de los lepidópteros. Por consiguiente, las formas de realización p vos enfoques para impactar plagas de insectos que no dependen d o-traducidas (es decir, traducidas en forma reversa) usando co ferentes de plantas basados en la secuencia de aminoácidos ipéptido que tiene actividad pesticida reforzada. Las formas de reali bién proveen mutaciones que confieren propiedades mejoradas o alt los polipéptidos de las formas de realización. Véase, por ej., las solic pendientes estadounidenses Nos. 10/606.320, presentada el 25 de ju 3 y 10/746.914, presentada el 24 de diciembre de 2003.

En la descripción que sigue, se usa un número de términos de ensiva. Las definiciones que siguen se proveen para facili endimiento de las formas de realización.

Las unidades, prefijos y símbolos pueden ser denotados en su ptada por el sistema internacional. A menos que se indique lo contra dos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a uencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orien iño a carboxi, respectivamente. Los rangos numéricos son inclusivos eros que definen el rango. Los aminoácidos pueden ser referidos ocidos (por ej., ácidos nucleicos peptídicos) que tienen la esencia nat nucleótidos naturales por el hecho de que se hibridan con ácidos nu nocatenarios de manera similar a la de los nucleótidos de ocur ural.

Como se usa en la presente, los términos "codificar" o "codi ndo se usan en el contexto de un ácido nucleico específico, signific ácido nucleico comprende la información requerida para dirigir la trad la secuencia de nucleótidos en una proteína específica. La informaci cual una proteína es codificada se especifica mediante el uso de co ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender las secu traducidas (por ej., intrones) dentro de las regiones traducidas del cleico o puede carecer de dichas secuencias no traducidas intervi r ej., como en cADN).

Como se usa en la presente, "secuencia de longitud comple erencia con un polinucleótido especificado o su proteína codificada si er la secuencia de ácido nucleico completa o la secuencia de amino scripción endógeno a menudo es inhibida. Por ende, cuando se mino "antisentido" en el contexto de una secuencia de nucleótidos par érmino se refiere a la hebra complementaria del producto de transe referencia.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan en rcambiable en la presente para hacer referencia a un polímero de re aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos les uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artifi aminoácido de ocurrencia natural correspondiente, así como ta ímeros de aminoácidos de ocurrencia natural.

Los términos "residuo" o "residuo de aminoácidos " o "aminoácid n de manera intercambiable en la presente para referirse a un amin es incorporado en una proteína, polipéptido, o péptido (en forma col oteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido de ocurrencia natur nos que se limite de otra forma, puede comprender análogos conoci inoácidos naturales que pueden funcionar de manera similar n de manera intercambiable para hacer referencia a los ácidos nucle ipéptidos o partes biológicamente activas de los mismos que son sus sencialmente libres de los componentes que normalmente acompa ractúan con el ácido nucleico o polipéptido como se encuentra en su biente de ocurrencia natural. Por ende, un ácido nucleico o polip lado o purificado es sustancialmente libre de otro material celular o me tivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan a nivel qu Un ácido nucleico "aislado" por lo general está libre de secuencias o, por ejemplo, secuencias codificadoras de proteínas) que natural quean el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extre ' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual de do nucleico. Por ejemplo, en varias formas de realización, los leicos aislados pueden contener menos de alrededor de 5 kb; 4 kb; 1 kb; 0,5 kb; o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que natural quean los ácidos nucleicos en el ADN genómico de la célula de l proteína que no es de interés.

En toda la memoria descriptiva, debe entenderse que la p mprender" o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo" i inclusión de un elemento, número entero o paso establecidos, o gr mentos, números enteros o pasos, mas no la exclusión de cualqui mento, número entero o paso, o grupo de elementos, números ent os.

Como se usa en la presente, el término "impactar plagas de insect iere a efectuar cambios en la alimentación, crecimiento y/o comporta l insecto en cualquier etapa de desarrollo, que incluyen, mas no se lim erminar el insecto; retrasar su crecimiento; prevenir su cap roductiva, actividad antialimentaria; y similares.

Como se usa en la presente, los términos "actividad pestic tividad insecticida" se usan como sinónimos para hacer referenci ividad de un organismo o una sustancia (tales como, por ejempl teína) que puede ser medida por, mas no limitada a, mortalidad de la ividad pesticida cuando está presente en el medio ambiente de una ra cada sustancia u organismo, la cantidad efectiva a nivel pestici erminada de manera empírica para cada plaga afectada en un biente específico. De manera similar, una "cantidad efectiva a ecticida" también puede ser usada para hacer referencia a una "ca ctiva a nivel pesticida" cuando la plaga es una plaga de insectos.

Como se usa en la presente, el término "manipulado en ombinante" o "manipulado" connota la utilización de tecnología de ombinante para introducir (por ej., manipular) un cambio en la estruct roteína basado en el entendimiento del mecanismo de la proteína de una consideración de los aminoácidos que están siendo introd ecionados o sustituidos.

Como se usa en la presente, el término "secuencia de nucl tante" o "mutación" o "secuencia de nucleótidos mutagenizada" conno uencia de nucleótidos que ha sido mutagenizada o alterada para co o más residuos de nucleótidos (por ej., pares de bases) que no secuencia de aminoácidos que confiere actividad insecticida mejo ucida en un polipéptido que la contiene. Como se usa en la prese mino "mutante" o "mutación" en el contexto de una proteína, un polipé uencia de aminoácidos, se refiere a una secuencia que ha tagenizada o alterada para contener uno o más residuos de amino no están presentes en la secuencia de tipo silvestre correspon ha mutagenesis o alteración consiste de una o más adiciones, delecio tituciones o reemplazos de residuos de aminoácidos. Un poli tante muestra actividad insecticida mejorada o reducida, o represen uencia de aminoácidos que confiere actividad insecticida mejorada lipéptido que la contiene. Por ende, el término "mutante" o "mutaci iere ya sea a uno entre la secuencia de nucleótidos mutante inoácidos codificados o a ambos. Los mutantes se pueden usar en ividual o en cualquier combinación compatible con otros mutantes mas de realización o con otros mutantes. Un "polipéptido mutante" strar, por otro lado, una reducción en la actividad insecticida. Cua rega más de una mutación a un ácido nucleico o proteína partícul ipéptido insecticida que tiene especificidad para un insecto que ceptible a la toxicidad de la proteína de tipo silvestre. Un hallaz ividad pesticida mejorada o reforzada requiere una demostración remento de actividad pesticida de al menos 10%, contra el insecto bla menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, %, o 300% o más de incremento de la actividad pesticida con relaci ividad pesticida del polipéptido insecticida de tipo silvestre determina pecto al mismo insecto.

Por ejemplo, se provee una actividad insecticida o pesticida me de un rango más amplio o más acotado de insectos es impactado ipéptido con relación al rango de insectos que es afectado por una to tipo silvestre. Un rango más amplio de impacto puede ser deseable c desee versatilidad, mientras que un rango más acotado de impacto deseable cuando, por ejemplo, los insectos podrían, de otra form actados por el uso o presencia de la toxina. Si bien las form lización no están sujetas a un mecanismo de acción particular, tamb mplo, Cry1 s, Cry2$, o Cry3s.

Los términos "sitio proteolítico" o "sitio de clivaje" se refieren uencia de aminoácidos que confiere sensibilidad a una clase de prote proteasa particular de manera tal que un polipéptido que conti uencia de aminoácidos es digerido por la clase de proteasas o pr ticular. Se dice que un sitio proteolítico es "sensible" a la(s) proteasa( onoce(n) ese sitio. Se aprecia en el arte que la eficiencia de digestió ue una reducción en la eficiencia de digestión puede llevar a un incre la estabilidad o longevidad del polipéptido en las tripas del insect e, un sitio proteolítico puede conferir sensibilidad a más de una prot se de proteasas, pero la eficiencia de digestión en ese sitio por teasas puede variar. Dichos sitios proteolíticos incluyen, por ejemplo, tripsina, sitios de quimotripsina y sitios de elastasa.

La investigación ha demostrado que las proteasas de tripa de in los lepidópteros incluyen tripsinas, quimotripsinas y elastasas. Véas Lenz y colegas (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201- acto de las proteínas Cry Bt en el insecto. Algunas proteasas activ teínas Cry al procesarlas a partir de una forma de "protoxina" en una ica, o "toxina". Véase, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42: 1 rroll y colegas (1997) J. Invertebrate Pathology 70: 41-49. Esta activac toxina puede incluir la extracción de los péptidos N- y C-terminales teína y también puede incluir clivaje interno de la proteína. Otras pro den degradar las proteínas Cry. Ver Oppert, ibid.

Una comparación de las secuencias de aminoácidos de toxinas rentes especificidades revela cinco bloques de secuencias alta servados. A nivel estructural, las toxinas comprenden tres do tintos que son, del término N a C, un grupo de siete alfa-hélices implic ormación de poros (referido como "dominio 1"), tres hojas beta anti-pa plicadas en el enlace celular (referido como "dominio 2"), y un sandwic erido como "dominio 3"). La ubicación y propiedades de estos domini ocidas para las personas versadas en el arte. Véase, por ejempl egas (1991) Nature, 305:815-821 y Morse y colegas (2001) Structure, En un esfuerzo por caracterizar mejor y mejorar las toxinas udiaron las cepas de la bacteria Bt. Se descubrió que las prepara talinas preparadas a partir de los cultivos de las cepas de Sí ividad pesticida contra la oruga taladradora europea (véase, por mplo experimental 1). Se trató de identificar las secuencias de núcle codifican las proteínas cristalinas a partir de las cepas seleccionada dos nucleicos de tipo silvestre (es decir, de ocurrencia natural) de las f realización fueron aislados de las cepas bacterianas, clonados en un expresión y transformados en E coli. Dependiendo de las característi determinada preparación, se reconoció que la demostración de la ac ticida a veces requería que el pretratamiento de tripsina activa teínas pesticidas. Por ende, se entiende que algunas proteínas pes uieren digestión de proteasa (por ej., por tripsina, quimotripsina y sim a activación, mientras que otras proteínas son biológicamente activa pesticidas) en ausencia de activación.

Dichas moléculas pueden ser alteradas por los medios descritos paran mediante un proceso que implica los pasos de: obtene uencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la famili lizar la estructura del polipéptido para identificar los sitios "b rticulares para mutagenesis de la secuencia génica subyacente basad sideración de la función propuesta del dominio blanco en el modo de la toxina; introducir una o más mutaciones en la secuencia de ácido n ra producir un cambio deseado en uno o más residuos de aminoácido uencia de polipéptidos codificada; y evaluar el polipéptido produci nto a su actividad pesticida.

Muchas de las toxinas insecticidas Bt que se relacionan a varios r similitudes en sus secuencias de aminoácidos y estructura terci dios para obtener las estructuras cristalinas de las toxinas Bt son con solución de estructura cristalina de alta resolución tanto de los polip 3A como de los Cry3B se encuentra disponible en la literatura. La est uelta del gen Cry3A (Li y colegas (1991 ) Nature 353:815-821) prov rospectiva de la relación entre la estructura y la función de la toxin Como se informa en la patente estadounidense No. 7.105. icitud estadounidense pendiente No. 10/746.914, presentada el iembre de 2003, la toxicidad de las proteínas Cry puede ser mejor gir la región ubicada entre las alfa hélices 3 y 4 del dominio 1 de la a teoría se esgrimió en el conocimiento que concierne las t ecticidas, que incluye: 1) que se informó que las alfa hélices 4 y inio 1 de las toxinas Cry3A se insertan en la bicapa lipídica de las el intestino medio de los insectos susceptibles (Gazit y colegas (1998 i/. Acad. Sci. USA 95: 12289-12294); 2) el conocimiento de los invento ubicación de los sitios de clivaje de tripsina y quimotripsina dentro uencia de aminoácidos de la proteína de tipo silvestre; 3) la observa e la proteína de tipo silvestre era más activa contra ciertos insectos d la activación in vitro por tratamiento de tripsina o quimotripsina; y 4) in que la digestión de toxinas del extremo 3' provocó toxicidad redu ectos.

Una serie de mutaciones puede ser creada y ubicada en una v cación particular; la adición de residuos de aminoácidos cerca d o(s) sensible(s) a proteasa para alterar el plegamiento del polipéptido e, reforzar la digestión del polipéptido en un sitio sensible a prote egar mutaciones para proteger el polipéptido de la digestión degra reduce la toxicidad (por ej., hacer una serie de mutaciones en do inoácido de tipo silvestre es reemplazado por valina para prote ipéptido de la digestión). Las mutaciones pueden ser usadas en ividual o en cualquier combinación para proveer los polipéptidos mas de realización.

De esta manera, las formas de realización proveen secuencia prenden una variedad de mutaciones, tales como, por ejempl tación que comprende un sitio adicional, o alternativo, sensible a pro cado entre las alfa-hélices 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codi a mutación que es un sitio sensible a proteasa adicional o alternativo sensible a varias clases de proteasas tales como serina proteasa luyen tripsina y quimotripsina, o enzimas tales como elastasa. Por end tación imotripsina en el término C del péptido.

La presencia de un sitio sensible a proteasa adicional y/o alterna secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado puede mej ividad pesticida y/o especificidad del polipéptido codificado por los cleicos de las formas de realización. Por consiguiente, las secuenc cleótidos de las formas de realización pueden ser manipuladas en ombinante o manipuladas para producir polipéptidos que tienen ac ecticida y/o especificidad mejoradas o alteradas a comparación con la tipo silvestre no modificada. Asimismo, las mutaciones reveladas sente se pueden ubicar en o usarse junto con otras secuenci cleótidos para proveer propiedades mejoradas. Por ejemplo, un sitio s roteasa que es fácilmente clivable por quimotripsina de insecto, por imotripsina encontrada en el gusano soldado bertha o el gusano del o íz (Hegedus y colegas (2003) Arch. Insect Biochem. PhysioL 53: 3 z y colegas (1991 ) Arch. Insect Biochem. PhysioL 16: 201-212), se icar en una secuencia de fondo Cry para proveer toxicidad mejorada motripsina ubicado inmediatamente 5' o 3' del sitio de tripsina de ocur ural. A modo alternativo, se pueden crear mutantes de sustitución les al menos un codón del ácido nucleico que codifica el sitio sen teasa de ocurrencia natural es destruido y los codones alternativ oducen en la secuencia de ácido nucleico a fin de proveer un sitio sen teasa diferente (por ej., sustituto). Un mutante de reemplazo también agregado a una secuencia Cry en la cual el sitio de clivaje de tripsi rrencia natural presente en el polipéptido codificado es destruido y u clivaje de quimotripsina o elastasa es introducido en su lugar.

Se reconoce que cualquier secuencia de nucleótidos que codifi uencias de aminoácidos que son sitios proteolíticos o sitios prote ativos (por ejemplo, secuencias tales como NGSR, RR, o LKM) se p r y que la identidad exacta de los codones usados para introducir cual estos sitios de clivajes en un polipéptido variante puede variar depen uso, es decir, expresión en una especie vegetal particular. Tamb onoce que cualquiera de las mutaciones reveladas se puede introd los polipéptidos codificados retengan actividad pesticida. Por end uencias también pueden ser mutadas de manera tal que los polipé ificados sean resistentes a la digestión proteolítica por quimotripsin un sitio de reconocimiento puede ser agregado en una ubicación pa cualquier combinación, y se pueden agregar múltiples siti onocimiento a la toxina o bien ser extraídos de la misma. Por en itaciones adicionales pueden comprender, tres, cuatro o más siti onocimiento. Debe reconocerse que las múltiples mutaciones se p nipular en cualquier secuencia de polinucleótidos adecuada siguiente, las secuencias de longitud completa o los fragmentos mas se pueden modificar para contener sitios de clivaje adicion rnativos así como también ser resistentes a digestión proteolítica. D ñera, las formas de realización proveen toxinas Cr que con taciones que mejoran la actividad pesticida así como ta posiciones y métodos mejorados para impactar plagas usando inas Bt uientes secuencias: RR, un sitio de clivaje de tripsina; LKM, un si mot psina; y NGSR, un sitio de tripsina. Estos sitios pueden ser alt medio de la adición o deleción de cualquier número o clase de resid inoácidos, siempre que la actividad pesticida del polipéptid ementada. Por ende, los polipéptidos codificados por las secuenci leótidos que comprenden las mutaciones comprenden al menos un c dición de aminoácidos con relación a la secuencia nativa o de fondo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 12 0, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, o s cambios o adiciones de aminoácidos. La actividad pesticida lipéptido también puede ser mejorada por truncamiento de la sec tiva o de longitud completa, como se conoce en el arte.

Las composiciones de las formas de realización incluyen cleicos, y fragmentos y variantes de los mismos, que codifican polip sticidas. En particular, las formas de realización proveen moléculas d planta. Las secuencias de nucleótidos optimizadas pueden ser prep cualquier organismo de interés usando métodos conocidos en e ase, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses Nos. 10/60 sentada el 25 de junio de 2003, ahora abandonada, y la 10/74 sentada el 24 de diciembre de 2003, que describen una secuen leótidos optimizada que codifica una proteína pesticida revelada. E mplo, la secuencia de nucleótidos fue preparada por traducción reve secuencia de aminoácidos de la proteína y cambio de la secuen cleótidos a fin de comprender los codones preferentes de maíz al tiem sigue codificando la misma secuencia de aminoácidos. Este procedi descrito en mayor detalle por Murray y colegas (1989) Nucleic acid :477-498. Las secuencias de nucleótidos optimizadas encuentran rementar la expresión de una proteína pesticida en una planta, por e ntas monocotiledóneas de la familia Gramineae (Poaceae) tal com mpio, una planta de maíz.

Las formas de realización también proveen polipéptidos pesticid iantes que son producidos a partir de ácidos nucleicos mutageni eñados para introducir secuencias de aminoácidos particulares lipéptidos de las formas de realización. En formas de realización partic secuencias de aminoácidos que son introducidas en los polip prenden una secuencia que provee un sitio de clivaje para una enzi o una proteasa.

Se conoce en el arte que la actividad pesticida de las toxinas iva típicamente por clivaje del péptido en las entrañas del insecto por teasas. Como los péptidos pueden no siempre ser olivados con co ciencia en las tripas del insecto, los fragmentos de una toxina de t mpleta pueden tener actividad pesticida reforzada a comparación ina de longitud completa en sí misma. Por esta razón, algunos lipéptidos de las formas de realización incluyen fragmentos de un poli ecticida de longitud completa y algunos de los fragmentos, varía taciones del polipéptido tienen actividad pesticida reforzada con relaci tividad del polipéptido insecticida de ocurrencia natural del cual d resión de un ácido nucleico revelado en la presente, o por el u nicas estándares de biología molecular.

Se reconoce que las proteínas pesticidas pueden ser oligomér ían en peso molecular, número de residuos, péptidos compon ividad contra plagas particulares y otras características. No obstant dio de los métodos establecidos en la presente, las proteínas activas variedad de plagas pueden ser aisladas y caracterizadas. Las pro ticidas de las formas de realización se pueden usar en combinaci s toxinas Bt u otras proteínas insecticidas para incrementar el rango insectos. Asimismo, el uso de las proteínas pesticidas de las form lización en combinación con otras toxinas Bt u otros principios insec distinta naturaleza tiene particular utilidad para la prevención y/o man resistencia a insectos. Otros agentes insecticidas incluyen inhibido teasa (tanto del tipo serina como cisteína), a-amilasa y peroxidasa.

Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos inoácidos y los polipéptidos codificados por las mismas también Debe entenderse que el término "fragmento" como se usa para rencia a las secuencias de ácido nucleico de las formas de realiz bién comprende las secuencias que son útiles como sondas de híbrid a clase de secuencias de nucleótidos por lo general no codifica proteí mentos que retienen actividad biológica. Por ende, los fragmentos uencia de nucleótidos puede variar de al menos alrededor leótidos, alrededor de 50 nucleótidos, alrededor de 100 nucleótidos, y ecuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica las proteí formas de realización.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos de las form lización que codifica una parte biológicamente activa de una pr ticida de las formas de realización codifica al menos 15, 25, 30, 5 , 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1 ,000, 1 00, o 1200 amino tiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polip ticida de las formas de realización (por ejemplo, 737 aminoácidos Q ID NO: 2). Por ende, se entiende que las formas de realización ta o nucleico de las formas de realización puede codificar una lógicamente activa de una proteína pesticida, o puede ser un fragmen puede usar como una sonda de hibridación o cebador de PCR usan todos revelados en la presente. Una parte biológicamente activa d teína pesticida se puede preparar aislando una parte de una uencias de nucleótidos de las formas de realización, expresando la ificada de la proteína pesticida (por ej., por expresión recombinante in valuando la actividad de la parte codificada de la proteína pesticida.

Los ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuenc leótidos de las formas de realización comprenden al menos 16, 20, , 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200, O, 1800, o 2000 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presen secuencia de nucleótidos revelada en la presente (por ejemplo, leótidos para la SEQ ID NO: 1). Las formas de realización partí loban fragmentos derivados de (por ej., producidos a partir de) un do nucleico de las formas de realización, en donde el fragmento codifi 3' de la correspondiente secuencia nativa o secuencia codificad gitud completa.

El término "variantes" se usa en la presente para hacer refere uencias sustancialmente similares. Para las secuencias de nucleótid iantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, a raíz eneración del código genético, codifican la secuencia de aminoáci 0 de los polipéptidos pesticidas de las formas de realización. iantes alélicas naturales de ocurrencia natural se pueden identificar de técnicas conocidas de biología molecular tales como, por ej cción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase action) y técnicas de hibridación, como se destaca en la presente.

Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuen cleótidos derivadas de manera sintética, tales como las generada mplo, usando mutagenesis dirigida a sitio, pero que codifican una p sticida de las formas de realización, tales como una toxina mutante. neral, las variantes de una secuencia de nucleótidos particulares realización (es decir, una secuencia de nucleótidos ejemplificativa) ta puede evaluar por comparación de la identidad de secuencia porc re el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos varian ipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referenci secuencia, por ejemplo, se revelan los ácidos nucleicos aislado ifican un polipéptido con una determinada identidad de sec centual con el polipéptido de la SEQ ID NO: 2. La identidad de sec centual entre cualquiera de dos polipéptidos se puede calcular usan gramas de alineación de secuencias descritos eh la presente que ámetros por defecto. Cuando cualquier determinado par de polinucle las formas de realización es evaluado por comparación de la identi uencia porcentual compartida por los dos polipéptidos que codific ntidad de secuencia porcentual entre los dos polipéptidos codificado nos alrededor de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, por lo gen nos alrededor de 75%, 80%, 85%, al menos alrededor de 90%, 91 %, , 94%, 95%, 96%, 97%, o al menos alrededor de 98%, 99% o ntidad de secuencia. inoácidos contiguos para retener la actividad biológica de la proteína decir, tener actividad pesticida. Dicha actividad pesticida puede ser dif ejorada en relación con la proteína nativa o puede ser inalterada, si la actividad pesticida sea retenida.

Las proteínas variantes abarcadas por las formas de realizació lógicamente activas, es decir, que continúan poseyendo la ac lógica deseada de la proteína nativa, es decir, actividad pesticida co cribe en la presente. Dichas variantes pueden ser generadas a partir mplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Las var lógicamente activas de una proteína nativa pesticida de las form lización tienen al menos alrededor de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, , 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, , o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido proteína nativa, determinada por programas de alineación de secu critos en la presente que usan parámetros por defecto. Una v lógicamente activa de una proteína de las formas de realización - prende un microorganismo transformado capaz de expresar al men teína pesticida de las formas de realización.

Las formas de realización proveen composiciones pesticida prenden un microorganismo transformado de las formas de realizad has formas de realización, el microorganismo transformado está pr eralmente en la composición pesticida en una cantidad efectiva ticida, junto con un portador adecuado. Las formas de realización ta loban composiciones pesticidas que comprenden una proteína aisla formas de realización, sola o en combinación con un orga sformado de las formas de realización y/o una proteína pe apsulada de las formas de realización, en una cantidad efectiva ecticida, junto con un portador adecuado.

Las formas de realización también proveen un método para increr rango blanco de insectos usando una proteína pesticida de las for lización en combinación con al menos otra o una "segunda" pr ticida. Cualquier proteína pesticida conocida en el arte se puede empl célula vegetal. Como se usa en la presente, los términos " sformada" y " planta transgénica" se refieren a una planta que comp tro de su genoma un polinucleótido heterólogo. En general, el polinucl erólogo es integrado en forma estable dentro del genoma de una sgénica o transformada de manera tal que el polinucleótido p eraciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integr genoma en forma individual o como parte del cásete de exp ombinante.

Debe entenderse que, como se usa en la presente, el t nsgénica" incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte nta, o planta cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de leico heterólogo que incluye transgénicas inicialmente alteradas así bién las creadas por cruzas sexuales o propagación asexual sgénica inicial. El término "transgénica" como se usa en la prese prende la alteración del genoma (cromosómico o extra-cromosómic todos convencionales de reproducción de plantas por eventos natura inan plantas transgénicas o su progenie previamente transformada c écula de ADN de las formas de realización y, por ende, que consi nos en parte de las células transgénicas.

Como se usa en la presente, el término "planta" incluye etales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetal cuales se pueden regenerar las plantas, callos de la planta, mat ntas y células vegetales intactos en plantas o partes de las planta o embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, se UIOS, mazorcas, cascaras, tallos, raíces, nervaduras, anteras y similar se de plantas que se puede usar en los métodos de las form lización es generalmente tan amplia como la clase de plantas sup clives a técnicas de transformación, con inclusión de p nocotiledóneas y dicotiledóneas. Dichas plantas incluyen, por ej lanum tuberosum y Zea mays.

Si bien las formas de realización no dependen de un meca lógico particular para incrementar la resistencia de una planta a la pl Una "planta o célula vegetal sujeto" es aquella en la que se ha efe ración genética, tal como transformación, con respecto a un gen de i s una planta o célula vegetal que desciende de una planta o célula al esta manera y que comprende la alteración. Un "control" o "pla trol" o "célula vegetal de control" proveen un punto de referencia para bios en el fenotipo de la planta o célula vegetal sujeto.

Una planta o célula vegetal de control puede comprender, por ej una planta o célula de tipo silvestre, es decir, del mismo genotipo terial de inicio para la alteración genética que generó la planta o eto; (b) una planta o célula vegetal del mismo genotipo que el mate ió pero que ha sido transformada con un constructo nulo (es decir, structo que no tiene efecto conocido sobre el rasgo de interés, tal co structo que comprende un gen marcador); (c) una planta o célula v es un segregador no transformado entre la progenie de una planta o etal sujeto; (d) una planta o célula vegetal genéticamente idéntic nta o célula vegetal sujeto pero que no se expone a condiciones o est rés agrícola.

Por ende, las proteínas de las formas de realización puede radas de varias maneras, con inclusión de sustituciones, delec camientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para nipulaciones son generalmente conocidos en el arte. Por ejempl iantes de secuencia de aminoácidos de las proteínas pesticidas se p parar introduciendo mutaciones en un ácido nucleico sintético (p lécula de ADN). Los métodos para mutagenesis y alteraciones de leico son conocidos en el arte. Por ejemplo, los cambios diseñados p introducidos usando una técnica de mutagenesis dirigida a sitio, m oligonucleótido. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Aca A 82:488-492; Kunkel y colegas (1987) Methods in Enzymol. 154:36 ente estadounidense No. 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. hniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New Y erencias citadas en las mismas.

Las secuencias de nucleótidos mutagenizadas de las form teína codificada puede tener al menos alrededor de 1 % o 2%, o alr 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, o incluso alrede fc, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, , 35%, o 40% o más de codones adicionales comparados respondiente proteína de tipo silvestre. Debería entenderse q uencias de nucleótidos mutagenizadas de las formas de realización tinadas a abarcar péptídos biológicamente funcionales, equivalente en actividad pesticida, tal como una actividad pesticida me rminada por propiedades antialimentarias contra las larvas de dradora europea. Dichas secuencias pueden aparecer como consec la redundancia de codones y equivalencia funcional que son conocid de ocurrencia natural dentro de las secuencias de ácido nucleico teínas codificadas de esta manera.

La persona versada en el arte reconoce que las adicion tituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud rela sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejempl odo de referencia. Se pueden realizar sustituciones conservativas, o el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propie iilares.

Por ende, los genes y secuencias de nucleótidos de las form lización incluyen tanto las secuencias de ocurrencia natural como las f tantes. De manera similar, las proteínas de las formas de reali prenden tanto las proteínas y variaciones (por ej., polipéptidos trun ocurrencia natural como las formas modificadas (por ej., mutantes) mas. Dichas variantes continúan teniendo la actividad pesticida de viamente, las mutaciones que se hacen en la secuencia de nucleótid ifica la variante no deben ubicar la secuencia fuera del marco de lec general, no crean regiones complementarias que podrían produc ructura secundaria de mARN. Véase, la solicitud de patente europ 444.

No se espera que las deieciones, inserciones y sustituciones uencias de proteínas comprendidas en la presente produzcan ca tagénico y recombinogénico tal como barajado de ADN. Con cedimiento, una o más secuencias codificadoras diferentes pued nipuladas para crear una nueva proteína pesticida que pose ptedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucle ombinantes son generadas a partir de una población de polinucleóti uencias relacionadas que comprenden regiones de secuencias que ntidad de secuencia sustancial y pueden ser recombinadas de óloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, las secu ificadoras de longitud completa, los motivos de secuencia que codifi inio de interés, o cualquier fragmento de una secuencia de nucleóti formas de realización pueden ser barajados entre las secuenci leótidos de las formas de realización y correspondientes partes de cu uencias de nucleótidos Cr conocidas para obtener un nuevo ge ifica una proteína con una propiedad de interés mejorada.

Las propiedades de interés incluyen, mas no se limitan a, ac ticida por unidad de proteína pesticida, estabilidad de proteína y to mpio, Stemmer (1994) Proc. Nati Acad. Sci. USA 91 :10747- mmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri y colegas (1997) Nature B :436-438; Moore y colegas (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y c 97) Proc. Nati Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri y colegas ture 391 :288-291 ; y las patentes estadounidenses Nos. 5.605. 37.458.

Las secuencias de nucleótidos de las formas de realización tamb eden usar para aislar las correspondientes secuencias de otros organ rticularmente otras bacterias, y más particularmente otras cepas de B esta manera, los métodos tales como PCR, hibridación y similar eden usar para identificar dichas secuencias basadas en su homolo cuencia con las secuencias establecidas en la presente. Las secuenci n seleccionadas sobre la base de su identidad de secuencia c cuencias completas establecidas en la presente o con los fragmentos smas están comprendidas por las formas de realización. Dichas secu luyen las secuencias que son ortólogos de las secuencias revela " " uencias de ADN del cADN o ADN genómico extraído de cu anismo de interés. Los métodos para diseñar los cebadores de ación por PCR son generalmente conocidos en el arte son revelad brook y colegas (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ld Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), en los su mbrook". Véase también Innis y colegas, eds. (1990) PCR Protoc ide to Methods and Applications (Academic Press, New York); I lfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); y I lfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New Yor todos conocidos de PCR incluyen, mas no se limitan a, los métodos u adores en pares, cebadores anidados, cebadores específicos si adores degenerados, cebadores específicos de genes, ceb ecíficos de vectores, cebadores parcialmente no combinados y similar En las técnicas de hibridación, toda o parte de la secuen leótidos conocida es usada como una sonda que selectivamente se otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes e ocidos generalmente en el arte y se revelan en Sambrook.

Por ejemplo, una secuencia completa revelada en la presente, o s partes de la misma, se puede usar como una sonda capaz de hibr ecíficamente con las correspondientes secuencias y ARN mensajeros anzar la hibridación específica bajo una variedad de condiciones, das incluyen secuencias que son únicas para las secuencias de las f realización y son por lo general de al menos de alrededor de 10 leótidos en longitud. Dichas sondas pueden ser usadas para am uencias de Cry correspondientes de un organismo elegido por PCR nica puede ser usada para aislar secuencias codificadoras adicionales anismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determi sencia de secuencias codificadoras en un organismo. Las técnic ridación incluyen examen de hibridación de bibliotecas de ADN cult sean placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook).

La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cab diciones rigurosas. El término "condiciones rigurosas" o "condi ñera tal que se detectan los grados inferiores de similitud (s riólogo). Por lo general, una sonda es de menos de alrededor de 1000 leótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las centración de sal es de menos de alrededor de iones de Na 1 camente alrededor de iones de Na 0,01 a 1 ,0 M (u otras sales) a pH y la temperatura es al menos alrededor de 30 °C para sondas corta 10 a 50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60°C para sondas larg más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pued anzadas con la adición de agentes de desestabilización tales mamida. Las condiciones de baja rigurosidad a modo de ejemplo in ridación con una solución tamponada de 30 a 35% de formamida, Na de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en 1X a 2X d X de SSC = NaCI 3,0 M/citrato de trisódico 0,3 M) de 50 a 55° diciones de rigurosidad moderadas a modo de ejemplo incluyen hibri 40 a 45% de formamida, NaCI 1 ,0 M, 1 % de SDS a 37 °C, y un lav ° ución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, el Tm (punto de ica) puede ser aproximado a partir de la ecuación de einkoth y 84) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81 ,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 ( 0,61 (% form) - 500/L; donde la M es la molaridad de los ca novalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guano sina en el ADN, % de form es el porcentaje de formamida en la soluc ridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. El Tm peratura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% d uencia blanco complementaria se híbrida con una sonda perfecta binada. Los lavados por lo general se realizan al menos hasta q anee el equilibrio y un nivel de entorno bajo de hibridación es alcanza o durante 2 horas, 1 hora o 30 minutos.

El Tm es reducido en alrededor de 1 °C por cada 1% de fa binación; por ende, el Tm, hibridación y/o condiciones de lavado se p istar para hibridarse con las secuencias de la identidad desead mplo, si se busca una secuencia con >90% de identidad, el Tm mi ° eado, las personas versadas en el arte entenderán que las variació rigurosidad de la hibridación y/o soluciones de lavado se describ ñera inherente. Si el grado deseado de falta de combinación genera menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se ementar la concentración de SSC para que se pueda usar una tempe erior. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleic uentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistr íecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Cap sevier, New York); y Ausubel y colegas,, eds. (1995) Current Proto lecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience rk). Ver también Sambrook. Por ende, las secuencias aisladas p ificar una proteína Cry de las formas de realización e hibridars diciones rigurosas con las secuencias Cry reveladas en la prese gmentos de las mismas, están comprendidas por las formas de realiza Los siguientes términos son usados para describir las relacion uencias entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "sec " " " " inucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos en la venta paración puede comprender adiciones o deleciones (es decir, esp parados con la secuencia de referencia (que no comprende adicio eciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Por lo gen tana de comparación es de al menos 20 nucleótidos contiguos de Io n forma opcional, puede ser de 30, 40, 50, 100, o más de longitu sonas versadas en el arte entienden que, para evitar una alta similit secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la sec polinucleótidos, se introduce por lo general una penalidad por espaci alty) y se deduce del número de combinaciones.

Los métodos de alineación de secuencias para la comparació ocidos en el arte. Por ende, la determinación de la identidad de sec centual entre cualquiera de dos secuencias se puede lograr usan oritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de dichos algo temáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 5:11 oritmo de alineación local de Smith y colegas, (1981) Adv. Appl. lligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión P, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de program G Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., ranton Road, San Diego, California, USA). Las alineaciones que usan gramas se pueden realizar usando los parámetros por defecto. El pro USTAL es bien descrito por Higgins y colegas, (1988) Gene 73:2 88); Higgins y colegas, (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet y colegas, cleic Acid Res. 16: 10881-90; Huang y colegas, (1992) CABIOS 8:15 arson y colegas, (1994) Meth. Mol. Bioi 25:307-331 El programa ALI a en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Una tabla de resi O PAM120, una penalidad por longitud de espacio de 12, y una pen espacio de 4 se puede usar con el programa ALIGN al compa uencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y c 90) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul ra. Las búsquedas de nucleótidos por BLAST se pueden realizar grama BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para o uencias de nucleótidos homólogas con una secuencia de nucleótid I ¦ * ciones distantes entre moléculas. Ver Altschul y colegas, (1997) ando se usa BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden us ámetros por defecto de los programas respectivos (por ej., BLASTN p uencias de nucleótidos, BLASTX para las proteínas). Véase el sitio w tional Center for Biotechnology Information en Internet en ncbi.hlm.ni alineación también se puede realizar de manera manual por inspecció A menos que se indique lo contrario, los valores de identid uencia/similitud provistos en la presente se refieren al valor ob ndo GAP Versión 10 usando los siguientes parámetros: % de identid similitud para una secuencia de nucleótidos usando GAP Weight d gth Weight de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de ide de similitud para una secuencia de aminoácidos usando GAP Weig ength Weight de 2 y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cu grama equivalente de los mismos. El término "programa equivalente" usa en la presente se refiere a cualquier programa de comparac uencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, lin ensión de espacios en unidades de bases combinadas. GAP debe o beneficio de número por penalidad de creación de espaci bmactones por cada espacio que inserta. Si se elige una penalid ensión de espacio mayor que cero, GAP debe, además, compensa ació insertado de la longitud del espacio multiplicado por la penalid ensión de espacios. Los valores de penalidad por creación de espaci ecto y valores de penalidad por extensión de espacios en la Versión G Wisconsin Genetics Software Package para las secuencias proteic 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos, la penalid ación de espacios por defecto es de 50 mientras que la penalid ensión de espacios por defecto es de 3. Las penalidades por extens acios y creación de espacios se pueden expresar como un número eccionado del grupo de números enteros que consiste de 0 a 200. Por r ejemplo, las penalidades por extensión de espacios y creación de es de ser 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ás. tuación para un par de símbolos es mayor que o igual a 0,50, el umb ilitud. La matriz de puntuación usada en la Versión 10 del paqu gramas GCG Wisconsin Genetics Software es BLOSUM62 (véase H enikoff (1989) Proa Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915). (c) Como se usa en la presente, "identidad de secuen ntidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polip e referencia a los residuos en las dos secuencias que son las ndo se alinean para la correspondencia máxima por sobre una vent nparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuen en referencia con las proteínas, se reconoce que las posiciones iduos que no son idénticos a menudo difieren por sustitucion inoácidos conservativas, donde los residuos de aminoácidos son sustí a otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similare carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no cambian las propie cionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustitu servativas, la identidad de secuencia porcentual se puede ajustar en o y 1. La puntuación de sustituciones conservativas es calculada, p o se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain lifornia). (d) Como se usa en la presente, "porcentaje de identid uencia" significa el valor determinado al comparar dos secu imamente alineadas por sobre una ventana de comparación, en do te de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación prender adiciones o deleciones (es decir, espacios) a comparación uencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) p eación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calcul erminar el número de posiciones en las cuales aparece la base de leico o residuo de aminoácidos idénticos en ambas secuencias ener el número de posiciones combinadas, dividir el número de posi binadas por el número total de posiciones en la ventana de compara ltiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de secuencia. (e) (i) El término "identidad sustancial" de las secuencia eralmente significa la identidad de secuencia de al menos 60%, 70%, , o 95% o más de identidad de secuencia.

Otro indicio de que las secuencias de nucleótidos son sustancial nticas es si dos moléculas se hibridan una con otra bajo condi rosas. En general, las condiciones rigurosas son seleccionad dedor de 5 °C menos que el Tm para la secuencia específica a una ica y pH definidos. No obstante, las condiciones rigurosas compr peraturas en el rango de alrededor de 1 °C a alrededor de 20°C men Tm, dependiendo del grado deseado de rigurosidad como se estipula sente. Los ácidos nucleicos que no se hibridan uno con otr diciones rigurosas son aún sustancialmente idénticos si los polipéptid ifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ej, cuan ia de un ácido nucleico es creada usando la degeneración de co xima permitida por el código genético. Un indicio de que dos secuen do nucleico son sustancialmente idénticas es cuando el polip ificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo e tido. Por ende, un péptido es sustancialmente idéntico a un se tido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente po titución conservativa. Los péptidos que son "sustancialmente sím parten secuencias como se destacó con anterioridad salvo q iciones de residuos que no son idénticas pueden diferir por cam inoácidos conservativos.

El uso del término "constructos de nucleótidos" en la presente n tinado a limitar las formas de realización a constructos de nucleótid prenden ADN. Las personas versadas en el arte reconocen q structos de nucleótidos, particularmente polinucleótidos y oligonucle puestos de ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleóti oxirribonucleótidos, también se pueden emplear en los métodos rev la presente. Los constructos de nucleótidos, ácidos nucleicos, y secu nucleótidos de las formas de realización comprenden, además, tod mas complementarias tales como constructos, moléculas y secu emás, los constructos de nucleótidos, moléculas de nucleóti ormas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras e 0, y similares.

Otra forma de realización se relaciona con un organismo transfo como un organismo seleccionado del grupo que consiste de pla ulas de insectos, bacteria, levadura, baculovirus, protozoo, nematodo organismo transformado comprende: una de molécula de ADN de las f realización, un cásete de expresión que comprende dicha molécula de n vector que comprende dicho cásete de expresión, que puede incorp manera estable en el genoma del organismo transformado.

Las secuencias de las formas de realización se proveen structo de ADN para expresión en el organismo de interés. El con luye secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas en forma operativa uencia de las formas de realización. El termino "ligadas en forma ope o se usa en la presente se refiere a un ligamiento funcional en motor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora i dia transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la se gulación transcripcional de las regiones reguladoras. El constructo d de contener, de manera adicional, genes marcadores seleccionares.

El constructo de ADN incluye en la dirección 5' a 3' de transcripció ión de iniciación de transcripción y traducción (es decir, un promotor uencia de ADN de las formas de realización, y una región de termina scripción y traducción (es decir, región de terminación) funcional anismo que sirve como huésped. La región de iniciación de transcripci ir, el promotor) puede ser nativa, análoga, foránea o heterólog pecto al organismo huésped y/o la secuencia de las formas de reali imismo, el promotor puede ser una secuencia natural o, a modo alter secuencia sintética. El término "foráneo" como se usa en la presente el promotor no se encuentra en el organismo nativo en el cual el pr introducido. Cuando el promotor es "foráneo" o "heterólogo" uencia de las formas de realización, significa que el promotor no motor nativo o de ocurrencia natural para la secuencia ligada en rativa de las formas de realización. Como se usa en la presente, uencia de interés, el huésped de la planta o cualquier combinación mos).

Las regiones de terminación convenientes están disponible a pa lásmido de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminaci opina sintasa y nopalina sintasa. Véase, también, Guerineau y c 91) Mol. Gen. Gene 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:67 facon y colegas (1991 ) Genes Dev. 5: 141-149; ogen y colegas nt cell 2:1261 -1272; unroe y colegas (1990) Gene 91 : 151-158; B egas (1989) Nucleic Acid Res. 17:7891-7903; y Joshi y colegas cleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, un ácido nucleico puede ser optimizado resión incrementada en el organismo huésped. Por ende, cua anismo huésped es una planta, los ácidos nucleicos sintéticos pued tetizados usando codones preferentes de plantas para la exp jorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 9 ra discusión de uso de codones preferentes de huésped. Por ejemplo, e Murray y colegas, supra. En el arte están disponibles los método tetizar genes preferentes de plantas. Véase, por ejemplo, las pa adounidenses Nos. 5.380.831 y 5.436.391 y Murray y colegas cleic Acids Res. 17:477-498, que se incorporan en la presente a mo rencia.

Las modificaciones de secuencias adicionales son conocida rzar la expresión génica en un huésped celular. Éstas incluy inación de secuencias que codifican señales de poliadenilación es ales en sitio de empalme exón-intrón, repeticiones de tipo transp s secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales p resión génica. El contenido de GC de la secuencia puede ser ajus eles promedios para un determinado huésped celular, como se calc erencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. El t lula huésped" como se usa en la presente se refiere a una célul tiene un vector y posibilita la replicación y/o expresión del vec resión. Las células huésped pueden ser células procarióticas tales c ' efalomiocarditis) (Elroy-Stein y colegas, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci 6126-6130); líderes de potivirus, por ejemplo, líder de virus graba aco o TEV (del inglés, Tobacco Etch Virus) (Gallie y colegas, (1995) (2):233-238), líder de virus del mosaico enano del maíz o MDM lés, Maize Dwarf Mosaic Virus); proteína de unión a cadena pesa unoglobulina humana (BiP) (Macejak y colegas, (1991) Nature 353:9 r no traducido de mARN de proteína de revestimiento del virus del m la alfalfa (AMV, del inglés Alfalfa Mosaic Virus ARN 5) (Jobling y co 87) Nature 325:622-625); líder del virus del mosaico de tabaco (TM lés Tobacco Mosaic Virus) (Gallie y colegas, (1989) en Molecular Biol A, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); y líder del virus del m rótico de maíz (MCMV, del inglés Maize Clorotic Motile Virus L mmel y colegas, (1991) Virology 81 :382-385). Ver, además, Della-Ci egas, (1987) Plant Physiol. 85:965-968.

Al preparar el cásete de expresión, los varios fragmentos de den ser manipulados, a fin de proveer las secuencias de ADN ultado deseado. Los ácidos nucleicos pueden ser combinado motores constitutivos, preferentes de tejidos, inducibles, u otros prom a expresión en el organismo huésped. Los promotores consti cuados para uso en una célula huésped vegetal incluyen, por ejem eo del promotor del promotor Rsyn7 y otros promotores consti elados en WO 99/43838 y la patente estadounidense No. 6.072. O eo del promotor 35S del CaMV (Odell y colegas, (1985) Nature 31 ); actina del arroz (McEIroy y colegas, (1990) Plant cell 2:16 quitina (Christensen y colegas, (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-ristensen y colegas, (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU ( egas, (1991 ) Theor. Appl. Genet 81 :581-588); MAS (Velten y co 84) EMBO J. 3:2723-2730); promotor de ALS (Patente US No. 5.659. ilares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los rev las patentes estadounidenses Nos. 5.608.149, 5.608.144, 5.60 69.597, 5.466.785, 5.399.680, 5.268.463, 5.608.142 y 6.177.611.

Dependiendo del resultado buscado, puede ser beneficioso expr nt Mol. Biol. 22: 783-792; Eckelkamp y colegas (1993) FEBS Letter 76); gen MPI (Corderok y colegas (1994) Plant J. 6(2): 141-150); y sím se incorporan en la presente a modo de referencia.

Asimismo, los promotores inducibles por patógenos se pueden e los métodos y constructos de nucleótidos de las formas de realiz ho promotores inducibles por patógenos incluyen las proteínas relacio patogénesis (proteínas PR, del inglés Pathogenesis-Related), qu ucidas después de la infección por patógeno; por ej., proteína teínas SAR, beta-1 t3-glucanasa, chitinasa, etc. Véase, por ejemplo, olegas (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes y colegas nt Cell 4: 645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. más, la WO 99/43819, incorporada en la presente a modo de referenc Son de interés los promotores que están expresadas localmente o sitio de infección por patógenos. Véase, por ejemplo, Marineau y c 87) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton y colegas (1989) Molecular robe Interactions 2:325-331 ; Somsisch y colegas (1986) Proc. Nati.

Los promotores regulados por químicos se pueden usar para mod resión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regula micos exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede s motor inducible por químicos, en donde la aplicación del químico ind resión génica o un promotor reprimible por químicos, en donde la apli químico reprime la expresión génica. Los promotores inducible micos son conocidos en el arte e incluyen, mas no se limitan a, el pr -2 de maíz, que es activado por ajustadores herbicidas de be fonamida, el promotor GST de maíz, que es activado por comp ctrofílicos hidrofóbicos que son usados como herbicidas pre-emerge promotor PR-1a, de tabaco que es activado por ácido salicílico. motores regulados por químicos de interés incluyen promotor puesta a esteroides (véase, por ejemplo, el promotor inducibl cocorticoides, en Schena y colegas (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. : 10421 -10425 y McNellis y colegas (1998) Plant J. 14(2):247-2 motores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (véa mpio, Gatz y colegas (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las pa egas (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331 -1341 ; Van Camp y colegas nt Physiol. 112(2):525-535; Canevascini y colegas (1996) Plant P (2):513-524; Yamamoto y colegas (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):77 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181 -196; Orozco y colegas nt Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka y colegas (1993) Proc Nati USA 90(20):9586-9590; y Guevara-Garcia y colegas (1993) Pi ):495-505. Dichos promotores pueden ser modificados, de ser nec a la expresión débil.

Los promotores preferentes de hojas son conocidos en el arte. ejemplo, Yamamoto y colegas (1997) Plant J. 12(2):255-265; K egas (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto y colegas (1994) il Physiol. 35(5)773-778; Gotor y colegas (1993) Plant J. 3:509-18; Or egas (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; y Matsuoka y colegas e. Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

Los promotores preferentes de raíz o específicos de raíz son con e pueden seleccionar a partir de los que se encuentran disponibles gas, (1990) Plant Cell 2(7):633-651 , donde se describen dos prom ecificos de raíces aislados de genes de hemoglobina de la Para ersonii no leguminosa de fijación de nitrógeno y la Trema tomento uminosa de no fijación de nitrógeno relacionada. Los promotores de es se ligaron a un gen informante de ß-glucuronidasa y se introd to en la Nicotiana tabacum no leguminosa y la Lotus comí uminosa, y en ambos casos se conservó la actividad del promotor esp raíz. Leach y Aoyagi (1991 ) describen su análisis de los promotores es de inducción de raíz rolC y roID altamente expresados de Agrobac ogenes (ver Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Concluyeron q erminantes de ADN preferentes de tejido y potenciadores están diso esos promotores. Teeri y colegas, (1989) usaron fusión génica a lac strar que el gen de T-ADN de Agrobacterium que codifica octopina especialmente activo en la epidermis de la punta de raíz y que el ge específico de raíz en la planta intacta y estimulado por daño en el tej hoja, una combinación especialmente deseable de las característica con un gen insecticida o larvicida (ver EMBO J. 8(2):353-350). El gen semillas, tales como los promotores de proteínas de almacenamie illas) así como también los promotores "de germinación de se uellos promotores activos durante la germinación de las semillas). mpson y colegas (1989) BioEssays 10:108, incorporada en la pres do de referencia. Dichos promotores preferentes de semillas incluye se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citoquinina, del inglés Cyt uced Message)\ cZ19B1 (zeína de maíz 19 kDa); milps (mio-ino fato sintasa) (ver la patente estadounidense No. 6.225.529; que se inc a presente a modo de referencia). Gamma-zeína y Glob-1 son prom ecíficos de endosperma. Para las dicotiledóneas, los prom ecíficos de semillas incluyen, mas no se limitan a, ß-faseolina de la ina, ß-conglicinina, lecitina de soja, cruciferina, y similares. Pa nocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, mas itan a, zeína de maíz 15 kDa, zeína 22 kDa, zeína 27 kDa, g-zeína, c ogido (shrunken) 1 , encogido 2, globulina 1 , etc. Ver también l 12733, donde se revelan los promotores preferentes de semillas es de extremol y extremo2 que se incorpora en la presente a mo dedor de 1/1000 transcriptos a alrededor de 1/100000 transcrip dedor de 1/500000 transcriptos. A modo alternativo, se reconoce ino "promotores débiles" también comprende promotores que resión solamente en pocas células y no en otras para brindar un ni resión bajo total. Cuando un promotor dirige expresión a ceptablemente altos, las partes de la secuencia promotora se p ecionar o modificar para reducir niveles de expresión.

Dichos promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo, el promotor del promotor Rsyn7 (WO 99/43838 y patente estadouniden 72.050), el núcleo del promotor de 35S CaMV, y similares. Otros prom stitutivos incluyen, por ejemplo, los revelados en las pa adounidenses Nos. 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121 , 5.569.597, 5.46 99.680, 5.268.463, 5.608.142 y 6.177.611 ; que se incorporan en la pr odo de referencia.

Por lo general, el cásete de expresión comprende un gen ma eccionable para la selección de células transformadas. Los genes marc :209-213; y Meijer y colegas (1991 ) Piant Mol. Biol. 16:807 reptomicina (Jones y colegas (1987) Mol. Gen. Genet 270:8 ectinomicina (Bretagne-Sagnard y colegas (1996) Transgenic Res. ); bleomicina (Hille y colegas (1990) Plant Mol. Biol. 7: 171 onamida (Guerineau y colegas (1990) Plant Mol. Biol. 15. M7 imoxinilo (Stalker y colegas (1988) Science 242:419-423); glifosato (S egas (1986) Science 233:478-481 ; y las solicitudes de estadounid S. 0/004.357; y 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock y colegas (1987) 6:2513-2518). Véase, en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biot -511 ; Christopherson y colegas (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 8; Yao y colegas (1992) Cell 71 : 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Micro 9-2422; Barkley y colegas (1980) en The Operon, pp. 177-220; Hu y c 87) Cell 48: 555-566; Brown y colegas (1987) Cell 49: 603-612; F egas (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle y colegas (1989) Proc. Nati. Aca A 86: 5400-5404; Fuerst y colegas (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3; Deuschle y colegas (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) sis, University of Heidelberg; Reines y colegas (1993) Proc. Nati. Aca timicrob. Agents Chepolillaer. 36: 913-919; Hlavka y colegas (1985) Han xperimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); y Gilí y c 88) Nature 334: 721-724. Dichas divulgaciones se incorporan en la pres do de referencia.

La lista anterior de genes marcadores seleccionabas no inten itativa. Cualquier gen marcador seleccionare puede ser usado mas de realización.

Los métodos de las formas de realización implican introdu ipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducir" hace refere sentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de manera tal uencia gane acceso al interior de una célula de la planta. Los méto formas de realización no dependen de un método particular para intr polinucleótido o polipéptido en una planta, solamente que el polinucle ipéptido gana acceso al interior de al menos una célula de la plant todos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en las planta ocidos en el arte e incluyen, mas no se limitan a, métod oducir secuencias de polipéptidos o polinucleótidos en plantas pueden ún el tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledó otiledónea, dirigida para la transformación.

Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótid ulas vegetales y posterior inserción en el genoma de la planta in roinyección (Crossway y colegas, (1986) Biotechniques 4:3 ctroporación (Riggs y colegas, (1986) Proa Nati. Acad. Sci. 5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (pa adounidenses Nos. 5.563.055 y 5.981.840), transferencia directa de szkowski y colegas, EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración de pa ística (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 4.94 79.918, 5.886.244 y 5.932.782, Tomes y colegas (1995) en Plan sue, and Organ Culture: Fundamental Methods ed. Gamborg y ringer-Verlag, Berlín); y McCabe y colegas (1988) Blotechnology 6 ); y transformación de Lec1 (WO 00/28058). Para la transformac as, ver Tu y colegas (1998) Plant Molecular Biology 37: 829-838 y C - 59-563 (maíz); las patentes estadounidenses Nos. 5.240.855, 5.322. 24.646; Klein y colegas (1988) Plant Physiol. 91 : 440-444 (maíz); Fr egas (1990) Biotechnology 8: 833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogt egas (1984) Nature (London) 311 : 763-764; la patente estadouniden 36.369 (cereales); Bytebier y colegas (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. U 5-5349 (Liliaceae); De Wet y colegas (1985) en The Experi nipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colegas (Longman, New 197-209 (polen); Kaeppler y colegas (1990) Plant Cell Reports 9: 415 eppler y colegas (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transfor diada por fibras); D'Halluin y colegas (1992) Plant cell 4: 149 ctroporación); Li y colegas (1993) Plant Cell Reports 2: 250-255 y C ord (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda y colegas ture Biotechnology 14: 745-750 (maíz vía Agrobacteríum tumefaciens); cuales se incorporan en la presente a modo de referencia.

En formas de realización específicas, las secuencias de las for lización se pueden proveer a una planta usando una variedad de m rnativo, el polinucleótido de toxina Cry puede ser transformado en sitoria en la planta usando técnicas conocidas en el arte. Dichas té luyen sistema vector viral y la precipitación del polinucleótido en una evita la liberación subsiguiente del ADN. Por ende, la transcripci N enlazado a partícula puede ocurrir, pero Ea frecuencia con la c rado para ser integrado en el genoma es altamente reducida. odos incluyen el uso de partículas revestidas con polietilimina (PEI; 3143).

Se conocen en el arte métodos para la inserción dirigida inucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. ma de realización, la inserción del polinucleótido en una ubicación gen eada se alcanza usando un sistema de recombinación específica d ase, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/ 099/25853, todas las cuales se incorporan en la presente a mo erencia. Brevemente, el polinucleótido de las formas de realización ar contenido en el cásete de transferencia flanqueado por dos siti gas (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden ser ivadas, y además polinizadas con la misma cepa transformada o bie as diferentes, y el híbrido resultante que tiene la expresión constit ucible de la característica fenotípica deseada es identificado. Dos eraciones pueden ser cultivadas para asegurar que la expresión acterística fenotípica deseada sea mantenida y heredada en forma e luego las semillas pueden ser cosechadas para asegurar que anzado la expresión de la característica fenotípica deseada.

Las secuencias de nucleótidos de las formas de realización pued vistas a la planta al poner en contacto la planta con un virus o leicos virales. En general, dichos métodos implican incorporar el con nucleótidos de interés en una de molécula de ARN o ADN viral. Se rec las proteínas recombinantes de las formas de realización pued ialmente sintetizadas como parte de una poliproteína viral, teriormente puede ser procesada por proteolisis in vivo o in vitr ducir el pesticida de proteínas deseado. También se reconoce que Las formas de realización también se relacionan con el mater pagación vegetal de una planta transformada de las formas de reali incluyen, mas no se limitan a, semillas, tubérculos, cormos, bulbos, ortes de raíces y tallos.

Las formas de realización pueden ser usadas para transformaci lquier especie vegetal que incluye, mas no se limita a, monocotiledó otiledóneas. Los ejemplos de las plantas de interés incluyen, mas itan a, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ej., B. napus, B. rapa, B. j ticularmente las especies Brassica útiles como fuente de aceite de s ifa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), rghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ej., mijo perla (Penn ucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria i o dedo (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Cart torius), tr\go(Triticum aestivum), soja (Glicina max), tabaco (Ni acum), papa (Solanum tuberosum), cacahuete (Arachis hypogaea), al ssypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea b r ej.( Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías aseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.), y miembros del género C s como pepino (C. sativus), cantalope (C. cantalupensis), y melón almi meló). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron tensia {Macrophyila hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas .), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias ( rida), claveles (Dianthus caryophyllus), flor de Pascua (Eup cherrima), y crisantemo. Las coniferas que pueden ser empleadas al llev ctica las formas de realización incluyen, por ejemplo, pinos tales com da (Pinus taeda), pino de incienso (Pinus elliotii), pino ponderoso derosa), pino poste-huésped (Pinus conforta), y pino Monterrey iata) abeto douglas (Pseudotsuga menziesii); tsuga del pacífico ( adensis)', picea de sitka (Picea glauca): secoya (Sequoia semper tos reales como abeto blanco (Abies amabilis) y abeto balsámico samea); y cedros tales como tuya gigante (Thuja plicata) y ciprés a amaecyparis nootkatensis). Las plantas de las formas de realización in ntas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, al enne): festuca roja {Festuca rubra): copa rojiza (Agrostis alba): poa a trívialis): festuca para ovejas (Festuca ovina); lanco suave (Bromus in tuca alta (Festuca arundinacea); timothy (Phleum pratense): ag rciopelado (Agrostis canina): pasto alcalino trepador (Puccinellia di to del trigo del oeste (Agropyron smithii); pasto Bermuda (Cynodon to San Agustín (Stenotaphrum secundatum): pasto zoysia (Zoysia spp.); hía (Paspalum notatum): cañamazo (Axonopus affinis): pasto escolo emochloa ophiuroides): pasto kikuyu (Pennisetum clandesinum): palum de costa (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); alo (Buchloe dactyloids): grama de avena (Bouteloua curtipendula).

Las plantas de interés incluyen plantas de granos que proveen s interés, plantas de semilla de aceite y plantas leguminosas. Las semil rés incluyen de semillas de granos, tales como maíz, trigo, cebada, go, centeno, mijo, etc. Las plantas de semilla de aceite incluyen al a, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, lino, ricino, oli plantas leguminosas incluyen judías y arvejas. Las judías incluyen 93.881 ; y Geiser y colegas (1986) Gene 48:109), pentina (descrita ente estadounidense No. 5.981.722) y similares. Las combina eradas también pueden incluir múltiples copias de cualquier inucleótidos de interés. Los polinucleótidos de las formas de reali bién se pueden apilar con cualquier gen o combinación de gene ducir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos desead luyen mas no se limitan a rasgos deseables para alimento animal tales es de aceite alto (por ej., la patente estadounidense No. 6.23 inoácidos equilibrados (por ej. hordotioninas (las patentes estadounid S. 5.990.389, 5.885.801 , 5.885.802, and 5.703.049); alta lisina en C liamson y colegas, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20 teínas de alta metionina (Pedersen y colegas, (1986) J. Biol. :6279; Kirihara y colegas, (1988) Gene 71 :359; y Musumura y c 89) Plant Mol. Biol 12: 123)); digestibilídad incrementada (por ej., pro almacenamiento modificadas (Solicitud estadounidense Acta 053.410, presentada el 7 de noviembre de 2001); y tioredoxinas (S adounidense Acta No. 10/005.429, presentada el 3 de diciembre de ; inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (p bar); y resistencia a glifosato (gen EPSPS y gen GAT como se revei solicitudes estadounidenses Nos. 10/004.357 y 10/427.692); y r eables para productos de proceso o procesamiento tales como acei r ej., patente estadounidense No. 6.232.529 ); aceites modificados (p es desaturasa de ácidos grasos (patente estadounidense No. 5.95 94/11516)); almidones modificados (por ej., ADPG pirofosfo Pase), sintasas de almidón (SS, del inglés Starch Synthases), enzi ificación de almidón (SBE del inglés, Starch Branching Enzymes) y e desramificación de almidón (SDBE del inglés, Starch Debra zymes)); y polímeros o bioplásticos (por ej., Patente US No. 5.602.321 otiolasa, polihidroxibutirato sintasa, y acetoacetil-CoA reductasa (Sch egas, (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresi ihidroxialcanoatos (PHAs)), cuyas divulgaciones se incorporan a la pr odo de referencia. Uno también podría combinar los polinucléotidos mas de realización con polinucléotidos que proveen rasgos agrónomo o esterilidad masculina, (por ej., ver la patente estadounidens polinucleótidos de interés se pueden combinar en cualquier moment lquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende s rasgos deseados se pueden usar como el blanco para introducir r cionales mediante transformación subsiguiente. Los rasgos se p oducir de manera simultánea en un protocolo de co-transformación c inucléotidos de interés provistos por cualquier combinación de los c transformación. Por ejemplo, si se introducen dos secuencias, la uencias pueden estar contenidas en casetes de transformación sep ns) o contenidas en el mismo cásete de transformación (cis). La exp las secuencias se puede dirigir mediante el mismo promotor o me rentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introdu ete de transformación que suprime la expresión del polinucleóti rés. Esto se puede combinar con cualquier combinación de otros c supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combi eada de rasgos en la planta. También se reconoce que las secuenc inucleótidos pueden ser apiladas en una ubicación genómica de ndo un sistema de recombinación específica de sitio. Véase, por ej Antes de que el material de propagación vegetal (frutos, tub bo, cormo, granos, semillas), pero especialmente semillas, sea v o producto comercial, se trata en forma habitual con un revesti tector que comprende herbicidas, insecticidas, fungicidas, bacter aticidas, moluscidas, o mezclas de varias de estas preparaciones, ea, junto con otros portadores, agentes tensioactivos, o adyuvant mueven la aplicación empleados de manera habitual en el arte mulación para brindar protección en contra del daño causado por pla terias, hongos o animales. A fin de tratar la semilla, el revesti tector puede ser aplicado a las semillas ya sea impregnando los tubé ranos con una formulación líquida o bien revistiendo los tubérculos o una formulación seca o húmeda combinada. Asimismo, en eciales, otros métodos de aplicación a plantas son posibles, por tamiento dirigido a los yemas o los frutos.

La semilla de la planta de las formas de realización que compren uencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida de las for dén usar para transformar organismos patogénicos de insectos. anismos incluyen baculovirus, hongos, protozoo, bacteria y nematodos Un gen que codifica una proteína pesticida de las formas de reali de ser introducido mediante un vector adecuado en un huésped micro icho huésped se aplica al medio ambiente, o a las plantas o anímal ino "introducido" en el contexto de insertar un ácido nucleico en una e referencia a la "transfección" o "transformación" o "transducción" e i eferencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucari cariótica donde el ácido nucleico puede ser incorporado en el genom ula (por ej., ADN mitocondrial, cromosómico, plasmídico o plast vertido en un replicón autónomo, o expresado en forma transitoria ( RN transfectado).

Los huéspedes de microorganismos que se conocen por ocu esfera" (filoplano, filoesfera, rizoesfera y/o rizoplano) de uno o más C interés pueden ser seleccionados. Estos microorganismos eccionados de manera tal que sean capaces de competir exitosament ticularmente levadura, por e/., Saccharomyces, Cryptoc yveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. S ticular interés las especies bacterianas de fitoesferas tales udomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia maree tobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas sphe thomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaügenes enír vibacter xyli y Azotobacter vinelandii y las especies de levadu esferas tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aura ptocoecus albidus, C. diffiuens, C. laurentii, Saccharomyces ros toriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyvero onae, y Aureobasidium pollulans. Son de particular interé roorganismos pigmentados.

Están disponibles un número de formas para introducir un ge resa la proteína pesticida en el huésped de microorganismo diciones que permiten el mantenimiento y expresión estables del ge mplo, pueden ser construidos los casetes de expresión que incluy ce ribosomales, un codón de iniciación, señales de terminación y sími se, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.039.523 y 4.85 0 0480762A2; Sambrook y colegas (1992) Molecular Cloning: A Labo ual, ed. Maniatis y colegas (Coid Spring Harbor Laboratory Press, ing Harbor, New York), en lo sucesivo "Sambrook II"; Davis y colega 80) Advanced Bacterial Genetics (Coid Spring Harbor Laboratory ld Spring Harbor, New York; y las referencias allí citadas.

Las células huésped adecuadas, donde las células que con ticidas de proteínas se tratan para prolongar la actividad de las pro ticidas en la célula cuando la célula tratada es aplicada al medio am la(s) plaga(s) blanco, pueden incluir ya sean procariotas o euca malmente limitándose a aquellas células que no producen sust icas a organismos superiores, tales como mamíferos. No obstante, p rse los organismos que producen sustancias tóxicas a orga eriores, donde la toxina es inestable o el nivel de aplicad icientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad s como Saccharomyces y Schizosaccharomyces y lev idiomycetes, tal como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomy ilares.

Las características de interés particular para seleccionar una sped a tos efectos de producción de proteínas pesticidas inclu ilidad de introducir el gen de proteína pesticida en el huésped, disponi sistemas de expresión, eficiencia de expresión, estabilidad de la prote huésped y la presencia de capacidades genéticas auxiliares acterísticas de interés para uso como microcápsulas de pesticidas in lidades protectoras para el pestictda, tales como paredes celulares gr mentación y envasado intracelular o formación de cuerpos de ind idad de la hoja; falta de toxicidad mamífera; atracción a plaga estión; facilidad para exterminio y reparo sin daño a la toxina; y si as consideraciones incluyen facilidad de formulación y manejo, eco abilidad de almacenamiento y similares.

Los organismos huésped de particular interés incluyen levadu m-negativas.

Las bacterias colonizadoras de raíz, por ejemplo, pueden ser aisla planta de interés mediante los métodos conocidos en el ecíficamente, una cepa de Bacillus cereus que coloniza raíces pue lada de las raíces de una planta (véase, por ejemplo, Handelsman y c 91 ) Appl. Environ. Microbio!. 56:713-718). Los genes que codific teínas pesticidas de las formas de realización pueden ser introducid cillus cereus que coloniza la raíz mediante métodos estándares con el arte.

Los genes que codifican proteínas pesticidas pueden ser introd ejemplo, en el Bacillus que coloniza la raíz por medi etrotransformación. Específicamente, los genes que codifican las pro ticidas pueden ser clonados en un vector lanzadera, por ejemplo, pH recius y colegas (1989) FEMS Microbio!. Letts. 60: 211-218. El zadera pHT3101 que contiene la secuencia codificadora del gen de pr ticida particular puede, por ejemplo, ser transformado en el B po y/o costos reducidos de recuperación y purificación por unid teína.

Las proteínas pesticidas pueden realizarse para ser segregadas /, por ejemplo, fusionando un péptido señal de E. coli apropiado c remo amino-terminal de la proteína pesticida. Los péptidos onocidos por E. coli se pueden encontrar en las proteínas que se con regan en E co//t por ejemplo la proteína OmpA (Ghrayeb y colegas IBO J, 3:2437-2442). La OmpA es una proteína principal de la me erior de E coli y, por ende, se cree que su péptido señal es eficient ceso de translocación. Además, el péptido señal OmpA no necesi dificado antes del procesamiento, como puede ser el caso con ptidos señal, por ejemplo, péptido señal de lipoproteína (Duffaud y c 87) Meth. Enzymol. 153: 492).

Las proteínas pesticidas de las formas de realización pued mentadas en un huésped bacteriano y la bacteria resultante es proce da como un asperjado microbiano de la misma manera que las ce erjadas como insecticida (Gaertner y colegas (1993), en: Adv ineered Pesticides, ed. Kim).

A modo alternativo, las proteínas pesticidas son prod oduciendo un gen heterólogo en un huésped celular. La expresión d erólogo genera, de manera directa o indirecta, la producci ntenimiento intracelular del pesticida. Estas células se tratan lueg diciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la ndo la célula es aplicada al medio ambiente de la(s) plaga(s) blan ducto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estas proteínas pes uralmente encapsuladas pueden luego ser formuladas de acuerd nicas convencionales para la aplicación al medio ambiente que aloj ga blanco, por ej., tierra, agua y follaje de las plantas. Véase, por ej A 0192319, y las referencias citadas en la misma.

En las formas de realización, un microorganismo transformad luye organismos completos, células, espora(s), proteína(s) pestic ponente(s) pesticida(s), componente(s) de impacto sobre la posiciones formuladas pueden ser preparadas por medios convenci s como desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtr trifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de célula prende el polipéptido.

Dichas composiciones reveladas con anterioridad pueden ser obt diante la adición de un agente de superficie activa, un portador iner servante, un humectante, un estimulante de alimentación, un atraye nte de encapsulación, un aglutinante, un emulsionante, un coloran tector UV, un tampón, un agente de flujo o fertilizante, do ronutrientes u otras preparaciones que influencian el cultivo vegetal. s agroquímicos incluyen, mas no se limitan a, herbicidas, insect gicidas, bactericidas, nematicidas, moluscidas, acaricidas, regulador tivo vegetal, auxiliares de cosecha, y fertilizantes, pueden ser combi portadores, agentes tensioactivos o adyuvantes empleados de itual en el arte de la formulación u otros componentes que facili nejo y aplicación del producto para las plagas blanco particulare Las composiciones de las formas de realización pueden ser aplicad ñera simultánea o sucesiva con otros compuestos. Los métodos para ingrediente activo de las formas de realización o una comp oquímica de las formas de realización que contiene al menos una teínas pesticidas producidas por las cepas bacterianas de las form lización incluyen, mas no se limitan a, aplicación foliar, revestimie illas y aplicación en la tierra. El número de aplicaciones y la ta icación dependen de la intensidad de la infestación por la respondiente.

Los agentes de superficie activa adecuados incluyen, mas no se l compuestos aniónicos tales como carboxilato de, por ejemplo, un me boxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mon eres de ácido fosfórico con etoxilados de alcohol graso o sales de eres; sulfatos de alcohol graso tales como dodecil sulfato sódico, oc fato sódico o cetil sulfato sódico; sulfatos de alcohol graso etoxi fatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de pe eres grasos de éteres de alcohol poíihídrico, por ej., ésteres de ácido sorbitan, productos de condensación de dichos ésteres con óxido de e ej., ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitán, copolímeros en óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales t7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol, o glicoles acetilénico etoxilados. Los eje un agente de superficie activa catiónico incluyen, por ejemplo, una o poliamina alifática tal como un acetato, naftenato u oleato; o amin tiene oxígeno tal como óxido de amina de polioxietileno alquilamin ina enlazada a amida preparada por la condensación de un boxílico con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternario.

Los ejemplos de materiales inertes incluyen, mas no se limi erales inorgánicos tales como caolína, filosilicatos, carbonatos, su fatos, o materiales botánicos tales como corteza, mazorca de vorizada, cascaras de maní, cáscaras de arroz, y cáscaras de almendr Las composiciones de las formas de realización pueden estar en cuada para la aplicación directa o como un concentrado de la comp En otra forma de realización, las composiciones, así como tambi roorganismos transformados y proteínas pesticidas de las form lización, se pueden tratar antes de la formulación para prolongar la act ticida cuando se aplica al medio ambiente de una plaga blanco siemp retratamiento no sea perjudicial a la actividad pesticida. Dicho trata de ser por medio químico y/o físico siempre que el tratamiento no afe ñera perjudicial las propiedades de la(s) composición(es). Los ejemp ctivos químicos incluyen mas no se limitan a agentes de halógen hídos tales como formaldehído y glutaraldehído; anti-infectivos, tales ruro de zefirán; alcoholes, tales como isopropanol y etanol; y fij tológicos, tales como fijador de Bouin y fijador de Helly (véase, por ej mason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman y Co.).

En otras formas de realización, puede ser ventajoso trat ipéptidos de toxina Cry con una proteasa, por ejemplo tripsina, para roteína antes de la aplicación de una composición de proteína pestic formas de realización al medio ambiente de la plaga blanco. Los m Las composiciones (que incluyen los microorganismos transform teínas pesticidas de las formas de realización) pueden ser aplica dio ambiente de una plaga de insectos mediante, por ejemplo, asp mizaciónt polvorización, diseminación, revestimiento o verti educción en o sobre la tierra, introducción en agua de irrigació amiento de semillas o por aplicación o polvorización general al mome la plaga comenzó a aparecer o antes de la aparición de las plagas dida de protección. Por ejemplo, la proteína pesticida y/o microorga sformados de las formas de realización pueden ser mezclados con el a proteger el grano durante el almacenamiento. En general es imp ener un buen control de plagas en las etapas tempranas de del etal, ya que es el momento en el que la planta es casi más severa ada. Las composiciones de las formas de realización pueden conte ñera conveniente, otro insecticida, si se considera necesario. En una realización, la composición es aplicada directamente a la tierra, al tie plantación, en forma granular de una composición de un portador y ertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de las f dén incluir plagas en productos almacenados, agrónomas, foréstal rnadero, macetas, plantas ornamentales, comida y fibra, salud ani lica, estructura doméstica y comercial y viviendas. Las plagas de in luyen insectos seleccionados del grupo seleccionados del ord eópteros, dípteros, himenópteros, lepidópteros, malófagos, homó mípteros, ortópteros, tisanópteros, dermápteros, isópteros, anó nápteros, tricópteros, etc., particularmente coleópteros y lepidópteros.

Las larvas del orden de los lepidópteros incluyen, mas no se limi anos soldados, gusanos cortadores, saltamontes, y heliotinas en la ctuidae Spodópteros frugiperda JE Smith (gusano soldado de otoñ gua Hübner (gusano soldado de la remolacha); S. litura Fabricius (g tador de tabaco, oruga excavadora); Mamestra configurata Walker (g dado bertha); M. brassicae Linnaeus (polilla del repollo); Agrotis fnagel (gusano cortador negro); A. orthogonia Morrison (gusano corta te); A. subterránea Fabricius (gusano cortador granulado); Al iilacea Hübner (gusano de la hoja del algodón); Trichoplusia ni ra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (gusano cortador del cítrico); icosta Smith (gusano cortador del frijol del oeste); gusanos taladra renadores, gusanos peludos, gusanos belloteros, y gusanos depred la familia de pirálidos Ostrinia nubilalis Hübner (oruga taladradora eur yelois transitella Waiker (gusano de la naranja naval); Anagasta kue ler (polilla de la harina mediterránea); Cadra cautella Waiker (polilla endra); Chilo suppressalis Waiker (taladrador del vástago del arro tellus, (taladrador del sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (polil oz); Crambus caliginosellus Clemens (gusano peludo de la raíz del ma rrellus Zincken (gusano peludo de la poa); Cnaphalocrocis me enée (enrollador de la hoja de arroz); Desmia funeralis Hübner (enr la hoja de la vid); Diaphania hyalinata Linnaeus (gusano del meló dalis Stoll (gusano del pimiento); Diatraea grandiosella Dyar dradora del sudoeste), D. saccharalis Fabricius (taladrador de la ca car); Eoreuma loftini Dyar (taladrador de arroz mejicano); Ephestia bner (polilla del tabaco (cacao)); Gallería mellonella Linnaeus (polilla d s grande); Herpetogramma licarsisalis Waiker (gusano peludo del cé eris gloverana Walsingham (gusano de la yema de lomo negro del oes iana Fernald (gusano de la yema de lomo negro del este); A yrospila Walker (enrollador de la hoja del árbol de frutos); A. r naeus (enrollador de la hoja europeo); y otras especies A xophyes orana Fischer von Rósslerstamm (polilla tortrix de fruto e hylis hospes Walsingham (polilla de girasol con bandas); Cydia latife lsingham (filaría); C. pomonella Linnaeus (polilla de la pera y nzana); Platynota fíavedana Clemens (enrollador de la hoja); P. s lsingham (enrollador de la hoja omnívoro); Lobesia botrana De iffermüller (polilla de la vid europea); Spiionota oceliana De iffermüller (polilla de las yemas con motas); Endopiza viteana Cí lilla de los arándanos); Eupoecilia ambiguella Hübner (polilla de la nagota salubrícola Meyrick (enrollador de la hoja de la manzana de pholita molesta Busck (polilla del fruto oriental); Suleima heiianthan lilla de la yema de girasol); Argyrotaenia spp. Choristoneura spp..

Otras plagas agrónomas seleccionadas en el orden de los lepidó marrón); Harrisina americana Guérin-Méneville (gusano depredador de vid); Hemileuca oüviae Cockrell (oruga); Hyphantria cunea sano peludo de otoño); Keiferia ¡ycopersicella Walsingham (lomb ate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Huist (saltamontes de tsuga orient ellaria lugubrosa Huist (saltamontes de tsuga occidental); Leucoma aeus (polilla de satén); Lymantria dispar Linnaeus (polilla gitana); Ma quemaculata Haworth (halcón polilla de cinco motas, gusano de c tomate); M. sexta Haworth (gusano de cuernos del tomate, gusa rnos del tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (polilla de invi eacrita vernata Peck (oruga americana de primavera); Papilio cresp mer (cola de golondrina gigante, oruga de la mariposa); Phryg ifornica Packard (gusano del roble de California); Phyllocnistis inton (minador de hojas de cítrico); Phyllonorycter blancardella Fa nador de hojas ientiforme moteado); Pieris brassicae Linnaeus (ma nca grande); P. rapae Linnaeus (mariposa blanca pequeña); naeus (mariposa blanca con venas verdes); Platyptilia carduidactyla lilla de la alcachofa); Plutella xylostella Linnaeus (polilla lomo de dia Son de interés las larvas y los adultos en el orden de los coleópter uyen gorgojos de las familias antríbidos, brúquidos y curculiónido lusión de, mas sin limitarse a: Anthonomus grandis Boheman (gorg odón); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgojo de agua del phHus granarius Linnaeus (gorgojo del trigo); S. oryzae Linnaeus (g arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgojo de la hoja de t indrocopturus adspersus LeConte (gorgojo de vastago de gi icronyx fulvus LeConte (gorgojo de semilla de girasol rojo); S. so onté (gorgojo de semilla de girasol gris); Sphenophorus maidis Chitt inche del maíz)); escarabajos, escarabajos de pepino, gusanos de l arabajos de las hojas, escarabajos de la papa, y minadores de hoja ilia de los crisomélidos (que incluyen, mas no se limitan a: Leptin emíineata Say (escarabajo de papa de Colorado); Diabrotica vi ifera LeConte (gusano de la raíz de maíz del oeste); D. barberi Sr rence (gusano de la raíz del maíz del norte,); D. undecimpunctata h rber (gusano de la raíz del maíz del sur); Chaetocnema pulicaria Mels carabajo del maíz); Phyllotreta cruciferae Goeze (escarabajo del zotrogus majalis Razoumowsky (chapulín europeo); Phyllophaga meister (larva blanca); Ligyrus gibbosus De Geer (escarabaj ahoria)); escarabajos de la familia de derméstidos; ciempiés de la fam éridos, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius otes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; escarabajos de troncos de la f escolítidos y escarabajos de la familia de tenebriónidos.

Los adultos e inmaduros del orden de los dípteros son de inte luyen los minadores de hojas Agromyza parvimaízis Loew (minador de nchado de maíz); mosquitas (con inclusión de, mas sin limita tarinia sorghicola Coquillett (mosquita del sorgo); Mayetiola destruct sca Hessian); Sitodipfosis mosellana Géhin (mosquita del ofasiópteros murtfeldtiana Felt, (mosquita de la semilla de girasol)); m frutos (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas frit); cresas usión de, mas sin limitarse a: Delta píatura eigen (cresa de la sem íz); D. coarctata Fallen (mosca del bulbo del trigo); y otras Delta romyza americana Fitch (cresa del vástago del trigo); Musca do Se incluyen insectos de interés adultos y ninfas del orden d ípteros y homópteros tales como, mas sin limitarse a, adélgidos ilia de adélgidos, insectos de las plantas de la familia de los m das de la familia de los cicádidos, saltamontes, Empoasca spp.; ilia de los cicadélidos, saltamontes de las familias Cixiidae, Fl goroidea, Issidae y Delphacidae, saltamontes de la familia d mbrácidos, psílidos de la familia de los psílidos, moscas blancas ilia de los aleiródidos, áfidos de la familia de los afídidos, filoxera ilia de los filoxéridos, insectos coco de la familia de los pseudocó hinillas de las familias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylo spididae, Eriococcidae, Ortheziidae, Phoenicococcidae y Margaro ectos chupadores de la familia de los tingidos, insecto oloroso de la los pentatómidos, cinches, Blissus spp.; y otros insectos de la aeidae, insectos de saliva de la familia Cercopidae insectos de la cal la familia Coreidae, e insectos rojos y tintóreos del algodón de la fam pirrocóridos. smann (áfido lanudo de manzana); Brevicoryne brassicae Linnaeus repollo); Hyalopterus pruni Geoffroy (afido de ciruela harinoso); L/ simi Kaltenbach (áfido del nabo); Metopolophium dirrhodum Walker cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (áfido de la papa); / sicae Sulzer (áfido de la papa y el durazno, áfido del durazno v sonovia ribisnigri Mosley (áfido de la lechuga); Pemphigus spp. (áfid y áfidos de agalla); Rhopalosiphum maidis Fitch (áfido de la hoja de padi Linnaeus (áfido de la avena y de la cereza silvestre); Schi minum Rondani (insecto verde); Sipha flava Forbes (áfido amarillo a de azúcar); Sitobion avenae Fabricius (áfido del grano i rioaphis maculata Buckton (áfido moteado de la alfalfa); Toxópteros a yer de Fonscolombe (áfido negro del cítrico); y T. citricida Kirkaldy rrón del cítrico); Adelges spp. (adélgidos); Phylloxera devastatrix Per xera del pacanero); Bemisia tabaci Gennadius (mosca blanca del t sea blanca de la batata); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca bla hoja plateada); Dialeurodes citri Ashmead (mosca blanca del c aleurodes abutiloneus (mosca blanca de alas bandeadas) y T. vapora throneoura spp. (saltamontes de la uva); Magicicada septendecim Lin ada periódica); Icerya purchasi Maskell (cochinilla algodó adraspidiotus perniciosus Comstock (cochinilla de San José); Planoc i Risso (insecto harinoso del cítrico); Pseudococcus spp. (otro compl ecto harinoso); Cacopsílido pyricola Foerster (psílido de la pera); spyri Ashmead (psílido del caqui).

Las especies de interés importantes a nivel agrónomo del orden ípteros incluyen, mas no se limitan a: Acrosternum hilare Say (i roso verde); Anasa tristis De Geer (chinche); Blissus leuco copterus Say (chinche); Corythuca gossypii Fabricius (insecto chupa odón); Cyrtopeltis modesta Distant (insecto del tomate); Dys urelias Herrich-Scháffer (insecto tintóreo del algodón); Euschistus y (insecto oloroso marrón); E. variolarius Palisot de Beauvois (i roso de una mota); Graptostepor ende spp. (complejo de insect illas); Leptoglossus corculus Say (insecto de semilla de pino de a); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (insecto de planta mancha psido de la manzana); Cyrtopeltis modestus Distant (insecto del tor topeltis notatus Distant (mosca chupadora); Spanagonicus albofas ter (picudo de marca blanca); Diaphnocoris chlorionis Say (insec cia negra); Labopidicola allii Knight (insecto de cebolla); Pseudatom iatus Reuter (picudo de algodón); Adelphocoris rapidus Say (inse tas rápido); Poecilocapsus lineatus Fabricius (insecto de plantas de as); Nysius ericae Schilling (insecto falsa chinche); Nysius rap ard (insecto falsa chinche); Nezara viridula Linnaeus (insecto oloroso sur); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae stomatidae spp.; Reduviidae spp.; y Cimicidae spp.

También se incluyen adultos y larvas del orden de los acáridos (á s como Acería tosichella Keifer (ácaro del enrulado del trigo); P ns Müller (ácaro del trigo marrón); ácaros araña y ácaros rojos en la los tetraníquidos, Panonychus ulmi Koch (ácaro rojo europeo); Tetra cae Koch (ácaro araña de dos motas); (T. mcdanieli McGregor Daniel); T. cinnabarinus Boisduva! (ácaro araña carmín); T. tur Lone Star); y ácaros de costra y sarna en las familias Psorop motidae y Sarcoptidae.

Las plagas de insectos del orden Thysanura son de interés, tales isma saccharina Linnaeus (lepisma); Thermobia domestica P ecto de fuego).

Las plagas de artrópodos adicionales cubiertos incluyen: arañas en de Araneae tales como Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik ( lusa marrón); y Latrodectus mactans Fabricius (araña viuda neg mpiés en el orden de Scutigeromorpha tales como Scutigera co/e naeus (ciempiés doméstico).

Las plagas de insectos pueden ser evaluadas para la actividad pe las composiciones de las formas de realización en etapas tempran arrollo, por ej. como larvas u otras formas inmaduras. Los insectos p desarrollados en total oscuridad de alrededor de 20 °C a alrededor de e alrededor de 30% a alrededor de 70% de humedad relativ ensayos pueden ser realizados tal como se describe en Czapla y ante un período apropiado de tiempo. Los bioensayos descritos sente se pueden usar con cualquier plaga de insectos de alimentació pa de larva o adulta.

Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración ma do de limitación.

EXPERIMENTACIÓN emplo 1 : Bioensayo para evaluar la actividad pesticida de la toxi thuringiensis contra los insectos seleccionados Los bioensayos fueron realizados para evaluar los efectos del pépt ina insecticida Bt, establecido en la SEQ ID NO: 2, en una varied gas de insectos lepidópteros como se establece en la Tabla 1. Los e alimentación fueron realizados en una dieta artificial que conte teína insecticida. La proteína insecticida se aplicó de manera tópica u dieta artificial específica de lepidópteros. La toxina se aplicó a una t pg por 25 pL de muestra por pocilio y se dejó secar. La proteína est pón de carbonato 10 mM a un pH de 10. Una larva neonata se ub sano del oído del maíz (Helicoverpa zea) + sano cortador negro (Agrotis ípsilon) + sano soldado de otoño (Spodópteros frugiperda) + ga taladradora del sudoeste (Diatraea grandiosella) + sano cortador del frijol del oeste {Richia albicosta) + tamontes de la soja (Pseudoplusia includens) + ga del frijol terciopelo (Anticarsia gemmatalis) + Ejemplo 2: Determinación de IC50 Se realizaron bioensayos para determinar un IC50 del péptido de ecticida, establecido en la SEQ ID NO: 2, en oruga taladradora e trinia nubilalis), gusano del oído del maíz (Helicoverpa zea), g tador negro (Agrotis ípsilon), gusano soldado de otoño (Spodó iperda), oruga taladradora del sudoeste (Diatraea grandiosella) y g tador del frijol del oeste (Richia albicosta). Los ensayos de alimen ron realizados en una dieta artificial que contenía la proteína insectici la 2: Resultados IC50 ecto evaluado IC50 ppm ga taladradora europea 2,89 ano del oído del maíz 175,2 sano cortador negro 57,7 sano soldado de otoño >200 ga taladradora del sudoeste 3,05 sano cortador del frijol del oeste >100 Ejemplo 3: Transformación de maíz por bombardeo de partícula regeneración de plantas transgénicas Los embriones inmaduros de maíz de las plantas donant ernadero son bombardeadas con una molécula de ADN que conti uencia de nucleótidos de toxina (por ej., SEQ ID NO: 1) ligada en rativa a un promotor de ubiquitina y el gen marcador seleccionar ohlleben y colegas (1988) Gene 70: 25-37), que confiere resiste briones por placa, en medio 560Y durante 4 horas y luego se alinean a blanco de 2,5 cm en preparación para bombardeo.

Preparación de ADN Se forma un vector plasmídico que comprend uencia de nucleótidos de toxina (por ej. , SEQ ID NO: 1) ligada en rativa un promotor de ubiquitina. Por ejemplo, un vector de transfor cuado comprende un promotor UBI1 de Zea mays, una UTR 5' de intrón UBI1 , en combinación con un terminador Pinll. El vector co cionalmente un gen marcador seleccionable PAT dirigido por un prom MV35S e incluye un terminador de CAMV35S. En forma opcional, eccionable puede residir en un plásmido separado. Un molécula d comprende una secuencia de nucleótidos de toxina así como tamb seleccionable PAT se precipita en pellas de tungsteno de 1 , 1 µ?? (di medio) usando un procedimiento de precipitación de CaCfe a continua 100 µ?_ de partículas de tungsteno preparado en agu 10 µ!_ (1 µ9) de ADN en tampón Tris EDTA (1 µ9 de total) vamente, el líquido es extraído, y se agrega 105 µ? de 100% etan a de partícula de tungsteno final. Para el bombardeo de partícula tículas de tungsteno/ADN se someten a sonicación brevemente chan 10 µ? en el centro de cada macroportador y se dejan secar aire 2 minutos antes del bombardeo.

Tratamiento con acelerador de partículas Las placas de muestra son bombardeadas a nivel #4 en acel ) de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un d ple a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de casa tu N/partículas preparadas.

Tratamiento posterior Después del bombardeo, los embriones son mantenidos en medio ante 2 días, luego se transfieren a medio de selección 560R que cont /Litros de Bialafos, y se subcultivan cada 2 semanas. Despu oximadamente 10 semanas de selección, los clones de callo resiste ección se transfieren a medio 288J para iniciar la regeneración de la icas (1 ,6 galones) y se cultivan hasta madurar. Las plantas se exami lasifican en cuanto a la expresión de la toxina mediante ensayos con el arte o como se describió con anterioridad.

Medios de bombardeo v cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/L de sales básal GMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitamina de Eriksson (1000X Sl 1), 0,5 mg/L de HCI de tiamina, 120,0 g/L de sucrosa, 1 ,0 mg/L 2, 8 g/L de L-prolina (llevada a un volumen con DI H20 después del aj 5,8 con KOH; 2,0 g/L de Gelrite™ (agregado después de alcan umen con DI H20); y 8,5 mg/L de nitrato de plata (agregado despu erilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de sel 0R) comprende 4,0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 r zcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/L de ina, 30,0 g/L de sucrosa, y 2,0 mg/L de 2,4-D (Nevado a un volumen después del ajuste a pH 5,8 con KOH); 3,0 g/L de Gelrite™(agr pués de alcanzar un volumen con DI H20)¡ y 0,85 mg/L de nitrato de rite™ (agregado después de alcanzar un volumen con DI H20); 3. rite™; y 1 ,0 mg/L de ácido indolacético y 3,0 mg/L de bialafos (agr pués de esterilizar el medio y enfriar a 60 °C).

El medio libre de hormonas (272V) comprende 4,3 g/L de sale BCO 11117-074), 5,0 ml/l de solución de reserva de vitamina MS (0,1 ácido nicotínico, 0,02 g/L de HCL de tiamina, 0,10 g/L de HCL de pirid ,40 g/L de glicina llevado a un volumen con DI H20 pulido), 0,1 g/L d sitol, y 40,0 g/L de sucrosa (llevado a un volumen con DI H20 pués de ajustar el pH a 5,6); y 6 g/L de bacto-agar (agregado desp anzar un volumen con DI H20 pulido), esterilizado y enfriado a 60°C.

Ejemplo 4: Transformación mediada por Agrobacterium de Maíz regeneración de plantas transgénicas Para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium co uencia de nucleótidos de toxina (por ej SEQ ID NO: 1), se puede todo de Zhao (patente estadounidense No. 5.981.840, y publicaci ente PCT W098/32326; cuyos contenidos se incorporan en la pres io sólido después del paso de infección. Después de este período ivo, se contempla un paso de "descanso". En este paso de descans briones son incubados en presencia de al menos un antibiótico co a inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un a ctivo para los transformantes vegetales (paso 3: paso de descanso briones inmaduros pueden ser cultivados en medio sólido con antib o sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium fase de descanso para las células infectadas. A continuación, se c embriones inoculados en medio que contiene un agente selectiv upera el callo transformado en desarrollo (paso 5: el paso de selecció briones inmaduros se cultivan en medio sólido con un agente selecti era un crecimiento selectivo de las células transformadas. El ca enera luego en las plantas (paso 5: paso de regeneración), y lo tivados en el medio selectivo se pueden cultivar luego en medio sólid enerar las plantas.

Ejemplo 5: Transformación de embriones de soja áticos que se multiplicaron como embriones de etapa globular temp suspensiones se mantienen como se describe a continuación.

Los cultivos de suspensión embriogénica de soja se pueden ma 35 mi de medio líquido en un agitador giratorio, 150 rpm, a 26°C con rescentes en un esquema de 16:8 hora día/noche. Los cultivo cultivados cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de 35 mi de medio líquido. cultivos de suspensión embriogénica de soja se pueden transformar diante el método de bombardeo por acelerador de partículas (K egas, (1987) Nature (London) 327:70-73, patente estadounidens 55.050). Un instrumento de DuPont Biolistic PDS1000/HE (renovaci io) se puede usar para estas transformaciones.

Un gen marcador seleccionare que se puede usar para facil nsformación de la soja es un transgen compuesto del promotor 35S d mosaico de la col (Odell y colegas, (1985) Nature 313:810-812), romicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E co/ ; Gritz y co CaCl2 (2,5 M). La preparación de partículas luego es agitada durant utos, mezclada en una micrófuga durante 10 segundos y se ext renadante. Las partículas revestidas de ADN se lavan luego una vez e 0% de etanol y se resuspenden en 40 µ? de etanol anhidro. La susp partículas/ADN se puede someter a sonicación tres veces duran undo cada una. Cinco microlitros de las partículas de oro revestid N se cargan luego en cada disco macro portador.

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo de suspensión d anas se coloca en una placa de petri vacía de 60x15 mm y se ext ido residual del tejido con una pipeta. Para cada experimen sformación, aproximadamente 5-10 cultivos de tejido se bomb malmente.

La presión de ruptura de membrana se fija a 1100 psi, y la cám cua a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se oximadamente 3,5 pulgadas de distancia de la pantalla de retenció bardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido puede ser divi briogénicos transformados, propagados a nivel clonal y nuevos. Cada a puede ser tratada como un evento de transformación indepen as suspensiones se pueden subcultivar luego y mantenerse como gru briones inmaduros o regenerar en plantas completas por madura minación de embriones somáticos individuales.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de pa ndonadas en esta memoria descriptiva indican el nivel de las per sadas en el arte al cual pertenece esta invención. Todas las publica entes y solicitudes de patentes se incorporan en la presente a mo rencia al mismo punto como si cada publicación, patente y solicit ente individual hubiera sido específica e individualmente indicada orporada a modo de referencia.

Si bien la presente invención ha sido descrita en detalle a mo tración y ejemplo a los fines de claridad de entendimiento, es obvi rtos cambios y modificaciones se pueden llevar a la práctica dent ance de las formas de realiz

Claims

VINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada p cciona del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuen leótidos de la SEQ ID NO:1 , o un complemento de longitud completa ma; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptid prende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteín prende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 9 ntidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b); y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteín prende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 9 ntidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b). 2. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo c 5. Una célula huésped caracterizada porque contiene el cons DN de acuerdo con la reivindicación 3. 6. La célula huésped de acuerdo con la reivindicaci acterizada porque es una célula bacteriana. 7. La célula huésped de acuerdo con la reivindicaci acterizada porque es una célula vegetal. 8. Una planta transgénica caracterizada porque comprende la sped de acuerdo con la reivindicación 7. 9. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicaci acterizada porque dicha planta se selecciona del grupo que consi íz, sorgo, trigo, repollo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, al oz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza 10. La semilla transformada de la planta de acuerdo c indicación 9, caracterizada porque la semilla comprende el constru secuencia con una secuencia de polipéptidos de (a) o (b); y (d) una secuencia de polipéptidos que tiene al menos 99% de ide secuencia con una secuencia de polipéptidos de (a) o (b). 12. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 11 caracte que comprende, además, secuencias de aminoácidos heterólogos. 13. Una composición caracterizada porque comprende el polip acuerdo con la reivindicación 1 1. 14. La composición de acuerdo con la reivindicació acterizada porque dicha composición se selecciona del grupo que c un polvo, polvillo, pella, gránulo, asperjado, emulsión, coloide y solució 15. La composición de acuerdo con la reivindicació acterizada porque dicha composición se prepara por dese ilización, homogenización, extracción, filtración, centrifug imentación, o concentración de un cultivo de células Bacillus thuringie 16. La composición de acuerdo con la reivindicació a plaga, con una cantidad efectiva a nivel pesticida de un polipépti erdo con la reivindicación 1 1. 19. Un método para producir un polipéptido con actividad pes acterizado porque comprende cultivar la célula huésped de acuerdo indicación 4 bajo condiciones en las que una molécula de ácido nu codifica el polipéptido es expresada, dicho polipéptido e eccionado del grupo que consiste de:. (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos Q ID NO:2; (b) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleóti EQ ID NO:1 ; (c) una secuencia de polipéptidos que tiene al menos 98% de ide secuencia con una secuencia de polipéptidos de (a) o (b); y (d) una secuencia de polipéptidos que tiene al menos 99% de ide secuencia con una secuencia de polipéptidos de (a) o (b). prende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteín prende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 9 ntidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b)¡ y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteín prende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 9 tidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b); donde dicha secuencia de nucleótidos está ligada en forma operativ motor que dirige la expresión de una secuencia codificadora en una etal. 21. La planta de acuerdo con la reivindicación 20, carácte que dicha planta es una célula vegetal. 22. Un método para proteger una planta de una plaga, carácte que comprende introducir en dicha planta o célula de la misma al me tor de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que c prende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 9 ntidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b)¡ y (f) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteín prende una secuencia de aminoácidos caracterizada por al menos 9 ntidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (b). 23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, caracte que dicha planta produce un polipéptido pesticida que tiene ac ticida contra una plaga de lepidópteros. RESUMEN La invención provee ácidos nucleicos, y variantes y fragmentos mos, obtenidos de cepas de Bacillus thuringiensis que co ipéptidos que tienen actividad pesticida contra plagas de insectos usión de Lepidópteros. Las formas de realización particulares nción proveen ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas pesti posiciones pesticidas, constructos de ADN, y plantas y microorgan sformados que comprenden un ácido nucleico de las formas de realiz as composiciones encuentran uso en los métodos para controlar p ecialmente plagas en plantas.