MX2010013144A - Anticuerpos anti-flt3. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos completamente humanos que se enlazan específicamente a FLT3 humano dentro de los dominios extracelulares 4 o 5 con alta afinidad. La invención además proporciona métodos para tratar leucemia administrando una cantidad efectiva de un anticuerpo ya sea solo o en combinación con un agente anti-cancerígeno o tratamiento que incluye metotrexato.

Description

A•^N—TICUE—RPOS ANTI-FLT3¦ Esta solicitud reclama el beneficio licitudes Provisionales Estadounidenses Nos. 61 130,539, y 61/103,394 las cuales todas se prese o 30 de 2008.

La presente invención se dirige a an anos, que incluyen fragmentos o porciones de los son específicos al receptor de tirosina cinasa Fms humano (FLT3) . Los anticuerpos son usados pa cimiento de células cancerígenas y pueden ser usa n combinación con un agente anti-neoplástico, qu o no se limita a metotrexato (MTX) , para tratam cemia .

El receptor de tirosina cinasa 3 simila ano (FLT3), también conocido como cinasa de hí ad timulación por el ligando FLT3 (FL) mejora la prol supervivencia de células de leucemia. La inhibici alización de FLT3 conduce a apoptosis en driticas e inhibición de respuestas inmunes.

Los inhibidores de molécula pequeña pletamente específicos de FLT3 y pueden de sistencia al fármaco. De este modo, inhibidores d écula pequeña todavía tienen que proporcionar etivo efectivas para leucemia. Nuevos tratamien a necesidad médica no cubierta son altamente dese cedimiento de anticuerpo puede superar algunas ventajas asociadas con inhibidores de FLT3 de ueña. Primero, anticuerpos son específicos a un inido, de este modo evitando efectos se enciales que resultan de la inhibición de tiples. Segundo, anticuerpos neutralizantes po nativo (especialmente en el caso de un a utralizante) como mutado (debido a los mecanismos munes), ampliando la población paciente objetivo.

Los esfuerzos en el pasado con res sarrollo de terapéuticos para leucemia incluyen in FLT3 (Li Y., et al., Int. J. Hematol . 82(2):108-1 Y., Drug Development Research 67(6): 495-500 ( , et al., Expert Opinión in Biological Therapy 7 0 (2007.)) no han sido ampliamente exitoso trategias desarrolladas han incluido: anticu ridoma del documento US 5,777,084; anticuerpos 1 documento WO95/27062, anticuerpos al liga cumento W094/28391; moléculas pequeñas del 2005/094823.

Zheng R . , et al., Blood 103 ( 1 ): 267-274 ( , et al., Blood 104 (4 ): 1137-44 (2004), Piloto, O., dependiente del ligado (receptor mutante) de FL loto, Cáncer Res., supra.). Hasta la presente i se han conocido las secuencias de CDR precisas y enlace al epitope de anticuerpos anti-FLT3 vención .

Adicionalmente, existe una necesida oporcionar inhibidores anti-FLT3 alternativos lo enen alta afinidad de enlace para FLT3 y bloquean 1 ligando al receptor de FLT3, y por lo tanto i tivación de FLT3 y su trayectoria de señalizació para con aquellos inhibidores conocidos en la té esente invención parece proporcionar anticuerpos ternativos los cuales tienen afinidad de enlace ligando mejorada para FLT3 comparados con ibidores conocidos en la técnica.

Existe también una necesidad para pro ducida por FL de FLT3 tipo nativo y cinasas corrie las trayectorias de MPK, PI3K, y STAT5 en leu esente invención parece proporcionar anticuerpos manos los cuales inhiben la fosforilación induci FLT3 tipo nativo y cinasas corriente abajo ayectorias de MPK, PI3K, y STAT5 en leucemia comp uellos inhibidores conocidos en el arte.

Además, existe una necesidad para pro hibidores anti-FLT3 alternativos los cuales pacidad mejorada para activar funciones efectora rriente abajo tales como citotoxicidad celular de 1 anticuerpo (ADCC) . La presente invención oporcionar anticuerpos anti-FLT3 humanos los cual pacidad mejorada para activar las funciones uñes corriente abajo que incluyen ADCC compa uellos inhibidores conocidos en la técnica. ueña y metotrexato utilizando lineas de cé cemia en cultivo no fue efectivo en el tratam cemia, mientras combinaciones con otras quimi ron efectivas (Furukawa, Y. et al., Leukemi ¡1005-1014) . Resultados experimentales que se refi sente invención demuestran que en efecto, combi 3 objetivo de anticuerpo, es decir EB10, con M élo animal de leucemia resulta en un mej mático en supervivencia .

La presente invención proporciona un antic gmento del mismo, el cual se enlaza a un epitope dominios D4 o D5 del FLT3 humano.

La presente invención proporciona un mét tar una condición pre-cancerosa o cáncer en un comprende administrar MTX en combinación con un FLT3 al mamífero en una cantidad efectiva para t tagonistas monoclonales humanos, y fragmentos smos, que se enlazan al FLT3 de antigeno humano .

Un aspecto de la presente invención icuerpo o fragmento del mismo que se enlaza a prende una CDRHl que tiene la secuencia GYTFTSYYM :1) o SYYMH {SEC ID N0:2), una CDRH2 que tiene la PSGGSTSYAQKFQG (SEC ID NO: 3), una CDRH3 que uencia GVGAHDAFDI (SEC ID NO: 4) o VVAAAVADY (SEC CDRL1 que tiene la secuencia RSSQSLLHSNGNNYLD :6) o RSSQSLLHSNGYNYLD (SEC ID NO: 7), una CDRL2 secuencia LGSNRAS (SEC ID N0:8), y una CDRL3 que uencia MQGTHPAIS (SEC ID NO: 9) o MQSLQTPFT (SEC ID Un aspecto de la presente invención icuerpo o fragmento del mismo que se enlaza a prende una CDRHl que tiene la secuencia GYTFTSYYM :1) o SYYMH (SEC ID NO: 2), una CDRH2 que tiene la En otro aspecto de la presente inven icuerpo o fragmento del mismo que se ecificamente a FLT3, comprende una CDRH1 que uencia GYTFTSYYMH (SEC ID N0:1) o SYYMH (SEC ID N H2 que tiene la secuencia IINPSGGSTSYAQKFQG (SEC CDRH3 que tiene la secuencia VVAAAVADY (SEC ID N L1 que tiene la secuencia RSSQSLLHSNGYNYLD (SEC CDRL2 que tiene la secuencia LGSNRAS (SEC ID NO: L3 que tiene la secuencia MQSLQTPFT (SEC ID NO: 11) En otro aspecto de la presente inven icuerpo o fragmento del mismo que se ecificamente a FLT3 , comprende una CDRH1 que uencia GGTFSSYAIS (SEC ID NO: 12) o SYAIS (SEC I CDRH2 que tiene la secuencia GIIPIFGTANYAQKFQG :14), una CDRH3 que tiene la secuencia FALFGFREQAF NO: 15), una CDRL1 que tiene la secuencia RASQSIS y una secuencia de VH de: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGL STSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGAHDA SS (SEC ID NO: 19) .

Otro aspecto de la presente invención icuerpo o fragmento del mismo que se enlaza a prende una VL que tiene la secuencia: DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKP SNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPFTFGPG C ID NO:24) , y una secuencia de VH de: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWARQAPGQGL STSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVVAAAVAD S (SEC ID N0:21) .

Otro aspecto de la presente invención icuerpo o fragmento del mismo que se enlaza a icuerpo monoclonal que comprende una cadena lige ID NO: 28 y una cadena pesada de la SEC ID NO: 2 ena ligera de la SEC ID NO: 29 y una cadena pesa ID NO: 26; o una cadena ligera de la SEC ID NO: ena pesada de la SEC ID NO: 27. En otro aspec sente invención, un anticuerpo comprende dos eras de la SEC ID NO: 28 y dos cadenas pesadas d NO: 25, o comprende dos cadenas ligeras de la SE y dos cadenas pesadas de la SEC ID NO: 26; o comp enas ligeras de la SEC ID NO: 30 y dos cadenas p SEC ID NO: 27. Fragmentos enlazantes a FLT3 icuerpos son parte de la invención.

La presente invención también se dirige lado que codifica tales anticuerpos y porcione mos. Otros aspectos de la presente invención inc do polinucleico aislado que comprende una secu permiten la expresión del anticuerpo o fragm smo .

Adicionalmente, la presente invención se odos para inhibir el crecimiento de una cerigena, y métodos para tratar leucemia, iferos, administrando una cantidad efectiva icuerpo. Los anticuerpos de la presente invenci usados para tratar enfermedades neoplástic luyen tumores sólidos y no sólidos, y para el tr leucemia. Un aspecto de la presente invención es icuerpos previamente descritos o fragmentos de l o un medicamento. En aún otro aspecto, los an viamente descritos o fragmentos de los mismos s el tratamiento de cáncer, que incluyen pero no se cemia. La presente invención también proporcion un anticuerpo de la invención para la manufactu picamente tienen dos cadenas pesadas idéntica denas ligeras idénticas con cada una de las cadena gadas covalentemente a una cadena pesada por u sulfuro intercadena. Enlaces disulfuro múltiple gan las dos cadenas pesadas entre si. Anticuerpos ingeniería pueden abarcar una variedad de alter estructura y/o formato de anticuerpos que se uralmente. Como se usa en la presente, el ticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobul prenden 4 cadenas de polipéptido, dos cadenas pe dos cadenas ligeras (L) inter-conectadas por ulfuro. Cadenas individuales pueden desdobl inios que tienen tamaños (110-125 aminoác ructuras similares, pero diferentes funciones.

La cadena ligera pude comprender un iable (abreviado aqui como VL) (abreviado aquí iable (abreviado aquí como VH) y/o, dependiend se o isotipo de anticuerpo, existen tres o cuatro stantes (CH1, CH2, CH3 y CH4) (abrevia ectivamente como CH) . En humanos, los isotipos I , IgG, e IgM, con IgA e IgG además se subdi clases o subtipos (IgAi_2 e IgGi-4) . La presente luye anticuerpos de cualquiera de las clases o cionadas anteriormente. El IgGl humano es el ferido para los anticuerpos de la presente invenci En general, los dominios variables siderable variabilidad de secuencia de aminoáci icuerpo al siguiente, particularmente en la ubica io de enlace al antigeno. Tres regiones, llamadas determinan la complementariedad o hiper reviadas aqui como CDR) , se encuentran en cada un y VH, las cuales son soportadas por region p: //www . bioin . org.uk/abs/chothia .html) . Cada VH puesta de tres CDR y cuatro FR, arregladas del no al término carboxi en el siguiente orden: FR1-2-FR3-CDR3-FR4.

La porción de un anticuerpo que cons inios VH y VL es designada Fv (Fragmento var stituye el sitio de enlace al antigeno. La cadena Fv) es un fragmento de anticuerpo que contiene u y un dominio VH en una cadena de polipéptido, en érmino de un dominio y el Otérmino del otro domi dos por un enlazador flexible (véase, por eje ente Estadounidense No. 4,946,778 (Ladner e umento O 88/09344 (Huston et al.), documento WO Cafferty et al.)) describen la despliegue de f v en la superficie de los paquetes de despliegue ombinantes solubles, tales como bacteriófagos. inoácidos . Un ejemplo no limitante de tales lazadores es (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ) 3 .

Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo q o parcialmente, sustancialmente o completamente p una mezcla de componentes; (2) ha sido identi arado y/o recuperado de un componente de su ural; (3) es monoclonal; (4) está libre de otras partir de las mismas especies; (5) es expresado ula a partir de diferentes especies; o (6) no ocu uraleza. Componentes contaminantes de su ambient materiales los cuales podrían interferir apéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, luir enzimas, hormonas, y otros solutos proteinác teináceos. Ejemplos de anticuerpos aislados inc icuerpo que ha sido purificado de afinidad, un a ha sido elaborado por un hibridoma u otra line sentes. Los anticuerpos monoclonales son ecífieos , siendo dirigidos contra un sitio a ÍCO (también conocido como determinante o epitope) trario a las preparaciones convencionales de a liclonal) las cuales típicamente incluyen d icuerpos dirigidos contra diferentes determinant icuerpo monoclonal se dirige contra un determina el antígeno. El modificador "anticuerpo" i ácter del anticuerpo a obtenerse de una tancialmente homogénea de anticuerpos, y struido por requerir la producción del anticu lquier método particular.

El término "anticuerpo humano, " como se u sente, incluye anticuerpos que tienen regiones va stantes que corresponden a secuencias de inmuno línea germinal humana (como se describe en Kabat, codificado por la secuencia de inmunoglobulina minal humana. Sin embargo, el término "anticuerp o se usa en la presente, no está propuesto par icuerpos en los cuales las secuencias de CDR der linea germinal humana de otras especies de m es como un ratón, han sido injertadas en secue ructura humana.

La frase "anticuerpo humano recombinante" icuerpos humanos que son preparados, expresados, lados por medios recombinantes , tales como an resados usando un vector de expresión rec nsfectado en una célula hospedera, anticuerpos a tir de una biblioteca de anticuerpo humano combi ombinante, anticuerpos aislados de un animal nsgénico para los genes de inmunoglobulina h icuerpos preparados, expresados, creados o aisl un anticuerpo IgG, por ejemplo, el Fe comprende y CH3. El Fe de un anticuerpo IgA o IgM además dominio CH . El Fe está asociado con el enlace al activación de citotoxicidad mediada por el co C) y ADCC . Para anticuerpos tales como IgA e les son complejos de proteínas múltiples similare formación del complejo requiere dominios constante De este modo, anticuerpos de la invención o no se limitan a, anticuerpos que se uralmente, anticuerpos, anticuerpos humanos, an anizados, anticuerpos humanos recombinantes , an ocionales, fragmentos de digestión, ecificadas y variantes de los mismos, que éticos de anticuerpo o que comprenden porci icuerpos que imitan la estructura y/o funció icuerpo o fragmento especificado o porción del mi inios VL-CL VL-CH1 y no retienen la región de art cadena pesada {por ejemplo, por digestión de s los cuales retienen la región de articulación ada, facb (por ejemplo, por digestión de p b' )2f Fab 1 el cual carece de enlaces disulfuro, mplOf por digestión de plasmina o pepsina) , mplo, por digestión de pepsina, reducción parci egación) y Fv o scFv (por ejemplo, por téc logia molecular) . Los fragmentos de anticuerpo án propuestos para incluir, por ejemplo, an rimidos de dominio, anticuerpos lineales, anticu ena única, scFv, anticuerpos de dominio único, an cadena única multivalentes , anticuerpos multi-es mados de fragmentos de anticuerpo que incluyen di acuerpos y similares que se enlazan especifícam ígenos . ace) , y tamaño compacto (por ejemplo, dominios os) .

Los anticuerpos de la presente inven ecificos para FLT3. La especificidad del antic iere al reconocimiento selectivo del anticuerpo tope particular de un antigeno. Los anticuerpo ención, por ejemplo, pueden ser monoespeci specíficos. Los anticuerpos biespecí fieos (Bs icuerpos que tienen dos diferentes especific ios de enlace al antígeno. En donde un anticuer de una especificidad, los epítopes reconocidos p ciados con un antígeno único o con más de un ant e modo, la presente invención proporciona an specíficos que se enlazan a dos diferentes antíg menos una especificidad para FLT3. Como se eriormente, tales anticuerpos incluyen cualquier prender cualquiera de los cinco segmentos del racelular de FLT3 {posteriormente referido si o "dominios" o "EDC"), es decir, DI, D2, D3, D4 tope en el cual los anticuerpos o fragmento sente invención se enlaza está dentro del domino anticuerpos EB10 y D4-3 se enlazan a un epito dominio 4 de FLT3, mientras el NC7 se enlaza a u tro del dominio 5 de FLT3. El término "epitope" en la presente se refiere a sitios tridimen cretos, en un antigeno que son reconocidos icuerpos de la invención. Los epitopes son las unológicamente activas en un antigeno de compl iones que actualmente se enlazan a un recepto ula B, y que son actualmente unidas por las mol icuerpos resultantes que son producidos por las c antigenos en general contienen al menos un e ntiguos. De este modo, epitopes no lineales requie ado de repliegue de proteina para llevar los re inoácidos requisitos en la proximidad entre si pa estructura nativa tridimensional y provocar una uñe que produce anticuerpos con especificidad de igeno .

Los anticuerpos, o fragmentos de los mism sente invención se enlazan a FLT3 mutante o ivo. Los FLT3, ya sea mutantes o de tipo nat mplo, son frecuentemente expresados en AML como o también en otras leucemias. Se mutan en aproxi tercio de pacientes con AML agudo, ya licaciones internas en serie (ITD) del do tamembrana o por mutaciones de punto que i almente el dominio cinasa (KD) . Ambos tipos de stitutivamente activan a FLT3. Además de interfer ando CDR y/o residuos de FW y seleccionando s ace al antigeno que tienen las características ase, por ejemplo, Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 95) .) . Las CDR son mutadas en una variedad de fo ma es aleatorizar residuos individuales o combina iduos de manera que en una población de, de o íos de enlace al antígeno idénticos, subseries ta veinte aminoácidos se encuentran en p ticulares. Alternativamente, las mutaciones pu ucidas sobre un intervalo de residuos por método pensos a error (véase, por ejemplo, Hawkins et . Biol. 226: 889-96 (1992)). En otro ejemplo, los despliegue de fago que contienen genes de región cadena ligera y pesada pueden ser propagados adoras de E. coli (véase, por ejemplo, Lo et al., l. 250: 359-68 (1996).). Por ejemplo, los vec mutados para generar todas las sustituci noácido posibles en cada sitio. Las varia icuerpo de este modo generadas son exhibidas en ovalente a partir de partículas de fago filament iones al producto del gene III de M13 empacado a partícula. Las variantes de despliegue de onces seleccionadas por su actividad biológi mplo, afinidad de enlace, especificidad, IC50, o se describe en la presente. Para identificar s ión CDR candidatos para modificación, se puede agénesis de exploración de alanina para id iduos de región de CDR que contribuyen signific enlace al antígeno. Alternativamente, o en adi agénesis aleatoria puede ser realizada en un uencias de CDR en una o más posiciones de residuos ntras la CDR está operablemente ligada a l la presente, otros anticuerpos mo stancialmente homólogos" pueden ser fácilmente d manufacturados utilizando varias técnicas ombinante bien conocidas por aquellos experto nica. Por ejemplo, las regiones de estructur iar de la secuencia nativa al nivel de estructura varias sustituciones de aminoácido, adic resiones intermedias y terminales, y simila argo, una variedad de diferentes regiones de e ana pueden ser usadas individualmente o en co o una base para las inmunoglobulinas humanizad sente invención. En general, modificaciones de l dén ser fácilmente realizados por una variedad de n conocidas, tales como mutagénesis dirigida al si La presente invención incluye polipéptido azan a FLT3 con secuencias de aminoácido sustan icionalmente, la presente invención incluye sust nservativas ele aminoácido que preservan las caract ncionales de los anticuerpos actualmente descritos.

La presente invención incluye secuencias cleico que codifican una cadena pesada de anticue T3, que comprende cualquiera de las regiones de rción de las mismas, o cualquiera de las CDR de cluyen cualquiera de las variantes de las mismas, scribe en la presente. La invención también léculas de ácido nucleico que codifican una cade anticuerpo anti-FLT3 que comprende cualquiera iones de VL o una porción de las mismas o cual CDR de VL, que incluyen cualquiera de las var mismas como se describe en la presente.

Cada dominio de los anticuerpos de esta de ser un anticuerpo completo con el dominio va las secuencias de CDR. El factor caracterizante i la capacidad de cada dominio para asociarse con u plementario para formar un sitio de enlace al consiguiente, los términos fragmento de cadena ada variable no deben ser construidos para iantes, que incluyen variantes a las CDRs que no cto material en la especificidad.

Los anticuerpos de la presente invención p ducidos por métodos conocidos en la técnica. Esto luyen el método inmunológico descrito por Ko stein, Nature 256: 495-497 (1975) y Campbell, M ibody Technology, The Production and Characteriz ent and Human Hybridomas, Burdon et al., Eds . , L hniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vo evier Science Publishers, Amsterdam (1985); bién el método de ADN recombinante descrito por enieria para expresar los genes de inmunoglobulina Los fragmentos de anticuerpo pueden ser p doblando un anticuerpo completo, o expresando ifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerp preparados por métodos descritos por Lamoyi et unol. ethods 56: 235-243 (1983) y por Parham, J. : 2895-2902 (1983). Tales fragmentos pueden conte os fragmentos de Fab o el fragmento F(ab' > gmentos también pueden contener anticuerpos d iable de fragmento de cadena única, es deci cuerpos, u otros fragmentos de anticuerpos. Los a producir tales equivalentes funcionales se desc Solicitud de PCT WO 93/21319, Solicitud de Patent 239,400; Solicitud de PCT WO 89/09622; Soli ente Europea 338,745; y Solicitud de Patente Eu , 424. A través de esta especificación, el ernativamente usados.

La presente invención proporciona antic gmentos aislados de los mismos específicos para icuerpos de la invención son capaces de una o má uientes actividades: 1) desplegar alta afinidad ia FLT3; 2) bloquear el enlace de ligando al re 3 y por lo tanto inhibir la activación de F yectoria de señalización; 3) inducir la rápida y ernalización de modulación descendente de FLT erficie celular; 4) inhibir la fosforilación ind de FLT3 tipo nativo y cinasas corriente abajo yectorias de MPK, PI3K, y STAT5 en leucemia; 5) unogenicidad reducida en humanos; 6) desplegar orada para activar funciones efectoras inmune jo tales como citotoxicidad celular dependie icuerpo (ADCC) ; 7) inducir la internalizac licaciones en serie interna (FLT3-ITD) ; (iii) enlace a un epitope dentro del domin inio 5 de FLT3; (iv) neutralización de la activación de FL (v) neutralización de activación d ependiente de FL; (vi) mediación de ADCC; (vii) internalización de FLT3; (viii) reducción de FLT3 de la superficie; (ix) enlace a FLT3 con un KD no oximadamente 4.5 x 10"10 M.

Los anticuerpos de la presente invención s dominio externo de FLT3 e inhiben el enlace del F inhibición puede ser determinada, por ejemplo, ayo de enlace directo usando receptor unido a la purificado. En una modalidad, los anticuerpo les son trayectorias corriente abajo. La neutrali 3 también incluye inhibición, disminución, ina interrupción de una o más de estas ac malmente asociadas con transducción de señal. A tralización incluye inhibición de heterodímeros como también homodimeros de FLT3. Por consigui tralización de FLT3 tiene varios efectos, que ibición, disminución, inactivación y/o interru cimiento (prolif ración y diferenciación) , ang clutamiento de vasos sanguíneos, invasión, y met motilidad y metástasis celular (adhesión e in ular) . Neutralizando FLT3, por medio de, pero no los varios mecanismos descritos, los anticuerpo sente invención reducen la actividad de cinasa de o inhibiendo el progreso de la enfermedad.

Una medida de neutralización de FLT3 sfotirosina en un ensayo ELISA o en un manchado gunos ensayos para actividad de tirosina c scriben en Panek et al., J. Pharmacol. Exp 3:1433-44 (1997) y Batley et al., Life Sci. 998). Los anticuerpos de la invención causan una gnificante en fosforilación de tirosina de FLT3 de roximadamente 60%, preferiblemente al menos aproxi %, y más preferiblemente al menos aproximadamente ulas que responden al ligando.

Otra medida de neutralización de FLT3 ibición de fosforilación de sustratos corriente 3. Por consiguiente, el nivel de fosforilación K, Akt o MAPK puede ser medida.

Además, los métodos para detección de exp osina pueden ser utilizados para determ tralización de FLT3, en donde las proteínas a se :567-71 (1994); Sauter et al., Am. J. Path. 14 96); Collins, Glia 15:289-96 (1995); Radinsky n. Cáncer Res. 1:19-31 (1995); Petrides et al. . 50:3934-39 (1990); Hoffmann et al . , Antican 4419-26 (1997); Wikstrand et al., Cáncer Res. 5 95) .

Ensayos in vivo también pueden ser utiliza erminar la neutralización de FLT3. Por eje ibición de tirosina cinasa del receptor pu ervada por ensayos mitogénicos usando lineas imuladas con ligando del receptor en la pre encia del inhibidor. Un método involucra prue ibición de crecimiento de células tumorales que 3 o células transfectadas para expresar F ibición también puede ser observada usando orales, por ejemplo, células tumorales humanas i al .

En otra modalidad, los anticuerpos de la ención modulan descendentemente a FLT3. La can 3 presente en la superficie de una célula depen ducción, internalización y degradación de la eptora. La cantidad de FLT3 presente en la super célula puede ser medida indirectamente, detec ernali zación del receptor o una molécula u eptor. Por ejemplo, la internalización del recep medida poniendo en contacto o recubriendo las cé resan FLT3 con un anticuerpo etiquetado. El a do a la membrana es entonces retirado, recol tado. La internalización del anticuerpo se etiendo a lisis las células y detectando los co quetados .

La cantidad de FLT3 presente en la super Como se describe en los Ejemplos abajo, el superficie celular puede ser detectado y medido icuerpo diferente que es especifico para FLT3 quea o compite con el enlace del anticuerpo a ser rtrum, et al., Cáncer Res. 63:8912-21 (2003)). alidad, el tratamiento de una célula que expresa anticuerpo de la presente invención resulta ucción de FLT3 de la superficie celular.

Otra medida de la modulación descendent ucción de la proteina receptora total presente ula, y refleja la degradación de receptores inter siguiente, el tratamiento de células (partic ulas de cáncer) con anticuerpos de la invención r reducción significante en el FLT3 celular total.

Los anticuerpos de la presente invención i cimiento del tumor. Por ejemplo, tumores de xe ticuerpos de la invención promueven el regreso ndo se usan en una inmunoterapia . La promoción de 1 tumor significa que la administración de una ctiva de anticuerpo, o una cantidad efectiva nbinación de un anticuerpo y un agente neoplástic una reducción en tamaño o necrosis del tumor. La tumor puede ser medida como un promedio a trav po de sujetos que sufren un régimen de tr ticular, o pueden ser medidos por el número de s grupo de tratamiento en el cual regresan los tumor Los anticuerpos de la invención pueden ser purificados por cualquier método conocido en la incluyen precipitación por sulfato de amonio o s io seguido por diálisis contra salina, cromatog ercambio iónico, cromatografía de inmuno-afi nidad así como también filtración en gel o elect Las fuentes adecuadas de ADN que gmentos de anticuerpos incluyen cualquier célula, ridomas y célula del bazo que expresan el anti gitud completa. Los fragmentos pueden ser usado smos como equivalentes de anticuerpo, o pu ombinados en equivalentes, como se describe anter supresión de ADN, recombinación y otras técnicas esta sección se pueden llevar a cabo por ocidos. Otra fuente de ADN es la biblioteca de d fagos de anticuerpos, como se conoce en la téc icuerpos ejemplificados de la invención act borados via tecnología de despliegue de fago.

Adicionalmente, la presente invención pr tores de expresión que contienen las secue inucleótido descritas previamente, operablemente secuencia de expresión, un promotor y un inten luyen plásmidos de E. coli, tales como colE 322, pMB9, pUC, pKSM, y RP4. Vectores proc bién incluyen derivados de ADN de fago tales co os fagos de ADN de hebra única filamentosos. Un e vector útil en levadura es el plásmido 2 µ. Los cuados para la expresión en células de mamífero ivados bien conocidos de SV-40, adenovirus, secu derivadas de retrovirus y vectores lanzadera der combinación de vectores de mamífero funcionale o aquellos descritos anteriormente, y cionales y ADN de fago.

Vectores de expresión eucariótica adició ocen en la técnica (por ejemplo, P.J. Souther g, J. Mol. Appl . Genet. 1:327-41 (1982); Subraman . Cell. Biol. 1:854-64 (1981); Kaufmann and Sharp, l. 159:601-21 (1982); Kaufmann and Sharp, Mol. Ce trol de expresión útiles son el sistema lac, el , el sistema tac, el sistema trc, regiones prom radoras mayores del fago lambda, la región de co proteina recubierta fd, los promotores glicoli adura, por ejemplo, el promotor para la 3-fosfo asa, los promotores de levadura de fosfatasa de á mplo, Pho5, los promotores de los factore reamiento de levadura, y promotores derivados de novirus, retrovirus y virus de simio, por e em motores tardío y temprano o SV40, y otras s ocidas por controlar la expresión de genes de carióticas o eucarióticas y sus virus o combinac mismos .

En donde se desee expresar un constructo de adura, un gene de selección adecuado para uso en gene trpl presente en el plásmido de levadu icientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) son compl plásmidos conocidos que portan el gene Leu2.

La presente invención también proporciona pederas recombinantes que contienen los vec resión previamente descritos. Los anticuerpos sente invención pueden ser expresados en líneas tintas de hibridomas. Los ácidos nucleicos, lo prenden una secuencia que codifica un polipé formidad con la invención, pueden ser usad nsformación de una célula hospedera de mamífero ad Las líneas de células de preferencia parti eccionadas basadas en el alto nivel de e resión constitutiva de proteína de interés y cont ima de las proteínas hospederas. Las líneas de c ífero disponibles como hospederas para expresión ocidas en la técnica e incluyen muchas líneas de cilluSf tales como Bacillus subtilis, y Streptomyc Estas células hospederas recombinantes pu das para producir un anticuerpo, o fragmento de tivando las células bajo condiciones que peri resión del anticuerpo o fragmento del mismo y pu anticuerpo o fragmento del mismo a partir de 1 pedera o medio que circunda la célula hospe etivo del anticuerpo o fragmento expresado para las células hospederas recombinantes puede ser f ertando una señal o secuencia que codifica el er secretor (véase, Shokri et al., Appl technol. 60:654-64 (2003); Nielsen et al., Pr :l-6 (1997); y von Heinje et al., Nucí. Acids Res. (1986) ) en el extremo 5' del gene que cod icuerpo de interés. Estos elementos de pépti retor pueden ser derivados de ya sea s teínas u otros productos de degradación ta tonas, sales de amonio o similares), y sales in lfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, gnesio y calcio) . El medio además contiene, por stancias que promueven el crecimiento, tales como icadores, por ejemplo, hierro, zinc, mang ilares .

Los anticuerpos de esta invención pu sionados a residuos adicionales de aminoácidos, siduos de aminoácidos pueden ser una etiqueta de zás para facilitar el aislamiento. Otros res noácidos para formar objetivo de los anticuerpos ejidos específicos también están contemplados.

Otra modalidad para la preparación de an la presente invención es la expresión de ácido codifica el anticuerpo de conformidad con la inv i-FLT3 de alta afinidad de conformidad con la ención pueden ser aislados de una biblioteca de d fago construida de genes de región variable d era y cadena pesada humana. Por ejemplo, un iable de la invención se puede obtener de un lin gre periférica que contiene un gene de región comodado. Alternativamente, las porciones de iable, tales como regiones CDR y FW, pueden ser diferentes secuencias humanas. Más de 90% d uperados después de tres rondas de selecc ecificos a FLT3. Las afinidades de enlace para FL s seleccionados pueden estar en el intervalo nM, tan alto como muchos anticuerpos monoclonales ducidos usando tecnología de hibridoma.

Anticuerpos de la presente invención s ener por ejemplo, de anticuerpos que se o, por ejemplo, residuos que podrían de otro ltados en la interfaz VH-VL de un heterodimero de Los anticuerpos de la presente invención luyen aquellos por los cuales las caracteris ace han sido mejoradas por mutación directa, mé uración de afinidad, despliegue de fago, o lanz ena. La especificidad y afinidad puede ser modi orada por mutaciones de CDR y selección para s ace al antigeno que tienen las características ase, por ejemplo, Yang et al., J. Mol. Biol. 25 95)). Las CDR son mutadas en una variedad de fo ma es aleatorizar residuos individuales o combina iduos de manera que en una población de otro íos de enlace al antígeno idénticos, todos lo noácidos se encuentran en posiciones part ernativamente, las mutaciones son inducidas enlazan a FLT3 de la invención es preferiblement preferiblemente, es el dominio extracelular de inio extracelular de FLT3 puede estar libre o co a molécula.

Los anticuerpos de esta invención pu ionados a residuos adicionales de aminoácido iduos de aminoácidos pueden ser una etiqueta p zás para facilitar el aislamiento. Otros res noácidos para buscar objetivo de los anticuerpos ejidos específicos también están contemplados.

En otro aspecto de la invención, inhibido 3, que incluyen pero no se limitan a anticuerp ención, pueden ser administrados en conjunto micamente o biosintéticamente ligados a, agent plásticos o anti-angiogénicos o agentes que produ ectable. Como se ejemplifica abajo, anticuerpo ecíficamente al receptor y suministra una toxin la internalización de ligando-toxina. En otro as jugado de agente inhibidor de FLT-3 puede ser dir ado entre si o unido via un enlazador, pépti tido. Por ejemplo, un agente anti-tumoral es u ico tal como un agente quimioterapéutico ioisótopo. Los agentes anti-neoplásticos adecú ocidos por aquellos expertos en la técnica e raciclinas (por ejemplo, daunomicina y doxor istatina, metotrexato (MTX) , vindesina, neocarzin -platino, clorambucilo, citosina arabinósi orouridina, melfalano, ricina y calicamicina . Lo mioterapéuticos son conjugados al inhibidor, ant écula pequeña usando métodos convencionales (Vé mplo, Hermentin and Seiler, Behring Inst. Mitt. 8 88)). En un aspecto, MTX es un agente anti-ne o e in vitro para propósitos de diagnóstico. El a duce señal provoca una señal medible la cual es d medios externos, usualmente la medición de ctromagnética . Para la mayor parte, el agente qu señal es una enzima o cromóforo, o emite orescencia, fosforescencia o quimioluminiscenc móforos incluyen tintes los cuales absorben l ión visible o ultravioleta, y pueden ser sus ductos de degradación de reacciones catalizada ima .

La invención además contempla anticuerpos os cuales están ligadas porciones de reportero u porciones objetivo son primeros miembros azantes. Los agentes anti-neoplásticos , por ejem jugados a segundas membranas de tales pares y son ígidos al sitio en donde el anticuerpo anti-FLT3 Los radioisótopos adecuados para uso como i-tumorales también se conocen por aquellos exper nica. Por ejemplo, se usa 131I o 211At. Estos isó dos al anticuerpo usando técnicas convencionales ejemplo, Pedley et al., Br. J. Cáncer 68:69-73 ernativamente, el agente anti-tumoral el cual es anticuerpo es una enzima la cual activa un profá a forma, un profármaco es administrado el cual su forma activa hasta que alcanza el sitio del de se convierte a su forma de citotoxina una ve plejo de anticuerpo se administra. En la prác jugado de anticuerpo-enzima es administrado al p deja localizar en la región del tejido a ser tra fármaco es entonces administrado al paciente de m conversión al fármaco citotóxico ocurre en la re ido a ser tratado. Alternativamente, el agen anticuerpo como se describe previamente, ta porciona por la presente invención. Condiciones ser tratadas de conformidad con la presente olucran células que expresan preferiblement ntras no se desee ser ligado por cualquier ticular, los presentes métodos proporcionan tr crecimiento de células cancerígenas que incl mplo, aquellos en los cuales el crecimiento neo hazo al transplante de órgano o un trastorno in o una enfermedad autoinmune la cual es estimu 3.

"Tratamiento" o "trata", en el context sente invención se refiere a tratamiento terapéu luye inhibir, reducir, aminorar o invertir el pr condición subyacente o cambio fisiológico no ciado con una enfermedad o trastorno, aliviar los 5Q indetectable . "Tratamiento" también puede s porcionar supervivencia comparada con la supe erada si no recibe tratamiento. Aquellos en nece tamiento incluyen aquellos ya con la enfermedad alidad, la presente invención puede ser usada icamento .

Una condición precancerosa a ser tra drome mielodisplásico . Otros cánceres a ser luyen pero no se limitan a malignidades hema es como leucemia, es decir, AML, ALL y CML e sticas, entre otros. Otras leucemias incluyen aqu Tabla 9, la cual lista la expresión de FLT3 en 1 ulas de leucemia humana seleccionadas obtenidas d EB10 de lineas de células de leucemia seleccion cer también puede ser un tumor sólido, tal como ebral o tiroideo. profiláctico o terapéutico. El término administra a en la presente significa administrar los antic presente invención a un mamífero por cualquier m eda lograr el resultado buscado. Pueden ser admin r ejemplo, intravenosamente o intramuscularmente ticuerpos humanos de la invención son partic iles para administración a humanos, pue inistrados a otros mamíferos también. El término o se usa en la presente está propuesto para incl se limita a, humanos, animales de laboratorio, ésticas y animales de granja. La cantidad terapéu ctiva significa una cantidad de anticuerpo de la ención que, cuando se administra a un mamí ctiva en producir el efecto terapéutico deseado, ibir el crecimiento del tumor. Las dosificaci tamiento pueden ser tituladas usando métodos d formidad con los factores tal como estado de en o y peso del individuo, y la capacidad del anti ción de anticuerpo para obtener una respuesta de individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiv una la cual en la cual cualquier efecto judicial del anticuerpo o porción del anticu pensados por los efectos terapéuticamente benéfi imenes de dosificación se pueden ajustar para pro respuesta óptima deseada (por ejemplo, una apéutica o profiláctica) .

Los anticuerpos anti-FLT3 presentes se inistrar para tratamientos terapéuticos a un pac esidad del mismo en una cantidad suficiente para ucir el progreso del tumor o condición patoló greso incluye, por ejemplo, el crecimiento, ástasis y/o reaparición del tumor o condición pa dición del paciente. U intervalo ejemplar, no a una cantidad terapéuticamente efectiva de un a la invención es 0.1-50 mg/kg, más preferibleme kg y más preferiblemente 5-20 mg/kg. Las canti ificación y frecuencia pueden ser determinadas icos que tratan al paciente y pueden incluir os que 1 mg/kg hasta más de 100 mg/kg propo riamente, tres veces por semana, semanalmente, a dos semanas o con menos frecuencia. La d inistración puede ser en el intervalo de 1-100, 2 mg/kg. Se debe notar que, sin embargo, que la ención no se limita a cualquier dosis particular.

En modalidades alternativas, la invención de incluir métodos para inhibir activación o madu ulas dendriticas que comprende poner en contacto dritica con un anticuerpo de la invención ya sea s 17,866 ( Schlessinger et al., anticuerpos anti binación con agentes anti-neoplásticos ) ; O ksal et al., anticuerpos anti-EGFR en combina liación) . Se puede usar cualquier agente anti-ne cuado, tal como un agente quimioterapéutico, rad binación del mismo.

Los agente anti-neoplásticos los cua ualmente conocidos en la técnica o son evaluados, upar en una variedad de clases que incluyen, por ibidores mitóticos, agentes de quelación, abolitos, antibióticos de intercalación, inhibid tor de crecimiento, inhibidores del ciclo imas, inhibidores de topoisomerasa y age ervivencia, modificadores de respuesta biológica, i-hormonas y anti-angiogénesis . Ejemplos de ag uilación incluyen, pero no se limitan a, ci interna (braquioterapia - BT) al paciente siendo dosis de agente anti-neoplástico administrada de erosos factores, que incluyen, por ejemplo, el nte, el tipo y severidad del tumor siendo trat a de administración del agente. Se debe enfati argo, que la presente invención no se limita a is particular.

En un aspecto de la presente invención, ? nte anti-neoplástico preferido para ser proporci binación con un anticuerpo de la invención. L porcionados en la presente, demuestran ergisticos del anticuerpo anti-FLT3, EB10, combi . Esta combinación es particularmente n speradamente proporciona el trabajo in vitro publ ukawa et al., (Leukemia 21: 1005-1014 (2007)), orta que la administración simultánea de un ejemplo únicamente MTX, así como también binación del mismo, es decir, antes y durante, pués, durante y después o antes, durante y de ciar la terapia del agente anti-neoplástico . Por anticuerpo anti-FLT3 se puede administrar entre s, preferiblemente 3 y 20 días, más preferibleme 12 días antes de iniciar la terapia de radiació alidad preferida de la invención, la quimiote inistra al mismo tiempo con o, más preferi secuentemente a la terapia de anticuerpo.

En otro aspecto de la invención, se pu lquier inhibidor FLT3 en combinación con MTX tamiento de leucemia.

Anticuerpos anti-FLT3 de la invención s inistrar con anticuerpos que neutralizan otros r olucrados en crecimiento de tumor o angiogénesis limita a, quimiocina, antigenos asociados al tidos. Además, estos estimuladores se pueden ad MTX. Se debe apreciar, sin embargo, que la admin un anticuerpo anti-FLT3 solo, como una monoter iciente para prevenir, inhibir o reducir el pro or en una manera terapéuticamente efectiva.

En la presente invención, cualquier métod cuado se pueda usar para administrar anticuerpos la invención, y opcionalmente, para co-administra i-neoplásticos tal como MTX y/o antagonistas eptores. Los regímenes del agente anti-ne lizados de conformidad con la invención, lquier régimen que se cree ser opcionalmente adec tratamiento de la condición neoplástica del ignidades diferentes, que incluyen varias f cemia pueden requerir el uso de anticuerpos a sente invención no se limita a cualquier métod ticular de administración.

Se entenderá que los anticuerpos anti-FL ención, cuando se usan en un mamífero para el pro filaxis o tratamiento, serán administrados en la composición, adicionalmente que comprende un macéuticamente aceptable. Portadores farmacéu ptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o a, salina, salina amortiguada de fosfato, cerol, etanol y similares, así como también comb los mismos. Portadores farmacéuticamente aceptabl más comprender cantidades menores de sustancias a o agentes de humectación o emulsificación, preser rtiguadores, los cuales mejoran la vida útil o ef las proteínas de enlace. Las composiciones ección, pueden como es bien conocido en la técn ctiva de un anticuerpo anti-FLT3 humano con MTX. dén además contener cualquier antagonista adecuad mplo, otro receptor del factor de crecimiento in tumorigénesis o angiogénesis (por ejemplo, EGFR lt-1, VEGFR-2, PDGFR, NGFR y FGFR) . Alternativame ción, los kits de la presente invención puede prender un agente anti-neoplástico . Ejemplos de i-neoplásticos adecuados en el contexto de la ención se han descrito en la presente. Los ki sente invención pueden además comprender ad mplos de los cuales se ha descrito anteriormente.

Más aún, incluido dentro del alcance de la ención está el uso de los anticuerpos presentes i vitro por métodos de investigación o diagnóst les son bien conocidos en la técnica. Los mé gnóstico incluyen kits, los cuales contienen an ta 4.5 x 10"iU M, o no mayor que 4.5 x 10~?? erminadas a 25°C. Se prefiere que el anticuerpo e 3 con una constante de velocidad de disociaci SOC) entre 4.5 x 10"5 1/s (seg-1, 1/segundos) y 6 x x 10"5 1/s y 5.7 x 10~5 1/s, todas medidas por r plasmón de superficie, descrita en la presente, preferiblemente el anticuerpo enlazado a FLT3 co soc entre 5.1 x 10"5 1/s y 5.6 x 10"5 1/s, o dentro as constantes de velocidad. Se prefiere que el a enlaza a FLT3 con una constante de velocidad de a o Kasoc) entre 0.5 x 105 M"1seg"1 (1/Ms; 1/molar 1/ 5 x 105 M^seg"1, o 1 x 105 M^seg"1 y 4 x 105 M_1se idos por resonancia de plasmón de superficie, des presente, a 25°C y más preferiblemente el antic aza a FLT3 con una Ka o Kasoc entre 1.2 x 105 M_1se 105 M"1seg"1, o dentro del 10% de estas const los CDRs en las Tablas 1 y 2. En otro asp ención es un anticuerpo monoclonal, o fragmento d ecifico para FLT3 que tiene una región CDR3 d era con la secuencia: MQGTHPAIS (SEC ID NO: 9). ecto, la invención es un anticuerpo monoc gmento del mismo, especifico para FLT3 que tiene cadena pesada con la secuencia: GVGAHDAFDI (SEC un aspecto diferente, la invención es un a ocional, o fragmento del mismo, que comprende ión variable de cadena ligera seleccionada del siste de EB10, NC7 y D4-3, y (ii) una región va ena pesada seleccionada del grupo que consiste y D4-3. En otro aspecto, la invención es un a ocional, o fragmento del mismo, especifico para prende (i) una región variable de cadena ligera y D4-3 (ii) una región variable de cadena pesada En una modalidad de la presente inven icuerpo o fragmento de anticuerpo inhibe la fosf una trayectoria corriente abajo de FLT3 que inclu , P13K y MAPK.

En un aspecto de los anticuerpos ac critos son inmunocon ugados a un agente antine incluye auristatina o metotrexato. El inmuno de estar enlazado a una etiqueta detectable. Otr un método para detectar, poniendo en contacto un célula objetivo con el anticuerpo o frag icuerpo y determinar si la muestra contie ectando el anticuerpo etiquetado.

En un aspecto, la composición terapé ctiva para inhibir el crecimiento de células neo expresan FLT3 o que promueven la regresión de anos que expresan FLT3. En aspectos adiciona critos en una cantidad efectiva para inhibir la a aduración de célula dendritica.

Otro aspecto de esta invención es un mét tar cáncer en un mamífero que comprende admini ífero una cantidad efectiva de un anticuerpo, o mismo, de cualquiera de los aspectos ya descr ención también proporciona un método para ignidades hematológicas que incluyen leucemia, ención, leucemia incluye, pero no se limita a: loide aguda (AML) , leucemia linfocitica agud cemia mieloide crónica en crisis blástica (CML e stica) y síndrome mielodisplásico . Otro mé tamiento proporcionado por esta invención combin anticuerpos o fragmentos del mismo de esta invenc la administración de un agente anti-cancerígeno ratamiento. En un método de tratamiento, el agen Se entenderá y esperará que las variacione ncipios de la invención descrita en la presente er por un experto en la técnica y se pretende ificaciones se incluyan dentro del alcance de la ención .

Los siguientes ejemplos además ilus ención, pero no deben ser construidos para lii anee de la invención en cualquier vía; de ningun en ser construidos para limitar el alcance ampl ención. Descripciones detalladas de vencionales , tal como aquellas empleadas strucción de vectores y plásmidos, la inserción codifican polipéptidos en los vectores y plásm roducción de plásmidos en células hospederas resión y determinación de los mismos de genes y gene pueden ser obtenidos de numerosas publicaci pectivamente ) en un plásmido de expresión adecu mplo pGSHC, y se diseña por ingeniería una secu leótido de cadena ligera adecuada, por ejemplo SE 41 o 42 (para EB10, NC7 y D4-3 respectivament smido de expresión adecuado, tal como pGSLC, por cuado tal como clonación por PCR. Para estabil ea celular estable, se co-transfecta una línea pedera adecuada, tal como células NSO o CHO, con cadena pesada y ligera linearizados por electrop tivo en medio adecuado tal como Medio Eagle Modi becco libre de glutamina con suero de terne lizado y suplemento de glutamina sintetasa. Se e clones para expresión de anticuerpo por u unosorbente unido a enzima (ELISA) y selecc ductor elevado para cultivo en matraces de ru ificación de anticuerpos por un método adecuado EB10 se muestra estar selectivamente enlazado ano con enlace de alta afinidad, FL de bloque y i-tumor potente mediada en modelos de xenoinjert anismo que involucra la activación de función uñe .

La presente invención también incluye el a ocional humano recombinante NC7, un IgGlK de pleta dirigidos al receptor FLT3 humano. Es compr cadena pesada gamma-1 humana del subgrupo I y u era kappa humana del subgrupo II. El NC7 se mué ar selectivamente enlazado a FLT3 humano con e a afinidad y FL en bloque.

La presente invención también incluye el a ocional humano recombinante D4-3, un IgGlK de pleta dirigidos al receptor FLT3 humano. Es compr cadena esada amma-1 humana del sub ru o I u acionadas a la presente invención. Las secuencias inucleico que codifican las secuencias de a critas más abajo también son incluidas dentro de la presente invención. la 1: Secuencias de Aminoácidos del Anticuerpo EB iones Variables CDRs de Cadena Pesada y Ligera. la 2 : Secuencia de Aminoácidos del Anticuerpo D4-3 I iones Variables CDRs de Cadena Pesada y Ligera la 3: Secuencia de Aminoácidos del Anticuerpo NC7 iones Variables CDRs de Cadena Pesada y Ligera 4: Secuencia de Aminoácidos SEC ID Nos de An NC7 y D4-3 Cadena Pesada Cadena Ligera nticuerpo Región Señal sin Señal Región Señal sin variable Completar Completa variable completar B10 19 25 31 22 28 C7 20 26 32 23 29 4-3 21 27 33 24 0 la 5: Sumario de Datos in vivo para Anticuerpos 4-3 e realizó el análisis FACS usando células de leuc como se describe anteriormente.

= Intensidad de Fluorescencia Media topes de Enlace de Anticuerpos Anti-FLT3 Se construye una serie de fusiones de mut supresión del dominio extracelular FLT3 por dom inoácidos 24-451) . El control positivo, produce e gitud completa (Fdl-5) que contiene aminoácidos manera similar. Se clonaron todos los construct tor de expresión pcADN 3.1 (+) (Invitrogen, Cars ndo los sitios de restricción Nhel y HindIII en an dentro del armazón con el dominio Fe de IgG ionado en C-término a una etiqueta de hexahistidi verifica la integridad de cada uno de los constr uenciamiento de ADN. Temporalmente se expre structos en células COS, y se verifica por ana chado Western el tamaño correcto de cada c resado. Se concentran los sobrenadantes del ular. Se examina el enlace de FL a los receptores imando la concentración de proteina relativa íante en el sobrenadante tanto por ELISA Fe an o por análisis de manchado Western y después se fato con 0.1% de TWEEN®-20) , y después se incuba /cavidad de diluciones seriales de los anticue Í-FLT3 en 2% M de PBST. Después de 3 lavados, s placas con 100 µ?/cavidad de anticuerpo Fab an jugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Labs Inc. ayo de enlace al ligando, las placas se recubre 0 ng/cavidad) durante la noche a 4°C, seg ubación con las variantes de eliminación del do FLT3 por 1 hora con agitación suave. Después de 3 placas se incuban con 100 µ?/cavidad del anti i-humano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResea .) . Las placas se desarrollan como se eriormente . Se examina el enlace de FL a los r mutante.

Los estudios de mapeo de epitope revelan gmentos Fab monovalentes tanto EB10 como D4-3, pe inio 4 o dominio 5 el cual es diferente de los ocidos en la técnica los cuales se enlazan a los 3. petencia de Ensayo Inmunosorbente enlazado a 1 ISA) y Ensayo de Bloqueo Para el ensayo de enlace FLT3, se recubre 96 cavidades con un anticuerpo-His (Qiagen, mania) durante la noche a 4°C. Las cavidades se 1 hora con amortiguador de bloqueo (PBS que cont TWEEN-20® y 5% de suero de ternero fetal (FCS) ) incuba con FLT3-Fc (1 g/ml x 100 µ?/cavidad) por peratura ambiente. Las cavidades se lavan tres T y después se agrega EB10 o IgG control y se peratura ambiente por 1 hora. Después del lavado, incuba con 100 µ? del conjugado de anticuerp ubiertas con FL (25 ng/cavidad) y después se peratura ambiente por una hora adicional. Des ado, se agrega conjugado HRP estreptavidina, y s orbancia a 450 nm. Se calcula la concentr icuerpo requerido para 50% de inhibición de FLT3 L (IC50) · Se examina la capacidad de EB10 para enla eptor por ELISA. Como se muestra en la Tabla 6, aza a FLT3 con un EC5o dentro del intervalo de 0.5 Se examina la capacidad de EB10 para blo ace receptor-ligando en un ELISA de competencia e Como se muestra en la Tabla 7, EB10 bloquea el a FLT3 con un IC50 dentro del intervalo de ntras no se observa la actividad de bloqueo trol . la 7: Actividades de Bloqueo Ligando FLT3-Rec icuerpos Anti-FLT3 por Ensayo Inmunosorbente enla ima Por lo tanto, los anticuerpos de la ención tienen capacidad de bloqueo de ligando nidad de enlace alta para FLT3. lisis de Cinéticas de Enlace por Análisis de Reso smón de Superficie/Biacore™ Se midieron los cinéticos de enlace del a LT3 a 25°C usando la resonancia de plasmón de su la reacción de disociación. Ka/ también referida c la constante de velocidad de la reacción de asoci stante de afinidad (KD) se calcula de la relació stantes de velocidad kasoc : kdisoc cedidas en Mola umen Ka, Kd y KD para los anticuerpos ej emplifica sente, EB10, NC7 y D4-3 en la Tabla 8. la 8. Cinéticos de Enlace de Anticuerpos a FLT ombinante Por lo tanto, los anticuerpos de la ención tienen altos cinéticos de enlace para FLT3. respondiente diluido en PBS . Las células se lava o y después se incuban en 100 µ? de anticuerpo undario anti-humano conjugado con PE uno esearch) (diluciones 1/200) por 45 minutos pués del lavado, las células se analizan por Cito jo tal como Citometria de Flujo Coulter® Epics® lter, Miami, Fl) / los datos medidos en Inten orescencia Media (MFI) .

La tabla 9 lista los resultados de teñido eas celulares de leucemia seleccionadas. El ométrico de flujo muestra que EB10 se une a FLT3 ivo expresado en células EOL-1, y también a FLT ante expresado en células BaF3-ITD. No se obser a EB10 en las lineas celulares JM1 FLT3 negativ trol . la 9 : EB10 Enlazado a FLT3 en Líneas Celulares de ana Seleccionadas por Citometria de Flujo ayo de Fosforilación otinina) . Se incuban cantidades iguales de ulares de cada muestra durante la noche a icuerpo 4G8 anti-FLT3 (BD Pharmingen) y des rosa de proteína A (Upstate Biotechnology, Lake por 2 horas adicionales. Después de la electrofo nsfiere a membranas de nitrocelulosa {Invitro liza en inmunomanchado con anticuerpo 4G1 fotirosina (Upstate Biotechnology) para valorar forilado. Las tiras de membrana se tra ensificador de señal Qentix™ (Pierce, Rockford, minaron nuevamente con anticuerpo S-18 anti-FLT z Biotechnology, Santa Cruz, CA) para detectar 3 total. Se visualizan las bandas de proteín mioluminiscencia (Amersham, Piscataway, NJ) . Para K, StatS o AKT activado, se separan 50 g de ext teína celular por electroforesis SDS-PAGE, se tra EB10 Inhibe Fosforilación inducida por FL Tipo nativo y Fosforilación Constitutiva Independ ando de FLT3 ITD Mutante: En células EOL-1 y ción de FL incrementa fuertemente la fosforila eptor FLT3. La incubación con EB10 blo forilación inducida por FL en una manera dependie is con un IC50 de 0.4~4 nM. Estos resultados in 0 es un potente inhibidor de la activación induci ando de FLT3 tipo nativo.

La mutación de IRD encontrada con alta f A L se conoce por causar fosforilación y activa eptor independiente a FL de trayectorias de señ cinasa, se reporta el efecto inhibitorio de ivación constitutiva de FLT3 mutante usando ulares BaF3-ITD y MV4;11 en la Tabla 10. El FLT3 líneas celulares tanto BaF3-ITD como MV4/ la 10: EB10 Inhibe Fosforilación Inducida por FL o nativo y Fosforilación Constitutiva Independi ando de FLT3 ITD Mutante: Línea celular Estado de mutación FLT3 Inhibición de Fosforil EOL-1 Tipo nativo 0.4 nM EM3 Tipo nativo nM BaF3-ITD Mutación ITD 4 nM MV4;11 Mutación ITD 40 nM Los anticuerpos de la presente invención i forilación inducida por FL de FLT3 de tipo nativo.

EB10 inhibe la Activación medida por FLT3 riente Abajo: Se han identificado las trayectori 3K y StatS por estar involucradas en la señ rriente abajo de FLT3 activado (Stirewalt DL yectoria de señalización MAPK corriente abajo (T incubación con EB10 inhibe la fosforilación ind de AKT en células EOL-1 y fosforilación independi AKT en células BaF3-ITD (Tabla 12) . En células fosforilación de StatS independiente a FL rtemente inhibida por EB10, mientras en EOL-1 cto (Tabla 13) . la 11: EB10 Inhibe Activación Mediada por FLT3 asa Corriente Abajo Línea celular Estado de mutación FLT3 Inhibición de Fosforila MAPK (ICso) EOL-1 Tipo nativo 0.1 nM E 3 Tipo nativo 0.1 nM BaF3-ITD Mutación ITD 0.1 nM MV4;1 1 Mutación ITD 0.4 nM la 13: EB10 Inhibe la Fosforilación de StatS inde L ayos de Proliferación Celular Se cosechan células EOL-1 y se lavan tr ndo medio RPMI 1640 libre de suero. Las cé tivan en medio RPMI 1640 libre de suero por 12 ho ulas BaF3-ITD, se realiza en ensayo de prolifer io RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS en la au exógeno. Las células se reconstituyen en medio AI suero, se colocan por triplicado en una plac idades de fondo plano (1 x 104/100 µ?/cavida liferación antecedente (es decir, muestras celu imuladas con FL) a partir de cpm de todas las erimentales . Se calcula el porcentaje de inhibici siguiente fórmula : [ (cpm de muestra no tratada stra tratada con anticuerpo) /cpm de muestra no t %.

EB10 Inhibe la Proliferación del Tipo Na resa células de Leucemia: FL juega un importante proliferación de células de leucemia. El tratami 0 inhibe la proliferación de células EOL-1 induci una manera dependiente de la dosis (Tabla 14) . la 14. EB10 Inhibe la Proliferación de células de -l inducida por FL Tratamiento Concentración %de inhibición de proliferación induci EB10 Inhibe la Proliferación de FLT3 ITD expresa Células de Leucemia: Las células nsforman FLT3-ITD proliferan en la ause imulación por FL. La estimulación por FL no incr liferación de células BaF3-ITD. El tratamiento ibe la proliferación independiente a FL de estas una manera dependiente de la dosis Tabla 15) . la 15. EB10 Inhibe la Proli eración de Células de 3 inducida por FL Tratamiento Concentración %de Inhibición de proliferació (nM) independiente a FL (Media ± Desviación estándar EB10 1.5 0.5±2.4 EB10 3 0.5±5.6 EB10 6 9.6±3.1 EB10 13 13.0±4.0 rófugos a 5 x 105 células/muestra en 500 mi pleto frío. Se agrega aproximadamente 1 mg de icuerpo etiquetado con 125I D4-3 a las células y 1 hora a 4°C. Las células se lavan dos veces o, se suspenden nuevamente en 500 mi de medio pués se incuban a 4 o 37°C por 0, 30, 60, 120, 2 utos. En cada punto de tiempo, las células se l es con PBS, después se cuantifican las muestras contador gamma para determinar las cantidades to ioactividad unida a la superficie celular. Se muestras a 37°C con amortiguador de descubrimie de glicina, urea 2M, pH 2.5). Se cuantifican rtiguador de descubrimiento como las pelotillas cubierta en un contador gamma para determ centaje de radioactividad internalizada.

Internalización de Anticuerpos anti-FLT3 3 en Superficie Celular EOL-1 Células EOL-1 radioetiquetadas con EB10 o das a la superficie de células del tumor y se int couver, Columbia Británica, Canadá, o Kit lamiento de Célula NK, Miltenyi Biotec. Las etivo se etiquetan (2 x 106) con 200 Ci de 51 as y después se lavan. Se incuban los rementados de células NK (0 hasta 400,000 célul les previamente se incuban con 10 pg/mL (67 nmol/ trol, C225, EB10, NC7 o D4-3 mAb por 45 minutos, ulas objetivo etiquetadas con 51Cr, por tripl cas de 96 cavidades de fondo en forma de V por 6 C, o con 5% de SDS para medir la lisis total. P liberación espontánea, se incuban células objeti ulas en 100 µ?/cavidad) con 100 µ? de medio única olectan de cada sobrenadante de la cavidad de los citotoxicidad y se cuantifica el 51Cr en un conta l como 1470 allac WIZARD, PerkinElmer Life and A ences, Inc., Boston, MA) . Se calcula el porce cocitos, en particular receptor Fe que expresa sinas (NK) naturales. Los anticuerpos de la ención proporcionan anticuerpos anti-FLT3 hum les tienen una capacidad mejorada para act ciones efectoras inmunes corriente abajo tal co 0 induce una respuesta ADCC fuerte; NC7 y D4-3 i puesta ADCC menos potente (Tabla 17) . la 17: ADCC en Células FLT3 de Leucemia Humana in oinjertos Efectivamente Tratados con EB10, NC7 y ones diariamente para sobrevivencia. Se co revivencia en los grupos de tratamiento por la p k .

Todos los ratones en el grupo de control s eminación extensiva de la enfermedad dentro de lo empo de sobrevivencia medio 36.0 ± 3.1 d paración, la sobrevivencia es significanteme longada en grupos de ratones tratados con 500 pg, g/dosis de EB10 (tiempo de sobrevivencia medi 7, 55.3 ± 18.9, o 52.8 ± 18.6, con un valor P d 005 o <0.001, respectivamente). No se observa efe po tratado con 10 pg de EB10, lo que indica que i-leucémico de EB10 es dependiente de la dosis.

Injerto de Médula Ósea de Células de ana: Se recolecta la médula ósea del fémur de lo tados con EB10 500 /dosis del ru o tratado Modelo de Leucemia BaF3-ITD: Se inicia la . de grupos de 10 ratones atimicos (nu/nu) con 5 ulas BaF3-ITD. Para análisis estadístico, usar n Whitney Rank Sum de una cola (SigmaStat 2.03, S cago, IL) . Iniciar el tratamiento un día despu eccion de tumor. Los ratones se tratan tres ve ana con una inyección i.p. de 500 pg/dosis o 100 EB10 en 200 µ? de PBS . Se trata el grupo control ano purificado (500 pg/dosis) . Se monitorean dí ratones para sobrevivencia.

En comparación al tratamiento con IgG empo de sobrevivencia medio 32.4 ± 10.6 d tamiento con EB10 significativamente prol revivencia de los ratones (63.4 ± 44.6 días, P < dosis con 500 g, y 66.5 ± 32.9 días, P < 0.01 is con 100 . Estos resultados muestran ue 10 g/ml de salina ÜSP. Se monitorean diariarr ones para sobrevivencia. Se compara la sobrevi grupos de tratamiento por la prueba Log Rank.

EB10 significativamente prolonga la sobre media de sobrevivencia varía de 63 días hasta a la dosis de 10 mg/kg y 0.2 mg/kg, respectiva paran a los 36 días para el control de salina. Es dependiente de la dosis, con cada dosis nificativamente más eficaz que la siguiente dosis Modelo de Leucemia Humana en Xenoinjerto S cia la inyección i.v. de ratones NOD-SCID en gru 5 x 106 células de leucemia. Se inicia el trata después de la inyección del tumor. Los ratones veces a la semana con una inyección i.p. de 20 0, NC7 y D4-3 en 200 µ? de PBS. Se trata el grup IgG humano purificado (500 g/dosis) . Se monit 5 días, p < 0.0001 y 55.5 días, p pectivamente) en el modelo de leucemia SEM-K2. La significantemente más fuerte para EB10 que para 001) y D43 (p < 0.0001). No existe diferencia sig eficacia entre NC7 y D43 (p = 0.244). cacia EB10 Determinada por Estudios PK En estudios PK de dosis repetida, EB10 s eficaz a dosis muy bajas. El umbral para eficac encuentra estar entre 2 y 10 pg/ml. EB10 logr cacia en modelos de leucemia de murina entre mi de Cprom, y entre 49 y 475 pg/ml Cmax. Un undario para Cmax es 375 hasta 475 pg/ml. apia de Combinación con EB10 y Agente Quimiote otrexato (MTX) en Modelo de Leucemia SEM-K2 2) EBIO 10 mg/kg, i.p. 2x/semana; 3) MTX 100 mg/kg, Q7D; y 4) Combinación ele MTX 100 mg/kg y EBIO 10 m Se prepara MTX (Sigma Chemical, Cat #M ina USP a una concentración de 10 mg/ml y dosis d s ciclos. Se prepara EB10 en salina USP y se semana hasta el dia 40, cuando muere el último trol de salina. Se dosifican todos los ratones en . En el grupo de combinación, se dosifica co os una hora antes del tratamiento con EB10 inicia 1. Se registra la sobrevivencia de los riamente. Se vigila los ratones para sobrevivenc rifica cualquier ratón que exhibe sig bidez/mortalidad; se marca como muerto en el rificio. El estudio termina al dia 168 y se lquier ratón que sobreviva en este punto. Se co nificantemente mayor que cualquier tratamiento oterapia. La terapia con EB10 significativamente sobrevivencia de ratones {p <0.01) en comparación trol. En menor medida, la terapia con MTX también sobrevivencia .

La terapia de combinación tanto con EB10 tiene una eficacia intensificada (P < 0. paración a monoterapia. La combinación de EB1 ulta en una sobrevivencia media significantemen cualquiera de los otro tratamientos en este más, cuatro ratones en el grupo de combinación s final del estudio, dia 168, considerando que lo reciben otros tratamientos de sobrevivencia en es hecho que el tratamiento de combinación permite ones sobrevivir más allá de 150 dias de tra siderando que no EB10 ni MTX como monoterapia so

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un anticuerpo que específicamente se enlaza a FL C ID NO. 43), caracterizado porque comprende una ne la secuencia SYYMH (SEC ID NO:2), una CDRH2 secuencia IINPSGGSTSYAQKFQG ( SEC ID N0:3), una ne la secuencia GVGAHDAFDI (SEC ID NO: 4) o VVAAA NO: 5), una CDRL1 que tiene la secuencia RSSQSLL C ID NO: 6) o RSSQSLLHSNGYNYLD (SEC ID NO: 7), una ne la secuencia LGSNRAS (SEC ID NO: 8), y una C ne la secuencia MQGTHPAIS (SEC ID NO: 9) o MQSLQ NO: 11) . El anticuerpo de conformidad con la reivindic acterizado porque comprende una CDRH1 que uencia SYYMH (SEC ID N0:2), una CDRH2 que uencia IINPSGGSTSYAQKFQG (SEC ID NO: 3), una C C ID NO:22) , y una VH que comprende la secuencia de amin EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQ GGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGAH TVSS (SEC ID NO: 19) . El anticuerpo de conformidad con cualquiera vindicaciones 1-3, caracterizado porque compr ena pesada que comprende la secuencia de aminoác ID NO: 25 y una cadena ligera que comprende la aminoácido de la SEC ID NO: 28. El anticuerpo de conformidad con cualquiera vindicaciones 1-4, caracterizado porque compr enas pesadas, cada una que comprende la secu noácido de la SEC ID NO:25 y dos cadenas ligeras, comprende la secuencia de aminoácido de la SEC I El anticuerpo de conformidad con la reivindic Un fragmento de cualquiera de los anticuerpos vindica de conformidad con cualquiera vindicaciones 1-6, caracterizado porque el ecificamente se enlaza a FLT3 humano. Un ácido polinucleico aislado caracterizad prende una secuencia de nucleótido que cod icuerpo o fragmento de conformidad con cualquier vindicaciones 1-7. Un vector de expresión caracterizado porque com do polinucleico de conformidad con la reivindi rablemente ligado a elementos de control de exp iera que el anticuerpo codificado o fragmento p resado . Una célula recombinante que comprende el v resión de conformidad con la reivindica acterizada porque la célula recombinante es to con un portador, diluyente o e macéuticamente aceptable. Un anticuerpo o fragmento como se reivi formidad con cualquiera de las reivindicaciones a uso como un medicamento. Un anticuerpo o fragmento como se reivi formidad con cualquiera de las reivindicaciones a uso en el tratamiento de cáncer. Un anticuerpo o fragmento como se reivi formidad con la reivindicación 14, caracterizado cer es leucemia. . Un producto que contiene un anticuerpo o frag formidad con cualquiera de las reivindicaciones l agente o tratamiento anti-cancerigeno adici binación para uso simultáneo, separado o secue apia .